{"words": ["Figure", "1B", ":", "PK", "vs", ".", "PIPLC", "treatment", "to", "determine", "prion", "loads", "in", "infected", "cells", "in", "384", "-", "well", "plates", ".", "Both", "treatments", "discriminate", "between", "RML", "prion", "infected", "CAD5", "and", "non", "-", "infectious", "brain", "homogenate", "(", "NBH", ")", "treated", "CAD5", "cells", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Shown", "are", "mean", "±", "SD", ",", "n", "≤", "30", "individually", "cultured", "wells", ".", "C", ":", "The", "infectivity", "of", "PIPLC", "and", "PK", "-", "treated", "cell", "lysates", "was", "determined", "by", "infecting", "CAD5", "cells", "with", "lysates", "as", "indicated", ".", "The", "signal", "intensity", "of", "the", "highest", "dilution", "was", "measured", "and", "compared", "to", "untreated", "RML", "CAD5", "cell", "lysate", ".", "PIPLC", "-", "treated", "cells", "and", "PK", "-", "treated", "lysates", "showed", "similar", "infectivity", "titers", ".", "Prion", "-", "infected", "and", "NBH", ",", "as", "well", "as", "RML", "on", "CAD5ΔPrnp", "were", "used", "for", "control", ".", "D", ":", "RML", "-", "infected", "CAD5", "and", "GT", "-", "1", "/", "7", "cells", "were", "transfected", "with", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "or", "Prnp", "targeting", "siRNAs", "in", "a", "384", "-", "well", "plate", "and", "subjected", "to", "PK", "or", "PIPLC", "treatment", ".", "Z", "'", "-", "factors", "were", "calculated", "for", "each", "condition", ".", "Shown", "are", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "22", "individually", "cultured", "wells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B: PK vs. PIPLC treatment to determine prion loads in infected cells in 384-well plates. Both treatments discriminate between RML prion infected CAD5 and non-infectious brain homogenate (NBH) treated CAD5 cells. **** = p-value < 0.0001 (Student's t-test). Shown are mean ± SD, n ≤ 30 individually cultured wells.C: The infectivity of PIPLC and PK-treated cell lysates was determined by infecting CAD5 cells with lysates as indicated. The signal intensity of the highest dilution was measured and compared to untreated RML CAD5 cell lysate. PIPLC-treated cells and PK-treated lysates showed similar infectivity titers. Prion-infected and NBH, as well as RML on CAD5ΔPrnp were used for control.D: RML-infected CAD5 and GT-1/7 cells were transfected with non-targeting (NT) or Prnp targeting siRNAs in a 384-well plate and subjected to PK or PIPLC treatment. Z'-factors were calculated for each condition. Shown are mean ± SD, n = 22 individually cultured wells."}
{"words": ["Figure", "4A", ":", "Western", "blot", "showing", "Hnrnpk", "siRNA", "transfection", "(", "96", "hrs", ".", ")", "decreases", "Hnrnpk", "protein", "levels", "while", "increases", "PrPSc", "in", "RML", "prion", "infected", "GT", "-", "1", "/", "7", ".", "Prnp", "siRNAs", "suppressed", "both", "PrPC", "and", "PrPSc", "as", "expected", ".", "⍺", ":", "anti", "Quantifications", "are", "reported", "as", "normalized", "to", "Actin", "and", "in", "comparison", ",", "to", "NT", ".", "PK", "-", "western", "blot", "is", "quantified", "relative", "to", "NT", ".", "B", ":", "Western", "Blot", "of", "PSA", "-", "treated", "uninfected", "and", "infected", "GT", "-", "1", "/", "7", "cells", ".", "Increasing", "concentration", "of", "PSA", "leads", "to", "a", "more", "prominent", "reduction", "of", "PrPSc", "in", "mouse", "cells", ".", "PK", "-", "western", "blot", "is", "quantified", "relative", "to", "DMSO", ".", "C", ":", "mRNA", "levels", "of", "Hnrnpk", "and", "Prnp", "following", "siRNA", "and", "PSA", "treatment", ".", "FPKM", ":", "Fragments", "per", "kilobase", "of", "transcript", "per", "million", "mapped", "reads", ".", "Hnrnpk", "siRNAs", "lead", "to", "a", "decrease", "in", "Hnrnpk", "mRNA", "levels", "as", "well", "as", "an", "increase", "in", "Prnp", "mRNA", "levels", ".", "No", "difference", "is", "seen", "between", "DMSO", "treated", "and", "PSA", "treated", "cells", "for", "either", "Hnrnpk", "levels", "of", "Prnp", "levels", ".", "n", "=", "2", "per", "treatment", "group", ".", "D", ":", "Quantification", "of", "PrPSc", "levels", "in", "RML", "GT", "-", "1", "/", "7", "cells", "following", "treatment", "with", "1", "µM", "PSA", "in", "comparison", "to", "DMSO", ".", "Each", "dot", "represents", "an", "experiment", ".", "Shown", "are", "mean", "±", "SD", ".", "E", ":", "Brightfield", "microscopy", "images", "of", "the", "effect", "of", "siRNA", "mediated", "HNRNPK", "downregulation", "on", "prion", "-", "induced", "vacuolation", "in", "PG127", "hovS", "cells", ".", "Downregulation", "of", "HNRNPK", "leads", "to", "an", "enhanced", "cytopathological", "vacuolation", "phenotype", "when", "compared", "to", "NT", "siRNA", ".", "ovPRNP", "siRNA", "transfected", ",", "as", "well", "as", "uninfected", "cells", "were", "used", "as", "controls", "Downregulation", "of", "ovPRNP", "in", "the", "infected", "hovS", "eliminates", "the", "vacuoles", ";", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "vacuoles", "of", "NT", ",", "HNRNPK", "and", "ovPRNP", "siRNA", "treated", "PG127", "hovS", ".", "Cells", "from", "pictures", "at", "three", "different", "positions", "in", "the", "well", "were", "manually", "counted", "and", "the", "amount", "of", "vacuolated", "cells", "was", "normalized", "to", "the", "total", "amount", "of", "cells", ".", "Values", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0113", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "=", "<", "0", ".", "0001", "(", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ".", "F", ":", "Quantification", "of", "PrPSc", "levels", "in", "PG127", "hovS", "cells", "following", "treatment", "with", "1", "µM", "PSA", "in", "comparison", "to", "DMSO", ".", "Each", "dot", "represents", "an", "experiment", ".", "Shown", "are", "mean", "±", "SD", ".", "G", ":", "Same", "as", "in", "E", ",", "using", "shRNAs", "instead", "of", "siRNA", ".", "Downregulation", "of", "HNRNPK", "leads", "to", "an", "enhanced", "cytopathological", "vacuolation", "phenotype", "when", "compared", "to", "NT", "shRNA", ".", "Uninfected", "cells", "were", "used", "as", "controls", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "vacuoles", "of", "NT", "and", "HNRNPK", "shRNA", "treated", "PG127", "hovS", ".", "Cells", "from", "pictures", "at", "three", "different", "positions", "in", "the", "well", "were", "manually", "counted", "and", "the", "amount", "of", "vacuolated", "cells", "was", "normalized", "to", "the", "total", "amount", "of", "cells", ".", "Values", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "=", "<", "0", ".", "0009", "(", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ".", "H", ":", "Quantification", "of", "PrPSc", "levels", "in", "PG127", "hovS", "cells", "following", "treatment", "with", "shRNA", "against", "HNRNPK", "and", "1", "µM", "PSA", "in", "comparison", "to", "DMSO", "and", "NT", ".", "Each", "dot", "represents", "an", "experiment", ".", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "027", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Shown", "are", "mean", "±", "SD", ".", "I", ":", "Gene", "set", "overrepresentation", "analysis", "of", "differentially", "expressed", "genes", "(", "log2FC", "-", "0", ".", "25", "≥", "or", "0", ".", "25", "≤", "and", "FDR", "≤", "0", ".", "05", ")", "for", "siRNA", "mediated", "Hnrnpk", "downregulation", "or", "PSA", "treatment", "in", "RML", "GT", "-", "1", "/", "7", "cells", "analyzed", "by", "RNAseq", ".", "Differentially", "regulated", "genes", "(", "up", "in", "siRNA", "treatment", "and", "down", "in", "PSA", "or", "vice", "versa", ")", "were", "overlapped", "and", "used", "for", "pathway", "analysis", ".", "No", "significantly", "enriched", "pathways", "are", "detected", "for", "upregulated", "genes", "in", "Hnrnpk", "and", "downregulated", "in", "PSA", "treatment", ".", "For", "the", "opposing", "direction", ",", "an", "enrichment", "of", "genes", "involved", "in", "glucose", "metabolism", "was", "detected", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A: Western blot showing Hnrnpk siRNA transfection (96 hrs.) decreases Hnrnpk protein levels while increases PrPSc in RML prion infected GT-1/7. Prnp siRNAs suppressed both PrPC and PrPSc as expected. ⍺: anti Quantifications are reported as normalized to Actin and in comparison, to NT. PK-western blot is quantified relative to NT.B: Western Blot of PSA-treated uninfected and infected GT-1/7 cells. Increasing concentration of PSA leads to a more prominent reduction of PrPSc in mouse cells. PK-western blot is quantified relative to DMSO.C: mRNA levels of Hnrnpk and Prnp following siRNA and PSA treatment. FPKM: Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads. Hnrnpk siRNAs lead to a decrease in Hnrnpk mRNA levels as well as an increase in Prnp mRNA levels. No difference is seen between DMSO treated and PSA treated cells for either Hnrnpk levels of Prnp levels. n = 2 per treatment group.D: Quantification of PrPSc levels in RML GT-1/7 cells following treatment with 1 µM PSA in comparison to DMSO. Each dot represents an experiment. Shown are mean ± SD.E: Brightfield microscopy images of the effect of siRNA mediated HNRNPK downregulation on prion-induced vacuolation in PG127 hovS cells. Downregulation of HNRNPK leads to an enhanced cytopathological vacuolation phenotype when compared to NT siRNA. ovPRNP siRNA transfected, as well as uninfected cells were used as controls Downregulation of ovPRNP in the infected hovS eliminates the vacuoles; Right panel: Quantification of vacuoles of NT, HNRNPK and ovPRNP siRNA treated PG127 hovS. Cells from pictures at three different positions in the well were manually counted and the amount of vacuolated cells was normalized to the total amount of cells. Values represent mean ± SD. * p = 0.0113, **** p = <0.0001 (Dunnett's multiple comparisons test). Scale bar = 100 µm. n = 3 technical replicates.F: Quantification of PrPSc levels in PG127 hovS cells following treatment with 1 µM PSA in comparison to DMSO. Each dot represents an experiment. Shown are mean ± SD.G: Same as in E, using shRNAs instead of siRNA. Downregulation of HNRNPK leads to an enhanced cytopathological vacuolation phenotype when compared to NT shRNA. Uninfected cells were used as controls Right panel: Quantification of vacuoles of NT and HNRNPK shRNA treated PG127 hovS. Cells from pictures at three different positions in the well were manually counted and the amount of vacuolated cells was normalized to the total amount of cells. Values represent mean ± SD. *** p = <0.0009 (Dunnett's multiple comparisons test). Scale bar = 100 µm. n = 3 technical replicates.H: Quantification of PrPSc levels in PG127 hovS cells following treatment with shRNA against HNRNPK and 1 µM PSA in comparison to DMSO and NT. Each dot represents an experiment. *= p-value < 0.027 (Student's t-test). Shown are mean ± SD.I: Gene set overrepresentation analysis of differentially expressed genes (log2FC -0.25 ≥ or 0.25 ≤ and FDR ≤ 0.05) for siRNA mediated Hnrnpk downregulation or PSA treatment in RML GT-1/7 cells analyzed by RNAseq. Differentially regulated genes (up in siRNA treatment and down in PSA or vice versa) were overlapped and used for pathway analysis. No significantly enriched pathways are detected for upregulated genes in Hnrnpk and downregulated in PSA treatment. For the opposing direction, an enrichment of genes involved in glucose metabolism was detected."}
{"words": ["Figure", "5A", ":", "Western", "Blot", "of", "RML", "prion", "infected", "COCS", "treated", "with", "1", "µM", "PSA", "or", "DMSO", ".", "PSA", "treatment", "was", "started", "two", "weeks", "after", "infection", "and", "continued", "until", "lysis", ".", "PSA", "reduced", "the", "amount", "of", "PrPSc", ".", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "Western", "Blot", ";", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "Values", ":", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0211", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", ":", "Western", "Blot", "analysis", "of", "NBH", "-", "treated", "COCS", ".", "PSA", "treatment", "was", "identical", "to", "the", "samples", "of", "A", ".", "PSA", "did", "not", "affect", "PrPC", "expression", ".", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "Western", "Blot", ";", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "Values", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "⍺", ":", "antiC", ":", "Negative", "geotaxis", "climbing", "assay", "in", "prion", "infected", "Drosophila", ".", "Flies", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "0", ".", "5", "mM", "PSA", ",", "0", ".", "75", "mM", "PSA", ",", "or", "1", "mM", "PSA", "at", "the", "larval", "stage", "and", "during", "adulthood", "for", "the", "duration", "of", "the", "assay", ".", "Climbing", "ability", "was", "assessed", "on", "groups", "of", "flies", "(", "n", "=", "3", "x", "15", ")", "three", "times", "a", "week", "and", "expressed", "as", "a", "performance", "index", ".", "Statistical", "analysis", "on", "the", "difference", "between", "PG127", "prion", "infected", "versus", "control", "prion", "-", "free", "treatment", "group", "data", "in", "each", "graph", "was", "performed", "by", "an", "unpaired", "t", "test", ":", "DMSO", ":", "p", "=", "0", ".", "0002", ";", "PSA", ":", "0", ".", "5", "mM", ":", "p", "=", "0", ".", "0186", ";", "0", ".", "75", "mM", ":", "p", "=", "n", ".", "s", ".", ";", "1", "mM", ":", "p", "=", "n", ".", "s", ".", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ".", "Shown", "are", "mean", "±", "SDD", ":", "RT", "-", "QuIC", "analysis", "of", "whole", "-", "head", "homogenates", "of", "prion", "infected", "Drosophila", ".", "For", "each", "sample", ",", "10", "male", "and", "10", "female", "heads", "from", "the", "same", "treatment", "group", "were", "homogenized", ",", "1", ":", "20", "diluted", "and", "applied", "to", "the", "RT", "-", "QuIC", ".", "Shown", "are", "the", "RT", "-", "QuIC", "reactions", "of", "three", "independent", "homogenates", "per", "treatment", "group", ",", "each", "assessed", "in", "quadruplicates", ".", "For", "quantification", ",", "the", "lag", "-", "time", "of", "each", "reaction", "was", "calculated", "and", "plotted", "in", "a", "graph", ".", "Shown", "are", "mean", "±", "SD", ".", "The", "assays", "were", "performed", "for", "100", "hours", ",", "samples", "not", "yielding", "a", "positive", "reaction", "are", "considered", "negative", ".", "*", "*", "*", "=", "p", "≤", "0", ".", "0006", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ",", "flies", "fed", "with", "NBH", "and", "treated", "with", "DMSO", "were", "used", "as", "a", "negative", "control", ",", "a", "standard", "prion", "-", "free", "and", "a", "prion", "-", "containing", "sample", "were", "used", "as", "assay", "controls", ".", "To", "control", "for", "potential", "interference", "of", "DMSO", "or", "PSA", "with", "the", "RT", "-", "QuIC", "reaction", ",", "prion", "positive", "sample", "was", "spiked", "with", "1", "µM", "PSA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A: Western Blot of RML prion infected COCS treated with 1 µM PSA or DMSO. PSA treatment was started two weeks after infection and continued until lysis. PSA reduced the amount of PrPSc. Right panel: Quantification of the Western Blot; n = 5 biological replicates. Values: mean ± SD. * p = 0.0211 (Student's t-test).B: Western Blot analysis of NBH-treated COCS. PSA treatment was identical to the samples of A. PSA did not affect PrPC expression. Right panel: Quantification of the Western Blot; n = 5 biological replicates. Values represent mean ± SD. n.s. = not significant (Student's t-test). ⍺: antiC: Negative geotaxis climbing assay in prion infected Drosophila. Flies were treated with DMSO, 0.5 mM PSA, 0.75 mM PSA, or 1 mM PSA at the larval stage and during adulthood for the duration of the assay. Climbing ability was assessed on groups of flies (n=3 x 15) three times a week and expressed as a performance index. Statistical analysis on the difference between PG127 prion infected versus control prion-free treatment group data in each graph was performed by an unpaired t test: DMSO: p = 0.0002; PSA: 0.5 mM: p = 0.0186; 0.75 mM: p = n.s.; 1 mM: p = n.s. n.s. = not significant. Shown are mean ± SDD: RT-QuIC analysis of whole-head homogenates of prion infected Drosophila. For each sample, 10 male and 10 female heads from the same treatment group were homogenized, 1:20 diluted and applied to the RT-QuIC. Shown are the RT-QuIC reactions of three independent homogenates per treatment group, each assessed in quadruplicates. For quantification, the lag-time of each reaction was calculated and plotted in a graph. Shown are mean ± SD. The assays were performed for 100 hours, samples not yielding a positive reaction are considered negative. *** = p ≤ 0.0006, n.s. = not significant, flies fed with NBH and treated with DMSO were used as a negative control, a standard prion-free and a prion-containing sample were used as assay controls. To control for potential interference of DMSO or PSA with the RT-QuIC reaction, prion positive sample was spiked with 1 µM PSA."}
{"words": ["Figure", "1B", "Expression", "levels", "of", "GlcNAc", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "GAS", ",", "ΔgacG", ",", "H", ",", "I", ",", "J", ",", "K", ",", "and", "L", "were", "measured", "as", "the", "sWGA", "fluorescence", "intensity", "(", "normalized", "to", "WT", "GAS", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Expression levels of GlcNAc in wild-type (WT) GAS, ΔgacG, H, I, J, K, and L were measured as the sWGA fluorescence intensity (normalized to WT GAS)."}
{"words": ["Figure", "2B", ",", "C", "Accumulation", "of", "LC3", "-", "II", ".", "(", "B", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "LC3", "-", "II", "during", "non", "-", "infection", "(", "NI", ")", ",", "WT", "GAS", ",", "ΔgacI", ",", "and", "ΔgacI", ":", ":", "gacI", ".", "(", "C", ")", "LC3", "-", "II", "intensity", "normalized", "to", "NI", ".", "D", ",", "E", "Recruitment", "of", "ubiquitin", "in", "GAS", "-", "infected", "cells", ".", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "WT", "GAS", ",", "ΔgacI", ",", "and", "ΔgacI", ":", ":", "gacI", "for", "4", "h", ",", "fixed", ",", "and", "immunostained", "for", "ubiquitin", "(", "FK2", ":", "magenta", ")", ".", "Cellular", "and", "bacterial", "DNA", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "cyan", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "confocal", "images", "and", "(", "E", ")", "percentage", "of", "cells", "with", "ubiquitin", "-", "positive", "GAS", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "G", ",", "H", "Localization", "of", "ubiquitin", "in", "sWGA", "-", "treated", "GAS", ".", "HeLa", "WT", "were", "infected", "with", "the", "indicated", "GAS", "strains", "masked", "with", "sWGA", "for", "4", "h", ",", "fixed", ",", "and", "immunostained", "for", "ubiquitin", "(", "magenta", ")", ".", "(", "G", ")", "Representative", "confocal", "images", "and", "(", "H", ")", "percentages", "of", "cell", "with", "ubiquitin", "-", "positive", "GAS", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "I", ",", "J", "Recruitment", "of", "p62", "to", "gacI", "mutants", ".", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "WT", "GAS", ",", "ΔgacI", ",", "and", "ΔgacI", ":", ":", "gacI", "for", "4", "h", ",", "fixed", ",", "and", "immunostained", "for", "p62", "(", "magenta", ")", ".", "Cellular", "and", "bacterial", "DNA", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "cyan", ")", ".", "(", "I", ")", "Representative", "confocal", "images", "and", "(", "J", ")", "percentage", "of", "cells", "with", "p62", "-", "positive", "GAS", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B, C Accumulation of LC3-II. (B) Representative western blot of LC3-II during non-infection (NI), WT GAS, ΔgacI, and ΔgacI::gacI. (C) LC3-II intensity normalized to NI.D, E Recruitment of ubiquitin in GAS-infected cells. HeLa cells were infected with WT GAS, ΔgacI, and ΔgacI::gacI for 4 h, fixed, and immunostained for ubiquitin (FK2: magenta). Cellular and bacterial DNA were stained with DAPI (cyan). (D) Representative confocal images and (E) percentage of cells with ubiquitin-positive GAS. Scale bar, 10 μm.G, H Localization of ubiquitin in sWGA-treated GAS. HeLa WT were infected with the indicated GAS strains masked with sWGA for 4 h, fixed, and immunostained for ubiquitin (magenta). (G) Representative confocal images and (H) percentages of cell with ubiquitin-positive GAS. Scale bar, 10 μm.I, J Recruitment of p62 to gacI mutants. HeLa cells were infected with WT GAS, ΔgacI, and ΔgacI::gacI for 4 h, fixed, and immunostained for p62 (magenta). Cellular and bacterial DNA were stained with DAPI (cyan). (I) Representative confocal images and (J) percentage of cells with p62-positive GAS. Scale bar, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", "Co", "-", "localization", "of", "GFP", "-", "FBXO2", "and", "mCherry", "-", "LC3", "in", "GAS", "-", "infected", "cells", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "EmGFP", "-", "FBXO", "(", "green", ")", "and", "mCherry", "-", "LC3", "(", "magenta", ")", "were", "infected", "with", "WT", "GAS", "for", "2", "h", ";", "scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Representative", "confocal", "images", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", "percentages", "of", "FBXO", "-", "positive", "cells", ".", "E", ",", "F", "Localization", "of", "EmGFP", "-", "FBXO2", "in", "GAS", "-", "infected", "cells", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "FBXO2", "(", "green", ")", "were", "infected", "with", "the", "indicated", "GAS", "strains", "for", "2", "or", "4", "h", "at", "an", "MOI", "of", "100", ";", "scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Representative", "confocal", "images", "at", "4", "h", "of", "WT", "GAS", ",", "ΔgacI", ",", "and", "ΔgacI", ":", ":", "gacI", "(", "E", ")", "and", "(", "F", ")", "percentages", "of", "FBXO2", "‐", "positive", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B Co-localization of GFP-FBXO2 and mCherry-LC3 in GAS-infected cells. HeLa cells transfected with the indicated EmGFP-FBXO (green) and mCherry-LC3 (magenta) were infected with WT GAS for 2 h; scale bar, 10 μm. Representative confocal images (A) and (B) percentages of FBXO-positive cells.E, F Localization of EmGFP-FBXO2 in GAS-infected cells. HeLa cells transfected with GFP-FBXO2 (green) were infected with the indicated GAS strains for 2 or 4 h at an MOI of 100; scale bar, 10 μm. Representative confocal images at 4 h of WT GAS, ΔgacI, and ΔgacI::gacI (E) and (F) percentages of FBXO2‐positive cells."}
{"words": ["Figure", "4B", ",", "HeLa", "cells", "transfected", "the", "indicated", "GFP", "-", "FBXO2", "mutants", "(", "green", ")", "were", "infected", "with", "WT", "GAS", "for", "4", "h", ";", "scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Representative", "confocal", "images", "(", "B", ")", "E", ",", "F", "Recruitment", "of", "FBXO2", "to", "intracellular", "GAS", "in", "SKP1", "/", "CUL1", "/", "ROC1", "knockdown", "cells", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "FBXO2", "(", "green", ")", "and", "the", "indicated", "siRNAs", "were", "infected", "with", "GAS", ",", "fixed", "at", "4", "h", ";", "scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Representative", "confocal", "images", "(", "E", ")", "and", "percentages", "of", "FBXO2", "localized", "to", "GAS", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B, HeLa cells transfected the indicated GFP-FBXO2 mutants (green) were infected with WT GAS for 4 h; scale bar, 10 μm. Representative confocal images (B)E, F Recruitment of FBXO2 to intracellular GAS in SKP1/CUL1/ROC1 knockdown cells. HeLa cells transfected with GFP-FBXO2 (green) and the indicated siRNAs were infected with GAS, fixed at 4 h; scale bar, 10 μm. Representative confocal images (E) and percentages of FBXO2 localized to GAS (F)."}
{"words": ["Figure", "5D", "HeLa", "WT", "or", "FBXO2", "-", "KO", "cells", "transfected", "with", "mCherry", "-", "Gal3", "(", "magenta", ")", "were", "infected", "with", "WT", "GAS", "for", "2", "or", "4", "h", ",", "and", "percentages", "of", "Gal3", "-", "positive", "GAS", "-", "containing", "cells", "were", "quantified", ".", "E", "-", "J", "Localization", "of", "ubiquitin", ",", "LC3", "and", "p62", "in", "FBXO2", "KO", "cells", ".", "HeLa", "WT", "or", "FBXO2", "-", "KO", "cells", "were", "infected", "with", "WT", "GAS", "for", "4", "h", ",", "fixed", ",", "and", "immunostained", "for", "ubiquitin", "(", "FK2", ":", "magenta", ")", "or", "LC3", "(", "magenta", ")", "or", "p62", "(", "magenta", ")", ".", "Representative", "confocal", "images", "(", "E", ",", "G", ",", "and", "I", ")", "and", "percentages", "of", "cells", "with", "ubiquitin", ",", "LC3", ",", "or", "p62", "-", "positive", "GAS", "(", "F", ",", "H", ",", "and", "J", ")", ".", "M", ",", "N", "GlcNAc", "recognition", "of", "FBXO2", "required", "for", "GAS", "xenophagy", ".", "Non", "-", "transfected", "HeLa", "WT", "cells", "and", "HeLa", "FBXO2", "-", "KO", "cells", "transfected", "GFP", ",", "GFP", "-", "FBXO2", ",", "GFP", "-", "FBXO2", "YW", "/", "AA", "were", "infected", "with", "GAS", "WT", "for", "4", "h", ",", "fixed", ",", "and", "immunostained", "for", "ubiquitin", ".", "Percentages", "of", "cells", "with", "LC3", "(", "M", ")", "or", "ubiquitin", "(", "N", ")", "-", "positive", "GAS", "were", "quantified", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5D HeLa WT or FBXO2-KO cells transfected with mCherry-Gal3 (magenta) were infected with WT GAS for 2 or 4 h, and percentages of Gal3-positive GAS-containing cells were quantified.E - J Localization of ubiquitin, LC3 and p62 in FBXO2 KO cells. HeLa WT or FBXO2-KO cells were infected with WT GAS for 4 h, fixed, and immunostained for ubiquitin (FK2: magenta) or LC3 (magenta) or p62 (magenta). Representative confocal images (E, G, and I) and percentages of cells with ubiquitin, LC3, or p62 -positive GAS (F, H, and J).M, N GlcNAc recognition of FBXO2 required for GAS xenophagy. Non-transfected HeLa WT cells and HeLa FBXO2-KO cells transfected GFP, GFP-FBXO2, GFP-FBXO2 YW/AA were infected with GAS WT for 4 h, fixed, and immunostained for ubiquitin. Percentages of cells with LC3 (M) or ubiquitin (N) -positive GAS were quantified."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "C", "Recruitment", "of", "LC3", "and", "ubiquitin", "to", "intracellular", "GAS", "in", "SKP1", "/", "CUL1", "/", "ROC1", "knockdown", "cells", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "mCherry", "-", "LC3", "(", "magenta", ")", "and", "the", "indicated", "siRNAs", "were", "infected", "with", "GAS", "for", "4", "h", ".", "Cells", "were", "immunostained", "for", "ubiquitin", "(", "FK2", ")", ";", "scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Representative", "confocal", "images", "(", "A", ")", "and", "percentages", "of", "cells", "with", "ubiquitin", "(", "B", ")", "and", "LC3", "(", "C", ")", "-", "positive", "GAS", ".", "D", ",", "E", "Neddylated", "cullin", "inhibitor", ":", "MLN4924", "-", "treated", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "WT", "GAS", ",", "and", "fixed", "at", "4", "h", ".", "Cells", "were", "immunostained", "for", "ubiquitin", "(", "FK2", ":", "magenta", ")", "or", "LC3", "(", "magenta", ")", ";", "scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "cells", "with", "ubiquitin", "-", "positive", "GAS", "(", "D", ")", "and", "LC3", "-", "positive", "GAS", "(", "E", ")", ".", "F", "Lysates", "from", "HeLa", "cells", "infected", "with", "GAS", "were", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "lipoteichoic", "acid", "antibody", "and", "Protein", "G", "-", "Magnetic", "Beads", ".", "Immunoprecipitates", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-C Recruitment of LC3 and ubiquitin to intracellular GAS in SKP1/CUL1/ROC1 knockdown cells. HeLa cells transfected with mCherry-LC3 (magenta) and the indicated siRNAs were infected with GAS for 4 h. Cells were immunostained for ubiquitin (FK2); scale bar, 10 μm. Representative confocal images (A) and percentages of cells with ubiquitin (B) and LC3 (C) -positive GAS.D, E Neddylated cullin inhibitor: MLN4924-treated HeLa cells were infected with WT GAS, and fixed at 4 h. Cells were immunostained for ubiquitin (FK2: magenta) or LC3 (magenta); scale bar, 10 μm. Representative images and quantification of cells with ubiquitin-positive GAS (D) and LC3-positive GAS (E).F Lysates from HeLa cells infected with GAS were immunoprecipitated with an anti-lipoteichoic acid antibody and Protein G-Magnetic Beads. Immunoprecipitates were analyzed by immunoblotting."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "BMDMs", "were", "treated", "with", "E", ".", "coli", "(", "MOI", "=", "100", ")", "for", "30", "minutes", "and", "further", "cultured", "for", "various", "length", "of", "time", "as", "indicated", ".", "The", "dynamic", "of", "ENT3", "expression", "was", "determined", "by", "measuring", "Slc29a3", "transcripts", "via", "RT", "-", "qPCR", ".", "(", "B", ")", "Phagocytosis", "inhibitor", ",", "Cytochalasin", "D", "(", "CytoD", ")", ",", "pretreated", "BMDMs", "were", "incubated", "with", "E", ".", "coli", "(", "MOI", "=", "100", ")", "and", "subjected", "for", "Slc29a3", "expression", "analysis", "via", "RT", "-", "qPCR", "6", "hours", "post", "-", "infection", ".", "Data", "information", ":", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "as", "1", ".", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", ")", "Different", "bacterial", "components", "were", "applied", "as", "stimulants", "to", "BMDMs", ".", "Slc29a3", "expression", "was", "analyzed", "after", "30", "minutes", "of", "stimulation", "and", "a", "total", "of", "6", "hours", "incubation", ".", "(", "E", ")", "BMDMs", "were", "treated", "with", "different", "doses", "of", "LPS", "for", "30", "minutes", ",", "harvested", "6", "hours", "post", "-", "stimulation", ",", "and", "subjected", "for", "RT", "-", "qPCR", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "as", "1", ".", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) BMDMs were treated with E. coli (MOI=100) for 30 minutes and further cultured for various length of time as indicated. The dynamic of ENT3 expression was determined by measuring Slc29a3 transcripts via RT-qPCR. (B) Phagocytosis inhibitor, Cytochalasin D (CytoD), pretreated BMDMs were incubated with E. coli (MOI=100) and subjected for Slc29a3 expression analysis via RT-qPCR 6 hours post-infection. Data information: The expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group as 1. The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(D) Different bacterial components were applied as stimulants to BMDMs. Slc29a3 expression was analyzed after 30 minutes of stimulation and a total of 6 hours incubation. (E) BMDMs were treated with different doses of LPS for 30 minutes, harvested 6 hours post-stimulation, and subjected for RT-qPCR analysis. Data information: The expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group as 1. The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "WT", "or", "(", "D", ")", "MyD88", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "stimulated", "with", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", "or", "live", "E", ".", "coli", "(", "MOI", "=", "100", ")", "in", "the", "presence", "of", "10", "µM", "TBK", "inhibitor", ",", "MRT", "67307", ",", "and", "analyzed", "for", "Slc29a3", "expression", ".", "Data", "information", ":", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "E", ")", "The", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", "-", "treated", "BMDMs", "were", "examined", "for", "Ifnb1", "expression", "after", "30", "minutes", "of", "stimulation", "and", "a", "total", "of", "6", "hours", "incubation", ".", "Data", "information", ":", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "F", ")", "BMDMs", "were", "treated", "with", "100", "U", "/", "ml", "of", "IFN", "-", "β", "for", "various", "length", "of", "time", "and", "subjected", "for", "Slc29a3", "expression", ".", "Data", "information", ":", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) WT or (D) MyD88-/- BMDMs were stimulated with 10 ng/ml LPS or live E. coli (MOI=100) in the presence of 10 µM TBK inhibitor, MRT 67307, and analyzed for Slc29a3 expression. Data information: The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(E) The 10 ng/ml LPS-treated BMDMs were examined for Ifnb1 expression after 30 minutes of stimulation and a total of 6 hours incubation. Data information: The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(F) BMDMs were treated with 100 U/ml of IFN-β for various length of time and subjected for Slc29a3 expression. Data information: The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", "-", "E", ")", "BMDMs", "from", "WT", ",", "IFNAR1", "-", "/", "-", "(", "B", ")", ",", "or", "STAT1", "-", "/", "-", "(", "C", ")", "mice", "were", "treated", "with", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", ",", "live", "E", ".", "coli", "(", "MOI", "=", "100", ")", ",", "or", "100", "U", "/", "ml", "IFN", "-", "β", ",", "harvested", "and", "examined", "for", "Slc29a3", "induction", ".", "BMDMs", "from", "WT", ",", "IFNAR1", "-", "/", "-", "(", "D", ")", "or", "STAT1", "-", "/", "-", "(", "E", ")", "mice", "were", "treated", "with", "100", "U", "/", "ml", "IFN", "-", "β", ",", "50", "µg", "/", "ml", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ",", "or", "EMCV", "(", "MOI", "=", "10", ")", ",", "harvested", "and", "examined", "for", "Slc29a3", "induction", ".", "Data", "information", ":", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "as", "1", ".", "The", "results", "shown", "in", "B", "to", "E", "are", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "The", "expression", "dynamic", "of", "Slc29a3", "was", "profiled", "in", "BMDMs", "treated", "with", "two", "different", "doses", "of", "IFN", "-", "α", "(", "F", ")", ",", "IFN", "-", "β", "(", "G", ")", ",", "IFN", "-", "γ", "(", "H", ")", "for", "various", "length", "of", "time", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "as", "1", ".", "The", "results", "shown", "in", "F", "to", "H", "from", "two", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B-E) BMDMs from WT, IFNAR1-/- (B), or STAT1-/- (C) mice were treated with 10 ng/ml LPS, live E. coli (MOI=100), or 100 U/ml IFN-β, harvested and examined for Slc29a3 induction. BMDMs from WT, IFNAR1-/- (D) or STAT1-/- (E) mice were treated with 100 U/ml IFN-β, 50 µg/ml poly(I:C), or EMCV (MOI=10), harvested and examined for Slc29a3 induction. Data information: The expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group as 1. The results shown in B to E are from three biological replicates (n=3) Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(F-H) The expression dynamic of Slc29a3 was profiled in BMDMs treated with two different doses of IFN-α (F), IFN-β (G), IFN-γ (H) for various length of time as indicated. Data information: The expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group as 1. The results shown in F to H from two biological replicates (n=2). Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "induction", "fold", "change", "(", "treated", "/", "untreated", ")", "of", "Slc29a3", "and", "selected", "ISG", "transcripts", "were", "curated", "from", "INTERFEROME", "database", ".", "Shown", "is", "data", "extracted", "from", "250", "IU", "/", "ml", "IFN", "-", "β", "treated", "BMDMs", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Primers", "targeting", "3", "'", "flanking", "region", "2", "(", "D", ")", ",", "3", "'", "flanking", "region", "1", "(", "E", ")", ",", "and", "promoter", "region", "(", "F", ")", "were", "used", "to", "quantify", "the", "STAT1", "binding", "in", "BMDMs", "upon", "100", "U", "/", "ml", "IFN", "-", "β", "after", "4", "hour", "stimulation", "via", "qChIP", "assay", ".", "Data", "information", ":", "The", "results", "in", "D", "-", "F", "were", "generated", "from", "two", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "2", ")", "with", "four", "technical", "repeats", "each", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "One", "representative", "example", "is", "shown", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The induction fold change (treated/untreated) of Slc29a3 and selected ISG transcripts were curated from INTERFEROME database. Shown is data extracted from 250 IU/ml IFN-β treated BMDMs. Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(D-F) Primers targeting 3' flanking region 2 (D), 3' flanking region 1 (E), and promoter region (F) were used to quantify the STAT1 binding in BMDMs upon 100 U/ml IFN-β after 4 hour stimulation via qChIP assay. Data information: The results in D-F were generated from two biological replicates (n=2) with four technical repeats each (n=4). One representative example is shown. Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "(", "A", ")", "BMDMs", "were", "infected", "with", "EMCV", "(", "MOI", "=", "10", ")", "and", "harvested", "at", "indicated", "time", "points", ".", "(", "B", ")", "THP", "-", "1", "derived", "macrophages", "were", "challenged", "with", "EV71", "(", "MOI", "=", "5", ")", "and", "collected", "at", "different", "time", "points", ".", "(", "C", ")", "BMDMs", "were", "co", "-", "cultured", "with", "50", "µg", "/", "ml", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "with", "various", "length", "of", "time", "and", "harvested", ".", "The", "mRNA", "expression", "of", "Slc29a3", "or", "SLC29A3", "was", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "or", "RPLP0", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "at", "time", "0", "as", "1", ".", "Results", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "ENT3fl", "/", "fl", "and", "Cx3cr1cre", "/", "+", "ENT3fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "12", ")", "were", "challenged", "with", "EMCV", "(", "104", "PFU", ",", "i", ".", "p", ".", ")", "and", "monitored", "for", "the", "survival", "(", "D", ")", "and", "disease", "severity", "(", "E", ")", "for", "two", "weeks", ".", "Survival", "results", "were", "analyzed", "by", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "ENT3fl", "/", "fl", "and", "Cx3cr1cre", "/", "+", "ENT3fl", "/", "fl", "mice", "were", "challenged", "with", "107", "PFU", "EMCV", "and", "measured", "the", "viral", "titer", "in", "the", "brain", "at", "post", "-", "infection", "day", "3", "by", "plaque", "assay", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Shown", "are", "representative", "plaque", "assay", "images", "(", "F", ")", "and", "the", "quantification", "(", "G", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) (A) BMDMs were infected with EMCV (MOI=10) and harvested at indicated time points. (B) THP-1 derived macrophages were challenged with EV71 (MOI=5) and collected at different time points. (C) BMDMs were co-cultured with 50 µg/ml poly (I:C) with various length of time and harvested. The mRNA expression of Slc29a3 or SLC29A3 was measured by RT-qPCR. The expression level was calculated relative to Rpl19 or RPLP0 and normalized to untreated group at time 0 as 1. Results are combined from three biological replicates (n=3) Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(D, E) ENT3fl/fl and Cx3cr1cre/+ENT3fl/fl mice (n=12) were challenged with EMCV (104 PFU, i.p.) and monitored for the survival (D) and disease severity (E) for two weeks. Survival results were analyzed by log-rank (Mantel-Cox) test, *p < 0.05. Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(F, G) ENT3fl/fl and Cx3cr1cre/+ENT3fl/fl mice were challenged with 107 PFU EMCV and measured the viral titer in the brain at post-infection day 3 by plaque assay (n=6). Shown are representative plaque assay images (F) and the quantification (G). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "infected", "with", "EMCV", "(", "MOI", "=", "10", ")", ",", "and", "the", "culture", "supernatants", "were", "harvested", "24", "hours", "post", "-", "infection", "to", "measure", "the", "production", "of", "IFN", "-", "α", ",", "IFN", "-", "β", ",", "and", "IFN", "-", "γ", "by", "ELISA", ".", "Shown", "are", "combined", "results", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "The", "combined", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "The", "mitochondrial", "respiratory", "capacity", "(", "D", ")", "and", "glycolysis", "capacity", "(", "E", ")", "of", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "treated", "with", "1000", "U", "/", "ml", "IFN", "-", "β", "for", "6", "hours", "were", "measured", "by", "extracellular", "flux", "analysis", ".", "Shown", "are", "the", "representative", "results", "of", "OCR", "and", "ECAR", "kinetics", "from", "six", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "The", "combined", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "The", "replication", "of", "EMCV", "in", "WT", "(", "G", ")", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "(", "H", ")", "were", "evaluated", "in", "the", "presence", "of", "exogenous", "1", "or", "10", "µM", "of", "ribonucleosides", "(", "A", ",", "U", ",", "C", ",", "G", ")", "9", "hours", "post", "-", "infection", "(", "MOI", "=", "10", ")", ".", "The", "expression", "of", "EMCV", "-", "2A2B", "was", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Shown", "are", "results", "from", "three", "to", "four", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", "-", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "G", ",", "H", ")", "the", "EMCV", "-", "2A2B", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "at", "time", "0", "as", "1", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "The", "combined", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) WT and ENT3-/- BMDMs were infected with EMCV (MOI=10), and the culture supernatants were harvested 24 hours post-infection to measure the production of IFN-α, IFN-β, and IFN-γ by ELISA. Shown are combined results from three biological replicates (n=3). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, ***p < 0.001. n.s. no significance. The combined data are shown as mean ± SEM.(D, E) The mitochondrial respiratory capacity (D) and glycolysis capacity (E) of WT and ENT3-/- BMDMs treated with 1000 U/ml IFN-β for 6 hours were measured by extracellular flux analysis. Shown are the representative results of OCR and ECAR kinetics from six biological replicates (n=6). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, ***p < 0.001. n.s. no significance. The combined data are shown as mean ± SEM.(G, H) The replication of EMCV in WT (G) and ENT3-/- BMDMs (H) were evaluated in the presence of exogenous 1 or 10 µM of ribonucleosides (A, U, C, G) 9 hours post-infection (MOI=10). The expression of EMCV-2A2B was determined by RT-qPCR. Shown are results from three to four biological replicates (n=3-4). Data information: In G, H) the EMCV-2A2B expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group at time 0 as 1. Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, ***p < 0.001. n.s. no significance. The combined data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Illustration", "of", "strategy", "to", "track", "the", "viral", "uncoating", "upon", "infection", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "(", "B", ")", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Syto82", "-", "labeled", "EMCV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "and", "subjected", "to", "live", "imagining", "30", ",", "60", "and", "90", "minutes", "post", "-", "infection", ".", "The", "arrowheads", "indicated", "the", "Syto82", "+", "virus", "puncta", "in", "the", "cell", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "Syto82", "signal", "in", "BMDMs", "after", "60", "minutes", "was", "performed", "by", "enumerating", "Syto82", "+", "cells", "(", "%", ")", "and", "(", "D", ")", "the", "mean", "fluorescent", "intensity", "(", "MFI", ")", "per", "Syto82", "+", "cell", "(", "D", ")", ".", "Results", "were", "generated", "from", "images", "of", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "each", "with", "4", "fields", "analyzed", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "E", ")", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Syto82", "-", "labeled", "EMCV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "and", "co", "-", "stained", "with", "100", "nM", "Lysotracker", "Green", ",", "subjected", "to", "live", "imagining", "60", "minutes", "post", "-", "infection", ".", "Data", "were", "the", "representative", "images", "of", "two", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "5", "µm", ".", "(", "F", ")", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "infected", "with", "EMCV", "(", "MOI", "=", "10", ")", "for", "2", "hours", "and", "then", "enriched", "the", "endosomes", "and", "lysosomes", ".", "EMCV", "particles", "in", "endosome", "-", "or", "lysosome", "-", "enriched", "fractions", "were", "quantified", "by", "plaque", "assay", ".", "Shown", "are", "combined", "results", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "G", "-", "K", ")", "(", "G", ")", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "original", "strain", "or", "delta", "variant", "at", "MOI", "=", "0", ".", "1", "for", "48", "hours", ",", "harvested", ",", "and", "examined", "for", "SLC29A3", "induction", ".", "(", "H", ")", "ENT3", "knockdown", "in", "Calu", "-", "3", "cells", "was", "performed", "by", "lentiviral", "shRNA", "system", ".", "The", "knockdown", "efficiency", "was", "confirmed", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "ENT3", "knockdown", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "delta", "variant", "and", "subjected", "for", "the", "viral", "replication", "analysis", "24", "hours", "post", "-", "infection", ".", "The", "virus", "released", "out", "of", "cells", "was", "measured", "by", "plaque", "assay", "(", "I", ")", ",", "and", "the", "viral", "titer", "in", "the", "cells", "was", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", "(", "J", ")", ".", "(", "K", ")", "The", "replication", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "delta", "variant", "in", "scramble", "and", "ENT3", "knockdown", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "evaluated", "in", "the", "presence", "of", "exogenous", "1", "or", "10", "µM", "of", "ribonucleosides", "(", "A", ",", "U", ",", "C", ",", "G", ")", "24", "hours", "post", "-", "infection", "(", "MOI", "=", "0", ".", "1", ")", ".", "The", "SLC29A3", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "RPLP0", "and", "normalized", "to", "control", "as", "1", ".", "The", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "E", "gene", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "RPLP0", "to", "normalize", "the", "cell", "number", ".", "Shown", "are", "combined", "results", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Illustration of strategy to track the viral uncoating upon infection. (B-D) (B) WT and ENT3-/- BMDMs were infected with Syto82-labeled EMCV (MOI=1) and subjected to live imagining 30, 60 and 90 minutes post-infection. The arrowheads indicated the Syto82+ virus puncta in the cell. Scale bars represent 10 µm. (C) Quantification of Syto82 signal in BMDMs after 60 minutes was performed by enumerating Syto82+ cells (%) and (D) the mean fluorescent intensity (MFI) per Syto82+ cell (D). Results were generated from images of three biological replicates (n=3), each with 4 fields analyzed. Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(E) WT and ENT3-/- BMDMs were infected with Syto82-labeled EMCV (MOI=1) and co-stained with 100 nM Lysotracker Green, subjected to live imagining 60 minutes post-infection. Data were the representative images of two biological replicates (n=2). Scale bars represent 5 µm. (F) WT and ENT3-/- BMDMs were infected with EMCV (MOI=10) for 2 hours and then enriched the endosomes and lysosomes. EMCV particles in endosome- or lysosome-enriched fractions were quantified by plaque assay. Shown are combined results from three biological replicates (n=3). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(G-K) (G) Calu-3 cells were infected with SARS-CoV-2 original strain or delta variant at MOI=0.1 for 48 hours, harvested, and examined for SLC29A3 induction. (H) ENT3 knockdown in Calu-3 cells was performed by lentiviral shRNA system. The knockdown efficiency was confirmed by RT-qPCR. ENT3 knockdown Calu-3 cells were infected with SARS-CoV-2 delta variant and subjected for the viral replication analysis 24 hours post-infection. The virus released out of cells was measured by plaque assay (I), and the viral titer in the cells was measured by RT-qPCR (J). (K) The replication of SARS-CoV-2 delta variant in scramble and ENT3 knockdown Calu-3 cells were evaluated in the presence of exogenous 1 or 10 µM of ribonucleosides (A, U, C, G) 24 hours post-infection (MOI=0.1). The SLC29A3 expression level was calculated relative to RPLP0 and normalized to control as 1. The SARS-CoV-2 E gene expression level was calculated relative to RPLP0 to normalize the cell number. Shown are combined results from three biological replicates (n=3). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "1B", "(", "Top", ")", "Semiquantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "UPF1SL", "or", "UPF1LL", "transcript", "levels", "following", "transfection", "of", "HEK", "-", "293", "cells", "with", "a", "NT", "siRNA", "or", "a", "siRNA", "that", "specifically", "targets", "the", "UPF1LL", "isoform", ".", "(", "Bottom", ")", "Venn", "diagram", "(", "to", "scale", ")", "of", "overlapping", "targets", "identified", "from", "RNA", "-", "seq", "following", "total", "UPF1", "or", "UPF1LL", "-", "specific", "knockdown", ".", "Depicted", "are", "genes", "that", "increased", "in", "abundance", "at", "least", "1", ".", "4", "-", "fold", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "met", "read", "count", "cutoffs", "in", "both", "datasets", ".", "P", "value", "indicates", "enrichment", "of", "genes", "that", "increased", "in", "abundance", "at", "least", "1", ".", "4", "-", "fold", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", ")", "with", "UPF1LL", "-", "specific", "knockdown", "among", "those", "regulated", "by", "total", "UPF1", ",", "as", "determined", "by", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "C", "Heat", "map", "of", "changes", "in", "relative", "mRNA", "abundance", "for", "genes", "encoding", "NMD", "factors", ",", "as", "determined", "from", "RNA", "-", "seq", "following", "transfection", "of", "HEK", "-", "293", "cells", "with", "a", "siRNA", "that", "targets", "both", "UPF1", "isoforms", "(", "UPF1total", ")", "or", "a", "siRNA", "that", "specifically", "targets", "the", "UPF1LL", "isoform", ".", "D", "Density", "plot", "of", "changes", "in", "relative", "mRNA", "abundance", "as", "determined", "by", "RNA", "-", "seq", "in", "SMG7ko", "/", "SMG6kd", "cells", ",", "relative", "to", "a", "parental", "cell", "line", "treated", "with", "control", "siRNAs", "Genes", "were", "categorized", "as", "up", "-", "regulated", "by", "siUPF1total", "only", ",", "siUPF1LL", "only", ",", "or", "both", "siUPF1total", "and", "siUPF1LL", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "K", "-", "W", "test", ",", "with", "Dunn", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", ".", "E", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "following", "transfection", "of", "HEK", "-", "293", "cells", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "Relative", "fold", "changes", "are", "in", "reference", "to", "NT", "siRNA", ".", "Asterisk", "(", "*", ")", "indicates", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "as", "determined", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Black", "dots", "represent", "individual", "data", "points", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Dashed", "line", "indicates", "log2", "(", "fold", "change", ")", "of", "+", "0", ".", "5", ".", "PTC", "+", "indicates", "the", "use", "of", "primers", "specific", "to", "transcript", "isoforms", "with", "validated", "poison", "exonsF", "Gene", "ontology", "analysis", "of", "1621", "genes", "that", "increased", "in", "expression", "at", "least", "1", ".", "4", "-", "fold", "upon", "UPF1LL", "-", "specific", "knockdown", "in", "HEK", "-", "293", "cells", "under", "normal", "cellular", "conditions", ".", "Genes", "may", "map", "to", "multiple", "categories", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B (Top) Semiquantitative RT-PCR of UPF1SL or UPF1LL transcript levels following transfection of HEK-293 cells with a NT siRNA or a siRNA that specifically targets the UPF1LL isoform. (Bottom) Venn diagram (to scale) of overlapping targets identified from RNA-seq following total UPF1 or UPF1LL-specific knockdown. Depicted are genes that increased in abundance at least 1.4-fold (FDR < 0.05) and met read count cutoffs in both datasets. P value indicates enrichment of genes that increased in abundance at least 1.4-fold (FDR < 0.05) with UPF1LL-specific knockdown among those regulated by total UPF1, as determined by Fisher's exact test.C Heat map of changes in relative mRNA abundance for genes encoding NMD factors, as determined from RNA-seq following transfection of HEK-293 cells with a siRNA that targets both UPF1 isoforms (UPF1total) or a siRNA that specifically targets the UPF1LL isoform.D Density plot of changes in relative mRNA abundance as determined by RNA-seq in SMG7ko/SMG6kd cells, relative to a parental cell line treated with control siRNAs Genes were categorized as up-regulated by siUPF1total only, siUPF1LL only, or both siUPF1total and siUPF1LL. Statistical significance was determined by K-W test, with Dunn's correction for multiple comparisons.E RT-qPCR analysis of indicated transcripts following transfection of HEK-293 cells with the indicated siRNAs. Relative fold changes are in reference to NT siRNA. Asterisk (*) indicates P < 0.05, as determined by two-way ANOVA. Black dots represent individual data points and error bars indicate mean±SD (n = 3 biological replicates). Dashed line indicates log2(fold change) of +0.5. PTC+ indicates the use of primers specific to transcript isoforms with validated poison exonsF Gene ontology analysis of 1621 genes that increased in expression at least 1.4-fold upon UPF1LL-specific knockdown in HEK-293 cells under normal cellular conditions. Genes may map to multiple categories."}
{"words": ["Figure", "2B", "Scatterplot", "of", "CLIP", "-", "UPF1LL", "vs", "CLIP", "-", "UPF1SL", "RIP", "-", "seq", "efficiency", ".", "mRNAs", "were", "binned", "according", "to", "3", "'", "UTR", "length", "(", "short", ",", "medium", ",", "or", "long", ")", ".", "C", "Density", "plot", "of", "recovered", "mRNAs", "in", "CLIP", "-", "UPF1LL", "or", "CLIP", "-", "UPF1SL", "affinity", "purifications", ".", "mRNAs", "were", "binned", "according", "to", "3", "'", "UTR", "length", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "K", "-", "S", "test", ".", "D", "Density", "plot", "of", "recovered", "mRNAs", "in", "CLIP", "-", "UPF1LL", "affinity", "purifications", "relative", "to", "that", "of", "CLIP", "-", "UPF1SL", ".", "mRNAs", "were", "subdivided", "by", "PTBP1", "and", "/", "or", "hnRNP", "L", "motif", "density", "within", "the", "3", "'", "UTR", ",", "as", "indicated", "by", "the", "gradient", "triangle", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "K", "-", "W", "test", ",", "with", "Dunn", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", ".", "E", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "from", "CLIP", "-", "UPF1", "overexpression", "RNA", "-", "seq", "experiments", ".", "Relative", "fold", "changes", "are", "in", "reference", "to", "the", "GFP", "expressing", "control", "line", ".", "Significance", "of", "CLIP", "-", "UPF1SL", "or", "CLIP", "-", "UPF1LL", "overexpression", "was", "compared", "to", "the", "GFP", "expressing", "control", "line", ".", "Asterisk", "(", "*", ")", "indicates", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "as", "determined", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Black", "dots", "represent", "individual", "data", "points", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "log2", "(", "fold", "change", ")", "of", "±", "0", ".", "5", ".", "For", "protected", "mRNAs", ",", "the", "motif", "density", "of", "PTBP1", "/", "hnRNP", "L", "within", "the", "3", "'", "UTR", "is", "indicated", ".", "PTC", "+", "indicates", "the", "use", "of", "primers", "specific", "to", "transcript", "isoforms", "with", "validated", "poison"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Scatterplot of CLIP-UPF1LL vs CLIP-UPF1SL RIP-seq efficiency. mRNAs were binned according to 3'UTR length (short, medium, or long).C Density plot of recovered mRNAs in CLIP-UPF1LL or CLIP-UPF1SL affinity purifications. mRNAs were binned according to 3'UTR length. Statistical significance was determined by K-S test.D Density plot of recovered mRNAs in CLIP-UPF1LL affinity purifications relative to that of CLIP-UPF1SL. mRNAs were subdivided by PTBP1 and/or hnRNP L motif density within the 3'UTR, as indicated by the gradient triangle. Statistical significance was determined by K-W test, with Dunn's correction for multiple comparisons.E RT-qPCR analysis of indicated transcripts from CLIP-UPF1 overexpression RNA-seq experiments. Relative fold changes are in reference to the GFP expressing control line. Significance of CLIP-UPF1SL or CLIP-UPF1LL overexpression was compared to the GFP expressing control line. Asterisk (*) indicates P < 0.05, as determined by two-way ANOVA. Black dots represent individual data points and error bars indicate mean±SD (n = 3 biological replicates). Dashed lines indicate log2(fold change) of ±0.5. For protected mRNAs, the motif density of PTBP1/hnRNP L within the 3'UTR is indicated. PTC+ indicates the use of primers specific to transcript isoforms with validated poison exons"}
{"words": ["Figure", "3A", "Semiquantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "UPF1SL", "or", "UPF1LL", "transcript", "levels", "following", "transfection", "of", "HEK", "-", "293", "cells", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "B", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "following", "transfection", "of", "a", "NT", "siRNA", "or", "SRSF1", "-", "specific", "siRNA", "under", "conditions", "of", "CLIP", "-", "UPF1SL", "or", "CLIP", "-", "UPF1LL", "overexpression", ".", "Relative", "fold", "changes", "are", "in", "reference", "to", "the", "GFP", "expressing", "control", "line", "treated", "with", "a", "NT", "siRNA", ".", "Asterisk", "(", "*", ")", "indicates", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Black", "dots", "represent", "individual", "data", "points", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "C", "Density", "plot", "of", "changes", "in", "relative", "mRNA", "abundance", "as", "determined", "by", "RNA", "-", "seq", "following", "SRSF1", "overexpression", "Genes", "were", "categorized", "as", "up", "-", "regulated", "by", "siUPF1total", "only", ",", "siUPF1LL", "only", ",", "or", "both", "siUPF1total", "and", "siUPF1LL", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "K", "-", "W", "test", ",", "with", "Dunn", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", ".", "D", "Density", "plot", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "with", "genes", "binned", "according", "to", "enrichment", "in", "the", "CLIP", "-", "UPF1LL", "or", "CLIP", "-", "UPF1SL", "affinity", "purifications", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Semiquantitative RT-PCR of UPF1SL or UPF1LL transcript levels following transfection of HEK-293 cells with the indicated siRNAs.B RT-qPCR analysis of indicated transcripts following transfection of a NT siRNA or SRSF1-specific siRNA under conditions of CLIP-UPF1SL or CLIP-UPF1LL overexpression. Relative fold changes are in reference to the GFP expressing control line treated with a NT siRNA. Asterisk (*) indicates P < 0.05, as determined by unpaired Student's t-test. Black dots represent individual data points and error bars indicate mean±SD (n = 3 biological replicates).C Density plot of changes in relative mRNA abundance as determined by RNA-seq following SRSF1 overexpression Genes were categorized as up-regulated by siUPF1total only, siUPF1LL only, or both siUPF1total and siUPF1LL. Statistical significance was determined by K-W test, with Dunn's correction for multiple comparisons.D Density plot as in (C), with genes binned according to enrichment in the CLIP-UPF1LL or CLIP-UPF1SL affinity purifications."}
{"words": ["Figure", "4B", "UPF1SLΔCH", "translocation", "along", "an", "RNA", "substrate", "harboring", "a", "high", "-", "affinity", "PTBP1", "binding", "site", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "PTBP1", ".", "Time", "to", "50", "%", "unwound", "and", "relative", "total", "%", "unwound", "at", "end", "-", "of", "-", "assay", "(", "1200", "sec", ")", "are", "indicated", ".", "Results", "of", "four", "technical", "replicates", "are", "shown", "for", "each", "dataset", "and", "represent", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Shaded", "region", "indicates", "SD", ".", "C", "Results", "as", "in", "(", "B", ")", "but", "with", "UPF1LLΔCH", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B UPF1SLΔCH translocation along an RNA substrate harboring a high-affinity PTBP1 binding site in the absence and presence of PTBP1. Time to 50% unwound and relative total % unwound at end-of-assay (1200 sec) are indicated. Results of four technical replicates are shown for each dataset and represent at least three independent experiments. Shaded region indicates SD. C Results as in (B) but with UPF1LLΔCH."}
{"words": ["Figure", "5B", "Density", "plots", "of", "changes", "in", "relative", "mRNA", "abundance", "as", "determined", "by", "RNA", "-", "seq", "following", "treatment", "of", "HEK", "-", "293", "cells", "with", "1", "µM", "thapsigargin", "for", "6hr", "(", "left", ")", "or", "9hr", "(", "right", ")", ".", "Genes", "were", "categorized", "as", "up", "-", "regulated", "by", "siUPF1total", "only", "or", "siUPF1LL", "only", "under", "basal", "conditions", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "K", "-", "W", "test", ",", "with", "Dunn", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", ".", "D", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "following", "transfection", "of", "HEK", "-", "293", "cells", "with", "indicated", "siRNAs", "and", "treatment", "with", "1", "µM", "thapsigargin", "for", "6hr", ".", "Relative", "fold", "changes", "are", "in", "reference", "to", "vehicle", "-", "treated", ",", "NT", "siRNA", ".", "Black", "dots", "represent", "individual", "data", "points", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "log2", "(", "fold", "change", ")", "of", "±", "0", ".", "5", ".", "PTC", "+", "indicates", "the", "use", "of", "primers", "specific", "to", "transcript", "isoforms", "with", "validated", "poison"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Density plots of changes in relative mRNA abundance as determined by RNA-seq following treatment of HEK-293 cells with 1 µM thapsigargin for 6hr (left) or 9hr (right). Genes were categorized as up-regulated by siUPF1total only or siUPF1LL only under basal conditions. Statistical significance was determined by K-W test, with Dunn's correction for multiple comparisons.D RT-qPCR analysis of indicated transcripts following transfection of HEK-293 cells with indicated siRNAs and treatment with 1 µM thapsigargin for 6hr. Relative fold changes are in reference to vehicle-treated, NT siRNA. Black dots represent individual data points and error bars indicate mean±SD (n = 3 biological replicates). Dashed lines indicate log2(fold change) of ±0.5. PTC+ indicates the use of primers specific to transcript isoforms with validated poison exons"}
{"words": ["Figure", "6C", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "following", "transfection", "of", "HEK", "-", "293", "cells", "with", "indicated", "siRNAs", "and", "treatment", "with", "50", "µg", "/", "mL", "puromycin", "for", "4hr", ".", "Relative", "fold", "changes", "are", "in", "reference", "to", "vehicle", "-", "treated", ",", "NT", "siRNA", ".", "Black", "dots", "represent", "individual", "data", "points", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "log2", "(", "fold", "change", ")", "of", "±", "0", ".", "5", ".", "PTC", "+", "indicates", "the", "use", "of", "primers", "specific", "to", "transcript", "isoforms", "with", "validated", "poison"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C RT-qPCR analysis of indicated transcripts following transfection of HEK-293 cells with indicated siRNAs and treatment with 50 µg/mL puromycin for 4hr. Relative fold changes are in reference to vehicle-treated, NT siRNA. Black dots represent individual data points and error bars indicate mean±SD (n = 3 biological replicates). Dashed lines indicate log2(fold change) of ±0.5. PTC+ indicates the use of primers specific to transcript isoforms with validated poison exons"}
{"words": ["Figure", "7A", "mRNA", "decay", "measurement", "using", "Roadblock", "-", "qPCR", "RNA", "was", "isolated", "from", "HEK", "-", "293", "cells", "at", "indicated", "timepoints", "following", "transfection", "with", "indicated", "siRNAs", "and", "treatment", "with", "400", "µM", "4sU", "and", "50", "µg", "/", "mL", "puromycin", ".", "mRNA", "half", "-", "lives", "were", "estimated", "by", "fitting", "the", "data", "to", "a", "single", "-", "phase", "exponential", "decay", "model", ".", "Puromycin", "treatment", "was", "compared", "to", "the", "vehicle", "control", "and", "siUPF1LL", "was", "compared", "to", "the", "siNT", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "puromycin", "treatment", "using", "the", "extra", "-", "sum", "-", "of", "-", "squares", "F", "test", ".", "Error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "B", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "following", "transfection", "of", "HEK", "-", "293", "cells", "with", "indicated", "siRNAs", "and", "treatment", "with", "50", "µg", "/", "mL", "puromycin", "for", "4hr", ".", "Relative", "fold", "changes", "are", "in", "reference", "to", "vehicle", "-", "treated", ",", "NT", "siRNA", ".", "Black", "dots", "represent", "individual", "data", "points", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "log2", "(", "fold", "change", ")", "of", "±", "0", ".", "5", ".", "PTC", "+", "indicates", "the", "use", "of", "primers", "specific", "to", "transcript", "isoforms", "with", "validated", "poison", "exonsC", "Density", "plot", "of", "changes", "in", "relative", "mRNA", "abundance", "as", "determined", "from", "RNA", "-", "seq", "following", "treatment", "of", "HEK", "-", "293", "cells", "with", "50", "µg", "/", "mL", "of", "puromycin", "for", "4hr", ".", "mRNAs", "were", "subdivided", "by", "PTBP1", "and", "/", "or", "hnRNP", "L", "motif", "density", "within", "the", "first", "400", "nt", "of", "3", "'", "UTR", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "K", "-", "W", "test", ",", "with", "Dunn", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", ".", "D", "Density", "plot", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "following", "UPF1LL", "-", "specific", "knockdown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A mRNA decay measurement using Roadblock-qPCR RNA was isolated from HEK-293 cells at indicated timepoints following transfection with indicated siRNAs and treatment with 400 µM 4sU and 50 µg/mL puromycin. mRNA half-lives were estimated by fitting the data to a single-phase exponential decay model. Puromycin treatment was compared to the vehicle control and siUPF1LL was compared to the siNT in the absence and presence of puromycin treatment using the extra-sum-of-squares F test. Error bars indicate mean±SD (n = 4 biological replicates).B RT-qPCR analysis of indicated transcripts following transfection of HEK-293 cells with indicated siRNAs and treatment with 50 µg/mL puromycin for 4hr. Relative fold changes are in reference to vehicle-treated, NT siRNA. Black dots represent individual data points and error bars indicate mean±SD (n = 3 biological replicates). Dashed lines indicate log2(fold change) of ±0.5. PTC+ indicates the use of primers specific to transcript isoforms with validated poison exonsC Density plot of changes in relative mRNA abundance as determined from RNA-seq following treatment of HEK-293 cells with 50 µg/mL of puromycin for 4hr. mRNAs were subdivided by PTBP1 and/or hnRNP L motif density within the first 400 nt of 3'UTR. Statistical significance was determined by K-W test, with Dunn's correction for multiple comparisons. D Density plot as in (C), following UPF1LL-specific knockdown."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "E", "Echocardiographic", "analysis", "of", "(", "A", ")", "posterior", "wall", "thickness", ",", "(", "B", ")", "septum", "thickness", ",", "(", "C", ")", "left", "ventricle", "end", "diastolic", "diameter", ",", "(", "D", ")", "fractional", "area", "change", "and", "(", "E", ")", "ejection", "fraction", ".", "n", "=", "8", "per", "genotype", ".", "F", "Comparison", "of", "TAZ", "gene", "expression", ",", "normalized", "to", "S12", ",", "in", "heart", ",", "liver", ",", "and", "kidney", ",", "analyzed", "in", "triplicates", "by", "quantitative", "PCR", ".", "n", "=", "5", "per", "genotype", ".", "G", "TAZ", "gene", "expression", "in", "percent", ".", "Wild", "-", "type", "is", "set", "to", "100", "%", ".", "H", ",", "I", "Lipid", "species", "profiles", "of", "cardiolipin", "(", "H", ")", "and", "monolysocardiolipin", "(", "I", ")", "in", "isolated", "cardiac", "mitochondria", "analyzed", "by", "mass", "spectrometry", ".", "n", "=", "4", "per", "genotype", ".", "J", "Comparison", "of", "ratios", "of", "total", "monolysocardiolipin", "and", "cardiolipin", "content", "in", "indicated", "tissues", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-E Echocardiographic analysis of (A) posterior wall thickness, (B) septum thickness, (C) left ventricle end diastolic diameter, (D) fractional area change and (E) ejection fraction. n= 8 per genotype.F Comparison of TAZ gene expression, normalized to S12, in heart, liver, and kidney, analyzed in triplicates by quantitative PCR. n= 5 per genotype.G TAZ gene expression in percent. Wild-type is set to 100%.H, I Lipid species profiles of cardiolipin (H) and monolysocardiolipin (I) in isolated cardiac mitochondria analyzed by mass spectrometry. n= 4 per genotype.J Comparison of ratios of total monolysocardiolipin and cardiolipin content in indicated tissues."}
{"words": ["Figure", "2A", "Periodic", "measurement", "of", "the", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "of", "mitochondria", ",", "isolated", "from", "5", "mice", "per", "genotype", ",", "before", "and", "after", "the", "administration", "of", "the", "indicated", "compounds", "(", "left", ")", ".", "Quantification", "of", "OCR", "in", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "8", "per", "genotype", "(", "right", ")", ".", "B", "OCR", "rates", "of", "cardiac", "mitochondria", "after", "administration", "of", "pyruvate", ",", "malate", "and", "ADP", ",", "n", "=", "7", "per", "genotype", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Periodic measurement of the oxygen consumption rate (OCR) of mitochondria, isolated from 5 mice per genotype, before and after the administration of the indicated compounds (left). Quantification of OCR in independent experiments, n= 8 per genotype (right).B OCR rates of cardiac mitochondria after administration of pyruvate, malate and ADP, n= 7 per genotype."}
{"words": ["Figure", "3A", "Mitochondrial", "membranes", ",", "isolated", "from", "cardiac", "tissue", ",", "were", "solubilized", "in", "1", "%", "digitonin", "and", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", "and", "Western", "-", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "B", "Cardiac", "mitochondria", "were", "prepared", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "analyzed", "on", "a", "large", "pore", "BN", "-", "gel", "for", "better", "resolution", "of", "supercomplexes", ".", "C", "Cardiac", "mitochondria", "were", "solubilized", "in", "0", ".", "4", "%", "DDM", "and", "complexes", "were", "separated", "by", "BN", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "-", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "D", "Mitochondria", "were", "isolated", "from", "kidney", "and", "liver", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "E", "Quantification", "of", "ROS", "production", "over", "time", "in", "cardiac", "mitochondria", "using", "the", "ROS", "-", "specific", "fluorescence", "-", "based", "sensor", "H2DCFDA", ".", "One", "representative", "measurement", "is", "shown", ".", "Analyses", "were", "performed", "in", "triplicates", "and", "confirmed", "for", "three", "animals", "per", "genotype", ".", "Significance", "was", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "T", "-", "TEST", ".", "sh", ",", "shTAZ", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Mitochondrial membranes, isolated from cardiac tissue, were solubilized in 1% digitonin and analyzed by BN-PAGE and Western- blotting with the indicated antibodies.B Cardiac mitochondria were prepared as in (A) and analyzed on a large pore BN-gel for better resolution of supercomplexes.C Cardiac mitochondria were solubilized in 0.4% DDM and complexes were separated by BN-PAGE and analyzed by Western- blotting with the indicated antibodies.D Mitochondria were isolated from kidney and liver and analyzed as in (A).E Quantification of ROS production over time in cardiac mitochondria using the ROS-specific fluorescence-based sensor H2DCFDA. One representative measurement is shown. Analyses were performed in triplicates and confirmed for three animals per genotype. Significance was calculated using Student's T-TEST. sh, shTAZ."}
{"words": ["Figure", "4A", "Enzymatic", "activity", "of", "ubiquinone", "-", "cytochrome", "c", "oxidase", "in", "mitochondria", "isolated", "from", "cardiac", "tissue", ".", "The", "ubiquinone", "analogue", "decylubiquinone", "was", "used", "in", "this", "assay", ".", "Data", "were", "standardized", "to", "malate", "-", "dehydrogenase", "activity", "and", "presented", "as", "percent", "of", "wild", "-", "type", ",", "n", "=", "4", "per", "genotype", ".", "B", "Cytochrome", "c", "reductase", "activity", ",", "standardized", "to", "malate", "-", "dehydrogenase", "activity", "in", "cardiac", "mitochondria", ",", "were", "plotted", "as", "%", "of", "wild", "-", "type", ",", "n", "=", "3", "per", "genotype", ".", "C", "Protein", "levels", "of", "Cox1", "and", "Rieske", "compared", "to", "VDAC3", "in", "three", "different", "dilutions", "of", "isolated", "mitochondria", ",", "separated", "on", "SDS", "gel", "and", "visualized", "by", "Western", "-", "blotting", ".", "D", "Respiratory", "chain", "complexes", "in", "cardiac", "mitochondria", "were", "separated", "on", "BN", "-", "PAGE", "and", "stained", "for", "activity", "of", "complex", "I", ",", "II", ",", "IV", "and", "F1FO", "-", "ATPase", ".", "sh", ",", "shTAZ", ";", "Q", ",", "ubiquinone", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Enzymatic activity of ubiquinone-cytochrome c oxidase in mitochondria isolated from cardiac tissue. The ubiquinone analogue decylubiquinone was used in this assay. Data were standardized to malate-dehydrogenase activity and presented as percent of wild-type, n= 4 per genotype.B Cytochrome c reductase activity, standardized to malate-dehydrogenase activity in cardiac mitochondria, were plotted as % of wild-type, n= 3 per genotype.C Protein levels of Cox1 and Rieske compared to VDAC3 in three different dilutions of isolated mitochondria, separated on SDS gel and visualized by Western-blotting.D Respiratory chain complexes in cardiac mitochondria were separated on BN-PAGE and stained for activity of complex I, II, IV and F1FO- ATPase. sh, shTAZ; Q, ubiquinone."}
{"words": ["Figure", "5A", "Enzymatic", "activity", "of", "the", "succinate", "dehydrogenase", "in", "isolated", "cardiac", "mitochondria", "from", "3", "animals", "per", "genotype", ".", "B", "Mitochondrial", "membranes", "were", "solubilized", "in", "1", "%", "digitonin", "and", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", "and", "Western", "-", "blotting", "using", "antibodies", "against", "SDH", "components", "SDHA", "and", "SDHB", "(", "upper", "panel", ")", ".", "For", "a", "loading", "control", ",", "samples", "were", "separated", "on", "SDS", "gel", "and", "analyzed", "by", "Western", "-", "blotting", "(", "lower", "panel", ")", ".", "C", "Steady", "state", "protein", "levels", "analyzed", "by", "SDS", "gel", "separation", "of", "indicated", "amounts", "of", "mitochondrial", "protein", "and", "subsequent", "Western", "-", "blotting", "with", "antibodies", "against", "SDHA", "and", "VDAC3", "or", "visualizing", "of", "Flavin", "fluorescence", "after", "excitation", "with", "488", "nm", ".", "Lower", "panel", ":", "quantification", "of", "signal", "ratio", "SDHA", "/", "VDAC3", "in", "shTAZ", "and", "control", "(", "set", "to", "100", "%", ")", ".", "D", "Analysis", "of", "gene", "expression", "in", "cardiac", "tissue", "analyzed", "in", "(", "C", ")", "by", "qPCR", "using", "primers", "against", "indicated", "mRNA", ".", "Data", "of", "one", "representative", "measurement", ",", "normalized", "to", "b", "-", "actin", "with", "WT", "set", "to", "100", "%", "are", "shown", ".", "Identical", "results", "were", "obtained", "in", "further", "experiments", "with", "two", "different", "pairs", "of", "animals", ".", "E", "Upper", "panel", ":", "SDH", "complex", "of", "cardiac", ",", "liver", "and", "kidney", "were", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", "as", "in", "(", "B", ")", ";", "lower", "panel", ":", "the", "same", "samples", "were", "analyzed", "by", "SDS", "gel", "and", "Western", "-", "blotting", ".", "F", ",", "G", "Analysis", "of", "enzymatic", "activity", "of", "the", "succinate", "dehydrogenase", "related", "to", "the", "malate", "dehydrogenase", "activity", "in", "mitochondria", "isolated", "from", "kidney", "(", "F", ")", "and", "liver", "(", "G", ")", ".", "Values", "of", "3", "animals", "per", "genotype", "are", "plotted", "as", "percent", "of", "wild", "-", "type", ".", "sh", ",", "shTAZ", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Enzymatic activity of the succinate dehydrogenase in isolated cardiac mitochondria from 3 animals per genotype.B Mitochondrial membranes were solubilized in 1% digitonin and analyzed by BN-PAGE and Western-blotting using antibodies against SDH components SDHA and SDHB (upper panel). For a loading control, samples were separated on SDS gel and analyzed by Western-blotting (lower panel).C Steady state protein levels analyzed by SDS gel separation of indicated amounts of mitochondrial protein and subsequent Western- blotting with antibodies against SDHA and VDAC3 or visualizing of Flavin fluorescence after excitation with 488 nm. Lower panel: quantification of signal ratio SDHA/VDAC3 in shTAZ and control (set to 100%).D Analysis of gene expression in cardiac tissue analyzed in (C) by qPCR using primers against indicated mRNA. Data of one representative measurement, normalized to b-actin with WT set to 100% are shown. Identical results were obtained in further experiments with two different pairs of animals.E Upper panel: SDH complex of cardiac, liver and kidney were analyzed by BN-PAGE as in (B); lower panel: the same samples were analyzed by SDS gel and Western-blotting.F, G Analysis of enzymatic activity of the succinate dehydrogenase related to the malate dehydrogenase activity in mitochondria isolated from kidney (F) and liver (G). Values of 3 animals per genotype are plotted as percent of wild-type. sh, shTAZ."}
{"words": ["Figure", "6A", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "cardiac", "troponinT", "(", "cTNT", ")", "expression", "was", "performed", "at", "day", "60", "post", "cardiac", "differentiation", ".", "98", "%", "of", "cTNT", "+", "cardiomyocytes", "(", "CM", ")", "were", "obtained", "after", "metabolic", "selection", ".", "B", "RT", "-", "PCR", "showing", "the", "expression", "of", "indicated", "genes", "in", "undifferentiated", "iPSCs", "and", "differentiated", "iPSC", "-", "CMs", "of", "BTHS", "patient", "TAZ10", "and", "a", "healthy", "control", ".", "C", "Immunostaining", "of", "control", "(", "left", ")", "and", "BTHS", "iPSC", "-", "CMs", "at", "day", "60", "post", "differentiation", "for", "cardiac", "troponin", "T", "(", "cTNT", ")", "and", "Connexin", "43", "(", "Cx43", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50µm", ".", "D", "Quantitation", "of", "sarcomere", "organization", ".", "Left", "panel", ":", "Immunostaining", "of", "cTNT", ",", "MLC2a", "(", "myosin", "light", "chain", ")", "and", "a", "-", "actinin", "at", "day", "60", "post", "cardiac", "differentiation", ".", "Right", "panel", ":", "The", "bar", "graphs", "at", "the", "right", "panel", "represent", "the", "sarcomere", "regularity", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "for", "the", "comparison", "between", "control", "and", "BTHS", "patient", "TAZ10", ".", "Significance", "was", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "T", "-", "TEST", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "002", "and", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0006", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "E", "Measurement", "of", "cell", "surface", "areas", ".", "Cell", "surface", "area", "was", "measured", "in", "single", "cardiomyocytes", "(", "n", "=", "at", "least", "30", "measurements", "each", "group", "from", "N", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "group", ")", "at", "day", "60", "post", "cardiac", "differentiation", "after", "immunostaining", "of", "sarcomeric", "a", "-", "actinin", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Flow cytometry analysis of cardiac troponinT (cTNT) expression was performed at day 60 post cardiac differentiation. 98% of cTNT+ cardiomyocytes (CM) were obtained after metabolic selection.B RT-PCR showing the expression of indicated genes in undifferentiated iPSCs and differentiated iPSC-CMs of BTHS patient TAZ10 and a healthy control.C Immunostaining of control (left) and BTHS iPSC-CMs at day 60 post differentiation for cardiac troponin T (cTNT) and Connexin 43 (Cx43). Scale bars: 50µm.D Quantitation of sarcomere organization. Left panel: Immunostaining of cTNT, MLC2a (myosin light chain) and a-actinin at day 60 post cardiac differentiation. Right panel: The bar graphs at the right panel represent the sarcomere regularity from 3 independent experiments. Error bars represent standard deviation for the comparison between control and BTHS patient TAZ10. Significance was analyzed using Student's T-TEST **P = 0.002 and ***P = 0.0006. Scale bars: 50 µm.E Measurement of cell surface areas. Cell surface area was measured in single cardiomyocytes (n = at least 30 measurements each group from N = 3 independent experiments each group) at day 60 post cardiac differentiation after immunostaining of sarcomeric a-actinin. Scale bars: 50 µm."}
{"words": ["Figure", "7A", "Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "of", "cardiomyocytes", "from", "patient", "TAZ10", "and", "control", "at", "basal", "conditions", "and", "after", "the", "administration", "of", "the", "indicated", "compounds", ".", "B", "Mitochondrial", "membranes", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", "and", "Western", "-", "blotting", "using", "indicated", "antibodies", ".", "For", "a", "loading", "control", "samples", "were", "separated", "on", "SDS", "gel", "and", "analyzed", "by", "Western", "-", "blotting", "(", "lower", "panel", ")", ".", "C", "Western", "blot", "analysis", "of", "SDHA", "protein", "levels", "compared", "to", "VDAC3", ".", "Quantification", "of", "SDHA", "relative", "to", "VDAC3", "in", "percent", "with", "control", "set", "to", "100", "%", ".", "Error", "bars", "indicate", "range", "of", "values", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "D", "Analysis", "of", "SDHA", "gene", "expression", "in", "triplicates", "by", "qPCR", "in", "cardiomyocytes", ",", "analyzed", "in", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Oxygen consumption rate (OCR) of cardiomyocytes from patient TAZ10 and control at basal conditions and after the administration of the indicated compounds.B Mitochondrial membranes analyzed by BN-PAGE and Western-blotting using indicated antibodies. For a loading control samples were separated on SDS gel and analyzed by Western-blotting (lower panel).C Western blot analysis of SDHA protein levels compared to VDAC3. Quantification of SDHA relative to VDAC3 in percent with control set to 100%. Error bars indicate range of values of two independent experiments.D Analysis of SDHA gene expression in triplicates by qPCR in cardiomyocytes, analyzed in (C)."}
{"words": ["Figure", "1", "[", "a", "]", "Sagittal", "sections", "obtained", "from", "mice", "(", "p15", ")", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "immunostained", "for", "ADP", "-", "ribose", "using", "the", "pan", "-", "ADP", "-", "ribose", "detection", "reagent", "MABE1016", ".", "Representative", "images", "showing", "levels", "of", "ADP", "-", "ribose", "in", "the", "hippocampal", "regions", "CA1", ",", "CA3", ",", "and", "dentate", "gyrus", "(", "DG", ")", ",", "and", "in", "the", "cerebral", "cortex", ".", "Red", "dotted", "boxes", "highlight", "the", "elevated", "ADP", "-", "ribose", "staining", "in", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "cerebellum", "(", "left", "dotted", "box", ")", "and", "hippocampus", "(", "right", "doted", "box", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "mm", ",", "50", "μm", ".", "WT", "(", "n", "=", "4", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "Parp1", "+", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Summary", "histograms", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "Pairwise", "comparisons", "between", "WT", "versus", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "and", "WT", "versus", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "were", "conducted", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "ANOVA", "with", "Dunn", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", "and", "statistically", "significant", "differences", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "are", "shown", ".", "[", "b", "]", "Protein", "extracts", "from", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", ",", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "forebrain", "tissue", ",", "containing", "hippocampus", "and", "cortex", ",", "were", "incubated", "with", "1", "mM", "NAD", "+", "for", "45", "min", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "PARP", "inhibitor", "as", "indicated", ",", "and", "ADP", "-", "ribosylation", "detected", "by", "western", "blotting", "using", "the", "poly", "(", "ADP", "-", "ribose", ")", "-", "specific", "detection", "reagent", "MABE1031", ".", "Representative", "images", "from", "two", "or", "more", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "A", "western", "blot", "showing", "the", "level", "of", "Parp1", "and", "Xrcc1", "in", "the", "forebrain", "tissue", "extracts", "is", "also", "shown", ",", "Inset", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 [a] Sagittal sections obtained from mice (p15) of the indicated genotypes were immunostained for ADP-ribose using the pan-ADP-ribose detection reagent MABE1016. Representative images showing levels of ADP-ribose in the hippocampal regions CA1, CA3, and dentate gyrus (DG), and in the cerebral cortex. Red dotted boxes highlight the elevated ADP-ribose staining in Xrcc1Nes-Cre cerebellum (left dotted box) and hippocampus (right doted box). Scale bars: 5 mm, 50 μm. WT (n = 4 mice), Xrcc1Nes-Cre (n = 4), Parp1+/- /Xrcc1Nes-Cre (n = 4), Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (n = 3) and Parp1-/- (n = 3). Summary histograms show mean ± SEM. Pairwise comparisons between WT versus Xrcc1Nes-Cre mice and WT versus Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre mice were conducted by Kruskal-Wallis ANOVA with Dunn's post-hoc test and statistically significant differences (*p<0.05) are shown.  [b] Protein extracts from wild type (WT), Xrcc1Nes-Cre, and Parp1-/- forebrain tissue, containing hippocampus and cortex, were incubated with 1 mM NAD+ for 45 min in the presence or absence of PARP inhibitor as indicated, and ADP-ribosylation detected by western blotting using the poly(ADP-ribose)-specific detection reagent MABE1031. Representative images from two or more independent experiments are shown. A western blot showing the level of Parp1 and Xrcc1 in the forebrain tissue extracts is also shown, Inset. "}
{"words": ["Figure", "2", "[", "a", "]", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "for", "survival", "of", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "The", "table", "shows", "number", "of", "individuals", "in", "each", "group", ",", "median", "survival", "(", "weeks", ")", ",", "and", "p", "-", "values", "from", "pairwise", "curve", "comparisons", ";", "Und", ":", "undetermined", "(", "Log", "-", "rank", "Mantel", "-", "Cox", "tests", ")", ".", "[", "b", "]", "Video", "monitoring", "and", "recording", "of", "generalised", "running", "/", "bouncing", "seizures", "in", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", "from", "P15", "-", "P19", ".", "The", "point", "of", "death", "of", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "by", "fatal", "seizure", "is", "indicated", "(", "cross", ")", ".", "Note", "no", "seizures", "from", "mice", "of", "other", "genotypes", "were", "detected", ".", "WT", "(", "n", "=", "9", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "cre", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ",", "Parp1", "+", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ",", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 [a] Kaplan-Meier curves for survival of mice of the indicated genotypes. The table shows number of individuals in each group, median survival (weeks), and p-values from pairwise curve comparisons; Und: undetermined (Log-rank Mantel-Cox tests).  [b] Video monitoring and recording of generalised running/bouncing seizures in mice of the indicated genotypes from P15-P19. The point of death of Xrcc1Nes-Cre mice by fatal seizure is indicated (cross). Note no seizures from mice of other genotypes were detected. WT (n = 9 mice), Xrcc1Nes-cre (n = 3 mice), Parp1+/- /Xrcc1Nes-Cre (n = 3 mice), and Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (n = 3). "}
{"words": ["Figure", "3", "[", "b", "]", "Heatplots", "of", "cumulative", "SLEs", ":", "WT", "(", "n", "=", "11", "slices", "from", "3", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "12", "slices", "from", "4", "mice", ")", ",", "Parp1", "+", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "12", "slices", "from", "3", "mice", ")", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "10", "slices", "from", "3", "mice", ")", ".", "Each", "horizontal", "bar", "corresponds", "to", "one", "slice", "with", "the", "colour", "code", "indicating", "cumulative", "SLEs", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 [b] Heatplots of cumulative SLEs: WT (n=11 slices from 3 mice), Xrcc1Nes-Cre (n=12 slices from 4 mice), Parp1+/-/Xrcc1Nes-Cre (n=12 slices from 3 mice) and Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (n=10 slices from 3 mice). Each horizontal bar corresponds to one slice with the colour code indicating cumulative SLEs. "}
{"words": ["Figure", "4", "[", "e", "]", "Summary", "histograms", "(", "mean", "±", "SEM", ")", "of", "cumulative", "seizure", "-", "like", "activity", "at", "5", ",", "10", ",", "and", "15", "min", "timepoints", "in", "cortex", ",", "CA1", ",", "and", "CA3", "regions", "of", "wild", "type", "and", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "brain", "slices", "from", "mice", "treated", "or", "not", "for", "5", "-", "8", "days", "ad", "libitum", "with", "PARP1", "inhibitor", "(", "ABT", "-", "888", ")", "prior", "to", "analysis", ".", "WT", "(", "n", "=", "8", "slices", "from", "4", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "10", "from", "5", "mice", ")", ",", "WT", "+", "PARPi", "(", "n", "=", "6", "from", "3", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "+", "PARPi", "(", "n", "=", "9", "from", "3", "mice", ")", ".", "Pairwise", "comparisons", "at", "the", "15", "min", "time", "point", "between", "WT", "versus", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "and", "WT", "versus", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "+", "PARPi", "were", "conducted", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "'", "s", "post", "-", "hoc", "tests", "and", "statistically", "significant", "differences", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "are", "shown", "."], "labels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text": "Figure 4 [e] Summary histograms (mean ± SEM) of cumulative seizure-like activity at 5, 10, and 15 min timepoints in cortex, CA1, and CA3 regions of wild type and Xrcc1Nes-Cre brain slices from mice treated or not for 5-8 days ad libitum with PARP1 inhibitor (ABT-888) prior to analysis. WT (n = 8 slices from 4 mice), Xrcc1Nes-Cre (n = 10 from 5 mice), WT + PARPi (n = 6 from 3 mice), Xrcc1Nes-Cre + PARPi (n = 9 from 3 mice). Pairwise comparisons at the 15 min time point between WT versus Xrcc1Nes-Cre mice and WT versus Xrcc1Nes-Cre mice + PARPi were conducted by Kruskal-Wallis with Dunn's post-hoc tests and statistically significant differences (*p<0.05) are shown. "}
{"words": ["Figure", "5", "[", "a", "]", "Representative", "images", "of", "indirect", "immunofluorescence", "of", "DIV6", "hippocampal", "neurons", "cultured", "from", "P1", "WT", "and", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mouse", "pups", ",", "immunostained", "for", "ADP", "-", "ribose", "(", "red", ")", ",", "NeuN", "to", "identify", "neurons", "(", "green", ")", ",", "and", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Cells", "were", "pretreated", "with", "PARP", "inhibitor", "(", "10", "µM", ")", "or", "vehicle", "for", "2", "h", "prior", "to", "fixation", ",", "with", "PARG", "inhibitor", "(", "10", "μM", ")", "additionally", "present", "for", "the", "final", "hour", ".", "Scale", "bar", "10", "µm", ".", "[", "b", "]", "Histogram", "of", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "relative", "pan", "-", "ADP", "-", "ribose", "fluorescence", "in", "NeuN", "-", "positive", "hippocampal", "neurons", "pretreated", "with", "PARP", "inhibitor", "(", "5", "µM", ")", "or", "vehicle", "for", "5", "h", "prior", "to", "fixation", ",", "with", "PARG", "inhibitor", "(", "10", "μM", ")", "additionally", "present", "for", "the", "final", "hour", ".", "Neurons", "were", "cultured", "from", "WT", "(", "n", "=", "6", "mice", ",", ">", "180", "cells", "per", "condition", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "6", ",", ">", "180", ")", ",", "Parp1", "+", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", ",", ">", "90", ")", ",", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", ",", ">", "90", ")", ".", "*", "indicates", "significant", "differences", "from", "WT", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "ANOVA", ",", "p", "=", "0", ".", "0013", "and", "Dunn", "'", "s", "post", "-", "hoc", "tests", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 [a] Representative images of indirect immunofluorescence of DIV6 hippocampal neurons cultured from P1 WT and Xrcc1Nes-Cre mouse pups, immunostained for ADP-ribose (red), NeuN to identify neurons (green), and counterstained with DAPI (blue). Cells were pretreated with PARP inhibitor (10 µM) or vehicle for 2 h prior to fixation, with PARG inhibitor (10 μM) additionally present for the final hour. Scale bar 10 µm. [b] Histogram of mean (± SEM) relative pan-ADP-ribose fluorescence in NeuN-positive hippocampal neurons pretreated with PARP inhibitor (5 µM) or vehicle for 5 h prior to fixation, with PARG inhibitor (10 μM) additionally present for the final hour. Neurons were cultured from WT (n = 6 mice, > 180 cells per condition), Xrcc1Nes-Cre (n = 6, > 180), Parp1+/-/Xrcc1Nes-Cre (n = 3, > 90), and Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (n = 3, > 90). * indicates significant differences from WT (Kruskal-Wallis ANOVA, p = 0.0013 and Dunn's post-hoc tests). "}
{"words": ["Figure", "6Summary", "histogram", "of", "the", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "of", "the", "integrated", "fluorescence", "responses", "for", "all", "individual", "synapses", "for", "each", "condition", ".", "Synapse", "number", "is", "the", "same", "as", "in", "(", "D", "-", "F", ")", ".", "Responses", "are", "significantly", "higher", "in", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "synapses", "versus", "both", "WT", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "0033", ",", "and", "pairwise", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Summary histogram of the mean (± SEM) of the integrated fluorescence responses for all individual synapses for each condition. Synapse number is the same as in (D-F). Responses are significantly higher in Xrcc1Nes-Cre synapses versus both WT and Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (one-way ANOVA, *p < 0.0033, and pairwise student's t-tests)."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "Immunolocalization", "of", "TSN2", "-", "TAPa", "and", "GFP", "-", "TAPa", "fusion", "proteins", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "seedlings", ".", "The", "seedlings", "were", "grown", "under", "no", "stress", "(", "NS", ")", "conditions", "(", "23ºC", ")", "or", "incubated", "for", "40", "min", "at", "39ºC", "(", "HS", ")", "and", "then", "immunostained", "with", "α", "-", "Myc", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, Immunolocalization of TSN2-TAPa and GFP-TAPa fusion proteins in root cells of 5-d-old seedlings. The seedlings were grown under no stress (NS) conditions (23ºC) or incubated for 40 min at 39ºC (HS) and then immunostained with α-Myc. Scale bars = 10 μm."}
{"words": ["Figure", "3B", ",", "Co", "-", "localization", "of", "RFP", "-", "TSN2", "(", "red", ")", "with", "GFP", "-", "ADH2", "(", "negative", "control", ")", "and", "GFP", "-", "UBP1", "(", "positive", "control", ")", "in", "N", ".", "benthamiana", "protoplasts", "incubated", "under", "23", "°", "C", "(", "NS", ")", "or", "at", "39ºC", "for", "40", "min", "(", "HS", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "C", ",", "Pearson", "and", "Spearman", "coefficients", "(", "rp", "and", "rs", ",", "respectively", ")", "of", "co", "-", "localization", "(", "PSC", ")", "of", "RFP", "-", "TSN2", "with", "individual", "GFP", "-", "tagged", "TSN", "-", "interacting", "proteins", "listed", "in", "A", "and", "with", "both", "negative", "and", "positive", "control", "proteins", "(", "denoted", "by", "red", "arrowheads", ")", "under", "HS", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "of", "at", "least", "5", "replicate", "measurements", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ",", "BiFC", "between", "cYFP", "-", "TSN2", "and", "nYFP", "-", "TSN", "-", "interacting", "proteins", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaf", "cells", "or", "protoplasts", "after", "HS", "(", "39ºC", "for", "40", "min", ")", ".", "BiFC", "analysis", "of", "cYFP", "-", "TSN2", "and", "nYFP", "-", "TSN", "-", "interacting", "proteins", "(", "TIPs", ")", "with", "empty", "vectors", "(", "EV", ")", "encoding", "nYFP", "and", "cYFP", ",", "respectively", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Only", "one", "representative", "example", "of", "BiFC", "between", "cYFP", "and", "nYFP", "-", "TIP", "is", "shown", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B, Co-localization of RFP-TSN2 (red) with GFP-ADH2 (negative control) and GFP-UBP1 (positive control) in N. benthamiana protoplasts incubated under 23°C (NS) or at 39ºC for 40 min (HS). Scale bars = 5 μm.C, Pearson and Spearman coefficients (rp and rs, respectively) of co-localization (PSC) of RFP-TSN2 with individual GFP-tagged TSN-interacting proteins listed in A and with both negative and positive control proteins (denoted by red arrowheads) under HS. Data represent means ± SD of at least 5 replicate measurements from three independent experiments.D, BiFC between cYFP-TSN2 and nYFP-TSN-interacting proteins in N. benthamiana leaf cells or protoplasts after HS (39ºC for 40 min). BiFC analysis of cYFP-TSN2 and nYFP-TSN-interacting proteins (TIPs) with empty vectors (EV) encoding nYFP and cYFP, respectively was used as a negative control. Only one representative example of BiFC between cYFP and nYFP-TIP is shown. Scale bars = 5 μm."}
{"words": ["Figure", "4D", ",", "BiFC", "between", "cYFP", "-", "TSN2", "(", "full", "-", "length", ")", ",", "cYFP", "-", "SN", "or", "cYFP", "-", "Tudor", "and", "nYFP", "-", "TSN", "-", "interacting", "proteins", "in", "N", ".", "benthamiana", "protoplasts", "after", "HS", "(", "39ºC", "for", "40", "min", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "Boxplots", "show", "quantification", "of", "the", "reconstituted", "YFP", "signal", ".", "AU", ",", "arbitrary", "units", ".", "Upper", "and", "lower", "box", "boundaries", "represent", "the", "first", "and", "third", "quantiles", ",", "respectively", ",", "horizontal", "lines", "mark", "the", "median", ",", "and", "whiskers", "mark", "the", "highest", "and", "lowest", "values", ".", "Three", "independent", "experiments", ",", "each", "containing", "seven", "individual", "measurements", ",", "were", "performed", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tudor", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D, BiFC between cYFP-TSN2 (full-length), cYFP-SN or cYFP-Tudor and nYFP-TSN-interacting proteins in N. benthamiana protoplasts after HS (39ºC for 40 min). Scale bars = 10 μm. Boxplots show quantification of the reconstituted YFP signal. AU, arbitrary units. Upper and lower box boundaries represent the first and third quantiles, respectively, horizontal lines mark the median, and whiskers mark the highest and lowest values. Three independent experiments, each containing seven individual measurements, were performed. ***P < 0.001 vs Tudor (one-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "5B", ",", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "Ip", ")", "of", "the", "two", "TSN", "isoforms", "and", "RH12", "in", "protein", "extracts", "prepared", "from", "N", ".", "benthamiana", "leaves", "agro", "-", "infiltrated", "with", "GFP", "-", "TSN1", "or", "GFP", "-", "TSN2", "and", "Myc", "-", "RH12", ".", "Free", "GFP", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Input", "and", "Co", "-", "Ip", "fractions", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "α", "-", "Myc", "and", "α", "-", "GFP", ".", "C", ",", "Localization", "of", "RH12", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "expressing", "GFP", "-", "RH12", "under", "control", "of", "the", "native", "promoter", ".", "The", "seedlings", "were", "grown", "under", "23", "°", "C", "(", "NS", ")", "or", "incubated", "at", "39", "°", "C", "for", "60", "min", "(", "HS", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B, Co-immunoprecipitation (Co-Ip) of the two TSN isoforms and RH12 in protein extracts prepared from N. benthamiana leaves agro-infiltrated with GFP-TSN1 or GFP-TSN2 and Myc-RH12. Free GFP was used as a negative control. Input and Co-Ip fractions were analyzed by immunoblotting using α-Myc and α-GFP.C, Localization of RH12 in root cells of 5-d-old Arabidopsis seedlings expressing GFP-RH12 under control of the native promoter. The seedlings were grown under 23°C (NS) or incubated at 39°C for 60 min (HS). Scale bars = 10 μm."}
{"words": ["Figure", "6B", ",", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "Ip", ")", "of", "TSN", "and", "RBP47", "in", "protein", "extracts", "prepared", "from", "10", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "expressing", "Pro35S", ":", "GFP", "-", "RBP47", "and", "grown", "under", "no", "stress", "(", "NS", ")", ",", "HS", "(", "39ºC", "for", "60", "min", ")", "or", "salt", "(", "NaCl", ")", "stress", "(", "150", "mM", "NaCl", "for", "60", "min", ")", "conditions", ".", "The", "GFP", "-", "expressing", "line", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Endogenous", "TSN", "(", "107", "kD", ")", "was", "detected", "in", "total", "fractions", "(", "Input", ")", "and", "fractions", "co", "-", "immunoprecipitated", "(", "Co", "-", "Ip", ")", "with", "RBP47", "but", "not", "with", "free", "GFP", "in", "all", "three", "conditions", ".", "Input", "and", "Co", "-", "Ip", "fractions", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "α", "-", "TSN", "and", "α", "-", "GFP", ".", "C", ",", "Localization", "of", "GFP", "-", "tagged", "proteins", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "expressing", "Pro35S", ":", "GFP", "-", "RBP47", ",", "Pro35S", ":", "GFP", "-", "UBP1", ",", "Pro35S", ":", "GFP", "-", "TCTP", "and", "ProUBQ", ":", "GFP", "-", "SnRK1α2", ".", "The", "seedlings", "were", "grown", "under", "23", "°", "C", "(", "NS", ")", ",", "incubated", "at", "39", "°", "C", "for", "60", "min", "(", "HS", ")", "or", "treated", "with", "200", "mM", "NaCl", "at", "23", "°", "C", "for", "60", "min", "(", "NaCl", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "10"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B, Co-immunoprecipitation (Co-Ip) of TSN and RBP47 in protein extracts prepared from 10-d-old Arabidopsis seedlings expressing Pro35S:GFP-RBP47 and grown under no stress (NS), HS (39ºC for 60 min) or salt (NaCl) stress (150 mM NaCl for 60 min) conditions. The GFP-expressing line was used as a negative control. Endogenous TSN (107 kD) was detected in total fractions (Input) and fractions co-immunoprecipitated (Co-Ip) with RBP47 but not with free GFP in all three conditions. Input and Co-Ip fractions were analyzed by immunoblotting using α-TSN and α-GFP.C, Localization of GFP-tagged proteins in root cells of 5-d-old Arabidopsis seedlings expressing Pro35S:GFP-RBP47, Pro35S:GFP-UBP1, Pro35S:GFP-TCTP and ProUBQ:GFP-SnRK1α2. The seedlings were grown under 23°C (NS), incubated at 39°C for 60 min (HS) or treated with 200 mM NaCl at 23°C for 60 min (NaCl). Scale bars = 10 μm"}
{"words": ["Figure", "7D", ",", "Localization", "of", "GFP", "-", "SnRK1α1", "and", "GFP", "-", "SnRK1α2", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "WT", "and", "tsn1", "tsn2", "seedlings", "grown", "under", "23", "°", "C", "(", "NS", ")", "or", "incubated", "at", "39", "°", "C", "for", "60", "min", "(", "HS", ")", ".", "Insets", "show", "enlarged", "areas", "inside", "dashed", "rectangles", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "J", ",", "Colocalization", "of", "GFP", "-", "SnRK1α1", ",", "GFP", "-", "SnRK1α1CD", ",", "or", "GFP", "-", "SnRK1α1RD", "with", "RFP", "-", "RBP47", "in", "N", ".", "benthamiana", "protoplasts", "subjected", "to", "HS", "(", "40", "min", "at", "39", "°", "C", ")", ".", "For", "colocalization", "analysis", "under", "NS", "conditions", "see", "Fig", ".", "EV5B", ".", "For", "CHX", "treatment", ",", "protoplasts", "were", "incubated", "with", "200", "ng", "μL", "-", "1", "CHX", "for", "30", "min", "at", "23ºC", "before", "HS", ".", "GFP", "and", "RFP", "fusion", "proteins", "were", "expressed", "under", "the", "control", "of", "the", "UBQ", "and", "35S", "promoter", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7D, Localization of GFP-SnRK1α1 and GFP-SnRK1α2 in root cells of 5-d-old Arabidopsis WT and tsn1 tsn2 seedlings grown under 23°C (NS) or incubated at 39°C for 60 min (HS). Insets show enlarged areas inside dashed rectangles. Scale bars = 10 μm.J, Colocalization of GFP-SnRK1α1, GFP-SnRK1α1CD, or GFP-SnRK1α1RD with RFP-RBP47 in N. benthamiana protoplasts subjected to HS (40 min at 39°C). For colocalization analysis under NS conditions see Fig. EV5B. For CHX treatment, protoplasts were incubated with 200 ng μL-1 CHX for 30 min at 23ºC before HS. GFP and RFP fusion proteins were expressed under the control of the UBQ and 35S promoter, respectively. Scale bars = 5 μm."}
{"words": ["Figure", "8C", ",", "Localization", "of", "GFP", "-", "SnRK1α1", "and", "GFP", "-", "SnRK1α2", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "WT", "seedlings", "incubated", "at", "39", "°", "C", "and", "imaged", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "D", ",", "Quantification", "of", "GFP", "-", "SnRK1α1", "and", "GFP", "-", "SnRK1α2", "foci", "in", "the", "experiment", "shown", "in", "C", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "of", "at", "least", "16", "replicate", "measurements", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", "with", "similar", "results", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", ".", "E", ",", "F", ",", "Immunoblot", "analysis", "with", "indicated", "antibodies", "of", "protein", "extracts", "prepared", "from", "root", "tips", "of", "10", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "tsn1", "tsn2", "(", "E", ")", "or", "tsn1", "tsn2", "expressing", "ProTSN2", ":", "GFP", "-", "TSN2", "(", "F", ")", "heat", "-", "stressed", "seedlings", "(", "39ºC", ")", "0", ",", "20", ",", "40", "and", "60", "min", "after", "the", "onset", "of", "HS", ".", "The", "charts", "show", "SnRK1", "activity", ",", "expressed", "as", "the", "ratio", "of", "phosphorylated", "to", "total", "SnRK1", "protein", ".", "The", "data", "represent", "mean", "ratios", "of", "integrated", "band", "intensities", "(", "for", "both", "isoforms", ")", "normalized", "to", "0", "min", "±", "SD", "from", "at", "least", "four", "different", "experiments", ".", "P", "values", "denote", "statistically", "significant", "differences", "for", "comparisons", "to", "0", "min", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", ".", "G", ",", "Expression", "levels", "of", "DIN2", "and", "DIN6", "in", "Arabidopsis", "WT", ",", "tsn1", "tsn2", ",", "tsn1", "tsn2", ";", "TSN2", "and", "snrk1α1", "-", "/", "-", "snrk1α2", "-", "/", "+", "10", "-", "d", "-", "old", "heat", "-", "stressed", "seedlings", "relative", "to", "unstressed", "controls", ".", "For", "CHX", "treatment", ",", "the", "WT", "seedlings", "were", "pre", "-", "treated", "with", "200", "ng", "μL", "-", "1", "CHX", "for", "30", "min", "before", "HS", ".", "Upper", "and", "lower", "box", "boundaries", "represent", "the", "first", "and", "third", "quantiles", ",", "respectively", ".", "Horizontal", "lines", "mark", "the", "median", "of", "five", "replicate", "measurements", ",", "and", "whiskers", "mark", "the", "highest", "and", "lowest", "values", ".", "Means", "with", "different", "letters", "are", "significantly", "different", "at", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8C, Localization of GFP-SnRK1α1 and GFP-SnRK1α2 in root cells of 5-d-old Arabidopsis WT seedlings incubated at 39°C and imaged at the indicated time points. Scale bars = 10 μm. D, Quantification of GFP-SnRK1α1 and GFP-SnRK1α2 foci in the experiment shown in C. Data represent means ± SD of at least 16 replicate measurements. The experiment was repeated three times with similar results. ***P < 0.05 (two-tailed t-test). E, F, Immunoblot analysis with indicated antibodies of protein extracts prepared from root tips of 10-d-old Arabidopsis tsn1 tsn2 (E) or tsn1 tsn2 expressing ProTSN2:GFP-TSN2 (F) heat-stressed seedlings (39ºC) 0, 20, 40 and 60 min after the onset of HS. The charts show SnRK1 activity, expressed as the ratio of phosphorylated to total SnRK1 protein. The data represent mean ratios of integrated band intensities (for both isoforms) normalized to 0 min ± SD from at least four different experiments. P values denote statistically significant differences for comparisons to 0 min (two-tailed t-test).G, Expression levels of DIN2 and DIN6 in Arabidopsis WT, tsn1 tsn2, tsn1 tsn2;TSN2 and snrk1α1-/- snrk1α2-/+ 10-d-old heat-stressed seedlings relative to unstressed controls. For CHX treatment, the WT seedlings were pre-treated with 200 ng μL-1 CHX for 30 min before HS. Upper and lower box boundaries represent the first and third quantiles, respectively. Horizontal lines mark the median of five replicate measurements, and whiskers mark the highest and lowest values. Means with different letters are significantly different at P < 0.05 (one-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Representative", "fluorescent", "images", "(", "red", ")", "showing", "that", "mouse", "primary", "cortical", "neurons", "were", "transduced", "with", "shRNA", "-", "control", "or", "shATIC", "#", "6", "at", "DIV", "3", "and", "then", "transfected", "with", "MYC", "-", "LRRK2", "-", "WT", "and", "DsRed", "at", "a", "plasmid", "ratio", "of", "10", ":", "1", "at", "DIV", "5", ".", "Neuronal", "viability", "was", "analyzed", "at", "72", "-", "hour", "post", "-", "transfection", "with", "non", "-", "viable", "neurons", "exhibiting", "no", "obvious", "neurite", "process", "(", "arrow", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "neuronal", "viability", ".", "Bars", "indicate", "the", "viability", "(", "n", ">", "100", ")", "for", "each", "transfection", "condition", "expressed", "as", "a", "percent", "of", "control", "neurons", "(", "DsRed", "with", "pcDNA3", ".", "1", "empty", "vector", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "with", "n", ">", "100", "cells", "quantified", "in", "each", "experiment", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "Endogenous", "LRRK2", "levels", "in", "ATIC", "overexpression", "cells", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "transfected", "with", "V5", "-", "ATIC", "or", "empty", "vector", ".", "After", "48", "hours", ",", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "tests", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "Endogenous", "LRRK2", "levels", "in", "ATIC", "KO", "cells", "upon", "LV", "-", "flag", "-", "ATIC", "expressing", ".", "SH", "-", "SY5Y", "WT", "or", "ATIC", "KO", "cells", "were", "infected", "with", "lentiviruses", "carrying", "Flag", "-", "ATIC", "or", "empty", "vector", ".", "After", "48", "hours", ",", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "the", "means", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Representative fluorescent images (red) showing that mouse primary cortical neurons were transduced with shRNA-control or shATIC #6 at DIV 3 and then transfected with MYC-LRRK2-WT and DsRed at a plasmid ratio of 10:1 at DIV 5. Neuronal viability was analyzed at 72-hour post-transfection with non-viable neurons exhibiting no obvious neurite process (arrow). Scale bars, 100 μm. (C) Quantification of neuronal viability. Bars indicate the viability (n > 100) for each transfection condition expressed as a percent of control neurons (DsRed with pcDNA3.1 empty vector). Data represent the mean ± SEM from three independent experiments with n > 100 cells quantified in each experiment. **p < 0.01, ***p < 0.001 by one-way ANOVA followed by a Tukey's post hoc test.(D and E) Endogenous LRRK2 levels in ATIC overexpression cells. SH-SY5Y cells were transfected with V5-ATIC or empty vector. After 48 hours, LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot. Images were quantified by ImageJ software. Data are mean ± SEM, n=3 independent experiments. ***p < 0.001 by Student's t tests.(H and I) Endogenous LRRK2 levels in ATIC KO cells upon LV-flag-ATIC expressing. SH-SY5Y WT or ATIC KO cells were infected with lentiviruses carrying Flag-ATIC or empty vector. After 48 hours, LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot. Images were quantified by ImageJ software. Data are the means ± SEM, n=3 independent experiments. ***p < 0.001 by one-way ANOVA followed by a Tukey's post hoc test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "and", "B", ")", "Overexpressed", "LRRK2", "levels", "in", "HEK", "293T", "cells", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "MYC", "-", "LRRK2", "and", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "for", "48", "hours", ".", "LRRK2", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "(", "G", "-", "N", ")", "LRRK2", "expression", "levels", "in", "primary", "neurons", "(", "G", "and", "H", ")", ",", "microglia", "(", "I", "and", "J", ")", ",", "astrocytes", "(", "K", "and", "L", ")", "and", "human", "fibroblasts", "(", "M", "and", "N", ")", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "Mouse", "primary", "cortical", "neurons", ",", "microglia", ",", "astrocytes", "or", "human", "fibroblasts", "from", "a", "health", "control", "were", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "for", "48", "hours", ".", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "(", "Q", "and", "R", ")", "LRRK2", "expression", "levels", "in", "mouse", "striatum", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "AICAr", "(", "72μg", "/", "day", "/", "animal", ")", "or", "saline", "(", "used", "as", "a", "control", ")", "was", "injected", "into", "mouse", "striatum", "via", "osmotic", "pumps", ".", "One", "day", "after", "injection", ",", "striatal", "tissues", "near", "the", "injection", "sites", "were", "collected", "and", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "from", "total", "six", "mice", "(", "three", "male", "mice", "and", "three", "female", "mice", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "'", "s", "t", "tests", ".", "(", "S", ")", "Representative", "fluorescent", "images", "(", "green", ")", "showing", "that", "mouse", "primary", "cortical", "neurons", "were", "co", "-", "transfected", "with", "MYC", "-", "LRRK2", "WT", "or", "G2019S", "(", "GS", ")", ",", "and", "eGFP", "at", "a", "plasmid", "ratio", "of", "10", ":", "1", "at", "DIV", "5", ",", "and", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", ".", "Neuronal", "viability", "was", "analyzed", "at", "48", "-", "hour", "post", "-", "transfection", "with", "non", "-", "viable", "neurons", "exhibiting", "no", "obvious", "neurite", "process", "(", "arrow", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "(", "T", ")", "Quantification", "of", "neuronal", "viability", ".", "Bars", "indicate", "the", "viability", "(", "n", ">", "100", ")", "for", "each", "transfection", "condition", "expressed", "as", "a", "percent", "of", "control", "neurons", "(", "eGFP", "with", "pcDNA3", ".", "1", "empty", "vector", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "with", "n", ">", "100", "cells", "quantified", "in", "each", "experiment", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A and B) Overexpressed LRRK2 levels in HEK 293T cells upon AICAr treatment. HEK293 cells were transfected with MYC-LRRK2 and treated with or without 1mM AICAr for 48 hours. LRRK2 levels were analyzed by Western blot.(G-N) LRRK2 expression levels in primary neurons (G and H), microglia (I and J), astrocytes (K and L) and human fibroblasts (M and N) upon AICAr treatment. Mouse primary cortical neurons, microglia, astrocytes or human fibroblasts from a health control were treated with or without 1mM AICAr for 48 hours. LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot.(Q and R) LRRK2 expression levels in mouse striatum upon AICAr treatment. AICAr (72μg/day/animal) or saline (used as a control) was injected into mouse striatum via osmotic pumps. One day after injection, striatal tissues near the injection sites were collected and LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot. Images were quantified by ImageJ software. Data are mean ± SEM from total six mice (three male mice and three female mice). ****p < 0.0001 by Student's t tests.(S) Representative fluorescent images (green) showing that mouse primary cortical neurons were co-transfected with MYC-LRRK2 WT or G2019S (GS), and eGFP at a plasmid ratio of 10:1 at DIV 5, and treated with or without 1mM AICAr. Neuronal viability was analyzed at 48-hour post-transfection with non-viable neurons exhibiting no obvious neurite process (arrow). Scale bars, 100 μm. (T) Quantification of neuronal viability. Bars indicate the viability (n > 100) for each transfection condition expressed as a percent of control neurons (eGFP with pcDNA3.1 empty vector). Data represent the mean ± SEM from three independent experiments with n > 100 cells quantified in each experiment. *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 by one-way ANOVA followed by a Tukey's post hoc test."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "LRRK2", "protein", "levels", "upon", "treatment", "of", "AICAr", "together", "with", "a", "proteasome", "inhibitor", "MG132", "or", "an", "autophagy", "inhibitor", "chloroquine", "(", "CQ", ")", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", ",", "0", ".", "35μM", "MG132", ",", "and", "5μM", "CQ", "as", "showed", "in", "(", "A", ")", "for", "48", "hours", ".", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "(", "C", ")", "LRRK2", "and", "GBA", "mRNA", "levels", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "2mM", "AICAr", "for", "24", "hours", ".", "Total", "RNA", "was", "extracted", ".", "LRRK2", "and", "GBA", "mRNA", "levels", "were", "analyzed", "by", "real", "-", "time", "PCR", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "tests", ".", "ns", ":", "not", "statistically", "significant", ".", "(", "D", ")", "LRRK2", "mRNA", "level", "upon", "AICAr", "treatment", "in", "the", "presence", "of", "actinomycin", "D", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "2mM", "AICAr", "for", "24", "hours", "and", "in", "the", "presence", "of", "10μg", "/", "ml", "actinomycin", "D", ".", "Total", "RNA", "was", "extracted", ".", "LRRK2", "mRNA", "levels", "were", "analyzed", "by", "real", "-", "time", "PCR", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "LRRK2", "expression", "levels", "from", "native", "LRRK2", "cDNA", "and", "synthesized", "LRRK2", "cDNA", "with", "synonymous", "codons", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "HEK", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "LRRK2", "with", "native", "cDNA", "or", "with", "synthesized", "cDNA", ",", "and", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "for", "48", "hours", ".", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "tests", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "The", "specific", "region", "(", "2221", "-", "3927bp", ")", "of", "the", "synthesized", "Flag", "-", "LRRK2", "cDNA", "was", "replaced", "with", "the", "native", "sequence", "and", "the", "response", "of", "this", "chimeric", "LRRK2", "cDNA", "expression", "to", "AICAr", "treatment", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "'", "s", "t", "tests", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A and B) LRRK2 protein levels upon treatment of AICAr together with a proteasome inhibitor MG132 or an autophagy inhibitor chloroquine (CQ). SH-SY5Y cells were treated with or without 1mM AICAr, 0.35μM MG132, and 5μM CQ as showed in (A) for 48 hours. LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot. Images were quantified by ImageJ software. Data are mean ± SEM, n=3 independent experiments. ***p < 0.001, ****p < 0.0001 by one-way ANOVA followed by a Tukey's post hoc test.(C) LRRK2 and GBA mRNA levels upon AICAr treatment. SH-SY5Y cells were treated with or without 2mM AICAr for 24 hours. Total RNA was extracted. LRRK2 and GBA mRNA levels were analyzed by real-time PCR. Data are mean ± SEM, n=4 independent experiments. **p < 0.01 by Student's t tests. ns: not statistically significant. (D) LRRK2 mRNA level upon AICAr treatment in the presence of actinomycin D. SH-SY5Y cells were treated with or without 2mM AICAr for 24 hours and in the presence of 10μg/ml actinomycin D. Total RNA was extracted. LRRK2 mRNA levels were analyzed by real-time PCR. Data are mean ± SEM, n=4 independent experiments. **p < 0.01, ****p < 0.0001 by two-way ANOVA followed by Sidak's multiple comparison test.(E and F) LRRK2 expression levels from native LRRK2 cDNA and synthesized LRRK2 cDNA with synonymous codons upon AICAr treatment. HEK 293T cells were transfected with Flag-LRRK2 with native cDNA or with synthesized cDNA, and treated with or without 1mM AICAr for 48 hours. LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot. Images were quantified by ImageJ software. Data are mean ± SEM, n=3 independent experiments. ***p < 0.001 by Student's t tests.(I and J) The specific region (2221-3927bp) of the synthesized Flag-LRRK2 cDNA was replaced with the native sequence and the response of this chimeric LRRK2 cDNA expression to AICAr treatment was analyzed by Western blot. Images were quantified by ImageJ software. Data are mean ± SEM, n=3 independent experiments. ****p < 0.0001 by Student's t tests."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", "LRRK2", "protein", "levels", "in", "AUF1", "knockout", "(", "KO", ")", "cells", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "SH", "-", "SY5Y", "WT", "and", "AUF1", "KO", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "for", "48", "hours", ".", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "LRRK2", "protein", "levels", "in", "AUF1", "KO", "cells", "with", "AUF1", "expressing", "back", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "SH", "-", "SY5Y", "WT", "and", "KO", "cells", "were", "transfected", "AUF1", "-", "GFP", "or", "GFP", "and", "selected", "with", "4μg", "/", "ml", "blasticidin", ".", "The", "resulting", "stable", "cell", "lines", "were", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "for", "48", "hours", ".", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "Overexpressed", "LRRK2", "levels", "in", "AUF1", "KO", "cells", "with", "AUF1", "expressing", "back", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "SH", "-", "SY5Y", "WT", "and", "AUF1", "KO", "cells", "were", "transfected", "AUF1", "-", "GFP", "or", "GFP", "and", "selected", "with", "4μg", "/", "ml", "blasticidin", ".", "The", "resulting", "cell", "lines", "were", "transfected", "with", "a", "construct", "with", "native", "LRRK2", "cDNA", "or", "synthesized", "LRRK2", "cDNA", "with", "synonymous", "codons", "and", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "for", "48", "hours", ".", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B LRRK2 protein levels in AUF1 knockout (KO) cells upon AICAr treatment. SH-SY5Y WT and AUF1 KO cells were treated with or without 1mM AICAr for 48 hours. LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot.(E and F) LRRK2 protein levels in AUF1 KO cells with AUF1 expressing back upon AICAr treatment. SH-SY5Y WT and KO cells were transfected AUF1-GFP or GFP and selected with 4μg/ml blasticidin. The resulting stable cell lines were treated with or without 1mM AICAr for 48 hours. LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot.(G and H) Overexpressed LRRK2 levels in AUF1 KO cells with AUF1 expressing back upon AICAr treatment. SH-SY5Y WT and AUF1 KO cells were transfected AUF1-GFP or GFP and selected with 4μg/ml blasticidin. The resulting cell lines were transfected with a construct with native LRRK2 cDNA or synthesized LRRK2 cDNA with synonymous codons and treated with or without 1mM AICAr for 48 hours. LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot. Images were quantified by ImageJ software."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "and", "B", ")", "AUF1", "binds", "to", "LRRK2", "mRNA", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "SH", "-", "SY5Y", "WT", "and", "AUF1", "KO", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "for", "24", "hours", ".", "RNA", "and", "protein", "complexes", "were", "immunoprecipitated", "using", "AUF1", "antibody", ".", "The", "LRRK2", "mRNA", "levels", "were", "analyzed", "by", "semiquantitative", "reverse", "transcription", "(", "RT", ")", "-", "PCR", ".", "18S", "ribosomal", "RNA", "(", "rRNA", ")", "was", "as", "a", "loading", "control", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "tests", ".", "(", "D", ")", "Direct", "interaction", "of", "LRRK2", "mRNA", "and", "four", "AUF1", "isoforms", ".", "Biotin", "-", "labelled", "62", "-", "nt", "LRRK2", "RNA", "probes", "from", "native", "LRRK2", "cDNA", "or", "synthesized", "LRRK2", "cDNA", "were", "incubated", "with", "purified", "AUF1", "isoforms", "in", "an", "RNA", "electrophoretic", "mobility", "shift", "assay", "(", "EMSA", ")", ".", "Free", "probes", "and", "AUF1", "bound", "probes", "were", "detected", "using", "a", "chemiluminescent", "RNA", "EMSA", "kit", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A and B) AUF1 binds to LRRK2 mRNA upon AICAr treatment. SH-SY5Y WT and AUF1 KO cells were treated with or without 1mM AICAr for 24 hours. RNA and protein complexes were immunoprecipitated using AUF1 antibody. The LRRK2 mRNA levels were analyzed by semiquantitative reverse transcription (RT)-PCR. 18S ribosomal RNA (rRNA) was as a loading control. Images were quantified by ImageJ software. Data are mean ± SEM, n=3 independent experiments. *p < 0.05 by Student's t tests.(D) Direct interaction of LRRK2 mRNA and four AUF1 isoforms. Biotin-labelled 62-nt LRRK2 RNA probes from native LRRK2 cDNA or synthesized LRRK2 cDNA were incubated with purified AUF1 isoforms in an RNA electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Free probes and AUF1 bound probes were detected using a chemiluminescent RNA EMSA kit."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "and", "B", ")", "DCP1A", "and", "DCP2", "expression", "levels", "upon", "AICAr", "treatment", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "for", "48", "hours", ".", "DCP1A", "and", "DCP2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "tests", ".", "(", "E", ")", "LRRK2", "mRNA", "decapping", "by", "DCP1A", "and", "DCP2", ".", "Recombinant", "DCP1A", "and", "DCP2", "proteins", "were", "purified", "from", "HEK", "293T", "cells", "and", "incubated", "with", "[", "α", "-", "32P", "]", "cap", "-", "labeled", "LRRK2", "RNA", ".", "LRRK2", "mRNA", "decapping", "was", "analyzed", "by", "one", "-", "dimensional", "thin", "layer", "chromatography", ".", "The", "decapping", "activity", "is", "demonstrated", "by", "the", "increased", "m7GDP", "levels", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A and B) DCP1A and DCP2 expression levels upon AICAr treatment. SH-SY5Y cells were treated with or without 1mM AICAr for 48 hours. DCP1A and DCP2 expression levels were analyzed by Western blot. Images were quantified by ImageJ software. Data are mean ± SEM, n=3 independent experiments. **p < 0.01 by Student's t tests.(E) LRRK2 mRNA decapping by DCP1A and DCP2. Recombinant DCP1A and DCP2 proteins were purified from HEK 293T cells and incubated with [α-32P]cap-labeled LRRK2 RNA. LRRK2 mRNA decapping was analyzed by one-dimensional thin layer chromatography. The decapping activity is demonstrated by the increased m7GDP levels."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "and", "B", ")", "LRRK2", "protein", "levels", "upon", "the", "treatment", "of", "AICAr", ",", "AICAr", "plus", "an", "adenosine", "transporter", "(", "AT", ")", "inhibitor", "ABT702", "or", "an", "adenosine", "kinase", "(", "ADK", ")", "inhibitors", "NBT", "-", "1", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", ",", "AICAr", "plus", "1μM", "ABT", "-", "702", "or", "50μM", "NBT", "-", "1", "for", "48", "hours", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "LRRK2", "protein", "levels", "upon", "the", "treatment", "of", "AICAr", "or", "plus", "AMPK", "direct", "activator", "A769662", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", ",", "10", ",", "20", ",", "or", "50", "μM", "A769662", "for", "48", "hours", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "LRRK2", "protein", "levels", "upon", "the", "treatment", "of", "1mM", "AICAr", "in", "WT", "and", "AMPK", "KO", "SH", "-", "SY5Ycells", "for", "48", "hours", ".", "LRRK2", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "ImageJ", "software", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A and B) LRRK2 protein levels upon the treatment of AICAr, AICAr plus an adenosine transporter (AT) inhibitor ABT702 or an adenosine kinase (ADK) inhibitors NBT-1. SH-SY5Y cells were treated with or without 1mM AICAr, AICAr plus 1μM ABT-702 or 50μM NBT-1 for 48 hours.(C and D) LRRK2 protein levels upon the treatment of AICAr or plus AMPK direct activator A769662. SH-SY5Y cells were treated with or without 1mM AICAr, 10, 20, or 50 μM A769662 for 48 hours.(E and F) LRRK2 protein levels upon the treatment of 1mM AICAr in WT and AMPK KO SH-SY5Ycells for 48 hours. LRRK2 expression levels were analyzed by Western blot. Images were quantified by ImageJ software."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "B", ")", "Representative", "confocal", "images", "(", "GFP", ")", "of", "dopamine", "neurons", "in", "each", "cluster", "from", "9", "-", "week", "-", "old", "WT", "and", "LRRK2", "-", "G2019S", "transgenic", "flies", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "treatment", "after", "posteclosion", ".", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "Quantification", "of", "dopamine", "neurons", "per", "DA", "cluster", "in", "9", "-", "week", "-", "old", "WT", "and", "LRRK2", "-", "G2019S", "transgenic", "flies", "with", "or", "without", "1mM", "AICAr", "treatment", "after", "posteclosion", ".", "(", "F", ")", "Total", "numbers", "of", "dopamine", "neurons", "in", "four", "major", "DA", "clusters", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "WT", "and", "LRRK2", "-", "G2019S", "transgenic", "flies", "with", "or", "without", "AICAr", "treatment", "after", "posteclosion", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "12", "flies", "per", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(B) Representative confocal images (GFP) of dopamine neurons in each cluster from 9-week-old WT and LRRK2-G2019S transgenic flies with or without 1mM AICAr treatment after posteclosion. Scale bars, 25 μm.(C-E) Quantification of dopamine neurons per DA cluster in 9-week-old WT and LRRK2-G2019S transgenic flies with or without 1mM AICAr treatment after posteclosion. (F) Total numbers of dopamine neurons in four major DA clusters of 9-week-old WT and LRRK2-G2019S transgenic flies with or without AICAr treatment after posteclosion. Data are mean ± SEM, n=12 flies per group. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 by one-way ANOVA followed by a Tukey's post hoc test."}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "DAneuron", "staining", ".", "WT", "and", "LRRK", "-", "KO", "mice", "were", "injected", "with", "1ul", "LPS", "(", "5ug", "/", "animal", ")", "or", "phosphate", "buffered", "saline", "(", "PBS", ")", "into", "the", "substantia", "nigra", "pars", "compacta", "(", "SNpc", ")", "and", "administrated", "with", "AICAr", "(", "2", ".", "4μg", "/", "day", "/", "animal", ")", "or", "saline", "to", "same", "stereotaxic", "coordinates", "using", "osmotic", "pumps", ".", "After", "21", "days", "of", "injection", ",", "DA", "neurons", "were", "stained", "by", "anti", "-", "tyrosine", "hydroxylase", "(", "TH", ")", "antibody", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "TH", "positive", "neurons", "in", "substantia", "nigra", "pars", "compacta", "(", "SNpc", ")", "using", "an", "unbiased", "stereological", "method", "with", "stereo", "investigator", "software", "from", "7", "-", "8", "animals", "per", "group", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "Nissl", "-", "positive", "neurons", "in", "SNpc", "using", "an", "unbiased", "stereological", "method", "with", "stereo", "investigator", "software", "from", "7", "-", "8", "animals", "per", "group", ".", "(", "E", ")", "CD68", "levels", "in", "WT", "and", "LRRK", "-", "KO", "mice", "injected", "with", "1μl", "LPS", "(", "5μg", "/", "animal", ")", "or", "PBS", "into", "striatum", "followed", "by", "administration", "of", "AICAr", "(", "2", ".", "4μg", "/", "day", "/", "animal", ")", "or", "saline", "to", "same", "stereotaxic", "coordinates", "using", "osmotic", "pumps", ".", "After", "21", "days", "of", "injection", ",", "LRRK2", "and", "CD68", "expression", "in", "striatal", "tissues", "near", "the", "needle", "sites", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "images", "from", "(", "E", ")", "using", "ImageJ", "software", ",", "n", "=", "3", "animals", "per", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A) Representative images of DAneuron staining. WT and LRRK-KO mice were injected with 1ul LPS (5ug/animal) or phosphate buffered saline (PBS) into the substantia nigra pars compacta (SNpc) and administrated with AICAr (2.4μg/day/animal) or saline to same stereotaxic coordinates using osmotic pumps. After 21 days of injection, DA neurons were stained by anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody. Scale bars, 500 μm.(B) Quantification of TH positive neurons in substantia nigra pars compacta (SNpc) using an unbiased stereological method with stereo investigator software from 7-8 animals per group. (C) Quantification of Nissl-positive neurons in SNpc using an unbiased stereological method with stereo investigator software from 7-8 animals per group.(E) CD68 levels in WT and LRRK-KO mice injected with 1μl LPS (5μg/animal) or PBS into striatum followed by administration of AICAr (2.4μg/day/animal) or saline to same stereotaxic coordinates using osmotic pumps. After 21 days of injection, LRRK2 and CD68 expression in striatal tissues near the needle sites was analyzed by Western blot. (F) Quantification of images from (E) using ImageJ software, n=3 animals per group."}
{"words": ["Figure", "1qRT", "-", "PCR", "for", "INHBA", "relative", "to", "RPL27", "using", "RNA", "from", "SCC13", "cells", "transduced", "with", "a", "lentiviral", "vector", "allowing", "expression", "of", "INHBA", "in", "a", "doxycycline", "(", "DOX", ")", "-", "inducible", "manner", "(", "SCC13", "Act", "clone", "1", "and", "2", ")", "or", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "(", "N", "=", "3", ")", ".", "SCC13", "Act", "and", "EV", "cell", "lines", "were", "generated", "from", "lentivirally", "transduced", "cells", "upon", "single", "cell", "clonal", "expansion", ".", "Western", "blot", "of", "cell", "lysate", "and", "conditioned", "media", "(", "CM", ";", "bottom", ")", "of", "transduced", "SCC13", "cells", "for", "the", "activin", "βA", "subunit", "and", "GAPDH", "(", "loading", "control", "for", "cell", "lysate", ")", "under", "reducing", "conditions", ".", "The", "higher", "molecular", "weight", "of", "recombinant", "activin", "βA", "results", "from", "the", "HA", "-", "epitope", "tag", ".", "Ponceau", "S", "staining", "of", "the", "membrane", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "for", "the", "CM", ".", "Representative", "pictures", "of", "5", "week", "-", "old", "tumors", "(", "indicated", "by", "arrows", ")", "formed", "in", "NOD", "/", "SCID", "mice", "upon", "intradermal", "injection", "of", "SCC13", "Act", "(", "clone", "2", ")", "or", "SCC13", "EV", "cells", "and", "tumor", "volume", "at", "different", "time", "points", "of", "tumor", "development", ".", "N", "=", "3", "-", "6", "tumors", ".", "Representative", "images", "of", "H", "&", "E", "stainings", "of", "tumors", "formed", "by", "SCC13", "EV", "and", "Act", "cells", "(", "clone", "2", ")", "at", "day", "35", "(", "asterisk", "indicates", "cartilage", ",", "arrow", "indicates", "site", "of", "invasion", ")", ".", "An", "inset", "panel", "indicates", "the", "area", "where", "tumor", "cells", "invade", "into", "the", "cartilage", ".", "Tumor", "sections", "were", "evaluated", "for", "invasion", "through", "the", "basement", "membrane", ".", "N", "=", "6", "(", "EV", ")", ",", "N", "=", "6", "Act", "(", "3", "tumors", "from", "clone", "1", "and", "3", "tumors", "from", "clone", "2", ")", ".", "Tumors", "from", "Act", "mice", "were", "pooled", "in", "the", "graph", ")", ".", "Tumor", "weight", "at", "endpoint", "(", "5", "weeks", "after", "injection", ")", ".", "N", "=", "3", "-", "6", "tumors", ".", "Herovici", "staining", "and", "quantification", "of", "percentage", "of", "collagen", "-", "positive", "(", "dark", "blue", ")", "area", "per", "field", "of", "view", ".", "N", "=", "3", "tumors", ",", "n", "=", "3", "-", "4", "histological", "sections", ".", "Representative", "images", "of", "sections", "from", "tumors", "formed", "by", "SCC13", "EV", "and", "SCC13", "Act", "(", "clone", "2", ")", "stained", "for", "Ki67", "(", "red", ")", ",", "PDGFR", "-", "α", "(", "green", ")", "and", "counterstained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "/", "PDGFR", "-", "α", "positive", "cells", "is", "shown", "in", "the", "graph", ".", "N", "=", "3", "tumors", ",", "n", "=", "3", "-", "4", "histological", "sections", ".", "Representative", "images", "of", "sections", "from", "3D", "cultures", "of", "primary", "human", "skin", "fibroblasts", "with", "either", "SCC13", "EV", "or", "SCC13", "Act", "(", "clones", "1", "and", "2", ")", "cells", "stained", "with", "either", "H", "&", "E", "or", "Herovici", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "-", "positive", "cells", "in", "sections", "from", "SCC13", "EV", "and", "SCC13", "Act", "(", "clone", "2", ")", "organotypic", "cultures", "(", "co", "-", "stained", "with", "E", "-", "cadherin", "to", "indicate", "epithelial", "cells", ")", ".", "N", "=", "3", "independent", "cultures", ",", "n", "=", "3", "histological", "sections", ".", "Representative", "images", "of", "sections", "from", "SCC13", "EV", "and", "SCC13", "Act", "(", "clone", "2", ")", "organotypic", "cultures", "stained", "for", "K14", "(", "red", ")", "and", "collagen", "IV", "(", "green", ")", "combined", "with", "Hoechst", "staining", "(", "blue", ")", "and", "quantification", "of", "the", "K14", "-", "positive", "area", "below", "the", "basement", "membrane", "(", "BM", ")", ".", "N", "=", "3", "independent", "cultures", ",", "n", "=", "4", "histological", "sections", ".", "The", "area", "indicated", "with", "a", "white", "rectangle", "in", "the", "left", "picture", "is", "shown", "at", "higher", "magnification", "in", "the", "right", "picture", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1qRT-PCR for INHBA relative to RPL27 using RNA from SCC13 cells transduced with a lentiviral vector allowing expression of INHBA in a doxycycline (DOX)-inducible manner (SCC13 Act clone 1 and 2) or empty vector (EV) (N=3). SCC13 Act and EV cell lines were generated from lentivirally transduced cells upon single cell clonal expansion.Western blot of cell lysate and conditioned media (CM; bottom) of transduced SCC13 cells for the activin βA subunit and GAPDH (loading control for cell lysate) under reducing conditions. The higher molecular weight of recombinant activin βA results from the HA-epitope tag. Ponceau S staining of the membrane was used as a loading control for the CM.Representative pictures of 5 week-old tumors (indicated by arrows) formed in NOD/SCID mice upon intradermal injection of SCC13 Act (clone 2) or SCC13 EV cells and tumor volume at different time points of tumor development. N=3-6 tumors.Representative images of H&E stainings of tumors formed by SCC13 EV and Act cells (clone 2) at day 35 (asterisk indicates cartilage, arrow indicates site of invasion). An inset panel indicates the area where tumor cells invade into the cartilage. Tumor sections were evaluated for invasion through the basement membrane. N=6 (EV), N=6 Act (3 tumors from clone 1 and 3 tumors from clone 2). Tumors from Act mice were pooled in the graph).Tumor weight at endpoint (5 weeks after injection). N=3-6 tumors.Herovici staining and quantification of percentage of collagen-positive (dark blue) area per field of view. N=3 tumors, n=3-4 histological sections.Representative images of sections from tumors formed by SCC13 EV and SCC13 Act (clone 2) stained for Ki67 (red), PDGFR-α (green) and counterstained with Hoechst (blue). Quantification of Ki67/PDGFR-α positive cells is shown in the graph. N=3 tumors, n=3-4 histological sections.Representative images of sections from 3D cultures of primary human skin fibroblasts with either SCC13 EV or SCC13 Act (clones 1 and 2) cells stained with either H&E or Herovici.Quantification of Ki67-positive cells in sections from SCC13 EV and SCC13 Act (clone 2) organotypic cultures (co-stained with E-cadherin to indicate epithelial cells). N=3 independent cultures, n=3 histological sections.Representative images of sections from SCC13 EV and SCC13 Act (clone 2) organotypic cultures stained for K14 (red) and collagen IV (green) combined with Hoechst staining (blue) and quantification of the K14-positive area below the basement membrane (BM). N=3 independent cultures, n=4 histological sections. The area indicated with a white rectangle in the left picture is shown at higher magnification in the right picture."}
{"words": ["Figure", "2Primary", "murine", "dermal", "fibroblasts", ",", "which", "had", "been", "treated", "with", "recombinant", "activin", "A", "at", "different", "concentrations", ",", "were", "analyzed", "for", "BrdU", "incorporation", ".", "N", "=", "3", "-", "4", ".", "Representative", "images", "of", "collagen", "gels", "and", "quantification", "of", "the", "extent", "of", "gel", "contraction", "(", "percentage", "of", "initial", "gel", "size", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "activin", "A", "(", "20", "ng", "/", "ml", ")", "and", "/", "or", "TGF", "-", "β1", "(", "1", "ng", "/", "ml", ")", ".", "N", "=", "3", "-", "4", ".", "qRT", "-", "PCR", "and", "Western", "blot", "analyses", "of", "ACTA2", "/", "αSMA", "expression", "using", "total", "RNA", "/", "lysates", "of", "fibroblasts", "treated", "with", "activin", "A", "or", "TGF", "-", "β1", "for", "6", "h", ".", "N", "=", "3", ".", "The", "membrane", "was", "re", "-", "probed", "with", "GAPDH", "and", "mDia2", "antibodies", ".", "Representative", "images", "of", "fibroblasts", "treated", "with", "activin", "A", ",", "TGF", "-", "β1", "or", "vehicle", "(", "control", ")", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "stained", "for", "αSMA", "(", "green", ")", ",", "counterstained", "with", "rhodamine", "-", "coupled", "phalloidin", "(", "red", ")", "and", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "Bar", "graph", "shows", "percentage", "of", "fibroblasts", "with", "stress", "fibers", ".", "N", "=", "3", ".", "epresentative", "images", "of", "control", "and", "activin", "A", "-", "treated", "fibroblasts", "stained", "with", "rhodamine", "-", "coupled", "phalloidin", ";", "scatter", "plot", "shows", "quantification", "of", "filopodium", "length", "in", "control", ",", "activin", "A", "-", "and", "TGF", "-", "β1", "-", "treated", "fibroblasts", ".", "N", "=", "27", "-", "70", "filopodia", ".", "Scratch", "assay", "of", "fibroblasts", "treated", "with", "activin", "A", "or", "vehicle", "for", "24", "h", ".", "N", "=", "3", ".", "The", "area", "covered", "by", "cells", "in", "the", "original", "scratch", "was", "quantified", ".", "Migration", "in", "one", "control", "culture", "was", "set", "to", "1", ".", "Chemotactic", "migration", "of", "primary", "mouse", "fibroblasts", "from", "wt", "mice", "for", "24", "h", "in", "a", "transwell", "assay", "towards", "increasing", "concentrations", "of", "activin", "A", "or", "vehicle", ".", "N", "=", "3", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "CAF", "marker", "genes", "relative", "to", "Rps29", "using", "RNA", "from", "fibroblasts", "treated", "with", "activin", "A", "for", "6", "h", ".", "N", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Primary murine dermal fibroblasts, which had been treated with recombinant activin A at different concentrations, were analyzed for BrdU incorporation. N=3-4.Representative images of collagen gels and quantification of the extent of gel contraction (percentage of initial gel size) in the presence or absence of activin A (20 ng/ml) and/or TGF-β1 (1 ng/ml). N=3-4.qRT-PCR and Western blot analyses of ACTA2/αSMA expression using total RNA/lysates of fibroblasts treated with activin A or TGF-β1 for 6 h. N=3. The membrane was re-probed with GAPDH and mDia2 antibodies.Representative images of fibroblasts treated with activin A, TGF-β1 or vehicle (control) as in (C), stained for αSMA (green), counterstained with rhodamine-coupled phalloidin (red) and Hoechst (blue). Bar graph shows percentage of fibroblasts with stress fibers. N=3.epresentative images of control and activin A-treated fibroblasts stained with rhodamine-coupled phalloidin; scatter plot shows quantification of filopodium length in control, activin A- and TGF-β1-treated fibroblasts. N=27-70 filopodia.Scratch assay of fibroblasts treated with activin A or vehicle for 24 h. N=3. The area covered by cells in the original scratch was quantified. Migration in one control culture was set to 1.Chemotactic migration of primary mouse fibroblasts from wt mice for 24 h in a transwell assay towards increasing concentrations of activin A or vehicle. N=3.qRT-PCR analysis of CAF marker genes relative to Rps29 using RNA from fibroblasts treated with activin A for 6 h. N=3."}
{"words": ["Figure", "3qRT", "-", "PCR", "for", "INHBA", "relative", "to", "RPL27", "using", "RNA", "from", "primary", "human", "fibroblasts", "transduced", "with", "a", "lentiviral", "vector", "allowing", "expression", "of", "INHBA", "in", "an", "inducible", "manner", "after", "treatment", "with", "DOX", "for", "24", "h", "(", "Fb", "Act", ",", "clones", "1", "and", "2", ")", "or", "with", "empty", "vector", "(", "Fb", "EV", ")", "(", "N", "=", "3", ")", ".", "Fb", "Act", "and", "Fb", "EV", "cultures", "were", "generated", "from", "lentivirally", "-", "transduced", "cells", "upon", "clonal", "expansion", "of", "resistant", "single", "cells", ".", "Western", "blot", "of", "conditioned", "media", "(", "CM", ")", "of", "transduced", "fibroblasts", "showing", "mature", "activin", "βA", ".", "Ponceau", "S", "staining", "of", "the", "membrane", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Chemotactic", "migration", "of", "SCC13", "cells", "for", "24", "h", "in", "a", "transwell", "assay", "containing", "CM", "from", "Fb", "Act", "(", "clone", "2", ")", "or", "Fb", "EV", ".", "N", "=", "4", ".", "Migration", "in", "one", "control", "culture", "was", "set", "to", "1", ".", "Relative", "colony", "area", "of", "SCC13", "cells", "upon", "culture", "in", "CM", "from", "Fb", "Act", "(", "clone", "2", ")", "or", "EV", ".", "N", "=", "3", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "de", "-", "cellularized", "matrix", "from", "Fb", "Act", "(", "clone", "2", ")", "and", "Fb", "EV", "stained", "for", "fibronectin", "or", "collagen", "I", ".", "Relative", "colony", "area", "of", "SCC13", "cells", "plated", "on", "either", "de", "-", "cellularized", "matrix", "from", "Fb", "Act", "(", "clone", "2", ")", "or", "Fb", "EV", ".", "N", "=", "3", ".", "Migration", "of", "SCC13", "cells", "plated", "on", "either", "de", "-", "cellularized", "matrix", "from", "Fb", "Act", "(", "clone", "2", ")", "or", "Fb", "EV", ".", "N", "=", "6", ".", "The", "experimental", "setup", "is", "shown", "schematically", "above", "the", "graph", ".", "Fb", "Act", "(", "clone", "2", ")", "or", "Fb", "EV", "cells", "were", "cultured", "together", "in", "2D", "with", "SCC13", "cells", ".", "After", "7", "day", "of", "culture", "SCC13", "cells", "were", "identified", "by", "K14", "and", "the", "number", "of", "K14", "-", "positive", "colony", "area", "was", "quantified", ".", "N", "=", "6", ".", "Quantification", "of", "SCC13", "tumor", "spheroid", "area", "in", "single", "hanging", "drop", "including", "CM", "from", "Fb", "EV", "or", "Fb", "Act", "(", "clone", "2", ")", "(", "including", "1", "%", "FBS", ")", ",", "DMEM", "/", "1", "%", "FBS", ",", "or", "DMEM", "/", "1", "%", "FBS", "plus", "20", "ng", "/", "mL", "recombinant", "activin", "A", ".", "The", "area", "of", "the", "spheroid", "formed", "in", "one", "Fb", "EV", "sample", "was", "set", "to", "1", ".", "N", "=", "9", "-", "10", "hanging", "drops", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "K14", "-", "stained", "areas", "from", "3D", "cultures", "of", "SCC13", "cells", "seeded", "on", "top", "of", "either", "Fb", "Act", "(", "clone", "2", ")", "or", "Fb", "EV", ".", "N", "=", "3", "independent", "cultures", ",", "n", "=", "3", "histological", "sections", ".", "Representative", "pictures", "of", "tumors", "formed", "in", "NOD", "/", "SCID", "mice", "6", "-", "7", "weeks", "after", "intradermal", "injection", "of", "SCC13", "cells", "with", "Fb", "Act", "(", "clone", "2", ")", "or", "Fb", "EV", ".", "Tumor", "volume", "at", "different", "time", "points", "of", "tumor", "development", "(", "6", "-", "7", "weeks", "after", "injection", ")", ".", "N", "=", "5", "tumors", "per", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3qRT-PCR for INHBA relative to RPL27 using RNA from primary human fibroblasts transduced with a lentiviral vector allowing expression of INHBA in an inducible manner after treatment with DOX for 24 h (Fb Act, clones 1 and 2) or with empty vector (Fb EV) (N=3). Fb Act and Fb EV cultures were generated from lentivirally-transduced cells upon clonal expansion of resistant single cells.Western blot of conditioned media (CM) of transduced fibroblasts showing mature activin βA. Ponceau S staining of the membrane was used as a loading control.Chemotactic migration of SCC13 cells for 24 h in a transwell assay containing CM from Fb Act (clone 2) or Fb EV. N=4. Migration in one control culture was set to 1.Relative colony area of SCC13 cells upon culture in CM from Fb Act (clone 2) or EV. N=3.Representative immunofluorescence images of de-cellularized matrix from Fb Act (clone 2) and Fb EV stained for fibronectin or collagen I.Relative colony area of SCC13 cells plated on either de-cellularized matrix from Fb Act (clone 2) or Fb EV. N=3.Migration of SCC13 cells plated on either de-cellularized matrix from Fb Act (clone 2) or Fb EV. N=6. The experimental setup is shown schematically above the graph.Fb Act (clone 2) or Fb EV cells were cultured together in 2D with SCC13 cells. After 7 day of culture SCC13 cells were identified by K14 and the number of K14-positive colony area was quantified. N=6.Quantification of SCC13 tumor spheroid area in single hanging drop including CM from Fb EV or Fb Act (clone 2) (including 1% FBS), DMEM/1% FBS, or DMEM/1% FBS plus 20 ng/mL recombinant activin A. The area of the spheroid formed in one Fb EV sample was set to 1. N=9-10 hanging drops.Representative images and quantification of K14-stained areas from 3D cultures of SCC13 cells seeded on top of either Fb Act (clone 2) or Fb EV. N=3 independent cultures, n=3 histological sections.Representative pictures of tumors formed in NOD/SCID mice 6-7 weeks after intradermal injection of SCC13 cells with Fb Act (clone 2) or Fb EV. Tumor volume at different time points of tumor development (6-7 weeks after injection). N=5 tumors per group."}
{"words": ["Figure", "4mDia2", "(", "Diap3", ")", "expression", "quantified", "by", "RNA", "sequencing", "of", "fibroblasts", "isolated", "from", "ear", "skin", ".", "N", "=", "3", "pools", "of", "3", "-", "6", "mice", ".", "Primary", "mouse", "fibroblasts", "were", "treated", "with", "activin", "A", "or", "TGF", "-", "β1", "or", "vehicle", "for", "6h", "and", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "N", "=", "3", ")", "and", "Western", "blot", "for", "mDia2", "(", "Diap3", ")", "and", "mDia2", "expression", ",", "respectively", ".", "The", "GAPDH", "loading", "control", "is", "identical", "to", "the", "one", "in", "Fig", "2C", ",", "since", "the", "same", "membrane", "was", "probed", "for", "mDia2", ",", "αSMA", "and", "GAPDH", ".", "Immortalized", "mouse", "fibroblasts", "were", "transduced", "with", "a", "lentivirus", "expressing", "a", "DOX", "-", "inducible", "dominant", "-", "negative", "ActRIB", "mutant", "(", "dnActRIB", ")", "or", "an", "empty", "lentivirus", "(", "EV", ")", ",", "treated", "with", "activin", "A", "for", "2", ".", "5", "h", "and", "analyzed", "by", "Western", "blot", "for", "mDia2", "and", "GAPDH", ".", "Representative", "sections", "of", "ear", "skin", "tumors", "formed", "by", "SCC13", "EV", "or", "SCC13", "Act", "cells", "(", "clone", "2", ")", "stained", "for", "mDia2", "or", "K14", "(", "green", ")", "(", "top", ")", ",", "mDia2", "(", "green", ")", "or", "MECA32", "/", "LYVE1", "(", "red", ",", "bottom", ")", "and", "counterstained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4mDia2 (Diap3) expression quantified by RNA sequencing of fibroblasts isolated from ear skin. N=3 pools of 3-6 mice.Primary mouse fibroblasts were treated with activin A or TGF-β1 or vehicle for 6h and analyzed by qRT-PCR (N=3) and Western blot for mDia2 (Diap3) and mDia2 expression, respectively. The GAPDH loading control is identical to the one in Fig 2C, since the same membrane was probed for mDia2, αSMA and GAPDH.Immortalized mouse fibroblasts were transduced with a lentivirus expressing a DOX-inducible dominant-negative ActRIB mutant (dnActRIB) or an empty lentivirus (EV), treated with activin A for 2.5 h and analyzed by Western blot for mDia2 and GAPDH.Representative sections of ear skin tumors formed by SCC13 EV or SCC13 Act cells (clone 2) stained for mDia2 or K14 (green) (top), mDia2 (green) or MECA32/LYVE1 (red, bottom) and counterstained with Hoechst (blue)."}
{"words": ["Figure", "5qRT", "-", "PCR", "for", "mDia2", "/", "DIAPH3", "relative", "to", "RPL27", "using", "RNA", "from", "normal", "human", "skin", "(", "N", "=", "11", ")", ",", "SCCs", "(", "N", "=", "9", ")", "and", "BCCs", "(", "N", "=", "7", ")", ".", "Representative", "skin", "/", "tumor", "sections", "from", "normal", "human", "skin", ",", "SCC", "and", "BCC", "patients", "stained", "for", "mDia2", "/", "DIAPH3", ".", "Note", "the", "strong", "mDia2", "/", "DIAPH3", "-", "positivity", "in", "the", "tumor", "stroma", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "D", ":", "Dermis", ",", "E", ":", "Epidermis", ":", "T", ":", "Tumor", ".", "Expression", "levels", "of", "mDia2", "/", "DIAPH3", "in", "tumor", "and", "normal", "tissues", "based", "on", "TCGA", "cancer", "data", "(", "TCGA", "data", "version", "20141017", ",", "http", ":", "/", "/", "firebrowse", ".", "org", "/", ")", ".", "Gene", "expression", "levels", "were", "presented", "as", "normalized", "log2", "RSEM", "(", "RNA", "-", "Seq", "by", "Expectation", "-", "Maximization", ")", "index", "from", "the", "database", ".", "BLCA", ":", "Bladder", "Urothelial", "Carcinoma", "(", "N", "=", "408", "&", "19", "tumor", "and", "normal", "tissue", "samples", ",", "respectively", ")", ",", "BRCA", ":", "Breast", "Invasive", "Carcinoma", "(", "N", "=", "1100", "&", "112", ")", ",", "CESC", ":", "Cervical", "SCC", "(", "N", "=", "306", "&", "3", ")", ",", "ESCA", ":", "Esophageal", "SCC", "(", "N", "=", "185", "&", "11", ")", ",", "HNSC", ":", "Head", "-", "Neck", "SCC", "(", "N", "=", "522", "&", "44", ")", ",", "LIHC", ":", "Liver", "Hepatocellular", "Carcinoma", "(", "N", "=", "373", "&", "47", ")", ",", "LUSC", ":", "Lung", "SCC", "(", "N", "=", "501", "&", "51", ")", ",", "PAAD", ":", "Pancreatic", "Adenocarcinoma", "(", "N", "=", "179", "&", "4", ")", ",", "PRAD", ":", "Prostate", "Adenocarcinoma", "(", "N", "=", "496", "&", "50", ")", ",", "READ", ":", "Rectum", "Adenocarcinoma", "(", "N", "=", "167", "&", "10", ")", ",", "STES", ":", "Stomach", "and", "Esophageal", "Carcinoma", "(", "N", "=", "600", "&", "46", ")", ",", "UCEC", ":", "Uterine", "Corpus", "Endometrial", "Carcinoma", "(", "N", "=", "546", "&", "35", ")", ".", "Box", "plot", "shows", "relative", "mDia2", "/", "DIAPH3", "expression", "in", "human", "tumor", "(", "red", ")", "and", "normal", "(", "blue", ")", "tissue", ".", "Boxes", "indicate", "the", "interquartile", "range", ",", "whiskers", "indicate", "data", "points", "within", "1", ".", "5", "times", "interquartile", "range", ",", "dots", "outside", "the", "whiskers", "indicate", "outliers", ",", "and", "the", "central", "line", "indicates", "median", ".", "Relative", "gene", "expression", "of", "mDia2", "/", "DIAPH3", "and", "INHBA", "in", "the", "stroma", "of", "intrahepatic", "cholangiocarcinoma", ",", "breast", "and", "colorectal", "cancers", "vs", ".", "stroma", "of", "respective", "normal", "tissues", "based", "on", "datasets", "GSE45001", "(", "D", ")", "(", "N", "=", "10", "normal", "tissue", "&", "10", "cancer", "samples", ",", "GSE9014", "(", "E", ")", "(", "N", "=", "4", "&", "13", ")", ",", "and", "GSE35602", "(", "F", ")", "(", "N", "=", "6", "&", "53", ")", ",", "and", "in", "CAFs", "from", "breast", "cancer", "samples", "vs", ".", "normal", "breast", "fibroblasts", "(", "GSE29270", "dataset", ")", "(", "G", ")", "(", "N", "=", "5", "&", "23", ")", ".", "NS", ":", "Normal", "stroma", ",", "CS", ":", "Cancer", "stroma", ",", "NF", ":", "Normal", "fibroblasts", ",", "CAF", ":", "Cancer", "-", "associated", "fibroblasts", ")", ".", "The", "expression", "values", "of", "the", "datasets", "were", "obtained", "using", "GEO2R", "tool", "in", "the", "GEO", "database", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "based", "on", "datasets", "from", "GEO", ",", "EGA", "and", "TCGA", ",", "demonstrating", "that", "high", "expression", "of", "both", "mDia2", "/", "DIAPH3", "and", "INHBA", "in", "patients", "with", "liver", ",", "stomach", "and", "breast", "cancer", "correlates", "with", "poor", "overall", "survival", ".", "Data", "and", "statistical", "analyses", "were", "collected", "from", "KMPlotter", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5qRT-PCR for mDia2/DIAPH3 relative to RPL27 using RNA from normal human skin (N=11), SCCs (N=9) and BCCs (N=7).Representative skin/tumor sections from normal human skin, SCC and BCC patients stained for mDia2/DIAPH3. Note the strong mDia2/DIAPH3-positivity in the tumor stroma. Scale bars: 100 μm. D: Dermis, E: Epidermis: T: Tumor.Expression levels of mDia2/DIAPH3 in tumor and normal tissues based on TCGA cancer data (TCGA data version 20141017, http://firebrowse.org/). Gene expression levels were presented as normalized log2 RSEM (RNA-Seq by Expectation-Maximization) index from the database. BLCA: Bladder Urothelial Carcinoma (N = 408 & 19 tumor and normal tissue samples, respectively), BRCA: Breast Invasive Carcinoma (N = 1100 & 112), CESC: Cervical SCC (N = 306 & 3), ESCA: Esophageal SCC (N = 185 & 11), HNSC: Head-Neck SCC (N = 522 & 44), LIHC: Liver Hepatocellular Carcinoma (N = 373 & 47), LUSC: Lung SCC (N = 501 & 51), PAAD: Pancreatic Adenocarcinoma (N = 179 & 4), PRAD: Prostate Adenocarcinoma (N = 496 & 50), READ: Rectum Adenocarcinoma (N = 167 & 10), STES: Stomach and Esophageal Carcinoma (N = 600 & 46), UCEC: Uterine Corpus Endometrial Carcinoma (N = 546 & 35). Box plot shows relative mDia2/DIAPH3 expression in human tumor (red) and normal (blue) tissue. Boxes indicate the interquartile range, whiskers indicate data points within 1.5 times interquartile range, dots outside the whiskers indicate outliers, and the central line indicates median.Relative gene expression of mDia2/DIAPH3 and INHBA in the stroma of intrahepatic cholangiocarcinoma, breast and colorectal cancers vs. stroma of respective normal tissues based on datasets GSE45001 (D) (N = 10 normal tissue & 10 cancer samples, GSE9014 (E) (N = 4 & 13), and GSE35602 (F) (N = 6 & 53), and in CAFs from breast cancer samples vs. normal breast fibroblasts (GSE29270 dataset) (G) (N = 5 & 23). NS: Normal stroma, CS: Cancer stroma, NF: Normal fibroblasts, CAF: Cancer-associated fibroblasts). The expression values of the datasets were obtained using GEO2R tool in the GEO database.Kaplan-Meier survival curves based on datasets from GEO, EGA and TCGA, demonstrating that high expression of both mDia2/DIAPH3 and INHBA in patients with liver, stomach and breast cancer correlates with poor overall survival. Data and statistical analyses were collected from KMPlotter."}
{"words": ["Figure", "6Immortalized", "mouse", "fibroblasts", "were", "transduced", "with", "a", "lentiviral", "vector", "expressing", "different", "mDia2", "-", "targeting", "shRNAs", "(", "shmDia2", "#", "1", "-", "3", ")", "or", "empty", "vector", "(", "sh", "-", "EV", ")", ".", "The", "knock", "-", "down", "was", "confirmed", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "N", "=", "3", ")", ",", "Western", "blot", "and", "immunofluorescence", ".", "Ki67", "staining", "of", "mDia2", "knock", "-", "down", "and", "control", "mouse", "fibroblasts", ".", "N", "=", "3", ".", "migration", "in", "scratch", "assays", "of", "mDia2", "knock", "-", "down", "and", "control", "mouse", "fibroblasts", ".", "N", "=", "3", ".", "qRT", "-", "PCR", "for", "mDia1", ",", "mDia3", ",", "Fmn1", "and", "Fmn2", "and", "several", "CAF", "genes", "relative", "to", "Rps29", "using", "RNA", "from", "control", "(", "sh", "-", "EV", ")", "and", "mDia2", "knock", "-", "down", "(", "sh", "-", "mDia2", ")", "fibroblasts", ".", "N", "=", "3", ".", "Representative", "images", "of", "mDia2", "knockdown", "and", "control", "mouse", "fibroblasts", "stained", "for", "p53", "(", "left", ")", ",", "and", "quantification", "of", "cells", "showing", "accumulation", "of", "p53", "in", "the", "nucleus", "(", "right", ")", ".", "N", "=", "3", ".", "Representative", "Western", "blots", "for", "p53", ",", "vinculin", "and", "histone", "H1", "using", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "fractions", "and", "total", "lysate", "of", "mDia2", "knock", "-", "down", "(", "F", ")", "or", "activin", "A", "-", "treated", "fibroblasts", "(", "6h", ",", "20", "ng", "/", "ml", ")", "(", "G", ")", "and", "control", "mouse", "fibroblasts", "and", "quantification", "of", "the", "nuclear", "p53", "/", "histone", "H1", "ratio", ".", "Vinculin", "and", "histone", "H1", "were", "used", "as", "loading", "controls", "for", "the", "cytoplasmic", "and", "nuclear", "fractions", ",", "respectively", ".", "N", "=", "6", ".", "Representative", "Western", "blots", "for", "p53", ",", "mDia2", "and", "GAPDH", "using", "total", "lysates", "of", "mDia2", "knock", "-", "down", "and", "control", "mouse", "fibroblasts", "treated", "for", "24", "h", "with", "pifithrin", "-", "α", "(", "PFT", "-", "α", ")", "(", "15", "μM", ")", ".", "Representative", "p53", "immunofluorescence", "images", "of", "mDia2", "knock", "-", "down", "mouse", "fibroblasts", "treated", "with", "PFT", "-", "α", "or", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "(", "top", ")", "and", "quantification", "of", "cells", "showing", "accumulation", "of", "p53", "in", "the", "nucleus", "(", "bottom", ")", ".", "N", "=", "3", ".", "qRT", "-", "PCR", "for", "mDia2", ",", "Postn", ",", "Mmp13", ",", "Fn1", ",", "Spp1", "and", "Acta2", "relative", "to", "Rps29", "using", "RNA", "from", "mDia2", "knock", "-", "down", "and", "control", "fibroblasts", "treated", "with", "PFT", "-", "α", "or", "vehicle", ".", "N", "=", "3", ".", "Colony", "size", "of", "SCC13", "Act", "cells", "(", "clone", "2", ")", "after", "co", "-", "culture", "with", "either", "immortalized", "mDia2", "knockdown", "(", "sh", "-", "mDia2", ")", "or", "control", "(", "sh", "-", "EV", ")", "mouse", "fibroblasts", ".", "N", "=", "4", ".", "Representative", "pictures", "of", "5", "-", "week", "-", "old", "tumors", "formed", "upon", "intradermal", "co", "-", "injection", "of", "SCC13", "Act", "cells", "(", "clone", "2", ")", "with", "sh", "-", "EV", "or", "sh", "-", "mDia2", "knock", "-", "down", "immortalized", "mouse", "fibroblasts", ".", "Graph", "shows", "tumor", "volume", "at", "different", "timepoints", "of", "tumor", "development", ".", "N", "=", "3", "-", "5", "tumors", "per", "group", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "sections", "from", "ear", "skin", "tumors", "formed", "by", "SCC13", "Act", "(", "clone", "2", ")", "co", "-", "injected", "with", "sh", "-", "EV", "or", "sh", "-", "mDia2", "fibroblasts", ",", "stained", "for", "E", "-", "cadherin", "(", "green", ")", "and", "periostin", "or", "p53", "(", "red", ")", ",", "counterstained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Immortalized mouse fibroblasts were transduced with a lentiviral vector expressing different mDia2-targeting shRNAs (shmDia2 #1-3) or empty vector (sh-EV). The knock-down was confirmed by qRT-PCR (N=3), Western blot and immunofluorescence.Ki67 staining of mDia2 knock-down and control mouse fibroblasts. N=3.migration in scratch assays of mDia2 knock-down and control mouse fibroblasts. N=3.qRT-PCR for mDia1, mDia3, Fmn1 and Fmn2 and several CAF genes relative to Rps29 using RNA from control (sh-EV) and mDia2 knock-down (sh-mDia2) fibroblasts. N=3.Representative images of mDia2 knockdown and control mouse fibroblasts stained for p53 (left), and quantification of cells showing accumulation of p53 in the nucleus (right). N=3.Representative Western blots for p53, vinculin and histone H1 using nuclear and cytoplasmic fractions and total lysate of mDia2 knock-down (F) or activin A-treated fibroblasts (6h, 20 ng/ml) (G) and control mouse fibroblasts and quantification of the nuclear p53/histone H1 ratio. Vinculin and histone H1 were used as loading controls for the cytoplasmic and nuclear fractions, respectively. N=6.Representative Western blots for p53, mDia2 and GAPDH using total lysates of mDia2 knock-down and control mouse fibroblasts treated for 24 h with pifithrin-α (PFT-α) (15 μM).Representative p53 immunofluorescence images of mDia2 knock-down mouse fibroblasts treated with PFT-α or vehicle (DMSO) (top) and quantification of cells showing accumulation of p53 in the nucleus (bottom). N=3.qRT-PCR for mDia2, Postn, Mmp13, Fn1, Spp1 and Acta2 relative to Rps29 using RNA from mDia2 knock-down and control fibroblasts treated with PFT-α or vehicle. N=3.Colony size of SCC13 Act cells (clone 2) after co-culture with either immortalized mDia2 knockdown (sh-mDia2) or control (sh-EV) mouse fibroblasts. N=4.Representative pictures of 5-week-old tumors formed upon intradermal co-injection of SCC13 Act cells (clone 2) with sh-EV or sh-mDia2 knock-down immortalized mouse fibroblasts. Graph shows tumor volume at different timepoints of tumor development. N=3-5 tumors per group.Representative immunofluorescence images of sections from ear skin tumors formed by SCC13 Act (clone 2) co-injected with sh-EV or sh-mDia2 fibroblasts, stained for E-cadherin (green) and periostin or p53 (red), counterstained with Hoechst (blue)."}
{"words": ["Figure", "7Tumor", "volume", "at", "different", "time", "points", "after", "co", "-", "injection", "of", "SCC13", "cells", "with", "EV", "or", "dnActRIB", "fibroblasts", ".", "N", "=", "5", "tumors", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "sections", "from", "ear", "skin", "tumors", "formed", "by", "SCC13", "cells", "co", "-", "injected", "with", "EV", "or", "dnActRIB", "fibroblasts", "stained", "for", "K14", "(", "left", ")", "or", "PDGFRα", "(", "right", ")", "(", "green", ")", "and", "mDia2", "(", "red", ")", ",", "counterstained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "Bar", "graph", "shows", "the", "percentage", "of", "mDia2", "-", "positive", "area", ".", "N", "=", "3", ".", "SCC13", "EV", "or", "SCC13", "Fst", "cells", "were", "injected", "into", "the", "ear", "skin", "of", "NOD", "/", "SCID", "mice", "and", "tumor", "weight", "was", "determined", "12", "weeks", "after", "injection", ".", "N", "=", "9", "-", "10", "tumors", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "sections", "from", "ear", "skin", "tumors", "formed", "by", "SCC13", "EV", "or", "SSC13", "Fst", "cells", "stained", "for", "K14", "or", "mDia2", "(", "red", ")", ",", "counterstained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "Bar", "graph", "shows", "the", "percentage", "of", "mDia2", "-", "positive", "area", ".", "N", "=", "3", ".", "Tumors", "formed", "by", "SCC13", "Act", "cells", "were", "treated", "ex", "vivo", "for", "6h", "with", "follistatin", "(", "FST", ")", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", "and", "/", "or", "SMIFH2", "(", "10", "μM", ")", ",", "or", "with", "activin", "A", "(", "20", "ng", "/", "ml", ")", "and", "stained", "for", "Ki67", ".", "N", "=", "3", "tumor", "explants", ",", "n", "=", "4", "histological", "sections", ".", "Representative", "images", "of", "spheroids", "formed", "by", "SCC13", "Act", "cells", "labeled", "with", "PKH67", "(", "green", ")", "with", "primary", "human", "fibroblasts", "embedded", "in", "collagen", "gels", "and", "graph", "showing", "increase", "in", "the", "spheroid", "area", "between", "day", "0", "and", "day", "3", ".", "Spheroids", "were", "either", "treated", "with", "FST", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", "or", "SMIFH2", "(", "10", "μM", ")", "or", "left", "untreated", ".", "N", "=", "6", "-", "8", "tumor", "spheroids", ".", "Increase", "in", "A431", "tumor", "volume", "(", "mm3", ")", "compared", "to", "day", "0", "(", "time", "when", "the", "tumors", "were", "first", "injected", "with", "FST", ",", "approximately", "3", "-", "4", "weeks", "after", "injection", "of", "the", "cells", ")", "upon", "treatment", "of", "the", "tumors", "with", "FST", "(", "100", "ng", "per", "injection", ")", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", ".", "N", "=", "3", "-", "5", "tumors", "per", "group", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "the", "FST", "or", "vehicle", "-", "treated", "tumors", ",", "stained", "for", "mDia2", "(", "green", ")", "and", "K14", "(", "red", ")", ",", "counterstained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Tumor volume at different time points after co-injection of SCC13 cells with EV or dnActRIB fibroblasts. N=5 tumors.Representative immunofluorescence images of sections from ear skin tumors formed by SCC13 cells co-injected with EV or dnActRIB fibroblasts stained for K14 (left) or PDGFRα (right) (green) and mDia2 (red), counterstained with Hoechst (blue). Bar graph shows the percentage of mDia2-positive area. N=3.SCC13 EV or SCC13 Fst cells were injected into the ear skin of NOD/SCID mice and tumor weight was determined 12 weeks after injection. N=9-10 tumors.Representative immunofluorescence images of sections from ear skin tumors formed by SCC13 EV or SSC13 Fst cells stained for K14 or mDia2 (red), counterstained with Hoechst (blue). Bar graph shows the percentage of mDia2-positive area. N=3.Tumors formed by SCC13 Act cells were treated ex vivo for 6h with follistatin (FST) (50 ng/ml) and/or SMIFH2 (10 μM), or with activin A (20 ng/ml) and stained for Ki67. N=3 tumor explants, n=4 histological sections.Representative images of spheroids formed by SCC13 Act cells labeled with PKH67 (green) with primary human fibroblasts embedded in collagen gels and graph showing increase in the spheroid area between day 0 and day 3. Spheroids were either treated with FST (50 ng/ml) or SMIFH2 (10 μM) or left untreated. N=6-8 tumor spheroids.Increase in A431 tumor volume (mm3) compared to day 0 (time when the tumors were first injected with FST, approximately 3-4 weeks after injection of the cells) upon treatment of the tumors with FST (100 ng per injection) or vehicle (PBS). N=3-5 tumors per group. Representative immunofluorescence images the FST or vehicle-treated tumors, stained for mDia2 (green) and K14 (red), counterstained with Hoechst (blue)."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "BAL", "from", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "neonatal", "i", ".", "n", ".", "transfer", "of", "YS", "EMP", "from", "CD45", ".", "1", "+", "E10", ".", "5", "embryos", ",", "8", "-", "week", "old", "un", "-", "transferred", "Csf2ra", "-", "/", "-", ",", "and", "WT", "(", "CD45", ".", "2", ")", "mice", ".", "Pre", "-", "gated", "viable", "CD45", "+", "singlets", ".", "Numbers", "of", "EMP", "effectively", "transferred", "in", "neonates", "(", "white", "circle", ")", "and", "numbers", "of", "EMP", "-", "derived", "AM", "(", "red", "circles", ")", "in", "BAL", "and", "lung", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "transfer", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Numbers", "of", "EMP", "-", "derived", "AM", "in", "the", "BAL", "(", "left", ")", "and", "lung", "(", "right", ")", "(", "C", ")", "in", "the", "BAL", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "transfer", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ".", "total", "protein", "in", "the", "BAL", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "transfer", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ".", "total", "eFluor780", "+", "events", "(", "E", ")", "in", "the", "BAL", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "transfer", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "(", "left", ")", "and", "percentage", "of", "donor", "-", "derived", "AM", "(", "right", ")", "in", "the", "BAL", "and", "lung", "from", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "1", ":", "1", ":", "1", "mixture", "with", "E17", ".", "5", "fetal", "liver", "(", "FeLi", ")", "monocytes", "(", "Mo", ")", "(", "CD45", ".", "1", "+", ")", ",", "E14", ".", "5", "FeLi", "Mo", "(", "CD45", ".", "1", "+", "CD45", ".", "2", "+", ")", ",", "and", "E10", ".", "5", "YS", "EMP", "(", "CD45", ".", "2", "+", ")", "(", "F", ")", "or", "E17", ".", "5", "fetal", "lung", "(", "FeLu", ")", "Mo", "(", "CD45", ".", "1", "+", ")", ",", "E14", ".", "5", "FeLu", "Mo", "(", "CD45", ".", "1", "+", "CD45", ".", "2", "+", ")", ",", "and", "E10", ".", "5", "YS", "EMP", "(", "CD45", ".", "2", "+", ")", "(", "G", ")", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative flow cytometric analysis of BAL from Csf2ra-/- recipients 8 weeks after neonatal i.n. transfer of YS EMP from CD45.1+ E10.5 embryos, 8-week old un-transferred Csf2ra-/-, and WT (CD45.2) mice. Pre-gated viable CD45+ singlets.Numbers of EMP effectively transferred in neonates (white circle) and numbers of EMP-derived AM (red circles) in BAL and lung of adult Csf2ra-/- recipients 8 weeks after transfer (n = 5 mice).Numbers of EMP-derived AM in the BAL (left) and lung (right) (C) in the BAL of adult Csf2ra-/- recipients 8 weeks after transfer (n = 5 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 3 mice) and WT (n = 3 mice) were included as negative and positive controls.total protein in the BAL of adult Csf2ra-/- recipients 8 weeks after transfer (n = 5 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 3 mice) and WT (n = 3 mice) were included as negative and positive controls.total eFluor780+ events (E) in the BAL of adult Csf2ra-/- recipients 8 weeks after transfer (n = 5 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 3 mice) and WT (n = 3 mice) were included as negative and positive controls.Representative flow cytometric analysis (left) and percentage of donor-derived AM (right) in the BAL and lung from Csf2ra-/- recipients 8 weeks after neonatal transfer of 1:1:1 mixture with E17.5 fetal liver (FeLi) monocytes (Mo) (CD45.1+), E14.5 FeLi Mo (CD45.1+CD45.2+), and E10.5 YS EMP (CD45.2+) (F) or E17.5 fetal lung (FeLu) Mo (CD45.1+), E14.5 FeLu Mo (CD45.1+CD45.2+), and E10.5 YS EMP (CD45.2+) (G) (n = 3 mice)."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "(", "left", ")", "and", "percentage", "of", "donor", "-", "derived", "AM", "(", "right", ")", "in", "the", "BAL", "(", "top", ")", "and", "lung", "(", "bottom", ")", "from", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "10", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "1", ":", "1", "mixture", "with", "CD45", ".", "1", "+", "E14", ".", "5", "FeLi", "Mo", "and", "CD45", ".", "2", "+", "E14", ".", "5", "FeLi", "pMΦ", "(", "Group", "1", ")", "or", "CD45", ".", "1", "+", "E14", ".", "5", "FeLi", "pMΦ", "and", "CD45", ".", "2", "+", "FeLi", "Mo", "(", "Group", "2", ")", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "The", "expansion", "fold", "of", "donor", "cells", "in", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "10", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "cells", "described", "above", "in", "A", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "(", "left", ")", "and", "percentage", "of", "donor", "-", "derived", "AM", "(", "right", ")", "of", "BAL", "and", "lung", "from", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "1", ":", "1", ":", "1", "mixture", "with", "CD45", ".", "1", "+", "E17", ".", "5", "FeLi", "pMΦ", ",", "CD45", ".", "1", "+", "CD45", ".", "2", "+", "E14", ".", "5", "FeLi", "pMΦ", ",", "and", "CD45", ".", "2", "+", "E10", ".", "5", "YS", "pMΦ", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "Total", "numbers", "of", "donor", "-", "derived", "AM", "in", "the", "BAL", "and", "lung", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "transfer", "of", "cells", "described", "above", "in", "C", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "(", "left", ")", "and", "percentage", "of", "donor", "-", "derived", "AM", "(", "right", ")", "of", "BAL", "and", "lung", "from", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "1", ":", "1", ":", "1", "mixture", "with", "CD45", ".", "1", "+", "E17", ".", "5", "FeLu", "pMΦ", ",", "CD45", ".", "1", "+", "CD45", ".", "2", "+", "E14", ".", "5", "FeLu", "pMΦ", ",", "and", "CD45", ".", "2", "+", "E10", ".", "5", "YS", "pMΦ", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "Total", "numbers", "of", "donor", "-", "derived", "AM", "in", "the", "BAL", "and", "lung", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "8", "weeks", "after", "transfer", "of", "cells", "described", "above", "in", "E", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "(", "left", ")", "and", "percentage", "of", "donor", "-", "derived", "AM", "(", "right", ")", "in", "the", "BAL", "and", "lung", "from", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "7", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "1", ":", "1", "mixture", "with", "CD45", ".", "1", "+", "E14", ".", "5", "FeLi", "Mo", "from", "WT", "embryos", "and", "CD45", ".", "2", "+", "E14", ".", "5", "FeLi", "pMΦ", "from", "Myb", "-", "/", "-", "(", "G", ")", "or", "Myb", "+", "/", "+", "(", "H", ")", "embryos", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative flow cytometric analysis (left) and percentage of donor-derived AM (right) in the BAL (top) and lung (bottom) from Csf2ra-/- recipients 10 weeks after neonatal transfer of 1:1 mixture with CD45.1+ E14.5 FeLi Mo and CD45.2+ E14.5 FeLi pMΦ (Group 1) or CD45.1+ E14.5 FeLi pMΦ and CD45.2+ FeLi Mo (Group 2) (n = 3 mice). The expansion fold of donor cells in Csf2ra-/- recipients 10 weeks after neonatal transfer of cells described above in A (n = 3 mice).Representative flow cytometric analysis (left) and percentage of donor-derived AM (right) of BAL and lung from Csf2ra-/- recipients 8 weeks after neonatal transfer of 1:1:1 mixture with CD45.1+ E17.5 FeLi pMΦ, CD45.1+CD45.2+ E14.5 FeLi pMΦ, and CD45.2+ E10.5 YS pMΦ (n = 3 mice). Total numbers of donor-derived AM in the BAL and lung of adult Csf2ra-/- recipients 8 weeks after transfer of cells described above in C (n = 3 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 3 mice) and WT (n = 3 mice) were included as negative and positive controls.Representative flow cytometric analysis (left) and percentage of donor-derived AM (right) of BAL and lung from Csf2ra-/- recipients 8 weeks after neonatal transfer of 1:1:1 mixture with CD45.1+ E17.5 FeLu pMΦ, CD45.1+CD45.2+ E14.5 FeLu pMΦ, and CD45.2+ E10.5 YS pMΦ (n = 3 mice). Total numbers of donor-derived AM in the BAL and lung of adult Csf2ra-/- recipients 8 weeks after transfer of cells described above in E (n = 3 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 3 mice) and WT (n = 3 mice) were included as negative and positive controls.Representative flow cytometric analysis (left) and percentage of donor-derived AM (right) in the BAL and lung from Csf2ra-/- recipients 7 weeks after neonatal transfer of 1:1 mixture with CD45.1+ E14.5 FeLi Mo from WT embryos and CD45.2+ E14.5 FeLi pMΦ from Myb-/- (G) or Myb+/+ (H) embryos (n = 3 mice)."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "BAL", "from", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "7", "weeks", "after", "neonatal", "i", ".", "n", ".", "transfer", "of", "pMΦ", "or", "fetal", "Mo", "from", "CD45", ".", "1", "+", "E14", ".", "5", "fetal", "livers", ",", "7", "-", "week", "old", "un", "-", "transferred", "Csf2ra", "-", "/", "-", ",", "WT", "(", "CD45", ".", "2", ")", "mice", ".", "Pre", "-", "gated", "viable", "CD45", "+", "singlets", ".", "Numbers", "of", "donor", "-", "derived", "AM", "in", "the", "BAL", "(", "left", ")", "and", "lung", "(", "right", ")", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "7", "weeks", "(", "B", ")", "or", "1", "year", "(", "C", ")", "after", "neonatal", "transfer", "of", "cells", "described", "in", "A", "(", "n", "=", "7", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "4", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ".", "Total", "protein", "in", "the", "BAL", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "7", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "cells", "described", "in", "A", "(", "n", "=", "7", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "4", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ".", "total", "eFluor780", "+", "events", "in", "the", "BAL", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "7", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "cells", "described", "in", "A", "(", "n", "=", "7", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "4", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ".", "Total", "protein", "in", "the", "BAL", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "1", "year", "(", "F", ",", "G", ")", "after", "neonatal", "transfer", "of", "cells", "described", "in", "A", "(", "n", "=", "7", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "4", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ".", "total", "eFluor780", "+", "events", "in", "the", "BAL", "of", "adult", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "1", "year", "(", "F", ",", "G", ")", "after", "neonatal", "transfer", "of", "cells", "described", "in", "A", "(", "n", "=", "7", "mice", ")", ".", "Age", "-", "matched", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", "and", "WT", "(", "n", "=", "4", "mice", ")", "were", "included", "as", "negative", "and", "positive", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative flow cytometric analysis of BAL from Csf2ra-/- recipients 7 weeks after neonatal i.n. transfer of pMΦ or fetal Mo from CD45.1+ E14.5 fetal livers, 7-week old un-transferred Csf2ra-/-, WT (CD45.2) mice. Pre-gated viable CD45+ singlets.Numbers of donor-derived AM in the BAL (left) and lung (right) of adult Csf2ra-/- recipients 7 weeks (B) or 1 year (C) after neonatal transfer of cells described in A (n = 7 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 5 mice) and WT (n = 4 mice) were included as negative and positive controls.Total protein in the BAL of adult Csf2ra-/- recipients 7 weeks after neonatal transfer of cells described in A (n = 7 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 5 mice) and WT (n = 4 mice) were included as negative and positive controls.total eFluor780+ events in the BAL of adult Csf2ra-/- recipients 7 weeks after neonatal transfer of cells described in A (n = 7 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 5 mice) and WT (n = 4 mice) were included as negative and positive controls.Total protein in the BAL of adult Csf2ra-/- recipients 1 year (F, G) after neonatal transfer of cells described in A (n = 7 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 5 mice) and WT (n = 4 mice) were included as negative and positive controls.total eFluor780+ events in the BAL of adult Csf2ra-/- recipients 1 year (F, G) after neonatal transfer of cells described in A (n = 7 mice). Age-matched Csf2ra-/- (KO) (n = 5 mice) and WT (n = 4 mice) were included as negative and positive controls."}
{"words": ["Figure", "4Body", "weight", "measurement", "of", "influenza", "virus", "(", "20", "pfu", "of", "PR8", "strain", ")", "-", "infected", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "24", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "pMΦ", "or", "fetal", "Mo", "from", "E14", ".", "5", "fetal", "livers", "(", "n", "=", "7", "mice", "from", "each", "transferred", "group", ")", ",", "24", "-", "week", "old", "un", "-", "transferred", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "and", "WT", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "temperature", "(", "B", ")", "measurement", "of", "influenza", "virus", "(", "20", "pfu", "of", "PR8", "strain", ")", "-", "infected", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "24", "weeks", "after", "neonatal", "transfer", "of", "pMΦ", "or", "fetal", "Mo", "from", "E14", ".", "5", "fetal", "livers", "(", "n", "=", "7", "mice", "from", "each", "transferred", "group", ")", ",", "24", "-", "week", "old", "un", "-", "transferred", "Csf2ra", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "and", "WT", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Oxygen", "(", "O2", ")", "saturation", "in", "influenza", "-", "infected", "mice", "described", "in", "A", ",", "B", "7", "days", "post", "-", "infection", "(", "p", ".", "i", ".", ")", "(", "n", "=", "5", "mice", "from", "Csf2ra", "-", "/", "-", "group", ";", "n", "=", "7", "mice", "from", "each", "transferred", "group", ";", "n", "=", "8", "from", "WT", "group", ")", ".", "Survival", "curve", "of", "influenza", "-", "infected", "mice", "described", "in", "A", ",", "B", "(", "n", "=", "5", "mice", "from", "Csf2ra", "-", "/", "-", "group", ";", "n", "=", "7", "mice", "from", "each", "transferred", "group", ";", "n", "=", "8", "from", "WT", "group", ")", ".", "Total", "eFluor780", "+", "events", "in", "the", "BAL", "of", "influenza", "-", "infected", "mice", "described", "in", "A", ",", "B", "10", "days", "p", ".", "i", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", "from", "each", "group", ")", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "Csf2ra", "(", "CD116", ")", "expression", "on", "different", "fetal", "precursors", "from", "WT", "embryos", ".", "The", "solid", "gray", "histogram", "represents", "the", "fluorescence", "minus", "one", "(", "FMO", ")", "controls", ",", "the", "open", "black", "histogram", "represents", "stained", "samples", ".", "The", "gray", "number", "represents", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "FMO", "controls", ",", "the", "black", "number", "represents", "MFI", "of", "stained", "samples", ".", "E10", ".", "5", "YS", "cells", "were", "pooled", "from", "8", "-", "10", "embryos", ",", "E14", ".", "5", "lung", "cells", "were", "pooled", "from", "3", "-", "4", "embryos", ",", "and", "E14", ".", "5", "liver", "cells", "were", "from", "individual", "embryo", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "Csf2ra", "expressions", "on", "pMΦ", "-", "and", "fetal", "Mo", "-", "derived", "AM", "in", "Csf2ra", "-", "/", "-", "recipients", "4", "weeks", "after", "transfer", "of", "pMΦ", "or", "fetal", "Mo", "from", "E14", ".", "5", "fetal", "livers", ".", "AM", "from", "4", "-", "week", "old", "WT", "mice", "were", "included", "as", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Body weight measurement of influenza virus (20 pfu of PR8 strain)-infected Csf2ra-/- recipients 24 weeks after neonatal transfer of pMΦ or fetal Mo from E14.5 fetal livers (n = 7 mice from each transferred group), 24-week old un-transferred Csf2ra-/- (n = 5), and WT (n = 8).temperature (B) measurement of influenza virus (20 pfu of PR8 strain)-infected Csf2ra-/- recipients 24 weeks after neonatal transfer of pMΦ or fetal Mo from E14.5 fetal livers (n = 7 mice from each transferred group), 24-week old un-transferred Csf2ra-/- (n = 5), and WT (n = 8).Oxygen (O2) saturation in influenza-infected mice described in A, B 7 days post-infection (p.i.) (n = 5 mice from Csf2ra-/- group; n = 7 mice from each transferred group; n=8 from WT group).Survival curve of influenza-infected mice described in A, B (n = 5 mice from Csf2ra-/- group; n = 7 mice from each transferred group; n=8 from WT group).Total eFluor780+ events in the BAL of influenza-infected mice described in A, B 10 days p.i. (n = 3 mice from each group).Representative flow cytometric analysis of Csf2ra (CD116) expression on different fetal precursors from WT embryos. The solid gray histogram represents the fluorescence minus one (FMO) controls, the open black histogram represents stained samples. The gray number represents mean fluorescence intensity (MFI) of FMO controls, the black number represents MFI of stained samples. E10.5 YS cells were pooled from 8-10 embryos, E14.5 lung cells were pooled from 3-4 embryos, and E14.5 liver cells were from individual embryo.Representative flow cytometric analysis of Csf2ra expressions on pMΦ- and fetal Mo-derived AM in Csf2ra-/- recipients 4 weeks after transfer of pMΦ or fetal Mo from E14.5 fetal livers. AM from 4-week old WT mice were included as controls."}
{"words": ["Figure", "5Heatmap", "of", "AM", "signature", "-", "up", "genes", "(", "D", ")", ",", "AM", "signature", "-", "down", "genes", "(", "E", ")", ",", "and", "AM", "-", "specific", "transcription", "factors", "(", "F", ")", "in", "the", "precursors", "and", "mature", "AM", "described", "above", "in", "A", ".", "the", "data", "are", "from", "one", "RNA", "-", "seq", "experiment", "(", "1", "-", "2", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "qPCR", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "analysis", "of", "Myb", ",", "Maf", ",", "Mafb", ",", "and", "Pparg", "expression", "in", "different", "fetal", "precursors", "from", "WT", "embryos", "and", "mature", "AM", "from", "WT", "adult", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Heatmap of AM signature-up genes (D), AM signature-down genes (E), and AM-specific transcription factors (F) in the precursors and mature AM described above in A. the data are from one RNA-seq experiment (1 - 2 biological replicates per group).qPCR (n = 3 biological replicates) analysis of Myb, Maf, Mafb, and Pparg expression in different fetal precursors from WT embryos and mature AM from WT adult mice."}
{"words": ["Figure", "6Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "of", "pMΦ", "and", "fetal", "Mo", "from", "E14", ".", "5", "WT", "fetal", "liver", "at", "baseline", "and", "after", "treatment", "with", "oligomycin", "(", "Oligo", ")", ",", "FCCP", "or", "rotenone", "(", "Rot", ")", "and", "antimycin", "A", "(", "AA", ")", ".", "Extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ")", "of", "pMΦ", "and", "fetal", "Mo", "from", "E14", ".", "5", "WT", "fetal", "liver", "at", "baseline", "and", "after", "treatment", "with", "glucose", ",", "Oligo", ",", "or", "2", "-", "Deoxy", "-", "D", "-", "glucose", "(", "2", "-", "DG", ")", ".", "RNA", "-", "seq", "(", "C", ",", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ")", "analysis", "of", "Eno1", ",", "Slc2a6", ",", "Txn1", ",", "and", "Txnip", "gene", "expression", "in", "pMΦ", "and", "fetal", "Mo", "from", "E14", ".", "5", "WT", "fetal", "liver", ".", "qPCR", "(", "D", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "analysis", "of", "Eno1", ",", "Slc2a6", ",", "Txn1", ",", "and", "Txnip", "gene", "expression", "in", "pMΦ", "and", "fetal", "Mo", "from", "E14", ".", "5", "WT", "fetal", "liver", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Oxygen consumption rate (OCR) of pMΦ and fetal Mo from E14.5 WT fetal liver at baseline and after treatment with oligomycin (Oligo), FCCP or rotenone (Rot) and antimycin A (AA).Extracellular acidification rate (ECAR) of pMΦ and fetal Mo from E14.5 WT fetal liver at baseline and after treatment with glucose, Oligo, or 2-Deoxy-D-glucose (2-DG).RNA-seq (C, n = 2 biological replicates) analysis of Eno1, Slc2a6, Txn1, and Txnip gene expression in pMΦ and fetal Mo from E14.5 WT fetal liver.qPCR (D, n = 3 biological replicates) analysis of Eno1, Slc2a6, Txn1, and Txnip gene expression in pMΦ and fetal Mo from E14.5 WT fetal liver."}
{"words": ["Figure", "1FACS", "analysis", "of", "relative", "TCRβ", "+", "T", "cell", "content", "in", "blood", "(", "left", "panel", ")", "and", "tumors", "(", "right", "panel", ")", "of", "mice", "at", "the", "end", "of", "treatments", "as", "indicated", "in", "A", ".", "αCD4", "/", "αCD8", ":", "n", "=", "10", ";", "IgG", ":", "n", "=", "6", ".", "Tumor", "burden", "(", "left", "panel", ")", ",", "tumor", "number", "(", "middle", "panel", ")", "and", "average", "tumor", "size", "(", "right", "panel", ")", "per", "mouse", "assessed", "during", "colon", "resection", "at", "the", "end", "of", "treatments", ".", "αCD4", "/", "αCD8", ":", "n", "=", "10", ";", "IgG", ":", "n", "=", "9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1FACS analysis of relative TCRβ+ T cell content in blood (left panel) and tumors (right panel) of mice at the end of treatments as indicated in A. αCD4/αCD8: n=10; IgG: n=6.Tumor burden (left panel), tumor number (middle panel) and average tumor size (right panel) per mouse assessed during colon resection at the end of treatments. αCD4/αCD8: n=10; IgG: n=9."}
{"words": ["Figure", "2Immune", "cell", "contexture", "in", "healthy", "colon", "and", "colon", "tumors", "of", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mice", ".", "Relative", "TCRβ", "+", "T", "cell", "content", "in", "colon", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "tumor", "(", "n", "=", "22", ")", ".", "relative", "content", "of", "individual", "cell", "types", "was", "determined", "in", "tissue", "-", "derived", "single", "cell", "suspension", "using", "cell", "type", "specific", "antibodies", "and", "FACS", "analysis", ".", "Immune", "cell", "contexture", "in", "healthy", "colon", "and", "colon", "tumors", "of", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mice", ".", "Anti", "-", "CD3", "immunostaining", "on", "normal", "colon", "(", "left", "panel", ")", "and", "a", "representative", "colon", "tumor", "section", "derived", "from", "an", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mouse", "(", "right", "panel", ":", "higher", "magnification", "of", "area", "indicated", "in", "middle", "panel", ")", ".", "Immune", "cell", "contexture", "in", "healthy", "colon", "and", "colon", "tumors", "of", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mice", ".", "Relative", "CD11b", "+", "myeloid", "cell", "content", "in", "colon", "(", "n", "=", "16", ")", "and", "tumors", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "relative", "content", "of", "individual", "cell", "types", "was", "determined", "in", "tissue", "-", "derived", "single", "cell", "suspension", "using", "cell", "type", "specific", "antibodies", "and", "FACS", "analysis", ".", "Immune", "cell", "contexture", "in", "healthy", "colon", "and", "colon", "tumors", "of", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mice", ".", "Anti", "-", "Gr1", "immunostaining", "on", "normal", "colon", "(", "left", "panel", ")", "and", "a", "representative", "colon", "tumor", "section", "derived", "from", "an", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mouse", "(", "right", "panel", ":", "higher", "magnification", "of", "area", "indicated", "in", "middle", "panel", ")", ".", "Immune", "cell", "contexture", "in", "healthy", "colon", "and", "colon", "tumors", "of", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mice", ".", "Relative", "CD11b", "+", "MHCII", "-", "Gr1hi", "neutrophil", "(", "E", ")", "and", "CD11b", "+", "MHCII", "-", "Gr1lo", "monocyte", "(", "F", ")", "content", "in", "colon", "(", "n", "=", "13", ")", "and", "tumors", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "relative", "content", "of", "individual", "cell", "types", "was", "determined", "in", "tissue", "-", "derived", "single", "cell", "suspension", "using", "cell", "type", "specific", "antibodies", "and", "FACS", "analysis", ".", "Immune", "cell", "contexture", "in", "healthy", "colon", "and", "colon", "tumors", "of", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mice", ".", ",", "Correlation", "of", "tumor", "T", "cell", "numbers", "to", "sample", "-", "matched", "tumor", "-", "derived", "neutrophil", "(", "left", "panel", ")", "and", "monocyte", "(", "right", "panel", ")", "numbers", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "relative", "content", "of", "individual", "cell", "types", "was", "determined", "in", "tissue", "-", "derived", "single", "cell", "suspension", "using", "cell", "type", "specific", "antibodies", "and", "FACS", "analysis", ".", "Percentage", "of", "T", "cell", "subsets", "among", "total", "CD45", "+", "hematopoietic", "cells", "in", "colon", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "tumor", "(", "n", "=", "11", ")", ".", "H", ",", "CD4", "+", "TCRβ", "+", "T", "cells", ".", "I", ",", "CD8", "+", "TCRβ", "+", "T", "cells", ".", "J", ",", "Foxp3", "+", "CD4", "+", "TCRβ", "+", "regulatory", "T", "cells", "(", "Tregs", ")", ".", "relative", "content", "of", "individual", "cell", "types", "was", "determined", "in", "tissue", "-", "derived", "single", "cell", "suspension", "using", "cell", "type", "specific", "antibodies", "and", "FACS", "analysis", ".", "Percentage", "of", "Tregs", "among", "total", "T", "cells", "(", "CD45", "+", "TCRβ", "+", ")", "in", "normal", "colon", "(", "n", "=", "10", ")", "or", "colon", "tumors", "(", "n", "=", "11", ")", ".", "relative", "content", "of", "individual", "cell", "types", "was", "determined", "in", "tissue", "-", "derived", "single", "cell", "suspension", "using", "cell", "type", "specific", "antibodies", "and", "FACS", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Immune cell contexture in healthy colon and colon tumors of Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mice. Relative TCRβ+ T cell content in colon (n=10) and tumor (n=22). relative content of individual cell types was determined in tissue-derived single cell suspension using cell type specific antibodies and FACS analysis.Immune cell contexture in healthy colon and colon tumors of Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mice. Anti-CD3 immunostaining on normal colon (left panel) and a representative colon tumor section derived from an Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mouse (right panel: higher magnification of area indicated in middle panel).Immune cell contexture in healthy colon and colon tumors of Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mice. Relative CD11b+ myeloid cell content in colon (n=16) and tumors (n=16). relative content of individual cell types was determined in tissue-derived single cell suspension using cell type specific antibodies and FACS analysis.Immune cell contexture in healthy colon and colon tumors of Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mice. Anti-Gr1 immunostaining on normal colon (left panel) and a representative colon tumor section derived from an Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mouse (right panel: higher magnification of area indicated in middle panel).Immune cell contexture in healthy colon and colon tumors of Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mice. Relative CD11b+ MHCII- Gr1hi neutrophil (E) and CD11b+ MHCII- Gr1lo monocyte (F) content in colon (n=13) and tumors (n=16). relative content of individual cell types was determined in tissue-derived single cell suspension using cell type specific antibodies and FACS analysis.Immune cell contexture in healthy colon and colon tumors of Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mice. , Correlation of tumor T cell numbers to sample-matched tumor-derived neutrophil (left panel) and monocyte (right panel) numbers (n=16). relative content of individual cell types was determined in tissue-derived single cell suspension using cell type specific antibodies and FACS analysis.Percentage of T cell subsets among total CD45+ hematopoietic cells in colon (n=10) and tumor (n=11). H, CD4+ TCRβ+ T cells. I, CD8+ TCRβ+ T cells. J, Foxp3+ CD4+ TCRβ+ regulatory T cells (Tregs). relative content of individual cell types was determined in tissue-derived single cell suspension using cell type specific antibodies and FACS analysis.Percentage of Tregs among total T cells (CD45+ TCRβ+) in normal colon (n=10) or colon tumors (n=11). relative content of individual cell types was determined in tissue-derived single cell suspension using cell type specific antibodies and FACS analysis."}
