بسم الله الرحمن الرحيم موضوعنا اليوم ان شاء الله
رب العالمين «Saccharose Hemolysis Test»
«Saccharose
Hemolysis Test» يعتبر كفحص تعزيزي أو تأكيدي لتشخيص
حالة الـ BNH اللي هي الـ Paroxymal Noctorial
Hemoglobinuria لو شخص احنا شكينا عندهاللي هو الـ
BNH البروكزيما النكتوريا الـ Hemoglobinuria بنعمله
بداية فحص يسمى Sugar Water Test هذا يعتبر
Screening Test يعني بقول النتيجة Positive أو
Negative الآن لما تطلع معايا نتيجة Sugar Water
Test Positive بروح بعمل الـ Saccharose Hemolysis
Test عشان أؤكد النتيجة اللي عنديوأشوف نسبة الـ
Hemolysis اللي صارت عند المرض طيب الـ BNH اللي هو
الـ Paroxysmal Noctorial Hemoglobinuria عبارة عن
إيش؟ عبارة عن acquired clonal disorder of
hemolysis in which the patient red cells are
abnormally sensitive to lyses by normal
constituents of plasma يعني الناس المصابين بهذا
المرضبيصير عندهم disorder في الـ hemobiosis بحيث
أنه الخلايا الـ RBCs اللي عندهم بتصير حساسة
للمكونات الطبيعية اللي موجودة في البلازمة زي الـ
complement يعني بيصيروا حساسين لوجود الـ
complement و الـ complement هنا هتعمل عندهم
license للخلايا وتصير عندهم أعراض الـ hemolysis
طبعا أعراض الـ hemolysis hemoglobinuria during
sleepعشانك أجى اسمها Nocturial
HemoglobinuriaJoints and Hemocydrineuria هذه أعراض
اللي هو الـ Hemolytic .. الـ Bionetch زي ما حكينا
عبارة عن خلل مكتسب بيصير في الـ Hemobiotic Stem
Cell بحيث أنه طبعا بيصير فيها mutation الـ
mutation هذه بترتب عليها خلايا فيها بعض الـ
abnormalitiesهذه الـ Abnormalities يعني بينتج عنها
تكسير لخلايا الـ RBCs في الوضع الطبيعي بالـ
Complement Components الموجودة بشكل طبيعي اللي
المفروض مايصيرش تكسير للخلايا منها عند الإنسان الـ
Normal طيب، طيب ليش بيصير الخلال هذا؟ الآن هدول
الناس الـ mutation بنتج عنها تكوين خلايا فيها نقص
في بعض الـ membrane-bound proteins زي الـ
Acetylcholine esteraseالـ Neutrophil Alkaline
Phosphatase الـ CD55 بـ K Accelerating Factor
Homologous Restriction Factor CD59 Membrane
Inhibitor of Reactive Lyses أو MIRL طيب نقص هذه
البروتينات إيش بترتب عليه؟ خلّيني أشرح هلقيت الـ
CD55 والـ CD59 والـ HRFهدول مهمين جداً في حماية
الخلية من الـ complement-mediated attack يعني هدول
بيحموا الخلية من الـ complement طبعاً أنتوا عارفين
إن الـ complement إذا صار لها fixation على الخلاية
هتعمل license للخلاية فهدول موجودين كحماية هدول
عبارة عن cell markers موجودة على سطح الخلية
موجودين كحماية لإلها الآن لو صار خلل فيهمأكيد
الخلايا هتصير عرضة لـComplement Attack وحيصرلها
Lysis الآن الـ CD59 إيش بيعمل Inhibits
the formation of the terminal complex of
complement componentكيف يعني؟ طبعا الـ complement
عبارة عن cascade معين يعني خطوات متعددة في النهاية
بتكون complex الـ complex هاد هو اللي بيعمل ال
ISIS للخلايا فالـ CD59 بتمنع تكون هذا الـ
complement and it has been established that the
deficiency of CD59 is largely responsible for the
complement sensitivity of BNH red cellsالآن غياب
الـ CD59 مسؤول بشكل أساسي عن تكون خلايا الـ RBCs
في حالة غيابه تكون خلايا الها high sensitivity للـ