{"words": ["Figure", "3In", "vitro", "co", "-", "culture", "of", "activated", "T", "cells", "with", "increasing", "ratios", "of", "neutrophils", ",", "monocytes", "or", "macrophages", ".", "T", "cell", "proliferation", "index", "is", "numbers", "of", "proliferated", "T", "cells", "after", "three", "days", "of", "indicated", "co", "-", "culture", "condition", "relative", "to", "the", "number", "of", "proliferated", "T", "cells", "when", "cultured", "alone", ".", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "T", "cells", "were", "derived", "from", "lymph", "nodes", "of", "wild", "-", "type", "mice", ".", "Neutrophils", ",", "monocytes", "and", "macrophages", "were", "derived", "from", "colon", "tumors", "of", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mice", ".", "Each", "dot", "represents", "an", "individual", "neutrophil", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "monocyte", "(", "n", "=", "3", ")", "or", "macrophage", "(", "n", "=", "4", ")", "sample", ".", "Bars", "represent", "mean", "+", "/", "-", "SD", ".", "Tumor", "neutrophil", "(", "left", "panel", ")", "and", "monocyte", "(", "right", "panel", ")", "content", "after", "αGr1", "+", "CXCR2i", "(", "n", "=", "7", ")", "or", "IgG", "+", "DMSO", "(", "n", "=", "10", ")", "treatments", ".", "Average", "tumor", "volume", "per", "mouse", "at", "the", "end", "of", "αGr1", "+", "CXCR2i", "(", "n", "=", "9", ")", "or", "IgG", "+", "DMSO", "(", "n", "=", "12", ")", "treatments", "as", "indicated", "in", "B", ".", "Anti", "-", "CD3", "immunostaining", "on", "representative", "tumor", "sections", "derived", "from", "mice", "after", "indicated", "treatments", ".", "FACS", "analysis", "of", "CD45", "+", "TCRβ", "+", "cells", ",", "CD45", "+", "TCRβ", "+", "CD8", "+", "cells", "and", "CD45", "+", "TCRβ", "+", "CD4", "+", "Foxp3", "+", "cells", "in", "extracted", "tumors", "after", "αGr1", "+", "CXCR2i", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "IgG", "+", "DMSO", "(", "n", "=", "7", ")", "treatments", ".", "FACS", "analysis", "of", "IFNγ", "(", "left", "panel", ")", "and", "IL17A", "(", "right", "panel", ")", "expression", "in", "tumor", "extracted", "T", "cells", "after", "αGr1", "+", "CXCR2i", "(", "n", "=", "7", ")", "or", "IgG", "+", "DMSO", "(", "n", "=", "7", ")", "treatments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3In vitro co-culture of activated T cells with increasing ratios of neutrophils, monocytes or macrophages. T cell proliferation index is numbers of proliferated T cells after three days of indicated co-culture condition relative to the number of proliferated T cells when cultured alone. CD4+ and CD8+ T cells were derived from lymph nodes of wild-type mice. Neutrophils, monocytes and macrophages were derived from colon tumors of Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mice. Each dot represents an individual neutrophil (n=4), monocyte (n=3) or macrophage (n=4) sample. Bars represent mean +/- SD.Tumor neutrophil (left panel) and monocyte (right panel) content after αGr1 + CXCR2i (n=7) or IgG + DMSO (n=10) treatments.Average tumor volume per mouse at the end of αGr1 + CXCR2i (n=9) or IgG + DMSO (n=12) treatments as indicated in B.Anti-CD3 immunostaining on representative tumor sections derived from mice after indicated treatments.FACS analysis of CD45+ TCRβ+ cells, CD45+ TCRβ+ CD8+ cells and CD45+ TCRβ+ CD4+ Foxp3+ cells in extracted tumors after αGr1 + CXCR2i (n=8) or IgG + DMSO (n=7) treatments.FACS analysis of IFNγ (left panel) and IL17A (right panel) expression in tumor extracted T cells after αGr1 + CXCR2i (n=7) or IgG + DMSO (n=7) treatments."}
{"words": ["Figure", "4Measurement", "of", "cytokines", "present", "in", "cell", "culture", "supernatants", "of", "T", "cells", "co", "-", "cultured", "with", "either", "tumor", "-", "derived", "neutrophils", "(", "T", "+", "Ne", ";", "n", "=", "3", ")", "or", "with", "tumor", "-", "derived", "monocytes", "(", "T", "+", "Mo", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "Cytokines", "with", "a", "log2", "fold", "change", ">", "0", ".", "6", "or", "<", "-", "0", ".", "4", "were", "considered", "as", "differentially", "present", "in", "supernatants", ".", "Shown", "is", "a", "heatmap", "of", "scaled", "cytokines", "levels", "(", "z", "-", "score", ")", "differentially", "present", "in", "T", "+", "Ne", "compared", "to", "T", "+", "Mo", ".", "Adjusted", "p", "-", "values", "were", "calculated", "by", "moderated", "t", "-", "test", "(", "limma", ")", "and", "Benjamini", "post", "test", "and", "were", "<", "0", ".", "05", "only", "for", "MMP9", "and", "RELMβ", ".", "Supernatants", "of", "T", "cells", "alone", "(", "T", "only", ";", "n", "=", "2", ")", "served", "as", "internal", "control", ".", "T", "cells", "cultured", "with", "monocytes", "did", "not", "have", "differential", "presence", "of", "cytokines", "compared", "to", "T", "cells", "alone", ".", "Co", "-", "immunostaining", "for", "MMP9", "(", "green", ")", "and", "S100A9", "(", "red", ")", "on", "a", "representative", "tumor", "section", "derived", "from", "an", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mouse", ".", "Right", "panel", "shows", "a", "higher", "magnification", "of", "indicated", "area", "of", "the", "left", "panel", ".", "mRNA", "expression", "levels", "of", "Mmp9", "(", "C", ")", "or", "Tgfb1", ",", "Tgfb2", "and", "Tgfb3", "(", "D", ")", "in", "indicated", "FACS", "sorted", "cell", "types", "isolated", "from", "mouse", "colon", "tumors", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "are", "derived", "from", "RNA", "-", "sequencing", "and", "are", "displayed", "as", "reads", "per", "kilo", "base", "per", "million", "mapped", "reads", "(", "rpkm", ")", ".", "Neutrophil", "-", "T", "cell", "co", "-", "cultures", "treated", "with", "vehicle", "(", "T", "+", "Ne", ")", ",", "10µm", "Galunisertib", "(", "T", "+", "Ne", "+", "TGFBRi", ")", ",", "T", "cell", "proliferation", "after", "three", "days", "of", "indicated", "co", "-", "culture", "conditions", ".", "T", "cell", "proliferation", "index", "is", "numbers", "of", "proliferated", "T", "cells", "under", "indicated", "condition", "relative", "to", "the", "number", "of", "proliferated", "T", "cells", "when", "cultured", "alone", ".", "Neutrophil", "-", "T", "cell", "co", "-", "cultures", "treated", "with", "vehicle", "(", "T", "+", "Ne", ")", ",", "10µm", "of", "the", "MMP", "inhibitor", "GM6001", "(", "T", "+", "Ne", "+", "MMPi", ")", "Protein", "levels", "of", "free", "active", "TGFβ1", "in", "cell", "culture", "supernatants", "of", "indicated", "conditions", "determined", "by", "ELISA", ".", "Neutrophil", "-", "T", "cell", "co", "-", "cultures", "treated", "with", "vehicle", "(", "T", "+", "Ne", ")", ",", "10µm", "of", "the", "MMP", "inhibitor", "GM6001", "(", "T", "+", "Ne", "+", "MMPi", ")", "T", "cell", "proliferation", "after", "three", "days", "of", "indicated", "co", "-", "culture", "conditions", ".", "T", "cell", "proliferation", "index", "is", "numbers", "of", "proliferated", "T", "cells", "under", "indicated", "condition", "relative", "to", "the", "number", "of", "proliferated", "T", "cells", "when", "cultured", "alone", ".", "Neutrophil", "-", "T", "cell", "co", "-", "cultures", "treated", "with", "vehicle", "(", "T", "+", "Ne", ")", ",", "10µm", "Galunisertib", "(", "T", "+", "Ne", "+", "TGFBRi", ")", ",", "10µm", "of", "the", "MMP", "inhibitor", "GM6001", "(", "T", "+", "Ne", "+", "MMPi", ")", "or", "with", "10µm", "Galunisertib", "plus", "10µm", "GM6001", "(", "T", "+", "Ne", "+", "TGFBRi", "+", "MMPi", ")", ".", "T", "cell", "proliferation", "after", "three", "days", "of", "indicated", "co", "-", "culture", "conditions", ".", "T", "cell", "proliferation", "index", "is", "numbers", "of", "proliferated", "T", "cells", "under", "indicated", "condition", "relative", "to", "the", "number", "of", "proliferated", "T", "cells", "when", "cultured", "alone", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Measurement of cytokines present in cell culture supernatants of T cells co-cultured with either tumor-derived neutrophils (T + Ne; n=3) or with tumor-derived monocytes (T + Mo; n=3). Cytokines with a log2 fold change >0.6 or <-0.4 were considered as differentially present in supernatants. Shown is a heatmap of scaled cytokines levels (z-score) differentially present in T + Ne compared to T + Mo. Adjusted p-values were calculated by moderated t-test (limma) and Benjamini post test and were <0.05 only for MMP9 and RELMβ. Supernatants of T cells alone (T only; n=2) served as internal control. T cells cultured with monocytes did not have differential presence of cytokines compared to T cells alone.Co-immunostaining for MMP9 (green) and S100A9 (red) on a representative tumor section derived from an Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mouse. Right panel shows a higher magnification of indicated area of the left panel.mRNA expression levels of Mmp9 (C) or Tgfb1, Tgfb2 and Tgfb3 (D) in indicated FACS sorted cell types isolated from mouse colon tumors (n=4). Data are derived from RNA-sequencing and are displayed as reads per kilo base per million mapped reads (rpkm).Neutrophil - T cell co-cultures treated with vehicle (T + Ne), 10µm Galunisertib (T + Ne + TGFBRi), T cell proliferation after three days of indicated co-culture conditions. T cell proliferation index is numbers of proliferated T cells under indicated condition relative to the number of proliferated T cells when cultured alone.Neutrophil - T cell co-cultures treated with vehicle (T + Ne), 10µm of the MMP inhibitor GM6001 (T + Ne + MMPi) Protein levels of free active TGFβ1 in cell culture supernatants of indicated conditions determined by ELISA.Neutrophil - T cell co-cultures treated with vehicle (T + Ne), 10µm of the MMP inhibitor GM6001 (T + Ne + MMPi) T cell proliferation after three days of indicated co-culture conditions. T cell proliferation index is numbers of proliferated T cells under indicated condition relative to the number of proliferated T cells when cultured alone.Neutrophil - T cell co-cultures treated with vehicle (T + Ne), 10µm Galunisertib (T + Ne + TGFBRi), 10µm of the MMP inhibitor GM6001 (T + Ne + MMPi) or with 10µm Galunisertib plus 10µm GM6001 (T + Ne + TGFBRi + MMPi). T cell proliferation after three days of indicated co-culture conditions. T cell proliferation index is numbers of proliferated T cells under indicated condition relative to the number of proliferated T cells when cultured alone."}
{"words": ["Figure", "5Evaluation", "of", "TGFβ", "signaling", "activity", "in", "mouse", "colon", "tumors", "after", "four", "consecutive", "daily", "injections", "of", "hosts", "with", "40mg", "/", "kg", "of", "the", "MMP2", "/", "9", "-", "inhibitor", "SB3", "-", "CT", "(", "MMPi", ")", ".", ",", "Co", "-", "immunostaining", "for", "pSMAD3", "(", "green", ")", "and", "IGFBP7", "(", "magenta", ")", "on", "representative", "tumor", "-", "containing", "colon", "sections", "derived", "from", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mice", "treated", "with", "vehicle", "(", "A", ")", "MMPi", "(", "B", ")", ".", "Evaluation", "of", "TGFβ", "signaling", "activity", "in", "mouse", "colon", "tumors", "after", "four", "consecutive", "daily", "injections", "of", "hosts", "with", "40mg", "/", "kg", "of", "the", "MMP2", "/", "9", "-", "inhibitor", "SB3", "-", "CT", "(", "MMPi", ")", ".", "Quantification", "of", "pSMAD3", "+", "cells", "(", "left", "panel", ")", "and", "pSMAD3", "staining", "intensity", "per", "pSMAD3", "+", "cell", "(", "right", "panel", ")", "on", "at", "least", "five", "arbitrarily", "selected", "tumor", "areas", "per", "section", "of", "MMPi", "(", "n", "=", "6", ")", "or", "vehicle", "(", "n", "=", "6", ")", "treated", "mice", ".", "effect", "of", "in", "vivo", "TGFBRi", "and", "MMPi", "treatment", "of", "mice", "for", "two", "weeks", "on", "colon", "tumor", "formation", ".", "Apcfl", "/", "fl", "-", "Cdx2CreERT2", "mice", "were", "treated", "with", "Tamoxifen", "and", ",", "one", "day", "post", "treatment", ",", "injected", "with", "either", "MMPi", "(", "n", "=", "10", ")", "or", "the", "TGFBRi", "SB431542", "(", "n", "=", "10", ")", "at", "40mg", "/", "kg", "for", "two", "weeks", "with", "five", "injections", "per", "week", ".", "Vehicle", "treated", "mice", ":", "n", "=", "11", ".", "Average", "tumor", "size", "per", "mouse", "was", "assessed", "during", "colon", "resection", "one", "week", "after", "the", "end", "of", "treatments", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Evaluation of TGFβ signaling activity in mouse colon tumors after four consecutive daily injections of hosts with 40mg/kg of the MMP2/9-inhibitor SB3-CT (MMPi). , Co-immunostaining for pSMAD3 (green) and IGFBP7 (magenta) on representative tumor-containing colon sections derived from Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mice treated with vehicle (A) MMPi (B).Evaluation of TGFβ signaling activity in mouse colon tumors after four consecutive daily injections of hosts with 40mg/kg of the MMP2/9-inhibitor SB3-CT (MMPi). Quantification of pSMAD3+ cells (left panel) and pSMAD3 staining intensity per pSMAD3+ cell (right panel) on at least five arbitrarily selected tumor areas per section of MMPi (n=6) or vehicle (n=6) treated mice.effect of in vivo TGFBRi and MMPi treatment of mice for two weeks on colon tumor formation. Apcfl/fl-Cdx2CreERT2 mice were treated with Tamoxifen and, one day post treatment, injected with either MMPi (n=10) or the TGFBRi SB431542 (n=10) at 40mg/kg for two weeks with five injections per week. Vehicle treated mice: n=11. Average tumor size per mouse was assessed during colon resection one week after the end of treatments (E)."}
{"words": ["Figure", "6evaluation", "of", "S100A9", "+", "neutrophil", "and", "CD8", "+", "T", "cell", "infiltration", "in", "histologic", "sections", "of", "human", "CRC", "tumors", ".", ",", "Anti", "-", "S100A9", "immunostaining", "on", "a", "representative", "human", "CRC", "section", ".", "Arrowheads", "indicate", "neutrophil", "infiltration", "at", "the", "tumor", "boarder", ".", "Co", "-", "immunostaining", "for", "CD8", "(", "brown", ")", "and", "S100A9", "(", "gray", "-", "blue", ")", "in", "the", "same", "CRC", "sample", "as", "shown", "in", "A", ".", "evaluation", "of", "S100A9", "+", "neutrophil", "and", "CD8", "+", "T", "cell", "infiltration", "in", "histologic", "sections", "of", "human", "CRC", "tumors", ".", "Quantification", "of", "S100A9", "+", "cells", "(", "upper", "panel", ")", "and", "CD8", "+", "T", "cells", "in", "different", "areas", "on", "CRC", "tumor", "sections", "containing", "tumor", "border", "with", "adjacent", "benign", "mucosa", "as", "determined", "by", "a", "specialized", "pathologist", ":", "\"", "Tumor", "center", "\"", "was", "tissue", "within", "tumor", ">", "200μm", "from", "tumor", "border", ",", "\"", "Tumor", "border", "\"", "was", "tissue", "within", "tumor", "<", "100μm", "from", "tumor", "border", "and", "\"", "Adjacent", "benign", "mucosa", "\"", "was", "mucosa", "tissue", "outside", "tumor", "<", "100μm", "from", "tumor", "border", ".", "Per", "section", ",", "all", "identifiable", "tumor", "border", "and", "adjacent", "benign", "areas", ",", "as", "well", "as", "three", "arbitrary", "tumor", "center", "areas", "were", "scored", ".", "Sections", "were", "derived", "from", "10", "individual", "patients", ".", "Gene", "expression", "scores", "were", "generated", "as", "described", "in", "material", "and", "methods", ".", "Boxes", "are", "lower", "and", "upper", "quartiles", "with", "median", "as", "solid", "lines", ";", "horizontal", "lines", "define", "minimum", "and", "maximum", ";", "dots", "define", "outliers", ".", ",", "Neutrophil", "scores", "in", "tumor", "samples", "categorized", "according", "to", "CMS", "subtypes", ".", "Gene", "expression", "scores", "were", "generated", "as", "described", "in", "material", "and", "methods", ".", "Boxes", "are", "lower", "and", "upper", "quartiles", "with", "median", "as", "solid", "lines", ";", "horizontal", "lines", "define", "minimum", "and", "maximum", ";", "dots", "define", "outliers", ".", "Comparison", "of", "T", "cell", "gene", "expression", "scores", "in", "CMS4", "tumors", "within", "two", "publicly", "available", "CRC", "gene", "expression", "datasets", "(", "median", ",", "lower", "and", "upper", "quartiles", ";", "horizontal", "lines", "define", "minimum", "and", "maximum", ";", "dots", "define", "outliers", ")", ".", "Samples", "are", "categorized", "according", "to", "the", "medians", "(", "high", "=", ">", "median", ";", "low", "=", "neutrophil", "and", "TGFβ", "gene", "expression", "scores", ".", "Upper", "panel", ":", "TCGA", "dataset", ".", "Lower", "panel", "GSE39582", "dataset", ".", "Proliferation", "of", "activated", "blood", "T", "cells", "in", "vitro", "in", "co", "-", "culture", "with", "increasing", "ratios", "of", "CRC", "patient", "-", "derived", "autologous", "blood", "neutrophils", ".", "CD3", "+", "T", "cells", "and", "CD66b", "+", "neutrophils", "were", "isolated", "and", "cultured", "individually", "for", "each", "patient", ".", "Bar", "graphs", "display", "relative", "numbers", "of", "proliferated", "T", "cells", "after", "three", "days", "of", "co", "-", "culture", ".", "Each", "dot", "per", "condition", "represents", "a", "neutrophil", "sample", "from", "an", "individual", "patient", "(", "n", "=", "13", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "+", "SD", ".", "Proliferation", "of", "activated", "blood", "T", "cells", "in", "vitro", "in", "co", "-", "culture", "with", "autologous", "blood", "neutrophils", ".", "Cells", "were", "derived", "from", "both", "CRC", "patients", "(", "n", "=", "2", ")", "and", "healthy", "volunteers", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "T", "cells", "and", "neutrophils", "were", "cultured", "at", "a", "1", ":", "1", "ratio", "and", "treated", "with", "vehicle", "(", "T", "+", "Ne", ")", "or", "10µm", "Galunisertib", "(", "T", "+", "Ne", "+", "TGFBRi", ")", ".", "Each", "line", "represents", "a", "neutrophil", "sample", "from", "an", "individual", "healthy", "volunteer", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6evaluation of S100A9+ neutrophil and CD8+ T cell infiltration in histologic sections of human CRC tumors. , Anti-S100A9 immunostaining on a representative human CRC section. Arrowheads indicate neutrophil infiltration at the tumor boarder. Co-immunostaining for CD8 (brown) and S100A9 (gray-blue) in the same CRC sample as shown in A.evaluation of S100A9+ neutrophil and CD8+ T cell infiltration in histologic sections of human CRC tumors. Quantification of S100A9+ cells (upper panel) and CD8+ T cells in different areas on CRC tumor sections containing tumor border with adjacent benign mucosa as determined by a specialized pathologist: \"Tumor center\" was tissue within tumor >200μm from tumor border, \"Tumor border\" was tissue within tumor <100μm from tumor border and \"Adjacent benign mucosa\" was mucosa tissue outside tumor <100μm from tumor border. Per section, all identifiable tumor border and adjacent benign areas, as well as three arbitrary tumor center areas were scored. Sections were derived from 10 individual patients.Gene expression scores were generated as described in material and methods. Boxes are lower and upper quartiles with median as solid lines; horizontal lines define minimum and maximum; dots define outliers. , Neutrophil scores in tumor samples categorized according to CMS subtypes.Gene expression scores were generated as described in material and methods. Boxes are lower and upper quartiles with median as solid lines; horizontal lines define minimum and maximum; dots define outliers. Comparison of T cell gene expression scores in CMS4 tumors within two publicly available CRC gene expression datasets (median, lower and upper quartiles; horizontal lines define minimum and maximum; dots define outliers). Samples are categorized according to the medians (high = >median; low = neutrophil and TGFβ gene expression scores. Upper panel: TCGA dataset. Lower panel GSE39582 dataset.Proliferation of activated blood T cells in vitro in co-culture with increasing ratios of CRC patient-derived autologous blood neutrophils. CD3+ T cells and CD66b+ neutrophils were isolated and cultured individually for each patient. Bar graphs display relative numbers of proliferated T cells after three days of co-culture. Each dot per condition represents a neutrophil sample from an individual patient (n=13). Bars represent mean + SD.Proliferation of activated blood T cells in vitro in co-culture with autologous blood neutrophils. Cells were derived from both CRC patients (n=2) and healthy volunteers (n=5). T cells and neutrophils were cultured at a 1:1 ratio and treated with vehicle (T + Ne) or 10µm Galunisertib (T + Ne + TGFBRi). Each line represents a neutrophil sample from an individual healthy volunteer."}
{"words": ["Figure", "1Immunofluorescence", "staining", "of", "LN229", ",", "U87and", "SNB19", "tumor", "cells", "with", "primary", "antibodies", "against", "αv", ",", "β3", "or", "β5", "integrin", "subunits", ".", "Scale", "bars", ",", "20μm", "for", "LN229", "and", "SNB19", ",", "and", "50μm", "for", "U87", ".", "Targeted", "gene", "delivery", "into", "LN229", ",", "U87", "and", "SNB19", "cells", "by", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "Luc", "carrying", "the", "Luc", "reporter", "gene", ".", "Cells", "were", "seeded", "in", "48", "well", "plates", "before", "transduction", ".", "Non", "-", "targeted", "/", "AAVP", "-", "Luc", "was", "used", "as", "negative", "control", "for", "targeted", "transduction", ".", "Results", "represent", "the", "average", "Relative", "Luminescence", "Units", "(", "RLU", ")", "/", "1μg", "protein", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "3", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "endogenous", "Grp78", "protein", "expression", "levels", "in", "LN229", ",", "U87", "and", "SNB19", "cells", "following", "treatment", "with", "increasing", "concentrations", "of", "TMZ", ".", "Grp78", "level", "was", "normalized", "to", "GAPDH", ".", "Data", "shown", "in", "right", "panel", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "3", ".", "Induction", "of", "Grp78", "promoter", "activity", "by", "TMZ", "in", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "Grp78", "-", "Luc", "cells", ".", "LN229", ",", "U87", "and", "SNB19", "cells", "stably", "transduced", "with", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "Grp78", "-", "Luc", "or", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "CMV", "-", "Luc", "were", "grown", "in", "the", "presence", "of", "TMZ", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Results", "represent", "the", "average", "RLU", "/", "1μg", "protein", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "3", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "correction", "(", "GraphPad", "Prism", "6", ")", "was", "used", "for", "data", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunofluorescence staining of LN229, U87and SNB19 tumor cells with primary antibodies against αv, β3 or β5 integrin subunits. Scale bars, 20μm for LN229 and SNB19, and 50μm for U87.Targeted gene delivery into LN229, U87 and SNB19 cells by RGD4C/AAVP-Luc carrying the Luc reporter gene. Cells were seeded in 48 well plates before transduction. Non-targeted/AAVP-Luc was used as negative control for targeted transduction. Results represent the average Relative Luminescence Units (RLU)/1μg protein. Data shown are representative of two experiments, n=3.Western blot analysis of the endogenous Grp78 protein expression levels in LN229, U87 and SNB19 cells following treatment with increasing concentrations of TMZ. Grp78 level was normalized to GAPDH. Data shown in right panel are representative of two experiments, n=3.Induction of Grp78 promoter activity by TMZ in RGD4C/AAVP-Grp78-Luc cells. LN229, U87 and SNB19 cells stably transduced with RGD4C/AAVP-Grp78-Luc or RGD4C/AAVP-CMV-Luc were grown in the presence of TMZ for the indicated times. Results represent the average RLU/1μg protein. Data shown are representative of two experiments, n=3. Two-way ANOVA with Bonferroni correction (GraphPad Prism 6) was used for data analysis."}
{"words": ["Figure", "2TMZ", "induction", "of", "phospho", "-", "eIF2α", "and", "ATF6", "-", "p90", "expression", ".", "Human", "glioblastoma", "cells", "transduced", "with", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "Grp78", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "following", "treatment", "with", "TMZ", "(", "100", "μM", "for", "LN229", "and", "SNB19", ",", "60", "μM", "for", "U87", ")", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "constitutive", "expression", "and", "splicing", "of", "XBP1", "in", "glioblastoma", "cells", "transduced", "with", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "Grp78", ",", "in", "the", "presence", "of", "TMZ", ".", "Sizes", "of", "the", "PCR", "products", "were", "289", "bp", "for", "unspliced", "XBP1", "and", "263", "bp", "for", "spliced", "XBP1", ",", "the", "lower", "size", "band", "is", "not", "specific", ".", "Time", "points", "were", "selected", "among", "those", "tested", "in", "the", "Western", "blot", "in", "(", "A", ")", ",", "subsequently", "the", "image", "containing", "0", ",", "1", "and", "2", "hours", "was", "juxtaposed", "to", "images", "of", "6", ",", "12", "and", "24", "hours", ".", "A", "white", "line", "has", "been", "added", "between", "the", "gel", "pieces", "that", "have", "been", "juxtaposed", ".", "Tumor", "cell", "killing", "in", "vitro", "by", "the", "HSVtk", "/", "GCV", "approach", ".", "Glioblastoma", "cells", "stably", "transduced", "with", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "Grp78", "-", "HSVtk", "or", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "CMV", "-", "HSVtk", "were", "treated", "with", "either", "GCV", "(", "10", "μM", ")", "or", "TMZ", "(", "100", "μM", "for", "LN229", "and", "SNB19", ",", "60", "μM", "for", "U87", ")", "or", "combination", "of", "both", "GCV", "and", "TMZ", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "MitoSOX", "and", "analyzed", "by", "FACS", "at", "day", "4", "post", "-", "treatment", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "experiments", ",", "n", "=", "3", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "GraphPad", "Prism", "6", ")", "was", "used", "for", "data", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2TMZ induction of phospho-eIF2α and ATF6-p90 expression. Human glioblastoma cells transduced with RGD4C/AAVP-Grp78 were analyzed by Western blot following treatment with TMZ (100 μM for LN229 and SNB19, 60 μM for U87). GAPDH was used as a control.RT-PCR analysis of constitutive expression and splicing of XBP1 in glioblastoma cells transduced with RGD4C/AAVP-Grp78, in the presence of TMZ. Sizes of the PCR products were 289 bp for unspliced XBP1 and 263 bp for spliced XBP1, the lower size band is not specific. Time points were selected among those tested in the Western blot in (A), subsequently the image containing 0, 1 and 2 hours was juxtaposed to images of 6, 12 and 24 hours. A white line has been added between the gel pieces that have been juxtaposed.Tumor cell killing in vitro by the HSVtk/GCV approach. Glioblastoma cells stably transduced with RGD4C/AAVP-Grp78-HSVtk or RGD4C/AAVP-CMV-HSVtk were treated with either GCV (10 μM) or TMZ (100 μM for LN229 and SNB19, 60 μM for U87) or combination of both GCV and TMZ. Cells were stained with MitoSOX and analyzed by FACS at day 4 post-treatment. Data shown are representative of three experiments, n=3. Two-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test (GraphPad Prism 6) was used for data analysis."}
{"words": ["Figure", "3Immuofluorescent", "staining", "for", "αv", "integrin", "expression", "in", "brain", "sections", "including", "intracranial", "tumor", "(", "T", ")", "and", "the", "surrounding", "healthy", "brain", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100μm", ".", "Co", "-", "staining", "of", "CD31", "(", "red", ")", "and", "phage", "(", "green", ")", "in", "brain", "sections", "comprising", "tumor", "and", "healthy", "brain", ".", "Scale", "bar", ",", "100μm", ".", "A", "high", "-", "magnification", "view", "from", "the", "low", "-", "magnification", "insert", "of", "the", "tumor", "section", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "homing", "ability", "of", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "Grp78", "-", "HSVtk", "to", "brain", "tumors", ",", "brain", "tissue", "and", "pancreas", "after", "intravenous", "administration", ".", "The", "data", "were", "normalized", "both", "to", "non", "-", "targeted", "vector", "and", "to", "tissue", "weight", "then", "expressed", "as", "relative", "TU", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "5", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "GraphPad", "Prism", "6", ")", "was", "used", "for", "data", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immuofluorescent staining for αv integrin expression in brain sections including intracranial tumor (T) and the surrounding healthy brain (B). Scale bar, 100μm.Co-staining of CD31 (red) and phage (green) in brain sections comprising tumor and healthy brain. Scale bar, 100μm. A high-magnification view from the low-magnification insert of the tumor section is shown. Scale bar, 25 μm.Quantification of the relative homing ability of RGD4C/AAVP-Grp78-HSVtk to brain tumors, brain tissue and pancreas after intravenous administration. The data were normalized both to non-targeted vector and to tissue weight then expressed as relative TU. Data shown are representative of two experiments, n=5. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test (GraphPad Prism 6) was used for data analysis."}
{"words": ["Figure", "4In", "vivo", "BLI", "of", "Luc", "expression", "for", "evaluation", "of", "tumor", "viability", "and", "tumor", "size", "of", "representative", "tumor", "-", "bearing", "mice", "from", "all", "experimental", "groups", "before", "initiation", "of", "therapy", "(", "day", "9", "post", "intracranial", "cell", "implantation", ")", "and", "at", "the", "end", "of", "treatments", "(", "day", "27", "post", "intracranial", "cell", "implantation", ")", ".", "Individual", "tumor", "Luc", "intensities", "before", "(", "filled", "circles", ")", "and", "after", "therapy", "(", "open", "circles", ")", ",", "on", "days", "9", "and", "27", "post", "cell", "implantation", ",", "respectively", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "5", ".", "Average", "tumor", "Luc", "activity", "showing", "glioblastoma", "progression", "in", "each", "experimental", "group", ".", "Pre", "-", "treatment", "day", "9", "was", "set", "at", "100", "%", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "5", ".", "Survival", "benefit", "for", "tumor", "-", "bearing", "mice", "from", "all", "treatment", "groups", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "5", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "(", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "fractions", ")", ".", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "was", "used", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4In vivo BLI of Luc expression for evaluation of tumor viability and tumor size of representative tumor-bearing mice from all experimental groups before initiation of therapy (day 9 post intracranial cell implantation) and at the end of treatments (day 27 post intracranial cell implantation).Individual tumor Luc intensities before (filled circles) and after therapy (open circles), on days 9 and 27 post cell implantation, respectively. Data shown are representative of two experiments, n=5.Average tumor Luc activity showing glioblastoma progression in each experimental group. Pre-treatment day 9 was set at 100%. Data shown are representative of two experiments, n=5.Survival benefit for tumor-bearing mice from all treatment groups. Data shown are representative of two experiments, n=5. Statistical significance was determined by Kaplan-Meier method (Kaplan-Meier survival fractions). Log-rank (Mantel-Cox) test was used."}
{"words": ["Figure", "5Hematoxylin", "and", "eosin", "staining", "(", "H", "&", "E", ")", "and", "immunostaining", "for", "the", "proliferation", "marker", "protein", "Ki67", "of", "representative", "tumor", "sections", "from", "all", "experimental", "groups", ",", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", "for", "H", "&", "E", "and", "100", "μm", "for", "Ki67", ".", "T", ",", "tumor", ";", "B", ",", "brain", ".", "The", "low", "-", "magnification", "inserts", "represent", "negative", "controls", "with", "the", "secondary", "antibody", "alone", "on", "serial", "sections", "used", "for", "both", "Ki67", "and", "caspase", "-", "3", "immunostainings", ".", "Blood", "vessel", "staining", "with", "CD31", "(", "red", ")", ".", "DAPI", "staining", "of", "the", "sections", "is", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "T", ",", "tumor", ";", "B", ",", "brain", ".", "The", "low", "-", "magnification", "inserts", "represent", "negative", "controls", "with", "the", "secondary", "antibody", "alone", "on", "serial", "sections", "used", "for", "both", "Ki67", "and", "caspase", "-", "3", "immunostainings", ".", "Tumor", "immunostaining", "for", "apoptosis", "using", "an", "anti", "-", "caspase", "-", "3", "antibody", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Hematoxylin and eosin staining (H&E) and immunostaining for the proliferation marker protein Ki67 of representative tumor sections from all experimental groups, Scale bars, 200 μm for H&E and 100 μm for Ki67. T, tumor; B, brain. The low-magnification inserts represent negative controls with the secondary antibody alone on serial sections used for both Ki67 and caspase-3 immunostainings.Blood vessel staining with CD31 (red). DAPI staining of the sections is shown in blue. Scale bar, 200 μm. T, tumor; B, brain. The low-magnification inserts represent negative controls with the secondary antibody alone on serial sections used for both Ki67 and caspase-3 immunostainings.Tumor immunostaining for apoptosis using an anti- caspase-3 antibody. Scale bar, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "6Fluorescence", "-", "activated", "cell", "sorting", "(", "FACS", ")", "analysis", "with", "antibodies", "against", "Sox", "-", "2", ",", "Nestin", "and", "CD133", "stem", "cell", "markers", ".", "Immunofluorescent", "staining", "for", "αv", ",", "β3", "or", "β5", "integrins", "in", "primary", "HSJD", "-", "GBM", "-", "001", "and", "G26", "GBM", "cells", ".", "Targeted", "transduction", "of", "HSJD", "-", "GBM", "-", "001", "and", "G26", "cells", ",", "over", "a", "time", "course", ",", "by", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "Luc", ".", "Non", "-", "targeted", "/", "AAVP", "-", "Luc", "was", "used", "as", "negative", "control", ".", "Results", "represent", "RLU", "/", "1μg", "protein", "of", "triplicate", "wells", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis with antibodies against Sox-2, Nestin and CD133 stem cell markers.Immunofluorescent staining for αv, β3 or β5 integrins in primary HSJD-GBM-001 and G26 GBM cells.Targeted transduction of HSJD-GBM-001 and G26 cells, over a time course, by RGD4C/AAVP-Luc. Non-targeted/AAVP-Luc was used as negative control. Results represent RLU/1μg protein of triplicate wells. Data shown are representative of two experiments, n=3. Scale bar, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "7Immunofluorescent", "staining", "for", "αv", ",", "β3", "or", "β5", "integrins", "in", "human", "normal", "astrocytes", ",", "chondrocytes", ",", "skin", "and", "lung", "fibroblasts", ".", "Treatment", "of", "chondrocytes", ",", "astrocytes", ",", "lung", "and", "skin", "fibroblasts", "with", "RGD4C", "/", "AAVP", "-", "Luc", "vector", ",", "alone", "or", "in", "the", "presence", "of", "TMZ", ".", "Non", "-", "targeted", "/", "AAVP", "-", "Luc", "was", "used", "as", "negative", "control", ".", "Results", "represent", "RLU", "/", "1μg", "protein", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bars", ",", "160", "μm", "for", "chondrocytes", "and", "80", "μm", "for", "all", "other", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Immunofluorescent staining for αv, β3 or β5 integrins in human normal astrocytes, chondrocytes, skin and lung fibroblasts.Treatment of chondrocytes, astrocytes, lung and skin fibroblasts with RGD4C/AAVP-Luc vector, alone or in the presence of TMZ. Non-targeted/AAVP-Luc was used as negative control. Results represent RLU/1μg protein. Data shown are representative of two experiments, n=3. Scale bars, 160 μm for chondrocytes and 80 μm for all other cells."}
{"words": ["Figure", "8BLI", "of", "luciferase", "of", "representative", "tumor", "-", "bearing", "mice", "from", "all", "experimental", "groups", "at", "day", "19", "post", "therapy", "initiation", ".", "Survival", "benefit", "for", "tumor", "-", "bearing", "mice", "from", "all", "treatment", "groups", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "6", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "(", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "fractions", ")", ".", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "was", "used", ".", "H", "&", "E", "staining", ",", "Ki67", "immunostaining", ",", "and", "evaluation", "of", "apoptosis", "in", "tumors", "by", "using", "an", "anti", "-", "caspase", "-", "3", "antibody", "staining", "of", "representative", "tumor", "sections", "from", "all", "experimental", "groups", ".", "The", "low", "-", "magnification", "inserts", "represent", "negative", "controls", "with", "the", "secondary", "antibody", "alone", "on", "serial", "sections", "used", "for", "both", "Ki67", "and", "caspase", "-", "3", "immunostainings", ".", "Arrow", "points", "to", "apoptotic", "cells", ".", "Immunostaining", "of", "tumors", "with", "an", "antibody", "against", "CD133", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8BLI of luciferase of representative tumor-bearing mice from all experimental groups at day 19 post therapy initiation.Survival benefit for tumor-bearing mice from all treatment groups. Data shown are representative of two experiments, n=6. Statistical significance was determined by Kaplan-Meier method (Kaplan-Meier survival fractions). Log-rank (Mantel-Cox) test was used.H&E staining, Ki67 immunostaining, and evaluation of apoptosis in tumors by using an anti- caspase-3 antibody staining of representative tumor sections from all experimental groups. The low-magnification inserts represent negative controls with the secondary antibody alone on serial sections used for both Ki67 and caspase-3 immunostainings. Arrow points to apoptotic cells.Immunostaining of tumors with an antibody against CD133. Scale bars, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "9Immunostaining", "analysis", "for", "αv", ",", "β3", "or", "β5", "integrins", "in", "GL261", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "BLI", "of", "Luc", "of", "representative", "tumor", "-", "bearing", "mice", "from", "all", "experimental", "groups", "at", "day", "34", "post", "treatment", ".", "Total", "tumor", "Luc", "intensities", "in", "each", "experimental", "group", "before", "treatment", ",", "on", "day", "10", "post", "cell", "implantation", ",", "and", "after", "therapy", ",", "on", "day", "34", "post", "cell", "implantation", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "6", ".", "Data", "analysis", "was", "done", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Survival", "benefit", "for", "tumor", "-", "bearing", "mice", "from", "all", "treatment", "groups", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "6", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "(", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "fractions", ")", ".", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "was", "used", ".", "Weights", "of", "C57BL", "/", "6J", "mice", "bearing", "intracranial", "GL261", "tumors", ",", "from", "all", "experimental", "groups", ",", "before", "and", "after", "treatment", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "experiments", ",", "n", "=", "6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9Immunostaining analysis for αv, β3 or β5 integrins in GL261 cells. Scale bar, 50 μm.BLI of Luc of representative tumor-bearing mice from all experimental groups at day 34 post treatment.Total tumor Luc intensities in each experimental group before treatment, on day 10 post cell implantation, and after therapy, on day 34 post cell implantation. Data shown are representative of two experiments, n=6. Data analysis was done by two-way ANOVA and Bonferroni's multiple comparison test.Survival benefit for tumor-bearing mice from all treatment groups. Data shown are representative of two experiments, n=6. Statistical significance was determined by Kaplan-Meier method (Kaplan-Meier survival fractions). Log-rank (Mantel-Cox) test was used.Weights of C57BL/6J mice bearing intracranial GL261 tumors, from all experimental groups, before and after treatment. Data shown are representative of two experiments, n=6."}
{"words": ["Figure", "1Ferrozine", "-", "based", "intracellular", "iron", "concentration", "measurement", "in", "L6", "cells", "after", "temporal", "analysis", "of", "iron", "treatment", "at", "100", "or", "250", "µM", "for", "multiple", "time", "points", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "versus", "each", "time", "points", "with", "FeSO4", "100", "µM", ")", ".", "Representative", "confocal", "microscope", "images", "of", "L6", "cells", "stained", "with", "IP", "-", "1", "(", "Iron", "Probe", "1", ")", "or", "transfected", "with", "IRE", "-", "CFP", "(", "Iron", "Regulatory", "Element", ")", "reporter", "after", "iron", "treatment", "(", "FeSO4", ",", "250", "µM", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "L6", "cells", "using", "iron", "sensitive", "fluorescent", "PGSK", "dye", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "with", "iron", "chelator", "DPD", "(", "500", "µM", ")", ".", "Relative", "gene", "expressions", "-", "ferritin", "heavy", "chain", "(", "FTH", ")", ",", "ferritin", "light", "chain", "(", "FTL", ")", ",", "ferroportin", "(", "SLC40A1", ",", "transferrin", "receptor", "1", "(", "tfr1", ",", "TFRC", ")", "-", "normalized", "to", "18sr", "RNA", "expression", "after", "iron", "treatment", "(", "FeSO4", ",", "250", "µM", ")", "for", "24", "h", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "versus", "Basal", ")", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "ferritin", "(", "heavy", "chain", ")", "and", "tfr1", "(", "indicated", "with", "arrowhead", ")", "over", "GAPDH", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", ".", "Glucose", "uptake", "of", "L6", "cells", "with", "insulin", "stimulation", "(", "10", "nM", "or", "100", "nM", ",", "20", "min", ")", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "1", "h", "or", "24", "h", ")", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "phospho", "-", "IRS1", "(", "Y612", ")", "and", "phospho", "-", "AKT", "(", "T308", ")", "over", "GAPDH", "with", "insulin", "stimulation", "(", "10", "nM", "or", "100", "nM", ",", "5", "min", ")", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Ferrozine-based intracellular iron concentration measurement in L6 cells after temporal analysis of iron treatment at 100 or 250 µM for multiple time points. *P < 0.05 (unpaired Student's t-test versus each time points with FeSO4 100 µM).Representative confocal microscope images of L6 cells stained with IP-1 (Iron Probe 1) or transfected with IRE-CFP (Iron Regulatory Element) reporter after iron treatment (FeSO4, 250 µM) for 24 h.Representative confocal images of L6 cells using iron sensitive fluorescent PGSK dye after iron treatment (250 µM, 24 h) with iron chelator DPD (500 µM).Relative gene expressions - ferritin heavy chain (FTH), ferritin light chain (FTL), ferroportin (SLC40A1, transferrin receptor 1 (tfr1, TFRC) - normalized to 18sr RNA expression after iron treatment (FeSO4, 250 µM) for 24 h. *P < 0.05 (unpaired Student's t-test versus Basal).Representative western blot images and quantification of ferritin (heavy chain) and tfr1 (indicated with arrowhead) over GAPDH after iron treatment (250 µM, 24 h).Glucose uptake of L6 cells with insulin stimulation (10 nM or 100 nM, 20 min) after iron treatment (250 µM, 1 h or 24 h).Representative western blot images and quantification of phospho-IRS1 (Y612) and phospho-AKT (T308) over GAPDH with insulin stimulation (10 nM or 100 nM, 5 min) after iron treatment (250 µM, 24 h)."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "confocal", "microscope", "image", "of", "L6", "cells", "stably", "expressing", "tandem", "fluorescent", "-", "eGFP", "-", "mCherry", "LC3B", "treated", "with", "iron", "(", "FeSO4", ",", "250", "µM", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", "(", "4", "h", ",", "8", "h", ",", "24", "h", ")", ".", "Quantification", "of", "mean", "LC3B", "puncta", "per", "cell", "from", "(", "A", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "three", "times", ",", "and", "one", "representative", "experiment", "is", "presented", "here", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "p62", "to", "actin", "in", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "FeSO4", ",", "250", "µM", ")", "at", "multiple", "time", "points", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "LC3B", "-", "II", "to", "GAPDH", "in", "L6", "cells", "after", "4h", "iron", "treatment", "stimulated", "with", "chloroquine", "(", "CQ", ",", "30", "µM", ")", ".", "*", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "LC3B", "-", "II", "to", "GAPDH", "in", "L6", "cells", "after", "24", "h", "iron", "treatment", "stimulated", "with", "CQ", "30", "µM", ".", "Representative", "confocal", "microscope", "z", "-", "stack", "image", "of", "mCherry", "-", "LC3B", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", ".", "Quantification", "of", "LC3B", "puncta", "size", "from", "(", "F", ")", ".", "Experiments", "were", "performed", "three", "times", ",", "and", "one", "representative", "experiment", "is", "presented", "here", ".", "Quantification", "of", "autophagosomes", "motility", "from", "live", "cell", "microscopy", "(", "Supplementary", "Movie", "1", ")", "from", "mCherry", "-", "LC3B", "L6", "cells", "under", "basal", ",", "iron", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "and", "starvation", "(", "amino", "acid", "free", ")", "condition", ".", "Experiments", "were", "performed", "three", "times", ",", "and", "one", "representative", "experiment", "is", "presented", "here", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "compared", "to", "Iron", "24h", ")", ".", "Representative", "TEM", "images", "of", "autophagosome", "and", "autolysosomes", "in", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", ".", "Representative", "confocal", "microscope", "images", "of", "eGFP", "-", "mCherry", "-", "LC3B", "L6", "cells", "with", "Lysotracker", "DeepRed", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative confocal microscope image of L6 cells stably expressing tandem fluorescent-eGFP-mCherry LC3B treated with iron (FeSO4, 250 µM) for the indicated time points (4 h, 8 h, 24 h). Quantification of mean LC3B puncta per cell from (A). Experiments were repeated three times, and one representative experiment is presented here.Representative western blot images and quantification of p62 to actin in L6 cells after iron treatment (FeSO4, 250 µM) at multiple time points.Representative western blot images and quantification of LC3B-II to GAPDH in L6 cells after 4h iron treatment stimulated with chloroquine (CQ, 30 µM). * Representative western blot images and quantification of LC3B-II to GAPDH in L6 cells after 24 h iron treatment stimulated with CQ 30 µM.Representative confocal microscope z-stack image of mCherry-LC3B L6 cells after iron treatment (250 µM, 24 h).Quantification of LC3B puncta size from (F). Experiments were performed three times, and one representative experiment is presented here.Quantification of autophagosomes motility from live cell microscopy (Supplementary Movie 1) from mCherry-LC3B L6 cells under basal, iron (250 µM, 24 h) and starvation (amino acid free) condition. Experiments were performed three times, and one representative experiment is presented here. *P < 0.05 (unpaired Student's t-test compared to Iron 24h).Representative TEM images of autophagosome and autolysosomes in L6 cells after iron treatment (250 µM, 24 h).Representative confocal microscope images of eGFP-mCherry-LC3B L6 cells with Lysotracker DeepRed after iron treatment (250 µM, 24 h)."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "western", "blot", "images", "of", "phospho", "-", "ULK1", "(", "S757", ")", ",", "phospho", "-", "S6Kp70", "(", "T389", ")", ",", "total", "S6K", ",", "GAPDH", "after", "iron", "treatment", "(", "FeSO4", ",", "250", "µM", ")", "for", "multiple", "time", "points", ".", "Quantification", "of", "mTORC1", "activity", "analyzed", "through", "phosphorylation", "of", "S6K", "T389", "to", "total", "S6k", "and", "ULK1", "S757", "to", "GAPDH", "after", "iron", "treatment", "(", "FeSO4", ",", "250", "µM", ")", "for", "multiple", "time", "points", ".", "Representative", "epi", "-", "immunofluorescent", "images", "of", "L6", "cells", "transfected", "with", "myc", "-", "RHEB", "Q46L", "and", "immuno", "-", "stained", "against", "LC3B", "and", "myc", "after", "iron", "treatment", "(", "FeSO4", ",", "250", "µM", ")", "for", "24", "h", ".", "Ferrozine", "-", "based", "colorimetric", "measurement", "of", "intracellular", "iron", "in", "wild", "-", "type", "(", "wt", ")", "L6", "and", "RHEB", "-", "Q64L", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "50", "µM", "or", "250", "µM", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "wt", "L6", "and", "RHEB", "-", "Q64L", "L6", "cells", "pulsed", "with", "Lysotracker", "Deep", "Red", "and", "immuno", "-", "stained", "against", "LC3B", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", ".", "Quantification", "of", "LC3B", "-", "free", "lysosome", "numbers", "in", "(", "E", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "three", "times", ",", "and", "one", "representative", "experiment", "is", "presented", "here", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "multiple", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "versus", "Basal", "in", "wt", "and", "RHEB", "Q64L", "cells", ")", "Representative", "TEM", "images", "of", "wt", "L6", "and", "RHEB", "-", "Q64L", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantifications", "of", "phospho", "-", "IRS1", "(", "Y612", ",", "indicated", "by", "arrowhead", ")", "and", "AKT", "(", "T308", ",", "indicated", "by", "arrowhead", ")", "to", "GAPDH", "in", "wt", "and", "RHEB", "-", "Q64L", "L6", "cells", "stimulated", "with", "insulin", "(", "100", "nM", ",", "5", "min", ")", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "multiple", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "versus", "Basal", "in", "wt", "and", "RHEB", "Q64L", "cells", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative western blot images of phospho-ULK1 (S757), phospho-S6Kp70 (T389), total S6K, GAPDH after iron treatment (FeSO4, 250 µM) for multiple time points. Quantification of mTORC1 activity analyzed through phosphorylation of S6K T389 to total S6k and ULK1 S757 to GAPDH after iron treatment (FeSO4, 250 µM) for multiple time points.Representative epi-immunofluorescent images of L6 cells transfected with myc-RHEB Q46L and immuno-stained against LC3B and myc after iron treatment (FeSO4, 250 µM) for 24 h.Ferrozine-based colorimetric measurement of intracellular iron in wild-type (wt) L6 and RHEB-Q64L L6 cells after iron treatment (50 µM or 250 µM) for 24 h.Representative confocal images of wt L6 and RHEB-Q64L L6 cells pulsed with Lysotracker Deep Red and immuno-stained against LC3B after iron treatment (250 µM, 24 h).Quantification of LC3B-free lysosome numbers in (E). Experiments were repeated three times, and one representative experiment is presented here. *P < 0.05 (multiple unpaired Student's t-test versus Basal in wt and RHEB Q64L cells)Representative TEM images of wt L6 and RHEB-Q64L cells after iron treatment (250 µM, 24 h).Representative western blot images and quantifications of phospho-IRS1 (Y612, indicated by arrowhead) and AKT (T308, indicated by arrowhead) to GAPDH in wt and RHEB-Q64L L6 cells stimulated with insulin (100 nM, 5 min) after iron treatment (250 µM, 24 h). *P < 0.05 (multiple unpaired Student's t-test versus Basal in wt and RHEB Q64L cells)"}
{"words": ["Figure", "4Representative", "confocal", "microscope", "images", "of", "L6", "cells", "pulsed", "with", "PGSK", "dye", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "24", "h", "iron", "withdrawal", ".", "Ferrozine", "based", "colorimetric", "measurement", "of", "intracellular", "iron", "in", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "24", "h", "withdrawal", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "phospho", "-", "IRS1", "(", "Y612", ")", "and", "phospho", "-", "AKT", "(", "T308", ")", "to", "GAPDH", "in", "L6", "cells", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "24", "h", "withdrawal", ".", "Representative", "epi", "-", "immunofluorescent", "microscope", "images", "of", "L6", "cells", "immuno", "-", "stained", "against", "LC3B", "and", "LAMP1", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "3", "h", "withdrawal", ".", "Quantification", "of", "autophagosome", "-", "free", "lysosomes", "in", "(", "E", ")", ".", "Experiments", "were", "performed", "three", "times", ",", "and", "one", "representative", "experiment", "is", "presented", "here", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "ferritin", "to", "vinculin", "in", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "withdrawal", "for", "4", "h", "or", "24", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative confocal microscope images of L6 cells pulsed with PGSK dye after iron treatment (250 µM, 24 h) followed by 24 h iron withdrawal. Ferrozine based colorimetric measurement of intracellular iron in L6 cells after iron treatment (250 µM, 24 h) followed by 24 h withdrawal.Representative western blot images and quantification of phospho-IRS1 (Y612) and phospho-AKT (T308) to GAPDH in L6 cells iron treatment (250 µM, 24 h) followed by 24 h withdrawal.Representative epi-immunofluorescent microscope images of L6 cells immuno-stained against LC3B and LAMP1 after iron treatment (250 µM, 24 h) followed by 3 h withdrawal.Quantification of autophagosome-free lysosomes in (E). Experiments were performed three times, and one representative experiment is presented here.Representative western blot images and quantification of ferritin to vinculin in L6 cells after iron treatment (250 µM, 24 h) followed by withdrawal for 4 h or 24 h."}
{"words": ["Figure", "5Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "phospho", "-", "mTOR", "S2448", ",", "total", "mTOR", "and", "actin", "in", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "withdrawal", "for", "4", "h", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "of", "phospho", "-", "mTOR", "S2448", ",", "total", "mTOR", "phsophpo", "-", "TSC2", "T1462", ",", "total", "TSC2", ",", "phospho", "-", "AKT", "S473", ",", "total", "AKT", ",", "actin", "in", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "withdrawal", "for", "4", "h", "with", "or", "without", "MK2206", "(", "AKT", "inhibitor", ".", ")", "Representative", "western", "blot", "images", "of", "phospho", "-", "UVRAG", "S550", "and", "total", "UVRAG", "in", "L6", "cells", "transfected", "with", "FLAG", "-", "UVRAG", "and", "FLAG", "pulldown", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "4", "h", "and", "24", "h", ")", "followed", "by", "withdrawal", "for", "1", "h", "and", "3", "h", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "of", "endogenous", "phospho", "-", "UVRAG", "S550", ",", "total", "UVRAG", "expression", "in", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "withdrawal", "for", "4", "h", "with", "or", "without", "torin1", "(", "200", "nM", ")", ".", "Live", "cell", "imaging", "analysis", "of", "L6", "cells", "transfected", "with", "LAMP1", "-", "RFP", "from", "Movie", "EV2", ":", "lysosomal", "number", "in", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "withdrawal", "for", "4", "h", "with", "or", "without", "Torin1", "(", "200", "nM", ")", ".", "Live", "cell", "imaging", "analysis", "of", "L6", "cells", "transfected", "with", "LAMP1", "-", "RFP", "from", "Movie", "EV2", ":", "speed", "(", "F", ")", "in", "L6", "cells", "after", "iron", "treatment", "(", "250", "µM", ",", "24", "h", ")", "followed", "by", "withdrawal", "for", "4", "h", "with", "or", "without", "Torin1", "(", "200", "nM", ")", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "time", "-", "lapse", "captures", "of", "lysosomes", "at", "6", "sec", "intervals", "for", "30", "sec", ".", "White", "and", "yellow", "arrows", "mark", "positions", "of", "two", "representative", "LAMP1", "puncta", "over", "30", "seconds", ",", "and", "the", "traces", "of", "puncta", "were", "shown", "as", "lines", "in", "final", "panel", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative western blot images and quantification of phospho-mTOR S2448, total mTOR and actin in L6 cells after iron treatment (250 µM, 24 h) followed by withdrawal for 4 h.Representative western blot images of phospho-mTOR S2448, total mTOR phsophpo-TSC2 T1462, total TSC2, phospho-AKT S473, total AKT, actin in L6 cells after iron treatment (250 µM, 24 h) followed by withdrawal for 4 h with or without MK2206 (AKT inhibitor.)Representative western blot images of phospho-UVRAG S550 and total UVRAG in L6 cells transfected with FLAG-UVRAG and FLAG pulldown after iron treatment (250 µM, 4 h and 24 h) followed by withdrawal for 1 h and 3 h.Representative western blot images of endogenous phospho-UVRAG S550, total UVRAG expression in L6 cells after iron treatment (250 µM, 24 h) followed by withdrawal for 4 h with or without torin1 (200 nM).Live cell imaging analysis of L6 cells transfected with LAMP1-RFP from Movie EV2: lysosomal number in L6 cells after iron treatment (250 µM, 24 h) followed by withdrawal for 4 h with or without Torin1 (200 nM).Live cell imaging analysis of L6 cells transfected with LAMP1-RFP from Movie EV2: speed (F) in L6 cells after iron treatment (250 µM, 24 h) followed by withdrawal for 4 h with or without Torin1 (200 nM).Representative confocal images of time-lapse captures of lysosomes at 6 sec intervals for 30 sec. White and yellow arrows mark positions of two representative LAMP1 puncta over 30 seconds, and the traces of puncta were shown as lines in final panel."}
{"words": ["Figure", "6Prussian", "Perl", "blue", "staining", "in", "liver", "and", "skeletal", "muscle", "after", "iron", "injections", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "ferritin", "and", "tfr1", "(", "indicated", "by", "arrowhead", ")", "to", "tubulin", "in", "skeletal", "muscles", "24", "h", "after", "iron", "injections", ".", "Insulin", "tolerance", "test", "24", "h", "after", "iron", "injections", ".", "Glucose", "tolerance", "test", "(", "GTT", ")", "24", "h", "after", "iron", "injections", ".", "Insulin", "tolerance", "test", "24", "h", "after", "iron", "injections", ".", "Quantification", "of", "area", "under", "curve", "in", "ITT", "(", "E", ")", ".", "Glucose", "tolerance", "test", "(", "GTT", ")", "24", "h", "after", "iron", "injections", ".", "Quantification", "of", "area", "under", "curve", "for", "panel", "(", "F", ")", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "phospho", "-", "IRS1", "(", "Y612", ")", "and", "phospho", "-", "AKT", "(", "T308", ")", "to", "GAPDH", "in", "skeletal", "muscles", "24", "h", "after", "iron", "injection", "followed", "by", "i", ".", "p", ".", "insulin", "injection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Prussian Perl blue staining in liver and skeletal muscle after iron injections.Representative western blot images and quantification of ferritin and tfr1 (indicated by arrowhead) to tubulin in skeletal muscles 24 h after iron injections.Insulin tolerance test 24 h after iron injections.Glucose tolerance test (GTT) 24 h after iron injections.Insulin tolerance test 24 h after iron injections. Quantification of area under curve in ITT (E).Glucose tolerance test (GTT) 24 h after iron injections. Quantification of area under curve for panel (F).Representative western blot images and quantification of phospho-IRS1 (Y612) and phospho-AKT (T308) to GAPDH in skeletal muscles 24 h after iron injection followed by i.p. insulin injection."}
{"words": ["Figure", "7Representative", "confocal", "microscope", "images", "of", "skeletal", "muscle", "tissue", "sections", "immuno", "-", "stained", "against", "LC3B", "(", "Alexa", "647", ")", "and", "LAMP1", "(", "Alexa", "555", ")", "Quantification", "of", "lysosomes", "(", "LAMP1", "puncta", ")", "in", "skeletal", "muscles", "24", "h", "after", "iron", "injections", ".", "Representative", "TEM", "images", "of", "skeletal", "muscle", "24", "h", "after", "iron", "injections", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "of", "phospho", "-", "UVRAG", "S550", "and", "total", "UVRAG", "in", "skeletal", "muscle", "24", "h", "after", "iron", "injections", ".", "Representative", "western", "blot", "images", "and", "quantification", "of", "LC3", "-", "B", "and", "p62", "to", "tubulin", "in", "skeletal", "muscles", "24", "h", "after", "iron", "injections", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative confocal microscope images of skeletal muscle tissue sections immuno-stained against LC3B (Alexa 647) and LAMP1 (Alexa 555) Quantification of lysosomes (LAMP1 puncta) in skeletal muscles 24 h after iron injections.Representative TEM images of skeletal muscle 24 h after iron injections.Representative western blot images of phospho-UVRAG S550 and total UVRAG in skeletal muscle 24 h after iron injections.Representative western blot images and quantification of LC3-B and p62 to tubulin in skeletal muscles 24 h after iron injections."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", "-", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "(", "B", ")", "and", "densitometric", "quantification", "(", "C", ")", "of", "OTUD1", "in", "aortas", "of", "control", "and", "Ang", "II", "-", "induced", "mice", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "D", ")", "mRNA", "levels", "of", "OTUD1", "in", "aortas", "of", "control", "and", "Ang", "II", "-", "induced", "mice", "were", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "The", "values", "were", "normalized", "to", "Rn18s", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "CD31", "(", "green", ")", "and", "OTUD1", "(", "red", ")", "of", "aortic", "sections", "(", "scale", "bar", "=", "25", "μm", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "α", "-", "SMA", "(", "green", ")", "and", "OTUD1", "(", "red", ")", "of", "aortic", "sections", "(", "scale", "bar", "=", "25", "μm", ")", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "Time", "-", "course", "of", "OTUD1", "induction", "in", "response", "to", "Ang", "II", "in", "HUVECs", ".", "HUVECs", "were", "exposed", "to", "1", "μM", "Ang", "II", "for", "indicated", "time", ".", "Western", "blot", "analysis", "(", "G", ")", "and", "densitometric", "quantification", "(", "H", ")", "of", "OTUD1", "were", "shown", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B-C) Western blot analysis (B) and densitometric quantification (C) of OTUD1 in aortas of control and Ang II-induced mice. β-actin was used as the loading control (n=5 biological replicates). (D) mRNA levels of OTUD1 in aortas of control and Ang II-induced mice were determined by RT-qPCR. The values were normalized to Rn18s (n=5 biological replicates).(E) Representative immunofluorescence staining of CD31 (green) and OTUD1 (red) of aortic sections (scale bar=25 μm). (F) Representative immunofluorescence staining of α-SMA (green) and OTUD1 (red) of aortic sections (scale bar=25 μm).(G-H) Time-course of OTUD1 induction in response to Ang II in HUVECs. HUVECs were exposed to 1 μM Ang II for indicated time. Western blot analysis (G) and densitometric quantification (H) of OTUD1 were shown (n = 3 biological replicates). GAPDH was used as the loading control."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "H", "&", "E", "staining", "of", "aortic", "sections", "of", "the", "mice", "from", "four", "groups", "(", "scale", "bar", "=", "25", "μm", ")", ".", "E", ",", "endothelium", ";", "M", ",", "media", ";", "A", ",", "adventitia", ".", "(", "B", ")", "The", "quantification", "of", "arterial", "wall", "thickness", "in", "panel", "A", ";", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "Masson", "'", "s", "Trichrome", "staining", "of", "aortic", "sections", "of", "the", "mice", "(", "scale", "bar", "=", "50", "μm", ")", ".", "(", "D", ")", "The", "quantification", "of", "collagen", "deposition", "in", "panel", "C", ";", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "(", "E", ")", "of", "VE", "-", "cadherin", ",", "Vimentin", ",", "Twist", ",", "Snail", ",", "and", "OTUD1", "and", "densitometric", "quantification", "(", "F", ")", "of", "VE", "-", "cadherin", ",", "Vimentin", ",", "Twist", "and", "Snail", "in", "aortic", "tissues", "of", "the", "mice", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "mRNA", "levels", "of", "Cdh5", ",", "Vim", ",", "Twist1", ",", "Snai1", "(", "G", ")", ",", "Tgfb1", "and", "Col1a1", "(", "H", ")", "in", "aortic", "tissues", "of", "the", "mice", "were", "examined", "by", "real", "-", "time", "qPCR", "assay", ".", "The", "values", "were", "normalized", "to", "Rn18s", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative images of H&E staining of aortic sections of the mice from four groups (scale bar=25 μm). E, endothelium; M, media; A, adventitia. (B) The quantification of arterial wall thickness in panel A; n=5 biological replicates. (C) Representative images of Masson's Trichrome staining of aortic sections of the mice (scale bar=50 μm). (D) The quantification of collagen deposition in panel C; n=5 biological replicates.(E-F) Western blot analysis (E) of VE-cadherin, Vimentin, Twist, Snail, and OTUD1 and densitometric quantification (F) of VE-cadherin, Vimentin, Twist and Snail in aortic tissues of the mice. β-actin was used as the loading control (n=5 biological replicates).(G-H) mRNA levels of Cdh5, Vim, Twist1, Snai1 (G), Tgfb1 and Col1a1 (H) in aortic tissues of the mice were examined by real-time qPCR assay. The values were normalized to Rn18s (n=5 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "HUVECs", "transfected", "with", "si", "-", "OTUD1", "or", "NC", "were", "challenged", "with", "1", "μM", "Ang", "II", "for", "24", "h", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "VE", "-", "cadherin", ",", "Vimentin", ",", "α", "-", "SMA", ",", "Twist", "and", "Snail", "were", "performed", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "(", "E", ")", "HUVECs", "transfected", "with", "Flag", "-", "OTUD1", "or", "EV", "were", "challenged", "with", "1", "μM", "Ang", "II", "for", "24", "h", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "VE", "-", "cadherin", ",", "Vimentin", ",", "α", "-", "SMA", ",", "Twist", "and", "Snail", "were", "performed", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) HUVECs transfected with si-OTUD1 or NC were challenged with 1 μM Ang II for 24 h. Western blot analysis of VE-cadherin, Vimentin, α-SMA, Twist and Snail were performed. GAPDH was used as the loading control.(E) HUVECs transfected with Flag-OTUD1 or EV were challenged with 1 μM Ang II for 24 h. Western blot analysis of VE-cadherin, Vimentin, α-SMA, Twist and Snail were performed. GAPDH was used as the loading control."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "OTUD1", "and", "SMAD2", "or", "SMAD3", "in", "HUVECs", "transfected", "with", "Flag", "-", "OTUD1", ".", "Exogenous", "Flag", "-", "OTUD1", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "IgG", ",", "immunoglobulin", "G", ".", "(", "G", ")", "Immunoprecipitation", "of", "SMAD3", "in", "293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "GFP", "-", "SMAD3", ",", "HA", "-", "Ub", "and", "Flag", "-", "OTUD1", "and", "then", "challenged", "with", "10", "μM", "MG132", "for", "6", "h", ".", "Ubiquitinated", "SMAD3", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "using", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "(", "H", ")", "Immunoprecipitation", "of", "SMAD3", "in", "293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "GFP", "-", "SMAD3", ",", "HA", "-", "Ub", ",", "and", "Flag", "-", "OTUD1", "or", "Flag", "-", "OTUD1", "(", "C320S", ")", ",", "and", "then", "challenged", "with", "10", "μM", "MG132", "for", "6", "h", ".", "Ubiquitinated", "SMAD3", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "using", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "(", "I", ")", "Immunoprecipitation", "of", "SMAD3", "in", "293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "GFP", "-", "SMAD3", ",", "Flag", "-", "OTUD1", ",", "and", "HA", "-", "Ub", ",", "HA", "-", "Ub", "-", "K48", "(", "K48", "only", ")", ",", "or", "HA", "-", "Ub", "-", "K63", "(", "K63", "only", ")", ",", "respectively", ",", "and", "then", "challenged", "with", "10", "μM", "MG132", "for", "6", "h", ".", "Ubiquitinated", "SMAD3", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "using", "anti", "-", "HA", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Co-immunoprecipitation of OTUD1 and SMAD2 or SMAD3 in HUVECs transfected with Flag-OTUD1. Exogenous Flag-OTUD1 was immunoprecipitated by anti-Flag antibody. IgG, immunoglobulin G.(G) Immunoprecipitation of SMAD3 in 293T cells co-transfected with GFP-SMAD3, HA-Ub and Flag-OTUD1 and then challenged with 10 μM MG132 for 6 h. Ubiquitinated SMAD3 was detected by immunoblotting using anti-HA antibody. (H) Immunoprecipitation of SMAD3 in 293T cells co-transfected with GFP-SMAD3, HA-Ub, and Flag-OTUD1 or Flag-OTUD1(C320S), and then challenged with 10 μM MG132 for 6 h. Ubiquitinated SMAD3 was detected by immunoblotting using anti-HA antibody. (I) Immunoprecipitation of SMAD3 in 293T cells co-transfected with GFP-SMAD3, Flag-OTUD1, and HA-Ub, HA-Ub-K48 (K48 only), or HA-Ub-K63 (K63 only), respectively, and then challenged with 10 μM MG132 for 6 h. Ubiquitinated SMAD3 was detected by immunoblotting using anti-HA antibody."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "B", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "various", "amount", "of", "Flag", "-", "OTUD1", ".", "Western", "blot", "analysis", "(", "A", ")", "and", "densitometric", "quantification", "(", "B", ")", "of", "SMAD3", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "(", "E", ")", "and", "densitometric", "quantification", "(", "F", ")", "of", "SMAD3", "in", "aortic", "tissues", "of", "the", "mice", "from", "four", "groups", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "G", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "SMAD3", "and", "SMAD4", "in", "293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "GFP", "-", "SMAD3", ",", "HA", "-", "Ub", ",", "and", "HA", "-", "Ub", "-", "K63", "(", "K63", "only", ")", ",", "respectively", ",", "and", "then", "challenged", "with", "10", "μM", "MG132", "for", "6", "h", ".", "Exogenous", "SMAD3", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "GFP", "antibody", ".", "(", "H", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "SMAD3", "and", "SMAD4", "in", "293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "GFP", "-", "SMAD3", "and", "Flag", "-", "OTUD1", "and", "then", "challenged", "with", "10", "μM", "MG132", "for", "6", "h", ".", "Exogenous", "SMAD3", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "GFP", "antibody", ".", "IgG", ",", "immunoglobulin", "G", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-B) 293T cells were transfected with various amount of Flag-OTUD1. Western blot analysis (A) and densitometric quantification (B) of SMAD3. GAPDH was used as the loading control (n=3 biological replicates).(E-F) Western blot analysis (E) and densitometric quantification (F) of SMAD3 in aortic tissues of the mice from four groups. β-actin was used as the loading control (n=5 biological replicates).(G) Co-immunoprecipitation of SMAD3 and SMAD4 in 293T cells co-transfected with GFP-SMAD3, HA-Ub, and HA-Ub-K63 (K63 only), respectively, and then challenged with 10 μM MG132 for 6 h. Exogenous SMAD3 was immunoprecipitated by anti-GFP antibody.(H) Co-immunoprecipitation of SMAD3 and SMAD4 in 293T cells co-transfected with GFP-SMAD3 and Flag-OTUD1 and then challenged with 10 μM MG132 for 6 h. Exogenous SMAD3 was immunoprecipitated by anti-GFP antibody. IgG, immunoglobulin G."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "images", "(", "A", ")", "of", "H", "&", "E", "staining", "of", "aortic", "sections", "(", "scale", "bar", "=", "25", "μm", ")", "and", "quantification", "of", "arterial", "wall", "thickness", "(", "B", ")", ";", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "E", ",", "endothelium", ";", "M", ",", "media", ";", "A", ",", "adventitia", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Representative", "images", "(", "C", ")", "of", "Masson", "'", "s", "Trichrome", "staining", "of", "aortic", "sections", "(", "scale", "bar", "=", "25", "μm", ")", "and", "quantification", "of", "collagen", "deposition", "(", "D", ")", ";", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "(", "E", ")", "and", "densitometric", "quantification", "(", "F", ")", "of", "VE", "-", "cadherin", ",", "Vimentin", ",", "Twist", "and", "Snail", "in", "aortic", "tissues", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-B) Representative images (A) of H&E staining of aortic sections (scale bar=25 μm) and quantification of arterial wall thickness (B); n=5 biological replicates. E, endothelium; M, media; A, adventitia. (C-D) Representative images (C) of Masson's Trichrome staining of aortic sections (scale bar=25 μm) and quantification of collagen deposition (D); n=5 biological replicates.(E-F) Western blot analysis (E) and densitometric quantification (F) of VE-cadherin, Vimentin, Twist and Snail in aortic tissues. β-actin was used as the loading control (n=5 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Immunocytochemistry", "showing", "post", "-", "synaptic", "marker", "PSD", "-", "95", "(", "red", ")", ",", "pre", "-", "synaptic", "marker", "Synapsin", "-", "I", "(", "green", ")", ",", "dendritic", "marker", "Map2", "(", "blue", ")", "and", "co", "-", "localization", "of", "PSD", "-", "95", "and", "Synapsin", "-", "I", "from", "dissociated", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "hippocampal", "neurons", "at", "DIV", "16", ".", "Representative", "secondary", "dendrites", "(", "left", ")", "and", "quantification", "of", "colocalized", "synaptic", "puncta", "number", "and", "area", "(", "right", ")", "(", "n", "=", "36", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "neurons", ")", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "F", ")", "A", "train", "of", "high", "frequency", "stimulation", "(", "HFS", ";", "100", "Hz", "for", "1s", ")", "induced", "early", "-", "phase", "LTP", "(", "E", "-", "LTP", ")", "at", "Schaffer", "collateral", "synapses", "in", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "n", "=", "7", "slices", "from", "6", "mice", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "n", "=", "6", "slices", "from", "5", "mice", ")", "mice", ".", "Representative", "fEPSP", "traces", "were", "recorded", "before", "and", "60", "min", "after", "LTP", "induction", "(", "Scale", "bars", ":", "0", ".", "5", "mV", ",", "5", "ms", ")", ".", "Summary", "bar", "graphs", "showing", "the", "fEPSP", "slopes", "measured", "50", "-", "60", "min", "after", "a", "HFS", "at", "Schaffer", "collateral", "synapses", "was", "on", "the", "right", ".", "(", "G", ")", "Late", "-", "phase", "LTP", "(", "L", "-", "LTP", ")", "induced", "by", "four", "trains", "of", "HFS", "in", "Nedd4", "-", "2", "WT", "slices", "(", "n", "=", "7", "slices", "from", "7", "mice", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "slices", "(", "n", "=", "9", "slices", "from", "8", "mice", ")", ".", "Representative", "fEPSP", "traces", "were", "recorded", "before", "and", "180", "min", "after", "LTP", "induction", "(", "Scale", "bars", ":", "0", ".", "5", "mV", ",", "5", "ms", ")", ".", "Summary", "bar", "graphs", "showing", "the", "fEPSP", "slopes", "measured", "160", "-", "180", "min", "after", "L", "-", "LTP", "induction", "at", "Schaffer", "collateral", "synapses", "was", "on", "the", "right", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Immunocytochemistry showing post-synaptic marker PSD-95 (red), pre-synaptic marker Synapsin-I (green), dendritic marker Map2 (blue) and co-localization of PSD-95 and Synapsin-I from dissociated Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO hippocampal neurons at DIV 16. Representative secondary dendrites (left) and quantification of colocalized synaptic puncta number and area (right) (n = 36 for Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO neurons) are shown. Scale bar: 5 µm.(F) A train of high frequency stimulation (HFS; 100 Hz for 1s) induced early-phase LTP (E-LTP) at Schaffer collateral synapses in Nedd4-2 WT (n = 7 slices from 6 mice) and Nedd4-2 cKO (n = 6 slices from 5 mice) mice. Representative fEPSP traces were recorded before and 60 min after LTP induction (Scale bars: 0.5 mV, 5 ms). Summary bar graphs showing the fEPSP slopes measured 50-60 min after a HFS at Schaffer collateral synapses was on the right. (G) Late-phase LTP (L-LTP) induced by four trains of HFS in Nedd4-2 WT slices (n = 7 slices from 7 mice) and Nedd4-2 cKO slices (n = 9 slices from 8 mice). Representative fEPSP traces were recorded before and 180 min after LTP induction (Scale bars: 0.5 mV, 5 ms). Summary bar graphs showing the fEPSP slopes measured 160-180 min after L-LTP induction at Schaffer collateral synapses was on the right. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Barnes", "maze", "test", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "(", "6", "-", "8", "weeks", "old", ")", ".", "Schematic", "representation", "of", "Barnes", "maze", "(", "top", "left", ")", ".", "Mice", "were", "trained", "for", "4", "days", "with", "three", "training", "trials", "on", "each", "day", "to", "locate", "the", "escape", "box", "(", "black", "circle", ")", ".", "Learning", "curve", "during", "4", "training", "days", "was", "shown", "by", "the", "escape", "latency", "and", "the", "number", "of", "errors", "before", "escaping", "(", "top", "right", ")", ".", "Schematic", "representation", "of", "Barnes", "maze", "on", "probe", "trials", "(", "bottom", "left", ")", ".", "Quadrant", "occupancy", "on", "probe", "trial", "at", "day5", "and", "at", "day12", "(", "bottom", "right", ")", "were", "assessed", "by", "the", "time", "spent", "in", "the", "target", "area", "(", "green", "quadrant", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Barnes maze test from Nedd4-2 WT (n = 8) or Nedd4-2 cKO (n = 8) mice (6-8 weeks old). Schematic representation of Barnes maze (top left). Mice were trained for 4 days with three training trials on each day to locate the escape box (black circle). Learning curve during 4 training days was shown by the escape latency and the number of errors before escaping (top right). Schematic representation of Barnes maze on probe trials (bottom left). Quadrant occupancy on probe trial at day5 and at day12 (bottom right) were assessed by the time spent in the target area (green quadrant)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Western", "blots", "of", "F", "-", "actin", "to", "G", "-", "actin", "ratio", "with", "or", "without", "cLTP", "induction", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultured", "neurons", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "experimental", "design", "for", "cLTP", "inductions", "(", "top", "left", ")", ".", "Representative", "western", "blots", "(", "bottom", "left", ")", "and", "quantification", "of", "F", "-", "actin", "to", "G", "-", "actin", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "right", ")", "cultures", "after", "cLTP", "induction", "and", "recovery", "in", "normal", "aCSF", "for", "10", "or", "30", "min", "before", "lysis", "(", "n", "=", "11", "and", "8", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultures", ",", "respectively", ")", ".", "For", "quantification", ",", "data", "from", "cLTP", "induction", "were", "normalized", "to", "data", "from", "control", "(", "CTL", ")", "condition", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Western blots of F-actin to G-actin ratio with or without cLTP induction from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultured neurons. Schematic representation of the experimental design for cLTP inductions (top left). Representative western blots (bottom left) and quantification of F-actin to G-actin from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO (right) cultures after cLTP induction and recovery in normal aCSF for 10 or 30 min before lysis (n = 11 and 8 for Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO cultures, respectively). For quantification, data from cLTP induction were normalized to data from control (CTL) condition."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Western", "blots", "of", "Nedd4", "-", "2", ",", "total", "cofilin", ",", "phospho", "(", "p", ")", "-", "cofilin", "and", "GAPDH", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "forebrains", "at", "postnatal", "day", "14", ".", "Representative", "western", "blots", "and", "quantification", "of", "total", "cofilin", "relative", "to", "GAPDH", "and", "p", "-", "cofilin", "relative", "to", "total", "cofilin", "(", "n", "=", "6", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "brains", ")", "were", "shown", ".", "(", "B", ")", "Immunocytochemistry", "of", "cofilin", ",", "p", "-", "cofilin", "and", "dendritic", "marker", "MAP2", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultured", "hippocampal", "neurons", "at", "DIV", "16", ".", "Representative", "dendrites", "of", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "neurons", "and", "quantification", "of", "total", "cofilin", "relative", "to", "MAP2", "and", "p", "-", "cofilin", "relative", "to", "total", "cofilin", "are", "shown", "(", "n", "=", "25", "and", "26", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "neurons", ",", "respectively", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "Immunocytochemistry", "showing", "cofilin", ",", "p", "-", "cofilin", ",", "and", "dendritic", "marker", "MAP2", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultured", "hippocampal", "neurons", "induced", "with", "or", "without", "cLTP", "at", "DIV", "16", ".", "Representative", "dendrites", "and", "quantification", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultures", "are", "shown", "(", "n", "=", "36", "-", "39", "neurons", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "For", "quantification", ",", "data", "from", "cLTP", "induction", "were", "normalized", "to", "data", "from", "control", "(", "CTL", ")", "condition", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Western blots of Nedd4-2, total cofilin, phospho (p)-cofilin and GAPDH from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO forebrains at postnatal day 14. Representative western blots and quantification of total cofilin relative to GAPDH and p-cofilin relative to total cofilin (n = 6 for Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO brains) were shown.(B) Immunocytochemistry of cofilin, p-cofilin and dendritic marker MAP2 from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultured hippocampal neurons at DIV 16. Representative dendrites of Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO neurons and quantification of total cofilin relative to MAP2 and p-cofilin relative to total cofilin are shown (n = 25 and 26 for Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO neurons, respectively). Scale bar: 5 µm.(C) Immunocytochemistry showing cofilin, p-cofilin, and dendritic marker MAP2 from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultured hippocampal neurons induced with or without cLTP at DIV 16. Representative dendrites and quantification from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultures are shown (n = 36-39 neurons). Scale bar: 5 µm. For quantification, data from cLTP induction were normalized to data from control (CTL) condition."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunocytochemistry", "showing", "post", "-", "synaptic", "marker", "PSD", "-", "95", "(", "red", ")", ",", "pre", "-", "synaptic", "marker", "Synapsin", "-", "I", "(", "green", ")", ",", "dendritic", "marker", "Map2", "(", "blue", ")", "and", "co", "-", "localization", "of", "PSD", "-", "95", "and", "Synapsin", "-", "I", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultured", "hippocampal", "neurons", "at", "DIV", "16", "treated", "with", "TAT", ",", "TAT", "-", "S3", ",", "or", "TAT", "-", "pS3", "peptide", "for", "12", "hrs", "(", "10", "μM", ")", ".", "Representative", "secondary", "dendrites", "of", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "top", "left", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "bottom", "left", ")", "neurons", "are", "shown", ".", "Quantification", "of", "colocalized", "synaptic", "puncta", "number", "and", "synaptic", "puncta", "area", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "top", "right", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "bottom", "right", ")", "neurons", "is", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "32", "-", "36", "neurons", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "Patch", "-", "clamp", "recordings", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "hippocampal", "neurons", "treated", "with", "TAT", ",", "TAT", "-", "S3", ",", "or", "TAT", "-", "pS3", "peptide", "for", "12", "hrs", "(", "10", "μM", ")", "at", "DIV", "14", "-", "17", ".", "Representative", "mEPSC", "traces", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "top", "left", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "bottom", "left", ")", "are", "shown", ".", "Quantification", "of", "mEPSC", "amplitude", "and", "frequency", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "top", "right", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "bottom", "right", ")", "neurons", "are", "shown", "(", "n", "=", "22", "-", "24", "neurons", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunocytochemistry showing post-synaptic marker PSD-95 (red), pre-synaptic marker Synapsin-I (green), dendritic marker Map2 (blue) and co-localization of PSD-95 and Synapsin-I from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultured hippocampal neurons at DIV 16 treated with TAT, TAT-S3, or TAT-pS3 peptide for 12 hrs (10 μM). Representative secondary dendrites of Nedd4-2 WT (top left) and Nedd4-2 cKO (bottom left) neurons are shown. Quantification of colocalized synaptic puncta number and synaptic puncta area for Nedd4-2 WT (top right) and Nedd4-2 cKO (bottom right) neurons is on the right (n = 32-36 neurons). Scale bar: 5 µm.(B) Patch-clamp recordings from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO hippocampal neurons treated with TAT, TAT-S3, or TAT-pS3 peptide for 12 hrs (10 μM) at DIV 14-17. Representative mEPSC traces from Nedd4-2 WT (top left) and Nedd4-2 cKO (bottom left) are shown. Quantification of mEPSC amplitude and frequency from Nedd4-2 WT (top right) and Nedd4-2 cKO (bottom right) neurons are shown (n = 22-24 neurons)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "Barnes", "maze", "test", "after", "intraperitoneally", "injecting", "TAT", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "TAT", "-", "pS3", "(", "n", "=", "8", ")", "peptide", "in", "Nedd4", "-", "2", "WT", "mice", "(", "top", ")", ",", "or", "TAT", "(", "n", "=", "9", ")", "or", "TAT", "-", "pS3", "(", "n", "=", "8", ")", "peptides", "in", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "mice", "(", "bottom", ")", ".", "Learning", "curve", "during", "4", "training", "days", "of", "Barnes", "maze", "task", "showing", "the", "escape", "latency", ",", "number", "of", "errors", "before", "escaping", ",", "and", "the", "quadrant", "occupancy", "on", "probe", "trial", "at", "day", "5", "and", "at", "day", "12", "were", "assessed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) Barnes maze test after intraperitoneally injecting TAT (n = 8) or TAT-pS3 (n = 8) peptide in Nedd4-2 WT mice (top), or TAT (n = 9) or TAT-pS3 (n = 8) peptides in Nedd4-2 cKO mice (bottom). Learning curve during 4 training days of Barnes maze task showing the escape latency, number of errors before escaping, and the quadrant occupancy on probe trial at day 5 and at day 12 were assessed."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "SDS", "-", "PAGE", "analysis", "of", "purified", "sACES1211", "showed", "a", "single", "band", "of", "~", "170", "kDa", "and", "thus", "indicates", "extensive", "N", "-", "glycosylation", "(", "protein", "-", "only", "molecular", "weight", "is", "138", "kDa", ")", ".", "B", ".", "SEC", "-", "HPLC", "analysis", "of", "the", "respective", "samples", "of", "purified", "sACES1211", ",", "truncated", "N", "-", "domain", ",", "or", "truncated", "C", "-", "domain", "showed", "a", "single", "symmetric", "peak", "for", "each", "protein", "with", "calibrated", "molecular", "weights", "of", "244", "kDa", ",", "147", "kDa", ",", "and", "75", "kDa", ",", "respectively", ".", "The", "sACES1211", "sample", "did", "not", "show", "any", "peaks", "corresponding", "to", "single", "-", "domain", "or", "homodimer", "molecular", "weights", ".", "C", ".", "Native", "PAGE", "analysis", "showed", "a", "major", "diffuse", "band", "of", "~", "260", "kDa", "and", "a", "minor", "band", "of", "~", "500", "kDa", "for", "purified", "sACES1211", ",", "representing", "monomeric", "and", "dimeric", "forms", "of", "the", "protein", ".", "Commercial", "gel", "filtration", "standards", "and", "bovine", "serum", "albumin", "(", "BSA", ")", "were", "used", "to", "estimate", "the", "molecular", "weight", ".", "Purified", "truncated", "N", "-", "domain", "was", "used", "as", "an", "additional", "molecular", "weight", "marker", "for", "sACES1211", "and", "showed", "a", "single", "diffuse", "band", "of", "~", "160", "kDa", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. SDS-PAGE analysis of purified sACES1211 showed a single band of ~170 kDa and thus indicates extensive N-glycosylation (protein-only molecular weight is 138 kDa).B. SEC-HPLC analysis of the respective samples of purified sACES1211, truncated N-domain, or truncated C-domain showed a single symmetric peak for each protein with calibrated molecular weights of 244 kDa, 147 kDa, and 75 kDa, respectively. The sACES1211 sample did not show any peaks corresponding to single-domain or homodimer molecular weights.C. Native PAGE analysis showed a major diffuse band of ~260 kDa and a minor band of ~500 kDa for purified sACES1211, representing monomeric and dimeric forms of the protein. Commercial gel filtration standards and bovine serum albumin (BSA) were used to estimate the molecular weight. Purified truncated N-domain was used as an additional molecular weight marker for sACES1211 and showed a single diffuse band of ~160 kDa."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ",", "B", ")", "B", "-", "ALL", "progression", "measured", "as", "(", "A", ")", "absolute", "number", "or", "(", "B", ")", "percentage", "of", "OFP", "+", "cells", "in", "peripheral", "blood", "of", "transplanted", "mice", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ",", "CTRL", "=", "6", "mice", ",", "IFNγ", "=", "10", "mice", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ";", "mice", "in", "blue", "and", "yellow", "(", "B", ")", "were", "also", "analyzed", "by", "single", "-", "cell", "RNA", "sequencing", "(", "F", ",", "G", ")", "Percentage", "of", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "cells", "within", "OFP", "-", "BM", "cells", "(", "F", ")", "and", "maturation", "state", "(", "G", ")", "of", "CD8", "+", "lymphocytes", "(", "CD62L", "-", "CD44", "-", "double", "negative", ",", "CD62L", "-", "CD44", "+", "effector", "memory", ",", "CD62L", "+", "CD44", "-", "naive", "and", "CD62L", "+", "CD44", "+", "central", "memory", ")", "in", "the", "BM", "immune", "infiltrate", "at", "12", "-", "and", "17", "-", "days", "after", "B", "-", "ALL", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A, B) B-ALL progression measured as (A) absolute number or (B) percentage of OFP+ cells in peripheral blood of transplanted mice (mean ± SD, each dot represents an individual mouse, CTRL = 6 mice, IFNγ = 10 mice; **** p ≤ 0.001, Two-Way ANOVA; mice in blue and yellow (B) were also analyzed by single-cell RNA sequencing(F, G) Percentage of CD4+ and CD8+ cells within OFP- BM cells (F) and maturation state (G) of CD8+ lymphocytes (CD62L-CD44- double negative, CD62L-CD44+ effector memory, CD62L+CD44- naive and CD62L+CD44+ central memory) in the BM immune infiltrate at 12- and 17-days after B-ALL (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; ** p = 0.005, **** p ≤ 0.001, Two-Way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Engraftment", "of", "CD45", ".", "2", "donor", "cells", "and", "lineage", "composition", "following", "transplantation", "of", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "IFNγ", "receptor", "1", "knock", "out", "(", "KO", ")", "HSPCs", "transduced", "with", "either", "the", "control", "Tie2", ".", "NGFR", "(", "CTRL", ")", "or", "Tie2", ".", "IFNγ", "(", "IFNγ", ")", "LV", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ",", "WT", "CTRL", "=", "7", "mice", ",", "WT", "IFNγ", "=", "7", "mice", ",", "KO", "CTRL", "=", "7", "mice", ",", "KO", "IFNγ", "=", "7", "mice", ")", ".", "(", "C", ")", "B", "-", "ALL", "progression", "measured", "as", "absolute", "number", "of", "OFP", "+", "cells", "in", "the", "peripheral", "blood", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0286", "at", "day", "10", ";", "p", "=", "0", ".", "0174", "at", "day", "12", ";", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ";", "Ordinary", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ")", ".", "(", "E", ")", "Percentage", "of", "CD8", "+", "T", "lymphocytes", "within", "OFP", "-", "CD45", "+", "BM", "cells", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Engraftment of CD45.2 donor cells and lineage composition following transplantation of wild-type (WT) or IFNγ receptor 1 knock out (KO) HSPCs transduced with either the control Tie2.NGFR (CTRL) or Tie2.IFNγ (IFNγ) LV (mean ± SD, each dot represents an individual mouse, WT CTRL = 7 mice, WT IFNγ = 7 mice, KO CTRL = 7 mice, KO IFNγ = 7 mice).(C) B-ALL progression measured as absolute number of OFP+ cells in the peripheral blood (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; * p = 0.0286 at day 10; p = 0.0174 at day 12; *** p = 0.0002; **** p ≤ 0.0001; Ordinary Two-Way ANOVA).(E) Percentage of CD8+ T lymphocytes within OFP- CD45+ BM cells (mean ± SD, each dot represents an individual mouse)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ",", "C", ")", "Violin", "plots", "show", "the", "distribution", "of", "IFNγ", "(", "B", ")", "and", "MHC", "-", "II", "gene", "(", "C", ")", "signatures", "for", "each", "experimental", "condition", ",", "within", "each", "custom", "cell", "-", "type", ".", "Wilcox", "Rank", "Sum", "Test", "for", "IFNγ", "signature", ",", "condition", "IFNγ", "d12", "vs", ".", "CTR", "d12", ":", "B", "-", "ALL", "p", "=", "2", ".", "68x10", "-", "19", ",", "B", "cells", "p", "=", "0", ".", "5", ",", "plasma", "cells", "p", "=", "0", ".", "78", ";", "Wilcox", "Rank", "Sum", "Test", "for", "MHC", "-", "II", "signature", ",", "condition", "IFNγ", "d12", "vs", ".", "CTRL", "d12", ":", "B", "-", "ALL", "p", "=", "4", ".", "26x10", "-", "46", ",", "B", "cells", "p", "=", "1x10", "-", "9", ",", "plasma", "cells", "p", "=", "0", ".", "32", ".", "(", "F", ")", "Expression", "of", "Mki67", "transcripts", "in", "B", "-", "ALL", "cells", "from", "CTRL", "d12", "and", "IFNγ", "d12", "conditions", ",", "extracted", "from", "the", "scRNAseq", "dataset", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "Welch", "'", "s", "test", ")", ".", "(", "I", ")", "Loss", "of", "IFNγ", "response", "over", "time", "in", "B", "-", "ALL", "cells", "from", "the", "IFNγ", "group", ",", "potentially", "facilitated", "by", "reduced", "expression", "of", "Ifngr1", ",", "Ifngr2", ",", "Jak1", ",", "Stat1", "and", "Irf1", "(", "data", "extracted", "from", "the", "scRNAseq", "dataset", "statistical", "analysis", "by", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B, C) Violin plots show the distribution of IFNγ (B) and MHC-II gene (C) signatures for each experimental condition, within each custom cell-type. Wilcox Rank Sum Test for IFNγ signature, condition IFNγ d12 vs. CTR d12: B-ALL p= 2.68x10-19, B cells p=0.5, plasma cells p= 0.78; Wilcox Rank Sum Test for MHC-II signature, condition IFNγ d12 vs. CTRL d12: B-ALL p= 4.26x10-46, B cells p=1x10-9, plasma cells p= 0.32.(F) Expression of Mki67 transcripts in B-ALL cells from CTRL d12 and IFNγ d12 conditions, extracted from the scRNAseq dataset (**** p ≤ 0.0001, Welch's test).(I) Loss of IFNγ response over time in B-ALL cells from the IFNγ group, potentially facilitated by reduced expression of Ifngr1, Ifngr2, Jak1, Stat1 and Irf1 (data extracted from the scRNAseq dataset statistical analysis by Two-Way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "6Combination", "gene", "therapy", "with", "IFNα", ",", "TNFα", "and", "IFNγ", ",", "expressed", "from", "the", "Tie2", "vector", "platform", ".", "CTRL", "(", "Tie2", ".", "NGFR", ")", ",", "2", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "9", "mice", ";", "IFNα", ",", "1", "experiment", ",", "n", "=", "2", "mice", ";", "IFNα", "/", "IFNγ", ",", "1", "experiment", ",", "n", "=", "4", "mice", ";", "IFNα", "/", "TNFα", ",", "1", "experiment", ",", "n", "=", "3", "mice", ";", "IFNγ", "/", "TNFα", ",", "2", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "19", "mice", ".", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "MHC", "II", "+", "macrophages", "identified", "by", "F4", "/", "80", "expression", "in", "the", "spleen", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0484", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0049", ",", "ordinary", "One", "-", "Way", "ANOVA", ")", ".", "(", "D", ")", "Percentage", "of", "CD8", "+", "T", "lymphocytes", "within", "CD45", "positive", "and", "OFP", "negative", "splenic", "cells", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0356", ",", "ordinary", "One", "-", "Way", "ANOVA", ")", ".", "(", "Combination", "of", "IFNγ", "gene", "therapy", "with", "immuno", "-", "oncology", "drugs", ".", "CTRL", "(", "Tie2", ".", "NGFR", ")", "+", "antibody", "isotype", ",", "n", "=", "6", "mice", ";", "CTRL", "+", "αCTLA4", "antibody", ",", "n", "=", "5", "mice", ";", "CTRL", "+", "αLAG3", "antibody", ",", "n", "=", "5", "mice", ";", "CTRL", "+", "1", "-", "Methyltryptophan", "(", "1", "-", "MT", ")", ",", "n", "=", "5", "mice", ";", "IFNγ", "(", "Tie2", ".", "IFNγ", ")", "+", "antibody", "isotype", ",", "n", "=", "7", "mice", ";", "IFNγ", "+", "αCTLA4", "antibody", ",", "n", "=", "7", "mice", ";", "IFNγ", "+", "αLAG3", "antibody", ",", "n", "=", "7", "mice", ";", "IFNγ", "+", "1", "-", "MT", ",", "n", "=", "5", "mice", ".", "(", "F", ")", "Percentage", "of", "MHC", "II", "+", "macrophages", "identified", "by", "F4", "/", "80", "expression", "in", "the", "spleen", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", "as", "compared", "to", "CTRL", "isotype", ",", "ordinary", "One", "-", "Way", "ANOVA", ")", ".", "(", "G", ")", "Percentage", "of", "CD8", "+", "T", "lymphocytes", "within", "OFP", "negative", "BM", "cells", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ")", ".", "S"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Combination gene therapy with IFNα, TNFα and IFNγ, expressed from the Tie2 vector platform. CTRL (Tie2.NGFR), 2 independent experiments, n = 9 mice; IFNα, 1 experiment, n = 2 mice; IFNα/IFNγ, 1 experiment, n= 4 mice; IFNα/TNFα, 1 experiment, n = 3 mice; IFNγ/TNFα, 2 independent experiments, n = 19 mice. (C) Percentage of MHC II+ macrophages identified by F4/80 expression in the spleen (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; *p = 0.0484, **p = 0.0049, ordinary One-Way ANOVA). (D) Percentage of CD8+ T lymphocytes within CD45 positive and OFP negative splenic cells (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; *p = 0.0356, ordinary One-Way ANOVA). ( Combination of IFNγ gene therapy with immuno-oncology drugs. CTRL (Tie2.NGFR) + antibody isotype, n = 6 mice; CTRL + αCTLA4 antibody, n= 5 mice; CTRL + αLAG3 antibody, n = 5 mice; CTRL + 1-Methyltryptophan (1-MT), n = 5 mice; IFNγ (Tie2.IFNγ) + antibody isotype, n = 7 mice; IFNγ + αCTLA4 antibody, n = 7 mice; IFNγ + αLAG3 antibody, n = 7 mice; IFNγ +1-MT, n = 5 mice. (F) Percentage of MHC II+ macrophages identified by F4/80 expression in the spleen (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001 as compared to CTRL isotype, ordinary One-Way ANOVA). (G) Percentage of CD8+ T lymphocytes within OFP negative BM cells (mean ± SD, each dot represents an individual mouse). S "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "traces", "showing", "SQR", "-", "driven", "oxygen", "consumption", "in", "3x106", "control", "(", "C", ")", "and", "five", "patientsfibroblasts", "(", "P1", "-", "5", ")", "in", "the", "absence", "(", "solid", "traces", ")", "or", "presence", "(", "dashed", "traces", ")", "of", "CoQ10", "in", "the", "culture", "medium", ".", "See", "Materials", "and", "Methods", "for", "the", "role", "and", "concentration", "of", "the", "compounds", "used", ".", "(", "B", ")", "Relative", "rates", "of", "SQR", "-", "driven", "oxygen", "consumption", "are", "normalized", "to", "CIV", "respiration", "rates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative traces showing SQR-driven oxygen consumption in 3x106 control (C) and five patientsfibroblasts (P1-5) in the absence (solid traces) or presence (dashed traces) of CoQ10 in the culture medium. See Materials and Methods for the role and concentration of the compounds used. (B) Relative rates of SQR-driven oxygen consumption are normalized to CIV respiration rates."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "western", "blot", "showing", "the", "level", "of", "SQR", ",", "TST", ",", "ETHE1", "and", "SUOX", "proteins", "in", "three", "control", "(", "C1", "-", "3", ")", "and", "four", "patients", "fibroblasts", "(", "P1", "-", "4", ")", ".", "(", "B", "-", "E", ")", "Relative", "levels", "of", "proteins", "normalized", "to", "Vinculin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative western blot showing the level of SQR, TST, ETHE1 and SUOX proteins in three control (C1-3) and four patients fibroblasts (P1-4). (B-E) Relative levels of proteins normalized to Vinculin."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "western", "blots", "showing", "the", "level", "of", "SQR", ",", "TST", ",", "ETHE1", "and", "SUOX", "proteins", "in", "two", "controls", "(", "C1", ",", "C2", ")", "and", "two", "patients", "fibroblasts", "(", "P3", ",", "P4", ")", ".", "(", "B", "-", "E", ")", "Relative", "levels", "of", "proteins", "normalized", "to", "Vinculin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative western blots showing the level of SQR, TST, ETHE1 and SUOX proteins in two controls (C1, C2) and two patients fibroblasts (P3, P4). (B-E) Relative levels of proteins normalized to Vinculin."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Representative", "western", "blots", "showing", "SQR", ",", "TST", ",", "ETHE1", "and", "SUOX", "of", "two", "control", "fibroblasts", "treated", "with", "DMSO", "(", "-", ")", "or", "with", "DMSO", "+", "4", "-", "NB", "(", "+", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "proteins", "levels", "in", "fibroblasts", "treated", "with", "4", "-", "NB", "relative", "to", "control", ".", "(", "C", ")", "Representative", "western", "blots", "showing", "ADCK3", ",", "SQR", ",", "TST", ",", "ETHE1", "and", "SUOX", "in", "two", "control", "(", "EV", ")", "and", "six", "ADCK3", "-", "depleted", "clones", "(", "ADCK3", "RNAi", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "proteins", "levels", "in", "ADCK3", "-", "depleted", "clones", "(", "ADCK3", "RNAi", ")", "relative", "to", "controls", "(", "EV", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Representative western blots showing SQR, TST, ETHE1 and SUOX of two control fibroblasts treated with DMSO (-) or with DMSO+ 4-NB (+). (B) Quantification of proteins levels in fibroblasts treated with 4-NB relative to control.(C) Representative western blots showing ADCK3, SQR, TST, ETHE1 and SUOX in two control (EV) and six ADCK3-depleted clones (ADCK3 RNAi). (D) Quantification of proteins levels in ADCK3-depleted clones (ADCK3 RNAi) relative to controls (EV)."}
{"words": ["Figure", "7Distribution", "of", "peptides", "containing", "sulfhydrated", "cysteine", "residues", "relative", "to", "their", "H", "/", "L", "ratios", "as", "determined", "by", "the", "BTA", "analysis", "of", "cell", "extracts", "isolated", "from", "C1", "and", "P1", "patient", "cells", "(", "indicated", "in", "A", ")", "and", "C2", "and", "P4", "fibroblasts", "(", "B", ")", ".", "Values", "of", "H", "/", "L", "ratios", "are", "plotted", "against", "the", "number", "of", "identified", "peptides", ".", "The", "gray", "line", "marks", "the", "H", "/", "L", "ratio", ">", "2", ",", "consisting", "of", "cysteine", "-", "containing", "peptides", "in", "proteins", "from", "patient", "cell", "lines", "that", "exhibited", "higher", "reactivity", "with", "H2S", "compared", "with", "the", "respective", "control", ".", "Indicated", "on", "the", "X", "axes", "are", "representative", "sensitive", "cysteine", "peptides", ",", "which", "are", "common", "between", "the", "ones", "found", "in", "the", "RedoxDB", "database", ",", "and", "by", "the", "BTA", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Distribution of peptides containing sulfhydrated cysteine residues relative to their H/L ratios as determined by the BTA analysis of cell extracts isolated from C1 and P1 patient cells (indicated in A) and C2 and P4 fibroblasts (B). Values of H/L ratios are plotted against the number of identified peptides. The gray line marks the H/L ratio >2, consisting of cysteine-containing peptides in proteins from patient cell lines that exhibited higher reactivity with H2S compared with the respective control. Indicated on the X axes are representative sensitive cysteine peptides, which are common between the ones found in the RedoxDB database, and by the BTA assay."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Representative", "western", "blots", "showing", "the", "levels", "of", "SQR", ",", "TST", ",", "ETHE1", "and", "SUOX", "protein", "in", "the", "kidney", "of", "three", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "three", "mutant", "(", "Mut", ")", "mice", ".", "(", "B", "-", "E", ")", "Relative", "levels", "of", "proteins", "normalized", "to", "Vinculin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Representative western blots showing the levels of SQR, TST, ETHE1 and SUOX protein in the kidney of three wild-type (WT) and three mutant (Mut) mice. (B-E) Relative levels of proteins normalized to Vinculin."}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", ")", "Representative", "western", "blots", "showing", "the", "levels", "of", "SQR", ",", "TST", ",", "ETHE1", "and", "SUOX", "protein", "from", "the", "brain", "of", "5", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "five", "mutant", "(", "Mut", ")", "mice", "(", "B", "-", "E", ")", "Relative", "levels", "of", "proteins", "normalized", "to", "Vinculin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A) Representative western blots showing the levels of SQR, TST, ETHE1 and SUOX protein from the brain of 5 wild-type (WT) and five mutant (Mut) mice (B-E) Relative levels of proteins normalized to Vinculin."}
{"words": ["Figure", "10", "(", "A", ")", "Total", "GSH", "amount", "normalized", "to", "protein", "from", "kidney", "and", "(", "B", ")", "brain", "of", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "mutant", "(", "Mut", ")", "mice", ".", "Error", "bars", "represent", "SDs", "of", "at", "least", "3", "animals", "per", "group", ".", "(", "C", ")", "Thiosulfate", "levels", "in", "urine", "and", "(", "D", ")", "plasma", "normalized", "to", "protein", "amount", ".", "Error", "bars", "represent", "SDs", "of", "9", "animals", "per", "group", "(", "urine", ")", "and", "6", "animals", "per", "group", "(", "plasma", ")", ".", "(", "E", ")", "H2S", "amount", "normalized", "to", "tissue", "from", "kidney", "and", "(", "F", ")", "brain", ".", "Error", "bars", "represent", "SDs", "of", "7", "/", "8", "animals", "per", "group", ".", "(", "G", ")", "Acylcarnitine", "C4", ",", "C5", "and", "C6", "levels", "from", "plasma", ",", "normalized", "to", "volume", ".", "Error", "bars", "represent", "SDs", "of", "5", "wild", "-", "type", "and", "3", "mutants", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 10(A) Total GSH amount normalized to protein from kidney and (B) brain of wild-type (WT) and mutant (Mut) mice. Error bars represent SDs of at least 3 animals per group.(C) Thiosulfate levels in urine and (D) plasma normalized to protein amount. Error bars represent SDs of 9 animals per group (urine) and 6 animals per group (plasma).(E) H2S amount normalized to tissue from kidney and (F) brain. Error bars represent SDs of 7/8 animals per group.(G) Acylcarnitine C4, C5 and C6 levels from plasma, normalized to volume. Error bars represent SDs of 5 wild-type and 3 mutants."}
{"words": ["Figure", "1T2", "-", "weighed", "brain", "MRIs", "of", "patient", "A", "(", "D1", "-", "3", ")", "at", "28", "months", "of", "age", "and", "patient", "B", "at", "(", "D4", "-", "6", ")", "at", "16", "months", "of", "age", ",", "showing", "global", "brain", "atrophy", "as", "well", "as", "periventricular", "and", "deep", "white", "matter", "hyperintensities", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1T2-weighed brain MRIs of patient A (D1-3) at 28 months of age and patient B at (D4-6) at 16 months of age, showing global brain atrophy as well as periventricular and deep white matter hyperintensities."}
{"words": ["Figure", "3Quantifications", "of", "HOPS", "/", "CORVET", "subunits", "in", "fibroblast", "lysates", "(", "top", ")", "and", "representative", "immunoblots", "(", "bottom", ")", ",", "analyzed", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "E", ")", "VPS33A", ",", "(", "F", ")", "VPS11", ",", "(", "G", ")", "VPS18", ".", "Immunoblots", "(", "left", ")", "and", "quantifications", "normalized", "to", "control", "(", "right", ")", "of", "VPS16", ",", "VPS33A", "and", "VPS11", "in", "lysates", "from", "fibroblasts", "transduced", "with", "a", "lentivirus", "to", "express", "VPS16", "or", "control", "(", "empty", "vector", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Quantifications of HOPS/CORVET subunits in fibroblast lysates (top) and representative immunoblots (bottom), analyzed as in (C). (E) VPS33A, (F) VPS11, (G) VPS18.Immunoblots (left) and quantifications normalized to control (right) of VPS16, VPS33A and VPS11 in lysates from fibroblasts transduced with a lentivirus to express VPS16 or control (empty vector)."}
{"words": ["Figure", "4Analysis", "of", "the", "early", "endosome", "marker", "EEA1", "in", "fibroblasts", "transduced", "with", "control", "or", "VPS16", "-", "expressing", "lentivirus", "by", "confocal", "microscopy", ".", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "micrographs", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "EEA1", "-", "stained", "puncta", "number", "and", "intensities", "(", "ca", "80", "cells", "analyzed", "for", "each", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Analysis", "of", "intracellular", "Transferrin", "trafficking", ".", "Fibroblasts", "fed", "with", "fluorescently", "labeled", "Transferrin", "were", "co", "-", "stained", "with", "LysoTracker", "(", "G", ")", "or", "an", "antibody", "against", "LAMP2", "(", "H", ")", ".", "Representative", "images", "(", "left", ")", "of", "fibroblasts", "transduced", "with", "control", "virus", ",", "with", "magnified", "areas", "demonstrating", "co", "-", "localized", "puncta", "(", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bars", "10", "μm", "or", "2", "μm", "(", "inserts", ")", ".", "Quantifications", "(", "right", ")", "of", "the", "co", "-", "localization", "between", "Transferrin", "and", "LysoTracker", "or", "LAMP2", ",", "respectively", ",", "expressed", "as", "Pearson", "correlation", "coefficients", ".", "Colored", "horizontal", "bars", "indicate", "the", "median", "values", "and", "whiskers", "5", "and", "95", "percentiles", "(", "n", "=", "10", "optical", "sections", "from", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Analysis of the early endosome marker EEA1 in fibroblasts transduced with control or VPS16-expressing lentivirus by confocal microscopy. (A) Representative confocal micrographs. Scale bar, 20 μm. (B) Quantification of EEA1-stained puncta number and intensities (ca 80 cells analyzed for each of n=3 biological replicates).Analysis of intracellular Transferrin trafficking. Fibroblasts fed with fluorescently labeled Transferrin were co-stained with LysoTracker (G) or an antibody against LAMP2 (H). Representative images (left) of fibroblasts transduced with control virus, with magnified areas demonstrating co-localized puncta (arrowheads). Scale bars 10 μm or 2 μm (inserts). Quantifications (right) of the co-localization between Transferrin and LysoTracker or LAMP2, respectively, expressed as Pearson correlation coefficients. Colored horizontal bars indicate the median values and whiskers 5 and 95 percentiles (n=10 optical sections from 3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "5Confocal", "micrographs", "of", "fibroblasts", "transduced", "with", "control", "or", "VPS16", "-", "expressing", "lentivirus", "and", "labeled", "with", "LysoTracker", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "LysoTracker", "-", "stained", "puncta", "number", "and", "intensities", "(", "ca", "80", "cells", "analyzed", "for", "each", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Representative", "immunoblots", "(", "bottom", ")", "and", "summary", "quantifications", "(", "top", ")", "of", "the", "levels", "of", "LAMP1", "(", "C", ")", "and", "LAMP2", "(", "D", ")", "in", "fibroblasts", ",", "normalized", "to", "levels", "of", "actin", "(", "ACTB", ")", "and", "expressed", "as", "%", "of", "controls", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Analysis", "of", "lysosomal", "Cathepsin", "D", "(", "CtsD", ")", "processing", "by", "immunoblotting", ".", "Immunoblot", "to", "detect", "CtsD", "isoforms", "(", "left", ")", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "processing", ",", "calculated", "as", "the", "percentage", "of", "CtsD", "divided", "by", "the", "sum", "of", "all", "isoforms", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Confocal micrographs of fibroblasts transduced with control or VPS16-expressing lentivirus and labeled with LysoTracker. Scale bar, 20 μm. Quantification of LysoTracker-stained puncta number and intensities (ca 80 cells analyzed for each of n=3 biological replicates).Representative immunoblots (bottom) and summary quantifications (top) of the levels of LAMP1 (C) and LAMP2 (D) in fibroblasts, normalized to levels of actin (ACTB) and expressed as % of controls (n=3 biological replicates). Analysis of lysosomal Cathepsin D (CtsD) processing by immunoblotting. Immunoblot to detect CtsD isoforms (left) and quantification (right) of processing, calculated as the percentage of CtsD divided by the sum of all isoforms (n=3 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "6Analysis", "of", "autophagosome", "numbers", "in", "fibroblasts", "transfected", "to", "express", "mRFP", "-", "GFP", "-", "LC3", ".", "(", "F", ")", "Representative", "confocal", "micrographs", "(", "optical", "sections", ")", "of", "fibroblasts", "imaged", "live", "under", "basal", "or", "serum", "-", "starved", "conditions", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Analysis", "of", "autophagosome", "numbers", "in", "fibroblasts", "transfected", "to", "express", "mRFP", "-", "GFP", "-", "LC3", ".", "Quantification", "of", "autophagosomes", ",", "defined", "as", "green", "+", "red", "puncta", "(", "G", ")", "and", "autophago", "-", "lysosomes", ",", "calculated", "as", "the", "number", "of", "red", "(", "but", "not", "green", ")", "puncta", "divided", "by", "the", "total", "number", "of", "puncta", ".", "Colored", "horizontal", "bars", "denote", "median", "values", "and", "whiskers", "5", "and", "95", "percentiles", "(", "n", "=", "50", "-", "113", "cells", "from", "a", "total", "of", "3", "independent", "experiments", ";", "for", "exact", "values", "see", "Appendix", "Table", "S1", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Analysis of autophagosome numbers in fibroblasts transfected to express mRFP-GFP-LC3. (F) Representative confocal micrographs (optical sections) of fibroblasts imaged live under basal or serum-starved conditions. Scale bar, 20 μm.Analysis of autophagosome numbers in fibroblasts transfected to express mRFP-GFP-LC3. Quantification of autophagosomes, defined as green + red puncta (G) and autophago-lysosomes, calculated as the number of red (but not green) puncta divided by the total number of puncta. Colored horizontal bars denote median values and whiskers 5 and 95 percentiles (n=50-113 cells from a total of 3 independent experiments; for exact values see Appendix Table S1)."}
{"words": ["Figure", "7Myelination", ",", "as", "reported", "using", "the", "Tg", "(", "mbp", ":", "gfp", "-", "caax", ")", "transgenic", ",", "is", "significantly", "reduced", "in", "vps16", "crispants", ".", "The", "yellow", "box", "indicates", "the", "region", "assessed", "in", "D", ".", "Scale", "bar", "100", "μm", ".", "Bar", "graphs", "represent", "data", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "comparisons", "by", "Mann", "-", "Whitney", "U", "tests", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Myelination, as reported using the Tg(mbp:gfp-caax) transgenic, is significantly reduced in vps16 crispants. The yellow box indicates the region assessed in D. Scale bar 100 μm. Bar graphs represent data as mean ±SEM. Statistical comparisons by Mann-Whitney U tests (n=6). ** p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "8LysoTracker", "signal", "colocalizes", "with", "the", "astroglial", "reporter", "slc1a2b", ":", "citrine", "and", "does", "not", "appear", "to", "overlap", "with", "the", "pan", "-", "neuronal", "reporter", "elavl3", ":", "GCaMP5G", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8LysoTracker signal colocalizes with the astroglial reporter slc1a2b:citrine and does not appear to overlap with the pan-neuronal reporter elavl3:GCaMP5G."}
{"words": ["Figure", "1C", "-", "F", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "esg", "-", "GFP", "and", "Delta", "(", "Dl", ")", "staining", "with", "the", "midgut", "section", "from", "the", "R4", "region", "of", "14", "-", "day", "Drosophila", "(", "C", ")", ",", "26", "-", "day", "Drosophila", "(", "D", ")", ",", "40", "-", "day", "Drosophila", "(", "E", ")", ",", "and", "40", "-", "day", "Drosophila", "in", "response", "to", "0", ".", "5", "mM", "ALA", "administration", ",", "which", "started", "at", "day", "26", "after", "eclosion", "(", "F", ")", ".", "esg", "-", "GFP", "(", "green", ")", "identifies", "ISCs", "and", "their", "differentiating", "cells", ".", "Dl", "staining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "ISCs", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "J", ".", "Western", "blotting", "results", "of", "midguts", "indicate", "a", "decrease", "of", "LAS", "in", "the", "midguts", "of", "aged", "Drosophila", ".", "Loading", "controls", ",", "β", "-", "tubulin", ".", "K", ".", "Quantification", "of", "LAS", "band", "intensity", "as", "seen", "in", "experiments", "(", "J", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "L", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C-F. Immunofluorescence images of esg-GFP and Delta (Dl) staining with the midgut section from the R4 region of 14-day Drosophila (C), 26-day Drosophila (D), 40-day Drosophila (E), and 40-day Drosophila in response to 0.5 mM ALA administration, which started at day 26 after eclosion (F). esg-GFP (green) identifies ISCs and their differentiating cells. Dl staining (red) was used to visualize ISCs. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue.J. Western blotting results of midguts indicate a decrease of LAS in the midguts of aged Drosophila. Loading controls, β-tubulin. K. Quantification of LAS band intensity as seen in experiments (J). Error bars indicate the SD of three independent experiments. L Data information: Error bars represent SDs. Student's t-tests, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05."}
{"words": ["Figure", "2C", ".", "Quantification", "of", "the", "content", "of", "ALA", "in", "midguts", "of", "flies", "with", "indicated", "genotypes", "using", "LC", "-", "ESI", "-", "MS", "/", "MS", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "D", "-", "F", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "the", "midgut", "section", "from", "the", "R4", "region", "in", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "UAS", "-", "lacZ", "(", "D", ",", "control", ")", ",", "Las", "RNAi", "(", "E", ")", ",", "or", "Las", "RNAi", "in", "response", "to", "ALA", "administration", "(", "F", ")", ".", "esg", "-", "GFP", "(", "green", ")", "indicates", "ISCs", "and", "their", "differentiating", "cells", ".", "Dl", "staining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "ISCs", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μmI", "-", "J", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "control", "(", "FRT40A", ",", "I", ")", "and", "Las", "RNAi", "(", "J", ")", "MARCM", "clones", "(", "green", ",", "outlined", "by", "white", "dotted", "lines", ")", "10", "days", "after", "clone", "induction", "(", "ACI", ")", ".", "Pdm1", "staining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "ECs", ".", "K", ".", "Quantification", "of", "the", "ratio", "of", "Pdm1", "+", "cells", "per", "clone", "of", "MARCM", "clones", "with", "indicated", "genotypes", ".", "n", "is", "indicated", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "clone", ".", "L", ".", "Quantification", "of", "MARCM", "clone", "size", "of", "experiments", "in", "(", "I", "-", "J", ")", ".", "n", "is", "indicated", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "clone", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", "(", "D", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C. Quantification of the content of ALA in midguts of flies with indicated genotypes using LC-ESI-MS/MS. Error bars indicate the SD of three independent experiments. Data information: Error bars represent SDs. Student's t-tests, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.D-F. Immunofluorescence images of the midgut section from the R4 region in Drosophila carrying esgts-GAL4-driven UAS-lacZ (D, control), Las RNAi (E), or Las RNAi in response to ALA administration (F). esg-GFP (green) indicates ISCs and their differentiating cells. Dl staining (red) was used to visualize ISCs. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μmI-J. Immunofluorescence images of control (FRT40A, I) and Las RNAi (J) MARCM clones (green, outlined by white dotted lines) 10 days after clone induction (ACI). Pdm1 staining (red) was used to visualize ECs. K. Quantification of the ratio of Pdm1+ cells per clone of MARCM clones with indicated genotypes. n is indicated. Each dot corresponds to one clone. L. Quantification of MARCM clone size of experiments in (I-J). n is indicated. Each dot corresponds to one clone. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μm (D Error bars represent SDs. Student's t-tests, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "Drosophila", "midguts", "treated", "with", "the", "pH", "indicator", "Bromophenol", "Blue", ".", "Moreover", ",", "quantification", "of", "the", "three", "categories", "of", "Drosophila", "of", "indicated", "conditions", ".", "The", "three", "categories", "can", "be", "divided", "into", ":", "homeostasis", ",", "a", "well", "-", "defined", "acidic", "(", "yellow", "colored", ")", "copper", "cell", "region", "(", "CCR", ")", "is", "flanked", "by", "basic", "(", "blue", "colored", ")", "anterior", "midgut", "(", "AM", ")", "and", "posterior", "midgut", "(", "PM", ")", ".", "\"", "Perturbed", "A", "\"", ",", "the", "acidic", "region", "is", "lost", "and", "the", "whole", "gut", "is", "basic", ";", "\"", "Perturbed", "B", "\"", ",", "the", "strongly", "acidic", "region", "is", "lost", ",", "and", "the", "remainder", "of", "the", "gut", "also", "becomes", "less", "basic", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "guts", "from", "left", "to", "right", "are", "90", ",", "90", ",", "and", "90", ".", "Error", "bars", "show", "the", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Excretion", "of", "Drosophila", "treated", "with", "Bromophenol", "Blue", ".", "Images", "of", "deposits", "and", "quantification", "of", "deposit", "numbers", "are", "shown", ".", "Excretions", "are", "quantified", "in", "30", "fields", "for", "each", "group", "of", "12", "Drosophila", ".", "Tests", "were", "repeated", "as", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "The", "statistical", "tests", "used", "in", "other", "panels", "were", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "G", ".", "Survival", "(", "percentage", ")", "of", "female", "W1118", "Drosophila", "with", "and", "without", "supplementation", "of", "ALA", "as", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "flies", ":", "100", "(", "W1118", "+", "0", ".", "5", "mM", "ALA", ")", "and", "100", "(", "W1118", "+", "0", "mM", "ALA", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "conducted", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "p", "-", "values", "for", "lifespan", "curves", "were", "calculated", "by", "the", "log", "-", "rank", "test", ".", "The", "statistical", "tests", "used", "in", "other", "panels", "were", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "I", ".", "Survival", "(", "percentage", ")", "of", "female", "Canton", "-", "S", "Drosophila", "with", "and", "without", "supplementation", "of", "ALA", "as", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "flies", ":", "100", "(", "Canton", "-", "S", "+", "0", "mM", "ALA", ")", ",", "100", "(", "Canton", "-", "S", "+", "0", ".", "5", "mM", "ALA", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "conducted", ".", "J", ".", "Survival", "(", "percentage", ")", "of", "female", "Canton", "-", "S", "Drosophila", "with", "and", "without", "supplementation", "of", "ALA", "at", "26", "-", "day", "as", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "flies", ":", "100", "(", "Canton", "-", "S", "+", "0", "mM", "ALA", ")", "and", "100", "(", "Canton", "-", "S", "+", "0", ".", "5", "mM", "ALA", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "conducted", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "p", "-", "values", "for", "lifespan", "curves", "(", "were", "calculated", "by", "the", "log", "-", "rank", "test", ".", "The", "statistical", "tests", "used", "in", "other", "panels", "were", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Representative images and quantification of Drosophila midguts treated with the pH indicator Bromophenol Blue. Moreover, quantification of the three categories of Drosophila of indicated conditions. The three categories can be divided into: homeostasis, a well-defined acidic (yellow colored) copper cell region (CCR) is flanked by basic (blue colored) anterior midgut (AM) and posterior midgut (PM). \"Perturbed A\", the acidic region is lost and the whole gut is basic; \"Perturbed B\", the strongly acidic region is lost, and the remainder of the gut also becomes less basic. The numbers of quantified guts from left to right are 90, 90, and 90. Error bars show the SD of three independent experiments.C. Excretion of Drosophila treated with Bromophenol Blue. Images of deposits and quantification of deposit numbers are shown. Excretions are quantified in 30 fields for each group of 12 Drosophila. Tests were repeated as three independent experiments. Data information: The statistical tests used in other panels were student's t-tests. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.G. Survival (percentage) of female W1118 Drosophila with and without supplementation of ALA as indicated. The numbers of quantified flies: 100 (W1118 + 0.5 mM ALA) and 100 (W1118 + 0 mM ALA). Three independent experiments were conducted. Data information: Error bars represent SDs. p-values for lifespan curves were calculated by the log-rank test. The statistical tests used in other panels were student's t-tests. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.I. Survival (percentage) of female Canton-S Drosophila with and without supplementation of ALA as indicated. The numbers of quantified flies: 100 (Canton-S + 0 mM ALA), 100 (Canton-S + 0.5 mM ALA). Three independent experiments were conducted. J. Survival (percentage) of female Canton-S Drosophila with and without supplementation of ALA at 26-day as indicated. The numbers of quantified flies: 100 (Canton-S + 0 mM ALA) and 100 (Canton-S + 0.5 mM ALA). Three independent experiments were conducted. Data information: Error bars represent SDs. p-values for lifespan curves ( were calculated by the log-rank test. The statistical tests used in other panels were student's t-tests. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "F", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "midgut", "sections", "from", "the", "R4", "region", "in", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "expression", "of", "CAT", "cDNA", "(", "A", ")", ",", "CAT", "cDNA", "with", "AD4", "administration", "(", "B", ")", ",", "CAT", "cDNA", "with", "ALA", "administration", "(", "C", ")", ",", "Keap1", "RNAi", "(", "D", ")", ",", "Keap1", "RNAi", "with", "AD4", "administration", "(", "E", ")", ",", "or", "Keap1", "RNAi", "with", "ALA", "administration", "(", "F", ")", ".", "esg", "-", "GFP", "(", "green", ")", "represents", "ISCs", "and", "their", "differentiating", "cells", ".", "Dl", "staining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "ISCs", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "esg", "-", "GFP", "+", "cells", ",", "Dl", "+", "cells", "of", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "expression", "of", "lacZ", "cDNA", ",", "CAT", "cDNA", ",", "CAT", "cDNA", "with", "AD4", "administration", ",", "CAT", "cDNA", "with", "ALA", "administration", ",", "Keap1", "RNAi", ",", "Keap1", "RNAi", "with", "AD4", "administration", ",", "or", "Keap1", "RNAi", "with", "ALA", "administration", ".", "n", "is", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "guts", "from", "left", "to", "right", "are", "18", ",", "19", ",", "20", ",", "18", ",", "18", ",", "19", ",", "19", ",", "18", ",", "19", ",", "20", ",", "18", ",", "18", ",", "19", ",", "and", "19", ".", "H", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "pH3", "+", "cells", "and", "luciferase", "activity", "of", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "expression", "of", "lacZ", "cDNA", ",", "CAT", "cDNA", ",", "CAT", "cDNA", "with", "AD4", "administration", ",", "CAT", "cDNA", "with", "ALA", "administration", ",", "Keap1", "RNAi", ",", "Keap1", "RNAi", "with", "AD4", "administration", ",", "or", "Keap1", "RNAi", "with", "ALA", "administration", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "guts", "from", "left", "to", "right", "are", "18", ",", "19", ",", "20", ",", "18", ",", "18", ",", "19", ",", "and", "19", ".", "I", "-", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "I", "-", "L", ".", "Representative", "images", "of", "the", "midgut", "section", "from", "the", "R4", "region", "of", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "expression", "of", "lacZ", "cDNA", "(", "I", ")", ",", "Las", "RNAi", "(", "J", ")", ",", "Las", "RNAi", "and", "CAT", "cDNA", "(", "K", ")", ",", "or", "Las", "RNAi", "and", "Keap1", "RNAi", "(", "L", ")", ".", "esg", "-", "GFP", "(", "green", ")", "indicates", "ISCs", "and", "their", "differentiating", "cells", ".", "Dl", "staining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "ISCs", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-F. Immunofluorescence images of midgut sections from the R4 region in Drosophila carrying esgts-GAL4-driven expression of CAT cDNA (A), CAT cDNA with AD4 administration (B), CAT cDNA with ALA administration (C), Keap1 RNAi (D), Keap1 RNAi with AD4 administration (E), or Keap1 RNAi with ALA administration (F). esg-GFP (green) represents ISCs and their differentiating cells. Dl staining (red) was used to visualize ISCs. G. Quantification of the number of esg-GFP+ cells, Dl+ cells of Drosophila carrying esgts-GAL4-driven expression of lacZ cDNA, CAT cDNA, CAT cDNA with AD4 administration, CAT cDNA with ALA administration, Keap1 RNAi, Keap1 RNAi with AD4 administration, or Keap1 RNAi with ALA administration. n is indicated. The numbers of quantified guts from left to right are 18, 19, 20, 18, 18, 19, 19, 18, 19, 20, 18, 18, 19, and 19. H. Quantification of the number of pH3+ cells and luciferase activity of Drosophila carrying esgts-GAL4-driven expression of lacZ cDNA, CAT cDNA, CAT cDNA with AD4 administration, CAT cDNA with ALA administration, Keap1 RNAi, Keap1 RNAi with AD4 administration, or Keap1 RNAi with ALA administration. The numbers of quantified guts from left to right are 18, 19, 20, 18, 18, 19, and 19. I- Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μm Error bars represent SDs. Student's t-tests, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.I-L. Representative images of the midgut section from the R4 region of Drosophila carrying esgts-GAL4-driven expression of lacZ cDNA (I), Las RNAi (J), Las RNAi and CAT cDNA (K), or Las RNAi and Keap1 RNAi (L). esg-GFP (green) indicates ISCs and their differentiating cells. Dl staining (red) was used to visualize ISCs. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μm"}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Volcano", "plots", "of", "differentially", "expressed", "genes", "in", "pair", "-", "wise", "comparison", "of", "40", "-", "day", "Drosophila", "treated", "without", "ALA", "administration", "to", "40", "-", "day", "Drosophila", "treated", "with", "0", ".", "5", "mM", "ALA", "administration", ".", "Blue", "symbols", "indicate", "significantly", "downregulated", "mass", "bins", "(", "Log2", "FC", "<", "-", "0", ".", "6", "and", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "red", "symbols", "indicate", "significantly", "upregulated", "mass", "bins", "(", "Log2", "FC", ">", "0", ".", "6", "and", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "and", "gray", "symbols", "indicate", "mass", "bins", "that", "were", "not", "significantly", "changed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Volcano plots of differentially expressed genes in pair-wise comparison of 40-day Drosophila treated without ALA administration to 40-day Drosophila treated with 0.5 mM ALA administration. Blue symbols indicate significantly downregulated mass bins (Log2 FC < -0.6 and p < 0.05), red symbols indicate significantly upregulated mass bins (Log2 FC > 0.6 and p < 0.05), and gray symbols indicate mass bins that were not significantly changed."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "C", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "esg", "-", "GFP", "and", "Lysotracker", "staining", "with", "the", "midgut", "section", "from", "the", "R4", "region", "in", "14", "-", "day", "WT", "flies", "(", "A", ")", ",", "40", "-", "day", "WT", "flies", "(", "B", ")", ",", "40", "-", "day", "WT", "flies", "with", "ALA", "administration", "(", "C", ")", ".", "esg", "-", "GFP", "(", "green", ";", "outlined", "by", "dotted", "lines", ")", ",", "lysotracker", "(", "red", ")", ".", "esg", "-", "GFP", "+", "cells", "are", "outlined", "by", "red", "dotted", "lines", "in", "the", "images", "of", "lysotracker", "staining", "channel", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "number", "of", "Lysotracker", "in", "esg", "positive", "cells", "from", "experiments", "(", "A", "-", "C", ")", ".", "n", "is", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "guts", "from", "left", "to", "right", "are", "9", ",", "11", ",", "and", "8", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "size", "of", "Lysotracker", "in", "esg", "positive", "cells", "from", "experiments", "(", "A", "-", "C", ")", ".", "n", "is", "as", "indicated", ".", "F", "-", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "5", "μm", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "F", "-", "H", ".", "Expression", "of", "esg", "-", "GAL4", "-", "driven", "UAS", "-", "GFP", "-", "mCherry", "-", "Atg8a", "in", "14", "-", "day", "Drosophila", "(", "F", ")", ",", "40", "-", "day", "Drosophila", "(", "G", ")", ",", "40", "-", "day", "Drosophila", "with", "ALA", "administration", "started", "at", "the", "middle", "age", "(", "26", "days", ")", "(", "H", ")", ".", "GFP", "(", "green", ")", "and", "mCherry", "(", "red", ")", ".", "The", "red", "arrows", "indicate", "the", "autophagosomes", ".", "I", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "number", "of", "mCherry", "in", "esg", "positive", "cells", "from", "experiments", "(", "F", "-", "H", ")", ".", "n", "is", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "guts", "from", "left", "to", "right", "are", "11", ",", "10", ",", "and", "12", ".", "J", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "size", "of", "mCherry", "in", "esg", "positive", "cells", "from", "experiments", "(", "F", "-", "H", ")", ".", "n", "is", "as", "indicated", ".", "K", "-", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "2", "μm", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "K", "-", "L", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "esg", "-", "GFP", "and", "Lysotracker", "staining", "with", "the", "midgut", "section", "from", "the", "R4", "region", "in", "14", "-", "day", "flies", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "UAS", "-", "lacZ", "(", "K", ")", ",", "and", "14", "-", "day", "flies", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "Las", "RNAi", "(", "L", ")", ".", "esg", "-", "GFP", "(", "green", ";", "outlined", "by", "dotted", "lines", ")", ",", "lysotracker", "(", "red", ")", ".", "esg", "-", "GFP", "+", "cells", "are", "outlined", "by", "dotted", "lines", ".", "M", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "number", "of", "Lysotracker", "in", "esg", "positive", "cells", "from", "experiments", "(", "K", "-", "L", ")", ".", "n", "is", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "guts", "from", "left", "to", "right", "are", "10", ",", "and", "9", ".", "N", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "size", "of", "Lysotracker", "in", "esg", "positive", "cells", "from", "experiments", "(", "K", "-", "L", ")", ".", "n", "is", "as", "indicated", ".", "O", "-", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "5", "μm", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "O", "-", "P", ".", "Expression", "of", "esg", "-", "GAL4", "-", "driven", "UAS", "-", "GFP", "-", "mCherry", "-", "Atg8a", "in", "14", "-", "day", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "UAS", "-", "lacZ", "(", "flies", "were", "cultured", "at", "18", "°", "C", "and", "transferred", "to", "29", "°", "C", "after", "flies", "eclosion", ")", "(", "O", ")", ",", "and", "14", "-", "day", "Drosophila", "with", "Las", "depleted", "in", "ISCs", "and", "EBs", "(", "flies", "were", "cultured", "at", "18", "°", "C", "and", "transferred", "to", "29", "°", "C", "after", "flies", "eclosion", ")", "(", "P", ")", ".", "GFP", "(", "green", ")", "and", "mCherry", "(", "red", ")", ".", "The", "red", "arrows", "indicate", "the", "autophagosomes", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "2", "μm", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-C. Immunofluorescence images of esg-GFP and Lysotracker staining with the midgut section from the R4 region in 14-day WT flies (A), 40-day WT flies (B), 40-day WT flies with ALA administration (C). esg-GFP (green; outlined by dotted lines), lysotracker (red). esg-GFP+ cells are outlined by red dotted lines in the images of lysotracker staining channel. D. Quantification of the dot number of Lysotracker in esg positive cells from experiments (A-C). n is indicated. The numbers of quantified guts from left to right are 9, 11, and 8. E. Quantification of the dot size of Lysotracker in esg positive cells from experiments (A-C). n is as indicated. F- Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 5 μm Error bars represent SDs. Student's t-tests, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.F-H. Expression of esg-GAL4-driven UAS-GFP-mCherry-Atg8a in 14-day Drosophila (F), 40-day Drosophila (G), 40-day Drosophila with ALA administration started at the middle age (26 days) (H). GFP (green) and mCherry (red). The red arrows indicate the autophagosomes. I. Quantification of the dot number of mCherry in esg positive cells from experiments (F-H). n is indicated. The numbers of quantified guts from left to right are 11, 10, and 12. J. Quantification of the dot size of mCherry in esg positive cells from experiments (F-H). n is as indicated. K- Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 2 μm Error bars represent SDs. Student's t-tests, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.K-L. Immunofluorescence images of esg-GFP and Lysotracker staining with the midgut section from the R4 region in 14-day flies carrying esgts-GAL4-driven UAS-lacZ (K), and 14-day flies carrying esgts-GAL4-driven Las RNAi (L). esg-GFP (green; outlined by dotted lines), lysotracker (red). esg-GFP+ cells are outlined by dotted lines. M. Quantification of the dot number of Lysotracker in esg positive cells from experiments (K-L). n is indicated. The numbers of quantified guts from left to right are 10, and 9. N. Quantification of the dot size of Lysotracker in esg positive cells from experiments (K-L). n is as indicated. O- Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 5 μm Error bars represent SDs. Student's t-tests, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.O-P. Expression of esg-GAL4-driven UAS-GFP-mCherry-Atg8a in 14-day Drosophila carrying esgts-GAL4-driven UAS-lacZ (flies were cultured at 18 °C and transferred to 29 °C after flies eclosion) (O), and 14-day Drosophila with Las depleted in ISCs and EBs (flies were cultured at 18 °C and transferred to 29 °C after flies eclosion) (P). GFP (green) and mCherry (red). The red arrows indicate the autophagosomes. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 2 μm Error bars represent SDs. Student's t-tests, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "C", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "midgut", "section", "from", "the", "R4", "region", "in", "40", "-", "day", "flies", "(", "A", ")", ",", "40", "-", "day", "flies", "with", "spermidine", "administration", "started", "at", "26th", "day", "after", "fly", "eclosion", "(", "B", ")", ",", "40", "-", "day", "flies", "with", "spermidine", "and", "ALA", "administration", "started", "at", "26th", "day", "after", "fly", "eclosion", "(", "C", ")", ".", "esg", "-", "GFP", "(", "green", ")", "indicates", "ISCs", "and", "their", "differentiating", "cells", ".", "Dl", "(", "red", ")", "staining", "was", "used", "to", "visualize", "ISCs", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μmF", "-", "I", ".", "Representative", "images", "of", "the", "midgut", "section", "from", "the", "R4", "region", "of", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "expression", "of", "lacZ", "cDNA", "(", "F", ",", "control", ")", ",", "Las", "RNAi", "(", "G", ")", ",", "Las", "RNAi", "and", "Atg5", "cDNA", "(", "H", ")", ",", "or", "Las", "RNAi", "with", "spermidine", "administration", "(", "I", ")", ".", "GFP", "(", "green", ")", "and", "Dl", "staining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "ISCs", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μmN", ".", "Survival", "(", "percentage", ")", "of", "female", "Drosophila", "with", "indicated", "genotypes", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "Drosophila", ":", "100", "(", "UAS", "-", "lacZ", ")", ",", "100", "(", "Las", "RNAi", ")", ",", "100", "(", "Las", "RNAi", "+", "UAS", "-", "Atg5", ")", ",", "and", "100", "(", "Las", "RNAi", "+", "UAS", "-", "Atg8a", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "conducted", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "p", "-", "values", "for", "lifespan", "curves", "(", "N", ")", "were", "calculated", "by", "the", "log", "-", "rank", "test", ".", "The", "statistical", "tests", "used", "in", "other", "panels", "were", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-C. Immunofluorescence images of midgut section from the R4 region in 40-day flies (A), 40-day flies with spermidine administration started at 26th day after fly eclosion (B), 40-day flies with spermidine and ALA administration started at 26th day after fly eclosion (C). esg-GFP (green) indicates ISCs and their differentiating cells. Dl (red) staining was used to visualize ISCs. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μmF-I. Representative images of the midgut section from the R4 region of Drosophila carrying esgts-GAL4-driven expression of lacZ cDNA (F, control), Las RNAi (G), Las RNAi and Atg5 cDNA (H), or Las RNAi with spermidine administration (I). GFP (green) and Dl staining (red) was used to visualize ISCs. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μmN. Survival (percentage) of female Drosophila with indicated genotypes. The numbers of quantified Drosophila: 100 (UAS-lacZ), 100 (Las RNAi), 100 (Las RNAi + UAS-Atg5), and 100 (Las RNAi + UAS-Atg8a). Three independent experiments were conducted. Data information: Error bars represent SDs. p-values for lifespan curves (N) were calculated by the log-rank test. The statistical tests used in other panels were student's t-tests. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05."}
{"words": ["Figure", "8A", "-", "E", ".", "Expressions", "of", "Rab5", "-", "GFP", "reporter", "in", "ISCs", "of", "14", "-", "day", "WT", "Drosophila", "(", "A", ")", ",", "40", "-", "day", "WT", "Drosophila", "(", "B", ")", ",", "40", "-", "day", "Drosophila", "with", "ALA", "administration", "(", "C", ")", ",", "14", "-", "day", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", ">", "UAS", "-", "lacZ", "(", "D", ")", ",", "and", "14", "-", "day", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", ">", "Las", "RNAi", "(", "E", ")", ".", "GFP", "(", "green", ")", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "fluorescence", "intensity", "of", "RAB5", "-", "GFP", "in", "experiments", "(", "A", "-", "E", ")", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "cell", ".", "n", "is", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "guts", "from", "left", "to", "right", "are", "13", ",", "11", ",", "12", ",", "10", "and", "13", ".", "G", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "2", "μm", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "G", "-", "K", ".", "Expressions", "of", "Rab7", "-", "GFP", "reporter", "in", "ISCs", "of", "14", "-", "day", "WT", "Drosophila", "(", "G", ")", ",", "40", "-", "day", "WT", "Drosophila", "(", "H", ")", ",", "40", "-", "day", "Drosophila", "with", "ALA", "administration", "(", "I", ")", ",", "14", "-", "day", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", ">", "UAS", "-", "lacZ", "(", "J", ")", ",", "and", "14", "-", "day", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", ">", "Las", "RNAi", "(", "K", ")", ".", "GFP", "(", "green", ")", ".", "L", ".", "Quantification", "of", "fluorescence", "intensity", "of", "RAB7", "-", "GFP", "in", "experiments", "(", "G", "-", "K", ")", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "cell", ".", "n", "is", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "guts", "from", "left", "to", "right", "are", "11", ",", "10", ",", "11", ",", "13", "and", "12", ".", "M", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "2", "μm", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "M", "-", "Q", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "midgut", "section", "from", "the", "R4", "region", "of", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "expression", "of", "lacZ", "cDNA", "(", "M", ",", "control", ")", ",", "constitutively", "active", "form", "of", "RAB5", "(", "N", ")", ",", "constitutively", "active", "form", "of", "RAB5", "with", "ALA", "administration", "(", "O", ")", ",", "constitutively", "active", "form", "of", "RAB7", "(", "P", ")", ",", "or", "constitutively", "active", "form", "of", "RAB7", "with", "ALA", "administration", "(", "Q", ")", ".", "GFP", "(", "green", ")", "and", "Dl", "staining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "ISCs", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A-E. Expressions of Rab5-GFP reporter in ISCs of 14-day WT Drosophila (A), 40-day WT Drosophila (B), 40-day Drosophila with ALA administration (C), 14-day Drosophila carrying esgts-GAL4>UAS-lacZ (D), and 14-day Drosophila carrying esgts-GAL4>Las RNAi (E). GFP (green). F. Quantification of fluorescence intensity of RAB5-GFP in experiments (A-E). Each dot corresponds to one cell. n is indicated. The numbers of quantified guts from left to right are 13, 11, 12, 10 and 13. G Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 2 μm Error bars represent SDs. Student's t-tests, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.G-K. Expressions of Rab7-GFP reporter in ISCs of 14-day WT Drosophila (G), 40-day WT Drosophila (H), 40-day Drosophila with ALA administration (I), 14-day Drosophila carrying esgts-GAL4>UAS-lacZ (J), and 14-day Drosophila carrying esgts-GAL4>Las RNAi (K). GFP (green). L. Quantification of fluorescence intensity of RAB7-GFP in experiments (G-K). Each dot corresponds to one cell. n is indicated. The numbers of quantified guts from left to right are 11, 10, 11, 13 and 12. M Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 2 μm Error bars represent SDs. Student's t-tests, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.M-Q. Immunofluorescence images of midgut section from the R4 region of Drosophila carrying esgts-GAL4-driven expression of lacZ cDNA (M, control), constitutively active form of RAB5 (N), constitutively active form of RAB5 with ALA administration (O), constitutively active form of RAB7 (P), or constitutively active form of RAB7 with ALA administration (Q). GFP (green) and Dl staining (red) was used to visualize ISCs. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μm"}
{"words": ["Figure", "9A", "-", "D", ".", "Representative", "images", "of", "midgut", "sections", "from", "the", "R4", "region", "of", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "expression", "of", "lacZ", "cDNA", "(", "A", ",", "control", ")", ",", "Las", "RNAi", "(", "B", ")", ",", "Las", "RNAi", "and", "RAB5", "-", "CA", "(", "C", ")", ",", "or", "Las", "RNAi", "and", "RAB7", "-", "CA", "(", "D", ")", ".", "GFP", "(", "green", ")", ",", "Dl", "staining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "ISCs", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A-D. Representative images of midgut sections from the R4 region of Drosophila carrying esgts-GAL4-driven expression of lacZ cDNA (A, control), Las RNAi (B), Las RNAi and RAB5-CA (C), or Las RNAi and RAB7-CA (D). GFP (green), Dl staining (red) was used to visualize ISCs. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μm"}
{"words": ["Figure", "10C", ".", "Survival", "(", "percentage", ")", "of", "female", "Drosophila", "of", "indicated", "genotypes", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "Drosophila", ":", "100", "(", "UAS", "-", "lacZ", ")", ",", "100", "(", "Las", "RNAi", ")", ",", "100", "(", "Las", "RNAi", "+", "UAS", "-", "Rab5", "-", "CA", ")", "and", "100", "(", "Las", "RNAi", "+", "UAS", "-", "Rab7", "-", "CA", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "conducted", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "p", "-", "values", "for", "lifespan", "curves", "(", "C", ")", "were", "calculated", "by", "the", "log", "-", "rank", "test", ".", "The", "statistical", "tests", "used", "in", "other", "panels", "were", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "F", "-", "I", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "dpERK", "staining", "of", "midgut", "sections", "of", "the", "R4", "region", "of", "40", "-", "day", "Drosophila", "(", "F", ")", ",", "40", "-", "day", "Drosophila", "with", "ALA", "administration", "(", "G", ")", ",", "14", "-", "day", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "UAS", "-", "lacZ", "(", "H", ")", ",", "and", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "Las", "RNAi", "(", "I", ")", ".", "dpERK", "(", "red", ")", ".", "J", ".", "Quantification", "of", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "dpERK", "in", "experiments", "(", "F", "-", "I", ")", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "cell", ".", "n", "is", "indicated", ".", "The", "numbers", "of", "quantified", "guts", "from", "left", "to", "right", "are", "11", ",", "12", ",", "12", ",", "and", "13", ".", "K", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", "Error", "bars", "represent", "SDs", ".", "The", "statistical", "tests", "used", "in", "other", "panels", "were", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "non", "-", "significant", "(", "NS", ")", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "K", "-", "M", ".", "Representative", "images", "of", "midgut", "sections", "from", "the", "R4", "region", "of", "Drosophila", "carrying", "esgts", "-", "GAL4", "-", "driven", "expression", "of", "lacZ", "cDNA", "(", "K", ",", "control", ")", ",", "Las", "RNAi", "(", "L", ")", ",", "or", "Las", "RNAi", "and", "dominant", "negative", "form", "of", "EGFR", "(", "EGFR", "-", "DN", ",", "M", ")", ".", "GFP", "(", "green", ")", "and", "Dl", "staining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "ISCs", ".", "Data", "information", ":", "DAPI", "stained", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", "represent", "10"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 10C. Survival (percentage) of female Drosophila of indicated genotypes. The numbers of quantified Drosophila: 100 (UAS-lacZ), 100 (Las RNAi), 100 (Las RNAi + UAS-Rab5-CA) and 100 (Las RNAi + UAS-Rab7-CA). Three independent experiments were conducted Data information: Error bars represent SDs. p-values for lifespan curves (C) were calculated by the log-rank test. The statistical tests used in other panels were student's t-tests. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.F-I. Immunofluorescence images of dpERK staining of midgut sections of the R4 region of 40-day Drosophila (F), 40-day Drosophila with ALA administration (G), 14-day Drosophila carrying esgts-GAL4-driven UAS-lacZ (H), and Drosophila carrying esgts-GAL4-driven Las RNAi (I). dpERK (red). J. Quantification of the fluorescence intensity of dpERK in experiments (F-I). Each dot corresponds to one cell. n is indicated. The numbers of quantified guts from left to right are 11, 12, 12, and 13. K Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μm Error bars represent SDs. The statistical tests used in other panels were student's t-tests. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, and non-significant (NS) represents p > 0.05.K-M. Representative images of midgut sections from the R4 region of Drosophila carrying esgts-GAL4-driven expression of lacZ cDNA (K, control), Las RNAi (L), or Las RNAi and dominant negative form of EGFR (EGFR-DN, M). GFP (green) and Dl staining (red) was used to visualize ISCs. Data information: DAPI stained nuclei are shown in blue. Scale bars represent 10 μm"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "ATG", "-", "5", "staining", "in", "non", "-", "cancerous", "gastric", "tissues", "scored", "285", "(", "×", "200", ")", ";", "(", "B", ")", "ATG", "-", "5", "staining", "in", "GC", "tumor", "tissues", "scored", "50", "(", "×", "400", ")", ";", "(", "C", ")", "ATG", "-", "5", "staining", "in", "GC", "tumor", "tissues", "scored", "270", "(", "×", "400", ")", ";", "(", "D", ")", "ATG", "-", "5", "staining", "in", "GC", "tumor", "tissues", "scored", "400", "(", "×", "200", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1  (A) ATG-5 staining in non-cancerous gastric tissues scored 285(×200); (B) ATG-5 staining in GC tumor tissues scored 50(×400); (C) ATG-5 staining in GC tumor tissues scored 270(×400); (D) ATG-5 staining in GC tumor tissues scored 400(×200). "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "and", "B", ")", "Patients", "were", "divided", "into", "four", "following", "subgroups", "based", "on", "ATG", "-", "5", "immunostaining", ":", "scored", "0", "-", "99", "(", "curve", "a", ")", ",", "scored", "100", "-", "199", "(", "curve", "b", ")", ",", "scored", "200", "-", "299", "(", "curve", "c", ")", "and", "scored", "300", "-", "400", "(", "curve", "d", ")", ".", "The", "difference", "among", "different", "subgroups", "was", "statistically", "significant", "as", "evaluated", "by", "overall", "Log", "-", "rank", "comparisons", "(", "OS", ":", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "DFS", ":", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "003", ")", ".", "Pairwise", "Log", "-", "rank", "comparisons", "showed", "that", "the", "subgroup", "D", "exhibited", "the", "poorest", "survival", "rates", "as", "compared", "to", "other", "subgroups", "(", "OS", ":", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "DFS", ":", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Patients", "were", "divided", "into", "four", "following", "subgroups", "based", "on", "MRP", "-", "1", "immunostaining", ":", "scored", "0", "-", "99", "(", "curve", "a", ")", ",", "scored", "100", "-", "199", "(", "curve", "b", ")", ",", "scored", "200", "-", "299", "(", "curve", "c", ")", "and", "scored", "300", "-", "400", "(", "curve", "d", ")", ".", "The", "difference", "among", "various", "subgroups", "was", "statistically", "significant", "by", "overall", "Log", "-", "rank", "comparisons", "(", "OS", ":", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "001", ",", "DFS", ":", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "018", ")", ".", "Pairwise", "Log", "-", "rank", "comparisons", "showed", "that", "the", "subgroup", "A", "had", "the", "most", "favorable", "prognosis", "among", "the", "four", "subgroups", "(", "OS", ":", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "DFS", ":", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Patients", "were", "divided", "into", "four", "subgroups", "according", "to", "different", "TNM", "stages", ".", "The", "difference", "among", "different", "subgroups", "was", "statistically", "significant", "by", "overall", "Log", "-", "rank", "comparisons", "(", "OS", ":", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "DFS", ":", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Pairwise", "Log", "-", "rank", "comparisons", "showed", "that", "subgroups", "III", "or", "IV", "exhibited", "poorer", "survival", "rates", "than", "that", "of", "subgroups", "IB", "and", "II", "(", "OS", ":", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "DFS", ":", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A and B) Patients were divided into four following subgroups based on ATG-5 immunostaining: scored 0-99 (curve a), scored 100-199 (curve b), scored 200-299 (curve c) and scored 300-400 (curve d). The difference among different subgroups was statistically significant as evaluated by overall Log-rank comparisons (OS: P<0.001, DFS: P = 0.003). Pairwise Log-rank comparisons showed that the subgroup D exhibited the poorest survival rates as compared to other subgroups (OS: P<0.05, DFS: P<0.01).(C and D) Patients were divided into four following subgroups based on MRP-1 immunostaining: scored 0-99 (curve a), scored 100-199 (curve b), scored 200-299 (curve c) and scored 300-400 (curve d). The difference among various subgroups was statistically significant by overall Log-rank comparisons (OS: P = 0.001, DFS: P = 0.018). Pairwise Log-rank comparisons showed that the subgroup A had the most favorable prognosis among the four subgroups (OS: P<0.05, DFS: P<0.001).(E and F) Patients were divided into four subgroups according to different TNM stages. The difference among different subgroups was statistically significant by overall Log-rank comparisons (OS: P<0.001, DFS: P<0.001). Pairwise Log-rank comparisons showed that subgroups III or IV exhibited poorer survival rates than that of subgroups IB and II (OS: P<0.01, DFS: P<0.001)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "The", "level", "of", "ATG5", "was", "detected", "in", "cell", "lines", "using", "western", "blot", "analysis", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "internal", "controls", ".", "(", "B", ")", "The", "IC", "25", ",", "IC50", "and", "IC75", "of", "SGC", "-", "7901", "and", "SGC", "-", "7901", "/", "DDP", "cells", "were", "tested", "using", "the", "MTT", "assays", "after", "DPP", "treatment", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) The level of ATG5 was detected in cell lines using western blot analysis. β -actin was used as internal controls.(B) The IC 25, IC50 and IC75 of SGC-7901 and SGC-7901/DDP cells were tested using the MTT assays after DPP treatment."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "mRNA", "level", "of", "ATG", "-", "5", "was", "detected", "by", "real", "time", "PCR", "after", "treatment", "with", "siRNAs", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "internal", "controls", ".", "(", "B", ")", "The", "protein", "level", "of", "ATG", "-", "5", "was", "detected", "by", "western", "blot", "after", "treatment", "with", "siRNAs", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "internal", "controls", ".", "(", "C", ")", "The", "proliferation", "ability", "was", "tested", "using", "MTT", "assay", "48", "hours", "or", "72", "hours", "after", "different", "treatment", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The mRNA level of ATG-5 was detected by real time PCR after treatment with siRNAs. GAPDH was used as internal controls.(B) The protein level of ATG-5 was detected by western blot after treatment with siRNAs. β -actin was used as internal controls.(C) The proliferation ability was tested using MTT assay 48 hours or 72 hours after different treatment."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "The", "autophagy", "was", "detected", "by", "immunofluorescence", "assay", "of", "LC3B", "in", "the", "cells", "48", "hours", "after", "different", "treatment", ".", "(", "B", ")", "The", "protein", "levels", "of", "LC3A", "and", "LC3B", "were", "tested", "by", "western", "blot", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "internal", "controls", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) The autophagy was detected by immunofluorescence assay of LC3B in the cells 48 hours after different treatment.(B) The protein levels of LC3A and LC3B were tested by western blot. β-actin was used as internal controls."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "c", ")", "Intravascular", "endothelial", "cell", "interactions", "and", "transmigration", "of", "neutrophils", "(", "Ly", "-", "6G", "+", "CX3CR", "-", "1", "-", ";", "red", ")", "and", "cMOs", "(", "Ly", "-", "6G", "-", "CX3CR", "-", "1low", ";", "green", ")", "to", "the", "perivascular", "tissue", "as", "assessed", "6", "h", "after", "intrascrotal", "stimulation", "with", "recombinant", "murine", "uPA", ",", "PAI", "-", "1", ",", "or", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", "in", "postcapillary", "venules", "of", "the", "cremaster", "of", "CX3CR", "-", "1GFP", "/", "+", "mice", "by", "multi", "-", "channel", "in", "vivo", "microscopy", ".", "Representative", "still", "images", "(", "scale", "bar", ":", "50", ":", "µm", ")", "and", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "saline", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "uPA", ";", "§", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "PAI", "-", "1", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(c) Intravascular endothelial cell interactions and transmigration of neutrophils (Ly-6G+ CX3CR-1-; red) and cMOs (Ly-6G- CX3CR-1low; green) to the perivascular tissue as assessed 6 h after intrascrotal stimulation with recombinant murine uPA, PAI-1, or uPA-PAI-1 in postcapillary venules of the cremaster of CX3CR-1GFP/+ mice by multi-channel in vivo microscopy. Representative still images (scale bar: 50: µm) and quantitative data are shown (mean±SEM for n=4 mice per group; #p<0.05 vs. saline; *p<0.05 vs. uPA; §p<0.05 vs. PAI-1; One-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "b", ")", "Expression", "of", "PECAM", "-", "1", "/", "CD31", "(", "red", ")", "and", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", "or", "VCAM", "-", "1", "/", "CD106", "(", "green", ")", "in", "the", "cremaster", "muscle", "of", "WT", "mice", "as", "assessed", "ex", "vivo", "by", "confocal", "laser", "scanning", "microscopy", "6", "h", "after", "intrascrotal", "injection", "of", "recombinant", "murine", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", "or", "saline", ",", "representative", "images", "(", "scale", "bar", ":", "50", "µm", ")", "and", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "saline", ";", "t", "test", ")", ".", "(", "g", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "LFA", "-", "1", "/", "CD11a", "clustering", "on", "the", "surface", "of", "mouse", "neutrophils", "under", "increasing", "flow", "conditions", "in", "vitro", "in", "the", "presence", "of", "either", "E", "-", "selectin", "/", "CD62E", "+", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", ",", "E", "-", "selectin", "/", "CD62E", "+", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", "+", "KC", ",", "or", "E", "-", "selectin", "/", "CD62E", "+", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", "+", "KC", "+", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", "as", "assessed", "by", "spinning", "disk", "confocal", "microscopy", ",", "representative", "images", "and", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "scale", "bar", ":", "10", "μm", ";", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", "mice", ";", "n", "=", "10", "-", "13", "flow", "chambers", ",", "n", "=", "122", "-", "222", "cells", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "E", "-", "selectin", "/", "CD62E", "+", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(b) Expression of PECAM-1/CD31 (red) and ICAM-1/CD54 or VCAM-1/CD106 (green) in the cremaster muscle of WT mice as assessed ex vivo by confocal laser scanning microscopy 6 h after intrascrotal injection of recombinant murine uPA-PAI-1 or saline, representative images (scale bar: 50 µm) and quantitative data are shown (mean±SEM for n=4 mice per group; #p<0.05 vs. saline; t test).(g) Quantitative analysis of LFA-1/CD11a clustering on the surface of mouse neutrophils under increasing flow conditions in vitro in the presence of either E-selectin/CD62E + ICAM-1/CD54, E-selectin/CD62E + ICAM-1/CD54 + KC, or E-selectin/CD62E + ICAM-1/CD54 + KC + uPA-PAI-1 as assessed by spinning disk confocal microscopy, representative images and quantitative data are shown (scale bar: 10 μm; mean±SD; n=3 mice; n=10-13 flow chambers, n =122-222 cells); *p<0.05 vs. E-selectin/CD62E + ICAM-1/CD54; One-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "b", ")", "Correlation", "analyses", "of", "RNA", "expression", "levels", "of", "uPA", "(", "PLAU", "gene", ")", ",", "PAI", "-", "1", "(", "SERPINE1", "gene", ")", ",", "and", "the", "neutrophil", "marker", "gene", "FPR1", ",", "and", "overall", "survival", "of", "breast", "cancer", "patients", "(", "stages", "0", "and", "1", ")", "with", "high", "and", "low", "PLAU", "or", "SERPINE1", "gene", "expression", "levels", "(", "cut", "-", "off", "z", "≥", "2", ".", "0", ")", "in", "the", "METABRIC", "breast", "cancer", "cohort", ".", "(", "c", ")", "Surface", "expression", "of", "MMP", "-", "9", ",", "VEGF", ",", "and", "NE", "as", "assessed", "on", "circulating", "neutrophils", "isolated", "from", "the", "peripheral", "blood", "of", "WT", "mice", "(", "saline", ")", "or", "from", "the", "peritoneal", "cavity", "of", "WT", "mice", "6", "h", "after", "intraperitoneal", "stimulation", "with", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", "(", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", ")", "by", "multi", "-", "channel", "flow", "cytometry", ",", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "6", "mice", "per", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "saline", ";", "t", "test", ")", ".", "(", "f", ")", "Formation", "of", "NETs", "(", "histone", "H3", "+", ";", "green", ")", "as", "assessed", "ex", "vivo", "by", "confocal", "microscopy", "in", "the", "cremaster", "muscle", "of", "WT", "mice", "6", "h", "after", "intra", "-", "scrotal", "injection", "of", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", ",", "TNF", ",", "or", "saline", ",", "PECAM", "-", "1", "/", "CD31", "+", "postcapillary", "venules", "(", "blue", ")", "and", "Ly", "-", "6G", "+", "neutrophils", "(", "red", ")", "are", "depicted", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "scale", "bar", ":", "50", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(b) Correlation analyses of RNA expression levels of uPA (PLAU gene), PAI-1 (SERPINE1 gene), and the neutrophil marker gene FPR1, and overall survival of breast cancer patients (stages 0 and 1) with high and low PLAU or SERPINE1 gene expression levels (cut-off z≥ 2.0) in the METABRIC breast cancer cohort.(c) Surface expression of MMP-9, VEGF, and NE as assessed on circulating neutrophils isolated from the peripheral blood of WT mice (saline) or from the peritoneal cavity of WT mice 6 h after intraperitoneal stimulation with uPA-PAI-1 (uPA-PAI-1) by multi-channel flow cytometry, quantitative data are shown (mean±SEM for n=4-6 mice per group; #p<0.05 vs. saline; t test).(f) Formation of NETs (histone H3+; green) as assessed ex vivo by confocal microscopy in the cremaster muscle of WT mice 6 h after intra-scrotal injection of uPA-PAI-1, TNF, or saline, PECAM-1/CD31+ postcapillary venules (blue) and Ly-6G+ neutrophils (red) are depicted. Representative images are shown (scale bar: 50 µm)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", ")", "Effect", "of", "compound", "WX", "-", "340", "on", "binding", "of", "recombinant", "murine", "uPA", "to", "PAI", "-", "1", "protein", "as", "assessed", "by", "ELISA", ",", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "3", "experiments", "per", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "drug", "vehicle", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "d", ")", "Relative", "development", "rates", "and", "tumor", "weight", "in", "animals", "treated", "with", "WX", "-", "340", "a", "priori", "or", "therapeutically", "after", "1", "week", "after", "tumor", "cell", "injection", "on", "a", "daily", "basis", "as", "assessed", "in", "an", "orthotopic", "model", "of", "4T1", "breast", "cancer", "in", "WT", "mice", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "6", "mice", "per", "group", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "drug", "vehicle", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "f", ")", "Numbers", "of", "neutrophils", "and", "4T1", "tumor", "cells", "in", "lungs", "and", "brain", "of", "WT", "mice", "receiving", "WX", "-", "340", "or", "vehicle", "therapeutically", "after", "1", "week", "after", "tumor", "cell", "injection", "on", "a", "daily", "basis", "as", "assessed", "14", "days", "after", "intravenous", "injection", "of", "4T1", "tumor", "cells", "by", "multi", "-", "channel", "flow", "cytometry", ",", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "6", "mice", "per", "group", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "drug", "vehicle", ";", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a) Effect of compound WX-340 on binding of recombinant murine uPA to PAI-1 protein as assessed by ELISA, quantitative data are shown (mean±SEM for n=3 experiments per group; #p<0.05 vs. drug vehicle; One-way ANOVA).(d) Relative development rates and tumor weight in animals treated with WX-340 a priori or therapeutically after 1 week after tumor cell injection on a daily basis as assessed in an orthotopic model of 4T1 breast cancer in WT mice (mean±SEM for n=4-6 mice per group; *p<0.05 vs. drug vehicle; One-way ANOVA).(f) Numbers of neutrophils and 4T1 tumor cells in lungs and brain of WT mice receiving WX-340 or vehicle therapeutically after 1 week after tumor cell injection on a daily basis as assessed 14 days after intravenous injection of 4T1 tumor cells by multi-channel flow cytometry, quantitative data are shown (mean±SEM for n=4-6 mice per group; *p<0.05 vs. drug vehicle; t test)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Representative", "EPSP", "and", "mEPSP", "electrophysiological", "traces", "from", "larval", "NMJs", "at", "Muscle", "6", "in", "which", "a", "motoneuron", "specific", "driver", "was", "used", "to", "overexpress", "either", "a", "control", "transgene", "(", "DVGlut", "-", "GAL4", ">", "UAS", "-", "RFP", ")", ",", "dNmnat", "(", "DVGlut", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "dNmnat", ")", ",", "or", "Wnd", "(", "DVGlut", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "Wnd", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "EPSP", "amplitudes", ",", "in", "which", "75", "consecutive", "evoked", "events", "were", "averaged", "per", "cell", ",", "and", "then", "cell", "amplitudes", "were", "averaged", "per", "genotype", ".", "[", "UAS", "-", "RFP", "n", "=", "13", "cells", ",", "UAS", "-", "dNmnat", "n", "=", "14", "cells", ",", "UAS", "-", "Wnd", "n", "=", "10", "cells", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "36", ",", "F", "=", "12", ".", "66", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "dNmnat", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "Wnd", "p", "=", "0", ".", "0093", "(", "*", "*", ")", "]", ".", "]", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "mEPSP", "amplitudes", ",", "in", "which", "75", "consecutive", "spontaneous", "events", "were", "averaged", "per", "cell", ",", "and", "then", "cell", "amplitudes", "were", "averaged", "per", "genotype", ".", "[", "UAS", "-", "RFP", "n", "=", "15", "cells", ",", "UAS", "-", "dNmnat", "n", "=", "14", "cells", ",", "UAS", "-", "Wnd", "n", "=", "10", "cells", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "38", ",", "F", "=", "11", ".", "66", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", ".", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "dNmnat", "p", "=", "0", ".", "994", "(", "NS", ")", ",", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "Wnd", "p", "=", "0", ".", "0003", "(", "*", "*", "*", ")", "]", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "quantal", "content", ",", "which", "was", "calculated", "individually", "per", "cell", "by", "dividing", "the", "mean", "EPSP", "amplitude", "by", "the", "mean", "mEPSP", "amplitude", ",", "and", "then", "averaged", "per", "genotype", ".", "[", "UAS", "-", "RFP", "n", "=", "15", "cells", ",", "UAS", "-", "dNmnat", "n", "=", "14", "cells", ",", "UAS", "-", "Wnd", "n", "=", "10", "cells", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "38", ",", "F", "=", "9", ".", "286", ",", "p", "=", "0", ".", "0006", ".", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "dNmnat", "p", "=", "0", ".", "0015", "(", "*", "*", ")", ",", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "Wnd", "p", "=", "0", ".", "0003", "(", "*", "*", "*", ")", "]", ".", "]", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "the", "NMJ", "synaptic", "terminal", "at", "muscle", "4", "in", "third", "-", "instar", "larvae", ".", "The", "genotypes", "in", "this", "experiment", "were", "identical", "to", "those", "tested", "in", "the", "electrophysiology", "experiments", "in", "A", "-", "D", ".", "NMJs", "were", "stained", "for", "the", "presynaptic", "bouton", "marker", "DVGLUT", "(", "green", ")", "and", "nerve", "membrane", "marker", "HRP", "(", "red", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "number", "of", "DVGlut", "+", "boutons", "per", "muscle", "4", "NMJ", "in", "each", "genotype", ".", "[", "UAS", "-", "RFP", "n", "=", "23", ",", "UAS", "-", "dNmnat", "n", "=", "21", ",", "UAS", "-", "Wnd", "n", "=", "20", "NMJs", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "63", ",", "F", "=", "68", ".", "31", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "dNmnat", "p", "=", "0", ".", "9818", "(", "NS", ")", ",", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "Wnd", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "]", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Representative EPSP and mEPSP electrophysiological traces from larval NMJs at Muscle 6 in which a motoneuron specific driver was used to overexpress either a control transgene (DVGlut-GAL4 > UAS-RFP), dNmnat (DVGlut-Gal4 > UAS-dNmnat), or Wnd (DVGlut-Gal4 > UAS-Wnd).(B) Quantification of mean (±SEM) EPSP amplitudes, in which 75 consecutive evoked events were averaged per cell, and then cell amplitudes were averaged per genotype. [UAS-RFP n = 13 cells, UAS-dNmnat n = 14 cells, UAS-Wnd n= 10 cells. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=36, F=12.66, p<0.0001. UAS-RFP vs UAS-dNmnat p < 0.0001 (****), UAS-RFP vs UAS-Wnd p = 0.0093 (**)].]. (C) Quantification of mean (±SEM) mEPSP amplitudes, in which 75 consecutive spontaneous events were averaged per cell, and then cell amplitudes were averaged per genotype. [UAS-RFP n = 15 cells, UAS-dNmnat n = 14 cells, UAS-Wnd n= 10 cells. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=38, F=11.66, p = 0.0001. UAS-RFP vs UAS-dNmnat p=0.994 (NS), UAS-RFP vs UAS-Wnd p = 0.0003 (***)].(D) Quantification of quantal content, which was calculated individually per cell by dividing the mean EPSP amplitude by the mean mEPSP amplitude, and then averaged per genotype. [UAS-RFP n = 15 cells, UAS-dNmnat n = 14 cells, UAS-Wnd n= 10 cells. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=38, F=9.286, p = 0.0006. UAS-RFP vs UAS-dNmnat p=0.0015 (**), UAS-RFP vs UAS-Wnd p = 0.0003 (***)].]. (E) Representative images of the NMJ synaptic terminal at muscle 4 in third-instar larvae. The genotypes in this experiment were identical to those tested in the electrophysiology experiments in A-D. NMJs were stained for the presynaptic bouton marker DVGLUT (green) and nerve membrane marker HRP (red).(F) Quantification of the mean (±SEM) number of DVGlut+ boutons per muscle 4 NMJ in each genotype. [UAS-RFP n = 23, UAS-dNmnat n = 21, UAS-Wnd n= 20 NMJs. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=63, F=68.31, p < 0.0001. UAS-RFP vs UAS-dNmnat p=0.9818 (NS), UAS-RFP vs UAS-Wnd p < 0.0001(****)]."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "EPSP", "and", "mEPSP", "physiological", "traces", "from", "larval", "NMJs", "at", "Muscle", "6", ".", "Recordings", "were", "taken", "from", "WT", "control", "larvae", "(", "Elav", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "RFP", ")", ",", "hiw", "mutants", "driving", "a", "control", "transgene", "(", "hiwND8", ";", "Elav", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "RFP", ")", ",", "and", "hiw", "mutants", "expressing", "RNAis", "to", "knockdown", "either", "dNmnat", "(", "hiwND8", ";", "Elav", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "dNmnat", "-", "RNAi", "[", "#", "29402", "]", ")", "or", "Wnd", "(", "hiwND8", ";", "Elav", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "Wnd", "-", "RNAi", "[", "#", "25396", "]", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "EPSP", "amplitudes", ",", "in", "which", "75", "consecutive", "evoked", "events", "were", "averaged", "per", "cell", ",", "and", "then", "cell", "amplitudes", "were", "averaged", "per", "genotype", ".", "[", "WT", "n", "=", "10", "cells", ",", "hiw", "n", "=", "10", "cells", ",", "hiw", ">", "Wnd", "-", "RNAi", "n", "=", "10", "cells", ",", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "n", "=", "10", "cells", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "39", ",", "F", "=", "14", ".", "02", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "=", "0", ".", "0012", "(", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "Wnd", "-", "RNAi", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "9880", "(", "NS", ")", "]", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "quantal", "content", "(", "±", "SEM", ")", ".", "[", "WT", "n", "=", "9", "cells", ",", "hiw", "n", "=", "9", "cells", ",", "hiw", ">", "Wnd", "-", "RNAi", "n", "=", "10", "cells", ",", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "n", "=", "10", "cells", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "38", ",", "F", "=", "2", ".", "508", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "=", "0", ".", "0361", "(", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "Wnd", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "9889", "(", "NS", ")", "]", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "the", "NMJ", "synaptic", "terminal", "at", "muscle", "4", "in", "third", "-", "instar", "larvae", ".", "The", "genotypes", "in", "this", "experiment", "were", "identical", "to", "those", "tested", "in", "panels", "A", "-", "C", ".", "NMJs", "were", "stained", "for", "the", "presynaptic", "bouton", "marker", "DVGLUT", "(", "green", ")", "and", "nerve", "membrane", "marker", "HRP", "(", "red", ")", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "number", "of", "DVGlut", "+", "boutons", "per", "muscle", "4", "NMJ", "in", "each", "genotype", ".", "[", "WT", "n", "=", "23", ",", "hiw", "n", "=", "21", ",", "hiw", ">", "Wnd", "-", "RNAi", "n", "=", "16", ",", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "n", "=", "19", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "78", ",", "F", "=", "169", ".", "1", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "Wnd", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "9988", "(", "NS", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "hiw", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "9695", "(", "NS", ")", "]", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative EPSP and mEPSP physiological traces from larval NMJs at Muscle 6. Recordings were taken from WT control larvae (Elav-Gal4>UAS-RFP), hiw mutants driving a control transgene (hiwND8;Elav-Gal4 > UAS-RFP), and hiw mutants expressing RNAis to knockdown either dNmnat (hiwND8;Elav-Gal4 > UAS-dNmnat-RNAi [#29402] ) or Wnd (hiwND8;Elav-Gal4 > UAS-Wnd-RNAi [#25396]).(B) Quantification of mean (±SEM) EPSP amplitudes, in which 75 consecutive evoked events were averaged per cell, and then cell amplitudes were averaged per genotype. [WT n = 10 cells, hiw n = 10 cells, hiw > Wnd-RNAi n= 10 cells, hiw > dNmnat-RNAi n = 10 cells. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=39, F=14.02, p<0.0001. WT vs hiw p = 0.0012 (**), WT vs hiw > Wnd-RNAi p < 0.0001 (****), WT vs hiw > dNmnat-RNAi p = 0.9880 (NS)].(C) Quantification of quantal content (±SEM). [WT n = 9 cells, hiw n = 9 cells, hiw > Wnd-RNAi n= 10 cells, hiw > dNmnat-RNAi n = 10 cells. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=38, F= 2.508, p<0.0001. WT vs hiw p = 0.0361 (*), WT vs hiw > Wnd-RNAi p = 0.0001 (***), WT vs hiw > dNmnat-RNAi p = 0.9889 (NS)].(D) Representative images of the NMJ synaptic terminal at muscle 4 in third-instar larvae. The genotypes in this experiment were identical to those tested in panels A-C. NMJs were stained for the presynaptic bouton marker DVGLUT (green) and nerve membrane marker HRP (red).(E) Quantification of the mean (±SEM) number of DVGlut+ boutons per muscle 4 NMJ in each genotype. [WT n = 23, hiw n = 21 , hiw > Wnd-RNAi n= 16, hiw > dNmnat-RNAi n=19. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=78, F=169.1, p < 0.0001. WT vs hiw p < 0.0001 (****), WT vs hiw > Wnd-RNAi p = 0.9988 (NS), WT vs hiw > dNmnat-RNAi p < 0.0001 (****), hiw vs hiw > dNmnat-RNAi p = 0.9695 (NS)]."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "immunostained", "larval", "NMJs", "and", "active", "zones", "from", "WT", ",", "hiw", "mutant", ",", "and", "hiw", "mutant", "driving", "an", "RNAi", "against", "dNmnat", "[", "#", "29402", "]", ".", "In", "the", "top", "3", "panels", ",", "greyscale", "images", "of", "entire", "terminal", "were", "acquired", "by", "staining", "for", "nerve", "marker", "HRP", ".", "Presynaptic", "Brp", "puncta", "(", "green", ")", "and", "postsynaptic", "dGluRIII", "clusters", "(", "magenta", ")", "were", "imaged", "to", "quantify", "N", "in", "each", "genotype", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "NMJ", "synaptic", "terminal", "surface", "area", "in", "each", "genotype", ".", "[", "WT", "n", "=", "14", ",", "hiw", "n", "=", "12", ",", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "n", "=", "12", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "37", ",", "F", "=", "22", ".", "427", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "hiw", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "2907", "(", "NS", ")", "]", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "BRP", "puncta", "per", "NMJ", "[", "WT", "n", "=", "14", ",", "hiw", "n", "=", "12", ",", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "n", "=", "12", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "37", ",", "F", "=", "2", ".", "854", ",", "p", "=", "0", ".", "0711", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "=", "0", ".", "0573", "(", "NS", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "4529", "(", "NS", ")", ",", "hiw", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "5030", "(", "NS", ")", "]", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "percentage", "of", "Brp", "puncta", "that", "were", "apposed", "to", "a", "dGluRIII", "clusters", "at", "each", "NMJ", "[", "WT", "n", "=", "14", ",", "hiw", "n", "=", "12", ",", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "n", "=", "12", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "37", ",", "F", "=", "2", ".", "093", ",", "p", "=", "0", ".", "4716", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "=", "0", ".", "2168", "(", "NS", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "1882", "(", "NS", ")", ",", "hiw", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "9966", "(", "NS", ")", "]", ".", "(", "E", ")", "Representative", "electrophysiological", "traces", "from", "a", "synaptic", "facilitation", "experiment", "in", "which", "trains", "of", "5", "pulses", "were", "used", "to", "evoke", "consecutive", "action", "potentials", "at", "100", "ms", "ISI", ".", "Genotypes", "for", "these", "experiments", "were", ":", "WT", "(", "elav", ">", "UAS", "-", "RFP", ")", ",", "hiw", "mutant", "(", "hiw", ";", "elav", ">", "UAS", "-", "RFP", ")", ",", "or", "hiw", "depleted", "of", "dNmnat", "(", "hiw", ";", "elav", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "facilitation", "index", ",", "in", "which", "the", "amplitude", "of", "the", "5th", "pulse", "is", "divided", "by", "the", "amplitude", "of", "the", "1st", "pulse", ".", "[", "100", "ms", "ISI", ":", "WT", "n", "=", "11", ",", "hiw", "n", "=", "9", ",", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "n", "=", "12", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "31", ",", "F", "=", "7", ".", "546", ",", "p", "=", "0", ".", "0023", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "=", "0", ".", "0020", "(", "*", "*", ")", ",", "hiw", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "0229", "(", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "5141", "(", "NS", ")", ".", "50", "ms", "ISI", ":", "WT", "n", "=", "11", ",", "hiw", "n", "=", "9", ",", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "n", "=", "12", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "31", ",", "F", "=", "5", ".", "587", ",", "p", "=", "0", ".", "0089", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "=", "0", ".", "0129", "(", "*", ")", ",", "hiw", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "0217", "(", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "dNmnat", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "9546", "(", "NS", ")", ".", "]"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative images of immunostained larval NMJs and active zones from WT, hiw mutant, and hiw mutant driving an RNAi against dNmnat [#29402]. In the top 3 panels, greyscale images of entire terminal were acquired by staining for nerve marker HRP. Presynaptic Brp puncta (green) and postsynaptic dGluRIII clusters (magenta) were imaged to quantify N in each genotype.(B) Quantification of NMJ synaptic terminal surface area in each genotype. [WT n = 14, hiw n = 12 , hiw > dNmnat-RNAi n=12. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=37, F=22.427, p < 0.0001. WT vs hiw p < 0.0001 (****), WT vs hiw > dNmnat-RNAi p < 0.0001 (****), hiw vs hiw > dNmnat-RNAi p = 0.2907 (NS)].(C) Quantification of BRP puncta per NMJ [WT n = 14, hiw n = 12, hiw > dNmnat-RNAi n=12. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=37, F=2.854, p = 0.0711. WT vs hiw p = 0.0573 (NS), WT vs hiw > dNmnat-RNAi p = 0.4529 (NS), hiw vs hiw > dNmnat-RNAi p = 0.5030 (NS)].(D) Quantification of percentage of Brp puncta that were apposed to a dGluRIII clusters at each NMJ [WT n = 14, hiw n = 12, hiw > dNmnat-RNAi n=12. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=37, F=2.093, p = 0.4716. WT vs hiw p = 0.2168 (NS), WT vs hiw > dNmnat-RNAi p = 0.1882 (NS), hiw vs hiw > dNmnat-RNAi p = 0.9966 (NS)].(E) Representative electrophysiological traces from a synaptic facilitation experiment in which trains of 5 pulses were used to evoke consecutive action potentials at 100 ms ISI. Genotypes for these experiments were: WT (elav>UAS-RFP), hiw mutant (hiw; elav>UAS-RFP), or hiw depleted of dNmnat (hiw; elav>dNmnat-RNAi). (F) Quantification of the facilitation index, in which the amplitude of the 5th pulse is divided by the amplitude of the 1st pulse. [100 ms ISI: WT n=11, hiw n= 9, hiw>dNmnat-RNAi n= 12. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF = 31, F= 7.546, p =0.0023. WT vs hiw p =0.0020 (**), hiw vs hiw> dNmnat-RNAi p= 0.0229 (*), WT vs hiw> dNmnat-RNAi p= 0.5141 (NS). 50 ms ISI: WT n=11, hiw n= 9, hiw>dNmnat-RNAi n= 12. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF = 31, F= 5.587, p =0.0089. WT vs hiw p =0.0129 (*), hiw vs hiw> dNmnat-RNAi p= 0.0217 (*), WT vs hiw> dNmnat-RNAi p= 0.9546 (NS).]"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "NMJ", "synaptic", "terminals", "in", "control", "(", "DVGlut", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "HA", "-", "dNmnat", ")", "and", "hiw", "mutant", "(", "hiwND9", ",", "DVGlut", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "HA", "-", "dNmnat", ")", "larvae", ".", "NMJs", "at", "larval", "muscle", "4", "were", "identified", "using", "HRP", "(", "blue", "in", "top", "panel", ")", "immunostaining", ".", "Insets", "highlight", "active", "zones", "within", "single", "boutons", ",", "which", "were", "identified", "by", "staining", "for", "the", "presynaptic", "active", "zone", "protein", "Brp", "(", "red", ")", ".", "An", "anti", "-", "HA", "antibody", "was", "used", "to", "stain", "for", "an", "HA", "-", "tagged", "dNmnat", "(", "green", ")", "transgene", "to", "measure", "protein", "levels", "in", "control", "and", "hiw", "mutant", "active", "zones", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "HA", "-", "dNmnat", "levels", "across", "the", "entire", "NMJ", "synaptic", "terminal", ",", "normalized", "to", "total", "terminal", "area", "and", "presented", "as", "fold", "change", "over", "WT", ".", "[", "WT", ">", "HA", "-", "dNmnat", "n", "=", "10", "terminals", ",", "hiw", ">", "HA", "-", "dNmnat", "n", "=", "10", "terminals", ".", "Unpaired", "T", "-", "test", ",", "DF", "=", "18", ",", "p", "=", "0", ".", "0028", "(", "*", "*", ")", "]", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "HA", "-", "dNmnat", "levels", "per", "unit", "area", "in", "WT", "and", "hiw", "for", "synaptic", "terminals", "excluding", "active", "zones", "(", "herein", "referred", "to", "as", "\"", "terminals", "\"", ")", "versus", "active", "zones", "(", "AZs", ")", "only", ".", "[", "WT", "n", "=", "10", "terminals", ",", "hiw", "n", "=", "9", "terminals", ",", "each", "parsed", "into", "terminal", "minus", "AZs", "and", "AZs", "only", ".", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "34", ",", "p", "=", "0", ".", "0005", "for", "row", "factor", "(", "terminal", "versus", "AZs", ")", "and", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "column", "factor", "(", "WT", "vs", "hiw", ")", ".", "WT", "terminal", "vs", "hiw", "terminal", "p", "=", "0", ".", "9830", "(", "NS", ")", ".", "Hiw", "terminal", "vs", "hiw", "AZs", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ".", "WT", "AZs", "vs", "hiw", "AZs", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ".", "]"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative images of NMJ synaptic terminals in control (DVGlut-Gal4 > UAS-HA-dNmnat) and hiw mutant (hiwND9,DVGlut-Gal4 > UAS-HA-dNmnat) larvae. NMJs at larval muscle 4 were identified using HRP (blue in top panel) immunostaining. Insets highlight active zones within single boutons, which were identified by staining for the presynaptic active zone protein Brp (red). An anti-HA antibody was used to stain for an HA-tagged dNmnat (green) transgene to measure protein levels in control and hiw mutant active zones.(B) Quantification of HA-dNmnat levels across the entire NMJ synaptic terminal, normalized to total terminal area and presented as fold change over WT. [WT > HA-dNmnat n = 10 terminals, hiw > HA-dNmnat n = 10 terminals. Unpaired T-test, DF = 18, p = 0.0028 (**)].(C) Quantification of HA-dNmnat levels per unit area in WT and hiw for synaptic terminals excluding active zones (herein referred to as \"terminals\") versus active zones (AZs) only. [WT n = 10 terminals, hiw n = 9 terminals, each parsed into terminal minus AZs and AZs only. 2-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons, DF = 34, p = 0.0005 for row factor (terminal versus AZs) and p < 0.0001 for column factor (WT vs hiw). WT terminal vs hiw terminal p = 0.9830 (NS). Hiw terminal vs hiw AZs p < 0.0001 (****). WT AZs vs hiw AZs p < 0.0001 (****).]"}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "entire", "boutons", "in", "wild", "type", ",", "hiw", ";", "wnd", ",", "and", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "NMJs", ".", "B", ")", "High", "magnification", "electron", "micrographs", "showing", "representative", "\"", "T", "-", "bar", "\"", "structures", "at", "active", "zones", "in", "NMJs", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Red", "arrows", "denote", "the", "beginning", "and", "end", "of", "the", "T", "-", "bar", "top", ",", "demonstrating", "changes", "in", "T", "-", "bar", "width", "in", "the", "genotypes", "tested", ".", "As", "illustrated", ",", "a", "significant", "reduction", "in", "T", "-", "bar", "size", "is", "observed", "in", "hiw", ";", "wnd", ",", "and", "this", "defect", "is", "suppressed", "in", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", ".", "C", ")", "Quantification", "of", "mean", "T", "-", "bar", "width", "[", "WT", "n", "=", "90", ",", "hiw", ";", "wnd", "n", "=", "55", ",", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "n", "=", "81", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "225", ",", "F", "=", "13", ".", "829", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "WT", "vs", "hiw", ";", "wnd", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "9318", "(", "NS", ")", ",", "hiw", ";", "wnd", "vs", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "]", ".", "(", "D", ")", "Analysis", "of", "cumulative", "frequency", "distribution", "of", "T", "-", "bar", "width", "shows", "a", "left", "shift", "in", "distribution", "in", "hiw", ";", "wnd", "but", "no", "change", "in", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "compared", "with", "WT", "NMJs", "[", "WT", "vs", "hiw", ";", "wnd", "K", "-", "S", "test", ",", "D", "=", "0", ".", "5636", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "K", "-", "S", "test", ",", "D", "=", "0", ".", "1815", ",", "p", "=", "0", ".", "1240", "(", "NS", ")", ",", "hiw", ";", "wnd", "vs", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "K", "-", "S", "test", ",", "D", "=", "0", ".", "4121", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "]", ".", "]", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "mean", "T", "-", "bar", "height", "[", "WT", "n", "=", "90", ",", "hiw", ";", "wnd", "n", "=", "55", ",", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "n", "=", "81", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "225", ",", "F", "=", "10", ".", "472", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "WT", "vs", "hiw", ";", "wnd", "p", "=", "0", ".", "0008", "(", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "6694", "(", "NS", ")", ",", "hiw", ";", "wnd", "vs", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "]", "(", "F", ")", "Analysis", "of", "cumulative", "frequency", "distribution", "of", "T", "-", "bar", "height", "shows", "a", "left", "shift", "in", "distribution", "in", "hiw", ";", "wnd", "but", "no", "change", "in", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "compared", "with", "WT", "NMJs", "[", "WT", "vs", "hiw", ";", "wnd", "K", "-", "S", "test", ",", "D", "=", "0", ".", "3343", ",", "p", "=", "0", ".", "001", "(", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "K", "-", "S", "test", ",", "D", "=", "0", ".", "1012", ",", "p", "=", "0", ".", "7748", "(", "NS", ")", ",", "hiw", ";", "wnd", "vs", "hiw", ";", "wnd", ",", "Elav", "-", "GAL4", ">", "dNmnat", "RNAi", "K", "-", "S", "test", ",", "D", "=", "0", ".", "3484", ",", "p", "=", "0", ".", "0008", "(", "*", "*", "*", ")", "]", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Representative electron micrographs of entire boutons in wild type, hiw;wnd, and hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi NMJs.B) High magnification electron micrographs showing representative \"T-bar\" structures at active zones in NMJs of the indicated genotypes. Red arrows denote the beginning and end of the T-bar top, demonstrating changes in T-bar width in the genotypes tested. As illustrated, a significant reduction in T-bar size is observed in hiw;wnd, and this defect is suppressed in hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi.C) Quantification of mean T-bar width [WT n = 90, hiw;wnd n = 55, hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi n=81. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=225, F=13.829, p < 0.0001. WT vs hiw;wnd p < 0.0001 (****), WT vs hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi p = 0.9318 (NS), hiw;wnd vs hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi p < 0.0001 (****)]. (D) Analysis of cumulative frequency distribution of T-bar width shows a left shift in distribution in hiw;wnd but no change in hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi compared with WT NMJs [WT vs hiw;wnd K-S test, D=0.5636, p < 0.0001 (****), WT vs hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi K-S test, D=0.1815, p = 0.1240 (NS), hiw;wnd vs hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi K-S test, D=0.4121, p < 0.0001 (****)].]. (E) Quantification of mean T-bar height [WT n = 90, hiw;wnd n = 55, hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi n=81. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=225, F=10.472, p < 0.0001. WT vs hiw;wnd p = 0.0008 (***), WT vs hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi p = 0.6694 (NS), hiw;wnd vs hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi p < 0.0001 (****)] (F) Analysis of cumulative frequency distribution of T-bar height shows a left shift in distribution in hiw;wnd but no change in hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi compared with WT NMJs [WT vs hiw;wnd K-S test, D=0.3343, p = 0.001 (***), WT vs hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi K-S test, D=0.1012, p = 0.7748 (NS), hiw;wnd vs hiw;wnd, Elav-GAL4 > dNmnat RNAi K-S test, D=0.3484, p = 0.0008 (***)]."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Representative", "EPSP", "and", "mEPSP", "electrophysiological", "traces", "from", "larval", "NMJs", "at", "Muscle", "6", "in", "which", "a", "motoneuron", "specific", "driver", "was", "used", "to", "overexpress", "either", "a", "control", "transgene", "(", "DVGlut", "-", "GAL4", ">", "UAS", "-", "RFP", ")", ",", "or", "one", "of", "the", "catalytic", "dNmnat", "mutants", "(", "DVGlut", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "WR", "-", "dNmnat", ",", "DVGlut", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "H30A", "-", "dNmnat", ")", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "EPSP", "amplitudes", ",", "in", "which", "75", "consecutive", "evoked", "events", "were", "averaged", "per", "cell", ",", "and", "then", "cell", "amplitudes", "were", "averaged", "per", "genotype", ".", "[", "UAS", "-", "RFP", "n", "=", "8", "cells", ",", "UAS", "-", "WR", "-", "dNmnat", "n", "=", "7", "cells", ",", "UAS", "-", "H30A", "-", "dNmnat", "n", "=", "7", "cells", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "21", ",", "F", "=", "0", ".", "8596", ",", "p", "=", "0", ".", "4383", ".", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "WR", "-", "dNmnat", "p", "=", "0", ".", "8810", "(", "NS", ")", ",", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "H30A", "-", "dNmnat", "p", "=", "0", ".", "9997", "(", "NS", ")", "]", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "quantal", "content", "(", "±", "SEM", ")", "[", "UAS", "-", "RFP", "n", "=", "8", "cells", ",", "UAS", "-", "WR", "-", "dNmnat", "n", "=", "7", "cells", ",", "UAS", "-", "H30A", "-", "dNmnat", "n", "=", "7", "cells", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "21", ",", "F", "=", "1", ".", "154", ",", "p", "=", "0", ".", "3365", ".", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "WR", "-", "dNmnat", "p", "=", "0", ".", "8696", "(", "NS", ")", ",", "UAS", "-", "RFP", "vs", "UAS", "-", "H30A", "-", "dNmnat", "p", "=", "0", ".", "9697", "(", "NS", ")", "]", ".", "]", ".", "(", "E", ")", "Representative", "EPSP", "and", "mEPSP", "electrophysiological", "traces", "from", "larval", "NMJs", "at", "Muscle", "6", ".", "Recordings", "were", "taken", "from", "WT", "control", "larvae", "(", "Elav", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "RFP", ")", ",", "hiw", "mutants", "driving", "a", "control", "transgene", "(", "hiwND8", ";", "Elav", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "RFP", ")", ",", "and", "hiw", "mutants", "expressing", "an", "RNAi", "to", "knockdown", "NAD", "+", "syn", "(", "hiwND8", ";", "Elav", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "NAD", "+", "syn", "-", "RNAi", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "EPSP", "amplitudes", ",", "in", "which", "75", "consecutive", "evoked", "events", "were", "averaged", "per", "cell", ",", "and", "then", "cell", "amplitudes", "were", "averaged", "per", "genotype", ".", "[", "WT", "n", "=", "10", "cells", ",", "hiw", "n", "=", "10", "cells", ",", "hiw", ">", "NADsyn", "-", "RNAi", "n", "=", "10", "cells", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "29", ",", "F", "=", "14", ".", "02", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "NADsyn", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "5147", "(", "NS", ")", "]", ".", "]", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "quantal", "content", ".", "[", "WT", "n", "=", "10", "cells", ",", "hiw", "n", "=", "10", "cells", ",", "hiw", ">", "NADsyn", "-", "RNAi", "n", "=", "10", "cells", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "29", ",", "F", "=", "6", ".", "635", ",", "p", "=", "0", ".", "0047", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "=", "0", ".", "0063", "(", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "NADsyn", "-", "RNAi", "p", "=", "0", ".", "8942", "(", "NS", ")", "]", ".", "(", "H", ")", "Representative", "images", "of", "the", "NMJ", "synaptic", "terminal", "at", "muscle", "4", "in", "third", "-", "instar", "larvae", ".", "The", "genotypes", "in", "this", "experiment", "were", "identical", "to", "those", "tested", "in", "panels", "E", "-", "G", ".", "NMJs", "were", "stained", "for", "the", "presynaptic", "bouton", "marker", "DVGLUT", "(", "green", ")", "and", "nerve", "membrane", "marker", "HRP", "(", "red", ")", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "number", "of", "DVGlut", "+", "boutons", "per", "muscle", "4", "NMJ", "in", "each", "genotype", ".", "[", "WT", "n", "=", "25", ",", "hiw", "n", "=", "21", ",", "hiw", ">", "NADsyn", "-", "RNAi", "n", "=", "24", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "w", "/", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", ",", "DF", "=", "67", ",", "F", "=", "141", ".", "3", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "WT", "vs", "hiw", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ",", "WT", "vs", "hiw", ">", "Nadysn", "-", "RNAi", "p", ">", "0", ".", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "]", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Representative EPSP and mEPSP electrophysiological traces from larval NMJs at Muscle 6 in which a motoneuron specific driver was used to overexpress either a control transgene (DVGlut-GAL4 > UAS-RFP), or one of the catalytic dNmnat mutants (DVGlut-Gal4 > UAS-WR-dNmnat, DVGlut-Gal4 > UAS-H30A-dNmnat).(C) Quantification of mean (±SEM) EPSP amplitudes, in which 75 consecutive evoked events were averaged per cell, and then cell amplitudes were averaged per genotype. [UAS-RFP n = 8 cells, UAS-WR-dNmnat n = 7 cells, UAS-H30A-dNmnat n= 7 cells. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=21, F=0.8596, p = 0.4383. UAS-RFP vs UAS-WR-dNmnat p = 0.8810 (NS), UAS-RFP vs UAS-H30A-dNmnat p = 0.9997 (NS)].(D) Quantification of quantal content (±SEM) [UAS-RFP n = 8 cells, UAS-WR-dNmnat n = 7 cells, UAS-H30A-dNmnat n= 7 cells. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=21, F=1.154, p = 0.3365. UAS-RFP vs UAS-WR-dNmnat p = 0.8696 (NS), UAS-RFP vs UAS-H30A-dNmnat p = 0.9697 (NS)].]. (E) Representative EPSP and mEPSP electrophysiological traces from larval NMJs at Muscle 6. Recordings were taken from WT control larvae (Elav-Gal4>UAS-RFP), hiw mutants driving a control transgene (hiwND8;Elav-Gal4 > UAS-RFP), and hiw mutants expressing an RNAi to knockdown NAD+syn (hiwND8;Elav-Gal4 > UAS-NAD+syn-RNAi).(F) Quantification of mean (±SEM) EPSP amplitudes, in which 75 consecutive evoked events were averaged per cell, and then cell amplitudes were averaged per genotype. [WT n = 10 cells, hiw n = 10 cells, hiw > NADsyn-RNAi n = 10 cells. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=29, F=14.02, p<0.0001. WT vs hiw p <0.0001 (****), WT vs hiw > NADsyn-RNAi p = 0.5147 (NS)].]. (G) Quantification of quantal content. [WT n = 10 cells, hiw n = 10 cells, hiw > NADsyn-RNAi n = 10 cells. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=29, F= 6.635, p = 0.0047. WT vs hiw p = 0.0063 (**), WT vs hiw > NADsyn-RNAi p = 0.8942 (NS)].(H) Representative images of the NMJ synaptic terminal at muscle 4 in third-instar larvae. The genotypes in this experiment were identical to those tested in panels E-G. NMJs were stained for the presynaptic bouton marker DVGLUT (green) and nerve membrane marker HRP (red).(I) Quantification of the mean (±SEM) number of DVGlut+ boutons per muscle 4 NMJ in each genotype. [WT n = 25, hiw n = 21, hiw > NADsyn-RNAi n=24. 1-way ANOVA w/Tukey's multiple comparisons, DF=67, F=141.3, p < 0.0001. WT vs hiw p < 0.0001 (****), WT vs hiw > Nadysn-RNAi p > 0.0001 (****)]."}
{"words": ["Figure", "1Cross", "-", "sectional", "and", "longitudinal", "analysis", "of", "the", "association", "between", "amyloid", "-", "PET", "(", "in", "centiloid", ")", ",", "CSF", "p", "-", "tau181", ",", "and", "CSF", "sTREM2", "in", "early", "Aβ", "-", "accumulators", "(", "i", ".", "e", ".", "Aβ", "CSF", "+", "/", "PET", "−", ";", "n", "=", "70", ")", "and", "late", "Aβ", "-", "accumulators", "(", "i", ".", "e", ".", "Aβ", "CSF", "+", "/", "PET", "+", ";", "n", "=", "201", ")", ".", "Cross", "-", "sectional", "linear", "regressions", "between", "A", ")", "centiloid", "and", "p", "-", "tau181", "and", "B", ")", "centiloid", "and", "sTREM2", ".", "Standardized", "beta", "-", "estimates", "(", "β", ")", ",", "T", "-", "values", ",", "and", "p", "-", "values", "were", "derived", "from", "linear", "regressions", "controlling", "for", "age", ",", "sex", ",", "education", ",", "and", "clinical", "status", ".", "Cross", "-", "sectional", "and", "longitudinal", "analysis", "of", "the", "association", "between", "amyloid", "-", "PET", "(", "in", "centiloid", ")", ",", "CSF", "p", "-", "tau181", ",", "and", "CSF", "sTREM2", "in", "early", "Aβ", "-", "accumulators", "(", "i", ".", "e", ".", "Aβ", "CSF", "+", "/", "PET", "−", ";", "n", "=", "70", ")", "and", "late", "Aβ", "-", "accumulators", "(", "i", ".", "e", ".", "Aβ", "CSF", "+", "/", "PET", "+", ";", "n", "=", "201", ")", ".", "Longitudinal", "linear", "regressions", "between", "C", ")", "centiloid", "and", "change", "in", "p", "-", "tau181", "and", "D", ")", "centiloid", "and", "change", "in", "sTREM2", ".", "Standardized", "beta", "-", "estimates", "(", "β", ")", ",", "T", "-", "values", ",", "and", "p", "-", "values", "were", "derived", "from", "linear", "regressions", "controlling", "for", "age", ",", "sex", ",", "education", ",", "and", "clinical", "status", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Cross-sectional and longitudinal analysis of the association between amyloid-PET (in centiloid), CSF p-tau181, and CSF sTREM2 in early Aβ-accumulators (i.e. Aβ CSF+/PET−; n=70) and late Aβ-accumulators (i.e. Aβ CSF+/PET+; n=201). Cross-sectional linear regressions between A) centiloid and p-tau181 and B) centiloid and sTREM2. Standardized beta-estimates (β), T-values, and p-values were derived from linear regressions controlling for age, sex, education, and clinical status.Cross-sectional and longitudinal analysis of the association between amyloid-PET (in centiloid), CSF p-tau181, and CSF sTREM2 in early Aβ-accumulators (i.e. Aβ CSF+/PET−; n=70) and late Aβ-accumulators (i.e. Aβ CSF+/PET+; n=201). Longitudinal linear regressions between C) centiloid and change in p-tau181 and D) centiloid and change in sTREM2. Standardized beta-estimates (β), T-values, and p-values were derived from linear regressions controlling for age, sex, education, and clinical status."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "T", "-", "value", "projection", "of", "the", "association", "between", "sTREM2", "on", "FDG", "-", "PET", ",", "stratified", "by", "group", ".", "FDG", "-", "PET", "z", "-", "scores", "were", "derived", "by", "referencing", "FDG", "-", "PET", "SUVRs", "to", "cognitively", "normal", "controls", "(", "i", ".", "e", ".", "n", "=", "131", ";", "Aβ", "CSF", "−", "/", "PET", "−", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) T-value projection of the association between sTREM2 on FDG-PET, stratified by group. FDG-PET z-scores were derived by referencing FDG-PET SUVRs to cognitively normal controls (i.e. n=131; Aβ CSF−/PET−)."}
{"words": ["Figure", "1Bright", "field", "(", "BF", ")", ",", "red", "(", "mCherry", ")", "and", "green", "(", "Atoh1", "-", "nGFP", ")", "fluorescent", "images", "of", "organoid", "cultures", "after", "10", "days", "of", "expansion", ".", "Scale", "bars", "=", "400µm", ".", "High", "power", "single", "plane", "confocal", "images", "of", "EdU", "labeled", "control", "and", "TRIM71", "-", "expressing", "organoids", ".", "An", "EdU", "pulse", "was", "given", "on", "day", "8", "and", "EdU", "incorporation", "(", "green", ")", "was", "analyzed", "1", ".", "5", "hours", "later", ".", "JAG1", "immunostaining", "(", "magenta", ")", "marks", "supporting", "cells", "/", "prosensory", "cells", ",", "mCherry", "(", "red", ")", "marks", "transduced", "cells", ",", "Hoechst", "labels", "cell", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "25µm", ".", "Percentage", "of", "EdU", "+", "mCherry", "+", "cells", "per", "organoids", "in", "(", "I", ")", ";", "(", "n", "=", "5", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", "of", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Bright field (BF), red (mCherry) and green (Atoh1-nGFP) fluorescent images of organoid cultures after 10 days of expansion. Scale bars = 400µm.High power single plane confocal images of EdU labeled control and TRIM71-expressing organoids. An EdU pulse was given on day 8 and EdU incorporation (green) was analyzed 1.5 hours later. JAG1 immunostaining (magenta) marks supporting cells/prosensory cells, mCherry (red) marks transduced cells, Hoechst labels cell nuclei (blue). Scale bar= 25µm. Percentage of EdU+ mCherry+ cells per organoids in (I); (n = 5, two independent experiments). P-values were calculated using two-tailed, unpaired t test. **P < 0.01. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ±standard deviation (SD) of biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2Bright", "field", "(", "BF", ")", ",", "red", "(", "mCherry", ")", "and", "green", "(", "Atoh1", "-", "nGFP", ")", "fluorescent", "images", "of", "organoid", "cultures", "after", "2", "days", "of", "differentiation", ".", "Scale", "bar", "=", "400µm", ".", "RT", "-", "qPCR", "of", "Atoh1", "mRNA", "in", "organoids", "(", "n", "=", "3", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", ".", "High", "power", "single", "plane", "confocal", "images", "of", "MYO7A", "immuno", "-", "stained", "(", "magenta", ")", "organoids", ".", "Atoh1", "-", "GFP", "(", "green", ")", "and", "MYO7A", "(", "magenta", ")", "mark", "nascent", "hair", "cells", ".", "MCherry", "(", "red", ")", "marks", "transduced", "cells", ".", "Scale", "bar", "=", "20µm", ".", "Quantification", "of", "MYO7A", "+", "mCherry", "+", "cells", "per", "organoid", "in", "(", "E", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", ".", "P", ">", "0", ".", "5", "deemed", "not", "significant", "(", "n", ".", "s", ".", ")", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", ".", "RT", "-", "PCR", "of", "Myo7a", "mRNA", "expression", "in", "organoids", "(", "n", "=", "3", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Bright field (BF), red (mCherry) and green (Atoh1-nGFP) fluorescent images of organoid cultures after 2 days of differentiation. Scale bar = 400µm.RT-qPCR of Atoh1 mRNA in organoids (n=3, two independent experiments). P-values were calculated using one-way ANOVA with Tukey's correction. ****P < 0.0001. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates.High power single plane confocal images of MYO7A immuno-stained (magenta) organoids. Atoh1-GFP (green) and MYO7A (magenta) mark nascent hair cells. MCherry (red) marks transduced cells. Scale bar = 20µm. Quantification of MYO7A+ mCherry+ cells per organoid in (E) (n=3, two independent experiments). P-values were calculated using one-way ANOVA with Tukey's correction. P>0.5 deemed not significant (n.s.). Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates.RT-PCR of Myo7a mRNA expression in organoids (n=3, two independent experiments). P-values were calculated using one-way ANOVA with Tukey's correction. *P ≤ 0.05. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates."}
{"words": ["Figure", "3Colony", "forming", "efficiency", "(", "n", "=", "4", "in", "WT", ",", "n", "=", "5", "in", "Trim71", "KO", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "A", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "n", ".", "s", ",", "not", "significant", ".", "Organoid", "diameter", "(", "n", "=", "4", "in", "WT", ",", "n", "=", "5", "in", "Trim71", "KO", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "A", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "n", ".", "s", ",", "not", "significant", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", ".", "High", "power", "single", "plane", "confocal", "images", "of", "EdU", "(", "red", ")", "and", "Hoechst", "(", "blue", ")", "labeled", "WT", "and", "TRIM71", "KO", "organoids", ".", "A", "single", "EdU", "pulse", "was", "given", "on", "day", "7", "and", "EdU", "incorporation", "was", "analyzed", "1", ".", "5", "hours", "later", ".", "Scale", "bars", "=", "25µm", ".", "Percentage", "of", "EdU", "+", "cells", "in", "(", "F", ")", "(", "n", "=", "15", "in", "WT", ",", "n", "=", "11", "in", "Trim71", "KO", ",", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", ".", "RT", "-", "qPCR", "of", "Trim71", "and", "hair", "cell", "-", "specific", "(", "Atoh1", ",", "Gfi1", "and", "Pou4f3", ")", "mRNAs", "in", "WT", "and", "Trim71", "KO", "organoids", "after", "2", "days", "of", "differentiation", "(", "n", "=", "3", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "A", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Colony forming efficiency (n=4 in WT, n=5 in Trim71 KO, two independent experiments). A two-tailed, unpaired t test was used to calculate P values. n.s, not significant. Organoid diameter (n=4 in WT, n=5 in Trim71 KO, two independent experiments). A two-tailed, unpaired t test was used to calculate P values. n.s, not significant. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates.High power single plane confocal images of EdU (red) and Hoechst (blue) labeled WT and TRIM71 KO organoids. A single EdU pulse was given on day 7 and EdU incorporation was analyzed 1.5 hours later. Scale bars = 25µm. Percentage of EdU+ cells in (F) (n=15 in WT, n=11 in Trim71 KO, three independent experiments). Two-tailed, unpaired t test was used to calculate P values, n.s. not significant. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates.RT-qPCR of Trim71 and hair cell-specific (Atoh1, Gfi1 and Pou4f3) mRNAs in WT and Trim71 KO organoids after 2 days of differentiation (n=3, two independent experiments). A two-tailed, unpaired t test was used to calculate P values. *P < 0.05. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4Cochlear", "epithelial", "cells", "isolated", "from", "P5", "wild", "type", "mice", "were", "transduced", "with", "control", "(", "Ctrl", ")", "or", "TRIM71", "-", "expressing", "lentivirus", "and", "bulk", "RNA", "sequencing", "was", "used", "to", "analyze", "differential", "gene", "expression", "after", "10", "days", "of", "expansion", ".", "Volcano", "plot", "of", "RNA", "-", "seq", "data", ".", "Plotted", "is", "beta", "-", "value", "(", "x", "-", "axis", ")", "versus", "−", "log10", "q", "-", "value", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "Transcripts", "that", "are", "significantly", "upregulated", "in", "response", "to", "TRIM71", "expression", "are", "marked", "in", "red", "circles", ",", "and", "transcripts", "that", "are", "significantly", "downregulated", "are", "marked", "in", "blue", "circles", ".", "Immunoblots", "showing", "LIN28B", ",", "AGO2", ",", "HMGA2", ",", "P", "-", "SMAD1", "/", "5", "/", "9", "and", "β", "-", "actin", "protein", "levels", "in", "P5", "control", ",", "TRIM71", "and", "△", "NHL", "expressing", "cochlear", "organoids", "at", "10", "days", "of", "expansion", ".", "Note", "β", "-", "actin", "was", "used", "to", "normalize", "protein", "levels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Cochlear epithelial cells isolated from P5 wild type mice were transduced with control (Ctrl) or TRIM71-expressing lentivirus and bulk RNA sequencing was used to analyze differential gene expression after 10 days of expansion. Volcano plot of RNA-seq data. Plotted is beta-value (x-axis) versus −log10 q-value (y-axis). Transcripts that are significantly upregulated in response to TRIM71 expression are marked in red circles, and transcripts that are significantly downregulated are marked in blue circles.Immunoblots showing LIN28B, AGO2, HMGA2, P-SMAD1/5/9 and β-actin protein levels in P5 control, TRIM71 and △NHL expressing cochlear organoids at 10 days of expansion. Note β-actin was used to normalize protein levels."}
{"words": ["Figure", "5Cochlear", "epithelial", "cells", "isolated", "from", "P5", "wild", "type", "were", "transduced", "with", "control", "(", "Ctrl", ")", "or", "TRIM71", "-", "expressing", "lentivirus", "and", "expanded", "as", "organoids", ".", "MCherry", "(", "red", ")", "marks", "transduced", "cells", ".", "Hoechst", "staining", "(", "blue", ")", "labels", "cell", "nuclei", ".", "High", "power", "single", "plane", "confocal", "images", "of", "control", "(", "Ctrl", ")", "and", "TRIM71", "-", "expressing", "organoids", "immuno", "-", "stained", "for", "progenitor", "/", "supporting", "cell", "marker", "JAG1", "(", "magenta", ")", "and", "progenitor", "marker", "HMGA2", "(", "green", ")", "after", "10", "days", "of", "expansion", ".", "Scale", "bars", "=", "25µm", ".", "Quantification", "of", "JAG1", "+", "mCherry", "+", "HMGA2", "+", "cells", "per", "organoid", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "A", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", ".", "Cochlear", "epithelial", "cells", "isolated", "from", "P5", "wild", "type", "were", "transduced", "with", "control", "(", "Ctrl", ")", "or", "TRIM71", "-", "expressing", "lentivirus", "and", "expanded", "as", "organoids", ".", "MCherry", "(", "red", ")", "marks", "transduced", "cells", ".", "Hoechst", "staining", "(", "blue", ")", "labels", "cell", "nuclei", ".", "High", "power", "confocal", "images", "of", "control", "(", "Ctrl", ")", "or", "TRIM71", "-", "expressing", "organoids", "immuno", "-", "stained", "for", "progenitor", "/", "supporting", "cell", "marker", "JAG1", "(", "magenta", ")", "and", "supporting", "cell", "marker", "S100A1", "(", "green", ")", "after", "10", "days", "of", "expansion", ".", "Scale", "bars", "=", "25µm", ".", "Quantification", "of", "JAG1", "+", "mCherry", "+", "S100A1", "+", "cells", "per", "organoid", "in", "(", "C", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "A", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", ".", "Cochlear", "epithelial", "cells", "isolated", "from", "Atoh1", "-", "nGFP", "transgenic", "mice", "(", "E", ",", "F", ")", "were", "transduced", "with", "control", "(", "Ctrl", ")", "or", "TRIM71", "-", "expressing", "lentivirus", "and", "expanded", "as", "organoids", ".", "MCherry", "(", "red", ")", "marks", "transduced", "cells", ".", "Hoechst", "staining", "(", "blue", ")", "labels", "cell", "nuclei", ".", "High", "power", "single", "plane", "confocal", "images", "of", "control", "(", "Ctrl", ")", "or", "TRIM71", "-", "expressing", "organoids", "immuno", "-", "stained", "for", "transcription", "factor", "NFIB", "(", "magenta", ")", "after", "2", "days", "of", "differentiation", ".", "Atoh1", "-", "nGFP", "(", "green", ")", "marks", "nascent", "hair", "cells", ".", "White", "arrowheads", "mark", "Atoh1", "-", "GFP", "+", "cells", "with", "low", "NFIB", "expression", "(", "NFIBlow", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "25µm", ".", "Quantification", "of", "NFIBlow", ",", "NFIBhigh", ",", "NFIBlowAtoh1", "-", "nGFP", "+", ",", "NFIBhigh", "Atoh1", "-", "nGFP", "+", "cells", "in", "control", "(", "Ctrl", ")", "and", "TRIM71", "-", "expressing", "organoids", "(", "n", "=", "4", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Cochlear epithelial cells isolated from P5 wild type were transduced with control (Ctrl) or TRIM71-expressing lentivirus and expanded as organoids. MCherry (red) marks transduced cells. Hoechst staining (blue) labels cell nuclei. High power single plane confocal images of control (Ctrl) and TRIM71-expressing organoids immuno-stained for progenitor/supporting cell marker JAG1 (magenta) and progenitor marker HMGA2 (green) after 10 days of expansion. Scale bars=25µm. Quantification of JAG1+ mCherry+ HMGA2+ cells per organoid in (A) (n=3, two independent experiments). A two-tailed, unpaired t test was used to calculate P values. ***P < 0.001. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates.Cochlear epithelial cells isolated from P5 wild type were transduced with control (Ctrl) or TRIM71-expressing lentivirus and expanded as organoids. MCherry (red) marks transduced cells. Hoechst staining (blue) labels cell nuclei. High power confocal images of control (Ctrl) or TRIM71-expressing organoids immuno-stained for progenitor/supporting cell marker JAG1 (magenta) and supporting cell marker S100A1 (green) after 10 days of expansion. Scale bars=25µm. Quantification of JAG1+ mCherry+ S100A1+ cells per organoid in (C) (n=3, two independent experiments). A two-tailed, unpaired t test was used to calculate P values. **P < 0.01. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates.Cochlear epithelial cells isolated from Atoh1-nGFP transgenic mice (E, F) were transduced with control (Ctrl) or TRIM71-expressing lentivirus and expanded as organoids. MCherry (red) marks transduced cells. Hoechst staining (blue) labels cell nuclei. High power single plane confocal images of control (Ctrl) or TRIM71-expressing organoids immuno-stained for transcription factor NFIB (magenta) after 2 days of differentiation. Atoh1-nGFP (green) marks nascent hair cells. White arrowheads mark Atoh1-GFP+ cells with low NFIB expression (NFIBlow). Scale bars=25µm. Quantification of NFIBlow, NFIBhigh, NFIBlowAtoh1-nGFP+, NFIBhigh Atoh1-nGFP+ cells in control (Ctrl) and TRIM71-expressing organoids (n=4, two independent experiments). Two-way ANOVA with Tukey's correction was used to calculate P values. ****P < 0.0001. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates."}
{"words": ["Figure", "6Bright", "field", "(", "BF", ")", "and", "red", "and", "green", "fluorescent", "images", "of", "organoid", "cultures", "at", "2", "days", "of", "differentiation", ".", "MCherry", "(", "red", ")", "marks", "transduced", "cells", "and", "Atoh1", "-", "nGFP", "(", "green", ")", "marks", "nascent", "hair", "cells", ".", "Scale", "bars", "=", "400µm", ".", "Percentage", "of", "mCherry", "+", "Atoh1", "-", "nGFP", "+", "organoids", "in", "(", "B", ")", "(", "n", "=", "5", "for", "Lin28b", "group", ",", "n", "=", "6", "for", "all", "the", "other", "groups", ";", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", ".", "RT", "-", "qPCR", "-", "analysis", "of", "progenitor", "(", "Hmga2", ")", "and", "supporting", "cell", "-", "specific", "(", "Zbtb20", ",", "Nfib", ")", "gene", "expression", "in", "control", ",", "Lin28b", ",", "TRIM71", "or", "Lin28b", "+", "TRIM71", "-", "expressing", "organoids", "after", "10", "days", "of", "expansion", "(", "n", "=", "3", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Bright field (BF) and red and green fluorescent images of organoid cultures at 2 days of differentiation. MCherry (red) marks transduced cells and Atoh1-nGFP (green) marks nascent hair cells. Scale bars =400µm.Percentage of mCherry+Atoh1-nGFP+ organoids in (B) (n=5 for Lin28b group, n=6 for all the other groups; two independent experiments). One-way ANOVA with Tukey's correction was used to calculate P values. *P ≤ 0.05, **P < 0.01 and ****P < 0.0001. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates.RT-qPCR- analysis of progenitor (Hmga2) and supporting cell-specific (Zbtb20, Nfib) gene expression in control, Lin28b, TRIM71 or Lin28b+TRIM71-expressing organoids after 10 days of expansion (n=3, two independent experiments). One-way ANOVA with Tukey's correction was used to calculate P values. *P ≤ 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates."}
{"words": ["Figure", "7RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "hair", "cell", "(", "Aoth1", "and", "Pou4f3", ")", "and", "progenitor", "-", "specific", "(", "Trim71", ")", "gene", "expression", "in", "Hmga2", "knockdown", "and", "control", "cultures", ".", "Hmga2", "expression", "was", "analyzed", "to", "confirm", "knockdown", ".", "Plotted", "are", "fold", "difference", "between", "control", "and", "Hmga2", "shRNA", "group", "and", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ";", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "A", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", ".", "Low", "power", "bright", "field", "(", "BF", ")", "and", "green", "fluorescent", "images", "(", "Atoh1", "-", "nGFP", ")", "of", "Hmga2", "shRNA", "knockdown", "and", "control", "organoid", "cultures", "after", "2", "days", "of", "differentiation", ".", "Scale", "bars", "=", "400", "µm", ".", "Quantification", "of", "Atoh1", "-", "nGFP", "+", "organoids", "in", "(", "E", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "A", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "P", "values", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "Data", "information", ":", "Plotted", "are", "individual", "data", "points", ",", "representing", "the", "average", "value", "per", "animal", "and", "treatment", ",", "and", "mean", "±", "SD", "of", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7RT-qPCR analysis of hair cell (Aoth1 and Pou4f3) and progenitor-specific (Trim71) gene expression in Hmga2 knockdown and control cultures. Hmga2 expression was analyzed to confirm knockdown. Plotted are fold difference between control and Hmga2 shRNA group and mean ± SD (n=3, biological replicates; two independent experiments). A two-tailed, unpaired t test was used to calculate P values. **P < 0.01, ***P < 0.001 and ****P < 0.0001. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates. Low power bright field (BF) and green fluorescent images (Atoh1-nGFP) of Hmga2 shRNA knockdown and control organoid cultures after 2 days of differentiation. Scale bars=400 µm. Quantification of Atoh1-nGFP+ organoids in (E) (n=3, two independent experiments). A two-tailed, unpaired t test was used to calculate P values. *P ≤ 0.05. Data information: Plotted are individual data points, representing the average value per animal and treatment, and mean ± SD of biological replicates. "}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "RMD", "assays", "performed", "after", "DSBs", "have", "been", "generated", "by", "sgRNAs", "/", "Cas9", ".", "The", "distance", "between", "the", "sgRNA", "/", "Cas9", "cleavage", "sites", "and", "the", "repeat", "sequences", "is", "indicated", ".", "U2OS", "cells", "carrying", "a", "single", "copy", "of", "the", "EGFP", "-", "SSA", "reporter", "(", "3427", "-", "17", ")", "were", "transfected", "with", "sgRNA", "/", "Cas9", "plasmids", ",", "and", "the", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "was", "determined", "(", "left", ")", ".", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "reporters", "EGFP", "-", "SSA", "-", "17", "/", "6", "bp", ",", "EGFP", "-", "SSA", "-", "0", ".", "3", "kb", ",", "EGFP", "-", "SSA", "-", "0", ".", "6", "kb", "and", "EGFP", "-", "SSA", "-", "1", ".", "0", "kb", "were", "pooled", "as", "a", "population", "after", "selection", "of", "the", "drug", "marker", "on", "the", "reporters", ",", "followed", "by", "sgRNA", "/", "Cas9", "cleavage", "(", "right", ")", ".", "C", ",", "RMD", "is", "strongly", "induced", "when", "a", "DSB", "is", "generated", "close", "to", "one", "repeat", ".", "The", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cell", "line", "carrying", "a", "single", "copy", "of", "the", "reporter", "was", "transfected", "with", "sgRNA", "/", "Cas9", "plasmids", "as", "indicated", ",", "and", "the", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "was", "determined", ".", "Determination", "of", "RMD", "frequency", "in", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cells", "when", "POLD3", "is", "depleted", "by", "lentiviral", "expression", "of", "shRNA", ".", "Cells", "infected", "with", "a", "lentiviral", "empty", "vector", "were", "used", "as", "control", ".", "The", "knockdown", "level", "of", "the", "indicated", "proteins", "was", "shown", "by", "Western", "blot", ",", "using", "KU70", "as", "the", "loading", "control", ".", "Determination", "of", "RMD", "frequency", "in", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cells", "when", "RAD52", "is", "depleted", "by", "lentiviral", "expression", "of", "shRNA", ".", "Cells", "infected", "with", "a", "lentiviral", "empty", "vector", "were", "used", "as", "control", ".", "The", "knockdown", "level", "of", "the", "indicated", "proteins", "was", "shown", "by", "Western", "blot", ",", "using", "KU70", "as", "the", "loading", "control", ".", "G", ",", "Determination", "of", "RMD", "frequency", "in", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cells", "when", "RAD51", "is", "depleted", "by", "lentiviral", "expression", "of", "shRNA", ".", "Cells", "infected", "with", "a", "lentiviral", "empty", "vector", "were", "used", "as", "control", ".", "The", "knockdown", "level", "of", "the", "indicated", "proteins", "was", "shown", "by", "Western", "blot", ",", "using", "KU70", "as", "the", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, RMD assays performed after DSBs have been generated by sgRNAs/Cas9. The distance between the sgRNA/Cas9 cleavage sites and the repeat sequences is indicated. U2OS cells carrying a single copy of the EGFP-SSA reporter (3427-17) were transfected with sgRNA/Cas9 plasmids, and the percentage of GFP-positive cells was determined (left). U2OS cells transfected with the indicated reporters EGFP-SSA-17/6 bp, EGFP-SSA-0.3 kb, EGFP-SSA-0.6 kb and EGFP-SSA-1.0 kb were pooled as a population after selection of the drug marker on the reporters, followed by sgRNA/Cas9 cleavage (right).C, RMD is strongly induced when a DSB is generated close to one repeat. The U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cell line carrying a single copy of the reporter was transfected with sgRNA/Cas9 plasmids as indicated, and the percentage of GFP-positive cells was determined.Determination of RMD frequency in U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cells when POLD3 is depleted by lentiviral expression of shRNA. Cells infected with a lentiviral empty vector were used as control. The knockdown level of the indicated proteins was shown by Western blot, using KU70 as the loading control.Determination of RMD frequency in U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cells when RAD52 is depleted by lentiviral expression of shRNA. Cells infected with a lentiviral empty vector were used as control. The knockdown level of the indicated proteins was shown by Western blot, using KU70 as the loading control.G, Determination of RMD frequency in U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cells when RAD51 is depleted by lentiviral expression of shRNA. Cells infected with a lentiviral empty vector were used as control. The knockdown level of the indicated proteins was shown by Western blot, using KU70 as the loading control."}
{"words": ["Figure", "2B", ",", "RMD", "efficiency", "is", "decreased", "when", "the", "distance", "from", "a", "DSB", "to", "one", "repeat", "is", "increased", ".", "RMD", "assays", "were", "performed", "in", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cells", "using", "the", "indicated", "sgRNAs", "/", "Cas9", ".", "The", "distance", "between", "the", "sgRNA", "/", "Cas9", "cleavage", "sites", "and", "the", "repeat", "sequences", "is", "shown", ".", "C", "and", "D", ",", "Knockdown", "of", "POLD3", "impairs", "RMD", "when", "a", "DSB", "is", "close", "to", "one", "repeat", ".", "RMD", "frequency", "was", "determined", "in", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cells", "using", "the", "indicated", "sgRNAs", "/", "Cas9", "with", "or", "without", "depletion", "of", "POLD3", "by", "lentivirus", "-", "expressed", "shRNA", ".", "Cells", "infected", "with", "a", "lentiviral", "empty", "vector", "were", "used", "as", "control", ".", "The", "distance", "between", "the", "sgRNA", "/", "Cas9", "cleavage", "sites", "and", "the", "repeat", "sequences", "is", "indicated", ".", "The", "knockdown", "level", "of", "POLD3", "was", "shown", "by", "Western", "blot", ",", "and", "KU70", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B, RMD efficiency is decreased when the distance from a DSB to one repeat is increased. RMD assays were performed in U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cells using the indicated sgRNAs/Cas9. The distance between the sgRNA/Cas9 cleavage sites and the repeat sequences is shown.C and D, Knockdown of POLD3 impairs RMD when a DSB is close to one repeat. RMD frequency was determined in U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cells using the indicated sgRNAs/Cas9 with or without depletion of POLD3 by lentivirus-expressed shRNA. Cells infected with a lentiviral empty vector were used as control. The distance between the sgRNA/Cas9 cleavage sites and the repeat sequences is indicated. The knockdown level of POLD3 was shown by Western blot, and KU70 was used as the loading control."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "Cyclin", "E", "overexpression", "results", "in", "increased", "RMD", "when", "the", "DSB", "is", "close", "to", "one", "repeat", ".", "The", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "3", ")", "cell", "line", "carrying", "Tet", "-", "on", "-", "cyclin", "E", "plasmid", "was", "used", ",", "and", "RMD", "frequency", "was", "determined", "with", "or", "without", "induction", "of", "cyclin", "E", "expression", "by", "doxycycline", "(", "DOX", ",", "0", ".", "5", "µg", "/", "mL", ")", ",", "which", "was", "added", "24", "hours", "before", "transfection", "of", "the", "indicated", "sgRNAs", "/", "Cas9", ".", "Cyclin", "E", "expression", "levels", "were", "validated", "by", "Western", "blot", ",", "using", "KU70", "as", "the", "loading", "control", ".", "B", ",", "ATR", "is", "required", "for", "BIR", "/", "RMD", "upon", "cyclin", "E", "overexpression", ".", "RMD", "frequency", "was", "determined", "in", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "3", ")", "cells", "infected", "with", "lentivirus", "-", "expressed", "ATR", "shRNA", "or", "the", "control", "vector", "(", "Ctrl", ")", "with", "and", "without", "induction", "of", "cyclin", "E", "expression", "by", "DOX", "(", "0", ".", "5", "µg", "/", "ml", ")", "after", "R29", "sgRNA", "/", "Cas9", "cleavage", ".", "ATR", "knockdown", "was", "shown", "by", "Western", "blot", "with", "KU70", "as", "the", "loading", "control", ".", "D", ",", "RMD", "is", "stimulated", "when", "Cas9", "-", "D10A", "is", "used", "to", "create", "a", "nick", "near", "the", "repeat", ".", "The", "repair", "frequencies", "of", "the", "U2OS", "(", "MMEJ", ")", "reporter", "cell", "line", "(", "left", ")", "and", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cell", "line", "(", "right", ")", "were", "determined", "after", "expression", "of", "the", "indicated", "sgRNAs", "/", "Cas9", "and", "sgRNAs", "/", "Cas9", "-", "D10A", ".", "The", "distance", "between", "the", "sgRNA", "cleavage", "sites", "and", "the", "left", "and", "right", "repeat", "sequences", "is", "indicated", "(", "right", "bottom", ")", ".", "E", ",", "RMD", "induced", "by", "Cas9", "-", "D10A", "is", "dependent", "on", "POLD3", ".", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cells", "were", "infected", "with", "lentiviruses", "expressing", "shRNA", "for", "POLD3", "or", "vector", "control", "and", "RMD", "was", "determined", "after", "cleavage", "by", "the", "indicated", "sgRNAs", "/", "Cas9", "-", "D10A", ".", "The", "distance", "between", "sgRNA", "/", "Cas9", "-", "D10A", "cleavage", "sites", "and", "the", "left", "and", "right", "repeat", "sequences", "is", "indicated", "at", "the", "bottom", ".", "The", "knockdown", "level", "of", "POLD3", "was", "shown", "by", "Western", "blot", ",", "and", "KU70", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "F", ",", "p27", "suppresses", "BIR", "/", "RMD", "and", "SSA", "/", "RMD", ".", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "3", ")", "cells", "carrying", "the", "Tet", "-", "on", "-", "cyclin", "E", "allele", "were", "infected", "with", "and", "without", "p27", "lentiviral", "viruses", ".", "RMD", "was", "determined", "before", "and", "after", "induction", "of", "cyclin", "E", "overexpression", "by", "DOX", "(", "0", ".", "5", "µg", "/", "mL", ")", "added", "24", "hours", "before", "transfection", "with", "the", "indicated", "sgRNAs", "/", "Cas9", ".", "Cyclin", "E", "expression", "levels", "and", "cell", "cycle", "profiles", "are", "shown", "in", "Appendix", "Fig", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, Cyclin E overexpression results in increased RMD when the DSB is close to one repeat. The U2OS (EGFP-SSA-3427-3) cell line carrying Tet-on-cyclin E plasmid was used, and RMD frequency was determined with or without induction of cyclin E expression by doxycycline (DOX, 0.5 µg/mL), which was added 24 hours before transfection of the indicated sgRNAs/Cas9. Cyclin E expression levels were validated by Western blot, using KU70 as the loading control.B, ATR is required for BIR/RMD upon cyclin E overexpression. RMD frequency was determined in U2OS (EGFP-SSA-3427-3) cells infected with lentivirus-expressed ATR shRNA or the control vector (Ctrl) with and without induction of cyclin E expression by DOX (0.5 µg/ml) after R29 sgRNA/Cas9 cleavage. ATR knockdown was shown by Western blot with KU70 as the loading control.D, RMD is stimulated when Cas9-D10A is used to create a nick near the repeat. The repair frequencies of the U2OS (MMEJ) reporter cell line (left) and U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cell line (right) were determined after expression of the indicated sgRNAs/Cas9 and sgRNAs/Cas9-D10A. The distance between the sgRNA cleavage sites and the left and right repeat sequences is indicated (right bottom).E, RMD induced by Cas9-D10A is dependent on POLD3. U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cells were infected with lentiviruses expressing shRNA for POLD3 or vector control and RMD was determined after cleavage by the indicated sgRNAs/Cas9-D10A. The distance between sgRNA/Cas9-D10A cleavage sites and the left and right repeat sequences is indicated at the bottom. The knockdown level of POLD3 was shown by Western blot, and KU70 was used as the loading control.F, p27 suppresses BIR/RMD and SSA/RMD. U2OS (EGFP-SSA-3427-3) cells carrying the Tet-on-cyclin E allele were infected with and without p27 lentiviral viruses. RMD was determined before and after induction of cyclin E overexpression by DOX (0.5 µg/mL) added 24 hours before transfection with the indicated sgRNAs/Cas9. Cyclin E expression levels and cell cycle profiles are shown in Appendix Fig S6."}
{"words": ["Figure", "4B", ",", "Impact", "of", "the", "5", "'", "DSB", "/", "repeat", "distance", "on", "RMD", "frequency", "when", "the", "3", "'", "DSB", "/", "repeat", "distance", "is", "fixed", ".", "RMD", "assays", "were", "performed", "using", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", ",", "and", "RMD", "frequency", "was", "determined", "by", "the", "number", "of", "GFP", "+", "cells", "normalized", "to", "transfection", "efficiency", ".", "The", "distance", "between", "the", "sgRNA", "targeting", "sites", "and", "the", "repeats", "is", "indicated", ".", "C", ",", "Long", "-", "range", "RMD", "is", "dependent", "on", "POLD3", "when", "one", "DSB", "is", "close", "to", "a", "repeat", ".", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", "were", "transfected", "with", "nontargeting", "siRNA", "(", "Ctrl", ")", "or", "a", "pool", "of", "POLD3", "siRNAs", "(", "siPOLD3", ")", "24", "hours", "before", "for", "the", "first", "time", ",", "and", "with", "transfection", "of", "sgRNAs", "/", "Cas9", "the", "second", "time", ".", "The", "graphs", "show", "the", "frequency", "of", "GFP", "+", "cells", "normalized", "to", "the", "transfection", "efficiency", ".", "The", "distance", "between", "the", "sgRNA", "targeting", "sites", "and", "the", "repeats", "is", "indicated", ".", "D", "and", "E", ",", "Impact", "of", "the", "3", "'", "DSB", "/", "repeat", "distance", "on", "RMD", "frequency", "when", "the", "5", "'", "DSB", "/", "repeat", "distance", "is", "fixed", ".", "RMD", "assays", "were", "performed", "using", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", ",", "and", "RMD", "frequency", "was", "determined", "by", "the", "number", "of", "GFP", "+", "cells", "normalized", "to", "transfection", "efficiency", ".", "The", "distance", "between", "the", "sgRNA", "targeting", "sites", "and", "the", "repeats", "is", "indicated", ".", "F", ",", "RMD", "frequency", "of", "two", "far", "-", "apart", "repeats", "that", "are", "a", "short", "distance", "from", "the", "DSB", ".", "RMD", "was", "determined", "in", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", "using", "the", "indicated", "sgRNAs", "/", "Cas9", ",", "with", "the", "frequency", "of", "GFP", "+", "cells", "normalized", "to", "transfection", "efficiency", ".", "The", "distance", "between", "the", "sgRNA", "targeting", "sites", "and", "the", "repeats", "is", "indicated", ".", "G", ",", "The", "roles", "of", "POLD3", ",", "RAD51", "and", "RAD52", "in", "RMD", "of", "two", "far", "-", "apart", "repeats", "that", "are", "a", "short", "distance", "from", "the", "DSB", ".", "RMD", "was", "determined", "in", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", "using", "the", "indicated", "sgRNAs", "/", "Cas9", "after", "POLD3", "(", "left", ")", "or", "RAD51", "(", "middle", ")", "was", "depleted", "by", "siRNA", "or", "RAD52", "was", "knocked", "out", "(", "right", ")", ".", "The", "distance", "between", "the", "sgRNA", "targeting", "sites", "and", "the", "repeats", "is", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B, Impact of the 5' DSB/repeat distance on RMD frequency when the 3' DSB/repeat distance is fixed. RMD assays were performed using mES cells carrying the RMD-GFP reporter, and RMD frequency was determined by the number of GFP+ cells normalized to transfection efficiency. The distance between the sgRNA targeting sites and the repeats is indicated.C, Long-range RMD is dependent on POLD3 when one DSB is close to a repeat. mES cells carrying the RMD-GFP reporter were transfected with nontargeting siRNA (Ctrl) or a pool of POLD3 siRNAs (siPOLD3) 24 hours before for the first time, and with transfection of sgRNAs/Cas9 the second time. The graphs show the frequency of GFP+ cells normalized to the transfection efficiency. The distance between the sgRNA targeting sites and the repeats is indicated.D and E, Impact of the 3' DSB/repeat distance on RMD frequency when the 5' DSB/repeat distance is fixed. RMD assays were performed using mES cells carrying the RMD-GFP reporter, and RMD frequency was determined by the number of GFP+ cells normalized to transfection efficiency. The distance between the sgRNA targeting sites and the repeats is indicated.F, RMD frequency of two far-apart repeats that are a short distance from the DSB. RMD was determined in mES cells carrying the RMD-GFP reporter using the indicated sgRNAs/Cas9, with the frequency of GFP+ cells normalized to transfection efficiency. The distance between the sgRNA targeting sites and the repeats is indicated.G, The roles of POLD3, RAD51 and RAD52 in RMD of two far-apart repeats that are a short distance from the DSB. RMD was determined in mES cells carrying the RMD-GFP reporter using the indicated sgRNAs/Cas9 after POLD3 (left) or RAD51 (middle) was depleted by siRNA or RAD52 was knocked out (right). The distance between the sgRNA targeting sites and the repeats is indicated."}
{"words": ["Figure", "5SSA", "/", "RMD", "and", "BIR", "/", "SSA", "are", "both", "dependent", "on", "ATM", ".", "SSA", "/", "RMD", "and", "BIR", "/", "SSA", "frequencies", "in", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cells", "were", "determined", "after", "the", "addition", "of", "ATM", "inhibitor", "(", "20mM", "ku55933", ")", "or", "DMSO", "to", "the", "cell", "culture", "medium", "24", "hours", "before", "transfection", "of", "the", "indicated", "sgRNA", "/", "Cas9BIR", "/", "SSA", "are", "both", "dependent", "on", "ATM", ".", "BIR", "/", "RMD", "in", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", "were", "determined", "after", "the", "addition", "of", "ATM", "inhibitor", "(", "20mM", "ku55933", ")", "or", "DMSO", "to", "the", "cell", "culture", "medium", "24", "hours", "before", "transfection", "of", "the", "indicated", "sgRNA", "/", "Cas9", "or", "in", "ATM", "KO", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", "(", "right", ")", ".", "Dependence", "of", "RMD", "on", "H2AX", ".", "SSA", "/", "RMD", "and", "BIR", "/", "RMD", "frequencies", "in", "U2OS", "(", "EGFP", "-", "SSA", "-", "3427", "-", "17", ")", "cells", "were", "determined", "using", "the", "indicated", "sgRNA", "/", "Cas9", "after", "depletion", "of", "H2AX", "by", "lentivirus", "expressed", "shRNA", "Depletion", "of", "H2AX", "by", "shRNA", "in", "was", "determined", "by", "qPCRD", ",", "Dependence", "of", "RMD", "on", "H2AX", ".", "BIR", "/", "RMD", "in", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", ",", "or", "by", "transfection", "with", "H2AX", "siRNA", "or", "in", "RAD52", "KO"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5SSA/RMD and BIR/SSA are both dependent on ATM. SSA/RMD and BIR/SSA frequencies in U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cells were determined after the addition of ATM inhibitor (20mM ku55933) or DMSO to the cell culture medium 24 hours before transfection of the indicated sgRNA/Cas9BIR/SSA are both dependent on ATM. BIR/RMD in mES cells carrying the RMD-GFP reporter were determined after the addition of ATM inhibitor (20mM ku55933) or DMSO to the cell culture medium 24 hours before transfection of the indicated sgRNA/Cas9 or in ATM KO mES cells carrying the RMD-GFP reporter (right).Dependence of RMD on H2AX. SSA/RMD and BIR/RMD frequencies in U2OS (EGFP-SSA-3427-17) cells were determined using the indicated sgRNA/Cas9 after depletion of H2AX by lentivirus expressed shRNA Depletion of H2AX by shRNA in was determined by qPCRD, Dependence of RMD on H2AX. BIR/RMD in mES cells carrying the RMD-GFP reporter , or by transfection with H2AX siRNA or in RAD52 KO cells"}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "Frequency", "of", "long", "-", "range", "RMD", "is", "increased", "by", "an", "additional", "DSB", "downstream", "of", "the", "3", "'", "repeat", ".", "Illustrations", "show", "the", "GFP", "-", "RMD", "reporter", ",", "with", "sgRNAs", "/", "Cas9", "cleavage", "sites", "indicated", "as", "red", "arrows", "(", "left", ")", ".", "The", "frequency", "of", "BIR", "/", "SSA", "in", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", "was", "determined", "after", "cleavage", "of", "the", "reporter", "by", "the", "indicated", "sgRNAs", "/", "Cas9", "(", "right", ")", ".", "B", "and", "C", ",", "The", "effects", "of", "RAD52", ",", "POLD3", ",", "ATM", "and", "H2AX", "inactivation", "on", "BIR", "/", "RMD", "with", "cleavage", "at", "L17", "/", "D10k", ".", "The", "frequency", "of", "BIR", "/", "RMD", "in", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", "was", "determined", "using", "the", "sgRNAs", "/", "Cas9", "at", "L17", "/", "D10k", "in", "RAD52", "KO", "cells", "or", "after", "POLD3", "depletion", "by", "siRNA", "(", "B", ")", ",", "or", "after", "treatment", "with", "ATM", "inhibitor", "(", "ku55933", ",", "15mM", ")", "or", "H2AX", "depletion", "by", "siRNA", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, Frequency of long-range RMD is increased by an additional DSB downstream of the 3' repeat. Illustrations show the GFP-RMD reporter, with sgRNAs/Cas9 cleavage sites indicated as red arrows (left). The frequency of BIR/SSA in mES cells carrying the RMD-GFP reporter was determined after cleavage of the reporter by the indicated sgRNAs/Cas9 (right).B and C, The effects of RAD52, POLD3, ATM and H2AX inactivation on BIR/RMD with cleavage at L17/D10k. The frequency of BIR/RMD in mES cells carrying the RMD-GFP reporter was determined using the sgRNAs/Cas9 at L17/D10k in RAD52 KO cells or after POLD3 depletion by siRNA (B), or after treatment with ATM inhibitor (ku55933, 15mM) or H2AX depletion by siRNA (C)."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "Long", "-", "range", "BIR", "/", "RMD", "with", "identical", "repeats", "or", "divergent", "repeats", ".", "The", "frequency", "of", "BIR", "/", "RMD", "in", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", "with", "identical", "repeats", "(", "0", "%", ")", "or", "repeats", "with", "1", "%", "and", "3", "%", "divergence", "was", "determined", "after", "cleavage", "at", "L17", "/", "R3", ".", "3k", "or", "L17", "/", "R28", ".", "4k", ".", "B", "and", "C", ",", "The", "effect", "of", "MSH2", "on", "BIR", "/", "RMD", "when", "repeat", "sequences", "are", "divergent", ".", "The", "frequency", "of", "BIR", "/", "RMD", "was", "determined", "after", "cleavage", "at", "L17", "/", "R3", ".", "3k", "or", "L17", "/", "R28", ".", "4k", "in", "mES", "cells", "carrying", "the", "RMD", "-", "GFP", "reporter", "with", "1", "%", "and", "3", "%", "divergent", "repeats", ",", "and", "with", "and", "without", "MSH2", "KO", "(", "B", ")", "or", "with", "MSH2", "KO", "and", "POLD3", "depletion", "by", "siRNAs", "(", "C", ")", ".", "The", "MSH2", "KO", "was", "validated", "by", "Western", "blot", ",", "using", "KU70", "as", "the", "loading", "control", "as", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "two", "-", "tailed", "non", "-", "paired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, Long-range BIR/RMD with identical repeats or divergent repeats. The frequency of BIR/RMD in mES cells carrying the RMD-GFP reporter with identical repeats (0%) or repeats with 1% and 3% divergence was determined after cleavage at L17/R3.3k or L17/R28.4k.B and C, The effect of MSH2 on BIR/RMD when repeat sequences are divergent. The frequency of BIR/RMD was determined after cleavage at L17/R3.3k or L17/R28.4k in mES cells carrying the RMD-GFP reporter with 1% and 3% divergent repeats, and with and without MSH2 KO (B) or with MSH2 KO and POLD3 depletion by siRNAs (C). The MSH2 KO was validated by Western blot, using KU70 as the loading control as shown in (B). Data information: Error bars represent standard deviation (SD) of at least three independent experiments. *P < 0.05, **P < 0.01, two-tailed non-paired t-test. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Kaplan", "Meier", "plot", "for", "survival", "in", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "11", ")", "and", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "10", ")", "mice", "with", "mammary", "cancer", "after", "tumor", "onset", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0185", ";", "Log", "rank", "test", ".", "(", "B", ")", "Tumor", "volumes", ",", "followed", "over", "time", ",", "of", "control", "mammary", "tumor", "E0771", "cells", "(", "shRenilla", ")", "and", "Apelin", "-", "depleted", "(", "shApln", ")", "E0771", "cells", "orthotopically", "-", "injected", "into", "both", "syngeneic", "C57BL", "/", "6J", "Apln", "+", "/", "+", "and", "Apln", "-", "/", "-", "mice", "(", "5x105", "cells", "/", "mouse", ")", ",", "respectively", ".", "Tumor", "volumes", "were", "determined", "using", "calipers", "and", "are", "shown", "as", "mean", "tumor", "volumes", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Data", "shown", "is", "pooled", "from", "2", "independent", "experiments", ".", "Apln", "+", "/", "+", ";", "shRenilla", "(", "n", "=", "18", ")", ",", "Apln", "+", "/", "+", ";", "shApln", "(", "n", "=", "17", ")", ",", "Apln", "-", "/", "-", ";", "shRenilla", "(", "n", "=", "14", ")", ",", "Apln", "-", "/", "-", ";", "shApln", "(", "n", "=", "15", ")", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "(", "C", ")", "Mean", "percentages", "(", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "of", "CD31", "+", "area", "in", "E0771", "shRenilla", "(", "n", "=", "3", ")", "or", "shApln", "(", "n", "=", "3", ")", "mammary", "tumors", ",", "assessed", "on", "day", "23", "post", "-", "orthotopic", "injection", "into", "C57BL", "/", "6J", "Apln", "+", "/", "+", "or", "Apln", "-", "/", "-", "mice", ",", "respectively", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "t", "test", ".", "(", "D", ")", "Mean", "percentages", "(", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "of", "extravasated", "Dextran", "in", "E0771", "shRenilla", "(", "n", "=", "9", ")", "or", "shApln", "(", "n", "=", "12", ")", "mammary", "tumors", ",", "assessed", "on", "day", "19", "post", "-", "orthotopic", "injection", "into", "C57BL", "/", "6J", "Apln", "+", "/", "+", "or", "Apln", "-", "/", "-", "mice", ",", "respectively", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "t", "test", ".", "Right", "panel", "shows", "representative", "immunofluorescence", "of", "Dextran", "(", "red", ")", ",", "CD31", "+", "vessels", "(", "green", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "regions", "of", "Dextran", "extravasation", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "μm", "(", "E", ")", "Mean", "counts", "(", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "of", "pimonidazole", "positive", "foci", ",", "assessed", "on", "day", "26", "post", "-", "orthotopic", "injection", "of", "E0771", "shRenilla", "(", "n", "=", "6", ")", "or", "shApln", "(", "n", "=", "4", ")", "into", "C57BL", "/", "6J", "wild", "-", "type", "mice", "(", "5x105", "cells", "/", "mouse", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "t", "test", ".", "Right", "panels", "show", "representative", "immunohistochemical", "pimonidazole", "staining", "at", "two", "different", "magnifications", ";", "Scale", "bars", "=", "200", "μm", "(", "upper", "panels", ")", "and", "50", "μm", "(", "lower", "panels", ")", ".", "(", "F", ")", "Mean", "percentage", "(", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "of", "tumor", "-", "infiltrating", "immune", "cells", "normalized", "to", "CD45", "+", ".", "E0771", "shRenilla", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "shApln", "(", "n", "=", "6", ")", "were", "orthotopically", "injected", "into", "C57BL", "/", "6J", "Apln", "+", "/", "+", "or", "Apln", "-", "/", "-", "mice", "(", "5x105", "cells", "/", "mouse", ")", ",", "respectively", "and", "tumors", "were", "harvested", "day", "25", "post", "-", "injection", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "t", "test", ".", "All", "immune", "cell", "populations", "were", "gated", "for", "viable", "CD45", "+", "cells", "and", "then", "further", "defined", "as", ":", "CD8", "T", "cells", "(", "Thy1", ".", "2", "+", ",", "CD8", "+", ")", ",", "CD4", "T", "cells", ",", "(", "Thy1", ".", "2", "+", ",", "CD4", "+", ")", ",", "Inflammatory", "Monocytes", "(", "Ly6C", "+", ",", "Cd11b", "+", ",", "Ly6G", "-", ")", ",", "PMN", "-", "MDSCs", "(", "Ly6G", "+", ",", "Cd11b", "+", ")", ",", "natural", "killer", "cells", "(", "Thy1", ".", "2", "-", ",", "Ly6G", "-", ",", "NK1", ".", "1", "+", ")", ",", "natural", "killer", "T", "cells", "(", "Thy1", ".", "2", "+", ",", "CD4", "-", ",", "CD8", "-", ",", "NK1", ".", "1", "+", ")", "and", "peripheral", "dendritic", "cells", "(", "Ly6G", "-", ",", "Ly6C", "+", ",", "Cd11b", "-", ",", "PDAC1", "+", ",", "B220", "+", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Kaplan Meier plot for survival in NeuT;Apln+/+ (n=11) and NeuT;Apln-/- (n=10) mice with mammary cancer after tumor onset. *P=0.0185; Log rank test.(B) Tumor volumes, followed over time, of control mammary tumor E0771 cells (shRenilla) and Apelin-depleted (shApln) E0771 cells orthotopically-injected into both syngeneic C57BL/6J Apln+/+ and Apln-/- mice (5x105 cells/mouse), respectively. Tumor volumes were determined using calipers and are shown as mean tumor volumes ± S.E.M. Data shown is pooled from 2 independent experiments. Apln+/+;shRenilla (n=18), Apln+/+;shApln (n=17), Apln-/-;shRenilla (n=14), Apln-/-;shApln (n=15); ** P<0.01, *** P<0.001; two-way ANOVA.(C) Mean percentages (± S.E.M.) of CD31+ area in E0771 shRenilla (n=3) or shApln (n=3) mammary tumors, assessed on day 23 post-orthotopic injection into C57BL/6J Apln+/+ or Apln-/- mice, respectively. **P<0.01; t test. (D) Mean percentages (± S.E.M.) of extravasated Dextran in E0771 shRenilla (n=9) or shApln (n=12) mammary tumors, assessed on day 19 post-orthotopic injection into C57BL/6J Apln+/+ or Apln-/- mice, respectively. **P<0.01; t test. Right panel shows representative immunofluorescence of Dextran (red), CD31+ vessels (green), and DAPI (blue). The white arrows indicate regions of Dextran extravasation. Scale bars = 100 μm(E) Mean counts (± S.E.M.) of pimonidazole positive foci, assessed on day 26 post-orthotopic injection of E0771 shRenilla (n=6) or shApln (n=4) into C57BL/6J wild-type mice (5x105 cells/mouse). *P<0.05; t test. Right panels show representative immunohistochemical pimonidazole staining at two different magnifications; Scale bars = 200 μm (upper panels) and 50 μm (lower panels).(F) Mean percentage (± S.E.M.) of tumor-infiltrating immune cells normalized to CD45+. E0771 shRenilla (n=8) or shApln (n=6) were orthotopically injected into C57BL/6J Apln+/+ or Apln-/- mice (5x105 cells/mouse), respectively and tumors were harvested day 25 post-injection. *P<0.05, **P<0.01; t test. All immune cell populations were gated for viable CD45+ cells and then further defined as: CD8 T cells (Thy1.2+, CD8+), CD4 T cells, (Thy1.2+, CD4+), Inflammatory Monocytes (Ly6C+, Cd11b+, Ly6G-), PMN-MDSCs (Ly6G+, Cd11b+), natural killer cells (Thy1.2-, Ly6G-, NK1.1+), natural killer T cells (Thy1.2+, CD4-, CD8-, NK1.1+) and peripheral dendritic cells (Ly6G- ,Ly6C+, Cd11b- , PDAC1+, B220+)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Left", "-", "Heatmap", "of", "RNA", "-", "Seq", "transcriptome", "analysis", "of", "CD31", "+", "/", "CD105", "+", "endothelial", "cells", "sorted", "from", "tumors", "established", "by", "E0771", "shRenilla", "(", "n", "=", "6", ")", "or", "shApln", "(", "n", "=", "3", ")", "cells", "orthotopically", "injected", "into", "C57BL", "/", "6J", "Apln", "+", "/", "+", "or", "Apln", "-", "/", "-", "mice", ",", "respectively", ".", "Tumors", "were", "harvested", "day", "25", "post", "-", "injection", "and", "genes", "displayed", "are", "significantly", "deregulated", "at", "the", "adjusted", "p", "-", "value", "cut", "-", "off", "of", "0", ".", "05", ".", "Right", "-", "Ingenuity", "Pathway", "Analysis", "for", "biological", "processes", "predicted", "to", "be", "decreased", "downstream", "of", "the", "differentially", "expressed", "genes", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "vessel", "sprouts", "(", "mean", "values", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "upon", "VEGF", "treatment", "(", "30ng", "/", "mL", ")", "of", "embryoid", "bodies", "(", "EB", ")", "derived", "from", "murine", "ES", "cells", "(", "mESCs", ")", "with", "sense", "integrations", "in", "the", "Apelin", "gene", "(", "Apln", "STOP", ")", "of", "the", "splice", "acceptor", "described", "in", "Appendix", "Figure", "S1B", "or", "Cre", "-", "reverted", "antisense", "(", "Apln", "GO", ")", "sister", "cells", ".", "Apln", "GO", "(", "Day", "2", "n", "=", "6", ";", "Day", "4", "n", "=", "40", ",", "Day", "6", "n", "=", "54", ",", "Day", "8", "n", "=", "32", ",", "Day", "10", "n", "=", "35", ",", "Day", "11", "n", "=", "31", ")", ",", "Apln", "STOP", "(", "Day", "2", "n", "=", "4", ";", "Day", "4", "n", "=", "15", ",", "Day", "6", "n", "=", "31", ",", "Day", "8", "n", "=", "28", ",", "Day", "10", "n", "=", "32", ",", "Day", "11", "n", "=", "37", ")", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "brightfield", "images", "and", "automated", "analysis", "of", "vessel", "sprouts", "by", "Definiens", "software", "are", "shown", "in", "the", "bottom", "panels", ".", "Scale", "bars", "=", "200", "μm", "(", "C", ")", "Differentially", "expressed", "genes", "using", "RNAseq", "transcriptome", "analysis", "of", "CD31", "+", "endothelial", "cells", "(", "ECs", ")", "sorted", "from", "sprouting", "EBs", "from", "Apelin", "STOP", "cells", "stimulated", "with", "VEGF", "(", "30ng", "/", "mL", ")", "and", "DMSO", "(", "-", "Apln", ")", "and", "repaired", "Apelin", "GO", "sister", "cells", "stimulated", "with", "VEGF", "and", "Apelin", "(", "1000nM", ")", "(", "+", "Apln", ")", ".", "VEGF", "target", "genes", "and", "angiogenesis", "-", "related", "genes", ",", "predicted", "by", "Ingenuity", "Pathway", "Analysis", "(", "IPA", ")", "software", ",", "are", "indicated", "by", "bars", "on", "the", "upper", "axis", "of", "the", "heatmap", ".", "GO", "terms", "were", "analyzed", "by", "DAVID", "on", "-", "line", "software", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Left - Heatmap of RNA-Seq transcriptome analysis of CD31+/CD105+ endothelial cells sorted from tumors established by E0771 shRenilla (n=6) or shApln (n=3) cells orthotopically injected into C57BL/6J Apln+/+ or Apln-/- mice, respectively. Tumors were harvested day 25 post-injection and genes displayed are significantly deregulated at the adjusted p-value cut-off of 0.05. Right - Ingenuity Pathway Analysis for biological processes predicted to be decreased downstream of the differentially expressed genes.(B) Quantification of vessel sprouts (mean values ± S.E.M.) upon VEGF treatment (30ng/mL) of embryoid bodies (EB) derived from murine ES cells (mESCs) with sense integrations in the Apelin gene (Apln STOP) of the splice acceptor described in Appendix Figure S1B or Cre-reverted antisense (Apln GO) sister cells. Apln GO (Day 2 n=6; Day 4 n=40, Day 6 n=54, Day 8 n= 32, Day 10 n=35, Day 11 n=31), Apln STOP (Day 2 n=4; Day 4 n=15, Day 6 n=31, Day 8 n= 28, Day 10 n=32, Day 11 n=37); ** P<0.01, *** P<0.001, two-way ANOVA. Representative brightfield images and automated analysis of vessel sprouts by Definiens software are shown in the bottom panels. Scale bars = 200 μm(C) Differentially expressed genes using RNAseq transcriptome analysis of CD31+ endothelial cells (ECs) sorted from sprouting EBs from Apelin STOP cells stimulated with VEGF (30ng/mL) and DMSO (-Apln) and repaired Apelin GO sister cells stimulated with VEGF and Apelin (1000nM) (+Apln). VEGF target genes and angiogenesis-related genes, predicted by Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software, are indicated by bars on the upper axis of the heatmap. GO terms were analyzed by DAVID on-line software."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Experimental", "set", "up", "and", "(", "right", ")", "Kaplan", "Meier", "survival", "plot", "of", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "and", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "mice", "with", "mammary", "cancer", ",", "left", "untreated", "(", "control", ")", "or", "treated", "with", "the", "indicate", "dose", "of", "the", "broad", "VEGFR", "blocker", "sunitinib", ".", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Control", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Control", "(", "n", "=", "11", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Sunitinib", "(", "n", "=", "11", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Sunitinib", "(", "n", "=", "12", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "Log", "rank", "test", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "when", "the", "tumor", "size", "reached", "1cm3", ",", "following", "ethical", "guidelines", ".", "The", "dotted", "line", "indicates", "50", "%", "of", "survival", ".", "(", "B", ")", "Percentages", "(", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "of", "tumor", "burden", "in", "mammary", "glands", "of", "untreated", "(", "control", ")", "and", "sunitinib", "-", "treated", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "and", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "mice", ",", "assessed", "4", "weeks", "after", "tumor", "onset", ".", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Control", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Control", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Sunitinib", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Sunitinib", "(", "n", "=", "5", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "H", "&", "E", "images", "are", "shown", "for", "each", "genotype", "in", "the", "right", "panels", ".", "Scale", "bars", "=", "1000", "μm", "(", "large", "panels", ")", "and", "50", "μm", "(", "insets", ")", ".", "(", "C", ")", "Tumor", "volumes", "of", "untreated", "(", "control", ")", "and", "sunitinib", "-", "treated", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "and", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "mammary", "tumors", ",", "size", "-", "matched", "at", "20", "-", "70mm3", "and", "followed", "over", "time", "by", "MRI", "analysis", ";", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Control", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Control", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Sunitinib", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Sunitinib", "(", "n", "=", "6", ")", "mice", "per", "group", ";", "Lines", "represent", "nonlinear", "fit", "of", "tumor", "growth", ".", "Box", "and", "arrow", "indicate", "the", "time", "point", "used", "for", "analysis", "in", "panel", "D", ".", "(", "D", ")", "Mitotic", "counts", "(", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "and", "representative", "H", "&", "E", "images", "of", "mammary", "tumors", "in", "untreated", "(", "control", ")", "­", "and", "sunitinib", "-", "treated", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "and", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "mice", ",", "assessed", "6", "weeks", "after", "tumor", "onset", ".", ";", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Control", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Control", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Sunitinib", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Sunitinib", "(", "n", "=", "4", ")", "tumors", "per", "group", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "to", "sunitinib", "-", "treated", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", ".", "White", "arrows", "indicate", "mitotic", "figures", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", "(", "E", ")", "Tumor", "volumes", ",", "followed", "over", "the", "indicated", "time", ",", "of", "orthotopically", "injected", "E0771", "shRenilla", "cells", "left", "untreated", "(", "control", ")", "or", "treated", "three", "times", "a", "week", "from", "day", "8", "after", "tumor", "injection", "with", "an", "Apelin", "antagonist", "alone", "(", "MM54", ",", "0", ".", "4μg", "/", "g", ")", ",", "sunitinib", "alone", "(", "60mg", "/", "kg", ")", "or", "a", "combination", "of", "both", ".", "Tumor", "volumes", "were", "measured", "using", "calipers", "and", "are", "shown", "as", "mean", "tumor", "volumes", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "E0771", "shRenilla", "Control", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "MM54", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "Sunitinib", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "Sunitinib", "+", "MM54", "(", "n", "=", "5", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Experimental set up and (right) Kaplan Meier survival plot of NeuT;Apln+/+ and NeuT;Apln-/- mice with mammary cancer, left untreated (control) or treated with the indicate dose of the broad VEGFR blocker sunitinib. NeuT;Apln+/+ Control (n=8), NeuT;Apln-/- Control (n=11), NeuT;Apln+/+ Sunitinib (n=11), NeuT;Apln-/- Sunitinib (n=12); *P<0.05; Log rank test. Mice were sacrificed when the tumor size reached 1cm3, following ethical guidelines. The dotted line indicates 50% of survival.(B) Percentages (mean ± S.E.M.) of tumor burden in mammary glands of untreated (control) and sunitinib-treated NeuT;Apln+/+ and NeuT;Apln-/- mice, assessed 4 weeks after tumor onset. NeuT;Apln+/+ Control (n=6), NeuT;Apln-/- Control (n=8), NeuT;Apln+/+ Sunitinib (n=5), NeuT;Apln-/- Sunitinib (n=5); *P<0.05; ***P<0.001; one-way ANOVA. Representative H&E images are shown for each genotype in the right panels. Scale bars = 1000 μm (large panels) and 50 μm (insets).(C) Tumor volumes of untreated (control) and sunitinib-treated NeuT;Apln+/+ and NeuT;Apln-/- mammary tumors, size-matched at 20-70mm3 and followed over time by MRI analysis; NeuT;Apln+/+ Control (n=7), NeuT;Apln-/- Control (n=5), NeuT;Apln+/+ Sunitinib (n=5), NeuT;Apln-/- Sunitinib (n=6) mice per group; Lines represent nonlinear fit of tumor growth. Box and arrow indicate the time point used for analysis in panel D. (D) Mitotic counts (mean ± S.E.M.) and representative H&E images of mammary tumors in untreated (control) ­and sunitinib-treated NeuT;Apln+/+ and NeuT;Apln-/- mice, assessed 6 weeks after tumor onset.; NeuT;Apln+/+ Control (n=7), NeuT;Apln-/- Control (n=6), NeuT;Apln+/+ Sunitinib (n=9), NeuT;Apln-/- Sunitinib (n=4) tumors per group; *P<0.05; one-way ANOVA to sunitinib-treated NeuT;Apln-/-. White arrows indicate mitotic figures. Scale bars = 50 μm(E) Tumor volumes, followed over the indicated time, of orthotopically injected E0771 shRenilla cells left untreated (control) or treated three times a week from day 8 after tumor injection with an Apelin antagonist alone (MM54, 0.4μg/g), sunitinib alone (60mg/kg) or a combination of both. Tumor volumes were measured using calipers and are shown as mean tumor volumes ± S.E.M. E0771 shRenilla Control (n=6), MM54 (n=5), Sunitinib (n=5), Sunitinib+MM54 (n=5); *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, two-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Representative", "MRI", "images", ";", "Scale", "bar", "=", "5mm", "and", "(", "C", ")", "quantification", "(", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "of", "relative", "tumor", "blood", "volume", "(", "rTBV", ")", "over", "time", "after", "NeuT", "+", "mammary", "tumors", "were", "size", "-", "matched", "at", "20", "-", "70mm3", "(", "0", "weeks", ")", ".", "Treatments", "and", "genotypes", "are", "indicated", ".", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Control", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Control", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Sunitinib", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Sunitinib", "(", "n", "=", "5", ")", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "untreated", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "mice", "and", "#", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "untreated", "control", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "mice", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Of", "note", ",", "in", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "mice", ",", "only", "2", "tumors", "could", "be", "analyzed", "after", "6", "weeks", "as", "some", "mice", "had", "to", "be", "sacrificed", "due", "to", "the", "large", "tumor", "sizes", "following", "ethical", "guidelines", ".", "Thus", ",", "we", "did", "not", "perform", "any", "statistical", "analysis", "on", "the", "6", "weeks", "timepoints", ".", "(", "D", ")", "Analysis", "(", "mean", "values", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "of", "CD31", "+", "area", "(", "x104", "μm2", ")", "/", "field", ",", "number", "of", "dilated", "tumor", "vessels", "and", "percentage", "of", "alphaSMA", "+", "area", "per", "CD31", "+", "blood", "vessels", "in", "mammary", "tumors", "of", "untreated", "(", "control", ")", "and", "sunitinib", "-", "treated", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "and", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "mice", ",", "assessed", "6", "weeks", "after", "mammary", "tumors", "were", "size", "-", "matched", ".", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Control", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Control", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Sunitinib", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Sunitinib", "(", "n", "=", "4", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ".", "(", "E", ")", "Representative", "immunofluorescence", "and", "immunohistochemistry", "images", "from", "Fig", ".", "5D", "quantification", ".", "Dilated", "blood", "vessels", "are", "marked", "by", "a", "red", "asterisk", ".", "DAPI", "(", "blue", ")", "is", "shown", "as", "a", "counterstain", "to", "visualize", "nuclei", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "μm", "(", "upper", "panels", ")", ",", "50", "μm", "(", "middel", "panels", ")", "and", "20", "μm", "(", "lower", "panels", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Representative MRI images; Scale bar = 5mm and (C) quantification (mean ± S.E.M.) of relative tumor blood volume (rTBV) over time after NeuT+ mammary tumors were size-matched at 20-70mm3 (0 weeks). Treatments and genotypes are indicated. NeuT;Apln+/+ Control (n=4), NeuT;Apln-/- Control (n=4), NeuT;Apln+/+ Sunitinib (n=5), NeuT;Apln-/- Sunitinib (n=5); **P<0.01, and ***P<0.001 compared to untreated NeuT;Apln+/+ mice and #P<0.05 compared to untreated control NeuT;Apln-/- mice; two-way ANOVA. Of note, in NeuT;Apln+/+ mice, only 2 tumors could be analyzed after 6 weeks as some mice had to be sacrificed due to the large tumor sizes following ethical guidelines. Thus, we did not perform any statistical analysis on the 6 weeks timepoints.(D) Analysis (mean values ± S.E.M.) of CD31+ area (x104 μm2)/field, number of dilated tumor vessels and percentage of alphaSMA+ area per CD31+ blood vessels in mammary tumors of untreated (control) and sunitinib-treated NeuT;Apln+/+ and NeuT;Apln-/- mice, assessed 6 weeks after mammary tumors were size-matched. NeuT;Apln+/+ Control (n=4), NeuT;Apln-/- Control (n=4), NeuT;Apln+/+ Sunitinib (n=5), NeuT;Apln-/- Sunitinib (n=4); *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; one-way ANOVA and Kruskal-Wallis test. (E) Representative immunofluorescence and immunohistochemistry images from Fig. 5D quantification. Dilated blood vessels are marked by a red asterisk. DAPI (blue) is shown as a counterstain to visualize nuclei. Scale bars = 100 μm (upper panels), 50 μm (middel panels) and 20 μm (lower panels)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Percentages", "of", "CA9", "+", "cells", "adjacent", "to", "CD31", "+", "tumor", "blood", "vessels", "in", "untreated", "(", "control", ")", "and", "sunitinib", "-", "treated", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "and", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "mice", ",", "6", "weeks", "after", "mammary", "tumors", "were", "size", "-", "matched", ".", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Control", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Control", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Sunitinib", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Sunitinib", "(", "n", "=", "4", ")", ";", "100", "-", "200", "peri", "-", "vascular", "intra", "-", "tumoral", "regions", "per", "group", "were", "counted", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "Right", "panels", "show", "representative", "immunofluorescent", "images", ".", "Areas", "limited", "by", "dotted", "white", "lines", "indicate", "CA9", "+", "areas", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "(", "B", ")", "Representative", "MRI", "images", ";", "Scale", "bar", "=", "5mm", "and", "(", "C", ")", "quantification", "(", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "of", "vessel", "permeability", "(", "K2", ")", "in", "NeuT", "+", "mammary", "tumors", "followed", "over", "time", ".", "Treatments", "and", "genotypes", "are", "indicated", ".", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Control", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Control", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "Sunitinib", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "Sunitinib", "(", "n", "=", "5", ")", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "compared", "to", "untreated", "control", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "mice", "and", "§", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "sunitinib", "-", "treated", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "mice", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Of", "note", ",", "in", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "mice", ",", "only", "2", "tumors", "could", "be", "analysed", "after", "6", "weeks", "as", "some", "mice", "had", "to", "be", "sacrificed", "due", "to", "the", "large", "tumor", "sizes", "following", "ethical", "guidelines", ".", "Thus", "we", "did", "not", "perform", "any", "statistical", "analysis", "on", "the", "6", "weeks", "timepoints", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Percentages of CA9+ cells adjacent to CD31+ tumor blood vessels in untreated (control) and sunitinib-treated NeuT;Apln+/+ and NeuT;Apln-/- mice, 6 weeks after mammary tumors were size-matched. NeuT;Apln+/+ Control (n=4), NeuT;Apln-/- Control (n=4), NeuT;Apln+/+ Sunitinib (n=4), NeuT;Apln-/- Sunitinib (n=4); 100-200 peri-vascular intra-tumoral regions per group were counted. ***P<0.001; one-way ANOVA. Right panels show representative immunofluorescent images. Areas limited by dotted white lines indicate CA9+ areas. Scale bars = 50 μm.(B) Representative MRI images; Scale bar = 5mm and (C) quantification (mean ± S.E.M.) of vessel permeability (K2) in NeuT+ mammary tumors followed over time. Treatments and genotypes are indicated. NeuT;Apln+/+ Control (n=4), NeuT;Apln-/- Control (n=5), NeuT;Apln+/+ Sunitinib (n=4), NeuT;Apln-/- Sunitinib (n=5); ***P<0.001, compared to untreated control NeuT;Apln+/+ mice and §P<0.05 compared to sunitinib-treated NeuT;Apln+/+ mice; two-way ANOVA. Of note, in NeuT;Apln+/+ mice, only 2 tumors could be analysed after 6 weeks as some mice had to be sacrificed due to the large tumor sizes following ethical guidelines. Thus we did not perform any statistical analysis on the 6 weeks timepoints."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Number", "of", "metastatic", "lung", "foci", "in", "untreated", "(", "control", ")", "and", "sunitinib", "-", "treated", "(", "60mg", "/", "kg", ",", "three", "times", "a", "week", "from", "tumor", "initiation", ")", "NeuT", ";", "Apln", "+", "/", "+", "or", "NeuT", ";", "Apln", "-", "/", "-", "mice", ",", "assessed", "6", "weeks", "after", "mammary", "tumors", "were", "size", "-", "matched", ".", "Data", "of", "individual", "lung", "sections", "and", "means", "(", "black", "bars", ")", "are", "shown", ".", "Right", "panels", "show", "representative", "H", "&", "E", "images", ",", "where", "black", "arrows", "and", "insets", "indicate", "metastatic", "foci", ".", "Scale", "bars", "=", "1000", "μm", "(", "large", "panels", ")", "and", "50", "μm", "(", "insets", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ";", "n", "=", "3", "mice", "per", "cohort", "and", "three", "sections", "per", "lung", "were", "analysed", ".", "(", "B", ")", "Kaplan", "Meier", "survival", "plot", "for", "distant", "metastasis", "free", "survival", "from", "the", "KM", "-", "plotter", "database", "(", "Data", "Ref", ":", "Győrffy", "et", "al", ",", "2013", ")", "for", "high", "and", "low", "Apelin", "(", "APLN", ")", "-", "expressing", "groups", "in", "human", "breast", "cancer", ".", "Patients", "were", "split", "by", "the", "median", ".", "Affymetrix", "Apelin", "ID", "222856", "_", "at", ".", "(", "C", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "plot", "for", "progression", "-", "free", "survival", "stratifying", "RCC", "patients", "with", "high", "and", "low", "APELIN", "serum", "levels", "3", "-", "5", "months", "after", "the", "start", "date", "of", "sunitinib", "treatment", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0367", ";", "Log", "rank", "test", ".", "(", "D", ")", "Kaplan", "Meier", "plots", "for", "progression", "-", "free", "survival", "in", "RCC", "patients", "stratified", "into", "groups", "of", "high", "or", "low", "levels", "of", "APELIN", "and", "VEGF", ".", "Cut", "-", "off", "levels", "were", "set", "by", "the", "median", ".", "Serum", "was", "analysed", "3", "-", "5", "months", "after", "the", "start", "date", "of", "sunitinib", "treatment", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "Log", "rank", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Number of metastatic lung foci in untreated (control) and sunitinib-treated (60mg/kg, three times a week from tumor initiation) NeuT;Apln+/+ or NeuT;Apln-/- mice, assessed 6 weeks after mammary tumors were size-matched. Data of individual lung sections and means (black bars) are shown. Right panels show representative H&E images, where black arrows and insets indicate metastatic foci. Scale bars = 1000 μm (large panels) and 50 μm (insets). *P<0.05, **P<0.01; ***P<0.001; Kruskal-Wallis test; n=3 mice per cohort and three sections per lung were analysed.(B) Kaplan Meier survival plot for distant metastasis free survival from the KM-plotter database (Data Ref: Győrffy et al, 2013) for high and low Apelin (APLN)-expressing groups in human breast cancer. Patients were split by the median. Affymetrix Apelin ID 222856_at.(C) Kaplan-Meier plot for progression-free survival stratifying RCC patients with high and low APELIN serum levels 3-5 months after the start date of sunitinib treatment. *P=0.0367; Log rank test.(D) Kaplan Meier plots for progression-free survival in RCC patients stratified into groups of high or low levels of APELIN and VEGF. Cut-off levels were set by the median. Serum was analysed 3-5 months after the start date of sunitinib treatment. *P<0.05, **P<0.01; Log rank test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Localization", "of", "endogenous", "SHP", "-", "1", "in", "hematopoietic", "and", "non", "-", "hematopoietic", "cells", "was", "determined", "by", "confocal", "imaging", "after", "staining", "with", "SHP", "-", "1", "antibody", ".", "DAPI", "was", "used", "for", "nuclear", "staining", ",", "Scale", "bar", ":", "5µm", ".", "Fluorescence", "intensities", "along", "the", "line", "drawn", "in", "a", "representative", "cell", "were", "obtained", "using", "Zen", "software", "and", "the", "co", "-", "localization", "plots", "were", "made", "using", "GraphPad", "(", "Red", ":", "SHP", "-", "1", ",", "Blue", ":", "DAPI", ")", ".", "(", "C", ")", "SFB", "tagged", "PAF1", ",", "SFB", "-", "LEO1", ",", "SFB", "-", "CTR9", ",", "SFB", "-", "CDC73", ",", "SFB", "-", "RTF1", ",", "SFB", "-", "WDR61", "along", "with", "Myc", "SHP", "-", "1", "or", "Myc", "PTPN7", "were", "transfected", "in", "293T", "cells", "and", "interaction", "of", "SHP", "-", "1", "with", "PAF", "complex", "components", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "Myc", "antibody", "after", "S", "protein", "beads", "pulldown", "in", "presence", "of", "TurboNuclease", ".", "(", "D", ")", "SFB", "empty", "vector", ",", "SFB", "SHP", "-", "1", "or", "SFB", "PTPN7", "was", "co", "-", "transfected", "with", "Myc", "tagged", "H2B", "in", "293T", "cells", ".", "The", "interaction", "of", "H2B", "with", "SHP", "-", "1", "was", "detected", "through", "immunoblotting", "using", "Myc", "antibody", "after", "pull", "down", "with", "streptavidin", "sepharose", "beads", ".", "(", "E", ")", "Endogenous", "association", "of", "SHP", "-", "1", "with", "Paf1", "complex", "subunits", "(", "CDC73", ",", "RTF1", ",", "WDR61", ",", "LEO1", ",", "Paf1", ",", "CTR9", ")", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "after", "performing", "immunoprecipitation", "with", "either", "IgG", "or", "SHP", "-", "1", "antibody", ".", "(", "F", ")", "Immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "with", "control", "IgG", "or", "anti", "-", "SHP", "-", "1", "antibody", "was", "performed", "with", "extracts", "prepared", "from", "MCF7", "cells", "and", "endogenous", "association", "of", "H2B", "with", "SHP", "-", "1", "was", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "(", "G", ")", "Glutathione", "Sepharose", "beads", "immobilized", "with", "bacterially", "expressed", "recombinant", "GST", "or", "GST", "-", "H2B", "proteins", "were", "incubated", "with", "bacterially", "purified", "recombinant", "MBP", "-", "SHP", "-", "1", ".", "The", "association", "of", "SHP", "-", "1", "with", "H2B", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "MBP", "antibody", ".", "Expression", "of", "GST", ",", "GST", "-", "H2B", "and", "MBP", "SHP", "-", "1", "was", "shown", "by", "Coomassie", "staining", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Localization of endogenous SHP-1 in hematopoietic and non-hematopoietic cells was determined by confocal imaging after staining with SHP-1 antibody. DAPI was used for nuclear staining, Scale bar:5µm. Fluorescence intensities along the line drawn in a representative cell were obtained using Zen software and the co-localization plots were made using GraphPad (Red: SHP-1, Blue: DAPI).(C) SFB tagged PAF1, SFB-LEO1, SFB-CTR9, SFB-CDC73, SFB-RTF1, SFB-WDR61 along with Myc SHP-1 or Myc PTPN7 were transfected in 293T cells and interaction of SHP-1 with PAF complex components was detected by immunoblotting with Myc antibody after S protein beads pulldown in presence of TurboNuclease.(D) SFB empty vector, SFB SHP-1 or SFB PTPN7 was co-transfected with Myc tagged H2B in 293T cells. The interaction of H2B with SHP-1 was detected through immunoblotting using Myc antibody after pull down with streptavidin sepharose beads.(E) Endogenous association of SHP-1 with Paf1 complex subunits (CDC73, RTF1, WDR61, LEO1, Paf1, CTR9) was detected by immunoblotting after performing immunoprecipitation with either IgG or SHP-1 antibody.(F) Immunoprecipitation (IP) with control IgG or anti-SHP-1 antibody was performed with extracts prepared from MCF7 cells and endogenous association of H2B with SHP-1 was detected by immunoblotting.(G) Glutathione Sepharose beads immobilized with bacterially expressed recombinant GST or GST-H2B proteins were incubated with bacterially purified recombinant MBP-SHP-1. The association of SHP-1 with H2B was detected by immunoblotting with MBP antibody. Expression of GST, GST-H2B and MBP SHP-1 was shown by Coomassie staining."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Nuclear", "extracts", "of", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "knockout", "cells", "(", "derived", "from", "two", "independent", "guide", "RNAs", ")", "were", "made", "and", "the", "levels", "of", "H2BUb", "were", "detected", ".", "(", "B", ")", "Wild", "type", "(", "WT", ")", "293T", "cells", "along", "with", "SHP", "-", "1", "KO", "cells", "transfected", "with", "either", "Myc", "vector", ",", "Myc", "SHP", "-", "1", "∆", "SH2", "or", "Myc", "SHP", "-", "1", "NLS", "mutant", "were", "lysed", ".", "H2BUb", "levels", "were", "determined", "using", "specific", "antibody", ".", "(", "C", ")", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "KO", "293T", "cells", "transfected", "with", "Myc", "vector", ",", "Myc", "SHP", "-", "1", "or", "Myc", "SHP", "-", "1", "C", "/", "S", "(", "C453S", ")", "mutant", "were", "lysed", ".", "H2BUb", "levels", "were", "determined", "using", "specific", "antibody", ".", "(", "D", ")", "H2B", "WT", "along", "with", "the", "indicated", "Y", "/", "F", "and", "Y", "/", "D", "mutants", "were", "transfected", "into", "293T", "cells", ".", "Histone", "extract", "was", "prepared", "from", "cells", "transfected", "with", "each", "construct", "and", "subjected", "to", "western", "blotting", "with", "anti", "-", "H2B", "and", "anti", "-", "H2BUb", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "In", "vitro", "ubiquitination", "assay", "was", "performed", "using", "bacterially", "purified", "GST", ",", "GST", "tagged", "H2B", "and", "its", "mutants", "as", "substrates", ".", "Recombinant", "E1", ",", "E2", "(", "UBE2A", ")", "and", "ubiquitin", "were", "included", "in", "each", "reaction", ".", "Ubiquitination", "was", "detected", "by", "H2BUb", "antibody", ".", "(", "F", ")", "In", "vitro", "ubiquitination", "was", "performed", "using", "biotin", "tagged", "non", "-", "phospho", "and", "phospho", "(", "pY121", ")", "peptide", "of", "H2B", "as", "substrates", "in", "the", "presence", "of", "E1", "and", "E2", ".", "H2BUb", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "specific", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Nuclear extracts of WT and SHP-1 knockout cells (derived from two independent guide RNAs) were made and the levels of H2BUb were detected.(B) Wild type (WT) 293T cells along with SHP-1 KO cells transfected with either Myc vector, Myc SHP-1 ∆SH2 or Myc SHP-1 NLS mutant were lysed. H2BUb levels were determined using specific antibody.(C) WT and SHP-1 KO 293T cells transfected with Myc vector, Myc SHP-1 or Myc SHP-1 C/S (C453S) mutant were lysed. H2BUb levels were determined using specific antibody.(D) H2B WT along with the indicated Y/F and Y/D mutants were transfected into 293T cells. Histone extract was prepared from cells transfected with each construct and subjected to western blotting with anti-H2B and anti-H2BUb antibodies.(E) In vitro ubiquitination assay was performed using bacterially purified GST, GST tagged H2B and its mutants as substrates. Recombinant E1, E2(UBE2A) and ubiquitin were included in each reaction. Ubiquitination was detected by H2BUb antibody.(F) In vitro ubiquitination was performed using biotin tagged non-phospho and phospho (pY121) peptide of H2B as substrates in the presence of E1 and E2. H2BUb was detected by immunoblotting with specific antibody."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "In", "vitro", "phosphorylated", "GST", "H2B", "by", "Syk", "kinase", "was", "incubated", "with", "bacterially", "purified", "recombinant", "wild", "type", "SHP", "-", "1", "or", "elution", "buffer", "and", "the", "amount", "of", "released", "phosphate", "was", "assayed", "colorimetrically", "using", "the", "malachite", "green", "reagent", "(", "A620", " ", "nm", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "absorbance", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "Error", "bar", "indicates", "SD", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "B", ")", "Bacterially", "purified", "GST", "H2B", "was", "subjected", "to", "in", "vitro", "kinase", "assay", "using", "HEK293T", "cell", "lysate", ",", "and", "then", "phosphorylated", "proteins", "were", "incubated", "with", "either", "bacterially", "purified", "MBP", "tagged", "constitutively", "active", "(", "SHP", "-", "1", "ΔSH2", ")", ",", "or", "catalytically", "inactive", "SHP", "-", "1", "C", "/", "S", "mutant", ".", "The", "phosphorylation", "status", "of", "recombinant", "H2B", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "phospho", "-", "tyrosine", "antibody", ".", "(", "C", ")", "Phospho", "(", "pH2B", ")", "Y121", "and", "non", "-", "phospho", "peptide", "of", "H2B", "was", "incubated", "with", "constitutively", "active", "(", "SHP", "-", "1", "ΔSH2", ")", "or", "catalytically", "inactive", "mutant", "(", "C", "/", "S", ")", "of", "SHP", "-", "1", "and", "the", "released", "phosphate", "was", "assayed", "colorimetrically", "using", "the", "malachite", "green", "reagent", "(", "A620nm", ")", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "Error", "bars", "indicate", "SD", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "vector", ",", "Myc", "tagged", "SHP", "-", "1", "WT", "or", "C", "/", "S", "mutant", ".", "The", "phosphorylation", "status", "of", "endogenous", "H2B", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "pY121", "-", "H2B", "antibody", ".", "(", "E", ")", "Nuclear", "extracts", "of", "293T", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "KO", "cells", "were", "made", "and", "the", "levels", "of", "H2B", "phosphorylation", "were", "detected", "using", "pY121", "-", "H2B", "antibody", ".", "(", "F", ")", "Wild", "type", "(", "WT", ")", "along", "with", "SHP", "-", "1", "KO", "293T", "cells", "transfected", "with", "either", "Myc", "vector", ",", "Myc", "SHP", "-", "1", "or", "Myc", "SHP", "-", "1", "C", "/", "S", "mutant", "were", "lysed", ".", "Levels", "of", "pY121", "-", "H2B", "and", "H2BUb", "were", "determined", "using", "specific", "antibodies", ".", "(", "G", ")", "293T", "Cells", "were", "treated", "with", "SHP", "-", "1", "inhibitor", "TPI", "(", "50nm", ")", "for", "1hr", "and", "levels", "of", "pY121", "-", "H2B", "was", "determined", "using", "pY121H2B", "antibody", ".", "MCF7", "cells", "were", "transduced", "with", "(", "H", ")", "CTR9", "shRNA", "along", "with", "control", "shRNA", ".", "Post", "72", "h", ",", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", "to", "isolate", "soluble", "and", "nuclear", "fractions", ".", "Levels", "of", "phosphorylated", "and", "ubiquitinated", "H2B", "were", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "specific", "antibodies", ".", "MCF7", "cells", "were", "transduced", "with", "(", "I", ")", "Paf1", "shRNA", ",", "along", "with", "control", "shRNA", ".", "Post", "72", "h", ",", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", "to", "isolate", "soluble", "and", "nuclear", "fractions", ".", "Levels", "of", "phosphorylated", "and", "ubiquitinated", "H2B", "were", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "specific", "antibodies", ".", "MCF7", "cells", "were", "transduced", "with", "(", "J", ")", "RTF1", "shRNA", "along", "with", "control", "shRNA", ".", "Post", "72", "h", ",", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", "to", "isolate", "soluble", "and", "nuclear", "fractions", ".", "Levels", "of", "phosphorylated", "and", "ubiquitinated", "H2B", "were", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "specific", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) In vitro phosphorylated GST H2B by Syk kinase was incubated with bacterially purified recombinant wild type SHP-1 or elution buffer and the amount of released phosphate was assayed colorimetrically using the malachite green reagent (A620 nm). Data represent mean absorbance from four independent experiments. Error bar indicates SD; *p<0.05, by Student's t test.(B) Bacterially purified GST H2B was subjected to in vitro kinase assay using HEK293T cell lysate, and then phosphorylated proteins were incubated with either bacterially purified MBP tagged constitutively active (SHP-1 ΔSH2), or catalytically inactive SHP-1 C/S mutant. The phosphorylation status of recombinant H2B was detected by immunoblotting with phospho-tyrosine antibody.(C) Phospho (pH2B) Y121 and non-phospho peptide of H2B was incubated with constitutively active (SHP-1 ΔSH2) or catalytically inactive mutant (C/S) of SHP-1 and the released phosphate was assayed colorimetrically using the malachite green reagent (A620nm). n=3 independent experiments, Error bars indicate SD; ***p<0.001 (one-way ANOVA, Tukey's multiple comparison test).(D) 293T cells were transfected with vector, Myc tagged SHP-1 WT or C/S mutant. The phosphorylation status of endogenous H2B was detected by immunoblotting with pY121-H2B antibody.(E) Nuclear extracts of 293T WT and SHP-1 KO cells were made and the levels of H2B phosphorylation were detected using pY121-H2B antibody.(F) Wild type (WT) along with SHP-1 KO 293T cells transfected with either Myc vector, Myc SHP-1 or Myc SHP-1 C/S mutant were lysed. Levels of pY121-H2B and H2BUb were determined using specific antibodies.(G) 293T Cells were treated with SHP-1 inhibitor TPI (50nm) for 1hr and levels of pY121-H2B was determined using pY121H2B antibody.MCF7 cells were transduced with (H) CTR9 shRNA along with control shRNA. Post 72 h, cells were collected and lysed to isolate soluble and nuclear fractions. Levels of phosphorylated and ubiquitinated H2B were detected by immunoblotting with indicated specific antibodies.MCF7 cells were transduced with (I) Paf1 shRNA, along with control shRNA. Post 72 h, cells were collected and lysed to isolate soluble and nuclear fractions. Levels of phosphorylated and ubiquitinated H2B were detected by immunoblotting with indicated specific antibodies.MCF7 cells were transduced with (J) RTF1 shRNA along with control shRNA. Post 72 h, cells were collected and lysed to isolate soluble and nuclear fractions. Levels of phosphorylated and ubiquitinated H2B were detected by immunoblotting with indicated specific antibodies."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Cell", "lysates", "derived", "from", "293T", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", ",", "SFB", "-", "tagged", "H2B", ",", "H2B", "Y121F", "or", "H2B", "Y121D", "constructs", "were", "pulled", "down", "with", "S", "-", "protein", "agarose", "beads", ".", "RNF20", "interaction", "with", "H2B", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "specific", "antibody", ".", "(", "B", ")", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "SFB", "-", "tagged", "H2B", ",", "H2B", "Y121F", "or", "H2B", "Y121D", "constructs", "along", "with", "Myc", "-", "tagged", "UBE2A", ".", "Cell", "lysates", "were", "pulled", "down", "with", "S", "-", "protein", "beads", ",", "and", "interaction", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "Myc", "antibody", ".", "(", "C", ")", "Glutathione", "Sepharose", "beads", "bound", "with", "bacterially", "expressed", "recombinant", "GST", "-", "H2B", ",", "GST", "H2B", "Y121F", "and", "GST", "-", "H2B", "Y121D", "proteins", "were", "incubated", "with", "bacterially", "purified", "recombinant", "His", "UBE2A", ",", "and", "interaction", "of", "UBE2A", "with", "H2B", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "His", "antibody", ".", "Recombinant", "protein", "expression", "and", "pulldown", "was", "shown", "by", "Coomassie", "staining", ".", "(", "D", ")", "Bacterially", "purified", "GST", ",", "GST", "H2B", "and", "GST", "H2B", "-", "p", "(", "phosphorylated", "using", "Syk", ")", "was", "incubated", "with", "recombinant", "His", "UBE2A", ",", "and", "interaction", "of", "UBE2A", "with", "H2B", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "His", "antibody", ".", "Recombinant", "protein", "expression", "and", "pulldown", "was", "shown", "by", "Coomassie", "staining", ".", "(", "E", ")", "WT", "293T", "cells", "along", "with", "SHP", "-", "1", "KO", "were", "co", "-", "transfected", "with", "SFB", "vector", "or", "SFB", "H2B", "along", "with", "Myc", "UbE2A", ".", "Cell", "lysates", "were", "pulldown", "using", "S", "-", "protein", "beads", ",", "and", "interaction", "of", "UBE2A", "with", "H2B", "was", "determined", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "SFB", "vector", "or", "SFB", "H2B", "along", "with", "Myc", "UBE2A", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "SHP", "-", "1", "inhibitor", "TPI", "(", "50nm", ")", "for", "1hr", "after", "24hrs", "of", "transfection", ".", "Cells", "lysates", "were", "subjected", "to", "pull", "-", "down", "with", "S", "-", "protein", "beads", ",", "and", "western", "blotting", "was", "performed", "using", "specific", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Cell lysates derived from 293T cells transfected with empty vector, SFB-tagged H2B, H2B Y121F or H2B Y121D constructs were pulled down with S-protein agarose beads. RNF20 interaction with H2B was detected by immunoblotting with specific antibody.(B) HEK293T cells were co-transfected with the SFB-tagged H2B, H2B Y121F or H2B Y121D constructs along with Myc-tagged UBE2A. Cell lysates were pulled down with S-protein beads, and interaction was detected by immunoblotting with Myc antibody.(C) Glutathione Sepharose beads bound with bacterially expressed recombinant GST-H2B, GST H2B Y121F and GST-H2B Y121D proteins were incubated with bacterially purified recombinant His UBE2A, and interaction of UBE2A with H2B was detected by immunoblotting with His antibody. Recombinant protein expression and pulldown was shown by Coomassie staining.(D) Bacterially purified GST, GST H2B and GST H2B-p (phosphorylated using Syk) was incubated with recombinant His UBE2A, and interaction of UBE2A with H2B was detected by immunoblotting with His antibody. Recombinant protein expression and pulldown was shown by Coomassie staining.(E) WT 293T cells along with SHP-1 KO were co-transfected with SFB vector or SFB H2B along with Myc UbE2A. Cell lysates were pulldown using S-protein beads, and interaction of UBE2A with H2B was determined by Western blotting with the indicated antibodies.(F) HEK293T cells were transfected with SFB vector or SFB H2B along with Myc UBE2A.Cells were treated with SHP-1 inhibitor TPI (50nm) for 1hr after 24hrs of transfection. Cells lysates were subjected to pull-down with S-protein beads, and western blotting was performed using specific antibodies."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "super", "-", "resolution", "images", "of", "MCF7", "cells", "immunostained", "with", "SHP", "-", "1", "in", "combination", "with", "CDK9", ",", "total", "RNA", "Polymerse", "II", ",", "RNA", "polymerase", "II", "Ser2P", ",", "and", "RNA", "Polymerase", "II", "Ser5P", ".", "Scale", "bar", ":", "5µm", ".", "Fluorescence", "intensities", "along", "the", "line", "drawn", "in", "a", "representative", "section", "of", "cell", "were", "obtained", "using", "Zen", "software", "and", "the", "co", "-", "localization", "plots", "were", "made", "using", "GraphPad", ".", "(", "B", ")", "Co", "-", "localization", "of", "SHP", "-", "1", "with", "CDK9", ",", "total", "RNA", "Polymerase", "II", ",", "RNA", "Polymerase", "II", "S2P", ",", "and", "RNA", "Polymerase", "II", "S5P", "was", "measured", "by", "Pearson", "correlation", "coefficient", "using", "ImageJ", ".", "Values", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "10", "(", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "C", ")", "Endogenous", "interaction", "of", "SHP", "-", "1", "with", "RNA", "Polymerase", "II", ",", "RNA", "polymerase", "II", "Ser2P", ",", "and", "RNA", "Polymerase", "II", "Ser5P", "and", "CDK9", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "after", "performing", "immunoprecipitation", "with", "either", "IgG", "or", "SHP", "-", "1", "antibody", "using", "TurboNuclease", "treated", "cell", "lysate", ".", "(", "D", ")", "Nuclear", "extracts", "of", "MCF", "-", "7", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "knockout", "cells", "were", "made", "and", "the", "levels", "of", "RNA", "Polymerase", "II", ",", "RNA", "Polymerase", "II", "Ser2P", "and", "RNA", "Polymerase", "II", "Ser5P", "were", "detected", "by", "immunoblotting", "using", "specific", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "Nuclear", "extracts", "of", "cells", "treated", "with", "either", "DMSO", "or", "SHP", "-", "1", "inhibitor", "TPI", "(", "50nm", ")", "were", "used", "to", "detect", "total", "RNA", "Polymerase", "II", "and", "its", "modifications", "by", "immunoblotting", "using", "specific", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "Nuclear", "extracts", "of", "MCF", "-", "7", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "knockout", "cells", "transfected", "with", "Myc", "vector", ",", "H2B", "Y121F", "or", "H2B", "Y121D", "constructs", "were", "made", "and", "the", "levels", "of", "RNA", "Polymerase", "II", ",", "RNA", "Polymerase", "II", "Ser2P", ",", "RNA", "Polymerase", "II", "Ser5P", "and", "Lamin", "B1", "were", "detected", "by", "immunoblotting", "using", "specific", "antibodies", ".", "(", "G", ")", "Immunofluorescence", "of", "WT", "or", "SHP", "-", "1", "knockout", "MCF7", "cells", "labelled", "with", "the", "5", "-", "Ethynyl", "Uridine", "(", "EU", ")", "for", "60", "minutes", "to", "capture", "nascent", "RNA", "synthesis", ".", "Scale", "bars", "10μm", ".", "(", "H", ")", "The", "EU", "incorporation", "in", "MCF", "-", "7", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "KO", "cells", "was", "quantified", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "Values", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "I", ")", "Representative", "images", "of", "immunofluorescence", "of", "DMSO", "or", "TPI", "treated", "(", "50nm", ")", "MCF7", "cells", "labelled", "with", "EU", "for", "60", "minutes", "was", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "40µm", ".", "(", "J", ")", "The", "EU", "incorporation", "in", "MCF7", "cells", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPI", "was", "quantified", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "Values", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative super-resolution images of MCF7 cells immunostained with SHP-1 in combination with CDK9, total RNA Polymerse II, RNA polymerase II Ser2P, and RNA Polymerase II Ser5P. Scale bar: 5µm. Fluorescence intensities along the line drawn in a representative section of cell were obtained using Zen software and the co-localization plots were made using GraphPad.(B) Co-localization of SHP-1 with CDK9, total RNA Polymerase II, RNA Polymerase II S2P, and RNA Polymerase II S5P was measured by Pearson correlation coefficient using ImageJ. Values presented as the mean ± SD, n=10 (from three independent experiments). ***p value < 0.001. (One-way ANOVA).(C) Endogenous interaction of SHP-1 with RNA Polymerase II, RNA polymerase II Ser2P, and RNA Polymerase II Ser5P and CDK9 was detected by immunoblotting after performing immunoprecipitation with either IgG or SHP-1 antibody using TurboNuclease treated cell lysate.(D) Nuclear extracts of MCF-7 WT and SHP-1 knockout cells were made and the levels of RNA Polymerase II, RNA Polymerase II Ser2P and RNA Polymerase II Ser5P were detected by immunoblotting using specific antibodies.(E) Nuclear extracts of cells treated with either DMSO or SHP-1 inhibitor TPI (50nm) were used to detect total RNA Polymerase II and its modifications by immunoblotting using specific antibodies.(F) Nuclear extracts of MCF-7 WT and SHP-1 knockout cells transfected with Myc vector, H2B Y121F or H2B Y121D constructs were made and the levels of RNA Polymerase II, RNA Polymerase II Ser2P, RNA Polymerase II Ser5P and Lamin B1 were detected by immunoblotting using specific antibodies.(G) Immunofluorescence of WT or SHP-1 knockout MCF7 cells labelled with the 5-Ethynyl Uridine (EU) for 60 minutes to capture nascent RNA synthesis. Scale bars 10μm. (H) The EU incorporation in MCF-7 WT and SHP-1 KO cells was quantified in three independent experiments. Values presented as the mean ± SD, ***indicates p<0.001 (One-way ANOVA).(I) Representative images of immunofluorescence of DMSO or TPI treated (50nm) MCF7 cells labelled with EU for 60 minutes was shown. Scale bar: 40µm. (J) The EU incorporation in MCF7 cells treated with DMSO or TPI was quantified in three independent experiments. Values presented as the mean ± SD, ***indicates p<0.001 (One-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "C", ",", "D", ")", "MCF", "-", "7", "WT", "cells", "along", "with", "SHP", "-", "1", "KO", "cells", "transfected", "with", "either", "vector", ",", "H2B", "Y121F", "or", "H2B", "Y121D", "mutant", "were", "used", "for", "ChIP", "q", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "H2BUb", "at", "indicated", "genes", ".", "The", "data", "shown", "is", "derived", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(C, D) MCF-7 WT cells along with SHP-1 KO cells transfected with either vector, H2B Y121F or H2B Y121D mutant were used for ChIP q-PCR analysis of the H2BUb at indicated genes. The data shown is derived from two independent experiments. Error bars indicate the mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Lysates", "of", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "knockout", "MCF7", "cells", "were", "made", "and", "the", "levels", "of", "LC3", "-", "I", "and", "II", "were", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ")", "Levels", "of", "LC3", "II", "were", "normalized", "against", "total", "LC3", "(", "LC3", "I", "+", "LC3", "II", ")", ".", "The", "data", "shown", "is", "derived", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "Representative", "super", "-", "resolution", "images", "of", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "KO", "MCF7", "cells", "immunostained", "with", "LC3", "antibody", ",", "(", "Scale", "bar", ":", "5µm", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "LC3", "puncta", "accumulation", "per", "cell", "done", "by", "using", "ImageJ", "was", "shown", ".", "Bars", "represents", "mean", "±", "SD", ".", "(", "N", "=", "60", ")", "*", "*", "*", "p", "value", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "E", ")", "WT", "along", "with", "SHP", "-", "1", "KO", "MCF7", "cells", "transfected", "with", "either", "Myc", "vector", ",", "Myc", "SHP", "-", "1", "or", "Myc", "SHP", "-", "1", "NLS", "mutant", "were", "lysed", ".", "Levels", "of", "LC3", "and", "actin", "were", "determined", "using", "specific", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "knockout", "MCF7", "cells", "transfected", "with", "the", "Myc", "vector", "or", "Myc", "-", "tagged", "H2B", ",", "H2B", "Y121F", "or", "H2B", "Y121D", "constructs", "were", "immunostained", "with", "endogenous", "p62", "and", "Myc", "antibody", ".", "Image", "acquisition", "was", "done", "using", "LSM", "700", ",", "(", "Scale", "bar", ":", "20µm", ")", ".", "(", "G", ")", "Accumulation", "of", "p62", "was", "quantified", "by", "counting", "p62", "positive", "puncta", "per", "cell", ".", "(", "N", "=", "25", ")", ";", "values", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "value", "<", "0", ".", "001", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "H", ")", "Representative", "super", "-", "resolution", "images", "of", "LC3", "and", "LAMP2", "immunostaining", "in", "WT", "and", "SHP", "-", "1", "KO", "MCF7", "cells", ".", "(", "Scale", "bar", ":", "20", "µm", "for", "merge", "&", "5", "µm", "for", "Zoom", ")", ".", "(", "I", ")", "LC3", "puncta", "co", "-", "localizing", "with", "LAMP2", "per", "cell", "were", "quantified", "using", "ImageJ", ".", "(", "N", "=", "45", ")", ";", "values", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "value", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Lysates of WT and SHP-1 knockout MCF7 cells were made and the levels of LC3-I and II were detected by immunoblotting. (B) Levels of LC3 II were normalized against total LC3 (LC3 I+LC3 II). The data shown is derived from three independent experiments. Error bars indicate the mean ± SD. *p value < 0.05, Student's t-test.(C) Representative super- resolution images of WT and SHP-1 KO MCF7 cells immunostained with LC3 antibody, (Scale bar: 5µm). (D) Quantification of LC3 puncta accumulation per cell done by using ImageJ was shown. Bars represents mean ± SD.(N=60) ***p value < 0.001, Student's t-test.(E) WT along with SHP-1 KO MCF7 cells transfected with either Myc vector, Myc SHP-1 or Myc SHP-1 NLS mutant were lysed. Levels of LC3 and actin were determined using specific antibodies.(F) WT and SHP-1 knockout MCF7 cells transfected with the Myc vector or Myc-tagged H2B, H2B Y121F or H2B Y121D constructs were immunostained with endogenous p62 and Myc antibody. Image acquisition was done using LSM 700, (Scale bar: 20µm). (G) Accumulation of p62 was quantified by counting p62 positive puncta per cell. (N= 25); values presented as the mean ± SD. ***p value < 0.001 (One-way ANOVA).(H) Representative super-resolution images of LC3 and LAMP2 immunostaining in WT and SHP-1 KO MCF7 cells. (Scale bar: 20 µm for merge & 5 µm for Zoom). (I) LC3 puncta co-localizing with LAMP2 per cell were quantified using ImageJ. (N=45); values presented as the mean ± SD. ***p value < 0.001, Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "B", "Chromatin", "accessibility", "as", "measured", "by", "the", "number", "of", "all", "(", "TSS", "and", "distal", ")", "ATAC", "-", "Seq", "peaks", "(", "read", "count", "≥", "10", ")", "detected", "in", "DN2", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "DN3", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "ISP", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "DPCD3", "-", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "DPCD3", "+", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "SPCD4", "+", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "SPCD8", "+", "(", "n", "=", "5", ")", "populations", ".", "Horizontal", "lines", "of", "the", "box", "plot", "indicate", "the", "median", ",", "lower", "and", "upper", "limits", "of", "each", "box", "correspond", "to", "the", "first", "and", "third", "quartiles", "(", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "and", "the", "lower", "and", "upper", "whiskers", "extend", "from", "min", "to", "max", ";", "pval", "=", "0", ".", "035", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "Test", ")", ".", "C", "Fraction", "of", "OCRs", "having", "increasing", ",", "decreasing", ",", "steady", "and", "fluctuating", "accessibility", "pattern", "during", "T", "-", "cell", "development", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "Average", "number", "of", "normalized", "reads", "in", "OCRs", "(", "y", "-", "axis", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 B Chromatin accessibility as measured by the number of all (TSS and distal) ATAC-Seq peaks (read count ≥10) detected in DN2 (n=5), DN3 (n=5), ISP (n=5), DPCD3- (n=6), DPCD3+ (n=6), SPCD4+ (n=5), SPCD8+ (n=5) populations. Horizontal lines of the box plot indicate the median, lower and upper limits of each box correspond to the first and third quartiles (the 25th and 75th percentiles) and the lower and upper whiskers extend from min to max; pval=0.035 (Kruskal-Wallis Test). C Fraction of OCRs having increasing, decreasing, steady and fluctuating accessibility pattern during T-cell development (x-axis). Average number of normalized reads in OCRs (y-axis)."}
{"words": ["Figure", "2", "A", "Unsupervised", "hierarchical", "clustering", "based", "on", "the", "variance", "stabilizing", "transformation", "(", "VST", ")", "normalized", "read", "counts", "(", "each", "row", "is", "also", "normalized", "by", "the", "row", "mean", ")", "of", "the", "2", ",", "021", "signature", "open", "chromatin", "regions", "of", "7", "stages", "B", "ATAC", "-", "Seq", "genome", "tracks", "showing", "three", "signature", "peaks", "located", "near", "the", "genes", "SAE1", ",", "RAG1", ",", "and", "CD8A", ".", "Framed", "regions", "indicate", "cell", "-", "type", "-", "specific", "signature", "ATAC", "-", "Seq", "peaks", ".", "Blue", "triangles", "indicate", "known", "promoter", "or", "enhancer", "regions", ",", "which", "are", "annotated", "in", "the", "GeneHancer", "(", "GH", ")", "Regulatory", "Elements", "database"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 A Unsupervised hierarchical clustering based on the variance stabilizing transformation (VST) normalized read counts (each row is also normalized by the row mean) of the 2,021 signature open chromatin regions of 7 stages  B ATAC-Seq genome tracks showing three signature peaks located near the genes SAE1, RAG1, and CD8A. Framed regions indicate cell-type-specific signature ATAC-Seq peaks. Blue triangles indicate known promoter or enhancer regions, which are annotated in the GeneHancer (GH) Regulatory Elements database "}
{"words": ["Figure", "3A", "The", "rationale", "of", "footprinting", "analysis", "as", "illustrated", "by", "actual", "ATAC", "-", "Seq", "peaks", ",", "HINT", "-", "ATAC", "footprint", "hits", ",", "and", "example", "TF", "motif", "instances", "near", "RAG1", "gene", "in", "DN2", "population", "of", "thymus", "donor", "6", ".", "B", "Heatmap", "of", "ln", "(", "odds", "ratio", ")", "of", "the", "50", "TFs", "showing", "the", "most", "differential", "abundance", "of", "binding", "motifs", "in", "the", "open", "chromatin", "regions", ".", "TFs", "with", "an", "SD", "of", "the", "motif", "counts", "<", "10", "are", "excluded", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A The rationale of footprinting analysis as illustrated by actual ATAC-Seq peaks, HINT-ATAC footprint hits, and example TF motif instances near RAG1 gene in DN2 population of thymus donor 6.B Heatmap of ln(odds ratio) of the 50 TFs showing the most differential abundance of binding motifs in the open chromatin regions. TFs with an SD of the motif counts <10 are excluded."}
{"words": ["Figure", "4", "D", "Chromatin", "accessibility", "as", "assessed", "by", "the", "number", "of", "ATAC", "peaks", "identified", "in", "the", "sorted", "populations", "of", "normal", "thymic", "T", "-", "cell", "precursors", "and", "in", "T", "-", "ALLs", ",", "respectively", "(", "n", "=", "10", "/", "19", "patients", "have", "two", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "9", "/", "19", "patients", "have", "one", "replicate", ")", ".", "Horizontal", "lines", "of", "the", "box", "plot", "indicate", "the", "median", ",", "lower", "and", "upper", "limits", "of", "each", "box", "correspond", "to", "the", "first", "and", "third", "quartiles", "(", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "and", "the", "lower", "and", "upper", "whiskers", "extend", "from", "min", "to", "max", ";", "pval", "=", "4", ".", "4e", "-", "08", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "Test", ")", ".", "E", "Heatmap", "representing", "the", "enrichment", "and", "depletion", "of", "binding", "motifs", "of", "top", "50", "TFs", "in", "OCRs", "of", "T", "-", "ALLs", "in", "comparison", "to", "healthy", "T", "-", "cell", "precursors", ".", "Patients", "on", "the", "x", "-", "axis", ";", "same", "order", "as", "in", "panel", "(", "C", ")", ".", "Gray", "cells", "represent", "TFs", "having", "non", "-", "significant", "enrichment", "or", "depletion", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 D Chromatin accessibility as assessed by the number of ATAC peaks identified in the sorted populations of normal thymic T-cell precursors and in T-ALLs, respectively (n=10/19 patients have two biological replicates, n=9/19 patients have one replicate). Horizontal lines of the box plot indicate the median, lower and upper limits of each box correspond to the first and third quartiles (the 25th and 75th percentiles) and the lower and upper whiskers extend from min to max; pval=4.4e-08 (Kruskal-Wallis Test).  E Heatmap representing the enrichment and depletion of binding motifs of top 50 TFs in OCRs of T-ALLs in comparison to healthy T-cell precursors. Patients on the x-axis; same order as in panel (C). Gray cells represent TFs having non-significant enrichment or depletion. "}
{"words": ["Figure", "5", "C", "log2", "fold", "changes", "of", "292", "genes", "which", "are", "differentially", "expressed", "(", "x", "-", "axis", ",", "RNA", "-", "Seq", ":", "non", "-", "sorted", "bulk", "thymi", "vs", ".", "T", "-", "ALLs", ")", "and", "differentially", "accessible", "(", "y", "-", "axis", ",", "ATAC", "-", "Seq", ":", "sorted", "T", "-", "cell", "populations", "vs", ".", "T", "-", "ALLs", ")", "in", "T", "-", "ALLs", "in", "comparison", "to", "healthy", "T", "-", "cell", "precursors", ".", "Dot", "size", "and", "color", "indicate", "the", "frequency", "(", "number", "of", "patients", "having", "dysregulation", "of", "the", "gene", ")", ".", "Genes", "with", "≥", "5", "/", "19", "frequency", "are", "shown", "on", "the", "plot", ".", "Protein", "coding", "genes", "with", "≥", "12", "/", "19", "frequency", "are", "labelled", ".", "For", "plotting", "the", "average", "LFC", "values", "of", "ATAC", "and", "RNA", "are", "used", "per", "gene", "per", "quartile", ".", "Q1", "-", "4", "stands", "for", "the", "quadrant", "1", "-", "4", ".", "D", "Heatmap", "of", "VST", "normalized", "read", "counts", "(", "each", "row", "is", "also", "normalized", "by", "the", "row", "mean", ")", "of", "differentially", "expressed", "genes", "(", "pval", "<", "0", ".", "1", ";", "DESeq2", ")", "in", "three", "patients", "in", "comparison", "to", "remaining", "16", ".", "Orange", "triangles", "indicate", "three", "patients", "with", "no", "DAB1", "but", "high", "SPI1", "expression", "and", "motif", "counts", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 C log2 fold changes of 292 genes which are differentially expressed (x-axis, RNA-Seq: non-sorted bulk thymi vs. T-ALLs) and differentially accessible (y-axis, ATAC-Seq: sorted T-cell populations vs. T-ALLs) in T-ALLs in comparison to healthy T-cell precursors. Dot size and color indicate the frequency (number of patients having dysregulation of the gene). Genes with ≥5/19 frequency are shown on the plot. Protein coding genes with ≥12/19 frequency are labelled. For plotting the average LFC values of ATAC and RNA are used per gene per quartile. Q1 - 4 stands for the quadrant 1 - 4. D Heatmap of VST normalized read counts (each row is also normalized by the row mean) of differentially expressed genes (pval<0.1; DESeq2) in three patients in comparison to remaining 16. Orange triangles indicate three patients with no DAB1 but high SPI1 expression and motif counts."}
{"words": ["Figure", "1Levels", "of", "differential", "free", "amino", "acids", "in", "MERRF", "patients", "'", "muscle", "(", "B", ")", "by", "LC", "-", "MS", "analysis", ",", "expressed", "relative", "to", "CTL", ".", "In", "panels", "the", "dashed", "line", "indicates", "the", "Mean", "CTL", "value", "set", "at", "1", ".", "In", "panels", "B", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", ".", "Muscle", ":", "MERRF", "(", "n", "=", "10", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "15", ")", "(", "H", ")", "Western", "blots", "of", "muscle", "lysates", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "OGDH", ",", "ALT2", ",", "α", "-", "actin", ",", "and", "GOT2", "(", "top", "panel", ")", ",", "ALT1", "and", "GAPDH", "(", "middle", "panel", ")", ",", "GOT1", "and", "GAPDH", "(", "bottom", "panel", ")", ",", "C", "(", "CTL", ")", ",", "M", "(", "MERRF", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Levels of differential free amino acids in MERRF patients' muscle (B) by LC-MS analysis, expressed relative to CTL. In panels the dashed line indicates the Mean CTL value set at 1. In panels B data are presented as Mean ± SEM. Muscle: MERRF (n=10), CTL (n=15)(H) Western blots of muscle lysates separated by denaturing SDS-PAGE and probed for OGDH, ALT2, α-actin, and GOT2 (top panel), ALT1 and GAPDH (middle panel), GOT1 and GAPDH (bottom panel), C (CTL), M (MERRF)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "V", ")", "Age", "-", "dependent", "muscle", "protein", "levels", "of", "ALT2", "(", "A", ")", ",", "GOT2", "(", "C", ")", ",", "OGDH", "(", "E", ")", ",", "GOT1", "(", "G", ")", ",", "ALT1", "(", "I", ")", ",", "AGC1", "(", "K", ")", ",", "SUCLA2", "(", "M", ")", ",", "BCAT2", "(", "O", ")", ",", "BCKDH", "(", "Q", ")", ",", "PCCA", "(", "S", ")", ",", "and", "MUT", "(", "U", ")", ",", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", ",", "in", "COX10", "KO", "expressed", "relative", "to", "same", "age", "CTL", "set", "at", "1", ".", "Representative", "western", "blots", "of", "muscle", "lysates", "from", "170", "-", "200", "days", "old", "mice", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "ALT2", "(", "B", ")", ",", "GOT2", "(", "D", ")", ",", "OGDH", "(", "F", ")", ",", "GOT1", "(", "H", ")", ",", "ALT1", "(", "J", ")", ",", "AGC1", "(", "L", ")", ",", "SUCLA2", "(", "N", ")", ",", "BCAT2", "(", "P", ")", ",", "BCKDHB", "(", "R", ")", ",", "PCCA", "(", "T", ")", ",", "and", "MUT", "(", "V", ")", "and", "GAPDH", "(", "B", ",", "D", ",", "F", ",", "H", ",", "J", ",", "L", ",", "N", ",", "P", ",", "R", ",", "T", ",", "V", ")", ".", ":", "In", "panels", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Statistically", "significant", "differences", "between", "the", "two", "groups", "were", "estimated", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "005", "COX10", "KO", "vs", "CTL", ".", "(", "X", ")", "Muscle", "fractional", "incorporation", "of", "M", "+", "6", "of", "glutamate", ",", "M", "+", "5", "of", "αKG", ",", "M", "+", "4", "of", "fumarate", ",", "M", "+", "4", "of", "malate", ",", "M", "+", "3", "of", "alanine", "and", "M", "+", "3", "of", "lactate", ",", "in", "200", "days", "COX10", "KO", "and", "CTL", "mice", "IP", "injected", "with", "[", "13C5", ",", "15N", "]", "-", "glutamate", ".", "In", "panels", "X", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", ".", "In", "panel", "X", ",", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Statistically", "significant", "differences", "between", "the", "two", "groups", "were", "estimated", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "005", "COX10", "KO", "vs", "CTL", ".", "(", "Z", ")", "Muscle", "fractional", "incorporation", "of", "M", "+", "6", "of", "valine", ",", "M", "+", "5", "of", "α", "-", "KIV", ",", "M", "+", "4", "of", "β", "-", "ΗΙΒ", ",", "M", "+", "3", "of", "propionyl", "carnitine", ",", "in", "200", "days", "COX10", "KO", "and", "CTL", "mice", "IP", "injected", "with", "[", "13C5", ",", "15N", "]", "-", "valine", ".", "In", "panels", "Z", ",", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", ".", "In", "panel", "Z", ",", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistically", "significant", "differences", "between", "the", "two", "groups", "were", "estimated", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "005", "COX10", "KO", "vs", "CTL", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-V) Age-dependent muscle protein levels of ALT2 (A), GOT2 (C), OGDH (E), GOT1 (G), ALT1 (I), AGC1 (K), SUCLA2 (M), BCAT2 (O), BCKDH (Q), PCCA (S), and MUT (U), estimated by band densitometry normalized by GAPDH, in COX10 KO expressed relative to same age CTL set at 1. Representative western blots of muscle lysates from 170-200 days old mice separated by denaturing SDS-PAGE and probed for ALT2 (B), GOT2 (D), OGDH (F), GOT1 (H), ALT1 (J), AGC1 (L), SUCLA2 (N), BCAT2 (P), BCKDHB (R), PCCA (T), and MUT (V) and GAPDH (B, D, F, H, J, L, N, P, R, T, V). : In panels data are presented as Mean ± SD. COX10 KO (n=4), CTL (n=4). Statistically significant differences between the two groups were estimated by unpaired two-tailed Student's test. *, p<0.05 **, p<0.005 COX10 KO vs CTL.(X) Muscle fractional incorporation of M+6 of glutamate, M+5 of αKG, M+4 of fumarate, M+4 of malate, M+3 of alanine and M+3 of lactate, in 200 days COX10 KO and CTL mice IP injected with [13C5, 15N]-glutamate. In panels X data are presented as Mean ± SEM. In panel X, COX10 KO (n=4), CTL (n=4). Statistically significant differences between the two groups were estimated by unpaired two-tailed Student's test. *, p<0.05 **, p<0.005 COX10 KO vs CTL.(Z) Muscle fractional incorporation of M+6 of valine, M+5 of α-KIV, M+4 of β-ΗΙΒ, M+3 of propionyl carnitine, in 200 days COX10 KO and CTL mice IP injected with [13C5, 15N]-valine. In panels Z, data are presented as Mean ± SEM. In panel Z, COX10 KO (n=3), CTL (n=3). Statistically significant differences between the two groups were estimated by unpaired two-tailed Student's test. *, p<0.05 **, p<0.005 COX10 KO vs CTL."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Age", "-", "dependent", "Ph", "-", "4EBP1", "/", "4E", "-", "BP1", "ratio", "in", "COX10", "KO", "expressed", "relative", "to", "same", "age", "CTL", "set", "at", "1", ".", "(", "C", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "muscle", "lysates", "from", "200", "days", "old", "mice", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "Ph", "-", "4E", "-", "BP1", "and", "for", "4E", "-", "BP1", ".", "In", "panels", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "same", "age", "CTL", ".", "(", "D", ")", "Age", "-", "dependent", "protein", "levels", "of", "Ph", "-", "4E", "-", "BP1", "in", "COX10", "KO", "muscle", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", "expressed", "relative", "to", "50", "days", "COX10", "KO", "set", "at", "1", ".", "(", "E", ")", "Western", "blots", "of", "muscle", "lysates", "from", "50", ",", "100", ",", "and", "200", "days", "old", "COX10", "KO", "mice", ",", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "Ph", "-", "4E", "-", "BP1", "and", "GAPDH", ".", "In", "panel", "D", ",", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "COX10", "KO", "at", "different", "ages", ".", "50d", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "100d", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "200d", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Age", "-", "dependent", "protein", "levels", "of", "SESTRIN", "2", "(", "F", ")", ",", "REDD1", "(", "H", ")", ",", "LC3II", "(", "J", ")", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", ",", "in", "COX10", "KO", "expressed", "relative", "to", "same", "age", "CTL", "set", "at", "1", ".", "Representative", "western", "blot", "of", "muscle", "lysates", "from", "100", "and", "170", "-", "200", "days", "old", "mice", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "SESTRIN", "2", "(", "G", ")", ",", "REDD1", "(", "I", ")", ",", "LC3II", "(", "K", ")", "In", "panels", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "same", "age", "CTL", ".", "Age", "-", "dependent", "protein", "levels", "of", "MURF1", "(", "L", ")", ",", "and", "ATROGIN1", "(", "N", ")", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", ",", "in", "COX10", "KO", "expressed", "relative", "to", "same", "age", "CTL", "set", "at", "1", ".", "Representative", "western", "blot", "of", "muscle", "lysates", "from", "100", "and", "170", "-", "200", "days", "old", "mice", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "(", "M", ")", ",", "ATROGIN1", "(", "O", ")", ",", "and", "GAPDH", "In", "panels", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "same", "age", "CTL", ".", "(", "P", ")", "Ph", "-", "4EBP1", "/", "4E", "-", "BP1", "ratio", "and", "SESTRIN", "2", "protein", "levels", "normalized", "by", "α", "-", "actin", ",", "estimated", "by", "band", "densitometry", ",", "in", "MERRF", "muscle", "expressed", "relative", "to", "CTL", "muscle", "set", "at", "1", ".", "(", "Q", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "MERRF", "and", "CTL", "muscle", "lysates", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "Ph", "-", "4EBP1", ",", "4EBP1", ",", "SESTRIN", "2", ",", "and", "α", "-", "actin", ".", "In", "panel", "P", ",", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "MERRF", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "MERRF", "vs", ".", "CTL", ".", "Statistically", "significant", "differences", "between", "the", "two", "groups", "for", "all", "panels", "were", "estimated", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Age-dependent Ph-4EBP1/4E-BP1 ratio in COX10 KO expressed relative to same age CTL set at 1. (C) Representative western blot of muscle lysates from 200 days old mice separated by denaturing SDS-PAGE and probed for Ph-4E-BP1 and for 4E-BP1. In panels data are presented as Mean ± SD. COX10 KO (n=4), CTL (n=4). *, p<0.05 COX10 KO vs. same age CTL.(D) Age-dependent protein levels of Ph-4E-BP1 in COX10 KO muscle estimated by band densitometry normalized by GAPDH expressed relative to 50 days COX10 KO set at 1. (E) Western blots of muscle lysates from 50, 100, and 200 days old COX10 KO mice, separated by denaturing SDS-PAGE and probed for Ph-4E-BP1 and GAPDH. In panel D, data are presented as Mean ± SD. #, p<0.05 COX10 KO vs. COX10 KO at different ages. 50d (n=3), 100d (n=3), 200d (n=3).Age-dependent protein levels of SESTRIN 2 (F), REDD1 (H), LC3II (J) estimated by band densitometry normalized by GAPDH, in COX10 KO expressed relative to same age CTL set at 1. Representative western blot of muscle lysates from 100 and 170-200 days old mice separated by denaturing SDS-PAGE and probed for SESTRIN 2 (G), REDD1 (I), LC3II (K) In panels data are presented as Mean ± SD. COX10 KO (n=4), CTL (n=4). *, p<0.05 COX10 KO vs. same age CTL.Age-dependent protein levels of MURF1 (L), and ATROGIN1 (N) estimated by band densitometry normalized by GAPDH, in COX10 KO expressed relative to same age CTL set at 1. Representative western blot of muscle lysates from 100 and 170-200 days old mice separated by denaturing SDS-PAGE and probed for (M), ATROGIN1 (O), and GAPDH In panels data are presented as Mean ± SD. COX10 KO (n=4), CTL (n=4). *, p<0.05 COX10 KO vs. same age CTL.(P) Ph-4EBP1/4E-BP1 ratio and SESTRIN 2 protein levels normalized by α-actin, estimated by band densitometry, in MERRF muscle expressed relative to CTL muscle set at 1. (Q) Representative western blot of MERRF and CTL muscle lysates separated by denaturing SDS-PAGE and probed for Ph-4EBP1, 4EBP1, SESTRIN 2, and α-actin. In panel P, data are presented as Mean ± SD. MERRF (n=4), CTL (n=4). *, p<0.05 MERRF vs. CTL. Statistically significant differences between the two groups for all panels were estimated by unpaired two-tailed Student's test."}
{"words": ["Figure", "4Age", "-", "dependent", "levels", "of", "ATF4", "(", "B", ")", ",", "MTHFD2", "(", "D", ")", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", ",", "in", "COX10", "KO", "expressed", "relative", "to", "same", "age", "CTL", "set", "at", "1", ".", "Representative", "western", "blot", "of", "muscle", "lysates", "from", "200", "days", "old", "mice", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "ATF4", "(", "C", ")", ",", "MTHFD2", "(", "E", ")", "and", "GAPDH", "In", "panels", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "same", "age", "CTL", ".", "For", "each", "age", ",", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "-", "4", ")", ".", "Age", "-", "dependent", "levels", "of", "ASNS", "(", "F", ")", ",", "and", "HSP60", "(", "H", ")", ",", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", ",", "in", "COX10", "KO", "expressed", "relative", "to", "same", "age", "CTL", "set", "at", "1", ".", "Representative", "western", "blot", "of", "muscle", "lysates", "from", "200", "days", "old", "mice", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "ASNS", "(", "G", ")", ",", "and", "HSP60", "(", "I", ")", "and", "GAPDH", "In", "panels", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "same", "age", "CTL", ".", "For", "each", "age", ",", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "-", "4", ")", ".", "(", "N", ")", "Levels", "of", "metabolites", "of", "trans", "-", "sulfuration", "pathway", "by", "LC", "-", "MS", "analysis", "in", "MERRF", "muscle", "and", "plasma", "expressed", "relative", "to", "CTL", "muscle", "and", "plasma", ".", "α", "-", "HB", ",", "α", "-", "hydroxybutyrate", ";", "GSH", ",", "glutathione", ".", "In", "panel", "N", ",", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", ".", "Muscle", ":", "MERRF", "(", "n", "=", "10", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "15", ")", ".", "Plasma", ":", "MERRF", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "25", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "MERRF", "vs", ".", "CTL", ".", "Statistically", "significant", "differences", "between", "the", "two", "groups", "for", "all", "panels", "were", "estimated", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Age-dependent levels of ATF4 (B), MTHFD2 (D) estimated by band densitometry normalized by GAPDH, in COX10 KO expressed relative to same age CTL set at 1. Representative western blot of muscle lysates from 200 days old mice separated by denaturing SDS-PAGE and probed for ATF4 (C), MTHFD2 (E) and GAPDH In panels data are presented as Mean ± SD. *, p<0.05 COX10 KO vs. same age CTL. For each age, COX10 KO (n=4), CTL (n-4).Age-dependent levels of ASNS (F), and HSP60 (H), estimated by band densitometry normalized by GAPDH, in COX10 KO expressed relative to same age CTL set at 1. Representative western blot of muscle lysates from 200 days old mice separated by denaturing SDS-PAGE and probed for ASNS (G), and HSP60 (I) and GAPDH In panels data are presented as Mean ± SD. *, p<0.05 COX10 KO vs. same age CTL. For each age, COX10 KO (n=4), CTL (n-4).(N) Levels of metabolites of trans-sulfuration pathway by LC-MS analysis in MERRF muscle and plasma expressed relative to CTL muscle and plasma. α-HB, α-hydroxybutyrate; GSH, glutathione. In panel N, data are presented as Mean ± SEM. Muscle: MERRF (n=10), CTL (n=15). Plasma: MERRF (n=9), CTL (n=25). * p<0.05 MERRF vs. CTL. Statistically significant differences between the two groups for all panels were estimated by unpaired two-tailed Student's test."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", "-", "I", ")", "Age", "-", "dependent", "levels", "of", "HADH", "(", "D", ")", ",", "ACOT2", "(", "F", ")", ",", "and", "ACOT9", "(", "H", ")", ",", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", ",", "in", "COX10", "KO", "expressed", "relative", "to", "same", "age", "CTL", "set", "at", "1", ".", "Representative", "western", "blot", "of", "muscle", "lysates", "from", "200", "days", "old", "mice", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "HADH", "(", "E", ")", ",", "ACOT2", "(", "G", ")", ",", "ACOT9", "(", "I", ")", ",", "and", "GAPDH", "(", "E", ",", "G", ",", "I", ")", ".", "In", "panels", ",", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "same", "age", "CTL", ".", "(", "K", ",", "L", ")", "Levels", "of", "acylcarnitine", ",", "3", "-", "OH", "acylcarnitine", ",", "fatty", "acid", "and", "3", "-", "OH", "fatty", "acid", "in", "MERRF", "muscle", "(", "K", ")", "and", "plasma", "(", "L", ")", "by", "LC", "-", "MS", "analysis", ",", "expressed", "relative", "to", "CTL", ".", "In", "panels", "data", "by", "LC", "-", "MS", "analysis", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", ".", "In", "panels", "A", "and", "C", ",", "50", ",", "100", ",", "200d", ":", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "same", "age", "CTL", ".", "In", "panels", "K", "and", "L", ",", "muscle", ":", "MERRF", "(", "n", "=", "10", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "15", ")", ";", "plasma", ":", "MERRF", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "25", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "MERRF", "vs", ".", "CTL", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D-I) Age-dependent levels of HADH (D), ACOT2 (F), and ACOT9 (H), estimated by band densitometry normalized by GAPDH, in COX10 KO expressed relative to same age CTL set at 1. Representative western blot of muscle lysates from 200 days old mice separated by denaturing SDS-PAGE and probed for HADH (E), ACOT2 (G), ACOT9 (I), and GAPDH (E, G, I). In panels , data are presented as Mean ± SD. COX10 KO (n=4), CTL (n=4). *, p<0.05 COX10 KO vs. same age CTL.(K, L) Levels of acylcarnitine, 3-OH acylcarnitine, fatty acid and 3-OH fatty acid in MERRF muscle (K) and plasma (L) by LC-MS analysis, expressed relative to CTL. In panels data by LC-MS analysis are presented as Mean ± SEM. In panels A and C, 50, 100, 200d: COX10 KO (n=6), CTL (n=6). *, p<0.05 COX10 KO vs. same age CTL. In panels K and L, muscle: MERRF (n=10), CTL (n=15); plasma: MERRF (n=9), CTL (n=25). *, p<0.05 MERRF vs. CTL."}
{"words": ["Figure", "6Age", "-", "dependent", "muscle", "protein", "levels", "of", "P5CS", "(", "B", ")", ",", "PYCR1", "(", "D", ")", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", ",", "in", "COX10", "KO", "expressed", "relative", "to", "same", "age", "CTL", "set", "at", "1", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "same", "age", "CTL", ".", "Representative", "western", "blots", "of", "muscle", "lysates", "from", "170", "days", "old", "mice", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", "P5CS", "(", "C", ")", ",", "PYCR1", "(", "E", ")", "GAPDH", "In", "panels", "data", "are", "normalized", "to", "same", "age", "CTL", "set", "to", "1", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "50", ",", "100", ",", "200d", ":", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "CTL", ".", "Age", "-", "dependent", "muscle", "protein", "levels", "of", "PYCR2", "(", "F", ")", "OAT", "(", "H", ")", ",", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", ",", "in", "COX10", "KO", "expressed", "relative", "to", "same", "age", "CTL", "set", "at", "1", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "same", "age", "CTL", ".", "Representative", "western", "blots", "of", "muscle", "lysates", "from", "170", "days", "old", "mice", "separated", "by", "denaturing", "SDS", "-", "PAGE", "and", "probed", "for", ",", "PYCR2", "(", "G", ")", ",", "OAT", "(", "I", ")", ",", "and", "GAPDH", ":", "In", "panels", "data", "are", "normalized", "to", "same", "age", "CTL", "set", "to", "1", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "50", ",", "100", ",", "200d", ":", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "CTL", ".", "(", "M", ")", "MERRF", "plasma", "levels", "of", "4", "-", "hydroxyl", "-", "L", "-", "proline", "by", "LC", "-", "MS", "analysis", ",", "expressed", "relative", "to", "CTL", "value", "set", "at", "1", ".", "(", "N", ")", "PYCR1", "protein", "levels", ",", "estimated", "by", "band", "densitometry", "normalized", "by", "GAPDH", ",", "in", "MERRF", "muscle", "expressed", "relative", "to", "CTL", "muscle", ".", "In", "panel", "N", ",", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "MERRF", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "MERRF", "vs", ".", "CTL", ".", "Statistically", "significant", "differences", "between", "the", "two", "groups", "for", "all", "panels", "were", "estimated", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Age-dependent muscle protein levels of P5CS (B), PYCR1 (D) estimated by band densitometry normalized by GAPDH, in COX10 KO expressed relative to same age CTL set at 1. Data are presented as Mean ± SD. *, p<0.05 COX10 KO vs. same age CTL. Representative western blots of muscle lysates from 170 days old mice separated by denaturing SDS-PAGE and probed for P5CS (C), PYCR1 (E) GAPDH In panels data are normalized to same age CTL set to 1. Data are presented as Mean ± SD. 50, 100, 200d: COX10 KO (n=4), CTL (n=4). *, p<0.05 COX10 KO vs. CTL.Age-dependent muscle protein levels of PYCR2 (F) OAT (H), estimated by band densitometry normalized by GAPDH, in COX10 KO expressed relative to same age CTL set at 1. Data are presented as Mean ± SD. *, p<0.05 COX10 KO vs. same age CTL. Representative western blots of muscle lysates from 170 days old mice separated by denaturing SDS-PAGE and probed for , PYCR2 (G), OAT (I), and GAPDH : In panels data are normalized to same age CTL set to 1. Data are presented as Mean ± SD. 50, 100, 200d: COX10 KO (n=4), CTL (n=4). *, p<0.05 COX10 KO vs. CTL.(M) MERRF plasma levels of 4-hydroxyl-L-proline by LC-MS analysis, expressed relative to CTL value set at 1.(N) PYCR1 protein levels, estimated by band densitometry normalized by GAPDH, in MERRF muscle expressed relative to CTL muscle. In panel N, data are presented as Mean ± SD. MERRF (n=4), CTL (n=4). *, p<0.05 MERRF vs. CTL. Statistically significant differences between the two groups for all panels were estimated by unpaired two-tailed Student's test."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "C", ")", "Plasma", "levels", "of", "Leptin", "(", "A", ")", ",", "soluble", "Leptin", "Receptor", "(", "LepR", ")", ",", "(", "B", ")", "and", "Free", "Leptin", "Index", "(", "C", ")", "by", "ELISA", ",", "in", "200", "days", "old", "CTL", "and", "COX10", "KO", "mice", ".", "In", "panels", "A", "-", "C", ",", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "COX10", "KO", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "COX10", "KO", "vs", ".", "CTL", ".", "(", "G", ")", "Levels", "of", "glucocorticoids", "in", "MERRF", "plasma", "by", "LC", "-", "MS", "analysis", ",", "expressed", "relative", "to", "CTL", "value", "set", "at", "1", ".", "In", "panels", "G", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", ".", "MERRF", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "CTL", "(", "n", "=", "25", ")", ".", "(", "N", ")", "Age", "-", "dependent", "grip", "strength", "of", "COX10", "KO", "mice", "treated", "with", "RU", "-", "486", "and", "vehicle", ".", "The", "black", "arrow", "indicates", "the", "beginning", "of", "the", "treatment", "at", "43", "days", ".", "In", "panel", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", ".", "Panel", "N", ":", "KO", "+", "RU486", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "KO", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "P", ")", "Visceral", "fat", "deposits", "of", "COX10", "KO", "mice", "treated", "with", "RU", "-", "486", "and", "vehicle", "at", "100", "days", "of", "age", ".", "In", "panel", "P", ",", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "KO", "+", "RU486", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "KO", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "KO", "+", "RU486", "vs", ".", "KO", ".", "Statistically", "significant", "differences", "between", "the", "two", "groups", "for", "all", "panels", "were", "estimated", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-C) Plasma levels of Leptin (A), soluble Leptin Receptor (LepR), (B) and Free Leptin Index (C) by ELISA, in 200 days old CTL and COX10 KO mice. In panels A-C, data are presented as Mean ± SD. COX10 KO (n=5), CTL (n=5). *, p<0.05 COX10 KO vs. CTL.(G) Levels of glucocorticoids in MERRF plasma by LC-MS analysis, expressed relative to CTL value set at 1. In panels G data are presented as Mean ± SEM. MERRF (n=9), CTL (n=25).(N) Age-dependent grip strength of COX10 KO mice treated with RU-486 and vehicle. The black arrow indicates the beginning of the treatment at 43 days. In panel data are presented as Mean ± SEM. Panel N: KO+RU486 (n=6), KO (n=4).(P) Visceral fat deposits of COX10 KO mice treated with RU-486 and vehicle at 100 days of age. In panel P, data are presented as Mean ± SD. KO+RU486 (n=6), KO (n=6). *, p<0.05 KO+RU486 vs. KO. Statistically significant differences between the two groups for all panels were estimated by unpaired two-tailed Student's test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "GAPC", "enzymatic", "activity", "was", "measured", "in", "wild", "-", "type", "crude", "extracts", "treated", "with", "H2O", "(", "mock", ")", ",", "and", "100", "µM", "of", "Tyr", "-", "Asp", ",", "Tyr", ",", "Asp", ",", "and", "Ile", "-", "Glu", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "The", "enzymatic", "activities", "of", "GAPC", "(", "B", ")", ",", "GAPA", "/", "B", "(", "C", ")", ",", "and", "GAPN", "(", "D", ")", "were", "measured", "in", "the", "wild", "type", "and", "double", "k", ".", "o", ".", "mutant", "gapc1gapc2", "treated", "with", "H2O", "(", "mock", ")", ",", "and", "100", "µM", "of", "Tyr", "-", "Asp", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "(", "A", "-", "D", ";", "four", "technical", "replicates", ")", ",", "significance", "was", "assessed", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) GAPC enzymatic activity was measured in wild-type crude extracts treated with H2O (mock), and 100 µM of Tyr-Asp, Tyr, Asp, and Ile-Glu. (B-D) The enzymatic activities of GAPC (B), GAPA/B (C), and GAPN (D) were measured in the wild type and double k.o. mutant gapc1gapc2 treated with H2O (mock), and 100 µM of Tyr-Asp. Data information: Data are mean ± SEM of n=4 (A-D; four technical replicates) , significance was assessed using unpaired two-tailed Student t-test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Fresh", "weight", "quantification", "of", "Arabidopsis", "and", "tobacco", "seedlings", ".", "Seedlings", "were", "pretreated", "with", "mock", "(", "water", ")", ",", "Tyr", "-", "Asp", "(", "100", "μM", ")", ",", "Tyr", "and", "Asp", "(", "100", "μM", ")", ",", "Ser", "-", "Leu", "(", "100", "μM", ")", ",", "or", "Gly", "-", "Pro", "(", "100", "μM", ")", "for", "1", "h", "prior", "an", "oxidative", "stress", "(", "catechin", "or", "H2O2", ")", ".", "Each", "treatment", "was", "compared", "to", "its", "respective", "control", ",", "corresponding", "to", "plants", "grown", "in", "one", "24", "-", "well", "plate", "(", "represented", "by", "the", "adjoined", "bars", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "10", "-", "12", "(", "seedlings", ")", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "t", "-", "test", "was", "performed", "to", "compare", "treatments", "with", "control", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "cm", ".", "(", "B", ")", "Catechin", "-", "(", "left", "upper", "panel", ")", "and", "(", "catechin", "-", ")", "Tyr", "-", "Asp", "-", "treated", "tobacco", "plants", "(", "right", "upper", "panel", ")", "grown", "for", "four", "days", "in", "liquid", "media", ".", "H2O2", "-", "(", "left", "upper", "panel", ")", "and", "(", "H2O2", "-", ")", "Tyr", "-", "Asp", "-", "treated", "tobacco", "plants", "(", "right", "upper", "panel", ")", "grown", "for", "two", "days", "in", "liquid", "media", ".", "All", "plants", "were", "2", "-", "weeks", "-", "old", "before", "starting", "the", "stress", "treatment", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "10", "-", "12", "(", "seedlings", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Fresh weight quantification of Arabidopsis and tobacco seedlings. Seedlings were pretreated with mock (water), Tyr-Asp (100 μM), Tyr and Asp (100 μM), Ser-Leu (100 μM), or Gly-Pro (100 μM) for 1 h prior an oxidative stress (catechin or H2O2). Each treatment was compared to its respective control, corresponding to plants grown in one 24-well plate (represented by the adjoined bars). Data information: Data are mean ± SEM of n=10-12 (seedlings). Unpaired two-tailed Student t-test was performed to compare treatments with control. Scale bar: 10 cm.(B) Catechin- (left upper panel) and (catechin-) Tyr-Asp-treated tobacco plants (right upper panel) grown for four days in liquid media. H2O2- (left upper panel) and (H2O2-) Tyr-Asp-treated tobacco plants (right upper panel) grown for two days in liquid media. All plants were 2-weeks-old before starting the stress treatment. Data information: Data are mean ± SEM of n=10-12 (seedlings)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "C", ")", "Fresh", "weight", "measurements", "of", "Arabidopsis", "wild", "-", "type", "and", "gapc1", "/", "gapc2", "double", "k", ".", "o", ".", "plants", "subjected", "to", "the", "oxidative", "stress", "(", "e", ".", "g", ".", "catechin", ")", "and", "Tyr", "-", "Asp", "treatments", ".", "Each", "treatment", "was", "compared", "to", "its", "respective", "control", ",", "corresponding", "to", "plants", "grown", "in", "one", "24", "-", "well", "plate", "(", "represented", "by", "the", "adjoined", "bars", ")", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Representative", "Arabidopsis", "wild", "type", "and", "gapc1", "/", "gapc2", "double", "k", ".", "o", ".", "seedlings", "from", "the", "different", "treatments", ".", "All", "plants", "were", "10", "-", "day", "-", "old", "at", "the", "stress", "onset", ".", "The", "seedlings", "were", "exposed", "to", "catechin", "for", "three", "days", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "10", "-", "12", "(", "seedlings", ")", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "t", "-", "test", "was", "performed", "to", "compare", "treatments", "with", "control", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "cm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-C) Fresh weight measurements of Arabidopsis wild-type and gapc1/gapc2 double k.o. plants subjected to the oxidative stress (e.g. catechin) and Tyr-Asp treatments. Each treatment was compared to its respective control, corresponding to plants grown in one 24-well plate (represented by the adjoined bars). (D-F) Representative Arabidopsis wild type and gapc1/gapc2 double k.o. seedlings from the different treatments. All plants were 10-day-old at the stress onset. The seedlings were exposed to catechin for three days. Data information: Data are mean ± SEM of n=10-12 (seedlings). Unpaired two-tailed Student t-test was performed to compare treatments with control. Scale bar: 10 cm. "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "PEPCK", "activity", "was", "measured", "in", "a", "protein", "lysate", "prepared", "from", "3", "-", "week", "-", "old", "Arabidopsis", "leaves", "in", "absence", "(", "control", ",", "C", ")", "or", "presence", "of", "500", "µM", "of", "the", "different", "dipeptides", ".", "Measurements", "were", "performed", "in", "the", "carboxylation", "direction", ",", "as", "described", "in", "the", "Methods", "section", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SE", "of", "4", "independent", "lysate", "preparations", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "t", "-", "tests", "were", "performed", "to", "compare", "dipeptide", "treatments", "with", "the", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) PEPCK activity was measured in a protein lysate prepared from 3-week-old Arabidopsis leaves in absence (control, C) or presence of 500 µM of the different dipeptides. Measurements were performed in the carboxylation direction, as described in the Methods section. Data are mean ± SE of 4 independent lysate preparations. Unpaired two-tailed Student t-tests were performed to compare dipeptide treatments with the control."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Mettl14", "cKO", "leads", "to", "perinatal", "lethality", ".", "Newborn", "cKO", "pups", "are", "smaller", "with", "tight", "and", "shiny", "skin", ".", "(", "B", ")", "Immunohistochemistry", "confirms", "loss", "of", "Mettl14", "expression", "in", "skin", "in", "cKO", "animals", ".", "(", "C", ")", "H", "/", "E", "staining", "of", "newborn", "skin", "sections", "from", "WT", "and", "Mettl14", "cKO", "mice", ".", "(", "D", ")", "Expression", "of", "p63", "in", "skin", "epidermis", "was", "examined", "by", "immunofluorescence", "staining", "in", "WT", "and", "cKO", "mice", ".", "(", "E", ")", "Number", "of", "p63", "-", "positive", "cells", "in", "WT", "and", "cKO", "skin", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "Skin", "stratification", "in", "WT", "and", "cKO", "skin", "was", "determined", "by", "immunofluorescence", "staining", "with", "different", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Krt14", ":", "Keratin", "14", ";", "Krt10", ":", "Keratin", "10", ";", "β4", ":", "β4", "-", "integrin", ";", "DAPI", "for", "nucleus", "staining", ".", "The", "dashed", "line", "denotes", "the", "basement", "membrane", "that", "separates", "dermis", "and", "epidermis", "(", "Epi", ")", ".", "(", "G", ")", "Wound", "healing", "as", "monitored", "by", "wound", "size", "8", "days", "post", "injury", ".", "n", "=", "3", ";", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "(", "standard", "deviation", ")", ".", "H", ")", "Histological", "staining", "of", "skin", "sections", "at", "the", "wound", "edges", ".", "Halves", "of", "wound", "sections", "are", "shown", ".", "Note", "significant", "reduction", "of", "HPE", "(", "hyperproliferative", "epidermis", ")", "in", "cKO", "skin", ".", "Es", ":", "eschar", ".", "Dotted", "lines", "denote", "epidermal", "boundaries", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "Ki67", "-", "positive", "cells", "present", "in", "wound", "HPE", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "open", "circles", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "19", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Mettl14 cKO leads to perinatal lethality. Newborn cKO pups are smaller with tight and shiny skin.(B) Immunohistochemistry confirms loss of Mettl14 expression in skin in cKO animals.(C) H/E staining of newborn skin sections from WT and Mettl14 cKO mice.(D) Expression of p63 in skin epidermis was examined by immunofluorescence staining in WT and cKO mice. (E) Number of p63-positive cells in WT and cKO skin was quantified and shown as box and whisker plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). (F) Skin stratification in WT and cKO skin was determined by immunofluorescence staining with different antibodies as indicated. Krt14: Keratin 14; Krt10: Keratin 10; β4: β4-integrin; DAPI for nucleus staining. The dashed line denotes the basement membrane that separates dermis and epidermis (Epi).(G) Wound healing as monitored by wound size 8 days post injury. n=3; P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D. (standard deviation).H) Histological staining of skin sections at the wound edges. Halves of wound sections are shown. Note significant reduction of HPE (hyperproliferative epidermis) in cKO skin. Es: eschar. Dotted lines denote epidermal boundaries. (I) Quantification of Ki67-positive cells present in wound HPE. The plot indicates the mean (open circles within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=19, P<0.01 (Student's t-test). "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "EdU", "staining", "of", "WT", "or", "Mettl14", "cKO", "skin", "after", "pulse", "-", "chase", "labeling", ".", "Skin", "samples", "were", "counterstained", "with", "antibody", "against", "β4", "-", "integrin", ".", "Note", "reduced", "EdU", "label", "-", "retaining", "cells", "in", "cKO", "skin", "epidermis", ".", "Arrows", "indicate", "Edu", "-", "positive", "cells", ".", "(", "B", ")", "Label", "-", "retaining", "cells", "in", "WT", "or", "Mettl14", "cKO", "skin", "were", "quantified", "and", "shown", "as", "box", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "n", "=", "19", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Number", "of", "holoclones", "derived", "from", "WT", "and", "Mettl14", "cKO", "skin", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "n", "=", "24", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Morphology", "of", "primary", "keratinocytes", "isolated", "from", "WT", "or", "Mettl14", "cKO", "skin", ".", "(", "E", ")", "Expression", "of", "Mettl14", "and", "p63", "in", "WT", "and", "KO", "cells", "was", "determined", "by", "immunoblots", "with", "respective", "antibodies", ".", "Immunoblot", "for", "GAPDH", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "F", ")", "Proliferation", "of", "WT", "and", "Mettl14", "null", "cells", "in", "vitro", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "dot", "plots", ".", "n", "=", "3", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "Day", "6", ",", "9", ",", "and", "12", ",", "and", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "Day", "3", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "CFE", "(", "colony", "formation", "efficiency", ")", "of", "WT", "and", "Mettl14", "null", "cells", "was", "determined", "in", "vitro", ".", "Results", "were", "quantified", "and", "shown", "as", "bar", "graph", "(", "F", ")", ".", "n", "=", "19", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "(", "I", ")", "Fluorescence", "microscopy", "demonstrates", "different", "survival", "capability", "of", "WT", "and", "Mettl14", "inducible", "KO", "cells", "with", "or", "without", "Tamoxifen", "(", "TAM", ")", "treatment", ".", "(", "J", ")", "Ratio", "of", "WT", "and", "Mettl14", "inducible", "KO", "cells", "in", "the", "co", "-", "culture", "model", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "dot", "plots", ".", "n", "=", "8", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "KO", "cells", "with", "TAM", "treatment", "compared", "with", "WT", "cells", "or", "KO", "cells", "without", "TAM", "stimulation", "at", "both", "Day", "7", "and", "14", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) EdU staining of WT or Mettl14 cKO skin after pulse-chase labeling. Skin samples were counterstained with antibody against β4-integrin. Note reduced EdU label-retaining cells in cKO skin epidermis. Arrows indicate Edu-positive cells. (B) Label-retaining cells in WT or Mettl14 cKO skin were quantified and shown as box plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). n=19, P<0.01 (Student's t-test). (C) Number of holoclones derived from WT and Mettl14 cKO skin was quantified and shown as box and whisker plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). n=24, P<0.01 (Student's t-test).(D) Morphology of primary keratinocytes isolated from WT or Mettl14 cKO skin.(E) Expression of Mettl14 and p63 in WT and KO cells was determined by immunoblots with respective antibodies. Immunoblot for GAPDH was used as loading control.(F) Proliferation of WT and Mettl14 null cells in vitro was quantified and shown as dot plots. n=3, P<0.01 (Student's t-test) for Day 6, 9, and 12, and P<0.05 (Student's t-test) for Day 3. Error bar represents S.D.(G-H) CFE (colony formation efficiency) of WT and Mettl14 null cells was determined in vitro. Results were quantified and shown as bar graph (F). n=19, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.(I) Fluorescence microscopy demonstrates different survival capability of WT and Mettl14 inducible KO cells with or without Tamoxifen (TAM) treatment. (J) Ratio of WT and Mettl14 inducible KO cells in the co-culture model was quantified and shown as dot plots. n=8, P<0.01 (Student's t-test) for KO cells with TAM treatment compared with WT cells or KO cells without TAM stimulation at both Day 7 and 14. Error bar represents S.D. "}
{"words": ["Figure", "3B", ")", "Mutations", "in", "the", "predicted", "m6A", "modification", "sites", "can", "significantly", "reduce", "Pvt1", "methylation", ".", "n", "=", "3", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "C", ")", "Deletion", "of", "endogenous", "Pvt1", "by", "an", "inducible", "Cas9", "(", "iCas9", ")", "system", "can", "significantly", "reduce", "Pvt1", "RNA", "level", "(", "quantification", "from", "RT", "-", "PCR", ",", "left", "panel", ")", "and", "MYC", "protein", "level", "(", "quantification", "from", "immunoblot", ",", "right", "panel", ")", "expression", ".", "n", "=", "3", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "D", ")", "CFE", "of", "WT", ",", "Pvt1", "inducible", "KO", ",", "and", "Pvt1", "inducible", "KO", "cells", "rescued", "with", "WT", "or", "mutant", "Pvt1", "was", "quantified", "and", "presented", "as", "bar", "graph", ".", "n", "=", "3", ",", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "E", ")", "Skin", "organoids", "derived", "from", "WT", "or", "Pvt1", "inducible", "KO", "cells", "were", "grafted", "to", "nude", "mice", ".", "The", "regenerated", "skin", "was", "analyzed", "by", "H", "/", "E", "staining", ".", "F", ")", "Epidermal", "thickness", "of", "WT", "and", "Pvt1", "KO", "skin", "grafts", "was", "quantified", "and", "presented", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "n", "=", "18", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", ")", "Number", "of", "p63", "-", "positive", "cells", "in", "WT", "and", "cKO", "skin", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "bar", "graph", ".", "n", "=", "5", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "H", ")", "Fluorescence", "microscopy", "demonstrates", "different", "survival", "capability", "of", "WT", "and", "Pvt1", "inducible", "KO", "cells", "with", "or", "without", "Doxycycline", "(", "Dox", ")", "treatment", ".", "I", ")", "Ratio", "of", "WT", "and", "Pvt1", "inducible", "KO", "cells", "in", "the", "co", "-", "culture", "model", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "dot", "plots", ".", "n", "=", "8", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "KO", "cells", "with", "Dox", "treatment", "compared", "with", "WT", "cells", "or", "KO", "cells", "without", "Dox", "stimulation", "at", "both", "Day", "7", "and", "14", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B) Mutations in the predicted m6A modification sites can significantly reduce Pvt1 methylation.n=3. Error bar represents S.D.C) Deletion of endogenous Pvt1 by an inducible Cas9 (iCas9) system can significantly reduce Pvt1 RNA level (quantification from RT-PCR, left panel) and MYC protein level (quantification from immunoblot, right panel) expression. n=3, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.D) CFE of WT, Pvt1 inducible KO, and Pvt1 inducible KO cells rescued with WT or mutant Pvt1 was quantified and presented as bar graph. n=3, **: P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.E) Skin organoids derived from WT or Pvt1 inducible KO cells were grafted to nude mice. The regenerated skin was analyzed by H/E staining.F) Epidermal thickness of WT and Pvt1 KO skin grafts was quantified and presented as box and whisker plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). n=18, P<0.01 (Student's t-test).G) Number of p63-positive cells in WT and cKO skin was quantified and shown as bar graph. n=5, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.H) Fluorescence microscopy demonstrates different survival capability of WT and Pvt1 inducible KO cells with or without Doxycycline (Dox) treatment.I) Ratio of WT and Pvt1 inducible KO cells in the co-culture model was quantified and shown as dot plots. n=8, P<0.01 (Student's t-test) for KO cells with Dox treatment compared with WT cells or KO cells without Dox stimulation at both Day 7 and 14. Error bar represents S.D."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Interaction", "between", "Pvt1", "and", "MYC", "was", "determined", "by", "immunoprecipitation", "followed", "with", "RT", "-", "PCR", ".", "Note", "significant", "decrease", "in", "Pvt1", "and", "MYC", "interaction", "upon", "FTO", "treatment", "(", "left", "panel", ")", ",", "calcium", "shift", "-", "induced", "differentiation", "(", "middle", "panel", ",", "Hi", ":", "high", "calcium", ")", ",", "and", "Pvt1", "methylation", "site", "mutations", "(", "right", "panel", ")", ".", "n", "=", "3", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "B", ")", "Immunoblots", "show", "decreased", "MYC", "protein", "level", "in", "differentiated", "keratinocytes", "and", "Mettl14", "KO", "cells", ".", "Undifferentiated", "WT", "and", "Mettl14", "KO", "cells", "(", "C", ")", "were", "treated", "with", "cycloheximide", ".", "Cell", "lysates", "were", "collected", "at", "0", ",", "30", ",", "60", ",", "90", ",", "120", ",", "180", ",", "and", "300", "minutes", "post", "treatment", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "different", "antibodies", "as", "indicated", ".", "undifferentiated", "WT", "and", "Pvt1", "KO", "cells", "(", "D", ")", "were", "treated", "with", "cycloheximide", ".", "Cell", "lysates", "were", "collected", "at", "0", ",", "30", ",", "60", ",", "90", ",", "120", ",", "180", ",", "and", "300", "minutes", "post", "treatment", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "different", "antibodies", "as", "indicated", ".", "WT", "cells", "before", "and", "after", "calcium", "shift", "-", "induced", "differentiation", "(", "E", ")", "were", "treated", "with", "cycloheximide", ".", "Cell", "lysates", "were", "collected", "at", "0", ",", "30", ",", "60", ",", "90", ",", "120", ",", "180", ",", "and", "300", "minutes", "post", "treatment", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "different", "antibodies", "as", "indicated", ".", "(", "F", ")", "Skin", "organoids", "derived", "from", "Mettl14", "KO", "cells", "or", "KO", "cells", "rescued", "with", "exogenous", "expression", "of", "MYC", "were", "grafted", "to", "nude", "mice", ".", "The", "regenerated", "skin", "was", "analyzed", "by", "H", "/", "E", "staining", ".", "(", "G", ")", "Epidermal", "thickness", "of", "KO", "and", "KO", "skin", "rescued", "with", "MYC", "expression", "was", "quantified", "and", "presented", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "n", "=", "18", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "H", ")", "Number", "of", "p63", "-", "positive", "cells", "in", "KO", "and", "KO", "skin", "rescued", "with", "MYC", "expression", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "bar", "graph", ".", "n", "=", "5", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "(", "I", ")", "Fluorescence", "microscopy", "demonstrates", "different", "survival", "capability", "of", "WT", "and", "Mettl14", "KO", "cells", "with", "inducible", "expression", "of", "MYC", ".", "(", "J", ")", "Ratio", "of", "WT", "and", "Mettl14", "KO", "cells", "with", "inducible", "expression", "of", "MYC", "in", "the", "co", "-", "culture", "model", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "dot", "plots", ".", "n", "=", "8", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "KO", "cells", "without", "Dox", "treatment", "(", "no", "MYC", "expression", ")", "compared", "with", "WT", "cells", "or", "KO", "cells", "with", "Dox", "stimulation", "(", "exogenous", "MYC", "expression", ")", "at", "both", "Day", "7", "and", "14", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Interaction between Pvt1 and MYC was determined by immunoprecipitation followed with RT-PCR. Note significant decrease in Pvt1 and MYC interaction upon FTO treatment (left panel), calcium shift-induced differentiation (middle panel, Hi: high calcium), and Pvt1 methylation site mutations (right panel). n=3, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.B) Immunoblots show decreased MYC protein level in differentiated keratinocytes and Mettl14 KO cells.Undifferentiated WT and Mettl14 KO cells (C) were treated with cycloheximide. Cell lysates were collected at 0, 30, 60, 90, 120, 180, and 300 minutes post treatment and subjected to immunoblotting with different antibodies as indicated.undifferentiated WT and Pvt1 KO cells (D) were treated with cycloheximide. Cell lysates were collected at 0, 30, 60, 90, 120, 180, and 300 minutes post treatment and subjected to immunoblotting with different antibodies as indicated.WT cells before and after calcium shift-induced differentiation (E) were treated with cycloheximide. Cell lysates were collected at 0, 30, 60, 90, 120, 180, and 300 minutes post treatment and subjected to immunoblotting with different antibodies as indicated.(F) Skin organoids derived from Mettl14 KO cells or KO cells rescued with exogenous expression of MYC were grafted to nude mice. The regenerated skin was analyzed by H/E staining.(G) Epidermal thickness of KO and KO skin rescued with MYC expression was quantified and presented as box and whisker plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). n=18, P<0.01 (Student's t-test).(H) Number of p63-positive cells in KO and KO skin rescued with MYC expression was quantified and shown as bar graph. n=5, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.(I) Fluorescence microscopy demonstrates different survival capability of WT and Mettl14 KO cells with inducible expression of MYC.(J) Ratio of WT and Mettl14 KO cells with inducible expression of MYC in the co-culture model was quantified and shown as dot plots. n=8, P<0.01 (Student's t-test) for KO cells without Dox treatment (no MYC expression) compared with WT cells or KO cells with Dox stimulation (exogenous MYC expression) at both Day 7 and 14. Error bar represents S.D."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Western", "blot", "analysis", "showing", "the", "expression", "of", "the", "WRNIP1", "protein", "in", "wild", "-", "type", "cells", "(", "shWRNIP1WT", ")", "and", "WRNIP1", "-", "deficient", "(", "shWRNIP1", ")", "or", "mutant", "(", "shWRNIP1T294A", ")", "cells", ".", "MRC5SV", "fibroblasts", "were", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "The", "membrane", "was", "probed", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "or", "anti", "-", "WRNIP1", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Below", "each", "lane", "of", "the", "blot", "the", "ratio", "of", "WRNIP1", "protein", "to", "total", "protein", ",", "then", "normalised", "to", "MRC5SV", ",", "is", "reported", ".", "(", "B", ")", "Experimental", "scheme", "of", "dual", "labelling", "of", "DNA", "fibers", "in", "shWRNIP1WT", ",", "shWRNIP1", "and", "shWRNIP1T294A", "cells", ".", "Cells", "were", "pulse", "-", "labelled", "with", "CldU", ",", "and", "then", "subjected", "to", "a", "pulse", "-", "labelling", "with", "IdU", ".", "(", "C", ")", "Analysis", "of", "replication", "fork", "velocity", "(", "fork", "speed", ")", "in", "the", "cells", "under", "unperturbed", "conditions", ".", "The", "length", "of", "the", "green", "tracks", "were", "measured", ".", "Mean", "values", "are", "represented", "as", "horizontal", "black", "lines", "(", "ns", ",", "not", "significant", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "For", "each", "replication", "origin", ",", "the", "length", "of", "the", "right", "-", "fork", "signal", "was", "measured", "and", "plotted", "against", "the", "length", "of", "the", "left", "-", "fork", "signal", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "symmetric", "and", "asymmetric", "forks", "is", "given", ".", "If", "the", "ratio", "between", "the", "left", "-", "fork", "length", "and", "the", "right", "-", "fork", "length", "deviated", "by", "more", "than", "33", "%", "from", "1", "(", "that", "is", ",", "outside", "the", "violet", "dashed", "lines", "in", "the", "graphs", ")", ",", "the", "fork", "was", "considered", "asymmetric", ".", "The", "percentage", "of", "asymmetric", "forks", "was", "calculated", "for", "all", "cell", "lines", ".", "N", "=", "number", "of", "forks", "counted", "for", "each", "cell", "line", ".", "R", "represents", "linear", "correlation", "coefficient", ".", "(", "E", ")", "Experimental", "scheme", "of", "dual", "labelling", "of", "DNA", "fibers", "in", "shWRNIP1WT", ",", "shWRNIP1", "and", "shWRNIP1T294A", "cells", ".", "Cells", "were", "pulse", "-", "labelled", "with", "CldU", ",", "treated", "with", "4mM", "HU", "and", "then", "subjected", "to", "a", "pulse", "-", "labelling", "with", "IdU", ".", "(", "F", ")", "Graphs", "show", "the", "percentage", "of", "red", "(", "CldU", ")", "tracts", "(", "stalled", "forks", ")", "or", "red", "-", "green", "(", "CldU", "-", "IdU", ")", "contiguous", "tracts", "(", "restarting", "forks", ")", "in", "the", "cells", ".", "Mean", "shown", ",", "n", "=", "3", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", ".", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Representative", "DNA", "fiber", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "G", ")", "Experimental", "scheme", "of", "dual", "labelling", "of", "DNA", "fibers", "in", "shWRNIP1WT", ",", "shWRNIP1", "and", "shWRNIP1T294A", "cells", ".", "Cells", "were", "sequentially", "pulse", "-", "labelled", "with", "CldU", "and", "IdU", "as", "indicated", ",", "then", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ".", "(", "H", ")", "Representative", "IdU", "tract", "length", "distributions", "in", "all", "cell", "lines", "under", "unperturbed", "conditions", "(", "left", "graph", ")", "or", "after", "HU", "treatment", "(", "right", "graph", ")", ".", "Median", "tract", "lengths", "are", "given", "in", "parentheses", ".", "See", "also", "Tables", "S1", "and", "S2", "for", "details", "on", "the", "data", "sets", "and", "statistical", "test", ".", "Representative", "DNA", "fiber", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Western blot analysis showing the expression of the WRNIP1 protein in wild-type cells (shWRNIP1WT) and WRNIP1-deficient (shWRNIP1) or mutant (shWRNIP1T294A) cells. MRC5SV fibroblasts were used as a positive control. The membrane was probed with an anti-FLAG or anti-WRNIP1. GAPDH was used as a loading control. Below each lane of the blot the ratio of WRNIP1 protein to total protein, then normalised to MRC5SV, is reported.(B) Experimental scheme of dual labelling of DNA fibers in shWRNIP1WT, shWRNIP1 and shWRNIP1T294A cells. Cells were pulse-labelled with CldU, and then subjected to a pulse-labelling with IdU.(C) Analysis of replication fork velocity (fork speed) in the cells under unperturbed conditions. The length of the green tracks were measured. Mean values are represented as horizontal black lines (ns, not significant; Student's t-test).(D) Cells were treated as in (B). For each replication origin, the length of the right-fork signal was measured and plotted against the length of the left-fork signal. A schematic representation of symmetric and asymmetric forks is given. If the ratio between the left-fork length and the right-fork length deviated by more than 33% from 1 (that is, outside the violet dashed lines in the graphs), the fork was considered asymmetric. The percentage of asymmetric forks was calculated for all cell lines. N= number of forks counted for each cell line. R represents linear correlation coefficient.(E) Experimental scheme of dual labelling of DNA fibers in shWRNIP1WT, shWRNIP1 and shWRNIP1T294A cells. Cells were pulse-labelled with CldU, treated with 4mM HU and then subjected to a pulse-labelling with IdU.(F) Graphs show the percentage of red (CldU) tracts (stalled forks) or red-green (CldU-IdU) contiguous tracts (restarting forks) in the cells. Mean shown, n = 3. Error bars represent standard error. (*, p < 0.05; **, p < 0.01; Student's t test). Representative DNA fiber images are shown. Scale bars, 10 µm.(G) Experimental scheme of dual labelling of DNA fibers in shWRNIP1WT, shWRNIP1 and shWRNIP1T294A cells. Cells were sequentially pulse-labelled with CldU and IdU as indicated, then treated or not with 4 mM HU.(H) Representative IdU tract length distributions in all cell lines under unperturbed conditions (left graph) or after HU treatment (right graph). Median tract lengths are given in parentheses. See also Tables S1 and S2 for details on the data sets and statistical test. Representative DNA fiber images are shown. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Experimental", "scheme", "of", "dual", "labelling", "of", "DNA", "fibers", "in", "wild", "-", "type", "cells", "(", "shWRNIP1WT", ")", "or", "WRNIP1", "-", "deficient", "cells", "(", "shWRNIP1", ")", ".", "Cells", "were", "sequentially", "pulse", "-", "labelled", "with", "CldU", "and", "IdU", "as", "indicated", ",", "then", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "4", "mM", "HU", "in", "combination", "or", "not", "with", "50", "µM", "Mirin", ".", "(", "B", ")", "Representative", "IdU", "tract", "length", "distributions", "in", "shWRNIP1WT", "(", "left", "graph", ")", "or", "shWRNIP1", "cells", "(", "right", "graph", ")", "after", "treatment", ".", "Median", "tract", "lengths", "are", "given", "in", "parentheses", ".", "See", "Tables", "S1", "and", "S2", "for", "details", "on", "the", "data", "sets", "and", "statistical", "test", ".", "Representative", "DNA", "fiber", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Experimental scheme of dual labelling of DNA fibers in wild-type cells (shWRNIP1WT) or WRNIP1-deficient cells (shWRNIP1). Cells were sequentially pulse-labelled with CldU and IdU as indicated, then left untreated or treated with 4 mM HU in combination or not with 50 µM Mirin.(B) Representative IdU tract length distributions in shWRNIP1WT (left graph) or shWRNIP1 cells (right graph) after treatment. Median tract lengths are given in parentheses. See Tables S1 and S2 for details on the data sets and statistical test. Representative DNA fiber images are shown. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Evaluation", "of", "ssDNA", "accumulation", "at", "parental", "-", "strand", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "analysis", "in", "wild", "-", "type", "(", "shWRNIP1WT", ")", "or", "WRNIP1", "-", "deficient", "(", "shWRNIP1", ")", "cells", ".", "Experimental", "design", "of", "ssDNA", "assay", "is", "shown", ".", "Cells", "were", "labelled", "with", "IdU", "for", "24", "h", ",", "as", "indicated", ",", "washed", "and", "left", "to", "recover", "for", "2", "h", ",", "then", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ".", "In", "parallel", "samples", ",", "the", "MRE11", "activity", "is", "chemically", "inhibited", "with", "50", "µM", "Mirin", ",", "alone", "or", "in", "combination", "with", "HU", "-", "induced", "replication", "stress", ".", "After", "treatment", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "an", "anti", "-", "IdU", "antibody", "without", "denaturing", "the", "DNA", "to", "specifically", "detect", "parental", "ssDNA", ".", "Horizontal", "black", "lines", "represent", "the", "mean", "SE", ";", "n", "=", "3", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "(", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "DNA", "was", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "(", "B", ")", "Analysis", "of", "chromatin", "binding", "of", "MRE11", "and", "RAD51", "in", "shWRNIP1WT", "and", "shWRNIP1", "cells", ".", "Chromatin", "fractions", "of", "cells", ",", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ",", "were", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "The", "membrane", "was", "probed", "with", "the", "anti", "-", "WRNIP1", ",", "anti", "-", "MRE11", "and", "anti", "-", "RAD51", "antibodies", ".", "LAMIN", "B1", "was", "used", "as", "a", "loading", "for", "the", "chromatin", "fraction", ".", "Total", "amount", "of", "RAD51", "and", "MRE11", "(", "Input", ")", "in", "the", "cells", "was", "determined", "with", "the", "relevant", "antibodies", ".", "LAMIN", "B1", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "In", "the", "graph", ",", "the", "fold", "increase", "respect", "to", "the", "wild", "-", "type", "untreated", "of", "the", "normalized", "ratio", "of", "the", "chromatin", "-", "bound", "RAD51", "(", "or", "MRE11", ")", "/", "total", "RAD51", "(", "or", "MRE11", ")", "is", "reported", "for", "each", "cell", "line", ".", "(", "C", ")", "Analysis", "of", "DNA", "-", "protein", "interactions", "between", "ssDNA", "and", "endogenous", "RAD51", "in", "shWRNIP1WT", "and", "shWRNIP1", "cells", "by", "in", "situ", "PLA", "assay", ".", "Experimental", "designed", "used", "for", "the", "assay", "is", "given", ".", "Cells", "were", "labelled", "with", "IdU", "for", "24", "h", ",", "as", "indicated", ",", "washed", "and", "left", "to", "recover", "for", "2", "h", ",", "then", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", "for", "4", "h", ".", "Next", ",", "cells", "were", "fixed", ",", "stained", "with", "an", "anti", "-", "IdU", "antibody", "without", "denaturing", "the", "DNA", "to", "specifically", "detect", "parental", "-", "strand", "ssDNA", ",", "and", "subjected", "to", "PLA", "assay", "as", "described", "in", "the", "\"", "Experimental", "procedures", "\"", "section", ".", "Antibodies", "raised", "against", "IdU", "or", "RAD51", "were", "used", "to", "reveal", "ssDNA", "or", "endogenous", "RAD51", "respectively", ".", "Each", "red", "spot", "represents", "a", "single", "interaction", "between", "ssDNA", "and", "RAD51", ".", "No", "spot", "has", "been", "revealed", "in", "cells", "stained", "with", "each", "single", "antibody", "(", "negative", "control", ")", ".", "DNA", "was", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Representative", "images", "of", "the", "PLA", "assay", "are", "given", ".", "Graph", "shows", "the", "number", "of", "PLA", "spots", "per", "cell", ".", "Horizontal", "black", "lines", "represent", "the", "mean", "value", "(", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ";", "n", "=", "3", ".", "(", "D", ")", "Localization", "of", "WRNIP1", ",", "MRE11", "and", "RAD51", "to", "stalled", "replication", "forks", ".", "Forks", "were", "isolated", "by", "CldU", "-", "co", "-", "immunoprecipitation", "(", "CldU", "-", "IP", ")", ".", "shWRNIP1WT", "or", "shWRNIP1", "cells", "were", "pulse", "-", "labelled", "with", "CldU", ",", "then", "fixed", "or", "treated", "with", "HU", ".", "Cells", "were", "cross", "-", "linked", ",", "and", "the", "nuclear", "extracts", "were", "isolated", "(", "Input", ")", "and", "subjected", "to", "CldU", "-", "IP", "using", "an", "anti", "-", "CldU", "antibody", "(", "CldU", "-", "IP", ")", ".", "The", "membranes", "were", "probed", "with", "the", "anti", "-", "WRNIP1", "or", "anti", "-", "RAD51", "antibodies", ".", "After", "stripping", ",", "the", "membranes", "were", "probed", "with", "an", "anti", "-", "MRE11", "antibody", ".", "LAMIN", "B1", "and", "GAPDH", "were", "used", "as", "loading", "controls", "(", "Input", ")", ".", "Ponceau", "S", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "of", "CldU", "-", "IP", ".", "Dot", "blot", "analysis", "was", "performed", "to", "confirm", "that", "equal", "amounts", "of", "immunoprecipitatedDNA", "from", "each", "sample", ".", "10", "%", "of", "each", "IP", "was", "loaded", "on", "a", "nitrocellulose", "membrane", ".", "The", "membrane", "was", "probed", "with", "an", "anti", "-", "CldU", "antibody", ".", "The", "graph", "shows", "the", "normalized", "ratio", "of", "the", "proteins", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "CldU", "(", "CldUCo", "-", "IP", "proteins", ")", "/", "the", "total", "of", "labelled", "DNAimmunoprecipitated", "with", "CldU", "(", "CldUIP", ")", "for", "each", "cell", "line", "after", "replication", "stress", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "The", "dots", "in", "the", "graph", "represent", "the", "individual", "data", "points", "from", "each", "single", "experiment", ".", "Horizontal", "black", "line", "represents", "the", "mean", "value", "from", "two", "replicates", ";", "n", "=", "2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Evaluation of ssDNA accumulation at parental-strand by immunofluorescence microscopy analysis in wild-type (shWRNIP1WT) or WRNIP1-deficient (shWRNIP1) cells. Experimental design of ssDNA assay is shown. Cells were labelled with IdU for 24 h, as indicated, washed and left to recover for 2 h, then treated or not with 4 mM HU. In parallel samples, the MRE11 activity is chemically inhibited with 50 µM Mirin, alone or in combination with HU-induced replication stress. After treatment, cells were fixed and stained with an anti-IdU antibody without denaturing the DNA to specifically detect parental ssDNA. Horizontal black lines represent the mean SE; n = 3. Error bars represent standard error (ns, not significant; **, p<0.01; ****, p<0.0001; two-tailed Student's t test). Representative images are shown. DNA was counterstained with DAPI (blue).(B) Analysis of chromatin binding of MRE11 and RAD51 in shWRNIP1WT and shWRNIP1 cells. Chromatin fractions of cells, treated or not with 4 mM HU, were analysed by immunoblotting. The membrane was probed with the anti-WRNIP1, anti-MRE11 and anti-RAD51 antibodies. LAMIN B1 was used as a loading for the chromatin fraction. Total amount of RAD51 and MRE11 (Input) in the cells was determined with the relevant antibodies. LAMIN B1 was used as a loading control. In the graph, the fold increase respect to the wild-type untreated of the normalized ratio of the chromatin-bound RAD51 (or MRE11)/ total RAD51 (or MRE11) is reported for each cell line.(C) Analysis of DNA-protein interactions between ssDNA and endogenous RAD51 in shWRNIP1WT and shWRNIP1 cells by in situ PLA assay. Experimental designed used for the assay is given. Cells were labelled with IdU for 24 h, as indicated, washed and left to recover for 2 h, then treated or not with 4 mM HU for 4 h. Next, cells were fixed, stained with an anti-IdU antibody without denaturing the DNA to specifically detect parental-strand ssDNA, and subjected to PLA assay as described in the \"Experimental procedures\" section. Antibodies raised against IdU or RAD51 were used to reveal ssDNA or endogenous RAD51 respectively. Each red spot represents a single interaction between ssDNA and RAD51. No spot has been revealed in cells stained with each single antibody (negative control). DNA was counterstained with DAPI (blue). Representative images of the PLA assay are given. Graph shows the number of PLA spots per cell. Horizontal black lines represent the mean value (ns, not significant; **, p < 0.01; two-tailed Student's t test); n = 3.(D) Localization of WRNIP1, MRE11 and RAD51 to stalled replication forks. Forks were isolated by CldU-co-immunoprecipitation (CldU-IP). shWRNIP1WT or shWRNIP1 cells were pulse-labelled with CldU, then fixed or treated with HU. Cells were cross-linked, and the nuclear extracts were isolated (Input) and subjected to CldU-IP using an anti-CldU antibody (CldU-IP). The membranes were probed with the anti-WRNIP1 or anti-RAD51 antibodies. After stripping, the membranes were probed with an anti-MRE11 antibody. LAMIN B1 and GAPDH were used as loading controls (Input). Ponceau S was used as a loading control of CldU-IP. Dot blot analysis was performed to confirm that equal amounts of immunoprecipitatedDNA from each sample. 10% of each IP was loaded on a nitrocellulose membrane. The membrane was probed with an anti-CldU antibody. The graph shows the normalized ratio of the proteins co-immunoprecipitated with CldU (CldUCo-IP proteins)/ the total of labelled DNAimmunoprecipitated with CldU (CldUIP) for each cell line after replication stress from two independent experiments. The dots in the graph represent the individual data points from each single experiment. Horizontal black line represents the mean value from two replicates; n = 2."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Experimental", "scheme", "of", "pulse", "-", "labelling", "of", "DNA", "fibers", "in", "wild", "-", "type", "cells", "(", "shWRNIP1WT", ")", "or", "WRNIP1", "-", "deficient", "cells", "(", "shWRNIP1", ")", ".", "Cells", "were", "labelled", "with", "IdU", "and", "exposed", "or", "not", "to", "25", "μM", "RAD51", "inhibitor", ",", "then", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ".", "(", "B", ")", "Representative", "IdU", "tract", "length", "distributions", "in", "shWRNIP1WT", "cells", "(", "left", "graph", ")", "or", "shWRNIP1", "cells", "(", "right", "graph", ")", ".", "Median", "tract", "lengths", "are", "reported", "in", "parentheses", ".", "See", "Tables", "S1", "and", "S2", "for", "details", "on", "the", "data", "sets", "and", "statistical", "test", ".", "Representative", "DNA", "fiber", "images", "are", "reported", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Scheme", "of", "DNA", "fiber", "tract", "analysis", "in", "shWRNIP1", "cells", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "an", "empty", "vector", "or", "a", "plasmid", "expressing", "a", "wild", "-", "type", "human", "RAD51", ",", "and", "48", "h", "thereafter", "labelled", "with", "IdU", "and", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ".", "(", "D", ")", "Representative", "IdU", "tract", "length", "distributions", "in", "shWRNIP1", "cells", "or", "shWRNIP1", "cells", "expressing", "exogenous", "wild", "-", "type", "RAD51", "after", "HU", "exposure", ".", "Median", "tract", "lengths", "are", "given", "in", "parentheses", ".", "See", "Tables", "S1", "and", "S2", "for", "details", "on", "the", "data", "sets", "and", "statistical", "test", ".", "Representative", "DNA", "fiber", "images", "are", "given", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Western", "blot", "shows", "the", "expression", "of", "the", "RAD51", "protein", "in", "shWRNIP1", "cells", ".", "The", "membrane", "was", "probed", "with", "an", "anti", "-", "RAD51", ".", "LAMIN", "B1", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Experimental scheme of pulse-labelling of DNA fibers in wild-type cells (shWRNIP1WT) or WRNIP1-deficient cells (shWRNIP1). Cells were labelled with IdU and exposed or not to 25 μM RAD51 inhibitor, then treated or not with 4 mM HU.(B) Representative IdU tract length distributions in shWRNIP1WT cells (left graph) or shWRNIP1 cells (right graph). Median tract lengths are reported in parentheses. See Tables S1 and S2 for details on the data sets and statistical test. Representative DNA fiber images are reported. Scale bars, 10 µm.(C) Scheme of DNA fiber tract analysis in shWRNIP1 cells. Cells were transfected with an empty vector or a plasmid expressing a wild-type human RAD51, and 48 h thereafter labelled with IdU and treated or not with 4 mM HU.(D) Representative IdU tract length distributions in shWRNIP1 cells or shWRNIP1 cells expressing exogenous wild-type RAD51 after HU exposure. Median tract lengths are given in parentheses. See Tables S1 and S2 for details on the data sets and statistical test. Representative DNA fiber images are given. Scale bars, 10 µm. Western blot shows the expression of the RAD51 protein in shWRNIP1 cells. The membrane was probed with an anti-RAD51. LAMIN B1 was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "experiments", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "or", "FLAG", "-", "WRNIP1", "plasmid", ".", "Cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "HU", ".", "After", "treatment", ",", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "(", "FLAG", "-", "IP", ")", "using", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "The", "presence", "of", "WRNIP1", ",", "BRCA2", "and", "RAD51", "was", "assessed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "anti", "-", "FLAG", ",", "anti", "-", "RAD51", "and", "anti", "-", "BRCA2", "antibodies", ",", "respectively", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "analysed", "(", "Input", ")", ".", "The", "membrane", "was", "probed", "with", "the", "same", "antibodies", "used", "for", "IP", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "B", ")", "Analysis", "of", "protein", "-", "protein", "interactions", "between", "WRNIP1", "and", "endogenous", "RAD51", "in", "wild", "-", "type", "(", "shWRNIP1WT", ")", "or", "WRNIP1", "-", "mutant", "(", "shWRNIP1T294A", ")", "cells", "by", "in", "situ", "PLA", "assay", ".", "Cells", "were", "labelled", "with", "IdU", "for", "24", "h", ",", "washed", "and", "left", "to", "recover", "for", "2", "h", ",", "then", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ".", "Antibodies", "raised", "against", "FLAG", "-", "Tag", "and", "RAD51", "were", "used", "to", "reveal", "FLAG", "-", "WRNIP1", "or", "endogenous", "RAD51", "respectively", ".", "Each", "red", "spot", "represents", "a", "single", "interaction", "between", "WRNIP1", "and", "RAD51", ".", "No", "spot", "has", "been", "revealed", "in", "cells", "stained", "with", "each", "single", "antibody", "(", "negative", "control", ")", ".", "DNA", "was", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Representative", "images", "of", "the", "PLA", "assay", "are", "shown", ".", "Graph", "shows", "the", "mean", "number", "of", "PLA", "spots", "per", "cell", "SE", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "(", "ns", ",", "not", "significant", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ";", "n", "=", "3", ".", "(", "C", ")", "Experimental", "scheme", "of", "pulse", "-", "labelling", "of", "DNA", "fibers", "in", "wild", "-", "type", "cells", "(", "shWRNIP1WT", ")", "or", "WRNIP1", "-", "deficient", "cells", "(", "shWRNIP1", ")", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "BRCA2", "siRNA", "(", "siBRCA2", ")", ",", "and", "48", "h", "thereafter", "labelled", "with", "IdU", ",", "then", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ".", "(", "D", ")", "Representative", "IdU", "tract", "length", "distributions", "in", "shWRNIP1WT", "/", "siBRCA2", "or", "shWRNIP1siBRCA2", "cells", "treated", "or", "not", "with", "HU", ".", "Median", "tract", "lengths", "are", "given", "in", "parentheses", ".", "See", "Tables", "S1", "and", "S2", "for", "details", "on", "the", "data", "sets", "and", "statistical", "test", ".", "Representative", "DNA", "fiber", "images", "are", "reported", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Western", "blot", "shows", "BRCA2", "depletion", "in", "shWRNIP1WT", "and", "shWRNIP1", "cells", ".", "The", "membrane", "was", "probed", "with", "an", "anti", "-", "BRCA2", "or", "anti", "-", "WRNIP1", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "E", ")", "Experimental", "scheme", "of", "pulse", "-", "labelling", "of", "DNA", "fibers", "in", "shWRNIP1", "cells", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "shWRNIP1siCtrl", ")", "or", "FBH1", "siRNA", "(", "shWRNIP1siFBH1", ")", ",", "and", "48", "h", "thereafter", "labelled", "with", "IdU", ",", "then", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ".", "(", "F", ")", "Representative", "IdU", "tract", "length", "distributions", "in", "shWRNIP1siCtrl", "or", "shWRNIP1siFBH1", "cells", "with", "or", "without", "HU", "treatment", ".", "Representative", "DNA", "fiber", "images", "are", "reported", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Western", "blot", "shows", "FBH1", "depletion", "in", "the", "cells", ".", "The", "membrane", "was", "probed", "with", "an", "anti", "-", "FBH1", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Median", "tract", "lengths", "are", "given", "in", "parentheses", ".", "See", "Tables", "S1", "and", "S2", "for", "details", "on", "the", "data", "sets", "and", "statistical", "test", ".", "(", "G", ")", "Analysis", "of", "chromatin", "binding", "of", "RAD51", "in", "shWRNIP1", "cells", "depleted", "for", "FBH1", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "shWRNIP1siCtrl", ")", "or", "FBH1", "siRNA", "(", "shWRNIP1siFBH1", ")", ",", "and", "48", "h", "treated", "or", "not", "with", "HU", "for", "4h", ".", "Chromatin", "fractions", "of", "cells", "were", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "The", "membrane", "was", "probed", "with", "the", "anti", "-", "FBH1", "and", "anti", "-", "RAD51", "antibodies", ".", "LAMIN", "B1", "was", "used", "as", "a", "loading", "for", "the", "chromatin", "fraction", ".", "Total", "amount", "of", "RAD51", "(", "Input", ")", "in", "the", "cells", "was", "determined", "with", "the", "relevant", "antibodies", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "ratio", "of", "the", "RAD51", "/", "LAMIN", "B1", "signal", "(", "chromatin", ")", "is", "reported", "below", "each", "lane", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Co-immunoprecipitation experiments in HEK293T cells transfected with empty vector or FLAG-WRNIP1 plasmid. Cells were treated or not with HU. After treatment, cell lysates were immunoprecipitated (FLAG-IP) using anti-FLAG antibody. The presence of WRNIP1, BRCA2 and RAD51 was assessed by immunoblotting using the anti-FLAG, anti-RAD51 and anti-BRCA2 antibodies, respectively. Whole cell extracts were analysed (Input). The membrane was probed with the same antibodies used for IP. GAPDH was used as a loading control.(B) Analysis of protein-protein interactions between WRNIP1 and endogenous RAD51 in wild-type (shWRNIP1WT) or WRNIP1-mutant (shWRNIP1T294A) cells by in situ PLA assay. Cells were labelled with IdU for 24 h, washed and left to recover for 2 h, then treated or not with 4 mM HU. Antibodies raised against FLAG-Tag and RAD51 were used to reveal FLAG-WRNIP1 or endogenous RAD51 respectively. Each red spot represents a single interaction between WRNIP1 and RAD51. No spot has been revealed in cells stained with each single antibody (negative control). DNA was counterstained with DAPI (blue). Representative images of the PLA assay are shown. Graph shows the mean number of PLA spots per cell SE. Error bars represent standard error (ns, not significant; two-tailed Student's t test); n = 3.(C) Experimental scheme of pulse-labelling of DNA fibers in wild-type cells (shWRNIP1WT) or WRNIP1-deficient cells (shWRNIP1). Cells were transfected with BRCA2 siRNA (siBRCA2), and 48 h thereafter labelled with IdU, then treated or not with 4 mM HU.(D) Representative IdU tract length distributions in shWRNIP1WT/siBRCA2 or shWRNIP1siBRCA2 cells treated or not with HU. Median tract lengths are given in parentheses. See Tables S1 and S2 for details on the data sets and statistical test. Representative DNA fiber images are reported. Scale bars, 10 µm. Western blot shows BRCA2 depletion in shWRNIP1WT and shWRNIP1 cells. The membrane was probed with an anti-BRCA2 or anti-WRNIP1. GAPDH was used as a loading control.(E) Experimental scheme of pulse-labelling of DNA fibers in shWRNIP1 cells. Cells were transfected with control siRNA (shWRNIP1siCtrl) or FBH1 siRNA (shWRNIP1siFBH1), and 48 h thereafter labelled with IdU, then treated or not with 4 mM HU.(F) Representative IdU tract length distributions in shWRNIP1siCtrl or shWRNIP1siFBH1 cells with or without HU treatment. Representative DNA fiber images are reported. Scale bars, 10 µm. Western blot shows FBH1 depletion in the cells. The membrane was probed with an anti-FBH1. GAPDH was used as a loading control. Median tract lengths are given in parentheses. See Tables S1 and S2 for details on the data sets and statistical test.(G) Analysis of chromatin binding of RAD51 in shWRNIP1 cells depleted for FBH1. Cells were transfected with control siRNA (shWRNIP1siCtrl) or FBH1 siRNA (shWRNIP1siFBH1), and 48 h treated or not with HU for 4h. Chromatin fractions of cells were analysed by immunoblotting. The membrane was probed with the anti-FBH1 and anti-RAD51 antibodies. LAMIN B1 was used as a loading for the chromatin fraction. Total amount of RAD51 (Input) in the cells was determined with the relevant antibodies. GAPDH was used as a loading control. The ratio of the RAD51/LAMIN B1 signal (chromatin) is reported below each lane."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Analysis", "of", "DNA", "damage", "accumulation", ".", "Wild", "-", "type", "(", "shWRNIP1WT", ")", ",", "WRNIP1", "-", "deficient", "(", "shWRNIP1", ")", "or", "mutant", "(", "shWRNIP1T294A", ")", "cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", "for", "4", "h", ",", "then", "subjected", "to", "-", "H2AXimmunofluorescence", "microscopy", ".", "Graph", "shows", "data", "presented", "as", "mean", "of", "-", "H2AX", "-", "positive", "cells", "SE", "from", "three", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "1", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Representative", "images", "of", "nuclei", "showing", "the", "different", "number", "of", "foci", "per", "nucleus", "are", "reported", ".", "(", "B", ")", "Analysis", "of", "DNA", "breakage", "accumulation", ".", "shWRNIP1WT", ",", "shWRNIP1", "and", "shWRNIP1T294A", "cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "then", "subjected", "to", "alkaline", "Comet", "assay", ".", "Graph", "shows", "data", "presented", "as", "mean", "tail", "moment", "SE", "from", "three", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "1", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "Evaluation", "of", "cell", "death", ".", "shWRNIP1WT", "shWRNIP1", "and", "shWRNIP1T294A", "cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", "for", "16", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "evaluated", "by", "LIVE", "/", "DEAD", "fluorescent", "assay", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "of", "dead", "cells", "SE", "from", "three", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "1", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Representative", "images", "of", "double", "-", "staining", "of", "viable", "(", "green", ")", "and", "dead", "(", "red", ")", "cells", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "Experimental", "scheme", "for", "evaluation", "of", "the", "chromosomal", "aberrations", "is", "shown", ".", "shWRNIP1WT", "shWRNIP1", "and", "shWRNIP1T294A", "cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ",", "then", "left", "to", "recover", "for", "16h", "in", "drug", "-", "free", "medium", "and", "metaphases", "collected", "with", "colcemid", ".", "Next", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "processed", "as", "reported", "in", "\"", "Supplemental", "information", "\"", "section", ".", "Dot", "plot", "shows", "the", "number", "of", "chromosomal", "aberrations", "per", "cell", ".", "Horizontal", "black", "lines", "represent", "the", "mean", "SE", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "(", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Representative", "Giemsa", "-", "stained", "metaphases", "of", "cells", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", ".", "Arrows", "indicate", "chromosomal", "aberrations", ".", "(", "E", ")", "Experimental", "scheme", "of", "the", "Mirin", "aberration", "analysis", "is", "given", ".", "The", "experiment", "was", "carried", "out", "as", "in", "(", "D", ")", "but", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "or", "not", "with", "50", "µM", "Mirin", ".", "Dot", "plot", "shows", "the", "effect", "of", "Mirin", "exposure", "on", "the", "number", "of", "chromosome", "aberrations", "per", "cell", "in", "shWRNIP1", "cells", ".", "Horizontal", "black", "lines", "represent", "the", "mean", "SE", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "(", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Representative", "Giemsa", "-", "stained", "metaphases", "of", "shWRNIP1", "cells", "treated", "with", "Mirin", "alone", "or", "in", "combination", "with", "HU", ".", "Arrows", "indicate", "chromosomal", "aberrations", ".", "(", "F", ")", "Experimental", "design", "of", "the", "chromosomal", "aberration", "assay", "is", "reported", ".", "shWRNIP1", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNAs", "(", "siCtrl", ")", "or", "FBH1", "siRNA", "(", "siFBH1", ")", ".", "Fourth", "-", "eight", "hours", "thereafter", ",", "cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "4", "mM", "HU", "and", "then", "left", "to", "recover", "for", "16", "h", ".", "Metaphases", "were", "collected", "with", "colcemid", "and", "prepared", "as", "reported", "in", "\"", "Supplemental", "information", "\"", "section", ".", "Dot", "plot", "shows", "the", "number", "of", "chromosomal", "aberrations", "per", "cell", ".", "Western", "blot", "shows", "FBH1", "depletion", "in", "the", "cells", ".", "The", "membrane", "was", "probed", "with", "an", "anti", "-", "FBH1", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Horizontal", "black", "lines", "represent", "the", "mean", "SE", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", ".", "(", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Analysis of DNA damage accumulation. Wild-type (shWRNIP1WT), WRNIP1-deficient (shWRNIP1) or mutant (shWRNIP1T294A) cells were treated or not with 4 mM HU for 4 h, then subjected to -H2AXimmunofluorescence microscopy. Graph shows data presented as mean of -H2AX-positive cells SE from three independent experiments; n = 3. Error bars represent standard error (*, p < 0.1; **, p < 0.01; two-tailed Student's t test). Representative images of nuclei showing the different number of foci per nucleus are reported.(B) Analysis of DNA breakage accumulation. shWRNIP1WT, shWRNIP1 and shWRNIP1T294A cells were treated as in (A), then subjected to alkaline Comet assay. Graph shows data presented as mean tail moment SE from three independent experiments; n = 3. Error bars represent standard error (*, p < 0.1; **, p < 0.01; two-tailed Student's t test). Representative images are shown.(C) Evaluation of cell death. shWRNIP1WT shWRNIP1 and shWRNIP1T294A cells were treated or not with 4 mM HU for 16 h. Cell viability was evaluated by LIVE/DEAD fluorescent assay. Data are expressed as mean of dead cells SE from three independent experiments; n = 3. Error bars represent standard error (*, p < 0.1; **, p < 0.01; two-tailed Student's t test). Representative images of double-staining of viable (green) and dead (red) cells are shown.(D) Experimental scheme for evaluation of the chromosomal aberrations is shown. shWRNIP1WT shWRNIP1 and shWRNIP1T294A cells were treated or not with 4 mM HU, then left to recover for 16h in drug-free medium and metaphases collected with colcemid. Next, cells were fixed and processed as reported in \"Supplemental information\" section. Dot plot shows the number of chromosomal aberrations per cell. Horizontal black lines represent the mean SE. Error bars represent standard error (ns, not significant; **, p < 0.01; two-tailed Student's t test). Representative Giemsa-stained metaphases of cells treated or not with 4 mM HU. Arrows indicate chromosomal aberrations.(E) Experimental scheme of the Mirin aberration analysis is given. The experiment was carried out as in (D) but cells were pre-treated or not with 50 µM Mirin. Dot plot shows the effect of Mirin exposure on the number of chromosome aberrations per cell in shWRNIP1 cells. Horizontal black lines represent the mean SE. Error bars represent standard error (ns, not significant; **, p < 0.01; two-tailed Student's t test). Representative Giemsa-stained metaphases of shWRNIP1 cells treated with Mirin alone or in combination with HU. Arrows indicate chromosomal aberrations.(F) Experimental design of the chromosomal aberration assay is reported. shWRNIP1 cells were transfected with control siRNAs (siCtrl) or FBH1 siRNA (siFBH1). Fourth-eight hours thereafter, cells were treated or not with 4 mM HU and then left to recover for 16 h. Metaphases were collected with colcemid and prepared as reported in \"Supplemental information\" section. Dot plot shows the number of chromosomal aberrations per cell. Western blot shows FBH1 depletion in the cells. The membrane was probed with an anti-FBH1. GAPDH was used as a loading control. Horizontal black lines represent the mean SE. Error bars represent standard error. (**, p < 0.01; two-tailed Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "1SILAC", "-", "based", "proteomics", "data", "identify", "known", "(", "red", ")", "&", "novel", "(", "green", ")", "hypoxia", "-", "induced", "proteins", "in", "SW620", "cells", ".", "One", "sample", "T", "-", "test", "was", "performed", ".", "Western", "blotting", "confirmed", "GPRC5A", "as", "a", "hypoxia", "-", "induced", "protein", "in", "SILAC", "lysates", ".", "Validation", "of", "GPRC5A", "western", "blot", "data", "using", "siRNA", ".", "*", "Non", "-", "specific", "band", "of", "~", "60kDa", "not", "depleted", "by", "GPRC5A", "siRNA", ".", "Confocal", "microscopy", "showing", "plasma", "membrane", "GPRC5A", "expression", "in", "hypoxic", "SW620", "cells", "(", "scale", "bars", ":", "75um", ")", ".", "Western", "blotting", "showing", "GPRC5A", "upregulation", "by", "hypoxia", "in", "a", "panel", "of", "colorectal", "tumour", "cell", "lines", ".", "Basal", "&", "hypoxia", "-", "induced", "GPRC5A", "protein", "expression", "was", "decreased", "by", "HIF", "-", "1", "/", "2α", "depletion", ".", "Depletion", "of", "HIF", "-", "1β", "decreased", "GPRC5A", "protein", "upregulation", "in", "hypoxia", ".", "Hypoxia", "mimetic", "DMOG", "induced", "HIF", "-", "1", "/", "2α", ",", "CA9", "&", "GPRC5A", "protein", "expression", ".", "Dual", "HIF", "-", "1", "/", "2α", "depletion", "reduced", "GPRC5A", "induction", "by", "DMOG", ".", "qRT", "-", "PCR", "demonstrating", "that", "GPRC5A", "mRNA", "was", "upregulated", "by", "hypoxia", ".", "GPRC5A", "was", "normalised", "to", "HPRT", "(", "error", "bars", "±", "SD", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "demonstrating", "that", "HIF", "-", "1", "/", "2α", "depletion", "decreased", "GPRC5A", "induction", "during", "hypoxia", ".", "GPRC5A", "was", "normalised", "to", "HPRT", "(", "error", "bars", "±", "SD", ")", ".", "ChIP", "/", "PCR", "analyses", "identify", "HIF", "-", "1α", "a", "binding", "to", "the", "GPRC5A", "promoter", "region", "containing", "a", "putative", "optimal", "HRE", "(", "error", "bars", "±", "SD", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1SILAC-based proteomics data identify known (red) & novel (green) hypoxia-induced proteins in SW620 cells. One sample T-test was performed.Western blotting confirmed GPRC5A as a hypoxia-induced protein in SILAC lysates.Validation of GPRC5A western blot data using siRNA. *Non-specific band of ~60kDa not depleted by GPRC5A siRNA.Confocal microscopy showing plasma membrane GPRC5A expression in hypoxic SW620 cells (scale bars: 75um).Western blotting showing GPRC5A upregulation by hypoxia in a panel of colorectal tumour cell lines.Basal & hypoxia-induced GPRC5A protein expression was decreased by HIF-1/2α depletion.Depletion of HIF-1β decreased GPRC5A protein upregulation in hypoxia.Hypoxia mimetic DMOG induced HIF-1/2α, CA9 & GPRC5A protein expression. Dual HIF-1/2α depletion reduced GPRC5A induction by DMOG.qRT-PCR demonstrating that GPRC5A mRNA was upregulated by hypoxia. GPRC5A was normalised to HPRT (error bars ± SD).qRT-PCR demonstrating that HIF-1/2α depletion decreased GPRC5A induction during hypoxia. GPRC5A was normalised to HPRT (error bars ± SD).ChIP/PCR analyses identify HIF-1α a binding to the GPRC5A promoter region containing a putative optimal HRE (error bars ± SD)."}