complement يعني عدم وجوده بيخلي الخلايا حساسة جداً
لـ complementBNH Type 3 هذا عادةً بنلاقي فيه
Complete Deficiency في الـ CD59 بينما Type 2
هنلاقي Partial Deficiency في الحالة طبعاً عشان هيك
يعني هنلاقي فيه Difference في الـ Sensitivity بين
الشخص والتاني حسب قداش كمية الـ CD59 الموجودة
وهنلاقي اختلاف في حدة الأعراض وحدة الـ Hemolysis
زي ما قلنا الـ BNH Red Cells عادة بتكون
susceptible to lysis by complement يعني حساسة لإنه
يصير لها تكثير عن طريق الـ complement هذه الشغلة
بدنا ناخد خلايا RBCs ونشوفها هل هي فعلا حساسة إنه
يصير لها lysis بالكمplement ولا لأ فهذه الفحوصات
اللي ممكن نستخدمها في فحص اسمه Sugar Water Test
هذا يعتبر كـ Screening Testالفحص التاني Sucrose
Lysis Test والفحص التالت الـ Acidified Serum أو
HAM Test اسمه يعني هذا الفحص الأول Screening
والتانين التانين يعتبروا confirmatory tests لـ BNH
يعني أنا بتاخد خلايا واشوف هال بيصيرلهم Lysis ولا
ما بيصيرلهم Lysis في الظروف العادية
يمكن في البداية لاحظته إحنا حكينا عنه Clonal
Disorder بمعنى إنه مش كل الـ Stem Cells هتكون صارت
فيها الـ mutation عشان هيك مش كل خلايا الـ RBCs
هتكون فيها النقص في هذه الـ Factors اللي ع الـ
Cell Membrane تمام؟ هنا بترتب عليه الكلام اللي
بدنا نقوله الآنA characteristic feature of a
positive test for BNHis that not all the patient
cells undergoolysis يعني مش كل خلايا المريض راح
يصير الهالايسيز حتى لو كانت الظروف optimal الظروف
مناسبة وكل شي تمام لكن مش كل الخلايا هيصير
الهالايسيز this is because only a proportion of
any patient being a Schritzel population is
hypersensitive to lysis by complementطبعًا لأنه زي
ما قلتلكم مش كل الخلايا هيصير لها license
بالـComplement وهتكون حساسة للـComplement وطبعًا
هذه النسبة تختلف من شخص إلى شخص هنلاقي إنه في
عندنا علاقة وطيظة ما بين عدد الخلايا اللي فيها
مشكلة وما بين درجة الـHemolysis اللي بتصير يعني كل
ما كانت عدد الخلايا اللي affected أكتر هيصير عندي
Hemolysis أكترin vitro بغض النظر عن الفحص اللي أنا
بستخدمه من الفخصات اللي ذكرناها إيش بيلزمني
Reagent؟ هي الفكرة بكل بساطة أنه أنا بدي أجيب
Saccharose solution isotonic أحط الخلايا فيه تمام؟
وبعد ما أحط الخلايا فيه أضيفله complement
component وأشوف هل صار licensed ولا ماصارشأذن
بلزمني Sucrose Solution بلزمني Cyanomethamoglobin
اللي هو الـ Drug Canary Agent بلزمني Test Tubes
بلزمني A,B,O-Compatible Serum إيش يعني A,B,O
-Compatible Serum؟ أول إش إلا إيش بلزمني السيرم؟
بلزمني السيرم عشان أجيب منه complement يعني يعتبر
كمصدر للـComplement تمام؟ طب ليش أنا بجيبه A,B,O
-Compatible؟ لازم يكون من نفس الفصيلةعشان ما يصير
الـ slices نتيجة تفاعل الـ Antibody الموجود في الـ
Serum على مع الـ Antigen اللي على الخلايا فأنا بدي
أجيب Serum متطابق أضيفه على الخلايا عشان حتى لا
يتسبب فيه تكسير للخلايا وأنا أروح أفكر إن هذا
التكسير جاي من الـ BNH تمام؟أو بنجيب سيرم من شخص
فصيلته AB طب ليش اخترنا الشخص اللي فصيلته AB لأن
الـ AB ما عنده antibodies في السيرم إذا توفر عندي
شخص فصيلته AB باخد السيرم منه مافيش باخد
compatible serum يعني من نفس الفصيلة تمام من شخص A
normal بلزمني Sodium chloride بلزمني طبعاً Bybds