{"words": ["Figure", "2Expression", "of", "CA9", "in", "formalin", "fixed", "paraffin", "embedded", "hypoxic", "SW620", "cells", "by", "IHC", ".", "Reduced", "CA9", "expression", "with", "siRNA", "confirms", "antibody", "specificity", "(", "scale", "bars", ":", "200um", ")", ".", "Expression", "of", ";", "GPRC5A", "in", "formalin", "fixed", "paraffin", "embedded", "hypoxic", "SW620", "cells", "by", "IHC", ".", "Reduced", ";", "GPRC5A", "expression", "with", "siRNA", "confirms", "antibody", "specificity", "(", "scale", "bars", ":", "200um", ")", ".", "IHC", "analysis", "of", "serial", "sections", "from", "human", "colorectal", "tissue", "from", "patients", "with", "mesenteric", "ischaemia", "(", "strangulated", "colon", ")", ".", "GPRC5A", "is", "co", "-", "expressed", "with", "CA9", "in", "the", "colonic", "epithelial", "cells", "(", "scale", "bars", ":", "50um", ")", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "mouse", "intestinal", "tissue", ".", "Gene", "expression", "was", "normalised", "to", "housekeeping", "gene", "Tbp", ".", "Raw", "data", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "are", "shown", "(", "error", "bars", "±", "SEM", ")", ".", "Tg", "[", "fli1", ":", "eGFP", ";", "vhl", "-", "/", "-", "]", "&", "Tg", "[", "fli1", ":", "eGFP", "]", "zebrafish", "embryos", "(", "5", "days", "post", "-", "fertilisation", ")", "demonstrate", "excessive", "angiogenesis", "&", "increased", "expression", "of", "HIF", "target", "genes", "(", "scale", "bars", ":", "100um", ")", ".", "gprc5ba", "was", "induced", "in", "vhl", "mutant", "zebrafish", "embryos", "&", "fli1", ":", "eGFP", "zebrafish", "embryos", "exposed", "to", "5", "%", "O2", "(", "vs", "normoxia", ")", "for", "24", "hours", "(", "RT", "-", "PCR", ")", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "curve", "following", "analysis", "of", "transcriptomics", "dataset", "GSE24551", ".", "Event", "-", "free", "survival", "is", "significantly", "reduced", "in", "patients", "with", "tumours", "expressing", "high", "levels", "of", "GPRC5A", "mRNA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Expression of CA9 in formalin fixed paraffin embedded hypoxic SW620 cells by IHC. Reduced CA9 expression with siRNA confirms antibody specificity (scale bars: 200um).Expression of ; GPRC5A in formalin fixed paraffin embedded hypoxic SW620 cells by IHC. Reduced ; GPRC5A expression with siRNA confirms antibody specificity (scale bars: 200um).IHC analysis of serial sections from human colorectal tissue from patients with mesenteric ischaemia (strangulated colon). GPRC5A is co-expressed with CA9 in the colonic epithelial cells (scale bars: 50um).Quantitative RT-PCR analysis of mouse intestinal tissue. Gene expression was normalised to housekeeping gene Tbp. Raw data from three independent experiments (n=3 mice) are shown (error bars ± SEM).Tg[fli1:eGFP; vhl-/-] & Tg[fli1:eGFP] zebrafish embryos (5 days post-fertilisation) demonstrate excessive angiogenesis & increased expression of HIF target genes (scale bars: 100um).gprc5ba was induced in vhl mutant zebrafish embryos & fli1:eGFP zebrafish embryos exposed to 5% O2 (vs normoxia) for 24 hours (RT-PCR).Kaplan-Meier curve following analysis of transcriptomics dataset GSE24551. Event-free survival is significantly reduced in patients with tumours expressing high levels of GPRC5A mRNA."}
{"words": ["Figure", "3GPRC5A", "depletion", "markedly", "increases", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "during", "hypoxia", ".", "Three", "independent", "siRNA", "sequences", "targeting", "GPRC5A", "induce", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "during", "hypoxia", ".", "GPRC5A", "depletion", "reduces", "hypoxic", "cell", "growth", "/", "survival", ".", "Crystal", "violet", "cell", "assays", "show", "reduced", "cell", "growth", "/", "survival", "in", "GPRC5A", "depleted", "cells", "during", "hypoxia", "[", "n", "=", "3", "]", ".", "Expression", "of", "an", "siRNA", "-", "resistant", "GPRC5A", "cDNA", "rescues", "hypoxic", "GPRC5A", "-", "depleted", "cells", "from", "apoptosis", ".", "Upper", ":", "doxycycline", "-", "induced", "expression", "GPRC5Asi1R", "rescues", "increases", "caspase", "-", "3", "/", "PARP", "cleavage", "induced", "by", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", ".", "Lower", ":", "generation", "of", "an", "siRNA1", "resistant", "GPRC5A", "cDNA", "by", "synonymous", "mutations", ".", "Caspase", "inhibitor", "QVD", "prevents", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "by", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", ".", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", "induces", "apoptosis", "as", "determined", "by", "the", "violet", "ratiometric", "membrane", "asymmetry", "probe", "/", "dead", "cell", "apoptosis", "assay", "and", "flow"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3GPRC5A depletion markedly increases caspase-3 activation/PARP cleavage during hypoxia.Three independent siRNA sequences targeting GPRC5A induce caspase-3 activation/PARP cleavage during hypoxia.GPRC5A depletion reduces hypoxic cell growth/survival. Crystal violet cell assays show reduced cell growth/survival in GPRC5A depleted cells during hypoxia [n=3].Expression of an siRNA-resistant GPRC5A cDNA rescues hypoxic GPRC5A-depleted cells from apoptosis. Upper: doxycycline-induced expression GPRC5Asi1R rescues increases caspase-3/PARP cleavage induced by GPRC5A depletion in hypoxia. Lower: generation of an siRNA1 resistant GPRC5A cDNA by synonymous mutations.Caspase inhibitor QVD prevents caspase-3 activation/PARP cleavage by GPRC5A depletion in hypoxia.GPRC5A depletion in hypoxia induces apoptosis as determined by the violet ratiometric membrane asymmetry probe/dead cell apoptosis assay and flow cytometry"}
{"words": ["Figure", "4Hypoxia", "induced", "YAP", "stabilisation", "via", "Ser397", "dephosphorylated", "was", "abrogated", "in", "GPRC5A", "depleted", "cells", ".", "Hypoxia", "-", "induced", "nuclear", "localisation", "of", "YAP", "was", "attenuated", "in", "GPRC5A", "depleted", "cells", ".", "Hypoxia", "activated", "TEAD", "activity", "(", "8x", "GTIIC", "-", "luc", "reporter", ")", "but", "this", "was", "reduced", "by", "GPRC5A", "depletion", ".", "A", "representative", "triplicate", "experiment", "is", "shown", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Hypoxia", "reduced", "LATS", "activity", "and", "expression", "but", "this", "was", "prevented", "by", "GPRC5A", "depletion", ".", "Constitutively", "active", "RhoA", "(", "G14V", ")", "expression", "restored", "YAP", "stabilisation", "(", "Ser397", "dephosphorylation", ")", "by", "hypoxia", "in", "GPRC5A", "depleted", "cells", ".", "The", "YAP", "/", "TEAD", "inhibitor", "verteporfin", "selectively", "inhibited", "cancer", "cell", "survival", "in", "hypoxia", "by", "crystal", "violet", "assay", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "YAP", "knockdown", "was", "sufficient", "to", "induce", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "in", "hypoxia", "and", "was", "not", "further", "enhanced", "by", "GPRC5A", "depletion", ".", "Crystal", "violet", "assays", "show", "that", "YAP", "was", "required", "downstream", "of", "GPRC5A", "to", "promote", "cell", "survival", ".", "GPRC5A", "depleted", "cells", "were", "rescued", "by", "expression", "of", "an", "siRNA", "-", "resistant", "GPRC5A", "cDNA", "(", "GPRC5Asi1R", ")", "but", "this", "was", "prevented", "by", "co", "-", "depletion", "of", "YAP", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Expression", "of", "an", "siRNA", "-", "resistant", "GPRC5A", "rescued", "the", "critical", "phenotypes", "of", "GPRC5A", "depletion", ".", "GPRC5Asi1R", "expression", "prevented", "PARP", "cleavage", "in", "hypoxia", "as", "well", "as", "restoring", "hypoxia", "-", "induced", "YAP", "stabilisation", "(", "Ser397", "dephosphorylation", ")", ";", "these", "phenotypes", "were", "reversed", "by", "YAP", "depletion", ".", "GPRC5A", "depletion", "attenuated", "hypoxia", "-", "induced", "BCL", "-", "XL", "expression", ".", "Constitutively", "active", "YAP", "(", "S127A", ")", "expression", "induced", "BCL", "-", "XL", "expression", "and", "prevents", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "by", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", ".", "GPRC5Asi1R", "expression", "restored", "BCL", "-", "XL", "expression", "and", "prevents", "the", "appearance", "of", "cleaved", "caspase", "-", "3", "induced", "by", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Hypoxia induced YAP stabilisation via Ser397 dephosphorylated was abrogated in GPRC5A depleted cells.Hypoxia-induced nuclear localisation of YAP was attenuated in GPRC5A depleted cells.Hypoxia activated TEAD activity (8x GTIIC-luc reporter) but this was reduced by GPRC5A depletion. A representative triplicate experiment is shown (n=3).Hypoxia reduced LATS activity and expression but this was prevented by GPRC5A depletion.Constitutively active RhoA (G14V) expression restored YAP stabilisation (Ser397 dephosphorylation) by hypoxia in GPRC5A depleted cells.The YAP/TEAD inhibitor verteporfin selectively inhibited cancer cell survival in hypoxia by crystal violet assay (n=3 independent experiments).YAP knockdown was sufficient to induce caspase-3 activation/PARP cleavage in hypoxia and was not further enhanced by GPRC5A depletion.Crystal violet assays show that YAP was required downstream of GPRC5A to promote cell survival. GPRC5A depleted cells were rescued by expression of an siRNA-resistant GPRC5A cDNA (GPRC5Asi1R) but this was prevented by co-depletion of YAP (n=3 independent experiments).Expression of an siRNA-resistant GPRC5A rescued the critical phenotypes of GPRC5A depletion. GPRC5Asi1R expression prevented PARP cleavage in hypoxia as well as restoring hypoxia-induced YAP stabilisation (Ser397 dephosphorylation); these phenotypes were reversed by YAP depletion.GPRC5A depletion attenuated hypoxia-induced BCL-XL expression.Constitutively active YAP (S127A) expression induced BCL-XL expression and prevents caspase-3 activation/PARP cleavage by GPRC5A depletion in hypoxia.GPRC5Asi1R expression restored BCL-XL expression and prevents the appearance of cleaved caspase-3 induced by GPRC5A depletion in hypoxia."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "NRF1", ",", "NRF2", "-", "α", "and", "PGC1", "-", "α", "in", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "or", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "or", "ISD", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "ACTIN", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Ratios", "of", "target", "proteins", "versus", "loading", "control", "normalized", "to", "the", "0", "-", "h", "time", "point", "of", "each", "condition", ".", "(", "B", ")", "qPCR", "analysis", "of", "Nrf1", ",", "Gabpa", "and", "Ppargc1a", "mRNA", "in", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "or", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "or", "ISD", "for", "the", "indicated", "time", "points", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "NRF1", "expression", "in", "mouse", "PMs", "transfected", "with", "p65", "-", "specific", "siRNA", "(", "si", "-", "p65", ")", "or", "control", "siRNA", "(", "si", "-", "NC", ")", "for", "48", "h", ",", "followed", "by", "infection", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "for", "8", "h", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Ratios", "of", "target", "proteins", "versus", "loading", "control", "normalized", "to", "the", "untreated", "sample", "of", "each", "condition", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "mitochondrial", "proteins", "and", "autophagy", "marker", "LC3", "in", "mouse", "PMs", "transfected", "with", "NRF1", "-", "specific", "siRNA", "(", "si", "-", "NRF1", ")", "or", "control", "siRNA", "(", "si", "-", "NC", ")", "for", "48", "h", ",", "followed", "by", "infection", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "ACTIN", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Ratios", "of", "target", "proteins", "versus", "loading", "control", "normalized", "to", "the", "untreated", "sample", "of", "each", "condition", ".", "(", "F", ")", "Mitochondrial", "mass", "determined", "by", "mtDNA", "/", "nuclear", "DNA", "(", "nDNA", ")", "ratio", "in", "mouse", "PMs", "transfected", "with", "NRF1", "-", "specific", "siRNA", "(", "si", "-", "NRF1", ")", "or", "control", "siRNA", "(", "si", "-", "NC", ")", "for", "48", "h", ",", "followed", "by", "infection", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "for", "the", "indicated", "time", "points", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Immunoblot analysis of NRF1, NRF2-α and PGC1-α in mouse PMs infected with VSV or HSV-1 or treated with poly(I:C) or ISD for the indicated time points. ACTIN was used as a loading control. Ratios of target proteins versus loading control normalized to the 0-h time point of each condition.(B) qPCR analysis of Nrf1, Gabpa and Ppargc1a mRNA in mouse PMs infected with VSV or HSV-1 or treated with poly(I:C) or ISD for the indicated time points (n=3 biological replicates per group). Data information: Data are from three independent experiments and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test.(C) Immunoblot analysis of NRF1 expression in mouse PMs transfected with p65-specific siRNA (si-p65) or control siRNA (si-NC) for 48 h, followed by infection with VSV or HSV-1 for 8 h. GAPDH was used as a loading control. Ratios of target proteins versus loading control normalized to the untreated sample of each condition.(E) Immunoblot analysis of mitochondrial proteins and autophagy marker LC3 in mouse PMs transfected with NRF1-specific siRNA (si-NRF1) or control siRNA (si-NC) for 48 h, followed by infection with VSV or HSV-1 for the indicated time points. ACTIN was used as a loading control. Ratios of target proteins versus loading control normalized to the untreated sample of each condition.(F) Mitochondrial mass determined by mtDNA/nuclear DNA (nDNA) ratio in mouse PMs transfected with NRF1-specific siRNA (si-NRF1) or control siRNA (si-NC) for 48 h, followed by infection with VSV or HSV-1 for the indicated time points (n=3 biological replicates per group). Data information: Data are from three independent experiments and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test."}
{"words": ["Figure", "2RNA", "-", "sequencing", "(", "RNA", "-", "seq", ")", "analysis", "of", "gene", "expression", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", "infected", "with", "VSV", "for", "8", "h", ".", "(", "C", ")", "Pheatmap", "analysis", "showing", "downregulated", "DEGs", "encoding", "mitochondrial", "inner", "membrane", "proteins", ".", "TPM", ",", "transcripts", "per", "kilobase", "of", "exon", "model", "per", "million", "mapped", "reads", ".", "(", "D", ")", "Mitochondrial", "mass", "determined", "by", "mtDNA", "/", "nuclear", "DNA", "(", "nDNA", ")", "ratio", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "for", "the", "indicated", "time", "points", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "D", ")", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "The", "representative", "curves", "of", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "(", "F", ")", "or", "HSV", "-", "1", "(", "G", ")", "for", "8", "h", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Oligomycin", ":", "1", "µM", ",", "FCCP", ":", "4", "µM", ",", "Rotenone", ":", "1", "µM", ".", "Quantification", "of", "basal", "and", "maximal", "OCR", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "at", "least", "three", "biological", "replicates", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "Electron", "micrographs", "of", "mitochondria", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "for", "8", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "nm", "(", "H", ")", ".", "(", "I", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "mitochondrial", "cristae", "(", "the", "ratio", "of", "cristae", "number", "to", "mitochondrial", "area", ")", "in", "(", "H", ")", "(", "20", "-", "30", "mitochondria", "per", "group", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "at", "least", "three", "biological", "replicates", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2RNA-sequencing (RNA-seq) analysis of gene expression in wild-type and NRF1-KO mouse PMs (n=3 biological replicates per group) infected with VSV for 8 h. (C) Pheatmap analysis showing downregulated DEGs encoding mitochondrial inner membrane proteins. TPM, transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads.(D) Mitochondrial mass determined by mtDNA/nuclear DNA (nDNA) ratio in wild-type and NRF1-KO mouse PMs infected with VSV or HSV-1 for the indicated time points (n=3 biological replicates per group). Data information: Data are from three independent experiments (D) and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test.(F and G) The representative curves of oxygen consumption rate (OCR) in wild-type and NRF1-KO mouse PMs infected with VSV (F) or HSV-1 (G) for 8 h (n=5 biological replicates per group). Oligomycin: 1 µM, FCCP: 4 µM, Rotenone: 1 µM. Quantification of basal and maximal OCR. Data information: Data are from at least three biological replicates and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test.(H and I) Electron micrographs of mitochondria in wild-type and NRF1-KO mouse PMs infected with VSV or HSV-1 for 8 h. Scale bars, 500 nm (H). (I) Quantitative analysis of mitochondrial cristae (the ratio of cristae number to mitochondrial area) in (H) (20-30 mitochondria per group, biological replicates). Data information: Data are from at least three biological replicates and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Luciferase", "activity", "of", "IFN", "-", "β", ",", "NF", "-", "κB", "and", "ISRE", "promoter", "reporter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "or", "plasmids", "encoding", "incremental", "NRF1", "-", "Myc", "for", "24", "h", "followed", "by", "infection", "with", "VSV", "for", "8", "h", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "phosphorylated", "and", "total", "TBK1", ",", "p65", "and", "STAT1", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "(", "B", ")", "or", "stimulated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "or", "ISD", "(", "C", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Ratios", "of", "phosphorylated", "proteins", "versus", "total", "proteins", "normalized", "to", "the", "0", "-", "h", "or", "4", "-", "h", "time", "point", "of", "each", "wild", "-", "type", "sample", ".", "(", "D", ")", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnb1", ",", "Il6", ",", "Tnfa", "and", "Cxcl10", "mRNA", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "or", "stimulated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "or", "ISD", "for", "the", "indicated", "time", "points", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ND", ",", "not", "detectable", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "E", ")", "ELISA", "quantification", "of", "IFN", "-", "β", ",", "IL6", "and", "TNF", "-", "α", "secretion", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "treated", "as", "in", "(", "D", ")", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ND", ",", "not", "detectable", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Luciferase activity of IFN-β, NF-κB and ISRE promoter reporter in HEK293T cells transfected with empty vector or plasmids encoding incremental NRF1-Myc for 24 h followed by infection with VSV for 8 h (n=4 biological replicates per group).(B and C) Immunoblot analysis of phosphorylated and total TBK1, p65 and STAT1 in wild-type and NRF1-KO mouse PMs infected with VSV or HSV-1 (B) or stimulated with poly(I:C) or ISD (C) for the indicated time points. GAPDH was used as a loading control. Ratios of phosphorylated proteins versus total proteins normalized to the 0-h or 4-h time point of each wild-type sample.(D) qPCR analysis of Ifnb1, Il6, Tnfa and Cxcl10 mRNA in wild-type and NRF1-KO mouse PMs infected with VSV or HSV-1 or stimulated with poly(I:C) or ISD for the indicated time points (n=3 biological replicates per group). Data information: Data are from three independent experiments and presented as mean ± s.e.m. ND, not detectable, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test.(E) ELISA quantification of IFN-β, IL6 and TNF-α secretion in wild-type and NRF1-KO mouse PMs treated as in (D) (n=3 biological replicates per group). Data information: Data are from three independent experiments and presented as mean ± s.e.m. ND, not detectable, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "8", "-", "week", "-", "old", "Nrf1F", "/", "F", "and", "Nrf1MyeKO", "mice", "(", "n", "=", "3", "for", "PBS", "treatment", "and", "n", "=", "6", "for", "virus", "treatment", ")", "were", "intravenously", "infected", "with", "VSV", "(", "4", "×", "107", "PFU", "/", "mouse", ")", "or", "HSV", "-", "1", "(", "1", "×", "107", "PFU", "/", "mouse", ")", ".", "After", "24", "h", ",", "ELISA", "quantification", "of", "IFN", "-", "β", ",", "IL6", "and", "TNF", "-", "α", "in", "sera", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "were", "used", "to", "measure", "significance", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnb1", ",", "Il6", "and", "Tnfa", "mRNA", "in", "the", "lung", "of", "Nrf1F", "/", "F", "and", "Nrf1MyeKO", "mice", "infected", "with", "VSV", "as", "in", "A", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "were", "used", "to", "measure", "significance", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", ")", "qPCR", "analysis", "of", "VSV", "mRNA", "and", "plaque", "assay", "of", "VSV", "titers", "in", "the", "lungs", "of", "Nrf1F", "/", "F", "and", "Nrf1MyeKO", "mice", "infected", "with", "VSV", "as", "in", "A", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "were", "used", "to", "measure", "significance", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnb1", ",", "Il6", "and", "Tnfa", "mRNA", "in", "the", "brains", "of", "Nrf1F", "/", "F", "and", "Nrf1MyeKO", "mice", "infected", "with", "HSV", "-", "1", "as", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "(", "F", ")", "qPCR", "analysis", "of", "HSV", "-", "1", "UL30", "mRNA", "and", "plaque", "assay", "of", "HSV", "-", "1", "titers", "in", "the", "brain", "of", "Nrf1F", "/", "F", "and", "Nrf1MyeKO", "mice", "infected", "with", "HSV", "-", "1", "as", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "were", "used", "to", "measure", "significance", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "G", ")", "Survival", "of", "Nrf1F", "/", "F", "and", "Nrf1MyeKO", "mice", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", "at", "various", "times", "after", "intraperitoneal", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "infection", "with", "HSV", "-", "1", "(", "2", "×", "107", "PFU", "per", "mouse", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "(", "G", ")", "were", "used", "to", "measure", "significance", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) 8-week-old Nrf1F/F and Nrf1MyeKO mice (n=3 for PBS treatment and n=6 for virus treatment) were intravenously infected with VSV (4×107 PFU/mouse) or HSV-1 (1×107 PFU/mouse). After 24 h, ELISA quantification of IFN-β, IL6 and TNF-α in sera. Data information: Data are presented as mean ± s.e.m. Two-tailed, unpaired Student's t test were used to measure significance. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.(B) qPCR analysis of Ifnb1, Il6 and Tnfa mRNA in the lung of Nrf1F/F and Nrf1MyeKO mice infected with VSV as in A (n=6 per group). Data information: Data are presented as mean ± s.e.m. Two-tailed, unpaired Student's t test were used to measure significance. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.(C) qPCR analysis of VSV mRNA and plaque assay of VSV titers in the lungs of Nrf1F/F and Nrf1MyeKO mice infected with VSV as in A (n=6 per group). Data information: Data are presented as mean ± s.e.m. Two-tailed, unpaired Student's t test were used to measure significance. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.(E) qPCR analysis of Ifnb1, Il6 and Tnfa mRNA in the brains of Nrf1F/F and Nrf1MyeKO mice infected with HSV-1 as in (A) (n=6 per group). (F) qPCR analysis of HSV-1 UL30 mRNA and plaque assay of HSV-1 titers in the brain of Nrf1F/F and Nrf1MyeKO mice infected with HSV-1 as in (A) (n=6 per group). Data information: Data are presented as mean ± s.e.m. Two-tailed, unpaired Student's t test were used to measure significance. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.(G) Survival of Nrf1F/F and Nrf1MyeKO mice (n=10 per group) at various times after intraperitoneal (i.p.) infection with HSV-1 (2×107 PFU per mouse). Data information: Data are presented as mean ± s.e.m. log-rank (Mantel-Cox) test (G) were used to measure significance. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "mtROS", "levels", "measured", "by", "MitoSOX", "staining", "and", "flow", "cytometry", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "(", "left", ")", "or", "HSV", "-", "1", "(", "right", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "MFI", ",", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "B", ")", "DNA", "was", "isolated", "from", "digitonin", "extracts", "of", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "(", "left", ")", "or", "HSV", "-", "1", "(", "right", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Cytosolic", "translocation", "of", "mtDNA", "was", "quantified", "via", "qPCR", "using", "the", "indicated", "primer", "sets", ".", "18S", "rRNA", "served", "as", "a", "control", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "(", "8", "h", ")", "or", "HSV", "-", "1", "(", "4", "h", ")", "were", "imaged", "by", "confocal", "microscope", "after", "staining", "with", "anti", "-", "DNA", "(", "DNA", ")", "and", "anti", "-", "Prohibitin", "(", "Mito", ")", "antibodies", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "µm", "(", "C", ")", ".", "(", "D", ")", "The", "number", "of", "cytosolic", "mtDNA", "puncta", "per", "cell", "was", "quantitated", "by", "ImageJ", "(", "n", "=", "30", "cells", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "or", "representative", "data", "(", "C", ")", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "E", ")", "ELISA", "quantification", "of", "IFN", "-", "β", "(", "left", ")", "and", "IL6", "(", "right", ")", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "pretreated", "with", "or", "without", "EtBr", "(", "450", "ng", "/", "ml", ",", "72", "h", ")", ",", "followed", "by", "infection", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "for", "8", "h", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "(", "F", ")", "ELISA", "quantification", "of", "IFN", "-", "β", "(", "left", ")", "and", "IL6", "(", "right", ")", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "-", "KO", "mouse", "PMs", "pretreated", "with", "or", "without", "MitoQ", "(", "100", "nM", ",", "2", "h", ")", ",", "followed", "by", "infection", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "for", "8", "h", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "H", ")", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnb1", "and", "Il6", "mRNA", "in", "the", "lungs", "of", "Nrf1F", "/", "F", "and", "Nrf1MyeKO", "mice", "pretreated", "with", "MitoQ", "as", "in", "(", "G", ")", "and", "1", "h", "later", "infected", "i", ".", "p", ".", "with", "VSV", "(", "5", "×", "108", "PFU", "/", "mouse", ")", "for", "24", "h", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "(", "I", ")", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnb1", "and", "Il6", "mRNA", "in", "the", "brains", "of", "Nrf1F", "/", "F", "and", "Nrf1MyeKO", "mice", "pretreated", "with", "MitoQ", "as", "in", "(", "G", ")", "and", "1", "h", "later", "infected", "i", ".", "p", ".", "with", "HSV", "-", "1", "(", "1", "×", "107", "PFU", "/", "mouse", ")", "for", "24", "h", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) mtROS levels measured by MitoSOX staining and flow cytometry in wild-type and NRF1-KO mouse PMs infected with VSV (left) or HSV-1 (right) for the indicated time points. MFI, mean fluorescence intensity (n=3 biological replicates per group). Data information: Data are from three independent experiments and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test.(B) DNA was isolated from digitonin extracts of wild-type and NRF1-KO mouse PMs infected with VSV (left) or HSV-1 (right) for the indicated time points. Cytosolic translocation of mtDNA was quantified via qPCR using the indicated primer sets. 18S rRNA served as a control (n=3 biological replicates per group). Data information: Data are from three independent experiments and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test.(C and D) Wild-type and NRF1-KO mouse PMs infected with VSV (8 h) or HSV-1 (4 h) were imaged by confocal microscope after staining with anti-DNA (DNA) and anti-Prohibitin (Mito) antibodies. Scale bars, 5 µm (C). (D) The number of cytosolic mtDNA puncta per cell was quantitated by ImageJ (n=30 cells per group). Data information: Data are from three independent experiments or representative data (C) and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test.(E) ELISA quantification of IFN-β (left) and IL6 (right) in wild-type and NRF1-KO mouse PMs pretreated with or without EtBr (450 ng/ml, 72 h), followed by infection with VSV or HSV-1 for 8 h (n=3 biological replicates per group). (F) ELISA quantification of IFN-β (left) and IL6 (right) in wild-type and NRF1-KO mouse PMs pretreated with or without MitoQ (100 nM, 2 h), followed by infection with VSV or HSV-1 for 8 h (n=3 biological replicates per group). Data information: Data are from three independent experiments and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test.(H) qPCR analysis of Ifnb1 and Il6 mRNA in the lungs of Nrf1F/F and Nrf1MyeKO mice pretreated with MitoQ as in (G) and 1 h later infected i.p. with VSV (5×108 PFU/mouse) for 24 h (n=6 per group). (I) qPCR analysis of Ifnb1 and Il6 mRNA in the brains of Nrf1F/F and Nrf1MyeKO mice pretreated with MitoQ as in (G) and 1 h later infected i.p. with HSV-1 (1×107 PFU/mouse) for 24 h (n=6 per group). Data information: Data are from three independent experiments and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, using a two-tailed, unpaired Student's t test."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "and", "Phos", "-", "tag", "SDS", "-", "PAGE", "analysis", "of", "mouse", "PMs", "infected", "with", "VSV", "or", "HSV", "-", "1", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "C", ")", "Interaction", "between", "TBK1", "and", "NRF1", "in", "HEK293T", "cells", "was", "detected", "by", "co", "-", "immunoprecipitation", "of", "differentially", "tagged", "proteins", ".", "(", "G", ")", "Endogenous", "phospho", "-", "NRF1", "S318", "signal", "was", "detected", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "S318A", "mouse", "PMs", "after", "the", "infection", "with", "different", "viruses", "for", "8", "h", ".", "The", "red", "arrows", "indicate", "phosphorylated", "signals", "for", "NRF1", ".", "(", "J", ")", "ELISA", "quantification", "of", "IFN", "-", "β", "and", "IL6", "secretion", "in", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "S318A", "mouse", "PMs", "treated", "as", "in", "(", "I", ")", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "were", "used", "to", "measure", "significance", ".", "(", "L", ")", "Survival", "of", "wild", "-", "type", "and", "NRF1", "S318A", "mice", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", "at", "various", "times", "after", "intraperitoneal", "infection", "with", "HSV", "-", "1", "(", "2", "×", "107", "PFU", "per", "mouse", ")", ".", "Data", "information", ":", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "(", "L", ")", "were", "used", "to", "measure", "significance", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Immunoblot analysis and Phos-tag SDS-PAGE analysis of mouse PMs infected with VSV or HSV-1 for the indicated time points.(C) Interaction between TBK1 and NRF1 in HEK293T cells was detected by co-immunoprecipitation of differentially tagged proteins.(G) Endogenous phospho-NRF1 S318 signal was detected in wild-type and NRF1 S318A mouse PMs after the infection with different viruses for 8 h. The red arrows indicate phosphorylated signals for NRF1.(J) ELISA quantification of IFN-β and IL6 secretion in wild-type and NRF1 S318A mouse PMs treated as in (I) (n=3 biological replicates per group). Data information: Data are from three independent experiments and presented as mean ± s.e.m. ns, not significant (p > 0.05), *p < 0.05, **p < 0.01. Two-tailed, unpaired Student's t test were used to measure significance.(L) Survival of wild-type and NRF1 S318A mice (n=10 per group) at various times after intraperitoneal infection with HSV-1 (2×107 PFU per mouse). Data information: log-rank (Mantel-Cox) test (L) were used to measure significance."}
{"words": ["Figure", "1Confocal", "images", "demonstrate", "overlap", "of", "GFP", "tagged", "mtON", "with", "MitoTrackerTM", "Red", "CMXRos", "stained", "C", ".", "elegans", "hypodermal", "mitochondria", ".", "Scale", "bar", "10", "µm", ".", "Immunoblot", "comparing", "the", "cytosolic", "supernatant", "and", "the", "mitochondria", "-", "enriched", "pellet", "of", "isolation", "fractions", ".", "GFP", "-", "tagged", "mtON", "migrates", "at", "the", "predicted", "molecular", "weight", "of", "82", "kDa", "accounting", "for", "the", "mitochondria", "-", "target", "sequence", ",", "the", "proton", "pump", ",", "and", "GFP", ".", "mtON", "is", "observed", "only", "in", "the", "mitochondrial", "fraction", "compared", "to", "marker", "proteins", "HSP60", "(", "mitochondria", ")", "and", "actin", "(", "cytosol", ")", ".", "All", "blots", "are", "from", "the", "same", "lanes", "on", "one", "membrane", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Confocal images demonstrate overlap of GFP tagged mtON with MitoTrackerTM Red CMXRos stained C. elegans hypodermal mitochondria. Scale bar 10 µm.Immunoblot comparing the cytosolic supernatant and the mitochondria-enriched pellet of isolation fractions. GFP-tagged mtON migrates at the predicted molecular weight of 82 kDa accounting for the mitochondria-target sequence, the proton pump, and GFP. mtON is observed only in the mitochondrial fraction compared to marker proteins HSP60 (mitochondria) and actin (cytosol). All blots are from the same lanes on one membrane."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "TMRE", "fluorescence", "traces", "in", "arbitrary", "units", "(", "a", ".", "u", ".", ")", "before", "and", "after", "Δψm", "dissipation", "with", "FCCP", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "where", "FCCP", "was", "added", ".", "+", "/", "-", "ATR", "traces", "were", "performed", "in", "the", "absence", "of", "succinate", ".", "mtON", "activation", "was", "continuous", "throughout", "the", "traces", ".", "Light", "green", "trace", "is", "from", "mitochondria", "with", "ATR", ",", "gray", "traces", "are", "without", ".", "Quantification", "of", "change", "in", "fluorescence", "(", "ΔF", ")", "normalized", "to", "the", "maximum", "change", "in", "fluorescence", "given", "by", "succinate", "respiration", "(", "ΔFmax", ")", "for", "each", "mitochondrial", "preparation", ".", "Data", "are", "from", "the", "maximum", "light", "dose", "in", "Fig", ".", "EV", "3A", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0469", ",", "+", "ATR", "succinate", "vs", ".", "+", "ATR", "+", "light", "p", "=", "0", ".", "9978", ",", "n", "=", "6", "mitochondrial", "isolations", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "Representative", "BCECF", "-", "AM", "490", "/", "440", "nm", "ratio", "trace", ".", "Ratio", "of", "545", "nm", "fluorescence", "intensity", "at", "either", "440", "or", "490", "nm", "excitation", ".", "Dashed", "lines", "are", "where", "light", "or", "FCCP", "treatment", "occurred", ".", "Light", "green", "trace", "is", "from", "mitochondria", "with", "ATR", ",", "gray", "traces", "are", "without", ".", "Quantification", "of", "change", "in", "BCECF", "-", "AM", "fluorescence", "ratio", "normalized", "to", "maximum", "change", "given", "by", "succinate", "matrix", "alkalization", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", ",", "-", "ATR", "succinate", "vs", ".", "-", "ATR", ",", "+", "light", "*", "p", "=", "0", ".", "0212", ",", "+", "ATR", "succinate", "vs", ".", "+", "ATR", "light", "p", "=", "0", ".", "999", ",", "+", "ATR", "succinate", "vs", ".", "+", "ATR", ",", "-", "light", "p", "=", "0", ".", "0237", ",", "+", "ATR", ",", "+", "light", "vs", ",", "+", "ATR", ",", "-", "light", "p", "=", "0", ".", "0474", ",", "n", "=", "3", "mitochondrial", "isolations", ".", "Some", "individual", "points", "overlap", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "ATP", "levels", "normalized", "to", "total", "ATP", "synthesis", "given", "by", "succinate", "respiration", ".", "Data", "from", "Fig", ".", "EV", "3B", ".", "Succinate", "data", "shown", "for", "comparison", "after", "normalization", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0011", ",", "+", "ATR", "succinate", "vs", "+", "ATR", "light", "p", "=", "0", ".", "5680", ",", "n", "=", "3", ",", "7", ",", "3", ",", "7", ",", "biological", "replicates", "for", "each", "bar", "from", "left", "to", "right", ".", "Some", "individual", "points", "overlap", ".", "Data", "show", "mean", "+", "SEM", ".", "O2", "required", "to", "consume", "50", "nmoles", "of", "ADP", "after", "mtON", "activation", ".", "Data", "are", "the", "maximum", "illumination", "from", "Fig", ".", "EV", "4D", "using", "time", "-", "matched", "dark", "conditions", ",", "One", "-", "way", "ANOVA", "*", "p", "=", "0", ".", "013", "(", "-", "ATR", ",", "-", "light", "vs", ".", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "=", "0", ".", "010", ".", "-", "ATR", ",", "+", "light", "vs", ".", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "=", "0", ".", "013", ".", ")", "-", "ATR", ",", "-", "light", "n", "=", "5", ",", "rest", "n", "=", "6", "mitochondrial", "preparations", ".", "Data", "show", "mean", "+", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative TMRE fluorescence traces in arbitrary units (a.u.) before and after Δψm dissipation with FCCP. Dashed lines indicate where FCCP was added. +/- ATR traces were performed in the absence of succinate. mtON activation was continuous throughout the traces. Light green trace is from mitochondria with ATR, gray traces are without. Quantification of change in fluorescence (ΔF) normalized to the maximum change in fluorescence given by succinate respiration (ΔFmax) for each mitochondrial preparation. Data are from the maximum light dose in Fig. EV 3A. Two-way ANOVA with Sidak's test for multiple comparisons, *p = 0.0469, +ATR succinate vs. +ATR +light p = 0.9978, n = 6 mitochondrial isolations. Data show mean ± SEM.Representative BCECF-AM 490/440 nm ratio trace. Ratio of 545 nm fluorescence intensity at either 440 or 490 nm excitation. Dashed lines are where light or FCCP treatment occurred. Light green trace is from mitochondria with ATR, gray traces are without. Quantification of change in BCECF-AM fluorescence ratio normalized to maximum change given by succinate matrix alkalization. Two-way ANOVA with Sidak's test for multiple comparisons, -ATR succinate vs. -ATR, +light *p = 0.0212, +ATR succinate vs. +ATR light p = 0.999, +ATR succinate vs. +ATR,-light p = 0.0237, +ATR, +light vs, +ATR, -light p = 0.0474, n = 3 mitochondrial isolations. Some individual points overlap. Data show mean ± SEM.ATP levels normalized to total ATP synthesis given by succinate respiration. Data from Fig. EV 3B. Succinate data shown for comparison after normalization. Two-way ANOVA with Sidak's test for multiple comparisons, *p = 0.0011, +ATR succinate vs +ATR light p = 0.5680, n = 3,7,3,7, biological replicates for each bar from left to right. Some individual points overlap. Data show mean + SEM.O2 required to consume 50 nmoles of ADP after mtON activation. Data are the maximum illumination from Fig. EV 4D using time-matched dark conditions, One-way ANOVA *p = 0.013 (-ATR, -light vs. +ATR, +light p = 0.010. -ATR, +light vs. +ATR, +light p = 0.013.) -ATR, -light n = 5, rest n = 6 mitochondrial preparations. Data show mean + SEM."}
{"words": ["Figure", "3Day", "1", "adult", "animals", "expressing", "mtON", "were", "exposed", "to", "50", "µM", "rotenone", "(", "ETC", "complex", "I", "inhibitor", ")", "for", "5", "hours", "and", "survival", "was", "scored", ".", "Illumination", "was", "continuous", "throughout", "toxin", "exposure", "(", "see", "methods", ")", ".", "ATR", "alone", "was", "protective", "(", "-", "ATR", ",", "-", "light", "vs", ".", "+", "ATR", ",", "-", "light", "p", "=", "0", ".", "016", ".", ")", "The", "effect", "of", "mtON", "activation", "was", "greater", "than", "the", "ATR", "alone", "effect", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "p", "=", "0", ".", "01", ".", "(", "-", "ATR", ",", "-", "light", "vs", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "=", "0", ".", "0002", ".", "-", "ATR", ",", "+", "light", "vs", ".", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "=", "0", ".", "0009", ".", "n", "=", "3", "plates", "each", "condition", "with", "at", "least", "15", "animals", "per", "plate", ")", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "mtON", "-", "expressing", "animals", "were", "exposed", "to", "50", "µM", "antimycin", "A", "(", "complex", "III", "inhibitor", ")", "and", "survival", "was", "scored", "18", "hours", "later", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "p", "=", "0", ".", "02", "(", "-", "ATR", ",", "-", "light", "vs", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "-", "ATR", ",", "+", "light", "vs", ".", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "=", "0", ".", "01", ".", "n", "=", "5", "plates", "each", "condition", "with", "at", "least", "15", "animals", "per", "plate", ")", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "mtON", "-", "expressing", "animals", "were", "exposed", "to", "0", ".", "25", "M", "azide", "(", "complex", "IV", "inhibitor", ")", "for", "1", "hour", "and", "scored", "for", "survival", "1", "hour", "after", "recovering", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", ".", "(", "-", "ATR", ",", "-", "light", "vs", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "-", "ATR", ",", "+", "light", "vs", ".", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "=", "3", "plates", "each", "condition", "with", "at", "least", "15", "animals", "per", "plate", ")", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "mtON", "-", "expressing", "animals", "were", "exposed", "to", "31", "µM", "oligomycin", "A", "(", "ATP", "synthase", "inhibitor", ")", "and", "survival", "was", "scored", "18", "hours", "later", ".", "No", "significant", "differences", "were", "found", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "n", "=", "3", "plates", "each", "condition", "with", "at", "least", "15", "animals", "per", "plate", ")", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "mtON", "-", "expressing", "animals", "in", "a", "complex", "I", "mutant", "background", "(", "gas", "-", "1", ")", "were", "scored", "for", "locomotion", "speed", "in", "the", "presence", "of", "food", "by", "counting", "body", "bends", "per", "minute", ".", "mtON", "activation", "rescued", "the", "decreased", "locomotion", "of", "the", "gas", "-", "1", "mutant", "background", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ",", "-", "ATR", ",", "+", "light", "vs", ".", "+", "ATR", ",", "+", "light", "*", "p", "=", "0", ".", "0145", ",", "+", "ATR", ",", "+", "light", "vs", ".", "wildtype", "(", "WT", ")", "*", "p", "=", "0", ".", "0008", "(", "-", "ATR", ",", "-", "light", "vs", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "=", "0", ".", "0272", ",", "+", "ATR", ",", "-", "light", "vs", ".", "+", "ATR", ",", "+", "light", "p", "=", "0", ".", "0332", ",", "all", "conditions", "vs", "WT", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "30", ",", "30", ",", "30", ",", "41", ",", "41", "animals", "each", "bar", "from", "left", "to", "right", ")", ".", "Data", "show", "mean", "±", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Day 1 adult animals expressing mtON were exposed to 50 µM rotenone (ETC complex I inhibitor) for 5 hours and survival was scored. Illumination was continuous throughout toxin exposure (see methods). ATR alone was protective (-ATR, -light vs. +ATR, -light p = 0.016.) The effect of mtON activation was greater than the ATR alone effect, one-way ANOVA with Tukey's post hoc test *p = 0.01. (-ATR, -light vs +ATR, +light p = 0.0002. -ATR, +light vs. +ATR, +light p = 0.0009. n = 3 plates each condition with at least 15 animals per plate). Data show mean ± SEM. mtON-expressing animals were exposed to 50 µM antimycin A (complex III inhibitor) and survival was scored 18 hours later. One-way ANOVA with Tukey's post hoc test *p = 0.02 (-ATR, -light vs +ATR, +light p = 0.03, -ATR, +light vs. +ATR, +light p = 0.01. n = 5 plates each condition with at least 15 animals per plate). Data show mean ± SEM. mtON-expressing animals were exposed to 0.25 M azide (complex IV inhibitor) for 1 hour and scored for survival 1 hour after recovering, one-way ANOVA with Tukey's post hoc test *p = 0.0002. (-ATR, -light vs +ATR, +light p < 0.0001, -ATR, +light vs. +ATR, +light p <0.0001. n = 3 plates each condition with at least 15 animals per plate). Data show mean ± SEM. mtON-expressing animals were exposed to 31 µM oligomycin A (ATP synthase inhibitor) and survival was scored 18 hours later. No significant differences were found by one-way ANOVA (n = 3 plates each condition with at least 15 animals per plate). Data show mean ± SEM.mtON-expressing animals in a complex I mutant background (gas-1) were scored for locomotion speed in the presence of food by counting body bends per minute. mtON activation rescued the decreased locomotion of the gas-1 mutant background, one-way ANOVA with Tukey's post hoc test, -ATR, +light vs. +ATR, +light *p = 0.0145, +ATR, +light vs. wildtype (WT) *p = 0.0008 (-ATR, -light vs +ATR, +light p = 0.0272, +ATR, -light vs. +ATR, +light p = 0.0332, all conditions vs WT, p < 0.001, n = 30, 30,30,41,41 animals each bar from left to right). Data show mean ± standard deviation."}
{"words": ["Figure", "4Top", ":", "Immunoblot", "assessing", "the", "effect", "of", "mtON", "activation", "on", "AMPK", "phosphorylation", "status", ".", "Top", "bands", "(", "~", "62", "kDa", ")", "are", "phosphorylated", "AMPK", "signal", ",", "and", "bottom", "bands", "(", "~", "43", "kDa", ")", "are", "actin", "signal", ".", "Image", "is", "from", "the", "same", "membrane", "cut", "to", "separately", "probe", "for", "phosphorylated", "AMPK", "(", "pAMPK", ")", "and", "actin", ".", "Bottom", ":", "Densitometry", "analysis", "showing", "decreased", "pAMPK", "to", "actin", "ratio", ",", "as", "there", "is", "no", "known", "antibody", "directed", "against", "total", "AMPK", "in", "C", ".", "elegans", ".", "Phosphorylation", "increases", "in", "the", "absence", "of", "food", ",", "but", "low", "phosphorylation", "is", "preserved", "when", "mtON", "is", "activated", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0203", ",", "n", "=", "3", ",", "3", ",", "3", ",", "4", ",", "4", "biological", "replicates", "each", "bar", "from", "left", "to", "right", ".", "Data", "show", "mean", "+", "standard", "deviation", ".", "Locomotion", "was", "assessed", "by", "counting", "body", "bends", "per", "minute", ".", "Wild", "type", "animals", "were", "compared", "to", "aak", "-", "2", "(", "ok524", ")", "mutant", "animals", ".", "2", "-", "sample", ",", "2", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "wild", "type", "n", "=", "35", ",", "aak", "-", "2", "n", "=", "39", "animals", "across", "at", "least", "3", "days", ".", "Data", "show", "mean", "±", "standard", "deviation", ".", "Locomotion", "in", "response", "to", "mtON", "activation", ".", "Illumination", "was", "continuous", "throughout", "body", "bends", "measurement", "(", "see", "methods", ")", ".", "For", "AAK", "-", "2", "activation", ",", "animals", "were", "exposed", "to", "1", "mM", "AICAR", "for", "4", "hours", "before", "body", "bends", "measurement", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ",", "-", "ATR", ",", "+", "light", "vs", "+", "ATR", ",", "+", "light", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "+", "ATR", ",", "+", "light", "vs", ".", "AICAR", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "+", "ATR", ",", "+", "light", "vs", "AICAR", "+", "light", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "=", "36", ",", "39", ",", "37", ",", "46", ",", "36", ",", "36", "animals", "each", "bar", "from", "left", "to", "right", ".", "Data", "show", "mean", "±", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Top: Immunoblot assessing the effect of mtON activation on AMPK phosphorylation status. Top bands (~62 kDa) are phosphorylated AMPK signal, and bottom bands (~43 kDa) are actin signal. Image is from the same membrane cut to separately probe for phosphorylated AMPK (pAMPK) and actin. Bottom: Densitometry analysis showing decreased pAMPK to actin ratio, as there is no known antibody directed against total AMPK in C. elegans. Phosphorylation increases in the absence of food, but low phosphorylation is preserved when mtON is activated, two-way ANOVA with Sidak's test for multiple comparisons, *p = 0.0203, n = 3,3,3,4,4 biological replicates each bar from left to right. Data show mean + standard deviation.Locomotion was assessed by counting body bends per minute. Wild type animals were compared to aak-2(ok524) mutant animals. 2-sample, 2-tailed unpaired t-test *p < 0.0001, wild type n = 35, aak-2 n = 39 animals across at least 3 days. Data show mean ± standard deviation.Locomotion in response to mtON activation. Illumination was continuous throughout body bends measurement (see methods). For AAK-2 activation, animals were exposed to 1 mM AICAR for 4 hours before body bends measurement. One-way ANOVA with Tukey's post hoc test, -ATR, +light vs +ATR, +light *p < 0.0001, +ATR, +light vs. AICAR *p < 0.0001, +ATR,+light vs AICAR +light *p < 0.0001. n = 36, 39, 37, 46, 36, 36 animals each bar from left to right. Data show mean ± standard deviation."}
{"words": ["Figure", "5Survival", "after", "HR", "in", "day", "1", "adult", "animals", "is", "shown", "with", "hypoxic", "preconditioning", "(", "PC", ",", "represented", "by", "diagonal", "stripes", ")", "2", "-", "sample", "2", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "ctrl", "vs", ".", "PC", "*", "p", "=", "0", ".", "0035", ",", "n", "=", "4", ",", "each", "averaged", "from", "3", "technical", "replicates", "with", "at", "least", "15", "animals", "per", "replicate", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "Protection", "(", "%", ")", "is", "percent", "survival", "minus", "percent", "survival", "of", "control", "condition", ".", "PC", "data", "calculated", "from", "panel", "B", ".", "FCCP", "final", "concentrations", "0", ".", "001", ",", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "1", ",", "1", "nM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ",", "PC", "vs", ".", "0", ".", "001", "nM", "FCCP", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0012", ",", "0", ".", "001", "nM", "FCCP", "vs", "0", ".", "01", "FCCP", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0142", ",", "n", "=", "4", ",", "3", ",", "3", ",", "3", ",", "3", "independent", "experiments", "each", "bar", "from", "left", "to", "right", ",", "each", "averaged", "from", "3", "technical", "replicates", "with", "at", "least", "15", "animals", "per", "replicate", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "Illumination", "was", "continuous", "throughout", "PC", "alone", ";", "control", "illumination", "was", "for", "the", "same", "duration", "under", "normoxic", "conditions", "(", "see", "methods", "&", "panel", "A", ")", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "comparing", "+", "ATR", "vs", "-", "ATR", "in", "each", "group", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "016", ",", "n", "=", "11", ",", "11", ",", "4", ",", "4", ",", "6", ",", "6", "independent", "experiments", "each", "bar", "from", "left", "to", "right", ",", "each", "averaged", "from", "3", "technical", "replicates", "with", "at", "least", "15", "animals", "per", "replicate", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "light", "during", "hypoxia", ".", "2", "sample", "2", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0276", ",", "n", "=", "7", "independent", "experiments", ",", "each", "averaged", "from", "3", "technical", "replicates", "with", "at", "least", "15", "animals", "per", "replicate", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Survival after HR in day 1 adult animals is shown with hypoxic preconditioning (PC, represented by diagonal stripes) 2-sample 2-tailed unpaired t-test, ctrl vs. PC *p = 0.0035, n = 4, each averaged from 3 technical replicates with at least 15 animals per replicate. Data show mean ± SEM.Protection (%) is percent survival minus percent survival of control condition. PC data calculated from panel B. FCCP final concentrations 0.001, 0.01, 0.1, 1 nM. One-way ANOVA with Tukey's post hoc test, PC vs. 0.001 nM FCCP, *p = 0.0012, 0.001 nM FCCP vs 0.01 FCCP, *p = 0.0142, n = 4,3,3,3,3 independent experiments each bar from left to right, each averaged from 3 technical replicates with at least 15 animals per replicate. Data show mean ± SEM.Illumination was continuous throughout PC alone; control illumination was for the same duration under normoxic conditions (see methods & panel A). Two-way ANOVA comparing +ATR vs -ATR in each group. *p = 0.016, n = 11,11,4,4,6,6 independent experiments each bar from left to right, each averaged from 3 technical replicates with at least 15 animals per replicate. Data show mean ± SEM.light during hypoxia. 2 sample 2-tailed unpaired t-test, *p = 0.0276, n = 7 independent experiments, each averaged from 3 technical replicates with at least 15 animals per replicate. Data show mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "1Immunoblot", "of", "expression", "levels", "of", "MYC", ",", "TSC1", ",", "TSC2", ",", "and", "β", "-", "actin", "loading", "control", "in", "high", "MYC", "Burkitt", "'", "s", "lymphoma", "(", "BL", ")", "cells", "compared", "to", "low", "MYC", "Hodgkin", "lymphoma", "(", "HL", ")", "cells", ".", "Immunoblots", "showing", "expression", "levels", "of", "MYC", ",", "TSC1", ",", "TSC2", "or", "β", "-", "actin", "loading", "control", "in", "P493", "-", "6", "cells", "treated", "with", "tetracycline", "for", "72", "hours", "(", "+", "Tet", ")", "or", "in", "untreated", "cells", "(", "-", "Tet", ")", ".", "Relative", "TSC1", "and", "TSC2", "mRNA", "expression", "levels", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "for", "high", "MYC", "(", "-", "Tet", ")", "versus", "low", "MYC", "(", "+", "Tet", ")", "P493", "-", "6", "cells", "treated", "for", "24", "h", "with", "tetracycline", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "statistical", "relevance", "was", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "tailed", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "TSC1", "mRNA", "levels", "upon", "MYC", "suppression", "for", "24h", "-", "72h", "(", "+", "Tet", ")", ".", "Immunoblots", "for", "24h", "and", "48h", "(", "+", "Tet", ")", "show", "S6K", "and", "phosphorylation", "(", "P", "-", ")", "of", "S6K", "as", "downstream", "mTORC1", "target", ",", "and", "β", "-", "actin", "loading", "control", ".", "For", "72", "h", "(", "+", "Tet", ")", "the", "immunoblots", "show", "expression", "of", "MYC", "and", "phosphorylation", "(", "P", "-", ")", "of", "downstream", "mTORC1", "targets", "S6K", "and", "S6", ",", "and", "α", "-", "tubulin", "as", "loading", "control", ".", "Upper", "immunoblot", "shows", "the", "reduction", "in", "TSC1", "levels", "upon", "expression", "of", "two", "different", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNAs", "compared", "to", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "in", "P493", "-", "6", "cells", ".", "Other", "blots", "show", "the", "expression", "levels", "of", "TSC2", ",", "S6K", "/", "P", "-", "S6K", ",", "S6", "/", "P", "-", "S6", "and", "α", "-", "tubulin", "for", "loading", "control", ".", "Immunoblots", "of", "indicated", "proteins", "in", "P493", "-", "6", "cells", "with", "high", "MYC", "(", "-", "Tet", ",", "72", "hours", ")", "or", "low", "MYC", "(", "+", "Tet", ",", "72", "hours", ")", "levels", "either", "treated", "with", "rapamycin", "or", "solvent", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunoblot of expression levels of MYC, TSC1, TSC2, and β-actin loading control in high MYC Burkitt's lymphoma (BL) cells compared to low MYC Hodgkin lymphoma (HL) cells.Immunoblots showing expression levels of MYC, TSC1, TSC2 or β-actin loading control in P493-6 cells treated with tetracycline for 72 hours (+Tet) or in untreated cells (-Tet).Relative TSC1 and TSC2 mRNA expression levels determined by qRT-PCR for high MYC (-Tet) versus low MYC (+Tet) P493-6 cells treated for 24 h with tetracycline (mean ± st.dev., n=3 technical replicates) *p< 0.05; **p< 0.01; statistical relevance was determined by unpaired t-test (two-tailed).qRT-PCR analysis of TSC1 mRNA levels upon MYC suppression for 24h-72h (+Tet). Immunoblots for 24h and 48h (+Tet) show S6K and phosphorylation (P-) of S6K as downstream mTORC1 target, and β-actin loading control. For 72 h (+Tet) the immunoblots show expression of MYC and phosphorylation (P-) of downstream mTORC1 targets S6K and S6, and α-tubulin as loading control.Upper immunoblot shows the reduction in TSC1 levels upon expression of two different TSC1-specific sh-RNAs compared to scrambled control sh-RNA in P493-6 cells. Other blots show the expression levels of TSC2, S6K/P-S6K, S6/P-S6 and α-tubulin for loading control.Immunoblots of indicated proteins in P493-6 cells with high MYC (-Tet, 72 hours) or low MYC (+Tet, 72 hours) levels either treated with rapamycin or solvent."}
{"words": ["Figure", "2Elevated", "TSC1", "and", "MYC", "expression", "in", "BL", "(", "cohort", "1", ")", ".", "Example", "of", "immune", "staining", "of", "TSC1", ",", "MYC", ",", "the", "B", "-", "cell", "marker", "CD20", ",", "and", "DAPI", "nuclear", "DNA", "-", "staining", "in", "germinal", "centers", "of", "control", "lymph", "nodes", "(", "upper", "rows", ")", "and", "samples", "from", "BL", "patients", "(", "lower", "rows", ")", ".", "Boxplots", "at", "the", "right", "show", "quantification", "of", "TSC1", "or", "MYC", "staining", "from", "control", "germinal", "centers", "and", "BL", "samples", "(", "see", "materials", "and", "methods", ")", "(", "the", "horizontal", "line", "shows", "the", "median", ",", "whiskers", "show", "maximum", "and", "minimum", "data", "points", "and", "the", "box", "represents", "the", "first", "to", "the", "third", "quartiles", ",", "n", "=", "56", "fields", "for", "tumor", "samples", "and", "n", "=", "21", "fields", "for", "control", "germinal", "centers", ";", "scale", "bar", "=", "100", "μm", ")", ".", "Quantification", "of", "immunoblot", "analysis", "of", "TSC", "expression", "in", "BL", "(", "cohort", "2", ")", "(", "n", "=", "13", ")", "compared", "to", "healthy", "tonsils", "(", "n", "=", "3", ")", "or", "reactive", "lymph", "nodes", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ")", "shown", "in", "Fig", "EV2B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Elevated TSC1 and MYC expression in BL (cohort 1). Example of immune staining of TSC1, MYC, the B-cell marker CD20, and DAPI nuclear DNA-staining in germinal centers of control lymph nodes (upper rows) and samples from BL patients (lower rows). Boxplots at the right show quantification of TSC1 or MYC staining from control germinal centers and BL samples (see materials and methods) (the horizontal line shows the median, whiskers show maximum and minimum data points and the box represents the first to the third quartiles, n=56 fields for tumor samples and n=21 fields for control germinal centers; scale bar = 100 μm).Quantification of immunoblot analysis of TSC expression in BL (cohort 2) (n=13) compared to healthy tonsils (n=3) or reactive lymph nodes (n=3) (mean ± st. dev.) shown in Fig EV2B."}
{"words": ["Figure", "3Left", "graph", "shows", "the", "multiplication", "rate", "of", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "either", "a", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "determined", "by", "viable", "cell", "counting", "3", "days", "after", "seeding", "of", "equal", "number", "of", "viable", "cells", "(", "determined", "by", "Trypan", "blue", "exclusion", ";", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Right", "graph", "shows", "percentage", "of", "apoptotic", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "shRNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "determined", "by", "FACS", "analysis", "of", "AnnexinV", "/", "7AAD", "stained", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Rapamycin", "treatment", "recovers", "survival", "of", "TSC1", "knockdown", "in", "P493", "-", "6", "cells", ".", "Relative", "viable", "cell", "number", "counts", "of", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "shRNA", "or", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "14", "days", "after", "seeding", "equal", "number", "of", "viable", "cells", "(", "Trypan", "blue", "exclusion", ")", ",", "in", "the", "presence", "of", "30pM", "rapamycin", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "TSC1", "knockdown", "is", "synthetic", "lethal", "with", "MYC", "deregulation", ".", "U2OS", "-", "MYC", "-", "ER", "cells", "expressing", "either", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "were", "treated", "with", "hydroxytamoxifen", "to", "induce", "MYC", "and", "rapamycin", "(", "100", "nM", ")", "where", "indicated", ".", "Percentage", "of", "apoptotic", "cells", "was", "determined", "with", "Annexin", "/", "7AAD", "staining", "4", "days", "after", "MYC", "induction", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Survival", "rate", "of", "different", "BL", "cell", "lines", "upon", "TSC1", "knockdown", ".", "Graphs", "show", "numbers", "of", "viable", "cells", "expressing", "either", "a", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "3", "days", "after", "seeding", "of", "equal", "number", "of", "viable", "cells", "(", "determined", "by", "trypan", "blue", "exclusion", ";", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Immunoblots", "of", "control", "-", "or", "TSC1", "-", "shRNA", "expressing", "BL2", "or", "DG75", "cells", "treated", "with", "different", "concentrations", "of", "Rapamycin", "to", "either", "completely", "inhibit", "mTORC1", "activity", "(", "10nM", ")", "or", "titrate", "the", "activity", "to", "control", "levels", "(", "30", "pM", ")", ",", "and", "survival", "rate", "of", "these", "cells", "over", "7", "days", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ";", "(", "Bl2", "cells", "were", "selected", "for", "stable", "knockdown", "with", "Puromycin", ",", "DG75", "cells", "without", "selection", ")", ".", "Ramos", "cells", "expressing", "either", "a", "TSC1", "-", "specific", "or", "a", "control", "shRNA", "were", "inoculated", "into", "NOD", "/", "SCID", "mice", "and", "tumor", "volume", "was", "measured", "regularly", ".", "The", "immunoblot", "shows", "the", "level", "of", "knockdown", "of", "TSC1", "(", "sh", "-", "TSC1b", ")", "compared", "to", "control", "(", "sh", "-", "contr", ")", ",", "and", "levels", "of", "TSC2", "and", "phosphorylated", "mTORC1", "target", "proteins", "before", "inoculation", ".", "Tumor", "growth", "curves", "show", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ")", ".", "Pictures", "of", "xenotransplanted", "human", "Ramos", "lymphoma", "tumors", "35", "days", "after", "inoculation", ".", "The", "top", "panels", "show", "tumors", "derived", "from", "Ramos", "cells", "stably", "expressing", "control", "sh", "-", "RNA", "(", "sh", "-", "contr", ")", ";", "the", "lower", "panels", "show", "tumors", "derived", "from", "Ramos", "cells", "stably", "expressing", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "(", "sh", "-", "TSC1b", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Left graph shows the multiplication rate of P493-6 (-Tet) cells expressing either a scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA determined by viable cell counting 3 days after seeding of equal number of viable cells (determined by Trypan blue exclusion; mean ± st.dev., n=3 biological replicates). Right graph shows percentage of apoptotic P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control shRNA or a TSC1-specific sh-RNA determined by FACS analysis of AnnexinV/7AAD stained cells (mean ± st.dev., n=3 biological replicates).Rapamycin treatment recovers survival of TSC1 knockdown in P493-6 cells. Relative viable cell number counts of P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control shRNA or TSC1-specific sh-RNA 14 days after seeding equal number of viable cells (Trypan blue exclusion), in the presence of 30pM rapamycin where indicated (mean ± st.dev., n=3 biological replicates).TSC1 knockdown is synthetic lethal with MYC deregulation. U2OS-MYC-ER cells expressing either scrambled control sh-RNA or TSC1-specific sh-RNA were treated with hydroxytamoxifen to induce MYC and rapamycin (100 nM) where indicated. Percentage of apoptotic cells was determined with Annexin/7AAD staining 4 days after MYC induction (mean ± st.dev., n=3 biological replicates).Survival rate of different BL cell lines upon TSC1 knockdown. Graphs show numbers of viable cells expressing either a scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA 3 days after seeding of equal number of viable cells (determined by trypan blue exclusion; mean ± st.dev., n=3 biological replicates).Immunoblots of control- or TSC1-shRNA expressing BL2 or DG75 cells treated with different concentrations of Rapamycin to either completely inhibit mTORC1 activity (10nM) or titrate the activity to control levels (30 pM), and survival rate of these cells over 7 days (mean ± st.dev., n=3 biological replicates); (Bl2 cells were selected for stable knockdown with Puromycin, DG75 cells without selection).Ramos cells expressing either a TSC1-specific or a control shRNA were inoculated into NOD/SCID mice and tumor volume was measured regularly. The immunoblot shows the level of knockdown of TSC1 (sh-TSC1b) compared to control (sh-contr), and levels of TSC2 and phosphorylated mTORC1 target proteins before inoculation. Tumor growth curves show mean ± SEM (n=8/group). Pictures of xenotransplanted human Ramos lymphoma tumors 35 days after inoculation. The top panels show tumors derived from Ramos cells stably expressing control sh-RNA (sh-contr); the lower panels show tumors derived from Ramos cells stably expressing TSC1-specific sh-RNA (sh-TSC1b)."}
{"words": ["Figure", "4TSC1", "knockdown", "increases", "respiration", "in", "an", "mTORC1", "and", "MYC", "dependent", "manner", ".", "Rate", "of", "basal", "oxygen", "consumption", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "TSC", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", ",", "treated", "with", "20", "nM", "rapamycin", "for", "12", "h", ",", "or", "tetracycline", "to", "repress", "MYC", "for", "48", "h", "where", "indicatedTSC1", "knockdown", "increases", "respiration", "in", "an", "mTORC1", "and", "MYC", "dependent", "manner", ".", "Rate", "of", "basal", "oxygen", "consumption", "in", "response", "to", "10", "μM", "of", "the", "chemical", "uncoupler", "DNP", "to", "determine", "maximal", "respiration", "or", "10", "μM", "of", "the", "ATP", "synthase", "inhibitor", "oligomycin", "where", "indicated", "(", "B", ")", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", ".", "Ratio", "of", "mitochondrial", "to", "genomic", "DNA", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "either", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", ",", "and", "treated", "with", "20", "nM", "rapamycin", "for", "12", "h", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "expression", "of", "cytochrome", "C", "(", "CYCS", ")", "or", "ATP5G1", "mRNAs", "(", "D", ")", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "either", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", ",", "and", "treated", "with", "20", "nM", "rapamycin", "for", "12", "h", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "TSC1", "knockdown", "results", "in", "elevated", "ROS", "levels", "in", "a", "MYC", "and", "mTORC1", "dependent", "manner", ".", "FACS", "analysis", "of", "DCF", "-", "DA", "stained", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "to", "evaluate", "ROS", "production", "and", "treated", "with", "20", "nM", "rapamycin", "for", "12", "h", "and", "tetracycline", "for", "48", "h", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "TSC1", "knockdown", "results", "in", "increased", "phosphorylation", "of", "SAPK", "/", "JNK", ".", "Immunoblot", "of", "SAPK", "/", "JNK", "Thr183", "/", "Tyr185", "-", "phosphorylation", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", ".", "α", "-", "tubulin", "expression", "serves", "as", "loading", "control", ".", "Antioxidant", "treatment", "rescues", "cells", "from", "death", "caused", "by", "TSC1", "knockdown", ".", "Relative", "viable", "cell", "number", "counts", "of", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "shRNA", "or", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "3", "days", "after", "seeding", "equal", "number", "of", "viable", "cells", "(", "Trypan", "blue", "exclusion", ")", ",", "in", "the", "presence", "of", "10", "μM", "of", "the", "antioxidant", "BHA", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4TSC1 knockdown increases respiration in an mTORC1 and MYC dependent manner. Rate of basal oxygen consumption in P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control sh-RNA or TSC-specific sh-RNA, treated with 20 nM rapamycin for 12 h, or tetracycline to repress MYC for 48 h where indicatedTSC1 knockdown increases respiration in an mTORC1 and MYC dependent manner. Rate of basal oxygen consumption in response to 10 μM of the chemical uncoupler DNP to determine maximal respiration or 10 μM of the ATP synthase inhibitor oligomycin where indicated (B) (mean ± st. dev., n=6 biological replicates).Ratio of mitochondrial to genomic DNA determined by qRT-PCR in P493-6 (-Tet) cells expressing either scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA, and treated with 20 nM rapamycin for 12 h where indicated (mean ± st.dev., n=3 technical replicates).expression of cytochrome C (CYCS) or ATP5G1 mRNAs (D) determined by qRT-PCR in P493-6 (-Tet) cells expressing either scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA, and treated with 20 nM rapamycin for 12 h where indicated (mean ± st.dev., n=3 technical replicates).TSC1 knockdown results in elevated ROS levels in a MYC and mTORC1 dependent manner. FACS analysis of DCF-DA stained P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA to evaluate ROS production and treated with 20 nM rapamycin for 12 h and tetracycline for 48 h where indicated (mean ± st.dev., n=3 biological replicates).TSC1 knockdown results in increased phosphorylation of SAPK/JNK. Immunoblot of SAPK/JNK Thr183/Tyr185-phosphorylation in P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA. α-tubulin expression serves as loading control.Antioxidant treatment rescues cells from death caused by TSC1 knockdown. Relative viable cell number counts of P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control shRNA or TSC1-specific sh-RNA 3 days after seeding equal number of viable cells (Trypan blue exclusion), in the presence of 10 μM of the antioxidant BHA where indicated (mean ± st.dev., n=3 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "5Accumulation", "of", "EU", "-", "labeled", "(", "Click", "-", "It", ",", "Invitrogen", ")", "TSC1", "-", "mRNA", "over", "3", "h", "in", "high", "MYC", "(", "-", "Tet", ")", "versus", "low", "MYC", "(", "+", "Tet", ")", "P493", "-", "6", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "Drawing", "of", "the", "TSC1", "promoter", "and", "luciferase", "-", "reporter", "constructs", "with", "the", "predicted", "E", "-", "box", "(", "CACGTG", ",", "pos", ".", "-", "317", "/", "-", "322", ")", "indicated", ".", "Relative", "luciferase", "units", "(", "RLU", ")", "of", "co", "-", "transfection", "experiments", "using", "the", "indicated", "TSC1", "-", "promoter", "-", "reporters", "with", "MYC", "normalized", "to", "empty", "pcDNA3", "expression", "vector", "in", "HeLa", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Immunoblot", "shows", "MYC", "overexpression", "and", "α", "-", "tubulin", "as", "loading", "control", ".", "TSC1", "mRNA", "turnover", "determined", "by", "pulse", "and", "chase", "(", "Click", "-", "It", ",", "Invitrogen", ")", "over", "8", "h", "in", "P493", "-", "6", "cells", ",", "either", "treated", "with", "tetracycline", "to", "repress", "MYC", "or", "left", "untreated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "miR", "-", "15a", "expression", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "P493", "-", "6", "cells", "treated", "with", "tetracycline", "for", "3", "days", "(", "+", "Tet", ")", "to", "suppress", "MYC", "expression", "or", "in", "untreated", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "Immunoblots", "showing", "expression", "levels", "of", "TSC1", ",", "S6K", "/", "P", "-", "S6K", "and", "α", "-", "tubulin", "in", "P493", "-", "6", "and", "HEK293T", "cells", "overexpressing", "miR", "-", "15a", "or", "a", "control", "miRNA", ".", "At", "the", "right", "miR", "-", "15a", "overexpression", "was", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "P493", "-", "6", "and", "HEK293T", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "Immunoblot", "showing", "TSC1", "expression", ",", "S6K", "/", "P", "-", "S6K", "and", "α", "‑", "tubulin", "in", "MCF", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "LNA", "modified", "anti", "-", "sense", "miR", "-", "15a", "oligos", "or", "control", "LNAs", ".", "At", "the", "right", ",", "successful", "miR", "-", "15a", "knockdown", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "MCF", "-", "7", "cells", "is", "shown", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "Relative", "luciferase", "activities", "(", "RLU", ")", "derived", "from", "reporter", "constructs", "containing", "TSC1", "-", "3", "´", "UTR", "wild", "type", "sequences", "or", "with", "mutated", "miR", "-", "15a", "seed", "sequence", "binding", "site", "on", "co", "-", "transfection", "with", "miR", "-", "15a", "in", "MCF", "-", "7", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "The", "drawing", "at", "the", "left", "shows", "the", "TSC1", "-", "3", "'", "UTR", "with", "the", "position", "of", "the", "miR", "-", "15a", "/", "16", "-", "1", "seed", "sequence", "and", "used", "mutation", "indicated", ".", "Rate", "of", "oxygen", "consumption", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "ectopically", "expressing", "miR", "-", "15a", "or", "control", "-", "miRNA", "vector", ",", "under", "basal", "conditions", "and", "in", "response", "to", "10", "μM", "DNP", "or", "10", "μM", "oligomycin", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "8", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Accumulation of EU-labeled (Click-It, Invitrogen) TSC1-mRNA over 3 h in high MYC (-Tet) versus low MYC (+Tet) P493-6 cells (mean ± st. dev., n=3 technical replicates).Drawing of the TSC1 promoter and luciferase-reporter constructs with the predicted E-box (CACGTG, pos. -317/-322) indicated. Relative luciferase units (RLU) of co-transfection experiments using the indicated TSC1-promoter-reporters with MYC normalized to empty pcDNA3 expression vector in HeLa cells (mean ± st. dev., n=3). Immunoblot shows MYC overexpression and α-tubulin as loading control.TSC1 mRNA turnover determined by pulse and chase (Click-It, Invitrogen) over 8 h in P493-6 cells, either treated with tetracycline to repress MYC or left untreated (mean ± st.dev., n=3 technical replicates).miR-15a expression determined by qRT-PCR in P493-6 cells treated with tetracycline for 3 days (+Tet) to suppress MYC expression or in untreated (-Tet) cells (mean ± st. dev., n=3 technical replicates).Immunoblots showing expression levels of TSC1, S6K/P-S6K and α-tubulin in P493-6 and HEK293T cells overexpressing miR-15a or a control miRNA. At the right miR-15a overexpression was determined by qRT-PCR in P493-6 and HEK293T cells (mean ± st. dev., n=3 technical replicates).Immunoblot showing TSC1 expression, S6K/P-S6K and α‑tubulin in MCF-7 cells transfected with LNA modified anti-sense miR-15a oligos or control LNAs. At the right, successful miR-15a knockdown determined by qRT-PCR in MCF-7 cells is shown (mean ± st. dev., n=3 technical replicates).Relative luciferase activities (RLU) derived from reporter constructs containing TSC1-3´UTR wild type sequences or with mutated miR-15a seed sequence binding site on co-transfection with miR-15a in MCF-7 cells (mean ± st. dev., n=3 biological replicates). The drawing at the left shows the TSC1-3'UTR with the position of the miR-15a/16-1 seed sequence and used mutation indicated.Rate of oxygen consumption in P493-6 (-Tet) cells ectopically expressing miR-15a or control-miRNA vector, under basal conditions and in response to 10 μM DNP or 10 μM oligomycin where indicated (mean ± st. dev., n=8 biological replicates)."}
{"words": ["figf1a", ",", "Polychromasia", "(", "Wright", "-", "Giemsa", "stain", ",", "indicated", "by", "arrows", ")", "and", "increased", "reticulocytes", "(", "brilliant", "cresyl", "blue", "stain", ")", "revealed", "by", "staining", "blood", "smears", "from", "6", "-", "week", "-", "old", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "Nix", "-", "/", "-", "mice", "(", "scale", "bar", ",", "20", "µm", ")", ".", "b", ",", "c", ",", "Ter119", "(", "b", ")", "or", "Mitotracker", "deep", "red", "(", "c", ")", "versus", "CD71", "staining", "of", "RBCs", "from", "3", "-", "or", "6", "-", "week", "-", "old", "mice", ".", "Cell", "counts", "were", "also", "calculated", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "b", ",", "c", ",", "Ter119", "(", "b", ")", "or", "Mitotracker", "deep", "red", "(", "c", ")", "versus", "CD71", "staining", "of", "RBCs", "from", "3", "-", "or", "6", "-", "week", "-", "old", "mice", ".", "Cell", "counts", "were", "also", "calculated", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "d", ",", "Analyses", "of", "RBCs", "from", "3", "-", "or", "6", "-", "week", "-", "oldmice", "by", "immunocytochemistryAnalyses", "of", "RBCs", "from", "3", "-", "or", "6", "-", "week", "-", "oldmice", "by", "transmission", "electron"], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, Polychromasia (Wright-Giemsa stain, indicated by arrows) and increased reticulocytes (brilliant cresyl blue stain) revealed by staining blood smears from 6-week-old wild-type (WT) or Nix-/- mice (scale bar, 20 µm).b, c, Ter119 (b) or Mitotracker deep red (c) versus CD71 staining of RBCs from 3- or 6-week-old mice. Cell counts were also calculated (mean ± s.e.m.; n = 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.b, c, Ter119 (b) or Mitotracker deep red (c) versus CD71 staining of RBCs from 3- or 6-week-old mice. Cell counts were also calculated (mean ± s.e.m.; n = 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.d, Analyses of RBCs from 3- or 6-week-oldmice by immunocytochemistryAnalyses of RBCs from 3- or 6-week-oldmice by transmission electron microscopy"}
{"words": ["figf2a", ",", "Quantification", "of", "NHS", "-", "biotin", "-", "labelled", "RBCs", "or", "transferred", "CMFDA", "-", "labelled", "RBCs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "b", ",", "Western", "blot", "analyses", "of", "caspases", "in", "RBCs", "after", "in", "vitro", "culture", ".", "Asterisks", "denote", "processed", "caspases", ".", "FL", ",", "full", "length", ".", "c", ",", "The", "relative", "luminescence", "units", "(", "RLU", ")", "of", "caspase", "activities", "in", "cultured", "RBCs", "and", "the", "suppression", "of", "annexin", "V", "staining", "in", "Nix", "-", "/", "-", "RBCs", "after", "12", "-", "h", "culture", "in", "the", "presence", "of", "qVD", "-", "oph", "or", "solvent", "control", "(", "DMSO", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "d", ",", "Mitotracker", "versus", "annexin", "V", "staining", "of", "RBCs", "after", "in", "vitro", "culture", ".", "e", ",", "Mean", "fluorescent", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "ROS", "staining", "in", "RBCs", "after", "in", "vitro", "culture", ",", "and", "caspase", "activities", "in", "Nix", "-", "/", "-", "RBCs", "after", "24", "h", "culture", "with", "solvent", "control", ",", "ROS", "scavengers", "or", "qVD", "-", "oph", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "BHT", ",", "butylated", "hydroxytoluene", ";", "CAT", ",", "catalase", ";", "TEM", ",", "tempol", ".", "f", ",", "Haematoxylin", "and", "eosin", "(", "HE", ")", "staining", "of", "spleen", "sections", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "wild", "-", "type", "and", "Nix", "-", "/", "-", "mice", ".", "Arrows", "denote", "iron", "deposits", "within", "macrophagecytoplasm", ".", "Iron", "deposits", "were", "also", "stained", "with", "Prussian", "blue", ",", "followed", "by", "counterstain", "with", "nuclear", "-", "fast", "red", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "g", ",", "Real", "-", "time", "RT", "-", "PCR", "of", "erythropoietin", "(", "Epo", ")", "(", "n", "=", "12", ")", ".", "For", "all", "relevant", "panels", ",", "statistical", "significance", "of", "the", "data", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "is", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a, Quantification of NHS-biotin-labelled RBCs or transferred CMFDA-labelled RBCs (n = 3).b, Western blot analyses of caspases in RBCs after in vitro culture. Asterisks denote processed caspases. FL, full length.c, The relative luminescence units (RLU) of caspase activities in cultured RBCs and the suppression of annexin V staining in Nix-/- RBCs after 12-h culture in the presence of qVD-oph or solvent control (DMSO) (n = 3).d, Mitotracker versus annexin V staining of RBCs after in vitro culture.e, Mean fluorescent intensity (MFI) of ROS staining in RBCs after in vitro culture, and caspase activities in Nix-/- RBCs after 24 h culture with solvent control, ROS scavengers or qVD-oph (n = 3). BHT, butylated hydroxytoluene; CAT, catalase; TEM, tempol.f, Haematoxylin and eosin (HE) staining of spleen sections of 9-week-old wild-type and Nix-/- mice. Arrows denote iron deposits within macrophagecytoplasm. Iron deposits were also stained with Prussian blue, followed by counterstain with nuclear-fast red. Scale bar, 20 µm.g, Real-time RT-PCR of erythropoietin (Epo) (n = 12). For all relevant panels, statistical significance of the data (mean ± s.e.m.) is: *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001."}
{"words": ["figf3a", ",", "Ter119", "+", "CD71", "+", "reticulocytes", "sorted", "at", "day", "3", "or", "6", "after", "PHZ", "treatment", "were", "cultured", "for", "in", "vitro", "maturation", "for", "0", "(", "top", "row", ")", ",", "2", "(", "middle", "row", ")", "or", "4", "(", "bottom", "row", ")", "days", ",", "followed", "by", "Mitotracker", "deep", "red", "and", "Ter119", "staining", ".", "b", ",", "CD71", "+", "Ter119", "+", "reticulocytes", "sorted", "at", "day", "3", "after", "PHZ", "treatment", "were", "cultured", "and", "stained", "with", "new", "methylene", "blue", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "c", ",", "CD71", "+", "Ter119", "+", "reticulocytes", "sorted", "at", "day", "3", "after", "PHZ", "treatment", "were", "stained", "for", "LC3", "and", "COX", "IV", "and", "analysed", "by", "deconvolution", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "The", "Pearson", "coefficiency", "for", "LC3", "and", "COX", "IV", "co", "-", "localization", "at", "day", "0", "(", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "is", ":", "wild", "type", ",", "0", ".", "81", " ", "±", " ", "0", ".", "001", ";", "Nix", "-", "/", "-", ",", "0", ".", "44", " ", "±", " ", "0", ".", "036", "(", "n", "=", "35", ",", "P", "=", "0", ".", "0006", ")", ".", "d", ",", "CD71", "+", "Ter119", "+", "reticulocytes", "sorted", "at", "day", "3", "after", "PHZ", "treatment", "were", "analysed", "by", "electron", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", " ", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3a, Ter119+CD71+ reticulocytes sorted at day 3 or 6 after PHZ treatment were cultured for in vitro maturation for 0 (top row), 2 (middle row) or 4 (bottom row) days, followed by Mitotracker deep red and Ter119 staining.b, CD71+Ter119+ reticulocytes sorted at day 3 after PHZ treatment were cultured and stained with new methylene blue. Scale bar, 20 µm.c, CD71+Ter119+ reticulocytes sorted at day 3 after PHZ treatment were stained for LC3 and COX IV and analysed by deconvolution microscopy. Scale bar, 5 µm. The Pearson coefficiency for LC3 and COX IV co-localization at day 0 (mean ± s.e.m.) is: wild type, 0.81 ± 0.001; Nix-/-, 0.44 ± 0.036 (n = 35, P = 0.0006).d, CD71+Ter119+ reticulocytes sorted at day 3 after PHZ treatment were analysed by electron microscopy. Scale bar, 0.5 µm."}
{"words": ["figf4a", ",", "Ter119", "+", "CD71", "+", "reticulocytes", "were", "sorted", "from", "the", "peripheral", "blood", "of", "wild", "-", "type", "and", "Nix", "-", "/", "-", "mice", "at", "day", "6", "after", "PHZ", "treatment", ".", "The", "cells", "were", "cultured", "for", "in", "vitro", "maturation", "in", "the", "presence", "of", "10", "µM", "FCCP", "or", "1", "µM", "ABT", "-", "737", ",", "followed", "by", "staining", "with", "Mitotracker", "deep", "red", "and", "phycoerythrin", "-", "conjugated", "anti", "-", "Ter119", ".", "b", ",", "c", ",", "Reticulocytes", "were", "cultured", "with", "FCCP", "(", "b", ")", "or", "ABT", "-", "737", "(", "c", ")", "for", "24", "h", "and", "analysed", "by", "transmission", "electron", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4a, Ter119+CD71+ reticulocytes were sorted from the peripheral blood of wild-type and Nix-/- mice at day 6 after PHZ treatment. The cells were cultured for in vitro maturation in the presence of 10 µM FCCP or 1 µM ABT-737, followed by staining with Mitotracker deep red and phycoerythrin-conjugated anti-Ter119.b, c, Reticulocytes were cultured with FCCP (b) or ABT-737 (c) for 24 h and analysed by transmission electron microscopy. Scale bar, 0.5 µm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "BW25113", "(", "ycbB", ",", "relA", "'", ")", "and", "its", "derivatives", "obtained", "by", "individual", "deletion", "of", "endopeptidase", "genes", ".", "BW25113", "(", "ycbB", ",", "relA", "'", ")", "is", "an", "abbreviated", "name", "for", "BW25113", "ΔrelA", "pKT2", "(", "ycbB", ")", "pKT8", "(", "relA", "'", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2  (B) BW25113(ycbB, relA') and its derivatives obtained by individual deletion of endopeptidase genes. BW25113(ycbB, relA') is an abbreviated name for BW25113 ΔrelA pKT2(ycbB) pKT8(relA').  "}
{"words": ["Figure", "3", "Growth", "of", "BW25113", "(", "ycbB", ",", "relA", "'", ")", ",", "BW25113", "(", "ycbB", ",", "relA", "'", ")", "ΔmepM", ",", "and", "its", "derivatives", "harboring", "plasmids", "encoding", "MepM", ",", "MepM", "H393A", ",", "and", "MepM", "ΔLytM", "were", "tested", "in", "the", "presence", "of", "ceftriaxone", "at", "8", "µg", "/", "ml", "(", "+", "ceftriaxone", ")", "or", "in", "the", "absence", "of", "the", "drug", "(", "-", "ceftriaxone", ")", "in", "BHI", "agar", "plates", "supplemented", "with", "40", "µM", "IPTG", "and", "1", "%", "L", "-", "arabinose", "for", "induction", "of", "ycbB", "and", "relA", "'", ",", "respectively", ".", "The", "genes", "encoding", "MepM", ",", "MepM", "H393A", ",", "and", "MepM", "ΔLytM", "were", "inserted", "into", "the", "vector", "pHV9", "under", "the", "control", "of", "the", "PphlF", "promoter", ",", "which", "is", "inducible", "by", "2", ",", "4", "-", "diacetylphloroglucinol", "(", "DAPG", ")", ".", "Basal", "level", "of", "expression", "of", "mepM", "under", "the", "control", "of", "PphlF", "was", "sufficient", "to", "restore", "ceftriaxone", "resistance", "in", "the", "absence", "of", "the", "inducer", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 Growth of BW25113(ycbB, relA'), BW25113(ycbB, relA') ΔmepM, and its derivatives harboring plasmids encoding MepM, MepM H393A, and MepM ΔLytM were tested in the presence of ceftriaxone at 8 µg/ml (+ ceftriaxone) or in the absence of the drug (- ceftriaxone) in BHI agar plates supplemented with 40 µM IPTG and 1% L-arabinose for induction of ycbB and relA', respectively. The genes encoding MepM, MepM H393A, and MepM ΔLytM were inserted into the vector pHV9 under the control of the PphlF promoter, which is inducible by 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG). Basal level of expression of mepM under the control of PphlF was sufficient to restore ceftriaxone resistance in the absence of the inducer."}
{"words": ["Figure", "4", "The", "mepM", "gene", "was", "expressed", "under", "the", "control", "of", "TIS1", "or", "TIS2", "(", "translation", "initiation", ")", "and", "of", "PrhaBAD", "(", "the", "L", "-", "rhamnose", "-", "inducible", "promoter", "of", "vector", "pHV30", ")", ".", "Growth", "of", "BW25113", "(", "ycbB", ",", "relA", "'", ")", "ΔmepM", "harboring", "the", "pHV30", "derivatives", "was", "tested", "on", "BHI", "agar", "supplemented", "with", "ceftriaxone", "8", "µg", "/", "ml", ",", "IPTG", "40", "µM", "(", "induction", "of", "ycbB", ")", "and", "L", "-", "arabinose", "1", "%", "(", "induction", "of", "relA", "'", ")", ".", "(", "A", ")", "For", "TIS2", ",", "growth", "around", "paper", "disks", "containing", "1", "or", "2", "mg", "of", "L", "-", "rhamnose", "indicated", "that", "induction", "of", "the", "expression", "of", "mepM", "was", "required", "for", "ceftriaxone", "resistance", ".", "In", "contrast", ",", "a", "higher", "level", "of", "translation", "from", "TIS1", "was", "sufficient", "for", "ceftriaxone", "resistance", "in", "the", "absence", "of", "the", "inducer", ".", "(", "B", ")", "The", "experiment", "was", "repeated", "with", "bacteria", "pre", "-", "exposed", "to", "L", "-", "rhamnose", "that", "were", "harvested", "at", "the", "vicinity", "of", "the", "disk", "containing", "2", "mg", "of", "L", "-", "rhamnose", ".", "Expression", "of", "ceftriaxone", "resistance", "remained", "dependent", "on", "the", "presence", "of", "L", "-", "rhamnose", "indicating", "that", "the", "requirement", "for", "MepM", "is", "not", "transient", ".", "The", "diameter", "of", "the", "growth", "zones", "is", "larger", "in", "panel", "(", "B", ")", "than", "in", "panel", "(", "A", ")", "as", "expected", "from", "the", "fact", "that", "bacteria", "in", "the", "inoculum", "used", "in", "(", "B", ")", "had", "been", "grown", "in", "the", "presence", "of", "the", "inducer", "and", "already", "contained", "MepM", ".", "In", "(", "A", ")", "growth", "is", "only", "possible", "after", "diffusion", "of", "L", "-", "rhamnose", "in", "the", "medium", "prior", "to", "the", "action", "of", "ceftriaxone", ".", "At", "a", "distance", "from", "the", "disk", ",", "diffusion", "was", "not", "sufficiently", "rapid", "to", "observe", "resistance", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 The mepM gene was expressed under the control of TIS1 or TIS2 (translation initiation) and of PrhaBAD (the L-rhamnose-inducible promoter of vector pHV30). Growth of BW25113(ycbB, relA') ΔmepM harboring the pHV30 derivatives was tested on BHI agar supplemented with ceftriaxone 8 µg/ml, IPTG 40 µM (induction of ycbB) and L-arabinose 1% (induction of relA'). (A) For TIS2, growth around paper disks containing 1 or 2 mg of L-rhamnose indicated that induction of the expression of mepM was required for ceftriaxone resistance. In contrast, a higher level of translation from TIS1 was sufficient for ceftriaxone resistance in the absence of the inducer. (B) The experiment was repeated with bacteria pre-exposed to L-rhamnose that were harvested at the vicinity of the disk containing 2 mg of L-rhamnose. Expression of ceftriaxone resistance remained dependent on the presence of L-rhamnose indicating that the requirement for MepM is not transient. The diameter of the growth zones is larger in panel (B) than in panel (A) as expected from the fact that bacteria in the inoculum used in (B) had been grown in the presence of the inducer and already contained MepM. In (A) growth is only possible after diffusion of L-rhamnose in the medium prior to the action of ceftriaxone. At a distance from the disk, diffusion was not sufficiently rapid to observe resistance. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "rpHPLC", "chromatograms", "of", "sacculi", "isolated", "from", "BW25113", "grown", "in", "minimal", "medium", "to", "stationary", "phase", "and", "digested", "by", "lysozyme", "(", "upper", "panel", ")", "or", "by", "lysozyme", "and", "5", "µM", "MepM", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Absorbance", "was", "monitored", "at", "205", "nm", "(", "mAU", ",", "milli", "-", "absorbance", "unit", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 (A) rpHPLC chromatograms of sacculi isolated from BW25113 grown in minimal medium to stationary phase and digested by lysozyme (upper panel) or by lysozyme and 5 µM MepM (lower panel). Absorbance was monitored at 205 nm (mAU, milli-absorbance unit). "}
{"words": ["Figure", "6", "Functional", "complementation", "of", "the", "mepM", "deletion", "in", "BW25113", "(", "ycbB", ",", "relA", "'", ")", "ΔmepM", "was", "performed", "with", "the", "pHV30", "vector", "or", "recombinant", "plasmids", "encoding", "each", "of", "the", "eight", "endopeptidases", "under", "the", "control", "of", "the", "PrhaBAD", "promoter", "and", "of", "the", "TIS1", "translation", "initiation", "signal", ".", "Induction", "of", "endopeptidase", "(", "ED", ")", "genes", "was", "performed", "with", "0", ".", "2", "%", "L", "-", "rhamnose", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "8", "µg", "/", "ml", "ceftriaxone", ".", "BHI", "agar", "plates", "contained", "40", "µM", "IPTG", "and", "1", "%", "L", "-", "arabinose", "for", "induction", "of", "ycbB", "and", "relA", "'", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 Functional complementation of the mepM deletion in BW25113(ycbB, relA') ΔmepM was performed with the pHV30 vector or recombinant plasmids encoding each of the eight endopeptidases under the control of the PrhaBAD promoter and of the TIS1 translation initiation signal. Induction of endopeptidase (ED) genes was performed with 0.2% L-rhamnose in the presence or absence of 8 µg/ml ceftriaxone. BHI agar plates contained 40 µM IPTG and 1% L-arabinose for induction of ycbB and relA', respectively. "}
{"words": ["Figure", "8", "(", "B", ")", "The", "plating", "efficiency", "assay", "was", "performed", "with", "derivatives", "of", "BW25113", "Δ8EDs", "pHV53", "(", "mepM", ")", "harboring", "the", "vector", "pHV7", "or", "recombinant", "plasmids", "carrying", "each", "of", "the", "eight", "endopeptidase", "genes", "under", "the", "control", "of", "the", "ParaBAD", "promoter", ".", "In", "this", "assay", ",", "functional", "replacement", "of", "MepM", "is", "detected", "based", "on", "growth", "in", "media", "containing", "0", ".", "2", "%", "or", "1", "%", "L", "-", "arabinose", "for", "expression", "of", "the", "endopeptidase", "gene", "carried", "by", "vector", "pHV7", ",", "while", "by", "-", "passing", "the", "requirement", "for", "induction", "of", "the", "mepM", "copy", "of", "pHV53", "by", "L", "-", "rhamnose", ".", "Complementation", "was", "observed", "with", "both", "concentrations", "of", "inducer", "for", "mepH", ",", "mepS", ",", "and", "pbpG", ".", "Overproduction", "of", "mepM", "encoded", "by", "the", "pHV7", "derivative", "in", "the", "presence", "of", "the", "high", "dose", "of", "L", "-", "arabinose", "(", "1", "%", ")", "was", "lethal", ".", "The", "right", "panel", "presents", "the", "growth", "control", "performed", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "2", "%", "L", "-", "rhamnose", "for", "induction", "of", "the", "mepM", "copy", "carried", "by", "pHV53", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8 (B) The plating efficiency assay was performed with derivatives of BW25113 Δ8EDs pHV53(mepM) harboring the vector pHV7 or recombinant plasmids carrying each of the eight endopeptidase genes under the control of the ParaBAD promoter. In this assay, functional replacement of MepM is detected based on growth in media containing 0.2% or 1% L-arabinose for expression of the endopeptidase gene carried by vector pHV7, while by-passing the requirement for induction of the mepM copy of pHV53 by L-rhamnose. Complementation was observed with both concentrations of inducer for mepH, mepS, and pbpG. Overproduction of mepM encoded by the pHV7 derivative in the presence of the high dose of L-arabinose (1%) was lethal. The right panel presents the growth control performed in the presence of 0.2% L-rhamnose for induction of the mepM copy carried by pHV53. "}
{"words": ["Figure", "9", "(", "B", ")", "Functional", "complementation", "of", "the", "mepK", "deletion", "of", "BW25113", "ΔmepK", "pHV63", "(", "ycbB", ")", "was", "performed", "with", "the", "pHV30", "vector", "or", "recombinant", "plasmids", "encoding", "each", "of", "the", "eight", "endopeptidases", "under", "the", "control", "of", "the", "PrhaBAD", "promoter", ".", "Induction", "of", "ycbB", "and", "of", "endopeptidase", "(", "ED", ")", "genes", "was", "performed", "with", "0", ".", "2", "%", "L", "-", "arabinose", "and", "1", "%", "L", "-", "rhamnose", ",", "respectively", ".", "BHI", "agar", "plates", "contained", "chloramphenicol", "(", "20", "µg", "/", "ml", ")", "to", "counter", "-", "select", "loss", "of", "pHV63", "(", "ycbB", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9 (B) Functional complementation of the mepK deletion of BW25113 ΔmepK pHV63(ycbB) was performed with the pHV30 vector or recombinant plasmids encoding each of the eight endopeptidases under the control of the PrhaBAD promoter. Induction of ycbB and of endopeptidase (ED) genes was performed with 0.2% L-arabinose and 1% L-rhamnose, respectively. BHI agar plates contained chloramphenicol (20 µg/ml) to counter-select loss of pHV63(ycbB). "}
{"words": ["Figure", "10", "(", "A", ")", "Functional", "complementation", "of", "the", "mepK", "deletion", "of", "BW25113", "ΔmepK", "pHV63", "(", "ycbB", ")", "was", "performed", "with", "the", "pHV30", "vector", "or", "recombinant", "plasmids", "encoding", "mepA", ",", "mepK", ",", "mepS", "or", "derivatives", "encoding", "catalytically", "inactive", "endopeptidases", "under", "the", "control", "of", "the", "PrhaBAD", "promoter", ".", "(", "B", ")", "The", "complementation", "assay", "was", "repeated", "for", "BW25113", "Δ7EDs", "pHV63", "(", "ycbB", ")", ",", "which", "was", "obtained", "by", "deletion", "of", "all", "chromosomal", "endopeptidase", "genes", "except", "mepM", ".", "Induction", "of", "ycbB", "and", "of", "endopeptidase", "(", "ED", ")", "genes", "was", "performed", "with", "0", ".", "2", "%", "L", "-", "arabinose", "and", "1", "%", "L", "-", "rhamnose", ",", "respectively", ".", "BHI", "agar", "plates", "contained", "chloramphenicol", "(", "20", "µg", "/", "ml", ")", "to", "counter", "-", "select", "loss", "of", "pHV63", "(", "ycbB", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 10 (A) Functional complementation of the mepK deletion of BW25113 ΔmepK pHV63(ycbB) was performed with the pHV30 vector or recombinant plasmids encoding mepA, mepK, mepS or derivatives encoding catalytically inactive endopeptidases under the control of the PrhaBAD promoter. (B) The complementation assay was repeated for BW25113 Δ7EDs pHV63(ycbB), which was obtained by deletion of all chromosomal endopeptidase genes except mepM. Induction of ycbB and of endopeptidase (ED) genes was performed with 0.2% L-arabinose and 1% L-rhamnose, respectively. BHI agar plates contained chloramphenicol (20 µg/ml) to counter-select loss of pHV63(ycbB). "}
{"words": ["Figure", "11", "(", "A", ")", "Growth", "curves", "of", "(", "i", ")", "BW25113", "(", "ycbB", ",", "relA", "'", ")", "and", "its", "ΔsltY", "derivative", ";", "and", "(", "ii", ")", "strain", "M1", "and", "its", "derivatives", "(", "M1", ".", "1", "to", "1", ".", "4", ")", "harboring", "mutations", "in", "sltY", ".", "The", "growth", "medium", "contained", "(", "i", ")", "40", "µM", "IPTG", ",", "1", "%", "L", "-", "arabinose", ",", "and", "8", "µg", "/", "ml", "ceftriaxone", "for", "BW25113", "(", "ycbB", ",", "relA", "'", ")", "and", "its", "ΔsltY", "derivative", "or", "(", "ii", ")", "50", "µM", "IPTG", "and", "16", "µg", "/", "ml", "ampicillin", "for", "M1", "and", "its", "derivatives", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 11 (A) Growth curves of (i) BW25113(ycbB, relA') and its ΔsltY derivative; and (ii) strain M1 and its derivatives (M1.1 to 1.4) harboring mutations in sltY. The growth medium contained (i) 40 µM IPTG, 1% L-arabinose, and 8 µg/ml ceftriaxone for BW25113(ycbB, relA') and its ΔsltY derivative or (ii) 50 µM IPTG and 16 µg/ml ampicillin for M1 and its derivatives. "}
{"words": ["f1a", ",", "Pancreatic", "sections", "stained", "with", "Atg7", ",", "LC3", "and", "p62", "showing", "Atg7", "−", "/", "−", "next", "to", "Atg7", "+", "/", "+", "regions", "after", "Pdx", "-", "Cre", "-", "mediated", "recombination", ".", "Right", "-", "side", "images", "are", "cropped", "and", "magnified", "regions", "(", "boxed", ")", "from", "left", "-", "side", "images", ".", "The", "magnification", "is", "×", "2", ".", "5", ".", "b", ",", "Haematoxylin", "and", "eosin", "(", "HE", ")", ",", "p53", "and", "caspase", "-", "3", "staining", "of", "exocrine", "tissue", "in", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "Atg7", "−", "/", "−", "pancreases", ".", "c", ",", "Quantification", "(", "median", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "of", "p53", "and", "caspase", "-", "3", "activation", "in", "Atg7", "-", "deficient", "acinar", "tissue", ".", "d", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "overall", "survival", "of", "mice", "either", "wild", "type", "(", "blue", ")", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "(", "red", ")", "in", "the", "pancreas", ".", "Mantel", "-", "Cox", "test", "was", "used", "for", "statistics", ".", "'", "n", "/", "a", "'", ",", "14", "/", "16", "mice", "were", "killed", ">", "500", "days", "when", "completely", "healthy", ".", "e", ",", "Biochemical", "analysis", "of", "endocrine", "function", "in", "moribund", "Atg7", "−", "/", "−", "or", "age", "-", "matched", "healthy", "control", "mice", ".", "Detailed", "information", "about", "the", "mice", "is", "tabulated", ".", "A", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "was", "used", "for", "statistics", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1a, Pancreatic sections stained with Atg7, LC3 and p62 showing Atg7−/− next to Atg7+/+ regions after Pdx-Cre-mediated recombination. Right-side images are cropped and magnified regions (boxed) from left-side images. The magnification is × 2.5.b, Haematoxylin and eosin (HE), p53 and caspase-3 staining of exocrine tissue in Atg7+/+ and Atg7−/− pancreases.c, Quantification (median, s.e.m.) of p53 and caspase-3 activation in Atg7-deficient acinar tissue.d, Kaplan-Meier analysis comparing overall survival of mice either wild type (blue) or Atg7−/− (red) in the pancreas. Mantel-Cox test was used for statistics. 'n/a', 14/16 mice were killed >500 days when completely healthy.e, Biochemical analysis of endocrine function in moribund Atg7−/− or age-matched healthy control mice. Detailed information about the mice is tabulated. A Mann-Whitney U-test was used for statistics. Scale bars: 50 µm. **P 0.01 and ***P 0.001."}
{"words": ["f2a", ",", "Alcian", "blue", "/", "PAS", "(", "AB", "/", "PAS", ")", "staining", "in", "pancreases", "from", "150", "-", "day", "-", "old", "Atg7", "-", "proficient", "or", "Atg7", "-", "deficient", "KrasG12D", "/", "+", "mice", "(", "wild", "-", "type", "mice", "with", "expression", "of", "KrasG12D", "in", "their", "pancreases", ")", ".", "b", ",", "Quantification", "of", "PanIN", "from", "mice", "of", "the", "indicated", "genotype", "and", "age", ".", "Fold", "increase", "and", "male", "/", "female", "ratios", "are", "shown", ".", "Box", "plots", "express", "the", "first", "(", "Q1", ")", "and", "third", "(", "Q3", ")", "quartiles", "set", "by", "the", "upper", "and", "lower", "limits", "of", "the", "box", ",", "whereas", "the", "median", "is", "shown", "by", "the", "horizontal", "line", "inside", "the", "box", ".", "The", "whiskers", "extend", "upward", "and", "downward", "to", "the", "highest", "or", "lowest", "observation", "within", "the", "upper", "(", "Q3", "+", "1", ".", "5", "×", "the", "interquartile", "range", ")", "and", "lower", "(", "Q1", "−", "1", ".", "5", "×", "interquartile", "range", ")", "limits", ".", "Values", "outside", "the", "upper", "and", "lower", "limits", "are", "'", "outliers", "'", "and", "are", "shown", "by", "individual", "symbols", ".", "c", ",", "d", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "overall", "survival", "(", "c", ")", "or", "PDAC", "-", "free", "survival", "(", "d", ")", "of", "Atg7", "+", "/", "+", "(", "blue", ")", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "(", "red", ")", "KrasG12D", "/", "+", "mice", ".", "c", ",", "d", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "overall", "survival", "(", "c", ")", "or", "PDAC", "-", "free", "survival", "(", "d", ")", "of", "Atg7", "+", "/", "+", "(", "blue", ")", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "(", "red", ")", "KrasG12D", "/", "+", "micee", ",", "PanIN", "grading", "of", "pancreases", "from", "150", "-", "day", "-", "old", "Atg7", "+", "/", "+", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "Pdx", "-", "Cre", "KrasG12D", "/", "+", "mice", ".", "Values", "are", "mean", "and", "error", "bars", "are", "s", ".", "d", ".", "b", ",", "e", ",", "A", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "was", "used", "for", "statistics", ".", "f", ",", "Representative", "p53", "staining", "from", "150", "-", "day", "-", "old", "mice", "of", "both", "genotypes", ".", "g", ",", "PDAC", "-", "free", "survival", "of", "autophagy", "-", "proficient", "(", "blue", ")", "and", "Atg5", "-", "deficient", "(", "red", ")", "KrasG12D", "/", "+", "mice", ".", "d", ",", "g", ",", "Median", "survival", "±", " ", "s", ".", "d", ".", "and", "male", "/", "female", "(", "m", "/", "f", ")", "ratio", "are", "provided", ".", "'", "n", "/", "a", "'", ",", "no", "animals", "succumbed", "to", "PDAC", ".", "A", "log", "-", "rank", "test", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "was", "used", "for", "statistics", ".", "a", ",", "f", ",", "Scale", "bars", ":", "500", " ", "µm", "(", "a", ")", ",", "50", " ", "µm", "(", "f", ")", ".", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "01", ";", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2a, Alcian blue/PAS (AB/PAS) staining in pancreases from 150-day-old Atg7-proficient or Atg7-deficient KrasG12D/+ mice (wild-type mice with expression of KrasG12D in their pancreases).b, Quantification of PanIN from mice of the indicated genotype and age. Fold increase and male/female ratios are shown. Box plots express the first (Q1) and third (Q3) quartiles set by the upper and lower limits of the box, whereas the median is shown by the horizontal line inside the box. The whiskers extend upward and downward to the highest or lowest observation within the upper (Q3 + 1.5 × the interquartile range) and lower (Q1 − 1.5 × interquartile range) limits. Values outside the upper and lower limits are 'outliers' and are shown by individual symbols.c, d, Kaplan-Meier analysis comparing overall survival (c) or PDAC-free survival (d) of Atg7+/+ (blue) or Atg7−/− (red) KrasG12D/+ mice.c, d, Kaplan-Meier analysis comparing overall survival (c) or PDAC-free survival (d) of Atg7+/+ (blue) or Atg7−/− (red) KrasG12D/+ micee, PanIN grading of pancreases from 150-day-old Atg7+/+ or Atg7−/− Pdx-Cre KrasG12D/+ mice. Values are mean and error bars are s.d. b, e, A Mann-Whitney U-test was used for statistics.f, Representative p53 staining from 150-day-old mice of both genotypes.g, PDAC-free survival of autophagy-proficient (blue) and Atg5-deficient (red) KrasG12D/+ mice. d, g, Median survival ± s.d. and male/female (m/f) ratio are provided. 'n/a', no animals succumbed to PDAC. A log-rank test (Mantel-Cox) was used for statistics. a, f, Scale bars: 500 µm (a), 50 µm (f). *P  0.05, **P  0.01; NS, not significant."}
{"words": ["f3a", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "PDAC", "-", "free", "survival", "in", "Atg7", "+", "/", "+", "(", "blue", ")", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "(", "red", ")", "KrasG12D", "/", "+", " ", "p53", "−", "/", "−", "mice", ".", "b", ",", "Pancreatic", "tumours", "of", "indicated", "genotypes", "stained", "for", "Atg7", ",", "LC3", "and", "p62", ".", "Insets", "are", "magnified", "crops", "from", "the", "same", "images", "to", "show", "specifics", "of", "LC3", "and", "p62", "staining", ".", "The", "magnification", "is", " ", "×", " ", "4", ".", "c", ",", "Tumour", "incidence", "and", "tumour", "weight", "(", "median", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "in", "mice", "from", "indicated", "genotypes", ",", "killed", "at", "21", ",", "29", "and", "38", "days", "of", "age", ".", "Numbers", "in", "the", "incidence", "diagram", "represent", "tumour", "-", "bearing", "mice", "versus", "all", "mice", ".", "Significance", "was", "assessed", "with", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "(", "incidence", ")", "and", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "(", "weight", ")", ".", "d", ",", "Representative", "haematoxylin", "and", "eosin", "stainings", "of", "pancreases", "from", "indicated", "time", "points", "and", "genotypes", ".", "e", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "PDAC", "-", "free", "survival", "of", "Atg5", "+", "/", "+", "(", "blue", ")", "or", "Atg5", "−", "/", "−", "(", "green", ")", "KrasG12D", "/", "+", " ", "p53", "−", "/", "−", "mice", ".", "f", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "PDAC", "-", "free", "survival", "of", "KrasG12D", "/", "+", "p53", "−", "/", "−", "mice", "that", "were", "chloroquine", "-", "treated", "(", "CQ", ",", "red", ")", ",", "vehicle", "-", "treated", "(", "PBS", ",", "black", ")", "or", "untreated", "(", "blue", ")", ".", "a", ",", "e", ",", "f", ",", "The", "blue", "curve", "in", "all", "Kaplan", "-", "Meier", "plots", "represents", "the", "same", "colony", "of", "mice", "(", "KrasG12D", "/", "+", ",", "p53", "−", "/", "−", ",", "Atg7", "+", "/", "+", ",", "Atg5", "+", "/", "+", ")", ".", "A", "Mantel", "-", "Cox", "test", "was", "used", "for", "statistics", ".", "b", ",", "d", ",", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", "(", "b", ")", ",", "200", "µm", "(", "d", ")", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3a, Kaplan-Meier analysis comparing PDAC-free survival in Atg7+/+ (blue) or Atg7−/− (red) KrasG12D/+ p53−/− mice.b, Pancreatic tumours of indicated genotypes stained for Atg7, LC3 and p62. Insets are magnified crops from the same images to show specifics of LC3 and p62 staining. The magnification is × 4.c, Tumour incidence and tumour weight (median, s.e.m.) in mice from indicated genotypes, killed at 21, 29 and 38 days of age. Numbers in the incidence diagram represent tumour-bearing mice versus all mice. Significance was assessed with Fisher's exact test (incidence) and Mann-Whitney U-test (weight).d, Representative haematoxylin and eosin stainings of pancreases from indicated time points and genotypes.e, Kaplan-Meier analysis comparing PDAC-free survival of Atg5+/+ (blue) or Atg5−/− (green) KrasG12D/+ p53−/− mice.f, Kaplan-Meier analysis comparing PDAC-free survival of KrasG12D/+ p53−/− mice that were chloroquine-treated (CQ, red), vehicle-treated (PBS, black) or untreated (blue). a, e, f, The blue curve in all Kaplan-Meier plots represents the same colony of mice (KrasG12D/+, p53−/−, Atg7+/+, Atg5+/+). A Mantel-Cox test was used for statistics. b, d, Scale bars: 100 µm (b), 200 µm (d). *P 0.05, **P 0.01."}
{"words": ["f4a", ",", "LC3", "staining", "of", "representative", "pancreatic", "tumours", "from", "mice", "of", "indicated", "genotypes", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "b", ",", "Western", "blotting", "for", "LC3", ",", "p53", "and", "Atg7", "in", "cell", "lines", "derived", "from", "individual", "tumours", "which", "developed", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "p53", ".", "c", ",", "d", ",", "Average", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ",", "c", ")", "and", "extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ",", "c", ",", "d", ",", "Average", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ",", "c", ")", "and", "extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ",", "d", ")", "of", "eight", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "seven", "Atg7", "−", "/", "−", "cell", "lines", "revealed", "increased", "ECAR", "in", "autophagy", "-", "deficient", "cells", ".", "Error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "e", ",", "Treatment", "with", "2", "-", "deocyglucose", "(", "2", "-", "DG", ")", "reduces", "ECAR", "and", "abrogates", "the", "difference", "between", "cell", "lines", "from", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "Atg7", "−", "/", "−", "tumours", ".", "Values", "are", "the", "average", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "g", ",", "LC", "-", "MS", "analysis", "revealed", "increased", "glucose", "consumption", "from", "medium", "(", "f", ")", "and", "extracellular", "lactate", "accumulation", "(", "g", ")", "in", "Atg7", "-", "null", "cell", "lines", ".", "Values", "are", "the", "average", "of", "eight", "(", "Atg7", "+", "/", "+", ")", "and", "seven", "(", "Atg7", "−", "/", "−", ")", "biological", "replicates", ".", "h", ",", "LC", "-", "MS", "analysis", "shows", "increased", "accumulation", "of", "2", "-", "DG", "and", "its", "metabolite", "2", "-", "DG", "-", "6", "-", "phosphate", "in", "Atg7", "-", "deficient", "cell", "lines", ".", "Values", "are", "averages", "of", "five", "biological", "replicates", "for", "each", "genotype", ".", "i", ",", "Background", "levels", "of", "18F", "-", "FDG", "uptake", "in", "brain", "and", "heart", "can", "be", "seen", "in", "sagittal", "and", "coronal", "views", "(", "middle", "and", "right", "panels", ",", "respectively", ")", "of", "wild", "-", "type", "Atg7", "mice", "(", "top", "row", ")", ".", "In", "contrast", ",", "intense", "18F", "-", "FDG", "uptake", "is", "seen", "in", "pancreatic", "tumours", "of", "Atg7", "deficient", "mice", "(", "bottom", "row", ")", ".", "j", ",", "LC", "-", "MS", "of", "intracellular", "glycolytic", "and", "pentose", "phosphate", "pathway", "intermediates", "shows", "enhanced", "accumulation", "in", "Atg7", "−", "/", "−", "tumour", "cell", "lines", ".", "Values", "are", "average", "of", "eight", "(", "Atg7", "+", "/", "+", ")", "and", "six", "(", "Atg7", "−", "/", "−", ")", "biological", "replicates", ".", "f", "-", "h", ",", "j", ",", "Error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "a", ",", "f", "-", "h", ",", "j", ",", "A", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "was", "used", "to", "ascertain", "significance", ".", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "01", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4a, LC3 staining of representative pancreatic tumours from mice of indicated genotypes. Scale bars: 50 µm.b, Western blotting for LC3, p53 and Atg7 in cell lines derived from individual tumours which developed in the absence or presence of p53.c, d, Average oxygen consumption rate (OCR, c) and extracellular acidification rate (ECAR,c, d, Average oxygen consumption rate (OCR, c) and extracellular acidification rate (ECAR, d) of eight Atg7+/+ and seven Atg7−/− cell lines revealed increased ECAR in autophagy-deficient cells. Error bars are s.e.m.e, Treatment with 2-deocyglucose (2-DG) reduces ECAR and abrogates the difference between cell lines from Atg7+/+ and Atg7−/− tumours. Values are the average of three biological replicates. Error bars are s.e.m., g, LC-MS analysis revealed increased glucose consumption from medium (f) and extracellular lactate accumulation (g) in Atg7-null cell lines. Values are the average of eight (Atg7+/+) and seven (Atg7−/−) biological replicates.h, LC-MS analysis shows increased accumulation of 2-DG and its metabolite 2-DG-6-phosphate in Atg7-deficient cell lines. Values are averages of five biological replicates for each genotype.i, Background levels of 18F-FDG uptake in brain and heart can be seen in sagittal and coronal views (middle and right panels, respectively) of wild-type Atg7 mice (top row). In contrast, intense 18F-FDG uptake is seen in pancreatic tumours of Atg7 deficient mice (bottom row).j, LC-MS of intracellular glycolytic and pentose phosphate pathway intermediates shows enhanced accumulation in Atg7−/− tumour cell lines. Values are average of eight (Atg7+/+) and six (Atg7−/−) biological replicates. f-h, j, Error bars are s.e.m. a, f-h, j, A Mann-Whitney U-test was used to ascertain significance. *P  0.05, **P  0.01."}
{"words": ["Figure", "1C", "Subcellular", "fractionation", "of", "the", "WT", "and", "NLS", "-", "deficient", "FolSrpk1", "-", "GFP", "proteins", ".", "N", ",", "nucleus", ";", "C", ",", "cytosol", ".", "The", "amount", "of", "nuclear", "FolSrpk1", "-", "GFP", "was", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "For", "C", ",", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "at", "least", "three", "times", ".", "The", "fractionation", "controls", "were", "Fol", "histone", "H1", "(", "nucleus", ")", ",", "Actin", "(", "cytosol", ")", "and", "Coomassie", "brilliant", "blue", "(", "CBB", ")", "staining", ".", "D", "Quantitative", "measurement", "of", "H2O2", "in", "tomato", "roots", "after", "infection", "by", "the", "WT", "and", "FolSrpk1p", ":", ":", "FolSrpk1", "-", "GFP", "strains", "at", "0", "-", "5", "days", "post", "incubation", "(", "dpi", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "The", "presence", "of", "different", "letters", "above", "the", "mean", "values", "of", "three", "replicates", "indicates", "a", "significant", "difference", "between", "different", "samples", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ANOVA", ")", ".", "E", "Subcellular", "fractionation", "of", "FolSrpk1", "-", "GFP", "during", "the", "early", "infection", "stage", ".", "Total", "proteins", "were", "extracted", "from", "tomato", "roots", "at", "0", "(", "conidia", ")", ",", "1", ",", "3", "and", "5", "dpi", ".", "Equal", "amount", "of", "total", ",", "nuclear", "and", "cytoplasm", "proteins", "was", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "and", "FolSrpk1", "was", "detected", "using", "anti", "-", "GFP", ".", "The", "amount", "of", "total", "and", "nuclear", "FolSrpk1", "-", "GFP", "at", "0", "dpi", "was", "each", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "For", "E", ",", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "at", "least", "three", "times", ".", "The", "fractionation", "controls", "were", "Fol", "histone", "H1", "(", "nucleus", ")", ",", "Actin", "(", "cytosol", ")", "and", "Coomassie", "brilliant", "blue", "(", "CBB", ")", "staining", ".", "F", "Association", "of", "FolSrpk1", "with", "FolAha1", "under", "ROS", "stress", ".", "After", "treatment", "with", "10", "mM", "H2O2", "for", "0", ",", "1", "and", "2", "h", ",", "proteins", "pulled", "down", "with", "GFP", "-", "Trap", "beads", "were", "probed", "with", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Flag", "(", "top", ")", ".", "Input", "proteins", "were", "shown", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "FLAG", "antibodies", "(", "bottom", ")", ".", "The", "amount", "of", "immunoprecipitated", "FolSrpk1", "-", "Flag", "and", "FolAha1", "-", "GFP", "at", "0", "h", "was", "each", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "For", ",", "F", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "at", "least", "three", "times", ".", "G", "Fluorescence", "microscopy", "analysis", "of", "FolSrpk1", "-", "GFP", "in", "mycelia", "of", "the", "FolSrpk1p", ":", ":", "FolSrpk1", "-", "GFP", "strain", "treated", "with", "10", "mM", "H2O2", "for", "0", ",", "1", "and", "2", "h", ".", "Arrows", "indicate", "the", "nucleus", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "µm", ".", "I", "Subcellular", "fractionation", "analysis", "of", "FolSrpk1", "-", "GFP", "in", "mycelia", "of", "the", "FolSrpk1p", ":", ":", "FolSrpk1", "-", "GFP", "strain", "treated", "with", "10", "mM", "H2O2", "for", "0", ",", "1", "and", "2", "h", ".", "The", "amount", "of", "nuclear", "FolSrpk1", "-", "GFP", "at", "0", "h", "was", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "For", "I", ",", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "at", "least", "three", "times", ".", "The", "fractionation", "controls", "were", "Fol", "histone", "H1", "(", "nucleus", ")", ",", "Actin", "(", "cytosol", ")", "and", "Coomassie", "brilliant", "blue", "(", "CBB", ")", "staining", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C Subcellular fractionation of the WT and NLS-deficient FolSrpk1-GFP proteins. N, nucleus; C, cytosol. The amount of nuclear FolSrpk1-GFP was set as 1. Data information: For C, each gel shown is a representative experiment carried out at least three times. The fractionation controls were Fol histone H1 (nucleus), Actin (cytosol) and Coomassie brilliant blue (CBB) staining.D Quantitative measurement of H2O2 in tomato roots after infection by the WT and FolSrpk1p::FolSrpk1-GFP strains at 0-5 days post incubation (dpi). Data are presented as mean ± SD. The presence of different letters above the mean values of three replicates indicates a significant difference between different samples (P < 0.05, ANOVA).E Subcellular fractionation of FolSrpk1-GFP during the early infection stage. Total proteins were extracted from tomato roots at 0 (conidia), 1, 3 and 5 dpi. Equal amount of total, nuclear and cytoplasm proteins was separated by SDS-PAGE, and FolSrpk1 was detected using anti-GFP. The amount of total and nuclear FolSrpk1-GFP at 0 dpi was each set as 1. Data information: For E, each gel shown is a representative experiment carried out at least three times. The fractionation controls were Fol histone H1 (nucleus), Actin (cytosol) and Coomassie brilliant blue (CBB) staining.F Association of FolSrpk1 with FolAha1 under ROS stress. After treatment with 10 mM H2O2 for 0, 1 and 2 h, proteins pulled down with GFP-Trap beads were probed with anti-GFP and anti-Flag (top). Input proteins were shown by Western blotting with anti-GFP and anti-FLAG antibodies (bottom). The amount of immunoprecipitated FolSrpk1-Flag and FolAha1-GFP at 0 h was each set as 1. Data information: For , F each gel shown is a representative experiment carried out at least three times.G Fluorescence microscopy analysis of FolSrpk1-GFP in mycelia of the FolSrpk1p::FolSrpk1-GFP strain treated with 10 mM H2O2 for 0, 1 and 2 h. Arrows indicate the nucleus. Scale bars = 5 µm.I Subcellular fractionation analysis of FolSrpk1-GFP in mycelia of the FolSrpk1p::FolSrpk1-GFP strain treated with 10 mM H2O2 for 0, 1 and 2 h. The amount of nuclear FolSrpk1-GFP at 0 h was set as 1. Data information: For I, each gel shown is a representative experiment carried out at least three times. The fractionation controls were Fol histone H1 (nucleus), Actin (cytosol) and Coomassie brilliant blue (CBB) staining."}
{"words": ["Figure", "2Co", "-", "IP", "(", "C", ")", "analyses", "showing", "the", "association", "of", "WT", "and", "mutant", "FolSrpk1", "proteins", "with", "FolAha1", ".", "The", "amount", "of", "immunoprecipitated", "FolSrpk1", "-", "Flag", "and", "FolAha1", "-", "GFP", "in", "the", "first", "line", "was", "each", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "For", "C", ",", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "at", "least", "three", "times", ".", "Y2H", "(", "D", ")", "analyses", "showing", "the", "association", "of", "WT", "and", "mutant", "FolSrpk1", "proteins", "with", "FolAha1", ".", "F", "Fluorescence", "microscopy", "of", "FolSrpk1", "-", "GFP", "and", "its", "mutant", "forms", ".", "Arrows", "indicate", "the", "nucleus", ".", "Bars", "=", "5", "µm", ".", "G", "Quantification", "of", "FolSrpk1", "-", "GFP", "distribution", "in", "F", ".", "The", "calculation", "was", "from", "three", "independent", "replicates", "with", "three", "hyphae", "per", "replicate", "and", "three", "cells", "per", "hyphae", ".", "Different", "letters", "indicate", "statistically", "significant", "differences", "according", "to", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "The", "whiskers", "of", "the", "boxplots", "indicate", "the", "upper", "and", "lower", "quartiles", ",", "the", "boxes", "indicate", "the", "interquartile", "range", ",", "and", "the", "plus", "sign", "indicates", "the", "mean", ".", "H", "Subcellular", "fractionation", "of", "FolSrpk1", "-", "GFP", "and", "its", "mutant", "forms", ".", "The", "fractionation", "controls", "were", "Fol", "histone", "H1", "(", "nucleus", ")", ",", "Actin", "(", "cytosol", ")", "and", "CBB", "staining", ".", "The", "amount", "of", "nuclear", "FolSrpk1", "-", "GFP", "was", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "For", "H", ",", ",", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "at", "least", "three", "times", ".", "I", "K304", "acetylation", "of", "WT", "and", "mutant", "FolSrpk1", "proteins", "in", "the", "indicated", "strains", "after", "treatment", "with", "10", "mM", "H2O2", "for", "0", ",", "1", "and", "2", "h", ".", "The", "amount", "of", "acetylated", "and", "total", "FolSrpk1", "-", "GFP", "at", "0", "h", "was", "each", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "For", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "at", "least", "three", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Co-IP (C) analyses showing the association of WT and mutant FolSrpk1 proteins with FolAha1. The amount of immunoprecipitated FolSrpk1-Flag and FolAha1-GFP in the first line was each set as 1. Data information: For C, each gel shown is a representative experiment carried out at least three times.Y2H (D) analyses showing the association of WT and mutant FolSrpk1 proteins with FolAha1.F Fluorescence microscopy of FolSrpk1-GFP and its mutant forms. Arrows indicate the nucleus. Bars = 5 µm. G Quantification of FolSrpk1-GFP distribution in F. The calculation was from three independent replicates with three hyphae per replicate and three cells per hyphae. Different letters indicate statistically significant differences according to one-way ANOVA (P < 0.05). The whiskers of the boxplots indicate the upper and lower quartiles, the boxes indicate the interquartile range, and the plus sign indicates the mean.H Subcellular fractionation of FolSrpk1-GFP and its mutant forms. The fractionation controls were Fol histone H1 (nucleus), Actin (cytosol) and CBB staining. The amount of nuclear FolSrpk1-GFP was set as 1. Data information: For H, , each gel shown is a representative experiment carried out at least three times.I K304 acetylation of WT and mutant FolSrpk1 proteins in the indicated strains after treatment with 10 mM H2O2 for 0, 1 and 2 h. The amount of acetylated and total FolSrpk1-GFP at 0 h was each set as 1. Data information: For each gel shown is a representative experiment carried out at least three times."}
{"words": ["Figure", "3A", "K304", "acetylation", "(", "top", ")", "and", "amount", "(", "middle", ")", "of", "FolSrpk1", "-", "GFP", "and", "FolSrpk1K304Q", "-", "GFP", "in", "WT", "and", "FolArd1", "-", "OE", "strains", "treated", "with", "10", "mM", "H2O2", "for", "2", "h", ".", "The", "over", "-", "expressed", "FolArd1", "-", "Flag", "was", "detected", "by", "anti", "-", "Flag", "(", "bottom", ")", ".", "The", "amount", "of", "acetylated", "and", "total", "FolSrpk1", "in", "the", "WT", "was", "each", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "three", "times", ".", "C", "FolArd1", "directly", "acetylates", "FolSrpk1", "in", "vitro", ".", "Purified", "GST", "-", "FolSrpk1", "or", "its", "K304Q", "isoform", "(", "50", "ng", ")", "was", "incubated", "with", "or", "without", "50", "ng", "of", "purified", "FolArd1", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "anti", "-", "K304ac", "or", "anti", "-", "GST", "antibody", ".", "Anti", "-", "GST", "immunoblotting", "was", "used", "to", "show", "equal", "loading", ".", "The", "amount", "of", "acetylated", "and", "total", "GST", "-", "FolSrpk1", "in", "the", "first", "lane", "was", "each", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "three", "times", ".", "E", "Subcellular", "fractionation", "analysis", "of", "FolSrpk1", "-", "GFP", "in", "WT", ",", "ΔFolSir2", ",", "and", "FolSir2", "-", "OE", "strains", ".", "The", "amount", "of", "nuclear", "FolSrpk1", "-", "GFP", "in", "the", "WT", "was", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "three", "times", ".", "The", "fractionation", "controls", "were", "Fol", "histone", "H1", "(", "nucleus", ")", ",", "Actin", "(", "cytosol", ")", "and", "CBB", "staining", ".", "G", ",", "H", "Expression", "profile", "of", "FolArd1", "(", "G", ")", "and", "FolSir2", "(", "H", ")", "during", "the", "infection", "stage", ".", "Total", "RNA", "extracted", "from", "host", "roots", "at", "0", "(", "conidia", ")", "and", "1", "-", "5", "dpi", "was", "reverse", "transcribed", ".", "The", "expression", "levels", "were", "normalized", "to", "that", "of", "the", "Fol", "actin", "gene", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "The", "presence", "of", "different", "letters", "above", "the", "mean", "values", "of", "three", "replicates", "indicates", "a", "significant", "difference", "between", "different", "samples", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A K304 acetylation (top) and amount (middle) of FolSrpk1-GFP and FolSrpk1K304Q-GFP in WT and FolArd1-OE strains treated with 10 mM H2O2 for 2 h. The over-expressed FolArd1-Flag was detected by anti-Flag (bottom). The amount of acetylated and total FolSrpk1 in the WT was each set as 1. Data information: each gel shown is a representative experiment carried out three times.C FolArd1 directly acetylates FolSrpk1 in vitro. Purified GST-FolSrpk1 or its K304Q isoform (50 ng) was incubated with or without 50 ng of purified FolArd1 and then analyzed by immunoblotting using anti-K304ac or anti-GST antibody. Anti-GST immunoblotting was used to show equal loading. The amount of acetylated and total GST-FolSrpk1 in the first lane was each set as 1. Data information: each gel shown is a representative experiment carried out three times.E Subcellular fractionation analysis of FolSrpk1-GFP in WT, ΔFolSir2, and FolSir2-OE strains. The amount of nuclear FolSrpk1-GFP in the WT was set as 1. Data information: each gel shown is a representative experiment carried out three times. The fractionation controls were Fol histone H1 (nucleus), Actin (cytosol) and CBB staining.G, H Expression profile of FolArd1 (G) and FolSir2 (H) during the infection stage. Total RNA extracted from host roots at 0 (conidia) and 1-5 dpi was reverse transcribed. The expression levels were normalized to that of the Fol actin gene. Data are presented as mean ± SD. The presence of different letters above the mean values of three replicates indicates a significant difference between different samples (P < 0.05, ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "4A", "Relative", "expression", "level", "of", "six", "antioxidant", "enzymes", "during", "the", "infection", "stage", ".", "The", "experiments", "were", "carried", "out", "as", "in", "Fig", "3", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "The", "presence", "of", "different", "letters", "above", "the", "mean", "values", "of", "three", "biological", "replicates", "indicates", "a", "significant", "difference", "between", "different", "samples", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ANOVA", ")", ".", "B", "Secretion", "of", "the", "FOXG", "_", "17180", "-", "GFP", ",", "FOXG", "_", "15294", "-", "GFP", "and", "FOXG", "_", "13788", "-", "GFP", "proteins", ".", "The", "proteins", "extracted", "from", "mycelia", "(", "M", ")", "and", "culture", "supernatants", "(", "S", ")", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Actin", ".", "Each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "three", "times", ".", "The", "loading", "controls", "were", "Fol", "Actin", "and", "CBB", "staining", ".", "F", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Fol", "EF", "-", "1α", "transcript", "levels", "in", "tomato", "roots", "14", "days", "after", "infection", "by", "the", "indicated", "strains", ".", "The", "expression", "of", "tomato", "RCE1", "was", "used", "as", "a", "control", "to", "ensure", "the", "use", "of", "equal", "amounts", "of", "RNA", "for", "RT", "-", "PCR", ".", "Data", "information", ":", "For", "F", ",", "the", "presence", "of", "different", "letters", "above", "the", "mean", "values", "of", "four", "replicates", "indicates", "a", "significant", "difference", "between", "different", "samples", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ANOVA", ")", ".", "The", "whiskers", "of", "the", "boxplots", "indicate", "the", "upper", "and", "lower", "quartiles", ",", "the", "boxes", "indicate", "the", "interquartile", "range", ",", "and", "the", "plus", "sign", "indicates", "the", "mean", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Relative expression level of six antioxidant enzymes during the infection stage. The experiments were carried out as in Fig 3. Data are presented as mean ± SD. The presence of different letters above the mean values of three biological replicates indicates a significant difference between different samples (P < 0.05, ANOVA).B Secretion of the FOXG_17180-GFP, FOXG_15294-GFP and FOXG_13788-GFP proteins. The proteins extracted from mycelia (M) and culture supernatants (S) were analyzed by Western blotting with anti-GFP and anti-Actin. Each gel shown is a representative experiment carried out three times. The loading controls were Fol Actin and CBB staining.F qRT-PCR analysis of Fol EF-1α transcript levels in tomato roots 14 days after infection by the indicated strains. The expression of tomato RCE1 was used as a control to ensure the use of equal amounts of RNA for RT-PCR. Data information: For F, the presence of different letters above the mean values of four replicates indicates a significant difference between different samples (P < 0.05, ANOVA). The whiskers of the boxplots indicate the upper and lower quartiles, the boxes indicate the interquartile range, and the plus sign indicates the mean."}
{"words": ["Figure", "5B", "Relative", "growth", "reduction", "of", "the", "indicated", "strains", "representing", "the", "reduction", "in", "colony", "diameters", "between", "normal", "and", "stress", "conditions", "normalized", "to", "colony", "diameters", "under", "normal", "conditions", "(", "four", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "For", "B", ",", "the", "presence", "of", "different", "letters", "above", "the", "mean", "values", "of", "four", "replicates", "indicates", "a", "significant", "difference", "between", "different", "samples", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ANOVA", ")", ".", "The", "whiskers", "of", "the", "boxplots", "indicate", "the", "upper", "and", "lower", "quartiles", ",", "the", "boxes", "indicate", "the", "interquartile", "range", ",", "and", "the", "plus", "sign", "indicates", "the", "mean", ".", "C", "Determination", "of", "H2O2", "content", "in", "tomato", "roots", "infected", "by", "the", "indicted", "strains", "at", "0", "-", "5", "dpi", ".", "The", "experiments", "were", "carried", "out", "as", "in", "Fig", "1", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "F", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Fol", "EF", "-", "1α", "transcript", "levels", "in", "tomato", "roots", "14", "days", "after", "infection", "by", "the", "indicated", "strains", ".", "The", "experiments", "(", "four", "biological", "replicates", ")", "Data", "information", ":", "For", "F", ",", "the", "presence", "of", "different", "letters", "above", "the", "mean", "values", "of", "four", "replicates", "indicates", "a", "significant", "difference", "between", "different", "samples", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ANOVA", ")", ".", "The", "whiskers", "of", "the", "boxplots", "indicate", "the", "upper", "and", "lower", "quartiles", ",", "the", "boxes", "indicate", "the", "interquartile", "range", ",", "and", "the", "plus", "sign", "indicates", "the", "mean", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Relative growth reduction of the indicated strains representing the reduction in colony diameters between normal and stress conditions normalized to colony diameters under normal conditions (four biological replicates). Data information: For B, the presence of different letters above the mean values of four replicates indicates a significant difference between different samples (P < 0.05, ANOVA). The whiskers of the boxplots indicate the upper and lower quartiles, the boxes indicate the interquartile range, and the plus sign indicates the mean.C Determination of H2O2 content in tomato roots infected by the indicted strains at 0-5 dpi. The experiments were carried out as in Fig 1. Data are presented as mean ± SD of three biological replicates.F qRT-PCR analysis of Fol EF-1α transcript levels in tomato roots 14 days after infection by the indicated strains. The experiments (four biological replicates) Data information: For F, the presence of different letters above the mean values of four replicates indicates a significant difference between different samples (P < 0.05, ANOVA). The whiskers of the boxplots indicate the upper and lower quartiles, the boxes indicate the interquartile range, and the plus sign indicates the mean."}
{"words": ["Figure", "6A", "Subcellular", "fractionation", "of", "BcSrpk1", "-", "GFP", "in", "WT", "and", "BcSrpk1mutant", "strains", ".", "The", "amount", "of", "nuclear", "BcSrpk1", "-", "GFP", "was", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", ",", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "three", "times", ".", "The", "fractionation", "controls", "were", "histone", "H1", "(", "nucleus", ")", ",", "Actin", "(", "cytosol", ")", "and", "CBB", "staining", ".", "B", "Co", "-", "IP", "analysis", "revealing", "the", "interaction", "of", "BcAha1", "with", "BcSrpk1", "and", "its", "mutant", "forms", ".", "Data", "information", ":", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "three", "times", ".", "C", "K367", "acetylation", "of", "BcSrpk1", "during", "the", "early", "infection", "stage", ".", "Total", "proteins", "were", "extracted", "from", "tomato", "leaves", "at", "0", "(", "spores", ")", ",", "12", ",", "24", "and", "36", "hpi", ".", "Eluted", "proteins", "bound", "to", "the", "anti", "-", "GFP", "beads", "were", "probed", "by", "the", "anti", "-", "K304ac", "and", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "The", "amount", "of", "acetylated", "and", "total", "BcSrpk1", "at", "0", "hpi", "was", "each", "set", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "each", "gel", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", "carried", "out", "three", "times", ".", "F", "Relative", "density", "of", "DAB", "staining", "in", "E", "(", "four", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "For", "F", "the", "presence", "of", "different", "letters", "above", "the", "mean", "values", "of", "four", "replicates", "indicates", "a", "significant", "difference", "between", "different", "samples", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ANOVA", ")", ".", "The", "whiskers", "of", "the", "boxplots", "indicate", "the", "upper", "and", "lower", "quartiles", ",", "the", "boxes", "indicate", "the", "interquartile", "range", ",", "and", "the", "plus", "sign", "indicates", "the", "mean", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Subcellular fractionation of BcSrpk1-GFP in WT and BcSrpk1mutant strains. The amount of nuclear BcSrpk1-GFP was set as 1. Data information: , each gel shown is a representative experiment carried out three times. The fractionation controls were histone H1 (nucleus), Actin (cytosol) and CBB staining.B Co-IP analysis revealing the interaction of BcAha1 with BcSrpk1 and its mutant forms. Data information: each gel shown is a representative experiment carried out three times.C K367 acetylation of BcSrpk1 during the early infection stage. Total proteins were extracted from tomato leaves at 0 (spores), 12, 24 and 36 hpi. Eluted proteins bound to the anti-GFP beads were probed by the anti-K304ac and anti-GFP antibodies. The amount of acetylated and total BcSrpk1 at 0 hpi was each set as 1. Data information: each gel shown is a representative experiment carried out three times.F Relative density of DAB staining in E (four biological replicates). Data information: For F the presence of different letters above the mean values of four replicates indicates a significant difference between different samples (P < 0.05, ANOVA). The whiskers of the boxplots indicate the upper and lower quartiles, the boxes indicate the interquartile range, and the plus sign indicates the mean."}
{"words": ["Figure", "2Two", "top", "-", "ranked", "SplashRNA", "-", "designed", "shRNAmirs", "targeting", "human", "Nurd", "complex", "components", "and", "a", "control", "shRNAmir", "targeting", "human", "CD4", "were", "cloned", "into", "both", "miR", "-", "AB", "and", "miR", "-", "E", "lentiviral", "vectors", "with", "Venus", "as", "reporter", ".", "The", "lentiviruses", "packaged", "by", "these", "constructs", "were", "used", "for", "transduction", "of", "multiple", "human", "cell", "lines", ".", "RNAi", "efficiency", "was", "determined", "by", "western", "blot", "(", "WB", ")", "analysis", "of", "target", "protein", "levels", "in", "the", "lysates", "of", "the", "transduced", "cells", ".", "-", "actin", "served", "as", "loading", "control", ".", "The", "RNAi", "efficiency", "of", "Pten", ".", "1524", "and", "Pten", ".", "932", "shRNAmir", "mediated", "by", "miR", "-", "AB", "vs", ".", "miR", "-", "E", "was", "tested", "in", "NIH", "-", "3T3", "cells", "in", "the", "context", "of", "<", "30", "%", "transduction", "efficiency", "(", "GFP", "as", "reporter", ")", ".", "Representative", "western", "blots", "of", "Pten", "protein", "expression", "of", "the", "FACS", "-", "sorted", "GFP", "+", "cells", "from", "two", "biological", "replicates", "were", "shown", ".", "β", "-", "actin", "served", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Two top-ranked SplashRNA-designed shRNAmirs targeting human Nurd complex components and a control shRNAmir targeting human CD4 were cloned into both miR-AB and miR-E lentiviral vectors with Venus as reporter. The lentiviruses packaged by these constructs were used for transduction of multiple human cell lines. RNAi efficiency was determined by western blot (WB) analysis of target protein levels in the lysates of the transduced cells. -actin served as loading control.The RNAi efficiency of Pten.1524 and Pten.932 shRNAmir mediated by miR-AB vs. miR-E was tested in NIH-3T3 cells in the context of <30% transduction efficiency (GFP as reporter). Representative western blots of Pten protein expression of the FACS-sorted GFP+ cells from two biological replicates were shown. β-actin served as loading control."}
{"words": ["Figure", "3Two", "top", "-", "ranked", "SplashRNA", "-", "designed", "shRNAmirs", "targeting", "human", "or", "mouse", "surface", "protein", "FAS", "were", "cloned", "into", "Venus", "-", "expressing", "miR", "-", "AB", "lentiviral", "vectors", "which", "harbor", "different", "promoters", "to", "drive", "the", "shRNAmir", "expression", ".", "The", "packaged", "lentiviruses", "were", "used", "to", "infect", "the", "indicated", "human", "or", "mouse", "cell", "lines", ".", "A", "shRNAmir", "targeting", "human", "or", "mouse", "CD4", "driven", "under", "hCMV", "promoter", "was", "used", "as", "control", ".", "After", ">", "96h", "of", "infection", ",", "FAS", "protein", "levels", "in", "the", "transduced", "Venus", "-", "positive", "cells", "were", "determined", "by", "surface", "staining", "and", "shown", "in", "histograms", "(", "top", "panels", ")", "and", "quantified", "by", "MFI", "of", "APC", "(", "bottom", "panels", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Two top-ranked SplashRNA-designed shRNAmirs targeting human or mouse surface protein FAS were cloned into Venus-expressing miR-AB lentiviral vectors which harbor different promoters to drive the shRNAmir expression. The packaged lentiviruses were used to infect the indicated human or mouse cell lines. A shRNAmir targeting human or mouse CD4 driven under hCMV promoter was used as control. After >96h of infection, FAS protein levels in the transduced Venus-positive cells were determined by surface staining and shown in histograms (top panels) and quantified by MFI of APC (bottom panels)."}
{"words": ["Figure", "4293T", "cells", "were", "co", "-", "transduced", "with", "four", "miR", "-", "AB", "lentiviruses", "at", "1", ":", "1", "ratio", ",", "which", "carries", "a", "neutral", "shRNAmir", "targeting", "CD4", "or", "CD19", ",", "with", "Azurite", ",", "GFP", ",", "Ametrine", "or", "mOrange", "as", "reporter", "respectively", ".", "Cells", "were", "cultured", "for", "22", "days", "and", "fluorescence", "positive", "cells", "were", "quantified", "at", "the", "time", "points", "as", "indicated", ".", "Representative", "contour", "FACS", "plots", "cells", "on", "day", "4", "and", "day", "22", "shown", "(", "top", "panels", ")", ".", "Cell", "numbers", "of", "untransduced", ",", "single", "fluorescence", "positive", "cells", "and", "quadruple", "positive", "cells", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "untransduced", "cells", "on", "day", "4", ",", "and", "plotted", "over", "time", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "n", "=", "4", ".", "NS", "indicates", "no", "significant", "difference", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4293T cells were co-transduced with four miR-AB lentiviruses at 1:1 ratio, which carries a neutral shRNAmir targeting CD4 or CD19, with Azurite, GFP, Ametrine or mOrange as reporter respectively. Cells were cultured for 22 days and fluorescence positive cells were quantified at the time points as indicated. Representative contour FACS plots cells on day 4 and day 22 shown (top panels). Cell numbers of untransduced, single fluorescence positive cells and quadruple positive cells were quantified and normalized to untransduced cells on day 4, and plotted over time (bottom panel). Data are shown as mean ± s.d. and n=4. NS indicates no significant difference (P>0.05, two-tailed unpaired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "5CD8", "+", "T", "cells", "were", "activated", "for", "16h", "and", "then", "co", "-", "transduced", "with", "miR", "-", "AB", "retroviruses", "at", "1", ":", "1", "ratio", ",", "which", "carries", "a", "SplashRNA", "-", "designed", "shRNAmir", ",", "targeting", "surface", "protein", "CD127", ",", "CD90", ",", "CD44", "or", "CD8", ",", "with", "Azurite", ",", "GFP", ",", "Ametrine", "or", "mCherry2", "as", "fluorescent", "reporters", "respectively", "for", "4h", ".", "miR", "-", "AB", "retroviruses", "expressing", "CD19", "-", "specific", "shRNAmirs", "with", "same", "fluorescent", "reporters", "were", "used", "as", "controls", ".", "Surface", "staining", "was", "performed", "72h", "after", "transduction", ".", "FACS", "data", "were", "shown", "as", "overlaid", "histograms", "of", "control", "shRNAmirs", "(", "shCD19s", ")", "and", "target", "shRNAmirs", "(", "shCD127", ",", "shCD90", ",", "shCD44", "or", "shCD8", ")", ".", "Cells", "were", "categorized", "as", "sixteen", "populations", "expressing", "single", ",", "double", ",", "triple", "or", "quadruple", "fluorescent", "proteins", "or", "not", "(", "none", ")", "and", "fluorescent", "reporter", "-", "positive", "plots", "were", "highlighted", "with", "thick", "frames", "and", "white", "background", ".", "Each", "population", "'", "s", "surface", "staining", "profile", "was", "shown", "on", "the", "right", ".", "The", "data", "was", "representative", "of", "two", "biologically", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5CD8+ T cells were activated for 16h and then co-transduced with miR-AB retroviruses at 1:1 ratio, which carries a SplashRNA-designed shRNAmir, targeting surface protein CD127, CD90, CD44 or CD8, with Azurite, GFP, Ametrine or mCherry2 as fluorescent reporters respectively for 4h. miR-AB retroviruses expressing CD19-specific shRNAmirs with same fluorescent reporters were used as controls. Surface staining was performed 72h after transduction. FACS data were shown as overlaid histograms of control shRNAmirs (shCD19s) and target shRNAmirs (shCD127, shCD90, shCD44 or shCD8). Cells were categorized as sixteen populations expressing single, double, triple or quadruple fluorescent proteins or not (none) and fluorescent reporter-positive plots were highlighted with thick frames and white background. Each population's surface staining profile was shown on the right. The data was representative of two biologically independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "(", "left", ")", "t", "-", "sne", "plot", "from", "scRNAseq", "data", "of", "human", "organoids", "and", "cluster", "assignment", "of", "colonic", "cell", "populations", ".", "Red", "color", "corresponds", "to", "undifferentiated", "cells", ",", "light", "green", "corresponds", "to", "surface", "colonocytes", "(", "enterocytes", ")", ".", "t", "-", "sne", "plot", "for", "selected", "genes", "from", "single", "cell", "RNAseq", "of", "human", "colon", "epithelial", "cells", "revealing", "expression", "of", "ACE2", "specifically", "in", "differentiated", "surface", "colonocytes", "expressing", "KRT20", "and", "AQP8", ",", "which", "also", "express", "the", "IFN", "-", "γ", "receptor", "IFNGR2", ".", "B", ")", "Immunofluorescence", "staining", "for", "ACE2", "(", "red", ")", "and", "KRT20", "(", "green", ")", "of", "human", "colon", "tissue", "section", "indicating", "ACE2", "expression", "in", "surface", "colonocytes", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "C", ")", "Human", "colon", "organoids", "cultured", "in", "full", "medium", "(", "FM", ")", "condition", "(", "upper", "panel", ")", "or", "FM", "treated", "with", "IFN", "-", "γ", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Left", ":", "bright", "field", "images", "of", "7", "-", "day", "cultured", "human", "colon", "organoids", ",", "scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "Right", ":", "Immunofluorescence", "for", "KRT20", "(", "green", ";", "note", "increased", "expression", "upon", "IFN", "-", "γ", "treatment", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "D", ")", "Human", "colon", "organoids", "cultured", "in", "basic", "medium", "(", "upper", "panel", ")", "or", "additionally", "treated", "with", "IFN", "-", "γ", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Left", ":", "bright", "field", "images", "of", "organoids", "that", "were", "cultured", "for", "4", "days", "in", "basic", "medium", "and", "in", "addition", "for", "3", "days", "with", "IFN", "-", "γ", "(", "lower", "panel", ")", "scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "Middle", ":", "Immunofluorescence", "labelling", "for", "KRT20", "(", "green", ")", "Right", ":", "Immunofluorescence", "labelling", "for", "E", "-", "cadherin", "(", "green", ")", "to", "visualize", "epithelial", "cell", "boundaries", ";", "insets", "with", "higher", "magnification", "indicate", "elongation", "of", "epithelial", "cells", "that", "are", "grown", "in", "basic", "medium", "and", "treated", "with", "IFN", "-", "γ", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "Comparison", "of", "E", ")", "KRT20", ",", "F", ")", "MUC2", ",", "G", ")", "CHGA", ",", "H", ")", "LGR5", "mRNA", "expression", "in", "organoids", "grown", "in", "FM", "or", "in", "basic", "medium", "and", "either", "untreated", "or", "treated", "with", "IFN", "-", "γ", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "as", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "testACE2", "mRNA", "expression", "in", "organoids", "grown", "in", "FM", "or", "in", "basic", "medium", "and", "either", "untreated", "or", "treated", "with", "IFN", "-", "γ", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "as", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "testJ", ")", "Immunofluorescence", "staining", "for", "ACE2", "(", "red", ")", "and", "KRT20", "(", "green", ")", "of", "organoids", "grown", "in", "full", "medium", "(", "upper", ")", "or", "basic", "medium", "(", "lower", ")", "and", "additionally", "treated", "with", "IFN", "-", "γ", "(", "right", ")", ",", "indicating", "expression", "of", "ACE2", "in", "differentiated", "enterocytes", ".", "White", "arrows", "point", "to", "ACE2", ".", "Scale", "bar", ":", "10"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) (left) t-sne plot from scRNAseq data of human organoids and cluster assignment of colonic cell populations. Red color corresponds to undifferentiated cells, light green corresponds to surface colonocytes (enterocytes). t-sne plot for selected genes from single cell RNAseq of human colon epithelial cells revealing expression of ACE2 specifically in differentiated surface colonocytes expressing KRT20 and AQP8, which also express the IFN-γ receptor IFNGR2. B) Immunofluorescence staining for ACE2 (red) and KRT20 (green) of human colon tissue section indicating ACE2 expression in surface colonocytes. Scale bar: 50 µm.C) Human colon organoids cultured in full medium (FM) condition (upper panel) or FM treated with IFN-γ (lower panel). Left: bright field images of 7-day cultured human colon organoids, scale bar: 100 µm. Right: Immunofluorescence for KRT20 (green; note increased expression upon IFN-γ treatment). Scale bar: 25 µm.D) Human colon organoids cultured in basic medium (upper panel) or additionally treated with IFN-γ (lower panel). Left: bright field images of organoids that were cultured for 4 days in basic medium and in addition for 3 days with IFN-γ (lower panel) scale bar: 100 µm. Middle: Immunofluorescence labelling for KRT20 (green) Right: Immunofluorescence labelling for E-cadherin (green) to visualize epithelial cell boundaries; insets with higher magnification indicate elongation of epithelial cells that are grown in basic medium and treated with IFN-γ. Scale bar: 25 µm.Comparison of E) KRT20, F) MUC2, G) CHGA, H) LGR5 mRNA expression in organoids grown in FM or in basic medium and either untreated or treated with IFN-γ (n=3). Data are presented as mean +/- SD ,*: p≤0.05, **: p≤0.001, ***: p≤0.0001, as determined by one-way ANOVA, followed by Tukey's multiple comparisons testACE2 mRNA expression in organoids grown in FM or in basic medium and either untreated or treated with IFN-γ (n=3). Data are presented as mean +/- SD ,*: p≤0.05, **: p≤0.001, ***: p≤0.0001, as determined by one-way ANOVA, followed by Tukey's multiple comparisons testJ) Immunofluorescence staining for ACE2 (red) and KRT20 (green) of organoids grown in full medium (upper) or basic medium (lower) and additionally treated with IFN-γ (right), indicating expression of ACE2 in differentiated enterocytes. White arrows point to ACE2. Scale bar: 10 µm"}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "Immunofluorescence", "for", "N", "-", "protein", "(", "green", ")", "48", "h", "after", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "infection", "of", "human", "colon", "organoids", "cultured", "in", "full", "medium", "(", "upper", ")", ",", "full", "medium", "+", "IFN", "-", "γ", "(", "upper", "right", ")", ",", "basic", "medium", "(", "lower", "left", ")", "and", "basic", "medium", "+", "IFN", "-", "γ", "(", "lower", "right", ")", ".", "Yellow", "arrows", "point", "to", "N", "-", "protein", "positive", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "B", ")", "qPCR", "data", "displaying", "the", "relative", "virus", "load", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "measured", "by", "viral", "genome", "quantity", "in", "full", "medium", "vs", ".", "basic", "medium", "organoids", "48", "h", "after", "infection", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "C", ")", "qPCR", "data", "displaying", "the", "relative", "virus", "load", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "measured", "by", "viral", "genome", "quantity", "in", "full", "medium", "vs", ".", "full", "medium", "+", "IFN", "-", "γ", "treated", "organoids", "48", "h", "after", "infection", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "D", ")", "qPCR", "data", "displaying", "the", "relative", "virus", "load", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "measured", "by", "viral", "genome", "quantity", "in", "basic", "medium", "vs", ".", "basic", "medium", "+", "IFN", "-", "γ", "treated", "organoids", "48", "h", "after", "infection", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "E", ")", "qPCR", "data", "displaying", "the", "relative", "virus", "load", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "measured", "by", "viral", "genome", "quantity", "in", "full", "medium", "+", "IFN", "-", "γ", "vs", ".", "basic", "medium", "+", "IFN", "-", "γ", "treated", "organoids", "48", "h", "after", "infection", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "B", "-", "E", ")", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "as", "determined", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "F", ")", "qPCR", "data", "comparing", "the", "relative", "virus", "load", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "measured", "by", "viral", "genome", "quantity", "normalized", "to", "GAPDH", "at", "24", "and", "48", "h", "after", "infection", "in", "full", "medium", "(", "left", ")", "and", "basic", "medium", "(", "right", ")", "untreated", "or", "treated", "with", "IFN", "-", "γ", ",", "indicating", "increase", "in", "virus", "load", "in", "differentiated", "and", "IFN", "-", "γ", "treated", "conditions", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "as", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "testG", ")", "Electron", "microscopy", "imaging", "of", "organoids", "grown", "in", "basic", "medium", ",", "pretreated", "with", "IFN", "-", "γ", "for", "3", "days", "and", "infected", "for", "48", "h", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ".", "Upper", ":", "Overview", "showing", "large", "virus", "-", "loaded", "vesicles", "in", "an", "epithelial", "cell", ".", "Scale", "bar", ":", "500nm", ".", "Lower", ":", "Disintegrated", "organoid", "cell", "containing", "high", "virus", "load", ",", "scale", "bar", ":", "2", ".", "5µm", ",", "higher", "magnification", "to", "visualize", "virus", "particles", ",", "scale", "bar", ":", "100nm", ".", "H", ")", "Immunofluorescence", "for", "cleaved", "-", "caspase3", "(", "red", ")", "and", "E", "-", "cadherin", "(", "green", ")", "48", "h", "after", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "infection", "of", "human", "colon", "organoids", "cultured", "in", "full", "medium", "(", "upper", ")", ",", "full", "medium", "+", "IFN", "-", "γ", "(", "upper", "right", ")", ",", "basic", "medium", "(", "lower", "left", ")", "and", "basic", "medium", "+", "IFN", "-", "γ", "(", "lower", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "(", "below", ")", "Quantification", "of", "apoptotic", "cells", ",", "indicating", "increased", "cell", "death", "in", "the", "differentiated", "and", "IFN", "-", "γ", "treated", "condition", "after", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "infection", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "as", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) Immunofluorescence for N-protein (green) 48 h after SARS-CoV-2 infection of human colon organoids cultured in full medium (upper), full medium + IFN-γ (upper right), basic medium (lower left) and basic medium + IFN-γ (lower right). Yellow arrows point to N-protein positive cells. Scale bar: 25 µm.B) qPCR data displaying the relative virus load of SARS-CoV-2 measured by viral genome quantity in full medium vs. basic medium organoids 48 h after infection and normalized to GAPDH (n=6). C) qPCR data displaying the relative virus load of SARS-CoV-2 measured by viral genome quantity in full medium vs. full medium + IFN-γ treated organoids 48 h after infection and normalized to GAPDH (n=9). D) qPCR data displaying the relative virus load of SARS-CoV-2 measured by viral genome quantity in basic medium vs. basic medium + IFN-γ treated organoids 48 h after infection and normalized to GAPDH (n=4). E) qPCR data displaying the relative virus load of SARS-CoV-2 measured by viral genome quantity in full medium + IFN-γ vs. basic medium+ IFN-γ treated organoids 48 h after infection and normalized to GAPDH (n=4). (B-E) Data are presented as mean +/- SD ,*: p≤0.05, **: p≤0.001, ***: p≤0.0001, as determined by Student's t-test F) qPCR data comparing the relative virus load of SARS-CoV-2 measured by viral genome quantity normalized to GAPDH at 24 and 48 h after infection in full medium (left) and basic medium (right) untreated or treated with IFN-γ, indicating increase in virus load in differentiated and IFN-γ treated conditions (n=8). Data are presented as mean +/- SD ,*: p≤0.05, **: p≤0.001, ***: p≤0.0001, as determined by one-way ANOVA, followed by Tukey's multiple comparisons testG) Electron microscopy imaging of organoids grown in basic medium, pretreated with IFN-γ for 3 days and infected for 48 h with SARS-CoV-2. Upper: Overview showing large virus-loaded vesicles in an epithelial cell. Scale bar: 500nm. Lower: Disintegrated organoid cell containing high virus load, scale bar: 2.5µm, higher magnification to visualize virus particles, scale bar: 100nm.H) Immunofluorescence for cleaved-caspase3 (red) and E-cadherin (green) 48 h after SARS-CoV-2 infection of human colon organoids cultured in full medium (upper), full medium + IFN-γ (upper right), basic medium (lower left) and basic medium + IFN-γ (lower right). Scale bar: 50 µm. (below) Quantification of apoptotic cells, indicating increased cell death in the differentiated and IFN-γ treated condition after SARS-CoV-2 infection (n=7). Data are presented as mean +/- SD ,*: p≤0.05, **: p≤0.001, ***: p≤0.0001, as determined by one-way ANOVA, followed by Tukey's multiple comparisons test"}
{"words": ["Figure", "3C", ")", "Analysis", "of", "discordance", "and", "concordance", "of", "transcriptomic", "responses", "(", "DISCO", ")", "between", "untreated", "vs", ".", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "infected", "and", "untreated", "vs", "IFN", "-", "γ", "treated", "organoids", ".", "The", "50", "most", "regulated", "genes", "are", "highlighted", ";", "grey", ":", "discordant", "and", "black", ":", "concordant", ".", "D", ")", "Relative", "expression", "of", "selected", "enterocyte", "-", "specific", "genes", "upon", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "infection", ",", "normalized", "to", "GAPDH", ".", "Differences", "in", "gene", "expression", "were", "assessed", "using", "the", "linear", "model", "'", "lmFit", "'", "and", "'", "makeContrasts", "'", "in", "limma", ".", "E", ")", "Immunofluorescence", "for", "KRT20", "(", "green", ")", "in", "human", "colon", "organoids", "cultured", "in", "basic", "medium", "and", "either", "non", "-", "infected", "(", "left", ")", "or", "48", "h", "after", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "infection", "(", "right", ")", ",", "indicating", "a", "strong", "increase", "in", "KRT20", "expression", "after", "viral", "infection", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "Quantification", "of", "fluorescence", "intensity", "below", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "as", "determined", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "testF", ")", "qPCR", "data", "displaying", "the", "increase", "of", "INF", "-", "γ", "target", "genes", "(", "CXCL11", ",", "IFIT3", ")", "(", "upper", ")", "and", "enterocyte", "marker", "genes", "(", "KRT20", ",", "ACE2", ")", "(", "lower", ")", "after", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "infection", ",", "validating", "the", "results", "from", "the", "microarray", "analysis", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "as", "determined", "by", "Student", "'", "s", "t", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C) Analysis of discordance and concordance of transcriptomic responses (DISCO) between untreated vs. SARS-CoV-2 infected and untreated vs IFN-γ treated organoids. The 50 most regulated genes are highlighted; grey: discordant and black: concordant.D) Relative expression of selected enterocyte-specific genes upon SARS-CoV-2 infection, normalized to GAPDH. Differences in gene expression were assessed using the linear model 'lmFit' and 'makeContrasts' in limma.E) Immunofluorescence for KRT20 (green) in human colon organoids cultured in basic medium and either non-infected (left) or 48 h after SARS-CoV-2 infection (right), indicating a strong increase in KRT20 expression after viral infection. Scale bar: 50 µm. Quantification of fluorescence intensity below (n=8). Data are presented as mean +/- SD ,****: p≤0.0001, as determined by Student's t-testF) qPCR data displaying the increase of INF-γ target genes (CXCL11, IFIT3) (upper) and enterocyte marker genes (KRT20, ACE2) (lower) after SARS-CoV-2 infection, validating the results from the microarray analysis (n=3). Data are presented as mean +/- SD ,****: p≤0.0001, as determined by Student's t-test"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "5", "μg", "/", "mL", "of", "anti", "-", "kappa", "antibody", "(", "a", "-", "k", "chain", ",", "top", ")", "or", "1", "µM", "LatrunculinA", "(", "LatA", ",", "bottom", ")", ".", "Intracellular", "calcium", "flux", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", "in", "the", "presence", "of", "Src", "-", "inhibitor", "(", "PP2", ")", ",", "Syk", "-", "inhibitor", "(", "BAY", "613606", ")", "or", "vehicle", "control", ".", "(", "B", ")", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "control", "(", "-", ")", ",", "5", "μg", "/", "mL", "anti", "-", "kappa", "antibody", "or", "1", "µM", "LatA", "for", "the", "indicated", "time", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "analysed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "phospho", "-", "Lyn", "(", "Y507", ")", "and", "actin", "as", "loading", "control", ".", "The", "intensity", "of", "phosphorylated", "proteins", ",", "normalized", "to", "actin", ",", "was", "referred", "to", "the", "respective", "unstimulated", "sample", ",", "set", "as", "1", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "control", "(", "-", ")", ",", "5", "µg", "/", "mL", "anti", "-", "kappa", "antibody", "or", "1", "µM", "LatA", "for", "the", "indicated", "time", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "analysed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "phospho", "-", "Syk", "(", "pSyk", ")", ",", "phospho", "-", "CD19", "(", "pCD19", ")", ",", "phospho", "-", "Akt", "(", "pAkt", ")", ",", "phospho", "-", "ERK", "(", "pERK", ")", "and", "total", "ERK", "as", "loading", "control", ".", "The", "intensity", "of", "phosphorylated", "proteins", ",", "normalized", "to", "ERK", ",", "was", "referred", "to", "the", "respective", "unstimulated", "sample", ",", "set", "as", "1", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "control", "(", "-", ")", ",", "5", "µg", "/", "mL", "anti", "-", "kappa", "antibody", "or", "1", "µM", "LatA", "for", "the", "indicated", "time", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "analysed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "phospho", "-", "PLCγ2", "(", "pPLCγ2", ")", "and", "total", "ERK", "as", "loading", "control", ".", "The", "intensity", "of", "phosphorylated", "proteins", ",", "normalized", "to", "ERK", ",", "was", "referred", "to", "the", "respective", "unstimulated", "sample", ",", "set", "as", "1", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "control", "(", "-", ")", ",", "5", "µg", "/", "mL", "anti", "-", "kappa", "antibody", "or", "1", "µM", "LatA", "for", "the", "indicated", "time", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "analysed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "phospho", "-", "CD22", "(", "pCD22", ")", ",", "phospho", "-", "SHP1", "(", "pSHP1", ")", ",", "and", "CD22", "or", "total", "ERK", "as", "loading", "controls", ".", "The", "intensity", "of", "phosphorylated", "proteins", ",", "normalized", "to", "CD22", "or", "ERK", ",", "was", "referred", "to", "the", "respective", "unstimulated", "sample", ",", "set", "as", "1", ".", "(", "I", ")", "Wild", "-", "type", "and", "Cd22", "-", "/", "-", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "5", "µg", "/", "mL", "anti", "-", "kappa", "antibody", "or", "1", "µM", "LatA", "and", "intracellular", "calcium", "flux", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "J", ")", "Wild", "-", "type", "and", "Cd22Y2", ",", "5", ",", "6F", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "5", "µg", "/", "mL", "anti", "-", "kappa", "antibody", "or", "1", "µM", "LatA", "and", "intracellular", "calcium", "flux", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "K", "and", "L", ")", "Wild", "-", "type", ",", "Cd22", "-", "/", "-", "and", "Cd22Y2", ",", "5", ",", "6F", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "control", "(", "-", ")", "or", "1", "µM", "LatA", "for", "the", "indicated", "time", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "analysed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "phospho", "-", "CD19", "(", "pCD19", ")", ",", "phospho", "-", "Akt", "(", "pAkt", ")", ",", "phospho", "-", "ERK", "(", "pERK", ")", "and", "actin", "as", "loading", "control", ".", "The", "intensity", "of", "phosphorylated", "proteins", ",", "normalized", "to", "actin", ",", "was", "referred", "to", "the", "unstimulated", "sample", "of", "the", "wild", "type", "cells", ",", "set", "as", "1", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Wild-type primary B cells were treated with 5 μg/mL of anti-kappa antibody (a-k chain, top) or 1 µM LatrunculinA (LatA, bottom). Intracellular calcium flux was measured by flow cytometry in the presence of Src-inhibitor (PP2), Syk-inhibitor (BAY 613606) or vehicle control.(B) Wild-type primary B cells were treated with vehicle control (-), 5 μg/mL anti-kappa antibody or 1 µM LatA for the indicated time. Cells were lysed and analysed by SDS-PAGE followed by immunoblotting with phospho-Lyn (Y507) and actin as loading control. The intensity of phosphorylated proteins, normalized to actin, was referred to the respective unstimulated sample, set as 1.(C and D) Wild-type primary B cells were treated with vehicle control (-), 5 µg/mL anti-kappa antibody or 1 µM LatA for the indicated time. Cells were lysed and analysed by SDS-PAGE followed by immunoblotting with phospho-Syk (pSyk), phospho-CD19 (pCD19), phospho-Akt (pAkt), phospho-ERK (pERK) and total ERK as loading control. The intensity of phosphorylated proteins, normalized to ERK, was referred to the respective unstimulated sample, set as 1.(E and F) Wild-type primary B cells were treated with vehicle control (-), 5 µg/mL anti-kappa antibody or 1 µM LatA for the indicated time. Cells were lysed and analysed by SDS-PAGE followed by immunoblotting with phospho-PLCγ2 (pPLCγ2) and total ERK as loading control. The intensity of phosphorylated proteins, normalized to ERK, was referred to the respective unstimulated sample, set as 1.(G and H) Wild-type primary B cells were treated with vehicle control (-), 5 µg/mL anti-kappa antibody or 1 µM LatA for the indicated time. Cells were lysed and analysed by SDS-PAGE followed by immunoblotting with phospho-CD22 (pCD22), phospho-SHP1 (pSHP1), and CD22 or total ERK as loading controls. The intensity of phosphorylated proteins, normalized to CD22 or ERK, was referred to the respective unstimulated sample, set as 1.(I) Wild-type and Cd22-/- primary B cells were treated with 5 µg/mL anti-kappa antibody or 1 µM LatA and intracellular calcium flux was measured by flow cytometry.(J) Wild-type and Cd22Y2,5,6F primary B cells were treated with 5 µg/mL anti-kappa antibody or 1 µM LatA and intracellular calcium flux was measured by flow cytometry.(K and L) Wild-type, Cd22-/- and Cd22Y2,5,6F primary B cells were treated with vehicle control (-) or 1 µM LatA for the indicated time. Cells were lysed and analysed by SDS-PAGE followed by immunoblotting with phospho-CD19 (pCD19), phospho-Akt (pAkt), phospho-ERK (pERK) and actin as loading control. The intensity of phosphorylated proteins, normalized to actin, was referred to the unstimulated sample of the wild type cells, set as 1."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Determining", "the", "number", "and", "density", "of", "CD22", ",", "CD19", ",", "IgM", "and", "IgD", "on", "the", "surface", "of", "wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "PE", "-", "conjugated", "antibody", "against", "CD22", "(", "blue", "profile", ")", ",", "CD19", "(", "red", "profile", ")", ",", "IgM", "(", "red", "profile", ")", "or", "IgD", "(", "red", "profile", ")", "and", "their", "fluorescence", "profiles", "compared", "to", "those", "of", "standard", "beads", "(", "grey", "profiles", ")", ",", "which", "each", "possess", "a", "well", "-", "defined", "number", "of", "binding", "sites", "(", "st0", "=", "blank", ",", "st1", "-", "st4", "=", "increasing", "number", "of", "binding", "sites", ")", "against", "the", "primary", "antibody", ".", "For", "IgM", ",", "where", "the", "range", "of", "expression", "is", "large", ",", "the", "low", "and", "high", "25", "percentiles", "were", "calculated", "as", "in", "Mattila", "et", "al", ".", "2013", "and", "shown", "in", "brackets", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", "-", "E", ")", "Dual", "-", "colour", "SIM", "analysis", "of", "CD22", ",", "IgM", ",", "IgD", "and", "CD19", ".", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "fixed", ",", "stained", "with", "Atto633", "or", "488", "-", "conjugated", "antibody", "against", "CD22", ",", "IgM", "or", "IgD", "and", "Alexa647", "-", "conjugated", "antibody", "against", "CD19", "and", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", ".", "Cells", "were", "then", "embedded", "in", "agarose", ",", "imaged", "with", "SIM", "and", "analysed", ".", "(", "B", ")", "SIM", "images", "of", "CD22", ",", "IgM", ",", "IgD", "and", "CD19", ".", "(", "C", ")", "Cross", "-", "correlation", "function", ".", "(", "D", ")", "Pearson", "correlation", "coefficient", ".", "(", "E", ")", "Cluster", "size", "calculated", "from", "autocorrelation", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Determining the number and density of CD22, CD19, IgM and IgD on the surface of wild-type primary B cells. Cells were stained with PE-conjugated antibody against CD22 (blue profile), CD19 (red profile), IgM (red profile) or IgD (red profile) and their fluorescence profiles compared to those of standard beads (grey profiles), which each possess a well-defined number of binding sites (st0=blank, st1-st4=increasing number of binding sites) against the primary antibody. For IgM, where the range of expression is large, the low and high 25 percentiles were calculated as in Mattila et al. 2013 and shown in brackets.Data are representative of three independent experiments.(B-E) Dual-colour SIM analysis of CD22, IgM, IgD and CD19. Wild-type primary B cells were fixed, stained with Atto633 or 488-conjugated antibody against CD22, IgM or IgD and Alexa647-conjugated antibody against CD19 and settled onto nonstimulatory coverslips. Cells were then embedded in agarose, imaged with SIM and analysed.(B) SIM images of CD22, IgM, IgD and CD19.(C) Cross-correlation function.(D) Pearson correlation coefficient.(E) Cluster size calculated from autocorrelation analysis."}
{"words": ["Figure", "3Figure", "3", ".", "CD22", "is", "highly", "clustered", "on", "the", "surface", "of", "resting", "B", "cells", "(", "A", "-", "C", ")", "dSTORM", "analysis", "of", "CD22", ",", "CD19", ",", "IgM", "and", "IgD", ".", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "stained", "with", "Alexa647", "-", "conjugated", "antibody", "against", "CD22", ",", "Cy5", "-", "conjugated", "antibody", "against", "CD19", "or", "IgD", ",", "or", "Cy5", "-", "conjugated", "Fab", "fragments", "against", "IgM", "and", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", ",", "imaged", "with", "dSTORM", "and", "analysed", ".", "(", "A", ")", "2D", "(", "top", "and", "middle", ")", "and", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", "dSTORM", "images", "were", "reconstructed", "from", "single", "molecule", "localizations", ".", "The", "white", "dashed", "square", "is", "shown", "in", "magnification", "(", "middle", ")", "and", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "distribution", "of", "CD22", ",", "CD19", ",", "IgM", "and", "IgD", "with", "H", "function", "and", "Hopkins", "index", ".", "Error", "bars", "(", "Hopkins", "index", ")", "and", "thin", "lines", "(", "H", "function", ")", "denote", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "at", "least", "three", "experiments", "per", "receptor", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Figure 3. CD22 is highly clustered on the surface of resting B cells(A-C) dSTORM analysis of CD22, CD19, IgM and IgD. Wild-type primary B cells were stained with Alexa647-conjugated antibody against CD22, Cy5-conjugated antibody against CD19 or IgD, or Cy5-conjugated Fab fragments against IgM and settled onto nonstimulatory coverslips. Cells were then fixed, imaged with dSTORM and analysed.(A) 2D (top and middle) and pseudo 3D (bottom) dSTORM images were reconstructed from single molecule localizations. The white dashed square is shown in magnification (middle) and pseudo 3D (bottom).(B and C) Quantification of the distribution of CD22, CD19, IgM and IgD with H function and Hopkins index. Error bars (Hopkins index) and thin lines (H function) denote mean ± SEM. Data are pooled from at least three experiments per receptor.*P < 0.001, **P < 0.0001 (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "Single", "-", "particle", "-", "tracking", "of", "CD22", ",", "CD19", ",", "IgM", "and", "IgD", ".", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "stained", "with", "Atto633", "-", "conjugated", "Fab", "fragments", "against", "CD22", ",", "CD19", ",", "IgM", "and", "IgD", ",", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", "and", "imaged", ".", "Single", "particle", "trajectories", "were", "then", "analysed", ".", "(", "A", ")", "Trajectories", "of", "CD22", "showing", "diffusion", "of", "single", "particles", "over", "6", "s", ".", "(", "B", ")", "Magnified", "region", "from", "(", "A", ")", "traces", "one", "particle", "(", "current", "position", "indicated", "with", "white", "dashed", "circle", ",", "trajectory", "in", "red", ")", "over", "6", "s", ".", "(", "C", ")", "Diffusion", "coefficients", "of", "300", "representative", "CD22", ",", "CD19", ",", "IgM", "and", "IgD", "particles", ".", "Bars", "indicate", "the", "median", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "at", "least", "three", "experiments", "per", "receptor", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Single", "-", "particle", "-", "tracking", "of", "CD22", "in", "primary", "LifeAct", "-", "GFP", "-", "expressing", "B", "cells", ".", "Cells", "were", "labelled", "with", "Atto633", "-", "conjugated", "Fab", "fragments", "against", "CD22", ",", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", "and", "imaged", ".", "Single", "particle", "trajectories", "were", "then", "analysed", ".", "(", "D", ")", "Trajectories", "of", "CD22", "(", "left", ")", "showing", "diffusion", "of", "single", "particles", "over", "6", "s", "and", "overlaid", "with", "a", "still", "image", "of", "F", "-", "actin", "intensity", "(", "middle", ")", ".", "Areas", "of", "high", "F", "-", "actin", "density", "(", "grey", "line", "boundaries", ")", "with", "trajectories", "of", "CD22", "classified", "as", "being", "inside", "(", "red", ")", "and", "outside", "(", "blue", ")", "of", "F", "-", "actin", "rich", "areas", ".", "(", "E", ")", "Diffusion", "coefficients", "of", "CD22", "particles", "from", "(", "D", ")", "whose", "trajectories", "were", "classed", "as", "inside", "(", "in", ")", "or", "outside", "(", "out", ")", "of", "actin", "rich", "areas", ".", "The", "overall", "diffusion", "is", "also", "shown", "(", "all", ")", ".", "Bars", "and", "numbers", "are", "the", "median", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "two", "different", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "Correlation", "analysis", ".", "For", "each", "position", "in", "each", "CD22", "track", ",", "the", "actin", "intensity", "was", "measured", "and", "compared", "to", "the", "same", "number", "of", "random", "positions", "on", "the", "same", "cell", ".", "Values", "from", "different", "cells", "were", "normalized", "so", "that", "the", "average", "intensity", "in", "F", "-", "actin", "rich", "regions", "corresponds", "to", "a", "value", "of", "one", "and", "the", "average", "for", "F", "-", "actin", "low", "regions", "to", "zero", ".", "(", "G", ")", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "labelled", "with", "Atto633", "-", "conjugated", "Fab", "fragments", "against", "CD22", ",", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", "and", "treated", "with", "vehicle", "control", "(", "DMSO", ")", "or", "1µM", "LatA", ".", "Single", "particle", "trajectories", "were", "then", "analysed", ".", "Bars", "and", "numbers", "indicate", "the", "median", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "two", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "H", "-", "J", ")", "Wild", "-", "type", "primary", "B", "cells", "were", "stained", "with", "Alexa647", "-", "conjugated", "antibody", "against", "CD22", "and", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", ",", "imaged", "with", "dSTORM", "and", "analysed", ".", "(", "H", ")", "2D", "(", "top", ")", "and", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", "dSTORM", "images", "were", "reconstructed", "from", "single", "molecule", "localizations", ".", "The", "white", "dashed", "square", "is", "shown", "in", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", ".", "(", "I", "-", "J", ")", "Quantification", "of", "the", "distribution", "of", "CD22", "Hopkins", "index", "and", "with", "H", "function", ".", "Error", "bars", "(", "Hopkins", "index", ")", "and", "thin", "lines", "(", "H", "function", ")", "denote", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "two", "different", "experiments", ".", "(", "K", ")", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "F", "-", "actin", "by", "intracellular", "phalloidin", "staining", "of", "unstimulated", "or", "LatA", "treated", "wild", "-", "type", "B", "cells", "for", "the", "indicated", "length", "of", "time", ".", "(", "L", ")", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "CD22", "surface", "expression", "in", "resting", "or", "stimulated", "B", "cells", "with", "10µg", "/", "ml", "anti", "-", "µ", "chain", "(", "Jackson", "ImmunoResearch", ")", ",", "1µM", "or", "10µM", "LatA", "for", "5", "and", "15", "minutes", ".", "Error", "bars", "denote", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) Single-particle-tracking of CD22, CD19, IgM and IgD. Wild-type primary B cells were stained with Atto633-conjugated Fab fragments against CD22, CD19, IgM and IgD, settled onto nonstimulatory coverslips and imaged. Single particle trajectories were then analysed.(A) Trajectories of CD22 showing diffusion of single particles over 6 s.(B) Magnified region from (A) traces one particle (current position indicated with white dashed circle, trajectory in red) over 6 s.(C) Diffusion coefficients of 300 representative CD22, CD19, IgM and IgD particles. Bars indicate the median. Data are pooled from at least three experiments per receptor. *P < 0.0001 (Student's t-test).(D-F) Single-particle-tracking of CD22 in primary LifeAct-GFP-expressing B cells. Cells were labelled with Atto633-conjugated Fab fragments against CD22, settled onto nonstimulatory coverslips and imaged. Single particle trajectories were then analysed.(D) Trajectories of CD22 (left) showing diffusion of single particles over 6 s and overlaid with a still image of F-actin intensity (middle). Areas of high F-actin density (grey line boundaries) with trajectories of CD22 classified as being inside (red) and outside (blue) of F-actin rich areas.(E) Diffusion coefficients of CD22 particles from (D) whose trajectories were classed as inside (in) or outside (out) of actin rich areas. The overall diffusion is also shown (all). Bars and numbers are the median. Data are pooled from two different experiments. *P < 0.0001 (Student's t-test).(F) Correlation analysis. For each position in each CD22 track, the actin intensity was measured and compared to the same number of random positions on the same cell. Values from different cells were normalized so that the average intensity in F-actin rich regions corresponds to a value of one and the average for F-actin low regions to zero.(G) Wild-type primary B cells were labelled with Atto633-conjugated Fab fragments against CD22, settled onto nonstimulatory coverslips and treated with vehicle control (DMSO) or 1µM LatA. Single particle trajectories were then analysed. Bars and numbers indicate the median. Data are pooled from two experiments.*P < 0.0001 (Student's t-test).(H-J) Wild-type primary B cells were stained with Alexa647-conjugated antibody against CD22 and settled onto nonstimulatory coverslips. Cells were then fixed, imaged with dSTORM and analysed.(H) 2D (top) and pseudo 3D (bottom) dSTORM images were reconstructed from single molecule localizations. The white dashed square is shown in pseudo 3D (bottom).(I-J) Quantification of the distribution of CD22 Hopkins index and with H function. Error bars (Hopkins index) and thin lines (H function) denote mean ± SEM.Data are pooled from two different experiments.(K) Flow cytometric analysis of F-actin by intracellular phalloidin staining of unstimulated or LatA treated wild-type B cells for the indicated length of time.(L) Flow cytometric analysis of CD22 surface expression in resting or stimulated B cells with 10µg/ml anti-µ chain (Jackson ImmunoResearch), 1µM or 10µM LatA for 5 and 15 minutes. Error bars denote mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "B", ")", "Wild", "-", "type", "and", "CD45", "-", "deficient", "primary", "B", "cells", "were", "stained", "with", "Alexa647conjugated", "antibody", "against", "CD22", "and", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", ",", "imaged", "with", "dSTORM", "and", "analysed", ".", "(", "A", ")", "2D", "(", "top", ")", "and", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", "dSTORM", "images", "were", "reconstructed", "from", "single", "molecule", "localizations", ".", "The", "white", "dashed", "square", "is", "shown", "in", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", ".", "(", "B", ")", "Error", "bars", "(", "Hopkins", "index", ")", "and", "thin", "lines", "(", "H", "function", ")", "denote", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "three", "experiments", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "Wild", "-", "type", "and", "CD45", "-", "deficient", "primary", "B", "cells", "were", "labelled", "with", "Atto633", "-", "conjugated", "Fab", "fragments", "against", "CD22", "or", "IgM", ",", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", "and", "imaged", ".", "Single", "particle", "trajectories", "were", "then", "analysed", ".", "(", "C", ")", "Trajectories", "of", "CD22", "in", "wild", "-", "type", "(", "left", ")", "and", "CD45", "-", "deficient", "cells", "(", "right", ")", "showing", "diffusion", "of", "single", "particles", "over", "6", "s", ".", "(", "D", ")", "Diffusion", "coefficients", "of", "300", "representative", "CD22", "and", "IgM", "particles", ".", "Bars", "and", "numbers", "indicate", "the", "median", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "three", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Confinement", "analysis", "of", "CD22", "and", "IgM", ".", "Bars", "and", "numbers", "indicate", "the", "median", ".", "(", "F", ")", "Two", "-", "population", "analysis", "of", "CD22", "diffusion", ".", "Diffusion", "coefficient", "were", "plotted", "on", "a", "logarithmic", "scale", "and", "fitted", "to", "two", "Gaussian", "-", "shaped", "curves", "to", "account", "for", "slower", "(", "light", "grey", ")", "and", "faster", "(", "dark", "grey", ")", "diffusing", "populations", ".", "Wild", "-", "type", "(", "blue", "line", "and", "circles", ",", "left", ")", "and", "CD45", "-", "deficient", "(", "blue", "line", "and", "squares", ",", "left", "middle", ")", "primary", "B", "cells", "were", "compared", "in", "an", "overlay", "(", "right", "middle", ")", "and", "their", "proportions", "plotted", "(", "right", ")", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "CD45", "-", "deficient", "primary", "B", "cells", "were", "labelled", "with", "Atto633", "-", "conjugated", "Fab", "fragments", "against", "CD22", "or", "IgM", ",", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", ",", "treated", "with", "vehicle", "control", "(", "DMSO", ")", "or", "1µM", "LatA", "and", "imaged", ".", "Single", "particle", "trajectories", "were", "then", "analysed", "and", "diffusion", "coefficients", "calculated", ".", "(", "G", ")", "Diffusion", "coefficients", "of", "300", "representative", "CD22", "and", "IgM", "particles", ".", "Bars", "and", "numbers", "indicate", "the", "median", ".", "(", "H", ")", "Confinement", "analysis", ".", "Bars", "and", "numbers", "indicate", "the", "median", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "CD45", "-", "deficient", "primary", "B", "cells", "were", "stained", "with", "Alexa", "647", "-", "conjugated", "antibody", "against", "CD22", ",", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", "and", "treated", "with", "vehicle", "control", "or", "sialidase", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", ",", "imaged", "with", "dSTORM", "and", "analysed", ".", "(", "I", ")", "2D", "(", "top", ")", "and", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", "dSTORM", "images", "were", "reconstructed", "from", "single", "molecule", "localizations", ".", "The", "white", "dashed", "square", "is", "shown", "in", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "the", "distribution", "of", "CD22", "with", "Hopkins", "index", "and", "H", "function", ".", "Error", "bars", "(", "Hopkins", "index", ")", "and", "thin", "lines", "(", "H", "function", ")", "denote", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "two", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "K", "and", "L", ")", "Wild", "-", "type", "and", "CD45", "-", "deficient", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "control", "(", "-", ")", "or", "1", "µM", "LatA", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "analysed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "phospho", "-", "CD22", "(", "p", "-", "CD22", ")", "and", "total", "CD22", "as", "loading", "control", ".", "The", "intensity", "of", "p", "-", "CD22", ",", "normalized", "to", "CD22", ",", "was", "referred", "to", "the", "unstimulated", "sample", "of", "the", "wild", "-", "type", "cells", ",", "set", "as", "1", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-B) Wild-type and CD45-deficient primary B cells were stained with Alexa647conjugated antibody against CD22 and settled onto nonstimulatory coverslips. Cells were then fixed, imaged with dSTORM and analysed.(A) 2D (top) and pseudo 3D (bottom) dSTORM images were reconstructed from single molecule localizations. The white dashed square is shown in pseudo 3D (bottom).(B) Error bars (Hopkins index) and thin lines (H function) denote mean ± SEM. Data are pooled from three experiments.(C-E) Wild-type and CD45-deficient primary B cells were labelled with Atto633-conjugated Fab fragments against CD22 or IgM, settled onto nonstimulatory coverslips and imaged. Single particle trajectories were then analysed.(C) Trajectories of CD22 in wild-type (left) and CD45-deficient cells (right) showing diffusion of single particles over 6 s.(D) Diffusion coefficients of 300 representative CD22 and IgM particles. Bars and numbers indicate the median. Data are pooled from three experiments.(E) Confinement analysis of CD22 and IgM. Bars and numbers indicate the median.(F) Two-population analysis of CD22 diffusion. Diffusion coefficient were plotted on a logarithmic scale and fitted to two Gaussian-shaped curves to account for slower (light grey) and faster (dark grey) diffusing populations. Wild-type (blue line and circles, left) and CD45-deficient (blue line and squares, left middle) primary B cells were compared in an overlay (right middle) and their proportions plotted (right).(G and H) CD45-deficient primary B cells were labelled with Atto633-conjugated Fab fragments against CD22 or IgM, settled onto nonstimulatory coverslips, treated with vehicle control (DMSO) or 1µM LatA and imaged. Single particle trajectories were then analysed and diffusion coefficients calculated.(G) Diffusion coefficients of 300 representative CD22 and IgM particles. Bars and numbers indicate the median.(H) Confinement analysis. Bars and numbers indicate the median.(I and J) CD45-deficient primary B cells were stained with Alexa 647-conjugated antibody against CD22, settled onto nonstimulatory coverslips and treated with vehicle control or sialidase. Cells were then fixed, imaged with dSTORM and analysed.(I) 2D (top) and pseudo 3D (bottom) dSTORM images were reconstructed from single molecule localizations. The white dashed square is shown in pseudo 3D (bottom).(J) Quantification of the distribution of CD22 with Hopkins index and H function. Error bars (Hopkins index) and thin lines (H function) denote mean ± SEM.Data are pooled from two experiments.*P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0001 (Student's t-test).(K and L) Wild-type and CD45-deficient primary B cells were treated with vehicle control (-) or 1 µM LatA for the indicated times. Cells were lysed and analysed by SDS-PAGE followed by immunoblotting with phospho-CD22 (p-CD22) and total CD22 as loading control. The intensity of p-CD22, normalized to CD22, was referred to the unstimulated sample of the wild-type cells, set as 1."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "E", ")", "Wild", "-", "type", "and", "Cd22R130E", "primary", "B", "cells", "were", "labelled", "with", "Atto", "633", "-", "conjugated", "Fab", "fragments", "against", "CD22", "or", "IgM", ",", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", "and", "imaged", ".", "Single", "particle", "trajectories", "were", "then", "analysed", ".", "(", "A", ")", "Trajectories", "of", "CD22", "in", "Wild", "-", "type", "(", "left", ")", "and", "Cd22R130E", "cells", "(", "right", ")", "showing", "diffusion", "of", "single", "particles", "over", "6", "s", ".", "B", ")", "Diffusion", "coefficients", "of", "300", "representative", "CD22", "and", "IgM", "particles", ".", "Bars", "and", "numbers", "indicate", "the", "median", ".", "(", "C", ")", "Confinement", "analysis", ".", "Bars", "and", "numbers", "indicate", "the", "median", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "Two", "-", "population", "analysis", "of", "CD22", "diffusion", ".", "Analysis", "of", "CD22", "diffusion", "plotted", "on", "a", "logarithmic", "scale", "and", "fitted", "to", "two", "Gaussian", "-", "shaped", "curves", "to", "account", "for", "slower", "and", "faster", "diffusing", "populations", ".", "(", "D", ")", "Wild", "-", "type", "(", "blue", "line", "and", "circles", ")", "and", "Cd22R130E", "(", "blue", "dotted", "line", "and", "squares", "middle", ")", "primary", "B", "cells", "were", "compared", "in", "an", "overlay", "(", "left", ")", "and", "the", "proportions", "of", "the", "faster", "diffusing", "populations", "plotted", "(", "right", ")", ".", "(", "E", ")", "Proportions", "of", "faster", "-", "diffusing", "populations", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "Wild", "-", "type", "and", "Cd22R130E", "primary", "B", "cells", "were", "stained", "with", "Alexa", "647", "-", "conjugated", "antibody", "against", "CD22", "and", "settled", "onto", "nonstimulatory", "coverslips", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", ",", "imaged", "with", "dSTORM", "and", "analysed", ".", "(", "F", ")", "2D", "(", "top", ")", "and", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", "dSTORM", "images", "were", "reconstructed", "from", "single", "molecule", "localizations", ".", "The", "white", "dashed", "square", "is", "shown", "in", "pseudo", "3D", "(", "bottom", ")", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "distribution", "of", "CD22", "with", "Hopkins", "index", "and", "H", "function", ".", "Error", "bars", "(", "Hopkins", "index", ")", "and", "thin", "lines", "(", "H", "function", ")", "denote", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "three", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Wild", "-", "type", "and", "Cd22R130E", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "1", "µM", "LatA", "and", "intracellular", "calcium", "flux", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "I", "-", "K", ")", "Wild", "-", "type", "and", "Cd22R130E", "primary", "B", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "control", "(", "-", ")", "or", "1", "µM", "LatA", "for", "the", "indicated", "time", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "analysed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "phospho", "-", "CD19", "(", "p", "-", "CD19", ")", ",", "phospho", "-", "Akt", "(", "pAkt", ")", ",", "phospho", "-", "ERK", "(", "pERK", ")", "and", "actin", "and", "total", "ERK", "as", "loading", "controls", ".", "The", "intensity", "of", "phosphorylated", "proteins", ",", "normalized", "to", "actin", "or", "ERK", ",", "was", "referred", "to", "the", "unstimulated", "sample", "of", "the", "wild", "type", "cells", ",", "set", "as", "1", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-E) Wild-type and Cd22R130E primary B cells were labelled with Atto 633-conjugated Fab fragments against CD22 or IgM, settled onto nonstimulatory coverslips and imaged. Single particle trajectories were then analysed.(A) Trajectories of CD22 in Wild-type (left) and Cd22R130E cells (right) showing diffusion of single particles over 6 s.B) Diffusion coefficients of 300 representative CD22 and IgM particles. Bars and numbers indicate the median.(C) Confinement analysis. Bars and numbers indicate the median.(D and E) Two-population analysis of CD22 diffusion. Analysis of CD22 diffusion plotted on a logarithmic scale and fitted to two Gaussian-shaped curves to account for slower and faster diffusing populations.(D) Wild-type (blue line and circles) and Cd22R130E (blue dotted line and squares middle) primary B cells were compared in an overlay (left) and the proportions of the faster diffusing populations plotted (right).(E) Proportions of faster-diffusing populations.(F and G) Wild-type and Cd22R130E primary B cells were stained with Alexa 647-conjugated antibody against CD22 and settled onto nonstimulatory coverslips. Cells were then fixed, imaged with dSTORM and analysed.(F) 2D (top) and pseudo 3D (bottom) dSTORM images were reconstructed from single molecule localizations. The white dashed square is shown in pseudo 3D (bottom).(G) Quantification of the distribution of CD22 with Hopkins index and H function. Error bars (Hopkins index) and thin lines (H function) denote mean ± SEM. Data are pooled from three experiments.(H) Wild-type and Cd22R130E primary B cells were treated with 1 µM LatA and intracellular calcium flux was measured by flow cytometry.(I-K) Wild-type and Cd22R130E primary B cells were treated with vehicle control (-) or 1 µM LatA for the indicated time. Cells were lysed and analysed by SDS-PAGE followed by immunoblotting with phospho-CD19 (p-CD19), phospho-Akt (pAkt), phospho-ERK (pERK) and actin and total ERK as loading controls. The intensity of phosphorylated proteins, normalized to actin or ERK, was referred to the unstimulated sample of the wild type cells, set as 1.Data are representative of at least two experiments."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "z", "-", "stacks", "were", "acquired", "from", "FM4", "-", "64", "labeled", "vacuoles", "in", "wildtype", "cells", "(", "BJ3505", ")", ",", "using", "a", "spinning", "disc", "microscope", "(", "step", "size", "200", "nm", ")", ".", "3D", "reconstructions", "from", "these", "stacks", "reveal", "a", "peripherally", "located", "fusion", "pore", ".", "Scale", "bar", "2", "µm", ".", "B", ")", "Wildtype", "(", "BJ3505", ")", "and", "isogenic", "pmc1", "∆", "/", "vcx1Δ", "mutant", "cells", "were", "labeled", "with", "FM4", "-", "64", ".", "The", "number", "of", "vacuoles", "per", "cell", "was", "determined", "in", "3", "independent", "experiments", "evaluating", "200", "cells", "each", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "C", ")", "Frequency", "of", "visible", "fusion", "pores", ".", "Cells", "were", "grown", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "showing", "visible", "fusion", "pore", "was", "determined", "from", "z", "-", "stacks", ".", "Means", "s", ".", "d", ".", "are", "shown", "for", "100", "stained", "vacuoles", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "E", ")", "Distribution", "of", "Vph1", "-", "GFP", "and", "FM4", "-", "64", "in", "vacuole", "-", "vacuole", "contact", "sites", ".", "Vph1", "-", "GFP", "expressing", "cells", ",", "labeled", "with", "FM4", "-", "64", ",", "were", "analyzed", "under", "a", "spinning", "disk", "confocal", "microscope", "equipped", "with", "two", "cameras", "for", "the", "simultaneous", "acquisition", "of", "GFP", "and", "FM4", "-", "64", "fluorescence", "signals", ".", "Separate", "channels", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "The", "entire", "contact", "surface", ",", "but", "not", "the", "pore", ",", "is", "accessible", "to", "both", "probes", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "F", ")", "Expansion", "of", "a", "vacuolar", "fusion", "pore", "in", "real", "time", ".", "pmc1", "∆", "/", "vcx1Δ", "cells", "were", "labeled", "with", "FM4", "-", "64", "and", "immobilized", "in", "a", "50", "µL", "flow", "chamber", "(", "Ibidi", ")", ".", "The", "osmotic", "value", "of", "the", "medium", "was", "changed", "by", "perfusion", "with", "water", ",", "using", "a", "pump", "with", "a", "flow", "of", "30", "µL", "/", "s", ".", "A", "frame", "was", "acquired", "every", "2", "s", "for", "a", "total", "period", "of", "the", "30", "s", ",", "using", "the", "laser", "at", "minimal", "intensity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) z-stacks were acquired from FM4-64 labeled vacuoles in wildtype cells (BJ3505), using a spinning disc microscope (step size 200 nm). 3D reconstructions from these stacks reveal a peripherally located fusion pore. Scale bar 2 µm.B) Wildtype (BJ3505) and isogenic pmc1∆/vcx1Δ mutant cells were labeled with FM4-64. The number of vacuoles per cell was determined in 3 independent experiments evaluating 200 cells each. Scale bar: 2 µm. C) Frequency of visible fusion pores. Cells were grown as in (B). The percentage of cells showing visible fusion pore was determined from z-stacks. Means s.d. are shown for 100 stained vacuoles from 3 independent experiments. E) Distribution of Vph1-GFP and FM4-64 in vacuole-vacuole contact sites. Vph1-GFP expressing cells, labeled with FM4-64, were analyzed under a spinning disk confocal microscope equipped with two cameras for the simultaneous acquisition of GFP and FM4-64 fluorescence signals. Separate channels are shown on the right. The entire contact surface, but not the pore, is accessible to both probes. Scale bar: 2 µm.F) Expansion of a vacuolar fusion pore in real time. pmc1∆/vcx1Δ cells were labeled with FM4-64 and immobilized in a 50 µL flow chamber (Ibidi). The osmotic value of the medium was changed by perfusion with water, using a pump with a flow of 30 µL/s. A frame was acquired every 2 s for a total period of the 30 s, using the laser at minimal intensity."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "Vacuolar", "membranes", "of", "wildtype", "(", "BY4741", ")", ",", "nyv1", "∆", "vam3", "∆", ",", "ypt7", "∆", "or", "vma16F190Y", "cells", "were", "labeled", "with", "the", "vital", "dye", "FM4", "-", "64", ".", "A", "vacuole", "that", "was", "in", "a", "sufficiently", "peripheral", "location", "to", "be", "selectively", "photobleached", "was", "exposed", "to", "a", "laser", "pulse", "(", "white", "arrows", "indicate", "the", "bleaching", "area", ")", ".", "Recovery", "of", "fluorescence", "in", "this", "area", "was", "assayed", "10", "seconds", "later", "by", "spinning", "disc", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "B", ")", "Kinetics", "of", "FM4", "-", "64", "recovery", "in", "(", "A", ")", ".", "Means", "and", "s", ".", "d", ".", "are", "shown", "for", "20", "vacuole", "clusters", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "C", ")", "In", "vivo", "lipid", "and", "content", "mixing", ".", "Vacuoles", "in", "living", "yeast", "were", "labeled", "with", "the", "indicated", "lumenal", "(", "CDCFDA", ")", "and", "membrane", "(", "FM4", "-", "64", "or", "PX", "-", "GFP", ")", "probes", ".", "Note", "that", "CRY1", "cells", "lack", "the", "ADE2", "gene", "and", "hence", "naturally", "accumulate", "5", "-", "amino", "-", "1", "-", "(", "5", "-", "phospho", "-", "D", "-", "ribosyl", ")", "imidazole", "as", "fluorescent", "fluid", "phase", "marker", "in", "the", "vacuolar", "lumen", ".", "FRAP", "-", "experiments", "were", "performed", "(", "arrows", "indicate", "the", "bleaching", "area", ")", ".", "1", ".", "Non", "-", "bleached", "lumenal", "area", ".", "2", ".", "Bleached", "lumenal", "area", ".", "3", ".", "Bleached", "membrane", "area", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "D", "and", "E", ")", "Kinetics", "of", "fluorescence", "recovery", "after", "photobleaching", "of", "the", "probes", "in", "(", "C", ")", ".", "Numbers", "denote", "the", "areas", "shown", "in", "(", "C", ")", ":", "1", ".", "Non", "-", "bleached", "lumenal", "area", ".", "2", ".", "Bleached", "lumenal", "area", ".", "3", ".", "Bleached", "membrane", "area", ".", "Means", "and", "s", ".", "d", ".", "are", "shown", "for", "20", "vacuole", "clusters", "from", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) Vacuolar membranes of wildtype (BY4741), nyv1∆ vam3∆, ypt7∆ or vma16F190Y cells were labeled with the vital dye FM4-64. A vacuole that was in a sufficiently peripheral location to be selectively photobleached was exposed to a laser pulse (white arrows indicate the bleaching area). Recovery of fluorescence in this area was assayed 10 seconds later by spinning disc confocal microscopy. Scale bar: 2 µm. B) Kinetics of FM4-64 recovery in (A). Means and s.d. are shown for 20 vacuole clusters from 3 independent experiments. C) In vivo lipid and content mixing. Vacuoles in living yeast were labeled with the indicated lumenal (CDCFDA) and membrane (FM4-64 or PX-GFP) probes. Note that CRY1 cells lack the ADE2 gene and hence naturally accumulate 5-amino-1-(5-phospho-D-ribosyl)imidazole as fluorescent fluid phase marker in the vacuolar lumen. FRAP-experiments were performed (arrows indicate the bleaching area). 1. Non-bleached lumenal area. 2. Bleached lumenal area. 3. Bleached membrane area. Scale bar: 2 µm. D and E) Kinetics of fluorescence recovery after photobleaching of the probes in (C). Numbers denote the areas shown in (C): 1. Non-bleached lumenal area. 2. Bleached lumenal area. 3. Bleached membrane area. Means and s.d. are shown for 20 vacuole clusters from 3 independent experiments. "}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "FM4", "-", "64", "and", "GFP", "excitation", "/", "emission", "spectra", ".", "C", ")", "Assay", "by", "microscopy", ".", "Half", "of", "two", "cultures", "of", "cells", "expressing", "Vph1", "-", "EGFP", "or", "Nyv1", "-", "EGFP", "were", "labeled", "with", "FM4", "-", "64", ",", "washed", "and", "mixed", "with", "the", "other", ",", "non", "-", "labeled", "half", "of", "the", "same", "culture", ".", "Cells", "were", "analyzed", "by", "spinning", "disc", "confocal", "microscopy", ".", "The", "intensities", "of", "GFP", "fluorescence", "were", "tracked", "along", "the", "dashed", "lines", "and", "compared", "between", "neighboring", "FM4", "-", "64", "-", "labeled", "and", "unlabeled", "cells", ".", "D", ")", "FACS", "analysis", ".", "The", "strains", "were", "labeled", "washed", "and", "analyzes", "by", "FACS", ".", "Shown", "are", "side", "(", "SSC", "-", "A", ")", "and", "forward", "scatter", "(", "FSC", "-", "A", ")", ",", "as", "well", "as", "the", "fluorescence", "intensity", "distributions", "for", "FM4", "-", "64", "and", "for", "GFP", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "FM4", "-", "64", ".", "E", ")", "Comparison", "of", "the", "GFP", "mean", "fluorescence", "from", "FM4", "-", "64", "-", "stained", "cells", "and", "unstained", "cells", "(", "20", "'", "000", "each", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) FM4-64 and GFP excitation/emission spectra.C) Assay by microscopy. Half of two cultures of cells expressing Vph1-EGFP or Nyv1-EGFP were labeled with FM4-64, washed and mixed with the other, non-labeled half of the same culture. Cells were analyzed by spinning disc confocal microscopy. The intensities of GFP fluorescence were tracked along the dashed lines and compared between neighboring FM4-64-labeled and unlabeled cells.D) FACS analysis. The strains were labeled washed and analyzes by FACS. Shown are side (SSC-A) and forward scatter (FSC-A), as well as the fluorescence intensity distributions for FM4-64 and for GFP in the absence or presence of FM4-64. E) Comparison of the GFP mean fluorescence from FM4-64-stained cells and unstained cells (20'000 each). "}
{"words": ["Figure", "4C", ",", "D", ")", "FRAP", "assays", "for", "fusion", "pores", ".", "The", "indicated", "cells", "expressing", "(", "C", ")", "yeGFP", "-", "LT", "or", "(", "D", ")", "LT", "-", "yeGFP", "were", "labeled", "with", "FM4", "-", "64", "and", "subjected", "to", "FRAP", "experiments", "Cells", "were", "imaged", "before", "and", "0", "(", "bleached", ")", "or", "30", "seconds", "after", "photobleaching", "(", "recovery", ")", ".", "The", "bleached", "areas", "are", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "E", ",", "F", ")", "FRAP", "assays", "for", "fusion", "pores", "were", "performed", "as", "in", "(", "C", ",", "D", ")", ",", "but", "with", "nyv1", "∆", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "G", ")", "The", "histogram", "reports", "the", "fraction", "of", "cells", "showing", "FRAP", ".", "Means", "and", "s", ".", "d", ".", "are", "shown", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "with", "100", "cells", "analyzed", "in", "each", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C,D) FRAP assays for fusion pores. The indicated cells expressing (C) yeGFP-LT or (D) LT-yeGFP were labeled with FM4-64 and subjected to FRAP experiments Cells were imaged before and 0 (bleached) or 30 seconds after photobleaching (recovery). The bleached areas are indicated by an arrow. E,F) FRAP assays for fusion pores were performed as in (C, D), but with nyv1∆ cells. Scale bar: 2 µm. G) The histogram reports the fraction of cells showing FRAP. Means and s.d. are shown from 3 independent experiments, with 100 cells analyzed in each. "}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "F", ")", "The", "indicated", "yeast", "strains", "were", "transformed", "with", "expression", "plasmids", "for", "FYVE2", "-", "GFP", "and", "their", "vacuolar", "membranes", "were", "labeled", "with", "FM4", "-", "64", ".", "FRAP", "was", "performed", "using", "a", "spinning", "disk", "microscope", "equipped", "with", "an", "emission", "beam", "splitter", "and", "two", "synchronized", "cameras", ",", "allowing", "to", "simultaneously", "analyze", "FM4", "-", "64", "and", "GFP", "fluorescence", ".", "The", "histograms", "show", "the", "kinetics", "of", "signal", "recovery", "for", "(", "A", ")", "wildtype", "(", "WT", ")", ",", "(", "B", ")", "vam3tsf", ",", "(", "C", ")", "ypt7T22N", ",", "(", "D", ")", "vma16F190Y", ",", "(", "E", ")", "vps33P184L", ",", "and", "(", "F", ")", "nyv1", "∆", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "Arrows", "indicate", "the", "bleaching", "area", ".", "Means", "and", "s", ".", "d", ".", "are", "shown", "for", "20", "stained", "vacuoles", "from", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-F) The indicated yeast strains were transformed with expression plasmids for FYVE2-GFP and their vacuolar membranes were labeled with FM4-64. FRAP was performed using a spinning disk microscope equipped with an emission beam splitter and two synchronized cameras, allowing to simultaneously analyze FM4-64 and GFP fluorescence. The histograms show the kinetics of signal recovery for (A) wildtype (WT), (B) vam3tsf, (C) ypt7T22N, (D) vma16F190Y, (E) vps33P184L, and (F) nyv1∆ cells. Scale bar: 2 µm. Arrows indicate the bleaching area. Means and s.d. are shown for 20 stained vacuoles from 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "D", ")", "Wild", "-", "type", "(", "A", ",", "B", ")", "or", "nyv1", "∆", "cells", "(", "C", ",", "D", ")", ",", "which", "lack", "the", "vacuolar", "R", "-", "SNARE", "Nyv1", ",", "were", "labeled", "with", "FM4", "-", "64", ".", "Cells", "were", "immobilized", "on", "a", "chambered", "slide", "and", "subjected", "to", "FRAP", "experiments", "(", "C", ")", "Vacuole", "fission", "induced", "by", "hypertonic", "shift", ".", "FRAP", "experiments", "were", "performed", "before", "(", "0", "'", ")", "or", "15", "min", "after", "addition", "of", "NaCl", "to", "0", ".", "5", "mol", "/", "l", ".", "The", "fluorescence", "images", "show", "the", "vacuoles", "inside", "a", "single", "cell", ".", "(", "B", ",", "D", ")", "Cells", "in", "S", "-", "phase", "were", "selected", ",", "which", "grow", "a", "daughter", "cell", "and", "therefore", "fission", "their", "vacuoles", "into", "a", "chain", "of", "tubulo", "-", "vesicular", "structures", ",", "part", "of", "which", "are", "transported", "into", "the", "daughter", "cell", ".", "FRAP", "experiment", "on", "vesicles", "in", "the", "inheritance", "structure", "were", "performed", ".", "Arrows", "indicate", "the", "bleaching", "area", ",", "dashed", "orange", "lines", "the", "cell", "cortex", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-D) Wild-type (A, B) or nyv1∆ cells (C,D), which lack the vacuolar R-SNARE Nyv1, were labeled with FM4-64. Cells were immobilized on a chambered slide and subjected to FRAP experiments (C) Vacuole fission induced by hypertonic shift. FRAP experiments were performed before (0') or 15 min after addition of NaCl to 0.5 mol/l. The fluorescence images show the vacuoles inside a single cell. (B, D) Cells in S-phase were selected, which grow a daughter cell and therefore fission their vacuoles into a chain of tubulo-vesicular structures, part of which are transported into the daughter cell. FRAP experiment on vesicles in the inheritance structure were performed. Arrows indicate the bleaching area, dashed orange lines the cell cortex. Scale bar: 2 µm."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "Wildtype", "(", "BY4741", ")", "cells", "labeled", "with", "FM4", "-", "64", "show", "extensive", "contact", "zones", "between", "vacuoles", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "C", ")", "FRAP", "analysis", "of", "FM4", "-", "64", "-", "labeled", "wildtype", "cells", "was", "performed", "by", "acquiring", "pictures", "in", "continuous", "acquisition", "mode", "after", "bleaching", ",", "for", "a", "total", "period", "of", "5", "s", ".", "Three", "representative", "frames", "after", "photobleaching", "are", "shown", ".", "The", "bars", "in", "the", "magnified", "parts", "of", "frames", "2", "and", "3", "illustrate", "the", "positions", "at", "which", "the", "recovery", "of", "FM4", "-", "64", "fluorescence", "was", "quantified", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "D", ")", "Quantification", "of", "recovery", "experiments", "in", "(", "C", ")", ".", "A", "delay", "of", ">", "50", "ms", "between", "the", "appearance", "of", "the", "signal", "on", "both", "sides", "of", "the", "photobleached", "vacuole", "was", "considered", "as", "asymmetric", "recovery", ".", "The", "histogram", "shows", "means", "and", "s", ".", "d", ".", "from", "3", "independent", "experiments", "evaluating", "50", "stained", "vacuoles", "each", ".", "A", "Schematic", "view", "of", "the", "various", "possible", "positions", "of", "a", "fusion", "pore", "and", "its", "consequences", "for", "our", "ability", "to", "detect", "asymmetric", "FM4", "-", "64", "recovery", ".", "The", "contact", "zone", "between", "the", "two", "vacuoles", "is", "tilted", "by", "90", "°", "in", "the", "middle", "panel", ",", "which", "gives", "four", "examples", "for", "the", "positioning", "of", "the", "pore", "(", "shown", "as", "a", "black", "dot", ")", ".", "Asymmetric", "recovery", "could", "only", "be", "detected", "if", "the", "pore", "is", "sufficiently", "far", "from", "the", "center", "of", "the", "contact", "zone", "and", "close", "to", "the", "optical", "plane", "that", "is", "imaged", "(", "the", "cases", "marked", "in", "red", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) Wildtype (BY4741) cells labeled with FM4-64 show extensive contact zones between vacuoles. Scale bar: 2 µm.C) FRAP analysis of FM4-64-labeled wildtype cells was performed by acquiring pictures in continuous acquisition mode after bleaching, for a total period of 5 s. Three representative frames after photobleaching are shown. The bars in the magnified parts of frames 2 and 3 illustrate the positions at which the recovery of FM4-64 fluorescence was quantified. Scale bar: 2 µm. D) Quantification of recovery experiments in (C). A delay of >50 ms between the appearance of the signal on both sides of the photobleached vacuole was considered as asymmetric recovery. The histogram shows means and s.d. from 3 independent experiments evaluating 50 stained vacuoles each. A Schematic view of the various possible positions of a fusion pore and its consequences for our ability to detect asymmetric FM4-64 recovery. The contact zone between the two vacuoles is tilted by 90° in the middle panel, which gives four examples for the positioning of the pore (shown as a black dot). Asymmetric recovery could only be detected if the pore is sufficiently far from the center of the contact zone and close to the optical plane that is imaged (the cases marked in red). "}
{"words": ["Figure", "1", "|", "Representative", "analysis", "of", "B220", "and", "IgM", "surface", "expression", "in", "bone", "marrow", "(", "left", ")", "and", "spleen", "cells", "(", "right", ")", "of", "mice", "from", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "splenocytes", "from", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", "(", "pre", "-", "gated", "on", "B", "cells", ":", "B220", "+", "/", "CD19", "+", ")", "for", "surface", "expression", "of", "IgM", "and", "the", "3", "-", "83", "idiotype", "(", "54", ".", "1", ")", ".", "Shown", "data", "are", "representative", "11", "-", "35", "individual", "mice", "per", "genotype", ".", "PCR", "fragments", "amplified", "with", "specific", "primers", "for", "Vκ", "and", "Jκ5", "from", "genomic", "DNA", "of", "purified", "splenic", "B", "cells", "from", "Ptenf", "/", "f", "x", "3", "-", "83ki", "and", "Ptenf", "/", "f", "x", "mb1", "-", "cre", "x", "3", "-", "83ki", "mice", "on", "the", "respective", "backgrounds", ".", "Genomic", "tail", "DNA", "from", "a", "3", "-", "83ki", "mouse", "and", "DNA", "from", "purified", "splenic", "B", "cells", "of", "a", "control", "(", "ctrl", ")", "mouse", "were", "used", "as", "controls", ".", "PCR", "for", "the", "splicing", "factor", "Srp20", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Kb", "and", "Kd", "indicate", "the", "respective", "background", "of", "the", "mice", ",", "(", "H2", "-", "Kb", ":", "+", "Ag", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1| Representative analysis of B220 and IgM surface expression in bone marrow (left) and spleen cells (right) of mice from the indicated genotypes.Representative flow cytometric analysis of splenocytes from mice of the indicated genotypes (pre-gated on B cells: B220+/CD19+) for surface expression of IgM and the 3-83 idiotype (54.1). Shown data are representative 11 - 35 individual mice per genotype.PCR fragments amplified with specific primers for Vκ and Jκ5 from genomic DNA of purified splenic B cells from Ptenf/f x 3-83ki and Ptenf/f x mb1-cre x 3-83ki mice on the respective backgrounds. Genomic tail DNA from a 3-83ki mouse and DNA from purified splenic B cells of a control (ctrl) mouse were used as controls. PCR for the splicing factor Srp20 served as a loading control. Kb and Kd indicate the respective background of the mice, (H2-Kb: +Ag)."}
{"words": ["Figure", "2A", "|", "Intracellular", "expression", "of", "IgM", "(", "Ig", "-", "μHC", "ic", ")", "in", "bone", "marrow", "(", "left", ")", "and", "spleen", "cells", "(", "right", ")", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", "and", "compared", "between", "the", "populations", "of", "B", "cells", "(", "green", ",", "identified", "by", "B220", "and", "CD19", "expression", ")", "and", "non", "-", "B", "cells", "(", "gray", ")", ".", "Numbers", "in", "the", "histograms", "indicate", "the", "percentages", "of", "the", "positive", "populations", ".", "Figures", "are", "representative", "of", "11", "-", "35", "individual", "mice", "per", "genotype", ".", "B", "|", "Intracellular", "Ca2", "+", "influx", "was", "measured", "in", "CD90", ".", "2", "/", "Thy1", ".", "2", "-", "splenocytes", "derived", "from", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", "following", "stimulation", "with", "10", "μg", "/", "ml", "α", "-", "κLC", "antibody", ".", "Figures", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "individual", "mice", "per", "genotype", ".", "C", "|", "Serum", "IgM", "concentrations", "measured", "in", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Mean", "±", "SD", ",", "symbols", "represent", "IgM", "concentrations", "from", "individual", "mice", "(", "n", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "using", "the", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "(", "see", "also", "Table", "S1", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "D", ",", "E", "|", "Absolute", "numbers", "of", "B", "cells", "in", "bone", "marrow", "(", "D", ")", "and", "spleens", "(", "E", ")", "from", "mice", "of", "the", "respective", "genotypes", ",", "determined", "by", "B220", "/", "CD19", "surface", "expression", ".", "Mean", "±", "SD", ",", "symbols", "indicate", "the", "numbers", "of", "B", "cells", "in", "individual", "mice", "(", "n", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "using", "the", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "(", "see", "also", "Tables", "S2", "-", "3", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ";", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A | Intracellular expression of IgM (Ig-μHC ic) in bone marrow (left) and spleen cells (right) was determined by flow cytometry and compared between the populations of B cells (green, identified by B220 and CD19 expression) and non-B cells (gray). Numbers in the histograms indicate the percentages of the positive populations. Figures are representative of 11 - 35 individual mice per genotype.B | Intracellular Ca2+ influx was measured in CD90.2/Thy1.2- splenocytes derived from mice of the indicated genotypes following stimulation with 10 μg/ml α-κLC antibody. Figures are representative of at least 3 individual mice per genotype.C | Serum IgM concentrations measured in mice of the indicated genotypes. Mean ±SD, symbols represent IgM concentrations from individual mice (n). Statistical significance was calculated by using the Kruskal-Wallis test (see also Table S1), n. s. = not significant; **** p ≤ 0.0001.D, E | Absolute numbers of B cells in bone marrow (D) and spleens (E) from mice of the respective genotypes, determined by B220/CD19 surface expression. Mean ±SD, symbols indicate the numbers of B cells in individual mice (n). Statistical significance was calculated by using the Kruskal-Wallis test (see also Tables S2-3), n. s. = not significant; * p ≤ 0.05; *** p ≤ 0.001; **** p ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "3Splenocytes", "from", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "(", "A", ")", "Ptenf", "/", "f", ",", "Ptenf", "/", "f", "x", "mb1", "-", "cre", "and", "Ptenf", "/", "f", "x", "mb1", "-", "cre", "3", "-", "83ki", "mice", "on", "the", "respective", "backgrounds", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "B", "cells", "were", "pre", "-", "gated", "by", "B220", "and", "CD19", "expression", "and", "the", "IgM", "/", "IgD", "surface", "expression", "(", "dot", "plots", ",", "left", ")", "was", "determined", ".", "Histograms", "(", "right", ")", "show", "a", "comparison", "of", "intracellular", "IgD", "expression", "(", "Ig", "-", "δHC", "ic", ")", "between", "the", "splenic", "populations", "of", "B", "cells", "(", "orange", ",", "identified", "by", "B220", "and", "CD19", "expression", ")", "and", "non", "-", "B", "cells", "(", "gray", ")", ".", "Numbers", "in", "the", "histograms", "indicate", "the", "percentages", "of", "the", "positive", "populations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "11", "-", "35", "individual", "mice", "per", "genotype", ".", "(", "B", ")", "Ptenf", "/", "f", "x", "MD4tg", "and", "Ptenf", "/", "f", "x", "mb1", "-", "cre", "x", "MD4tg", "mice", "in", "presence", "and", "absence", "of", "antigen", "(", "ML5tg", ")", ",", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "B", "cells", "were", "pre", "-", "gated", "by", "B220", "and", "CD19", "expression", "and", "the", "IgM", "/", "IgD", "surface", "expression", "(", "dot", "plots", ",", "left", ")", "was", "determined", ".", "Histograms", "(", "right", ")", "show", "a", "comparison", "of", "intracellular", "IgD", "expression", "(", "Ig", "-", "δHC", "ic", ")", "between", "the", "splenic", "populations", "of", "B", "cells", "(", "orange", ",", "identified", "by", "B220", "and", "CD19", "expression", ")", "and", "non", "-", "B", "cells", "(", "gray", ")", ".", "Numbers", "in", "the", "histograms", "indicate", "the", "percentages", "of", "the", "positive", "populations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "11", "-", "35", "individual", "mice", "per", "genotype", ".", "C", "|", "Quantification", "of", "surface", "IgD", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "in", "Ptenf", "/", "f", "x", "MD4", "-", "trangenic", "mice", "in", "presence", "(", "mb1", "-", "cre", "+", "/", "+", ")", "and", "absence", "(", "mb1", "-", "cre", "+", "/", "ki", ")", "of", "Pten", ".", "Single", "dots", "represent", "the", "average", "MFI", "of", "4", "independent", "measurements", "per", "mouse", "(", "n", ")", ",", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "D", "|", "Serum", "anti", "-", "HEL", "titers", ".", "Sera", "from", "MD4tg", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "adjusted", "to", "an", "IgM", "concentration", "of", "500", "μg", "/", "ml", "and", "applied", "in", "triplicates", "to", "HEL", "-", "coated", "plates", "in", "dilution", "steps", "of", "1", ":", "3", ",", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "using", "the", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "(", "see", "also", "Table", "S4", ")", ".", "Statements", "of", "significance", "in", "the", "figure", "refer", "to", "the", "comparison", "between", "Ptenf", "/", "f", "x", "MD4tg", "(", "filled", "red", "squares", ")", "and", "Ptenf", "/", "f", "x", "MD4tg", "x", "MD5tg", "sera", "(", "filled", "orange", "triangles", ")", ",", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "E", "|", "Immunohistochemistry", "of", "sections", "from", "spleens", "of", "Ptenf", "/", "f", ",", "Ptenf", "/", "f", "x", "mb1", "-", "cre", ",", "Ptenf", "/", "f", "x", "mb1", "-", "cre", "x", "3", "-", "83ki", "and", "Ptenf", "/", "f", "x", "mb1", "-", "cre", "x", "MD4tg", "mice", "for", "CD169", "(", "green", ")", ",", "CD5", "(", "red", ")", "and", "IgM", "(", "cyan", ")", "at", "10x", "magnification", ".", "Pictures", "in", "the", "second", "row", "show", "enlarged", "areas", "indicated", "by", "the", "white", "squares", ",", "respectively", ".", "Double", "-", "arrows", "indicate", "the", "distance", "between", "T", "cell", "(", "red", ")", "and", "marginal", "zone", "(", "green", ")", ".", "Shown", "pictures", "are", "representative", "of", "2", "-", "3", "mice", "per"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Splenocytes from mice of the indicated genotypes, (A) Ptenf/f, Ptenf/f x mb1-cre and Ptenf/f x mb1-cre 3-83ki mice on the respective backgrounds were analyzed by flow cytometry. B cells were pre-gated by B220 and CD19 expression and the IgM/IgD surface expression (dot plots, left) was determined. Histograms (right) show a comparison of intracellular IgD expression (Ig-δHC ic) between the splenic populations of B cells (orange, identified by B220 and CD19 expression) and non-B cells (gray). Numbers in the histograms indicate the percentages of the positive populations. Data are representative of 11 - 35 individual mice per genotype.(B) Ptenf/f x MD4tg and Ptenf/f x mb1-cre x MD4tg mice in presence and absence of antigen (ML5tg), were analyzed by flow cytometry. B cells were pre-gated by B220 and CD19 expression and the IgM/IgD surface expression (dot plots, left) was determined. Histograms (right) show a comparison of intracellular IgD expression (Ig-δHC ic) between the splenic populations of B cells (orange, identified by B220 and CD19 expression) and non-B cells (gray). Numbers in the histograms indicate the percentages of the positive populations. Data are representative of 11 - 35 individual mice per genotype.C | Quantification of surface IgD mean fluorescence intensity (MFI) in Ptenf/f x MD4-trangenic mice in presence (mb1-cre +/+) and absence (mb1-cre +/ki) of Pten. Single dots represent the average MFI of 4 independent measurements per mouse (n), mean ±SD. Statistical significance was calculated by using an unpaired two-tailed t-test.D | Serum anti-HEL titers. Sera from MD4tg mice of the indicated genotypes were adjusted to an IgM concentration of 500 μg/ml and applied in triplicates to HEL-coated plates in dilution steps of 1 : 3, mean ±SEM. Statistical significance was calculated by using the Kruskal-Wallis test (see also Table S4). Statements of significance in the figure refer to the comparison between Ptenf/f x MD4tg (filled red squares) and Ptenf/f x MD4tg x MD5tg sera (filled orange triangles), ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001.E | Immunohistochemistry of sections from spleens of Ptenf/f, Ptenf/f x mb1-cre, Ptenf/f x mb1-cre x 3-83ki and Ptenf/f x mb1-cre x MD4tg mice for CD169 (green), CD5 (red) and IgM (cyan) at 10x magnification. Pictures in the second row show enlarged areas indicated by the white squares, respectively. Double-arrows indicate the distance between T cell (red) and marginal zone (green). Shown pictures are representative of 2 - 3 mice per genotype"}
{"words": ["Figure", "4B", "|", "3", "days", "post", "transduction", "the", "surface", "expression", "of", "IgM", "/", "IgD", "(", "dot", "plots", ",", "top", ")", ",", "IgD", "and", "CD23", "(", "histograms", ",", "bottom", ")", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", "and", "compared", "between", "EV", "-", "and", "FoxO1", "-", "A3", "-", "transduced", "cells", ".", "Fluorescence", "minus", "one", "(", "FMO", ")", "stainings", ",", "lacking", "α", "-", "IgD", "or", "α", "-", "CD23", "antibodies", "respectively", ",", "served", "as", "controls", "(", "ctrl", ")", ".", "Bar", "diagrams", "below", "flow", "cytometry", "data", "display", "the", "percentages", "of", "IgD", "+", "cells", "(", "n", "=", "12", ";", "left", ")", "and", "MFI", "of", "CD23", "(", "as", "relative", "units", ",", "RU", ")", ",", "normalized", "to", "the", "MFI", "measured", "in", "the", "respective", "EV", "transduced", "cells", ";", "n", "=", "12", ";", "middle", ")", ".", "Fcer2", "transcript", "levels", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "right", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "Mean", "±", "SD", ",", "symbols", "indicate", "data", "from", "individual", "mice", ".", "Statistical", "significance", "of", "IgD", "expression", "was", "determined", "by", "applying", "the", "Wilcoxon", "matched", "-", "pairs", "signed", "rank", "test", "for", "CD23", "and", "by", "applying", "the", "one", "sample", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "for", "Fcer2", "expression", ".", "C", "|", "Cstf64", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "Ell2", "(", "n", "=", "8", ")", "and", "Zfp318", "(", "n", "=", "11", ")", "expression", "levels", "were", "measured", "at", "3", "days", "post", "transduction", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "FoxO1", "-", "A3", "-", "and", "EV", "-", "transduced", "splenic", "B", "cells", "were", "FACS", "-", "purified", "according", "to", "the", "gating", "strategy", "Mean", "±", "SD", ",", "symbols", "indicate", "the", "expression", "in", "individual", "mice", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "using", "the", "one", "-", "sample", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "E", ":", "IgD", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "CD23", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Fcer2", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "F", ":", "Cstf64", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "Ell2", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Zfp318", "(", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B | 3 days post transduction the surface expression of IgM/IgD (dot plots, top), IgD and CD23 (histograms, bottom) was measured by flow cytometry and compared between EV- and FoxO1-A3-transduced cells. Fluorescence minus one (FMO) stainings, lacking α-IgD or α-CD23 antibodies respectively, served as controls (ctrl). Bar diagrams below flow cytometry data display the percentages of IgD+ cells (n = 12; left) and MFI of CD23 (as relative units, RU), normalized to the MFI measured in the respective EV transduced cells; n = 12; middle). Fcer2 transcript levels were measured by qRT-PCR (right, n = 4). Mean ±SD, symbols indicate data from individual mice. Statistical significance of IgD expression was determined by applying the Wilcoxon matched-pairs signed rank test for CD23 and by applying the one sample two-tailed t-test for Fcer2 expression.C | Cstf64 (n = 8), Ell2 (n = 8) and Zfp318 (n = 11) expression levels were measured at 3 days post transduction by qRT-PCR. FoxO1-A3- and EV-transduced splenic B cells were FACS-purified according to the gating strategy Mean ±SD, symbols indicate the expression in individual mice. Statistical significance was calculated by using the one-sample two-tailed t-test.E: IgD (n = 6), CD23 (n = 4) and Fcer2 (n = 4).F: Cstf64 (n = 4), Ell2 (n = 4) and Zfp318 (n = 4)."}
{"words": ["Figure", "5B", "|", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "Ramos", "cells", "reconstituted", "with", "HH10", "-", "mu", "IgM", ",", "HH10", "-", "mu", "IgD", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "α", "-", "murine", "μHC", "-", ",", "δHC", "-", "and", "κLC", "-", "antibodies", ",", "respectively", ".", "EV", "-", "transduced", "HL", "-", "KO", "cells", ",", "expressing", "GFP", "only", ",", "were", "used", "as", "negative", "control", "(", "gray", ")", ".", "C", "|", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "HEL", "-", "binding", "in", "reconstituted", "Ramos", "cells", "after", "staining", "with", "fluorescently", "-", "labeled", "HEL", ".", "EV", "-", "transduced", "HL", "-", "KO", "cells", ",", "expressing", "GFP", "only", ",", "were", "used", "as", "negative", "control", "(", "gray", ")", ".", "D", "|", "Representative", "intracellular", "Ca2", "+", "influx", "in", "HH10", "-", "mu", "IgM", "-", "and", "HH10", "-", "mu", "IgD", "-", "expressing", "cells", "upon", "stimulation", "with", "multivalent", "HEL", "(", "complex", "cHEL", ")", ",", "monovalent", "(", "soluble", "sHEL", ")", "(", "both", "at", "a", "concentration", "of", "1", "μg", "/", "ml", ")", ",", "or", "10", "μg", "/", "ml", "α", "-", "mouse", "κLC", "antibody", ",", "respectively", ".", "E", "|", "Representative", "intracellular", "Ca2", "+", "influx", "of", "HH10", "-", "mu", "IgM", "-", "(", "top", ")", "and", "HH10", "-", "mu", "IgD", "-", "(", "bottom", ")", "expressing", "cells", "upon", "stimulation", "with", "indicated", "ratios", "of", "1", "μg", "/", "ml", "cHEL", "and", "sHEL", ",", "and", "a", "1", ":", "25", "mixture", "of", "cHEL", "with", "bovine", "serum", "albumin", "(", "BSA", ")", ",", "where", "1", "=", "1", "μg", "/", "ml", ".", "F", "|", "Schematic", "overview", "of", "reconstitution", "of", "BCR", "-", "deficient", "Ramos", "(", "HL", "-", "KO", ")", "cells", "with", "HH10", "-", "specific", "human", "IgM", "(", "HH10", "-", "hu", "IgM", ")", "and", "IgD", "(", "HH10", "-", "hu", "IgD", ")", "BCR", "isotype", ".", "G", "-", "J", "|", "using", "HH10", "-", "hu", "IgM", "-", "and", "HH10", "-", "hu", "IgD", "-", "expressing", "cells", "instead", "of", "HH10", "-", "mu", "IgM", "-", "and", "HH10", "-", "mu", "IgD", "-", "expressing", "cells", ",", "respectively", ".", "Data", "shown", "in", "G", "to", "J", "are", "representative", "of", "minimum", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B | Representative flow cytometric analysis of Ramos cells reconstituted with HH10-mu IgM, HH10-mu IgD. Cells were stained with α-murine μHC-, δHC- and κLC-antibodies, respectively. EV-transduced HL-KO cells, expressing GFP only, were used as negative control (gray).C | Representative flow cytometric analysis of HEL-binding in reconstituted Ramos cells after staining with fluorescently-labeled HEL. EV-transduced HL-KO cells, expressing GFP only, were used as negative control (gray).D | Representative intracellular Ca2+ influx in HH10-mu IgM- and HH10-mu IgD-expressing cells upon stimulation with multivalent HEL (complex cHEL), monovalent (soluble sHEL) (both at a concentration of 1 μg/ml), or 10 μg/ml α-mouse κLC antibody, respectively.E | Representative intracellular Ca2+ influx of HH10-mu IgM- (top) and HH10-mu IgD- (bottom) expressing cells upon stimulation with indicated ratios of 1 μg/ml cHEL and sHEL, and a 1 : 25 mixture of cHEL with bovine serum albumin (BSA), where 1 = 1 μg/ml.F | Schematic overview of reconstitution of BCR-deficient Ramos (HL-KO) cells with HH10-specific human IgM (HH10-hu IgM) and IgD (HH10-hu IgD) BCR isotype. G - J | using HH10-hu IgM- and HH10-hu IgD-expressing cells instead of HH10-mu IgM- and HH10-mu IgD-expressing cells, respectively. Data shown in G to J are representative of minimum three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", "|", "Quantification", "of", "surface", "IgM", "(", "top", ")", "and", "IgD", "(", "bottom", ")", "MFI", "in", "B", "cells", "from", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Single", "dots", "represent", "the", "average", "MFI", "of", "4", "independent", "measurements", "per", "mouse", "(", "n", ")", ",", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "using", "the", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ";", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "|", "Representative", "intracellular", "Ca2", "+", "influx", "measured", "in", "Thy1", ".", "2", "-", "splenocytes", ",", "derived", "from", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "upon", "stimulation", "with", "cHEL", ",", "monovalent", "sHEL", "(", "both", "at", "a", "concentration", "of", "1", "μg", "/", "ml", ")", "or", "10", "μg", "/", "ml", "α", "-", "mouse", "κLC", "antibody", ",", "respectively", ".", "Line", "diagrams", "below", "the", "dot", "plots", "show", "the", "overlayed", "MFI", "of", "the", "Ca2", "+", "influx", "kinetics", "displayed", "in", "the", "plots", "above", ".", "C", "|", "Quantification", "of", "intracellular", "Ca2", "+", "influx", "The", "median", "area", "under", "the", "curve", "of", "the", "Ca2", "+", "influx", "kinetics", "was", "calculated", ",", "single", "dots", "represent", "data", "from", "individual", "mice", ",", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "applying", "the", "Mann", "-", "Whitney", "-", "U", "test", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A | Quantification of surface IgM (top) and IgD (bottom) MFI in B cells from mice of the indicated genotypes. Single dots represent the average MFI of 4 independent measurements per mouse (n), mean ±SD. Statistical significance was calculated by using the Kruskal-Wallis test n. s. = not significant; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001; **** p ≤ 0.0001.| Representative intracellular Ca2+ influx measured in Thy1.2- splenocytes, derived from mice of the indicated genotypes, upon stimulation with cHEL, monovalent sHEL (both at a concentration of 1 μg/ml) or 10 μg/ml α-mouse κLC antibody, respectively. Line diagrams below the dot plots show the overlayed MFI of the Ca2+ influx kinetics displayed in the plots above.C | Quantification of intracellular Ca2+ influx The median area under the curve of the Ca2+ influx kinetics was calculated, single dots represent data from individual mice, mean ±SD. Statistical significance was calculated by applying the Mann-Whitney-U test n. s. = not significant, ** p ≤ 0.01."}
{"words": ["Figure", "7B", "|", "Analysis", "of", "GC", "B", "cells", "in", "splenic", "B220", "+", "B", "cells", "from", "wild", "type", "(", "WT", ",", "top", ")", "and", "IgD", "-", "/", "-", "(", "bottom", ")", "animals", "after", "4", ",", "7", "and", "10", "days", "(", "left", "to", "right", ")", "post", "immunization", ".", "Percentages", "of", "follicular", "B", "cells", "(", "Fo", ".", "B", ";", "CD38", "+", "/", "CD95", "-", ")", "and", "GC", "B", "cells", "(", "CD38", "-", "/", "CD95", "+", ")", "are", "depicted", "in", "the", "plots", ".", "GC", "B", "cells", "(", "CD38", "-", "/", "CD95", "+", ")", "were", "further", "analyzed", "for", "GL", "-", "7", "expression", ",", "compared", "to", "Fo", ".", "B", "cells", "and", "quantified", ".", "C", "|", "Quantification", "of", "Fo", ".", "B", "cells", "(", "top", ",", "percentages", ")", "and", "CD38", "-", "/", "CD95", "+", "/", "GL", "-", "7", "+", "GC", "cells", "(", "percentages", "and", "absolute", "numbers", ",", "bottom", "panels", ")", "in", "WT", "(", "black", ")", "and", "IgD", "-", "/", "-", "(", "green", ")", "animals", "after", "4", ",", "7", ",", "10", "and", "14", "days", "post", "immunization", ",", "mean", "±", "SD", "(", "numbers", "of", "animals", "indicated", "in", "the", "top", "plot", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "D", "|", "Analysis", "of", "GC", "in", "spleen", "sections", "from", "WT", "and", "IgD", "-", "/", "-", "animals", "after", "4", ",", "7", "and", "10", "days", "post", "immunization", ".", "Representative", "images", "of", "2", "x", "2", "mm", "sections", "stained", "with", "DAPI", "(", "nuclei", ")", "and", "peanut", "agglutinin", "(", "PNA", ")", "are", "shown", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Scale", "bar", "represents", "500", "μm", ".", "Dashed", "white", "or", "yellow", "lines", "mark", "distinct", "GC", "foci", "in", "the", "merged", "images", ".", "E", "|", "Representative", "800", "x", "800", "μm", "regions", "of", "areas", "marked", "by", "yellow", "dashed", "lines", "within", "the", "images", "of", "D", "are", "shown", "as", "enlarged", "single", "GCs", ".", "As", "no", "distinct", "GC", "foci", "were", "observed", "in", "IgD", "-", "/", "-", "samples", "from", "days", "4", "and", "7", ",", "an", "identical", "800", "x", "800", "μm", "region", "is", "shown", "in", "each", "case", ".", "F", "|", "Quantification", "of", "number", "of", "GCs", "per", "mm2", "area", "of", "spleen", "sections", "from", "WT", "(", "black", ")", "and", "IgD", "-", "/", "-", "(", "green", ")", "animals", "after", "4", ",", "7", "and", "10", "days", "post", "immunization", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "two", "sections", "(", "from", "3", "animals", "per", "group", "and", "time", "point", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "G", "|", "Total", "serum", "α", "-", "TNP", "IgG", ".", "Sera", "from", "PBS", "-", "or", "TNP", "-", "Ova", "-", "immunized", "WT", "(", "left", ")", "and", "IgD", "-", "/", "-", "(", "middle", ")", "mice", ",", "collected", "at", "day", "7", "following", "immunization", ",", "were", "adjusted", "to", "an", "IgG", "concentration", "of", "1", "μg", "/", "ml", "and", "applied", "in", "duplicates", "and", "dilution", "steps", "of", "1", ":", "3", "to", "TNP", "-", "coated", "plates", ",", "respectively", ",", "mean", "±", "SEM", ".", "Right", ":", "Overlay", "of", "α", "-", "TNP", "IgG", "titers", "from", "TNP", "-", "Ova", "-", "immunized", "WT", "and", "IgD", "-", "/", "-", "mice", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "-", "U", "test", "(", "see", "also", "Table", "S7", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ",", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B | Analysis of GC B cells in splenic B220+ B cells from wild type (WT, top) and IgD-/- (bottom) animals after 4, 7 and 10 days (left to right) post immunization. Percentages of follicular B cells (Fo.B; CD38+/CD95-) and GC B cells (CD38-/CD95+) are depicted in the plots. GC B cells (CD38-/CD95+) were further analyzed for GL-7 expression, compared to Fo.B cells and quantified.C | Quantification of Fo.B cells (top, percentages) and CD38-/CD95+/GL-7+ GC cells (percentages and absolute numbers, bottom panels) in WT (black) and IgD-/- (green) animals after 4, 7, 10 and 14 days post immunization, mean ±SD (numbers of animals indicated in the top plot). Statistical significance was analyzed by a two-tailed unpaired t-test.D | Analysis of GC in spleen sections from WT and IgD-/- animals after 4, 7 and 10 days post immunization. Representative images of 2 x 2 mm sections stained with DAPI (nuclei) and peanut agglutinin (PNA) are shown for the indicated time points. Scale bar represents 500 μm. Dashed white or yellow lines mark distinct GC foci in the merged images. E | Representative 800 x 800 μm regions of areas marked by yellow dashed lines within the images of D are shown as enlarged single GCs. As no distinct GC foci were observed in IgD-/- samples from days 4 and 7, an identical 800 x 800 μm region is shown in each case. F | Quantification of number of GCs per mm2 area of spleen sections from WT (black) and IgD-/- (green) animals after 4, 7 and 10 days post immunization. Data represent mean ±SD of two sections (from 3 animals per group and time point) and were analyzed by two-tailed unpaired t-test. G | Total serum α-TNP IgG. Sera from PBS- or TNP-Ova-immunized WT (left) and IgD-/- (middle) mice, collected at day 7 following immunization, were adjusted to an IgG concentration of 1 μg/ml and applied in duplicates and dilution steps of 1 : 3 to TNP-coated plates, respectively, mean ±SEM. Right: Overlay of α-TNP IgG titers from TNP-Ova-immunized WT and IgD-/- mice. Statistical significance was calculated by using the Mann-Whitney-U test (see also Table S7), n. s. = not significant, * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01."}
{"words": ["Figure", "1C", ":", "Western", "blot", "analysis", "of", "proteins", "pulled", "down", "using", "the", "peptides", "input", "fraction", "corresponds", "to", "HeLa", "cell", "total", "protein", "extract", ".", "Bound", "proteins", "were", "analyzed", "using", "anti", "-", "VAP", "-", "A", ",", "anti", "VAP", "-", "B", "and", "anti", "-", "MOSPD2", "antibodies", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "D", ":", "Western", "blot", "analysis", "of", "proteins", "pulled", "down", "using", "peptides", "comprising", "WT", "and", "mutant", "(", "D478S", "and", "D478pS", ")", "ORP1", "FFAT", "sequence", "peptides", "Bound", "proteins", "were", "analyzed", "using", "anti", "VAP", "-", "A", ",", "anti", "-", "VAP", "-", "B", "and", "anti", "MOSPD2", "antibodies", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Data", "information", ":", "Acidic", "(", "D", "or", "phosphorylated", "residues", "(", "pS", "alcoholic", "(", "S", "residues", "are", "in", "red", ",", "green", "and", "blue", ",", "respectively", ";", "the", "other", "residues", "are", "in", "black", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C: Western blot analysis of proteins pulled down using the peptides input fraction corresponds to HeLa cell total protein extract. Bound proteins were analyzed using anti-VAP-A, anti VAP-B and anti-MOSPD2 antibodies. Actin was used as a loading control.D: Western blot analysis of proteins pulled down using peptides comprising WT and mutant (D478S and D478pS) ORP1 FFAT sequence peptides Bound proteins were analyzed using anti VAP-A, anti-VAP-B and anti MOSPD2 antibodies. Actin was used as a loading control. Data information: Acidic (D or phosphorylated residues (pS alcoholic (S residues are in red, green and blue, respectively; the other residues are in black."}
{"words": ["Figure", "2B", ":", "Coomassie", "blue", "staining", "of", "the", "recombinant", "wild", "-", "type", "MSP", "domains", "of", "VAP", "-", "A", "and", "VAP", "-", "B", ",", "and", "of", "the", "KD", "/", "MD", "mutant", "of", "VAP", "-", "A", ",", "after", "SDS", "-", "PAGE", ".", "C", ":", "Recombinant", "MSP", "domains", "pulled", "down", "with", "peptides", "corresponding", "to", "the", "Phospho", "-", "FFAT", "motif", "of", "STARD3", "(", "unphosphorylated", ";", "mono", "-", "phosphorylated", "on", "S209", "or", "S213", ";", "bi", "-", "phosphorylated", "on", "S209", "and", "S213", ")", ",", "and", "with", "the", "control", "peptides", "were", "revealed", "by", "Coomassie", "blue", "staining", ".", "The", "recombinant", "proteins", "subjected", "to", "the", "assay", "are", "showed", "in", "the", "input", "fraction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B: Coomassie blue staining of the recombinant wild-type MSP domains of VAP-A and VAP-B, and of the KD/MD mutant of VAP-A, after SDS-PAGE.C: Recombinant MSP domains pulled down with peptides corresponding to the Phospho-FFAT motif of STARD3 (unphosphorylated; mono-phosphorylated on S209 or S213; bi-phosphorylated on S209 and S213), and with the control peptides were revealed by Coomassie blue staining. The recombinant proteins subjected to the assay are showed in the input fraction."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "D", ":", "Surface", "Plasmon", "Resonance", "analysis", "of", "the", "MSP", "domain", "of", "VAP", "-", "A", "binding", "onto", "immobilized", "unphosphorylated", "(", "A", ")", ",", "monophosphorylated", "pS209", "(", "B", ")", "and", "pS213", "(", "C", ")", ",", "and", "bi", "-", "phosphorylated", "pS209", "+", "pS213", "(", "D", ")", "STARD3", "FFAT", "peptides", ".", "Representative", "sensorgrams", "resulting", "from", "the", "interaction", "between", "the", "MSP", "domain", "of", "VAP", "-", "A", "injected", "at", "different", "concentrations", "and", "the", "different", "FFAT", "peptides", "are", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "(", "B", "left", ")", ",", "(", "C", ")", ",", "and", "(", "D", "left", ")", ".", "Binding", "curves", "display", "the", "SPR", "signal", "(", "RU", ")", "as", "a", "function", "of", "time", ".", "Some", "samples", "were", "measured", "twice", "(", "concentrations", "printed", "in", "bold", ")", ".", "Signal", "obtained", "for", "the", "negative", "control", "peptide", "immobilized", "on", "another", "flowcell", "is", "systematically", "subtracted", ",", "as", "well", "as", "the", "bulk", "effect", "recorded", "with", "buffer", "only", ".", "Steady", "-", "state", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "pS209", "(", "B", "right", ")", "and", "pS209", "+", "pS213", "(", "D", "right", ")", "STARD3", "FFAT", "peptide", ",", "and", "the", "MSP", "domain", "of", "VAP", "-", "A", ".", "Equilibrium", "responses", "(", "Req", ")", "extracted", "from", "the", "left", "panel", "in", "association", "phase", "were", "plotted", "as", "a", "function", "of", "the", "dimeric", "MSP", "domain", "of", "VAP", "-", "A", "concentration", ",", "and", "fitted", "with", "a", "Langmuir", "binding", "model", ".", "E", ":", "Dissociation", "constants", "between", "peptides", "corresponding", "to", "different", "kind", "of", "FFAT", "motifs", "and", "the", "MSP", "domains", "of", "VAP", "-", "A", "and", "VAP", "-", "B", ".", "The", "kinetic", "experiments", "were", "performed", "at", "25", "°", "C", "in", "Tris", "-", "HCl", "50", "mM", ",", "pH", "7", ".", "5", ",", "NaCl", "75", "mM", "buffer", "supplemented", "with", "0", ".", "005", "%", "(", "v", "/", "v", ")", "surfactant", "polysorbate", "20", "(", "P20", ",", "GE", "Healthcare", ")", ".", "Mean", "of", "n", "independent", "experiments", ":", "n", "=", "2", "for", "pS209", "and", "pS209", "+", "pS213", ";", "3", "for", "pS213", ";", "and", "4", "for", "the", "non", "-", "phosphorylated", "FFAT", ".", "Uncertainties", "are", "obtained", "from", "the", "standard", "deviation", "considering", "a", "t", "-", "distribution", "coefficient", "for", "a", "risk", "factor", "of", "32", "%", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-D: Surface Plasmon Resonance analysis of the MSP domain of VAP-A binding onto immobilized unphosphorylated (A), monophosphorylated pS209 (B) and pS213 (C), and bi-phosphorylated pS209+pS213 (D) STARD3 FFAT peptides. Representative sensorgrams resulting from the interaction between the MSP domain of VAP-A injected at different concentrations and the different FFAT peptides are shown in (A), (B left), (C), and (D left). Binding curves display the SPR signal (RU) as a function of time. Some samples were measured twice (concentrations printed in bold). Signal obtained for the negative control peptide immobilized on another flowcell is systematically subtracted, as well as the bulk effect recorded with buffer only. Steady-state analysis of the interaction between pS209 (B right) and pS209+pS213 (D right) STARD3 FFAT peptide, and the MSP domain of VAP-A. Equilibrium responses (Req) extracted from the left panel in association phase were plotted as a function of the dimeric MSP domain of VAP-A concentration, and fitted with a Langmuir binding model.E: Dissociation constants between peptides corresponding to different kind of FFAT motifs and the MSP domains of VAP-A and VAP-B. The kinetic experiments were performed at 25 °C in Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, NaCl 75 mM buffer supplemented with 0.005% (v/v) surfactant polysorbate 20 (P20, GE Healthcare). Mean of n independent experiments: n=2 for pS209 and pS209+pS213; 3 for pS213; and 4 for the non-phosphorylated FFAT. Uncertainties are obtained from the standard deviation considering a t-distribution coefficient for a risk factor of 32%."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", ":", "Binding", "assays", ".", "Immunoprecipitation", "(", "GFP", "-", "Trap", ")", "experiments", "between", "GFP", "-", "tagged", "VAP", "-", "A", "(", "WT", "and", "KD", "/", "MD", "mutant", ";", "A", ")", ",", "VAP", "-", "B", "(", "B", ")", "and", "Flag", "-", "tagged", "STARD3", "(", "WT", "and", "S209A", ",", "S209D", "and", "S209D", "/", "P210A", "mutants", ")", ".", "Please", "note", "that", "the", "mutations", "modify", "the", "FFAT", "and", "Phospho", "-", "FFAT", "scores", "of", "this", "region", "of", "STARD3", ":", "compared", "to", "WT", "STARD3", "(", "Phospho", "-", "FFAT", ":", "2", ".", "5", ";", "conventional", "FFAT", ":", "6", ".", "5", ")", ",", "the", "STARD3", "S209A", ",", "mutant", "has", "both", "low", "Phospho", "-", "FFAT", "and", "FFAT", "scores", "(", "6", ".", "5", ")", ",", "the", "S209D", "mutant", "has", "a", "high", "conventional", "FFAT", "score", "(", "2", ".", "5", ")", "but", "a", "low", "Phospho", "-", "FFAT", "score", "(", "6", ".", "5", ")", ",", "and", "the", "double", "mutant", "has", "a", "conventional", "FFAT", "score", "of", "1", ".", "5", "and", "a", "Phospho", "-", "FFAT", "score", "of", "5", ".", "5", ".", "Approximatively", "5", "µg", "of", "total", "protein", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Actin", "antibodies", ".", "Immunoprecipitated", "material", "was", "analyzed", "using", "anti", "-", "Flag", "and", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "Recruitment", "assays", ".", "GFP", "-", "VAP", "-", "A", "(", "C", ";", "green", ")", "were", "left", "untransfected", "(", "C", ")", "and", "labelled", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "magenta", ")", "antibodies", ".", "The", "subpanels", "on", "the", "right", "are", "higher", "magnification", "(", "3", ".", "5", "×", ")", "images", "of", "the", "area", "outlined", "in", "white", ".", "The", "Overlay", "panel", "shows", "merged", "green", "and", "magenta", "images", ".", "The", "Coloc", "panel", "displays", "a", "colocalization", "mask", "on", "which", "pixels", "where", "the", "green", "and", "the", "magenta", "channels", "co", "-", "localize", "are", "shown", "in", "white", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "Inset", "scale", "bars", ":", "2", "µm", ".", ":", "Recruitment", "assays", ".", "GFP", "-", "VAP", "-", "A", "D", ",", "E", ",", "G", ";", "green", ")", "and", "GFP", "-", "VAP", "-", "A", "KD", "/", "MD", "-", "expressing", "cells", "(", "F", ";", "green", ")", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "STARD3", "(", "D", ",", "F", ")", ",", "Flag", "-", "STARD3", "S209A", "(", "E", ")", ",", "and", "Flag", "-", "STARD3", "S209D", "/", "P210A", "(", "G", ")", ",", "and", "labelled", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "magenta", ")", "antibodies", ".", "The", "subpanels", "on", "the", "right", "are", "higher", "magnification", "(", "3", ".", "5", "×", ")", "images", "of", "the", "area", "outlined", "in", "white", ".", "The", "Overlay", "panel", "shows", "merged", "green", "and", "magenta", "images", ".", "The", "Coloc", "panel", "displays", "a", "colocalization", "mask", "on", "which", "pixels", "where", "the", "green", "and", "the", "magenta", "channels", "co", "-", "localize", "are", "shown", "in", "white", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "Inset", "scale", "bars", ":", "2", "µm", ".", "H", ":", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficients", "between", "VAP", "-", "A", "(", "WT", "or", "KD", "/", "MD", "mutant", ")", "and", "STARD3", "(", "WT", "or", "S209A", ",", "S209D", ",", "S209D", "/", "P210A", ",", "FA", "/", "YA", "mutants", ")", "staining", "are", "shown", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "single", "cell", "(", "number", "of", "cells", ":", "VAP", "-", "A", "-", "STARD3", ":", "22", ";", "VAP", "-", "A", "-", "STARD3", "S209A", ":", "25", ";", "VAP", "-", "A", "-", "STARD3", "S209D", ":", "27", ";", "VAP", "-", "A", "-", "STARD3", "S209D", "/", "P210A", ":", "26", ";", "VAP", "-", "A", "-", "STARD3", "FA", "/", "YA", ":", "20", ";", "VAP", "-", "A", "KD", "/", "MD", "-", "STARD3", ":", "20", ",", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Means", "and", "error", "bars", "(", "SD", ")", "are", "shown", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A,B: Binding assays. Immunoprecipitation (GFP-Trap) experiments between GFP-tagged VAP-A (WT and KD/MD mutant; A), VAP-B (B) and Flag-tagged STARD3 (WT and S209A, S209D and S209D/P210A mutants). Please note that the mutations modify the FFAT and Phospho-FFAT scores of this region of STARD3: compared to WT STARD3 (Phospho-FFAT: 2.5; conventional FFAT: 6.5), the STARD3 S209A, mutant has both low Phospho-FFAT and FFAT scores (6.5), the S209D mutant has a high conventional FFAT score (2.5) but a low Phospho-FFAT score (6.5), and the double mutant has a conventional FFAT score of 1.5 and a Phospho-FFAT score of 5.5. Approximatively 5 µg of total protein extracts were analyzed by Western blot using anti-Flag, anti-GFP and anti-Actin antibodies. Immunoprecipitated material was analyzed using anti-Flag and anti-GFP antibodies.Recruitment assays. GFP-VAP-A (C ; green) were left untransfected (C) and labelled using anti-Flag (magenta) antibodies. The subpanels on the right are higher magnification (3.5×) images of the area outlined in white. The Overlay panel shows merged green and magenta images. The Coloc panel displays a colocalization mask on which pixels where the green and the magenta channels co-localize are shown in white. Scale bars: 10 µm. Inset scale bars: 2 µm.: Recruitment assays. GFP-VAP-A D, E, G; green) and GFP-VAP-A KD/MD-expressing cells (F; green) were transfected with Flag-STARD3 (D, F), Flag-STARD3 S209A (E), and Flag-STARD3 S209D/P210A (G), and labelled using anti-Flag (magenta) antibodies. The subpanels on the right are higher magnification (3.5×) images of the area outlined in white. The Overlay panel shows merged green and magenta images. The Coloc panel displays a colocalization mask on which pixels where the green and the magenta channels co-localize are shown in white. Scale bars: 10 µm. Inset scale bars: 2 µm.H: Pearson's correlation coefficients between VAP-A (WT or KD/MD mutant) and STARD3 (WT or S209A, S209D, S209D/P210A, FA/YA mutants) staining are shown. Each dot represents a single cell (number of cells: VAP-A-STARD3: 22; VAP-A-STARD3 S209A: 25; VAP-A-STARD3 S209D: 27; VAP-A-STARD3 S209D/P210A: 26; VAP-A-STARD3 FA/YA: 20; VAP-A KD/MD-STARD3: 20, from at least three independent experiments). Means and error bars (SD) are shown. Kruskal-Wallis with Dunn's multiple comparison test (**P < 0.01; ***P < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "5B", ":", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "and", "Western", "blot", "analysis", "of", "purified", "cSTD3", "and", "pS209", "cSTD3", "proteins", ".", "Top", ":", "the", "gel", "was", "stained", "with", "Sypro", "Orange", "to", "visualize", "proteins", "and", "molecular", "weight", "markers", ".", "Bottom", ":", "two", "similar", "gels", "were", "blotted", "onto", "nitrocellulose", "and", "analysed", "for", "the", "presence", "of", "total", "and", "STARD3", "-", "pS209", "using", "specific", "antibodies", ".", "C", ":", "Aggregation", "assays", ".", "LA", "liposomes", "(", "50", "µM", "total", "lipids", ")", "were", "incubated", "for", "5", "minutes", "with", "cSTD3", "or", "pS209", "cSTD3", "(", "380", "nM", ")", ".", "Then", ",", "LB", "liposomes", "(", "50", "µM", "total", "lipids", ")", "and", "VAP", "-", "AHIS6", "or", "VAP", "-", "A", "KD", "/", "MDHIS6", "(", "700", "nM", ")", "were", "successively", "added", ".", "Left", "panels", ":", "mean", "radius", "(", "black", "dots", ")", "and", "polydispersity", "(", "shaded", "area", ")", "over", "time", ".", "Right", "panels", ":", "size", "distribution", "before", "(", "grey", "bars", ")", "and", "after", "the", "reaction", "(", "black", "bars", ")", ".", "D", ":", "DHE", "transport", "assay", ".", "DOPC", "(", "1", ".", "2", "-", "dioleoyl", "-", "sn", "-", "glycero", "-", "3", "-", "phosphocholine", ")", "liposomes", "(", "62", ".", "5", "µM", "total", "lipids", ",", "LA", ")", "containing", "3", "mol", "%", "MPB", "-", "PE", "were", "mixed", "with", "cSTD3", "or", "pS209", "cSTD3", "(", "475", "nM", ")", ".", "After", "5", "minutes", ",", "liposomes", "(", "DOPC", "/", "DOGS", "-", "NTA", "-", "Ni2", "+", "/", "DNS", "-", "PE", "/", "DHE", "liposomes", "77", ".", "5", "/", "10", "/", "2", ".", "5", "/", "10", "mol", "/", "mol", ",", "62", ".", "5", "µM", "total", "lipids", ",", "LB", ")", ",", "covered", "or", "not", "with", "1", "µM", "of", "VAPHIS6", "or", "VAP", "-", "A", "KD", "/", "MDHIS6", ",", "were", "added", ".", "FRET", "between", "DHE", "and", "DNS", "-", "PE", "in", "the", "LB", "liposomes", "diminishes", "as", "DHE", "is", "transported", "towards", "LA", "liposomes", ".", "The", "signal", "was", "converted", "into", "amount", "of", "DHE", "present", "in", "LB", "liposomes", "(", "in", "mol", "%", ")", ".", "E", ":", "Initial", "DHE", "transport", "rate", "measured", "with", "cSTD3", "or", "pS209", "cSTD3", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "VAP", "-", "A", "HIS6", "or", "VAP", "-", "A", "KD", "/", "MDHIS6", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "n", "=", "3", "for", "cSTD3", "-", "VAP", "and", "n", "=", "4", "for", "all", "other", "data", ")", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B: SDS-PAGE gel and Western blot analysis of purified cSTD3 and pS209 cSTD3 proteins. Top: the gel was stained with Sypro Orange to visualize proteins and molecular weight markers. Bottom: two similar gels were blotted onto nitrocellulose and analysed for the presence of total and STARD3-pS209 using specific antibodies.C: Aggregation assays. LA liposomes (50 µM total lipids) were incubated for 5 minutes with cSTD3 or pS209 cSTD3 (380 nM). Then, LB liposomes (50 µM total lipids) and VAP-AHIS6 or VAP-A KD/MDHIS6 (700 nM) were successively added. Left panels: mean radius (black dots) and polydispersity (shaded area) over time. Right panels: size distribution before (grey bars) and after the reaction (black bars).D: DHE transport assay. DOPC (1.2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) liposomes (62.5 µM total lipids, LA) containing 3 mol% MPB-PE were mixed with cSTD3 or pS209 cSTD3 (475 nM). After 5 minutes, liposomes (DOPC/DOGS-NTA-Ni2+/DNS-PE/DHE liposomes 77.5/10/2.5/10 mol/mol, 62.5 µM total lipids, LB), covered or not with 1 µM of VAPHIS6 or VAP-A KD/MDHIS6, were added. FRET between DHE and DNS-PE in the LB liposomes diminishes as DHE is transported towards LA liposomes. The signal was converted into amount of DHE present in LB liposomes (in mol%).E: Initial DHE transport rate measured with cSTD3 or pS209 cSTD3 in the presence or absence of VAP-A HIS6 or VAP-A KD/MDHIS6. Data are represented as mean ± S.E.M. (n = 3 for cSTD3-VAP and n=4 for all other data). Mann-Whitney test (*P < 0.05)."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "E", ":", "HeLa", "/", "Ctrl", "(", "A", ")", ",", "HeLa", "/", "STARD3", "(", "B", ")", ",", "HeLa", "/", "STARD3", "S209A", "(", "C", ")", ",", "HeLa", "/", "STARD3", "S209D", "/", "P210A", "(", "D", ")", "and", "HeLa", "/", "STARD3", "Conv", "-", "FFAT", "(", "E", ")", "cells", "were", "labeled", "with", "anti", "-", "STARD3", "antibodies", "(", "magenta", ")", ",", "anti", "-", "Lamp1", "antibodies", "(", "green", ")", "and", "with", "the", "fluorescent", "cholesterol", "probe", "filipin", "(", "Cyan", "Hot", ")", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "gray", "(", "TO", "-", "PRO", "-", "3", ")", ".", "Higher", "magnifications", "images", "(", "2x", ")", "of", "the", "area", "outlined", "in", "white", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "The", "filipin", ",", "STARD3", "and", "Lamp1", "merged", "image", "is", "labeled", "Overlay", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "Inset", "scale", "bars", ":", "5", "µm", ".", "F", ":", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficients", "between", "STARD3", "and", "Lamp1", "staining", "in", "HeLa", "/", "STARD3", "cells", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "single", "cell", "(", "34", "cells", "from", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "Mean", "and", "error", "bars", "(", "SD", ")", "are", "shown", ".", "Note", "that", "STARD3", "and", "Lamp1", "signals", "are", "highly", "correlated", ".", "G", ":", "Relative", "fluorescence", "intensity", "of", "intracellular", "filipin", "signals", "in", "endosomes", "of", "HeLa", "/", "Ctrl", ",", "HeLa", "/", "STARD3", ",", "HeLa", "/", "STARD3", "S209A", ",", "HeLa", "/", "STARD3", "S209D", "/", "P210A", "and", "HeLa", "/", "STARD3", "Conv", "-", "FFAT", "cells", ".", "Data", "are", "displayed", "as", "a", "Superplot", "(", "Lord", "et", "al", ",", "2020", ")", "showing", "the", "relative", "filipin", "fluorescence", "intensity", "in", "endosomes", "of", "individual", "cells", "(", "small", "circles", ")", "from", "6", "independent", "experiments", "(", "mean", "of", "each", "experiment", "shown", "as", "a", "large", "circle", ")", ".", "Independent", "experiments", "are", "color", "-", "coded", ".", "Means", "and", "error", "bars", "(", "SD", ")", "are", "shown", "as", "black", "bars", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "n", "=", "6", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-E: HeLa/Ctrl (A), HeLa/STARD3 (B), HeLa/STARD3 S209A (C), HeLa/STARD3 S209D/P210A (D) and HeLa/STARD3 Conv-FFAT (E) cells were labeled with anti-STARD3 antibodies (magenta), anti-Lamp1 antibodies (green) and with the fluorescent cholesterol probe filipin (Cyan Hot). Nuclei are shown in gray (TO-PRO-3). Higher magnifications images (2x) of the area outlined in white are shown on the right. The filipin, STARD3 and Lamp1 merged image is labeled Overlay. Scale bars: 10 µm. Inset scale bars: 5 µm.F: Pearson's correlation coefficients between STARD3 and Lamp1 staining in HeLa/STARD3 cells. Each dot represents a single cell (34 cells from 4 independent experiments). Mean and error bars (SD) are shown. Note that STARD3 and Lamp1 signals are highly correlated.G: Relative fluorescence intensity of intracellular filipin signals in endosomes of HeLa/Ctrl, HeLa/STARD3, HeLa/STARD3 S209A, HeLa/STARD3 S209D/P210A and HeLa/STARD3 Conv-FFAT cells. Data are displayed as a Superplot (Lord et al, 2020) showing the relative filipin fluorescence intensity in endosomes of individual cells (small circles) from 6 independent experiments (mean of each experiment shown as a large circle). Independent experiments are color-coded. Means and error bars (SD) are shown as black bars. Kruskal-Wallis with Dunn's multiple comparison test (*P < 0.05; **P < 0.01; n=6 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "7A", ":", "Coomassie", "blue", "staining", "of", "the", "recombinant", "MSP", "domain", "of", "MOSPD2", "after", "SDS", "-", "PAGE", ".", "B", ":", "Recombinant", "MSP", "domains", "pulled", "down", "with", "STARD3", "FFAT", "peptides", "(", "unphosphorylated", ",", "mono", "-", "phosphorylated", "on", "S209", "or", "S213", ",", "bi", "-", "phosphorylated", "on", "S209", "and", "S213", ",", "or", "tri", "-", "phosphorylated", "on", "S203", ",", "S209", "and", "S213", ".", "and", "control", "peptides", "were", "revealed", "by", "Coomassie", "blue", "staining", ".", "The", "recombinant", "proteins", "subjected", "to", "the", "assay", "are", "shown", "in", "the", "input", "fraction", ".", "SPR", "analysis", "of", "the", "MSP", "domain", "of", "MOSPD2", "binding", "onto", "immobilized", "unphosphorylated", "(", "C", ")", "STARD3", "FFAT", ".", "Representative", "sensorgrams", "resulting", "from", "the", "interaction", "between", "the", "MSP", "domain", "of", "MOSPD2", "injected", "at", "different", "concentrations", "and", "the", "different", "FFAT", "peptides", "are", "shown", "in", "(", "C", ")", "Binding", "curves", "display", "the", "SPR", "signal", "(", "RU", ")", "as", "a", "function", "of", "time", ".", "Concentrations", "printed", "in", "bold", "indicate", "samples", "measured", "twice", ".", "Signal", "obtained", "for", "the", "negative", "control", "peptide", "immobilized", "on", "another", "flowcell", "is", "systematically", "subtracted", ",", "as", "well", "as", "the", "bulk", "effect", "recorded", "with", "buffer", "only", ".", "SPR", "analysis", "of", "the", "MSP", "domain", "of", "MOSPD2", "binding", "onto", "immobilized", "pS209", "(", "D", ")", "STARD3", "FFAT", ".", "Representative", "sensorgrams", "resulting", "from", "the", "interaction", "between", "the", "MSP", "domain", "of", "MOSPD2", "injected", "at", "different", "concentrations", "and", "the", "different", "FFAT", "peptides", "are", "shown", "in", "(", "D", "left", ")", ".", "Binding", "curves", "display", "the", "SPR", "signal", "(", "RU", ")", "as", "a", "function", "of", "time", ".", "Concentrations", "printed", "in", "bold", "indicate", "samples", "measured", "twice", ".", "Signal", "obtained", "for", "the", "negative", "control", "peptide", "immobilized", "on", "another", "flowcell", "is", "systematically", "subtracted", ",", "as", "well", "as", "the", "bulk", "effect", "recorded", "with", "buffer", "only", ".", "(", "D", "right", ")", "steady", "-", "state", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "pS209", "STARD3", "FFAT", "peptide", "and", "the", "MSP", "domain", "of", "MOSPD2", ".", "Equilibrium", "responses", "(", "Req", ")", "extracted", "from", "the", "left", "panel", "were", "plotted", "as", "a", "function", "of", "the", "monomeric", "concentration", "of", "the", "MSP", "domain", "of", "MOSPD2", ",", "and", "fitted", "with", "a", "1", ":", "1", "binding", "model", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "at", "25", "°", "C", "in", "Tris", "-", "HCl", "50", "mM", ",", "pH", "7", ".", "5", ",", "NaCl", "75", "mM", "buffer", "supplemented", "with", "0", ".", "005", "%", "(", "v", "/", "v", ")", "surfactant", "polysorbate", "20", "(", "P20", ",", "GE", "Healthcare", ")", ".", "Mean", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "Uncertainties", "are", "obtained", "from", "the", "standard", "deviation", "considering", "a", "t", "-", "distribution", "coefficient", "for", "a", "risk", "factor", "of", "32", "%", ".", "E", ":", "Interaction", "dissociation", "constants", "between", "the", "different", "STARD3", "FFAT", "peptides", "and", "the", "MSP", "domains", "of", "MOSPD2", ".", "F", ":", "Immunoprecipitation", "(", "GFP", "-", "Trap", ")", "experiments", "between", "GFP", "-", "tagged", "MOSPD2", "and", "Flag", "-", "tagged", "STARD3", "(", "WT", "and", "S209A", ",", "S209D", "and", "S209D", "/", "P210A", "mutants", ")", ".", "Approximatively", "5", "µg", "of", "total", "protein", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Actin", "antibodies", ".", "Immunoprecipitated", "material", "was", "analyzed", "using", "anti", "-", "Flag", "and", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "G", "-", "I", ":", "GFP", "-", "MOSPD2", "-", "expressing", "cells", "(", "green", ")", "were", "left", "untransfected", "(", "G", ")", "or", "transfected", "with", "Flag", "-", "STARD3", "(", "H", ")", "and", "Flag", "-", "STARD3", "S209A", "(", "I", ")", ",", "and", "labelled", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "magenta", ")", "antibodies", ".", "The", "subpanels", "on", "the", "right", "are", "higher", "magnification", "(", "3", ".", "5", "×", ")", "images", "of", "the", "area", "outlined", "in", "white", ".", "The", "Overlay", "panel", "shows", "merged", "green", "and", "magenta", "images", ".", "The", "Coloc", "panel", "displays", "a", "colocalization", "mask", "on", "which", "pixels", "where", "the", "green", "and", "the", "magenta", "channels", "co", "-", "localize", "are", "shown", "in", "white", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "J", ":", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficients", "between", "MOSPD2", "(", "WT", "or", "RD", "/", "LD", ")", "and", "STARD3", "(", "WT", ",", "S209A", "or", "FA", "/", "YA", ")", "staining", "are", "shown", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "single", "cell", "(", "number", "of", "cells", ":", "MOSPD2", "-", "STARD3", ":", "22", ";", "MOSPD2", "-", "STARD3", "S209A", ":", "21", ";", "MOSPD2", "-", "STARD3", "FA", "/", "YA", ":", "20", ";", "MOSPD2", "RD", "/", "LD", "-", "STARD3", ":", "17", ",", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Means", "and", "error", "bars", "(", "SD", ")", "are", "shown", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A: Coomassie blue staining of the recombinant MSP domain of MOSPD2 after SDS-PAGE.B: Recombinant MSP domains pulled down with STARD3 FFAT peptides (unphosphorylated, mono-phosphorylated on S209 or S213, bi-phosphorylated on S209 and S213, or tri-phosphorylated on S203, S209 and S213.and control peptides were revealed by Coomassie blue staining. The recombinant proteins subjected to the assay are shown in the input fraction.SPR analysis of the MSP domain of MOSPD2 binding onto immobilized unphosphorylated (C) STARD3 FFAT. Representative sensorgrams resulting from the interaction between the MSP domain of MOSPD2 injected at different concentrations and the different FFAT peptides are shown in (C) Binding curves display the SPR signal (RU) as a function of time. Concentrations printed in bold indicate samples measured twice. Signal obtained for the negative control peptide immobilized on another flowcell is systematically subtracted, as well as the bulk effect recorded with buffer only.SPR analysis of the MSP domain of MOSPD2 binding onto immobilized pS209 (D) STARD3 FFAT. Representative sensorgrams resulting from the interaction between the MSP domain of MOSPD2 injected at different concentrations and the different FFAT peptides are shown in (D left). Binding curves display the SPR signal (RU) as a function of time. Concentrations printed in bold indicate samples measured twice. Signal obtained for the negative control peptide immobilized on another flowcell is systematically subtracted, as well as the bulk effect recorded with buffer only. (D right) steady-state analysis of the interaction between pS209 STARD3 FFAT peptide and the MSP domain of MOSPD2. Equilibrium responses (Req) extracted from the left panel were plotted as a function of the monomeric concentration of the MSP domain of MOSPD2, and fitted with a 1:1 binding model. The experiments were performed at 25 °C in Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, NaCl 75 mM buffer supplemented with 0.005% (v/v) surfactant polysorbate 20 (P20, GE Healthcare). Mean of 2 independent experiments. Uncertainties are obtained from the standard deviation considering a t-distribution coefficient for a risk factor of 32%.E: Interaction dissociation constants between the different STARD3 FFAT peptides and the MSP domains of MOSPD2.F: Immunoprecipitation (GFP-Trap) experiments between GFP-tagged MOSPD2 and Flag-tagged STARD3 (WT and S209A, S209D and S209D/P210A mutants). Approximatively 5 µg of total protein extracts were analyzed by Western blot using anti-Flag, anti-GFP and anti-Actin antibodies. Immunoprecipitated material was analyzed using anti-Flag and anti-GFP antibodies.G-I: GFP-MOSPD2-expressing cells (green) were left untransfected (G) or transfected with Flag-STARD3 (H) and Flag-STARD3 S209A (I), and labelled using anti-Flag (magenta) antibodies. The subpanels on the right are higher magnification (3.5×) images of the area outlined in white. The Overlay panel shows merged green and magenta images. The Coloc panel displays a colocalization mask on which pixels where the green and the magenta channels co-localize are shown in white. Scale bars: 10 µm.J: Pearson's correlation coefficients between MOSPD2 (WT or RD/LD) and STARD3 (WT, S209A or FA/YA) staining are shown. Each dot represents a single cell (number of cells: MOSPD2-STARD3: 22; MOSPD2- STARD3 S209A: 21; MOSPD2-STARD3 FA/YA: 20; MOSPD2 RD/LD-STARD3: 17, from at least three independent experiments). Means and error bars (SD) are shown. Kruskal-Wallis with Dunn's multiple comparison test (***P < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "1Schematic", "of", "single", "‐", "plane", "acquisition", "FRAP", "on", "endogenously", "tagged", "Swi6", "‐", "EGFP", ".", "Representative", "still", "images", "of", "a", "FRAP", "experiment", "are", "shown", ".", "See", "also", "Movie", "EV1", ".", "Green", "sphere", ":", "yeast", "nucleus", "containing", "Swi6", "‐", "EGFP", ";", "green", "dots", ":", "heterochromatic", "Swi6", "‐", "EGFP", ";", "red", "circle", ":", "bleached", "area", ".", "Normalized", "average", "intensities", "(", "black", "dots", ")", "of", "FRAP", "on", "Swi6", "‐", "EGFP", "heterochromatic", "loci", "(", "n", "=", "31", ")", "fitted", "to", "a", "one", "‐", "component", "model", "(", "blue", "line", ")", ".", "The", "dashed", "lines", "indicate", "the", "final", "relative", "intensity", "that", "is", "set", "to", "1", "and", "the", "fluorescence", "half", "‐", "recovery", "time", "(", "t", "1", "/", "2", ")", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "FRAP", "on", "Swi6", "‐", "EGFP", "heterochromatic", "loci", ".", "The", "box", "bounds", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "divided", "by", "the", "median", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "a", "maximum", "of", "1", ".", "5", "×", "IQR", "beyond", "the", "box", ".", "Normalized", "fluorescence", "recovery", "values", "of", "FRAP", "on", "Swi6", "‐", "EGFP", "heterochromatic", "loci", ".", "The", "box", "bounds", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "divided", "by", "the", "median", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "a", "maximum", "of", "1", ".", "5", "×", "IQR", "beyond", "the", "box", ".", "FLIP", "experiment", "showing", "a", "bleached", "(", "FRAP", ",", "red", "circle", ")", "and", "unbleached", ",", "adjacent", "locus", "(", "FLIP", ",", "blue", "circle", ")", "in", "the", "same", "nucleus", ".", "The", "graph", "displays", "average", "relative", "fluorescence", "of", "FLIP", "(", "blue", ")", ",", "FRAP", "(", "red", ")", ",", "and", "control", "loci", "(", "no", "bleach", ",", "green", ")", "in", "other", "non", "‐", "bleached", "cells", ".", "Schematic", "of", "a", "line", "‐", "scan", "FRAP", "experiment", ".", "Fluorescence", "intensities", "are", "measured", "along", "a", "line", "of", "a", "non", "‐", "bleached", "nucleus", "(", "Ctrl", "nucleus", ")", "and", "a", "bleached", "nucleus", "(", "FRAP", "nucleus", ")", "in", "Swi6", "‐", "EGFP", "clr4", "∆", "cells", ".", "Red", "box", ":", "bleached", "region", ".", "Right", ":", "raw", "data", "example", ".", "Average", "relative", "intensities", "of", "a", "line", "‐", "scan", "FRAP", "experiment", "on", "Swi6", "‐", "EGFP", "in", "heterochromatin", "(", "blue", "line", ")", ",", "euchromatin", "(", "green", "line", ")", ",", "and", "clr4", "∆", "(", "red", "line", ")", ".", "The", "curves", "have", "a", "gliding", "average", "of", "40", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Schematic of single‐plane acquisition FRAP on endogenously tagged Swi6‐EGFP. Representative still images of a FRAP experiment are shown. See also Movie EV1. Green sphere: yeast nucleus containing Swi6‐EGFP; green dots: heterochromatic Swi6‐EGFP; red circle: bleached area.Normalized average intensities (black dots) of FRAP on Swi6‐EGFP heterochromatic loci (n = 31) fitted to a one‐component model (blue line). The dashed lines indicate the final relative intensity that is set to 1 and the fluorescence half‐recovery time (t 1/2).Fluorescence t 1/2 values of FRAP on Swi6‐EGFP heterochromatic loci. The box bounds the interquartile range (IQR) divided by the median, and whiskers extend to a maximum of 1.5 × IQR beyond the box.Normalized fluorescence recovery values of FRAP on Swi6‐EGFP heterochromatic loci. The box bounds the interquartile range (IQR) divided by the median, and whiskers extend to a maximum of 1.5 × IQR beyond the box.FLIP experiment showing a bleached (FRAP, red circle) and unbleached, adjacent locus (FLIP, blue circle) in the same nucleus. The graph displays average relative fluorescence of FLIP (blue), FRAP (red), and control loci (no bleach, green) in other non‐bleached cells.Schematic of a line‐scan FRAP experiment. Fluorescence intensities are measured along a line of a non‐bleached nucleus (Ctrl nucleus) and a bleached nucleus (FRAP nucleus) in Swi6‐EGFP clr4∆ cells. Red box: bleached region. Right: raw data example.Average relative intensities of a line‐scan FRAP experiment on Swi6‐EGFP in heterochromatin (blue line), euchromatin (green line), and clr4∆ (red line). The curves have a gliding average of 40."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "BAverage", "relative", "intensities", "over", "time", "and", "corresponding", "fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "heterochromatic", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "(", "blue", ")", "or", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "(", "red", ")", ".", "C", ",", "DAverage", "relative", "intensities", "over", "time", "and", "corresponding", "fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "heterochromatic", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "wild", "‐", "type", "(", "brown", ")", "or", "cid14", "∆", "(", "dark", "green", ")", "cells", "expressing", "Swi6", "‐", "EGFP", ".", "E", ",", "FAverage", "relative", "intensities", "over", "time", "and", "corresponding", "fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "heterochromatic", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "wild", "‐", "type", "cells", "expressing", "heterochromatic", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "(", "blue", ")", "or", "NLS", "‐", "Swi6", "KR25A", "‐", "EGFP", "(", "red", ")", ",", "or", "cid14", "∆", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "(", "green", ")", "or", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "(", "yellow", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "B", ")", ",", "(", "D", ")", "and", "(", "F", ")", ",", "the", "box", "bounds", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "divided", "by", "the", "median", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "a", "maximum", "of", "1", ".", "5", "×", "IQR", "beyond", "the", "box", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, BAverage relative intensities over time and corresponding fluorescence t 1/2 values of heterochromatic Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP (blue) or NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP (red).C, DAverage relative intensities over time and corresponding fluorescence t 1/2 values of heterochromatic Swi6 obtained from FRAP experiments performed with wild‐type (brown) or cid14∆ (dark green) cells expressing Swi6‐EGFP.E, FAverage relative intensities over time and corresponding fluorescence t 1/2 values of heterochromatic Swi6 obtained from FRAP experiments performed with wild‐type cells expressing heterochromatic NLS‐Swi6‐EGFP (blue) or NLS‐Swi6 KR25A‐EGFP (red), or cid14∆ cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP (green) or NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP (yellow).Data information: In (B), (D) and (F), the box bounds the interquartile range (IQR) divided by the median, and whiskers extend to a maximum of 1.5 × IQR beyond the box."}
{"words": ["Figure", "3Schematic", "of", "a", "chromosome", "indicating", "Swi6", "‐", "EGFP", "heterochromatic", "domains", "(", "green", ")", ".", "Cnp1", "‐", "mCherry", "and", "Taz1", "‐", "mCherry", "(", "red", ")", "mark", "centromeres", "and", "telomeres", ",", "respectively", ".", "Representative", "images", "demonstrating", "Swi6", "‐", "EGFP", "co", "‐", "localization", "with", "centromeres", "(", "Cnp1", "‐", "mCherry", ")", "and", "telomeres", "(", "Taz1", "‐", "mCherry", ")", "are", "shown", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "or", "telomeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "or", "telomeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "the", "RNA", "‐", "binding", "mutant", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "or", "telomeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "Swi6", "‐", "EGFP", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "after", "release", "of", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "(", "black", "dots", ")", "or", "the", "RNA", "‐", "binding", "mutant", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "(", "red", "dots", ")", "from", "G1", "/", "S", "cell", "cycle", "arrest", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "FRAP", "experiment", "at", "the", "respective", "time", "after", "release", "from", "cell", "cycle", "arrest", ".", "Swi6", "is", "dispersed", "in", "M", "phase", "due", "to", "H3S10", "phosphorylation", ",", "and", "M", "phase", "was", "therefore", "not", "included", "in", "the", "FRAP", "analysis", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "on", "centromeric", "Swi6", ".", "A", "total", "of", "40", ",", "66", ",", "and", "104", "individual", "cells", "residing", "in", "the", "G1", ",", "S", ",", "and", "G2", "phases", "of", "the", "cell", "cycle", "were", "analyzed", ",", "respectively", ".", "Representative", "bright", "‐", "field", "images", "of", "cells", "in", "G1", ",", "S", ",", "or", "G2", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "=", "2", "μm", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "on", "centromeric", "Swi6", "of", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "and", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "that", "reside", "in", "the", "G2", "of", "the", "cell", "cycle", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "or", "telomeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "the", "RNA", "‐", "binding", "mutant", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Schematic of a chromosome indicating Swi6‐EGFP heterochromatic domains (green). Cnp1‐mCherry and Taz1‐mCherry (red) mark centromeres and telomeres, respectively. Representative images demonstrating Swi6‐EGFP co‐localization with centromeres (Cnp1‐mCherry) and telomeres (Taz1‐mCherry) are shown.Fluorescence t 1/2 values of centromeric or telomeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP.Fluorescence t 1/2 values of centromeric or telomeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing the RNA‐binding mutant NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP.Fluorescence t 1/2 values of centromeric or telomeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing Swi6‐EGFP.Fluorescence t 1/2 values of centromeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed after release of cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP (black dots) or the RNA‐binding mutant NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP (red dots) from G1/S cell cycle arrest. Each dot represents one FRAP experiment at the respective time after release from cell cycle arrest. Swi6 is dispersed in M phase due to H3S10 phosphorylation, and M phase was therefore not included in the FRAP analysis.Fluorescence t 1/2 values obtained from FRAP experiments performed on centromeric Swi6. A total of 40, 66, and 104 individual cells residing in the G1, S, and G2 phases of the cell cycle were analyzed, respectively. Representative bright‐field images of cells in G1, S, or G2 are shown. Scale bars = 2 μm.Fluorescence t 1/2 values obtained from FRAP experiments performed on centromeric Swi6 of cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP and NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP that reside in the G2 of the cell cycle.Fluorescence t 1/2 values of centromeric or telomeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing the RNA‐binding mutant NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP."}
{"words": ["Figure", "4H3K9me2", "ChIP", "‐", "seq", "enrichment", "profiles", "for", "swi6", "+", "and", "swi6", "∆", "cells", "on", "centromere", "1", ".", "Centromeric", "repeat", "elements", "(", "dg", "/", "dh", ")", "are", "indicated", ".", "Inverted", "repeats", "(", "IRC1", ")", "constitute", "heterochromatin", "boundaries", "in", "wild", "‐", "type", "cells", "(", "Cam", "et", "al", ",", "2005", ")", ".", "The", "y", "‐", "axes", "represent", "log2", "ChIP", "‐", "seq", "enrichments", "in", "200", "‐", "bp", "genomically", "tiled", "windows", "calculated", "over", "clr4Δ", "cells", ".", "Two", "independent", "biological", "replicates", "for", "each", "genotype", "were", "performed", "(", "replicates", "1", "and", "2", ")", ".", "Positions", "of", "genomic", "elements", "on", "the", "plus", "and", "minus", "strands", "are", "indicated", ".", "Blue", ",", "protein", "‐", "coding", "genes", ";", "white", ",", "repeats", ";", "green", ",", "long", "terminal", "repeat", "(", "LTR", ")", ".", "H3K9me2", "ChIP", "‐", "seq", "enrichment", "profiles", "for", "swi6", "+", "and", "swi6", "∆", "cells", "on", "the", "telomere", "of", "the", "right", "arm", "of", "chromosome", "1", ".", "Two", "independent", "biological", "replicates", "for", "each", "genotype", "were", "performed", "(", "replicates", "1", "and", "2", ")", ".", "Differential", "expression", "of", "transcripts", "coming", "from", "centromere", "1", "assessed", "by", "tiling", "microarray", "gene", "expression", "analysis", ".", "Expression", "data", "for", "swi6", "+", "and", "swi6", "∆", "cells", "were", "taken", "from", "a", "previous", "publication", "(", "Woolcock", "et", "al", ",", "2012", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4H3K9me2 ChIP‐seq enrichment profiles for swi6+ and swi6∆ cells on centromere 1. Centromeric repeat elements (dg/dh) are indicated. Inverted repeats (IRC1) constitute heterochromatin boundaries in wild‐type cells (Cam et al, 2005). The y‐axes represent log2 ChIP‐seq enrichments in 200‐bp genomically tiled windows calculated over clr4Δ cells. Two independent biological replicates for each genotype were performed (replicates 1 and 2). Positions of genomic elements on the plus and minus strands are indicated. Blue, protein‐coding genes; white, repeats; green, long terminal repeat (LTR).H3K9me2 ChIP‐seq enrichment profiles for swi6+ and swi6∆ cells on the telomere of the right arm of chromosome 1. Two independent biological replicates for each genotype were performed (replicates 1 and 2).Differential expression of transcripts coming from centromere 1 assessed by tiling microarray gene expression analysis. Expression data for swi6+ and swi6∆ cells were taken from a previous publication (Woolcock et al, 2012)."}
{"words": ["Figure", "5C", "-", "EH3K9me2", "levels", "on", "heterochromatin", "‐", "adjacent", "genes", "assessed", "by", "ChIP", "-", "PCR", "in", "swi6", "+", ",", "swi6", "∆", ",", "and", "swi6", "‐", "L315E", "(", "CSD", "dimerization", "mutant", ")", "(", "C", ")", ",", "swi6", "‐", "W104A", "(", "H3K9me2", "binding", "mutant", ")", "(", "D", ")", ",", "and", "epe1", "∆", "(", "E", ")", "cells", ".", "Enrichments", "over", "clr4", "∆", "are", "normalized", "to", "adh1", "+", ".", "Average", "fold", "enrichment", "with", "s", ".", "d", ".", "is", "shown", "for", "three", "(", "C", "and", "E", ")", "or", "four", "(", "D", ")", "independent", "experiments", ".", "P", "‐", "values", "were", "generated", "by", "the", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "(", "two", "‐", "tailed", "distribution", ",", "two", "‐", "sample", ",", "unequal", "variance", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C-EH3K9me2 levels on heterochromatin‐adjacent genes assessed by ChIP-PCR in swi6+, swi6∆, and swi6‐L315E (CSD dimerization mutant) (C), swi6‐W104A (H3K9me2 binding mutant) (D), and epe1∆ (E) cells. Enrichments over clr4∆ are normalized to adh1+. Average fold enrichment with s.d. is shown for three (C and E) or four (D) independent experiments. P‐values were generated by the Student's t‐test (two‐tailed distribution, two‐sample, unequal variance)."}
{"words": ["Figure", "6sRNA", "reads", "mapping", "to", "centromere", "1", "in", "swi6", "+", "(", "green", ")", "and", "swi6", "∆", "(", "blue", ")", "cells", ".", "The", "dashed", "red", "box", "highlights", "the", "loss", "of", "brdrRNAs", "at", "the", "IRC1R", "in", "the", "absence", "of", "Swi6", ".", "Centromeric", "repeat", "elements", "and", "the", "central", "core", "are", "indicated", ".", "Counts", "were", "normalized", "to", "the", "library", "size", ".", "Asterisks", "denote", "tRNA", "fragments", ".", "Note", "that", "tRNA", "genes", "flank", "IRC3", "(", "Fig", "EV4", ")", "but", "not", "IRC1R", ".", "H3K9me2", "levels", "on", "heterochromatin", "‐", "adjacent", "genes", "assessed", "by", "ChIP", "-", "PCR", "in", "swi6", "+", ",", "swi6", "∆", ",", "tas3", "L479E", ",", "and", "tas3", "L479E", "swi6", "∆", "cells", ".", "Enrichments", "over", "clr4", "∆", "are", "normalized", "to", "adh1", "+", ".", "Average", "fold", "enrichment", "with", "s", ".", "d", ".", "is", "shown", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "P", "‐", "values", "were", "generated", "by", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "(", "two", "‐", "tailed", "distribution", ",", "two", "‐", "sample", ",", "unequal", "variance", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6sRNA reads mapping to centromere 1 in swi6+ (green) and swi6∆ (blue) cells. The dashed red box highlights the loss of brdrRNAs at the IRC1R in the absence of Swi6. Centromeric repeat elements and the central core are indicated. Counts were normalized to the library size. Asterisks denote tRNA fragments. Note that tRNA genes flank IRC3 (Fig EV4) but not IRC1R.H3K9me2 levels on heterochromatin‐adjacent genes assessed by ChIP-PCR in swi6+, swi6∆, tas3 L479E, and tas3 L479E swi6∆ cells. Enrichments over clr4∆ are normalized to adh1+. Average fold enrichment with s.d. is shown for three independent experiments. P‐values were generated by Student's t‐test (two‐tailed distribution, two‐sample, unequal variance)."}
{"words": ["Figure", "1B", "Representative", "microphotographs", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "immunohistochemical", "staining", "in", "lungs", "from", "young", "(", "2", "months", ")", "and", "old", "(", "22", "months", ")", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", "200", "µm", ".", "C", "Representative", "microphotographs", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "immunohistochemical", "staining", "in", "lung", "parenchyma", "of", "young", "(", "20", "-", "35", "years", "old", ")", "and", "old", "(", "60", "-", "80", "years", "old", ")", "humans", "(", "n", "=", "4", "-", "7", "individuals", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "µm", ".", "D", "Double", "-", "marker", "immunofluorescence", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "intensity", "level", "in", "type", "II", "pneumocytic", "pro", "-", "SP", "-", "C", "-", "positive", "and", "CD31", "-", "positive", "endothelia", "in", "lungs", "from", "young", "and", "old", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "E", "Double", "-", "marker", "immunofluorescence", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "intensity", "level", "in", "type", "II", "pneumocytic", "TTF1", "-", "positive", "and", "CD31", "-", "positive", "endothelia", "in", "lungs", "from", "young", "and", "old", "humans", "(", "n", "=", "4", "-", "7", "individuals", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Representative microphotographs and quantitative analyses of ACE2 immunohistochemical staining in lungs from young (2 months) and old (22 months) mice (n = 3 mice per group). Scale bar 200 µm.C Representative microphotographs and quantitative analyses of ACE2 immunohistochemical staining in lung parenchyma of young (20-35 years old) and old (60-80 years old) humans (n = 4-7 individuals per group). Scale bar, 200 µm.D Double-marker immunofluorescence and quantitative analyses of ACE2 intensity level in type II pneumocytic pro-SP-C-positive and CD31-positive endothelia in lungs from young and old mice (n = 3-6 mice per group). Scale bar, 100 µm. a.u. = arbitrary units.E Double-marker immunofluorescence and quantitative analyses of ACE2 intensity level in type II pneumocytic TTF1-positive and CD31-positive endothelia in lungs from young and old humans (n = 4-7 individuals per group). Scale bar, 100 µm. a.u. = arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "2C", "Representative", "images", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "immunohistochemical", "staining", "in", "lungs", "of", "age", "-", "matched", "wild", "type", "and", "G3", "Terc", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "µm", ".", "D", "Double", "-", "marker", "immunofluorescence", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "intensity", "level", "in", "type", "II", "pneumocytic", "pro", "-", "SP", "-", "C", "-", "positive", "and", "CD31", "-", "positive", "endothelia", "in", "lungs", "of", "age", "-", "matched", "wild", "type", "and", "G3", "Terc", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C Representative images and quantitative analyses of ACE2 immunohistochemical staining in lungs of age-matched wild type and G3 Terc-/- mice (n = 3-4 mice per group). Scale bar, 200 µm.D Double-marker immunofluorescence and quantitative analyses of ACE2 intensity level in type II pneumocytic pro-SP-C-positive and CD31-positive endothelia in lungs of age-matched wild type and G3 Terc-/- mice (n = 3-4 mice per group). Scale bar, 100 µm. a.u. = arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "3A", "Immunofluorescence", "showing", "gammaH2AX", "foci", "in", "MEFs", "Trf2F", "/", "F", "at", "the", "indicated", "time", "points", "following", "4OHT", "treatment", "and", "consequent", "TRF2", "knockout", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "B", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ace2", "mRNA", "expression", "levels", "in", "MEFs", "Trf2F", "/", "F", "treated", "as", "in", "A", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "C", "Immunofluorescence", "showing", "gammaH2AX", "foci", "in", "HeLa", "shTRF2", "cells", "at", "the", "indicated", "time", "points", "following", "doxycycline", "treatment", "and", "consequent", "TRF2", "knockdown", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "D", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "ACE2", "mRNA", "expression", "levels", "in", "HeLa", "shTRF2", "cells", "treated", "as", "in", "C", "(", "n", "=", "6", "independent", "experiments", ")", ".", "E", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "53BP1", "staining", "in", "liver", "from", "Trf2F", "/", "F", "mice", "treated", "with", "tamoxifen", "(", "to", "induce", "TRF2", "loss", "and", "telomere", "uncapping", ")", "or", "vehicle", ".", "The", "animals", "as", "been", "injected", "also", "with", "PBS", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "F", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ace2", "mRNA", "expression", "levels", "in", "livers", "of", "mice", "treated", "as", "in", "E", "(", "n", "=", "5", "-", "7", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Immunofluorescence showing gammaH2AX foci in MEFs Trf2F/F at the indicated time points following 4OHT treatment and consequent TRF2 knockout. Scale bar, 25 µm. B RT-qPCR detection of Ace2 mRNA expression levels in MEFs Trf2F/F treated as in A (n = 3 independent experiments).C Immunofluorescence showing gammaH2AX foci in HeLa shTRF2 cells at the indicated time points following doxycycline treatment and consequent TRF2 knockdown. Scale bar, 25 µm. D RT-qPCR detection of ACE2 mRNA expression levels in HeLa shTRF2 cells treated as in C (n = 6 independent experiments).E Representative immunofluorescence images of 53BP1 staining in liver from Trf2F/F mice treated with tamoxifen (to induce TRF2 loss and telomere uncapping) or vehicle. The animals as been injected also with PBS. Scale bar, 10 µm. F RT-qPCR detection of Ace2 mRNA expression levels in livers of mice treated as in E (n = 5-7 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "4B", "Relative", "luciferase", "activity", "in", "HeLa", "shTRF2", "following", "ionizing", "radiation", "(", "5", "Gy", ")", "or", "TRF2", "knockdown", "upon", "doxycycline", "-", "induced", "shTRF2", "expression", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Two", "-", "way", "paired", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Relative luciferase activity in HeLa shTRF2 following ionizing radiation (5 Gy) or TRF2 knockdown upon doxycycline-induced shTRF2 expression (n=3 independent experiments). Error bars represent the s.e.m. *P<0.05. Two-way paired ANOVA."}
{"words": ["Figure", "5A", "Immunofluorescence", "showing", "gammaH2AX", "foci", "in", "Trf2F", "/", "F", "MEFs", "at", "the", "indicated", "time", "points", "following", "4OHT", "treatment", "and", "consequent", "TRF2", "knockout", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "ATMi", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "B", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ace2", "mRNA", "expression", "levels", "in", "MEFs", "Trf2F", "/", "F", "treated", "as", "in", "A", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "C", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "53BP1", "staining", "in", "liver", "from", "Trf2F", "/", "F", "mice", "treated", "with", "tamoxifen", "(", "to", "induce", "telomere", "uncapping", ")", "or", "vehicle", "and", "injected", "with", "the", "indicated", "ASOs", "or", "PBS", "as", "control", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "D", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ace2", "mRNA", "levels", "in", "livers", "of", "mice", "treated", "as", "in", "C", "(", "n", "=", "5", "-", "8", "mice", "per", "group", ")", ".", "E", "Representative", "microphotographs", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "immunohistochemical", "staining", "in", "lungs", "of", "age", "-", "matched", "wild", "type", "and", "G3", "Terc", "-", "/", "-", "mice", ",", "treated", "with", "the", "indicated", "ASOs", "(", "n", "=", "4", "-", "9", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "µm", ".", "F", "Double", "-", "marker", "immunofluorescence", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "intensity", "level", "in", "type", "II", "pneumocytic", "pro", "-", "SP", "-", "C", "-", "positive", "cells", "in", "lungs", "of", "age", "-", "matched", "wild", "type", "and", "G3", "Terc", "-", "/", "-", "mice", ",", "treated", "with", "the", "indicated", "ASOs", "(", "n", "=", "4", "-", "9", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Immunofluorescence showing gammaH2AX foci in Trf2F/F MEFs at the indicated time points following 4OHT treatment and consequent TRF2 knockout and treated with DMSO or ATMi. Scale bar, 25 µm. B RT-qPCR detection of Ace2 mRNA expression levels in MEFs Trf2F/F treated as in A (n = 3 independent experiments).C Representative immunofluorescence images of 53BP1 staining in liver from Trf2F/F mice treated with tamoxifen (to induce telomere uncapping) or vehicle and injected with the indicated ASOs or PBS as control. Scale bar, 10 µm. D RT-qPCR detection of Ace2 mRNA levels in livers of mice treated as in C (n = 5-8 mice per group).E Representative microphotographs and quantitative analyses of ACE2 immunohistochemical staining in lungs of age-matched wild type and G3 Terc-/- mice, treated with the indicated ASOs (n = 4-9 mice per group). Scale bar, 200 µm.F Double-marker immunofluorescence and quantitative analyses of ACE2 intensity level in type II pneumocytic pro-SP-C-positive cells in lungs of age-matched wild type and G3 Terc-/- mice, treated with the indicated ASOs (n = 4-9 mice per group). Scale bar, 100 µm. a.u. = arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "1A", "Atf7ip", "KO", "cells", "show", "increased", "expression", "of", "SETDB1", "-", "regulated", "ERVs", "and", "the", "provirus", "reporter", ",", "MSCV", "-", "GFP", "as", "evidenced", "by", "RT", "-", "qPCR", "analysis", ".", "RNA", "expression", "was", "normalized", "to", "Hprt", "expression", "and", "is", "shown", "relative", "to", "the", "level", "in", "WT", "cells", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", ",", "technical", "replicates", ".", "B", "Atf7ip", "KO", "mESCs", "(", "TT", "#", "2", "-", "12", ")", "show", "decreased", "H3K9me3", "at", "the", "LTR", "of", "the", "SETDB1", "-", "regulated", "reporter", "and", "the", "ERVs", ",", "as", "evidenced", "by", "Native", "ChIP", "followed", "by", "qPCR", "analysis", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", ",", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "paired", "t", "-", "test", ".", "C", "SETDB1", "cellular", "amount", "is", "mostly", "maintained", "in", "Atf7ip", "KO", "mESCs", ".", "Endogenous", "SETDB1", "-", "ATF7IP", "interaction", "is", "validated", "by", "anti", "-", "ATF7IP", "antibody", "co", "-", "IP", "experiment", "with", "anti", "-", "ATF7IP", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Atf7ip KO cells show increased expression of SETDB1-regulated ERVs and the provirus reporter, MSCV-GFP as evidenced by RT-qPCR analysis. RNA expression was normalized to Hprt expression and is shown relative to the level in WT cells. Data are mean ± SD; n=3, technical replicates.B Atf7ip KO mESCs (TT#2-12) show decreased H3K9me3 at the LTR of the SETDB1-regulated reporter and the ERVs, as evidenced by Native ChIP followed by qPCR analysis. Gapdh was used as a negative control. Data are mean ± SEM; n=5, independent experiments. *P < 0.05 and **P < 0.01 by paired t-test.C SETDB1 cellular amount is mostly maintained in Atf7ip KO mESCs. Endogenous SETDB1-ATF7IP interaction is validated by anti-ATF7IP antibody co-IP experiment with anti-ATF7IP antibody."}
{"words": ["Figure", "2A", "IF", "analysis", "shows", "preferential", "cytoplasmic", "localization", "of", "SETDB1", "in", "Atf7ip", "KO", "mESCs", ".", "Representative", "projected", "images", "are", "shown", ",", "and", "the", "quantitative", "analyses", "are", "shown", "in", "B", "-", "D", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "B", "SETDB1", "signal", "in", "the", "nucleus", "that", "was", "determined", "by", "DAPI", "staining", "was", "calculated", ".", "The", "mean", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "as", "a", "bar", "-", "graph", "with", "jittered", "points", "indicating", "the", "average", "%", "intensity", "of", "each", "experiment", ".", "Over", "100", "cells", "were", "analysed", "per", "sample", "per", "experiment", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "C", ",", "D", "SETDB1", "foci", "in", "the", "nucleus", "that", "was", "determined", "by", "DAPI", "staining", "were", "calculated", ".", "Violin", "plot", "for", "SETDB1", "'", "s", "foci", "numbers", "from", "all", "the", "cells", "analysed", "in", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "in", "c", ".", "The", "mean", "from", "the", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "as", "a", "bar", "with", "jittered", "points", "indicating", "the", "average", "number", "of", "each", "experiment", "in", "D", ".", "Over", "100", "cells", "were", "analysed", "per", "sample", "per", "experiment", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", ",", "IF", "analysis", "shows", "preferential", "cytoplasmic", "localization", "of", "SETDB1", "in", "Atf7ip", "KO", "mESCs", ".", "Representative", "projected", "images", "are", "shown", ".", "Arrows", "indicate", "the", "region", "used", "for", "line", "-", "plot", "analysis", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "10", "ng", "/", "mL", "LMB", "or", "mock", "for", "5", "h", "before", "analysis", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "F", "The", "line", "-", "plot", "analysis", "for", "E", ".", "Relative", "intensities", "of", "SETDB1", "signal", "were", "measured", "by", "Image", "J", ".", "G", "The", "quantitative", "analysis", "for", "E", "is", "shown", ".", "SETDB1", "signal", "in", "the", "nucleus", "that", "was", "determined", "by", "DAPI", "staining", "was", "calculated", ".", "The", "mean", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "as", "a", "bar", "-", "graph", "with", "jittered", "points", "indicating", "the", "average", "%", "intensity", "of", "each", "experiment", ".", "Over", "100", "cells", "were", "analysed", "per", "sample", "per", "experiment", ".", "NS", ":", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "versus", "\"", "Mock", ",", "WT", "\"", "group", "by", "Dunnett", "'", "s", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A IF analysis shows preferential cytoplasmic localization of SETDB1 in Atf7ip KO mESCs. Representative projected images are shown, and the quantitative analyses are shown in B-D. Scale bar: 10 µm. B SETDB1 signal in the nucleus that was determined by DAPI staining was calculated. The mean from three independent experiments is shown as a bar-graph with jittered points indicating the average % intensity of each experiment. Over 100 cells were analysed per sample per experiment. ***P < 0.001 by unpaired Student's t-test. C, D SETDB1 foci in the nucleus that was determined by DAPI staining were calculated. Violin plot for SETDB1's foci numbers from all the cells analysed in three independent experiments is shown in c. The mean from the three independent experiments is shown as a bar with jittered points indicating the average number of each experiment in D. Over 100 cells were analysed per sample per experiment. *P < 0.05 by unpaired Student's t-test. E, IF analysis shows preferential cytoplasmic localization of SETDB1 in Atf7ip KO mESCs. Representative projected images are shown. Arrows indicate the region used for line-plot analysis. Cells were treated with 10 ng/mL LMB or mock for 5 h before analysis. Scale bar: 10 µm. F The line-plot analysis for E. Relative intensities of SETDB1 signal were measured by Image J. G The quantitative analysis for E is shown. SETDB1 signal in the nucleus that was determined by DAPI staining was calculated. The mean from three independent experiments is shown as a bar-graph with jittered points indicating the average % intensity of each experiment. Over 100 cells were analysed per sample per experiment. NS: P > 0.05, **P < 0.01 versus \"Mock, WT\" group by Dunnett's test. "}
{"words": ["Figure", "3A", "ATF7IP", "KO", "HEK293T", "cells", "shows", "endogenous", "SETDB1", "cytoplasmic", "localization", "phenotype", ".", "Endogenous", "SETDB1", "in", "HEK293T", "cells", "shows", "cytoplasm", "+", "nuclear", "localization", "profile", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "B", "Over", "-", "production", "of", "exogenous", "mouse", "SETDB1", "induces", "endogenous", "SETDB1", "nuclear", "localization", "in", "both", "WT", "and", "ATF7IP", "KO", "HEK293T", "cells", ".", "The", "representative", "data", "of", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "C", "LMB", "treatment", "enhances", "SETDB1", "nuclear", "accumulation", "in", "WT", "HEK293T", "cells", ",", "but", "no", "significant", "impact", "for", "ATF7IP", "KO", "HEK293T", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "10ng", "/", "ml", "of", "LMB", "for", "5", "h", "and", "then", "analysed", "with", "immunofluorescent", "staining", ".", "The", "representative", "data", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "D", "SETDB1", "signal", "in", "the", "nucleus", "shown", "in", "C", "was", "calculated", ".", "The", "mean", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "as", "a", "bar", "-", "graph", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ".", "Over", "50", "cells", "were", "analysed", "per", "sample", "per", "experiment", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", "test", ")", ".", "E", "5", "h", "of", "proteasome", "inhibitor", "bortezomib", "treatment", "do", "not", "have", "much", "impact", "on", "SETDB1", "relative", "nuclear", "accumulation", "in", "ATF7IP", "KO", "HEK293T", "cells", ".", "The", "representative", "data", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "F", "SETDB1", "signal", "in", "the", "nucleus", "shown", "in", "E", "was", "calculated", ".", "The", "mean", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "as", "a", "bar", "-", "graph", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ".", "Over", "50", "cells", "were", "analysed", "per", "sample", "per", "experiment", ".", "Statistics", "comparison", "was", "only", "shown", "between", "without", "and", "with", "drug", "treatment", "in", "WT", "and", "ATF7IP", "KO", "cells", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Dunnett", "'", "s", "method", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A ATF7IP KO HEK293T cells shows endogenous SETDB1 cytoplasmic localization phenotype. Endogenous SETDB1 in HEK293T cells shows cytoplasm+nuclear localization profile. Scale bar: 10 µm.B Over-production of exogenous mouse SETDB1 induces endogenous SETDB1 nuclear localization in both WT and ATF7IP KO HEK293T cells. The representative data of two independent experiments is shown. Scale bar: 10 µm.C LMB treatment enhances SETDB1 nuclear accumulation in WT HEK293T cells, but no significant impact for ATF7IP KO HEK293T cells. Cells were treated with 10ng/ml of LMB for 5 h and then analysed with immunofluorescent staining. The representative data of three independent experiments is shown. Scale bar: 10 µm. D SETDB1 signal in the nucleus shown in C was calculated. The mean from three independent experiments is shown as a bar-graph ± SEM; n=3. Over 50 cells were analysed per sample per experiment. **P < 0.01 by Student's t-test (two-sided test). E 5 h of proteasome inhibitor bortezomib treatment do not have much impact on SETDB1 relative nuclear accumulation in ATF7IP KO HEK293T cells. The representative data of three independent experiments is shown. Scale bar: 10 µm. F SETDB1 signal in the nucleus shown in E was calculated. The mean from three independent experiments is shown as a bar-graph ± SEM; n=3. Over 50 cells were analysed per sample per experiment. Statistics comparison was only shown between without and with drug treatment in WT and ATF7IP KO cells. *P < 0.05 and **P < 0.01 by Dunnett's method. "}
{"words": ["Figure", "4A", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "V5", "-", "SETDB1", "and", "either", "empty", "or", "3xF", "-", "ATF7IP", "expressing", "vector", ".", "Over", "50", "transfected", "cells", "analysed", "per", "sample", "were", "analyzed", ".", "The", "representative", "data", "of", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "B", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "V5", "-", "SETDB1", "d1", "mutant", "and", "either", "empty", "or", "3xF", "-", "ATF7IP", "expressing", "vector", ".", "Over", "50", "transfected", "cells", "per", "sample", "were", "analysed", ".", "The", "representative", "data", "of", "two", "independent", "experiments", "was", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "The", "yellow", "arrowheads", "indicate", "the", "cells", "that", "show", "nuclear", "(", "and", "cytoplasmic", ")", "-", "localization", "of", "introduced", "exogenous", "mSETDB1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A HEK293T cells were transfected with V5-SETDB1 and either empty or 3xF-ATF7IP expressing vector. Over 50 transfected cells analysed per sample were analyzed. The representative data of two independent experiments is shown. Scale bar: 10 µm.B HEK293T cells were transfected with V5-SETDB1 d1 mutant and either empty or 3xF-ATF7IP expressing vector. Over 50 transfected cells per sample were analysed. The representative data of two independent experiments was shown. Scale bar: 10 µm. The yellow arrowheads indicate the cells that show nuclear (and cytoplasmic)-localization of introduced exogenous mSETDB1."}
{"words": ["Figure", "5A", "Co", "-", "transfection", "with", "ATF7IP", "augments", "the", "K885", "ubiquitination", "of", "SETDB1", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "After", "the", "transfection", ",", "V5", "-", "SETDB1", "was", "immune", "-", "purified", "with", "anti", "-", "V5", "antibody", "and", "used", "for", "WB", "analysis", ".", "B", "ATF7IP", "regulates", "the", "ubiquitination", "of", "SETDB1", "in", "mESCs", ".", "Endogenous", "SETDB1", "was", "immune", "-", "purified", "from", "WT", "or", "Atf7ip", "KO", "mESCs", "cells", "and", "used", "for", "WB", "analysis", ".", "C", "LMB", "treatment", "increased", "the", "relative", "intensity", "of", "the", "upper", "ubiquitinated", "upper", "band", "of", "SETDB1", "in", "Atf7ip", "KO", "mESCs", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "10", "ng", "/", "mL", "LMB", "or", "mock", "for", "5", "h", "before", "analysis", ".", "D", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "3xF", "-", "or", "3xF", "-", "NLS", "-", "SETDB1", ".", "Over", "50", "transfected", "cells", "per", "sample", "were", "analysed", ".", "The", "representative", "data", "of", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "E", "Nuclear", "localization", "itself", "promotes", "the", "ubiquitination", "of", "SETDB1", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "3xFLAG", "-", "or", "3xFLAG", "-", "NLS", "-", "SETDB1", ".", "After", "FLAG", "-", "IP", ",", "the", "purified", "SETDB1s", "were", "analyzed", "by", "WB", ".", "F", ",", "G", "IF", "analysis", "was", "performed", "with", "Atf7ip", "KO", "mESCs", "stably", "expressing", "3xF", "-", "or", "3xF", "-", "NLS", "-", "SETDB1", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "in", "F", ",", "and", "the", "quantitative", "analysis", "is", "shown", "in", "G", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Addition", "of", "NLS", "increases", "nuclear", "localization", "of", "SETDB1", "in", "Atf7ip", "KO", "mESCs", ".", "The", "mean", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "as", "a", "bar", "-", "graph", "with", "jittered", "points", "indicating", "the", "average", "%", "intensity", "of", "each", "experiment", ".", "Over", "50", "cells", "were", "analysed", "per", "sample", "per", "experiment", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "H", "Nuclear", "localization", "promotes", "the", "ubiquitination", "of", "SETDB1", "in", "Atf7ip", "KO", "mESCs", ".", "Atf7ip", "KO", "mESCs", "expressing", "3xF", "-", "or", "3xF", "-", "NLS", "-", "SETDB", "were", "used", "for", "FLAG", "-", "IP", ",", "and", "the", "purified", "SETDB1s", "were", "analyzed", "by", "WB", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Co-transfection with ATF7IP augments the K885 ubiquitination of SETDB1. HEK293T cells were transfected After the transfection, V5-SETDB1 was immune-purified with anti-V5 antibody and used for WB analysis.B ATF7IP regulates the ubiquitination of SETDB1 in mESCs. Endogenous SETDB1 was immune-purified from WT or Atf7ip KO mESCs cells and used for WB analysis.C LMB treatment increased the relative intensity of the upper ubiquitinated upper band of SETDB1 in Atf7ip KO mESCs. Cells were treated with 10 ng/mL LMB or mock for 5 h before analysis.D HEK293T cells were transfected with either 3xF- or 3xF-NLS-SETDB1. Over 50 transfected cells per sample were analysed. The representative data of two independent experiments is shown. Scale bar: 10 µm.E Nuclear localization itself promotes the ubiquitination of SETDB1. HEK293T cells were transfected with 3xFLAG- or 3xFLAG-NLS-SETDB1. After FLAG-IP, the purified SETDB1s were analyzed by WB.F, G IF analysis was performed with Atf7ip KO mESCs stably expressing 3xF- or 3xF-NLS-SETDB1. Representative images are shown in F, and the quantitative analysis is shown in G. Scale bar: 10 µm. Addition of NLS increases nuclear localization of SETDB1 in Atf7ip KO mESCs. The mean from three independent experiments is shown as a bar-graph with jittered points indicating the average % intensity of each experiment. Over 50 cells were analysed per sample per experiment. ***P < 0.001 by unpaired Student's t-test.H Nuclear localization promotes the ubiquitination of SETDB1 in Atf7ip KO mESCs. Atf7ip KO mESCs expressing 3xF- or 3xF-NLS-SETDB were used for FLAG-IP, and the purified SETDB1s were analyzed by WB."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "Double", "fluorescence", "in", "situ", "hybridization", "using", "Nrg3", "(", "green", ")", "and", "Gad1", "(", "red", ")", "specific", "probes", ";", "DAPI", "was", "used", "as", "a", "counter", "stain", ".", "Nrg3", "is", "present", "in", "Gad1", "-", "positive", "(", "filled", "arrowheads", ")", "and", "-", "negative", "neurons", ".", "(", "A", "'", ")", "and", "(", "A", "'", "'", ")", "show", "higher", "magnifications", "of", "boxed", "areas", "indicated", "in", "(", "A", ")", ".", "Nrg3", "-", "negative", "neurons", "are", "indicated", "by", "open", "arrowheads", ";", "note", "that", "many", "but", "not", "all", "neurons", "express", "Nrg3", ".", "B", ")", "Comparison", "of", "mRNA", "levels", "of", "Nrg3", ",", "Nrg1β", "type", "III", "(", "Nrg1β", "−", "III", ")", ",", "Nrg2β", ",", "Nrg1β", "type", "II", "(", "Nrg1β", "−", "II", ")", ",", "Nrg2α", "and", "Nrg1β", "type", "I", "(", "Nrg1β", "−", "I", ")", "in", "the", "cortex", "(", "Cx", ")", ",", "hippocampus", "(", "HC", ")", "and", "striatum", "(", "Str", ")", "of", "juvenile", " ", "mice", "(", "P30", "-", "60", ")", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "of", "4", "biological", "replicates", ".", "2", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "performed", "to", "assess", "statistical", "significance", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "=", "not", "significant", ")", ".", "D", ")", "Detection", "of", "Nrg3", "by", "western", "blot", "analysis", "in", "fractions", "from", "brain", "lysates", ":", "S1", ",", "crude", "lysate", ";", "S2", ",", "cytosol", "and", "light", "membranes", ";", "S2", "'", ",", "cytosol", ";", "LM", ",", "light", "membranes", ";", "P2", "'", ",", "crude", "synaptosomes", ";", "S3", "'", ",", "synaptosomal", "cytoplasm", ";", "SV", ",", "synaptic", "vesicles", ";", "P3", ",", "synaptosomal", "membranes", ";", "SPM", ",", "synaptic", "plasma", "membranes", ".", "E", ",", "F", ")", "Immunohistochemical", "analysis", "in", "the", "hippocampus", "of", "wildtype", "(", "E", ",", "E", "'", ",", "E", "'", "'", ")", "and", "ErbB4", "mutant", "mice", "(", "F", ")", "at", "2", "month", "of", "age", "using", "Nrg3", "-", ",", "ErbB4", "-", "and", "parvalbumin", "(", "Parv", ")", "-", "specific", "antibodies", ".", "The", "white", "box", "in", "(", "E", ")", "is", "displayed", "magnified", "in", "(", "E", "'", ",", "E", "'", "'", ")", ".", "In", "control", "mice", ",", "Nrg3", "is", "enriched", "on", "dendrites", "of", "ErbB4", "+", "PV", " ", "interneurons", ",", "compared", "to", "the", "surrounding", "neuropil", "(", "E", "'", ",", "E", "'", "'", ")", ".", "In", "ErbB4", "mutants", ",", "the", "Nrg3", "enrichment", "on", "PV", " ", "interneurons", "is", "not", "apparent", "(", "F", ")", ".", "G", ")", "Nrg3", ",", "ErbB4", "and", "GluA4", "were", "identified", "by", "immunohistology", "and", "co", "-", "localized", "in", "synaptic", "puncta", "on", "dendrites", "of", "interneurons", "in", "the", "stratum", "radiatum", "of", "the", "hippocampal", "CA1", ".", "Note", "that", "(", "G", ")", "displays", "Nrg3", "/", "ErbB4", ",", "(", "G", "'", ")", "Nrg3", "/", "GluA4", ",", "and", "(", "G", "'", "'", ")", "ErbB4", "/", "GluA4", "signals", "of", "the", "same", "triple", "-", "stained", "image", ";", "false", "colors", "were", "assigned", "for", "better", "signal", "visualization", ".", "H", ")", "Quantification", "of", "GluA4", "puncta", "present", "on", "ErbB4", "+", "dendrites", "in", "the", "CA1", "stratum", "radiatum", "of", "adult", "wildtype", "(", "wt", ")", "and", "Nrg3", "-", "/", "-", "mice", "(", "age", "P90", "-", "120", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "box", "plots", "with", "Tukey", "'", "s", "whiskers", "and", "outliers", ";", "means", "are", "indicated", "by", "a", "Plus", "symbols", ".", "n", "=", "65", "(", "wt", ")", "and", "n", "=", "62", "(", "Nrg3", "-", "/", "-", ")", "from", "5", "animals", "each", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", "with", "Welch", "'", "s", "correction", "was", "performed", "to", "assess", "statistical", "significance", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) Double fluorescence in situ hybridization using Nrg3 (green) and Gad1 (red) specific probes; DAPI was used as a counter stain. Nrg3 is present in Gad1-positive (filled arrowheads) and -negative neurons. (A') and (A'') show higher magnifications of boxed areas indicated in (A). Nrg3-negative neurons are indicated by open arrowheads; note that many but not all neurons express Nrg3.B) Comparison of mRNA levels of Nrg3, Nrg1β type III (Nrg1β−III), Nrg2β, Nrg1β type II (Nrg1β−II), Nrg2α and Nrg1β type I (Nrg1β−I) in the cortex (Cx), hippocampus (HC) and striatum (Str) of juvenile mice (P30-60) by quantitative RT-PCR. Data represent means ± SD of 4 biological replicates. 2-way-ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons test was performed to assess statistical significance (****P<0.0001, ***P<0.001, ns=not significant).D) Detection of Nrg3 by western blot analysis in fractions from brain lysates: S1, crude lysate; S2, cytosol and light membranes; S2', cytosol; LM, light membranes; P2', crude synaptosomes; S3', synaptosomal cytoplasm; SV, synaptic vesicles; P3, synaptosomal membranes; SPM, synaptic plasma membranes.E, F) Immunohistochemical analysis in the hippocampus of wildtype (E,E',E'') and ErbB4 mutant mice (F) at 2 month of age using Nrg3-, ErbB4- and parvalbumin (Parv)-specific antibodies. The white box in (E) is displayed magnified in (E',E''). In control mice, Nrg3 is enriched on dendrites of ErbB4+ PV interneurons, compared to the surrounding neuropil (E',E''). In ErbB4 mutants, the Nrg3 enrichment on PV interneurons is not apparent (F).G) Nrg3, ErbB4 and GluA4 were identified by immunohistology and co-localized in synaptic puncta on dendrites of interneurons in the stratum radiatum of the hippocampal CA1. Note that (G) displays Nrg3/ErbB4, (G') Nrg3/GluA4, and (G'') ErbB4/GluA4 signals of the same triple-stained image; false colors were assigned for better signal visualization.H) Quantification of GluA4 puncta present on ErbB4+ dendrites in the CA1 stratum radiatum of adult wildtype (wt) and Nrg3-/- mice (age P90-120). Data are presented as box plots with Tukey's whiskers and outliers; means are indicated by a Plus symbols. n=65 (wt) and n=62 (Nrg3-/-) from 5 animals each. Unpaired t-test (2-tailed) with Welch's correction was performed to assess statistical significance (****P<0.0001)."}
{"words": ["Figure", "4", " ", "A", ")", " ", "His6", "-", "tagged", "EGF", "domains", "of", "Nrg1β", "and", "Nrg3", "were", "added", "to", "neuronal", "cultures", "at", "the", "indicated", "concentrations", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "ErbB4", " ", "immunoprecipitates", "using", "antibodies", "against", "phospho", "-", "tyrosine", "(", "pY", ")", "and", "ErbB4", ",", "and", "of", "whole", "lysates", "using", "antibodies", "against", "pErk1", "/", "2", "and", "pAkt", " ", " ", "A", ")", " ", "His6", "-", "tagged", "EGF", "domains", "of", "Nrg1β", "and", "Nrg3", "were", "added", "to", "neuronal", "cultures", "at", "the", "indicated", "concentrations", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "ErbB4", " ", "immunoprecipitates", "using", "antibodies", "against", "phospho", "-", "tyrosine", "(", "pY", ")", "and", "ErbB4", ",", "and", "of", "whole", "lysates", "using", "antibodies", "against", "pErk1", "/", "2", "and", "pAkt", " ", " ", "C", ",", "D", ")", " ", "Neurons", "from", "Nrg3", "-", "/", "-", ";", "ErbB4", "-", "/", "-", ";", "vGAT", "-", "Cre", " ", "mice", "were", "transduced", "with", "a", "lentivirus", "expressing", "either", "(", "C", ")", "ErbB4wt", "or", "(", "D", ")", "ErbB4kd", "(", "kinase", "dead", "ErbB4", ")", "in", "a", "Cre", "-", "dependent", "manner", ",", "and", "with", "a", "second", "virus", "at", "a", "low", "titer", "expressing", "Nrg3", "/", "SypCFP", ".", "Immunocytochemical", "analysis", "of", "ErbB4", "and", "SypCFP", ";", "(", "C", ",", "C", "'", ")", "and", "(", "D", ",", "D", "'", ")", "each", "show", "the", "same", "image", ",", "(", "C", "'", ",", "D", "'", ")", "show", "the", "SypCFP", "signal", " ", " ", "E", "-", "G", ")", "Quantification", "of", "Synapse", "preference", "towards", "ErbB4", "+", "neurons", "(", "E", ")", ",", "ErbB4", "enrichment", "(", "F", ")", "and", "SypCFP", "enrichment", "(", "G", ")", "in", "synapses", "on", "neurons", "expressing", "wildtype", "ErbB4", "(", "wt", ")", "or", "ErbB4kd", "(", "kd", ")", " ", " ", "H", ")", " ", "Nrg3", "-", "/", "-", "neuron", "cultures", "were", "transfected", "with", "a", "plasmid", "that", "strongly", "overexpresses", "Nrg3", "and", "GFP", "and", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "ErbB4", ",", "GFP", "and", "GluA", ";", "(", "H", ")", "shows", "the", "triple", "stained", "image", ",", "while", "(", "H", "'", ")", "and", "(", "H", "'", "'", ")", "only", "show", "ErbB4", "and", "GluA", "signals", ",", "respectively", " ", " ", "I", ")", "Co", "-", "cultures", "of", "Nrg3", "-", "/", "-", "neurons", "with", "HEK293", "cells", "expressing", "Nrg3", ".", "Cultures", "were", "stained", "with", "antibodies", "against", "Nrg3", ",", "ErbB4", "and", "GluA", ".", "Note", "that", "Nrg3", ",", "ErbB4", "and", "GluA", "are", "enriched", "at", "the", "contact", "sites", "between", "Nrg3", "-", "expressing", "HEK293", "cells", "and", "ErbB4", "+", "neurons", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A) His6-tagged EGF domains of Nrg1β and Nrg3 were added to neuronal cultures at the indicated concentrations. Western blot analyses of ErbB4 immunoprecipitates using antibodies against phospho-tyrosine (pY) and ErbB4, and of whole lysates using antibodies against pErk1/2 and pAkt  A) His6-tagged EGF domains of Nrg1β and Nrg3 were added to neuronal cultures at the indicated concentrations. Western blot analyses of ErbB4 immunoprecipitates using antibodies against phospho-tyrosine (pY) and ErbB4, and of whole lysates using antibodies against pErk1/2 and pAkt  C, D) Neurons from Nrg3-/-;ErbB4-/-;vGAT-Cre mice were transduced with a lentivirus expressing either (C) ErbB4wt or (D) ErbB4kd (kinase dead ErbB4) in a Cre-dependent manner, and with a second virus at a low titer expressing Nrg3/SypCFP. Immunocytochemical analysis of ErbB4 and SypCFP; (C,C') and (D,D') each show the same image, (C',D') show the SypCFP signal  E-G) Quantification of Synapse preference towards ErbB4+ neurons (E), ErbB4 enrichment (F) and SypCFP enrichment (G) in synapses on neurons expressing wildtype ErbB4 (wt) or ErbB4kd (kd)  H) Nrg3-/- neuron cultures were transfected with a plasmid that strongly overexpresses Nrg3 and GFP and immunostained with antibodies against ErbB4, GFP and GluA; (H) shows the triple stained image, while (H') and (H'') only show ErbB4 and GluA signals, respectively  I) Co-cultures of Nrg3-/- neurons with HEK293 cells expressing Nrg3. Cultures were stained with antibodies against Nrg3, ErbB4 and GluA. Note that Nrg3, ErbB4 and GluA are enriched at the contact sites between Nrg3-expressing HEK293 cells and ErbB4+ neurons "}
{"words": ["Figure", "5", "C", ")", "Example", "traces", "of", "evoked", "excitatory", "postsynaptic", "currents", "(", "eEPSCs", ")", "averaged", "over", "50", "sweeps", ".", "D", ",", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "peak", "amplitude", "of", "the", "first", "eEPSC", "(", "D", ")", "and", "of", "the", "paired", "pulse", "ratio", "(", "E", ")", "F", "-", "I", ")", "sEPSC", "recordings", "from", "CA1", "pyramidal", "(", "F", ",", "H", ")", "and", "PV", "neurons", "(", "G", ",", "I", ")", "in", "acute", "slices", ".", "sEPSC", "frequencies", "(", "F", ",", "G", ")", "and", "amplitudes", "(", "H", ",", "I", ")", "are"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 C) Example traces of evoked excitatory postsynaptic currents (eEPSCs) averaged over 50 sweeps. D, E) Quantification of the peak amplitude of the first eEPSC (D) and of the paired pulse ratio (E)  F-I) sEPSC recordings from CA1 pyramidal (F,H) and PV neurons (G, I) in acute slices. sEPSC frequencies (F,G) and amplitudes (H,I) are shown"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", "-", "C", ")", "Fluorescent", "dye", "release", "from", "the", "mitochondria", "-", "mimic", "liposomes", "by", "the", "indicated", "wild", "-", "type", "(", "wt", ")", "or", "mutant", "Bax", "in", "the", "presence", "(", "B", ")", "or", "absence", "(", "C", ")", "of", "tBid", "or", "by", "tBid", "alone", "(", "C", ")", "was", "measured", "by", "quenching", "the", "fluorescence", "of", "the", "released", "dyes", "by", "the", "dye", "-", "specific", "antibodies", "outside", "the", "liposomes", "during", "a", "time", "course", ".", "The", "fraction", "of", "dye", "release", "was", "normalized", "to", "that", "by", "detergent", ".", "The", "data", "shown", "were", "obtained", "from", "n", "=", "3", "independent", "replicates", "using", "the", "same", "preparations", "of", "the", "proteins", "and", "liposomes", ".", "(", "D", ")", "Digitonin", "permeabilized", "BMK", "Bax", "-", "/", "-", "/", "Bak", "-", "/", "-", "cells", "expressing", "SMAC", "-", "mCherry", "in", "the", "mitochondria", "intermembrane", "space", "(", "50", "μL", ",", "500", ",", "000", "total", "cells", ")", "were", "incubated", "with", "25", "nM", "of", "Bax", "and", "2", "nM", "cBid", "for", "the", "indicated", "time", "at", "37", "°", "C", "in", "a", "96", "-", "well", "plate", ".", "The", "samples", "were", "centrifuged", "for", "10", "min", "and", "separated", "into", "supernatant", "and", "pellet", "fractions", ".", "SMAC", "-", "mCherry", "release", "was", "calculated", "as", "the", "fraction", "of", "total", "(", "supernatant", "+", "pellet", ")", "mCherry", "fluorescence", "coming", "from", "the", "supernatant", "fraction", ".", "The", "data", "was", "normalized", "to", "the", "percent", "SMAC", "-", "mCherry", "release", "of", "wt", "Bax", "and", "cBid", "at", "60", "min", ".", "Each", "symbol", "represents", "the", "normalized", "SMAC", "-", "mCherry", "release", "for", "one", "single", "replicate", "(", "n", "=", "3", "or", "more", "independent", "replicates", ")", ".", "Where", "applicable", "the", "data", "was", "fit", "with", "the", "[", "Agonist", "]", "vs", ".", "response", "-", "Variable", "slope", "equation", "in", "Graphpad", "Prism", "8", ".", "0", ".", "1", ".", "The", "dotted", "lines", "represent", "the", "95", "%", "confidence", "interval", "of", "the", "fit", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B-C) Fluorescent dye release from the mitochondria-mimic liposomes by the indicated wild-type (wt) or mutant Bax in the presence (B) or absence (C) of tBid or by tBid alone (C) was measured by quenching the fluorescence of the released dyes by the dye-specific antibodies outside the liposomes during a time course. The fraction of dye release was normalized to that by detergent. The data shown were obtained from n = 3 independent replicates using the same preparations of the proteins and liposomes.(D) Digitonin permeabilized BMK Bax-/-/Bak-/- cells expressing SMAC-mCherry in the mitochondria intermembrane space (50 μL, 500,000 total cells) were incubated with 25 nM of Bax and 2 nM cBid for the indicated time at 37°C in a 96-well plate. The samples were centrifuged for 10 min and separated into supernatant and pellet fractions. SMAC-mCherry release was calculated as the fraction of total (supernatant + pellet) mCherry fluorescence coming from the supernatant fraction. The data was normalized to the percent SMAC-mCherry release of wt Bax and cBid at 60 min. Each symbol represents the normalized SMAC-mCherry release for one single replicate (n = 3 or more independent replicates). Where applicable the data was fit with the [Agonist] vs. response - Variable slope equation in Graphpad Prism 8.0.1. The dotted lines represent the 95% confidence interval of the fit."}
{"words": ["Figure", "2Fig", ".", "2", "Identification", "of", "protein", "complexes", "and", "communities", "in", "the", "cellular", "extracts", ".", "(", "A", ")", "Elution", "of", "selected", "protein", "complexes", "as", "a", "function", "of", "their", "retention", "times", "(", "see", "Appendix", "Fig", ".", "S4", "for", "their", "corresponding", "subunit", "elutions", ")", ".", "(", "B", ")", "Scatter", "plot", "indicating", "discrepancies", "in", "the", "expected", "and", "measured", "molecular", "weights", "of", "102", "protein", "complexes", "that", "elute", "as", "a", "single", "peak", ";", "50", "%", "of", "protein", "complexes", "are", "observed", "to", "have", "higher", "molecular", "weights", "than", "structurally", "characterized", ",", "indicating", "that", "they", "are", "organized", "in", "higher", "-", "order", "assemblies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Fig. 2 Identification of protein complexes and communities in the cellular extracts. (A) Elution of selected protein complexes as a function of their retention times (see Appendix Fig. S4 for their corresponding subunit elutions).(B) Scatter plot indicating discrepancies in the expected and measured molecular weights of 102 protein complexes that elute as a single peak; 50% of protein complexes are observed to have higher molecular weights than structurally characterized, indicating that they are organized in higher-order assemblies."}
{"words": ["Figure", "4Fig", ".", "4", "Higher", "-", "order", "assemblies", "identified", "by", "proteome", "-", "wide", "cross", "-", "linking", "mass", "spectrometry", ",", "biomolecular", "modeling", "and", "negative", "-", "stain", "electron", "microscopy", ".", "(", "A", ")", "Distance", "distributions", "of", "identified", "cross", "-", "links", "on", "top", "of", "the", "modeled", "protein", "complexes", "and", "identification", "of", "novel", "interactions", ".", "Satisfied", "distances", "are", "shown", "in", "blue", "and", "over", "-", "length", "cross", "-", "links", "are", "shown", "in", "red", ".", "(", "B", ")", "Negatively", "stained", "electron", "micrographs", "of", "fractions", "3", "-", "7", "and", "27", "directly", "derived", "from", "size", "exclusion", "chromatography", "showing", "the", "structural", "signatures", "and", "their", "structural", "integrity", "within", "the", "fractions", ".", "Decreasing", "molecular", "weight", "correlates", "with", "increased", "protein", "concentration", "as", "a", "function", "of", "protein", "complex", "elution", "is", "highlighted", ".", "(", "C", ")", "Abundance", "profiles", "as", "determined", "by", "quantitative", "mass", "spectrometry", "correlate", "with", "the", "number", "of", "observed", "single", "particles", "of", "the", "corresponding", "structural", "signature", "within", "the", "negative", "-", "staining", "electron", "micrographs", ";", "shown", "for", "fatty", "acid", "synthase", ",", "20S", "proteasome", ",", "60S", "and", "40S", "ribosome", "(", "the", "number", "of", "particles", "per", "image", "per", "fraction", "is", "indicated", "below", "the", "class", "averages", ")", ".", "(", "D", ")", "Simplification", "of", "lysate", "(", "collecting", "only", "the", "flow", "-", "through", "from", "anion", "exchange", "chromatography", ")", "prior", "to", "SEC", "separation", "allows", "class", "-", "averaging", "of", "structural", "signatures", "from", "complex", "fractions", "that", "were", "previously", "too", "low", "abundant", ".", "Proteins", "identified", "in", "this", "simplified", "fraction", "are", "found", "in", "Table", "S4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Fig. 4 Higher-order assemblies identified by proteome-wide cross-linking mass spectrometry, biomolecular modeling and negative-stain electron microscopy. (A) Distance distributions of identified cross-links on top of the modeled protein complexes and identification of novel interactions. Satisfied distances are shown in blue and over-length cross-links are shown in red.(B) Negatively stained electron micrographs of fractions 3-7 and 27 directly derived from size exclusion chromatography showing the structural signatures and their structural integrity within the fractions. Decreasing molecular weight correlates with increased protein concentration as a function of protein complex elution is highlighted.(C) Abundance profiles as determined by quantitative mass spectrometry correlate with the number of observed single particles of the corresponding structural signature within the negative-staining electron micrographs; shown for fatty acid synthase, 20S proteasome, 60S and 40S ribosome (the number of particles per image per fraction is indicated below the class averages).(D) Simplification of lysate (collecting only the flow-through from anion exchange chromatography) prior to SEC separation allows class-averaging of structural signatures from complex fractions that were previously too low abundant. Proteins identified in this simplified fraction are found in Table S4."}
{"words": ["Figure", "5Fig", ".", "5", "Visualization", "of", "transient", "interactions", "in", "fatty", "acid", "synthesis", ".", "(", "A", ")", "Communities", "in", "fatty", "acid", "metabolism", "and", "the", "quantification", "of", "intra", "-", "community", "distances", "within", "cryo", "-", "electron", "micrographs", ".", "Fatty", "acid", "synthase", "(", "FAS", ")", "frequently", "interacts", "with", "other", "sizeable", "protein", "complexes", "in", "a", "linear", "'", "pearl", "-", "string", "-", "like", "'", "arrangement", "and", "usually", "localizes", "at", "the", "edges", "of", "the", "community", ".", "Scale", "bars", "correspond", "to", "25", "nm", ".", "FAS", "particles", "(", "circles", ")", "and", "their", "nearest", "neighbors", "(", "arrow", "heads", ")", "are", "indicated", ".", "(", "C", ")", "Related", "to", "(", "A", ")", ".", "Calculation", "of", "minimum", "distances", "between", "pairs", "of", "FAS", "molecules", "as", "well", "as", "FAS", "molecules", "and", "their", "closest", "non", "-", "FAS", "neighbors", "in", "comparison", "to", "random", "distributions", ".", "Whereas", "FAS", "molecules", "are", "randomly", "distributed", ",", "their", "binders", "are", "not", ",", "confirming", "physical", "interactions", ".", "Supervised", "picking", "means", "that", "all", "single", "-", "particles", "were", "manually", "picked", "from", "the", "images", ".", "Randomized", "distance", "means", "that", "these", "manually", "picked", "particles", "were", "assigned", "random", "coordinates", "in", "each", "image", "(", "randomization", "of", "x", ",", "y", "coordinates", "considering", "image", "borders", ")", "and", "then", "their", "distance", "is", "calculated", ".", "(", "D", ")", "Cross", "-", "linking", "mass", "spectrometry", "data", "show", "that", "the", "binder", "is", "a", "carboxylase", "that", "is", "bound", "to", "the", "malonyl", "transacylase", "domain", "and", "acyl", "carrier", "protein", "(", "ACP", ")", "is", "in", "the", "vicinity", ",", "considering", "cross", "-", "link", "length", "and", "the", "positions", "of", "the", "lysine", "on", "the", "ctFAS", "structure", ".", "Cross", "-", "links", "come", "from", "both", "affinity", "-", "purified", "and", "fractionated", "cell", "extracts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Fig. 5 Visualization of transient interactions in fatty acid synthesis. (A) Communities in fatty acid metabolism and the quantification of intra-community distances within cryo-electron micrographs. Fatty acid synthase (FAS) frequently interacts with other sizeable protein complexes in a linear 'pearl-string-like' arrangement and usually localizes at the edges of the community. Scale bars correspond to 25 nm. FAS particles (circles) and their nearest neighbors (arrow heads) are indicated.(C) Related to (A). Calculation of minimum distances between pairs of FAS molecules as well as FAS molecules and their closest non-FAS neighbors in comparison to random distributions. Whereas FAS molecules are randomly distributed, their binders are not, confirming physical interactions. Supervised picking means that all single-particles were manually picked from the images. Randomized distance means that these manually picked particles were assigned random coordinates in each image (randomization of x,y coordinates considering image borders) and then their distance is calculated.(D) Cross-linking mass spectrometry data show that the binder is a carboxylase that is bound to the malonyl transacylase domain and acyl carrier protein (ACP) is in the vicinity, considering cross-link length and the positions of the lysine on the ctFAS structure. Cross-links come from both affinity-purified and fractionated cell extracts."}
{"words": ["Figure", "6Fig", ".", "6", "CryoEM", "structure", "of", "fatty", "acid", "synthase", "resolved", "to", "4", ".", "7", "Å", "as", "obtained", "from", "cryo", "electron", "micrographs", "of", "fraction", "numbers", "7", "-", "9", ".", "(", "A", ")", "The", "cryoEM", "of", "C", ".", "thermophilum", "fatty", "acid", "synthase", "(", "ctFAS", ")", "map", "is", "shown", "isosurface", "rendered", "and", "superimposed", "with", "the", "fitted", "X", "-", "ray", "structure", "of", "yeast", "FAS", "(", "Jenni", "et", "al", ",", "2007", ")", ".", "The", "domes", "and", "the", "cap", "show", "the", "unambiguous", "fit", "of", "α", "-", "helices", "and", "β", "-", "strands", ".", "(", "B", ")", "A", "slice", "through", "the", "central", "wheel", "of", "fungal", "FAS", ".", "The", "pitch", "of", "α", "-", "helices", "is", "resolved", ".", "(", "C", ")", "As", "for", "(", "B", ")", "but", "sliced", "through", "the", "dome", "structure", ".", "(", "D", ")", "Location", "of", "acyl", "carrier", "protein", "(", "ACP", ")", "within", "the", "cryoEM", "map", "of", "ctFAS", "and", "the", "position", "of", "additional", "density", "outside", "the", "dome", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Fig. 6 CryoEM structure of fatty acid synthase resolved to 4.7 Å as obtained from cryo electron micrographs of fraction numbers 7-9. (A) The cryoEM of C. thermophilum fatty acid synthase (ctFAS) map is shown isosurface rendered and superimposed with the fitted X-ray structure of yeast FAS (Jenni et al, 2007). The domes and the cap show the unambiguous fit of α-helices and β-strands.(B) A slice through the central wheel of fungal FAS. The pitch of α-helices is resolved.(C) As for (B) but sliced through the dome structure.(D) Location of acyl carrier protein (ACP) within the cryoEM map of ctFAS and the position of additional density outside the dome."}
{"words": ["Figure", "2A", "Whole", "mount", "immunofluorescence", "of", "a", "P8", "Syne4", "-", "/", "-", "organ", "of", "Corti", "showing", "intact", "hair", "cells", ",", "as", "labelled", "with", "myosin", "VIIa", ".", "B", "Whole", "mount", "immunofluorescence", "of", "WT", "and", "Syne4", "-", "/", "-", "organ", "of", "Corti", "from", "the", "8", ",", "16", ",", "and", "32", "kHz", "regions", "at", "P8", "and", "P14", ".", "C", "Inner", "and", "outer", "hair", "cell", "counts", "of", "Syne4", "-", "/", "-", "organ", "of", "Corti", "at", "P8", ",", "P10", ",", "P12", ",", "and", "P14", ".", "D", "FM1", "-", "43", "uptake", "performed", "on", "P8", "+", "1", "DIV", "(", "days", "-", "in", "-", "vitro", ")", "WT", "and", "Syne4", "-", "/", "-", "organ", "of", "Corti", ".", "Top", "shows", "OHC", "plane", "and", "bottom", "shows", "IHC", "plane", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Whole mount immunofluorescence of a P8 Syne4-/- organ of Corti showing intact hair cells, as labelled with myosin VIIa. B Whole mount immunofluorescence of WT and Syne4-/- organ of Corti from the 8, 16, and 32 kHz regions at P8 and P14. C Inner and outer hair cell counts of Syne4-/- organ of Corti at P8, P10, P12, and P14.D FM1-43 uptake performed on P8+1 DIV (days-in-vitro) WT and Syne4-/- organ of Corti. Top shows OHC plane and bottom shows IHC plane."}
{"words": ["Figure", "3B", "Whole", "mount", "immunofluorescence", "of", "a", "P9", "organ", "of", "Corti", "of", "a", "mouse", "injected", "with", "AAV", ".", "GFP", "at", "P1", "showing", "complete", "transduction", "of", "both", "inner", "and", "outer", "HC", ".", "Myosin", "VIIa", "was", "used", "to", "label", "the", "hair", "cells", ".", "C", "Examples", "of", "8", ",", "16", ",", "and", "32", "kHz", "regions", "of", "an", "organ", "of", "Corti", "of", "a", "mouse", "injected", "with", "AAV", ".", "GFP", ".", "Top", "shows", "OHC", "plane", ",", "bottom", "shows", "IHC", "plane", ",", "right", "shows", "YZ", "orthogonal", "projection", ".", "Black", "asterisks", "show", "bright", "Deiters", "cells", ".", "D", "Quantification", "of", "GFP", "intensity", "of", "inner", "and", "outer", "HC", "from", "3", "injected", "mice", ",", "normalized", "to", "the", "average", "intensity", "of", "HC", "in", "a", "control", ",", "un", "-", "injected", "mouse", ".", "E", "Transduction", "rates", "of", "AAV9", "-", "PHP", ".", "B", "at", "8", ",", "16", ",", "and", "32kHz", "regions", "based", "on", "GFP", "fluorescence", ".", "A", "total", "of", "162", "IHC", "and", "841", "OHC", "were", "analyzed", "from", "3", "injected", "mice", "and", "1", "control", "littermate", ".", "F", "Staining", "for", "FLAG", "at", "at", "P14", "of", "the", "organ", "of", "Corti", "of", "a", "mouse", "injected", "at", "P1", "with", "AAV", ".", "Syne4", ".", "G", "Quantification", "of", "FLAG", "and", "DAPI", "fluorescence", "intensity", "along", "a", "line", "centered", "at", "the", "nuclear", "envelope", ".", "Eight", "OHC", "were", "measured", ".", "H", "3D", "surface", "projection", "of", "two", "adjacent", "OHC", "from", "a", "mouse", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", ".", "In", "the", "left", "cell", "myosin", "VIIa", "and", "DAPI", "signals", "were", "removed", "to", "only", "show", "FLAG", "staining", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Whole mount immunofluorescence of a P9 organ of Corti of a mouse injected with AAV.GFP at P1 showing complete transduction of both inner and outer HC. Myosin VIIa was used to label the hair cells. C Examples of 8, 16, and 32 kHz regions of an organ of Corti of a mouse injected with AAV.GFP. Top shows OHC plane, bottom shows IHC plane, right shows YZ orthogonal projection. Black asterisks show bright Deiters cells. D Quantification of GFP intensity of inner and outer HC from 3 injected mice, normalized to the average intensity of HC in a control, un-injected mouse. E Transduction rates of AAV9-PHP.B at 8, 16, and 32kHz regions based on GFP fluorescence. A total of 162 IHC and 841 OHC were analyzed from 3 injected mice and 1 control littermate.F Staining for FLAG at at P14 of the organ of Corti of a mouse injected at P1 with AAV.Syne4.G Quantification of FLAG and DAPI fluorescence intensity along a line centered at the nuclear envelope. Eight OHC were measured.H 3D surface projection of two adjacent OHC from a mouse injected with AAV.Syne4. In the left cell myosin VIIa and DAPI signals were removed to only show FLAG staining."}
{"words": ["Figure", "4A", "Whole", "-", "mount", "immunofluorescence", "of", "the", "8", "kHz", "region", "from", "P14", "organ", "of", "Corti", "from", "WT", ",", "Syne4", "-", "/", "-", ",", "and", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", ".", "B", "3D", "surface", "projection", "of", "IHC", "and", "OHC", "at", "P14", "from", "the", "8kHz", "region", "of", "WT", ",", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "and", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", ".", "Open", "arrows", "denote", "basal", "end", ",", "white", "arrows", "denote", "cuticular", "plate", ".", "C", "Image", "analysis", "of", "nucleus", "position", "of", "IHC", "and", "OHC", ".", "Images", "show", "an", "arc", "fitted", "through", "the", "apical", "surface", ",", "nucleus", ",", "and", "basal", "end", "of", "the", "cell", "in", "3D", ".", "X", ",", "Y", ",", "and", "Z", "axes", "show", "position", "in", "μm", ".", "D", "Quantification", "of", "nuclear", "distance", "from", "the", "cuticular", "plate", ".", "A", "total", "of", "45", "IHC", "and", "135", "OHC", "from", "3", "WT", "mice", ",", "45", "IHC", "and", "81", "OHC", "from", "3", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", ",", "30", "IHC", "and", "90", "OHC", "from", "2", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", "were", "measured", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Whole-mount immunofluorescence of the 8 kHz region from P14 organ of Corti from WT, Syne4-/-, and Syne4-/- mice injected with AAV.Syne4. B 3D surface projection of IHC and OHC at P14 from the 8kHz region of WT, Syne4-/- mice and Syne4-/- mice injected with AAV.Syne4. Open arrows denote basal end, white arrows denote cuticular plate. C Image analysis of nucleus position of IHC and OHC. Images show an arc fitted through the apical surface, nucleus, and basal end of the cell in 3D. X, Y, and Z axes show position in μm.D Quantification of nuclear distance from the cuticular plate. A total of 45 IHC and 135 OHC from 3 WT mice, 45 IHC and 81 OHC from 3 Syne4-/- mice, 30 IHC and 90 OHC from 2 Syne4-/- mice injected with AAV.Syne4 were measured."}
{"words": ["Figure", "5A", "Representative", "example", "of", "ABR", "traces", "obtained", "at", "4w", "from", "a", "WT", ",", "Syne4", "-", "/", "-", "mouse", ",", "and", "Syne4", "-", "/", "-", "mouse", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", "in", "response", "to", "an", "18", "kHz", "stimulus", ".", "B", "ABR", "thresholds", "at", "4w", "of", "WT", ",", "Syne4", "-", "/", "-", ",", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", ",", "and", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "injected", "with", "AAV", ".", "GFP", ",", "n", "=", "7", "for", "WT", ",", "n", "=", "8", "for", "Syne4", "-", "/", "-", ",", "n", "=", "20", "for", "Syne4", "-", "/", "-", "+", "AAV", ".", "Syne4", ",", "n", "=", "6", "for", "Syne4", "-", "/", "-", "+", "AAV", ".", "GFP", ".", "C", "Quantification", "of", "P1", "-", "N1", "amplitude", "delta", "from", "(", "B", ")", ",", "n", "=", "4", "for", "WT", ",", "n", "=", "4", "for", "Syne4", "-", "/", "-", ",", "n", "=", "7", "for", "Syne4", "-", "/", "-", "+", "AAV", ".", "Syne4", ".", "D", "Quantification", "of", "P1", "latency", "from", "(", "B", ")", ",", "n", "=", "4", "for", "WT", ",", "n", "=", "2", "for", "Syne4", "-", "/", "-", ",", "n", "=", "7", "for", "Syne4", "-", "/", "-", "+", "AAV", ".", "Syne4", ".", "E", "DPOAE", "thresholds", "at", "4w", ",", "n", "=", "6", "for", "WT", ",", "n", "=", "5", "for", "Syne4", "-", "/", "-", ",", "n", "=", "6", "for", "Syne4", "-", "/", "-", "+", "AAV", ".", "Syne4", ".", "F", "ABR", "threshold", "at", "12w", ",", "n", "=", "6", "for", "WT", ",", "n", "=", "8", "for", "Syne4", "-", "/", "-", ",", "n", "=", "16", "for", "Syne4", "-", "/", "-", "+", "AAV", ".", "Syne4", ",", "n", "=", "5", "for", "Syne4", "-", "/", "-", "+", "AAV", ".", "GFP", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Representative example of ABR traces obtained at 4w from a WT, Syne4-/- mouse, and Syne4-/- mouse injected with AAV.Syne4 in response to an 18 kHz stimulus.B ABR thresholds at 4w of WT, Syne4-/-, Syne4-/- mice injected with AAV.Syne4, and Syne4-/- mice injected with AAV.GFP, n=7 for WT, n=8 for Syne4-/-, n=20 for Syne4-/- + AAV.Syne4, n=6 for Syne4-/- + AAV.GFP. C Quantification of P1-N1 amplitude delta from (B), n=4 for WT, n=4 for Syne4-/-, n=7 for Syne4-/- + AAV.Syne4. D Quantification of P1 latency from (B), n=4 for WT, n=2 for Syne4-/-, n=7 for Syne4-/- + AAV.Syne4. E DPOAE thresholds at 4w, n=6 for WT, n=5 for Syne4-/-, n=6 for Syne4-/- + AAV.Syne4. F ABR threshold at 12w, n=6 for WT, n=8 for Syne4-/-, n=16 for Syne4-/- + AAV.Syne4, n=5 for Syne4-/- + AAV.GFP. "}
{"words": ["Figure", "6A", "Whole", "mount", "immunofluorescence", "at", "12w", "of", "the", "organ", "of", "Corti", "of", "a", "Syne4", "-", "/", "-", "mouse", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", "mouse", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", ".", "B", "Whole", "mount", "immunofluorescence", "at", "12w", "of", "the", "12", "kHz", "region", "of", "WT", ",", "Syne4", "-", "/", "-", "mouse", ",", "and", "Syne4", "-", "/", "-", "mouse", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", ".", "C", "IHC", "and", "OHC", "counts", ",", "n", "=", "3", "for", "WT", ",", "n", "=", "4", "for", "Mut", ",", "n", "=", "6", "for", "Mut", "+", "AAV", ".", "Syne4", ".", "D", "Correlation", "between", "HC", "count", "and", "ABR", "threshold", "at", "12kHz", ".", "E", "3D", "surface", "projection", "of", "an", "OHC", "at", "12w", "from", "the", "12kHz", "region", "of", "WT", "and", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", ".", "Open", "arrows", "denote", "basal", "end", ",", "white", "arrows", "denote", "cuticular", "plate", ".", "F", "Image", "analysis", "of", "nucleus", "position", "of", "OHC", ".", "G", "Quantification", "of", "nuclear", "distance", "from", "the", "cuticular", "plate", ".", "A", "total", "of", "30", "OHC", "from", "3", "WT", "mice", "and", "38", "OHC", "from", "4", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", "were", "measured", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Whole mount immunofluorescence at 12w of the organ of Corti of a Syne4-/- mouse injected with AAV.Syne4 mouse injected with AAV.Syne4. B Whole mount immunofluorescence at 12w of the 12 kHz region of WT, Syne4-/- mouse, and Syne4-/- mouse injected with AAV.Syne4. C IHC and OHC counts, n=3 for WT, n=4 for Mut, n=6 for Mut + AAV.Syne4. D Correlation between HC count and ABR threshold at 12kHz. E 3D surface projection of an OHC at 12w from the 12kHz region of WT and Syne4-/- mice injected with AAV.Syne4. Open arrows denote basal end, white arrows denote cuticular plate. F Image analysis of nucleus position of OHC. G Quantification of nuclear distance from the cuticular plate. A total of 30 OHC from 3 WT mice and 38 OHC from 4 Syne4-/- mice injected with AAV.Syne4 were measured. "}
{"words": ["Figure", "7B", ",", "C", "Quantification", "of", "activity", "level", "and", "cumulative", "freezing", "duration", "at", "12w", "during", "seconds", "90", "-", "210", "of", "day", "2", "in", "WT", ",", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", ",", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "injected", "with", "AAV", ".", "Syne4", ",", "and", "Syne4", "-", "/", "-", "mice", "injected", "with", "AAV", ".", "GFP", ",", "n", "=", "14", "for", "WT", ",", "n", "=", "16", "for", "Syne4", "-", "/", "-", ",", "n", "=", "9", "for", "Syne4", "-", "/", "-", "+", "AAV", ".", "Syne4", ",", "n", "=", "5", "for", "Syne4", "-", "/", "-", "+", "AAV", ".", "GFP", ".", "(", "C", ")", "Activity", "level", ".", "(", "B", ")", "Cumulative", "freezing", "duration", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B, C Quantification of activity level and cumulative freezing duration at 12w during seconds 90-210 of day 2 in WT, Syne4-/- mice, Syne4-/- mice injected with AAV.Syne4, and Syne4-/- mice injected with AAV.GFP, n=14 for WT, n=16 for Syne4-/-, n=9 for Syne4-/- + AAV.Syne4, n=5 for Syne4-/- + AAV.GFP. (C) Activity level. (B) Cumulative freezing duration."}
{"words": ["Figure", "1Distribution", "of", "25", "-", "35", "mer", "reads", "mapping", "to", "the", "mouse", "genome", ".", "Proportion", "of", "30", "-", "35", "nt", "genomic", "reads", "matching", "mouse", "tRNA", "sequences", ".", "The", "sequencing", "was", "done", "in", "duplicates", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Perbase", "sequence", "coverage", "of", "30", "-", "35", "nt", "reads", "across", "parental", "tRNA", "sequence", ".", "Anticodon", "positions", "are", "demarcated", "by", "discontinuous", "lines", "(", "Blue", "=", "LIF", "-", "treated", ",", "Grey", "=", "Wnt3", "+", "LIF", "-", "treated", ",", "Red", "=", "RA", "-", "treated", "mESCs", ")", ".", "Perbase", "coverage", "of", "30", "-", "35", "nt", "reads", "across", "the", "468", "individual", "parental", "tRNAs", "plotted", "as", "heatmaps", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Distribution of 25-35 mer reads mapping to the mouse genome. Proportion of 30-35 nt genomic reads matching mouse tRNA sequences. The sequencing was done in duplicates. Error bars represent SEM, significance was calculated using unpaired t-test.Perbase sequence coverage of 30-35 nt reads across parental tRNA sequence. Anticodon positions are demarcated by discontinuous lines (Blue = LIF-treated, Grey = Wnt3+LIF- treated, Red = RA- treated mESCs). Perbase coverage of 30-35 nt reads across the 468 individual parental tRNAs plotted as heatmaps."}
{"words": ["Figure", "2Northern", "blot", "of", "candidate", "tRNAs", "and", "tsRNAs", "tsGlnCTG", ",", "tsGlyGCC", ",", "tsGluTTC", ",", "tsValCAC", "and", "tsLysTTT", ".", "The", "black", "arrows", "represent", "the", "tRNAs", "and", "the", "red", "arrows", "mark", "the", "tsRNAs", ".", "Northern", "Blot", "of", "5", "'", "-", "tsRNAs", ";", "tsGlyGCC", ",", "tsGlnCTG", ",", "tsGluTTC", ",", "tsLysTTT", ",", "tsValCAC", "at", "various", "timepoints", "of", "RA", "-", "induced", "mESCs", "differentiation", "showing", "dynamic", "expression", "of", "these", "5", "'", "-", "tsRNAs", ".", "Relative", "quantification", "of", "the", "tsRNA", "bands", "from", "northern", "hybridization", "tested", "across", "two", "biological", "replicates", ".", "The", "solid", "lines", "represent", "the", "expression", "of", "tsRNAs", "and", "the", "dashed", "lines", "represent", "tRNAs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Northern blot of candidate tRNAs and tsRNAs tsGlnCTG, tsGlyGCC, tsGluTTC, tsValCAC and tsLysTTT. The black arrows represent the tRNAs and the red arrows mark the tsRNAs.Northern Blot of 5'-tsRNAs; tsGlyGCC, tsGlnCTG, tsGluTTC, tsLysTTT, tsValCAC at various timepoints of RA-induced mESCs differentiation showing dynamic expression of these 5'-tsRNAs. Relative quantification of the tsRNA bands from northern hybridization tested across two biological replicates. The solid lines represent the expression of tsRNAs and the dashed lines represent tRNAs."}
{"words": ["Figure", "3Effect", "of", "ASO", "-", "mediated", "inhibition", "of", "5", "'", "-", "tsRNAs", "on", "alkaline", "phosphatase", "activity", "in", "RA", "-", "treated", "mESCs", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "Error", "bars", "represent", "SEM", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Relative", "expression", "of", "stemness", "markers", "in", "RA", "-", "induced", "differentiation", "mESCs", "blocked", "for", "5", "'", "-", "tsRNA", "function", "with", "ASOs", ".", "(", "n", "=", "2", ")", "Error", "bars", "represent", "SEM", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Volcano", "plot", "of", "the", "transcriptome", "depicting", "the", "overexpressed", "transcripts", "(", "in", "green", ")", "and", "downregulated", "transcripts", "(", "in", "pink", ")", "in", "ASO", "treated", "-", "differentiating", "cells", ".", "QPCR", "validation", "of", "transcripts", "involved", "in", "the", "stem", "cell", "signalling", "pathway", "that", "are", "upregulated", "upon", "5", "'", "-", "tsRNA", "knockdowns", "using", "ASOs", ".", "(", "n", "=", "2", ")", "Error", "bars", "represent", "SEM", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Effect of ASO-mediated inhibition of 5'-tsRNAs on alkaline phosphatase activity in RA-treated mESCs. (n = 3), Error bars represent SEM, significance was calculated using unpaired t-test.Relative expression of stemness markers in RA-induced differentiation mESCs blocked for 5'-tsRNA function with ASOs. (n = 2) Error bars represent SEM, significance was calculated using unpaired t-test.Volcano plot of the transcriptome depicting the overexpressed transcripts (in green) and downregulated transcripts (in pink) in ASO treated-differentiating cells.QPCR validation of transcripts involved in the stem cell signalling pathway that are upregulated upon 5'-tsRNA knockdowns using ASOs. (n =2) Error bars represent SEM, significance was calculated using unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "4Scatter", "plot", "showing", "Log2", "fold", "-", "change", "enrichment", "of", "protein", "interactome", "between", "LIF", "-", "and", "RA", "-", "treated", "mESCs", ".", "All", "peptides", "identified", "by", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "had", "<", "1", "%", "FDR", "(", "Fig", "EV4E", ")", ".", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "was", "conducted", "twice", "(", "R2", "=", "0", ".", "85", "between", "LIF", "duplicates", "and", "R2", "=", "0", ".", "82", "between", "RA", "-", "treated", "mESCs", "duplicates", ")", ".", "Scatter", "plot", "showing", "Log2", "fold", "-", "change", "enrichment", "of", "mRNAs", "associated", "with", "tsGlnCTG", "over", "Scramble", "(", "Scr1", ")", "in", "LIF", "-", "versus", "RA", "-", "treated", "mESCs", ".", "Bar", "plots", "and", "representative", "gene", "lists", "depicting", "association", "of", "tsGlnCTG", "with", "'", "pluripotency", "-", "associated", "'", "(", "D", ")", "and", "'", "differentiation", "-", "responsive", "'", "(", "D", "'", ")", "genes", "in", "LIF", "-", "or", "RA", "-", "treated", "mESCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Scatter plot showing Log2 fold-change enrichment of protein interactome between LIF- and RA-treated mESCs. All peptides identified by LC-MS/MS had < 1% FDR (Fig EV4E). LC-MS/MS was conducted twice (R2 = 0.85 between LIF duplicates and R2 = 0.82 between RA-treated mESCs duplicates).Scatter plot showing Log2 fold-change enrichment of mRNAs associated with tsGlnCTG over Scramble (Scr1) in LIF- versus RA-treated mESCs.Bar plots and representative gene lists depicting association of tsGlnCTG with 'pluripotency-associated' (D) and 'differentiation-responsive' (D') genes in LIF- or RA-treated mESCs."}
{"words": ["Figure", "5In", "vitro", "binding", "analysis", "of", "tsGlnCTG", "to", "Igf2bp1", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "antisense", "oligo", "(", "ASO", ")", "against", "tsGlnCTG", ".", "ASOs", "effectively", "disrupt", "the", "binding", "of", "tsGlnCTG", "to", "Igf2bp1", ".", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "Error", "bars", "represent", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Quantification", "of", "the", "Igf2bp1", "bound", "c", "-", "Myc", "mRNA", "between", "LIF", "-", "versus", "RA", "-", "treated", "mESCs", "(", "n", "=", "2", ";", "see", "Fig", ".", "EV5F", "for", "duplicate", "data", ")", ".", "Association", "of", "c", "-", "Myc", "transcript", "in", "different", "translating", "pools", "in", "RA", "treated", "mESCs", "as", "compared", "to", "LIF", "condition", ".", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "Error", "bars", "represent", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "by", "one", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Relative", "enrichment", "of", "c", "-", "Myc", "mRNA", "in", "translating", "(", "80S", "and", "Polysome", ")", "and", "non", "-", "translating", "(", "mRNPs", ")", "pools", "(", "fractionated", "from", "polysome", "profiling", ")", "between", "ASO", "-", "treated", "and", "Mock", "-", "treated", "RA", "-", "induced", "differentiating", "mESCs", ".", "(", "n", "=", "2", ")", "Error", "bars", "represent", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "one", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Relative", "levels", "of", "c", "-", "Myc", "mRNA", "in", "ASO", "-", "treated", "and", "Mock", "-", "treated", "RA", "-", "induced", "differentiating", "mESCs", "compared", "to", "LIF", "treated", "mESCs", ".", "(", "n", "=", "3", ")", "Error", "bars", "represent", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "one", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Epistatic", "analysis", "of", "5", "'", "-", "tsRNAs", "and", "IGF2BP1", "in", "regulating", "Myc", "transcriptional", "reporter", "activity", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "Error", "bars", "represent", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5In vitro binding analysis of tsGlnCTG to Igf2bp1 in the presence and absence of antisense oligo (ASO) against tsGlnCTG. ASOs effectively disrupt the binding of tsGlnCTG to Igf2bp1. (n = 2), Error bars represent S.E.M.Quantification of the Igf2bp1 bound c-Myc mRNA between LIF- versus RA-treated mESCs (n = 2; see Fig. EV5F for duplicate data).Association of c-Myc transcript in different translating pools in RA treated mESCs as compared to LIF condition. (n = 2), Error bars represent SD, significance was calculated by one-tailed unpaired t-test.Relative enrichment of c-Myc mRNA in translating (80S and Polysome) and non-translating (mRNPs) pools (fractionated from polysome profiling) between ASO-treated and Mock-treated RA-induced differentiating mESCs. (n =2) Error bars represent SD, significance was calculated using one-tailed unpaired t-test.Relative levels of c-Myc mRNA in ASO-treated and Mock-treated RA-induced differentiating mESCs compared to LIF treated mESCs. (n = 3) Error bars represent SD, significance was calculated using one-tailed unpaired t-test.Epistatic analysis of 5'-tsRNAs and IGF2BP1 in regulating Myc transcriptional reporter activity. (n = 3), Error bars represent SD, significance was calculated using unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Downstream", "polarization", "of", "VE", "-", "PTP", "(", "red", ")", "in", "endothelial", "cells", "in", "the", "thoracic", "aorta", ".", "Blood", "flow", ":", "left", "to", "right", ".", "VE", "-", "cadherin", ",", "green", ".", "(", "C", ")", "Higher", "magnification", "views", "of", "a", "region", "similar", "to", "B", ",", "showing", "variability", "of", "VE", "-", "PTP", "polarization", "ranging", "from", "conspicuous", "(", "upper", ")", "to", "subtle", "(", "lower", ")", ".", "Nuclei", ",", "blue", "(", "lamin", "A", "/", "C", ")", ".", "(", "(", "D", ")", "Dot", "plot", "of", "proportions", "of", "VE", "-", "PTP", "staining", "in", "upstream", "and", "downstream", "halves", "of", "endothelial", "cells", "in", "thoracic", "aorta", "of", "wild", "-", "type", "mouse", ".", "Each", "dot", "is", "one", "endothelial", "cell", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "15", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Downstream polarization of VE-PTP (red) in endothelial cells in the thoracic aorta. Blood flow: left to right. VE-cadherin, green. (C) Higher magnification views of a region similar to B, showing variability of VE-PTP polarization ranging from conspicuous (upper) to subtle (lower). Nuclei, blue (lamin A/C). ((D) Dot plot of proportions of VE-PTP staining in upstream and downstream halves of endothelial cells in thoracic aorta of wild-type mouse. Each dot is one endothelial cell. Mean ± SEM, n = 15 cells."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "VE", "-", "PTP", "internalization", "in", "HUVEC", "into", "EEA1", "endosomes", "(", "arrowheads", ")", "under", "static", "conditions", "and", "laminar", "flow", "of", "15", "dyn", "/", "cm2", "of", "shear", "force", "for", "5", ",", "10", ",", "and", "30", "min", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "VE", "-", "PTP", "staining", "signals", "of", "images", "shown", "in", "C", ",", "which", "co", "-", "localize", "with", "EEA1", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "10", "pooled", "in", "3", "independent", "experiments", "(", "(", "E", ")", "HUVEC", "exposed", "to", "same", "conditions", "as", "in", "C", ",", "followed", "by", "fixation", "with", "(", "upper", "row", ")", "or", "without", "(", "lower", "row", ")", "permeabilization", "with", "0", ".", "3", "%", "Triton", "X", "-", "100", ",", "and", "staining", "for", "VE", "-", "PTP", "(", "red", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ",", "Hoechst", "33342", ")", ".", "(", "F", ")", "VE", "-", "PTP", "on", "cell", "surface", "measured", "by", "cell", "-", "based", "ELISA", "assay", "of", "HUVEC", "after", "exposure", "as", "in", "C", "and", "D", ".", "Red", "and", "black", "lines", "show", "measurements", "with", "anti", "-", "VE", "-", "PTP", "antibody", "and", "isotype", "control", "antibody", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "6", "independent", "experiments", "/", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) VE-PTP internalization in HUVEC into EEA1 endosomes (arrowheads) under static conditions and laminar flow of 15 dyn/cm2 of shear force for 5, 10, and 30 min. (D) Quantification of VE-PTP staining signals of images shown in C, which co-localize with EEA1. Mean ± SEM, n= 10 pooled in 3 independent experiments ((E) HUVEC exposed to same conditions as in C, followed by fixation with (upper row) or without (lower row) permeabilization with 0.3% Triton X-100, and staining for VE-PTP (red) and nuclei (blue, Hoechst 33342). (F) VE-PTP on cell surface measured by cell-based ELISA assay of HUVEC after exposure as in C and D. Red and black lines show measurements with anti-VE-PTP antibody and isotype control antibody. Mean ± SEM, n = 6 independent experiments/group. D"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", "-", "D", ")", "Strong", "Tie2", "-", "pY992", "(", "green", ")", "staining", "at", "cell", "borders", "and", "VE", "-", "PTP", "(", "red", ")", "downstream", "polarization", "in", "outer", "curvature", "in", "C", "in", "contrast", "to", "weak", ",", "dispersed", "staining", "for", "Tie2", "-", "pY992", "and", "VE", "-", "PTP", "in", "inner", "curvature", "in", "D", "of", "aortic", "arch", "of", "wild", "-", "type", "mouse", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Tie2", "-", "pY992", "(", "green", ")", "at", "endothelial", "junctions", "marked", "by", "VE", "-", "cadherin", "(", "red", ")", ".", "(", "E", ")", "Contrasting", "patterns", "and", "intensity", "of", "Tie2", "-", "pY992", "in", "outer", "and", "inner", "curvatures", ".", "(", "F", ")", "Tie2", "-", "pY992", "mean", "fluorescence", "intensity", "at", "junctions", "(", "normalized", "to", "outer", "curvature", "=", "1", ".", "0", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C-D) Strong Tie2-pY992 (green) staining at cell borders and VE-PTP (red) downstream polarization in outer curvature in C in contrast to weak, dispersed staining for Tie2-pY992 and VE-PTP in inner curvature in D of aortic arch of wild-type mouse.(E-F) Tie2-pY992 (green) at endothelial junctions marked by VE-cadherin (red). (E) Contrasting patterns and intensity of Tie2-pY992 in outer and inner curvatures. (F) Tie2-pY992 mean fluorescence intensity at junctions (normalized to outer curvature = 1.0). Mean ± SEM, n = 6 mice/group."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", "Comparison", "of", "distribution", "of", "fluorescence", "intensities", "of", "extravasated", "antibody", "showing", "significantly", "stronger", "fluorescence", "due", "to", "greater", "leakage", "in", "inner", "curvature", ".", "(", "F", ")", "Mean", "fluorescence", "intensity", "value", "for", "each", "mouse", "in", "the", "two", "groups", "shown", "in", "E", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "7", "mice", "/", "group", ".", "(", "(", "G", ")", "Localized", "distribution", "of", "intense", "leakage", "(", "red", ")", "around", "ostium", "of", "an", "intercostal", "artery", "(", "arrow", ")", ".", "VE", "-", "cadherin", "(", "green", ")", ".", "(", "H", ")", "Opposite", "distributions", "of", "extravasation", "and", "VE", "-", "PTP", "polarization", "in", "endothelial", "cells", "in", "thoracic", "aorta", ".", "Left", "and", "right", "panels", "are", "the", "same", "image", "with", "colors", "switched", "to", "highlight", "leakage", "(", "red", ")", "and", "polarized", "VE", "-", "PTP", "(", "green", ",", "arrowheads", ")", "on", "the", "left", ",", "and", "polarized", "VE", "-", "PTP", "(", "red", ",", "arrowheads", ")", ",", "VE", "-", "cadherin", "(", "green", ")", ",", "and", "leakage", "(", "blue", ")", "on", "the", "right", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E) Comparison of distribution of fluorescence intensities of extravasated antibody showing significantly stronger fluorescence due to greater leakage in inner curvature. (F) Mean fluorescence intensity value for each mouse in the two groups shown in E. Mean ± SEM, n = 7 mice/group. ((G) Localized distribution of intense leakage (red) around ostium of an intercostal artery (arrow). VE-cadherin (green). (H) Opposite distributions of extravasation and VE-PTP polarization in endothelial cells in thoracic aorta. Left and right panels are the same image with colors switched to highlight leakage (red) and polarized VE-PTP (green, arrowheads) on the left, and polarized VE-PTP (red, arrowheads), VE-cadherin (green), and leakage (blue) on the right. D"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Measurements", "of", "Tie2", "-", "pY992", "staining", "intensity", "at", "intercellular", "junctions", "in", "aortic", "arch", "endothelial", "cells", "showing", "lower", "values", "in", "the", "inner", "curvature", "than", "in", "the", "upper", "curvature", "of", "VE", "-", "PTPfl", "/", "fl", "mice", "but", "equally", "high", "values", "in", "both", "regions", "of", "VE", "-", "PTPiECKO", "mice", ".", "Normalized", "to", "mean", "value", "for", "outer", "curvature", "of", "VE", "-", "PTPfl", "/", "fl", "mice", "scaled", "to", "1", ".", "0", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ".", "(", "C", ")", "HUVEC", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "VE", "-", "PTP", "siRNA", "and", "exposed", "to", "static", "or", "laminar", "shear", "force", "at", "15", "dyn", "/", "cm2", "for", "30", "min", ",", "followed", "by", "immunoprecipitation", "of", "Tie2", ".", "Left", ".", "Blot", "showing", "immunoprecipitates", "(", "top", ")", "or", "cell", "lysates", "(", "bottom", ")", "immunoblotted", "for", "pan", "-", "phosphotyrosine", "(", "antibody", "4G10", ")", ",", "Tie2", ",", "or", "VE", "-", "PTP", ".", "Ratio", "of", "staining", "for", "phosphorylated", "Tie2", "and", "total", "Tie2", "(", "Tie2", "-", "pY", "to", "Tie2", ",", "n", "=", "4", "experiments", ")", ".", "Right", ".", "Relative", "Tie2", "-", "pY", "levels", "in", "HUVEC", "after", "control", "siRNA", "or", "VE", "-", "PTP", "siRNA", ".", "Normalized", "to", "static", "control", "=", "1", ".", "(", "D", ")", "Effect", "of", "shear", "stress", "on", "the", "phosphorylation", "levels", "of", "Tie2", "Y992", "at", "cellular", "junctions", ".", "HUVECs", "treated", "with", "either", "control", "siRNA", "(", "left", ")", "or", "Tie2", "siRNA", "(", "right", ")", ",", "were", "exposed", "to", "15", "dyn", "/", "cm2", "shear", "stress", "for", "5", "min", ".", "The", "resulting", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "Tie2", "-", "pY992", "(", "red", ")", "and", "VE", "-", "cadherin", "(", "green", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Measurements of Tie2-pY992 staining intensity at intercellular junctions in aortic arch endothelial cells showing lower values in the inner curvature than in the upper curvature of VE-PTPfl/fl mice but equally high values in both regions of VE-PTPiECKO mice. Normalized to mean value for outer curvature of VE-PTPfl/fl mice scaled to 1.0. Mean ± SEM, n = 6 mice/group.(C) HUVEC transfected with control siRNA or VE-PTP siRNA and exposed to static or laminar shear force at 15 dyn/cm2 for 30 min, followed by immunoprecipitation of Tie2. Left. Blot showing immunoprecipitates (top) or cell lysates (bottom) immunoblotted for pan-phosphotyrosine (antibody 4G10), Tie2, or VE-PTP. Ratio of staining for phosphorylated Tie2 and total Tie2 (Tie2-pY to Tie2, n = 4 experiments). Right. Relative Tie2-pY levels in HUVEC after control siRNA or VE-PTP siRNA. Normalized to static control = 1.(D) Effect of shear stress on the phosphorylation levels of Tie2 Y992 at cellular junctions. HUVECs treated with either control siRNA (left) or Tie2 siRNA (right), were exposed to 15 dyn/cm2 shear stress for 5 min. The resulting cells were fixed and stained for Tie2-pY992 (red) and VE-cadherin (green)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "E", ")", "HUVECs", "cultured", "on", "biotinylated", "gelatin", "were", "treated", "either", "with", "control", "siRNA", ",", "VE", "-", "PTP", "siRNA", ",", "Tie2", "siRNA", "or", "VE", "-", "cadherin", "siRNA", ",", "then", "exposed", "to", "15", "dyn", "/", "cm2", "shear", "stress", "for", "30", "minutes", "followed", "by", "3", "min", "incubation", "with", "Streptavidin", "-", "Alexa647", "(", "red", ")", ",", "washing", ",", "fixation", "and", "staining", "for", "VE", "-", "cadherin", "(", "green", ")", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "Quantification", "of", "Streptavidin", "leakage", "area", "per", "image", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "19", "pooled", "in", "ten", "independent", "experiments", "(", "F", ")", ",", "and", "n", "=", "6", "pooled", "in", "three", "independent", "experiments", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(E) HUVECs cultured on biotinylated gelatin were treated either with control siRNA, VE-PTP siRNA, Tie2 siRNA or VE-cadherin siRNA, then exposed to 15 dyn/cm2 shear stress for 30 minutes followed by 3 min incubation with Streptavidin-Alexa647 (red), washing, fixation and staining for VE-cadherin (green). (F and G) Quantification of Streptavidin leakage area per image. Mean ± SEM, n = 19 pooled in ten independent experiments (F), and n = 6 pooled in three independent experiments (G). D"}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Fractional", "area", "occupied", "by", "Oil", "Red", "O", "-", "stained", "atheromas", "in", "aortic", "arch", ",", "brachiocephalic", "artery", ",", "at", "intercostal", "artery", "ostia", ",", "and", "away", "from", "ostia", ".", "Each", "dot", "is", "value", "for", "one", "mouse", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "13", "-", "18", "mice", "/", "group", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Fluorescence", "intensity", "distributions", "in", "D", "and", "mean", "intensities", "in", "E", "of", "extravasated", "anti", "-", "fibrinogen", "antibody", "in", "inner", "curvature", "of", "ApoE", "-", "/", "-", "/", "VE", "-", "PTPfl", "/", "fl", "mice", "and", "ApoE", "-", "/", "-", "/", "VE", "-", "PTPiECKO", "mice", "on", "high", "-", "fat", "diet", "for", "7", "wk", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "7", "mice", "/", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Fractional area occupied by Oil Red O-stained atheromas in aortic arch, brachiocephalic artery, at intercostal artery ostia, and away from ostia. Each dot is value for one mouse. Mean ± SEM, n = 13-18 mice/group.(D-E) Fluorescence intensity distributions in D and mean intensities in E of extravasated anti-fibrinogen antibody in inner curvature of ApoE-/-/VE-PTPfl/fl mice and ApoE-/-/VE-PTPiECKO mice on high-fat diet for 7 wk. Mean ± SEM, n = 7 mice/group."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "C", ")", "Measurements", "of", "Tie2", "-", "pY992", "intensity", "at", "intercellular", "junctions", "in", "aortic", "arch", "of", "mice", "shown", "in", "B", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "8", "mice", "/", "group", ".", "(", "E", ")", "Fractional", "area", "occupied", "by", "Oil", "Red", "O", "-", "stained", "atheromas", "in", "aortic", "arch", ",", "brachiocephalic", "artery", ",", "at", "intercostal", "artery", "ostia", ",", "and", "away", "from", "ostia", ".", "Each", "dot", "is", "value", "for", "one", "mouse", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "17", "mice", "/", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(C) Measurements of Tie2-pY992 intensity at intercellular junctions in aortic arch of mice shown in B. Mean ± SEM, n = 8 mice/group.(E) Fractional area occupied by Oil Red O-stained atheromas in aortic arch, brachiocephalic artery, at intercostal artery ostia, and away from ostia. Each dot is value for one mouse. Mean ± SEM, n = 17 mice/group."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "E", ")", "(", "left", ")", "Western", "blot", "of", "NANOG", ",", "OCT4", ",", "and", "SOX2", ".", "(", "right", ")", "Relative", "NANOG", "levels", "as", "estimated", "by", "densitometry", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "NANOG", "was", "nearly", "7", "-", "fold", "more", "in", "PD", ",", "which", "is", "twice", "that", "of", "2iL", "/", "SL2i", ".", "Data", "information", ":", "n", "≥", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "and", "ns", "=", "not", "significant", "(", "paired", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "of", "pERK", "and", "ERK", "at", "0", ",", "1", ",", "4", ",", "8", ",", "12", ",", "16", ",", "and", "24", "hrs", "after", "media", "change", "in", "indicated", "treatments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "G", ")", "Western", "blot", "of", "pERK", "and", "ERK", "in", "SLPD", ",", "SLCHIR", ",", "2iL", ",", "and", "SL2i", "after", "8", ",", "12", ",", "16", ",", "and", "24", "hrs", "of", "culture", "relative", "to", "SL", ",", "where", "the", "cells", "in", "SL", "were", "harvested", "24", "hrs", "after", "the", "media", "change", "(", "n", ">", "3", ")", ".", "(", "H", ")", "(", "left", ")", "Western", "blot", "of", "pERK", "and", "ERK", "in", "1μM", "PD", "and", "increasing", "concentrations", "of", "CHIR", "in", "serum", "-", "free", "N2B27", "media", ".", "(", "right", ")", "Relative", "pERK", "levels", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "I", ")", "(", "left", ")", "Western", "blot", "of", "pERK", "and", "ERK", "in", "3μM", "CHIR", "and", "increasing", "concentrations", "of", "PD", "in", "serum", "-", "free", "N2B27", "media", ".", "(", "right", ")", "Relative", "pERK", "levels", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "n", "≥", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "in", "H", ",", "and", "I", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "and", "ns", "=", "not", "significant", "(", "paired", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(E) (left) Western blot of NANOG, OCT4, and SOX2. (right) Relative NANOG levels as estimated by densitometry (n=8). NANOG was nearly 7-fold more in PD, which is twice that of 2iL/SL2i. Data information: n ≥ 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate). Data are presented as mean ± SEM *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 and ns = not significant (paired two-tailed student's t-test).(F) Western blot of pERK and ERK at 0, 1, 4, 8, 12, 16, and 24 hrs after media change in indicated treatments (n=3).(G) Western blot of pERK and ERK in SLPD, SLCHIR, 2iL, and SL2i after 8, 12, 16, and 24 hrs of culture relative to SL, where the cells in SL were harvested 24 hrs after the media change (n>3).(H) (left) Western blot of pERK and ERK in 1μM PD and increasing concentrations of CHIR in serum-free N2B27 media. (right) Relative pERK levels (n=3). (I) (left) Western blot of pERK and ERK in 3μM CHIR and increasing concentrations of PD in serum-free N2B27 media. (right) Relative pERK levels (n=6). Data information: n ≥ 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate). Data are presented as mean ± SEM in H, and I. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 and ns = not significant (paired two-tailed student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "G", ")", "(", "left", ")", "Western", "blot", "of", "pERK", "in", "TNERT", ",", "TNERTFgfr1", "-", "/", "-", ",", "TNERTFgfr2", "-", "/", "-", ",", "TNERTFgf4", "-", "/", "-", ",", "and", "TNERTFgfbp1", "-", "/", "-", "with", "or", "no", "OHT", ".", "(", "Right", ")", "relative", "pERK", "levels", "estimated", "by", "densitometry", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "n", "≥", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "in", "G", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "ns", "=", "not", "significant", "(", "paired", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(G) (left) Western blot of pERK in TNERT, TNERTFgfr1-/-, TNERTFgfr2-/-, TNERTFgf4-/-, and TNERTFgfbp1-/- with or no OHT. (Right) relative pERK levels estimated by densitometry (n=4). Data information: n ≥ 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate). Data are presented as mean ± SEM in G, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ns = not significant (paired two-tailed student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "E", ")", "Western", "blot", "of", "FGFR1", ",", "FGFR2", ",", "and", "pERK", "in", "TNERT", "at", "one", "-", "hour", "intervals", "at", "indicated", "time", "points", "after", "OHT", "treatment", "(", "n", ">", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(E) Western blot of FGFR1, FGFR2, and pERK in TNERT at one-hour intervals at indicated time points after OHT treatment (n>3)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "Western", "blot", "of", "pERK", "and", "ERK", "in", "TNERT", "and", "TNERTNono", "-", "/", "-", "cells", "treated", "with", "or", "no", "OHT", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "showing", "interactions", "between", "ERK", "and", "NONO", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Nanog", "induction", "by", "Doxycycline", "in", "TDiN", "cells", ".", "(", "E", ")", "(", "left", ")", "Western", "blot", "of", "pERK", "and", "ERK", "in", "E14Tg2a", "cells", "treated", "with", "PD", "or", "FGF4", ".", "(", "Middle", "and", "right", ")", "Relative", "levels", "of", "pERK", "and", "NONO", "in", "E14Tg2a", "cells", "treated", "with", "PD", "or", "FGF4", "(", "n", ">", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "n", "≥", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "in", "E", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "and", "ns", "=", "not", "significant", "(", "paired", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "L", ")", "Cycloheximide", "chase", "assay", "of", "NANOG", "in", "SL", ",", "SLPD", ",", "and", "SLFGF4", "in", "E14Tg2a", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) Western blot of pERK and ERK in TNERT and TNERTNono-/- cells treated with or no OHT (n=3).(D) Immunoprecipitation analysis showing interactions between ERK and NONO in the presence or absence of Nanog induction by Doxycycline in TDiN cells.(E) (left) Western blot of pERK and ERK in E14Tg2a cells treated with PD or FGF4. (Middle and right) Relative levels of pERK and NONO in E14Tg2a cells treated with PD or FGF4 (n>4). Data information: n ≥ 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate). Data are presented as mean ± SEM in E *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001 and ns = not significant (paired two-tailed student's t-test).(L) Cycloheximide chase assay of NANOG in SL, SLPD, and SLFGF4 in E14Tg2a cells."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "of", "pERK", "(", "red", ")", "and", "NANOG", "(", "green", ")", "in", "the", "indicated", "ESCs", ".", "Scale", "bars", "25", "μM", ".", "(", "B", ")", "The", "normalized", "fluorescence", "intensity", "of", "pERK", "was", "plotted", "against", "the", "normalized", "fluorescent", "intensity", "of", "NANOG", ".", "(", "C", ")", "(", "left", ")", "Immunofluorescence", "of", "pERK", "and", "NANOG", "in", "10", "%", "NANOG", "-", "high", "NiRFP2A", "cells", "at", "indicated", "time", "cultured", "in", "the", "same", "media", "collected", "from", "cells", "before", "FACS", ".", "(", "Right", ")", "The", "normalized", "fluorescence", "intensity", "of", "pERK", "was", "plotted", "against", "the", "normalized", "fluorescent", "intensity", "of", "NANOG", "at", "different", "time", "points", ".", "Scale", "bars", "25", "μM", ".", "(", "D", ")", "(", "left", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "pERK", ",", "and", "NANOG", "in", "10", "%", "NANOG", "-", "high", "NiRFP2A", "cells", "at", "indicated", "time", "cultured", "in", "the", "same", "media", "collected", "from", "cells", "before", "FAC", "sorting", ".", "(", "Right", ")", "Expression", "levels", "of", "NANOG", "and", "pERK", "in", "10", "%", "NANOG", "-", "high", "NiRFP2A", "cells", "relative", "to", "0", "hrs", "during", "the", "time", "course", "of", "culture", ".", "The", "NANOG", "and", "pERK", "expression", "oscillate", "between", "high", "and", "low", "levels", "in", "the", "cells", "during", "culture", ".", "Data", "information", ":", "n", "≥", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "in", "D", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "ns", "=", "not", "significant", "(", "paired", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Immunofluorescence of pERK (red) and NANOG (green) in the indicated ESCs. Scale bars 25 μM. (B)The normalized fluorescence intensity of pERK was plotted against the normalized fluorescent intensity of NANOG.(C) (left) Immunofluorescence of pERK and NANOG in 10% NANOG-high NiRFP2A cells at indicated time cultured in the same media collected from cells before FACS. (Right) The normalized fluorescence intensity of pERK was plotted against the normalized fluorescent intensity of NANOG at different time points. Scale bars 25 μM.(D) (left) Western blot analysis of pERK, and NANOG in 10% NANOG-high NiRFP2A cells at indicated time cultured in the same media collected from cells before FAC sorting. (Right) Expression levels of NANOG and pERK in 10% NANOG-high NiRFP2A cells relative to 0 hrs during the time course of culture. The NANOG and pERK expression oscillate between high and low levels in the cells during culture. Data information: n ≥ 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate). Data are presented as mean ± SEM in D. *P < 0.05, **P < 0.01 and ns = not significant (paired two-tailed student's t-test). "}