Spetrophotometerوبلزمني تجهيزات أخرى طبعاً العينة
بسحبها في Sodium Citrate طبعاً نسبة Sodium Citrate
1 part إلى 9 parts of holy blood يعني باخد جزء من
Sodium Citrate اللي تركيزه 0.109 مولر إلى 9 أجزاء
من الـ holy blood طبعاً هذا الـ 0.109 مولر بعادل 3
أو 8 من 10%
الـ Principle للشغل بنجيب Washed Dread Cells يعني
بجيب خلايا RBCs بعمللها Washing باستخدام Normal
Saline عشان مايعمللهاش Hemolysis طبعاً في طريقة
معينة للـ Washing أنه أنا بحط الـ Saline على
الخلايا وبعد هيك بعمل Centrifuge بعد هيك بتخلص من
الـ Saline هيك الـ Saline هياخد معاه الـ Plasma
والبروتينات العالقة بالـ Plasma كليتهابكرر الخطوة
هذه عشان أضمن أنه ماضلش عندي أي بلازمة أو أي
بروتين موجود جاي من البلازمة بكرر عملية الـ
Washing في النهاية الخلايا هتظل موجودة في وسط من
الـ Saline بعد تكرار عملية الـ Washing هتكون
الخلايا Suspended بـ Normal Saline تمام، إذا بجيب
الـ Washed Red Blood Cells وبعمللها Incubation في
Isotonic Saccharose Solutionفي محلول سكري Isotonic
نفس تركيز الخلايا بحيث انه مايكونش سبب في الـ
License لإلها وبضيف Normal ABA Compatible Serum
بجيب Serum من شخص متوافق إذا أنا عملت الحاجات
التلاتة الأساسية للفحص الشغلة الأولى وجود خلايا
الشغلة التانية في Isotonic solution وأضافت عليهم
Complement الآنفي هذه الظروف الـ Red blood cells
هتاخد الـ component من السيرم و هتيجي الـ
complement component من السيرم وتيجي على سطح الـ
RBCs طيب الإنسان اللي عنده BNH هيكون susceptible
أو sensitive للـ lysis فعشان هيك لو كان عنده BNH
عند هذه الظروف هيصير lysis للخلايا بينما الشخص
الطبيعيفي عنده حاجات هتحميه زي الـ CD55 والـ CD59
هذه الأشياء هتحمي الخلايا عنده من الـ Lysis
فبالتالي الـ Normal مش راح يصيرله Lysis في النهاية
طبعاًAt the end of the incubation period the
mixture is examined for hemolysis يعني بشوف هل حصل
hemolysis ولا لأ وعملية ال examination من ال
hemolysis بتتم عن طريق قراءة النتائج
spectrophotometrically
خطوات العمل طبعاً يعني احنا مش هناخدها بالتفصيل ان
شاء الله في العمل اللي بناخدها أول حاجة بحضر
washed cells بغسل الخلايا بطريقة إضافة blood على
saline وبعمل centrifuge وبعد هيك بتخلص من ال
saline بكرر عملية ال washing تلت مرات بعد هيك بعد
ما أخلص من عملية ال washing هيظل عندي RBCs متجمعة
لما اتخلصت من آخر مرة Saline حيظل عندي كمية من الـ
RBCs متجمعة في الأمبوبا الـ Packed RBCs هلاقيت الـ
Packed RBCs بدي أحضر منها Suspension 50%يعني خمسين
RBCs وخمسين Ash Saline فباخد تلت نقاط من الـ RBCs
الـ Suspended أو Equal Volume من الـ Backed RBCs
على نفس الـ Volume من الـ Normal Saline إذا خلصنا
خطوة تحضير الـ RBCs الخطوة اللي بعدها بدي أحضر لـ
Blood Sacrosis Tube فشو بدي أعمل؟ بدي أجيب الـ
Sacrosis Solutionوالـ Compatible Serum والخلايا
وأعمل لهم Incubation مع بعض تمام هيك طبعا بحط
Blank عشان أصفر الجهاز عليه وتكون قراقاتي بعد هيك
صحيحة الآن
بعد ما عملت الخطوة الأولى اللي هي كانت عبارة عن
Incubation للخلايا مع الـ Complement مع الـ
Saccharin solutionبدي أقرأ الـ Hemolysis و أقارن و
أعمل نسبة مئوية للـ Hemolysis يعني أداش صار عندي
Hemolysis لهذه العينة فعشان أقرأ الـ Hemolysis