{"words": ["Figure", "2", ".", "ACE2", "-", "Ig", "potently", "neutralizes", "viruses", "pseudotyped", "with", "S", "glycoproteins", "from", "the", "SARS", "CoV", "and", "2019", "nCoV", ".", "HIVs", "pseudotyped", "with", "the", "S", "glycoprotein", "from", "CoVs", "were", "incubated", "with", "different", "fusion", "proteins", "for", "1", "h", "before", "infection", ".", "Luciferase", "activities", "in", "target", "cells", "were", "measured", ",", "and", "the", "percent", "neutralization", "was", "calculated", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.ACE2-Ig potently neutralizes viruses pseudotyped with S glycoproteins from the SARS CoV and 2019 nCoV.HIVs pseudotyped with the S glycoprotein from CoVs were incubated with different fusion proteins for 1 h before infection. Luciferase activities in target cells were measured, and the percent neutralization was calculated."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "Inhibition", "of", "cell", "fusion", "by", "ACE2", "-", "Ig", ".", "Potent", "inhibition", "of", "cell", "fusion", "mediated", "by", "the", "SARS", "-", "CoV", "(", "left", ")", "or", "2019", "nCoV", "(", "right", ")", "spike", "(", "S", ")", "glycoprotein", ".", "Cells", "expressing", "diffferent", "S", "glycoprotein", "were", "incubated", "with", "indicated", "fusion", "proteins", "and", "mixed", "with", "ACE2", "-", "expressing", "cells", ".", "The", "activity", "of", "the", "reporter", "gene", ",", "β", "-", "gal", ",", "was", "measured", "as", "a", "correlate", "of", "fusion", ".", "The", "curves", "represent", "the", "best", "fit", "to", "the", "experimental", "data", "and", "were", "used", "for", "calculation", "of", "the", "IC50", ".", "Bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.Inhibition of cell fusion by ACE2-Ig.Potent inhibition of cell fusion mediated by the SARS-CoV (left) or 2019 nCoV (right) spike (S) glycoprotein. Cells expressing diffferent S glycoprotein were incubated with indicated fusion proteins and mixed with ACE2-expressing cells. The activity of the reporter gene, β-gal, was measured as a correlate of fusion. The curves represent the best fit to the experimental data and were used for calculation of the IC50. Bars indicate the S.E."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "in", "various", "mitotic", "stages", ".", "Cells", "were", "extracted", ",", "fixed", ",", "and", "co", "-", "stained", "for", "Cyclin", "B2", "(", "green", ")", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "that", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "Cyclin", "B2", "(", "green", ")", ",", "mAb414", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "an", "indicated", "siRNA", "Cells", "were", "extracted", ",", "fixed", ",", "and", "co", "-", "stained", "for", "Cyclin", "B2", "(", "green", ")", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "an", "indicated", "various", "drugs", "(", "E", ")", ".", "Cells", "were", "extracted", ",", "fixed", ",", "and", "co", "-", "stained", "for", "Cyclin", "B2", "(", "green", ")", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "(", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "synchronized", "by", "double", "thymidine", ",", "then", "released", "and", "collected", "at", "selected", "time", "points", ".", "Cell", "lysate", "samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Cyclin", "B1", "antibody", ",", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "antibody", ",", "or", "anti", "-", "β", "-", "Actin", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Representative immunofluorescence images of HeLa cells in various mitotic stages. Cells were extracted, fixed, and co-stained for Cyclin B2 (green), ACA (red), and DNA (blue). Scale bar, 10 µm.(C) Representative immunofluorescence images of HeLa cells that were fixed and co-stained for Cyclin B2 (green), mAb414 (red), and DNA (blue). Scale bar, 10 µm.Representative immunofluorescence images of HeLa cells treated with an indicated siRNA Cells were extracted, fixed, and co-stained for Cyclin B2 (green), ACA (red), and DNA (blue).Representative immunofluorescence images of HeLa cells treated with an indicated various drugs (E). Cells were extracted, fixed, and co-stained for Cyclin B2 (green), ACA (red), and DNA (blue).(F) HeLa cells were synchronized by double thymidine, then released and collected at selected time points. Cell lysate samples were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Cyclin B1 antibody, anti-Cyclin B2 antibody, or anti-β-Actin antibody."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Immunoprecipitation", "assay", "performed", "with", "two", "different", "rabbit", "Cyclin", "B2", "antibodies", ".", "Nocodazole", "-", "arrested", "mitotic", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", ".", "Immunoprecipitation", "was", "accomplished", "using", "control", "IgG", ",", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "-", "1", "(", "Abcam", ",", "ab185622", ")", ",", "and", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "-", "2", "(", "Proteintech", ",", "21644", "-", "1", "-", "AP", ")", ".", "Immunoprecipitation", "samples", "were", "resolved", "by", "Western", "blotting", "using", "a", "mouse", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "antibody", "(", "Santa", "Cruz", ",", "sc", "-", "28303", ")", "and", "a", "mouse", "anti", "-", "Mad2", "antibody", "(", "Santa", "Cruz", ",", "sc", "-", "47747", ")", "(", "C", "and", "D", ")", "Flag", "immunoprecipitation", "assay", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Flag", "-", "C", "-", "Mad2", "and", "GFP", "-", "Cyclin", "B1", "/", "B2", "(", "C", ")", ",", "and", "with", "Flag", "-", "Mad1", "-", "1", "-", "215", "and", "GFP", "-", "Cyclin", "B1", "/", "B2", "(", "D", ")", ".", "After", "36", "h", ",", "the", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", ",", "and", "immunoprecipitation", "was", "accomplished", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "Immunoprecipitates", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "anti", "-", "GFP", "antibody", "(", "E", ")", "GST", "pulldown", "assay", ".", "Purified", "GST", ",", "GST", "-", "Cyclin", "B1", "-", "165", "-", "433", ",", "and", "GST", "-", "Cyclin", "B2", "-", "130", "-", "398", "-", "bound", "agarose", "beads", "were", "used", "as", "affinity", "matrices", "to", "absorb", "purified", "Trx", "-", "6", "×", "His", "-", "tagged", "C", "-", "Mad2", "recombinant", "protein", ".", "Absorbed", "proteins", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "Coomassie", "Brilliant", "Blue", "staining", "(", "F", "-", "I", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "(", "F", ")", "or", "GFP", "-", "Cyclin", "B1", "(", "H", ")", ".", "The", "cells", "were", "transfected", "with", "siControl", "or", "siMad2", "for", "36", "h", "followed", "by", "treatment", "with", "nocodazole", "plus", "MG132", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "Mad2", "(", "red", ")", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Scatter", "graphs", "illustrating", "kinetochore", "intensity", "of", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "(", "G", ")", "or", "GFP", "-", "Cyclin", "B1", "(", "I", ")", "in", "cells", "treated", "as", "in", "F", "and", "H", ",", "respectively", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "kinetochore", "intensity", "(", "±", "SD", ")", "normalized", "to", "values", "of", "the", "siControl", "group", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", "(", "≥", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Immunoprecipitation assay performed with two different rabbit Cyclin B2 antibodies. Nocodazole-arrested mitotic cells were collected and lysed. Immunoprecipitation was accomplished using control IgG, anti-Cyclin B2-1 (Abcam, ab185622), and anti-Cyclin B2-2 (Proteintech, 21644-1-AP). Immunoprecipitation samples were resolved by Western blotting using a mouse anti-Cyclin B2 antibody ( Santa Cruz, sc-28303) and a mouse anti-Mad2 antibody (Santa Cruz, sc-47747)(C and D) Flag immunoprecipitation assay. 293T cells were co-transfected with Flag-C-Mad2 and GFP-Cyclin B1/B2 (C), and with Flag-Mad1-1-215 and GFP-Cyclin B1/B2 (D). After 36 h, the cells were collected and lysed, and immunoprecipitation was accomplished with anti-Flag M2 beads. Immunoprecipitates were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Flag antibody and anti-GFP antibody(E) GST pulldown assay. Purified GST, GST-Cyclin B1-165-433, and GST-Cyclin B2-130-398-bound agarose beads were used as affinity matrices to absorb purified Trx-6×His-tagged C-Mad2 recombinant protein. Absorbed proteins were analyzed by SDS-PAGE and Coomassie Brilliant Blue staining(F-I) Representative immunofluorescence images of HeLa cells stably expressing GFP-Cyclin B2 (F) or GFP-Cyclin B1 (H). The cells were transfected with siControl or siMad2 for 36 h followed by treatment with nocodazole plus MG132 for 2 h. Then cells were fixed and co-stained for Mad2 (red) and DNA (blue). Scale bar, 10 µm. Scatter graphs illustrating kinetochore intensity of GFP-Cyclin B2 (G) or GFP-Cyclin B1 (I) in cells treated as in F and H, respectively. Bars represent the mean kinetochore intensity (±SD) normalized to values of the siControl group. Each dot represents one cell (≥30 cells from three independent experiments)"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Flag", "immunoprecipitation", "assay", ".", "Flag", "-", "tagged", "Cyclin", "B2", "-", "WT", ",", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ",", "or", "Cyclin", "B1", "were", "expressed", "in", "293T", "cells", "and", "purified", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "Subsequently", ",", "the", "beads", "were", "incubated", "with", "mitotic", "HeLa", "lysates", "for", "2", "h", ",", "and", ",", "following", "extensive", "washes", ",", "immunoprecipitatates", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "anti", "-", "Mad2", "antibody", ".", "(", "C", ")", "Flag", "immunoprecipitation", "assay", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Flag", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "Flag", "-", "Cyclin", "B2", "-", "4A", "together", "with", "GFP", "(", "negative", "control", ")", "and", "GFP", "-", "CDK1", ".", "After", "36", "h", ",", "the", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", ",", "and", "immunoprecipitation", "was", "accomplished", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "Immunoprecipitation", "samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "GFP", "antibody", "and", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "(", "D", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ".", "After", "36", "h", "of", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "ACA", "(", "red", ")", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "(", "E", ")", "Scatter", "graphs", "illustrating", "kinetochore", "intensity", "of", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "/", "4A", "treated", "as", "in", "D", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "kinetochore", "intensity", "(", "±", "SD", ")", "normalized", "to", "the", "values", "of", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", "(", "≥", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Flag immunoprecipitation assay. Flag-tagged Cyclin B2-WT, Cyclin B2-4A, or Cyclin B1 were expressed in 293T cells and purified with anti-Flag M2 beads. Subsequently, the beads were incubated with mitotic HeLa lysates for 2 h, and, following extensive washes, immunoprecipitatates were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Flag antibody and anti-Mad2 antibody.(C) Flag immunoprecipitation assay. 293T cells were co-transfected with Flag-Cyclin B2-WT or Flag-Cyclin B2-4A together with GFP (negative control) and GFP-CDK1. After 36 h, the cells were collected and lysed, and immunoprecipitation was accomplished with anti-Flag M2 beads. Immunoprecipitation samples were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-GFP antibody and anti-Flag antibody.(D) Representative immunofluorescence images of HeLa cells transfected with GFP-Cyclin B2-WT or GFP-Cyclin B2-4A. After 36 h of transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained for ACA (red) and DNA (blue). (E) Scatter graphs illustrating kinetochore intensity of GFP-Cyclin B2-WT/4A treated as in D. Bars represent the mean kinetochore intensity (±SD) normalized to the values of GFP-Cyclin B2-WT. Each dot represents one cell (≥30 cells from three independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siControl", "or", "siCyclin", "B2", ".", "At", "36", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", ".", "The", "samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "antibody", ",", "anti", "-", "Cyclin", "B1", "antibody", ",", "and", "anti", "-", "tubulin", "antibody", "(", "B", ")", "Representative", "stills", "illustrating", "mitotic", "progression", "in", "mCherry", "-", "H2B", "expressed", "cells", "treated", "with", "Control", "siRNA", "or", "Cyclin", "B2", "siRNA", ".", "Images", "were", "acquired", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "the", "start", "of", "NEBD", ".", "The", "arrow", "indicates", "lagging", "chromosomes", "(", "C", ")", "Bar", "graph", "illustrating", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "normal", "anaphase", "or", "with", "anaphase", "lagging", "chromosomes", "in", "cells", "treated", "as", "in", "B", ".", "Bars", "are", "means", "±", "SD", "(", "≥", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", "(", "D", ")", "Scatter", "graph", "of", "the", "time", "from", "NEBD", "to", "the", "beginning", "of", "anaphase", "in", "cells", "treated", "as", "in", "B", "(", "n", "=", "30", "cells", ")", "(", "E", ")", "Representative", "stills", "illustrating", "mitotic", "progression", "in", "mCherry", "-", "H2B", "expressed", "cells", "depleted", "of", "endogenous", "Cyclin", "B2", "and", "rescued", "with", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ".", "Images", "were", "acquired", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "the", "start", "of", "NEBD", "(", "F", ")", "Bar", "graph", "illustrating", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "normal", "anaphase", "and", "cells", "with", "anaphase", "lagging", "chromosomes", "in", "cells", "treated", "as", "in", "E", ".", "Bars", "are", "means", "±", "SD", "(", "≥", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) HeLa cells were transfected with siControl or siCyclin B2. At 36 h after transfection, cells were collected and lysed. The samples were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Cyclin B2 antibody, anti-Cyclin B1 antibody, and anti-tubulin antibody(B) Representative stills illustrating mitotic progression in mCherry-H2B expressed cells treated with Control siRNA or Cyclin B2 siRNA. Images were acquired at the indicated time points after the start of NEBD. The arrow indicates lagging chromosomes(C) Bar graph illustrating the percentage of cells with normal anaphase or with anaphase lagging chromosomes in cells treated as in B. Bars are means ±SD (≥30 cells from three independent experiments)(D) Scatter graph of the time from NEBD to the beginning of anaphase in cells treated as in B (n = 30 cells)(E) Representative stills illustrating mitotic progression in mCherry-H2B expressed cells depleted of endogenous Cyclin B2 and rescued with GFP-Cyclin B2-WT or GFP-Cyclin B2-4A. Images were acquired at the indicated time points after the start of NEBD(F) Bar graph illustrating the percentage of cells with normal anaphase and cells with anaphase lagging chromosomes in cells treated as in E. Bars are means ±SD (≥30 cells from three independent experiments)"}
{"words": ["Figure", "5Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siControl", "or", "siCyclin", "B2", ".", "After", "36", "h", "of", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "Mad2", "(", "green", ")", "in", "D", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "siCyclin", "B2", "plus", "GFP", "-", "tagged", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ".", "At", "36", "h", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "Mad2", "(", "red", ")", "in", "DNA", "(", "blue", ")", "Scatter", "graphs", "illustrating", "kinetochore", "intensity", "of", "Mad2", "(", "cells", "treated", "as", "in", "A", "and", "B", "Bars", "represent", "the", "mean", "kinetochore", "intensity", "(", "±", "SD", ")", "normalized", "to", "the", "values", "of", "the", "siControl", "groupRepresentative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siControl", "or", "siCyclin", "B2", ".", "After", "36", "h", "of", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "fo", "Cdc20", "(", "green", ")", "in", "D", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", "E", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "siCyclin", "B2", "plus", "GFP", "-", "tagged", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ".", "At", "36", "h", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "fo", "Cdc20", "(", "red", ")", "in", "E", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", "Scatter", "graphs", "illustrating", "kinetochore", "intensity", "o", "Cdc20", "(", "F", ",", "cells", "treated", "as", "in", "D", "and", "E", ")", "Bars", "represent", "the", "mean", "kinetochore", "intensity", "(", "±", "SD", ")", "normalized", "to", "the", "values", "of", "the", "siControl", "group", "(", "G", ")", "Bar", "graph", "illustrating", "the", "mitotic", "index", "in", "cells", "treated", "with", "low", "concentrations", "of", "nocodazole", "for", "12", "h", "(", "H", ")", "Immunoprecipitation", "assay", "performed", "with", "Cdc20", "antibody", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siControl", "or", "siCyclin", "B2", ".", "At", "36", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "arrested", "in", "mitosis", ",", "collected", ",", "and", "lysed", ".", "Cell", "lysates", "were", "incubated", "with", "Protein", "A", "/", "G", "beads", "bound", "with", "Cdc20", "antibody", ".", "Following", "extensive", "washes", ",", "immunoprecipitates", "were", "resolved", "by", "SAS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Cdc20", ",", "anti", "-", "BubR1", ",", "anti", "-", "Bub3", ",", "and", "anti", "-", "Mad2"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative immunofluorescence images of HeLa cells transfected with siControl or siCyclin B2. After 36 h of transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained for Mad2 (green) in D, ACA (red), and DNA (blue) Representative immunofluorescence images of HeLa cells co-transfected with siCyclin B2 plus GFP-tagged Cyclin B2-WT or Cyclin B2-4A. At 36 h post-transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained for Mad2 (red) in DNA (blue)Scatter graphs illustrating kinetochore intensity of Mad2 ( cells treated as in A and B Bars represent the mean kinetochore intensity (±SD) normalized to the values of the siControl groupRepresentative immunofluorescence images of HeLa cells transfected with siControl or siCyclin B2. After 36 h of transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained fo Cdc20 (green) in D, ACA (red), and DNA (blue) E) Representative immunofluorescence images of HeLa cells co-transfected with siCyclin B2 plus GFP-tagged Cyclin B2-WT or Cyclin B2-4A. At 36 h post-transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained fo Cdc20 (red) in E, and DNA (blue)Scatter graphs illustrating kinetochore intensity o Cdc20 (F, cells treated as in D and E) Bars represent the mean kinetochore intensity (±SD) normalized to the values of the siControl group(G) Bar graph illustrating the mitotic index in cells treated with low concentrations of nocodazole for 12 h(H) Immunoprecipitation assay performed with Cdc20 antibody. HeLa cells were transfected with siControl or siCyclin B2. At 36 h after transfection, cells were arrested in mitosis, collected, and lysed. Cell lysates were incubated with Protein A/G beads bound with Cdc20 antibody. Following extensive washes, immunoprecipitates were resolved by SAS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Cdc20, anti-BubR1, anti-Bub3, and anti-Mad2 antibodies"}
{"words": ["Figure", "1Presence", "of", "TOC", "proteins", "in", "the", "central", "vacuole", "of", "protoplasts", ".", "Arabidopsis", "protoplasts", "expressing", "the", "YFP", "-", "tagged", "chloroplast", "proteins", "were", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", "following", "ConA", "treatment", "for", "four", "hours", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "A", ")", ".", "Chlorophyll", "autofluorescence", "was", "used", "to", "determine", "the", "localization", "of", "the", "YFP", "fluorescence", "signals", "relative", "to", "the", "chloroplasts", ".", "Signals", "for", "SP1", "-", "YFP", "and", "FAX1", "-", "YFP", ",", "which", "here", "are", "control", "proteins", ",", "were", "only", "present", "at", "the", "chloroplast", "envelope", ".", "Accumulation", "of", "YFP", "puncta", "in", "the", "central", "vacuole", "is", "indicated", "by", "the", "arrowheads", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Presence", "of", "TOC", "proteins", "in", "the", "central", "vacuole", "of", "Arabidopsis", "leaf", "and", "hypocotyl", "cells", ".", "Eight", "-", "day", "-", "old", "transgenic", "Arabidopsis", "seedlings", "stably", "expressing", "pToc33", ":", "YFP", "-", "Toc33", "or", "pToc75", ":", "YFP", "-", "Toc75", "were", "treated", "with", "ConA", "for", "two", "days", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Accumulation", "of", "YFP", "puncta", "in", "the", "central", "vacuole", "is", "indicated", "by", "the", "arrowheads", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Presence of TOC proteins in the central vacuole of protoplasts. Arabidopsis protoplasts expressing the YFP-tagged chloroplast proteins were analyzed by confocal microscopy following ConA treatment for four hours. Representative images are shown (A). Chlorophyll autofluorescence was used to determine the localization of the YFP fluorescence signals relative to the chloroplasts. Signals for SP1-YFP and FAX1-YFP, which here are control proteins, were only present at the chloroplast envelope. Accumulation of YFP puncta in the central vacuole is indicated by the arrowheads. Scale bar, 10 μm.Presence of TOC proteins in the central vacuole of Arabidopsis leaf and hypocotyl cells. Eight-day-old transgenic Arabidopsis seedlings stably expressing pToc33:YFP-Toc33 or pToc75:YFP-Toc75 were treated with ConA for two days, and then analyzed by confocal microscopy. Accumulation of YFP puncta in the central vacuole is indicated by the arrowheads. Scale bar, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "2Lack", "of", "TOC", "proteins", "in", "the", "central", "vacuole", "of", "atg7", "-", "2", "mutant", "hypocotyl", "cells", ".", "Eight", "-", "day", "-", "old", "transgenic", "Arabidopsis", "seedlings", "stably", "expressing", "pToc33", ":", "YFP", "-", "Toc33", "and", "pToc75", ":", "YFP", "-", "Toc75", "in", "the", "atg7", "-", "2", "mutant", "background", "were", "treated", "with", "ConA", "for", "two", "days", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Note", "that", "YFP", "-", "Toc33", "and", "YFP", "-", "Toc75", "bodies", "(", "arrowheads", ")", "were", "retained", "at", "plastid", "bridges", "and", "extensions", ",", "and", "not", "released", "into", "the", "vacuole", ",", "as", "occurs", "in", "the", "WT", "background", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Autophagy", "inhibition", "affected", "accumulation", "of", "TOC", "proteins", ".", "Eight", "-", "day", "-", "old", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "atg7", "-", "2", "plants", "were", "treated", "respectively", "with", "proteasome", "inhibitor", ",", "bortezomib", "(", "Btz", ")", ",", "cysteine", "protease", "inhibitor", ",", "E64d", ",", "or", "DMSO", "(", "Mock", ")", "for", "one", "day", ".", "Total", "protein", "extracts", "from", "these", "plants", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Actin", "acted", "as", "a", "loading", "control", ".", "Typical", "immunoblotting", "results", "are", "shown", "(", "B", ")", ".", "In", "B", ",", "the", "arrowhead", "indicates", "full", "-", "length", "Toc159", ",", "and", "the", "hollow", "arrow", "indicates", "a", "truncated", "form", "of", "Toc159", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "sizes", "in", "kD", ")", "are", "indicated", "to", "the", "right", "of", "the", "images", ".", "Autophagy", "inhibition", "affected", "accumulation", "of", "TOC", "proteins", ".", "Eight", "-", "day", "-", "old", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "atg7", "-", "2", "plants", "were", "treated", "respectively", "with", "proteasome", "inhibitor", ",", "bortezomib", "(", "Btz", ")", ",", "cysteine", "protease", "inhibitor", ",", "E64d", ",", "or", "DMSO", "(", "Mock", ")", "for", "one", "day", ".", "Band", "intensities", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "equivalent", "data", "for", "Actin", "(", "C", ")", ".", "Data", "are", "means", "±", "SEM", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "Asterisks", "in", "C", "indicate", "significance", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ",", "significant", "at", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "significant", "at", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Lack of TOC proteins in the central vacuole of atg7-2 mutant hypocotyl cells. Eight-day-old transgenic Arabidopsis seedlings stably expressing pToc33:YFP-Toc33 and pToc75:YFP-Toc75 in the atg7-2 mutant background were treated with ConA for two days, and then analyzed by confocal microscopy. Note that YFP-Toc33 and YFP-Toc75 bodies (arrowheads) were retained at plastid bridges and extensions, and not released into the vacuole, as occurs in the WT background Scale bar, 10 μm.Autophagy inhibition affected accumulation of TOC proteins. Eight-day-old wild-type (WT) and atg7-2 plants were treated respectively with proteasome inhibitor, bortezomib (Btz), cysteine protease inhibitor, E64d, or DMSO (Mock) for one day. Total protein extracts from these plants were analyzed by immunoblotting using antibodies as indicated. Actin acted as a loading control. Typical immunoblotting results are shown (B). In B, the arrowhead indicates full-length Toc159, and the hollow arrow indicates a truncated form of Toc159. Molecular weight markers (sizes in kD) are indicated to the right of the images.Autophagy inhibition affected accumulation of TOC proteins. Eight-day-old wild-type (WT) and atg7-2 plants were treated respectively with proteasome inhibitor, bortezomib (Btz), cysteine protease inhibitor, E64d, or DMSO (Mock) for one day. Band intensities were quantified and normalized to equivalent data for Actin (C). Data are means ± SEM from three biological replicates. Asterisks in C indicate significance according to an unpaired two-tailed Student's t-test (*, significant at P < 0.05; **, significant at P < 0.01)."}
{"words": ["Figure", "3Presence", "of", "autophagosome", "in", "the", "chloroplast", "envelope", ".", "Arabidopsis", "protoplasts", "expressing", "free", "YFP", "and", "YFP", "-", "ATG8", "(", "autophagosome", "marker", ")", "were", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Corresponding", "chlorophyll", "autofluorescence", "images", "were", "employed", "to", "orientate", "the", "YFP", "signal", "in", "relation", "to", "the", "chloroplasts", ".", "For", "eliminating", "interference", "from", "cytosolic", "signals", ",", "intact", "protoplasts", "(", "upper", "panels", ")", "were", "ruptured", "using", "10", "-", "μm", "nylon", "mesh", "to", "isolate", "the", "chloroplasts", ".", "Retention", "of", "YFP", "signals", "in", "association", "with", "chloroplasts", "upon", "rupturing", "the", "cell", "(", "lower", "panels", ")", "clearly", "indicated", "that", "the", "YFP", "-", "ATG8", "was", "associated", "with", "chloroplasts", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "A", ")", ".", "whole", "protein", "samples", "of", "protoplasts", "and", "purified", "chloroplasts", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", ",", "using", "antibodies", "against", "the", "YFP", "tag", "and", "Tic110", "(", "a", "chloroplast", "marker", ")", ".", "Typical", "immunoblotting", "results", "are", "shown", "(", "B", ")", ".", "Presence", "of", "NBR1", "-", "HA", "in", "chloroplast", "fraction", ".", "The", "protoplasts", "were", "isolated", "from", "four", "-", "week", "-", "old", "transgenic", "Arabidopsis", "plants", "stably", "expressing", "p35S", ":", "NBR1", "-", "HA", "(", "NBR1", "-", "HA", ")", "and", "p35S", ":", "YFP", "-", "HA", "(", "YFP", "-", "HA", ")", ",", "followed", "by", "chloroplast", "purification", ",", "respectively", ".", "Protein", "samples", "of", "whole", "protoplasts", "and", "isolated", "chloroplasts", "of", "NBR1", "-", "HA", "and", "YFP", "-", "HA", "were", "then", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", ",", "using", "antibodies", "against", "the", "HA", "tag", "and", "Tic40", ".", "Typical", "immunoblotting", "results", "are", "shown", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Presence of autophagosome in the chloroplast envelope. Arabidopsis protoplasts expressing free YFP and YFP-ATG8 (autophagosome marker) were analyzed by confocal microscopy. Corresponding chlorophyll autofluorescence images were employed to orientate the YFP signal in relation to the chloroplasts. For eliminating interference from cytosolic signals, intact protoplasts (upper panels) were ruptured using 10-μm nylon mesh to isolate the chloroplasts. Retention of YFP signals in association with chloroplasts upon rupturing the cell (lower panels) clearly indicated that the YFP-ATG8 was associated with chloroplasts. Representative images are shown (A).whole protein samples of protoplasts and purified chloroplasts were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting, using antibodies against the YFP tag and Tic110 (a chloroplast marker). Typical immunoblotting results are shown (B).Presence of NBR1-HA in chloroplast fraction. The protoplasts were isolated from four-week-old transgenic Arabidopsis plants stably expressing p35S:NBR1-HA (NBR1-HA) and p35S:YFP-HA (YFP-HA), followed by chloroplast purification, respectively. Protein samples of whole protoplasts and isolated chloroplasts of NBR1-HA and YFP-HA were then analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting, using antibodies against the HA tag and Tic40. Typical immunoblotting results are shown (G)."}
{"words": ["Figure", "4BiFC", "results", "showed", "interaction", "between", "NBR1", "and", "TOC", "proteins", ".", "cYFP", "and", "nYFP", "refer", "to", "C", "-", "terminal", "YFP", "fragment", "and", "N", "-", "terminal", "YFP", "fragment", ",", "respectively", ".", "Reconstitution", "of", "YFP", "fluorescence", "was", "assessed", "after", "transient", "coexpression", "of", "the", "indicated", "pairs", "of", "fusion", "proteins", ".", "CDKA1", "and", "OEP7", "were", "used", "as", "negative", "controls", "for", "OEM", "and", "cytosolic", "proteins", ",", "respectively", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "­", "The", "frequency", "of", "protoplasts", "showing", "a", "BiFC", "signal", "in", "C", "was", "quantified", ".", "All", "data", "are", "means", "±", "SEM", "from", "three", "experiments", ".", "NBR1", "coimmunoprecipitated", "with", "TOC", "proteins", ".", "Proteins", "were", "extracted", "from", "eight", "­", "-", "day", "-", "old", "transgenic", "Arabidopsis", "seedlings", "stably", "expressing", "p35S", ":", "NBR1", "-", "HA", "or", "p35S", ":", "NBR1", "-", "ΔUBA", "-", "HA", ",", "or", "control", "seedlings", "only", "expressing", "p35S", ":", "YFP", "-", "HA", ",", "following", "UVB", "treatment", "for", "four", "hours", ".", "Obtained", "protein", "extract", "was", "analyzed", "by", "IP", "using", "anti", "-", "HA", "resin", ",", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "of", "four", "endogenous", "proteins", "or", "HA", "-", "tagged", "proteins", ".", "Tic40", "acted", "as", "negative", "controls", ".", "The", "asterisks", "indicate", "nonspecific", "cross", "-", "reacting", "bands", ".", "Arrow", "indicates", "the", "NBR1", "-", "HA", "band", ".", "The", "arrowhead", "indicates", "full", "-", "length", "Toc159", "protein", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "sizes", "in", "kD", ")", "are", "indicated", "to", "the", "right", "of", "the", "images", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4BiFC results showed interaction between NBR1 and TOC proteins. cYFP and nYFP refer to C-terminal YFP fragment and N-terminal YFP fragment, respectively. Reconstitution of YFP fluorescence was assessed after transient coexpression of the indicated pairs of fusion proteins. CDKA1 and OEP7 were used as negative controls for OEM and cytosolic proteins, respectively. Representative images are shown. Scale bars, 10 μm.­ The frequency of protoplasts showing a BiFC signal in C was quantified. All data are means ± SEM from three experiments.NBR1 coimmunoprecipitated with TOC proteins. Proteins were extracted from eight­-day-old transgenic Arabidopsis seedlings stably expressing p35S:NBR1-HA or p35S: NBR1-ΔUBA-HA, or control seedlings only expressing p35S:YFP-HA, following UVB treatment for four hours. Obtained protein extract was analyzed by IP using anti-HA resin, and analyzed by immunoblotting of four endogenous proteins or HA-tagged proteins. Tic40 acted as negative controls. The asterisks indicate nonspecific cross-reacting bands. Arrow indicates the NBR1-HA band. The arrowhead indicates full-length Toc159 protein. Molecular weight markers (sizes in kD) are indicated to the right of the images."}
{"words": ["Figure", "5Phenotypes", "of", "seedlings", "under", "UVB", "stress", ".", "Briefly", ",", "eight", "-", "day", "-", "old", "WT", ",", "atg7", "-", "2", ",", "nbr1", "-", "2", "and", "NBR1", "-", "OX", "(", "overexpressor", ")", "seedlings", "grown", "under", "normal", "condition", "were", "subjected", "to", "UVB", "stress", ",", "with", "UVB", "treatment", "for", "3", "hours", "and", "recovery", "for", "7", "days", ".", "Representative", "plant", "images", "(", "A", ")", "and", "total", "chlorophyll", "content", "values", "(", "B", ")", "are", "shown", ";", "the", "latter", "provide", "a", "convenient", "metric", "for", "biomass", ".", "The", "chlorophyll", "values", "for", "the", "mutants", "and", "overexpressor", "plants", "were", "statistically", "significantly", "different", "from", "that", "for", "the", "WT", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ";", "*", ",", "significant", "at", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ",", "significant", "at", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "TOC", "protein", "levels", "were", "regulated", "by", "autophagy", "in", "response", "to", "short", "-", "term", "UVB", "stress", ".", "Eight", "-", "day", "-", "old", "plants", "of", "indicated", "genotypes", "were", "subjected", "to", "UVB", "stress", "for", "the", "indicated", "times", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "10", "μg", "total", "protein", "extract", "loaded", "per", "lane", "(", "C", ",", "upper", ")", ".", "Coomassie", "staining", "indicated", "that", "the", "treatments", "did", "not", "change", "the", "overall", "protein", "profile", "(", "C", ",", "lower", ")", ".", "Band", "intensities", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "equivalent", "Actin", "data", "(", "D", ")", "Time", "0", "was", "taken", "as", "100", "%", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "revealed", "that", "the", "Toc159", "protein", "level", "in", "nbr1", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "NBR1", "-", "OX", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "the", "Toc75", "protein", "level", "in", "atg7", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "nbr1", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "and", "NBR1", "-", "OX", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "and", "the", "Toc33", "protein", "level", "in", "atg7", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "nbr1", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "and", "NBR1", "-", "OX", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "were", "significantly", "different", "from", "levels", "in", "the", "WT", "at", "the", "time", "of", "1", "d", "recovery", "from", "UVB", "stress", ".", "Toc159", "was", "modified", "by", "both", "K48", "and", "K63", "ubiquitin", "linkage", "types", ".", "Eight", "-", "day", "-", "old", "WT", "plants", "were", "grown", "under", "normal", "growth", "condition", "(", "-", ")", ",", "or", "subjected", "to", "UVB", "stress", "(", "+", ")", ",", "with", "UVB", "treatment", "for", "four", "hours", ".", "The", "protein", "extract", "from", "the", "plants", "was", "analyzed", "by", "IP", "using", "native", "Toc159", "antibody", ",", "or", "its", "preimmune", "serum", "as", "a", "negative", "control", ",", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "antibodies", "as", "indicated", "to", "the", "left", "of", "the", "images", "(", "E", ")", ".", "Tic40", "acted", "as", "a", "negative", "control", ".", "The", "asterisk", "indicates", "a", "truncated", "Toc159", "form", "without", "A", "domain", "Molecular", "weight", "markers", "(", "sizes", "in", "kD", ")", "are", "indicated", "to", "the", "right", "of", "the", "images", ".", "Please", "note", "that", "ubiquitin", "antibodies", "tend", "to", "produce", "stronger", "signals", "for", "hyper", "-", "ubiquitinated", "species", "than", "for", "hypo", "-", "ubiquitinated", "or", "mono", "-", "ubiquitinated", "species", "(", "based", "on", "the", "number", "of", "epitopes", ")", ",", "which", "contrasts", "with", "the", "behaviour", "of", "the", "Toc159", "antibody", ".", "Thus", ",", "the", "signals", "of", "the", "two", "antibodies", "are", "not", "expected", "to", "fully", "overlap", ".", "Poly", "-", "ubiquitinated", "Toc159", "may", "not", "be", "detected", "by", "the", "Toc159", "antibody", "due", "to", "the", "much", "lower", "abundance", "of", "these", "species", "compared", "with", "the", "mono", "-", "ubiquitinated", "or", "unmodified", "forms", ".", "This", "is", "why", "the", "poly", "-", "Ub", "K48", "and", "K63", "signals", "appear", "at", "higher", "molecular", "weight", "positions", "than", "the", "Toc159", "signals", ".", "Relative", "Toc159", "amounts", "modified", "by", "K48", "or", "K63", "ubiquitin", "linkage", "in", "plants", "with", "or", "without", "UVB", "stress", "were", "assessed", "by", "quantifying", "the", "smeary", "band", "intensity", "of", "the", "IP", "samples", "in", "α", "-", "K48", "or", "α", "-", "K63", "blots", "(", "F", ")", ".", "All", "data", "are", "means", "±", "SEM", "from", "three", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Phenotypes of seedlings under UVB stress. Briefly, eight-day-old WT, atg7-2, nbr1-2 and NBR1-OX (overexpressor) seedlings grown under normal condition were subjected to UVB stress, with UVB treatment for 3 hours and recovery for 7 days. Representative plant images (A) and total chlorophyll content values (B) are shown; the latter provide a convenient metric for biomass. The chlorophyll values for the mutants and overexpressor plants were statistically significantly different from that for the WT (Student's t test; *, significant at P < 0.05; ***, significant at P < 0.001).TOC protein levels were regulated by autophagy in response to short-term UVB stress. Eight-day-old plants of indicated genotypes were subjected to UVB stress for the indicated times, and then analyzed by immunoblotting using 10 μg total protein extract loaded per lane (C, upper). Coomassie staining indicated that the treatments did not change the overall protein profile (C, lower). Band intensities were quantified and normalized to equivalent Actin data (D) Time 0 was taken as 100%. Unpaired two-tailed Student's t-tests revealed that the Toc159 protein level in nbr1-2 (P < 0.05) and NBR1-OX (P < 0.05), the Toc75 protein level in atg7-2 (P < 0.05), nbr1-2 (P < 0.01), and NBR1-OX (P < 0.05), and the Toc33 protein level in atg7-2 (P < 0.05), nbr1-2 (P < 0.01), and NBR1-OX (P < 0.05), were significantly different from levels in the WT at the time of 1 d recovery from UVB stress.Toc159 was modified by both K48 and K63 ubiquitin linkage types. Eight-day-old WT plants were grown under normal growth condition (-), or subjected to UVB stress (+), with UVB treatment for four hours. The protein extract from the plants was analyzed by IP using native Toc159 antibody, or its preimmune serum as a negative control, and analyzed by immunoblotting using antibodies as indicated to the left of the images (E). Tic40 acted as a negative control. The asterisk indicates a truncated Toc159 form without A domain Molecular weight markers (sizes in kD) are indicated to the right of the images. Please note that ubiquitin antibodies tend to produce stronger signals for hyper-ubiquitinated species than for hypo-ubiquitinated or mono-ubiquitinated species (based on the number of epitopes), which contrasts with the behaviour of the Toc159 antibody. Thus, the signals of the two antibodies are not expected to fully overlap. Poly-ubiquitinated Toc159 may not be detected by the Toc159 antibody due to the much lower abundance of these species compared with the mono-ubiquitinated or unmodified forms. This is why the poly-Ub K48 and K63 signals appear at higher molecular weight positions than the Toc159 signals. Relative Toc159 amounts modified by K48 or K63 ubiquitin linkage in plants with or without UVB stress were assessed by quantifying the smeary band intensity of the IP samples in α-K48 or α-K63 blots (F). All data are means ± SEM from three experiments."}
{"words": ["Figure", "6TOC", "protein", "levels", "were", "regulated", "by", "autophagy", "in", "response", "to", "short", "-", "term", "heat", "stress", ".", "Eight", "-", "day", "-", "old", "plants", "of", "indicated", "genotypes", "grown", "in", "vitro", "were", "subjected", "to", "short", "term", "heat", "stress", ",", "recovered", "for", "the", "indicated", "times", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "10", "μg", "total", "protein", "extract", "loaded", "per", "lane", "(", "B", ",", "upper", ")", ".", "Coomassie", "staining", "indicated", "that", "the", "treatments", "did", "not", "change", "the", "overall", "protein", "profile", "(", "B", ",", "lower", ")", ".", "Band", "intensities", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "equivalent", "Actin", "data", "(", "C", ")", ".", "Time", "0", "was", "taken", "as", "100", "%", ".", "Data", "are", "means", "±", "SEM", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "revealed", "that", "the", "Toc159", "protein", "level", "in", "nbr1", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "NBR1", "-", "OX", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "and", "the", "Toc75", "protein", "level", "in", "NBR1", "-", "OX", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "were", "significantly", "different", "from", "levels", "in", "the", "WT", "at", "Time", "12", "h", ";", "and", "that", "the", "Toc159", "protein", "level", "in", "atg7", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "nbr1", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "and", "NBR1", "-", "OX", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "and", "the", "Toc75", "protein", "level", "in", "atg7", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "nbr1", "-", "2", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "and", "NBR1", "-", "OX", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "were", "significantly", "different", "from", "levels", "in", "the", "WT", "at", "Time", "24", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6TOC protein levels were regulated by autophagy in response to short-term heat stress. Eight-day-old plants of indicated genotypes grown in vitro were subjected to short term heat stress, recovered for the indicated times, and then analyzed by immunoblotting using 10 μg total protein extract loaded per lane (B, upper). Coomassie staining indicated that the treatments did not change the overall protein profile (B, lower). Band intensities were quantified and normalized to equivalent Actin data (C). Time 0 was taken as 100%. Data are means ± SEM from three biological replicates. Unpaired two-tailed Student's t-tests revealed that the Toc159 protein level in nbr1-2 (P < 0.05) and NBR1-OX (P < 0.01), and the Toc75 protein level in NBR1-OX (P < 0.05), were significantly different from levels in the WT at Time 12 h; and that the Toc159 protein level in atg7-2 (P < 0.001), nbr1-2 (P < 0.01), and NBR1-OX (P < 0.001), and the Toc75 protein level in atg7-2 (P < 0.01), nbr1-2 (P < 0.01), and NBR1-OX (P < 0.01), were significantly different from levels in the WT at Time 24 h."}
{"words": ["Figure", "7Analysis", "of", "protein", "import", "efficiency", "in", "vitro", ".", "Chloroplasts", "were", "isolated", "from", "12", "-", "day", "-", "old", "WT", ",", "nbr1", "-", "2", "and", "NBR1", "-", "OX", "seedlings", "grown", "in", "vitro", "under", "normal", "condition", ",", "and", "were", "subjected", "to", "in", "vitro", "protein", "import", "assay", "by", "using", "35S", "-", "labeled", "Rubisco", "small", "subunit", "(", "SSU", ")", "precursor", "protein", "as", "the", "import", "substrate", ",", "followed", "by", "corresponding", "quantification", "of", "the", "maturation", "of", "the", "radiolabeled", "precursor", "protein", ".", "A", "representative", "phosphor", "screen", "image", "is", "shown", "(", "upper", "left", ")", ",", "and", "Coomassie", "staining", "of", "Rubisco", "large", "subunit", "(", "LSU", ")", "indicated", "equal", "loading", "(", "lower", "left", ")", ";", "Times", "indicate", "minutes", "after", "the", "start", "of", "each", "import", "reaction", ".", "IVT", ",", "in", "vitro", "translation", "product", "used", "as", "a", "control", ".", "Together", "with", "similar", "images", "from", "two", "additional", "experiments", ",", "this", "was", "used", "to", "conduct", "the", "quantitative", "analysis", "shown", "(", "right", ")", ";", "the", "amount", "of", "imported", ",", "mature", "protein", "in", "each", "sample", "was", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "that", "present", "at", "the", "final", "time", "point", "for", "the", "WT", ".", "Data", "are", "means", "±", "SEM", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "Chloroplast", "development", "in", "WT", ",", "nbr1", "-", "2", "and", "NBR1", "-", "OX", "seedlings", "under", "UVB", "stress", "was", "studied", ".", "Cotyledons", "of", "eight", "-", "day", "-", "old", "plants", "grown", "in", "vitro", "under", "normal", "condition", "(", "D", ")", "or", "UVB", "stress", "(", "E", ")", "were", "analyzed", "by", "transmission", "electron", "microscopy", ",", "and", "representative", "images", "are", "shown", ".", "UVB", "stress", "was", "conducted", "in", "the", "same", "procedures", "as", "in", "C", ".", "In", "D", "and", "E", ",", "the", "upper", "images", "are", "at", "the", "same", "magnification", "(", "scale", "bar", ",", "2", "μm", ")", ";", "and", "below", "these", "are", "high", "magnification", "(", "5", "×", ")", "images", "corresponding", "to", "the", "boxed", "regions", "above", ".", "These", "and", "similar", "micrographs", "of", "chloroplasts", "were", "used", "to", "determine", "chloroplast", "shape", "(", "F", ")", ",", "the", "number", "of", "thylakoid", "lamellae", "per", "granum", "(", "G", ")", ",", "and", "the", "number", "of", "starch", "granules", "per", "chloroplast", "(", "H", ")", "in", "each", "genotype", ",", "with", "or", "without", "UVB", "stress", ".", "Asterisks", "indicate", "significance", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ",", "significant", "at", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ",", "significant", "at", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "significant", "at", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Values", "are", "means", "±", "SEM", "from", "30", "-", "50", "chloroplasts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Analysis of protein import efficiency in vitro. Chloroplasts were isolated from 12-day-old WT, nbr1-2 and NBR1-OX seedlings grown in vitro under normal condition, and were subjected to in vitro protein import assay by using 35S-labeled Rubisco small subunit (SSU) precursor protein as the import substrate, followed by corresponding quantification of the maturation of the radiolabeled precursor protein. A representative phosphor screen image is shown (upper left), and Coomassie staining of Rubisco large subunit (LSU) indicated equal loading (lower left); Times indicate minutes after the start of each import reaction. IVT, in vitro translation product used as a control. Together with similar images from two additional experiments, this was used to conduct the quantitative analysis shown (right); the amount of imported, mature protein in each sample was expressed as a percentage of that present at the final time point for the WT. Data are means ± SEM from three biological replicates.Chloroplast development in WT, nbr1-2 and NBR1-OX seedlings under UVB stress was studied. Cotyledons of eight-day-old plants grown in vitro under normal condition (D) or UVB stress (E) were analyzed by transmission electron microscopy, and representative images are shown. UVB stress was conducted in the same procedures as in C. In D and E, the upper images are at the same magnification (scale bar, 2 μm); and below these are high magnification (5×) images corresponding to the boxed regions above. These and similar micrographs of chloroplasts were used to determine chloroplast shape (F), the number of thylakoid lamellae per granum (G), and the number of starch granules per chloroplast (H) in each genotype, with or without UVB stress. Asterisks indicate significance according to an unpaired two-tailed Student's t-test (*, significant at P < 0.05; ***, significant at P < 0.001; ****, significant at P < 0.0001). Values are means ± SEM from 30-50 chloroplasts."}
{"words": ["Figure", "8Phenotypes", "of", "two", "-", "week", "-", "old", "WT", ",", "nbr1", "-", "2", ",", "ppi1", "and", "ppi1", "nbr1", "-", "2", "seedlings", "grown", "on", "soil", ".", "Representative", "plant", "images", "(", "A", ")", "and", "chlorophyll", "contents", "(", "B", ")", "are", "shown", ".", "The", "chlorophyll", "values", "for", "the", "ppi1", "and", "ppi1", "nbr1", "-", "2", "plants", "were", "statistically", "significantly", "different", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "significant", "at", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Values", "are", "means", "±", "SEM", "from", "20", "plants", ".", "Chloroplast", "development", "in", "ppi1", "and", "ppi1", "nbr1", "-", "2", "seedlings", "was", "studied", ".", "Cotyledons", "of", "two", "-", "week", "-", "old", "plants", "grown", "under", "normal", "condition", "as", "in", "A", "were", "analyzed", "by", "transmission", "electron", "microscopy", ",", "and", "representative", "images", "are", "shown", "(", "E", ")", ".", "In", "E", ",", "the", "upper", "images", "are", "at", "the", "same", "magnification", "(", "scale", "bar", ",", "1", "μm", ")", ";", "and", "below", "these", "are", "high", "magnification", "(", "3", "×", ")", "images", "corresponding", "to", "the", "boxed", "regions", "above", ".", "These", "and", "similar", "micrographs", "of", "chloroplasts", "were", "used", "to", "determine", "chloroplast", "size", "(", "F", ")", "and", "the", "number", "of", "thylakoid", "lamellae", "per", "granum", "(", "G", ")", "in", "each", "genotype", ".", "Asterisks", "indicate", "significance", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "*", "*", ",", "significant", "at", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Values", "are", "means", "±", "SEM", "from", "30", "-", "40", "chloroplasts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Phenotypes of two-week-old WT, nbr1-2, ppi1 and ppi1 nbr1-2 seedlings grown on soil. Representative plant images (A) and chlorophyll contents (B) are shown. The chlorophyll values for the ppi1 and ppi1 nbr1-2 plants were statistically significantly different (Student's t test; ****, significant at P < 0.0001). Values are means ± SEM from 20 plants.Chloroplast development in ppi1 and ppi1 nbr1-2 seedlings was studied. Cotyledons of two-week-old plants grown under normal condition as in A were analyzed by transmission electron microscopy, and representative images are shown (E). In E, the upper images are at the same magnification (scale bar, 1 μm); and below these are high magnification (3×) images corresponding to the boxed regions above. These and similar micrographs of chloroplasts were used to determine chloroplast size (F) and the number of thylakoid lamellae per granum (G) in each genotype. Asterisks indicate significance according to an unpaired two-tailed Student's t-test (****, significant at P < 0.0001). Values are means ± SEM from 30-40 chloroplasts."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Comparative", "expression", "during", "murine", "pre", "-", "implantation", "embryo", "development", "of", "Dppa2", "(", "red", ")", ",", "Dppa4", "(", "blue", ")", ",", "Dux", "(", "black", ")", ",", "and", "Zscan4c", "(", "ZGA", "marker", ",", "green", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "average", "value", "of", "single", "-", "cell", "RNA", "-", "seq", "(", "C", ")", "Sashimi", "plot", "representing", "coverage", "on", "the", "Dppa4", "gene", "of", "an", "RNA", "sequencing", "analysis", "of", "murine", "zygotes", ",", "early", "2C", ",", "mid", "2C", "and", "late", "2C", "Arcs", "depict", "splicing", "events", ",", "and", "numbers", "their", "relative", "frequency", "(", "i", ".", "e", ".", "reads", "across", "junctions", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Comparative expression during murine pre-implantation embryo development of Dppa2 (red), Dppa4 (blue), Dux (black), and Zscan4c (ZGA marker, green). Each dot represents the average value of single-cell RNA-seq(C) Sashimi plot representing coverage on the Dppa4 gene of an RNA sequencing analysis of murine zygotes, early 2C, mid 2C and late 2C Arcs depict splicing events, and numbers their relative frequency (i.e. reads across junctions)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Average", "expression", "of", "Dppa2", "and", "Dppa4", "in", "a", "single", "-", "cell", "RNA", "-", "seq", "analysis", "of", "mESCs", "sorted", "for", "expression", "of", "both", "Tomato", "and", "GFP", "reporters", "driven", "by", "MERVL", "and", "Zscan4", "promoters", ",", "respectively", ",", "and", "the", "double", "-", "negative", "population", ".", "(", "B", ")", "Fraction", "of", "GFP", "+", "cells", "in", "mESCs", "carrying", "a", "MERVL", "-", "GFP", "reporter", "and", "depleted", "of", "Dppa2", "or", "Dppa4", "using", "shRNAs", "specific", "to", "the", "transcripts", "or", "a", "control", ".", "Bars", "represent", "the", "average", ",", "error", "bars", "the", "SD", ";", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "Dppa2", ",", "Dppa4", ",", "Dux", "and", "Zscan4", "gene", "expression", "in", "mESCs", "carrying", "a", "MERVL", "-", "GFP", "reporter", "and", "depleted", "of", "Dppa2", "or", "Dppa4", "using", "shRNAs", "specific", "to", "the", "transcripts", "or", "a", "control", ".", "Expression", "was", "normalized", "to", "Actb", ".", "Bars", "represent", "the", "average", ",", "error", "bars", "the", "SD", ";", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "RNA", "-", "seq", "analysis", "of", "WT", "and", "Dppa2", "(", "D", ")", "KO", "mESC", "clones", ".", "The", "dot", "plot", "displays", "the", "average", "gene", "expression", "of", "three", "independent", "clones", "from", "each", "cell", "type", ";", "n", "=", "3", ".", "RNA", "-", "seq", "analysis", "of", "WT", "and", "Dppa4", "(", "E", ")", "KO", "mESC", "clones", ".", "The", "dot", "plot", "displays", "the", "average", "gene", "expression", "of", "three", "independent", "clones", "from", "each", "cell", "type", ";", "n", "=", "3", ".", "(", "F", ")", "Comparative", "expression", "by", "qPCR", "of", "Dux", ",", "two", "downstream", "targets", "of", "DUX", "(", "Zscan4", "and", "Tdpoz4", ")", ",", "and", "two", "DUX", "-", "independent", "targets", "of", "DPPA2", "and", "DPPA4", "(", "Mael", "and", "Tdrd1", ")", "in", "mESCs", "depleted", "of", "endogenous", "DPPA2", "and", "DPPA4", "and", "overexpressing", "ectopically", "DUX", "or", "GFP", "as", "a", "control", ".", "Expression", "was", "normalized", "to", "Actb", ".", "Bars", "represent", "the", "average", ",", "error", "bars", "the", "SD", ";", "n", "=", "3", "(", "H", ")", "Comparative", "expression", "of", "DUX", "-", "dependent", ",", "DPPA2", "and", "DPPA4", "-", "dependent", ",", "and", "the", "rest", "of", "the", "genes", "in", "mESCs", "sorted", "for", "expression", "of", "both", "Tomato", "and", "GFP", "reporters", "driven", "by", "MERVL", "and", "Zscan4", "promoters", ",", "respectively", ",", "and", "the", "double", "-", "negative", "population", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Average expression of Dppa2 and Dppa4 in a single-cell RNA-seq analysis of mESCs sorted for expression of both Tomato and GFP reporters driven by MERVL and Zscan4 promoters, respectively, and the double-negative population.(B) Fraction of GFP+ cells in mESCs carrying a MERVL-GFP reporter and depleted of Dppa2 or Dppa4 using shRNAs specific to the transcripts or a control. Bars represent the average, error bars the SD; n = 3. ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, unpaired t-test.(C) Dppa2, Dppa4, Dux and Zscan4 gene expression in mESCs carrying a MERVL-GFP reporter and depleted of Dppa2 or Dppa4 using shRNAs specific to the transcripts or a control. Expression was normalized to Actb. Bars represent the average, error bars the SD; n = 3. ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, unpaired t-test.RNA-seq analysis of WT and Dppa2 (D) KO mESC clones. The dot plot displays the average gene expression of three independent clones from each cell type; n = 3.RNA-seq analysis of WT and Dppa4 (E) KO mESC clones. The dot plot displays the average gene expression of three independent clones from each cell type; n = 3.(F) Comparative expression by qPCR of Dux, two downstream targets of DUX (Zscan4 and Tdpoz4), and two DUX-independent targets of DPPA2 and DPPA4 (Mael and Tdrd1) in mESCs depleted of endogenous DPPA2 and DPPA4 and overexpressing ectopically DUX or GFP as a control. Expression was normalized to Actb. Bars represent the average, error bars the SD; n = 3(H) Comparative expression of DUX-dependent, DPPA2 and DPPA4-dependent, and the rest of the genes in mESCs sorted for expression of both Tomato and GFP reporters driven by MERVL and Zscan4 promoters, respectively, and the double-negative population (unpaired t-test)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Comparative", "expression", "by", "qPCR", "of", "Dux", ",", "two", "downstream", "targets", "of", "DUX", "(", "Zscan4", "and", "Tdpoz4", ")", ",", "and", "three", "targets", "of", "DPPA2", "and", "DPPA4", "independent", "of", "DUX", "(", "Mael", ",", "Tdrd1", ",", "Prex2", ")", "in", "mESCs", "depleted", "of", "endogenous", "DPPA2", "and", "DPPA4", "and", "overexpressing", "ectopically", "DPPA2", ",", "DPPA4", "or", "GFP", "as", "a", "control", "Expression", "was", "normalized", "to", "Actb", ".", "Bars", "represent", "the", "average", ",", "error", "bars", "the", "SD", ";", "n", "=", "3", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "B", ")", "Average", "coverage", "normalized", "for", "sequencing", "depth", "of", "the", "ChIP", "-", "seq", "signal", "of", "DPPA2", ",", "DPPA4", "or", "DPPA4", "truncated", "of", "the", "SAP", "domain", "overexpressed", "in", "mESCs", "in", "a", "window", "of", "500bp", "around", "the", "Dux", "gene", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Total", "input", "(", "TI", ")", "is", "shown", "in", "gray", ".", "Peaks", "over", "the", "Dux", "gene", "were", "called", "in", "DPPA2", ",", "DPPA4", "and", "DPPA4ΔSAP", "ChIP", "-", "seq", ".", "(", "C", ")", "Heatmap", "showing", "the", "distribution", "of", "DUX", ",", "DPPA2", ",", "DPPA4", "and", "DPPA4ΔSAP", "coverage", "in", "a", "±", "5kb", "window", "around", "the", "TSS", "of", "DUX", "-", "dependent", ",", "DPPA2", "and", "DPPA4", "-", "dependent", "and", "random", "genes", "in", "mESCs", ".", "(", "D", ")", "Boxplot", "/", "Jitterplot", "representing", "the", "percentage", "of", "GC", "nucleotide", "contents", "in", "the", "peaks", "from", "DPPA2", ",", "DPPA4", "and", "DUX", "ChIP", ",", "and", "in", "a", "random", "shuffle", "of", "peaks", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Comparative expression by qPCR of Dux, two downstream targets of DUX (Zscan4 and Tdpoz4), and three targets of DPPA2 and DPPA4 independent of DUX (Mael, Tdrd1, Prex2) in mESCs depleted of endogenous DPPA2 and DPPA4 and overexpressing ectopically DPPA2, DPPA4 or GFP as a control Expression was normalized to Actb. Bars represent the average, error bars the SD; n = 3. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, unpaired t-test.(B) Average coverage normalized for sequencing depth of the ChIP-seq signal of DPPA2, DPPA4 or DPPA4 truncated of the SAP domain overexpressed in mESCs in a window of 500bp around the Dux gene (n=2). Total input (TI) is shown in gray. Peaks over the Dux gene were called in DPPA2, DPPA4 and DPPA4ΔSAP ChIP-seq.(C) Heatmap showing the distribution of DUX, DPPA2, DPPA4 and DPPA4ΔSAP coverage in a ± 5kb window around the TSS of DUX-dependent, DPPA2 and DPPA4-dependent and random genes in mESCs.(D) Boxplot/Jitterplot representing the percentage of GC nucleotide contents in the peaks from DPPA2, DPPA4 and DUX ChIP, and in a random shuffle of peaks."}
{"words": ["Figure", "4Total", "expression", "of", "transposable", "element", "subfamilies", "in", "(", "A", ")", "Dppa2", "KO", "compared", "to", "WT", "mESC", "clones", ".", "Total", "expression", "of", "transposable", "element", "subfamilies", "in", "(", "B", ")", "Dppa4", "KO", "compared", "to", "WT", "mESC", "clones", ".", "(", "C", ")", "RNA", "-", "seq", "analysis", "of", "MERVL", "-", "int", ",", "L1Md", "_", "A", "and", "L1Md", "_", "T", "in", "mESCs", "sorted", "for", "expression", "of", "both", "Tomato", "and", "GFP", "reporters", "driven", "by", "MERVL", "and", "Zscan4", "promoters", ",", "respectively", ",", "and", "the", "double", "-", "negative", "population", ".", "(", "D", ")", "Heatmap", "displaying", "the", "enrichment", "of", "DUX", ",", "DPPA2", ",", "DPPA4", "and", "DPPA4ΔSAP", "binding", "at", "different", "transposable", "element", "families", ".", "Every", "subfamily", "enriched", "(", "pval", "<", "0", ".", "05", ")", "in", "at", "least", "one", "DPPA2", ",", "DPPA4", "or", "DPPA4ΔSAP", "replicate", "are", "shown", ".", "(", "E", ")", "MSA", "plot", "of", "DPPA2", ",", "DPPA4", "and", "DPPA4ΔSAP", "ChIP", "-", "seq", "in", "mESCs", "showing", "enrichment", "over", "L1Md", "_", "A", ",", "L1Md", "_", "T", "and", "MERVL", "-", "int", "sequences", ".", "Gaps", "are", "in", "grey", "and", "sequences", "in", "white", "with", "overlap", "of", "color", "-", "coded", "ChIP", "-", "seq", "signals", ".", "Upper", "plot", "shows", "average", "coverage", "of", "the", "signal", "over", "the", "aligned", "TEs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Total expression of transposable element subfamilies in (A) Dppa2 KO compared to WT mESC clones.Total expression of transposable element subfamilies in (B) Dppa4 KO compared to WT mESC clones.(C) RNA-seq analysis of MERVL-int, L1Md_A and L1Md_T in mESCs sorted for expression of both Tomato and GFP reporters driven by MERVL and Zscan4 promoters, respectively, and the double-negative population.(D) Heatmap displaying the enrichment of DUX, DPPA2, DPPA4 and DPPA4ΔSAP binding at different transposable element families. Every subfamily enriched (pval < 0.05) in at least one DPPA2, DPPA4 or DPPA4ΔSAP replicate are shown.(E) MSA plot of DPPA2, DPPA4 and DPPA4ΔSAP ChIP-seq in mESCs showing enrichment over L1Md_A, L1Md_T and MERVL-int sequences. Gaps are in grey and sequences in white with overlap of color-coded ChIP-seq signals. Upper plot shows average coverage of the signal over the aligned TEs."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Immunofluorescence", "of", "SATB2", "(", "green", ")", "and", "the", "GSC", "marker", "SOX2", "or", "OLIG2", "(", "red", ")", "on", "frozen", "tissue", "sections", "of", "human", "GBM", "surgical", "specimens", ".", "SATB2", "is", "preferentially", "expressed", "by", "GSCs", "in", "human", "GBMs", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "μm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "the", "fraction", "of", "SATB2", "+", "cells", "in", "SOX2", "+", "or", "OLIG2", "+", "cells", "in", "human", "GBMs", ".", "More", "than", "90", "%", "SOX2", "+", "or", "OLIG2", "+", "cells", "showed", "SATB2", "staining", ".", "n", "=", "3", "GBMs", ".", "C", ".", "qPCR", "analysis", "of", "SATB2", "mRNA", "expression", "in", "GSCs", "and", "matched", "non", "-", "stem", "tumor", "cells", "(", "NSTCs", ")", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "D", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "SATB2", ",", "SOX2", "and", "OLIG2", "expression", "in", "cell", "lysates", "of", "GSCs", "and", "matched", "NSTCs", ".", "E", ".", "Immunofluorescenc", "of", "SATB2", "(", "green", ")", "and", "SOX2", "(", "red", ")", "in", "T3359", "GSCs", "and", "matched", "NSTCs", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "F", ".", "qPCR", "analysis", "of", "SATB2", "mRNA", "expression", "in", "GSCs", "and", "neural", "progenitor", "cells", "(", "NPCs", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "G", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "SATB2", "and", "SOX2", "expression", "in", "cell", "lysates", "of", "GSCs", "and", "NPCs", ".", "H", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "SATB2", ",", "GSC", "marker", "SOX2", "and", "differentiation", "marker", "GFAP", "expression", "during", "serum", "-", "induced", "GSC", "differentiation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Immunofluorescence of SATB2 (green) and the GSC marker SOX2 or OLIG2 (red) on frozen tissue sections of human GBM surgical specimens. SATB2 is preferentially expressed by GSCs in human GBMs. Scale bar, 25 μm. B. Quantification of the fraction of SATB2+ cells in SOX2+ or OLIG2+ cells in human GBMs. More than 90% SOX2+ or OLIG2+ cells showed SATB2 staining. n=3 GBMs. C. qPCR analysis of SATB2 mRNA expression in GSCs and matched non-stem tumor cells (NSTCs) (n=5).D. Immunoblot analysis of SATB2, SOX2 and OLIG2 expression in cell lysates of GSCs and matched NSTCs.E. Immunofluorescenc of SATB2 (green) and SOX2 (red) in T3359 GSCs and matched NSTCs. Scale bar, 50 μm.F. qPCR analysis of SATB2 mRNA expression in GSCs and neural progenitor cells (NPCs) (n=3).G. Immunoblot analysis of SATB2 and SOX2 expression in cell lysates of GSCs and NPCs.H. Immunoblot analysis of SATB2, GSC marker SOX2 and differentiation marker GFAP expression during serum-induced GSC differentiation."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "SATB2", "expression", "in", "GSCs", "transduced", "with", "lentiviral", "-", "mediated", "non", "-", "targeting", "shRNA", "(", "shNT", ")", "or", "SATB2", "shRNA", "(", "shSATB2", ")", ".", "B", ".", "Cell", "viability", "of", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "C", ".", "EdU", "incorporation", "assay", "of", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "(", "C", ")", "showing", "the", "percentage", "of", "EdU", "+", "cells", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "E", ".", "Tumorsphere", "images", "of", "GSCs", "transduced", "with", "shNTor", "shSATB2", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "diameter", "of", "tumorspheres", "formed", "by", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "F", ":", "n", "=", "9", ";", "G", ":", "n", "=", "5", ")", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "tumorspheres", "formed", "by", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "F", ":", "n", "=", "9", ";", "G", ":", "n", "=", "5", ")", ".", "H", ".", "In", "vitro", "limiting", "dilution", "analysis", "of", "the", "tumorsphere", "formations", "of", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "Silencing", "SATB2", "attenuated", "the", "self", "-", "renewal", "capacity", "of", "GSCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblot analysis of SATB2 expression in GSCs transduced with lentiviral-mediated non-targeting shRNA (shNT) or SATB2 shRNA (shSATB2).B. Cell viability of GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=5).C. EdU incorporation assay of GSCs transduced with shNT or shSATB2. Scale bar: 50 μm. D. Quantification of (C) showing the percentage of EdU+ cells (n=5). E. Tumorsphere images of GSCs transduced with shNTor shSATB2. Scale bar: 100 μm. Quantification of the diameter of tumorspheres formed by GSCs expressing shNT or shSATB2 (F: n=9; G: n=5).G. Quantification of the number of tumorspheres formed by GSCs expressing shNT or shSATB2 (F: n=9; G: n=5).H. In vitro limiting dilution analysis of the tumorsphere formations of GSCs expressing shNT or shSATB2. Silencing SATB2 attenuated the self-renewal capacity of GSCs."}
{"words": ["Figure", "3", "A", ".", "Bioluminescent", "images", "of", "the", "GBM", "xenografts", "derived", "from", "the", "luciferase", "-", "labeled", "T3359", "GSCs", "expressing", "NT", "or", "SATB2", "shRNA", ".", "Representative", "images", "on", "day", "21", "posttransplantation", "are", "shown", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", ".", "Silencing", "SATB2", "significantly", "delayed", "GBM", "growth", ".", "C", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "mice", "intracranially", "implanted", "with", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "7", "mice", ";", "shSATB2", "-", "1", "or", "shSATB2", "-", "2", ":", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Median", "survival", ":", "shNT", ",", "28", "days", ";", "shSATB2", "-", "1", ",", "48", "days", ";", "shSATB2", "-", "2", ",", "45", "Days", ".", "Animals", "bearing", "GSC", "-", "derived", "xenografts", "expressing", "SATB2", "shRNA", "survived", "longer", "than", "the", "control", "animals", ".", "D", ".", "Immunofluorescence", "of", "SATB2", "(", "Green", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", "tumors", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "SATB2", "intensity", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", "tumors", "per", "group", ")", ".", "F", ".", "Immunofluorescence", "of", "Ki67", "(", "Green", ")", "in", "tumor", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", "tumors", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "positive", "cells", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", "tumors", "per", "group", ")", ".", "H", ".", "Immunofluorescence", "of", "SOX2", "(", "Red", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "4", "tumors", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "I", ".", "Quantification", "of", "SOX2", "positive", "cells", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "4", "tumors", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A. Bioluminescent images of the GBM xenografts derived from the luciferase-labeled T3359 GSCs expressing NT or SATB2 shRNA. Representative images on day 21 posttransplantation are shown (n=5 mice per group). Silencing SATB2 significantly delayed GBM growth . C. Kaplan-Meier survival curves of mice intracranially implanted with T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (shNT: n=7 mice; shSATB2-1 or shSATB2-2: n=5 mice). Median survival: shNT, 28 days; shSATB2-1, 48 days; shSATB2-2, 45 Days. Animals bearing GSC-derived xenografts expressing SATB2 shRNA survived longer than the control animals.  D. Immunofluorescence of SATB2 (Green) in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=5 tumors per group). Scale bar: 40 μm. E. Quantification of SATB2 intensity in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=5 tumors per group).  F. Immunofluorescence of Ki67 (Green) in tumor xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=5 tumors per group). Scale bar: 40 μm. G. Quantification of Ki67 positive cells in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=5 tumors per group).  H. Immunofluorescence of SOX2 (Red) in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=4 tumors per group). Scale bar: 40 μm. I. Quantification of SOX2 positive cells in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=4 tumors per group). "}
{"words": ["Figure", "4", "A", ".", "Heatmap", "analysis", "of", "differentially", "expressed", "genes", "between", "SATB2", "silencing", "H2S", "GSCs", "(", "shSATB2", ")", "and", "control", "H2S", "GSCs", "(", "shNT", ")", ".", "Differentially", "expressed", "genes", "had", "a", "1", ".", "8", "-", "fold", "or", "greater", "expression", "difference", ".", "Among", "differentially", "expressed", "genes", ",", "160", "are", "upregulated", "and", "185", "are", "downregulated", ".", "C", ".", "qPCR", "analysis", "of", "FOXM1", "and", "SATB2", "mRNA", "expression", "in", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "FOXM1", "and", "SATB2", "expression", "in", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "E", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "FOXM1", "and", "SATB2", "expression", "in", "tumor", "xenografts", "-", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "F", ".", "Heatmap", "analysis", "of", "FOXM1", "downstream", "targets", "between", "SATB2", "silencing", "H2S", "GSCs", "(", "shSATB2", ")", "and", "control", "H2S", "GSCs", "(", "shNT", ")", "from", "microarray", "analysis", ".", "Differentially", "expressed", "genes", "had", "a", "1", ".", "5", "-", "fold", "or", "greater", "expression", "difference", ".", "G", ".", "qPCR", "analysis", "of", "FOXM1", "downstream", "targets", "in", "H2S", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A. Heatmap analysis of differentially expressed genes between SATB2 silencing H2S GSCs (shSATB2) and control H2S GSCs (shNT). Differentially expressed genes had a 1.8-fold or greater expression difference. Among differentially expressed genes, 160 are upregulated and 185 are downregulated. C. qPCR analysis of FOXM1 and SATB2 mRNA expression in GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3).D. Immunoblot analysis of FOXM1 and SATB2 expression in GSCs transduced with shNT or shSATB2.E. Immunoblot analysis of FOXM1 and SATB2 expression in tumor xenografts-derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2. F. Heatmap analysis of FOXM1 downstream targets between SATB2 silencing H2S GSCs (shSATB2) and control H2S GSCs (shNT) from microarray analysis. Differentially expressed genes had a 1.5-fold or greater expression difference.  G. qPCR analysis of FOXM1 downstream targets in H2S GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3). "}
{"words": ["Figure", "5", "A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "FOXM1", "and", "SATB2", "expression", "in", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "B", ".", "Cell", "viability", "assay", "of", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "restored", "the", "cell", "proliferation", "impaired", "by", "SATB2", "silencing", ".", "C", ".", "Tumorsphere", "number", "of", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "restored", "the", "tumorsphere", "formation", "of", "GSCs", "impaired", "by", "SATB2", "silencing", ".", "In", "vivo", "bioluminescent", "images", "of", "the", "tumor", "xenografts", "derived", "from", "luciferase", "-", "labeled", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "5", "mice", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "4", "mice", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "5", "mice", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Representative", "images", "on", "day", "21", "posttransplantation", "are", "shown", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "in", "GSCs", "expressing", "shSATB2", "markedly", "restored", "GBM", "tumor", "growth", ".", "E", ".", "In", "vivo", "bioluminescent", "images", "or", "quantification", "of", "the", "tumor", "xenografts", "derived", "from", "luciferase", "-", "labeled", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "5", "mice", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "4", "mice", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "5", "mice", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Representative", "images", "on", "day", "21", "posttransplantation", "are", "shown", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "in", "GSCs", "expressing", "shSATB2", "markedly", "restored", "GBM", "tumor", "growth", ".", "F", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "mice", "intracranially", "implanted", "with", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "8", "mice", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "7", "mice", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "mice", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "8", "mice", ")", ".", "Median", "survival", ":", "shNT", ",", "30", "days", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ",", "28", "days", ";", "shSATB2", ",", "50", ".", "5", "Days", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ",", "34", "days", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "in", "GSCs", "expressing", "shSATB2", "markedly", "attenuated", "the", "increased", "survival", "of", "mice", "bearing", "the", "GSC", "-", "derived", "GBMs", ".", "G", ".", "Immunofluorescence", "of", "Ki67", "(", "Green", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "tumors", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "6", "tumors", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "H", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "positive", "cells", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "tumors", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "6", "tumors", ")", ".", "I", ".", "Immunofluorescence", "of", "SOX2", "(", "Red", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "tumors", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "6", "tumors", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "J", ".", "Quantification", "of", "SOX2", "positive", "cells", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "tumors", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "6", "tumors", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A. Immunoblot analysis of FOXM1 and SATB2 expression in T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2.  B. Cell viability assay of T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (n=5). Ectopic expression of FOXM1 restored the cell proliferation impaired by SATB2 silencing.  C. Tumorsphere number of T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (n=5). Ectopic expression of FOXM1 restored the tumorsphere formation of GSCs impaired by SATB2 silencing.  In vivo bioluminescent images of the tumor xenografts derived from luciferase-labeled T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=5 mice; shNT+FOXM1: n=4 mice; shSATB2: n=5 mice; shSATB2+ FOXM1: n=5 mice). Representative images on day 21 posttransplantation are shown. Ectopic expression of FOXM1 in GSCs expressing shSATB2 markedly restored GBM tumor growth.  E. In vivo bioluminescent images or quantification of the tumor xenografts derived from luciferase-labeled T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=5 mice; shNT+FOXM1: n=4 mice; shSATB2: n=5 mice; shSATB2+ FOXM1: n=5 mice). Representative images on day 21 posttransplantation are shown. Ectopic expression of FOXM1 in GSCs expressing shSATB2 markedly restored GBM tumor growth.  F. Kaplan-Meier survival curves of mice intracranially implanted with T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=8 mice; shNT+FOXM1: n=7 mice; shSATB2: n=6 mice; shSATB2+ FOXM1: n=8 mice). Median survival: shNT, 30 days; shNT+FOXM1, 28 days; shSATB2, 50.5 Days; shSATB2+FOXM1, 34 days. Ectopic expression of FOXM1 in GSCs expressing shSATB2 markedly attenuated the increased survival of mice bearing the GSC-derived GBMs.  G. Immunofluorescence of Ki67 (Green) in xenografts derived from T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=6 tumors; shNT+FOXM1: n=5 tumors; shSATB2: n=6 tumors; shSATB2+ FOXM1: n=6 tumors). Scale bar: 40 μm. H. Quantification of Ki67 positive cells in xenografts derived from T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=6 tumors; shNT+FOXM1: n=5 tumors; shSATB2: n=6 tumors; shSATB2+ FOXM1: n=6 tumors).  I. Immunofluorescence of SOX2 (Red) in xenografts derived from T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=6 tumors; shNT+FOXM1: n=5 tumors; shSATB2: n=6 tumors; shSATB2+ FOXM1: n=6 tumors). Scale bar: 40 μm. J. Quantification of SOX2 positive cells in xenografts derived from T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=6 tumors; shNT+FOXM1: n=5 tumors; shSATB2: n=6 tumors; shSATB2+ FOXM1: n=6 tumors). "}
{"words": ["Figure", "6", "B", ".", "ChIP", "assays", "with", "the", "SATB2", "antibody", "or", "IgG", "using", "GSCs", ",", "NSTCs", "and", "NPCs", ".", "PCR", "primers", "amplified", "a", "fragment", "flanking", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "Note", "that", "abundant", "SATB2", "binds", "to", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", "in", "GSCs", ".", "C", ".", "qPCR", "analysis", "of", "ChIP", "assays", "with", "the", "SATB2", "antibody", "or", "IgG", "using", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "PCR", "primers", "amplified", "a", "fragment", "flanking", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "Silencing", "SATB2", "decreased", "its", "binding", "amount", "to", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "D", ".", "CoIP", "assays", "of", "endogenous", "protein", "interaction", "in", "GSCs", ".", "Immunoblots", "of", "precipitated", "proteins", "or", "total", "lysates", "were", "performed", "using", "indicated", "antibodies", ".", "Note", "that", "SATB2", "associates", "with", "endogenous", "CBP", "while", "not", "P300", ".", "E", ".", "qPCR", "analysis", "of", "ChIP", "assays", "with", "the", "CBP", "antibody", "or", "IgG", "using", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "PCR", "primers", "amplified", "a", "fragment", "flanking", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "Silencing", "SATB2", "reduced", "the", "binding", "of", "CBP", "to", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "F", ".", "qPCR", "analysis", "of", "ChIP", "assays", "with", "the", "indicated", "antibody", "(", "AcH3K18", ",", "AcH3K27", ",", "AcH4", ")", "using", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "PCR", "primers", "amplified", "a", "fragment", "flanking", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "Silencing", "SATB2", "reduced", "acetylation", "of", "H3K18", ",", "H3K27", "and", "H4", "levels", "on", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "locus", ".", "G", ".", "qPCR", "analysis", "of", "FOXM1", "mRNA", "expression", "in", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "shSATB2", "or", "shCBP", "or", "both", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "H", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "FOXM1", "expression", "in", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "shSATB2", "or", "shCBP", "or", "both", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 B. ChIP assays with the SATB2 antibody or IgG using GSCs, NSTCs and NPCs. PCR primers amplified a fragment flanking the MAR of FOXM1 gene locus. Note that abundant SATB2 binds to the MAR of FOXM1 gene locus in GSCs.  C. qPCR analysis of ChIP assays with the SATB2 antibody or IgG using GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3). PCR primers amplified a fragment flanking the MAR of FOXM1 gene locus. Silencing SATB2 decreased its binding amount to the MAR of FOXM1 gene locus. D. CoIP assays of endogenous protein interaction in GSCs. Immunoblots of precipitated proteins or total lysates were performed using indicated antibodies. Note that SATB2 associates with endogenous CBP while not P300. E. qPCR analysis of ChIP assays with the CBP antibody or IgG using GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3). PCR primers amplified a fragment flanking the MAR of FOXM1 gene locus. Silencing SATB2 reduced the binding of CBP to the MAR of FOXM1 gene locus.  F. qPCR analysis of ChIP assays with the indicated antibody (AcH3K18, AcH3K27, AcH4) using T3359 GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3). PCR primers amplified a fragment flanking the MAR of FOXM1 gene locus. Silencing SATB2 reduced acetylation of H3K18, H3K27 and H4 levels on the MAR of FOXM1 locus.  G. qPCR analysis of FOXM1 mRNA expression in T3359 GSCs transduced with shSATB2 or shCBP or both (n=3).  H. Immunoblot analysis of FOXM1 expression in T3359 GSCs transduced with shSATB2 or shCBP or both. "}
{"words": ["Figure", "7", "A", ".", "Cell", "viability", "of", "T3359", "GSCs", "treated", "with", "indicated", "doses", "of", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "B", ".", "Tumorsphere", "images", "of", "T3359", "GSCs", "treated", "with", "indicated", "doses", "of", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "for", "6", "days", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "C", ".", "qPCR", "analysis", "of", "SATB2", ",", "FOXM1", "and", "FOXM1", "downstream", "targets", "in", "T3359", "GSCs", "treated", "with", "indicated", "doses", "of", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "for", "24", "hours", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", ".", "Bioluminescent", "imaging", "of", "tumor", "growth", "in", "mice", "bearing", "xenografts", "derived", "from", "the", "luciferase", "-", "labeled", "T3359", "GSCs", "treated", "with", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "at", "indicated", "days", "after", "GSC", "transplantation", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "tumor", "growth", "from", "(", "E", ")", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", ".", "G", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "mice", "bearing", "T3359", "GSC", "-", "derived", "xenografts", "treated", "with", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "(", "Vehicle", "control", ":", "n", "=", "9", "mice", ";", "C646", ":", "n", "=", "8", "mice", ")", ".", "Median", "survival", ":", "Vehicle", "control", ",", "27", "days", ";", "C646", ",", "33", ".", "5", "days", ".", "H", ".", "Immunofluorescence", "of", "Ki67", "(", "Green", ")", "in", "T3359", "GSC", "-", "derived", "xenografts", "from", "mice", "treated", "with", "with", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "(", "n", "=", "6", "tumors", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "I", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "positive", "cells", "in", "T3359", "GSC", "-", "derived", "xenografts", "from", "mice", "treated", "with", "with", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "(", "n", "=", "6", "tumors", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 A. Cell viability of T3359 GSCs treated with indicated doses of C646 or the vehicle control (n=5).  B. Tumorsphere images of T3359 GSCs treated with indicated doses of C646 or the vehicle control for 6 days. Scale bar: 100 μm.  C. qPCR analysis of SATB2, FOXM1 and FOXM1 downstream targets in T3359 GSCs treated with indicated doses of C646 or the vehicle control for 24 hours (n=3). E. Bioluminescent imaging of tumor growth in mice bearing xenografts derived from the luciferase-labeled T3359 GSCs treated with C646 or the vehicle control at indicated days after GSC transplantation (n=5 mice per group). F. Quantification of tumor growth from (E) (n=5 mice per group). G. Kaplan-Meier survival curves of mice bearing T3359 GSC-derived xenografts treated with C646 or the vehicle control (Vehicle control: n=9 mice; C646: n= 8 mice). Median survival: Vehicle control, 27 days; C646, 33.5 days.  H. Immunofluorescence of Ki67 (Green) in T3359 GSC-derived xenografts from mice treated with with C646 or the vehicle control (n=6 tumors per group). Scale bar: 40 μm. I. Quantification of Ki67 positive cells in T3359 GSC-derived xenografts from mice treated with with C646 or the vehicle control (n=6 tumors per group). "}
{"words": ["Figure", "1Immunohistochemistry", "performed", "on", "12", "month", "-", "old", "THY", "-", "Tau22", "mice", "showing", "AT100", "-", "positive", "neurons", "(", "green", ")", ",", "CBP", "-", "positive", "nuclei", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "-", "stained", "nuclei", "(", "blue", ")", "in", "the", "CA1", "region", "of", "the", "dorsal", "hippocampus", ".", "A", "representative", "image", "is", "shown", "with", "a", "focus", ".", "Scale", "bars", ":", "40µm", "and", "20µm", "as", "noted", ".", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Arrows", "depict", "neurons", "bearing", "neurofibrillary", "tangles", "and", "do", "not", "display", "CBP", "immunostaining", ".", "The", "star", "depicts", "a", "ghost", "tangle", "(", "AT100", "-", "positive", "neuron", "and", "no", "nucleus", ")", "Western", "blot", "analyses", "perfomed", "in", "the", "dorsal", "hippocampus", "of", "12", "month", "-", "old", "THY", "-", "Tau22", "mice", "compared", "to", "age", "-", "matched", "controls", ".", "NeuN", ",", "actin", ",", "tubulin", "and", "total", "H2B", "levels", "are", "not", "changed", ".", "Phosphorylated", "tau", "on", "serine", "404", "(", "Tau", "-", "Ph404", ")", "attest", "for", "samples", "from", "tauopathic", "mice", ".", "Quantification", "represents", "the", "ration", "of", "the", "protein", "level", "detected", "on", "the", "total", "amount", "of", "proteins", "on", "the", "membranes", ",", "with", "WT", "arbitrarily", "set", "at", "1", "(", "fold", "induction", ")", ".", "Bar", "graphs", "are", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "5", "-", "7", "/", "group", "as", "noted", ",", "multiple", "t", "tests", ",", "CBP", "*", "p", "=", "0", ".", "003", "and", "GFAP", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", "for", "THY", "-", "Tau", "vs", ".", "WT", "miceRNA", "-", "sequencing", "data", "performed", "in", "the", "hippocampus", "of", "8", "month", "-", "old", "mice", ".", "Functional", "analyses", "(", "DAVID", "GOTERM", ")", "performed", "on", "significantly", "deregulated", "genes", "in", "THY", "-", "Tau22", "mice", "compared", "to", "WT", "mice", ".", "Representative", "genes", "are", "presented", "below", ".", "|", "log2", "Fold", "Change", "|", ">", "0", ".", "2", ";", "*", "indicates", "FDR", "<", "0", ".", "05", ".", "IEG", ",", "Immediate", "Early", "Genes", ".", "Predicted", "promoter", "motif", "(", "right", ")", "analyses", "performed", "with", "GREAT", ".", "Groups", ":", "WT", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "THY", "-", "Tau22", "mice", "(", "n", "=", "2", ")", "Long", "-", "term", "spatial", "memory", "testing", ":", "Mice", "were", "injected", "3", "times", "(", "1", "per", "week", ")", "with", "Vehicle", "(", "WT", "mice", "saline", ",", "WT", "VEH", ",", "n", "=", "17", ")", ",", "Vehicle", "(", "THY", "-", "Tau22", "mice", "CSP", ",", "500", "μg", "/", "mouse", ",", "TAU", "VEH", ",", "n", "=", "10", ")", "or", "Molecule", "(", "THY", "-", "Tau22", "mice", "CSP", "-", "TTK21", ",", "500", "μg", "/", "mice", "TAU", "MOL", ",", "n", "=", "13", ")", "before", "training", "of", "spatial", "memory", "in", "the", "Morris", "water", "maze", "(", "MWM", ")", ";", "retention", "(", "Probe", "test", ")", "was", "tested", "10", "days", "after", "the", "last", "training", "session", ".", "Acquisition", "(", "Escape", "latencies", ",", "seconds", ")", "and", "retention", "performances", "(", "Time", "in", "target", "quadrant", ",", "seconds", ")", "are", "shown", "for", "the", "3", "groups", "of", "mice", ".", "All", "groups", "of", "mice", "displayed", "significant", "acquisition", "of", "the", "platform", "location", "(", "Day", "effect", ",", "F", "(", "4", ",", "148", ")", "=", "26", ".", "45", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Group", "and", "Group", "X", "Day", "effects", ",", "ns", ")", ",", "but", "only", "TAU", "VEH", "exhibited", "impaired", "retention", ".", "CSP", "-", "TTK21", "treatment", "fully", "restored", "the", "ability", "of", "THY", "-", "Tau22", "mice", "to", "remember", "the", "platform", "location", ".", "Bar", "graphs", "are", "mean", "±", "SEM", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "to", "a", "constant", "value", ",", "#", "when", "compared", "to", "random", "(", "dotted", "line", ",", "15sec", ")", "WT", "VEH", ",", "t", "(", "16", ")", "=", "4", ".", "6323", ",", "#", "p", "=", "0", ".", "0002", ";", "TAU", "VEH", ",", "t", "(", "9", ")", "=", "0", ".", "3606", ",", "p", "=", "0", ".", "7267", ";", "TAU", "MOL", ",", "t", "(", "12", ")", "=", "3", ".", "945", ",", "#", "p", "=", "0", ".", "0019", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "F", "(", "2", ",", "37", ")", "=", "3", ".", "55", ";", "p", "=", "0", ".", "03", ";", "*", "in", "the", "different", "comparisons", ":", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0166", ";", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "040", ";", "TAU", "MOL", "vs", "WT", "VEH", ",", "non", "significant", "p", "=", "0", ".", "437", ")", ".", "TQ", ",", "Target", "Quadrant", ";", "O", ",", "Other", ",", "corresponds", "to", "the", "mean", "of", "the", "3", "other"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunohistochemistry performed on 12 month-old THY-Tau22 mice showing AT100-positive neurons (green), CBP-positive nuclei (red) and DAPI-stained nuclei (blue) in the CA1 region of the dorsal hippocampus. A representative image is shown with a focus. Scale bars: 40µm and 20µm as noted. (n=5 mice). Arrows depict neurons bearing neurofibrillary tangles and do not display CBP immunostaining. The star depicts a ghost tangle (AT100-positive neuron and no nucleus)Western blot analyses perfomed in the dorsal hippocampus of 12 month-old THY-Tau22 mice compared to age-matched controls. NeuN, actin, tubulin and total H2B levels are not changed. Phosphorylated tau on serine 404 (Tau-Ph404) attest for samples from tauopathic mice. Quantification represents the ration of the protein level detected on the total amount of proteins on the membranes, with WT arbitrarily set at 1 (fold induction). Bar graphs are mean ± SEM. n=5-7/group as noted, multiple t tests, CBP * p=0.003 and GFAP **p=0.0001 for THY-Tau vs. WT miceRNA-sequencing data performed in the hippocampus of 8 month-old mice. Functional analyses (DAVID GOTERM) performed on significantly deregulated genes in THY-Tau22 mice compared to WT mice. Representative genes are presented below. |log2 Fold Change| > 0.2; * indicates FDR<0.05. IEG, Immediate Early Genes. Predicted promoter motif (right) analyses performed with GREAT. Groups: WT mice (n=3), THY-Tau22 mice (n=2)Long-term spatial memory testing: Mice were injected 3 times (1 per week) with Vehicle (WT mice saline, WT VEH, n=17), Vehicle (THY-Tau22 mice CSP, 500 μg /mouse, TAU VEH, n=10) or Molecule (THY-Tau22 mice CSP-TTK21, 500 μg/mice TAU MOL, n=13) before training of spatial memory in the Morris water maze (MWM); retention (Probe test) was tested 10 days after the last training session. Acquisition (Escape latencies, seconds) and retention performances (Time in target quadrant, seconds) are shown for the 3 groups of mice. All groups of mice displayed significant acquisition of the platform location (Day effect, F(4,148)= 26.45, p<0.001; Group and Group X Day effects, ns), but only TAU VEH exhibited impaired retention. CSP-TTK21 treatment fully restored the ability of THY-Tau22 mice to remember the platform location. Bar graphs are mean ± SEM. Student's t test to a constant value, # when compared to random (dotted line, 15sec) WT VEH, t(16)=4.6323, #p=0.0002; TAU VEH, t(9)=0.3606, p=0.7267; TAU MOL, t(12)=3.945, #p=0.0019. One-way ANOVA; F(2,37)= 3.55; p= 0.03; * in the different comparisons: TAU MOL vs. TAU VEH, *p=0.0166; WT VEH vs. TAU VEH, *p= 0.040; TAU MOL vs WT VEH, non significant p=0.437). TQ, Target Quadrant; O, Other, corresponds to the mean of the 3 other quadrants"}
{"words": ["Figure", "2The", "timeline", "of", "GFP", "-", "lentivirus", "and", "CSP", "or", "CSP", "-", "TTK21", "(", "one", "injection", ",", "500", "μg", "/", "mouse", ")", "injection", "is", "shown", ".", "(", "Left", ")", "The", "total", "number", "of", "spines", "was", "significantly", "decreased", "in", "TAU", "VEH", "compared", "to", "WT", "VEH", "mice", ".", "TAU", "MOL", "hippocampi", "showed", "a", "significant", "increase", "in", "the", "total", "number", "of", "spines", "compared", "to", "TAU", "VEH", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0011", ",", "post", "hoc", "Holm", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "F", "(", "2", ",", "243", ")", "=", "7", ".", "03", ";", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "p", "<", "0", ".", "0009", ";", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "p", "=", "0", ".", "0455", ")", ".", "(", "Middle", ")", "Based", "on", "spine", "type", ",", "the", "number", "of", "head", "spines", "(", "Mushrooms", ",", "thins", ")", "was", "significantly", "lower", "in", "both", "TAU", "VEH", "and", "TAU", "MOL", "than", "in", "WT", "VEH", "controls", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0018", ",", "post", "hoc", "Holm", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "F", "(", "2", ",", "243", ")", "=", "6", ".", "467", ";", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "p", "=", "0", ".", "0013", ";", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "MOL", ",", "p", "=", "0", ".", "0272", ".", "Stubby", "spine", "density", "was", "significantly", "increased", "in", "TAU", "MOL", "compared", "to", "TAU", "VEH", "mice", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", "F", "(", "2", ",", "243", ")", "=", "4", ".", "311", ",", "p", "=", "0", ".", "0145", ",", "post", "hoc", "Holm", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "p", "=", "0", ".", "0109", ")", ",", "as", "the", "number", "of", "filopodia", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", "F", "(", "2", ",", "243", ")", "=", "3", ".", "845", ",", "p", "=", "0", ".", "0227", ",", "post", "hoc", "Holm", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "p", "=", "0", ".", "0179", ")", ".", "(", "Right", ")", "Typical", "images", "are", "presented", "showing", "a", "dendrite", "fragment", "for", "each", "condition", ".", "White", "arrowhead", "depicts", "stubby", "spines", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "μm", ".", "Number", "of", "dendritc", "segments", ":", "WT", "VEH", ",", "n", "=", "67", ";", "TAU", "VEH", ",", "n", "=", "93", ",", "TAU", "MOL", ",", "n", "=", "87", ";", "Number", "of", "neurons", ":", "WT", "VEH", ",", "n", "=", "20", ";", "TAU", "VEH", ",", "n", "=", "28", ",", "TAU", "MOL", ",", "n", "=", "16", ";", "Number", "of", "mice", ":", "WT", "VEH", ",", "n", "=", "2", ";", "TAU", "VEH", ",", "n", "=", "3", ",", "TAU", "MOL", ",", "n", "=", "3", "CSP", "-", "TTK21", "injection", "into", "THY", "-", "Tau22", "mice", "rescues", "mature", "dendritic", "spines", "formation", "in", "response", "to", "learning", ".", "(", "Top", "left", ")", "The", "time", "line", "of", "injections", "is", "shown", ":", "Mice", "were", "injected", "3", "times", "(", "1", "per", "week", ")", "with", "Vehicle", "(", "WT", "mice", ",", "WT", "VEH", ",", "NaCl", "0", ".", "9", "%", ")", ",", "Vehicle", "(", "THY", "-", "Tau22", "mice", "(", "TAU", "VEH", ")", ",", "CSP", "500", "μg", "/", "mouse", ")", "or", "Molecule", "(", "THY", "-", "Tau22", "mice", "(", "TAU", "MOL", ")", ",", "500", "μg", "/", "mice", ")", "and", "either", "trained", "over", "a", "4", "-", "day", "acquisition", "period", "in", "the", "MWM", "(", "\"", "learning", "\"", "group", ")", "or", "left", "in", "their", "home", "cage", "(", "\"", "basal", "\"", "group", ")", ".", "Mushroom", "-", "shaped", "spines", "were", "counted", "in", "dorsal", "CA1", ",", "four", "days", "post", "-", "training", ".", "(", "Bottom", "left", ")", "The", "number", "of", "mature", "spines", "was", "significantly", "increased", "by", "learning", "in", "WT", "VEH", "and", "TAU", "MOL", "mice", ".", "Bar", "graphs", "are", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", ";", "Learning", "effect", ",", "F", "(", "1", ",", "139", ")", "=", "54", ".", "18", ";", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "#", "#", "#", "post", "hoc", "Holm", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "Learning", "vs", ".", "Basal", "in", "WT", "VEH", "(", "p", "=", "0", ".", "0001", ")", "and", "in", "TAU", "MOL", "mice", ";", "(", "p", "=", "0", ".", "0001", ")", ".", "After", "learning", ",", "WT", "VEH", "and", "TAU", "MOL", "mice", "displayed", "significantly", "higher", "number", "of", "mature", "spines", "than", "TAU", "VEH", "mice", "(", "Genotype", "X", "Treatment", "effect", ",", "F", "(", "2", ",", "139", ")", "=", "9", ".", "704", ";", "p", "=", "0", ".", "0001", ";", "*", "*", "*", "post", "hoc", "Holm", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", "(", "p", "=", "0", ".", "0001", ")", ",", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "VEH", "(", "p", "=", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "Right", ")", "Typical", "examples", "of", "a", "dendritic", "fragment", "bearing", "mushroom", "spines", "(", "arrows", ")", "are", "shown", "for", "each", "sub", "-", "group", "in", "response", "to", "learning", ".", "Number", "of", "dendritc", "segments", ":", "Learning", ":", "WT", "VEH", ",", "n", "=", "27", ";", "TAU", "VEH", ",", "n", "=", "27", ",", "TAU", "MOL", ",", "n", "=", "30", ";", "WT", "VEH", "_", "HC", ",", "n", "=", "27", ";", "Number", "of", "mice", ":", "WT", "VEH", ",", "n", "=", "3", ";", "TAU", "VEH", ",", "n", "=", "3", ",", "TAU", "MOL", ",", "n", "=", "3", ".", "Basal", ":", "WT", "VEH", ",", "n", "=", "27", ";", "TAU", "VEH", ",", "n", "=", "7", ",", "TAU", "MOL", ",", "n", "=", "15", ";", "Number", "of", "mice", ":", "WT", "VEH", ",", "n", "=", "3", ";", "TAU", "VEH", ",", "n", "=", "3", ",", "TAU", "MOL", ",", "n", "=", "2", "Mice", "were", "injected", "3", "times", "(", "1", "per", "week", ")", "with", "saline", "(", "WT", "VEH", ")", ",", "CSP", "(", "Vehicle", ",", "VEH", ")", "or", "CSP", "-", "TTK21", "(", "Molecule", ",", "MOL", ")", "(", "500", "μg", "/", "mice", ";", "THY", "-", "Tau22", "mice", "(", "TAU", ")", "before", "euthanasia", ".", "Long", "Term", "Depression", "measurements", "were", "performed", "on", "hippocampal", "slices", ".", "(", "Top", "left", ")", "Examples", "of", "analog", "traces", "recorded", "10", "min", "before", "(", "a", ")", "and", "55", "min", "after", "LTD", "induction", "(", "b", ";", "dotted", "line", ")", "in", "the", "three", "groups", "of", "mice", ".", "(", "Bottom", "left", ")", "Time", "course", "of", "LTD", ";", "LTD", "is", "expressed", "as", "a", "percent", "change", "in", "fEPSP", "(", "field", "excitatory", "postsynaptic", "potentials", ")", "slope", "over", "time", ".", "After", "the", "20", "-", "min", "baseline", "recording", ",", "a", "low", "-", "frequency", "stimulation", "(", "LFS", ",", "2Hz", "for", "10", "min", ")", "was", "applied", "(", "arrow", ")", ".", "Recording", "was", "stopped", "during", "the", "10", "-", "min", "conditioning", "stimulation", "and", "resumed", "after", "completion", "of", "LFS", ".", "LFS", "induced", "a", "strong", "depression", "of", "the", "fEPSP", "slope", ",", "which", "recovered", "partially", "to", "reach", "a", "stable", "level", "of", "depression", "about", "20", "min", "after", "stimulation", ".", "(", "Right", ")", "Average", "depression", "measured", "in", "the", "last", "10", "min", "of", "LTD", ".", "LTD", "was", "significantly", "different", "in", "TAU", "VEH", "(", "88", ".", "4", "±", "4", ".", "1", "%", "of", "the", "baseline", ",", "n", "=", "10", ")", "compared", "to", "controls", "(", "WT", "VEH", ",", "71", ".", "1", "±", "4", ".", "4", "%", ",", "n", "=", "9", ")", "(", "F", "(", "1", ",", "17", ")", "=", "8", ".", "8", ",", "p", "=", "0", ".", "008", ")", ".", "CSP", "-", "TTK21", "treatment", "restored", "LTD", "to", "control", "levels", "(", "64", ".", "9", "±", "5", ".", "2", "%", ",", "n", "=", "10", ")", "(", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "MOL", ":", "F", "(", "1", ",", "17", ")", "=", "0", ".", "83", ",", "p", "=", "0", ".", "37", ",", "ns", ";", "TAU", "VEH", "vs", ".", "TAU", "MOL", ":", "F", "(", "1", ",", "18", ")", "=", "13", ".", "2", ".", "p", "=", "0", ".", "0019", ")", ".", "Bar", "graphs", "are", "mean", "±"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The timeline of GFP-lentivirus and CSP or CSP-TTK21 (one injection, 500 μg/mouse) injection is shown. (Left) The total number of spines was significantly decreased in TAU VEH compared to WT VEH mice. TAU MOL hippocampi showed a significant increase in the total number of spines compared to TAU VEH (One-way ANOVA p=0.0011, post hoc Holm Sidak's multiple comparisons test F(2,243) = 7.03; WT VEH vs. TAU VEH, p < 0.0009; TAU MOL vs. TAU VEH, p=0.0455). (Middle) Based on spine type, the number of head spines (Mushrooms, thins) was significantly lower in both TAU VEH and TAU MOL than in WT VEH controls (One-way ANOVA p=0.0018, post hoc Holm Sidak's multiple comparisons test F(2,243) = 6.467; WT VEH vs. TAU VEH, p=0.0013; WT VEH vs. TAU MOL, p=0.0272. Stubby spine density was significantly increased in TAU MOL compared to TAU VEH mice (One-way ANOVA F(2,243) = 4.311, p = 0.0145, post hoc Holm Sidak's multiple comparisons test: TAU MOL vs. TAU VEH, p=0.0109), as the number of filopodia (One-way ANOVA F(2,243) = 3.845, p = 0.0227, post hoc Holm Sidak's multiple comparisons test TAU MOL vs. TAU VEH, p=0.0179). (Right) Typical images are presented showing a dendrite fragment for each condition. White arrowhead depicts stubby spines. Scale bar, 2 μm. Number of dendritc segments: WT VEH, n=67; TAU VEH, n=93, TAU MOL, n=87; Number of neurons: WT VEH, n=20; TAU VEH, n=28, TAU MOL, n=16; Number of mice: WT VEH, n=2; TAU VEH, n=3, TAU MOL, n=3 CSP-TTK21 injection into THY-Tau22 mice rescues mature dendritic spines formation in response to learning. (Top left) The time line of injections is shown: Mice were injected 3 times (1 per week) with Vehicle (WT mice, WT VEH, NaCl 0.9%), Vehicle (THY-Tau22 mice (TAU VEH), CSP 500 μg /mouse) or Molecule (THY-Tau22 mice (TAU MOL), 500 μg/mice) and either trained over a 4-day acquisition period in the MWM (\"learning\" group) or left in their home cage (\"basal\" group). Mushroom-shaped spines were counted in dorsal CA1, four days post-training. (Bottom left) The number of mature spines was significantly increased by learning in WT VEH and TAU MOL mice. Bar graphs are mean ± SEM. (Two-way ANOVA; Learning effect, F(1, 139)=54.18; p< 0.0001; ### post hoc Holm Sidak's multiple comparisons test: Learning vs. Basal in WT VEH (p=0.0001) and in TAU MOL mice; (p=0.0001). After learning, WT VEH and TAU MOL mice displayed significantly higher number of mature spines than TAU VEH mice (Genotype X Treatment effect, F(2,139)= 9.704; p=0.0001; *** post hoc Holm Sidak's multiple comparisons test: TAU MOL vs. TAU VEH (p=0.0001), WT VEH vs. TAU VEH (p=0.0001). (Right) Typical examples of a dendritic fragment bearing mushroom spines (arrows) are shown for each sub-group in response to learning. Number of dendritc segments: Learning: WT VEH, n=27; TAU VEH, n=27, TAU MOL, n=30; WT VEH_HC, n=27; Number of mice: WT VEH, n=3; TAU VEH, n=3, TAU MOL, n=3. Basal: WT VEH, n=27; TAU VEH, n=7, TAU MOL, n=15; Number of mice: WT VEH, n=3; TAU VEH, n=3, TAU MOL, n=2 Mice were injected 3 times (1 per week) with saline (WT VEH), CSP (Vehicle, VEH) or CSP-TTK21 (Molecule, MOL) (500 μg/mice; THY-Tau22 mice (TAU) before euthanasia. Long Term Depression measurements were performed on hippocampal slices. (Top left) Examples of analog traces recorded 10 min before (a) and 55 min after LTD induction (b; dotted line) in the three groups of mice. (Bottom left) Time course of LTD; LTD is expressed as a percent change in fEPSP (field excitatory postsynaptic potentials) slope over time. After the 20-min baseline recording, a low-frequency stimulation (LFS, 2Hz for 10 min) was applied (arrow). Recording was stopped during the 10-min conditioning stimulation and resumed after completion of LFS. LFS induced a strong depression of the fEPSP slope, which recovered partially to reach a stable level of depression about 20 min after stimulation. (Right) Average depression measured in the last 10 min of LTD. LTD was significantly different in TAU VEH (88.4 ± 4.1% of the baseline, n=10) compared to controls (WT VEH, 71.1 ± 4.4%, n=9) (F(1,17)=8.8, p=0.008). CSP-TTK21 treatment restored LTD to control levels (64.9 ± 5.2%, n=10) (WT VEH vs. TAU MOL: F(1,17)=0.83, p=0.37, ns; TAU VEH vs. TAU MOL: F(1,18)=13.2. p=0.0019). Bar graphs are mean ± SEM"}
{"words": ["Figure", "3Volcano", "plot", "showing", "that", "2756", "genes", "are", "differentially", "regulated", "between", "THY", "-", "Tau22", "and", "WT", "mice", "during", "learning", ".", "The", "log2", "(", "Fold", "-", "Change", ")", "was", "estimated", "by", "DESeq2", ".", "FDR", "<", "0", ".", "05", "and", "|", "log2", "Fold", "Change", "|", ">", "0", ".", "2", ".", "Red", "dots", "correspond", "to", "genes", "with", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "Numbers", "in", "the", "corners", "represent", "the", "number", "of", "down", "-", "regulated", "(", "left", ")", "and", "up", "-", "regulated", "(", "right", ")", "genes", ".", "C", "Heatmap", "representing", "expression", "of", "z", "-", "score", "of", "the", "2756", "deregulated", "genes", "in", "all", "experimental", "conditions", ".", "Color", "-", "coding", "was", "performed", "according", "to", "the", "z", "-", "score", "of", "the", "normalized", "reads", "counts", "divided", "by", "gene", "length", ".", "Clustering", "was", "performed", "using", "the", "Unweighted", "Pair", "Group", "Method", "with", "Arithmetic", "mean", "method", "and", "the", "Pearson", "\"", "s", "distance", ".", "Groups", ":", "WT", "VEH", "_", "HC", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "WT", "VEH", "(", "n", "=", "2", ")", ";", "TAU", "VEH", "(", "n", "=", "2", ")", ";", "TAU", "MOLVolcano", "plot", "showing", "that", "1756", "genes", "are", "differentially", "regulated", "between", "treated", "-", "THY", "-", "Tau22", "and", "WT", "mice", "during", "learning", ".", "Same", "parameters", "as", "in", "BF", ",", "G", "Volcano", "plots", "showing", "differentially", "regulated", "genes", "by", "the", "molecule", "in", "THY", "-", "Tau22", "mice", "(", "F", ")", "and", "by", "learning", "in", "WT", "mice", "(", "G", ")", ".", "Same", "parameters", "as", "in"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Volcano plot showing that 2756 genes are differentially regulated between THY-Tau22 and WT mice during learning. The log2(Fold-Change) was estimated by DESeq2. FDR<0.05 and |log2 Fold Change| > 0.2. Red dots correspond to genes with adjusted p-value <0.05. Numbers in the corners represent the number of down-regulated (left) and up-regulated (right) genes. C Heatmap representing expression of z-score of the 2756 deregulated genes in all experimental conditions. Color-coding was performed according to the z-score of the normalized reads counts divided by gene length. Clustering was performed using the Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean method and the Pearson\"s distance. Groups: WT VEH_HC (n=3), WT VEH (n=2); TAU VEH (n=2); TAU MOLVolcano plot showing that 1756 genes are differentially regulated between treated-THY-Tau22 and WT mice during learning. Same parameters as in BF, G Volcano plots showing differentially regulated genes by the molecule in THY-Tau22 mice (F) and by learning in WT mice (G). Same parameters as in B"}
{"words": ["Figure", "4Heatmap", "representing", "expression", "z", "-", "score", "of", "the", "98", "significantly", "over", "-", "expressed", "genes", "in", "the", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", "comparison", ",", "for", "all", "experimental", "conditions", ".", "Color", "-", "coding", "was", "performed", "according", "to", "the", "z", "-", "score", "of", "the", "normalized", "reads", "counts", "divided", "by", "gene", "length", ".", "Clustering", "was", "performed", "using", "the", "Unweighted", "Pair", "Group", "Method", "with", "Arithmetic", "mean", "method", "and", "the", "Pearson", "\"", "s", "disRNA", "-", "seq", "data", "showing", "expression", "of", "several", "immediate", "early", "genes", "(", "IEGs", ")", ":", "Nr4a1", ",", "Arc", ",", "Egr1", ",", "Dusp1", ",", "Fos", "and", "Junb", ".", "Most", "of", "the", "down", "-", "regulated", "IEGs", "in", "tauopathic", "compared", "to", "WT", "mice", "present", "a", "significant", "induction", "in", "THY", "-", "Tau22", "mice", "after", "CSP", "-", "TTK21", "injection", ".", "Adjusted", "p", "-", "values", "corresponding", "to", "p", "<", "0", ".", "05", "are", "indicated", "by", "*", ",", "for", "WT", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", "_", "HC", ",", "$", "for", "TAU", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", "and", "#", ",", "for", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEHRNA", "-", "seq", "data", "showing", "that", "CSP", "-", "TTK21", "treatment", "of", "tauopathic", "mice", "restored", "the", "expression", "of", "plasticity", "/", "memory", "-", "relevant", "target", "genes", ":", "Klotho", "(", "Kl", ")", ",", "and", "Neurotensin", "(", "Nts", ")", ".", "Adjusted", "p", "values", "corresponding", "to", "p", "<", "0", ".", "05", "are", "indicated", "by", "*", ",", "for", "WT", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", "_", "HC", ",", "$", "for", "TAU", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", "and", "#", ",", "for", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", ".", "F", "RT", "-", "qPCR", "validations", "performed", "in", "a", "different", "cohort", "of", "mice", "from", "the", "RNA", "-", "seq", "study", "(", "n", "=", "4", "-", "5", "/", "group", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "uncorrected", "Fisher", "\"", "s", "test", ".", "Klotho", ",", "Kl", ":", "F", "(", "3", ",", "16", ")", "=", "2", ".", "949", ",", "p", "=", "0", ".", "0643", ";", "*", "learning", "p", "=", "0", ".", "0145", "for", "WT", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", "_", "HC", ",", "$", "pathology", "p", "=", "0", ".", "0395", "for", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "VEH", ".", "Nts", ":", "F", "(", "3", ",", "14", ")", "=", "4", ".", "290", ",", "p", "=", "0", ".", "0241", ";", "$", "pathology", "p", "=", "0", ".", "0036", "for", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "#", "molecule", "p", "=", "0", ".", "0081", "for", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAWestern", "blot", "for", "Klotho", "and", "Neurotensin", "expression", "in", "the", "different", "experimental", "conditions", ".", "Immunoblot", "results", "are", "shown", "(", "n", "=", "5", "/", "group", ")", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "quantification", "of", "the", "protein", "levels", "as", "percentage", "of", "the", "control", "group", "WT", "VEH", "_", "HC", ",", "arbitrarily", "set", "at", "100", "%", ".", "Each", "detected", "protein", "was", "normalized", "to", "the", "corresponding", "amount", "of", "total", "proteins", "in", "the", "gels", "or", "the", "nitrocellulose", "membrane", ".", "Klotho", "and", "Neurotensin", "were", "further", "normalized", "to", "the", "level", "of", "actin", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "uncorrected", "Fisher", "\"", "s", "test", ".", "Klotho", ":", "F", "(", "3", ",", "16", ")", "=", "5", ".", "192", ",", "p", "=", "0", ".", "0107", ",", "*", "learning", "p", "=", "0", ".", "0117", "for", "WT", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", "_", "HC", ",", "$", "pathology", "p", "=", "0", ".", "0027", "for", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "#", "molecule", "p", "=", "0", ".", "0282", "for", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", ".", "Nts", ":", "F", "(", "3", ",", "16", ")", "=", "3", ".", "748", ",", "p", "=", "0", ".", "0326", ",", "$", "pathology", "p", "=", "0", ".", "0200", "for", "WT", "VEH", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "#", "molecule", "p", "=", "0", ".", "0079", "for", "TAU", "MOL", "vs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Heatmap representing expression z-score of the 98 significantly over-expressed genes in the TAU MOL vs. TAU VEH comparison, for all experimental conditions. Color-coding was performed according to the z-score of the normalized reads counts divided by gene length. Clustering was performed using the Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean method and the Pearson\"s disRNA-seq data showing expression of several immediate early genes (IEGs) : Nr4a1, Arc, Egr1, Dusp1, Fos and Junb. Most of the down-regulated IEGs in tauopathic compared to WT mice present a significant induction in THY-Tau22 mice after CSP-TTK21 injection. Adjusted p-values corresponding to p<0.05 are indicated by *, for WT VEH vs. WT VEH_HC, $ for TAU VEH vs. WT VEH and #, for TAU MOL vs. TAU VEHRNA-seq data showing that CSP-TTK21 treatment of tauopathic mice restored the expression of plasticity/memory-relevant target genes : Klotho (Kl), and Neurotensin (Nts). Adjusted p values corresponding to p<0.05 are indicated by *, for WT VEH vs. WT VEH_HC, $ for TAU VEH vs. WT VEH and #, for TAU MOL vs. TAU VEH. F RT-qPCR validations performed in a different cohort of mice from the RNA-seq study (n=4-5/group). One-way ANOVA with uncorrected Fisher\"s test. Klotho, Kl: F(3,16)=2.949, p=0.0643; * learning p=0.0145 for WT VEH vs. WT VEH_HC, $ pathology p=0.0395 for WT VEH vs. TAU VEH. Nts: F(3,14)=4.290, p=0.0241; $ pathology p=0.0036 for WT VEH vs. TAU VEH, # molecule p=0.0081 for TAU MOL vs. TAWestern blot for Klotho and Neurotensin expression in the different experimental conditions. Immunoblot results are shown (n=5/group). Bar graphs represent the quantification of the protein levels as percentage of the control group WT VEH_HC, arbitrarily set at 100%. Each detected protein was normalized to the corresponding amount of total proteins in the gels or the nitrocellulose membrane. Klotho and Neurotensin were further normalized to the level of actin. One-way ANOVA with uncorrected Fisher\"s test. Klotho: F(3,16)=5.192, p=0.0107, * learning p=0.0117 for WT VEH vs. WT VEH_HC, $ pathology p=0.0027 for WT VEH vs. TAU VEH, # molecule p=0.0282 for TAU MOL vs. TAU VEH. Nts: F(3,16)=3.748, p=0.0326, $ pathology p=0.0200 for WT VEH vs. TAU VEH, # molecule p=0.0079 for TAU MOL vs. TA"}
{"words": ["Figure", "5A", "Functional", "annotation", "charts", "(", "Benjamini", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "using", "using", "DAVID", "(", "GOTERM", "_", "Cellular", "Component", ")", "perfomed", "on", "the", "82", "significantly", "down", "-", "regulated", "genes", "by", "CSP", "-", "TTK21", "treatment", "in", "tauopathic", "mice", "(", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", ")", ",", "showing", "a", "significant", "association", "with", "neuronal", "terms", ".", "Significance", "is", "indicated", "as", "-", "log10", "(", "Benjamini", "p", "_", "value", ")", ".", "B", "Heatmap", "representing", "expression", "z", "-", "score", "of", "the", "82", "significantly", "down", "-", "regulated", "genes", "in", "the", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", "comparison", ",", "for", "all", "experimental", "conditions", ".", "Color", "-", "coding", "was", "performed", "according", "to", "the", "z", "-", "score", "of", "the", "normalized", "reads", "counts", "divided", "by", "gene", "length", ".", "Clustering", "was", "performed", "using", "the", "Unweighted", "Pair", "Group", "Method", "with", "Arithmetic", "mean", "method", "and", "the", "Pearson", "\"", "s", "disC", "RNA", "-", "seq", "data", "showing", "expression", "of", "several", "genes", "belonging", "to", "«", "synapse", "»", "annotation", "(", "DAVID", ")", ":", "Grik4", ",", "Homer3", "and", "Sv2b", ",", "which", "are", "significantly", "down", "-", "regulated", "by", "CSPTTK21", "treatment", "in", "THY", "-", "Tau22", "mice", ".", "Adjusted", "p", "values", "corresponding", "to", "p", "<", "0", ".", "05", "are", "indicated", "by", "*", "for", "WT", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", "_", "HC", ",", "$", "for", "TAU", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", "and", "#", ",", "for", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Functional annotation charts (Benjamini, p<0.05) using using DAVID (GOTERM_Cellular Component) perfomed on the 82 significantly down-regulated genes by CSP-TTK21 treatment in tauopathic mice (TAU MOL vs. TAU VEH), showing a significant association with neuronal terms. Significance is indicated as -log10(Benjamini p_value). B Heatmap representing expression z-score of the 82 significantly down-regulated genes in the TAU MOL vs. TAU VEH comparison, for all experimental conditions. Color-coding was performed according to the z-score of the normalized reads counts divided by gene length. Clustering was performed using the Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean method and the Pearson\"s disC RNA-seq data showing expression of several genes belonging to « synapse » annotation (DAVID): Grik4, Homer3 and Sv2b, which are significantly down-regulated by CSPTTK21 treatment in THY-Tau22 mice. Adjusted p values corresponding to p<0.05 are indicated by * for WT VEH vs. WT VEH_HC, $ for TAU VEH vs. WT VEH and #, for TAU MOL vs. TAU VEH"}
{"words": ["Figure", "6Mean", "H2Bac", "profiles", "at", "TSS", "relative", "to", "gene", "expression", "obtained", "from", "RNA", "-", "seq", "data", ".", "Expressed", "genes", "were", "separated", "into", "4", "groups", "(", "Q1", "to", "Q4", ",", "6483", "genes", "/", "group", ")", ",", "Q1", "representing", "the", "less", "expressed", "genes", "(", "0", "-", "25", "%", ")", "and", "Q4", ",", "the", "most", "expressed", "genes", "(", "75", "-", "100", "%", ")", ".", "Profiles", "were", "established", "with", "SeqMiner", "centered", "on", "TSS", "±", "2Kb", ".", "C", "Mean", "H2Bac", "profiles", "established", "with", "SeqMiner", "for", "all", "genes", "at", "TSS", "(", "top", ")", "and", "gene", "bodies", "(", "bottom", ")", "for", "the", "4th", "quartile", "(", "most", "expressed", "genes", ")", "in", "the", "two", "replicates", "(", "rep1", "and", "rep2", ")", ".", "Significance", "(", "Benjamini", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "of", "the", "annotations", "associated", "with", "both", "TSS", "(", "green", ")", "or", "Gene", "profiles", "(", "red", ")", "are", "shown", "(", "DAVID", ",", "KEGG", "Pathways", ")", "Differentially", "regulated", "H2Bac", "peaks", "were", "analyzed", "with", "SICER", "and", "significant", "Fold", "Changes", "(", "FC", ">", "1", ";", "FDR", "<", "0", ".", "001", ")", "between", "comparisons", "are", "shown", "for", "the", "pathology", "(", "TAU", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", ",", "blue", ")", "and", "the", "effect", "of", "the", "molecule", "(", "TAU", "MOL", "vs", ".", "TAU", "VEH", ",", "red", ")", ".", "Fold", "Change", "is", "shown", "as", "log2", "(", "Fold", "Change", ")", "(", "X", "-", "axis", ")", "and", "significance", ",", "as", "-", "log10", "(", "FDR", ")", "(", "Y", "-", "axis", ")", "Mean", "H2Bac", "and", "H3K27ac", "profiles", "established", "with", "SeqMiner", "for", "the", "1624", "decreased", "peaks", "obtained", "in", "the", "comparison", "TAU", "VEH", "vs", ".", "WT", "VEH", ".", "H2Bac", "but", "not", "H3K27ac", "peaks", "show", "differential", "regulationTime", "series", "Like", "plot", ".", "For", "every", "significant", "H2Bac", "decreased", "regions", "(", "1624", ")", "in", "WT", "VEH", "vs", "TAU", "VEH", ",", "normalized", "read", "counts", "were", "computed", "for", "each", "of", "the", "different", "conditions", "(", "WT", "VEH", ",", "TAU", "VEH", ",", "TAU", "MOL", ")", ".", "Fold", "changes", "are", "all", "referring", "to", "WT", "VEH", ".", "Y", "-", "axis", ":", "Fold", "change", ".", "X", "-", "axis", ":"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Mean H2Bac profiles at TSS relative to gene expression obtained from RNA-seq data. Expressed genes were separated into 4 groups (Q1 to Q4, 6483 genes/group), Q1 representing the less expressed genes (0-25%) and Q4, the most expressed genes (75-100%). Profiles were established with SeqMiner centered on TSS ±2Kb. C Mean H2Bac profiles established with SeqMiner for all genes at TSS (top) and gene bodies (bottom) for the 4th quartile (most expressed genes) in the two replicates (rep1 and rep2). Significance (Benjamini, p<0.05) of the annotations associated with both TSS (green) or Gene profiles (red) are shown (DAVID, KEGG Pathways)Differentially regulated H2Bac peaks were analyzed with SICER and significant Fold Changes (FC>1; FDR<0.001) between comparisons are shown for the pathology (TAU VEH vs. WT VEH, blue) and the effect of the molecule (TAU MOL vs. TAU VEH, red). Fold Change is shown as log2 (Fold Change) (X-axis) and significance, as -log10(FDR) (Y-axis)Mean H2Bac and H3K27ac profiles established with SeqMiner for the 1624 decreased peaks obtained in the comparison TAU VEH vs. WT VEH. H2Bac but not H3K27ac peaks show differential regulationTime series Like plot. For every significant H2Bac decreased regions (1624) in WT VEH vs TAU VEH, normalized read counts were computed for each of the different conditions (WT VEH, TAU VEH, TAU MOL). Fold changes are all referring to WT VEH. Y-axis: Fold change. X-axis: Conditions"}
{"words": ["Figure", "7A", "Mean", "enrichment", "profiles", "performed", "with", "SeqMiner", "presenting", "the", "genomic", "distribution", "of", "H2Bac", "and", "H3K27ac", "reads", "obtained", "in", "ChIP", "-", "seq", "experiments", "in", "the", "different", "experimental", "groups", ",", "established", "along", "putative", "neuronal", "CBP", "enhancers", "(", "±", "4Kb", ")", "(", "Kim", "et", "al", ".", ",", "2010", ")", ".", "In", "the", "dorsal", "hippocampus", ",", "H2Bac", "levels", "are", "enriched", "at", "CBP", "enhancers", "in", "WT", "WEH", "(", "blue", ")", ",", "decreased", "in", "tauopathic", "mice", "(", "TAU", "VEH", ",", "pink", ")", "and", "induced", "by", "CSP", "-", "TTK21", "treatment", "(", "TAU", "MOL", ",", "green", ")", ".", "B", "Mean", "profiles", "were", "separated", "in", "two", "sets", "of", "loci", ",", "including", "17817", "peaks", "highly", "enriched", "in", "H2Bac", "and", "showing", "a", "differential", "regulation", "in", "the", "experimental", "groups", "and", "23331", "peaks", "that", "were", "poorly", "enriched", "in", "H2Bac", "and", "not", "regulatedMean", "profiles", "established", "with", "SeqMiner", "for", "all", "genes", "at", "TSS", "for", "H2Bac", "(", "Left", ")", "and", "H3K27ac", "(", "Right", ")", ".", "H2Bac", "but", "not", "H3K24ac", "presents", "a", "differential", "regulation", "at", "TSSMean", "H2Bac", "profiles", "established", "with", "SeqMiner", "on", "the", "differentially", "regulated", "genes", "obtained", "in", "transcriptomic", "experiments", "(", "RNA", "-", "seq", ")", ",", "either", "decreased", "(", "left", ")", "or", "increased", "(", "right", ")", ".", "The", "'", "basal", "'", "H2Bac", "TSS", "enrichment", "state", "of", "these", "genes", "is", "differentially", "regulated", "whether", "the", "genes", "are", "decreased", "or", "increased", "in", "response", "to", "learningUCSC", "genome", "browser", "view", "of", "the", "c", "-", "fos", "genomic", "locus", "with", "H3K27ac", "ChIP", "-", "seq", "(", "blue", ")", ",", "H2Bac", "ChIP", "-", "seq", "(", "green", ")", "and", "Input", "(", "black", ")", "signals", ".", "Blue", "shading", "indicates", "locations", "of", "the", "c", "-", "fos", "enhancers", "(", "Joo", "et", "al", ".", ",", "2016", ")", ";", "gray", "shading", "indicates", "location", "of", "the", "promoter", ".", "Differential", "peaks", "were", "analyzed", "with", "SICER", ".", "This", "set", "of", "data", "shows", "that", "H2Bac", "levels", "were", "significantly", "decreased", "at", "e1", "(", "FDR", "=", "1", ".", "95", ".", "10", "-", "08", ")", ",", "e2", "(", "FDR", "=", "0", ".", "0005", ")", "and", "e5", "(", "FDR", "=", "2", ".", "44", ".", "10", "-", "05", ")", "enhancers", "in", "THY", "-", "Tau22", "compared", "to", "WT", "mice", ",", "and", "significantly", "enriched", "at", "e1", "(", "FDR", "=", "4", ".", "01", ".", "10", "-", "08", ")", "the", "regions", "encompassing", "e3", ",", "e4", "and", "TSS", "(", "FDR", "=", "7", ".", "53", ".", "10", "-", "07", ")", "and", "e5", "(", "FDR", "=", "0", ".", "001", ")", "after", "CSP", "-", "TTK21", "treatment", ".", "Expanded", "View", "Figure"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Mean enrichment profiles performed with SeqMiner presenting the genomic distribution of H2Bac and H3K27ac reads obtained in ChIP-seq experiments in the different experimental groups, established along putative neuronal CBP enhancers (± 4Kb) (Kim et al., 2010). In the dorsal hippocampus, H2Bac levels are enriched at CBP enhancers in WT WEH (blue), decreased in tauopathic mice (TAU VEH, pink) and induced by CSP-TTK21 treatment (TAU MOL, green). B Mean profiles were separated in two sets of loci, including 17817 peaks highly enriched in H2Bac and showing a differential regulation in the experimental groups and 23331 peaks that were poorly enriched in H2Bac and not regulatedMean profiles established with SeqMiner for all genes at TSS for H2Bac (Left) and H3K27ac (Right). H2Bac but not H3K24ac presents a differential regulation at TSSMean H2Bac profiles established with SeqMiner on the differentially regulated genes obtained in transcriptomic experiments (RNA-seq), either decreased (left) or increased (right). The 'basal' H2Bac TSS enrichment state of these genes is differentially regulated whether the genes are decreased or increased in response to learningUCSC genome browser view of the c-fos genomic locus with H3K27ac ChIP-seq (blue), H2Bac ChIP-seq (green) and Input (black) signals. Blue shading indicates locations of the c-fos enhancers (Joo et al., 2016); gray shading indicates location of the promoter. Differential peaks were analyzed with SICER. This set of data shows that H2Bac levels were significantly decreased at e1 (FDR=1.95.10-08), e2 (FDR=0.0005) and e5 (FDR= 2.44.10-05) enhancers in THY-Tau22 compared to WT mice, and significantly enriched at e1 (FDR= 4.01.10-08) the regions encompassing e3, e4 and TSS (FDR=7.53.10-07) and e5 (FDR= 0.001) after CSP-TTK21 treatment. Expanded View Figure Legend"}
{"words": ["Figure", "1B", "Quantification", "of", "the", "expression", "of", "miR", "-", "19a", "and", "miR", "-", "19b", "in", "bones", "of", "mice", "treated", "with", "PTH", "(", "n", "=", "15", ")", "or", "Scl", "-", "Ab", "(", "n", "=", "14", ")", "compared", "to", "veh", "(", "n", "=", "13", ")", "control", ".", "C", "Quantification", "of", "the", "expression", "of", "miR", "-", "19a", "and", "miR", "-", "19b", "in", "calvarial", "osteoblasts", "upon", "in", "vitro", "stimulation", "with", "PTH", "or", "Wnt3a", "compared", "to", "veh", "control", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", "Alkaline", "phosphatase", "staining", "of", "differentiating", "calvarial", "osteoblasts", "transfected", "with", "a", "scrambled", "(", "scr", ")", "control", "miRNA", ",", "anti", "-", "sense", "microRNA", "(", "anti", "-", "miR", ")", "inhibiting", "miR", "-", "19a", "or", "miR", "-", "19b", "or", "a", "combination", "thereof", "(", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", ")", "(", "representative", "image", "of", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "E", "Quantification", "of", "alkaline", "phosphatase", "staining", "of", "calvarial", "osteoblasts", "transfected", "with", "scr", ",", "anti", "-", "miR", "-", "19a", ",", "anti", "-", "miR", "-", "19b", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "F", ",", "G", "Expression", "analysis", "of", "osteoblast", "marker", "genes", "(", "F", ")", "Runx2", "and", "(", "G", ")", "Type", "I", "Collagen", "(", "Col1a1", ")", "in", "calvarial", "osteoblasts", "transfected", "with", "scr", ",", "anti", "-", "miR", "-", "19a", ",", "anti", "-", "miR", "-", "19b", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "H", "Images", "of", "von", "Kossa", "-", "stained", "histological", "sections", "of", "the", "proximal", "tibiae", "of", "12", "-", "week", "-", "old", "male", "C57Bl", "/", "6J", "mice", "and", "fluorescence", "double", "labeling", "to", "visualize", "bone", "formation", "(", "insets", ")", "after", "4", "-", "weeks", "of", "treatment", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "12", ")", ",", "scr", "control", "oligonucleotides", "(", "n", "=", "11", ")", "or", "veh", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Scale", "bars", "indicate", "1", "mm", "(", "black", ")", "and", "50", "μm", "(", "white", ")", ".", "I", "Bone", "histomorphometric", "analysis", "of", "the", "proximal", "tibiae", "of", "the", "same", "animals", "as", "in", "(", "H", ")", "Abbreviations", ":", "BV", "/", "TV", ",", "bone", "volume", "/", "tissue", "volume", ";", "MS", "/", "BS", ",", "mineralizing", "surface", "/", "bone", "surface", ";", "BFR", "/", "BS", ",", "bone", "formation", "rate", "/", "bone", "surface", ";", "MAR", ",", "mineral", "apposition", "rate", ";", "OS", "/", "BS", ",", "osteoid", "surface", "/", "bone", "surface", ";", "Ob", ".", "S", "/", "BS", ",", "osteoblast", "surface", "/", "bone", "surface", ";", "N", ".", "Ob", "/", "BS", ",", "number", "of", "osteoblasts", "/", "bone", "surface", ";", "ES", "/", "BS", ",", "eroded", "surface", "/", "bone", "surface", ";", "Oc", ".", "S", "/", "BS", ",", "osteoclast", "surface", "/", "bone", "surface", ";", "N", ".", "Oc", "/", "BS", ",", "number", "of", "osteoclasts", "/", "bone", "surface", ".", "J", "Images", "of", "von", "Kossa", "-", "stained", "histological", "sections", "of", "the", "fourth", "lumbar", "vertebral", "body", "of", "12", "-", "week", "-", "old", "mice", "after", "4", "-", "weeks", "of", "treatment", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", ",", "scr", "or", "veh", ".", "Scale", "bar", "indicates", "1", "mm", ".", "K", "Quantification", "of", "bone", "mass", "(", "BV", "/", "TV", ")", "of", "the", "fourth", "lumbar", "vertebral", "body", "of", "12", "-", "week", "-", "old", "mice", "after", "4", "-", "weeks", "of", "treatment", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "12", ")", ",", "scr", "(", "n", "=", "12", ")", "or", "veh", "(", "n", "=", "8", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Quantification of the expression of miR-19a and miR-19b in bones of mice treated with PTH (n=15) or Scl-Ab (n=14) compared to veh (n=13) control. C Quantification of the expression of miR-19a and miR-19b in calvarial osteoblasts upon in vitro stimulation with PTH or Wnt3a compared to veh control (n=3).D Alkaline phosphatase staining of differentiating calvarial osteoblasts transfected with a scrambled (scr) control miRNA, anti-sense microRNA (anti-miR) inhibiting miR-19a or miR-19b or a combination thereof (anti-miR-19a/b) (representative image of 4 independent experiments). E Quantification of alkaline phosphatase staining of calvarial osteoblasts transfected with scr, anti-miR-19a, anti-miR-19b or anti-miR-19a/b (n=4).F, G Expression analysis of osteoblast marker genes (F) Runx2 and (G) Type I Collagen (Col1a1) in calvarial osteoblasts transfected with scr, anti-miR-19a, anti-miR-19b or anti-miR-19a/b (n=4).H Images of von Kossa-stained histological sections of the proximal tibiae of 12-week-old male C57Bl/6J mice and fluorescence double labeling to visualize bone formation (insets) after 4-weeks of treatment with anti-miR-19a/b (n=12), scr control oligonucleotides (n=11) or veh (n=8). Scale bars indicate 1 mm (black) and 50 μm (white). I Bone histomorphometric analysis of the proximal tibiae of the same animals as in (H) Abbreviations: BV/TV, bone volume/tissue volume; MS/BS, mineralizing surface/bone surface; BFR/BS, bone formation rate/bone surface; MAR, mineral apposition rate; OS/BS, osteoid surface/bone surface; Ob.S/BS, osteoblast surface/bone surface; N.Ob/BS, number of osteoblasts/bone surface; ES/BS, eroded surface/bone surface; Oc.S/BS, osteoclast surface/bone surface; N.Oc/BS, number of osteoclasts/bone surface.J Images of von Kossa-stained histological sections of the fourth lumbar vertebral body of 12-week-old mice after 4-weeks of treatment with anti-miR-19a/b, scr or veh. Scale bar indicates 1 mm. K Quantification of bone mass (BV/TV) of the fourth lumbar vertebral body of 12-week-old mice after 4-weeks of treatment with anti-miR-19a/b (n=12), scr (n=12) or veh (n=8)."}
{"words": ["Figure", "2A", "Images", "of", "von", "Kossa", "-", "stained", "histological", "sections", "of", "the", "bone", "and", "bone", "marrow", "(", "upper", "panel", ")", "and", "of", "hematoxylin", "-", "eosin", "-", "stained", "liver", "sections", "(", "lower", "panel", ")", "of", "12", "-", "week", "-", "old", "mice", "after", "treatment", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "12", ")", ",", "scrambled", "(", "scr", ")", "control", "oligonucleotides", "(", "n", "=", "11", ")", "or", "vehicle", "(", "veh", ")", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Scale", "bars", "indicate", "100", "μm", "(", "upper", "panel", ")", "and", "50", "μm", "(", "lower", "panel", ")", ".", "B", ",", "C", "Quantification", "of", "the", "femur", "length", "(", "B", ")", "and", "width", "(", "C", ")", "after", "treatment", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "scr", "(", "n", "=", "7", ")", "or", "veh", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "D", ",", "E", "Quantification", "of", "the", "expression", "of", "miR", "-", "19a", "(", "D", ")", "and", "miR", "-", "19b", "(", "E", ")", "in", "the", "bone", ",", "bone", "marrow", "and", "liver", "after", "treatment", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "scr", "(", "n", "=", "4", ")", "or", "veh", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "F", "-", "H", "Quantification", "of", "the", "expression", "of", "the", "housekeeping", "genes", "glyceraldehyde", "-", "3", "-", "phosphate", "dehydrogenase", "(", "Gapdh", ")", ",", "beta", "-", "2", "microglobulin", "(", "b2m", ")", ",", "beta", "-", "actin", "1", "(", "β", "-", "actin", "1", ")", "and", "beta", "-", "actin", "2", "(", "β", "-", "actin", "2", ")", "in", "the", "bone", "(", "F", ")", ",", "bone", "marrow", "(", "G", ")", "and", "liver", "(", "H", ")", "after", "treatment", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "scr", "(", "n", "=", "4", ")", "or", "veh", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "I", ",", "J", "CTG", "assay", "-", "based", "quantification", "of", "luminescence", "signal", "intensity", "as", "surrogate", "parameter", "of", "metabolically", "active", "osteoblasts", "of", "the", "MC3T3", "-", "E1", "cell", "line", "(", "I", ")", "and", "of", "hepatocytes", "of", "the", "HepG2", "cell", "line", "(", "J", ")", "treated", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", ",", "scr", "or", "veh", "and", "after", "stimulation", "with", "staurosporine", "to", "induce", "cell", "death", "as", "positive", "control", ".", "n", "=", "6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Images of von Kossa-stained histological sections of the bone and bone marrow (upper panel) and of hematoxylin-eosin-stained liver sections (lower panel) of 12-week-old mice after treatment with anti-miR-19a/b (n=12), scrambled (scr) control oligonucleotides (n=11) or vehicle (veh) (n=8). Scale bars indicate 100 μm (upper panel) and 50 μm (lower panel). B, C Quantification of the femur length (B) and width (C) after treatment with anti-miR-19a/b (n=8), scr (n=7) or veh (n=8).D, E Quantification of the expression of miR-19a (D) and miR-19b (E) in the bone, bone marrow and liver after treatment with anti-miR-19a/b (n=4), scr (n=4) or veh (n=3).F-H Quantification of the expression of the housekeeping genes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gapdh), beta-2 microglobulin (b2m), beta-actin 1 (β-actin 1) and beta-actin 2 (β-actin 2) in the bone (F), bone marrow (G) and liver (H) after treatment with anti-miR-19a/b (n=4), scr (n=4) or veh (n=3).I, J CTG assay-based quantification of luminescence signal intensity as surrogate parameter of metabolically active osteoblasts of the MC3T3-E1 cell line (I) and of hepatocytes of the HepG2 cell line (J) treated with anti-miR-19a/b, scr or veh and after stimulation with staurosporine to induce cell death as positive control. n= 6."}
{"words": ["Figure", "3A", "Immunoblot", "of", "Tgif1", "protein", "expression", "in", "calvarial", "osteoblasts", "transfected", "with", "scrambled", "(", "scr", ")", ",", "or", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", ",", "anti", "-", "miR", "-", "19b", "and", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "left", ")", ",", "or", "with", "miR", "-", "19a", ",", "mir", "-", "19b", "and", "mir", "-", "19a", "/", "b", "mimics", "(", "right", ")", "as", "indicated", ".", "Immunoblot", "for", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Normalized", "fold", "expression", "and", "molecular", "weight", "in", "kilo", "Dalton", "(", "kD", ")", "are", "indicated", "(", "representative", "image", "of", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "C", "Images", "of", "von", "Kossa", "-", "stained", "histological", "sections", "of", "the", "proximal", "tibiae", "of", "12", "-", "week", "-", "old", "male", "mice", "of", "the", "genotypes", "Dmp1", "-", "Cre", "-", ";", "Tgif1fl", "/", "fl", "treated", "weekly", "with", "scr", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "Dmp1", "-", "CreTg", ";", "Tgif1fl", "/", "fl", "treated", "weekly", "with", "scr", "(", "n", "=", "7", ")", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "14", ")", "for", "4", "weeks", ".", "Scale", "bar", "indicates", "1", "mm", ".", "D", "Bone", "histomorphometric", "analysis", "of", "the", "proximal", "tibiae", "of", "the", "same", "animals", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "For", "abbreviations", "see", "legend", "to", "figure", "1", ".", "E", "Images", "of", "von", "Kossa", "-", "stained", "histological", "sections", "of", "the", "fourth", "lumbar", "vertebral", "bodies", "of", "the", "same", "animals", "as", "in", "(", "C", ")", "and", "(", "F", ")", "quantification", "of", "the", "BV", "/", "TV", ".", "Scale", "bar", "represents", "1", "mm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Immunoblot of Tgif1 protein expression in calvarial osteoblasts transfected with scrambled (scr), or with anti-miR-19a, anti-miR-19b and anti-miR-19a/b (left), or with miR-19a, mir-19b and mir-19a/b mimics (right) as indicated. Immunoblot for Actin was used as loading control. Normalized fold expression and molecular weight in kilo Dalton (kD) are indicated (representative image of 3 independent experiments).C Images of von Kossa-stained histological sections of the proximal tibiae of 12-week-old male mice of the genotypes Dmp1-Cre-;Tgif1fl/fl treated weekly with scr (n=8) or anti-miR-19a/b (n=10) and Dmp1-CreTg;Tgif1fl/fl treated weekly with scr (n=7) or anti-miR-19a/b (n=14) for 4 weeks. Scale bar indicates 1 mm. D Bone histomorphometric analysis of the proximal tibiae of the same animals as in (C). For abbreviations see legend to figure 1.E Images of von Kossa-stained histological sections of the fourth lumbar vertebral bodies of the same animals as in (C) and (F) quantification of the BV/TV. Scale bar represents 1 mm."}
{"words": ["Figure", "4A", "Immunoblot", "of", "Tgif1", "protein", "expression", "in", "calvarial", "osteoblasts", "after", "stimulation", "with", "PTH", "(", "+", ")", "or", "vehicle", "(", "-", ")", "and", "after", "transfection", "with", "scrambled", "(", "scr", ")", ",", "anti", "-", "miR", "-", "19a", ",", "anti", "-", "miR", "-", "19b", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "as", "indicated", ".", "Immunoblot", "for", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Normalized", "fold", "expression", "and", "molecular", "weight", "in", "kilo", "Dalton", "(", "kD", ")", "are", "indicated", "(", "representative", "image", "of", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "B", "Images", "of", "von", "Kossa", "-", "stained", "histological", "sections", "of", "the", "proximal", "tibiae", "of", "12", "-", "week", "-", "old", "male", "wild", "type", "mice", "after", "treatment", "with", "scr", "oligonucleotides", "and", "vehicle", "(", "veh", ")", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "and", "veh", "(", "n", "=", "10", ")", ",", "scr", "and", "intermittent", "PTH", "(", "n", "=", "12", ")", "or", "a", "co", "-", "treatment", "with", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "and", "PTH", "(", "n", "=", "10", ")", "for", "4", "weeks", ".", "Scale", "bar", "indicates", "1", "mm", ".", "C", "Histomorphometric", "analysis", "of", "the", "proximal", "tibiae", "of", "the", "same", "animals", "as", "in", "(", "B", ")", "after", "treatment", "with", "intermittent", "PTH", "or", "veh", "and", "/", "or", "weekly", "injections", "of", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "or", "scr", "control", "for", "4", "weeks", ".", "For", "abbreviations", "see", "legend", "to", "figure", "1", ".", "D", "Images", "of", "von", "Kossa", "-", "stained", "histological", "sections", "of", "the", "fourth", "lumbar", "vertebral", "bodies", "of", "the", "same", "animals", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bars", "indicate", "1", "mm", ".", "E", "Histomorphometric", "analysis", "of", "the", "fourth", "lumbar", "vertebral", "body", ".", "For", "abbreviations", "see", "legend", "to", "figure", "1", ",", "scr", ",", "veh", "n", "=", "8", ";", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", ",", "veh", "n", "=", "10", ";", "scr", ",", "PTH", "n", "=", "12", ";", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", ",", "veh", "n", "=", "10", ".", "F", "Analysis", "of", "serum", "carboxy", "-", "terminal", "collagen", "crosslinks", "(", "CTX", ")", "in", "the", "same", "animals", "as", "in", "(", "B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Immunoblot of Tgif1 protein expression in calvarial osteoblasts after stimulation with PTH (+) or vehicle (-) and after transfection with scrambled (scr), anti-miR-19a, anti-miR-19b or anti-miR-19a/b as indicated. Immunoblot for Actin was used as loading control. Normalized fold expression and molecular weight in kilo Dalton (kD) are indicated (representative image of 3 independent experiments).B Images of von Kossa-stained histological sections of the proximal tibiae of 12-week-old male wild type mice after treatment with scr oligonucleotides and vehicle (veh) (n=8), anti-miR-19a/b and veh (n=10), scr and intermittent PTH (n=12) or a co-treatment with anti-miR-19a/b and PTH (n=10) for 4 weeks. Scale bar indicates 1 mm. C Histomorphometric analysis of the proximal tibiae of the same animals as in (B) after treatment with intermittent PTH or veh and/or weekly injections of anti-miR-19a/b or scr control for 4 weeks. For abbreviations see legend to figure 1.D Images of von Kossa-stained histological sections of the fourth lumbar vertebral bodies of the same animals as in (B). Scale bars indicate 1 mm. E Histomorphometric analysis of the fourth lumbar vertebral body. For abbreviations see legend to figure 1, scr, veh n=8; anti-miR-19a/b, veh n= 10; scr, PTH n=12; anti-miR-19a/b, veh n=10. F Analysis of serum carboxy-terminal collagen crosslinks (CTX) in the same animals as in (B)."}
{"words": ["Figure", "5B", "-", "D", "Micro", "-", "Computed", "Tomography", "(", "μCT", ")", "of", "the", "distal", "femora", "(", "B", ",", "C", ")", "and", "midshaft", "femoral", "cross", "sections", "(", "D", ")", "of", "the", "same", "animals", "as", "in", "A", ",", "after", "termination", "of", "the", "experiment", ".", "E", "-", "G", "Quantification", "of", "trabecular", "BV", "/", "TV", "by", "μCT", "in", "femora", "(", "E", ")", ",", "tibiae", "(", "F", ")", ",", "and", "the", "fourth", "lumbar", "vertebral", "bodies", "(", "G", ")", "of", "the", "same", "animals", "as", "in", "(", "A", "-", "D", ")", "70", "days", "after", "OVX", ".", "J", "Expression", "analysis", "of", "the", "osteoclast", "marker", "genes", "Trap", "and", "Cathepsin", "K", "(", "CatK", ")", "in", "bone", "marrow", "macrophages", "isolated", "from", "sham", "-", "operated", "(", "n", "=", "2", ")", "or", "ovariectomized", "mice", "treated", "with", "scr", "(", "n", "=", "3", ")", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "3", ")", "after", "4", "days", "of", "differentiation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B-D Micro-Computed Tomography (μCT) of the distal femora (B, C) and midshaft femoral cross sections (D) of the same animals as in A, after termination of the experiment. E-G Quantification of trabecular BV/TV by μCT in femora (E), tibiae (F), and the fourth lumbar vertebral bodies (G) of the same animals as in (A-D) 70 days after OVX.J Expression analysis of the osteoclast marker genes Trap and Cathepsin K (CatK) in bone marrow macrophages isolated from sham-operated (n=2) or ovariectomized mice treated with scr (n=3) or anti-miR-19a/b (n=3) after 4 days of differentiation."}
{"words": ["Figure", "6C", "Representative", "images", "of", "TRAP", "-", "stained", "osteoclast", "cultures", "of", "bone", "marrow", "cells", "transfected", "with", "scrambled", "(", "scr", ")", "control", "oligonucleotide", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "representative", "images", "of", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Scale", "bar", "indicates", "200", "μm", ".", "D", "Quantification", "of", "multinucleated", "TRAP", "-", "positive", "multi", "-", "nucleated", "cells", "(", "MNCs", ")", "after", "4", "days", "of", "osteoclast", "differentiation", "of", "bone", "marrow", "cells", "transfected", "with", "scr", "(", "n", "=", "4", ")", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "E", ",", "F", "Representative", "images", "(", "E", ")", "and", "quantification", "of", "MNCs", "(", "F", ")", "after", "transfection", "with", "scr", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "and", "stimulation", "with", "conditioned", "medium", "(", "CM", ")", "collected", "from", "Ocy454", "cells", "that", "were", "stimulated", "with", "vehicle", "(", "veh", ")", "or", "PTH", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Scale", "bar", "indicates", "200", "μm", ".", "L", "Immunoblot", "of", "Crtc2", "protein", "expression", "in", "the", "cytoplasm", "and", "nucleus", "of", "Ocy454", "cells", "transfected", "with", "control", "GapmeR", "or", "GapmeR", "against", "PP2A", "-", "Cβ", "and", "stimulated", "with", "veh", "or", "PTH", ".", "Immunoblot", "for", "Lamin", "A", "/", "C", "was", "used", "as", "loading", "control", "and", "purity", "control", "of", "the", "nuclear", "fraction", ".", "Normalized", "fold", "expression", "and", "molecular", "weight", "in", "kilo", "Dalton", "(", "kD", ")", "are", "indicated", "(", "representative", "image", "of", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "M", "Immunoblot", "of", "Crtc2", "protein", "expression", "in", "the", "cytoplasm", "and", "nucleus", "of", "Ocy454", "cells", "transfected", "with", "scr", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "and", "stimulated", "with", "veh", "or", "PTH", ".", "Immunoblot", "for", "Lamin", "A", "/", "C", "was", "used", "as", "loading", "control", "and", "purity", "control", "of", "the", "nuclear", "fraction", ".", "Normalized", "fold", "expression", "and", "molecular", "weight", "in", "kilo", "Dalton", "(", "kD", ")", "are", "indicated", "(", "representative", "image", "of", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C Representative images of TRAP-stained osteoclast cultures of bone marrow cells transfected with scrambled (scr) control oligonucleotide or anti-miR-19a/b (representative images of 3 independent experiments). Scale bar indicates 200 μm. D Quantification of multinucleated TRAP-positive multi-nucleated cells (MNCs) after 4 days of osteoclast differentiation of bone marrow cells transfected with scr (n=4) or anti-miR-19a/b (n=8).E, F Representative images (E) and quantification of MNCs (F) after transfection with scr or anti-miR-19a/b and stimulation with conditioned medium (CM) collected from Ocy454 cells that were stimulated with vehicle (veh) or PTH (n=6). Scale bar indicates 200 μm.L Immunoblot of Crtc2 protein expression in the cytoplasm and nucleus of Ocy454 cells transfected with control GapmeR or GapmeR against PP2A-Cβ and stimulated with veh or PTH. Immunoblot for Lamin A/C was used as loading control and purity control of the nuclear fraction. Normalized fold expression and molecular weight in kilo Dalton (kD) are indicated (representative image of 3 independent experiments).M Immunoblot of Crtc2 protein expression in the cytoplasm and nucleus of Ocy454 cells transfected with scr or anti-miR-19a/b and stimulated with veh or PTH. Immunoblot for Lamin A/C was used as loading control and purity control of the nuclear fraction. Normalized fold expression and molecular weight in kilo Dalton (kD) are indicated (representative image of 3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", "Relative", "miR", "-", "19a", "(", "A", ")", "and", "miR", "-", "19b", "(", "B", ")", "expression", "in", "long", "bones", "of", "sham", "-", "operated", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "ovariectomized", "(", "OVX", ")", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", ".", "C", "expression", "of", "Tgif1", "mRNA", "in", "long", "bones", "of", "sham", "-", "operated", "(", "n", "=", "11", ")", "and", "OVX", "(", "n", "=", "6", ")", "mice", ".", "D", ",", "E", "Relative", "expression", "of", "miR", "-", "19a", "(", "D", ")", "and", "miR", "-", "19b", "(", "E", ")", "in", "Ocy454", "cells", "upon", "estrogen", "deficiency", "(", "ED", ")", "and", "control", "(", "C", ")", "treatment", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "H", "Expression", "of", "Rankl", "mRNA", "in", "Ocy454", "cells", "transfected", "with", "scrambled", "(", "scr", ")", "control", "oligonucleotide", "or", "anti", "-", "miR", "-", "19a", "/", "b", "in", "the", "context", "of", "ED", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "I", "Representative", "images", "of", "von", "Kossa", "-", "stained", "human", "bone", "samples", "obtained", "from", "non", "-", "fractured", "femoral", "heads", "of", "postmenopausal", "women", "after", "assignment", "to", "groups", "of", "relatively", "higher", "bone", "mass", "(", "HBM", ",", "n", "=", "4", ")", "and", "relatively", "lower", "bone", "mass", "(", "LBM", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "J", "Histomorphometric", "analysis", "of", "bone", "mass", "(", "BV", "/", "TV", ",", "bone", "volume", "/", "tissue", "volume", ")", ",", "Trabecular", "number", "(", "Tb", ".", "N", "/", "mm", ")", ",", "trabecular", "thickness", "(", "Tb", ".", "Th", ")", "and", "trabecular", "separation", "(", "Tb", ".", "Sp", ")", "of", "the", "same", "human", "bone", "samples", "as", "in", "(", "I", ")", ".", "K", ",", "L", "Representative", "µCT", "images", "of", "3D", "reconstructed", "human", "bone", "samples", "(", "K", ")", "and", "quantification", "of", "bone", "mineral", "density", "(", "BMD", ")", "(", "L", ")", ".", "HBM", ",", "n", "=", "4", ",", "LBM", ",", "n", "=", "4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, B Relative miR-19a (A) and miR-19b (B) expression in long bones of sham-operated (n=4) and ovariectomized (OVX) (n=4) mice. C expression of Tgif1 mRNA in long bones of sham-operated (n=11) and OVX (n=6) mice.D, E Relative expression of miR-19a (D) and miR-19b (E) in Ocy454 cells upon estrogen deficiency (ED) and control (C) treatment (n=6).H Expression of Rankl mRNA in Ocy454 cells transfected with scrambled (scr) control oligonucleotide or anti-miR-19a/b in the context of ED (n=9).I Representative images of von Kossa-stained human bone samples obtained from non-fractured femoral heads of postmenopausal women after assignment to groups of relatively higher bone mass (HBM, n=4) and relatively lower bone mass (LBM, n=4). J Histomorphometric analysis of bone mass (BV/TV, bone volume/tissue volume), Trabecular number (Tb.N/mm), trabecular thickness (Tb.Th) and trabecular separation (Tb.Sp) of the same human bone samples as in (I).K, L Representative µCT images of 3D reconstructed human bone samples (K) and quantification of bone mineral density (BMD) (L). HBM, n=4, LBM, n=4."}
{"words": ["Figure", "2A", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "HeLa", "cells", "treated", "or", "not", "with", "250", "µM", "LLOMe", "for", "5", "min", "or", "10", "min", "before", "chemical", "fixation", ".", "Cells", "were", "incubated", "for", "4", "h", "following", "washing", "steps", "and", "overnight", "incubation", "with", "15", "nm", "gold", "nanoparticles", "conjugated", "to", "bovine", "serum", "albumin", "to", "visualize", "lysosomes", "(", "black", "spots", "inside", "lysosomes", "are", "internalized", "gold", "nanoparticles", ")", "before", "treatment", "with", "LLOMe", "and", "processing", "of", "samples", "for", "electron", "microscopy", ".", "Arrows", "indicate", "areas", "with", "increased", "lysosome", "-", "ER", "contacts", ".", "B", "Quantification", "of", "electron", "micrographs", "showing", "an", "increase", "in", "membrane", "contact", "sites", "between", "ER", "and", "lysosomes", "following", "250", "µM", "LLOMe", "treatment", "for", "5", "or", "10", "minutes", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SD", "from", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "48", "lysosomes", "were", "quantified", "per", "experiment", "for", "each", "condition", ".", "C", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "VAP", "double", "knockout", "HeLa", "cells", "that", "were", "either", "left", "untreated", "or", "incubated", "with", "250", "µM", "LLOMe", "for", "5", "min", "or", "10", "min", "before", "chemical", "fixation", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "15", "nm", "gold", "nanoparticles", "conjugated", "to", "bovine", "serum", "albumin", "for", "4", "h", "to", "visualize", "lysosomes", ".", "After", "4", "h", ",", "gold", "nanoparticles", "were", "washed", "off", "and", "cells", "were", "incubated", "overnight", "before", "treatment", "with", "LLOMe", "and", "processing", "samples", "for", "electron", "microscopy", "(", "same", "as", "in", "A", ")", ".", "Quantification", "of", "electron", "micrographs", "showing", "no", "increase", "in", "membrane", "contact", "sites", "between", "ER", "and", "lysosomes", "following", "250", "µM", "LLOMe", "treatment", "for", "5", "or", "10", "minutes", "in", "VAP", "double", "knockout", "cells", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SD", "from", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "40", "lysosomes", "were", "quantified", "per", "experiment", "for", "each", "condition", ".", "D", "Representative", "movie", "stills", "of", "a", "live", "-", "cell", "imaging", "experiment", "illustrating", "the", "recruitment", "of", "transiently", "expressed", "eGFP", "-", "ORP1L", "to", "lysosomes", "following", "250", "µM", "LLOMe", "treatment", ".", "Cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "30", "min", "with", "75", "nM", "Lysotracker", "Deep", "Red", "to", "monitor", "lysosome", "damage", "(", "judged", "by", "the", "decreased", "number", "of", "Lysotracker", "spots", "after", "LLOMe", "treatment", ")", ".", "The", "graph", "represents", "quantification", "of", "eGFP", "-", "ORP1L", "foci", "per", "cell", "after", "LLOMe", "treatment", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SEM", "from", "n", "=", "3", "independent", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", ",", ">", "25", "cells", "were", "analyzed", "per", "experiment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Representative electron micrographs of HeLa cells treated or not with 250 µM LLOMe for 5 min or 10 min before chemical fixation. Cells were incubated for 4 h following washing steps and overnight incubation with 15 nm gold nanoparticles conjugated to bovine serum albumin to visualize lysosomes (black spots inside lysosomes are internalized gold nanoparticles) before treatment with LLOMe and processing of samples for electron microscopy. Arrows indicate areas with increased lysosome-ER contacts. B Quantification of electron micrographs showing an increase in membrane contact sites between ER and lysosomes following 250 µM LLOMe treatment for 5 or 10 minutes. Error bars denote +/- SD from n=3 independent experiments, >48 lysosomes were quantified per experiment for each condition.C Representative electron micrographs of VAP double knockout HeLa cells that were either left untreated or incubated with 250 µM LLOMe for 5 min or 10 min before chemical fixation. Cells were incubated with 15 nm gold nanoparticles conjugated to bovine serum albumin for 4 h to visualize lysosomes. After 4 h, gold nanoparticles were washed off and cells were incubated overnight before treatment with LLOMe and processing samples for electron microscopy (same as in A). Quantification of electron micrographs showing no increase in membrane contact sites between ER and lysosomes following 250 µM LLOMe treatment for 5 or 10 minutes in VAP double knockout cells. Error bars denote +/- SD from n=3 independent experiments, >40 lysosomes were quantified per experiment for each condition.D Representative movie stills of a live-cell imaging experiment illustrating the recruitment of transiently expressed eGFP-ORP1L to lysosomes following 250 µM LLOMe treatment. Cells were pre-treated for 30 min with 75 nM Lysotracker Deep Red to monitor lysosome damage (judged by the decreased number of Lysotracker spots after LLOMe treatment). The graph represents quantification of eGFP-ORP1L foci per cell after LLOMe treatment. Error bars denote +/- SEM from n=3 independent live-cell imaging experiments, >25 cells were analyzed per experiment."}
{"words": ["Figure", "3A", "Movie", "stills", "from", "a", "live", "-", "cell", "imaging", "experiment", "showing", "rapid", "2xSidM", "-", "eGFP", "recruitment", "to", "damaged", "lysosomes", "upon", "250", "µM", "LLOMe", "treatment", "(", "indicated", "in", "green", ")", ".", "Lysosomes", "were", "visualized", "using", "transiently", "overexpressed", "LAMP1", "-", "mCherry", "(", "indicated", "in", "red", ")", ".", "Yellow", "spots", "show", "colocalized", "PtdIns4P", "probe", "(", "2xSidM", "-", "eGFP", ")", "and", "LAMP1", "-", "mCherry", "after", "3", "and", "10", "min", "of", "LLOMe", "treatment", ".", "The", "graph", "shows", "the", "quantification", "of", "2xSidM", "-", "eGFP", "foci", "per", "cell", "after", "LLOMe", "treatment", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SEM", "from", "n", "=", "3", "independent", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", ",", ">", "20", "cells", "were", "analyzed", "per", "experiment", ".", "B", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "PI4K2A", "or", "PI4K2B", "for", "48", "h", "and", "transiently", "transfected", "with", "the", "2xSidM", "-", "eGFP", "probe", "to", "monitor", "PtdIns4P", "recruitment", "after", "LLOMe", "-", "treatment", "by", "live", "-", "cell", "imaging", ".", "Representative", "movie", "stills", "show", "the", "dynamics", "of", "2xSidM", "-", "eGFP", "recruitment", "in", "control", ",", "PI4K2A", "and", "PI4K2B", "depleted", "cells", ".", "The", "graph", "represents", "the", "quantification", "of", "2xSidM", "-", "eGFP", "foci", "per", "cell", "after", "LLOMe", "-", "treatment", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SEM", "from", "n", "=", "3", "independent", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", ",", ">", "25", "cells", "were", "analyzed", "per", "experiment", "for", "each", "condition", ".", "C", "CRISPR", "-", "Cas9", "mediated", "knockout", "of", "PI4K2A", "abolishes", "recruitment", "of", "the", "2xSidM", "-", "eGFP", "probe", "(", "PtdIns4P", ")", "to", "damaged", "lysosomes", ".", "Two", "different", "clones", "(", "clone", "2", "and", "clone", "3", ")", "were", "tested", ".", "The", "graph", "represents", "the", "quantification", "of", "2xSidM", "-", "eGFP", "foci", "per", "cell", "after", "LLOMe", "-", "treatment", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SD", "from", "n", "=", "2", "independent", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", ",", ">", "20", "cells", "were", "analyzed", "per", "experiment", "for", "each", "condition", ".", "D", "Representative", "movie", "stills", "from", "live", "fluorescence", "microscopy", "showing", "reduced", "eGFP", "-", "ORP1L", "recruitment", "in", "PI4K2A", "knockout", "cells", "compared", "to", "wild", "type", "HeLa", "cells", "upon", "treatment", "with", "250", "µM", "LLOMe", ".", "The", "graph", "represents", "the", "quantification", "of", "eGFP", "-", "ORP1L", "foci", "per", "cell", "after", "LLOMe", "treatment", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SEM", "from", "n", "=", "4", "independent", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", ",", ">", "80", "cells", "were", "analyzed", "per", "experiment", "for", "each", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Movie stills from a live-cell imaging experiment showing rapid 2xSidM-eGFP recruitment to damaged lysosomes upon 250 µM LLOMe treatment (indicated in green). Lysosomes were visualized using transiently overexpressed LAMP1-mCherry (indicated in red). Yellow spots show colocalized PtdIns4P probe (2xSidM-eGFP) and LAMP1-mCherry after 3 and 10 min of LLOMe treatment. The graph shows the quantification of 2xSidM-eGFP foci per cell after LLOMe treatment. Error bars denote +/- SEM from n=3 independent live-cell imaging experiments, >20 cells were analyzed per experiment.B HeLa cells were transfected with control siRNA or siRNA targeting PI4K2A or PI4K2B for 48 h and transiently transfected with the 2xSidM-eGFP probe to monitor PtdIns4P recruitment after LLOMe-treatment by live-cell imaging. Representative movie stills show the dynamics of 2xSidM-eGFP recruitment in control, PI4K2A and PI4K2B depleted cells. The graph represents the quantification of 2xSidM-eGFP foci per cell after LLOMe-treatment. Error bars denote +/- SEM from n=3 independent live-cell imaging experiments, >25 cells were analyzed per experiment for each condition.C CRISPR-Cas9 mediated knockout of PI4K2A abolishes recruitment of the 2xSidM-eGFP probe (PtdIns4P) to damaged lysosomes. Two different clones (clone 2 and clone 3) were tested. The graph represents the quantification of 2xSidM-eGFP foci per cell after LLOMe-treatment. Error bars denote +/- SD from n=2 independent live-cell imaging experiments, >20 cells were analyzed per experiment for each condition.D Representative movie stills from live fluorescence microscopy showing reduced eGFP-ORP1L recruitment in PI4K2A knockout cells compared to wild type HeLa cells upon treatment with 250 µM LLOMe. The graph represents the quantification of eGFP-ORP1L foci per cell after LLOMe treatment. Error bars denote +/- SEM from n=4 independent live-cell imaging experiments, >80 cells were analyzed per experiment for each condition."}
{"words": ["Figure", "4Representative", "movie", "stills", "from", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", "monitoring", "Lysotracker", "recovery", "after", "induced", "lysosomal", "damage", "using", "250", "µM", "LLOMe", ".", "Cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "75", "nM", "Lysotracker", "Deep", "Red", "for", "30", "min", "before", "addition", "of", "LLOMe", ".", "The", "graph", "represents", "the", "quantification", "of", "bright", "Lysotracker", "positive", "foci", "per", "cell", ".", "While", "the", "decrease", "in", "the", "number", "of", "Lysotracker", "spots", "is", "quickly", "recovering", "in", "HeLa", "cells", ",", "there", "is", "a", "severe", "impairment", "in", "lysosomal", "repair", "in", "HeLa", "-", "PI4K2A", "-", "KO", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative movie stills from live-cell imaging experiments monitoring Lysotracker recovery after induced lysosomal damage using 250 µM LLOMe. Cells were pre-treated with 75 nM Lysotracker Deep Red for 30 min before addition of LLOMe. The graph represents the quantification of bright Lysotracker positive foci per cell. While the decrease in the number of Lysotracker spots is quickly recovering in HeLa cells, there is a severe impairment in lysosomal repair in HeLa-PI4K2A-KO cells."}
{"words": ["Figure", "5A", "HeLa", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "siRNAs", "targeting", "ESCRT", "proteins", "TSG101", "and", "ALIX", "(", "siTSG101", "+", "siALIX", ")", "or", "with", "non", "-", "targeting", "siRNA", "control", "(", "siControl", ")", ",", "and", "incubated", "for", "24", "h", "before", "transfection", "with", "the", "PtdIns4P", "binding", "probe", "2xSidM", "-", "eGFP", ".", "24", "h", "post", "-", "transfection", "lysosomes", "were", "damaged", "with", "250", "µM", "LLOMe", "and", "PtdIns4P", "recruitment", "to", "damaged", "lysosomes", "was", "monitored", "using", "the", "2xSidM", "-", "eGFP", "probe", "in", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "2xSidM", "-", "eGFP", "foci", "per", "cell", "in", "cells", "co", "-", "depleted", "of", "TSG101", "+", "ALIX", "and", "control", "(", "siControl", ")", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A HeLa cells were co-transfected with siRNAs targeting ESCRT proteins TSG101 and ALIX (siTSG101+siALIX) or with non-targeting siRNA control (siControl), and incubated for 24 h before transfection with the PtdIns4P binding probe 2xSidM-eGFP. 24 h post-transfection lysosomes were damaged with 250 µM LLOMe and PtdIns4P recruitment to damaged lysosomes was monitored using the 2xSidM-eGFP probe in live-cell imaging experiments. The graph shows quantification of 2xSidM-eGFP foci per cell in cells co-depleted of TSG101+ALIX and control (siControl) cells."}
{"words": ["Figure", "6A", "Representative", "movie", "stills", "of", "a", "live", "-", "cell", "imaging", "experiment", "illustrate", "faster", "recruitment", "of", "the", "PtdIns4P", "probe", "2xSidM", "-", "eGFP", "to", "damaged", "lysosomes", "when", "compared", "to", "cholesterol", "as", "indicated", "by", "the", "mCherry", "-", "D4", "probe", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "2xSidM", "-", "eGFP", "and", "mCherry", "-", "D4", "foci", "per", "cell", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SD", "from", "n", "=", "2", "independent", "live", "-", "cell", "imaging", "experimentsD", "HeLa", "cells", "expressing", "an", "eGFP", "-", "tagged", "ORP1L", "mutant", "incapable", "of", "binding", "to", "VAP", "(", "mFFAT", ")", "show", "no", "accumulation", "of", "the", "cholesterol", "reporter", "mCherry", "-", "D4", "upon", "lysosomal", "damage", "induced", "with", "250", "µM", "LLOMe", "when", "compared", "to", "wildtype", "(", "wt", ")", "eGFP", "-", "ORP1L", ".", "The", "quantification", "graph", "shows", "D4", "-", "mCherry", "foci", "per", "cell", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SEM", "from", "n", "=", "4", "independent", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "were", "analyzed", "per", "experiment", "for", "each", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Representative movie stills of a live-cell imaging experiment illustrate faster recruitment of the PtdIns4P probe 2xSidM-eGFP to damaged lysosomes when compared to cholesterol as indicated by the mCherry-D4 probe. The graph shows quantification of 2xSidM-eGFP and mCherry-D4 foci per cell. Error bars denote +/- SD from n=2 independent live-cell imaging experimentsD HeLa cells expressing an eGFP-tagged ORP1L mutant incapable of binding to VAP (mFFAT) show no accumulation of the cholesterol reporter mCherry-D4 upon lysosomal damage induced with 250 µM LLOMe when compared to wildtype (wt) eGFP-ORP1L. The quantification graph shows D4-mCherry foci per cell. Error bars denote +/- SEM from n=4 independent live-cell imaging experiments, >50 cells were analyzed per experiment for each condition."}
{"words": ["Figure", "7A", "Representative", "movie", "stills", "from", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", "indicate", "recruitment", "of", "CHMP4B", "-", "eGFP", "to", "damaged", "lysosomes", "in", "control", "and", "U18666A", "treated", "cells", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "CHMP4B", "-", "eGFP", "were", "treated", "with", "2", "µM", "U18666A", "for", "17", "h", "before", "treatment", "with", "250", "µM", "LLOMe", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "CHMP4B", "-", "eGFP", "foci", "per", "cell", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SEM", "from", "n", "=", "4", ",", ">", "30", "cells", "per", "experiment", "for", "each", "condition", ".", "B", "Representative", "immunofluorescence", "images", "illustrate", "Galectin", "-", "3", "recruitment", "kinetics", "on", "the", "damaged", "lysosomes", "upon", "treatment", "with", "2", "µM", "U18666A", "for", "17", "h", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "or", "not", "(", "Control", ")", "with", "U18666A", "and", "+", "/", "-", "LLOMe", "for", "the", "indicated", "time", "points", ",", "fixed", "and", "processed", "for", "immunofluorescence", "microscopy", ".", "Endogenous", "levels", "of", "Galectin", "-", "3", "were", "visualized", ".", "C", "Number", "of", "Galectin", "-", "3", "positive", "dots", "per", "cell", "was", "automatically", "quantified", "from", "the", "dataset", "described", "in", "B", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SEM", "from", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", ">", "225", "cells", "were", "analyzed", "per", "condition", ",", "distribution", "visualized", "as", "violin", "plots", ".", "D", "Representative", "movie", "stills", "from", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", "indicate", "recruitment", "of", "the", "PtdIns4P", "probe", "2xSidM", "-", "eGFP", "to", "damaged", "lysosomes", "in", "control", "but", "not", "in", "the", "U18666A", "treated", "cells", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "2", "µM", "U18666A", "for", "17", "h", "before", "treatment", "with", "250", "µM", "LLOMe", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "2xSidM", "-", "eGFP", "foci", "per", "cell", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Representative movie stills from live-cell imaging experiments indicate recruitment of CHMP4B-eGFP to damaged lysosomes in control and U18666A treated cells. HeLa cells stably expressing CHMP4B-eGFP were treated with 2 µM U18666A for 17 h before treatment with 250 µM LLOMe. The graph shows quantification of CHMP4B-eGFP foci per cell. Error bars denote +/- SEM from n=4, >30 cells per experiment for each condition.B Representative immunofluorescence images illustrate Galectin-3 recruitment kinetics on the damaged lysosomes upon treatment with 2 µM U18666A for 17 h. HeLa cells were treated or not (Control) with U18666A and +/- LLOMe for the indicated time points, fixed and processed for immunofluorescence microscopy. Endogenous levels of Galectin-3 were visualized.C Number of Galectin-3 positive dots per cell was automatically quantified from the dataset described in B. Error bars denote +/- SEM from n=3 independent experiments. >225 cells were analyzed per condition, distribution visualized as violin plots.D Representative movie stills from live-cell imaging experiments indicate recruitment of the PtdIns4P probe 2xSidM-eGFP to damaged lysosomes in control but not in the U18666A treated cells. HeLa cells were treated with 2 µM U18666A for 17 h before treatment with 250 µM LLOMe. The graph shows quantification of 2xSidM-eGFP foci per cell."}
{"words": ["Figure", "8A", "Representative", "movie", "stills", "of", "a", "live", "-", "cell", "imaging", "experiment", "show", "recruitment", "dynamics", "of", "transiently", "expressed", "eGFP", "-", "OSBP", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "250", "µM", "LLOMe", ".", "The", "graph", "shows", "quantifications", "of", "OSBP", "foci", "per", "cell", ".", "Error", "bars", "denote", "+", "/", "-", "SEM", "from", "n", "=", "5", "independent", "live", "-", "cell", "imaging", "experiments", ",", ">", "22", "cells", "per", "experiment", ".", "D", "Knock", "down", "efficiency", "of", "siRNA", "depletion", "of", "OSBP", "in", "HeLa", "cells", "as", "detected", "by", "Western", "blot", ".", "β", "-", "actin", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Representative movie stills of a live-cell imaging experiment show recruitment dynamics of transiently expressed eGFP-OSBP in HeLa cells treated with 250 µM LLOMe. The graph shows quantifications of OSBP foci per cell. Error bars denote +/- SEM from n=5 independent live-cell imaging experiments, >22 cells per experiment.D Knock down efficiency of siRNA depletion of OSBP in HeLa cells as detected by Western blot. β-actin used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "The", "violin", "plot", "of", "ACE2", "gene", "expression", "of", "all", "major", "cell", "types", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.The violin plot of ACE2 gene expression of all major cell types."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "Cell", "type", "annotations", "of", "all", "four", "patients", "by", "the", "tSNE", "plot", ".", "Hepatocyte", "-", "cholangiocytes", "cluster", "includes", "potential", "stem", "-", "like", "cells", "capable", "of", "differentiating", "into", "both", "cell", "types", ".", "B", ")", "tSNE", "plot", "colored", "by", "patientsHeatmap", "of", "marker", "genes", "of", "16", "cell", "types", "identified", ".", "The", "red", "box", "highlights", "the", "cell", "type", "specific", "expression", "of", "ACE2", ".", "The", "violin", "plot", "of", "ACE2", "gene", "expression", "across", "all", "cell", "types", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.Cell type annotations of all four patients by the tSNE plot. Hepatocyte-cholangiocytes cluster includes potential stem-like cells capable of differentiating into both cell types. B) tSNE plot colored by patientsHeatmap of marker genes of 16 cell types identified. The red box highlights the cell type specific expression of ACE2.The violin plot of ACE2 gene expression across all cell types."}
{"words": ["Figure", "1Expression", "of", "Mpc", "proteins", "in", "mitochondria", "assessed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "crude", "mitochondrial", "preparations", ".", "The", "individual", "untagged", "Mpc1", "(", "Mpc1", ")", ",", "histidine", "-", "tagged", "Mpc1", "(", "Mpc1his", ")", ",", "histidine", "-", "tagged", "Mpc3", "(", "Mpc3his", ")", "or", "the", "Mpc1", "/", "Mpc3", "hetero", "-", "complex", "(", "Mpc1", "/", "Mpc3his", ")", "were", "detected", "with", "antibodies", "raised", "against", "Mpc1", "(", "left", "panel", ")", "or", "Mpc3", "(", "right", "panel", ")", "and", "are", "shown", "with", "dashed", "arrows", ".", "Five", "micrograms", "of", "each", "affinity", "-", "purified", "Mpc", "protein", "were", "analysed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "the", "bands", "were", "visualised", "by", "Coomassie", "Blue", "stain", ".", "Peptide", "mass", "finger", "printing", "was", "used", "to", "identify", "the", "major", "protein", "bandsThe", "stability", "of", "the", "purified", "proteins", "was", "assessed", "via", "thermal", "denaturation", "by", "fluorescent", "CPM", "-", "adduct", "formation", ".", "The", "thermal", "denaturation", "profiles", "(", "left", ")", "were", "used", "to", "calculate", "the", "first", "derivative", "(", "right", ")", ",", "which", "provides", "the", "apparent", "melting", "temperature", ",", "indicated", "with", "the", "same", "colour", "coding", ".", "The", "stability", "of", "the", "same", "samples", ",", "as", "in", "panel", "(", "D", ")", ",", "was", "assessed", "by", "NanoDSF", ".", "The", "changes", "in", "the", "330", "nm", "/", "350", "nm", "ratio", "with", "temperature", "(", "left", ")", "were", "used", "to", "calculate", "the", "first", "derivative", "(", "right", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Expression of Mpc proteins in mitochondria assessed by SDS-PAGE and immunoblot analysis of crude mitochondrial preparations. The individual untagged Mpc1 (Mpc1), histidine-tagged Mpc1 (Mpc1his), histidine-tagged Mpc3 (Mpc3his) or the Mpc1/Mpc3 hetero-complex (Mpc1/Mpc3his) were detected with antibodies raised against Mpc1 (left panel) or Mpc3 (right panel) and are shown with dashed arrows.Five micrograms of each affinity-purified Mpc protein were analysed by SDS-PAGE and the bands were visualised by Coomassie Blue stain. Peptide mass finger printing was used to identify the major protein bandsThe stability of the purified proteins was assessed via thermal denaturation by fluorescent CPM-adduct formation. The thermal denaturation profiles (left) were used to calculate the first derivative (right), which provides the apparent melting temperature, indicated with the same colour coding.The stability of the same samples, as in panel (D), was assessed by NanoDSF. The changes in the 330 nm/350 nm ratio with temperature (left) were used to calculate the first derivative (right)."}
{"words": ["Figure", "2Nickel", "-", "affinity", "-", "purified", "Mpc1", "/", "Mpc3", "hetero", "-", "complex", "used", "for", "SEC", "-", "MALLS", "analysis", ",", "showing", "a", "1", ":", "1", "stoichiometry", "of", "the", "protomers", ".", "SEC", "-", "MALLS", "analysis", "of", "the", "hetero", "-", "complex", ".", "The", "light", "scattering", "trace", "for", "Mpc1", "/", "Mpc3", "is", "shown", "as", "a", "black", "line", ".", "The", "masses", "of", "the", "protein", "-", "detergent", "-", "lipid", "complex", "(", "PDL", ",", "green", ")", ",", "the", "detergent", "-", "lipid", "micelle", "(", "DL", ",", "blue", ")", "and", "the", "protein", "(", "P", ",", "red", ")", "are", "indicated", ".", "Protein", "fractions", "across", "the", "peak", "were", "assessed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "visualised", "by", "Coomassie", "Blue", "staining", "(", "B", ",", "inset", ")", ".", "Nickel", "-", "affinity", "-", "purified", "Mpc3", "protein", "used", "for", "SEC", "-", "MALLS", "analysis", ".", "SEC", "-", "MALLS", "analysis", "of", "Mpc3", ",", "colour", "designation", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "The", "protein", "fractions", "across", "the", "peak", "(", "D", ",", "inset", ")", "were", "assessed", "as", "in", "(", "B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Nickel-affinity-purified Mpc1/Mpc3 hetero-complex used for SEC-MALLS analysis, showing a 1:1 stoichiometry of the protomers.SEC-MALLS analysis of the hetero-complex. The light scattering trace for Mpc1/Mpc3 is shown as a black line. The masses of the protein-detergent-lipid complex (PDL, green), the detergent-lipid micelle (DL, blue) and the protein (P, red) are indicated. Protein fractions across the peak were assessed by SDS-PAGE and visualised by Coomassie Blue staining (B, inset).Nickel-affinity-purified Mpc3 protein used for SEC-MALLS analysis.SEC-MALLS analysis of Mpc3, colour designation as in (B). The protein fractions across the peak (D, inset) were assessed as in (B)."}
{"words": ["Figure", "3Time", "course", "of", "pyruvate", "homo", "-", "exchange", "by", "the", "Mpc1", "/", "Mpc3", "hetero", "-", "complex", "in", "liposomes", "(", "n", "=", "8", ")", "in", "comparison", "to", "empty", "liposomes", "(", "n", "=", "6", ")", "at", "a", "ΔpH", "of", "1", ".", "6", ".", "Kinetic", "analysis", "of", "pyruvate", "homo", "-", "exchange", "at", "ΔpH", "of", "1", ".", "6", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "hetero", "-", "complex", "was", "assayed", "for", "initial", "rates", "of", "uptake", "in", "the", "concentration", "range", "of", "25", "-", "600", "μM", ".", "The", "calculated", "KΜ", "was", "299", "μΜ", "in", "this", "experiment", "and", "318", "and", "409", "μΜ", "in", "two", "additional", "biological", "repeats", ".", "Time", "course", "of", "pyruvate", "homo", "-", "exchange", "by", "the", "Mpc1", "/", "Mpc3", "hetero", "-", "complex", "in", "physiological", "pH", "(", "n", "=", "4", ")", "compared", "to", "empty", "liposomes", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "In", "the", "absence", "of", "a", "ΔpH", ",", "the", "time", "course", "of", "pyruvate", "homo", "-", "exchange", "was", "similar", "for", "the", "Mpc1", "/", "Mpc3", "proteoliposomes", "and", "the", "empty", "liposomes", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Inhibition", "of", "[", "14C", "]", "-", "pyruvate", "homo", "-", "exchange", "by", "UK5099", "(", "1", "-", "100", "μM", ")", ",", "Zaprinast", "(", "1", "-", "1000", "μM", ")", ",", "lonidamine", "(", "10", "-", "10000", "μM", ")", "and", "7ACC2", "(", "5", "-", "500", "μM", ")", ".", "Data", "points", "represent", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", "of", "a", "typical", "experiment", ".", "The", "IC50", "measurements", "have", "also", "been", "independently", "replicated", ",", "three", "times", "for", "UK5099", "Zaprinast", "and", "7ACC2", "(", "average", "IC50", "9", "±", "7", "μM", ",", "18", "±", "8", "μM", "and", "27", "±", "13", "μM", ",", "respectively", ")", "and", "two", "times", "for", "lonidamine", "(", "average", "IC50", ",", "118", "±", "24", "μM", ")", ".", "[", "14C", "]", "-", "pyruvate", "homo", "-", "exchange", "inhibition", "by", "the", "TZDs", ",", "pioglitazone", "and", "rosiglitazone", "(", "n", "=", "6", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Time course of pyruvate homo-exchange by the Mpc1/Mpc3 hetero-complex in liposomes (n=8) in comparison to empty liposomes (n=6) at a ΔpH of 1.6.Kinetic analysis of pyruvate homo-exchange at ΔpH of 1.6 (n=3). The hetero-complex was assayed for initial rates of uptake in the concentration range of 25-600 μM. The calculated KΜ was 299 μΜ in this experiment and 318 and 409 μΜ in two additional biological repeats.Time course of pyruvate homo-exchange by the Mpc1/Mpc3 hetero-complex in physiological pH (n=4) compared to empty liposomes (n=4).In the absence of a ΔpH, the time course of pyruvate homo-exchange was similar for the Mpc1/Mpc3 proteoliposomes and the empty liposomes (n=4).Inhibition of [14C]-pyruvate homo-exchange by UK5099 (1-100 μM), Zaprinast (1-1000 μM), lonidamine (10-10000 μM) and 7ACC2 (5-500 μM). Data points represent the mean of three technical replicates of a typical experiment. The IC50 measurements have also been independently replicated, three times for UK5099 Zaprinast and 7ACC2 (average IC50 9 ± 7 μM, 18 ± 8 μM and 27 ± 13 μM, respectively) and two times for lonidamine (average IC50, 118 ± 24 μM).[14C]-pyruvate homo-exchange inhibition by the TZDs, pioglitazone and rosiglitazone (n=6)."}
{"words": ["Figure", "4Time", "course", "of", "pyruvate", "homo", "-", "exchange", "in", "proteoliposomes", "at", "a", "ΔpH", "of", "1", ".", "6", "was", "compared", "for", "Mpc3", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "the", "Mpc1", "/", "Mpc3", "hetero", "-", "complex", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "empty", "liposomes", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Time", "course", "of", "pyruvate", "homo", "-", "exchange", "at", "a", "ΔpH", "of", "1", ".", "6", "was", "compared", "for", "Mpc1", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "Mpc1", "/", "Mpc3", "hetero", "-", "complex", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "empty", "liposomes", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Thermostability", "analysis", "via", "cpm", ".", "In", "detergent", "solution", ",", "Zaprinast", "(", "250", "μM", ")", "increased", "the", "thermostability", "of", "the", "Mpc1", "/", "Mpc3", "hetero", "-", "complex", "(", "black", "lines", ")", "(", "n", "=", "3", ")", "but", "not", "of", "Mpc3", "(", "blue", "lines", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Thermostability", "analysis", "via", "nanoDSF", ".", "In", "detergent", "solution", ",", "Zaprinast", "(", "250", "μM", ")", "increased", "the", "thermostability", "of", "the", "Mpc1", "/", "Mpc3", "hetero", "-", "complex", "(", "black", "lines", ")", "(", "n", "=", "3", ")", "but", "not", "of", "Mpc1", "(", "orange", "lines", ")", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Time course of pyruvate homo-exchange in proteoliposomes at a ΔpH of 1.6 was compared for Mpc3 (n=4), the Mpc1/Mpc3 hetero-complex (n=6) and empty liposomes (n=4).Time course of pyruvate homo-exchange at a ΔpH of 1.6 was compared for Mpc1 (n=4), Mpc1/Mpc3 hetero-complex (n=4) and empty liposomes (n=4).Thermostability analysis via cpm. In detergent solution, Zaprinast (250 μM) increased the thermostability of the Mpc1/Mpc3 hetero-complex (black lines) (n=3) but not of Mpc3 (blue lines) (n=3).Thermostability analysis via nanoDSF. In detergent solution, Zaprinast (250 μM) increased the thermostability of the Mpc1/Mpc3 hetero-complex (black lines) (n=3) but not of Mpc1 (orange lines) (n=3)."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "Image", "of", "8", "-", "9", "day", "old", "male", "control", "(", "w1118", ",", "left", ")", "and", "chmRNAi", "(", "right", ")", "flies", "upon", "ubiquitous", "chm", "knockdown", "(", "left", ")", "and", "the", "corresponding", "quantification", "(", "right", ")", "(", "N", "=", "6", ",", "Paired", "t", "-", "test", "was", "performed", "for", "statistical", "significance", ")", ";", "B", ")", "Image", "of", "8", "-", "9", "day", "old", "male", "control", "(", "w1118", ",", "left", ")", "and", "chmRNAi", "(", "right", ")", "flies", "upon", "fat", "-", "body", "specific", "chm", "knockdown", "(", "left", ")", "and", "the", "corresponding", "quantification", "(", "right", ")", "(", "N", "=", "4", ",", "Paired", "t", "-", "test", "was", "performed", "for", "statistical", "significance", ")", ";", "C", ")", "Image", "of", "8", "-", "9", "day", "old", "male", "control", "(", "w1118", ",", "left", ")", "and", "chmRNAi", "(", "right", ")", "flies", "upon", "neuron", "specific", "chm", "knockdown", "(", "left", ")", "and", "the", "corresponding", "quantification", "(", "right", ")", "(", "N", "=", "3", ",", "Paired", "t", "-", "test", "was", "performed", "for", "statistical", "significance", ")", ";", "D", ")", "Image", "of", "8", "-", "9", "day", "old", "male", "control", "(", "w1118", ",", "left", ")", "and", "chmRNAi", "(", "right", ")", "flies", "upon", "muscle", "specific", "chm", "knockdown", "(", "left", ")", "and", "the", "corresponding", "quantification", "(", "right", ")", "(", "N", "=", "3", ",", "Paired", "t", "-", "test", "was", "performed", "for", "statistical", "significance", ")", "Data", "information", ":", "All", "replicates", "are", "independent", "biological", "replicates", "and", "errors", "bars", "indicate", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "Paired", "t", "-", "test", "or", "Tukey", "test", "was", "performed", "as", "indicated", "and", "non", "-", "significant", "values", "are", "not", "shown", "(", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) Image of 8-9 day old male control (w1118, left) and chmRNAi (right) flies upon ubiquitous chm knockdown (left) and the corresponding quantification (right) (N = 6, Paired t-test was performed for statistical significance); B) Image of 8-9 day old male control (w1118, left) and chmRNAi (right) flies upon fat-body specific chm knockdown (left) and the corresponding quantification (right) (N = 4, Paired t-test was performed for statistical significance); C) Image of 8-9 day old male control (w1118, left) and chmRNAi (right) flies upon neuron specific chm knockdown (left) and the corresponding quantification (right) (N = 3, Paired t-test was performed for statistical significance); D) Image of 8-9 day old male control (w1118, left) and chmRNAi (right) flies upon muscle specific chm knockdown (left) and the corresponding quantification (right) (N = 3, Paired t-test was performed for statistical significance) Data information: All replicates are independent biological replicates and errors bars indicate standard error of the mean (SEM). Paired t-test or Tukey test was performed as indicated and non-significant values are not shown (* - p < 0.05, ** - p < 0.01, *** - p < 0.001, **** - p < 0.0001)."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Heatmap", "showing", "all", "significant", "proteins", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", "and", "Π", "<", "0", ".", "05", ")", "between", "control", "(", "w1118", ")", "and", "chmRNAi", ".", "Values", "in", "the", "heatmap", "are", "scaled", "raw", "intensity", "values", ".", "NAs", "are", "indicated", "in", "grey", ";"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Heatmap showing all significant proteins (FDR < 0.05 and Π < 0.05) between control (w1118) and chmRNAi. Values in the heatmap are scaled raw intensity values. NAs are indicated in grey;"}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "control", "(", "w1118", ")", "and", "chmRNAi", "male", "flies", "upon", "ubiquitous", "knockdown", "of", "chm", "with", "da", "-", "Gal4", "(", "N", "=", "4", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "All", "replicates", "had", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "0001", ")", ")", ";", "B", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "control", "(", "w1118", ")", "and", "chmRNAi", "male", "flies", "upon", "fatbody", "knockdown", "of", "chm", "with", "r4", "-", "Gal4", "(", "N", "=", "4", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "All", "replicates", "had", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "0001", ")", ")", ";", "C", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "control", "(", "w1118", ")", "and", "chmRNAi", "male", "flies", "upon", "neuronal", "knockdown", "of", "chm", "with", "elav", "-", "Gal4", "(", "N", "=", "4", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "All", "replicates", "had", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "0001", ")", ")", ";", "D", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "control", "(", "w1118", ")", "and", "chmRNAi", "male", "flies", "upon", "muscle", "knockdown", "of", "chm", "with", "mef", "-", "Gal4", "(", "N", "=", "4", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "All", "replicates", "had", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "0001", ")", ")", ";", "E", ",", "F", "Average", "survival", "curve", "between", "E", ")", "ethanol", "(", "N", "=", "3", ",", "paired", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "p", "-", "values", "ranged", "between", "0", ".", "2", "to", "0", ".", "05", "across", "replicates", ")", "and", "F", ")", "RU486", "(", "N", "=", "4", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", "with", "all", "of", "them", "having", "a", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", ")", "and", "administered", "control", "(", "w1118", ")", "and", "chmRNAi", "male", "flies", "using", "Act", "-", "GS", "-", "Gal4", "for", "adult", "-", "specific", "chm", "knockdown", ";", "G", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "control", "(", "w1118", ")", "and", "chmMYST", "/", "+", "male", "flies", "(", "N", "=", "5", ",", "paired", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", "with", "all", "of", "them", "having", "a", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "replicates", "are", "independent", "biological", "replicates", "and", "errors", "bars", "indicate", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "For", "survival", "curves", ",", "log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "The", "displayed", "p", "-", "value", "is", "based", "on", "all", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Average survival curve of control (w1118) and chmRNAi male flies upon ubiquitous knockdown of chm with da-Gal4 (N = 4, paired , Log-rank test was performed for each biological replicate. All replicates had p-values < 0.0001)); B) Average survival curve of control (w1118) and chmRNAi male flies upon fatbody knockdown of chm with r4-Gal4 (N = 4, paired , Log-rank test was performed for each biological replicate. All replicates had p-values < 0.0001)); C) Average survival curve of control (w1118) and chmRNAi male flies upon neuronal knockdown of chm with elav-Gal4 (N = 4, paired , Log-rank test was performed for each biological replicate. All replicates had p-values < 0.0001)); D) Average survival curve of control (w1118) and chmRNAi male flies upon muscle knockdown of chm with mef-Gal4 (N = 4, paired, Log-rank test was performed for each biological replicate. All replicates had p-values < 0.0001)); E, F Average survival curve between E) ethanol (N = 3, paired Log-rank test was performed for each biological replicate. p-values ranged between 0.2 to 0.05 across replicates) and F) RU486 (N = 4, paired, Log-rank test was performed for each biological replicate with all of them having a p-value < 0.05)) and administered control (w1118) and chmRNAi male flies using Act-GS-Gal4 for adult-specific chm knockdown; G) Average survival curve of control (w1118) and chmMYST/+ male flies (N = 5, paired Log-rank test was performed for each biological replicate with all of them having a p-value < 0.0001). Data information: All replicates are independent biological replicates and errors bars indicate standard error of the mean (SEM). For survival curves, log-rank test was performed for each biological replicate. The displayed p-value is based on all biological replicates."}
{"words": ["Figure", "5D", "-", "G", "Box", "plot", "(", "left", ")", "and", "heatmap", "(", "right", ")", "of", "annotated", "genes", "from", "GO", "terms", "of", "D", ")", "Cellular", "response", "to", "stress", "(", "ANOVA", "p", "-", "value", ":", "6", ".", "49", "x10", "-", "08", ")", ";", "E", ")", "Response", "to", "starvation", "(", "ANOVA", "p", "-", "value", ":", "3", ".", "09", "x10", "-", "07", ")", ";", "F", ")", "Carbohydrate", "metabolic", "process", "(", "ANOVA", "p", "-", "value", ":", "5", ".", "46", "x10", "-", "07", ")", ";", "G", ")", "Lipid", "metabolic", "process", "(", "ANOVA", "p", "-", "value", ":", "7", ".", "88", "x10", "-", "09", ")", ";", "Box", "plot", "shows", "the", "average", "vst", "normalized", "read", "counts", "of", "all", "annotated", "genes", "within", "the", "GO", "term", "averaged", "over", "the", "replicates", ".", "Boxes", "indicate", "inter", "-", "quartile", "range", "with", "central", "band", "as", "the", "median", ",", "central", "filled", "dot", "as", "the", "average", "and", "the", "whiskers", "indicating", "the", "maximum", "and", "minimum", "values", "across", "5", "biological", "replicates", ".", "Heatmap", "shows", "the", "scaled", "values", "of", "vst", "normalized", "read", "counts", "in", "each", "replicate", "for", "all", "conditions", ".", "Data", "information", ":", "All", "replicates", "are", "independent", "biological", "replicates", "and", "errors", "bars", "indicate", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "Tukey", "test", "was", "performed", "and", "non", "-", "significant", "values", "are", "not", "shown", "(", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5D-G Box plot (left) and heatmap (right) of annotated genes from GO terms of D) Cellular response to stress (ANOVA p-value: 6.49 x10-08); E) Response to starvation (ANOVA p-value: 3.09 x10-07); F) Carbohydrate metabolic process (ANOVA p-value: 5.46 x10-07); G) Lipid metabolic process (ANOVA p-value: 7.88 x10-09); Box plot shows the average vst normalized read counts of all annotated genes within the GO term averaged over the replicates. Boxes indicate inter-quartile range with central band as the median, central filled dot as the average and the whiskers indicating the maximum and minimum values across 5 biological replicates. Heatmap shows the scaled values of vst normalized read counts in each replicate for all conditions. Data information: All replicates are independent biological replicates and errors bars indicate standard error of the mean (SEM). Tukey test was performed and non-significant values are not shown (* - p < 0.05, ** - p < 0.01, *** - p < 0.001, **** - p < 0.0001)."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Weight", "of", "8", "-", "9", "day", "old", "male", "chmMYST", "/", "+", "and", "chmMYST", "/", "+", ";", "UAS", "-", "chmmyc", "flies", "upon", "weak", "(", "left", ",", "N", "=", "5", ",", "paired", ")", "and", "strong", "(", "right", ",", "N", "=", "4", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "All", "replicates", "had", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "0001", ")", "chm", "overexpression", "with", "arm", "-", "Gal4", "and", "da", "-", "Gal4", "respectively", "(", "Paired", "t", "-", "test", "was", "performed", ")", ";", "Data", "information", ":", "All", "are", "independent", "biological", "replicates", "and", "errors", "bars", "indicate", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "Paired", "t", "-", "test", "was", "performed", "for", "the", "fly", "weight", "data", "and", "non", "-", "significant", "values", "are", "not", "shown", "(", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "B", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "chmMYST", "/", "+", "and", "chmMYST", "/", "+", ";", "UAS", "-", "chmmyc", "male", "flies", "upon", "ubiquitous", "weak", "expression", "of", "chm", "with", "arm", "-", "Gal4", "(", "N", "=", "4", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "All", "replicates", "had", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "0001", ")", ";", "C", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "chmMYST", "/", "+", "and", "chmMYST", "/", "+", ";", "UAS", "-", "chmmyc", "male", "flies", "upon", "ubiquitous", "strong", "expression", "of", "chm", "with", "da", "-", "Gal4", "(", "N", "=", "3", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "All", "replicates", "had", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "0001", ")", ";", "Data", "information", ":", "All", "are", "independent", "biological", "replicates", "and", "errors", "bars", "indicate", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "For", "survival", "curves", ",", "log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "The", "displayed", "indicated", "p", "-", "value", "is", "based", "on", "all", "biological", "replicates", ".", "D", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "chmMYST", "/", "+", "and", "chmMYST", "/", "+", ";", "UAS", "-", "chmmyc", "male", "flies", "upon", "fatbody", "expression", "of", "chm", "with", "r4", "-", "Gal4", "(", "N", "=", "4", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "All", "replicates", "had", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "0001", ")", ";", "E", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "control", "chmMYST", "/", "+", "and", "chmMYST", "/", "+", ";", "UAS", "-", "chmmyc", "male", "flies", "upon", "neuronal", "expression", "of", "chm", "with", "elav", "-", "Gal4", "(", "N", "=", "5", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "All", "replicates", "had", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "0001", ")", ";", "F", ")", "Average", "survival", "curve", "of", "chmMYST", "/", "+", "and", "chmMYST", "/", "+", ";", "UAS", "-", "chmmyc", "male", "flies", "upon", "muscle", "expression", "of", "chm", "with", "mef", "-", "Gal4", "(", "N", "=", "5", ",", "paired", ",", "Log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "p", "-", "values", "ranged", "between", "0", ".", "6", "to", "0", ".", "0001", "across", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "are", "independent", "biological", "replicates", "and", "errors", "bars", "indicate", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "For", "survival", "curves", ",", "log", "-", "rank", "test", "was", "performed", "for", "each", "biological", "replicate", ".", "The", "displayed", "indicated", "p", "-", "value", "is", "based", "on", "all", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Weight of 8-9 day old male chmMYST/+ and chmMYST/+;UAS-chmmyc flies upon weak (left, N = 5, paired) and strong (right, N = 4, paired, Log-rank test was performed for each biological replicate. All replicates had p-values < 0.0001) chm overexpression with arm-Gal4 and da-Gal4 respectively (Paired t-test was performed); Data information: All are independent biological replicates and errors bars indicate standard error of the mean (SEM). Paired t-test was performed for the fly weight data and non-significant values are not shown (* - p < 0.05, ** - p < 0.01, *** - p < 0.001, **** - p < 0.0001).B) Average survival curve of chmMYST/+ and chmMYST/+;UAS-chmmyc male flies upon ubiquitous weak expression of chm with arm-Gal4 (N = 4, paired, Log-rank test was performed for each biological replicate. All replicates had p-values < 0.0001); C) Average survival curve of chmMYST/+ and chmMYST/+;UAS-chmmyc male flies upon ubiquitous strong expression of chm with da-Gal4 (N = 3, paired, Log-rank test was performed for each biological replicate. All replicates had p-values < 0.0001); Data information: All are independent biological replicates and errors bars indicate standard error of the mean (SEM). For survival curves, log-rank test was performed for each biological replicate. The displayed indicated p-value is based on all biological replicates. D) Average survival curve of chmMYST/+ and chmMYST/+;UAS-chmmyc male flies upon fatbody expression of chm with r4-Gal4 (N = 4, paired, Log-rank test was performed for each biological replicate. All replicates had p-values < 0.0001); E) Average survival curve of control chmMYST/+ and chmMYST/+;UAS-chmmyc male flies upon neuronal expression of chm with elav-Gal4 (N = 5, paired, Log-rank test was performed for each biological replicate. All replicates had p-values < 0.0001); F) Average survival curve of chmMYST/+ and chmMYST/+;UAS-chmmyc male flies upon muscle expression of chm with mef-Gal4 (N = 5, paired, Log-rank test was performed for each biological replicate. p-values ranged between 0.6 to 0.0001 across replicates). Data information: All are independent biological replicates and errors bars indicate standard error of the mean (SEM). For survival curves, log-rank test was performed for each biological replicate. The displayed indicated p-value is based on all biological replicates. "}
{"words": ["Figure", "1Results", "of", "the", "ELISAs", "used", "to", "determine", "IFN", "-", "β", "(", "A", ")", "secretion", "in", "PMA", "-", "differentiated", "THP", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "siCtrl", ",", "siRNF34", "-", "1", ",", "siRNF34", "-", "2", "or", "siRNF34", "-", "3", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "ELISA", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "of", "the", "ELISAs", "used", "to", "determine", "IL6", "(", "B", ")", "secretion", "in", "PMA", "-", "differentiated", "THP", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "siCtrl", ",", "siRNF34", "-", "1", ",", "siRNF34", "-", "2", "or", "siRNF34", "-", "3", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "ELISA", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "IFN", "-", "β", "(", "C", ")", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "RNF34", "or", "its", "E3", "ligase", "-", "dead", "mutant", "H342A", "followed", "by", "VSV", "infection", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ",", "and", "luciferase", "activity", "was", "reported", "as", "the", "fold", "induction", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "NF", "-", "κB", "(", "D", ")", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "RNF34", "or", "its", "E3", "ligase", "-", "dead", "mutant", "H342A", "followed", "by", "VSV", "infection", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ",", "and", "luciferase", "activity", "was", "reported", "as", "the", "fold", "induction", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Plaque", "assay", "of", "VSV", "loads", "in", "supernatants", "from", "cells", "transfected", "with", "shCtrl", ",", "shRNF34", "-", "1", ",", "shRNF34", "-", "2", "or", "shRNF34", "-", "3", "and", "subsequently", "infected", "with", "VSV", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "F", ")", "Microscopy", "images", "of", "shCtrl", "-", ",", "shRNF34", "-", "1", "-", ",", "shRNF34", "-", "2", "-", "or", "shRNF34", "-", "3", "cells", "infected", "with", "NDV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Gray", "represents", "cells", ";", "green", "represents", "NDV", ".", "Scale", "bar", ",", "300", "μm", ".", "(", "G", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "phosphorylated", "(", "p", ")", "and", "total", "IRF3", ",", "TBK1", ",", "and", "VSV", "-", "G", "proteins", "in", "PMA", "-", "differentiated", "THP", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "siCtrl", "or", "siRNF34", "-", "1", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "the", "IFN", "-", "β", "(", "H", ")", "mRNAs", "in", "PBMCs", "transfected", "with", "siCtrl", "or", "siRNF34", "-", "1", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "The", "results", "were", "normalized", "to", "the", "values", "obtained", "prior", "to", "VSV", "infection", ".", "(", "I", ")", "Results", "of", "the", "ELISA", "used", "to", "determine", "IFN", "-", "β", "secretion", "in", "PBMCs", "transfected", "with", "siCtrl", "or", "siRNF34", "-", "1", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "ELISA", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "the", "IL8", ",", "ISG54", "and", "ISG56", "(", "J", ")", "mRNAs", "in", "PBMCs", "transfected", "with", "siCtrl", "or", "siRNF34", "-", "1", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "The", "results", "were", "normalized", "to", "the", "values", "obtained", "prior", "to", "VSV", "infection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Results of the ELISAs used to determine IFN-β (A) secretion in PMA-differentiated THP-1 cells transfected with siCtrl, siRNF34-1, siRNF34-2 or siRNF34-3 oligos and infected with VSV for the indicated times. ELISA data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.Results of the ELISAs used to determine IL6 (B) secretion in PMA-differentiated THP-1 cells transfected with siCtrl, siRNF34-1, siRNF34-2 or siRNF34-3 oligos and infected with VSV for the indicated times. ELISA data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.Luciferase activity driven by the IFN-β (C) promoter in HEK293T cells transfected with Flag-RNF34 or its E3 ligase-dead mutant H342A followed by VSV infection for the indicated times. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection, and luciferase activity was reported as the fold induction. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.Luciferase activity driven by the NF-κB (D) promoter in HEK293T cells transfected with Flag-RNF34 or its E3 ligase-dead mutant H342A followed by VSV infection for the indicated times. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection, and luciferase activity was reported as the fold induction. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.(E) Plaque assay of VSV loads in supernatants from cells transfected with shCtrl, shRNF34-1, shRNF34-2 or shRNF34-3 and subsequently infected with VSV. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(F) Microscopy images of shCtrl-, shRNF34-1-, shRNF34-2- or shRNF34-3 cells infected with NDV-GFP (MOI = 1.0) for the indicated times. Gray represents cells; green represents NDV. Scale bar, 300 μm.(G) Immunoblot showing the levels of the phosphorylated (p) and total IRF3, TBK1, and VSV-G proteins in PMA-differentiated THP-1 cells transfected with siCtrl or siRNF34-1 oligos and infected with VSV for the indicated times.RT-PCR analysis of the expression of the IFN-β (H) mRNAs in PBMCs transfected with siCtrl or siRNF34-1 oligos and infected with VSV for the indicated times. The results were normalized to the values obtained prior to VSV infection.(I) Results of the ELISA used to determine IFN-β secretion in PBMCs transfected with siCtrl or siRNF34-1 oligos and infected with VSV for the indicated times. ELISA data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.RT-PCR analysis of the expression of the IL8, ISG54 and ISG56 (J) mRNAs in PBMCs transfected with siCtrl or siRNF34-1 oligos and infected with VSV for the indicated times. The results were normalized to the values obtained prior to VSV infection."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "ISRE", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "RNF34", "and", "Flag", "-", "V", ",", "Flag", "-", "N", "-", "RIG", "-", "I", ",", "Flag", "-", "MAVS", ",", "Flag", "-", "STING", "or", "Flag", "-", "TBK1", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "were", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "Y2H", "analysis", "in", "the", "AH109", "yeast", "strain", "co", "-", "transformed", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "A", "positive", "RNF34", "-", "MAVS", "interaction", "resulted", "in", "colony", "formation", "on", "synthetic", "medium", "lacking", "tryptophan", ",", "leucine", ",", "adenine", ",", "and", "histidine", "containing", "X", "-", "gal", ".", "pGBKT7", "-", "TP53", "+", "pGADT7", "-", "T", "and", "pGBKT7", "-", "lam", "+", "pGADT7", "-", "T", "were", "used", "as", "positive", "and", "negative", "controls", ",", "respectively", ".", "AH109", "co", "-", "transfected", "with", "pGBKT7", "-", "RNF34", "+", "pACT", "-", "2", "was", "used", "to", "exclude", "the", "self", "-", "activation", "of", "RNF34", ".", "(", "C", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "RNF34", "and", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "V", ".", "Anti", "-", "Flag", "or", "IgG", "agarose", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "(", "D", ")", "GST", "-", "tagged", "RNF34", "was", "subjected", "to", "a", "pull", "-", "down", "assay", "with", "HEK293T", "cell", "lysates", ".", "Immunoblot", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "antibody", "are", "shown", "in", "the", "top", "panel", ".", "Loading", "of", "the", "GST", "proteins", "assessed", "using", "Coomassie", "blue", "staining", "is", "shown", "in", "the", "bottom", "panel", ".", "GST", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "(", "E", ")", "Anti", "-", "Flag", "or", "IgG", "immunoprecipitates", "prepared", "from", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "vector", "-", "expressing", "plasmids", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "blotted", "onto", "a", "nitrocellulose", "membrane", ".", "The", "nitrocellulose", "membrane", "was", "incubated", "with", "soluble", "GST", "-", "RNF34", "(", "upper", "panel", ")", "or", "GST", "(", "middle", "panel", ")", "for", "2", "hrs", "and", "then", "analyzed", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "(", "F", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescence", "staining", "for", "Flag", "-", "RNF34", "colocalization", "with", "endogenous", "MAVS", "in", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "12", "hrs", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "G", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "RNF34", "protein", "in", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "H", ")", "In", "situ", "PLA", "assay", "of", "the", "RNF34", "-", "MAVS", "complex", "in", "HEK293T", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", "using", "an", "anti", "-", "RNF34", "or", "anti", "-", "MAVS", "antibody", ".", "RNF34", "-", "MAVS", "complex", ",", "red", ";", "nuclei", ",", "blue", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "I", ")", "One", "hundred", "cells", "were", "counted", ",", "and", "the", "quantification", "of", "PLA", "signals", "per", "cell", "is", "shown", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "J", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "RNF34", "and", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "mMAVS", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Luciferase activity driven by the ISRE promoter in HEK293T cells transfected with Myc-RNF34 and Flag-V, Flag-N-RIG-I, Flag-MAVS, Flag-STING or Flag-TBK1. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-tests were used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.(B) Y2H analysis in the AH109 yeast strain co-transformed with the indicated plasmids. A positive RNF34-MAVS interaction resulted in colony formation on synthetic medium lacking tryptophan, leucine, adenine, and histidine containing X-gal. pGBKT7-TP53+pGADT7-T and pGBKT7-lam+pGADT7-T were used as positive and negative controls, respectively. AH109 co-transfected with pGBKT7-RNF34+pACT-2 was used to exclude the self-activation of RNF34.(C) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Myc-RNF34 and Flag-MAVS or Flag-V. Anti-Flag or IgG agarose immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody.(D) GST-tagged RNF34 was subjected to a pull-down assay with HEK293T cell lysates. Immunoblot with an anti-MAVS antibody are shown in the top panel. Loading of the GST proteins assessed using Coomassie blue staining is shown in the bottom panel. GST was used as a negative control.(E) Anti-Flag or IgG immunoprecipitates prepared from cells transfected with Flag-MAVS or Flag-vector-expressing plasmids were subjected to SDS-PAGE and blotted onto a nitrocellulose membrane. The nitrocellulose membrane was incubated with soluble GST-RNF34 (upper panel) or GST (middle panel) for 2 hrs and then analyzed with anti-Flag antibody.(F) Representative confocal images of immunofluorescence staining for Flag-RNF34 colocalization with endogenous MAVS in THP-1 cells infected with VSV for 12 hrs. Scale bar, 10 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(G) Immunoblot showing the levels of the RNF34 protein in THP-1 cells infected with VSV (MOI = 1.0) for the indicated times. α-Tubulin was used as a loading control.(H) In situ PLA assay of the RNF34-MAVS complex in HEK293T cells infected with VSV (MOI =1.0) for the indicated times using an anti-RNF34 or anti-MAVS antibody. RNF34-MAVS complex, red; nuclei, blue. Scale bar, 5 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(I) One hundred cells were counted, and the quantification of PLA signals per cell is shown. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(J) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Myc-RNF34 and Flag-MAVS or Flag-mMAVS. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with anti-Myc or anti-Flag antibody."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "and", "Myc", "-", "Ub", "together", "with", "HA", "-", "RNF34", "or", "HA", "-", "H342A", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "The", "levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "B", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "and", "HA", "-", "RNF34", "together", "with", "Myc", "-", "Ub", "(", "K6", ",", "K11", ",", "K27", ",", "K29", ",", "K33", ",", "K48", ",", "or", "K63", "only", ")", "as", "indicated", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "C", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "and", "HA", "-", "RNF34", "together", "with", "Myc", "-", "Ub", "(", "wild", "-", "type", ",", "WT", ";", "Lys", "-", "to", "-", "Arg", "mutants", "of", "all", "Ub", "lysines", ",", "KO", ";", "K27", "/", "29R", ")", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "D", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "K27", "ubiquitination", "of", "MAVS", "in", "HEK293T", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Anti", "-", "MAVS", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "The", "WCL", "was", "immunoblotted", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "E", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "siCtrl", "-", "or", "siRNF34", "-", "1", "-", "transfected", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Anti", "-", "MAVS", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "The", "WCL", "was", "immunoblotted", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunoprecipitation analysis in HEK293T cells expressing Flag-MAVS and Myc-Ub together with HA-RNF34 or HA-H342A. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. The levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA, anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(B) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS and HA-RNF34 together with Myc-Ub (K6, K11, K27, K29, K33, K48, or K63 only) as indicated. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA, anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(C) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS and HA-RNF34 together with Myc-Ub (wild-type, WT; Lys-to-Arg mutants of all Ub lysines, KO; K27/29R). Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA, anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(D) Immunoprecipitation analysis of K27 ubiquitination of MAVS in HEK293T cells infected with VSV for the indicated times. Anti-MAVS immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-MAVS or anti-Ub-K27 antibody. The WCL was immunoblotted with an anti-MAVS or anti-Ub-K27 antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(E) Immunoprecipitation analysis of siCtrl- or siRNF34-1-transfected cells infected with VSV for the indicated times. Anti-MAVS immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-MAVS or anti-Ub-K27 antibody. The WCL was immunoblotted with an anti-MAVS or anti-Ub-K27 antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "4Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Lys", "to", "Arg", "mutants", "together", "with", "Myc", "-", "Ub", "and", "HA", "-", "RNF34", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "4KR", "mutant", "together", "with", "Myc", "-", "Ub", "and", "HA", "-", "RNF34", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "by", "performing", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "C", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "K311R", "mutant", "together", "with", "HA", "-", "RNF34", "and", "/", "or", "Myc", "-", "TRIM31", "following", "a", "3MA", "(", "0", ".", "2", "mM", ")", "treatment", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "Ub", "-", "K63", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "ell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "D", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "ubiquitination", "of", "endogenous", "MAVS", "in", "THP", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "siCtrl", ",", "siRNF34", ",", "or", "siTRIM31", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "E", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "endogenous", "interaction", "of", "MAVS", "-", "TRIM31", "and", "MAVS", "-", "RNF34", "in", "PBMCs", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS or Lys to Arg mutants together with Myc-Ub and HA-RNF34. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA, anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS or 4KR mutant together with Myc-Ub and HA-RNF34. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Ub-K27 antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed by performing immunoblotting with an anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(C) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS or K311R mutant together with HA-RNF34 and/or Myc-TRIM31 following a 3MA (0.2 mM) treatment. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Flag, anti-Ub-K63 or anti-Ub-K27 antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA or anti-Flag antibody. ell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(D) Co-immunoprecipitation analysis of the ubiquitination of endogenous MAVS in THP-1 cells transfected with siCtrl, siRNF34, or siTRIM31 oligos and infected with VSV for the indicated times. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(E) Co-immunoprecipitation analysis of the endogenous interaction of MAVS-TRIM31 and MAVS-RNF34 in PBMCs infected with VSV for the indicated times. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "degradation", "of", "MAVS", "in", "HEK293T", "cells", "subjected", "to", "VSV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "degradation", "of", "MAVS", "in", "HEK293T", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "NH4Cl", "(", "3", "mM", ")", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "mMAVS", "together", "with", "Myc", "-", "RNF34", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "increasing", "amounts", "of", "Myc", "-", "RNF34", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "with", "increasing", "amounts", "of", "HA", "-", "RNF34", "or", "its", "H342A", "mutant", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "F", ")", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "MAVS", "aggregates", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "together", "with", "WT", "Myc", "-", "RNF34", "or", "its", "ligase", "-", "dead", "mutant", "and", "cultured", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "MG132", "(", "10", "μM", ")", ",", "3", "-", "MA", "(", "1", "mM", ")", "or", "NH4Cl", "(", "3", "mM", ")", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "G", ")", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "MAVS", "aggregates", "in", "siCtrl", "-", "or", "siRNF34", "-", "1", "-", "transfected", "cells", "using", "an", "anti", "-", "MAVS", "antibody", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "H", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "siCtrl", "-", "or", "siRNF34", "-", "1", "-", "transfected", "PBMCs", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "I", ")", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "MAVS", "aggregates", "in", "THP", "-", "1", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "the", "K311R", "mutant", "together", "with", "Myc", "-", "RNF34", "or", "Myc", "-", "TRIM31", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunoblot showing the degradation of MAVS in HEK293T cells subjected to VSV infection (MOI = 1.0) for the indicated times. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(B) Immunoblot showing the degradation of MAVS in HEK293T cells infected with VSV (MOI = 1.0) for the indicated times in the presence or absence of NH4Cl (3 mM). α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(C) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in HEK293T cells expressing Flag-MAVS or Flag-mMAVS together with Myc-RNF34. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(D) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in HEK293T cells expressing Flag-MAVS or its 4KR mutant together with increasing amounts of Myc-RNF34. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(E) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in HEK293T cells expressing Flag-MAVS with increasing amounts of HA-RNF34 or its H342A mutant. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(F) SDD-AGE analysis of MAVS aggregates in HEK293T cells expressing Flag-MAVS together with WT Myc-RNF34 or its ligase-dead mutant and cultured in the presence or absence of MG132 (10 μM), 3-MA (1 mM) or NH4Cl (3 mM). SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(G) SDD-AGE analysis of MAVS aggregates in siCtrl- or siRNF34-1-transfected cells using an anti-MAVS antibody. SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(H) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in siCtrl- or siRNF34-1-transfected PBMCs. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(I) SDD-AGE analysis of MAVS aggregates in THP-1 cells expressing Flag-MAVS or the K311R mutant together with Myc-RNF34 or Myc-TRIM31. SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "SQSTM1", "or", "its", "I431A", "mutant", "together", "with", "HA", "-", "MAVS", ".", "Anti", "-", "Flag", "or", "IgG", "agarose", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "B", ")", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "IFN", "-", "β", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "Flag", "-", "SQSTM1", "or", "its", "I431A", "mutant", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "were", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "HA", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "Flag", "-", "SQSTM1", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "D", ")", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "IFN", "-", "β", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "Flag", "-", "NDP52", "or", "its", "D439R", "/", "C443K", "mutant", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "were", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "Myc", "-", "NDP52", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "F", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "DNP52", "-", "RNF34", "interaction", "in", "cells", "infected", "with", "VSV", ".", "Anti", "-", "DNP52", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "DNP52", "or", "anti", "-", "RNF34", "antibody", ".", "The", "WCL", "was", "immunoblotted", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "RNF34", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "G", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "Flag", "-", "NDP52", "and", "HA", "-", "RNF34", "in", "WT", "or", "MAVS", "-", "/", "-", "cells", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "H", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "NDP52", "or", "its", "D439R", "/", "C443K", "mutant", "together", "with", "HA", "-", "MAVS", "followed", "by", "VSV", "infection", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "I", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "siCtrl", "-", "or", "siNDP52", "-", "transfected", "cells", "expressing", "Flag", "-", "RNF34", "or", "Flag", "-", "V", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "J", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "siCtrl", "-", "or", "siNDP52", "-", "transfected", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ",", "12", "hrs", ")", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "K", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "MAVS", "-", "LC3", "interaction", "in", "siCtrl", "-", "or", "siNDP52", "-", "transfected", "cells", "infected", "with", "VSV", ".", "Anti", "-", "MAVS", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "NDP52", "levels", "were", "analyzed", "by", "performing", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "NDP52", "antibody", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Flag-SQSTM1 or its I431A mutant together with HA-MAVS. Anti-Flag or IgG agarose immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-HA or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(B) Luciferase activity driven by the IFN-β promoter in HEK293T cells transfected with HA-MAVS or its 4KR mutant together with Flag-SQSTM1 or its I431A mutant. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-tests were used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.(C) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in HEK293T cells expressing HA-MAVS or its 4KR mutant together with Flag-SQSTM1. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(D) Luciferase activity driven by the IFN-β promoter in HEK293T cells transfected with HA-MAVS or its 4KR mutant together with Flag-NDP52 or its D439R/C443K mutant. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-tests were used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.(E) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Flag-MAVS or its 4KR mutant together with Myc-NDP52. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(F) Immunoprecipitation analysis of the DNP52-RNF34 interaction in cells infected with VSV. Anti-DNP52 immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-DNP52 or anti-RNF34 antibody. The WCL was immunoblotted with an anti-MAVS or anti- RNF34 antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(G) Immunoprecipitation analysis of the interaction between Flag-NDP52 and HA-RNF34 in WT or MAVS-/- cells. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-HA antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(H) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Flag-NDP52 or its D439R/C443K mutant together with HA-MAVS followed by VSV infection. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-HA or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(I) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in siCtrl- or siNDP52-transfected cells expressing Flag-RNF34 or Flag-V. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(J) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in siCtrl- or siNDP52-transfected cells infected with VSV (MOI = 1, 12 hrs). α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(K) Immunoprecipitation analysis of the MAVS-LC3 interaction in siCtrl- or siNDP52-transfected cells infected with VSV. Anti-MAVS immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-MAVS or anti-LC3 antibody. NDP52 levels were analyzed by performing immunoblotting with an anti-NDP52 antibody. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Immunoblot", "showing", "MAVS", ",", "IRF3", "-", "p", ",", "LC3", ",", "TOM20", "and", "HSP60", "levels", "in", "siCtrl", "-", "or", "siRNF34", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "and", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "Z", "-", "VAD", "(", "50", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "showing", "MAVS", ",", "LC3", ",", "TOM20", "and", "HSP60", "levels", "in", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "RNF34", "or", "its", "H342A", "mutant", "and", "subsequently", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "Representative", "confocal", "images", "(", "C", ")", "of", "immunofluorescence", "staining", "for", "NDP52", "colocalization", "with", "MAVS", "in", "shCtrl", "-", "or", "shRNF34", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Red", "represents", "MAVS", "and", "green", "represents", "NDP52", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "quantification", "(", "D", ")", "of", "immunofluorescence", "staining", "for", "NDP52", "colocalization", "with", "MAVS", "in", "shCtrl", "-", "or", "shRNF34", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "E", ")", "Transmission", "electron", "microscopy", "images", "of", "shCtrl", "-", "and", "shRNF34", "-", "1", "HEK293T", "cells", "cultured", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "VSV", ".", "Arrows", "indicate", "mitochondria", "engulfed", "in", "autophagosomes", ".", "Double", "arrows", "indicate", "swollen", "mitochondria", "with", "disrupted", "cristae", ".", "M", ",", "mitochondria", "and", "N", ",", "nucleus", ".", "40000", "×", "magnification", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "F", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "the", "shift", "in", "the", "fluorescence", "emission", "of", "Keima", "from", "458", "nm", "to", "543", "nm", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Immunoblot showing MAVS, IRF3-p, LC3, TOM20 and HSP60 levels in siCtrl- or siRNF34-1 cells infected with VSV and cultured in the presence of Z-VAD (50 μM) for the indicated times. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(B) Immunoblot showing MAVS, LC3, TOM20 and HSP60 levels in cells transfected with Flag-RNF34 or its H342A mutant and subsequently infected with VSV for the indicated times. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.Representative confocal images (C) of immunofluorescence staining for NDP52 colocalization with MAVS in shCtrl- or shRNF34-1 cells infected with VSV for the indicated times. Red represents MAVS and green represents NDP52. Scale bar, 10 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.quantification (D) of immunofluorescence staining for NDP52 colocalization with MAVS in shCtrl- or shRNF34-1 cells infected with VSV for the indicated times. Scale bar, 10 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(E) Transmission electron microscopy images of shCtrl- and shRNF34-1 HEK293T cells cultured in the presence or absence of VSV. Arrows indicate mitochondria engulfed in autophagosomes. Double arrows indicate swollen mitochondria with disrupted cristae. M, mitochondria and N, nucleus. 40000× magnification. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(F) Representative confocal images of the shift in the fluorescence emission of Keima from 458 nm to 543 nm. Scale bar, 10 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "1B", "|", "hFwe", "-", "Lose", "mRNA", "expression", "is", "more", "abundant", "in", "elderly", "people", ".", "hFwe", "-", "Lose", "mRNA", "expression", "was", "analyzed", "by", "RT", "-", "qPCR", "in", "86", "lung", "tissue", "biopsies", "taken", "from", "non", "-", "COVID", "patients", "with", "age", "between", "20", "and", "82", "years", ".", "Older", "patients", "show", "a", "significant", "upregulation", "of", "hFwe", "-", "Lose", "expression", ".", "A", "log", "-", "Linear", "regression", "model", "demonstrates", "a", "positive", "correlation", "between", "age", "and", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "(", "R2", "=", "0", ".", "13", ";", "slope", "confidence", "interval", "of", "95", "%", "(", "CI", ")", "=", "[", "2", ".", "0", "-", "12", ".", "2", "]", ";", "p", "-", "value", "of", "the", "linear", "regression", "model", "<", "6", "⋅", "10", "-", "4", ")", ".", "C", "|", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "is", "elevated", "in", "lung", "tissue", "biopsies", "from", "patients", "with", "comorbidities", ".", "Box", "plot", "illustrates", "an", "increased", "expression", "of", "hFwe", "-", "Lose", "in", "lungs", "of", "patients", "with", "hypertension", "(", "HT", ";", "n", "=", "129", ")", ",", "obesity", "(", "n", "=", "45", ")", ",", "chronic", "obstructive", "pulmonary", "disease", "(", "COPD", "n", "=", "51", ")", ",", "diabetes", "(", "n", "=", "48", ")", ",", "cardio", "-", "vascular", "disease", "(", "CVD", ";", "n", "=", "63", ")", "versus", "disease", "-", "free", "control", "lungs", "(", "n", "=", "42", ")", ".", "Patient", "`", "s", "age", "is", "depicted", "in", "color", ".", "Two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "for", "each", "comorbidity", "(", "compared", "to", "disease", "-", "free", "patients", ")", ",", "and", "p", "-", "values", "are", "presented", "on", "the", "plot", ".", "The", "central", "band", "shows", "the", "median", ",", "the", "box", "indicates", "the", "interquartile", "range", ",", "the", "whiskers", "extend", "to", "the", "most", "extreme", "points", "within", "the", "1", ".", "5", "-", "fold", "distance", "of", "the", "interquartile", "range", "above", "and", "below", "the", "box", ".", "D", "|", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "is", "upregulated", "in", "lung", "tissue", "of", "COVID", "-", "19", "patients", ".", "Box", "plot", "illustrates", "an", "increased", "expression", "of", "hFwe", "-", "Lose", "in", "lung", "tissue", "of", "patients", "diagnosed", "with", "COVID", "-", "19", "(", "n", "=", "11", ")", ",", "individuals", "affected", "with", "host", "comorbidities", "(", "n", "=", "216", ")", "versus", "disease", "-", "free", "control", "lungs", "(", "n", "=", "42", ")", ".", "Patient", "'", "s", "age", "is", "depicted", "in", "color", ".", "Two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "(", "compared", "to", "disease", "-", "free", "patients", ")", ",", "and", "p", "-", "values", "are", "presented", "on", "the", "plot", ".", "The", "central", "band", "shows", "the", "median", ",", "the", "box", "indicates", "the", "interquartile", "range", ",", "the", "whiskers", "extend", "to", "the", "most", "extreme", "points", "within", "the", "1", ".", "5", "-", "fold", "distance", "of", "the", "interquartile", "range", "above", "and", "below", "the", "box", ".", "E", "|", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "infection", "manifests", "histological", "changes", "in", "patients", "'", "lungs", "as", "demonstrated", "by", "H", "&", "E", "staining", ".", "1", ")", "For", "comparison", ",", "the", "normal", "lung", "of", "an", "elderly", "individual", "is", "shown", ",", "containing", "air", "-", "filled", "empty", "looking", "alveolar", "spaces", "and", "thin", "alveolar", "septae", "/", "gas", "-", "exchange", "membranes", ".", "Note", "that", "there", "are", "almost", "no", "inflammatory", "cells", "and", "that", "capillaries", "are", "only", "merely", "visible", "since", "not", "congested", ".", "2", ")", "Diffuse", "(", "proliferative", ")", "alveolar", "damage", "showing", "evidence", "of", "cell", "death", ".", "An", "alveolar", "space", "filled", "with", "desquamated", "pneumocytes", "and", "macrophages", ",", "lymphocytes", "and", "focal", "erythrocyte", "extravasation", "as", "well", "as", "one", "multinucleated", "pneumocyte", "type", "II", ".", "The", "still", "recognizable", "epithelial", "lining", "is", "detached", ".", "Cells", "and", "surfactant", "are", "lost", "creating", "perforations", "in", "the", "alveolar", "wall", ",", "allowing", "migration", "of", "blood", "cells", "and", "fluid", "to", "enter", "inside", "the", "alveolar", "space", ".", "The", "adjacent", "interstitial", "space", "is", "significantly", "widened", ",", "showing", "an", "increase", "of", "mononuclear", "inflammatory", "cells", "and", "extravasation", "of", "erythrocytes", ".", "On", "the", "top", "and", "the", "lower", "right", ",", "dilated", "and", "congested", "capillaries", "can", "be", "seen", "(", "Hematoxylin", "and", "Eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "stain", ",", "200x", ")", ".", "Abbreviations", ":", "a", "-", "Alveolar", "structure", "destroyed", "by", "lymphocytes", ",", "desquamated", "epithelium", ",", "as", "well", "as", "extravasated", "blood", ";", "The", "alveoli", "should", "be", "empty", ",", "but", "here", "it", "is", "filled", "with", "a", "combination", "of", "degenerated", "cells", "and", "fibrin", ";", "b", "-", "Next", "alveoli", ";", "c", "-", "Expanded", "pulmonary", "interstitium", ".", "The", "interstitium", "should", "be", "as", "thin", "as", "10um", ",", "but", "here", "it", "is", "100um", ";", "d", "-", "Extravasation", "of", "erythrocytes", ";", "e", "-", "Lymphocytes", ";", "f", "-", "Congested", "capillaries", "and", "arterioles", ";", "g", "-", "Multinucleated", "alveolocyte", "/", "pneumocyte", "type", "II", ";", "h", "-", "Detached", "epithelium", ";", "i", "-", "A", "histiocyte", "with", "a", "kidney", "-", "shaped", "nucleus", "at", "the", "bottom", "of", "the", "circle", "has", "ingested", "erythrocytes", "(", "left", "-", "handed", ")", ",", "representing", "the", "first", "step", "of", "cellular", "elimination", ".", "Round", "inlet", "with", "encircled", "karyopyknotic", ",", "karyorrhectic", "and", "\"", "ghost", "-", "cell", "\"", "figures", "indicative", "of", "apoptosis", ".", "3", ")", "Presence", "of", "type", "II", "pneumocyte", "syncytial", "giant", "cells", "in", "a", "collapsing", "alveolar", "space", "with", "detached", "epithelial", "lining", ".", "The", "adjacent", "interstitial", "space", "shows", "analogous", "changes", "to", "2A1", ".", "At", "the", "bottom", ",", "there", "is", "a", "prominently", "dilated", "and", "congested", "capillary", "(", "H", "&", "E", ",", "200x", ")", ".", "Abbreviations", ":", "a", "-", "Alveoli", "with", "detached", "epithelium", ";", "b", "-", "Next", "alveoli", ";", "c", "-", "E", "Extravasation", "of", "erythrocytes", ";", "d", "-", "Expanded", "interstitium", ";", "e", "-", "Lymphocytes", ";", "f", "-", "Multinucleated", "pneumocyte", "type", "II", ".", "4", ")", "Diffuse", "alveolar", "damage", "showing", "massive", "extravasation", "of", "fibrin", "(", "homogeneous", "eosinophilic", "material", "in", "the", "center", "of", "the", "alveolar", "space", ")", ".", "The", "lining", "pneumocytes", "are", "almost", "all", "apoptotic", "/", "necrotic", ".", "The", "fibrin", "exudate", "is", "intermingled", "with", "mononuclear", "inflammatory", "cells", "and", "cellular", "debris", "(", "H", "&", "E", ",", "200x", ")", ".", "Abbreviations", ":", "a", "-", "Alveola", ";", "b", "-", "Congested", "capillaries", ";", "c", "-", "Fibrin", ";", "d", "-", "Remnants", "of", "degenerated", "/", "dying", "epithelium", ";", "e", "-", "Expanded", "interstitium", ";", "f", "-", "Cellular", "debris", "consisting", "of", "macrophages", ",", "detached", "epithelial", "cells", "and", "lymphocytes", ";", "g", "-", "Fully", "degenerated", "/", "lacking", "epithelial", "coverage", "within", "the", "alveoli", ".", "Round", "inlet", "with", "encircled", "karyopyknotic", ",", "karyorrhectic", "and", "\"", "ghost", "-", "cell", "\"", "figures", "indicative", "of", "apoptosis", ".", "5", ")", "Immunohistochemical", "stain", "(", "IHC", ")", "for", "fibrin", "showing", "microthrombi", "caused", "by", "dysfunction", "of", "endothelial", "cells", "in", "capillaries", "of", "the", "alveolar", "membranes", "/", "lung", "interstitium", "leading", "to", "obstruction", "of", "the", "microcirculation", "(", "IHC", "for", "fibrin", ",", "200x", ")", ".", "Abbreviations", ":", "a", "-", "All", "small", "alveolar", "septal", "capillaries", "are", "filled", "out", "with", "worm", "-", "like", "fibrin", "thrombi", "hampering", "/", "obstructing", "circulation", ";", "b", "-", "Normal", "interstitium", ".", "F", "|", "Healthy", "lungs", "show", "very", "low", "cleaved", "caspase", "-", "3", "positive", "cells", ".", "IHC", "staining", "for", "cleaved", "caspase", "-", "3", "(", "20x", ")", ".", "G", "|", "Expression", "of", "cleaved", "(", "active", ")", "caspase", "-", "3", "yielding", "apoptotic", "and", "pre", "-", "apoptotic", "cells", ":", "IHC", "for", "cleaved", "(", "active", ")", "caspase", "-", "3", "showing", "a", "brown", "nuclear", "staining", "signal", "in", "respective", "cells", ".", "31", ".", "5", "%", "cells", "were", "found", "to", "be", "caspase", "positive", ",", "11", ".", "7", "%", "with", "high", "caspase", "-", "3", "positivity", "and", "another", "19", ".", "8", "%", "with", "low", ".", "These", "cells", "are", "mainly", "located", "in", "the", "interstitium", ",", "but", "also", "in", "some", "alveolar", "epithelial", "and", "endothelial", "compartments", ".", "In", "the", "lower", "right", ",", "the", "edge", "of", "an", "alveolar", "space", "containing", "several", "(", "pre", "-", ")", "apoptotic", "pneumocytes", "is", "seen", ",", "while", "in", "the", "upper", "left", "a", "completely", "denuded", "/", "deepithelialized", "alveolus", "with", "two", "apoptotic", "remnants", "is", "observable", "(", "IHC", "for", "cleaved", "caspase", "-", "3", ",", "20x", ")", ".", "Abbreviations", ":", "a", "-", "Apoptotic", "large", "mononuclear", "cells", ";", "b", "-", "Apoptotic", "alveolocyte", "/", "pneumocyte", ";", "i", "-", "Amplification", "of", "apoptotic", "alveolocyte", "/", "pneumocyte", ".", "As", "shown", "in", "the", "round", "inlets", "of", "1E2", "and", "1E4", ",", "homogeneous", "dark", "nuclear", "condensation", "up", "to", "a", "size", "of", "2μm", "(", "karyopyknosis", ")", ",", "homogeneous", "pinkish", "-", "greyish", "nuclear", "condensation", ",", "large", "nuclear", "inclusion", "with", "marginalization", "of", "the", "condensed", "chromatin", ",", "coarse", "nuclear", "angulation", ",", "nose", "-", "like", "/", "polar", "body", "-", "like", "nuclear", "protrusions", ",", "the", "latter", "two", "being", "karyorrhectic", "debris", ",", "were", "all", "morphologically", "considered", "evidence", "of", "apoptosis", ".", "This", "has", "been", "correlated", "with", "and", "was", "reflected", "by", "the", "results", "of", "the", "cleaved", "caspase", "-", "3", "staining", "on", "step", "sections", ".", "All", "cells", "were", "counted", "on", "the", "20X", "fields", "for", "n", "=", "42", "disease", "-", "free", "and", "n", "=", "3", "COVID", "-", "19", "autopsy", "patients", ".", "The", "expression", "of", "hFwe", "-", "Lose", "in", "COVID", "-", "19", "patients", "is", "significantly", "higher", "than", "in", "disease", "-", "free", "individuals", ",", "regardless", "of", "cleaved", "caspase", "-", "3", "staining", "(", "Cas", "POS", ":", "p", "<", "0", ".", "004", ";", "Cas", "NEG", ":", "p", "<", "0", ".", "006", ")", ".", "In", "COVID", "-", "19", "patients", "we", "observed", "a", "significantly", "higher", "expression", "of", "hFwe", "-", "Lose", "in", "sections", "with", "positive", "cleaved", "caspase", "-", "3", "staining", "(", "p", "<", "0", ".", "004", ")", ".", "Two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "(", "compared", "to", "disease", "-", "free", "samples", "and", "NEG", "samples", ",", "respectively", ")", ",", "and", "p", "-", "values", "are", "presented", "on", "the", "plot", ".", "The", "central", "band", "shows", "the", "median", ",", "the", "box", "indicates", "the", "interquartile", "range", ",", "the", "whiskers", "extend", "to", "the", "most", "extreme", "points", "within", "the", "1", ".", "5", "-", "fold", "distance", "of", "the", "interquartile", "range", "above", "and", "below", "the", "box", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B | hFwe-Lose mRNA expression is more abundant in elderly people. hFwe-Lose mRNA expression was analyzed by RT-qPCR in 86 lung tissue biopsies taken from non-COVID patients with age between 20 and 82 years. Older patients show a significant upregulation of hFwe-Lose expression. A log-Linear regression model demonstrates a positive correlation between age and hFwe-Lose expression (R2= 0.13; slope confidence interval of 95% (CI) = [2.0-12.2]; p-value of the linear regression model < 6⋅10-4).C | hFwe-Lose expression is elevated in lung tissue biopsies from patients with comorbidities. Box plot illustrates an increased expression of hFwe-Lose in lungs of patients with hypertension (HT; n = 129), obesity (n = 45), chronic obstructive pulmonary disease (COPD n = 51), diabetes (n = 48), cardio-vascular disease (CVD; n = 63) versus disease-free control lungs (n = 42). Patient`s age is depicted in color. Two-sided Student's t-test was performed for each comorbidity (compared to disease-free patients), and p-values are presented on the plot. The central band shows the median, the box indicates the interquartile range, the whiskers extend to the most extreme points within the 1.5-fold distance of the interquartile range above and below the box.D | hFwe-Lose expression is upregulated in lung tissue of COVID-19 patients. Box plot illustrates an increased expression of hFwe-Lose in lung tissue of patients diagnosed with COVID-19 (n = 11), individuals affected with host comorbidities (n = 216) versus disease-free control lungs (n = 42). Patient's age is depicted in color. Two-sided Student's t-test was performed (compared to disease-free patients), and p-values are presented on the plot. The central band shows the median, the box indicates the interquartile range, the whiskers extend to the most extreme points within the 1.5-fold distance of the interquartile range above and below the box.E | SARS-CoV-2-infection manifests histological changes in patients' lungs as demonstrated by H&E staining. 1)For comparison, the normal lung of an elderly individual is shown, containing air-filled empty looking alveolar spaces and thin alveolar septae/gas-exchange membranes. Note that there are almost no inflammatory cells and that capillaries are only merely visible since not congested. 2) Diffuse (proliferative) alveolar damage showing evidence of cell death. An alveolar space filled with desquamated pneumocytes and macrophages, lymphocytes and focal erythrocyte extravasation as well as one multinucleated pneumocyte type II. The still recognizable epithelial lining is detached. Cells and surfactant are lost creating perforations in the alveolar wall, allowing migration of blood cells and fluid to enter inside the alveolar space. The adjacent interstitial space is significantly widened, showing an increase of mononuclear inflammatory cells and extravasation of erythrocytes. On the top and the lower right, dilated and congested capillaries can be seen (Hematoxylin and Eosin (H&E) stain, 200x). Abbreviations: a- Alveolar structure destroyed by lymphocytes, desquamated epithelium, as well as extravasated blood; The alveoli should be empty, but here it is filled with a combination of degenerated cells and fibrin; b- Next alveoli; c- Expanded pulmonary interstitium. The interstitium should be as thin as 10um, but here it is 100um; d- Extravasation of erythrocytes; e- Lymphocytes; f- Congested capillaries and arterioles; g- Multinucleated alveolocyte/pneumocyte type II; h- Detached epithelium; i- A histiocyte with a kidney-shaped nucleus at the bottom of the circle has ingested erythrocytes (left-handed), representing the first step of cellular elimination. Round inlet with encircled karyopyknotic, karyorrhectic and \"ghost-cell\" figures indicative of apoptosis. 3) Presence of type II pneumocyte syncytial giant cells in a collapsing alveolar space with detached epithelial lining. The adjacent interstitial space shows analogous changes to 2A1. At the bottom, there is a prominently dilated and congested capillary (H&E, 200x). Abbreviations: a- Alveoli with detached epithelium; b- Next alveoli; c- E Extravasation of erythrocytes; d- Expanded interstitium; e- Lymphocytes; f- Multinucleated pneumocyte type II. 4) Diffuse alveolar damage showing massive extravasation of fibrin (homogeneous eosinophilic material in the center of the alveolar space). The lining pneumocytes are almost all apoptotic/necrotic. The fibrin exudate is intermingled with mononuclear inflammatory cells and cellular debris (H&E, 200x). Abbreviations: a- Alveola; b- Congested capillaries; c- Fibrin; d- Remnants of degenerated / dying epithelium; e- Expanded interstitium; f- Cellular debris consisting of macrophages, detached epithelial cells and lymphocytes; g- Fully degenerated / lacking epithelial coverage within the alveoli. Round inlet with encircled karyopyknotic, karyorrhectic and \"ghost-cell\" figures indicative of apoptosis. 5) Immunohistochemical stain (IHC) for fibrin showing microthrombi caused by dysfunction of endothelial cells in capillaries of the alveolar membranes/lung interstitium leading to obstruction of the microcirculation (IHC for fibrin, 200x). Abbreviations: a- All small alveolar septal capillaries are filled out with worm-like fibrin thrombi hampering / obstructing circulation; b- Normal interstitium.F | Healthy lungs show very low cleaved caspase-3 positive cells. IHC staining for cleaved caspase-3 (20x). G | Expression of cleaved (active) caspase-3 yielding apoptotic and pre-apoptotic cells: IHC for cleaved (active) caspase-3 showing a brown nuclear staining signal in respective cells. 31.5% cells were found to be caspase positive, 11.7% with high caspase-3 positivity and another 19.8% with low. These cells are mainly located in the interstitium, but also in some alveolar epithelial and endothelial compartments. In the lower right, the edge of an alveolar space containing several (pre-)apoptotic pneumocytes is seen, while in the upper left a completely denuded/deepithelialized alveolus with two apoptotic remnants is observable (IHC for cleaved caspase-3, 20x). Abbreviations: a- Apoptotic large mononuclear cells; b-Apoptotic alveolocyte / pneumocyte; i- Amplification of apoptotic alveolocyte / pneumocyte. As shown in the round inlets of 1E2 and 1E4, homogeneous dark nuclear condensation up to a size of 2μm (karyopyknosis), homogeneous pinkish-greyish nuclear condensation, large nuclear inclusion with marginalization of the condensed chromatin, coarse nuclear angulation, nose-like/polar body-like nuclear protrusions, the latter two being karyorrhectic debris, were all morphologically considered evidence of apoptosis. This has been correlated with and was reflected by the results of the cleaved caspase-3 staining on step sections. All cells were counted on the 20X fields for n = 42 disease-free and n = 3 COVID-19 autopsy patients. The expression of hFwe-Lose in COVID-19 patients is significantly higher than in disease-free individuals, regardless of cleaved caspase-3 staining (Cas POS: p < 0.004; Cas NEG: p < 0.006). In COVID-19 patients we observed a significantly higher expression of hFwe-Lose in sections with positive cleaved caspase-3 staining (p < 0.004). Two-sided Student's t-test was performed (compared to disease-free samples and NEG samples, respectively), and p-values are presented on the plot. The central band shows the median, the box indicates the interquartile range, the whiskers extend to the most extreme points within the 1.5-fold distance of the interquartile range above and below the box."}
{"words": ["Figure", "2A", "|", "hFwe", "-", "Lose", "biomarker", "expression", "is", "more", "abundant", "in", "nasopharyngeal", "swab", "probes", "from", "older", "adults", ".", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "was", "analyzed", "by", "RT", "-", "qPCR", "in", "283", "nasopharyngeal", "swab", "samples", "taken", "from", "patients", "with", "age", "between", "1", "and", "96", "years", ",", "taken", "at", "the", "very", "beginning", "of", "the", "disease", "(", "the", "earliest", "contact", "with", "physician", ",", "before", "the", "disease", "progression", ")", ".", "The", "vertical", "axis", "represents", "relative", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "normalized", "to", "the", "mean", "of", "non", "-", "hospitalized", "patients", ".", "Colors", "depict", "the", "outcome", "groups", ":", "non", "-", "hospitalized", "(", "gray", ",", "n", "=", "85", ")", ",", "hospitalized", "(", "blue", ",", "n", "=", "177", ")", "and", "deceased", "(", "red", ",", "n", "=", "21", ")", ".", "The", "shape", "of", "data", "points", "reflects", "the", "cohorts", ":", "circles", "for", "the", "training", "cohort", "(", "n", "=", "203", ")", "and", "triangles", "for", "the", "validation", "cohort", "(", "n", "=", "80", ")", ".", "The", "lines", "show", "the", "fitted", "curves", "of", "an", "asymptotic", "model", "with", "the", "same", "asymptotic", "value", "but", "different", "rate", "constants", "per", "group", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", ")", ".", "Due", "to", "the", "comparatively", "low", "number", "of", "deceased", "patients", "in", "the", "dataset", "(", "n", "=", "21", ")", ",", "the", "curve", "for", "this", "group", "reflects", "the", "asymptotic", "value", ".", "Hospitalized", "and", "deceased", "patients", "show", "a", "positive", "correlation", "of", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "and", "age", "with", "a", "larger", "rate", "constant", "for", "the", "hospitalized", "patients", ".", "(", "R2", "=", "0", ".", "65", ")", "The", "p", "-", "value", "(", "<", "0", ".", "001", ")", "indicates", "that", "the", "blue", "curve", "(", "for", "hospitalized", "patients", ")", "grows", "faster", "with", "age", ",", "compared", "to", "the", "gray", "curve", "for", "non", "-", "hospitalized", "patients", ")", ".", "B", "|", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "is", "elevated", "in", "nasopharyngeal", "swab", "probes", "from", "patients", "with", "comorbidities", ".", "Box", "plots", "illustrate", "an", "increased", "relative", "expression", "of", "hFwe", "-", "Lose", "in", "nasopharyngeal", "swabs", "of", "patients", "with", "diabetes", "(", "n", "=", "129", ")", ",", "COPD", "(", "n", "=", "20", ")", ",", "obesity", "(", "BMI", ">", "30", ";", "n", "=", "152", ")", ",", "cardiomyopathy", "(", "\"", "CM", "\"", ",", "n", "=", "19", ")", ",", "heart", "failure", "(", "\"", "HF", "\"", ",", "n", "=", "35", ")", ",", "hypertension", "(", "\"", "HT", "\"", ",", "n", "=", "121", ")", ",", "chronic", "kidney", "disease", "(", "\"", "CKD", "\"", ",", "n", "=", "60", ")", "versus", "disease", "-", "free", "patients", "(", "n", "=", "96", ")", ".", "Two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "were", "performed", "(", "compared", "to", "disease", "-", "free", "patients", ")", ",", "and", "p", "-", "values", "are", "presented", "on", "the", "plot", ".", "The", "vertical", "axis", "represents", "relative", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "normalized", "to", "the", "mean", "of", "non", "-", "hospitalized", "patients", ".", "The", "color", "refers", "to", "the", "COVID", "-", "19", "disease", "outcome", ":", "gray", "for", "not", "hospitalised", ",", "blue", "for", "hospitalised", "and", "red", "for", "deceased", "patients", ".", "The", "shape", "of", "data", "points", "reflects", "the", "cohorts", ":", "circles", "for", "the", "training", "cohort", "(", "n", "=", "203", ")", "and", "triangles", "for", "the", "validation", "cohort", "(", "n", "=", "80", ")", ".", "The", "central", "band", "shows", "the", "median", ",", "the", "box", "indicates", "the", "interquartile", "range", ",", "the", "whiskers", "extend", "to", "the", "most", "extreme", "points", "within", "the", "1", ".", "5", "-", "fold", "distance", "of", "the", "interquartile", "range", "above", "and", "below", "the", "box", ".", "D", "|", "Elevated", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "in", "the", "nasal", "swab", "samples", "associates", "with", "patients", "'", "condition", "severity", "and", "respective", "medical", "treatment", ".", "Box", "plots", "illustrate", "an", "increased", "expression", "of", "hFwe", "-", "Lose", "in", "nasal", "swabs", "of", "patients", ",", "who", "were", "hospitalized", "within", "14", "days", "of", "disease", "progression", "(", "n", "=", "177", ")", ",", "admitted", "to", "intensive", "care", "unit", "(", "ICU", ")", "(", "n", "=", "34", ")", ",", "underwent", "intubation", "(", "n", "=", "58", ")", ",", "had", "respiratory", "rate", "greater", "than", "30", "(", "GT30", ")", "(", "n", "=", "76", ")", ",", "had", "blood", "oxygenation", "level", "(", "SpO2", ")", "less", "than", "94", "%", "(", "n", "=", "147", ")", ",", "and", "who", "died", "within", "30", "days", "of", "disease", "progression", "(", "n", "=", "21", ")", "versus", "patients", "without", "respective", "conditions", ".", "Pairwise", "two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "were", "performed", "(", "compared", "to", "patients", "without", "respective", "conditions", ")", ",", "and", "p", "-", "values", "are", "presented", "on", "the", "plot", ".", "The", "vertical", "axis", "represents", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "normalized", "to", "the", "mean", "of", "non", "-", "hospitalized", "patients", ".", "The", "color", "refers", "to", "the", "COVID", "-", "19", "disease", "outcome", ":", "gray", "for", "not", "hospitalised", ",", "blue", "for", "hospitalised", "and", "red", "for", "deceased", "patients", ".", "The", "shape", "of", "data", "points", "reflects", "the", "cohorts", ":", "circles", "for", "the", "training", "cohort", "(", "n", "=", "203", ")", "and", "triangles", "for", "the", "validation", "cohort", "(", "n", "=", "80", ")", ".", "The", "central", "band", "shows", "the", "median", ",", "the", "box", "indicates", "the", "interquartile", "range", ",", "the", "whiskers", "extend", "to", "the", "most", "extreme", "points", "within", "the", "1", ".", "5", "-", "fold", "distance", "of", "the", "interquartile", "range", "above", "and", "below", "the", "box", ".", "E", "|", "Elevated", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "in", "nasal", "swab", "associates", "with", "patients", "'", "disease", "outcome", ".", "Box", "plot", "emphasizes", "an", "increased", "expression", "of", "hFwe", "-", "Lose", "in", "nasal", "swabs", "of", "patients", ",", "who", "were", "hospitalized", "within", "14", "days", "of", "disease", "progression", "(", "n", "=", "177", ")", ",", "and", "who", "died", "within", "30", "days", "of", "disease", "progression", "(", "n", "=", "21", ")", "versus", "patients", "without", "respective", "conditions", ".", "Two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "were", "performed", "(", "compared", "to", "non", "-", "hospitalised", "patients", ")", ",", "and", "p", "-", "values", "are", "presented", "on", "the", "plot", ".", "The", "vertical", "axis", "represents", "hFwe", "-", "Lose", "expression", "normalized", "to", "the", "mean", "of", "non", "-", "hospitalized", "patients", ".", "The", "color", "refers", "to", "the", "COVID", "-", "19", "disease", "outcome", ":", "gray", "for", "not", "hospitalised", ",", "blue", "for", "hospitalised", "and", "red", "for", "deceased", "patients", ".", "The", "shape", "of", "data", "points", "reflects", "the", "cohorts", ":", "circles", "for", "the", "training", "cohort", "(", "n", "=", "203", ")", "and", "triangles", "for", "the", "validation", "cohort", "(", "n", "=", "80", ")", ".", "The", "central", "band", "shows", "the", "median", ",", "the", "box", "indicates", "the", "interquartile", "range", ",", "the", "whiskers", "extend", "to", "the", "most", "extreme", "points", "within", "the", "1", ".", "5", "-", "fold", "distance", "of", "the", "interquartile", "range", "above", "and", "below", "the", "box", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A | hFwe-Lose biomarker expression is more abundant in nasopharyngeal swab probes from older adults. hFwe-Lose expression was analyzed by RT-qPCR in 283 nasopharyngeal swab samples taken from patients with age between 1 and 96 years, taken at the very beginning of the disease (the earliest contact with physician, before the disease progression). The vertical axis represents relative hFwe-Lose expression normalized to the mean of non-hospitalized patients. Colors depict the outcome groups: non-hospitalized (gray, n = 85), hospitalized (blue, n = 177) and deceased (red, n = 21). The shape of data points reflects the cohorts: circles for the training cohort (n = 203) and triangles for the validation cohort (n = 80). The lines show the fitted curves of an asymptotic model with the same asymptotic value but different rate constants per group (see Materials and Methods). Due to the comparatively low number of deceased patients in the dataset (n = 21), the curve for this group reflects the asymptotic value. Hospitalized and deceased patients show a positive correlation of hFwe-Lose expression and age with a larger rate constant for the hospitalized patients. (R2= 0.65) The p-value (< 0.001) indicates that the blue curve (for hospitalized patients) grows faster with age, compared to the gray curve for non-hospitalized patients).B | hFwe-Lose expression is elevated in nasopharyngeal swab probes from patients with comorbidities. Box plots illustrate an increased relative expression of hFwe-Lose in nasopharyngeal swabs of patients with diabetes (n = 129), COPD (n = 20), obesity (BMI > 30; n = 152), cardiomyopathy (\"CM\", n = 19), heart failure (\"HF\", n = 35), hypertension (\"HT\", n = 121), chronic kidney disease (\"CKD\", n = 60) versus disease-free patients (n = 96). Two-sided Student's t-tests were performed (compared to disease-free patients), and p-values are presented on the plot. The vertical axis represents relative hFwe-Lose expression normalized to the mean of non-hospitalized patients. The color refers to the COVID-19 disease outcome: gray for not hospitalised, blue for hospitalised and red for deceased patients. The shape of data points reflects the cohorts: circles for the training cohort (n = 203) and triangles for the validation cohort (n = 80). The central band shows the median, the box indicates the interquartile range, the whiskers extend to the most extreme points within the 1.5-fold distance of the interquartile range above and below the box.D | Elevated hFwe-Lose expression in the nasal swab samples associates with patients' condition severity and respective medical treatment. Box plots illustrate an increased expression of hFwe-Lose in nasal swabs of patients, who were hospitalized within 14 days of disease progression (n = 177), admitted to intensive care unit (ICU) (n = 34), underwent intubation (n = 58), had respiratory rate greater than 30 (GT30) (n = 76), had blood oxygenation level (SpO2) less than 94% (n = 147), and who died within 30 days of disease progression (n = 21) versus patients without respective conditions. Pairwise two-sided Student's t-tests were performed (compared to patients without respective conditions), and p-values are presented on the plot. The vertical axis represents hFwe-Lose expression normalized to the mean of non-hospitalized patients. The color refers to the COVID-19 disease outcome: gray for not hospitalised, blue for hospitalised and red for deceased patients. The shape of data points reflects the cohorts: circles for the training cohort (n = 203) and triangles for the validation cohort (n = 80). The central band shows the median, the box indicates the interquartile range, the whiskers extend to the most extreme points within the 1.5-fold distance of the interquartile range above and below the box.E |Elevated hFwe-Lose expression in nasal swab associates with patients' disease outcome. Box plot emphasizes an increased expression of hFwe-Lose in nasal swabs of patients, who were hospitalized within 14 days of disease progression (n = 177), and who died within 30 days of disease progression (n = 21) versus patients without respective conditions. Two-sided Student's t-tests were performed (compared to non-hospitalised patients), and p-values are presented on the plot. The vertical axis represents hFwe-Lose expression normalized to the mean of non-hospitalized patients. The color refers to the COVID-19 disease outcome: gray for not hospitalised, blue for hospitalised and red for deceased patients. The shape of data points reflects the cohorts: circles for the training cohort (n = 203) and triangles for the validation cohort (n = 80). The central band shows the median, the box indicates the interquartile range, the whiskers extend to the most extreme points within the 1.5-fold distance of the interquartile range above and below the box."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Fluorescence", "micrograph", "images", "of", "representative", "cells", "stained", "for", "NONO", "in", "KELLY", "cells", "treated", "with", "2", ",", "4", ",", "6", ",", "8", "or", "10", "%", "1", ",", "6", "hexanediol", "showing", "dissolution", "of", "NONO", "puncta", "with", "increasing", "concentration", ".", "(", "D", ")", "Dot", "plot", "of", "NONO", "foci", "area", "(", "µm2", ")", "per", "nucleus", "at", "different", "concentrations", "of", "1", ",", "6", "hexanediol", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "Bars", "are", "SD", ".", "The", "numbers", "of", "biological", "replicates", "are", "indicated", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "F", ")", "Fluorescence", "micrograph", "images", "of", "representative", "cells", "stained", "for", "NONO", "in", "KELLY", "cells", "treated", "with", "PBS", ",", "RNase", "A", "or", "DNase", "I", ",", "as", "indicated", ".", "(", "G", ")", "Dot", "plot", "of", "summed", "green", "fluorescence", "per", "nucleus", "in", "(", "F", ")", ".", "Bars", "are", "SD", ".", "The", "numbers", "of", "biological", "replicates", "are", "indicated", "in", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Fluorescence micrograph images of representative cells stained for NONO in KELLY cells treated with 2, 4, 6, 8 or 10% 1,6 hexanediol showing dissolution of NONO puncta with increasing concentration. (D) Dot plot of NONO foci area (µm2) per nucleus at different concentrations of 1,6 hexanediol as in (C). Bars are SD. The numbers of biological replicates are indicated in (C).(F) Fluorescence micrograph images of representative cells stained for NONO in KELLY cells treated with PBS, RNase A or DNase I, as indicated. (G) Dot plot of summed green fluorescence per nucleus in (F). Bars are SD. The numbers of biological replicates are indicated in (F)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Fluorescence", "micrograph", "images", "of", "representative", "cells", "stained", "for", "NONO", "and", "NEAT1", "_", "2", "after", "transfection", "with", "plasmids", "expressing", "YFP", "fused", "NONO", "_", "WT", "and", "NONO", "_", "∆", "RRM1", "protein", ".", "DAPI", "(", "blue", ")", "stain", "indicates", "cell", "nuclei", ",", "YFP", "fused", "NONO", "(", "green", ")", "and", "NEAT1", "_", "2", "RNA", "FISH", "(", "red", ")", ".", "(", "B", ")", "The", "enrichment", "of", "mean", "NONO", "fluorescence", "detected", "within", "RNA", "FISH", "foci", "is", "quantitatively", "determined", "as", "a", "ratio", "relative", "to", "mean", "nuclear", "NONO", "fluorescence", "in", "(", "A", ")", ".", "Bars", "are", "SD", ".", "The", "numbers", "of", "biological", "replicates", "are", "indicated", "in", "(", "A", ")", ".", "Sphericity", "per", "NONO", "segment", ",", "NONO", "foci", "number", "per", "nucleus", "and", "NONO", "foci", "size", "between", "YFP", "fused", "NONO", "_", "WT", "and", "NONO", "_", "∆", "RRM1", "plasmids", ".", "Bars", "are", "SD", ".", "Biological", "replicates", "n", "=", "60", "in", "(", "C", ")", "and", "n", "=", "50", "in", "(", "D", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Fluorescence micrograph images of representative cells stained for NONO and NEAT1_2 after transfection with plasmids expressing YFP fused NONO_WT and NONO_∆RRM1 protein. DAPI (blue) stain indicates cell nuclei, YFP fused NONO (green) and NEAT1_2 RNA FISH (red). (B) The enrichment of mean NONO fluorescence detected within RNA FISH foci is quantitatively determined as a ratio relative to mean nuclear NONO fluorescence in (A). Bars are SD. The numbers of biological replicates are indicated in (A).Sphericity per NONO segment, NONO foci number per nucleus and NONO foci size between YFP fused NONO_WT and NONO_∆RRM1 plasmids. Bars are SD. Biological replicates n=60 in (C) and n=50 in (D)"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Relative", "NONO", "mRNA", "and", "protein", "levels", "in", "KELLY", "cells", "treated", "with", "control", "or", "NONO", "KD", "siRNAs", ".", "Representative", "Western", "blot", "image", "for", "NONO", "protein", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Relative NONO mRNA and protein levels in KELLY cells treated with control or NONO KD siRNAs. Representative Western blot image for NONO protein."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Western", "blot", "quantitation", "analysis", "of", "GATA2", "and", "HAND2", "protein", "levels", "between", "control", "and", "NONO", "KD", "siRNAs", ".", "(", "C", ")", "Representative", "Western", "blot", "images", "for", "GATA2", "and", "HAND2", "proteins", "in", "(", "B", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Western blot quantitation analysis of GATA2 and HAND2 protein levels between control and NONO KD siRNAs. (C) Representative Western blot images for GATA2 and HAND2 proteins in (B)."}
{"words": ["Figure", "1", "Plasma", "levels", "of", "the", "13", "biomarkers", "belonging", "to", "clusters", "3", ",", "4", ",", "6", "(", "see", "Table", "2", ")", "in", "healthy", "subjects", "(", "n", "=", "16", ")", "and", "PDAC", "patients", "(", "n", "=", "25", ")", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "Mann", "-", "Whitney", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "a", "scatter", "-", "plot", ",", "mean", "±", "SEM", ".", "p", "-", "values", "(", "for", "each", "cluster", ")", "were", "calculated", "with", "the", "Wilcoxon", "Rank", "Sum", "Test", "and", "indicate", "a", "significant", "association", "between", "each", "cluster", "and", "PDAC", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 Plasma levels of the 13 biomarkers belonging to clusters 3, 4, 6 (see Table 2) in healthy subjects (n=16) and PDAC patients (n=25), *p<0.01 (Mann-Whitney). Data are expressed as a scatter-plot, mean ± SEM. p-values (for each cluster) were calculated with the Wilcoxon Rank Sum Test and indicate a significant association between each cluster and PDAC. "}
{"words": ["Figure", "3", "A", ")", "Levels", "of", "TIMP1", ",", "MMP7", "and", "TSP2", "in", "plasma", "of", "KC", "mice", "(", "n", "=", "7", "-", "9", ")", "at", "60", ",", "120", ",", "180", ",", "240", "and", "330", "days", "of", "age", "and", "KPC", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "8", ")", "at", "30", ",", "90", "and", "150", "days", "of", "age", "(", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Mann", "-", "Whitney", ")", ".", "The", "exact", "n", "and", "p", "-", "values", "are", "indicated", "in", "Appendix", "Table", "S3", "B", ")", "Levels", "of", "TIMP1", ",", "MMP7", "and", "TSP2", "in", "plasma", "of", "healthy", "mice", "(", "n", "=", "15", ")", ",", "mice", "with", "chronic", "pancreatitis", "at", "150", "days", "of", "age", "(", "n", "=", "19", ")", ",", "KC", "mice", "at", "330", "days", "of", "age", "(", "control", "PdxCre", "n", "=", "3", "-", "4", ";", "KC", "n", "=", "7", "-", "8", ")", ",", "KPC", "mice", "at", "150", "days", "of", "age", "(", "control", "PdxCre", "n", "=", "4", "-", "7", ";", "KPC", "n", "=", "4", ")", ".", "The", "exact", "n", "is", "indicated", "in", "Appendix", "Table", "S3B", ".", "Box", "plots", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentiles", ",", "whiskers", "extends", "from", "min", "to", "max", "and", "horizontal", "lines", "indicate", "median", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "with", "1", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "\"", "s", "multiple", "comparison", "test", "C", ")", "Histological", "analysis", "of", "pancreas", "from", "PdxCre", "and", "KC", "mice", "with", "different", "grades", "of", "PanIN", "lesions", "at", "330", "days", "of", "age", ".", "Anti", "-", "TIMP1", ",", "anti", "-", "MMP7", ",", "anti", "-", "TSP2", "and", "anti", "-", "CCN2", "staining", "of", "a", "representative", "KC", "PanIN", "lesion", "(", "200X", ",", "scale", "bars", ":", "100μm", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A) Levels of TIMP1, MMP7 and TSP2 in plasma of KC mice (n=7-9) at 60, 120, 180, 240 and 330 days of age and KPC mice (n=3-8) at 30, 90 and 150 days of age (mean ± SEM). *p<0.05 (Mann-Whitney). The exact n and p-values are indicated in Appendix Table S3  B) Levels of TIMP1, MMP7 and TSP2 in plasma of healthy mice (n=15), mice with chronic pancreatitis at 150 days of age (n=19), KC mice at 330 days of age (control PdxCre n=3-4; KC n=7-8), KPC mice at 150 days of age (control PdxCre n=4-7; KPC n=4). The exact n is indicated in Appendix Table S3B. Box plots extends from 25th to 75th percentiles, whiskers extends from min to max and horizontal lines indicate median. p-values were calculated with 1-way ANOVA with Tukey\"s multiple comparison test  C) Histological analysis of pancreas from PdxCre and KC mice with different grades of PanIN lesions at 330 days of age. Anti-TIMP1, anti-MMP7, anti-TSP2 and anti-CCN2 staining of a representative KC PanIN lesion (200X, scale bars: 100μm) "}
{"words": ["Figure", "5", " ", "Responsiveness", "to", "gemcitabine", "(", "GEM", ")", ",", "either", "alone", "or", "combined", "with", "Nab", "-", "paclitaxel", "(", "NAB", "-", "P", ")", ",", "was", "evaluated", "in", "mice", "bearing", "orthotopic", "HuPa8", "in", "the", "pancreas", ".", "Nab", "-", "paclitaxel", "(", "25mg", "/", "kg", ")", "and", "gemcitabine", "(", "150mg", "/", "kg", ")", "were", "given", "i", ".", "v", ".", "on", "days", "1", "and", "8", "of", "each", "21", "-", "day", "cycle", "(", "for", "a", "total", "of", "8", "treatments", ")", ".", " ", "A", ")", "Levels", "of", "TIMP1", ",", "MMP7", "and", "TSP2", "in", "plasma", "of", "mice", "bearing", "orthotopic", "HuPa8", "at", "30", ",", "90", "and", "150", "days", "after", "tumor", "transplantation", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "≥", "4", "for", "each", "group", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "(", "Mann", "-", "Whitney", ")", ".", "The", "exact", "n", "and", "p", "-", "values", "are", "indicated", "in", "Table", "S5A", " ", "Responsiveness", "to", "gemcitabine", "(", "GEM", ")", ",", "either", "alone", "or", "combined", "with", "Nab", "-", "paclitaxel", "(", "NAB", "-", "P", ")", ",", "was", "evaluated", "in", "mice", "bearing", "orthotopic", "HuPa8", "in", "the", "pancreas", ".", "Nab", "-", "paclitaxel", "(", "25mg", "/", "kg", ")", "and", "gemcitabine", "(", "150mg", "/", "kg", ")", "were", "given", "i", ".", "v", ".", "on", "days", "1", "and", "8", "of", "each", "21", "-", "day", "cycle", "(", "for", "a", "total", "of", "8", "treatments", ")", "B", ")", "Magnetic", "resonance", "imaging", "of", "HuPa8", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ",", "the", "white", "dotted", "lines", "indicate", "tumor", "masses", ".", "Responsiveness", "to", "gemcitabine", "(", "GEM", ")", ",", "either", "alone", "or", "combined", "with", "Nab", "-", "paclitaxel", "(", "NAB", "-", "P", ")", ",", "was", "evaluated", "in", "mice", "bearing", "orthotopic", "HuPa8", "in", "the", "pancreas", ".", "Nab", "-", "paclitaxel", "(", "25mg", "/", "kg", ")", "and", "gemcitabine", "(", "150mg", "/", "kg", ")", "were", "given", "i", ".", "v", ".", "on", "days", "1", "and", "8", "of", "each", "21", "-", "day", "cycle", "(", "for", "a", "total", "of", "8", "treatments", ")", "C", ")", "Tumor", "growth", "over", "time", "measured", "by", "MRI", ";", "each", "black", "arrow", "indicates", "one", "treatment", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "for", "each", "group", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "\"", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", " ", "Responsiveness", "to", "gemcitabine", "(", "GEM", ")", ",", "either", "alone", "or", "combined", "with", "Nab", "-", "paclitaxel", "(", "NAB", "-", "P", ")", ",", "was", "evaluated", "in", "mice", "bearing", "orthotopic", "HuPa8", "in", "the", "pancreas", ".", "Nab", "-", "paclitaxel", "(", "25mg", "/", "kg", ")", "and", "gemcitabine", "(", "150mg", "/", "kg", ")", "were", "given", "i", ".", "v", ".", "on", "days", "1", "and", "8", "of", "each", "21", "-", "day", "cycle", "(", "for", "a", "total", "of", "8", "treatments", ")", " ", "D", ")", "Levels", "of", "the", "3", "selected", "biomarkers", "in", "plasma", "of", "HuPa8", "bearing", "mice", ",", "prior", "to", "(", "day", "80", ";", "at", "randomization", ")", ",", "during", "(", "day", "120", ")", "and", "after", "(", "day", "165", ")", "the", "treatments", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "≥", "4", "for", "each", "group", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "\"", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "The", "exact", "n", "is", "indicated", "in", "Appendix", "Table", "S5B", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 Responsiveness to gemcitabine (GEM), either alone or combined with Nab-paclitaxel (NAB-P), was evaluated in mice bearing orthotopic HuPa8 in the pancreas. Nab-paclitaxel (25mg/kg) and gemcitabine (150mg/kg) were given i.v. on days 1 and 8 of each 21-day cycle (for a total of 8 treatments). A) Levels of TIMP1, MMP7 and TSP2 in plasma of mice bearing orthotopic HuPa8 at 30, 90 and 150 days after tumor transplantation (mean ± SEM; n≥4 for each group). *p<0.05, (Mann-Whitney). The exact n and p-values are indicated in Table S5A  Responsiveness to gemcitabine (GEM), either alone or combined with Nab-paclitaxel (NAB-P), was evaluated in mice bearing orthotopic HuPa8 in the pancreas. Nab-paclitaxel (25mg/kg) and gemcitabine (150mg/kg) were given i.v. on days 1 and 8 of each 21-day cycle (for a total of 8 treatments) B) Magnetic resonance imaging of HuPa8. Representative images are shown, the white dotted lines indicate tumor masses . Responsiveness to gemcitabine (GEM), either alone or combined with Nab-paclitaxel (NAB-P), was evaluated in mice bearing orthotopic HuPa8 in the pancreas. Nab-paclitaxel (25mg/kg) and gemcitabine (150mg/kg) were given i.v. on days 1 and 8 of each 21-day cycle (for a total of 8 treatments) C) Tumor growth over time measured by MRI; each black arrow indicates one treatment (mean ± SEM; n=4 for each group; 2-way ANOVA with Tukey\"s multiple comparison test)  Responsiveness to gemcitabine (GEM), either alone or combined with Nab-paclitaxel (NAB-P), was evaluated in mice bearing orthotopic HuPa8 in the pancreas. Nab-paclitaxel (25mg/kg) and gemcitabine (150mg/kg) were given i.v. on days 1 and 8 of each 21-day cycle (for a total of 8 treatments) D) Levels of the 3 selected biomarkers in plasma of HuPa8 bearing mice, prior to (day 80; at randomization), during (day 120) and after (day 165) the treatments (mean ± SEM; n≥4 for each group; 2-way ANOVA with Tukey\"s multiple comparison test). The exact n is indicated in Appendix Table S5B "}
{"words": ["Figure", "1D", ":", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "TMBIM5", "and", "LETM1", "protein", "in", "tandem", "in", "the", "left", "3", "panels", ".", "The", "input", "represents", "the", "mitochondrial", "crudely", "isolated", "from", "HEK293", "cells", "and", "was", "used", "as", "input", "for", "the", "co", "-", "IP", ",", "LETM1", "was", "immunoprecipitated", "(", "left", "panel", ",", "IP", ":", "LETM1", ")", "using", "a", "LETM1", "monoclonal", "antibody", "and", "Protein", "G", "magnetic", "beads", "(", "ProtG", ")", ".", "ProtG", "beads", "alone", "were", "used", "as", "a", "negative", "control", "for", "binding", ",", "immunoprecipitates", "were", "immunoblotted", "(", "IB", ")", "for", "the", "indicated", "proteins", "to", "demonstrate", "interaction", ".", "10", "%", "of", "the", "input", "was", "used", "for", "immunoblotting", ".", "Prohibitin", "(", "PHB", ")", "was", "used", "as", "a", "control", "to", "illustrate", "no", "nonspecific", "binding", "of", "inner", "mitochondrial", "membrane", "proteins", "complexes", ".", "The", "middle", "and", "right", "panel", "of", "the", "coIPs", "illustrates", "the", "converse", "experiment", ",", "in", "the", "middle", "in", "TMBIM5WT", "and", "right", "TMBIMKO", ",", "using", "TMBIM5", "as", "bait", "(", "right", "panel", ",", "IP", ":", "TMBIM5", ")", ".", "The", "last", "two", "right", "panels", "show", "blots", "from", "BN", "-", "PAGE", "conducted", "in", "TMBIM5WT", "and", "KO", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D: Co-immunoprecipitation of TMBIM5 and LETM1 protein in tandem in the left 3 panels. The input represents the mitochondrial crudely isolated from HEK293 cells and was used as input for the co-IP, LETM1 was immunoprecipitated (left panel, IP: LETM1) using a LETM1 monoclonal antibody and Protein G magnetic beads (ProtG). ProtG beads alone were used as a negative control for binding, immunoprecipitates were immunoblotted (IB) for the indicated proteins to demonstrate interaction. 10% of the input was used for immunoblotting. Prohibitin (PHB) was used as a control to illustrate no nonspecific binding of inner mitochondrial membrane proteins complexes. The middle and right panel of the coIPs illustrates the converse experiment, in the middle in TMBIM5WT and right TMBIMKO, using TMBIM5 as bait (right panel, IP: TMBIM5). The last two right panels show blots from BN-PAGE conducted in TMBIM5WT and KO."}
{"words": ["Figure", "2A", ":", "Western", "blot", "analysis", "of", "TMBIM5", "in", "control", "and", "targeted", "HeLa", "and", "HEK293", "clones", ".", "E", ":", "Isolated", "mitochondria", "from", "three", "independent", "replicates", "of", "HEK293", "TMBIM5WT", "and", "TMBIM5KO1", "and", "KO2", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ",", "HSP60", "and", "TOM40", "served", "as", "mitochondrial", "loading", "controls", ".", "F", ":", "Densitometric", "analysis", "of", "the", "bands", "in", "(", "E", ")", "normalized", "to", "loading", "control", ",", "bar", "graph", "of", "three", "individual", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ",", "mean", "±", "SD", ",", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "performed", "against", "TMBIM5WT", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "008", ",", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "performed", "for", "the", "OPA1", "statistics", "against", "TMBIM5WT", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0009", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A: Western blot analysis of TMBIM5 in control and targeted HeLa and HEK293 clones.E: Isolated mitochondria from three independent replicates of HEK293 TMBIM5WT and TMBIM5KO1 and KO2 were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies, HSP60 and TOM40 served as mitochondrial loading controls. F: Densitometric analysis of the bands in (E) normalized to loading control, bar graph of three individual experiments (biological replicates), mean ± SD, One-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons test performed against TMBIM5WT *p<0.05, **p<0.008, Two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons test performed for the OPA1 statistics against TMBIM5WT, ***p=0.0009, ****p<0.0001."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "purified", "and", "reconstituted", "hTMBIM5", "for", "evaluating", "the", "incorporation", "of", "hTMBIM5", "into", "proteoliposomes", "prepared", "as", "described", "in", "materials", "and", "methods", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Western blot analysis of purified and reconstituted hTMBIM5 for evaluating the incorporation of hTMBIM5 into proteoliposomes prepared as described in materials and methods."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "Representative", "nuclear", "spreads", "of", "wild", "-", "type", "pachytene", "and", "Rec8", "−", "/", "−", "pachytene", "-", "like", "spermatocytes", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", "and", "ACA", ".", "Magnified", "views", "are", "indicated", "by", "dashed", "areas", ".", "Schematic", "representation", "on", "magnified", "chromosomes", "represents", "tightly", "associated", "sister", "-", "AEs", "(", "separated", "for", "easier", "representation", ")", "in", "paired", "wild", "-", "type", "homologs", ",", "and", "the", "appearance", "of", "two", "distinguishable", "/", "separated", "sister", "-", "AEs", "once", "REC8", "-", "mediated", "cohesion", "is", "lost", "in", "Rec8", "−", "/", "−", "univalents", ".", "Bars", ",", "10", "μm", "in", "spreads", "and", "1", "μm", "on", "insets", ".", "B", ")", "Representative", "nuclear", "spread", "of", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "spermatocytes", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", "and", "ACA", ".", "Magnified", "views", "are", "indicated", "by", "dashed", "areas", ".", "Schematic", "representation", "on", "magnified", "univalents", "represents", ":", "separation", "of", "sister", "-", "AEs", "(", "centre", ")", "and", "close", "association", "of", "sister", "-", "AEs", "(", "right", ")", ".", "Bellow", ":", "graph", "showing", "the", "percentages", "of", "axes", "with", ":", "separation", "of", "AEs", "(", "dark", "grey", "area", ")", "and", "closely", "associated", "AEs", "(", "light", "grey", "area", ")", ".", "414", "axes", "analysed", ",", "from", "11", "nuclei", ".", "Bars", ",", "10", "μm", "in", "spreads", "and", "1", "μm", "on", "insets", ".", "C", ")", "Magnified", "views", "of", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "univalents", "with", "LSAEs", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", "and", "ACA", ".", "Schematic", "representation", "indicates", "sites", "of", "LSAEs", ".", "Bellow", ":", "graph", "showing", "the", "percentages", "of", "axes", "with", ":", "LSAEs", "(", "red", "area", ")", ",", "extensive", "separation", "of", "AEs", "(", "dark", "grey", "area", ")", "and", "closely", "associated", "AEs", "(", "light", "grey", "area", ")", ".", "414", "axes", "analysed", ",", "from", "11", "nuclei", ".", "Bars", ",", "1", "μm", ".", "D", ")", "Representative", "nuclear", "spread", "of", "zygotene", "-", "like", "Smc1β", "−", "/", "−", "spermatocytes", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", "and", "ACA", ".", "Magnified", "views", "are", "indicated", "by", "dashed", "areas", ".", "Schematic", "representation", "on", "magnified", "univalents", "represents", "sites", "of", "LSAEs", ".", "Bellow", ":", "graph", "showing", "the", "percentages", "of", "axes", "with", ":", "LSAEs", "(", "red", "area", ")", ",", "extensive", "separation", "of", "AEs", "(", "dark", "grey", "area", ")", "and", "closely", "associated", "AEs", "(", "light", "grey", "area", ")", ".", "404", "axes", "analysed", ",", "from", "10", "nuclei", ".", "Bars", ",", "10", "μm", "in", "spreads", "and", "1", "μm", "on", "insets", ".", "E", ")", "STED", "images", "of", "representative", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "and", "Smc1β", "−", "/", "−", "univalents", "displaying", "LSAEs", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", ".", "Bars", ",", "1μm", ".", "F", ")", "Graph", "indicating", "the", "inter", "-", "axis", "distances", "measured", "in", "wild", "-", "type", "pachytene", "bivalents", ";", "pachytene", "-", "like", "Rec8", "−", "/", "−", "and", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "and", "Smc1β", "−", "/", "−", "univalents", ".", "Each", "measurement", "in", "wild", "-", "type", "and", "Rec8", "−", "/", "−", "corresponds", "to", "the", "median", "of", "3", "distances", "measured", "along", "one", "homolog", "(", "n", "=", "60", ")", ".", "Each", "measurement", "in", "Stag3", "mutant", "and", "Smc1β", "−", "/", "−", "mutant", "axes", "correspond", "to", "1", "distance", "measured", "at", "sites", "of", "local", "separation", "of", "AEs", "(", "n", "=", "40", "and", "n", "=", "20", ",", "respectively", ")", ".", "Horizontal", "lines", "indicate", "median", ".", "G", ")", "Graph", "indicating", "the", "inter", "-", "axis", "distances", "measured", "at", "terminally", "and", "centrally", "located", "sites", "of", "LSAEs", "in", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "univalents", ".", "Each", "measurement", "corresponds", "to", "1", "distance", "measured", "at", "terminally", "(", "n", "=", "20", ")", "and", "centrally", "(", "n", "=", "20", ")", "located", "sites", "of", "local", "separation", "of", "axial", "elements", ".", "Horizontal", "lines", "indicate", "median", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) Representative nuclear spreads of wild-type pachytene and Rec8−/− pachytene-like spermatocytes. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3 and ACA. Magnified views are indicated by dashed areas. Schematic representation on magnified chromosomes represents tightly associated sister-AEs (separated for easier representation) in paired wild-type homologs, and the appearance of two distinguishable/separated sister-AEs once REC8-mediated cohesion is lost in Rec8−/− univalents. Bars, 10 μm in spreads and 1 μm on insets.B) Representative nuclear spread of zygotene-like Stag3 mutant spermatocytes. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3 and ACA. Magnified views are indicated by dashed areas. Schematic representation on magnified univalents represents: separation of sister-AEs (centre) and close association of sister-AEs (right). Bellow: graph showing the percentages of axes with: separation of AEs (dark grey area) and closely associated AEs (light grey area). 414 axes analysed, from 11 nuclei. Bars, 10 μm in spreads and 1 μm on insets.C) Magnified views of zygotene-like Stag3 mutant univalents with LSAEs. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3 and ACA. Schematic representation indicates sites of LSAEs. Bellow: graph showing the percentages of axes with: LSAEs (red area), extensive separation of AEs (dark grey area) and closely associated AEs (light grey area). 414 axes analysed, from 11 nuclei. Bars, 1 μm.D) Representative nuclear spread of zygotene-like Smc1β−/− spermatocytes. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3 and ACA. Magnified views are indicated by dashed areas. Schematic representation on magnified univalents represents sites of LSAEs. Bellow: graph showing the percentages of axes with: LSAEs (red area), extensive separation of AEs (dark grey area) and closely associated AEs (light grey area). 404 axes analysed, from 10 nuclei. Bars, 10 μm in spreads and 1 μm on insets.E) STED images of representative zygotene-like Stag3 mutant and Smc1β−/− univalents displaying LSAEs. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3. Bars, 1μm.F) Graph indicating the inter-axis distances measured in wild-type pachytene bivalents; pachytene-like Rec8−/− and zygotene-like Stag3 mutant and Smc1β−/− univalents. Each measurement in wild-type and Rec8−/− corresponds to the median of 3 distances measured along one homolog (n=60). Each measurement in Stag3 mutant and Smc1β−/− mutant axes correspond to 1 distance measured at sites of local separation of AEs (n=40 and n=20, respectively). Horizontal lines indicate median.G) Graph indicating the inter-axis distances measured at terminally and centrally located sites of LSAEs in zygotene-like Stag3 mutant univalents. Each measurement corresponds to 1 distance measured at terminally (n=20) and centrally (n=20) located sites of local separation of axial elements. Horizontal lines indicate median."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "Representative", "wild", "-", "type", "pachytene", "bivalents", ";", "pachytene", "-", "like", "Rec8", "−", "/", "−", ",", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "and", "Smc1β", "−", "/", "−", "univalents", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP1", ",", "SYCP3", "and", "ACA", ".", "Filled", "arrowheads", "indicate", "sites", "of", "LSAEs", "with", "detectable", "SYCP1", ".", "Bars", ",", "1", "μm", ".", "Bellow", ":", "graphs", "showing", "the", "percentages", "of", "sites", "of", "LSAEs", "with", "detectable", "SC", "assembly", "along", "sister", "-", "AEs", "of", "Stag3", "mutant", "and", "Smc1β", "−", "/", "−", "univalents", "(", "n", "=", "120", "and", "n", "=", "68", ",", "respectively", ")", ".", "B", ")", "Representative", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "univalents", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", ",", "ACA", "and", ":", "SYCE1", ",", "SYCE2", "and", "TEX12", ".", "Filled", "arrowheads", "indicate", "SC", "assembly", "between", "sites", "of", "LSAEs", ".", "Bars", ",", "1", "μmC", ")", "Quantification", "of", "signal", "distribution", "within", "sites", "of", "LSAEs", ",", "in", "Stag3", "mutant", "spermatocytes", ".", "Signal", "distribution", "measured", "for", "SYCP3", "and", ":", "SYCP1", ",", "SYCE1", ",", "SYCE2", "and", "TEX12", ".", "Empty", "arrowheads", "indicate", "signal", "intensity", "peaks", "that", "correspond", "to", "each", "of", "the", "two", "sister", "-", "chromatid", "axes", ",", "filled", "arrowheads", "indicate", "SYCP1", "peaks", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) Representative wild-type pachytene bivalents; pachytene-like Rec8−/−, zygotene-like Stag3 mutant and Smc1β−/− univalents. Nuclear spreads were immunostained for SYCP1, SYCP3 and ACA. Filled arrowheads indicate sites of LSAEs with detectable SYCP1. Bars, 1 μm. Bellow: graphs showing the percentages of sites of LSAEs with detectable SC assembly along sister-AEs of Stag3 mutant and Smc1β−/− univalents (n=120 and n=68, respectively).B) Representative zygotene-like Stag3 mutant univalents. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3, ACA and: SYCE1, SYCE2 and TEX12. Filled arrowheads indicate SC assembly between sites of LSAEs. Bars, 1 μmC) Quantification of signal distribution within sites of LSAEs, in Stag3 mutant spermatocytes. Signal distribution measured for SYCP3 and: SYCP1, SYCE1, SYCE2 and TEX12. Empty arrowheads indicate signal intensity peaks that correspond to each of the two sister-chromatid axes, filled arrowheads indicate SYCP1 peaks."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Representative", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "and", "Smc1β", "−", "/", "−", "univalents", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", ",", "SYCE1", "and", "REC8", ".", "Bellow", ":", "graph", "showing", "the", "percentages", "of", "Stag3", "mutant", "axes", "with", "sites", "of", "LSAEs", "with", "and", "without", "flanking", "REC8", "foci", ".", "78", "axes", "with", "LSAEs", "were", "analysed", ".", "Bars", ",", "1", "μm", ".", "B", ")", "Representative", "pachytene", "-", "like", "Rec8", "−", "/", "−", ",", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "and", "Smc1β", "−", "/", "−", "univalents", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", ",", "SYCE1", "and", "RAD21L", ".", "Bars", ",", "1", "μm", ".", "C", ")", "Representative", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "and", "Smc1β", "−", "/", "−", "univalents", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", ",", "SYCE1", "and", "RAD21", ".", "Bars", ",", "1", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Representative zygotene-like Stag3 mutant and Smc1β−/− univalents. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3, SYCE1 and REC8. Bellow: graph showing the percentages of Stag3 mutant axes with sites of LSAEs with and without flanking REC8 foci. 78 axes with LSAEs were analysed. Bars, 1 μm.B) Representative pachytene-like Rec8−/−, zygotene-like Stag3 mutant and Smc1β−/− univalents. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3, SYCE1 and RAD21L. Bars, 1 μm.C) Representative zygotene-like Stag3 mutant and Smc1β−/− univalents. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3, SYCE1 and RAD21. Bars, 1 μm."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Representative", "wild", "-", "type", "pachytene", "sex", "chromosomes", ".", "Nuclear", "spreads", "of", "pachytene", "spermatocytes", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", ".", "Filled", "arrowheads", "indicate", "the", "PAR", ".", "Dashed", "area", "indicated", "in", "centre", "panel", "corresponds", "to", "the", "magnified", "view", "on", "the", "right", "panel", ".", "Bars", ",", "10", "μm", "in", "spreads", "and", "1", "μm", "on", "insets", ".", "B", ")", "Graph", "indicating", "the", "inter", "-", "axis", "distances", "measured", "at", "sites", "of", "local", "separation", "of", "axial", "elements", "in", "zygotene", "-", "like", "Stag3", "mutant", "univalents", "and", "along", "pachytene", "wild", "-", "type", "X", "-", "chromosomes", ".", "Each", "measurement", "in", "the", "X", "-", "chromosomes", "corresponds", "to", "the", "median", "of", "3", "distances", "(", "according", "to", "the", "scheme", "in", "figure", ")", "(", "n", "=", "54", ")", ".", "Each", "measurement", "in", "Stag3", "mutant", "corresponds", "to", "1", "distance", "measured", "at", "sites", "with", "local", "separation", "of", "axial", "elements", "(", "n", "=", "40", ")", ".", "Horizontal", "lines", "indicate", "median", ".", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "obtained", "with", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Bellow", ":", "schematic", "representation", "of", "the", "XY", "pair", ":", "sister", "-", "AEs", "are", "coloured", "in", "black", "and", "grey", "for", "easier", "visualization", ".", "Filled", "arrowhead", "indicates", "PAR", ".", "Purple", "bars", "in", "scheme", "indicate", "regions", "where", "inter", "-", "axis", "distances", "are", "measured", ".", "C", ")", "Representative", "pachytene", "wild", "-", "type", "sex", "chromosomes", ".", "Nuclear", "spreads", "of", "pachytene", "spermatocytes", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", "and", "SYCE2", ".", "Dashed", "area", "indicated", "in", "centre", "panel", "corresponds", "to", "the", "magnified", "view", "on", "the", "right", "panel", ".", "Empty", "arrowhead", "indicates", "two", "discernable", "sister", "-", "AEs", "without", "SYCE2", ".", "Bars", ",", "10", "μm", "in", "spreads", "and", "1", "μm", "on", "insets", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Representative wild-type pachytene sex chromosomes. Nuclear spreads of pachytene spermatocytes were immunostained for SYCP3. Filled arrowheads indicate the PAR. Dashed area indicated in centre panel corresponds to the magnified view on the right panel. Bars, 10 μm in spreads and 1 μm on insets.B) Graph indicating the inter-axis distances measured at sites of local separation of axial elements in zygotene-like Stag3 mutant univalents and along pachytene wild-type X-chromosomes. Each measurement in the X-chromosomes corresponds to the median of 3 distances (according to the scheme in figure) (n=54). Each measurement in Stag3 mutant corresponds to 1 distance measured at sites with local separation of axial elements (n=40). Horizontal lines indicate median. p < 0.0001, obtained with two-tailed Mann-Whitney test. Bellow: schematic representation of the XY pair: sister-AEs are coloured in black and grey for easier visualization. Filled arrowhead indicates PAR. Purple bars in scheme indicate regions where inter-axis distances are measured.C) Representative pachytene wild-type sex chromosomes. Nuclear spreads of pachytene spermatocytes were immunostained for SYCP3 and SYCE2. Dashed area indicated in centre panel corresponds to the magnified view on the right panel. Empty arrowhead indicates two discernable sister-AEs without SYCE2. Bars, 10 μm in spreads and 1 μm on insets."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Analysis", "of", "REC8", "distribution", "in", "representative", "pachytene", "wild", "-", "type", "sex", "chromosomes", ".", "Nuclear", "spreads", "of", "pachytene", "spermatocytes", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", "and", "REC8", ".", "Bars", ",", "10", "μm", "in", "spreads", "and", "1", "μm", "on", "insets", ".", "Magnified", "XY", "pair", "is", "indicated", "by", "dashed", "area", ".", "Scatterplot", "showing", "the", "number", "of", "REC8", "foci", "per", "X", "-", "chromosome", ".", "225", "foci", "identified", "in", "14", "X", "-", "chromosomes", ".", "Horizontal", "line", "indicates", "the", "mean", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "3", ".", "02", ".", "B", ")", "Top", ":", "representative", "computationally", "straightened", "pachytene", "wild", "-", "type", "X", "-", "chromosomes", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", "and", "REC8", ".", "Chromosomes", "were", "aligned", "at", "the", "PAR", ",", "and", "subdivided", "into", "25", "regular", "intervals", ".", "Bar", ",", "1", "μm", ".", "Bellow", ":", "histogram", "showing", "the", "distribution", "of", "the", "percentages", "of", "REC8", "foci", "(", "n", "=", "225", ")", "among", "25", "regular", "intervals", "along", "14", "X", "-", "chromosomes", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", ".", "C", ")", "Histogram", "showing", "the", "relative", "frequency", "of", "inter", "-", "REC8", "distances", "along", "X", "-", "chromosomes", ".", "211", "inter", "-", "REC8", "distances", "from", "14", "X", "-", "chromosomes", ".", "Grey", "area", "represents", "15", "%", "of", "the", "chromosome", "axis", "length", ".", "The", "respective", "cumulative", "distribution", "function", "is", "shown", ".", "D", ")", "Histogram", "showing", "the", "best", "fit", "of", "the", "observed", "inter", "-", "REC8", "distances", "to", "the", "gamma", "distribution", ".", "Green", "curve", "indicates", "the", "best", "fit", "of", "the", "observed", "inter", "-", "REC8", "distances", ".", "", "indicates", "the", "value", "for", "which", "the", "best", "fit", "was", "obtained", ",", "with", "estimated", "standard", "error", "0", ".", "27", ".", "E", ")", "Graph", "comparing", "the", "median", "distance", "of", "REC8", "foci", "with", "computationally", "predicted", "even", "and", "random", "distributions", ".", "Median", "distances", "between", "foci", "subdivided", "in", "three", "categories", "(", "11", "-", "14", ",", "15", "-", "18", "and", "19", "-", "22", "REC8", "foci", "per", "chromosome", ")", ".", "Purple", "asterisk", "indicates", "the", "median", "distance", "of", "all", "REC8", "foci", ".", "F", ")", "Scatterplot", "comparing", "inter", "-", "REC8", "distances", "along", "on", "X", "-", "chromosomes", "with", "the", "distances", "between", "flanking", "REC8", "foci", "at", "sites", "of", "LSAEs", "in", "the", "Stag3", "mutant", ".", "211", "inter", "-", "REC8", "distances", "measured", "along", "X", "-", "chromosomes", "and", "10", "distances", "measured", "between", "flanking", "REC8", "foci", "in", "Stag3", "mutant", ".", "Grey", "area", "represents", "15", "%", "of", "the", "chromosome", "axis", "length", ".", "Horizontal", "lines", "indicate", "the", "median", ".", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "obtained", "with", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Analysis of REC8 distribution in representative pachytene wild-type sex chromosomes. Nuclear spreads of pachytene spermatocytes were immunostained for SYCP3 and REC8. Bars, 10 μm in spreads and 1 μm on insets. Magnified XY pair is indicated by dashed area. Scatterplot showing the number of REC8 foci per X-chromosome. 225 foci identified in 14 X-chromosomes. Horizontal line indicates the mean, error bars indicate s.d. 3.02.B) Top: representative computationally straightened pachytene wild-type X-chromosomes. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3 and REC8. Chromosomes were aligned at the PAR, and subdivided into 25 regular intervals. Bar, 1 μm. Bellow: histogram showing the distribution of the percentages of REC8 foci (n=225) among 25 regular intervals along 14 X-chromosomes. Dotted line indicates mean.C) Histogram showing the relative frequency of inter-REC8 distances along X-chromosomes.211 inter-REC8 distances from 14 X-chromosomes. Grey area represents 15% of the chromosome axis length. The respective cumulative distribution function is shown.D) Histogram showing the best fit of the observed inter-REC8 distances to the gamma distribution. Green curve indicates the best fit of the observed inter-REC8 distances.  indicates the value for which the best fit was obtained, with estimated standard error 0.27.E) Graph comparing the median distance of REC8 foci with computationally predicted even and random distributions. Median distances between foci subdivided in three categories (11-14, 15-18 and 19-22 REC8 foci per chromosome). Purple asterisk indicates the median distance of all REC8 foci.F) Scatterplot comparing inter-REC8 distances along on X-chromosomes with the distances between flanking REC8 foci at sites of LSAEs in the Stag3 mutant. 211 inter-REC8 distances measured along X-chromosomes and 10 distances measured between flanking REC8 foci in Stag3 mutant. Grey area represents 15% of the chromosome axis length. Horizontal lines indicate the median. p < 0.0001, obtained with two-tailed Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Representative", "yet", "-", "unsynapsed", "autosome", "from", "wild", "-", "type", "zygotene", "spermatocytes", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", "and", "SYCE2", ".", "Magnified", "autosome", "is", "indicated", "by", "dashed", "area", ".", "Filled", "arrowheads", "indicate", "yet", "-", "unsynapsed", "axes", "regions", ".", "Bars", ",", "10", "μm", "in", "spreads", "and", "1", "μm", "on", "insetsB", ")", "Representative", "unsynapsed", "autosome", "from", "wild", "-", "type", "zygotene", "spermatocytes", ".", "Nuclear", "spreads", "were", "immunostained", "for", "SYCP3", ",", "REC8", "and", "ACA", ".", "Magnified", "autosome", "is", "indicated", "by", "dashed", "area", ".", "Bars", ",", "10", "μm", "in", "spreads", "and", "1", "μm", "on", "insets", ".", "C", ")", "Scatterplot", "comparing", "the", "average", "number", "of", "REC8", "foci", "along", "zygotene", "autosomes", "and", "X", "-", "chromosomes", ".", "Number", "of", "REC8", "foci", "were", "quantified", "along", "15", "zygotene", "autosomes", "and", "14", "X", "-", "chromosomes", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "number", "of", "REC8", "foci", "on", "each", "chromosome", ".", "Total", "number", "of", "foci", "identified", ":", "zygotene", "autosomes", "(", "343", ")", ",", "X", "-", "chromosomes", "(", "225", ")", ".", "Horizontal", "lines", "indicate", "the", "mean", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", ":", "7", ".", "42", "and", "3", ".", "02", "for", "zygotene", "autosomes", "and", "X", "-", "chromosomes", ",", "respectively", ".", "p", "=", "0", ".", "0060", ",", "obtained", "with", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "D", ")", "Histogram", "showing", "the", "relative", "frequency", "of", "inter", "-", "REC8", "distances", "along", "yet", "-", "unsynapsed", "zygotene", "autosomes", ".", "294", "inter", "-", "REC8", "distances", "analyzed", "in", "14", "chromosomes", ".", "Grey", "area", "represents", "15", "%", "of", "the", "chromosome", "axis", "length", ".", "The", "respective", "cumulative", "distribution", "function", "is", "shown", ".", "E", ")", "Scatterplot", "comparing", "the", "measured", "inter", "-", "REC8", "distances", "on", "yet", "-", "unsynapsed", "zygotene", "autosomes", ",", "X", "-", "chromosomes", "and", "sites", "of", "LSAEs", "in", "Stag3", "mutant", ".", "Number", "of", "inter", "-", "REC8", "distances", "for", "yet", "-", "unsynapsed", "zygotene", "autosomes", ",", "X", "-", "chromosomes", "and", "sites", "of", "local", "separation", "of", "axial", "elements", "in", "Stag3", "mutant", ",", "n", "=", "294", ",", "n", "=", "211", "and", "n", "=", "10", ",", "respectively", ".", "Horizontal", "lines", "indicate", "the", "median", ".", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "obtained", "with", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Representative yet-unsynapsed autosome from wild-type zygotene spermatocytes. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3 and SYCE2. Magnified autosome is indicated by dashed area. Filled arrowheads indicate yet-unsynapsed axes regions. Bars, 10 μm in spreads and 1 μm on insetsB) Representative unsynapsed autosome from wild-type zygotene spermatocytes. Nuclear spreads were immunostained for SYCP3, REC8 and ACA. Magnified autosome is indicated by dashed area. Bars, 10 μm in spreads and 1 μm on insets.C) Scatterplot comparing the average number of REC8 foci along zygotene autosomes and X-chromosomes. Number of REC8 foci were quantified along 15 zygotene autosomes and 14 X-chromosomes. Each dot represents the number of REC8 foci on each chromosome. Total number of foci identified: zygotene autosomes (343), X-chromosomes (225). Horizontal lines indicate the mean, error bars indicate s.d.: 7.42 and 3.02 for zygotene autosomes and X-chromosomes, respectively. p = 0.0060, obtained with two-tailed Mann-Whitney test.D) Histogram showing the relative frequency of inter-REC8 distances along yet-unsynapsed zygotene autosomes. 294 inter-REC8 distances analyzed in 14 chromosomes. Grey area represents 15% of the chromosome axis length. The respective cumulative distribution function is shown.E) Scatterplot comparing the measured inter-REC8 distances on yet-unsynapsed zygotene autosomes, X-chromosomes and sites of LSAEs in Stag3 mutant. Number of inter-REC8 distances for yet-unsynapsed zygotene autosomes, X-chromosomes and sites of local separation of axial elements in Stag3 mutant, n=294, n=211 and n=10, respectively. Horizontal lines indicate the median. p < 0.0001, obtained with two-tailed Mann-Whitney test."}
{"words": ["Fig", "1", "(", "B", ")", "Locomotor", "behavior", ",", "measured", "by", "thrashing", "rates", "in", "liquid", "medium", ",", "in", "the", "C", ".", "elegans", "strains", "with", "neuronal", "expression", "of", "human", "WT", "SOD1", "or", "ALS", "-", "linked", "mutant", "SOD1G85R", ",", "in", "the", "presence", "(", "M1", "/", "M1", ")", "or", "absence", "(", "+", "/", "+", ")", "of", "the", "suppressor", "mutation", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "(", "C", ")", "Northern", "(", "top", "panel", ")", "and", "western", "(", "middle", ",", "bottom", "panels", ")", "blot", "analyses", "of", "total", "RNA", "and", "protein", "from", "SOD1G85R", "strains", ",", "with", "(", "M1", "/", "M1", ")", "or", "without", "(", "+", "/", "+", ")", "suppressor", "mutations", ",", "demonstrating", "that", "the", "levels", "of", "SOD1G85R", "mRNA", "and", "total", "protein", "are", "not", "changed", "by", "the", "suppressor", "mutation", "(", "M1", "/", "M1", ")", ".", "The", "western", "blot", "lanes", "are", "from", "the", "same", "gel", "and", "exposure", ".", "(", "E", ")", "C", ".", "elegans", "SPR", "-", "5", "and", "UFD", "-", "2", "and", "their", "mammalian", "homologs", "lysine", "-", "specific", "demethylase", "1", "(", "LSD1", ")", "and", "ubiquitination", "factor", "E4", "B", "(", "UBE4B", ")", "share", "all", "major", "protein", "domains", ".", "These", "include", "the", "Swi3", "-", "Rsc8", "-", "Moira", "(", "SWIRM", ")", ",", "amine", "oxidase", "-", "like", "(", "AOL", ")", ",", "and", "TOWER", "domains", "in", "LSD1", "/", "SPR", "-", "5", "and", "the", "Ufd2", "Core", "and", "U", "-", "box", "domains", "in", "UBE4B", "/", "UFD", "-", "2", ".", "Positions", "of", "the", "missense", ",", "nonsense", ",", "and", "deletion", "mutations", "in", "mutant", "C", ".", "elegans", "are", "indicated", ".", "(", "F", ")", "Locomotor", "behavior", ",", "measured", "by", "thrashing", "rates", ",", "of", "the", "C", ".", "elegans", "carrying", "the", "SOD1G85R", "transgene", "on", "the", "normal", "background", "(", "WT", ")", ",", "with", "the", "null", "mutation", "of", "either", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", "or", "spr", "-", "5", "(", "by134", ")", ",", "the", "double", "mutation", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", ";", "spr", "-", "5", "(", "by134", ")", ",", "or", "the", "M1", "suppressor", "ufd", "-", "2", "(", "W824X", ")", ";", "spr", "-", "5", "(", "R646Q", ")", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "(", "G", ")", "Western", "blotting", "of", "the", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", "protein", "fractions", "from", "the", "C", ".", "elegans", "carrying", "the", "SOD1G85R", "transgene", "with", "the", "double", "mutation", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", ";", "spr", "-", "5", "(", "by134", ")", "compared", "with", "controls", ".", "While", "SOD1G85R", "protein", "levels", "are", "unchanged", "in", "the", "S", "fraction", ",", "those", "in", "the", "P", "fraction", "are", "decreased", "in", "the", "double", "suppressor", "mutant", ".", "The", "P", "fraction", "represents", "only", "about", "1", ".", "7", "%", "of", "total", "SOD1G85R", "in", "the", "WT", "sample", ";", "therefore", ",", "a", "higher", "ratio", "of", "the", "P", "fraction", "relative", "to", "the", "S", "fraction", "(", "approximately", "2", ":", "1", ")", "is", "used", "for", "the", "western", "analysis", ".", "(", "H", ")", "The", "overexpression", "(", "OE", ")", "of", "WT", "UFD", "-", "2", "or", "SPR", "-", "5", "in", "the", "C", ".", "elegans", "nervous", "system", "blocks", "the", "protection", "conferred", "by", "the", "double", "mutation", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", ";", "spr", "-", "5", "(", "by134", ")", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "The", "numerical", "data", "used", "to", "make", "this", "figure", "can", "be", "found", "in", "S1", "Data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 1(B) Locomotor behavior, measured by thrashing rates in liquid medium, in the C. elegans strains with neuronal expression of human WT SOD1 or ALS-linked mutant SOD1G85R, in the presence (M1/M1) or absence (+/+) of the suppressor mutation (n = 16).(C) Northern (top panel) and western (middle, bottom panels) blot analyses of total RNA and protein from SOD1G85R strains, with (M1/M1) or without (+/+) suppressor mutations, demonstrating that the levels of SOD1G85R mRNA and total protein are not changed by the suppressor mutation (M1/M1). The western blot lanes are from the same gel and exposure.(E) C. elegans SPR-5 and UFD-2 and their mammalian homologs lysine-specific demethylase 1 (LSD1) and ubiquitination factor E4 B (UBE4B) share all major protein domains. These include the Swi3-Rsc8-Moira (SWIRM), amine oxidase-like (AOL), and TOWER domains in LSD1/SPR-5 and the Ufd2 Core and U-box domains in UBE4B/UFD-2. Positions of the missense, nonsense, and deletion mutations in mutant C. elegans are indicated.(F) Locomotor behavior, measured by thrashing rates, of the C. elegans carrying the SOD1G85R transgene on the normal background (WT), with the null mutation of either ufd-2(tm1380) or spr-5(by134), the double mutation ufd-2(tm1380);spr-5(by134), or the M1 suppressor ufd-2(W824X);spr-5(R646Q) (n = 16).(G) Western blotting of the supernatant (S) and pellet (P) protein fractions from the C. elegans carrying the SOD1G85R transgene with the double mutation ufd-2(tm1380);spr-5(by134) compared with controls. While SOD1G85R protein levels are unchanged in the S fraction, those in the P fraction are decreased in the double suppressor mutant. The P fraction represents only about 1.7% of total SOD1G85R in the WT sample; therefore, a higher ratio of the P fraction relative to the S fraction (approximately 2:1) is used for the western analysis.(H) The overexpression (OE) of WT UFD-2 or SPR-5 in the C. elegans nervous system blocks the protection conferred by the double mutation ufd-2(tm1380);spr-5(by134) (n = 16). Data represent means ± SEM. The numerical data used to make this figure can be found in S1 Data."}
{"words": ["Fig", "2", "(", "A", ")", "Top", ":", "schematic", "drawing", "depicts", "pan", "-", "neuronal", "expression", "of", "YFP", "in", "head", "and", "ventral", "neurons", "in", "the", "context", "of", "the", "C", ".", "elegans", "body", "plan", ".", "Left", ":", "micrographs", "show", "the", "SOD1G85R", "-", "YFP", "proteins", "expressed", "in", "WT", "or", "the", "spr", "-", "5", "(", "by134", ")", ";", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", "mutant", "background", ".", "The", "double", "-", "mutant", "worms", "show", "a", "marked", "decrease", "in", "protein", "aggregation", "in", "neurons", ".", "Enlarged", "sections", "of", "headneurons", "(", "red", "framed", ")", "and", "ventral", "cord", "neurons", "(", "white", "framed", ")", "are", "shown", ".", "Middle", ":", "quantification", "of", "locomotion", "in", "the", "spr", "-", "5", "(", "by134", ")", ";", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", "and", "the", "WT", "C", ".", "elegans", "with", "neuronal", "expression", "of", "SOD1G85R", "-", "YFP", "(", "n", "=", "30", ")", ".", "Right", ":", "a", "decrease", "in", "the", "protein", "levels", "of", "SOD1G85R", "-", "YFP", "in", "the", "presence", "of", "spr", "-", "5", "(", "by134", ")", ";", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", "is", "shown", "by", "western", "blots", "of", "the", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "the", "pellet", "(", "P", ")", "fractions", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Analyses", "of", "the", "spr", "-", "5", "(", "by134", ")", ";", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", "and", "the", "WT", "C", ".", "elegans", "with", "neuronal", "expression", "of", "TDP", "-", "43", "-", "c25", "-", "YFP", "(", "n", "=", "30", ")", "or", "PolyQ", "-", "YFP", "(", "n", "=", "12", ")", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "D", ")", "Neurodegenerative", "rough", "-", "eye", "phenotype", "in", "adults", "is", "alleviated", "by", "the", "knockdown", "of", "the", "Drosophila", "homologs", "of", "ufd", "-", "2", "/", "UBE4B", "and", "spr", "-", "5", "/", "LSD1", "-", "CG9934", "and", "Su", "(", "Var", ")", "3", "-", "3", ",", "respectively", ",", "compared", "to", "the", "control", "(", "CTRL", ")", ".", "Eye", "-", "specific", "expression", "of", "TDP", "-", "43M337V", ",", "FUSR521C", ",", "and", "RNA", "interference", "(", "RNAi", ")", "was", "driven", "by", "GMR", "-", "Gal4", ".", "(", "E", ")", "Drosophila", "eye", "pigment", "quantitation", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "The", "numerical", "data", "used", "to", "make", "this", "figure", "can", "be", "found", "in", "S1", "Data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 2(A) Top: schematic drawing depicts pan-neuronal expression of YFP in head and ventral neurons in the context of the C. elegans body plan. Left: micrographs show the SOD1G85R-YFP proteins expressed in WT or the spr-5(by134);ufd-2(tm1380) mutant background. The double-mutant worms show a marked decrease in protein aggregation in neurons. Enlarged sections of headneurons (red framed) and ventral cord neurons (white framed) are shown. Middle: quantification of locomotion in the spr-5(by134);ufd-2(tm1380) and the WT C. elegans with neuronal expression of SOD1G85R-YFP (n = 30). Right: a decrease in the protein levels of SOD1G85R-YFP in the presence of spr-5(by134);ufd-2(tm1380) is shown by western blots of the supernatant (S) and the pellet (P) fractions. (B and C) Analyses of the spr-5(by134);ufd-2(tm1380) and the WT C. elegans with neuronal expression of TDP-43-c25-YFP (n = 30) or PolyQ-YFP (n = 12) as in (A).(D) Neurodegenerative rough-eye phenotype in adults is alleviated by the knockdown of the Drosophila homologs of ufd-2/UBE4B and spr-5/LSD1-CG9934 and Su(Var)3-3, respectively, compared to the control (CTRL). Eye-specific expression of TDP-43M337V, FUSR521C, and RNA interference (RNAi) was driven by GMR-Gal4.(E) Drosophila eye pigment quantitation. Data represent means ± SEM. The numerical data used to make this figure can be found in S1 Data."}
{"words": ["Fig", "3", "(", "A", ")", "Western", "blots", "of", "cell", "lysates", "derived", "from", "mock", "(", "CTRL", ")", ",", "single", "UBE4B", "or", "LSD1", ",", "or", "double", "UBE4B", "and", "LSD1", "knockdowns", ".", "Supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", "fractions", "were", "probed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "While", "the", "LSD1", "or", "UBE4B", "single", "-", "knockdown", "reduces", "the", "SOD1G85R", "aggregates", "in", "both", "supernatant", "and", "pellet", "fractions", ",", "the", "combined", "knockdown", "produces", "the", "strongest", "reduction", "in", "the", "aggregates", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "SOD1G85R", "protein", "levels", "by", "western", "blotting", "(", "A", ")", ".", "n", "=", "3", "(", "supernatant", ")", ";", "n", "=", "8", "(", "pellet", ")", ".", "(", "C", ")", "Western", "blots", "of", "a", "representative", "cycloheximide", "chase", "experiment", "to", "determine", "SOD1", "protein", "half", "-", "lives", "in", "the", "double", "UBE4B", "and", "LSD1", "knockdown", "cells", "versus", "controls", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "SOD1G85R", "clearance", ",", "as", "analyzed", "by", "western", "blotting", "in", "(", "C", ")", ".", "The", "graph", "indicates", "the", "relative", "band", "intensity", "of", "SOD1G85R", "at", "each", "chase", "time", "point", ".", "n", "=", "5", ";", "Overall", "p", "=", "0", ".", "02", "(", "paired", "t", "test", ",", "CTRL", "versus", "UBE4B", "and", "LSD1", "double", "knockdown", ")", ".", "Individual", "p", "=", "0", ".", "03", "(", "3", "h", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "003", "(", "6", "h", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "06", "(", "9", "h", ")", ",", "and", "p", "=", "0", ".", "004", "(", "12", "-", "21", "h", ")", ".", "(", "E", ")", "The", "half", "-", "life", "of", "SOD1G85R", "is", "reduced", "from", "8", ".", "5", "h", "to", "5", "h", "upon", "knockdown", "of", "UBE4B", "and", "LSD1", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "The", "numerical", "data", "used", "to", "make", "this", "figure", "can", "be", "found", "in", "S1", "Data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 3(A) Western blots of cell lysates derived from mock (CTRL), single UBE4B or LSD1, or double UBE4B and LSD1 knockdowns. Supernatant (S) and pellet (P) fractions were probed with indicated antibodies. While the LSD1 or UBE4B single-knockdown reduces the SOD1G85R aggregates in both supernatant and pellet fractions, the combined knockdown produces the strongest reduction in the aggregates. (B) Quantification of SOD1G85R protein levels by western blotting (A). n = 3 (supernatant); n = 8 (pellet).(C) Western blots of a representative cycloheximide chase experiment to determine SOD1 protein half-lives in the double UBE4B and LSD1 knockdown cells versus controls. (D) Quantification of SOD1G85R clearance, as analyzed by western blotting in (C). The graph indicates the relative band intensity of SOD1G85R at each chase time point. n = 5; Overall p = 0.02 (paired t test, CTRL versus UBE4B and LSD1 double knockdown). Individual p = 0.03 (3 h), p = 0.003 (6 h), p = 0.06 (9 h), and p = 0.004 (12-21 h).(E) The half-life of SOD1G85R is reduced from 8.5 h to 5 h upon knockdown of UBE4B and LSD1. Data represent means ± SEM. The numerical data used to make this figure can be found in S1 Data."}
{"words": ["Fig", "4", "(", "B", ")", "The", "volcano", "scatter", "plot", "indicates", "fold", "changes", "in", "the", "levels", "of", "gene", "transcripts", "affected", "differentially", "by", "the", "UBE4B", "and", "LSD1", "double", "knockdown", "versus", "control", "shRNA", ".", "Gray", "spots", "represent", "22", ",", "148", "annotated", "transcripts", ".", "Red", "spots", "are", "predicted", "p53", "-", "activated", "targets", ",", "and", "blue", "spots", "are", "predicted", "p53", "-", "inhibited", "targets", ".", "The", "enrichment", "of", "red", "spots", "in", "the", "up", "-", "regulated", "genes", "(", "right", "upper", "quadrant", ",", ">", "1", ".", "2", "-", "fold", "change", ",", "p", "≤", "0", ".", "04", ")", "and", "blue", "spots", "in", "the", "down", "-", "regulated", "genes", "(", "left", "upper", "quadrant", ")", "indicates", "that", "the", "p53", "-", "mediated", "transcription", "is", "activated", "by", "the", "UBE4B", "and", "LSD1", "double", "knockdown", ".", "C", ")", "RT", "-", "qPCR", "validation", "of", "the", "expression", "levels", "of", "representative", "p53", "target", "genes", "in", "the", "UBE4B", "and", "LSD1", "double", "-", "knockdown", "samples", ".", "n", "=", "(", "2", "to", "6", ")", ",", "p", "≤", "0", ".", "04", ".", "(", "D", ")", "The", "p53", "protein", "level", "is", "significantly", "increased", "by", "UBE4B", "and", "LSD1", "double", "knockdown", ".", "Left", ":", "representative", "western", "blots", "showing", "p53", "levels", ",", "the", "knockdown", "of", "UBE4B", "and", "LSD1", ",", "and", "the", "actin", "control", "in", "HEK293T", "cells", ".", "Right", ":", "quantification", "of", "the", "p53", "protein", "levels", "normalized", "against", "actin", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", ")", "The", "p53", "-", "mediated", "transcriptional", "activity", "is", "measured", "by", "a", "luciferase", "reporter", "under", "the", "control", "of", "a", "p53", "-", "response", "element", "promoter", ",", "which", "was", "transfected", "into", "HEK293T", "cells", "72", "-", "96", "h", "after", "the", "initiation", "of", "the", "UBE4B", "and", "LSD1", "single", "or", "double", "knockdowns", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "F", ")", "Increased", "interaction", "of", "p53", "with", "its", "activating", "partner", "53BP1", "in", "response", "to", "UBE4B", "and", "LSD1", "knockdown", ".", "Left", ":", "representative", "western", "blots", "of", "53BP1", "co", "-", "immunoprecipitation", ".", "Right", ":", "quantification", "of", "the", "53BP1", "co", "-", "immunoprecipitation", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "(", "G", ")", "RT", "-", "qPCR", "validation", "of", "the", "expression", "levels", "of", "FOXO3a", ",", "FOXO4", ",", "and", "PSMD11", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "H", ")", "The", "FOXO3a", "-", "mediated", "transcriptional", "activity", "was", "measured", "with", "a", "luciferase", "reporter", "under", "the", "control", "of", "a", "FOXO", "-", "response", "element", "promoter", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "shRNAs", "for", "control", ",", "LSD1", ",", "UBE4B", ",", "or", "both", "LSD1", "and", "UBE4B", ",", "followed", "by", "transfection", "of", "the", "luciferase", "reporter", "together", "with", "a", "constitutively", "active", "form", "of", "FOXO3a", "(", "TM", ")", "72", "-", "96", "h", "later", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "The", "numerical", "data", "used", "to", "make", "this", "figure", "can", "be", "found", "in", "S1", "Data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 4(B) The volcano scatter plot indicates fold changes in the levels of gene transcripts affected differentially by the UBE4B and LSD1 double knockdown versus control shRNA. Gray spots represent 22,148 annotated transcripts. Red spots are predicted p53-activated targets, and blue spots are predicted p53-inhibited targets. The enrichment of red spots in the up-regulated genes (right upper quadrant, >1.2-fold change, p ≤ 0.04) and blue spots in the down-regulated genes (left upper quadrant) indicates that the p53-mediated transcription is activated by the UBE4B and LSD1 double knockdown.C) RT-qPCR validation of the expression levels of representative p53 target genes in the UBE4B and LSD1 double-knockdown samples. n = (2 to 6), p ≤ 0.04.(D) The p53 protein level is significantly increased by UBE4B and LSD1 double knockdown. Left: representative western blots showing p53 levels, the knockdown of UBE4B and LSD1, and the actin control in HEK293T cells. Right: quantification of the p53 protein levels normalized against actin (n = 3).E) The p53-mediated transcriptional activity is measured by a luciferase reporter under the control of a p53-response element promoter, which was transfected into HEK293T cells 72-96 h after the initiation of the UBE4B and LSD1 single or double knockdowns (n = 6).(F) Increased interaction of p53 with its activating partner 53BP1 in response to UBE4B and LSD1 knockdown. Left: representative western blots of 53BP1 co-immunoprecipitation. Right: quantification of the 53BP1 co-immunoprecipitation (n = 2). Data represent means ± SEM.(G) RT-qPCR validation of the expression levels of FOXO3a, FOXO4, and PSMD11 (n = 6).(H) The FOXO3a-mediated transcriptional activity was measured with a luciferase reporter under the control of a FOXO-response element promoter. HEK293T cells were transfected with shRNAs for control, LSD1, UBE4B, or both LSD1 and UBE4B, followed by transfection of the luciferase reporter together with a constitutively active form of FOXO3a (TM) 72-96 h later (n = 6). Data represent means ± SEM. The numerical data used to make this figure can be found in S1 Data."}
{"words": ["Fig", "5", "(", "A", ")", "Increased", "protein", "levels", "of", "proteasome", "subunits", "upon", "the", "UBE4B", "and", "LSD1", "double", "knockdown", "in", "HEK293T", "cells", ".", "(", "B", ")", "The", "UBE4B", "and", "LSD1", "single", "or", "double", "knockdowns", "increase", "the", "proteasomal", "degradation", "of", "a", "reporter", "substrate", ",", "Suc", "-", "LLVY", "-", "Luciferin", ",", "whose", "degradation", "is", "measured", "in", "a", "luciferase", "release", "assay", ".", "The", "double", "knockdown", "shows", "synergistic", "proteasomal", "activation", "when", "compared", "with", "the", "individual", "knockdowns", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "C", ")", "The", "autophagy", "activity", "is", "significantly", "increased", "in", "cells", "with", "the", "UBE4B", "and", "LSD1", "double", "knockdown", ".", "The", "in", "vivo", "activity", "of", "the", "ATG4B", "protease", ",", "which", "cleaves", "LC3", "precursors", ",", "was", "quantified", "via", "a", "Gaussia", "luciferase", "release", "assay", "(", "see", "S5D", "Fig", ".", ",", "S5E", "Fig", ".", ",", "and", "Materials", "and", "Methods", "for", "details", ")", ".", "The", "HCT116", "cells", "were", "analyzed", "48", "h", "after", "the", "initiation", "of", "the", "knockdown", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "HEK293T", "cells", "with", "the", "UBE4B", "and", "LSD1", "double", "knockdown", "or", "the", "mock", "control", ".", "The", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "10", "mM", "3", "-", "methyladenine", "(", "3", "-", "MA", ")", "for", "48h", "before", "lysis", ".", "Western", "blots", "indicate", "an", "increase", "in", "LC3", "levels", "(", "top", "panels", ")", "in", "the", "double", "UBE4B", "and", "LSD1", "knockdown", "cells", "(", "middle", "panels", ")", ",", "while", "the", "actin", "control", "is", "unchanged", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "The", "graph", "shows", "the", "quantification", "of", "LC3", "-", "II", "levels", "as", "normalized", "to", "actin", "levels", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "A", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "with", "matched", "multiple", "comparisons", "and", "Tukey", "correction", "was", "used", "for", "statistics", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "The", "numerical", "data", "used", "to", "make", "this", "figure", "can", "be", "found", "in", "S1", "Data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 5(A) Increased protein levels of proteasome subunits upon the UBE4B and LSD1 double knockdown in HEK293T cells. (B) The UBE4B and LSD1 single or double knockdowns increase the proteasomal degradation of a reporter substrate, Suc-LLVY-Luciferin, whose degradation is measured in a luciferase release assay. The double knockdown shows synergistic proteasomal activation when compared with the individual knockdowns (n = 6).(C) The autophagy activity is significantly increased in cells with the UBE4B and LSD1 double knockdown. The in vivo activity of the ATG4B protease, which cleaves LC3 precursors, was quantified via a Gaussia luciferase release assay (see S5D Fig., S5E Fig., and Materials and Methods for details). The HCT116 cells were analyzed 48 h after the initiation of the knockdown.(D) Quantification of LC3-II levels in HEK293T cells with the UBE4B and LSD1 double knockdown or the mock control. The cells were treated with or without 10 mM 3-methyladenine (3-MA) for 48h before lysis. Western blots indicate an increase in LC3 levels (top panels) in the double UBE4B and LSD1 knockdown cells (middle panels), while the actin control is unchanged (bottom panels). The graph shows the quantification of LC3-II levels as normalized to actin levels (n = 3). A one-way ANOVA test with matched multiple comparisons and Tukey correction was used for statistics. Data represent means ± SEM. The numerical data used to make this figure can be found in S1 Data."}
{"words": ["Fig", "6", "(", "A", ")", "p53", "small", "molecule", "activators", "Tenovin", "-", "1", "and", "CP", "-", "31398", "reduce", "the", "levels", "of", "misfolded", "SOD1", "proteins", ",", "as", "determined", "by", "the", "SOD1G85R", "solubility", "assay", "in", "HEK293", "cells", ".", "Increasing", "concentrations", "of", "the", "p53", "activators", "significantly", "decrease", "the", "levels", "of", "SOD1G85R", "but", "not", "the", "endogenous", "WT", "SOD1", "proteins", "in", "western", "blots", "of", "both", "supernatant", "and", "pellet", "fractions", ".", "(", "B", ")", "A", "decrease", "in", "p53", "as", "the", "result", "of", "shRNA", "knockdown", "increases", "the", "levels", "of", "SOD1G85R", "but", "not", "WT", "SOD1", "proteins", "in", "the", "SOD1G85R", "aggregation", "assay", ",", "as", "shown", "by", "western", "blots", "of", "both", "supernatant", "(", "S", ")", "(", "n", "=", "2", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", "(", "n", "=", "3", ")", "fractions", ".", "(", "C", ")", "A", "complete", "absence", "of", "p53", "increases", "the", "accumulation", "of", "SOD1G85R", "mutant", "proteins", "in", "p53", "-", "/", "-", "HCT116", "cells", "when", "compared", "with", "controls", ".", "Representative", "western", "blots", "(", "left", "panels", ")", "and", "quantification", "of", "SOD1G85R", "levels", "in", "the", "supernatant", "lysates", "are", "shown", ".", "The", "middle", "graph", "indicates", "the", "ratio", "of", "G85R", "to", "WT", "SOD1", "proteins", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "p53", "with", "varying", "amounts", "of", "transfected", "mutant", "SOD1", ".", "The", "right", "graph", "panel", "shows", "the", "same", "data", "as", "shown", "in", "the", "middle", "panel", ",", "but", "normalized", "to", "the", "average", "SOD1G85R", "level", "for", "each", "amount", "of", "the", "transfected", "plasmid", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "The", "numerical", "data", "used", "to", "make", "this", "figure", "can", "be", "found", "in", "S1", "Data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 6(A) p53 small molecule activators Tenovin-1 and CP-31398 reduce the levels of misfolded SOD1 proteins, as determined by the SOD1G85R solubility assay in HEK293 cells. Increasing concentrations of the p53 activators significantly decrease the levels of SOD1G85R but not the endogenous WT SOD1 proteins in western blots of both supernatant and pellet fractions.(B) A decrease in p53 as the result of shRNA knockdown increases the levels of SOD1G85R but not WT SOD1 proteins in the SOD1G85R aggregation assay, as shown by western blots of both supernatant (S) (n = 2) and pellet (P) (n = 3) fractions.(C) A complete absence of p53 increases the accumulation of SOD1G85R mutant proteins in p53-/- HCT116 cells when compared with controls. Representative western blots (left panels) and quantification of SOD1G85R levels in the supernatant lysates are shown. The middle graph indicates the ratio of G85R to WT SOD1 proteins in the presence or absence of p53 with varying amounts of transfected mutant SOD1. The right graph panel shows the same data as shown in the middle panel, but normalized to the average SOD1G85R level for each amount of the transfected plasmid. Data represent means ± SEM. The numerical data used to make this figure can be found in S1 Data."}
{"words": ["Fig", "7", "(", "A", ")", "Left", ":", "p53", "knockdown", "reverses", "the", "enhanced", "clearance", "of", "SOD1G85R", "proteins", "conferred", "by", "the", "UBE4B", "and", "LSD1", "double", "knockdown", ".", "Total", "amounts", "of", "shRNAs", "were", "adjusted", "to", "be", "equal", "with", "nontargeting", "CTRL", "shRNAs", ".", "Right", ":", "quantification", "of", "insoluble", "aggregated", "SOD1G85R", "in", "pellet", "fractions", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "control", ",", "double", "(", "UBE4B", "/", "LSD1", ")", ",", "or", "triple", "(", "UBE4B", "/", "LSD1", "/", "p53", ")", "shRNAs", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "B", ")", "The", "degenerative", "TDP", "-", "43M337V", "eye", "phenotype", "is", "exacerbated", "by", "the", "knockdown", "of", "the", "Drosophila", "homolog", "of", "p53", "(", "p53", "RNAi", ")", ",", "or", "by", "the", "overexpression", "of", "a", "dominant", "-", "negative", "p53", "mutant", "(", "p53", ".", "R155H", ")", ".", "Expression", "of", "p53", "RNAi", ",", "p53", ".", "R155H", ",", "and", "TDP", "-", "43M337V", "are", "driven", "by", "GMR", "-", "Gal4", ".", "(", "C", ")", "The", "p53", "-", "activating", "drug", "Tenovin", "-", "1", "(", "TEN1", ")", "protects", "spinal", "cord", "motor", "neurons", "from", "SOD1G85R", "-", "induced", "proteotoxicity", ".", "Rat", "spinal", "cord", "cultures", "were", "grown", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", "and", "treated", "with", "0", ".", "8", "μM", "TEN1", "or", "vehicle", "(", "VEH", ")", "DMSO", ",", "followed", "by", "infection", "of", "HSV", "-", "SOD1G85R", "or", "the", "HSV", "-", "LacZ", "control", "after", "24", "h", ".", "At", "day", "5", "post", "-", "infection", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "a", "motor", "neuron", "-", "specific", "anti", "-", "neurofilament", "H", "(", "NF", "-", "H", ")", "antibody", ".", "Left", ":", "representative", "images", "of", "motor", "neurons", "in", "each", "condition", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "Right", ":", "quantification", "of", "motor", "neuron", "survival", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparisons", "and", "Tukey", "correction", ")", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 7(A) Left: p53 knockdown reverses the enhanced clearance of SOD1G85R proteins conferred by the UBE4B and LSD1 double knockdown. Total amounts of shRNAs were adjusted to be equal with nontargeting CTRL shRNAs. Right: quantification of insoluble aggregated SOD1G85R in pellet fractions from HEK293T cells transfected with control, double (UBE4B/LSD1), or triple (UBE4B/LSD1/p53) shRNAs (n = 2).(B) The degenerative TDP-43M337V eye phenotype is exacerbated by the knockdown of the Drosophila homolog of p53 (p53 RNAi), or by the overexpression of a dominant-negative p53 mutant (p53.R155H). Expression of p53 RNAi, p53.R155H, and TDP-43M337V are driven by GMR-Gal4.(C) The p53-activating drug Tenovin-1 (TEN1) protects spinal cord motor neurons from SOD1G85R-induced proteotoxicity. Rat spinal cord cultures were grown as described in Materials and Methods and treated with 0.8 μM TEN1 or vehicle (VEH) DMSO, followed by infection of HSV-SOD1G85R or the HSV-LacZ control after 24 h. At day 5 post-infection, cells were fixed and stained with a motor neuron-specific anti-neurofilament H (NF-H) antibody. Left: representative images of motor neurons in each condition. Scale bar = 50 μm. Right: quantification of motor neuron survival (one-way ANOVA with multiple comparisons and Tukey correction). Data represent means ± SEM."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Representative", "confocal", "image", "of", "long", "propriospinal", "neurons", "expressing", "FGF22", "(", "magenta", ")", "in", "cervical", "spinal", "cord", ".", "(", "E", ")", "Schematic", "illustration", "of", "the", "hCST", "collateral", "into", "the", "cervical", "cord", "and", "confocal", "images", "of", "hCST", "collaterals", "(", "green", ")", ",", "stained", "for", "vGlut", "(", "red", ")", "and", "vGAT", "(", "blue", ")", "21", "days", "following", "spinal", "cord", "injury", ".", "Insets", "represent", "3D", "views", "generated", "in", "Imaris", "of", "the", "deconvolved", "confocal", "image", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "bouton", "density", "and", "characterization", "of", "bouton", "between", "control", "and", "FGF22", "overexpressing", "mice", "(", "n", "=", "4", "-", "5", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "(", "G", ")", "Schematic", "illustration", "and", "representative", "confocal", "image", "of", "LPSN", "viral", "labeling", "(", "magenta", ")", "and", "CST", "collaterals", "(", "green", ")", ".", "Insets", "represent", "3D", "views", "generated", "in", "Imaris", "of", "the", "deconvolved", "confocal", "image", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "hCST", "contacts", "onto", "LPSNs", "and", "characterization", "of", "vGlut", "intensity", "onto", "individual", "LPSNs", "(", "n", "=", "4", "-", "5", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Representative confocal image of long propriospinal neurons expressing FGF22 (magenta) in cervical spinal cord.(E) Schematic illustration of the hCST collateral into the cervical cord and confocal images of hCST collaterals (green), stained for vGlut (red) and vGAT (blue) 21 days following spinal cord injury. Insets represent 3D views generated in Imaris of the deconvolved confocal image. (F) Quantification of bouton density and characterization of bouton between control and FGF22 overexpressing mice (n = 4-5 mice per group). ((G) Schematic illustration and representative confocal image of LPSN viral labeling (magenta) and CST collaterals (green). Insets represent 3D views generated in Imaris of the deconvolved confocal image. (H) Quantification of hCST contacts onto LPSNs and characterization of vGlut intensity onto individual LPSNs (n = 4-5 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Schematic", "illustration", "and", "representative", "confocal", "image", "for", "vGlut2", "-", "Cre", "neuronal", "labeling", "(", "cyan", ")", "and", "hCST", "collaterals", "(", "white", ")", ".", "Insets", "represent", "3D", "views", "generated", "in", "Imaris", "of", "the", "confocal", "image", ".", "Quantification", "of", "hCST", "contacts", "onto", "vGlut", "neurons", "(", "n", "=", "4", "-", "6", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Schematic illustration and representative confocal image for vGlut2-Cre neuronal labeling (cyan) and hCST collaterals (white). Insets represent 3D views generated in Imaris of the confocal image. Quantification of hCST contacts onto vGlut neurons (n = 4-6 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "Schematic", "illustration", "of", "the", "hCST", "collateral", "exiting", "into", "the", "cervical", "cord", "and", "confocal", "images", "showing", "exiting", "hCST", "collaterals", "in", "control", "(", "left", "panel", ")", "and", "FGF22", "treated", "(", "right", "panel", ")", "mice", "and", "quantification", "of", "the", "number", "of", "hCST", "collaterals", "that", "enter", "the", "cervical", "grey", "matter", "3", "weeks", "following", "spinal", "cord", "injury", ".", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "E", ")", "Schematic", "illustration", "of", "the", "boutons", "on", "cervical", "hCST", "collateral", "and", "confocal", "images", "showing", "putative", "synaptic", "boutons", "(", "arrows", ")", "on", "newly", "formed", "cervical", "hCST", "collaterals", "at", "3", "weeks", "following", "spinal", "cord", "injury", "in", "a", "FGF22", "(", "right", ")", "and", "a", "control", "(", "left", ")", "mice", ".", "Quantification", "of", "bouton", "density", "in", "control", "and", "FGF22", "treated", "mice", ".", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", "(", "F", ")", "Schematic", "illustration", "of", "the", "hCST", "contacts", "onto", "relay", "neurons", "in", "the", "cervical", "cord", "and", "confocal", "images", "showing", "contacts", "between", "CST", "collaterals", "(", "red", ")", "and", "cervical", "interneurons", "(", "cyan", ")", ".", "Insets", "represent", "3D", "views", "generated", "in", "Imaris", "of", "the", "confocal", "image", ".", "Quantification", "of", "the", "contacts", "between", "the", "hCST", "collaterals", "and", "cervical", "interneurons", "neurons", ".", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "(", "G", ")", "Confocal", "images", "showing", "contacts", "between", "CST", "collaterals", "(", "red", ")", "and", "long", "propriospinal", "neurons", "(", "magenta", ")", "transduced", "with", "FGF22", "(", "cyan", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "contacts", "between", "the", "hCST", "collaterals", "and", "long", "propriospinal", "transduced", "with", "FGF22", "or", "control", "virus", "(", "DP", "refers", "to", "double", "positive", "cells", ")", ".", "Insets", "on", "the", "right", "are", "magnification", "of", "the", "boxed", "area", "on", "the", "left", ".", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) Schematic illustration of the hCST collateral exiting into the cervical cord and confocal images showing exiting hCST collaterals in control (left panel) and FGF22 treated (right panel) mice and quantification of the number of hCST collaterals that enter the cervical grey matter 3 weeks following spinal cord injury. (n = 6 mice per group).(E) Schematic illustration of the boutons on cervical hCST collateral and confocal images showing putative synaptic boutons (arrows) on newly formed cervical hCST collaterals at 3 weeks following spinal cord injury in a FGF22 (right) and a control (left) mice. Quantification of bouton density in control and FGF22 treated mice. (n = 6 mice per group(F) Schematic illustration of the hCST contacts onto relay neurons in the cervical cord and confocal images showing contacts between CST collaterals (red) and cervical interneurons (cyan). Insets represent 3D views generated in Imaris of the confocal image. Quantification of the contacts between the hCST collaterals and cervical interneurons neurons. (n = 6 per group).(G) Confocal images showing contacts between CST collaterals (red) and long propriospinal neurons (magenta) transduced with FGF22 (cyan). Quantification of the contacts between the hCST collaterals and long propriospinal transduced with FGF22 or control virus (DP refers to double positive cells). Insets on the right are magnification of the boxed area on the left. (n = 6 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Timeline", "of", "the", "experiment", "with", "FGF22", "injection", "right", "after", "the", "onset", "of", "the", "spinal", "cord", "lesion", "(", "top", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "functional", "recovery", "in", "the", "regular", "(", "middle", ")", "and", "irregular", "(", "bottom", ")", "ladder", "rung", "test", "in", "controls", "(", "grey", ")", "and", "FGF22", "(", "orange", ")", "treated", "mice", "at", "baseline", ",", "at", "3", "days", "post", "injury", "(", "\"", "3dpi", "\"", ")", ",", "14dpi", "and", "21dpi", "after", "spinal", "cord", "injury", ".", "(", "n", "=", "9", "-", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "D", ")", "Timeline", "of", "the", "experiment", "with", "FGF22", "injection", "24hrs", "after", "the", "onset", "of", "the", "spinal", "cord", "lesion", "(", "top", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "functional", "recovery", "in", "the", "regular", "(", "middle", ")", "and", "irregular", "(", "bottom", ")", "ladder", "rung", "test", "in", "control", "(", "grey", ")", "and", "FGF22", "(", "orange", ")", "treated", "mice", "at", "baseline", ",", "at", "3", "days", "post", "injury", "(", "\"", "3dpi", "\"", "or", "2", "days", "\"", "2dpi", "for", "the", "late", "treatment", ")", ",", "14dpi", "and", "21dpi", "after", "spinal", "cord", "injury", ".", "(", "n", "=", "9", "-", "10", "per", "group", ")", ".", "(", "E", ")", "Timeline", "of", "the", "experiment", "with", "FGF22", "injection", "5", "days", "after", "the", "onset", "of", "the", "spinal", "cord", "lesion", "(", "top", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "functional", "recovery", "in", "the", "regular", "(", "middle", ")", "and", "irregular", "(", "bottom", ")", "ladder", "rung", "test", "in", "control", "(", "grey", ")", "and", "FGF22", "(", "orange", ")", "treated", "mice", "at", "baseline", ",", "at", "3", "days", "post", "injury", "(", "\"", "3dpi", "\"", ")", ",", "14dpi", "and", "21dpi", "after", "spinal", "cord", "injury", ".", "(", "n", "=", "9", "-", "10", "per", "group", ")", ".", ")", ".", "(", "F", "(", "F", ")", "Representative", "confocal", "image", "of", "CST", "boutons", "(", "green", ")", "and", "synapsin", "staining", "(", "red", ")", "and", "quantification", "of", "the", "percentage", "of", "bouton", "synapsin", "positive", "(", "n", "=", "6", "-", "7", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "G", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "CST", "bouton", "(", "green", ")", "and", "bassoon", "staining", "(", "magenta", ")", "and", "quantification", "of", "the", "percentage", "of", "boutons", "that", "are", "bassoon", "positive", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Timeline of the experiment with FGF22 injection right after the onset of the spinal cord lesion (top). Quantification of the functional recovery in the regular (middle) and irregular (bottom) ladder rung test in controls (grey) and FGF22 (orange) treated mice at baseline, at 3 days post injury (\"3dpi\"), 14dpi and 21dpi after spinal cord injury. (n = 9-10 mice per group). (D) Timeline of the experiment with FGF22 injection 24hrs after the onset of the spinal cord lesion (top). Quantification of the functional recovery in the regular (middle) and irregular (bottom) ladder rung test in control (grey) and FGF22 (orange) treated mice at baseline, at 3 days post injury (\"3dpi\" or 2 days \"2dpi for the late treatment), 14dpi and 21dpi after spinal cord injury. (n = 9-10 per group). (E) Timeline of the experiment with FGF22 injection 5 days after the onset of the spinal cord lesion (top). Quantification of the functional recovery in the regular (middle) and irregular (bottom) ladder rung test in control (grey) and FGF22 (orange) treated mice at baseline, at 3 days post injury (\"3dpi\"), 14dpi and 21dpi after spinal cord injury. (n = 9-10 per group).). (F(F) Representative confocal image of CST boutons (green) and synapsin staining (red) and quantification of the percentage of bouton synapsin positive (n = 6-7 mice per group). (G) Representative confocal images of CST bouton (green) and bassoon staining (magenta) and quantification of the percentage of boutons that are bassoon positive (n = 5-6 mice per group). D"}
{"words": ["Figure", "1A", "In", "silico", "analysis", "of", "Sirt7", "mRNA", "expression", "in", "different", "tissues", "of", "the", "BXD", "genetic", "reference", "population", "(", "www", ".", "genenetwork", ".", "org", ")", ".", "Adr", ":", "Adrenal", "Gland", "mRNA", ",", "Bla", ":", "Bladder", "mRNA", ",", "Bone", ":", "Bone", "Tibia", "mRNA", ",", "CNS", ":", "CNS", "mRNA", ",", "Cec", ":", "Cecum", "mRNA", ",", "Epi", ":", "Epididymis", "mRNA", ",", "Eso", ":", "Esophagus", "mRNA", ",", "Eye", ":", "Eye", "mRNA", ",", "Fat", ":", "Peritoneal", "Fat", "mRNA", ",", "GI", ":", "GI", "Track", "mRNA", ",", "Hea", ":", "Heart", "mRNA", ",", "Kid", ":", "Kidney", "mRNA", ",", "Liv", ":", "Liver", "mRNA", ",", "Lung", ":", "Lung", "mRNA", ",", "Mus", ":", "Gastrocnemius", "Muscle", "mRNA", ",", "Ova", ":", "Ovary", "mRNA", ",", "Pro", ":", "Prostate", "mRNA", ",", "Sal", ":", "Salivary", "Gland", "mRNA", ",", "Skin", ":", "Skin", "Back", "mRNA", ",", "Sn", ":", "Sciatic", "Nerve", "mRNA", ",", "Spl", ":", "Spleen", "mRNA", ",", "Tes", ":", "Testis", "mRNA", ",", "Thy", ":", "Thymus", "mRNA", ",", "Ton", ":", "Tongue", "mRNA", ",", "Tra", ":", "Trachea", "mRNA", ",", "and", "Ute", ":", "Uterus", "mRNA", ".", "B", "Correlation", "plot", "for", "kidney", "mRNA", "expression", "of", "Sirt7", "and", "Slc12a7", "that", "codifies", "KCC4", "in", "the", "mouse", "BxD", "genetic", "reference", "population", "(", "www", ".", "genenetwork", ".", "org", ")", ".", "C", "Oocytes", "injected", "with", "cRNA", "encoding", "KCC4", "were", "incubated", "with", "NAD", "+", "200", "μM", "and", "NAM", "10", "mM", "for", "4", "h", ".", "Lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "KCC4", "antibody", "and", "then", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "/", "immunoblotting", "using", "an", "anti", "-", "acetylated", "-", "lysine", "(", "AcK", ")", "or", "anti", "-", "KCC4", "antibody", ".", "Non", "-", "injected", "oocytes", "(", "UI", ")", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "D", "Oocytes", "expressing", "KCC4", "were", "incubated", "with", "NAM", "for", "the", "indicated", "times", ",", "and", "KCC4", "protein", "levels", "(", "upper", "panel", ")", ",", "and", "activity", "(", "lower", "panel", ")", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "/", "immunoblotting", "or", "Cl", "-", "-", "dependent", "86Rb", "+", "uptake", "under", "hypotonic", "conditions", ".", "E", "Oocytes", "injected", "with", "H20", "or", "KCC4", "were", "incubated", "for", "the", "indicated", "times", ",", "and", "KCC4", "protein", "levels", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "/", "immunoblotting", ".", "F", "Oocytes", "were", "injected", "with", "either", "WT", ",", "K114R", "or", "K114Q", "KCC4", "and", "incubated", "with", "vehicle", "(", "V", ")", ",", "NAD", "+", "or", "NAM", "for", "48", "h", ",", "and", "KCC4", "protein", "levels", "(", "upper", "pannel", ")", ",", "and", "activity", "(", "lower", "pannel", ")", "were", "analyzed", "as", "in", "D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A In silico analysis of Sirt7 mRNA expression in different tissues of the BXD genetic reference population (www.genenetwork.org). Adr: Adrenal Gland mRNA, Bla: Bladder mRNA, Bone: Bone Tibia mRNA, CNS: CNS mRNA, Cec: Cecum mRNA, Epi: Epididymis mRNA, Eso: Esophagus mRNA, Eye: Eye mRNA, Fat: Peritoneal Fat mRNA, GI: GI Track mRNA, Hea: Heart mRNA, Kid: Kidney mRNA, Liv: Liver mRNA, Lung: Lung mRNA, Mus: Gastrocnemius Muscle mRNA, Ova: Ovary mRNA, Pro: Prostate mRNA, Sal: Salivary Gland mRNA, Skin: Skin Back mRNA, Sn: Sciatic Nerve mRNA, Spl: Spleen mRNA, Tes: Testis mRNA, Thy: Thymus mRNA, Ton: Tongue mRNA, Tra: Trachea mRNA, and Ute: Uterus mRNA.B Correlation plot for kidney mRNA expression of Sirt7 and Slc12a7 that codifies KCC4 in the mouse BxD genetic reference population (www.genenetwork.org).C Oocytes injected with cRNA encoding KCC4 were incubated with NAD+ 200 μM and NAM 10 mM for 4 h. Lysates were immunoprecipitated with an anti-KCC4 antibody and then analyzed by SDS-PAGE/immunoblotting using an anti-acetylated-lysine (AcK) or anti-KCC4 antibody. Non-injected oocytes (UI) were used as a control.D Oocytes expressing KCC4 were incubated with NAM for the indicated times, and KCC4 protein levels (upper panel), and activity (lower panel) were analyzed by SDS-PAGE/immunoblotting or Cl--dependent 86Rb+ uptake under hypotonic conditions.E Oocytes injected with H20 or KCC4 were incubated for the indicated times, and KCC4 protein levels were analyzed by SDS-PAGE/immunoblotting.F Oocytes were injected with either WT, K114R or K114Q KCC4 and incubated with vehicle (V), NAD+ or NAM for 48 h, and KCC4 protein levels (upper pannel), and activity (lower pannel) were analyzed as in D."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", "KCC4", "activity", "(", "A", ")", ",", "and", "protein", "levels", "(", "B", ")", "were", "evaluated", "in", "Xenopus", "oocytes", "expressing", "SIRT7", "and", "KCC4", "that", "were", "incubated", "for", "the", "indicated", "times", "with", "NAD", "+", ".", "Non", "-", "injected", "oocytes", "(", "UI", ")", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "C", "KCC4", "activity", "was", "evaluated", "in", "Xenopus", "oocytes", "injected", "with", "cRNA", "encoding", "KCC4", "and", "coinjected", "with", "either", "wild", "-", "type", "(", "SIRT7", "WT", ")", "or", "the", "catalytically", "inactive", "SIRT7", "(", "SIRT7", "H188Y", ")", "for", "48", "h", ".", "D", "Oocytes", "were", "injected", "with", "either", "KCC4", "WT", ",", "K114R", "or", "K114Q", "for", "48", "h", "and", "then", "incubated", "with", "vehicle", "(", "V", ")", ",", "NAD", "+", "or", "NAM", "for", "24", "h", ",", "and", "KCC4", "and", "SIRT7", "protein", "levels", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "/", "immunoblotting", ".", "E", "Oocytes", "were", "injected", "with", "either", "KCC4", "WT", ",", "K114R", "or", "K114Q", "with", "and", "without", "SIRT7", "for", "48", "h", "and", "then", "incubated", "with", "vehicle", "(", "V", ")", "or", "NAM", "for", "4", "h", ".", "After", "lysis", ",", "KCC4", "was", "immunoprecipitated", "using", "an", "anti", "-", "KCC4", "antibody", ",", "and", "the", "acetylation", "status", "of", "KCC4", "was", "determined", "by", "SDS", "-", "PAGE", "/", "Western", "blotting", "using", "and", "anti", "-", "acetyl", "lysine", "antibody", ".", "F", ",", "G", "FLAG", "-", "KCC4", "and", "SIRT7", "were", "transfected", "into", "HEK293", "cells", "and", "treated", "for", "the", "indicated", "times", "with", "NAD", "+", "(", "F", ")", "or", "NAM", "(", "G", ")", "and", "then", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "/", "immunoblotting", "using", "an", "anti", "-", "KCC4", "or", "anti", "-", "SIRT7", "antibody", ".", "Non", "-", "transfected", "cells", "(", "UT", ")", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "H", "FLAG", "-", "KCC4", "and", "SIRT7", "were", "transfected", "into", "HEK293", "cells", "and", "treated", "for", "the", "indicated", "times", "with", "NAD", "+", "and", "NAM", ".", "After", "lysis", ",", "KCC4", "immunoprecipitation", "using", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "was", "performed", ",", "and", "the", "interaction", "with", "SIRT7", "was", "determined", "by", "SDS", "-", "PAGE", "/", "Western", "blotting", ".", "I", "HEK293", "cells", "expressing", "KCC4", "were", "incubated", "with", "NAD", "+", "200", "μM", "and", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "for", "0", ",", "3", ",", "6", "and", "9", "h", ".", "KCC4", "protein", "levels", "are", "shown", "at", "the", "indicated", "times", "in", "cells", "transfected", "with", "a", "scramble", "shRNA", "(", "+", "SIRT7", ")", "or", "a", "shRNA", "against", "SIRT7", "(", "-", "SIRT7", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B KCC4 activity (A), and protein levels (B) were evaluated in Xenopus oocytes expressing SIRT7 and KCC4 that were incubated for the indicated times with NAD+. Non-injected oocytes (UI) were used as a control.C KCC4 activity was evaluated in Xenopus oocytes injected with cRNA encoding KCC4 and coinjected with either wild-type (SIRT7 WT) or the catalytically inactive SIRT7 (SIRT7 H188Y) for 48 h.D Oocytes were injected with either KCC4 WT, K114R or K114Q for 48 h and then incubated with vehicle (V), NAD+ or NAM for 24 h, and KCC4 and SIRT7 protein levels were analyzed by SDS-PAGE/immunoblotting.E Oocytes were injected with either KCC4 WT, K114R or K114Q with and without SIRT7 for 48 h and then incubated with vehicle (V) or NAM for 4 h. After lysis, KCC4 was immunoprecipitated using an anti-KCC4 antibody, and the acetylation status of KCC4 was determined by SDS-PAGE/Western blotting using and anti-acetyl lysine antibody.F, G FLAG-KCC4 and SIRT7 were transfected into HEK293 cells and treated for the indicated times with NAD+ (F) or NAM (G) and then analyzed by SDS-PAGE/immunoblotting using an anti-KCC4 or anti-SIRT7 antibody. Non-transfected cells (UT) were used as a control.H FLAG-KCC4 and SIRT7 were transfected into HEK293 cells and treated for the indicated times with NAD+ and NAM. After lysis, KCC4 immunoprecipitation using an anti-FLAG antibody was performed, and the interaction with SIRT7 was determined by SDS-PAGE/Western blotting.I HEK293 cells expressing KCC4 were incubated with NAD+ 200 μM and cycloheximide (CHX) for 0, 3, 6 and 9 h. KCC4 protein levels are shown at the indicated times in cells transfected with a scramble shRNA (+SIRT7) or a shRNA against SIRT7 (-SIRT7)."}
{"words": ["Figure", "3A", "KCC4", "acetylation", "at", "the", "indicated", "pH", "in", "HEK293", "transfected", "with", "KCC4", ".", "After", "lysis", ",", "KCC4", "was", "immunoprecipitated", "using", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "/", "Western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "acetylated", "-", "lysine", "(", "AcK", ")", "or", "anti", "-", "KCC4", "antibody", ".", "Non", "-", "transfected", "cells", "(", "UT", ")", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "B", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "KCC4", "together", "with", "SIRT7", "with", "a", "scramble", "shRNA", "(", "-", ")", "or", "a", "shRNA", "against", "SIRT7", "(", "+", ")", ",", "and", "KCC4", "activity", "and", "protein", "level", "were", "determined", "at", "the", "indicated", "pH", ".", "SIRT7", "expression", "in", "these", "conditions", "is", "presented", "in", "C", ".", "C", "Nuclear", "and", "cytoplasmic", "SIRT7", "levels", "at", "different", "pH", "values", "in", "HEK293", "cells", ".", "At", "a", "lower", "pH", ",", "SIRT7", "appears", "to", "translocate", "to", "the", "cytoplasm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A KCC4 acetylation at the indicated pH in HEK293 transfected with KCC4. After lysis, KCC4 was immunoprecipitated using an anti-FLAG antibody, and then analyzed by SDS-PAGE/Western blotting using an anti-acetylated-lysine (AcK) or anti-KCC4 antibody. Non-transfected cells (UT) were used as a control.B HEK293 cells were transfected with KCC4 together with SIRT7 with a scramble shRNA (-) or a shRNA against SIRT7 (+), and KCC4 activity and protein level were determined at the indicated pH. SIRT7 expression in these conditions is presented in C.C Nuclear and cytoplasmic SIRT7 levels at different pH values in HEK293 cells. At a lower pH, SIRT7 appears to translocate to the cytoplasm."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "Sirt7", "mRNA", "(", "A", ")", "and", "protein", "(", "B", ")", "abundance", "in", "microdissected", "renal", "tubules", "normalized", "to", "Rpl26", "or", "Ponceau", ",", "respectively", ".", "Enrichment", "for", "each", "segment", "was", "previously", "validated", "by", "immunoblotting", "against", "segment", "-", "specific", "markers", "as", "indicated", "in", "material", "and", "methods", "(", "Spirli", "et", "al", ",", "2019", ")", ".", "C", "Immunolocalization", "of", "SIRT7", "and", "ATPase", "in", "the", "kidneys", "of", "C57BL6", "mice", "with", "metabolic", "acidosis", "(", "SIRT7", ",", "red", ";", "ATPase", ",", "green", ";", "DAPI", ",", "Blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "Controls", "of", "the", "specificity", "of", "antibodies", "using", "kidney", "of", "SIRT7", "-", "deficient", "mice", "are", "provided", "in", "Appendix", "Fig", "S4", ".", "D", "KCC4", "and", "SIRT7", "protein", "levels", "in", "kidneys", "from", "control", "mice", "or", "mice", "with", "metabolic", "acidosis", ".", "Values", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B Sirt7 mRNA (A) and protein (B) abundance in microdissected renal tubules normalized to Rpl26 or Ponceau, respectively. Enrichment for each segment was previously validated by immunoblotting against segment-specific markers as indicated in material and methods (Spirli et al, 2019).C Immunolocalization of SIRT7 and ATPase in the kidneys of C57BL6 mice with metabolic acidosis (SIRT7, red; ATPase, green; DAPI, Blue). Scale bar: 20 μm. Controls of the specificity of antibodies using kidney of SIRT7-deficient mice are provided in Appendix Fig S4.D KCC4 and SIRT7 protein levels in kidneys from control mice or mice with metabolic acidosis. Values are the mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "5A", "KCC4", "protein", "levels", "were", "determined", "in", "the", "kidneys", "of", "wild", "-", "type", "(", "SIRT7", "+", "/", "+", ")", "and", "SIRT7", "-", "deficient", "mice", "(", "SIRT7", "-", "/", "-", ")", ".", "SIRT7", "protein", "expression", "are", "absent", "in", "the", "kidneys", "of", "SIRT7", "-", "deficient", "mice", ".", "B", "KCC4", "protein", "levels", ",", "acetylation", "status", "of", "KCC4", ",", "and", "interaction", "with", "SIRT7", "in", "kidneys", "of", "SIRT7", "+", "/", "+", "and", "SIRT7", "-", "/", "-", "mice", "under", "normal", "conditions", "(", "Control", ")", "or", "with", "metabolic", "acidosis", ".", "C", "Immunolocalization", "of", "KCC4", "and", "H", "-", "ATPase", "in", "the", "kidneys", "of", "SIRT7", "+", "/", "+", "and", "SIRT7", "-", "/", "-", "mice", "under", "normal", "conditions", "(", "Control", ")", "or", "with", "metabolic", "acidosis", "(", "NH4Cl", ")", ".", "(", "KCC4", ",", "red", ";", "H", "-", "ATPase", ",", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "Cell", "count", "was", "performed", "automatically", "using", "the", "Gen5", "software", "to", "report", "the", "percentage", "of", "KCC4", "+", "cells", "among", "H", "-", "ATPase", "+", "cells", "(", "lower", "panel", ")", ".", "D", "NCC", "and", "NKCC2", "protein", "levels", "in", "the", "kidney", "of", "SIRT7", "+", "/", "+", "and", "SIRT7", "-", "/", "-", "mice", "under", "basal", "conditions", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A KCC4 protein levels were determined in the kidneys of wild-type (SIRT7+/+) and SIRT7-deficient mice (SIRT7-/-). SIRT7 protein expression are absent in the kidneys of SIRT7-deficient mice.B KCC4 protein levels, acetylation status of KCC4, and interaction with SIRT7 in kidneys of SIRT7+/+ and SIRT7-/-mice under normal conditions (Control) or with metabolic acidosis.C Immunolocalization of KCC4 and H-ATPase in the kidneys of SIRT7+/+ and SIRT7-/- mice under normal conditions (Control) or with metabolic acidosis (NH4Cl). (KCC4, red; H-ATPase, green). Scale bar: 20 μm. Cell count was performed automatically using the Gen5 software to report the percentage of KCC4+ cells among H-ATPase+ cells (lower panel).D NCC and NKCC2 protein levels in the kidney of SIRT7+/+ and SIRT7-/- mice under basal conditions."}
{"words": ["Figure", "1B", "Analysis", "of", "anti", "-", "Bax", "and", "anti", "-", "Bak", "antibody", "specificity", "using", "whole", "cell", "lysates", "from", "HCT116", "wild", "-", "type", ",", "Bax", "KO", ",", "Bak", "KO", "and", "Bax", "/", "Bak", "DKO", ".", "After", "detection", "of", "Bax", "the", "membrane", "was", "redecorated", "with", "anti", "-", "Bak", "antibodies", "(", "Bax", "/", "Bak", ")", ".", "Actin", "is", "used", "as", "loading", "control", ".", "C", "Western", "blot", "analysis", "of", "Bak", "in", "the", "heavy", "membrane", "(", "HM", ")", "fraction", "of", "human", "heart", ",", "cerebral", "cortex", "(", "CNS", "GM", ")", ",", "kidney", ",", "brain", "white", "matter", "(", "CNS", "WM", ")", ",", "lung", ",", "liver", ",", "and", "skeletal", "muscle", "tissue", ".", "The", "cytosol", "fraction", "obtained", "from", "CNS", "cortex", "(", "C", ")", ",", "LDH", ",", "and", "Tom20", "serve", "as", "fractionation", "and", "loading", "controls", ".", "n", "=", "3", ".", "D", "Presence", "of", "Bak", "in", "the", "cytosol", "of", "heart", ",", "cerebral", "cortex", "(", "CNS", "GM", ")", ",", "kidney", ",", "brain", "white", "matter", "(", "CNS", "WM", ")", ",", "lung", ",", "liver", ",", "and", "skeletal", "muscle", "tissue", "analyzed", "by", "Western", "blot", "in", "parallel", "to", "C", ".", "The", "heavy", "membrane", "heart", "fraction", "(", "HM", ")", ",", "LDH", "and", "Tom20", "serve", "as", "fractionation", "and", "loading", "controls", ".", "n", "=", "3", ".", "E", "Carbonate", "extraction", "of", "the", "heavy", "membrane", "protein", "fraction", "of", "human", "brain", "white", "matter", "(", "CNS", "WM", ")", "and", "lung", "tissue", "analyzed", "for", "the", "presence", "of", "Bak", "by", "Western", "blot", ".", "Membrane", "-", "associated", "protein", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "membrane", "-", "integral", "protein", "pellet", "(", "P", ")", "are", "displayed", ".", "Smac", "is", "released", "from", "the", "mitochondrial", "inter", "membrane", "space", "(", "IMS", ")", "during", "carbonate", "extraction", "and", "CoxIV", "remains", "in", "the", "pellet", ".", "n", "=", "2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Analysis of anti-Bax and anti-Bak antibody specificity using whole cell lysates from HCT116 wild-type, Bax KO, Bak KO and Bax/Bak DKO. After detection of Bax the membrane was redecorated with anti-Bak antibodies (Bax/Bak). Actin is used as loading control.C Western blot analysis of Bak in the heavy membrane (HM) fraction of human heart, cerebral cortex (CNS GM), kidney, brain white matter (CNS WM), lung, liver, and skeletal muscle tissue. The cytosol fraction obtained from CNS cortex (C), LDH, and Tom20 serve as fractionation and loading controls. n = 3.D Presence of Bak in the cytosol of heart, cerebral cortex (CNS GM), kidney, brain white matter (CNS WM), lung, liver, and skeletal muscle tissue analyzed by Western blot in parallel to C. The heavy membrane heart fraction (HM), LDH and Tom20 serve as fractionation and loading controls. n = 3.E Carbonate extraction of the heavy membrane protein fraction of human brain white matter (CNS WM) and lung tissue analyzed for the presence of Bak by Western blot. Membrane-associated protein supernatant (S) and membrane-integral protein pellet (P) are displayed. Smac is released from the mitochondrial inter membrane space (IMS) during carbonate extraction and CoxIV remains in the pellet. n = 2."}
{"words": ["Figure", "2A", "Confocal", "images", "of", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "Bak", "in", "the", "absence", "(", "left", ")", "or", "the", "presence", "(", "right", ")", "of", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", ".", "Scale", "bar", "15", "µm", ".", "n", "≥", "10", ".", "B", "FLIP", "(", "Fluorescence", "Loss", "in", "Photobleaching", ")", "of", "mitochondrial", "GFP", "-", "Bak", "in", "the", "absence", "(", "●", ",", "straight", "line", ")", "or", "the", "presence", "(", "○", ",", "broken", "line", ")", "of", "overexpressed", "Bcl", "-", "xL", ".", "Fluorescence", "of", "the", "neighboring", "cell", "(", "in", "Fig", ".", "2C", ")", "is", "shown", "as", "control", "(", ",", "dotted", "line", ")", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SEM", "from", "16", "(", "-", "Bcl", "-", "xL", ")", "and", "40", "(", "+", "Bcl", "-", "xL", ")", "ROI", "measurements", ".", "C", "FLIP", "of", "GFP", "-", "Bak", "in", "the", "absence", "(", "top", ")", "or", "the", "presence", "(", "bottom", ")", "of", "overexpressed", "Bcl", "-", "xL", "diminishes", "GFP", "-", "Bak", "fluorescence", "in", "the", "cytosol", "of", "targeted", "cells", "(", "circled", ")", "completely", "after", "90", "s", "and", "GFP", "fluorescence", "is", "detected", "only", "on", "the", "mitochondria", "(", "arrows", ")", ".", "During", "FLIP", "measurements", "mitochondrial", "GFP", "-", "Bak", "fluorescence", "is", "monitored", ",", "while", "the", "cytosol", "is", "bleached", "repeatedly", ".", "Time", "points", "in", "seconds", "are", "displayed", "above", "the", "images", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Confocal images of HCT116 Bax/Bak DKO cells transfected with GFP-Bak in the absence (left) or the presence (right) of Bcl-xL overexpression. Scale bar 15 µm. n ≥ 10.B FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching) of mitochondrial GFP-Bak in the absence (●, straight line) or the presence (○, broken line) of overexpressed Bcl-xL. Fluorescence of the neighboring cell (in Fig. 2C) is shown as control (, dotted line). Data represent averages ± SEM from 16 (-Bcl-xL) and 40 (+Bcl-xL) ROI measurements.C FLIP of GFP-Bak in the absence (top) or the presence (bottom) of overexpressed Bcl-xL diminishes GFP-Bak fluorescence in the cytosol of targeted cells (circled) completely after 90 s and GFP fluorescence is detected only on the mitochondria (arrows). During FLIP measurements mitochondrial GFP-Bak fluorescence is monitored, while the cytosol is bleached repeatedly. Time points in seconds are displayed above the images."}
{"words": ["Figure", "3A", "Western", "blot", "analysis", "of", "GFP", "-", "Bak", "localization", "in", "cytosol", "(", "C", ")", "and", "heavy", "membrane", "fraction", "(", "HM", ")", "of", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "with", "or", "without", "overexpressed", "wild", "-", "type", "Bcl", "-", "xL", "or", "Bcl", "-", "xL", "G138A", ".", "GAPDH", "and", "Tom20", "serve", "as", "fractionation", "controls", ".", "n", "=", "10", ".", "Bak", "shuttling", "by", "Bcl", "-", "xL", "is", "independent", "of", "the", "GFP", "fusion", "(", "Fig", ".", "E2a", ")", ".", "B", "Quantification", "of", "predominant", "mitochondrial", "localization", "(", "light", "grey", "bars", ")", "and", "mixed", "cytosolic", "and", "mitochondrial", "localization", "(", "dark", "grey", "bars", ")", "of", "Bak", "in", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Bak", "with", "or", "without", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SD", "from", "3", "independent", "experiments", "with", "n", "≥", "100", ".", "C", "Retrotranslocation", "rates", "measured", "for", "wild", "-", "type", "Bak", "or", "Bak", "D83R", "in", "the", "presence", "or", "the", "absence", "of", "Bcl", "-", "2", ",", "Mcl", "-", "1", ",", "wild", "-", "type", "Bcl", "-", "xL", "or", "Bcl", "-", "xL", "G138A", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SD", ".", "D", "Analysis", "of", "endogenous", "Bak", "localization", "in", "cytosol", "(", "C", ")", "and", "heavy", "membrane", "fraction", "(", "HM", ")", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "degradation", "-", "prone", "DD", "-", "FLAG", "-", "Bcl", "-", "xL", ".", "In", "the", "absence", "of", "Shield", "-", "1", "DD", "-", "FLAG", "-", "Bcl", "-", "xL", "is", "readily", "degraded", ",", "resulting", "in", "unaltered", "Bcl", "-", "xL", "levels", ".", "Addition", "of", "0", ".", "5", "µM", "Shield", "-", "1", "instantly", "stabilizes", "DD", "-", "FLAG", "-", "Bcl", "-", "xL", "resulting", "in", "elevated", "Bcl", "-", "xL", "levels", "that", "increase", "cytosolic", "levels", "of", "endogenous", "Bak", "(", "Fig", ".", "E3C", ",", "D", ")", ".", "Akt1", "and", "Tom20", "serve", "as", "fractionation", "controls", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Western blot analysis of GFP-Bak localization in cytosol (C) and heavy membrane fraction (HM) of HCT116 Bax/Bak DKO cells with or without overexpressed wild-type Bcl-xL or Bcl-xL G138A. GAPDH and Tom20 serve as fractionation controls. n = 10. Bak shuttling by Bcl-xL is independent of the GFP fusion (Fig. E2a).B Quantification of predominant mitochondrial localization (light grey bars) and mixed cytosolic and mitochondrial localization (dark grey bars) of Bak in HCT116 Bax/Bak DKO cells expressing GFP-Bak with or without Bcl-xL overexpression. Data represent averages ± SD from 3 independent experiments with n ≥ 100.C Retrotranslocation rates measured for wild-type Bak or Bak D83R in the presence or the absence of Bcl-2, Mcl-1, wild-type Bcl-xL or Bcl-xL G138A. Data represent averages ± SD.D Analysis of endogenous Bak localization in cytosol (C) and heavy membrane fraction (HM) of HeLa cells expressing degradation-prone DD-FLAG-Bcl-xL. In the absence of Shield-1 DD-FLAG-Bcl-xL is readily degraded, resulting in unaltered Bcl-xL levels. Addition of 0.5 µM Shield-1 instantly stabilizes DD-FLAG-Bcl-xL resulting in elevated Bcl-xL levels that increase cytosolic levels of endogenous Bak (Fig. E3C, D). Akt1 and Tom20 serve as fractionation controls. n = 3."}
{"words": ["Figure", "4B", "Quantification", "of", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "Bax", ",", "BaxTBak", ",", "BakTBax", "or", "Bak", "with", "the", "expressed", "protein", "being", "present", "largely", "cytosolic", "(", "white", "bars", ")", ",", "in", "a", "mixed", "distribution", "between", "cytosol", "and", "mitochondria", "(", "grey", "bars", ")", "or", "largely", "mitochondrial", "(", "black", "bars", ")", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SEM", "from", "7", "independent", "experiments", "with", "n", "≥", "100", "cells", ".", "C", "Confocal", "images", "of", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "Bax", ",", "BaxTBak", ",", "BakTBax", "or", "Bak", ".", "The", "GFP", "/", "YFP", "fluorescence", "of", "the", "expressed", "protein", "variants", "is", "depicted", "in", "the", "top", "panels", "and", "in", "green", "in", "the", "merged", "image", "on", "the", "bottom", ".", "The", "mitochondria", "were", "stained", "by", "MitoTracker", "far", "red", "depicted", "in", "red", "in", "the", "merged", "images", "(", "bottom", "row", ")", ".", "Scale", "10", "µm", ".", "n", "≥", "5", ".", "D", "Western", "blot", "analysis", "of", "Bax", ",", "BaxTBak", ",", "Bak", "and", "BakTBax", "localization", "expressed", "in", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", ".", "Cytosol", "(", "C", ")", "and", "heavy", "membrane", "fraction", "(", "HM", ")", "of", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "are", "displayed", ".", "GAPDH", "and", "VDAC", "serve", "as", "fractionation", "controls", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Quantification of HCT116 Bax/Bak DKO cells expressing Bax, BaxTBak, BakTBax or Bak with the expressed protein being present largely cytosolic (white bars), in a mixed distribution between cytosol and mitochondria (grey bars) or largely mitochondrial (black bars). Data represent averages ± SEM from 7 independent experiments with n ≥ 100 cells.C Confocal images of HCT116 Bax/Bak DKO cells expressing Bax, BaxTBak, BakTBax or Bak. The GFP/YFP fluorescence of the expressed protein variants is depicted in the top panels and in green in the merged image on the bottom. The mitochondria were stained by MitoTracker far red depicted in red in the merged images (bottom row). Scale 10 µm. n ≥ 5.D Western blot analysis of Bax, BaxTBak, Bak and BakTBax localization expressed in HCT116 Bax/Bak DKO cells. Cytosol (C) and heavy membrane fraction (HM) of HCT116 Bax/Bak DKO cells are displayed. GAPDH and VDAC serve as fractionation controls. n = 3."}
{"words": ["Figure", "5A", "Caspase", "3", "/", "7", "activity", "measured", "in", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "overexpressing", "Bax", ",", "BaxTBak", ",", "Bak", "or", "BakTBax", "with", "or", "without", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", "in", "the", "absence", "of", "apoptosis", "stimuli", ".", "Caspase", "activity", "is", "displayed", "in", "relative", "fluorescence", "units", "(", "RFU", ")", ".", "pcDNA3", ".", "1", "-", "transfected", "cells", "served", "as", "control", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SEM", ".", "n", "≥", "3", ".", "p", "-", "values", "according", "to", "One", "Way", "ANOVA", "are", "displayed", ".", "B", "Staurosporine", "(", "STS", ",", "1", "µM", ")", "-", "induced", "caspase", "3", "/", "7", "activity", "of", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "overexpressing", "Bax", ",", "BaxTBak", ",", "Bak", "or", "BakTBax", "with", "or", "without", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", "displayed", "in", "relative", "fluorescence", "units", "(", "RFU", ")", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SEM", ".", "n", "≥", "3", ".", "p", "-", "values", "according", "to", "One", "Way", "ANOVA", ".", "BaxTBak", "activities", "with", "and", "without", "Bcl", "-", "xL", "expression", "revealed", "no", "significant", "difference", "(", "n", ".", "s", ".", ")", ",", "while", "in", "the", "presence", "of", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", "BaxTBak", "activity", "is", "significantly", "higher", "than", "Bax", ",", "Bak", "or", "BakTBax", "activities", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "C", "Analysis", "of", "the", "active", "Bax", "conformation", "in", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "wild", "-", "type", "Bax", "or", "BaxTBak", "with", "(", "dark", "grey", "bars", ")", "or", "without", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", "(", "light", "grey", "bars", ")", "by", "the", "monoclonal", "antibody", "6A7", "(", "Sigma", ")", "detecting", "the", "active", "Bax", "protein", "fold", "by", "fluorescence", "imaging", ".", "Cells", "were", "analyzed", "prior", "or", "after", "treatment", "with", "1", "µM", "STS", "in", "the", "presence", "of", "the", "pan", "-", "caspase", "inhibitor", "qVD", ".", "Data", "are", "represented", "as", "%", "of", "the", "expressing", "cell", "population", "±", "SEM", ".", "n", "=", "4", ".", "D", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "ectopically", "expressing", "wild", "-", "type", "Bax", "or", "BaxTBak", "with", "(", "dark", "grey", "bars", ")", "or", "without", "Bcl", "-", "xL", "(", "light", "grey", "bars", ")", "were", "analyzed", "in", "the", "presence", "or", "the", "absence", "of", "1", "µM", "STS", "and", "qVD", "for", "retained", "mitochondrial", "cyt", "c", ".", "Data", "are", "represented", "as", "%", "of", "the", "expressing", "cell", "population", "±", "SEM", ".", "n", "=", "4", ".", "E", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "Annexin", "V", "-", "staining", "of", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "Bax", ",", "BaxTBak", ",", "Bak", "or", "BakTBax", "in", "the", "absence", "(", "red", "line", ")", "or", "the", "presence", "of", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", "(", "black", "line", ")", ",", "following", "STS", "-", "treatment", ".", "The", "percentage", "of", "gated", "cells", "is", "displayed", "in", "the", "color", "of", "the", "corresponding", "graph", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SD", ".", "n", "=", "4", ".", "F", "Colony", "formation", "of", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "transfected", "with", "pcDNA", ",", "Bax", ",", "BaxTBak", ",", "Bak", "or", "BakTBax", "with", "or", "without", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", ".", "STS", "(", "1", "µM", ")", "was", "added", "for", "24", "hrs", "before", "cells", "were", "replated", "and", "colonies", "were", "stained", "with", "methylene", "blue", "typically", "14", "days", "after", "treatment", ".", "G", "Quantification", "of", "colony", "formation", "of", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "Bax", ",", "BaxTBak", ",", "Bak", "or", "BakTBax", "with", "or", "without", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", "after", "STS", "treatment", "(", "Fig", ".", "5F", ")", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SEM", ".", "n", "=", "4", ".", "p", "-", "values", "according", "to", "One", "Way", "ANOVA", ".", "BaxTBak", "expressing", "cells", "with", "or", "without", "Bcl", "-", "xL", "expression", "showed", "no", "significant", "difference", "(", "n", ".", "s", ".", ")", ".", "H", "Quantification", "of", "the", "colony", "formation", "of", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "Bax", ",", "BaxTBak", ",", "Bak", "or", "BakTBax", "in", "presence", "of", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", "without", "apoptosis", "stimulation", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SEM", ".", "n", "=", "5", ".", "p", "-", "values", "according", "to", "One", "Way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Caspase 3/7 activity measured in HCT116 Bax/Bak DKO cells overexpressing Bax, BaxTBak, Bak or BakTBax with or without Bcl-xL overexpression in the absence of apoptosis stimuli. Caspase activity is displayed in relative fluorescence units (RFU). pcDNA3.1-transfected cells served as control. Data represent averages ± SEM. n ≥ 3. p-values according to One Way ANOVA are displayed.B Staurosporine (STS, 1 µM)-induced caspase 3/7 activity of Bax/Bak DKO cells overexpressing Bax, BaxTBak, Bak or BakTBax with or without Bcl-xL overexpression displayed in relative fluorescence units (RFU). Data represent averages ± SEM. n ≥ 3. p-values according to One Way ANOVA. BaxTBak activities with and without Bcl-xL expression revealed no significant difference (n.s.), while in the presence of Bcl-xL overexpression BaxTBak activity is significantly higher than Bax, Bak or BakTBax activities (p < 0.001).C Analysis of the active Bax conformation in HCT116 Bax/Bak DKO cells expressing wild-type Bax or BaxTBak with (dark grey bars) or without Bcl-xL overexpression (light grey bars) by the monoclonal antibody 6A7 (Sigma) detecting the active Bax protein fold by fluorescence imaging. Cells were analyzed prior or after treatment with 1 µM STS in the presence of the pan-caspase inhibitor qVD. Data are represented as % of the expressing cell population ± SEM. n = 4.D HCT116 Bax/Bak DKO cells ectopically expressing wild-type Bax or BaxTBak with (dark grey bars) or without Bcl-xL (light grey bars) were analyzed in the presence or the absence of 1 µM STS and qVD for retained mitochondrial cyt c. Data are represented as % of the expressing cell population ± SEM. n = 4.E Flow cytometry analysis of Annexin V-staining of Bax/Bak DKO cells expressing Bax, BaxTBak, Bak or BakTBax in the absence (red line) or the presence of Bcl-xL overexpression (black line), following STS-treatment. The percentage of gated cells is displayed in the color of the corresponding graph. Data represent averages ± SD. n = 4.F Colony formation of Bax/Bak DKO cells transfected with pcDNA, Bax, BaxTBak, Bak or BakTBax with or without Bcl-xL overexpression. STS (1 µM) was added for 24 hrs before cells were replated and colonies were stained with methylene blue typically 14 days after treatment.G Quantification of colony formation of Bax/Bak DKO cells expressing Bax, BaxTBak, Bak or BakTBax with or without Bcl-xL overexpression after STS treatment (Fig. 5F). Data represent averages ± SEM. n = 4. p-values according to One Way ANOVA. BaxTBak expressing cells with or without Bcl-xL expression showed no significant difference (n.s.).H Quantification of the colony formation of Bax/Bak DKO cells expressing Bax, BaxTBak, Bak or BakTBax in presence of Bcl-xL overexpression without apoptosis stimulation. Data represent averages ± SEM. n = 5. p-values according to One Way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "6A", "FLIP", "of", "BaxTBakSS", "without", "(", "○", ",", "broken", "line", ")", "or", "with", "(", "●", ",", "straight", "line", ")", "overexpressed", "Bcl", "-", "xL", ".", "Fluorescence", "of", "a", "neighboring", "cell", "is", "shown", "as", "control", "(", ",", "dotted", "line", ")", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SEM", "from", "20", "(", "-", "Bcl", "-", "xL", ")", "and", "16", "(", "+", "Bcl", "-", "xL", ")", "ROI", "measurements", ".", "B", "Western", "blot", "analysis", "of", "PARP", "cleavage", "in", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "overexpressing", "Bax", ",", "Bax", "S184V", ",", "BaxTBak", "or", "BaxTBak", "V197", "/", "198S", ".", "The", "experiment", "was", "carried", "out", "in", "the", "absence", "of", "apoptotic", "stimuli", ".", "Cells", "transfected", "with", "pcDNA3", ".", "1", "vector", "serve", "as", "control", "for", "PARP", "cleavage", ".", "Similar", "sample", "loading", "is", "controlled", "by", "actin", ".", "n", "=", "4", ".", "C", "Colony", "formation", "of", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "transfected", "with", "pcDNA", ",", "BaxTBak", "or", "BaxTBakSS", "with", "Bcl", "-", "xL", "overexpression", "in", "the", "absence", "of", "apoptotic", "stimuli", ".", "n", "=", "3", ".", "D", "Caspase", "3", "/", "7", "activity", "was", "measured", "in", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "overexpressing", "Bax", ",", "Bax", "S184V", ",", "BaxTBak", "or", "BaxTBak", "V197", "/", "198S", ".", "Caspase", "activity", "is", "displayed", "in", "relative", "fluorescence", "units", "(", "RFU", ")", ".", "The", "experiment", "was", "carried", "out", "in", "the", "absence", "of", "apoptotic", "stimuli", "and", "pcDNA3", ".", "1", "-", "transfected", "cells", "served", "as", "control", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SEM", ".", "n", "=", "4", ".", "p", "-", "values", "according", "to", "One", "Way", "ANOVA", "using", "the", "Holm", "-", "Sidak", "method", "are", "displayed", ".", "F", "STS", "-", "induced", "caspase", "3", "/", "7", "activity", "of", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "Bax", ",", "Bax", "S184V", ",", "BakTBax", "or", "BakTBax", "S184V", "is", "displayed", "normalized", "to", "Bax", "activity", ".", "Data", "represent", "averages", "±", "SEM", ".", "n", "≥", "3", ".", "G", "Western", "blot", "analysis", "of", "PARP", "cleavage", "after", "STS", "treatment", "in", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "overexpressing", "Bax", ",", "Bax", "S184V", ",", "BakTBax", "or", "BakTBax", "S184V", ".", "Empty", "vector", "-", "transfected", "cells", "serve", "as", "control", "for", "PARP", "cleavage", "and", "actin", "is", "the", "loading", "control", ".", "n", "=", "3", ".", "H", "Plot", "of", "Bax", "(", "●", ")", "and", "Bak", "(", "○", ")", "retrotranslocation", "rates", "vs", ".", "hydrophobicity", "of", "the", "MA", "of", "the", "constructs", ".", "R2", "=", "0", ".", "95", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A FLIP of BaxTBakSS without (○, broken line) or with (●, straight line) overexpressed Bcl-xL. Fluorescence of a neighboring cell is shown as control (, dotted line). Data represent averages ± SEM from 20 (-Bcl-xL) and 16 (+Bcl-xL) ROI measurements.B Western blot analysis of PARP cleavage in HCT116 Bax/Bak DKO cells overexpressing Bax, Bax S184V, BaxTBak or BaxTBak V197/198S. The experiment was carried out in the absence of apoptotic stimuli. Cells transfected with pcDNA3.1 vector serve as control for PARP cleavage. Similar sample loading is controlled by actin. n = 4.C Colony formation of Bax/Bak DKO cells transfected with pcDNA, BaxTBak or BaxTBakSS with Bcl-xL overexpression in the absence of apoptotic stimuli. n = 3.D Caspase 3/7 activity was measured in HCT116 Bax/Bak DKO cells overexpressing Bax, Bax S184V, BaxTBak or BaxTBak V197/198S. Caspase activity is displayed in relative fluorescence units (RFU). The experiment was carried out in the absence of apoptotic stimuli and pcDNA3.1-transfected cells served as control. Data represent averages ± SEM. n = 4. p-values according to One Way ANOVA using the Holm-Sidak method are displayed.F STS-induced caspase 3/7 activity of HCT116 Bax/Bak DKO cells expressing Bax, Bax S184V, BakTBax or BakTBax S184V is displayed normalized to Bax activity. Data represent averages ± SEM. n ≥ 3.G Western blot analysis of PARP cleavage after STS treatment in HCT116 Bax/Bak DKO cells overexpressing Bax, Bax S184V, BakTBax or BakTBax S184V. Empty vector-transfected cells serve as control for PARP cleavage and actin is the loading control. n = 3.H Plot of Bax (●) and Bak (○) retrotranslocation rates vs. hydrophobicity of the MA of the constructs. R2 = 0.95."}