بحضر تلت قنافيب واحدة فيهم بسميها الـ Total واحدة
للـ Blank واحدة لل Test الـ Total هذه ماكناش حاطين
واحدة زيها قبل هيك الـ Total هذه زي ما قلتلكم أنا
بدي أجيب الـ Absorbance الكل للـ Bloodعشان أشوف
قداش نسبة الـ Hemolysis اللي حصلت فباجي على كل
واحدة من هذه القنابيب بحط عليها Drupkin الـ
Drupkin هذا اللي هو الـ reaction بتاع الـ
Hemoglobin اللي بتفعل مع الـ Hemoglobin وبيعطيني
لون عشان في النهاية أقرأ على 540 نانومتر بحط عليها
كمية محددة زي ما هو L من الـ Drupkinأو باجي على
أنبوبة الـ Total خلّوا بالكم بعد الـ Incubation
هيكون يا بنات الخلايا ممكن يكون جزء من الخلايا
صاروا Hemolysis فإيش بعمل؟ بعمل Mixingلأ، عينت الـ
Blood لأن أنا الـ Total بدي أحسب كل الـ RBCs يعني
بدي أحسب بالنسبة للـ Total Volume من الـ RBCs اللي
أنا حطيته تمام؟ و بدي أحسب منه Unbooked الـ Total
فباخد منه يعني بعد ما أعمله Mixingبعد الـ
Incubation الأولى باخد منه كمية وبضيفها على الـ
Drupkin هيك أنا بكون أخدت قراءة الـ Total
Hemoglobin يعني كل الـ RBCs اللي أنا أضفتها أضفت
عليها Drupkin وأخدت القراءة بتاعتها، تمام؟ بعد هيك
باجي على أنبوبة Leblanc باخد Drupkin طبعا Leblanc
زي ما انتوا عارفين بنمشي بنفس خطوات الفحص بس
مانحطش Stableباخد من الـ Drupkin نفس الـ Volume
بحط عليه 250 µL من أمبوبة البلانك الأولى اللى
حطيناها بالخطوة الأولى فلقيت ال test ال test يا
بنات يفترض انه اخد الجزء اللى صارله hemolysis من
الخلايا طب كيف بدي اخد الجزء اللى صارله hemolysis
من الخلايا فاكرين تجربة Cosmetic Fragility؟ كنا
نعمل centrifuge وال supernatant تعبر عندي عن ال
hemolysis، مظبوط؟فاروح بعمل centrifuge و باخد من
السوبرناتان 250 ميكروليتر هلقيت لما باخد من
السوبرناتان 250 ميكروليتر بكون أخد الـRBCs اللي
صاريها Hemolysis منها 250 ميكروليتر وبعدها بقرأ
النتائج يعني بعمل Incubationوبقرأ النتيجة اللي
طلعت عندي على 540 نانومتر هيك بيكون عندي صفرت
الجهاز على الـ Blankواخدت قراقة للـ Test واخدت
قراقة لمين للـ Total الـ Test بس من الـ
Supernatant الـ Total من كل العينة بعمللها Mixing
و باخد منها الـ 250 µL طبعا بعد هيك زي ما قلتلكم
بدي أقرأ الـ Absorbance أو الـ Optical Density
والـ Percent Hemolysis بدي أحسب نسبة الـ Hemolysis
اللي حصلت هتكون مساوة Optical Density أو
Absorbance للـ Test على الـ Optical Density أو الـ
Absorbance للـ Total في 100%
هلقيت النتائج عندي الـ Negative أقل من 5% الـ
Negative أقل من 5% الـ Positive أكتر من 10% طيب،
من 6% لـ 10% إيش بعتبرها؟ بعتبرها Borderline يعني
ربما صار License للخلايا لأسباب أخرى غير الـ BMH
خليني أشوف إيش بعض الأسباب اللي ممكن تعمل
Hemolysis للخلايا
هذه الأسباب Increase Hemolysis من 6 لـ 10 أقل من
10% ممكن يكون في حالات اللوكيميا أو الـ
Myelofibrosis بينما الناس اللي عندهم PNH الـ
Hemolysis يكون عندهم من 10 يتراوح من 10 إلى 80%
تمام، نادرWill only rarely be as low as 5% يعني
نادراً ما يكون الـ Hemolysis عندهم قليل إلا ما
يكون عندهم مرتفع Results of Saccharose Hemolysis
Test should correlate with Acid Serum Test يعني
نتائج الـSaccharose Test هذا متطابق مفروض تكون
كماماً مع الـAcid Serum Test أو اللي سمناها في
البداية Ham Test يعطيكوا
العافية