{"words": ["Figure", "7A", "Carbonate", "extraction", "of", "the", "HM", "protein", "fraction", "of", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "wild", "-", "type", "Bcl", "-", "xL", "in", "the", "presence", "or", "the", "absence", "of", "Bak", "or", "Bax", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Carbonate", "extractable", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "membrane", "-", "integral", "protein", "pellet", "(", "P", ")", "are", "displayed", ".", "Smac", "is", "released", "from", "the", "IMS", "during", "carbonate", "extraction", "and", "VDAC", "remains", "in", "the", "pellet", ".", "n", "=", "4", ".", "B", "Western", "blot", "analysis", "of", "Bcl", "-", "xLTBax", "carbonate", "extraction", "from", "the", "heavy", "membrane", "fraction", "from", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "the", "Bcl", "-", "xL", "variant", "with", "or", "without", "Bak", "or", "Bax", ".", "Smac", "and", "VDAC", "serve", "as", "controls", "for", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", ".", "n", "=", "4", ".", "C", "Carbonate", "extraction", "of", "the", "HM", "protein", "fraction", "of", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "Bcl", "-", "xL", "G138A", "with", "or", "without", "Bak", "or", "Bax", ".", "Smac", "and", "VDAC", "serve", "as", "controls", "for", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", ".", "n", "=", "4", ".", "D", "HM", "protein", "fraction", "and", "carbonate", "extraction", "of", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "Bax", ",", "BaxTBak", "or", "Bax", "S184V", ".", "Smac", "and", "VDAC", "serve", "as", "controls", "for", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", ".", "n", "=", "4", ".", "E", "Smac", "release", "from", "the", "heavy", "membrane", "fraction", "(", "HM", ")", "into", "the", "cytosol", "(", "C", ")", "in", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "overexpressing", "Bax", "and", "BaxTBak", "without", "apoptotic", "stimuli", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Bax", "and", "BaxTBak", "were", "expressed", "differentially", "to", "produce", "similar", "levels", "of", "mitochondrial", "Bax", ".", "GAPDH", "and", "Tom20", "serve", "as", "fractionation", "controls", ".", "n", "=", "3", ".", "F", "PARP", "cleavage", "in", "HCT116", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "cells", "expressing", "similar", "levels", "of", "mitochondrial", "Bax", "or", "BaxTBak", "analyzed", "by", "Western", "blot", "without", "apoptotic", "stimuli", ".", "Actin", "is", "used", "as", "loading", "control", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Carbonate extraction of the HM protein fraction of Bax/Bak DKO cells expressing wild-type Bcl-xL in the presence or the absence of Bak or Bax analyzed by Western blot. Carbonate extractable supernatant (S) and membrane-integral protein pellet (P) are displayed. Smac is released from the IMS during carbonate extraction and VDAC remains in the pellet. n = 4.B Western blot analysis of Bcl-xLTBax carbonate extraction from the heavy membrane fraction from Bax/Bak DKO cells expressing the Bcl-xL variant with or without Bak or Bax. Smac and VDAC serve as controls for supernatant (S) and pellet (P). n = 4.C Carbonate extraction of the HM protein fraction of Bax/Bak DKO cells expressing Bcl-xL G138A with or without Bak or Bax. Smac and VDAC serve as controls for supernatant (S) and pellet (P). n = 4.D HM protein fraction and carbonate extraction of Bax/Bak DKO cells expressing Bax, BaxTBak or Bax S184V. Smac and VDAC serve as controls for supernatant (S) and pellet (P). n = 4.E Smac release from the heavy membrane fraction (HM) into the cytosol (C) in HCT116 Bax/Bak DKO cells overexpressing Bax and BaxTBak without apoptotic stimuli analyzed by Western blot. Bax and BaxTBak were expressed differentially to produce similar levels of mitochondrial Bax. GAPDH and Tom20 serve as fractionation controls. n = 3.F PARP cleavage in HCT116 Bax/Bak DKO cells expressing similar levels of mitochondrial Bax or BaxTBak analyzed by Western blot without apoptotic stimuli. Actin is used as loading control. n = 3."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "NPM1", "expression", "in", "CD34", "+", "Lin", "-", "cells", "from", "myelodysplastic", "syndrome", "(", "MDS", ")", "patients", "compared", "to", "healthy", "volunteers", "(", "n", "=", "29", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "staining", "of", "NPM1", "protein", "levels", "in", "bone", "marrow", "samples", "of", "MDS", "or", "acute", "myeloid", "leukemia", "(", "AML", ")", "with", "multi", "-", "lineage", "dysplasia", "(", "MLD", ")", ".", "Insets", "show", "representative", "staining", "in", "blasts", "[", "B", "]", "and", "in", "differentiated", "myeloid", "cells", "[", "e", ".", "g", ".", ",", "neutrophil", ",", "M", "]", "with", "a", "high", "magnification", ".", "(", "C", ")", "Percentages", "of", "patient", "samples", "with", "NPM1", "-", "low", "and", "NPM1", "-", "normal", "in", "healthy", ",", "MDS", "and", "MLD", "in", "AML", "groups", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) NPM1 expression in CD34+Lin- cells from myelodysplastic syndrome (MDS) patients compared to healthy volunteers (n = 29).(B) Representative staining of NPM1 protein levels in bone marrow samples of MDS or acute myeloid leukemia (AML) with multi-lineage dysplasia (MLD). Insets show representative staining in blasts [B] and in differentiated myeloid cells [e.g., neutrophil, M] with a high magnification.(C) Percentages of patient samples with NPM1-low and NPM1-normal in healthy, MDS and MLD in AML groups."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Representative", "distribution", "of", "Tubulin", "and", "CDC42", "in", "Ctrl", ",", "4", "-", "months", "old", "Npm1", "cKO", "and", "2", "-", "years", "old", "WT", "HSCs", "determined", "by", "IF", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "(", "F", ")", "HSCs", "of", "Ctrl", ",", "4", "-", "months", "old", "Npm1", "cKO", "and", "2", "-", "years", "old", "WT", "mice", "were", "sorted", "and", "stained", "for", "TOM20", ".", "Representative", "images", "(", "top", ")", "and", "quantification", "of", "mitochondrial", "volume", "and", "number", "(", "bottom", ")", "in", "single", "cells", "(", "n", "=", "58", "cells", "in", "Ctrl", ",", "n", "=", "70", "cells", "in", "cKO", "and", "n", "=", "23", "cells", "in", "Old", ",", "from", "3", "mice", "per", "group", ")", ",", "identified", "by", "volume", "rendering", "of", "TOM20", ".", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "(", "J", ")", "Representative", "images", "(", "top", ")", "and", "quantification", "of", "mitochondrial", "volume", "and", "number", "(", "bottom", ")", ",", "identified", "by", "volume", "rendering", "of", "TOM20", ",", "in", "MDS", "-", "L", "cells", "transfected", "with", "siNPM1", "or", "control", "(", "siCTRL", ")", "(", "n", "=", "58", "cells", "per", "group", ",", "from", "3", "transfected", "MDS", "-", "L", "cultures", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Representative distribution of Tubulin and CDC42 in Ctrl, 4-months old Npm1 cKO and 2-years old WT HSCs determined by IF. Scale bars, 5 μm.(F ) HSCs of Ctrl, 4-months old Npm1 cKO and 2-years old WT mice were sorted and stained for TOM20. Representative images (top) and quantification of mitochondrial volume and number (bottom) in single cells (n = 58 cells in Ctrl, n = 70 cells in cKO and n = 23 cells in Old, from 3 mice per group), identified by volume rendering of TOM20. Scale bars, 2 μm.(J) Representative images (top) and quantification of mitochondrial volume and number (bottom), identified by volume rendering of TOM20, in MDS-L cells transfected with siNPM1 or control (siCTRL) (n = 58 cells per group, from 3 transfected MDS-L cultures). Scale bars, 2 μm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "F", ")", "Representative", "peripheral", "blood", "(", "PB", ")", "smears", ".", "Insets", "show", "the", "differentiated", "granulocytes", "(", "a", ",", "b", ")", "in", "control", "mice", ",", "and", "anisocytosis", "(", "c", ")", ",", "dysplastic", "myeloid", "cells", "(", "d", "-", "g", ")", "in", "Npm1", "cKO", "mice", "(", "Npm1F", "/", "FVav1Cre", "+", ")", ".", "Npm1", "cKO", "mice", "show", "dysplastic", "erythroid", "cells", "(", "polychromatophilic", ",", "blue", "arrowhead", ";", "schistocyte", ",", "blue", "-", "outlined", "arrowhead", ";", "tear", "drop", ",", "Howell", "-", "Jolly", "bodies", ",", "black", "arrowhead", ";", "black", "-", "outlined", "arrowhead", ")", ",", "dysplastic", "monocytes", "(", "black", "arrow", ")", ",", "and", "dysplastic", "neutrophils", "(", "d", "-", "f", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(F) Representative peripheral blood (PB) smears. Insets show the differentiated granulocytes (a, b) in control mice, and anisocytosis (c), dysplastic myeloid cells (d-g) in Npm1 cKO mice (Npm1F/FVav1Cre+). Npm1 cKO mice show dysplastic erythroid cells (polychromatophilic, blue arrowhead; schistocyte, blue-outlined arrowhead; tear drop, Howell-Jolly bodies, black arrowhead; black-outlined arrowhead), dysplastic monocytes (black arrow), and dysplastic neutrophils (d-f). Scale bars, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Npm1", "and", "p53", "protein", "levels", "in", "KSL", "cells", "of", "Ctrl", "(", "Npm1F", "/", "FVav1Cre", "-", ")", ",", "and", "cKO", "(", "Npm1F", "/", "FVav1Cre", "+", ")", "mice", ".", "(", "F", ")", "Representative", "PB", "smears", "of", "DKO", "mice", ".", "Insets", "show", "anisocytosis", "(", "a", ")", ",", "poikilocytosis", "(", "b", ")", "and", "dysplastic", "myeloid", "cell", "(", "c", ")", ".", "DKO", "mice", "show", "dysplastic", "erythroid", "cells", "(", "polychromatophilic", ",", "blue", "arrowhead", ")", ",", "Howell", "-", "Jolly", "bodies", ",", "(", "black", "arrowhead", "in", "insert", "a", ")", ",", "dysplastic", "monocytes", "(", "black", "arrow", ",", "and", "i", "-", "v", ")", ",", "dysplastic", "neutrophils", "(", "vi", ")", ",", "a", "pseudo", "-", "Pelger", "-", "Huet", "anomaly", "(", "ii", ")", ",", "and", "dysplastic", "platelets", "(", "giant", "platelet", ",", "iv", "and", "vii", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10μm", ".", "(", "I", ")", "Representative", "H", "&", "E", "staining", "of", "sections", "of", "the", "spleen", "of", "2", "-", "month", "-", "old", "DKO", "mice", "with", "myeloid", "disorders", ".", "Arrowheads", "(", "right", ")", "indicate", "the", "infiltrating", "myeloid", "blasts", ".", "Scale", "bars", ",", "250", "μm", "(", "left", ")", "and", "10μm", "(", "right", ")", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Npm1 and p53 protein levels in KSL cells of Ctrl (Npm1F/FVav1Cre-), and cKO (Npm1F/FVav1Cre+) mice.(F) Representative PB smears of DKO mice. Insets show anisocytosis (a), poikilocytosis (b) and dysplastic myeloid cell (c). DKO mice show dysplastic erythroid cells (polychromatophilic, blue arrowhead), Howell-Jolly bodies, (black arrowhead in insert a), dysplastic monocytes (black arrow, and i-v), dysplastic neutrophils (vi), a pseudo-Pelger-Huet anomaly (ii), and dysplastic platelets (giant platelet, iv and vii). Scale bars, 10μm.(I) Representative H&E staining of sections of the spleen of 2-month-old DKO mice with myeloid disorders. Arrowheads (right) indicate the infiltrating myeloid blasts. Scale bars, 250 μm (left) and 10μm (right), respectively."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "Live", "confocal", "imaging", "of", "liver", "stage", "P", ".", "berghei", "expressing", "UIS4", "‐", "mCherry", "and", "cytoplasmic", "GFP", "reveals", "different", "morphologies", "of", "the", "LS", "‐", "TVN", ":", "elongated", "membrane", "clusters", "(", "left", ")", ",", "vesicles", "in", "the", "host", "cell", "cytoplasm", "(", "center", ")", ",", "and", "a", "thin", "tubule", "protruding", "from", "the", "PVM", "(", "right", ")", ".", "Live", "imaging", "was", "performed", "20", " ", "h", "after", "infection", "of", "hepatoma", "cells", ".", "Features", "are", "marked", "with", "white", "arrowheads", ".", "B", ")", "The", "UIS4", "‐", "and", "IBIS1", "‐", "positive", "tubules", "rapidly", "extend", "from", "and", "retract", "to", "the", "PVM", ".", "Confocal", "time", "‐", "lapse", "imaging", "of", "a", "UIS4", "‐", "mCherry", "‐", "expressing", "parasite", "at", "22", " ", "h", "(", "top", ")", "and", "an", "IBIS1", "‐", "mCherry", "‐", "expressing", "parasite", "at", "26", " ", "h", "(", "bottom", ")", "after", "infection", "of", "hepatoma", "cells", ".", "Tubules", "are", "indicated", "with", "a", "yellow", "arrow", ",", "and", "the", "time", "is", "shown", "in", "minutes", "and", "seconds", ".", "C", ")", "Imaging", "of", "IBIS1", "‐", "mCherry", "‐", "expressing", "P", ".", "berghei", "reveals", "similar", "features", "of", "the", "LS", "‐", "TVN", ",", "i", ".", "e", ".", "elongated", "membrane", "cluster", "(", "left", ")", ",", "vesicles", "in", "the", "host", "cell", "cytoplasm", "(", "center", ")", ",", "and", "a", "membrane", "tubule", "(", "right", ")", ".", "Infected", "cells", "were", "fixed", "26", " ", "h", "post", "‐", "infection", "and", "imaged", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "Features", "are", "indicated", "with", "a", "yellow", "arrowhead", ".", "Scale", "bars", ",", "10", " ", "µm", ".", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "distinct", "UIS4", "‐", "and", "IBIS1", "‐", "positive", "membranous", "structures", "in", "fixed", "infected", "hepatoma", "cells", "at", "three", "different", "time", "points", ":", "6", " ", "h", "after", "infection", "(", "the", "period", "of", "sporozoite", "transformation", "into", "exo", "‐", "erythrocytic", "forms", ")", ",", "24", " ", "h", "after", "infection", "(", "onset", "of", "parasite", "replication", "and", "growth", ")", ",", "and", "48", " ", "h", "after", "infection", "(", "mature", "liver", "stages", ")", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "(", "±", " ", "SD", ")", "from", "three", "separate", "wells", "(", "n", " ", "=", " ", "100", "per", "well", ")", "of", "one", "experiment", "and", "are", "representative", "of", "two", "experimental", "repetitions", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) Live confocal imaging of liver stage P. berghei expressing UIS4‐mCherry and cytoplasmic GFP reveals different morphologies of the LS‐TVN: elongated membrane clusters (left), vesicles in the host cell cytoplasm (center), and a thin tubule protruding from the PVM (right). Live imaging was performed 20 h after infection of hepatoma cells. Features are marked with white arrowheads.B) The UIS4‐ and IBIS1‐positive tubules rapidly extend from and retract to the PVM. Confocal time‐lapse imaging of a UIS4‐mCherry‐expressing parasite at 22 h (top) and an IBIS1‐mCherry‐expressing parasite at 26 h (bottom) after infection of hepatoma cells. Tubules are indicated with a yellow arrow, and the time is shown in minutes and seconds.C) Imaging of IBIS1‐mCherry‐expressing P. berghei reveals similar features of the LS‐TVN, i.e. elongated membrane cluster (left), vesicles in the host cell cytoplasm (center), and a membrane tubule (right). Infected cells were fixed 26 h post‐infection and imaged by epifluorescence microscopy. Features are indicated with a yellow arrowhead. Scale bars, 10 µm.D) Quantification of the distinct UIS4‐ and IBIS1‐positive membranous structures in fixed infected hepatoma cells at three different time points: 6 h after infection (the period of sporozoite transformation into exo‐erythrocytic forms), 24 h after infection (onset of parasite replication and growth), and 48 h after infection (mature liver stages). Values are shown as mean (± SD) from three separate wells (n = 100 per well) of one experiment and are representative of two experimental repetitions."}
{"words": ["Figure", "2Hepatoma", "cells", "infected", "with", "Plasmodium", "berghei", "ANKA", "parasites", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "UIS4", "and", "anti", "-", "HSP70", "A", ")", "Some", "UIS4", "‐", "positive", "vesicles", "are", "tethered", "to", "the", "PVM", "as", "'", "beads", "‐", "ona", "‐", "string", "'", ".", "Infected", "cell", "fixed", "24", "h", "post", "‐", "infection", ".", "B", ")", "The", "UIS4", "‐", "mCherry", "features", "we", "detect", "in", "live", "imaging", "of", "UIS4", "‐", "mCherry", "‐", "expressing", "P", ".", "berghei", ",", "i", ".", "e", ".", "elongated", "membrane", "clusters", "(", "left", ")", ",", "vesicles", "(", "center", ")", "and", "tubules", "(", "right", ")", "are", "also", "apparent", "in", "fixed", "wildtype", "parasites", "stained", "with", "anti", "‐", "UIS4", "antibody", ".", "Infected", "cells", "24", "h", "post", "‐", "infection", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Hepatoma", "cells", "infected", "with", "Plasmodium", "berghei", "ANKA", "parasites", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "UIS4", ".", "C", ")", "Often", "the", "LS", "‐", "TVN", "is", "a", "composite", "of", "vesicles", ",", "tubules", "and", "membrane", "clusters", ".", "Infected", "cell", "22", "h", "post", "‐", "infection", ".", "D", ")", "The", "LS", "‐", "TVN", "detectable", "in", "primary", "hepatocytes", "infected", "with", "UIS4", "‐", "mCherry", "‐", "expressing", "P", ".", "berghei", "also", "consists", "of", "elongated", "membrane", "clusters", "(", "yellow", "arrowhead", ")", ",", "vesicles", "(", "white", "arrow", ")", "and", "tubules", "(", "yellow", "arrow", ")", ".", "Infected", "cell", "18", "h", "post", "‐", "infection", ".", "E", ")", "Dynamic", "tubules", "(", "yellow", "arrow", ")", "are", "detectable", "with", "UIS4", "‐", "mCherry", "in", "infected", "primary", "hepatocytes", "24", "h", "post", "‐", "infection", ".", "Location", "of", "parasite", "is", "marked", "with", "a", "yellow", "asterisk", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Hepatoma cells infected with Plasmodium berghei ANKA parasites were fixed and stained with anti-UIS4 and anti-HSP70 A) Some UIS4‐positive vesicles are tethered to the PVM as 'beads‐ona‐string'. Infected cell fixed 24 h post‐infection.B) The UIS4‐mCherry features we detect in live imaging of UIS4‐mCherry‐expressing P. berghei, i.e. elongated membrane clusters (left), vesicles (center) and tubules (right) are also apparent in fixed wildtype parasites stained with anti‐UIS4 antibody. Infected cells 24 h post‐infection. Scale bars, 10 µm.Hepatoma cells infected with Plasmodium berghei ANKA parasites were fixed and stained with anti-UIS4. C) Often the LS‐TVN is a composite of vesicles, tubules and membrane clusters. Infected cell 22 h post‐infection.D) The LS‐TVN detectable in primary hepatocytes infected with UIS4‐mCherry‐expressing P. berghei also consists of elongated membrane clusters (yellow arrowhead), vesicles (white arrow) and tubules (yellow arrow). Infected cell 18 h post‐infection.E) Dynamic tubules (yellow arrow) are detectable with UIS4‐mCherry in infected primary hepatocytes 24 h post‐infection. Location of parasite is marked with a yellow asterisk. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "show", "a", "tubule", "(", "upper", "panel", ")", "labeled", "with", "UIS4", "and", "IBIS1", "(", "white", "arrowheads", ")", ",", "an", "elongated", "membrane", "cluster", "(", "middle", "panel", ")", "in", "which", "both", "proteins", "are", "present", ",", "and", "vesicles", "(", "bottom", "panel", ")", "that", "are", "often", "labeled", "with", "both", "UIS4", "and", "IBIS1", "(", "yellow", "arrow", ")", "and", "frequently", "labeled", "with", "only", "one", "protein", "(", "yellow", "arrowheads", ")", ".", "B", ")", "Epifluorescence", "microscopy", "of", "IBIS1", "and", "UIS4", "reveals", "that", "while", "most", "tubules", "are", "labeled", "with", "both", "proteins", "as", "above", "(", "white", "arrowhead", ")", ",", "some", "are", "labeled", "exclusively", "with", "UIS4", "(", "upper", "panel", ")", "or", "IBIS1", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Single", "‐", "labeled", "tubules", "were", "highlighted", "with", "white", "arrows", "and", "their", "frequency", "in", "infected", "cells", "with", "tubules", "is", "indicated", "in", "percent", "(", "±", " ", "SD", ")", ",", "which", "was", "calculated", "from", "two", "separate", "wells", "30", " ", "h", "post", "‐", "infection", "(", "n", " ", ">", " ", "150", "infected", "cells", "per", "well", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Confocal microscopy images show a tubule (upper panel) labeled with UIS4 and IBIS1 (white arrowheads), an elongated membrane cluster (middle panel) in which both proteins are present, and vesicles (bottom panel) that are often labeled with both UIS4 and IBIS1 (yellow arrow) and frequently labeled with only one protein (yellow arrowheads).B) Epifluorescence microscopy of IBIS1 and UIS4 reveals that while most tubules are labeled with both proteins as above (white arrowhead), some are labeled exclusively with UIS4 (upper panel) or IBIS1 (bottom panel). Single‐labeled tubules were highlighted with white arrows and their frequency in infected cells with tubules is indicated in percent (± SD), which was calculated from two separate wells 30 h post‐infection (n > 150 infected cells per well)."}
{"words": ["Figure", "4A", "‐", "C", ")", "Time", "‐", "lapse", "imaging", "of", "hepatoma", "cells", "infected", "with", "UIS4", "‐", "mCherry", "‐", "expressing", "Plasmodium", "berghei", "was", "used", "to", "determine", "the", "velocities", "of", "the", "UIS4", "‐", "positive", "features", ",", "e", ".", "g", ".", ",", "a", "tubule", "(", "A", ")", ",", "elongated", "membrane", "cluster", "(", "B", ")", "and", "vesicle", "(", "C", ")", "were", "tracked", "over", "time", ".", "Measured", "speeds", "of", "the", "dynamic", "features", "indicated", "with", "white", "arrows", "are", "depicted", "graphically", "to", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "10", " ", "µm", ".", "D", ")", "The", "velocities", "of", "several", "UIS4", "‐", "or", "IBIS1", "‐", "positive", "features", "[", "tubules", "(", "left", ")", ",", "elongated", "membrane", "clusters", "(", "center", ")", "and", "vesicles", "(", "right", ")", "]", "were", "measured", "over", "time", ",", "and", "the", "peak", "velocity", "of", "each", "was", "plotted", ".", "Plotted", "data", "was", "derived", "from", "multiple", "imaged", "infected", "cells", ":", "For", "IBIS1", "‐", "positive", "tubules", "data", "is", "derived", "from", "three", "infected", "cells", "and", "for", "UIS4", "‐", "positive", "tubules", "from", "13", "infected", "cells", ".", "Elongated", "membrane", "cluster", "speeds", "were", "analyzed", "in", "at", "least", "five", "infected", "cells", "for", "both", "UIS4", "and", "IBIS1", ",", "and", "vesicle", "speeds", "were", "analyzed", "in", "at", "least", "12", "different", "cells", "for", "both", "protein", "markers", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A‐C) Time‐lapse imaging of hepatoma cells infected with UIS4‐mCherry‐expressing Plasmodium berghei was used to determine the velocities of the UIS4‐positive features, e.g., a tubule (A), elongated membrane cluster (B) and vesicle (C) were tracked over time. Measured speeds of the dynamic features indicated with white arrows are depicted graphically to the right. Scale bars, 10 µm.D) The velocities of several UIS4‐ or IBIS1‐positive features [tubules (left), elongated membrane clusters (center) and vesicles (right)] were measured over time, and the peak velocity of each was plotted. Plotted data was derived from multiple imaged infected cells: For IBIS1‐positive tubules data is derived from three infected cells and for UIS4‐positive tubules from 13 infected cells. Elongated membrane cluster speeds were analyzed in at least five infected cells for both UIS4 and IBIS1, and vesicle speeds were analyzed in at least 12 different cells for both protein markers."}
{"words": ["Figure", "5B", ")", "Cells", "infected", "with", "UIS4", "‐", "mCherry", "‐", "expressing", "parasites", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "1", ".", "5", " ", "h", "(", "top", ")", "or", "cytochalasin", "D", "for", "30", " ", "min", "(", "bottom", ")", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Imaging", "occurred", "29", "and", "24", " ", "h", "post", "‐", "infection", ",", "respectively", ".", "UIS4", "‐", "positive", "tubules", ",", "static", "(", "top", ")", "and", "dynamic", "(", "bottom", ")", ",", "are", "indicated", "with", "white", "arrowheads", ".", "Displayed", "cells", "are", "representative", "of", "five", "imaged", "parasites", "from", "at", "least", "two", "different", "experiments", ".", "B", ")", "Cells", "infected", "with", "UIS4", "‐", "mCherry", "‐", "expressing", "parasites", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "1", ".", "5", " ", "h", "(", "top", ")", "or", "cytochalasin", "D", "for", "30", " ", "min", "(", "bottom", ")", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Imaging", "occurred", "29", "and", "24", " ", "h", "post", "‐", "infection", ",", "respectively", ".", "UIS4", "‐", "positive", "tubules", ",", "static", "(", "top", ")", "and", "dynamic", "(", "bottom", ")", ",", "are", "indicated", "with", "white", "arrowheads", ".", "Displayed", "cells", "are", "representative", "of", "five", "imaged", "parasites", "from", "at", "least", "two", "different", "experiments", ".", "C", ")", "No", "colocalization", "between", "host", "microtubules", "and", "UIS4", "‐", "positive", "tubules", "is", "detectable", ".", "Infected", "cells", "were", "fixed", "25", " ", "h", "post", "‐", "infection", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "UIS4", "and", "Tubulin", ".", "Scale", "bars", ",", "10", " ", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B) Cells infected with UIS4‐mCherry‐expressing parasites were treated with nocodazole for 1.5 h (top) or cytochalasin D for 30 min (bottom) and imaged by confocal microscopy. Imaging occurred 29 and 24 h post‐infection, respectively. UIS4‐positive tubules, static (top) and dynamic (bottom), are indicated with white arrowheads. Displayed cells are representative of five imaged parasites from at least two different experiments.B) Cells infected with UIS4‐mCherry‐expressing parasites were treated with nocodazole for 1.5 h (top) or cytochalasin D for 30 min (bottom) and imaged by confocal microscopy. Imaging occurred 29 and 24 h post‐infection, respectively. UIS4‐positive tubules, static (top) and dynamic (bottom), are indicated with white arrowheads. Displayed cells are representative of five imaged parasites from at least two different experiments.C) No colocalization between host microtubules and UIS4‐positive tubules is detectable. Infected cells were fixed 25 h post‐infection and stained with antibodies against UIS4 and Tubulin. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "6A", "and", "B", ")", "The", "bleach", "was", "applied", "to", "elongated", "membrane", "clusters", "of", "the", "LS", "‐", "TVN", "approximately", "27", " ", "h", "post", "‐", "infection", ".", "The", "UIS4", "‐", "mCherry", "signal", "typically", "did", "not", "recover", "in", "the", "bleached", "area", "(", "A", ")", ",", "although", "it", "was", "found", "to", "recover", "in", "some", "elongated", "membrane", "clusters", "(", "B", ")", ".", "C", ")", "When", "the", "bleach", "was", "applied", "to", "the", "PVM", "at", "25", " ", "h", "post", "‐", "infection", ",", "the", "signal", "recovered", "rapidly", "in", "the", "bleached", "region", ".", "Upon", "the", "application", "of", "additional", "bleach", "pulses", "in", "the", "same", "area", ",", "the", "bleached", "area", "(", "region", "#", "1", "measured", "graphically", ")", "repeatedly", "recovered", ",", "and", "the", "remaining", "PVM", "‐", "associated", "UIS4", "‐", "mCherry", "signal", "depleted", "(", "region", "#", "2", ")", "although", "the", "LS", "‐", "TVN", "‐", "associated", "signal", "remained", "(", "region", "#", "3", ")", ".", "When", "a", "region", "of", "the", "LS", "‐", "TVN", "was", "subsequently", "bleached", "(", "yellow", "arrow", ",", "region", "#", "4", ")", ",", "no", "recovery", "was", "observed", ".", "The", "times", "are", "shown", "in", "minutes", "and", "seconds", ".", "Scale", "bars", ",", "10", " ", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A and B) The bleach was applied to elongated membrane clusters of the LS‐TVN approximately 27 h post‐infection. The UIS4‐mCherry signal typically did not recover in the bleached area (A), although it was found to recover in some elongated membrane clusters (B).C) When the bleach was applied to the PVM at 25 h post‐infection, the signal recovered rapidly in the bleached region. Upon the application of additional bleach pulses in the same area, the bleached area (region #1 measured graphically) repeatedly recovered, and the remaining PVM‐associated UIS4‐mCherry signal depleted (region #2) although the LS‐TVN‐associated signal remained (region #3). When a region of the LS‐TVN was subsequently bleached (yellow arrow, region #4), no recovery was observed. The times are shown in minutes and seconds. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "7A", "and", "B", ")", "A", "phase", "‐", "contrast", "image", "containing", "the", "infected", "cell", "of", "interest", "(", "A", ")", "was", "used", "for", "comparison", "to", "the", "EM", "grid", "after", "fixation", "and", "preparation", "of", "the", "cells", "for", "TEM", "(", "B", ")", ".", "Green", "outlining", "of", "the", "cells", "in", "the", "phase", "‐", "contrast", "image", "was", "used", "as", "a", "tool", "for", "comparison", "and", "alignment", ".", "The", "insets", "defined", "in", "white", "are", "shown", "in", "the", "right", "panels", "merged", "with", "the", "fluorescent", "image", "of", "the", "UIS4", "‐", "mCherry", "signal", "acquired", "immediately", "prior", "to", "fixation", ".", "Scale", "bars", ",", "10", " ", "µm", ".", "C", ")", "Detection", "of", "the", "UIS4", "‐", "mCherry", "signal", "by", "widefield", "fluorescence", "microscopy", "in", "the", "cell", "of", "interest", "immediately", "prior", "to", "fixation", ".", "The", "location", "of", "the", "parasite", "is", "marked", "with", "an", "asterisk", ",", "and", "UIS4", "‐", "positive", "features", "are", "highlighted", "with", "arrowheads", ".", "D", ")", "Thirty", "‐", "six", "TEM", "sections", "of", "this", "sample", "were", "prepared", "and", "imaged", "(", "Movies", "S4", "and", "S5", ")", ".", "Features", "corresponding", "to", "the", "UIS4", "‐", "positive", "tubule", "(", "white", "arrowhead", ")", "were", "found", "in", "sections", "10", "-", "16", "and", "to", "the", "UIS4", "‐", "positive", "signal", "adjacent", "to", "the", "PVM", "(", "yellow", "arrowhead", ")", "were", "found", "in", "Sections", "16", "-", "29", ".", "Sections", "11", "(", "top", ")", "and", "20", "(", "bottom", ")", "are", "displayed", "to", "highlight", "these", "two", "features", ".", "Scale", "bars", ",", "1", " ", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A and B) A phase‐contrast image containing the infected cell of interest (A) was used for comparison to the EM grid after fixation and preparation of the cells for TEM (B). Green outlining of the cells in the phase‐contrast image was used as a tool for comparison and alignment. The insets defined in white are shown in the right panels merged with the fluorescent image of the UIS4‐mCherry signal acquired immediately prior to fixation. Scale bars, 10 µm.C) Detection of the UIS4‐mCherry signal by widefield fluorescence microscopy in the cell of interest immediately prior to fixation. The location of the parasite is marked with an asterisk, and UIS4‐positive features are highlighted with arrowheads.D) Thirty‐six TEM sections of this sample were prepared and imaged (Movies S4 and S5). Features corresponding to the UIS4‐positive tubule (white arrowhead) were found in sections 10-16 and to the UIS4‐positive signal adjacent to the PVM (yellow arrowhead) were found in Sections 16-29. Sections 11 (top) and 20 (bottom) are displayed to highlight these two features. Scale bars, 1 µm."}
{"words": ["Figure", "8A", ")", "Hepatoma", "cells", "infected", "with", "UIS4", "−", "mCherry", "−", "expressing", "Plasmodium", "berghei", "parasites", "were", "fixed", "22", "h", "post", "−", "infection", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "host", "cell", "protein", "markers", "of", "distinct", "organelles", ":", "anti", "−", "EEA1", "to", "label", "early", "endosomes", ",", "anti", "−", "CD63", "and", "anti", "−", "LAMP1", "to", "label", "late", "endosomes", "and", "lysosomes", ",", "anti", "−", "Calnexin", "to", "label", "the", "endoplasmic", "reticulum", ",", "and", "anti", "−", "Golgin97", "to", "label", "the", "Golgi", ".", "In", "all", "samples", ",", "either", "anti", "−", "mCherry", "or", "anti", "−", "UIS4", "was", "used", "to", "amplify", "the", "UIS4", "−", "mCherry", "signal", ".", "Imaging", "was", "carried", "out", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "In", "the", "right", "panels", ",", "fluorescence", "is", "merged", ",", "and", "selected", "regions", "with", "areas", "of", "interest", "are", "shown", "enlarged", ".", "At", "least", "20", "infected", "cells", "possessing", "LS", "−", "TVN", "features", "were", "visually", "examined", "for", "each", "condition", ",", "and", "representative", "images", "of", "UIS4", "−", "positive", "elongated", "membrane", "clusters", "(", "left", ")", "and", "UIS4", "−", "positive", "tubules", "(", "right", ",", "and", "indicated", "with", "yellow", "arrows", ")", "are", "displayed", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "B", ")", "Profiling", "of", "the", "red", "(", "UIS4", ")", "and", "green", "(", "CD63", ",", "left", "or", "LAMP", "‐", "1", ",", "right", ")", "signals", "along", "the", "indicated", "line", "within", "the", "insets", "from", "the", "images", "in", "(", "A", ")", "above", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A) Hepatoma cells infected with UIS4−mCherry−expressing Plasmodium berghei parasites were fixed 22 h post−infection and stained with antibodies against host cell protein markers of distinct organelles: anti−EEA1 to label early endosomes, anti−CD63 and anti−LAMP1 to label late endosomes and lysosomes, anti−Calnexin to label the endoplasmic reticulum, and anti−Golgin97 to label the Golgi. In all samples, either anti−mCherry or anti−UIS4 was used to amplify the UIS4−mCherry signal. Imaging was carried out by epifluorescence microscopy. In the right panels, fluorescence is merged, and selected regions with areas of interest are shown enlarged. At least 20 infected cells possessing LS−TVN features were visually examined for each condition, and representative images of UIS4−positive elongated membrane clusters (left) and UIS4−positive tubules (right, and indicated with yellow arrows) are displayed. Scale bars, 10 µm.B) Profiling of the red (UIS4) and green (CD63, left or LAMP‐1, right) signals along the indicated line within the insets from the images in (A) above."}
{"words": ["Figure", "9LC3", "colocalizes", "with", "UIS4", "on", "the", "Plasmodium", "liver", "stage", "PVM", "and", "TVNHepatoma", "cells", "infected", "with", "Plasmodium", "berghei", "expressing", "UIS4", "‐", "mCherry", "(", "top", ")", "or", "IBIS1", "‐", "mCherry", "(", "bottom", ")", "were", "fixed", "22", " ", "h", "or", "48", " ", "h", "post", "‐", "infection", ",", "respectively", ",", "and", "stained", "with", "anti", "‐", "LC3", "to", "label", "autophagic", "membranes", ".", "In", "the", "right", "panels", ",", "fluorescence", "is", "merged", ",", "and", "selected", "areas", "of", "interest", "are", "shown", "enlarged", ".", "Scale", "bars", ",", "10", " ", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9LC3 colocalizes with UIS4 on the Plasmodium liver stage PVM and TVNHepatoma cells infected with Plasmodium berghei expressing UIS4‐mCherry (top) or IBIS1‐mCherry (bottom) were fixed 22 h or 48 h post‐infection, respectively, and stained with anti‐LC3 to label autophagic membranes. In the right panels, fluorescence is merged, and selected areas of interest are shown enlarged. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "2", "μg", "of", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "6", "hrs", "and", "then", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "3", ")", "for", "18", "hrs", "(", "Pre", "-", "treatment", ")", "or", "infected", "with", "ZIKV", "first", "for", "6", "hrs", "and", "then", "transfected", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "12", "hrs", "(", "Post", "-", "treatment", ")", ".", "Levels", "of", "ZIKVgenomic", "RNA", "were", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "error", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ",", "N", "=", "3B", ".", "A549", "cells", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "3", ")", "for", "6", "hrs", "were", "transfected", "with", "2", "μg", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "12", "hrs", "after", "which", "levels", "of", "ifn", "-", "C", ".", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "16", "hrs", "and", "then", "transfected", "with", "an", "IFIT1", "promoter", "-", "driven", "firefly", "luciferase", "plasmid", "(", "pGL3B", "/", "561", ")", "and", "a", "constitutively", "active", "renilla", "luciferase", "construct", "(", "pRL", "-", "TK", ")", ",", "as", "well", "as", "1", "μg", "of", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ".", "Eight", "hours", "later", "cell", "lysates", "were", "harvested", "and", "subjected", "to", "luciferase", "assay", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "of", "two", "independent", "experiments", ",", "N", "=", "2D", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "each", "of", "the", "10", "ZIKV", "proteins", ".", "Sixteen", "hours", "later", "they", "were", "transfected", "with", "an", "IFIT1", "promoter", "-", "driven", "firefly", "luciferase", "plasmid", "(", "pGL3B", "/", "561", ")", "and", "a", "constitutively", "active", "renilla", "luciferase", "construct", "(", "pRL", "-", "TK", ")", ",", "as", "well", "as", "1", "μg", "of", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ".", "Eight", "hours", "later", "cell", "lysates", "were", "harvested", "and", "subjected", "to", "luciferase", "assay", ".", "C", "=", "capsid", ";", "E", "=", "envelope", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "error", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ",", "N", "=", "4E", ".", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "16", "hrs", "and", "then", "transfected", "with", "the", "indicated", "promoter", "-", "driven", "firefly", "luciferase", "plasmids", "and", "a", "constitutively", "active", "renilla", "luciferase", "construct", "(", "pRL", "-", "TK", ")", ",", "as", "well", "as", "1", "μg", "of", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ".", "Eight", "hours", "later", "cell", "lysates", "were", "harvested", "and", "subjected", "to", "luciferase", "assay", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "of", "two", "independent", "experiments", ",", "N", "=", "2F", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "individual", "ZIKV", "proteins", ",", "the", "indicated", "promoter", "-", "driven", "firefly", "luciferase", "plasmids", "and", "a", "constitutively", "active", "renilla", "luciferase", "construct", "(", "pRL", "-", "TK", ")", ",", "as", "well", "as", "0", ".", "4", "μg", "of", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ".", "Twenty", "-", "four", "hours", "later", "cell", "lysates", "were", "harvested", "and", "subjected", "to", "luciferase", "assay", ".", "C", "=", "capsid", ";", "E", "=", "envelope", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "error", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ";", "N", "="], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. A549 cells were transfected with 2 μg of poly(I:C) for 6 hrs and then infected with ZIKV (MOI=3) for 18 hrs (Pre-treatment) or infected with ZIKV first for 6 hrs and then transfected with poly(I:C) for 12 hrs (Post-treatment). Levels of ZIKVgenomic RNA were determined by qRT-PCR. Values are expressed as mean ± standard error. ***P<0.001 (Student's t-test), N=3B. A549 cells infected with ZIKV (MOI=3) for 6 hrs were transfected with 2 μg poly(I:C) for 12 hrs after which levels of ifn-C. A549 cells were infected with ZIKV (MOI=5) for 16 hrs and then transfected with an IFIT1 promoter-driven firefly luciferase plasmid (pGL3B/561) and a constitutively active renilla luciferase construct (pRL-TK), as well as 1 μg of poly(I:C). Eight hours later cell lysates were harvested and subjected to luciferase assay. Values are expressed as mean of two independent experiments, N=2D. HEK293T cells were transfected with plasmids encoding each of the 10 ZIKV proteins. Sixteen hours later they were transfected with an IFIT1 promoter-driven firefly luciferase plasmid (pGL3B/561) and a constitutively active renilla luciferase construct (pRL-TK), as well as 1 μg of poly(I:C). Eight hours later cell lysates were harvested and subjected to luciferase assay. C = capsid; E = envelope. Values are expressed as mean ± standard error. *P<0.05, **P<0.01 (Student's t-test), N=4E. A549 cells were infected with ZIKV (MOI=5) for 16 hrs and then transfected with the indicated promoter-driven firefly luciferase plasmids and a constitutively active renilla luciferase construct (pRL-TK), as well as 1 μg of poly(I:C). Eight hours later cell lysates were harvested and subjected to luciferase assay. Values are expressed as mean of two independent experiments, N=2F. HEK293T cells were transfected with plasmids encoding individual ZIKV proteins, the indicated promoter-driven firefly luciferase plasmids and a constitutively active renilla luciferase construct (pRL-TK), as well as 0.4 μg of poly(I:C). Twenty-four hours later cell lysates were harvested and subjected to luciferase assay. C = capsid; E = envelope. Values are expressed as mean ± standard error. *P<0.05, **P<0.01 (Student's t-test); N=3"}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "A549", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "α", "(", "100", "U", "/", "mL", ")", ",", "IFN", "-", "λ", "(", "200", "ng", "/", "mL", ")", "or", "IFN", "-", "γ", "(", "10", "U", "/", "mL", ")", "for", "6", "hrs", "after", "which", "they", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "3", ")", "for", "18", "hrs", "(", "Pre", "-", "treatment", ")", ".", "Alternatively", ",", "cells", "were", "first", "infected", "with", "ZIKV", "for", "6", "hrs", "followed", "by", "treatment", "with", "IFN", "for", "12", "hrs", "(", "Post", "-", "treatment", ")", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "and", "levels", "of", "ZIKV", "genomic", "RNA", "were", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "error", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ";", "N", "=", "3B", ".", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "3", ")", "for", "6", "hrs", "prior", "to", "addition", "of", "IFN", "-", "α", "(", "100", "U", "/", "mL", ")", ",", "IFN", "-", "λ", "(", "200", "ng", "/", "mL", ")", "or", "IFN", "-", "γ", "(", "10", "U", "/", "mL", ")", "for", "12", "hrs", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "and", "levels", "of", "ifit1", "RNAs", "were", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "error", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ";", "N", "=", "3C", ".", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "6", "hrs", "and", "then", "transfected", "with", "ISRE", "-", "or", "GAS", "-", "promoter", "-", "driven", "firefly", "luciferase", "together", "with", "a", "constitutively", "active", "renilla", "luciferase", "construct", ".", "Sixteen", "hours", "later", ",", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "α", "(", "100", "U", "/", "ml", ")", "or", "IFN", "-", "α", "(", "10", "U", "/", "ml", ")", "for", "2", "hrs", ".", "Cells", "lysates", "were", "harvested", "and", "relative", "luciferase", "activity", "from", "ISRE", "-", "and", "GAS", "-", "promoters", "were", "determined", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "error", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ";", "N", "=", "3D", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "ZIKV", "protein", "expression", "constructs", "together", "with", "an", "ISRE", "promoter", "-", "driven", "firefly", "luciferase", "plasmid", "(", "pGL3B", "/", "561", ")", "and", "a", "constitutively", "active", "renilla", "luciferase", "construct", "(", "pRL", "-", "TK", ")", ".", "After", "24", "hrs", "they", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "α", "(", "100", "U", "/", "mL", ")", "for", "10", "hrs", ".", "Cell", "lysates", "were", "then", "harvested", "and", "subjected", "to", "luciferase", "assays", ".", "C", "=", "capsid", ";", "E", "=", "envelope", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "error", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ";", "N", "="], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. A549 cells were treated with IFN-α (100 U/mL), IFN-λ (200 ng/mL) or IFN-γ (10 U/mL) for 6 hrs after which they were infected with ZIKV (MOI=3) for 18 hrs (Pre-treatment). Alternatively, cells were first infected with ZIKV for 6 hrs followed by treatment with IFN for 12 hrs (Post-treatment). Total RNA was isolated and levels of ZIKV genomic RNA were determined by qRT-PCR. Values are expressed as mean ± standard error. *P<0.05, **P<0.01 (Student's t-test); N=3B. A549 cells were infected with ZIKV (MOI=3) for 6 hrs prior to addition of IFN-α (100 U/mL), IFN-λ (200 ng/mL) or IFN-γ (10 U/mL) for 12 hrs. Total RNA was isolated and levels of ifit1 RNAs were determined by qRT-PCR. Values are expressed as mean ± standard error. *P<0.05, **P<0.01 (Student's t-test); N=3C. A549 cells were infected with ZIKV (MOI=5) for 6 hrs and then transfected with ISRE- or GAS- promoter-driven firefly luciferase together with a constitutively active renilla luciferase construct. Sixteen hours later, cells were treated with IFN-α (100 U/ml) or IFN-α (10 U/ml) for 2 hrs. Cells lysates were harvested and relative luciferase activity from ISRE- and GAS-promoters were determined. Values are expressed as mean ± standard error. *P<0.05 (Student's t-test); N=3D. HEK293T cells were transfected with ZIKV protein expression constructs together with an ISRE promoter-driven firefly luciferase plasmid (pGL3B/561) and a constitutively active renilla luciferase construct (pRL-TK). After 24 hrs they were treated with IFN-α (100 U/mL) for 10 hrs. Cell lysates were then harvested and subjected to luciferase assays. C = capsid; E = envelope. Values are expressed as mean ± standard error. *P<0.05 (Student's t-test); N=3"}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "24", "-", "48", "hrs", "after", "which", "cell", "lysates", "were", "processed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", ".", "Representative", "panels", "are", "shown", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ".", "B", ".", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "24", "hrs", "and", "then", "treated", "with", "DMSO", ",", "MG132", "(", "20", "µM", ")", "or", "epoxomicin", "(", "Epox", ")", "(", "400", "nM", ")", "for", "12", "hrs", ".", "Cell", "lysates", "were", "processed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", ".", "Representative", "panels", "are", "shown", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ".", "C", ".", "A549", "cells", "(", "MOI", "=", "2", ")", "or", "Human", "primary", "fetal", "astrocytes", "(", "HFA", ")", "(", "MOI", "=", "5", ")", "were", "infected", "with", "ZIKV", "for", "24", "hrs", "and", "48", "hrs", "respectively", ",", "after", "which", "IFN", "-", "α", "(", "100", "U", "/", "mL", ")", "was", "added", "for", "2", "hrs", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", "and", "processed", "for", "indirect", "immunofluorescence", ".", "Images", "were", "acquired", "on", "a", "spinning", "disk", "confocal", "microscope", "with", "a", "40X", "objective", ".", "Dashed", "line", "white", "circles", "indicated", "ZIKV", "-", "infected", "cells", ".", "Representative", "panels", "are", "shown", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "two", "times", ".", "D", ".", "Mouse", "embryonic", "fibroblasts", "(", "MEF", ")", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "48", "hrs", "after", "which", "IFN", "-", "α", "(", "200", "U", "/", "mL", ")", "was", "added", "for", "2", "hrs", ".", "Samples", "were", "processed", "for", "immunofluorescence", "assay", "as", "described", "in", "panel", "C", ".", "Representative", "panels", "are", "shown", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "two", "times", ".", "E", ".", "STAT2", "levels", "in", "MEFs", "were", "decreased", "by", "transfection", "with", "siRNAs", "for", "48", "hrs", "after", "which", "the", "cells", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "another", "48", "hrs", ".", "The", "ZIKV", "replication", "was", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "E", ".", "STAT2", "levels", "in", "MEFs", "were", "decreased", "by", "transfection", "with", "siRNAs", "for", "48", "hrs", "after", "which", "the", "cells", "were", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "another", "48", "hrs", ".", "The", "silencing", "efficiency", "was", "determined", "by", "immunoblotting", ".", "Representative", "panels", "are", "shown", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. A549 cells were infected with ZIKV (MOI=5) for 24-48 hrs after which cell lysates were processed by SDS-PAGE and immunoblotting. Representative panels are shown. The experiment was repeated three times.B. A549 cells were infected with ZIKV (MOI=5) for 24 hrs and then treated with DMSO, MG132 (20 µM) or epoxomicin (Epox) (400 nM) for 12 hrs. Cell lysates were processed by SDS-PAGE and immunoblotting. Representative panels are shown. The experiment was repeated three times.C. A549 cells (MOI=2) or Human primary fetal astrocytes (HFA) (MOI=5) were infected with ZIKV for 24 hrs and 48 hrs respectively, after which IFN-α (100 U/mL) was added for 2 hrs. Cells were then fixed and processed for indirect immunofluorescence. Images were acquired on a spinning disk confocal microscope with a 40X objective. Dashed line white circles indicated ZIKV-infected cells. Representative panels are shown. The experiment was repeated two times.D. Mouse embryonic fibroblasts (MEF) were infected with ZIKV (MOI=5) for 48 hrs after which IFN-α (200 U/mL) was added for 2 hrs. Samples were processed for immunofluorescence assay as described in panel C. Representative panels are shown. The experiment was repeated two times.E. STAT2 levels in MEFs were decreased by transfection with siRNAs for 48 hrs after which the cells were infected with ZIKV (MOI=5) for another 48 hrs. The ZIKV replication was measured by qRT-PCR.E. STAT2 levels in MEFs were decreased by transfection with siRNAs for 48 hrs after which the cells were infected with ZIKV (MOI=5) for another 48 hrs. The silencing efficiency was determined by immunoblotting. Representative panels are shown. The experiment was repeated three times."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", "pcDNA", "3", ".", "1", "or", "plasmids", "encoding", "FLAG", "-", "tagged", "WT", "or", "mutant", "NS5", "proteins", ".", "At", "48", "hrs", "post", "-", "transfection", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "α", "(", "100", "U", "/", "mL", ")", "for", "2", "hrs", "and", "then", "processed", "for", "indirect", "immunofluorescence", ".", "Images", "were", "acquired", "on", "a", "spinning", "disk", "confocal", "microscope", "with", "a", "40X", "objective", ".", "NS5", "positive", "cells", "are", "indicated", "by", "dashed", "white", "circles", ".", "Representative", "panels", "are", "shown", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "nuclearSTAT2", "was", "performed", "using", "Volocity", "image", "analyses", "software", ".", "A", "minimum", "of", "20", "cells", "were", "counted", "for", "each", "sample", ".", "N", ".", "D", ".", "=", "not", "detected", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "error", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ";", "N", "=", "3C", ".", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "FLAG", "-", "tagged", "ZIKVNS5", "or", "FLAG", "alone", "for", "24", "hrs", "and", "then", "treated", "with", "epoxomicin", "(", "400", "nM", ")", "for", "24", "hrs", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "process", "for", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "using", "a", "mouse", "anti", "-", "FLAG", "or", "anti", "-", "myc", "antibody", "followed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "Immunoblotting", ".", "Representative", "panels", "are", "shown", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ".", "D", ".", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "FLAG", "-", "tagged", "WT", ",", "mutant", "NS5", "proteins", "or", "FLAG", "alone", "for", "48", "hrs", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "process", "for", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "using", "rabbit", "anti", "-", "STAT2", "followed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", ".", "Arrows", "indicate", "co", "-", "immunoprecipitated", "WT", "NS5", "and", "NS5", "mutants", "that", "are", "in", "a", "complex", "with", "STAT2", ".", "Representative", "panels", "are", "shown", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "two", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. A549 cells were transfected with control plasmid pcDNA 3.1 or plasmids encoding FLAG-tagged WT or mutant NS5 proteins. At 48 hrs post-transfection cells were treated with IFN-α (100 U/mL) for 2 hrs and then processed for indirect immunofluorescence. Images were acquired on a spinning disk confocal microscope with a 40X objective. NS5 positive cells are indicated by dashed white circles. Representative panels are shown. The experiment was repeated three times.B. Quantification of nuclearSTAT2 was performed using Volocity image analyses software. A minimum of 20 cells were counted for each sample. N.D.= not detected. Values are expressed as mean ± standard error. *P<0.05, **P<0.01 (Student's t-test); N=3C. A549 cells were transfected with plasmids encoding FLAG-tagged ZIKVNS5 or FLAG alone for 24 hrs and then treated with epoxomicin (400 nM) for 24 hrs. Cells were harvested and process for immunoprecipitation (IP) using a mouse anti-FLAG or anti-myc antibody followed by SDS-PAGE and Immunoblotting. Representative panels are shown. The experiment was repeated three times.D. A549 cells were transfected with plasmids encoding FLAG-tagged WT, mutant NS5 proteins or FLAG alone for 48 hrs. Cells were harvested and process for immunoprecipitation (IP) using rabbit anti-STAT2 followed by SDS-PAGE and immunoblotting. Arrows indicate co-immunoprecipitated WT NS5 and NS5 mutants that are in a complex with STAT2. Representative panels are shown. The experiment was repeated two times."}
{"words": ["Figure", "1ER", "Proliferation", "under", "UPR", "-", "Inducing", "Conditions", "(", "A", ")", "Determination", "of", "ER", "abundance", "in", "control", "and", "UPR", "-", "induced", "cells", ".", "Representative", "cells", "are", "shown", ".", "The", "UPR", "was", "induced", "in", "wild", "-", "type", "cells", "by", "addition", "of", "DTT", ".", "Ultrastructure", "of", "control", "cells", "and", "UPR", "-", "induced", "cells", "was", "analyzed", "using", "ImageJ", ".", "The", "lower", "images", "show", "traces", "of", "cortical", "ER", "(", "represented", "in", "magenta", ")", "and", "the", "nuclear", "envelope", "(", "NE", ",", "in", "blue", ")", ".", "Vacuoles", ",", "nuclei", ",", "and", "mitochondria", "are", "indicated", "as", "V", ",", "N", ",", "and", "M", ",", "respectively", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "ER", "proliferation", "during", "the", "UPR", ".", "UPR", "was", "induced", "and", "cells", "were", "collected", "for", "EM", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Length", "of", "the", "ER", "(", "as", "traced", "in", "[", "A", "]", ")", "was", "measured", "and", "divided", "by", "the", "area", "of", "the", "section", ".", "Data", "are", "plotted", "relative", "to", "time", "0", ".", "Measurements", "for", "each", "time", "point", "correspond", "to", "the", "mean", "of", "25", "independent", "cell", "images", ".", "(", "C", ")", "Expression", "of", "HAC1i", "was", "induced", "by", "addition", "of", "100", "μM", "DOC", "for", "3", "h", ".", "ER", "was", "quantified", "as", "described", "above", "in", "(", "B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1ER Proliferation under UPR-Inducing Conditions(A) Determination of ER abundance in control and UPR-induced cells. Representative cells are shown. The UPR was induced in wild-type cells by addition of DTT. Ultrastructure of control cells and UPR-induced cells was analyzed using ImageJ. The lower images show traces of cortical ER (represented in magenta) and the nuclear envelope (NE, in blue). Vacuoles, nuclei, and mitochondria are indicated as V, N, and M, respectively.(B) Quantification of the ER proliferation during the UPR. UPR was induced and cells were collected for EM at the indicated time points. Length of the ER (as traced in [A]) was measured and divided by the area of the section. Data are plotted relative to time 0. Measurements for each time point correspond to the mean of 25 independent cell images.(C) Expression of HAC1i was induced by addition of 100 μM DOC for 3 h. ER was quantified as described above in (B)."}
{"words": ["Figure", "2The", "ER", "Morphologically", "Changes", "during", "the", "UPR", "(", "A", ")", "Control", "cells", "and", "UPR", "-", "induced", "cells", "were", "used", "to", "analyze", "and", "follow", "the", "ER", "within", "a", "single", "cell", "using", "EM", ".", "Boxes", "indicate", "the", "areas", "magnified", "in", "(", "B", ")", ".", "Cells", "shown", "here", "correspond", "to", "the", "full", "section", "of", "the", "images", "labeled", "\"", "+", "140", "nm", "\"", "in", "(", "B", ")", ".", "(", "B", ")", "Serial", "section", "of", "control", "and", "UPR", "-", "induced", "cells", ".", "Sections", "are", "separated", "by", "70", "nm", "on", "the", "z", "-", "axis", ".", "ER", "is", "represented", "in", "magenta", "and", "NE", "in", "blue", ".", "(", "C", ")", "Electro", "micrographs", "from", "control", "and", "UPR", "-", "induced", "cells", "showing", "that", "the", "distance", "between", "ER", "membranes", "increases", "during", "the", "UPR", ".", "For", "a", "better", "preservation", "of", "the", "ultrastructure", ",", "samples", "for", "this", "experiment", "were", "prepared", "using", "high", "-", "pressure", "freezing", "/", "freeze", "substitution", "techniques", "(", "see", "Material", "and", "Methods", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The ER Morphologically Changes during the UPR(A) Control cells and UPR-induced cells were used to analyze and follow the ER within a single cell using EM. Boxes indicate the areas magnified in (B). Cells shown here correspond to the full section of the images labeled \"+140 nm\" in (B).(B) Serial section of control and UPR-induced cells. Sections are separated by 70 nm on the z-axis. ER is represented in magenta and NE in blue.(C) Electro micrographs from control and UPR-induced cells showing that the distance between ER membranes increases during the UPR. For a better preservation of the ultrastructure, samples for this experiment were prepared using high-pressure freezing/freeze substitution techniques (see Material and Methods)."}
{"words": ["Figure", "3Characterization", "of", "ER", "-", "Containing", "Autophagosomes", "(", "ERAs", ")", "during", "the", "UPR", "(", "A", ")", "Images", "of", "representative", "DTT", "-", "treated", "wild", "-", "type", "cells", "that", "contain", "ERAs", ".", "Nuclei", "and", "cytoplasm", "are", "indicated", "as", "N", "and", "C", ",", "respectively", ".", "(", "B", ")", "Enlargement", "of", "representative", "images", "of", "ERAs", "from", "different", "cells", ".", "The", "bottom", "right", "image", "is", "likely", "to", "show", "a", "section", "through", "a", "cup", "-", "shaped", "ERA", ".", "Note", "that", "there", "are", "no", "connections", "between", "the", "stacked", "cisternae", "and", "the", "envelope", ".", "(", "C", ")", "High", "magnification", "of", "the", "ERA", "double", "membrane", "envelope", ".", "(", "D", ")", "Some", "ERAs", "are", "found", "attached", "to", "or", "are", "in", "close", "proximity", "to", "ER", "tubules", "/", "sheets", "(", "indicated", "by", "the", "arrow", ")", ".", "Note", "that", "the", "section", "in", "(", "A", ")", "includes", "two", "such", "junctions", ".", "(", "E", ")", "High", "-", "pressure", "freezing", "/", "freeze", "substitution", "image", "of", "an", "ERA", "linked", "to", "an", "ER", "tubule", "/", "sheet", ".", "The", "osmium", "/", "lead", "staining", "used", "in", "this", "technique", "visualizes", "ribosomes", "and", "demonstrates", "that", "the", "outer", "ERA", "envelope", "membrane", ",", "but", "not", "the", "stacked", "internal", "cisternae", ",", "are", "tightly", "studded", "with", "ribosomes", ",", "indicating", "that", "they", "originate", "from", "ER", "membranes", ".", "(", "F", ")", "High", "-", "pressure", "freezing", "/", "freeze", "substitution", "image", "of", "an", "ER", "-", "ERA", "junction", "using", "an", "improved", "protocol", "to", "visualize", "membranes", ".", "(", "G", ")", "Using", "the", "same", "technique", "as", "in", "(", "F", ")", ",", "we", "visualized", "the", "internal", "membrane", "content", "of", "an", "ERA", ".", "Note", "that", "both", "portions", "of", "the", "internal", "membranes", "and", "of", "the", "sequestering", "double", "membrane", "envelope", "contain", "bound", "ribosomes", ",", "and", "hence", "are", "likely", "derived", "from", "the", "ER", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Characterization of ER-Containing Autophagosomes (ERAs) during the UPR(A) Images of representative DTT-treated wild-type cells that contain ERAs. Nuclei and cytoplasm are indicated as N and C, respectively.(B) Enlargement of representative images of ERAs from different cells. The bottom right image is likely to show a section through a cup-shaped ERA. Note that there are no connections between the stacked cisternae and the envelope.(C) High magnification of the ERA double membrane envelope.(D) Some ERAs are found attached to or are in close proximity to ER tubules/sheets (indicated by the arrow). Note that the section in (A) includes two such junctions.(E) High-pressure freezing/freeze substitution image of an ERA linked to an ER tubule/sheet. The osmium/lead staining used in this technique visualizes ribosomes and demonstrates that the outer ERA envelope membrane, but not the stacked internal cisternae, are tightly studded with ribosomes, indicating that they originate from ER membranes.(F) High-pressure freezing/freeze substitution image of an ER-ERA junction using an improved protocol to visualize membranes.(G) Using the same technique as in (F), we visualized the internal membrane content of an ERA. Note that both portions of the internal membranes and of the sequestering double membrane envelope contain bound ribosomes, and hence are likely derived from the ER."}
{"words": ["Figure", "4Fluorescence", "Visualization", "of", "an", "ER", "Marker", "after", "UPR", "Induction", "(", "A", ")", "Cells", "treated", "with", "the", "UPR", "-", "inducing", "drug", "DTT", "(", "+", "DTT", ")", "or", "with", "no", "drug", "were", "visualized", "using", "a", "fusion", "protein", "between", "the", "translocon", "component", "Sec61", "and", "the", "red", "-", "fluorescent", "protein", "\"", "cherry", ".", "\"", "Top", "panels", "show", "untreated", "cells", ",", "and", "bottom", "panels", "show", "representative", "UPR", "-", "induced", "cells", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "showing", "UPR", "-", "induced", "cells", "that", "contain", "ERAs", "(", "indicated", "by", "arrows", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Fluorescence Visualization of an ER Marker after UPR Induction(A) Cells treated with the UPR-inducing drug DTT (+DTT) or with no drug were visualized using a fusion protein between the translocon component Sec61 and the red-fluorescent protein \"cherry.\" Top panels show untreated cells, and bottom panels show representative UPR-induced cells.(B) Representative images showing UPR-induced cells that contain ERAs (indicated by arrows)."}
{"words": ["Figure", "5Immunogold", "Labeling", "of", "ERAs", "with", "an", "Antibody", "Directed", "against", "an", "ER", "Membrane", "Marker", "(", "A", ")", "Representative", "section", "of", "a", "cell", "immunolabeled", "against", "a", "myc", "-", "tagged", "Sec63", ",", "an", "integral", "ER", "membrane", "protein", ".", "As", "a", "primary", "antibody", ",", "we", "used", "a", "rabbit", "polyclonal", "anti", "-", "myc", "and", ",", "as", "a", "secondary", ",", "we", "used", "15", "-", "nm", "gold", "particles", "-", "conjugated", "anti", "-", "rabbit", "antibody", ".", "Nucleus", ",", "nuclear", "envelope", ",", "ER", ",", "and", "ERA", "are", "indicated", "as", "N", ",", "NE", ",", "ER", ",", "and", "ERA", ",", "respectively", ".", "(", "B", ")", "High", "magnification", "of", "an", "electron", "micrograph", "of", "a", "section", "of", "ER", ".", "Quantification", "showed", "that", "there", "are", "5", "±", "2", "gold", "particles", "per", "linear", "micrometer", "of", "ER", ".", "(", "C", ")", "High", "magnification", "of", "ERAs", ".", "To", "predict", "how", "many", "gold", "particles", "one", "should", "expect", "in", "a", "particular", "ERA", ",", "we", "first", "calculated", "and", "averaged", "the", "amount", "of", "ER", "(", "expressed", "as", "length", "in", "linear", "micrometers", ")", "present", "in", "an", "ERA", "(", "similar", "to", "the", "ones", "shown", "in", "Figure", "3B", ")", ",", "and", "normalized", "the", "value", "for", "its", "area", ".", "These", "calculations", "determined", "that", "there", "are", "20", ".", "8", "±", "3", ".", "3", "μm", "of", "ER", "per", "μm2", "inside", "the", "ERAs", ".", "These", "values", "allowed", "us", "to", "predict", "how", "many", "gold", "particles", "would", "be", "expected", "over", "a", "section", "of", "an", "ERA", "if", "it", "were", "packed", "with", "ER", "membranes", ".", "Two", "representative", "ERAs", "are", "shown", ".", "The", "ERA", "shown", "in", "the", "middle", "picture", "should", "hold", "2", ".", "4", "μm", "of", "ER", "inside", "and", ",", "therefore", ",", "should", "have", "12", "gold", "particles", ".", "We", "counted", "12", "gold", "particles", ".", "The", "ERA", "on", "the", "right", "could", "contain", "2", ".", "7", "μm", "of", "ER", "and", "should", "contain14", "gold", "particles", ";", "we", "counted", "16", "gold", "particles", ".", "The", "image", "on", "the", "right", "shows", "a", "representative", "view", "of", "a", "nucleoplasmic", "region", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "gold", "-", "labeling", "density", "per", "area", ".", "To", "assess", "the", "signal", "-", "to", "-", "noise", "ratio", "of", "our", "immunogold", "-", "labeling", "procedure", ",", "we", "assessed", "background", "labeling", "by", "counting", "the", "number", "of", "gold", "particles", "over", "an", "areas", "of", "nucleoplasm", "(", "N", ")", "and", "over", "ERAs", ",", "and", "normalized", "the", "counts", "to", "the", "respective", "areas", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Immunogold Labeling of ERAs with an Antibody Directed against an ER Membrane Marker(A) Representative section of a cell immunolabeled against a myc-tagged Sec63, an integral ER membrane protein. As a primary antibody, we used a rabbit polyclonal anti-myc and, as a secondary, we used 15-nm gold particles-conjugated anti-rabbit antibody. Nucleus, nuclear envelope, ER, and ERA are indicated as N, NE, ER, and ERA, respectively.(B) High magnification of an electron micrograph of a section of ER. Quantification showed that there are 5 ± 2 gold particles per linear micrometer of ER.(C) High magnification of ERAs. To predict how many gold particles one should expect in a particular ERA, we first calculated and averaged the amount of ER (expressed as length in linear micrometers) present in an ERA (similar to the ones shown in Figure 3B), and normalized the value for its area. These calculations determined that there are 20.8 ± 3.3 μm of ER per μm2 inside the ERAs. These values allowed us to predict how many gold particles would be expected over a section of an ERA if it were packed with ER membranes. Two representative ERAs are shown. The ERA shown in the middle picture should hold 2.4 μm of ER inside and, therefore, should have 12 gold particles. We counted 12 gold particles. The ERA on the right could contain 2.7 μm of ER and should contain14 gold particles; we counted 16 gold particles. The image on the right shows a representative view of a nucleoplasmic region.(D) Quantification of gold-labeling density per area. To assess the signal-to-noise ratio of our immunogold-labeling procedure, we assessed background labeling by counting the number of gold particles over an areas of nucleoplasm (N) and over ERAs, and normalized the counts to the respective areas."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Wild", "-", "type", "cells", "transformed", "with", "a", "plasmid", "containing", "GFP", "-", "Atg8", "were", "grown", "for", "4", "h", "in", "synthetic", "media", "with", "no", "drug", ",", "with", "UPR", "-", "inducing", "conditions", "(", "+", "DTT", "and", "+", "TM", ")", ",", "or", "under", "nitrogen", "starvation", "conditions", "(", "N", "starv", ")", ",", "and", "then", "harvested", "for", "protein", "preparation", ".", "Protein", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "antibodies", "against", "GFP", "(", "top", "panel", ")", "or", "Hac1", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Total", "protein", "concentration", "was", "measured", "by", "BCA", "protein", "assay", ".", "Same", "concentration", "of", "protein", "was", "loaded", "in", "each", "lane", ",", "and", "transfer", "efficiency", "was", "checked", "by", "Ponceau", "staining", ".", "The", "identities", "of", "the", "different", "bands", "are", "indicated", ".", "(", "B", ")", "Wild", "-", "type", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "grown", "under", "the", "conditions", "described", "above", "were", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "(", "C", ")", "GFP", "-", "Atg8", "was", "detected", "in", "extracts", "from", "untreated", "hac1Δ", "cells", "or", "cells", "expressing", "HAC1i", "(", "+", "DOC", ")", "by", "Western", "blotting", "using", "antibodies", "against", "GFP", ".", "(", "D", ")", "Western", "blot", "using", "antibodies", "against", "GFP", "of", "extracts", "from", "hac1Δ", ",", "ire1Δ", ",", "or", "vps4Δ", "pep4Δ", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", ".", "Mutant", "cells", "were", "grown", "under", "regular", "conditions", ",", "UPR", "-", "inducing", "conditions", "(", "+", "DTT", ")", ",", "or", "nitrogen", "starvation", "conditions", "(", "N", "starv", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Wild-type cells transformed with a plasmid containing GFP-Atg8 were grown for 4 h in synthetic media with no drug, with UPR-inducing conditions (+DTT and +TM), or under nitrogen starvation conditions (N starv), and then harvested for protein preparation. Protein extracts were analyzed by Western blotting using antibodies against GFP (top panel) or Hac1 (bottom panel). Total protein concentration was measured by BCA protein assay. Same concentration of protein was loaded in each lane, and transfer efficiency was checked by Ponceau staining. The identities of the different bands are indicated.(B) Wild-type cells expressing GFP-Atg8 grown under the conditions described above were visualized by fluorescence microscopy.(C) GFP-Atg8 was detected in extracts from untreated hac1Δ cells or cells expressing HAC1i (+DOC) by Western blotting using antibodies against GFP.(D) Western blot using antibodies against GFP of extracts from hac1Δ, ire1Δ, or vps4Δ pep4Δ cells expressing GFP-Atg8. Mutant cells were grown under regular conditions, UPR-inducing conditions (+DTT), or nitrogen starvation conditions (N starv)."}
{"words": ["Figure", "7Localization", "of", "GFP", "-", "Atg8", "during", "UPR", "InductionSome", "of", "the", "DTT", "-", "treated", "cells", "shown", "in", "Figure", "4B", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "and", "Sec61", "-", "cherry", "(", "as", "an", "ER", "marker", ")", "were", "visualized", "using", "fluorescence", "microscopy", ".", "GFP", "-", "Atg8", "localizes", "in", "close", "proximity", "to", "the", "ERAs", "detected", "by", "the", "ER", "marker", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Localization of GFP-Atg8 during UPR InductionSome of the DTT-treated cells shown in Figure 4B expressing GFP-Atg8 and Sec61-cherry (as an ER marker) were visualized using fluorescence microscopy. GFP-Atg8 localizes in close proximity to the ERAs detected by the ER marker."}
{"words": ["Figure", "8Atg8", "and", "Other", "ATG", "Genes", "Are", "Necessary", "during", "UPR", "InductionSerial", "dilutions", "for", "wild", "-", "type", ",", "hac1Δ", ",", "atg1Δ", ",", "atg8Δ", ",", "atg9Δ", ",", "atg16Δ", ",", "and", "atg20Δ", "deletion", "cells", "and", "vps4Δ", "pep4Δ", "double", "deletion", "cells", "were", "grown", "on", "rich", "-", "media", "plates", "with", "no", "drug", "(", "YPD", ")", "or", "with", "different", "concentrations", "of", "tunicamycin", "(", "TM", ";", "0", ".", "2", "or", "1", ".", "0", "μg", "/", "ml", ")", ".", "atg19Δ", "gave", "an", "identical", "result", "to", "the", "other", "autophagy", "genes", "shown", "here", "(", "unpublished", "data", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Atg8 and Other ATG Genes Are Necessary during UPR InductionSerial dilutions for wild-type, hac1Δ, atg1Δ, atg8Δ, atg9Δ, atg16Δ, and atg20Δ deletion cells and vps4Δ pep4Δ double deletion cells were grown on rich-media plates with no drug (YPD) or with different concentrations of tunicamycin (TM; 0.2 or 1.0 μg/ml). atg19Δ gave an identical result to the other autophagy genes shown here (unpublished data)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "The", "bar", "graph", "represents", "top", "10", "biological", "pathways", "upregulated", "in", "gene", "ontology", "(", "GO", ")", "based", "Reactome", "pathway", "analysis", "using", "a", "set", "of", "genes", "induced", "(", "1", ".", "5", "fold", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Wald", "Test", ")", ",", "3", "biological", "replicates", ")", "in", "RNA", "-", "seq", "analysis", "in", "IRGM", "shRNA", "knockdown", "HT29", "cells", "compared", "to", "control", "shRNA", "cells", ".", "Heatmaps", "were", "generated", "for", "sentinel", "interferon", "-", "regulated", "genes", "(", "three", "biological", "replicates", ")", "using", "'", "ComplexHeatmap", "'", "library", "using", "'", "R", "'", "Bioconductor", "package", "where", "the", "gene", "expression", "matrix", "was", "transformed", "into", "z", "-", "score", ".", "The", "heat", "map", "was", "generated", "from", "the", "common", "genes", "present", "in", "the", "three", "GO", "terms", "indicated", "by", "the", "three", "black", "lines", ".", "The", "numbers", "on", "the", "bars", "indicate", "the", "p", "-", "value", "of", "that", "particular", "GO", "term", ".", "(", "D", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "validation", "of", "RNA", "-", "seq", "data", "in", "control", "and", "IRGM", "KD", "HT29", "cells", ".", "(", "E", ")", "The", "bar", "graph", "represents", "the", "top", "pathways", "upregulated", "in", "GO", "-", "based", "Reactome", "pathway", "analysis", "using", "set", "of", "genes", "induced", "(", "1", ".", "5", "fold", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Wald", "Test", ")", ",", "3", "mice", "each", "group", ")", "in", "the", "brain", "of", "Irgm1", "-", "/", "-", "mice", "compared", "to", "Irgm1", "+", "/", "+", "wild", "type", "mice", ".", "Heatmaps", "were", "generated", "for", "sentinel", "interferon", "-", "regulated", "genes", "(", "three", "biological", "replicates", ")", "using", "'", "ComplexHeatmap", "'", "library", "using", "'", "R", "'", "Bioconductor", "package", "where", "the", "gene", "expression", "matrix", "was", "transformed", "into", "z", "-", "score", ".", "The", "heat", "map", "was", "generated", "from", "the", "common", "genes", "present", "in", "the", "three", "GO", "terms", "indicated", "by", "the", "three", "black", "lines", ".", "The", "numbers", "on", "the", "bars", "indicate", "the", "p", "-", "value", "of", "that", "particular", "GO", "term", ".", "(", "H", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "validation", "of", "RNA", "-", "seq", "data", "in", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "brain", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) The bar graph represents top 10 biological pathways upregulated in gene ontology (GO) based Reactome pathway analysis using a set of genes induced (1.5 fold, p<0.05 (Wald Test), 3 biological replicates) in RNA-seq analysis in IRGM shRNA knockdown HT29 cells compared to control shRNA cells. Heatmaps were generated for sentinel interferon-regulated genes (three biological replicates) using 'ComplexHeatmap' library using 'R' Bioconductor package where the gene expression matrix was transformed into z-score. The heat map was generated from the common genes present in the three GO terms indicated by the three black lines. The numbers on the bars indicate the p-value of that particular GO term.(D) The qRT-PCR validation of RNA- seq data in control and IRGM KD HT29 cells.(E) The bar graph represents the top pathways upregulated in GO-based Reactome pathway analysis using set of genes induced (1.5 fold, p<0.05 (Wald Test), 3 mice each group) in the brain of Irgm1-/- mice compared to Irgm1+/+ wild type mice. Heatmaps were generated for sentinel interferon-regulated genes (three biological replicates) using 'ComplexHeatmap' library using 'R' Bioconductor package where the gene expression matrix was transformed into z-score. The heat map was generated from the common genes present in the three GO terms indicated by the three black lines. The numbers on the bars indicate the p-value of that particular GO term.(H) The qRT-PCR validation of RNA- seq data in Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse brain."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Heat", "map", "of", "nucleic", "acid", "sensor", "proteins", "upregulated", "in", "IRGM", "KD", "HT29", "cells", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "brain", "and", "BMDMs", ".", "Western", "blot", "analysis", "to", "determine", "levels", "of", "nucleic", "acid", "sensor", "proteins", "with", "lysates", "of", "(", "B", ")", "HT29", "control", "(", "henceforth", "IRGM", "+", "/", "+", ")", "and", "single", "allele", "CRISPR", "knockout", "IRGM", "cells", "(", "henceforth", "IRGM", "+", "/", "-", ")", ",", "Western", "blot", "analysis", "to", "determine", "levels", "of", "nucleic", "acid", "sensor", "proteins", "with", "lysates", "of", "(", "C", ")", "HT29", "cells", "stably", "expressing", "control", "shRNA", "or", "IRGM", "shRNA", ",", "Western", "blot", "analysis", "to", "determine", "levels", "of", "nucleic", "acid", "sensor", "proteins", "with", "lysates", "of", "(", "D", ")", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "brain", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "(", "E", ")", "Western", "blot", "analysis", "to", "determine", "levels", "of", "adaptor", "proteins", "in", "control", "and", "IRGM", "+", "/", "-", "HT29", "cells", ".", "(", "F", ")", "SDD", "-", "AGE", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "with", "a", "mitochondrial", "fraction", "from", "control", "and", "IRGM", "siRNA", "knockdown", "THP1", "cells", ".", "Western", "blot", "analysis", "with", "cytoplasmic", "fraction", "was", "also", "performed", ".", "Western", "blot", "analysis", "performed", "with", "lysates", "of", "(", "G", ")", "control", "and", "stable", "IRGM", "shRNA", "knockdown", "HT29", "cells", "(", "H", ")", "IRGM", "+", "/", "+", "and", "IRGM", "+", "/", "-", "HT29", "cellsWestern", "blot", "analysis", "performed", "with", "lysates", "of", "(", "I", ")", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "brain", "to", "determine", "levels", "of", "TBK1", "protein", ".", "Western", "blot", "analysis", "performed", "with", "lysates", "of", "(", "J", ")", "IRGM", "+", "/", "+", "and", "IRGM", "+", "/", "-", "HT29", "cellsWestern", "blot", "analysis", "performed", "with", "lysates", "of", "(", "K", "-", "L", ")", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "brain", "to", "determine", "levels", "of", "IRF", "proteins", ".", "Western", "blot", "analysis", "performed", "with", "lysates", "of", "(", "M", ")", "IRGM", "+", "/", "+", "and", "IRGM", "+", "/", "-", "HT29", "cellsWestern", "blot", "analysis", "performed", "with", "lysates", "of", "(", "N", ")", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "brain", "to", "determine", "levels", "of", "STAT", "proteins", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "performed", "with", "lysates", "of", "(", "O", ")", "IRGM", "+", "/", "+", "and", "IRGM", "+", "/", "-", "HT29", "cells", ".", "2", "biological", "replicates", "are", "shown", ".", "Western", "blot", "analysis", "performed", "with", "lysates", "of", "(", "P", ")", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "brain", "to", "determine", "levels", "of", "ISG", "proteins", "(", "n", "=", "2", "mice", ")", ".", "(", "Q", ")", "Representative", "confocal", "image", "of", "immunofluorescence", "assay", "performed", "with", "IRGM", "+", "/", "+", "and", "IRGM", "+", "/", "-", "HT29", "cells", "stained", "with", "MX1", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Heat map of nucleic acid sensor proteins upregulated in IRGM KD HT29 cells and Irgm1-/- mouse brain and BMDMs.Western blot analysis to determine levels of nucleic acid sensor proteins with lysates of (B) HT29 control (henceforth IRGM+/+) and single allele CRISPR knockout IRGM cells (henceforth IRGM+/-),Western blot analysis to determine levels of nucleic acid sensor proteins with lysates of (C) HT29 cells stably expressing control shRNA or IRGM shRNA,Western blot analysis to determine levels of nucleic acid sensor proteins with lysates of (D) Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse brain (n=3 mice).(E) Western blot analysis to determine levels of adaptor proteins in control and IRGM+/- HT29 cells.(F) SDD-AGE followed by western blot analysis with a mitochondrial fraction from control and IRGM siRNA knockdown THP1 cells. Western blot analysis with cytoplasmic fraction was also performed.Western blot analysis performed with lysates of (G) control and stable IRGM shRNA knockdown HT29 cells (H) IRGM+/+ and IRGM+/- HT29 cellsWestern blot analysis performed with lysates of (I) Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse brain to determine levels of TBK1 protein.Western blot analysis performed with lysates of (J) IRGM+/+ and IRGM+/- HT29 cellsWestern blot analysis performed with lysates of (K-L) Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse brain to determine levels of IRF proteins.Western blot analysis performed with lysates of (M) IRGM+/+ and IRGM+/- HT29 cellsWestern blot analysis performed with lysates of (N) Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse brain to determine levels of STAT proteins (n=3 mice).Western blot analysis performed with lysates of (O) IRGM+/+ and IRGM+/- HT29 cells. 2 biological replicates are shown.Western blot analysis performed with lysates of (P) Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse brain to determine levels of ISG proteins (n=2 mice).(Q) Representative confocal image of immunofluorescence assay performed with IRGM+/+ and IRGM+/- HT29 cells stained with MX1 antibodies. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "endogenous", "IRGM", "and", "endogenous", "RIG", "-", "I", ",", "cGAS", ",", "MDA5", ",", "TLR3", ",", "TLR4", ",", "TLR7", ",", "NLRC4", ",", "and", "AIM2", "in", "THP", "-", "1", "cell", "lysates", ".", "IgG", "(", "H", ")", ",", "IgG", "heavy", "chain", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "(", "B", ")", "GFP", "-", "IRGM", "and", "Flag", "-", "RIG", "-", "I", ",", "(", "C", ")", "GFP", "-", "IRGM", ",", "and", "Flag", "-", "cGAS", ",", "(", "D", ")", "GFP", "-", "IRGM", "and", "Flag", "-", "TLR3", "in", "HEK293T", "cell", "lysates", ".", "L", ".", "E", ",", "Long", "exposure", "of", "input", "blot", ".", "IgG", "(", "L", ")", ",", "IgG", "Light", "chain", ";", "IgG", "(", "H", ")", ",", "IgG", "heavy", "chain", ".", "(", "E", ")", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "of", "in", "-", "vitro", "translated", "and", "radiolabelled", "myc", "-", "tagged", "cGAS", ",", "RIG", "-", "I", ",", "and", "TLR3", "with", "GST", "or", "GST", "-", "tagged", "IRGM", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "with", "the", "lysates", "of", "HT", "-", "29", "cells", "stably", "transfected", "with", "control", "or", "Flag", "-", "IRGM", "plasmid", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "Western", "blot", "analysis", "with", "lysates", "of", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "GFP", "or", "GFP", "-", "IRGM", "and", "(", "G", ")", "Flag", "-", "RIG", "-", "I", "or", "(", "H", ")", "Flag", "-", "cGAS", "or", "(", "I", ")", "or", "Flag", "-", "TLR3", ".", "(", "J", "-", "K", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "RNA", "isolated", "from", "(", "J", ")", "control", "and", "Flag", "-", "IRGM", "stable", "HT", "-", "29", "cells", "(", "K", ")", "THP", "-", "1", "cells", "transiently", "transfected", "with", "control", "or", "Flag", "-", "IRGM", "plasmid", ".", "Luciferase", "reporter", "assays", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "ISRE", "reporter", "plasmid", "and", "other", "plasmids", "as", "indicated", ".", "Luciferase", "reporter", "assays", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "ISRE", "reporter", "plasmid", "and", "other", "plasmids", "as", "indicated", ".", "Luciferase", "reporter", "assays", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "ISRE", "reporter", "plasmid", "and", "other", "plasmids", "as", "indicated", ".", "(", "O", ")", "Western", "blotting", "analysis", "with", "lysates", "of", "control", "and", "untreated", "or", "Bafilomycin", "A1", "(", "300", "nM", ";", "4", "h", "and", "8", "h", ")", "treated", "Flag", "-", "IRGM", "expressing", "HT29", "stable", "cell", "lines", ".", "(", "P", ")", "Western", "blotting", "analysis", "with", "lysates", "of", "control", "and", "untreated", "or", "chloroquine", "(", "50", "µM", ";", "4", "h", "and", "8", "h", ")", "treated", "Flag", "-", "IRGM", "expressing", "HT29", "stable", "cell", "lines", ".", "(", "Q", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "RNA", "isolated", "from", "untreated", "or", "Bafilomycin", "A1", "(", "300", "nM", ";", "4", "h", ",", "8", "h", ",", "and", "12", "h", ")", "treated", "control", "or", "Flag", "-", "IRGM", "expressing", "HT", "-", "29", "stable", "cells", "as", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunoprecipitation (IP) analysis of the interaction between endogenous IRGM and endogenous RIG-I, cGAS, MDA5, TLR3, TLR4, TLR7, NLRC4, and AIM2 in THP-1 cell lysates. IgG (H), IgG heavy chain.(B-D) Co-immunoprecipitation (Co-IP) analysis of the interaction between (B) GFP-IRGM and Flag-RIG-I, (C) GFP-IRGM, and Flag-cGAS, (D) GFP-IRGM and Flag-TLR3 in HEK293T cell lysates. L.E, Long exposure of input blot. IgG (L), IgG Light chain; IgG (H), IgG heavy chain.(E) GST pull-down assay of in-vitro translated and radiolabelled myc-tagged cGAS, RIG-I, and TLR3 with GST or GST-tagged IRGM.(F) Western blot analysis with the lysates of HT-29 cells stably transfected with control or Flag-IRGM plasmid and probed with the indicated antibodies.(G-I) Western blot analysis with lysates of HEK293T cells transiently expressing GFP or GFP-IRGM and (G) Flag-RIG-I or (H) Flag-cGAS or (I) or Flag-TLR3.(J-K) The qRT-PCR analysis with RNA isolated from (J) control and Flag-IRGM stable HT-29 cells (K) THP-1 cells transiently transfected with control or Flag-IRGM plasmid.Luciferase reporter assays in HEK293T cells transiently transfected with ISRE reporter plasmid and other plasmids as indicated.Luciferase reporter assays in HEK293T cells transiently transfected with ISRE reporter plasmid and other plasmids as indicated.Luciferase reporter assays in HEK293T cells transiently transfected with ISRE reporter plasmid and other plasmids as indicated.(O) Western blotting analysis with lysates of control and untreated or Bafilomycin A1 (300 nM; 4 h and 8 h) treated Flag-IRGM expressing HT29 stable cell lines.(P) Western blotting analysis with lysates of control and untreated or chloroquine (50 µM; 4 h and 8 h) treated Flag-IRGM expressing HT29 stable cell lines.(Q) The qRT-PCR analysis with RNA isolated from untreated or Bafilomycin A1 (300 nM; 4 h, 8 h, and 12 h) treated control or Flag-IRGM expressing HT-29 stable cells as indicated."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "cell", "lysates", "of", "control", "or", "BECLIN1", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "expressing", "GFP", "or", "GFP", "-", "IRGM", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "The", "cell", "lysates", "of", "control", "or", "ATG5", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "expressing", "GFP", "or", "GFP", "-", "IRGM", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "RNA", "isolated", "from", "control", "or", "BECLIN1", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "expressing", "3X", "-", "Flag", "epitope", "or", "Flag", "-", "IRGM", "as", "indicated", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "RNA", "isolated", "from", "control", "or", "ATG5", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "expressing", "3X", "-", "Flag", "epitope", "or", "Flag", "-", "IRGM", "as", "indicated", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "RNA", "isolated", "from", "control", "or", "ATG5", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "expressing", "3X", "-", "Flag", "epitope", "or", "Flag", "-", "IRGM", "as", "indicated", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "RNA", "isolated", "from", "control", "or", "p62", "siRNA", "or", "BECLIN1", "siRNA", "transfected", "HT29", "cells", "expressing", "3X", "-", "Flag", "epitope", "or", "Flag", "-", "IRGM", "as", "indicated", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "GFP", "IRGM", "with", "(", "I", ")", "Flag", "-", "p62", "or", "Flag", "-", "NDP52", "or", "Flag", "-", "NBR1", "in", "HEK293T", "cell", "lysates", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "GFP", "IRGM", "with", "(", "J", ")", "Flag", "-", "Optineurin", "or", "Flag", "-", "TAX1BP1", "in", "HEK293T", "cell", "lysates", ".", "(", "K", "-", "M", ")", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "GFP", "IRGM", "with", "(", "K", ")", "Flag", "-", "cGAS", ",", "(", "L", ")", "Flag", "-", "RIG", "-", "I", ",", "(", "M", ")", "Flag", "-", "TLR3", "in", "control", "siRNA", "or", "p62", "siRNA", "transfected", "HEK293T", "cell", "lysates", ".", "(", "N", ")", "The", "cell", "lysates", "of", "control", "or", "p62", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "expressing", "GFP", "or", "GFP", "-", "IRGM", "(", "as", "indicate", ")", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "(", "O", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "RNA", "isolated", "from", "control", "or", "p62", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "expressing", "3X", "-", "Flag", "epitope", "or", "Flag", "-", "IRGM", "as", "indicated", ".", "(", "P", "-", "R", ")", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "HA", "-", "p62", "and", "(", "P", ")", "Flag", "-", "RIG", "-", "I", ",", "(", "Q", ")", "Flag", "-", "TLR3", ",", "(", "R", ")", "Flag", "-", "cGAS", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "GFP", "or", "GFP", "-", "IRGM", "in", "HEK293T", "cell", "lysates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The cell lysates of control or BECLIN1 siRNA transfected THP-1 cells expressing GFP or GFP-IRGM were subjected to immunoblotting with indicated antibodies.(B) The cell lysates of control or ATG5 siRNA transfected THP-1 cells expressing GFP or GFP-IRGM were subjected to immunoblotting with indicated antibodies.(C-D) qRT-PCR analysis with RNA isolated from control or BECLIN1 siRNA transfected THP-1 cells expressing 3X-Flag epitope or Flag-IRGM as indicated.qRT-PCR analysis with RNA isolated from control or ATG5 siRNA transfected THP-1 cells expressing 3X-Flag epitope or Flag-IRGM as indicated.qRT-PCR analysis with RNA isolated from control or ATG5 siRNA transfected THP-1 cells expressing 3X-Flag epitope or Flag-IRGM as indicated.(G-H) qRT-PCR analysis with RNA isolated from control or p62 siRNA or BECLIN1 siRNA transfected HT29 cells expressing 3X-Flag epitope or Flag-IRGM as indicated.Co-IP analysis of the interaction between GFP IRGM with (I) Flag-p62 or Flag-NDP52 or Flag-NBR1 in HEK293T cell lysates.Co-IP analysis of the interaction between GFP IRGM with (J) Flag-Optineurin or Flag-TAX1BP1 in HEK293T cell lysates.(K-M) Co-IP analysis of the interaction between GFP IRGM with (K) Flag-cGAS, (L) Flag-RIG-I, (M) Flag-TLR3 in control siRNA or p62 siRNA transfected HEK293T cell lysates.(N) The cell lysates of control or p62 siRNA transfected THP-1 cells expressing GFP or GFP- IRGM (as indicate) were subjected to immunoblotting with indicated antibodies.(O) The qRT-PCR analysis with RNA isolated from control or p62 transfected THP-1 cells expressing 3X-Flag epitope or Flag-IRGM as indicated.(P-R) Co-IP analysis of the interaction between HA-p62 and (P) Flag-RIG-I, (Q) Flag-TLR3, (R) Flag-cGAS in the absence and presence of GFP or GFP-IRGM in HEK293T cell lysates."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "Tom20", "antibody", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Zoom", "panels", "are", "digital", "magnifications", ".", "(", "B", ")", "The", "graph", "depicts", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "swollen", "/", "rounded", "mitochondria", "in", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", ".", "(", "C", ")", "Representative", "confocal", "(", "STED", ")", "images", "of", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "Tom20", "and", "Parkin", "antibodies", ".", "Line", "profile", ":", "Co", "-", "localization", "analysis", "using", "line", "intensity", "profiles", ".", "(", "D", ")", "Representative", "confocal", "(", "STED", ")", "images", "of", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "Tom20", "and", "Pink1", "antibodies", ".", "Line", "profile", ":", "Co", "-", "localization", "analysis", "using", "line", "intensity", "profiles", ".", "(", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "control", "siRNA", "and", "IRGM", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "Ubiquitin", "(", "green", ")", "and", "TOM20", "(", "red", ")", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "mitochondrial", "fraction", "of", "control", "siRNA", "and", "IRGM", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", ",", "probed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "(", "G", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "mitochondrial", "fraction", "of", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDM", "cells", ",", "probed", "with", "indicated", "antibodies", "(", "n", "=", "2", "mice", ")", ".", "(", "H", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "mitochondrial", "fraction", "of", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDM", "cells", "untreated", "or", "treated", "with", "Bafilomycin", "A1", "(", "300", "nM", ",", "3", "h", ")", ",", "probed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "(", "I", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "mitochondrial", "fraction", "of", "control", "siRNA", "and", "IRGM", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "untreated", "or", "treated", "with", "Bafilomycin", "A1", "(", "300", "nM", ",", "3", "h", ")", ",", "probed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "(", "J", ")", "Seahorse", "XF", "Cell", "Mito", "stress", "test", "for", "analysis", "of", "mitochondrial", "function", "in", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDM", "cells", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "using", "the", "XF24", "extracellular", "flux", "analyzer", ",", "and", "the", "flow", "chart", "showed", "the", "measurement", "of", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "(", "K", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "control", "and", "IRGM", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "stained", "with", "CMXRos", "red", "dye", ".", "(", "L", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "control", "siRNA", "and", "IRGM", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "stained", "with", "CMXRos", "red", "dye", "(", "10", "nM", ",", "30", "mins", ")", ".", "(", "M", ")", "Graph", "depicts", "the", "normalized", "mean", "fluorescent", "intensity", "of", "control", "and", "IRGM", "knockdown", "THP", "-", "1", "cells", "stained", "with", "CMXRos", ".", "(", "N", ")", "Representative", "dot", "plot", "showing", "flow", "cytometry", "analysis", "of", "control", "and", "IRGM", "siRNA", "knockdown", "THP", "-", "1", "cells", "stained", "with", "JC", "-", "1", "dye", "(", "2", "µM", ",", "30", "mins", ")", ".", "At", "low", "mitochondrial", "membrane", "potential", ",", "JC", "-", "1", "is", "predominantly", "a", "monomer", "that", "yields", "green", "fluorescence", ",", "whereas", "at", "mitochondrial", "membrane", "potential", "the", "dye", "aggregates", "producing", "a", "red", "to", "orange", "colored", "emission", ".", "(", "P", ")", "Representative", "flow", "cytometry", "analysis", "of", "control", "and", "IRGM", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "stained", "with", "MitoSox", "red", "dye", "(", "1µM", ",", "20", "min", ")", ".", "The", "percentage", "of", "control", "and", "IRGM", "knockdown", "cells", "with", "increased", "red", "fluorescence", "(", "mitochondrial", "ROS", "generation", ")", "is", "depicted", ".", "(", "Q", ")", "Representative", "flow", "cytometry", "analysis", "of", "control", "and", "IRGM", "siRNA", "transfected", "THP", "-", "1", "cells", "stained", "with", "CellRox", "-", "green", "and", "CellRox", "-", "orange", "dye", "(", "1µM", ",", "30", "min", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative confocal images of Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs processed for IF analysis with Tom20 antibody. Scale bar, 5 µm. Zoom panels are digital magnifications.(B) The graph depicts the percentage of cells with swollen/rounded mitochondria in Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs.(C) Representative confocal (STED) images of Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs processed for IF analysis with Tom20 and Parkin antibodies. Line profile: Co-localization analysis using line intensity profiles.(D) Representative confocal (STED) images of Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs processed for IF analysis with Tom20 and Pink1 antibodies. Line profile: Co-localization analysis using line intensity profiles.(E) Representative confocal images of control siRNA and IRGM siRNA transfected THP-1 cells processed for IF analysis with Ubiquitin (green) and TOM20 (red) antibodies. Scale bar, 10 µm.(F) Western blot analysis of mitochondrial fraction of control siRNA and IRGM siRNA transfected THP-1 cells, probed with indicated antibodies.(G) Western blot analysis of mitochondrial fraction of Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDM cells, probed with indicated antibodies (n=2 mice).(H) Western blot analysis of mitochondrial fraction of Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDM cells untreated or treated with Bafilomycin A1 (300 nM, 3 h), probed with indicated antibodies.(I) Western blot analysis of mitochondrial fraction of control siRNA and IRGM siRNA transfected THP-1 cells untreated or treated with Bafilomycin A1 (300 nM, 3 h), probed with indicated antibodies.(J) Seahorse XF Cell Mito stress test for analysis of mitochondrial function in Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDM cells. The experiments were performed using the XF24 extracellular flux analyzer, and the flow chart showed the measurement of oxygen consumption rate (OCR)(K) Representative confocal images of control and IRGM siRNA transfected THP-1 cells stained with CMXRos red dye.(L) Flow cytometry analysis of control siRNA and IRGM siRNA transfected THP-1 cells stained with CMXRos red dye (10 nM, 30 mins). (M) Graph depicts the normalized mean fluorescent intensity of control and IRGM knockdown THP-1 cells stained with CMXRos.(N) Representative dot plot showing flow cytometry analysis of control and IRGM siRNA knockdown THP-1 cells stained with JC-1 dye (2 µM, 30 mins). At low mitochondrial membrane potential, JC-1 is predominantly a monomer that yields green fluorescence, whereas at mitochondrial membrane potential the dye aggregates producing a red to orange colored emission.(P) Representative flow cytometry analysis of control and IRGM siRNA transfected THP-1 cells stained with MitoSox red dye (1µM, 20 min). The percentage of control and IRGM knockdown cells with increased red fluorescence (mitochondrial ROS generation) is depicted.(Q) Representative flow cytometry analysis of control and IRGM siRNA transfected THP-1 cells stained with CellRox-green and CellRox-orange dye (1µM, 30 min)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "Tom20", "(", "red", ")", "and", "dsDNA", "(", "green", ")", "antibody", ".", "(", "B", ")", "Representative", "STED", "microscopy", "images", "of", "control", "THP", "-", "1", "cells", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "cGAS", "(", "green", ")", ",", "dsDNA", "(", "red", ")", ",", "and", "Lamin", "B1", "(", "cyan", ")", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "The", "graph", "depicts", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "micronuclei", "in", "control", "siRNA", "and", "IRGM", "siRNA", "knockdown", "THP", "-", "1", "cells", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Representative", "STED", "microscopy", "images", "of", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "(", "D", ")", "transfected", "with", "mCherry", "-", "cGAS", "and", "immunostained", "with", "dsDNA", "(", "green", ")", "antibody", ".", "The", "white", "line", "depicts", "the", "periphery", "of", "the", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "3", "µm", ".", "(", "E", ")", "The", "graph", "depicts", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "micronuclei", "in", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", ".", "(", "F", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "cytosolic", "DNA", "(", "minus", "mitochondria", ")", "isolated", "from", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", ".", "(", "G", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "cytosolic", "DNA", "(", "minus", "mitochondria", ")", "isolated", "from", "control", "and", "IRGM", "siRNA", "transfected", "HT", "-", "29", "cells", ".", "(", "H", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "cytosolic", "DNA", "(", "minus", "mitochondria", ")", "isolated", "from", "control", "or", "IRGM", "shRNA", "or", "EtBr", "treated", "IRGM", "shRNA", "HT", "-", "29", "(", "Rho0", ")", "cells", ".", "(", "I", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "or", "IRGM", "shRNA", "or", "EtBr", "treated", "IRGM", "shRNA", "HT", "-", "29", "(", "Rho0", ")", "cells", ".", "(", "J", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "cytosolic", "DNA", "(", "minus", "mitochondria", ")", "isolated", "from", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "transfected", "with", "DNase", "I", "(", "15", "μg", ",", "6hr", ")", ".", "(", "K", ")", "The", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "RNA", "isolated", "from", "control", "and", "IRGM", "siRNA", "knockdown", "THP", "-", "1", "cells", "electroporated", "with", "DNase", "I", "(", "5", "μg", ",", "1hr", ")", "as", "indicated", ".", "(", "L", "-", "M", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "(", "L", ")", "dsRNA", "(", "green", ")", "and", "Tom20", "(", "red", ")", "antibodies", ".", "(", "M", ")", "The", "graph", "depicts", "the", "percentage", "of", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "with", "dsRNA", "aggregates", ".", "(", "N", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "RIG", "-", "I", "(", "red", ")", "and", "dsRNA", "(", "green", ")", "antibodies", ".", "Line", "profile", ":", "Co", "-", "localization", "analysis", "using", "line", "intensity", "profiles", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "(", "O", ")", "Mda5", "(", "red", ")", "and", "dsRNA", "(", "green", ")", "antibodies", "Co", "-", "localization", "analysis", "using", "line", "intensity", "profiles", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "processed", "for", "IF", "analysis", "with", "(", "P", ")", "Mda5", "(", "red", ")", ",", "dsRNA", "(", "green", ")", "and", "Tia1", "(", "blue", ")", "antibodies", "(", "Scale", "bar", ",", "3", "µm", ")", ".", "Line", "profile", ":", "Co", "-", "localization", "analysis", "using", "line", "intensity", "profiles", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Representative confocal images of Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs processed for IF analysis with Tom20 (red) and dsDNA (green) antibody.(B) Representative STED microscopy images of control THP-1 cells processed for IF analysis with cGAS (green), dsDNA (red), and Lamin B1 (cyan) antibodies. (C) The graph depicts the percentage of cells with micronuclei in control siRNA and IRGM siRNA knockdown THP-1 cells.(D-E) Representative STED microscopy images of Irgm1-/- mouse BMDMs (D) transfected with mCherry-cGAS and immunostained with dsDNA (green) antibody. The white line depicts the periphery of the cells. Scale bar, 3 µm. (E) The graph depicts the percentage of cells with micronuclei in Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs.(F) The qRT-PCR analysis with cytosolic DNA (minus mitochondria) isolated from Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs.(G) The qRT-PCR analysis with cytosolic DNA (minus mitochondria) isolated from control and IRGM siRNA transfected HT-29 cells.(H) The qRT-PCR analysis with cytosolic DNA (minus mitochondria) isolated from control or IRGM shRNA or EtBr treated IRGM shRNA HT-29 (Rho0) cells.(I) The qRT-PCR analysis with total RNA isolated from control or IRGM shRNA or EtBr treated IRGM shRNA HT-29 (Rho0) cells.(J) The qRT-PCR analysis with cytosolic DNA (minus mitochondria) isolated from Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs transfected with DNase I (15 μg, 6hr).(K) The qRT-PCR analysis with RNA isolated from control and IRGM siRNA knockdown THP-1 cells electroporated with DNase I (5 μg, 1hr) as indicated.(L-M) Representative confocal images of Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs processed for IF analysis with (L) dsRNA (green) and Tom20 (red) antibodies. (M) The graph depicts the percentage of Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs with dsRNA aggregates.(N) Representative confocal images of Irgm1-/- mouse BMDMs processed for IF analysis with RIG-I (red) and dsRNA (green) antibodies. Line profile: Co-localization analysis using line intensity profiles.Representative confocal images of Irgm1-/- mouse BMDMs processed for IF analysis with (O) Mda5 (red) and dsRNA (green) antibodies Co-localization analysis using line intensity profiles.Representative confocal images of Irgm1-/- mouse BMDMs processed for IF analysis with (P) Mda5 (red), dsRNA (green) and Tia1 (blue) antibodies (Scale bar, 3 µm). Line profile: Co-localization analysis using line intensity profiles."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "total", "RNA", "isolated", "from", "Irgm1", "+", "/", "+", "and", "Irgm1", "-", "/", "-", "mouse", "BMDMs", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "cGAS", "siRNA", "or", "RIG", "-", "I", "siRNA", "or", "cGAS", "siRNA", "and", "RIG", "-", "I", "siRNA", "as", "indicated", ".", "(", "B", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "total", "RNA", "isolated", "from", "HT", "-", "29", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "IRGM", "siRNA", "or", "doubly", "transfected", "with", "IRGM", "siRNA", "and", "cGAS", "siRNA", "or", "IRGM", "siRNA", "and", "RIG", "-", "I", "siRNA", "or", "transfected", "with", "three", "siRNAs", "as", "indicated", ".", "(", "C", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "total", "RNA", "isolated", "from", "HT", "-", "29", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "IRGM", "siRNA", "or", "doubly", "transfected", "with", "IRGM", "siRNA", "and", "STING", "siRNA", "or", "IRGM", "siRNA", "and", "MAVS", "siRNA", "or", "transfected", "with", "all", "the", "three", "siRNAs", "as", "indicated", ".", "(", "D", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "total", "RNA", "isolated", "from", "HT", "-", "29", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "IRGM", "siRNA", "or", "doubly", "transfected", "with", "IRGM", "siRNA", "and", "MDA5", "siRNA", "as", "indicated", ".", "(", "E", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "total", "RNA", "isolated", "from", "HT", "-", "29", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "IRGM", "siRNA", "or", "doubly", "transfected", "with", "IRGM", "siRNA", "and", "IRF3", "siRNA", "as", "indicated", ".", "(", "F", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "with", "total", "RNA", "isolated", "from", "HT", "-", "29", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "IRGM", "siRNA", "or", "doubly", "transfected", "with", "IRGM", "siRNA", "and", "STAT1", "siRNA", "or", "IRGM", "siRNA", "and", "STAT2", "siRNA", "as", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) qRT-PCR analysis with total RNA isolated from Irgm1+/+ and Irgm1-/- mouse BMDMs transfected with control siRNA or cGAS siRNA or RIG-I siRNA or cGAS siRNA and RIG-I siRNA as indicated.(B) qRT-PCR analysis with total RNA isolated from HT-29 cells transfected with control siRNA or IRGM siRNA or doubly transfected with IRGM siRNA and cGAS siRNA or IRGM siRNA and RIG-I siRNA or transfected with three siRNAs as indicated.(C) qRT-PCR analysis with total RNA isolated from HT-29 cells transfected with control siRNA or IRGM siRNA or doubly transfected with IRGM siRNA and STING siRNA or IRGM siRNA and MAVS siRNA or transfected with all the three siRNAs as indicated.(D) qRT-PCR analysis with total RNA isolated from HT-29 cells transfected with control siRNA or IRGM siRNA or doubly transfected with IRGM siRNA and MDA5 siRNA as indicated.(E) qRT-PCR analysis with total RNA isolated from HT-29 cells transfected with control siRNA or IRGM siRNA or doubly transfected with IRGM siRNA and IRF3 siRNA as indicated.(F) qRT-PCR analysis with total RNA isolated from HT-29 cells transfected with control siRNA or IRGM siRNA or doubly transfected with IRGM siRNA and STAT1 siRNA or IRGM siRNA and STAT2 siRNA as indicated."}
{"words": ["Figure", "4", "Immunofluorescence", "microscopy", "analysis", "reveals", "highly", "similar", "and", "mostly", "nuclear", "localization", "of", "the", "SMARCB1", "wild", "type", "and", "the", "R377C", "mutant", ",", "visualized", "by", "anti", "-", "HA", "staining", "(", "green", ")", ".", "Phalloidin", "and", "DAPI", "staining", "was", "used", "to", "visualize", "the", "actin", "cytoskeleton", "and", "the", "nucleus", ",", "respectively", ".", "A", "novel", "MS", "-", "microscopy", "approach", "was", "used", "to", "further", "define", "the", "molecular", "context", "of", "the", "proteins", ".", "This", "analysis", "identified", "possible", "chromosomal", ",", "endosomal", "and", "membrane", "localization", "of", "the", "proteins", ".", "The", "possible", "endosomal", "localization", "is", "in", "agreement", "with", "the", "anti", "-", "HA", "immunofluorescence", "microscopy", "results", ".", "(", "key", ":", "the", "scale", "bar", "for", "immunofluorescence", "images", "is", "10", "µm", ",", "and", "the", "color", "gradient", "on", "the", "MS", "-", "microscopy", "indicates", "the", "localization", "scores", "calculated", "by", "the", "MS", "-", "microscopy", "tool", ".", "The", "cell", "proliferation", "assay", "in", "HCT116", "CRC", "cells", "shows", "growth", "advantage", "conferred", "by", "the", "SMARCB1", "R377C", "mutation", "compared", "with", "the", "wild", "type", "SMARCB1", "or", "the", "vector", "control", ".", "The", "error", "bars", "designate", "the", "standard", "deviation", "(", "SD", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 Immunofluorescence microscopy analysis reveals highly similar and mostly nuclear localization of the SMARCB1 wild type and the R377C mutant, visualized by anti-HA staining (green). Phalloidin and DAPI staining was used to visualize the actin cytoskeleton and the nucleus, respectively. A novel MS-microscopy approach was used to further define the molecular context of the proteins. This analysis identified possible chromosomal, endosomal and membrane localization of the proteins. The possible endosomal localization is in agreement with the anti-HA immunofluorescence microscopy results. (key: the scale bar for immunofluorescence images is 10 µm, and the color gradient on the MS-microscopy indicates the localization scores calculated by the MS-microscopy tool.  The cell proliferation assay in HCT116 CRC cells shows growth advantage conferred by the SMARCB1 R377C mutation compared with the wild type SMARCB1 or the vector control. The error bars designate the standard deviation (SD) "}
{"words": ["Figure", "5", "Immunofluorescence", "microscopy", "analysis", "of", "the", "STK38L", "wild", "type", "and", "the", "R105W", "mutant", "display", "no", "clear", "difference", "in", "localization", ".", "Both", "the", "wild", "type", "and", "the", "R105W", "mutant", "display", "nuclear", ",", "cytoplasmic", "and", "plasma", "membrane", "localization", ".", "However", ",", "the", "MS", "-", "microscopy", "analysis", "suggests", "a", "more", "prominent", "endosomal", "localization", "with", "the", "R105W", "mutant", ".", "(", "key", ":", "the", "scale", "bar", "for", "the", "immunofluorescence", "images", "is", "10", "µm", ",", "and", "the", "color", "gradient", "on", "the", "MS", "-", "microscopy", "indicates", "the", "localization", "scores", "calculated", "by", "the", "MS", "-", "Microscopy", "tool", ".", "The", "cell", "proliferation", "assay", "in", "HCT116", "CRC", "cells", "shows", "growth", "advantage", "conferred", "by", "the", "expression", "of", "the", "wild", "type", "STK38L", ",", "whereas", "the", "R105W", "mutant", "only", "slightly", "increased", "the", "number", "of", "colonies", ".", "The", "error", "bars", "designate", "the", "standard", "deviation", "(", "SD", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 Immunofluorescence microscopy analysis of the STK38L wild type and the R105W mutant display no clear difference in localization. Both the wild type and the R105W mutant display nuclear, cytoplasmic and plasma membrane localization. However, the MS-microscopy analysis suggests a more prominent endosomal localization with the R105W mutant. (key: the scale bar for the immunofluorescence images is 10 µm, and the color gradient on the MS-microscopy indicates the localization scores calculated by the MS-Microscopy tool.  The cell proliferation assay in HCT116 CRC cells shows growth advantage conferred by the expression of the wild type STK38L, whereas the R105W mutant only slightly increased the number of colonies. The error bars designate the standard deviation (SD) "}
{"words": ["Figure", "1Examples", "of", "CT", "scan", "images", "of", "several", "metastases", "(", "M032R1", ",", "M032R2", ",", "and", "M032R5", ")", ".", "Volumetric", "measurements", "based", "on", "the", "PET", "and", "CT", "scans", "could", "be", "generated", "from", "M032", ",", "M032R1", ",", "and", "M032R5", ".", "Graph", "illustrates", "that", "the", "metastases", "R1", "and", "R5", "initially", "expanded", "before", "the", "start", "of", "the", "treatment", ",", "but", "regressed", "upon", "vemurafenib", "treatment", ".", "M032R5", "showed", "progressive", "disease", "after", "4", "months", ",", "whereas", "M032R1", "still", "displayed", "stable", "disease", ".", "M032", "was", "excised", "and", "no", "recurrence", "was", "observed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Examples of CT scan images of several metastases (M032R1, M032R2, and M032R5).Volumetric measurements based on the PET and CT scans could be generated from M032, M032R1, and M032R5. Graph illustrates that the metastases R1 and R5 initially expanded before the start of the treatment, but regressed upon vemurafenib treatment. M032R5 showed progressive disease after 4 months, whereas M032R1 still displayed stable disease. M032 was excised and no recurrence was observed."}
{"words": ["Figure", "2Hematoxylin", "-", "eosin", "(", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ")", "and", "p", "-", "ERK", "stainings", "on", "FFPE", "material", "of", "all", "metastases", "showed", "that", "all", "vemurafenib", "-", "resistant", "tumors", "had", "reactivation", "of", "the", "MAPK", "pathway", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "μmqPCR", "was", "performed", "on", "gDNA", "retrieved", "from", "each", "of", "the", "metastases", ",", "using", "primers", "for", "BRAF", "and", "CRAF", "and", "normalized", "on", "LINE", "levels", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "of", "three", "replicates", ",", "error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", ".", "The", "results", "confirmed", "that", "BRAF", "was", "amplified", "in", "M032R1", ",", "M032R2", ",", "and", "M032R5", ".", "Staining", "for", "BRAFV600E", "with", "a", "mutant", "epitope", "-", "specific", "antibody", "confirmed", "the", "upregulation", "of", "BRAFV600E", "in", "R1", ",", "R2", ",", "and", "R5", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Hematoxylin-eosin (H&amp;amp;E) and p-ERK stainings on FFPE material of all metastases showed that all vemurafenib-resistant tumors had reactivation of the MAPK pathway. Scale bar represents 100 μmqPCR was performed on gDNA retrieved from each of the metastases, using primers for BRAF and CRAF and normalized on LINE levels. Bars represent the mean of three replicates, error bars indicate standard deviation. The results confirmed that BRAF was amplified in M032R1, M032R2, and M032R5.Staining for BRAFV600E with a mutant epitope-specific antibody confirmed the upregulation of BRAFV600E in R1, R2, and R5. Scale bar represents 100 μm."}
{"words": ["Figure", "3Immunoblotting", "for", "MAPK", "pathway", "components", "confirmed", "reactivation", "of", "p", "-", "ERK", "and", "p", "-", "MEK", "in", "all", "resistant", "metastases", ".", "Immunoblotting", "for", "M032", "patient", "'", "s", "samples", "using", "an", "antibody", "directed", "against", "either", "the", "mutant", "BRAFV600E", "epitope", "or", "an", "N", "-", "terminal", "region", "of", "BRAF", "revealed", "the", "expression", "of", "a", "shorter", "variant", "of", "BRAFV600E", "in", "M032R3", ",", "of", "approximately", "80", "kDa", ".", "This", "80", "-", "kDa", "band", "could", "not", "be", "detected", "with", "the", "N", "-", "terminus", "-", "recognizing", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunoblotting for MAPK pathway components confirmed reactivation of p-ERK and p-MEK in all resistant metastases.Immunoblotting for M032 patient's samples using an antibody directed against either the mutant BRAFV600E epitope or an N-terminal region of BRAF revealed the expression of a shorter variant of BRAFV600E in M032R3, of approximately 80 kDa. This 80-kDa band could not be detected with the N-terminus-recognizing antibody."}
{"words": ["Figure", "4Validation", "of", "T55delinsRT", "was", "done", "by", "PCR", "using", "insertion", "-", "specific", "primers", ".", "As", "a", "control", ",", "primers", "amplifying", "exon", "2", "of", "MEK1WT", "were", "used", ".", "Transfection", "of", "pQXCIP", "-", "GFP", ",", "MEK1", "-", "WT", ",", "or", "MEK1", "-", "T55delinsRT", "into", "HEK293T", "cells", "showed", "that", "this", "mutation", "induces", "p", "-", "ERK", "and", "p", "-", "RSK", ".", "Validation", "of", "expression", "of", "pQXCIP", "-", "GFP", ",", "MEK1WT", ",", "or", "MEK1T55delinsRT", "in", "A375", "melanoma", "cells", "by", "immunoblotting", ".", "Dose", "-", "response", "curves", "for", "A375", "melanoma", "cells", "expressing", "GFP", ",", "MEK1WT", ",", "or", "MEK1T55delinsRT", "with", "indicated", "doses", "of", "BRAF", "inhibitor", "vemurafenib", ",", "ERK", "inhibitor", "SCH772984", ",", "or", "MEK", "inhibitor", "trametinib", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", ".", "Colony", "formation", "assays", "with", "A375", "melanoma", "cells", ",", "infected", "with", "GFP", ",", "MEK1WT", ",", "or", "MEK1T55delinsRT", "-", "encoding", "lentivirus", ",", "and", "treated", "with", "indicated", "doses", "and", "inhibitors", ".", "Treatment", "of", "A375", "MEK1T55delinsRT", "melanoma", "cells", "with", "DMSO", "(", "−", ")", ",", "250", "nM", "dabrafenib", "(", "D", ")", ",", "10", "nM", "trametinib", "(", "T", ")", ",", "or", "a", "combination", "(", "D", "+", "T", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Validation of T55delinsRT was done by PCR using insertion-specific primers. As a control, primers amplifying exon 2 of MEK1WT were used.Transfection of pQXCIP-GFP, MEK1-WT, or MEK1-T55delinsRT into HEK293T cells showed that this mutation induces p-ERK and p-RSK.Validation of expression of pQXCIP-GFP, MEK1WT, or MEK1T55delinsRT in A375 melanoma cells by immunoblotting.Dose-response curves for A375 melanoma cells expressing GFP, MEK1WT, or MEK1T55delinsRT with indicated doses of BRAF inhibitor vemurafenib, ERK inhibitor SCH772984, or MEK inhibitor trametinib. Error bars indicate standard deviation.Colony formation assays with A375 melanoma cells, infected with GFP, MEK1WT, or MEK1T55delinsRT-encoding lentivirus, and treated with indicated doses and inhibitors.Treatment of A375 MEK1T55delinsRT melanoma cells with DMSO (−), 250 nM dabrafenib (D), 10 nM trametinib (T), or a combination (D+T)."}
{"words": ["Figure", "5A375", "melanoma", "cells", "expressing", "GFP", ",", "MEK1WT", ",", "or", "MEK1T55delinsRT", "were", "injected", "into", "immune", "-", "deficient", "mice", "(", "n", "=", "8", "per", "group", ")", ",", "and", "after", "the", "tumor", "size", "of", "˜", "100", "mm3", "was", "reached", ",", "mice", "were", "treated", "with", "30", "mg", "/", "kg", "dabrafenib", "or", "vehicle", ".", "Graphs", "represent", "fold", "change", "in", "tumor", "volume", "normalized", "on", "the", "tumor", "volume", "on", "the", "day", "of", "the", "start", "of", "the", "treatment", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "error", "of", "the", "mean", ".", "Average", "tumor", "weight", "of", "all", "groups", "at", "the", "end", "of", "the", "experiment", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "P", "-", "values", "are", "indicated", "in", "the", "graph", ".", "Immunoblotting", "for", "MAPK", "pathway", "components", "performed", "on", "tumors", "of", "all", "groups", ".", "Immunohistochemistry", "for", "Sirius", "Red", "(", "staining", "for", "collagen", ")", "and", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "on", "tumors", "from", "all", "groups", ",", "to", "identify", "grade", "of", "demarcation", "and", "local", "invasion", ".", "Scale", "bar", "represents", "500", "(", "upper", "row", ")", "and", "100", "(", "lower", "row", ")", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A375 melanoma cells expressing GFP, MEK1WT, or MEK1T55delinsRT were injected into immune-deficient mice (n = 8 per group), and after the tumor size of ˜100 mm3 was reached, mice were treated with 30 mg/kg dabrafenib or vehicle. Graphs represent fold change in tumor volume normalized on the tumor volume on the day of the start of the treatment. Error bars indicate standard error of the mean.Average tumor weight of all groups at the end of the experiment described in (A). Error bars indicate standard deviation. Unpaired t-test was used to calculate statistical significance. P-values are indicated in the graph.Immunoblotting for MAPK pathway components performed on tumors of all groups.Immunohistochemistry for Sirius Red (staining for collagen) and H&amp;amp;E on tumors from all groups, to identify grade of demarcation and local invasion. Scale bar represents 500 (upper row) and 100 (lower row) μm."}
{"words": ["Figure", "6gDNA", "was", "isolated", "from", "another", "fragment", "of", "the", "tumor", "resection", ",", "and", "the", "PCR", "with", "the", "insertion", "-", "specific", "primers", "was", "repeated", ".", "Primers", "amplifying", "exon", "2", "of", "MEK1WT", "were", "used", "as", "an", "input", "control", ".", "Source", "data", "are", "available", "online", "for", "this", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6gDNA was isolated from another fragment of the tumor resection, and the PCR with the insertion-specific primers was repeated. Primers amplifying exon 2 of MEK1WT were used as an input control.Source data are available online for this figure."}
{"words": ["Figure", "7Staining", "for", "hematoxylin", "-", "eosin", "(", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ")", "and", "p", "-", "ERK", "on", "the", "PDX", "samples", "M032", ".", "X1", ",", "M032R1", ".", "X1", ",", "M032R2", ".", "X1", ",", "M032R4", ".", "X1", ",", "and", "M032R5", ".", "X1", ".", "Stainings", "showed", "that", "p", "-", "ERK", "is", "higher", "in", "the", "PDX", "derived", "from", "the", "resistant", "metastases", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "μm", ".", "Immunoblotting", "for", "components", "of", "the", "MAPK", "pathway", "confirmed", "reactivation", "of", "p", "-", "ERK", "in", "the", "PDX", "derived", "from", "the", "vemurafenib", "-", "resistant", "metastases", ",", "although", "the", "p", "-", "ERK", "signal", "is", "heterogeneous", "in", "the", "pre", "-", "treatment", "PDX", ".", "Validation", "of", "the", "BRAF", "amplification", "was", "performed", "by", "qPCR", "on", "gDNA", "derived", "from", "the", "PDX", ",", "using", "primers", "for", "BRAF", "and", "CRAF", "and", "normalized", "on", "LINE", "expression", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "of", "three", "replicates", ",", "error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", ".", "The", "results", "confirmed", "that", "BRAF", "was", "amplified", "in", "PDX", "derived", "from", "M032R2", "and", "M032R5", ",", "but", "not", "from", "M032R1", ".", "Presence", "of", "the", "MEK1T55delinsRT", "was", "analyzed", "by", "PCR", "using", "insertion", "-", "specific", "primers", ".", "As", "a", "control", ",", "primers", "amplifying", "exon", "2", "of", "MEK1WT", "were", "used", ".", "The", "insertion", "was", "found", "in", "M032R1", ".", "X1", "and", "M032R4", ".", "X1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Staining for hematoxylin-eosin (H&amp;amp;E) and p-ERK on the PDX samples M032.X1, M032R1.X1, M032R2.X1, M032R4.X1, and M032R5.X1. Stainings showed that p-ERK is higher in the PDX derived from the resistant metastases. Scale bar represents 100 μm.Immunoblotting for components of the MAPK pathway confirmed reactivation of p-ERK in the PDX derived from the vemurafenib-resistant metastases, although the p-ERK signal is heterogeneous in the pre-treatment PDX.Validation of the BRAF amplification was performed by qPCR on gDNA derived from the PDX, using primers for BRAF and CRAF and normalized on LINE expression. Bars represent the mean of three replicates, error bars indicate standard deviation. The results confirmed that BRAF was amplified in PDX derived from M032R2 and M032R5, but not from M032R1.Presence of the MEK1T55delinsRT was analyzed by PCR using insertion-specific primers. As a control, primers amplifying exon 2 of MEK1WT were used. The insertion was found in M032R1.X1 and M032R4.X1."}
{"words": ["Figure", "1ATAC", "-", "seq", "peaks", "more", "accessible", "in", "GPR56low", "(", "violet", ")", "or", "GPR56high", "(", "turquoise", ")", "against", "the", "background", "(", "grey", ")", "are", "enriched", "for", "enhancers", "associated", "with", "specific", "hematopoietic", "cell", "types", ".", "P", "-", "values", "and", "odds", "ratios", "are", "given", "for", "a", "pairwise", ",", "two", "-", "sided", "Fisher", "'", "s", "Exact", "test", "comparing", "each", "category", "(", "GPR56low", "/", "high", ")", "against", "the", "background", ".", "Enhancer", "annotations", "are", "taken", "from", "EnhancerAtlas", "2", ".", "0", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Knockdown", "efficiency", "of", "two", "shRNAs", "against", "GPR56", "(", "shGPR56weak", "and", "shGPR56strong", ")", "versus", "shLuc", "as", "negative", "control", "measured", "on", "protein", "level", "by", "flow", "cytometry", "in", "CD34", "+", "CB", "cells", ".", "Shown", "are", "representative", "FACS", "plots", "(", "left", ")", "and", "the", "percentage", "of", "GPR56", "+", "cells", "of", "transduced", "GFP", "+", "cells", "on", "day", "5", "(", "right", "panel", ")", ".", "Biological", "N", "=", "4", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "bars", "and", "error", "bars", "represent", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Integrative", "Genome", "Viewer", "(", "IGV", ")", "snapshot", "showing", "ATAC", "-", "seq", "peaks", "along", "and", "upstream", "of", "the", "VWF", "gene", "in", "GPR56high", "vs", ".", "low", "samples", "(", "top", ",", "average", "peak", "size", "of", "10", "GPR56high", "(", "turquoise", ")", "and", "15", "GPR56low", "samples", "(", "violet", ")", ")", ",", "RNA", "-", "seq", "reads", "of", "the", "same", "location", "in", "AML", "samples", "with", "high", "(", "n", "=", "9", ")", "versus", "low", "(", "n", "=", "11", ")", "GPR56", "expression", "(", "two", "middle", "tracks", ")", ",", "and", "RNA", "-", "seq", "reads", "of", "shLuc", "versus", "GPR56", "knockdown", "CD34", "+", "cells", "(", "3", "bottom", "tracks", ",", "one", "of", "two", "replicates", "shown", "for", "each", "condition", ")", ".", "Track", "height", "was", "group", "-", "scaled", ".", "Dashed", "vertical", "lines", "indicate", "binding", "sites", "for", "the", "annotated", "TFs", ".", "TFBS", ":", "transcription", "factor", "binding", "site", "derived", "from", "the", "HOCOMOCO", "v10", "database", ";", "TSS", ":", "transcription", "start", "site", ".", "TFs", "in", "blue", "bind", "to", "differentially", "accessible", "chromatin", "regions", ".", "Volcano", "plot", "of", "differential", "transcription", "factor", "(", "TF", ")", "motif", "accessibility", "(", "activity", ")", "in", "GPR56high", "(", "turquoise", ")", "vs", "GPR56low", "(", "violet", ")", "samples", "and", "their", "corresponding", "adjusted", "p", "-", "values", "determined", "with", "diffTF", ".", "Highlighted", "are", "TFs", "whose", "RNA", "expression", "was", "also", "positively", "or", "negatively", "affected", "by", "GPR56", "KD", "in", "the", "RNA", "-", "seq", "dataset", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1ATAC-seq peaks more accessible in GPR56low (violet) or GPR56high (turquoise) against the background (grey) are enriched for enhancers associated with specific hematopoietic cell types. P-values and odds ratios are given for a pairwise, two-sided Fisher's Exact test comparing each category (GPR56low / high) against the background. Enhancer annotations are taken from EnhancerAtlas 2.0. *** p<0.0005, ** p<0.005, * p<0.05.Knockdown efficiency of two shRNAs against GPR56 (shGPR56weak and shGPR56strong) versus shLuc as negative control measured on protein level by flow cytometry in CD34+ CB cells. Shown are representative FACS plots (left) and the percentage of GPR56+ cells of transduced GFP+ cells on day 5 (right panel). Biological N=4, unpaired t-test, bars and error bars represent mean and standard deviation. *** p<0.0005, ** p<0.005, * p<0.05.Integrative Genome Viewer (IGV) snapshot showing ATAC-seq peaks along and upstream of the VWF gene in GPR56high vs. low samples (top, average peak size of 10 GPR56high (turquoise) and 15 GPR56low samples (violet)), RNA-seq reads of the same location in AML samples with high (n=9) versus low (n=11) GPR56 expression (two middle tracks), and RNA-seq reads of shLuc versus GPR56 knockdown CD34+ cells (3 bottom tracks, one of two replicates shown for each condition). Track height was group-scaled. Dashed vertical lines indicate binding sites for the annotated TFs. TFBS: transcription factor binding site derived from the HOCOMOCO v10 database; TSS: transcription start site. TFs in blue bind to differentially accessible chromatin regions.Volcano plot of differential transcription factor (TF) motif accessibility (activity) in GPR56high (turquoise) vs GPR56low (violet) samples and their corresponding adjusted p-values determined with diffTF. Highlighted are TFs whose RNA expression was also positively or negatively affected by GPR56 KD in the RNA-seq dataset."}
{"words": ["Figure", "2Violin", "plots", "showing", "geometric", "mean", "(", "horizontal", "line", ")", "and", "individual", "values", "(", "circles", ")", "of", "the", "engraftment", "levels", "of", "different", "hematopoietic", "cell", "types", "in", "the", "bone", "marrow", "of", "NSG", "mice", "20", "weeks", "after", "transplantation", "of", "CB", "CD34", "+", "cells", "following", "overnight", "-", "infection", "with", "shGPR56strong", "(", "turqouise", ")", "and", "shGPR56weak", "(", "gray", ")", "versus", "shLuc", "control", "(", "violet", ")", ".", "Shown", "are", "percentages", "of", "indicated", "populations", ",", "which", "are", "also", "co", "-", "positive", "for", "human", "CD45", "and", "GFP", ",", "relative", "to", "all", "harvested", "bone", "marrow", "cells", ".", "HSPC", ":", "CD34", "+", "SSClowCD33", "-", "CD19", "-", ",", "B", "precursor", ":", "CD34", "+", "CD19", "+", "CD33", "-", ",", "myeloid", "progenitor", "(", "myelo", ".", "prog", ".", ")", ":", "CD34", "+", "CD33", "+", "CD19", "-", ",", "mature", "B", "cells", ":", "CD19", "+", "CD34", "-", ",", "mature", "myeloid", "cells", ":", "CD33", "+", "CD19", "-", "CD34", "-", ".", "Multiple", "unpaired", "t", "-", "tests", "of", "log", "-", "transformed", "values", ",", "p", "-", "values", "were", "Benjamini", "and", "Hochberg", "corrected", "(", "padj", ")", ",", "*", "padj", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "padj", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "padj", "<", "0", ".", "0005", ".", "Adhesion", "of", "control", "and", "GPR56", "KD", "K562", "cells", "on", "fibronectin", "-", "functionalized", "substrates", ".", "Left", ":", "Overlay", "of", "phase", "contrast", "and", "microinterferometry", "images", "of", "control", "(", "above", ")", "and", "GPR56", "KD", "cells", "(", "below", ")", ".", "The", "area", "of", "tight", "adhesion", "extracted", "by", "microinterferometry", "is", "highlighted", "in", "turquoise", "and", "violet", ",", "respectively", ".", "Right", ":", "Comparison", "of", "adhesion", "areas", "extracted", "by", "microinterferometry", ",", "reduction", "of", "adhesion", "area", "by", "factor", "1", ".", "9", "in", "GPR56", "KD", "cells", "(", "p", "=", "1", ".", "0", "x", "10", "-", "10", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "box", "plots", "showing", "medians", ",", "quartiles", ",", "and", "outliers", "according", "to", "the", "Tukey", "method", ")", ".", "Technical", "replicates", "Ncontrol", "=", "71", ",", "Technical", "replicates", "NKD", "=", "104", ",", "scale", "bar", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Violin plots showing geometric mean (horizontal line) and individual values (circles) of the engraftment levels of different hematopoietic cell types in the bone marrow of NSG mice 20 weeks after transplantation of CB CD34+ cells following overnight-infection with shGPR56strong (turqouise) and shGPR56weak (gray) versus shLuc control (violet). Shown are percentages of indicated populations, which are also co-positive for human CD45 and GFP, relative to all harvested bone marrow cells. HSPC: CD34+SSClowCD33-CD19-, B precursor: CD34+CD19+CD33-, myeloid progenitor (myelo. prog.): CD34+CD33+CD19-, mature B cells: CD19+CD34-, mature myeloid cells: CD33+CD19-CD34-. Multiple unpaired t-tests of log-transformed values, p-values were Benjamini and Hochberg corrected (padj), * padj<0.05, ** padj<0.005, *** padj<0.0005.Adhesion of control and GPR56 KD K562 cells on fibronectin-functionalized substrates. Left: Overlay of phase contrast and microinterferometry images of control (above) and GPR56 KD cells (below). The area of tight adhesion extracted by microinterferometry is highlighted in turquoise and violet, respectively. Right: Comparison of adhesion areas extracted by microinterferometry, reduction of adhesion area by factor 1.9 in GPR56 KD cells (p = 1.0 x 10-10, two-sided Mann-Whitney test, box plots showing medians, quartiles, and outliers according to the Tukey method). Technical replicates Ncontrol = 71, Technical replicates NKD = 104, scale bar 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "β", "-", "catenin", "protein", "expression", "in", "K562", "cells", "infected", "with", "shGPR56strong", "or", "shLuc", "negative", "control", "in", "presence", "and", "absence", "of", "Wnt3a", "(", "representative", "Western", "Blot", "(", "above", ")", "and", "quantification", "after", "normalization", "to", "GAPDH", "(", "below", ")", ".", "Shown", "is", "fold", "-", "change", "compared", "to", "shLuc", "in", "control", "media", ",", "bars", "and", "error", "bars", "represent", "mean", "and", "standard", "deviation", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Left", ":", "Representative", "immunofluorescence", "(", "IF", ")", "images", "showing", "primary", "cilium", "formation", "in", "RPE", "cells", "upon", "starvation", "after", "infection", "with", "shLuc", "(", "above", ")", "or", "shGPR56strong", "(", "below", ")", ".", "The", "non", "-", "motile", "primary", "cilium", "is", "visualized", "using", "antibodies", "against", "γ", "-", "tubulin", ",", "which", "stains", "the", "basal", "body", ",", "and", "the", "ciliary", "membrane", "marker", "ARL13B", ".", "DAPI", "indicates", "the", "nucleus", ".", "Images", "on", "the", "right", "show", "selected", "cells", "at", "3", "x", "magnification", ".", "Brightness", "was", "increased", "in", "all", "images", "to", "enhance", "visibility", "of", "cilia", ".", "Right", ":", "Percentage", "of", "RPE", "-", "1", "cells", "with", "primary", "cilium", "in", "shLuc", "vs", ".", "shGPR56strong", "RPE", "-", "1", "cells", "at", "different", "time", "points", "after", "the", "start", "of", "serum", "starvation", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", ",", "bars", "and", "error", "bars", "represent", "mean", "and", "stdev", "of", "three", "biological", "replicate", "wells", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3  β-catenin protein expression in K562 cells infected with shGPR56strong or shLuc negative control in presence and absence of Wnt3a (representative Western Blot (above) and quantification after normalization to GAPDH (below). Shown is fold-change compared to shLuc in control media, bars and error bars represent mean and standard deviation of three biological replicates, unpaired t-test).  Left: Representative immunofluorescence (IF) images showing primary cilium formation in RPE cells upon starvation after infection with shLuc (above) or shGPR56strong (below). The non-motile primary cilium is visualized using antibodies against γ-tubulin, which stains the basal body, and the ciliary membrane marker ARL13B. DAPI indicates the nucleus. Images on the right show selected cells at 3 x magnification. Brightness was increased in all images to enhance visibility of cilia. Right: Percentage of RPE-1 cells with primary cilium in shLuc vs. shGPR56strong RPE-1 cells at different time points after the start of serum starvation. Unpaired t-test, bars and error bars represent mean and stdev of three biological replicate wells. **** p<0.0001, *** p<0.0005, ** p<0.005, * p<0.05."}
{"words": ["Figure", "1B", "Relative", "(", "left", ")", "and", "absolute", "(", "right", ")", "amount", "of", "13C", "-", "Lys", "-", "labeled", "and", "unlabeled", "Aβ", "in", "APPtg", "mouse", "brains", "after", "labeling", "from", "75", "-", "125", "d", "(", "n", "=", "1", ")", ",", "75", "-", "175", "d", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "50", "-", "100", "d", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "50", "-", "125", "d", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "50", "-", "150", "(", "n", "=", "4", ")", "or", "50", "-", "175", "d", "(", "n", "=", "9", ")", "of", "age", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±", "SD", ".", "C", "Representative", "chromatogram", "and", "mass", "spectra", "of", "doubly", "charged", "ions", "of", "unlabeled", "Aβ17", "-", "28", "(", "663", ".", "3", "m", "/", "z", ")", "and", "13C", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "(", "666", ".", "3", "m", "/", "z", ")", "in", "an", "APPtg", "brain", "after", "labeling", "from", "75", "-", "175", "d", ".", "%", "-", "ion", "intensity", ",", "m", "/", "z", "-", "mass", "-", "to", "-", "charge", ".", "Data", "were", "acquired", "in", "data", "-", "independent", "analysis", "mode", "(", "MSE", ")", ".", "D", "Representative", "chromatograms", "of", "unlabeled", "Aβ17", "-", "28", "(", "left", ")", "and", "13C", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "(", "right", ")", "in", "an", "APPtg", "brain", "after", "labeling", "from", "50", "-", "175", "d", ".", "The", "intensities", "of", "4", "transitions", "(", "y10", ",", "y9", ",", "y8", ",", "and", "y7", ")", "were", "assessed", ".", "Data", "were", "acquired", "by", "MRM", "in", "nanoflow", "mode", ".", "F", "Representative", "chromatograms", "of", "unlabeled", "Aβ17", "-", "28", "(", "left", ")", "and", "13C", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "(", "right", ")", "in", "a", "non", "-", "APPtg", "brain", "after", "labeling", "from", "90", "-", "100", "d", ".", "Data", "were", "acquired", "by", "MRM", "in", "microflow", "mode", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Relative (left) and absolute (right) amount of 13C-Lys-labeled and unlabeled Aβ in APPtg mouse brains after labeling from 75-125 d (n = 1), 75-175 d (n = 4), 50-100 d (n = 5), 50-125 d (n = 2), 50-150 (n = 4) or 50-175 d (n = 9) of age. Error bars show mean ± SD.C Representative chromatogram and mass spectra of doubly charged ions of unlabeled Aβ17-28 (663.3 m/z) and 13C-Lys Aβ17-28 (666.3 m/z) in an APPtg brain after labeling from 75-175 d. %- ion intensity, m/z- mass-to-charge. Data were acquired in data-independent analysis mode (MSE). D Representative chromatograms of unlabeled Aβ17-28 (left) and 13C-Lys Aβ17-28 (right) in an APPtg brain after labeling from 50-175 d. The intensities of 4 transitions (y10, y9, y8, and y7) were assessed. Data were acquired by MRM in nanoflow mode.F Representative chromatograms of unlabeled Aβ17-28 (left) and 13C-Lys Aβ17-28 (right) in a non-APPtg brain after labeling from 90-100 d. Data were acquired by MRM in microflow mode."}
{"words": ["Figure", "2A", "MALDI", "-", "TOF", "mass", "spectrum", "of", "trypsin", "-", "digested", ",", "synthetic", "Aβ1", "-", "42", "(", "10", "pmol", ")", ".", "The", "Aβ17", "-", "28", "[", "MH", "]", "+", "fragment", "was", "detected", "with", "the", "highest", "intensity", ".", "Measurements", "in", "reflectron", "positive", "mode", ".", "The", "sequence", "of", "Aβ1", "-", "42", "with", "the", "tryptic", "cleavage", "sites", "is", "indicated", "at", "the", "topB", "MS", "/", "MS", "spectrum", "of", "unlabeled", "Aβ17", "-", "28", "and", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "synthetic", "peptides", "in", "the", "50", "fmol", "range", ".", "m", "/", "z", "of", "precursors", "ions", "(", "m", "/", "z", "663", ".", "34", "for", "Aβ17", "-", "28", "[", "MH", "]", "2", "+", ",", "m", "/", "z", "667", ".", "36", "for", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "[", "MH", "]", "2", "+", ")", "and", "their", "derived", "fragments", "are", "indicated", "as", "a", "series", "of", "y", "ions", "(", "y4", "-", "y10", ")", ".", "The", "peptides", "were", "analyzed", "in", "data", "independent", "acquisition", "MSE", "modeC", "Decreasing", "quantities", "of", "synthetic", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ1", "-", "42", "were", "trypsin", "-", "digested", "and", "analyzed", "by", "MRM", ".", "The", "intensities", "of", "4", "transitions", "(", "y10", ",", "y9", ",", "y8", ",", "and", "y7", ")", "were", "assessed", "for", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", ",", "showing", "a", "detection", "limit", "level", "of", "25", "amol", ".", "Measurements", "in", "technical", "triplicates", ",", "normalization", "to", "total", "ion", "current", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±", "SDD", "Decreasing", "quantities", "of", "synthetic", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ1", "-", "42", "were", "spiked", "into", "the", "insoluble", "fraction", "of", "APPtg", "brains", ",", "immunoprecipitated", ",", "trypsin", "-", "digested", ",", "and", "analyzed", "by", "MRM", ".", "Assessment", "of", "the", "intensities", "of", "y10", ",", "y9", ",", "y8", "and", "y7", "showed", "a", "detection", "limit", "level", "of", "50", "amol", "for", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "and", "detected", "an", "excess", "of", "brain", "-", "derived", "unlabeled", "Aβ17", "-", "28", ".", "Measurements", "in", "technical", "triplicates", ",", "normalization", "to", "total", "ion", "current", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A MALDI-TOF mass spectrum of trypsin-digested, synthetic Aβ1-42 (10 pmol). The Aβ17-28 [MH]+ fragment was detected with the highest intensity. Measurements in reflectron positive mode. The sequence of Aβ1-42 with the tryptic cleavage sites is indicated at the topB MS/MS spectrum of unlabeled Aβ17-28 and 13C15N-Lys Aβ17-28 synthetic peptides in the 50 fmol range. m/z of precursors ions (m/z 663.34 for Aβ17-28 [MH]2+, m/z 667.36 for 13C15N-Lys Aβ17-28 [MH]2+) and their derived fragments are indicated as a series of y ions (y4-y10). The peptides were analyzed in data independent acquisition MSE modeC Decreasing quantities of synthetic 13C15N-Lys Aβ1-42 were trypsin-digested and analyzed by MRM. The intensities of 4 transitions (y10, y9, y8, and y7) were assessed for 13C15N-Lys Aβ17-28, showing a detection limit level of 25 amol. Measurements in technical triplicates, normalization to total ion current. Error bars show mean ± SDD Decreasing quantities of synthetic 13C15N-Lys Aβ1-42 were spiked into the insoluble fraction of APPtg brains, immunoprecipitated, trypsin-digested, and analyzed by MRM. Assessment of the intensities of y10, y9, y8 and y7 showed a detection limit level of 50 amol for 13C15N-Lys Aβ17-28 and detected an excess of brain-derived unlabeled Aβ17-28. Measurements in technical triplicates, normalization to total ion current. Error bars show mean ± SD"}
{"words": ["Figure", "3B", "Temporal", "MRM", "analysis", "of", "13C", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "and", "unlabeled", "Aβ17", "-", "28", "in", "the", "liver", ",", "spleen", ",", "mesenteric", "lymph", "nodes", ",", "and", "peritoneal", "cells", "after", "13C", "-", "Lys", "-", "APPtg", "brain", "extract", "i", ".", "p", ".", "injection", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "time", "point", "and", "tissue", "at", "1", "-", "10", "d", ",", "except", "for", "n", "=", "2", "mice", "for", "peritoneal", "cells", "at", "3", "d", ";", "n", "=", "4", "mice", "per", "time", "point", "and", "tissue", "at", "25", "-", "100", "d", ",", "except", "for", "n", "=", "3", "mice", "for", "spleen", "at", "100", "d", ")", ".", "Measurements", "in", "technical", "triplicates", ",", "normalization", "to", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "intensity", "as", "a", "spiked", "internal", "standard", "and", "additionally", "to", "organ", "weight", "(", "mg", ")", "for", "lymph", "nodes", ".", "Error", "bars", "show", "median", "±", "interquartile", "range", ".", "C", "Temporal", "4G8", "immunoassay", "quantification", "of", "Aβ42", "in", "the", "liver", ",", "spleen", ",", "mesenteric", "lymph", "nodes", ",", "and", "peritoneal", "cells", "after", "unlabeled", "APPtg", "(", "n", "=", "8", "mice", "at", "5", "h", "-", "7", "d", ",", "except", "for", "n", "=", "5", "mice", "for", "peritoneal", "lavage", ",", "n", "=", "5", "mice", "at", "10", "-", "14", "d", ",", "n", "=", "4", "mice", "at", "21", "d", ")", "or", "non", "-", "tg", "brain", "extract", "injection", "(", "n", "=", "2", "mice", "at", "5", "h", "and", "3", "d", ",", "n", "=", "3", "mice", "at", "1", "d", ",", "n", "=", "1", "mouse", "at", "5", "and", "7", "d", ",", "except", "for", "peritoneal", "cells", "where", "n", "=", "1", "mouse", "at", "5", "h", "and", "3", "d", ",", "and", "n", "=", "2", "mice", "at", "1", "d", ")", ".", "Error", "bars", "show", "median", "±", "interquartile", "range", ".", "D", "Normalization", "of", "APPtg", "extract", "group", "data", "presented", "in", "(", "C", ")", "to", "organ", "weight", "(", "mg", ")", "and", "injected", "Aβ", "amount", "(", "range", "1", ",", "027", "-", "1", ",", "426", "ng", ")", ".", "Error", "bars", "show", "median", "±", "interquartile", "range", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Temporal MRM analysis of 13C-Lys Aβ17-28 and unlabeled Aβ17-28 in the liver, spleen, mesenteric lymph nodes, and peritoneal cells after 13C-Lys-APPtg brain extract i.p. injection (n = 3 mice per time point and tissue at 1-10 d, except for n = 2 mice for peritoneal cells at 3 d; n = 4 mice per time point and tissue at 25-100 d, except for n = 3 mice for spleen at 100 d). Measurements in technical triplicates, normalization to 13C15N-Lys Aβ17-28 intensity as a spiked internal standard and additionally to organ weight (mg) for lymph nodes. Error bars show median ± interquartile range.C Temporal 4G8 immunoassay quantification of Aβ42 in the liver, spleen, mesenteric lymph nodes, and peritoneal cells after unlabeled APPtg (n = 8 mice at 5 h - 7 d, except for n = 5 mice for peritoneal lavage, n = 5 mice at 10-14 d, n = 4 mice at 21 d) or non-tg brain extract injection (n = 2 mice at 5 h and 3 d, n = 3 mice at 1 d, n = 1 mouse at 5 and 7 d, except for peritoneal cells where n = 1 mouse at 5 h and 3 d, and n = 2 mice at 1 d). Error bars show median ± interquartile range. D Normalization of APPtg extract group data presented in (C) to organ weight (mg) and injected Aβ amount (range 1,027-1,426 ng). Error bars show median ± interquartile range."}
{"words": ["Figure", "4A", "Temporal", "MRM", "analysis", "of", "unlabeled", "Aβ17", "-", "28", "and", "13C", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "in", "the", "soluble", "brain", "fraction", "after", "13C", "-", "Lys", "APPtg", "brain", "extract", "i", ".", "p", ".", "injection", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "time", "point", "at", "1", "-", "10", "d", ",", "n", "=", "4", "mice", "per", "time", "point", "at", "25", "-", "100", "d", ")", ".", "Data", "information", ":", "measurements", "in", "technical", "triplicates", ",", "normalization", "to", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "intensity", "as", "a", "spiked", "internal", "standard", "and", "brain", "weight", "(", "mg", ")", ".", "All", "error", "bars", "show", "mean", "±", "SD", ".", "Comparative", "MRM", "analysis", "of", "13C", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "(", "B", ")", "in", "the", "insoluble", "brain", "fraction", "after", "13C", "-", "Lys", "-", "APPtg", "brain", "extract", "(", "donors", "labeled", "for", "50", "-", "125", "d", ")", "and", "13C", "-", "Lys", "-", "non", "-", "tg", "brain", "extract", "(", "donors", "labeled", "for", "10", "d", ")", "i", ".", "p", ".", "injection", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", "and", "time", "point", "at", "1", "-", "10", "d", ",", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", "and", "time", "point", "at", "25", ",", "50", ",", "100", "d", ",", "n", "=", "3", "mice", "in", "the", "APPtg", "extract", "group", "and", "n", "=", "4", "in", "the", "non", "-", "tg", "extract", "group", "at", "75", "d", ")", ",", "right", "side", "zoom", "for", "time", "points", "1", "-", "10", "d", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "P", "=", "0", ".", "0129", "at", "3", "d", ",", "P", "=", "0", ".", "0156", "at", "10", "d", ",", "P", "=", "0", ".", "0109", "at", "25", "d", ")", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "P", "=", "0", ".", "0091", "at", "1", "d", ",", "P", "=", "0", ".", "0011", "at", "5", "d", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "P", "=", "0", ".", "0006", "at", "7", "d", ")", ",", "13C", "-", "Lys", "APPtg", "extract", "-", "injected", "vs", "13C", "-", "Lys", "non", "-", "tg", "extract", "-", "injected", "for", "each", "time", "point", ".", "Data", "information", ":", "measurements", "in", "technical", "triplicates", ",", "normalization", "to", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "intensity", "as", "a", "spiked", "internal", "standard", "and", "brain", "weight", "(", "mg", ")", ".", "All", "error", "bars", "show", "mean", "±", "SD", ".", "C", "Comparative", "MRM", "analysis", "of", "unlabeled", "Aβ17", "-", "28", "(", "C", ")", "in", "the", "insoluble", "brain", "fraction", "after", "13C", "-", "Lys", "-", "APPtg", "brain", "extract", "(", "donors", "labeled", "for", "50", "-", "125", "d", ")", "and", "13C", "-", "Lys", "-", "non", "-", "tg", "brain", "extract", "(", "donors", "labeled", "for", "10", "d", ")", "i", ".", "p", ".", "injection", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", "and", "time", "point", "at", "1", "-", "10", "d", ",", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", "and", "time", "point", "at", "25", ",", "50", ",", "100", "d", ",", "n", "=", "3", "mice", "in", "the", "APPtg", "extract", "group", "and", "n", "=", "4", "in", "the", "non", "-", "tg", "extract", "group", "at", "75", "d", ")", ",", "right", "side", "zoom", "for", "time", "points", "1", "-", "10", "d", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "P", "=", "0", ".", "0129", "at", "3", "d", ",", "P", "=", "0", ".", "0156", "at", "10", "d", ",", "P", "=", "0", ".", "0109", "at", "25", "d", ")", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "P", "=", "0", ".", "0091", "at", "1", "d", ",", "P", "=", "0", ".", "0011", "at", "5", "d", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "P", "=", "0", ".", "0006", "at", "7", "d", ")", ",", "13C", "-", "Lys", "APPtg", "extract", "-", "injected", "vs", "13C", "-", "Lys", "non", "-", "tg", "extract", "-", "injected", "for", "each", "time", "point", ".", "Data", "information", ":", "measurements", "in", "technical", "triplicates", ",", "normalization", "to", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "intensity", "as", "a", "spiked", "internal", "standard", "and", "brain", "weight", "(", "mg", ")", ".", "All", "error", "bars", "show", "mean", "±", "SD", ".", "D", "Comparative", "4G8", "immunoassay", "quantification", "of", "Aβ42", "in", "the", "insoluble", "brain", "fraction", "after", "13C", "-", "Lys", "APPtg", "or", "13C", "-", "Lys", "non", "-", "tg", "brain", "extract", "i", ".", "p", ".", "injection", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", "and", "time", "point", "at", "1", "-", "10", "d", ",", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", "and", "time", "point", "at", "25", "-", "100", "d", ")", ",", "right", "side", "zoom", "for", "time", "points", "1", "-", "10", "d", ".", "Normalization", "to", "protein", "concentration", ".", "E", "Representative", "chromatograms", "of", "unlabeled", "Aβ17", "-", "28", "(", "left", ")", "and", "13C", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "(", "right", ")", "in", "the", "brain", "of", "an", "unlabeled", "50", "-", "day", "-", "old", "APPtg", "mouse", "not", "injected", "with", "labeled", "brain", "extract", ".", "Note", "the", "absence", "of", "13C", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", ".", "F", "MRM", "analysis", "of", "unlabeled", "and", "13C", "-", "Lys", "-", "labeled", "Aβ17", "-", "28", "in", "APPtg", "mouse", "brains", "after", "13C", "-", "Lys", "-", "labeled", "diet", "for", "1", "or", "3", "d", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "time", "point", ")", ".", "Data", "information", ":", "measurements", "in", "technical", "triplicates", ",", "normalization", "to", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "intensity", "as", "a", "spiked", "internal", "standard", "and", "brain", "weight", "(", "mg", ")", ".", "All", "error", "bars", "show", "mean", "±", "SD", ".", "G", "Comparative", "MRM", "analysis", "of", "13C", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "in", "the", "insoluble", "brain", "fraction", "after", "13C", "-", "Lys", "APPtg", "and", "13C", "-", "Lys", "non", "-", "tg", "brain", "extract", "(", "all", "donors", "labeled", "for", "100", "d", ")", "i", ".", "p", ".", "injection", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "measurements", "in", "technical", "triplicates", ",", "normalization", "to", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "intensity", "as", "a", "spiked", "internal", "standard", "and", "brain", "weight", "(", "mg", ")", ".", "All", "error", "bars", "show", "mean", "±", "SD", ".", "H", "MRM", "analysis", "of", "unlabeled", "and", "13C", "-", "Lys", "-", "labeled", "Aβ17", "-", "28", "in", "non", "-", "APPtg", "mouse", "brains", "after", "13C", "-", "Lys", "-", "labeled", "diet", "for", "1", "d", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "or", "at", "1", "d", "after", "13C", "-", "Lys", "-", "APPtg", "brain", "extract", "i", ".", "p", ".", "injection", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "Data", "information", ":", "measurements", "in", "technical", "triplicates", ",", "normalization", "to", "13C15N", "-", "Lys", "Aβ17", "-", "28", "intensity", "as", "a", "spiked", "internal", "standard", "and", "brain", "weight", "(", "mg", ")", ".", "All", "error", "bars", "show", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Temporal MRM analysis of unlabeled Aβ17-28 and 13C-Lys Aβ17-28 in the soluble brain fraction after 13C-Lys APPtg brain extract i.p. injection (n = 3 mice per time point at 1-10 d, n = 4 mice per time point at 25-100 d). Data information: measurements in technical triplicates, normalization to 13C15N-Lys Aβ17-28 intensity as a spiked internal standard and brain weight (mg). All error bars show mean ± SD.Comparative MRM analysis of 13C-Lys Aβ17-28 (B) in the insoluble brain fraction after 13C-Lys-APPtg brain extract (donors labeled for 50-125 d) and 13C-Lys-non-tg brain extract (donors labeled for 10 d) i.p. injection (n = 3 mice per group and time point at 1-10 d, n = 4 mice per group and time point at 25, 50, 100 d, n = 3 mice in the APPtg extract group and n = 4 in the non-tg extract group at 75 d), right side zoom for time points 1-10 d. Unpaired two-tailed t-test * p<0.05 (P=0.0129 at 3 d, P=0.0156 at 10 d, P=0.0109 at 25 d), ** p<0.01 (P=0.0091 at 1 d, P=0.0011 at 5 d), *** p<0.001 (P=0.0006 at 7 d), 13C-Lys APPtg extract-injected vs 13C-Lys non-tg extract-injected for each time point. Data information: measurements in technical triplicates, normalization to 13C15N-Lys Aβ17-28 intensity as a spiked internal standard and brain weight (mg). All error bars show mean ± SD.C Comparative MRM analysis of unlabeled Aβ17-28 (C) in the insoluble brain fraction after 13C-Lys-APPtg brain extract (donors labeled for 50-125 d) and 13C-Lys-non-tg brain extract (donors labeled for 10 d) i.p. injection (n = 3 mice per group and time point at 1-10 d, n = 4 mice per group and time point at 25, 50, 100 d, n = 3 mice in the APPtg extract group and n = 4 in the non-tg extract group at 75 d), right side zoom for time points 1-10 d. Unpaired two-tailed t-test * p<0.05 (P=0.0129 at 3 d, P=0.0156 at 10 d, P=0.0109 at 25 d), ** p<0.01 (P=0.0091 at 1 d, P=0.0011 at 5 d), *** p<0.001 (P=0.0006 at 7 d), 13C-Lys APPtg extract-injected vs 13C-Lys non-tg extract-injected for each time point. Data information: measurements in technical triplicates, normalization to 13C15N-Lys Aβ17-28 intensity as a spiked internal standard and brain weight (mg). All error bars show mean ± SD.D Comparative 4G8 immunoassay quantification of Aβ42 in the insoluble brain fraction after 13C-Lys APPtg or 13C-Lys non-tg brain extract i.p. injection (n = 3 mice per group and time point at 1-10 d, n = 4 mice per group and time point at 25-100 d), right side zoom for time points 1-10 d. Normalization to protein concentration.E Representative chromatograms of unlabeled Aβ17-28 (left) and 13C-Lys Aβ17-28 (right) in the brain of an unlabeled 50-day-old APPtg mouse not injected with labeled brain extract. Note the absence of 13C-Lys Aβ17-28.F MRM analysis of unlabeled and 13C-Lys-labeled Aβ17-28 in APPtg mouse brains after 13C-Lys-labeled diet for 1 or 3 d (n = 3 mice per time point). Data information: measurements in technical triplicates, normalization to 13C15N-Lys Aβ17-28 intensity as a spiked internal standard and brain weight (mg). All error bars show mean ± SD.G Comparative MRM analysis of 13C-Lys Aβ17-28 in the insoluble brain fraction after 13C-Lys APPtg and 13C-Lys non-tg brain extract (all donors labeled for 100 d) i.p. injection (n = 6 mice per group). Data information: measurements in technical triplicates, normalization to 13C15N-Lys Aβ17-28 intensity as a spiked internal standard and brain weight (mg). All error bars show mean ± SD.H MRM analysis of unlabeled and 13C-Lys-labeled Aβ17-28 in non-APPtg mouse brains after 13C-Lys-labeled diet for 1 d (n = 3 mice) or at 1 d after 13C-Lys-APPtg brain extract i.p. injection (n = 3 mice). Data information: measurements in technical triplicates, normalization to 13C15N-Lys Aβ17-28 intensity as a spiked internal standard and brain weight (mg). All error bars show mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "5", "-", "day", "-", "old", "seedlings", "of", "wild", "-", "type", "Arabidopsis", "thaliana", "Col", "-", "0", "and", "TF", "mutants", "gata12", "and", "wri3", "grown", "in", "the", "dark", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "mm", ".", "(", "B", ")", "Heat", "map", "indicates", "which", "TFs", "significantly", "affects", "hypocotyl", "length", ",", "root", "length", "and", "the", "composite", "trait", "of", "root", "to", "total", "length", "in", "dark", "-", "grown", "seedlings", "and", "whether", "the", "effects", "of", "TFs", "are", "dependent", "on", "condition", ".", "TFs", "are", "hierarchically", "clustered", "using", "Euclidean", "distance", ".", "(", "C", ")", "Heat", "map", "of", "the", "average", "relative", "effects", "of", "TF", "mutant", "alleles", "on", "hypocotyl", "length", ",", "root", "length", "and", "the", "ratio", "of", "root", "to", "total", "length", "reveal", "that", "TF", "lesions", "significantly", "perturbed", "TCA", "cycle", "-", "dependent", "growth", ".", "Mutant", "alleles", "are", "listed", "in", "rows", "and", "traits", "in", "columns", ".", "Cells", "of", "TF", "mutant", "alleles", "in", "heat", "map", "are", "colored", "if", "the", "AGI", "or", "AGI", ":", "TCA", "Metabolite", "linear", "model", "terms", "for", "each", "trait", "are", "statistically", "significant", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "16", "-", "20", "seedlings", "per", "genotype", "per", "condition", "across", "two", "experiments", "per", "genotype", ")", ".", "Mutant", "alleles", "are", "hierarchically", "clustered", "using", "Euclidean", "distance", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative 5-day-old seedlings of wild-type Arabidopsis thaliana Col-0 and TF mutants gata12 and wri3 grown in the dark. Scale bar, 1 mm.(B) Heat map indicates which TFs significantly affects hypocotyl length, root length and the composite trait of root to total length in dark-grown seedlings and whether the effects of TFs are dependent on condition. TFs are hierarchically clustered using Euclidean distance.(C) Heat map of the average relative effects of TF mutant alleles on hypocotyl length, root length and the ratio of root to total length reveal that TF lesions significantly perturbed TCA cycle-dependent growth. Mutant alleles are listed in rows and traits in columns. Cells of TF mutant alleles in heat map are colored if the AGI or AGI:TCA Metabolite linear model terms for each trait are statistically significant (P < 0.05, two-way ANOVA, 16-20 seedlings per genotype per condition across two experiments per genotype). Mutant alleles are hierarchically clustered using Euclidean distance."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Heat", "map", "indicates", "which", "TFs", "significantly", "affects", "rosette", "area", ",", "growth", "rate", ",", "shoot", "biomass", ",", "flowering", "time", "and", "seed", "yield", "and", "whether", "the", "effects", "of", "TFs", "are", "dependent", "on", "salt", "treatment", ".", "TFs", "are", "hierarchically", "clustered", "using", "Euclidean", "distance", ".", "(", "C", ")", "Rosette", "area", "of", "mutant", "allele", "of", "BPC4", "from", "day", "7", "to", "day", "21", "post", "-", "germination", ".", "Linear", "model", "for", "two", "-", "way", "ANOVA", "considers", "AGI", ",", "salt", "treatment", ",", "day", "post", "-", "germination", "and", "their", "interactions", ".", "The", "AGI", "and", "AGI", ":", "Salt", "Condition", "terms", "are", "statistically", "signification", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "respectively", ")", ".", "Heat", "map", "under", "line", "plot", "indicates", "which", "term", "in", "linear", "model", "is", "statistically", "significant", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "for", "each", "day", "from", "9", "biological", "replicates", "per", "condition", ".", "Solid", "lines", ",", "Col", "-", "0", ";", "dashed", "line", ",", "bpc4", ";", "circle", ",", "control", "condition", ";", "triangle", ",", "50", "mM", "NaCl", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Heat map indicates which TFs significantly affects rosette area, growth rate, shoot biomass, flowering time and seed yield and whether the effects of TFs are dependent on salt treatment. TFs are hierarchically clustered using Euclidean distance.(C) Rosette area of mutant allele of BPC4 from day 7 to day 21 post-germination. Linear model for two-way ANOVA considers AGI, salt treatment, day post-germination and their interactions. The AGI and AGI:Salt Condition terms are statistically signification (P < 0.001, P < 0.01, respectively). Heat map under line plot indicates which term in linear model is statistically significant (P < 0.05) using two-way ANOVA for each day from 9 biological replicates per condition. Solid lines, Col-0; dashed line, bpc4; circle, control condition; triangle, 50 mM NaCl."}
{"words": ["Figure", "1C", ")", "Western", "Blot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "PgP", "and", "control", "(", "α", "-", "TUBB", ")", "in", "RPE", "-", "1", "parental", "and", "Taxol", "resistant", "clones", ".", "E", ")", "Representative", "smRNA", "-", "FISH", "images", "of", "RPE", "-", "1", "Parental", "and", "clones", "for", "the", "ABCB1", "gene", "and", "DAPI", ".", "The", "images", "are", "projections", "of", "0", ",", "5μm", "sections", "and", "a", "total", "5", "μm", "in", "thickness", ".", "Scale", "bar", ",", "15μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C) Western Blot showing the levels of the PgP and control (α-TUBB) in RPE-1 parental and Taxol resistant clones.E) Representative smRNA-FISH images of RPE-1 Parental and clones for the ABCB1 gene and DAPI. The images are projections of 0,5μm sections and a total 5 μm in thickness. Scale bar, 15μm."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "TLA", "analysis", "for", "ABCB1", "contacts", "in", "RPE", "-", "1", "parental", "and", "Taxol", "resistant", "clone", "sg6C9", "covering", "the", "whole", "genome", ".", "Green", "arrow", "in", "sg6C9", "shows", "a", "de", "novo", "interaction", "found", "between", "ABCB1", "and", "a", "region", "in", "chromosome", "6", ".", "B", ")", "TLA", "analysis", "for", "RPE", "-", "1", "Parental", "and", "sg6C9", ".", "Zoom", "in", "in", "the", "region", "of", "chr6", "with", "de", "novo", "interaction", "for", "sg6C9", ".", "Image", "modified", "from", "IGV", "viewer", ".", "D", ")", "PCR", "products", "using", "the", "primers", "in", "C", "(", "1", ")", "over", "the", "ABCB1", "and", "EEF1A1", "regions", "in", "RPE", "-", "1", "Parental", "and", "the", "different", "Taxol", "resistant", "clones", ".", "E", ")", "PCR", "products", "using", "the", "primers", "in", "C", "(", "2", ")", "over", "the", "specific", "break", "site", "in", "the", "ABCB1", "promoter", "in", "RPE", "-", "1", "Parental", "and", "the", "different", "Taxol", "resistant", "clones", ".", "G", ")", "Percentage", "of", "RPE", "-", "1", "cells", "targeted", "with", "the", "ABCB1", "promoter", "sgRNAs", "found", "with", "vector", "integration", ".", "Percentages", "were", "calculated", "from", "data", "in", "Fig", "1A", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "CFA", "replicate", "experiment", ".", "Horizontal", "bars", "represent", "the", "mean", "of", "lentiviral", "integratation", "per", "sgRNA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) TLA analysis for ABCB1 contacts in RPE-1 parental and Taxol resistant clone sg6C9 covering the whole genome. Green arrow in sg6C9 shows a de novo interaction found between ABCB1 and a region in chromosome 6. B) TLA analysis for RPE-1 Parental and sg6C9. Zoom in in the region of chr6 with de novo interaction for sg6C9. Image modified from IGV viewer.D) PCR products using the primers in C(1) over the ABCB1 and EEF1A1 regions in RPE-1 Parental and the different Taxol resistant clones. E) PCR products using the primers in C(2) over the specific break site in the ABCB1 promoter in RPE-1 Parental and the different Taxol resistant clones.G) Percentage of RPE-1 cells targeted with the ABCB1 promoter sgRNAs found with vector integration. Percentages were calculated from data in Fig 1A. Each dot represents a CFA replicate experiment. Horizontal bars represent the mean of lentiviral integratation per sgRNA."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "H3K9me3", "ChIP", "-", "sequencing", "tracks", "from", "the", "q21", ".", "12", "arm", "of", "chromosome", "7", "in", "RPE", "-", "1", "cells", "(", "Parental", "and", "Taxol", "-", "resistant", "clones", ")", ".", "The", "ABCB1", "gene", "region", "is", "shown", "in", "pink", ".", "Each", "colored", "track", "shows", "the", "H3k9me3", "profile", "of", "a", "different", "Taxol", "-", "resistant", "clone", ".", "B", ")", "H3K9me3", "ChIP", "-", "qPCR", "in", "the", "ABCB1", "promoter", "region", ".", "Bar", "graph", "show", "primer", "pairs", "amplifying", "the", "sgRNA", "#", "6", "break", "and", "spanning", "this", "region", "(", "+", "/", "-", "base", "pairs", ")", "for", "each", "Taxol", "-", "resistant", "clone", "compared", "to", "the", "parental", ".", "Bar", "plots", "show", "the", "mean", "of", "H3K9me3", "relative", "enrichment", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "technical", "replicate", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) H3K9me3 ChIP-sequencing tracks from the q21.12 arm of chromosome 7 in RPE-1 cells (Parental and Taxol-resistant clones). The ABCB1 gene region is shown in pink. Each colored track shows the H3k9me3 profile of a different Taxol-resistant clone.B) H3K9me3 ChIP-qPCR in the ABCB1 promoter region. Bar graph show primer pairs amplifying the sgRNA#6 break and spanning this region (+/- base pairs) for each Taxol-resistant clone compared to the parental. Bar plots show the mean of H3K9me3 relative enrichment. Each dot represents a technical replicate (n=3)."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "vBcl", "-", "2", "binding", "proteins", ".", "After", "transfection", ",", "293T", "cells", "were", "used", "for", "GST", "-", "pulldown", "and", "the", "purified", "proteins", "were", "detected", "by", "silver", "staining", ".", "(", "c", ")", "UVRAG", "binds", "Beclin1", "through", "its", "CCD", ".", "After", "transfection", "with", "Beclin1", "-", "V5", ",", "together", "with", "full", "-", "length", "or", "fragments", "of", "Flag", "-", "UVRAG", ",", "293T", "whole", "cell", "lysates", "(", "WCLs", ")", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "with", "anti", "-", "Flag", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "with", "anti", "-", "V5", ".", "(", "d", ")", "Interactions", "between", "endogenous", "UVRAG", "and", "Beclin1", "and", "between", "endogenous", "UVRAG", "and", "PI", "(", "3", ")", "KC3", ".", "293T", "cell", "lysates", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "preimmune", "sera", "or", "anti", "-", "Beclin1", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "UVRAG", "or", "anti", "-", "Beclin1", ",", "or", "for", "immunoprecipitation", "with", "preimmune", "sera", "or", "anti", "-", "UVRAG", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "PI", "(", "3", ")", "KC3", ".", "(", "e", ")", "UVRAGCCD", "is", "required", "for", "Beclin1", "interaction", ".", "After", "transfection", "with", "Beclin1", "-", "V5", "(", "lanes", "2", "and", "4", ")", "together", "with", "Flag", "-", "UVRAGΔCCD", "(", "lanes", "1", "and", "2", ")", "or", "Flag", "-", "UVRAGΔC2", "(", "lanes", "3", "and", "4", ")", ",", "WCLs", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Flag", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "V5", ".", "(", "f", ")", "Beclin1", "binds", "UVRAG", "through", "its", "CCD", ".", "After", "transfection", "with", "Flag", "-", "UVRAG", "together", "with", "full", "-", "length", "or", "fragments", "of", "Beclin1", "-", "V5", ",", "WCLs", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "V5", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Flag", ".", "(", "g", ")", "An", "increase", "in", "UVRAG", "stability", "induced", "by", "Beclin1", ".", "After", "transfection", "with", "Flag", "-", "UVRAG", "and", "empty", "vector", "or", "Flag", "-", "UVRAG", "and", "Beclin1", "-", "V5", ",", "WCLs", "were", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "CHX", ",", "20", "μg", "ml", "−", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Flag", ".", "(", "h", ")", "UVRAG", "directly", "interacts", "with", "Beclin1", ".", "MBP", "-", "UVRAGCCD", "(", "lane", "1", ")", ",", "His6", "-", "Beclin1CCD", "(", "lane", "2", ")", "or", "mixtures", "of", "both", "proteins", "in", "a", "concentration", "dependent", "manner", "(", "lanes", "3", "-", "8", ")", ",", "were", "subjected", "to", "native", "gel", "electrophoresis", ".", "The", "numbers", "indicate", "the", "concentration", "(", "nmol", ")", "of", "protein", ".", "Arrows", "indicate", "the", "purified", "MBP", "-", "UVRAGCCD", ",", "His6", "-", "Beclin1CCD", "and", "complex", "between", "these", "two", ".", "(", "i", ")", "Beclin1CCD", "and", "UVRAGCCD", "associate", "into", "a", "α", "-", "helical", "heterodimer", ".", "After", "removing", "the", "N", "-", "terminal", "His6", "and", "MBP", "tags", ",", "the", "Beclin1CCD", "and", "the", "preformed", "Beclin1CCD", "-", "UVRAGCCD", "complex", "were", "subjected", "to", "circular", "dichroism", "spectroscopic", "analysis", ".", "The", "raw", "data", "for", "this", "experiment", "are", "presented", "in", "the", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) vBcl-2 binding proteins. After transfection, 293T cells were used for GST-pulldown and the purified proteins were detected by silver staining.(c) UVRAG binds Beclin1 through its CCD. After transfection with Beclin1-V5, together with full-length or fragments of Flag-UVRAG, 293T whole cell lysates (WCLs) were used for immunoprecipitation (IP) with anti-Flag followed by immunoblotting (IB) with anti-V5.(d) Interactions between endogenous UVRAG and Beclin1 and between endogenous UVRAG and PI(3)KC3. 293T cell lysates were used for immunoprecipitation with preimmune sera or anti-Beclin1, followed by immunoblotting with anti-UVRAG or anti-Beclin1, or for immunoprecipitation with preimmune sera or anti-UVRAG, followed by immunoblotting with anti-PI(3)KC3.(e) UVRAGCCD is required for Beclin1 interaction. After transfection with Beclin1-V5 (lanes 2 and 4) together with Flag-UVRAGΔCCD (lanes 1 and 2) or Flag-UVRAGΔC2 (lanes 3 and 4), WCLs were used for immunoprecipitation with anti-Flag followed by immunoblotting with anti-V5.(f) Beclin1 binds UVRAG through its CCD. After transfection with Flag-UVRAG together with full-length or fragments of Beclin1-V5, WCLs were used for immunoprecipitation with anti-V5 followed by immunoblotting with anti-Flag.(g) An increase in UVRAG stability induced by Beclin1. After transfection with Flag-UVRAG and empty vector or Flag-UVRAG and Beclin1-V5, WCLs were treated with cycloheximide (CHX, 20 μg ml−1) for the indicated time, followed by immunoblotting with anti-Flag.(h) UVRAG directly interacts with Beclin1. MBP-UVRAGCCD (lane 1), His6-Beclin1CCD (lane 2) or mixtures of both proteins in a concentration dependent manner (lanes 3-8), were subjected to native gel electrophoresis. The numbers indicate the concentration (nmol) of protein. Arrows indicate the purified MBP-UVRAGCCD, His6-Beclin1CCD and complex between these two.(i) Beclin1CCD and UVRAGCCD associate into a α-helical heterodimer. After removing the N-terminal His6 and MBP tags, the Beclin1CCD and the preformed Beclin1CCD-UVRAGCCD complex were subjected to circular dichroism spectroscopic analysis. The raw data for this experiment are presented in the Supplementary Information, Fig. S5."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "The", "Bcl", "-", "2", "binding", "domain", "of", "Beclin1", "is", "sufficient", "to", "bind", "vBcl", "-", "2", ".", "At", "48", "h", "posttransfection", "with", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "Beclin1", "-", "V5", ",", "together", "with", "HA", "-", "vBcl", "-", "2", ",", "WCLs", "of", "293T", "cells", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "V5", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "HA", ".", "(", "b", ")", "The", "loss", "of", "Beclin1", "interaction", "of", "vBcl", "-", "2AAA", "mutant", ".", "At", "48", "h", "posttransfection", "with", "wild", "-", "type", "HA", "-", "vBcl", "-", "2", "or", "vBcl", "-", "2AAA", "mutant", ",", "together", "with", "Beclin1", "-", "V5", ",", "WCLs", "of", "293T", "cells", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "V5", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "HA", ".", "(", "c", ")", "vBcl", "-", "2", "interaction", "with", "wild", "-", "type", "UVRAG", "in", "the", "presence", "of", "Beclin1", ".", "At", "48", "h", "posttransfection", "with", "Flag", "-", "UVRAG", "together", "with", "Beclin1", "-", "V5", "and", "HA", "-", "vBcl", "-", "2", "or", "vBcl", "-", "2AAA", "mutant", ",", "WCLs", "of", "293T", "cells", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Flag", ".", "(", "d", ")", "vBcl", "-", "2", "interaction", "with", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "in", "the", "presence", "of", "Beclin1", ".", "At", "48", "h", "posttransfection", "with", "HA", "-", "vBcl", "-", "2", "together", "with", "Flag", "-", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "and", "Beclin1", "-", "V5", ",", "WCLs", "of", "293T", "cells", "were", "used", "for", "immunprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Flag", ".", "(", "e", ")", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "N", "-", "terminal", "C2", "domain", "binds", "Beclin1", ".", "At", "48", "h", "posttransfection", "with", "Beclin1", "-", "V5", "together", "with", "full", "-", "length", "or", "fragments", "of", "Flag", "-", "PI", "(", "3", ")", "KC3", ",", "WCLs", "of", "293T", "cells", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Flag", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "V5", ".", "CAT", ",", "catalytic", "domain", ".", "(", "f", ")", "Beclin1CCD", "and", "Beclin1ECD", "are", "sufficient", "for", "binding", "PI", "(", "3", ")", "KC3", ".", "At", "48", "h", "posttransfection", "with", "Flag", "-", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "together", "with", "full", "-", "length", "or", "fragments", "of", "Beclin1", "-", "V5", ",", "WCLs", "of", "293T", "cells", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "V5", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Flag", ".", "CT", ",", "C", "terminus", "(", "aa", "337", "-", "448", ")", ".", "(", "g", ")", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "interaction", "with", "UVRAG", "in", "the", "presence", "of", "Beclin1", ".", "At", "48", "h", "posttransfection", "with", "Flag", "-", "UVRAGΔCCD", "or", "UVRAGCCD", "together", "with", "HA", "-", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "and", "Beclin1", "-", "V5", ",", "WCLs", "of", "293T", "cells", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Flag", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "HA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) The Bcl-2 binding domain of Beclin1 is sufficient to bind vBcl-2. At 48 h posttransfection with wild-type and mutant Beclin1-V5, together with HA-vBcl-2, WCLs of 293T cells were used for immunoprecipitation with anti-V5 followed by immunoblotting with anti-HA.(b) The loss of Beclin1 interaction of vBcl-2AAA mutant. At 48 h posttransfection with wild-type HA-vBcl-2 or vBcl-2AAA mutant, together with Beclin1-V5, WCLs of 293T cells were used for immunoprecipitation with anti-V5, followed by immunoblotting with anti-HA.(c) vBcl-2 interaction with wild-type UVRAG in the presence of Beclin1. At 48 h posttransfection with Flag-UVRAG together with Beclin1-V5 and HA-vBcl-2 or vBcl-2AAA mutant, WCLs of 293T cells were used for immunoprecipitation with anti-HA followed by immunoblotting with anti-Flag.(d) vBcl-2 interaction with PI(3)KC3 in the presence of Beclin1. At 48 h posttransfection with HA-vBcl-2 together with Flag-PI(3)KC3 and Beclin1-V5, WCLs of 293T cells were used for immunprecipitation with anti-HA followed by immunoblotting with anti-Flag.(e) PI(3)KC3 N-terminal C2 domain binds Beclin1. At 48 h posttransfection with Beclin1-V5 together with full-length or fragments of Flag-PI(3)KC3, WCLs of 293T cells were used for immunoprecipitation with anti-Flag followed by immunoblotting with anti-V5. CAT, catalytic domain.(f) Beclin1CCD and Beclin1ECD are sufficient for binding PI(3)KC3. At 48 h posttransfection with Flag-PI(3)KC3 together with full-length or fragments of Beclin1-V5, WCLs of 293T cells were used for immunoprecipitation with anti-V5 followed by immunoblotting with anti-Flag. CT, C terminus (aa 337-448).(g) PI(3)KC3 interaction with UVRAG in the presence of Beclin1. At 48 h posttransfection with Flag-UVRAGΔCCD or UVRAGCCD together with HA- PI(3)KC3 and Beclin1-V5, WCLs of 293T cells were used for immunoprecipitation with anti-Flag followed by immunoblotting with anti-HA."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "UVRAG", "expression", "and", "LC3", "process", "in", "HCT116", "cells", ".", "The", "same", "protein", "amounts", "of", "293T", ",", "NIH3T3", ",", "HCT116", "and", "MCF7", "cells", "were", "used", "for", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "UVRAG", "and", "anti", "-", "tubulin", ".", "WCLs", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "tagged", "UVRAG", "were", "included", "as", "controls", ".", "WCLs", "of", "HCT116", ".", "vector", "and", "HCT116", ".", "UVRAG", "were", "incubated", "with", "or", "without", "starvation", "conditions", "and", "used", "for", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "LC3", "and", "anti", "-", "tubulin", ".", "The", "raw", "data", "for", "this", "experiment", "is", "presented", "in", "the", "Supplementary", "information", ",", "Fig", ".", "S5", ".", "(", "b", ")", "Electron", "microscopy", "of", "autophagy", "in", "HCT116", "cells", ".", "HCT116", ".", "vector", "and", "HCT116", ".", "UVRAG", "cells", "were", "incubated", "under", "normal", "or", "starvation", "conditions", "for", "4", "h", "and", "subjected", "to", "scanning", "electron", "microscopy", ".", "Scale", "bars", "(", "from", "left", "to", "right", "panels", ")", "represent", "2", "nm", ",", "0", ".", "5", "nm", ",", "0", ".", "2", "nm", "and", "0", ".", "2", "nm", ".", "The", "arrows", "indicate", "autophagosome", "or", "autolysosome", ".", "(", "c", ")", "UVRAG", "induces", "autophagosome", "formation", "in", "HCT116", "cells", ".", "After", "transfection", "with", "GFP", "-", "LC3", "vector", ",", "HCT116", ".", "vector", "and", "HCT116", ".", "UVRAG", "cells", "were", "maintained", "under", "normal", "conditions", "or", "starved", "for", "3", "h", ".", "GFP", "-", "LC3", "was", "detected", "using", "an", "inverted", "fluorescence", "microscope", ".", "Arrows", "indicate", "autophagosomes", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "d", ")", "After", "transfection", "with", "GFP", "-", "LC3", "vector", ",", "HCT116", ".", "vector", "and", "HCT116", ".", "UVRAG", "cells", "were", "maintained", "under", "normal", "conditions", ",", "starved", "for", "3", "h", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "10", "mM", "3", "-", "methyladenine", "or", "treated", "with", "or", "without", "2", "μM", "rapamycin", "or", "rapamycin", "+", "10", "mM", "3", "-", "methyladenine", ".", "Autophagome", "was", "quantified", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "combined", "results", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) UVRAG expression and LC3 process in HCT116 cells. The same protein amounts of 293T, NIH3T3, HCT116 and MCF7 cells were used for immunoblotting with anti-UVRAG and anti-tubulin. WCLs of 293T cells transfected with Flag-tagged UVRAG were included as controls. WCLs of HCT116.vector and HCT116.UVRAG were incubated with or without starvation conditions and used for immunoblotting with anti-LC3 and anti-tubulin. The raw data for this experiment is presented in the Supplementary information, Fig. S5.(b) Electron microscopy of autophagy in HCT116 cells. HCT116.vector and HCT116.UVRAG cells were incubated under normal or starvation conditions for 4 h and subjected to scanning electron microscopy. Scale bars (from left to right panels) represent 2 nm, 0.5 nm, 0.2 nm and 0.2 nm. The arrows indicate autophagosome or autolysosome.(c) UVRAG induces autophagosome formation in HCT116 cells. After transfection with GFP-LC3 vector, HCT116.vector and HCT116.UVRAG cells were maintained under normal conditions or starved for 3 h. GFP-LC3 was detected using an inverted fluorescence microscope. Arrows indicate autophagosomes. The scale bars represent 10 μm.(d) After transfection with GFP-LC3 vector, HCT116.vector and HCT116.UVRAG cells were maintained under normal conditions, starved for 3 h in the absence or presence of 10 mM 3-methyladenine or treated with or without 2 μM rapamycin or rapamycin + 10 mM 3-methyladenine. Autophagome was quantified as the mean ± s.d. of combined results from three independent experiments."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "HCT116", ".", "vector", "and", "HCT116", ".", "UVRAG", "cells", "were", "labelled", "with", "LysoTracker", "and", "subjected", "to", "flow", "cytometry", "analysis", ".", "HCT116", ".", "vector", ",", "HCT116", ".", "UVRAG", ",", "and", "HCT116", ".", "UVRAG", "ΔCCD", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "wortmannin", "(", "1", "μM", ")", "for", "2", "h", "and", "their", "lysates", "were", "used", "to", "measure", "the", "lysosomal", "acid", "phosphatase", "enzymatic", "activity", ".", "Data", "represents", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "experiments", ".", "(", "b", ")", "UVRAG", "induces", "autophagosome", "formation", "in", "NIH3T3", "cells", ".", "After", "transfection", "with", "GFP", "-", "LC3", "vector", ",", "NIH3T3", ".", "vector", "and", "NIH3T3", ".", "UVRAG", "cells", "were", "maintained", "under", "normal", "conditions", ",", "starved", "for", "3", "h", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "10", "mM", "3", "-", "methyladenine", "or", "treated", "with", "or", "without", "2", "μM", "rapamycin", "or", "rapamycin", "+", "10", "mM", "3", "-", "methyladenine", ".", "Data", "represents", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) HCT116.vector and HCT116.UVRAG cells were labelled with LysoTracker and subjected to flow cytometry analysis. HCT116.vector, HCT116.UVRAG, and HCT116.UVRAG ΔCCD cells were treated with or without wortmannin (1 μM) for 2 h and their lysates were used to measure the lysosomal acid phosphatase enzymatic activity. Data represents mean ± s.d. of three experiments.(b) UVRAG induces autophagosome formation in NIH3T3 cells. After transfection with GFP-LC3 vector, NIH3T3.vector and NIH3T3.UVRAG cells were maintained under normal conditions, starved for 3 h in the absence or presence of 10 mM 3-methyladenine or treated with or without 2 μM rapamycin or rapamycin + 10 mM 3-methyladenine. Data represents mean ± s.d. of three experiments."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Autophagic", "activity", "of", "UVRAG", "mutants", ".", "HCT116", "cells", "expressing", "wild", "-", "type", "or", "mutant", "UVRAG", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", "expression", "vector", "and", "incubated", "under", "normal", "or", "starvation", "conditions", "for", "3", "h", ".", "Autophagy", "was", "quantified", "as", "described", "in", "Fig", ".", "3", ".", "(", "b", ")", "Effect", "of", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "UVRAG", "on", "Beclin1", "-", "mediated", "autophagy", ".", "MCF7", ".", "vector", ",", "MCF7", ".", "Beclin1", "and", "MCF7", ".", "Beclin1ΔECD", "cells", "were", "cotransfected", "with", "wild", "-", "type", "UVRAG", "or", "its", "mutant", "expression", "vector", "together", "with", "GFP", "-", "LC3", "expression", "vector", ".", "At", "16", "-", "18", "h", "posttransfection", ",", "cells", "were", "incubated", "under", "normal", "or", "starvation", "conditions", "for", "4", "h", ".", "Autophagy", "was", "quantified", "as", "described", "in", "Fig", ".", "3", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "20", "μm", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Interdependence", "between", "UVRAG", "and", "Beclin1", "for", "autophagosome", "induction", ".", "HCT116", ".", "vector", "and", "HCT116", ".", "UVRAG", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", ",", "Beclin1", "siRNA", "or", "UVRAG", "siRNA", "together", "with", "GFP", "-", "LC3", "expression", "vector", "as", "indicated", ".", "Autophagy", "was", "quantified", "as", "described", "in", "Fig", ".", "3", ".", "WCLs", "of", "these", "cells", "were", "used", "for", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "UVRAG", ",", "anti", "-", "Beclin1", "or", "anti", "-", "tubulin", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "20", "μm", ".", "In", "all", "figures", ",", "data", "represents", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "experiments", ".", "The", "raw", "data", "for", "c", "and", "d", "are", "presented", "in", "the", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", "S5", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Interdependence", "between", "UVRAG", "and", "Beclin1", "for", "autophagosome", "induction", ".", "MCF7", ".", "vector", ",", "MCF7", ".", "Beclin1", "and", "MCF7", ".", "Beclin1ΔECD", "cells", "(", "d", ")", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", ",", "Beclin1", "siRNA", "or", "UVRAG", "siRNA", "together", "with", "GFP", "-", "LC3", "expression", "vector", "as", "indicated", ".", "Autophagy", "was", "quantified", "as", "described", "in", "Fig", ".", "3", ".", "WCLs", "of", "these", "cells", "were", "used", "for", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "UVRAG", ",", "anti", "-", "Beclin1", "or", "anti", "-", "tubulin", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "20", "μm", ".", "In", "all", "figures", ",", "data", "represents", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "experiments", ".", "The", "raw", "data", "for", "c", "and", "d", "are", "presented", "in", "the", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Autophagic activity of UVRAG mutants. HCT116 cells expressing wild-type or mutant UVRAG were transfected with GFP-LC3 expression vector and incubated under normal or starvation conditions for 3 h. Autophagy was quantified as described in Fig. 3.(b) Effect of wild-type and mutant UVRAG on Beclin1-mediated autophagy. MCF7.vector, MCF7.Beclin1 and MCF7.Beclin1ΔECD cells were cotransfected with wild-type UVRAG or its mutant expression vector together with GFP-LC3 expression vector. At 16-18 h posttransfection, cells were incubated under normal or starvation conditions for 4 h. Autophagy was quantified as described in Fig. 3. The scale bars represent 20 μm.(c, d) Interdependence between UVRAG and Beclin1 for autophagosome induction. HCT116.vector and HCT116.UVRAG cells were transfected with control siRNA, Beclin1 siRNA or UVRAG siRNA together with GFP-LC3 expression vector as indicated. Autophagy was quantified as described in Fig. 3. WCLs of these cells were used for immunoblotting with anti-UVRAG, anti-Beclin1 or anti-tubulin. The scale bars represent 20 μm. In all figures, data represents mean ± s.d. of three experiments. The raw data for c and d are presented in the Supplementary Information, Fig S5.(c, d) Interdependence between UVRAG and Beclin1 for autophagosome induction.MCF7.vector, MCF7.Beclin1 and MCF7.Beclin1ΔECD cells (d) were transfected with control siRNA, Beclin1 siRNA or UVRAG siRNA together with GFP-LC3 expression vector as indicated. Autophagy was quantified as described in Fig. 3. WCLs of these cells were used for immunoblotting with anti-UVRAG, anti-Beclin1 or anti-tubulin. The scale bars represent 20 μm. In all figures, data represents mean ± s.d. of three experiments. The raw data for c and d are presented in the Supplementary Information, Fig S5."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Increased", "Beclin1", "-", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "interaction", "by", "UVRAG", "and", "continued", "interaction", "of", "UVRAG", "with", "Beclin1", "on", "stress", "conditions", ".", "HCT116", ".", "vector", ",", "HCT116", ".", "UVRAG", "and", "HCT116", ".", "UVRAGΔCCD", "cells", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Beclin1", ".", "WCLs", "were", "used", "for", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Beclin1", "and", "anti", "-", "PI", "(", "3", ")", "KC3", ".", "HCT116", ".", "UVRAG", "cells", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "UVRAG", "were", "incubated", "under", "nutrient", "-", "rich", "conditions", "(", "lanes", "1", "and", "2", ")", ",", "starvation", "for", "4", "h", "(", "lane", "3", ")", ",", "or", "2", "μM", "rapamycin", "treatment", "for", "2", "h", "(", "lane", "4", ")", ".", "WCLs", "were", "then", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Beclin1", "(", "lanes", "2", ",", "3", "and", "4", ")", "or", "preimmune", "antibody", "(", "lane", "1", ")", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Flag", ".", "The", "raw", "data", "for", "this", "experiment", "are", "presented", "in", "the", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S5", ".", "(", "b", ")", "Increased", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "activity", "by", "UVRAG", ".", "At", "48", "h", "posttransfection", "with", "Flag", "-", "tagged", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "with", "Beclin1", "(", "lane", "1", ")", ",", "with", "Beclin1", "+", "UVRAG", "(", "lane", "2", ")", "or", "with", "Beclin1", "+", "UVRAGΔCCD", "vector", "(", "lane", "3", ")", ",", "WCLs", "of", "293T", "cells", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Flag", "followed", "by", "an", "assay", "for", "PI", "(", "3", ")", "KC3", "lipid", "kinase", "activity", ",", "as", "described", "in", "the", "Methods", ".", "At", "16", "h", "posttransfection", "with", "p40", "(", "phox", ")", "PX", "-", "EGFP", "fusion", ",", "HCT116", ".", "vector", "and", "HCT116", ".", "UVRAG", "cells", "were", "detected", "using", "an", "inverted", "fluorescence", "microscope", ".", "p40", "(", "phox", ")", "PX", "-", "EGFP", "-", "positive", "vesicles", "were", "quantified", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "combined", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "c", ")", "Suppression", "of", "autophagy", "by", "γHV68", "vBcl", "-", "2", ".", "At", "18", "h", "posttransfection", "with", "GFP", "-", "LC3", "vector", ",", "NIH3T3", ".", "vector", ",", "NIH3T3", ".", "vBcl", "-", "2", "and", "NIH3T3", ".", "vBcl", "-", "2AAA", ",", "cells", "were", "incubated", "under", "normal", "or", "starvation", "conditions", "for", "4", "h", ".", "Subsequently", ",", "GFP", "-", "LC3", "was", "detected", "using", "an", "inverted", "fluorescence", "microscope", "and", "autophagy", "was", "quantified", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "combined", "results", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Increased Beclin1-PI(3)KC3 interaction by UVRAG and continued interaction of UVRAG with Beclin1 on stress conditions. HCT116.vector, HCT116.UVRAG and HCT116.UVRAGΔCCD cells were used for immunoprecipitation with anti-PI(3)KC3 followed by immunoblotting with anti-Beclin1. WCLs were used for immunoblotting with anti-Beclin1 and anti-PI(3)KC3. HCT116.UVRAG cells expressing Flag-tagged UVRAG were incubated under nutrient-rich conditions (lanes 1 and 2), starvation for 4 h (lane 3), or 2 μM rapamycin treatment for 2 h (lane 4). WCLs were then used for immunoprecipitation with anti-Beclin1 (lanes 2, 3 and 4) or preimmune antibody (lane 1) followed by immunoblotting with anti-Flag. The raw data for this experiment are presented in the Supplementary Information, Fig. S5.(b) Increased PI(3)KC3 activity by UVRAG. At 48 h posttransfection with Flag-tagged PI(3)KC3 with Beclin1 (lane 1), with Beclin1 + UVRAG (lane 2) or with Beclin1 + UVRAGΔCCD vector (lane 3), WCLs of 293T cells were used for immunoprecipitation with anti-Flag followed by an assay for PI(3)KC3 lipid kinase activity, as described in the Methods. At 16 h posttransfection with p40(phox) PX-EGFP fusion, HCT116.vector and HCT116.UVRAG cells were detected using an inverted fluorescence microscope. p40(phox) PX-EGFP-positive vesicles were quantified as the mean ± s.d. of combined results from three independent experiments. The scale bars represent 10 μm.(c) Suppression of autophagy by γHV68 vBcl-2. At 18 h posttransfection with GFP-LC3 vector, NIH3T3.vector, NIH3T3.vBcl-2 and NIH3T3.vBcl-2AAA, cells were incubated under normal or starvation conditions for 4 h. Subsequently, GFP-LC3 was detected using an inverted fluorescence microscope and autophagy was quantified as mean ± s.d. of combined results from three independent experiments."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "Proliferation", "rates", ".", "HCT116", ".", "vector", ",", "HCT116", ".", "UVRAG", ",", "HCT116", ".", "UVRAGΔC2", ",", "HCT116", ".", "UVRAGΔCCD", "and", "HCT116", ".", "UVRAGCCD", "cells", "(", "1", "×", "105", "per", "well", ")", "were", "seeded", "into", "6", "-", "well", "microtitre", "plates", ".", "Cell", "numbers", "were", "counted", "on", "the", "days", "indicated", ".", "The", "results", "represent", "means", "of", "three", "independent", "assays", ".", "(", "b", ")", "Anchorage", "independence", ".", "HCT116", ".", "vector", ",", "HCT116", ".", "UVRAG", ",", "HCT116", ".", "UVRAGΔC2", ",", "HCT116", ".", "UVRAGΔCCD", "and", "HCT116", ".", "UVRAGCCD", "cells", "(", "1", "×", "104", ")", "were", "incubated", "in", "soft", "agar", "as", "described", "in", "the", "Methods", ".", "After", "ten", "days", ",", "colonies", "were", "photographed", "and", "counted", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "50", "μm", ".", "(", "c", ")", "Tumorigenicity", ".", "HCT116", ".", "vector", ",", "HCT116", ".", "UVRAG", "and", "HCT116", ".", "UVRAGΔCCD", "cells", "(", "1", "×", "107", ")", "were", "subcutaneously", "injected", "into", "5", "nude", "mice", ",", "separately", ".", "At", "16", "days", "postinoculation", ",", "mice", "and", "tumours", "were", "photographed", "and", "tumour", "weights", "were", "measured", ".", "Arrows", "indicate", "location", "of", "tumours", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) Proliferation rates. HCT116.vector, HCT116.UVRAG, HCT116.UVRAGΔC2, HCT116.UVRAGΔCCD and HCT116.UVRAGCCD cells (1 × 105 per well) were seeded into 6-well microtitre plates. Cell numbers were counted on the days indicated. The results represent means of three independent assays.(b) Anchorage independence. HCT116.vector, HCT116.UVRAG, HCT116.UVRAGΔC2, HCT116.UVRAGΔCCD and HCT116.UVRAGCCD cells (1 × 104) were incubated in soft agar as described in the Methods. After ten days, colonies were photographed and counted. The scale bars represent 50 μm.(c) Tumorigenicity. HCT116.vector, HCT116.UVRAG and HCT116.UVRAGΔCCD cells (1 × 107) were subcutaneously injected into 5 nude mice, separately. At 16 days postinoculation, mice and tumours were photographed and tumour weights were measured. Arrows indicate location of tumours."}
{"words": ["Figure", "1C", ".", "qRT", "-", "PCR", "data", "showing", "induction", "of", "each", "gene", "in", "the", "iniBAC", "operon", "in", "WT", "Mtb", "cultured", "in", "low", "iron", "and", "in", "the", "virR", "mutant", "strain", "cultured", "in", "high", "iron", ",", "expressed", "as", "fold", "change", "relative", "to", "WT", "Mtb", "cultured", "in", "iron", "sufficient", "conditions", ".", "RNA", "extracted", "from", "biological", "triplicates", "was", "analyzed", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ".", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C. qRT-PCR data showing induction of each gene in the iniBAC operon in WT Mtb cultured in low iron and in the virR mutant strain cultured in high iron, expressed as fold change relative to WT Mtb cultured in iron sufficient conditions. RNA extracted from biological triplicates was analyzed. The data are presented as means +/- SEM. **P≤ 0.01 ***P ≤ 0.001 (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "MEV", "quantitation", "based", "on", "protein", "and", "lipid", "content", "in", "vesicle", "preparations", "isolated", "from", "the", "same", "number", "of", "Mtb", "cells", "treated", "with", "INH", "50", "ng", ".", "mlL", "-", "1", "for", "24", "and", "48", "h", "relative", "to", "untreated", "cells", ".", "Three", "independent", "cultures", "were", "analyzed", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", ".", "Immunodot", "blot", "assay", "detecting", "MEVs", "obtained", "from", "three", "independent", "cultures", "(", "1", ",", "2", ",", "3", ")", "and", "derived", "from", "the", "same", "number", "of", "Mtb", "exposed", "to", "50", "ng", ".", "mlL", "-", "1", "INH", "for", "24", "and", "48", "h", ".", "A", "polyclonal", "antiserum", "raised", "against", "purified", "MEV", "(", "Prados", "-", "Rosales", "et", "al", ".", ",", "2014a", ")", "was", "used", "as", "a", "primary", "antibody", ".", "E", ".", "Protein", "and", "lipid", "content", "in", "vesicle", "preparations", "isolated", "from", "the", "same", "number", "of", "WT", "and", "Msm", "overexpressing", "iniACMtb", "(", "Msm", "iniACMtb", ")", ".", "Three", "independent", "cultures", "were", "analyzed", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "H", ".", "The", "graph", "shows", "the", "avarage", "of", "nanoparticle", "size", "distribution", "in", "three", "independent", "vesicle", "preparations", "derived", "from", "WT", "(", "black", ")", "and", "Msm", "iniACMtb", "(", "grey", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. MEV quantitation based on protein and lipid content in vesicle preparations isolated from the same number of Mtb cells treated with INH 50 ng.mlL-1 for 24 and 48 h relative to untreated cells. Three independent cultures were analyzed. Data are presented as mean ± SEM ***P ≤ 0.001 (Student's t-test).B. Immunodot blot assay detecting MEVs obtained from three independent cultures (1, 2, 3) and derived from the same number of Mtb exposed to 50 ng.mlL-1 INH for 24 and 48 h. A polyclonal antiserum raised against purified MEV (Prados-Rosales et al., 2014a) was used as a primary antibody.E. Protein and lipid content in vesicle preparations isolated from the same number of WT and Msm overexpressing iniACMtb (Msm iniACMtb). Three independent cultures were analyzed. Data are presented as mean ± SEM *P≤ 0.05; *** P≤ 0.001 (Student's t-test).H. The graph shows the avarage of nanoparticle size distribution in three independent vesicle preparations derived from WT (black) and Msm iniACMtb (grey)."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Quantitation", "of", "MEVs", "released", "by", "Mtb", "strains", "in", "low", "iron", "cultures", "based", "on", "vesicle", "protein", "and", "lipid", "content", "normalized", "to", "CFUs", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "processed", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "005", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", ".", "Protein", "in", "vesicle", "isolates", "derived", "from", "three", "independent", "cultures", "of", "Mtb", "WT", "and", "iniA", ":", ":", "hyg", "mutant", "grown", "in", "low", "(", "LI", ")", "or", "high", "iron", "(", "HI", ")", "MM", "with", "or", "without", "50", "ng", "·", "mL", "-", "1", "INH", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "D", ".", "Lipid", "in", "vesicle", "isolates", "derived", "from", "three", "independent", "cultures", "of", "Mtb", "WT", "and", "iniA", ":", ":", "hyg", "mutant", "cultured", "in", "low", "(", "LI", ")", "or", "high", "iron", "(", "HI", ")", "MM", "with", "or", "without", "50", "ng", "·", "mL", "-", "1", "INH", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Quantitation of MEVs released by Mtb strains in low iron cultures based on vesicle protein and lipid content normalized to CFUs. Three biological replicates were processed. Data are presented as mean ± SD *P ≤0.05, **P≤ 0.005 (Student's t-test).C. Protein in vesicle isolates derived from three independent cultures of Mtb WT and iniA::hyg mutant grown in low (LI) or high iron (HI) MM with or without 50 ng·mL-1 INH. Data are presented as mean ± SEM *P ≤ 0.05. ***P≤ 0.001 (Student's t-test)D. Lipid in vesicle isolates derived from three independent cultures of Mtb WT and iniA::hyg mutant cultured in low (LI) or high iron (HI) MM with or without 50 ng·mL-1 INH. Data are presented as mean ± SD *P ≤ 0.05 (Student's t-test)"}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Mycobactin", "synthesized", "by", "Mtb", "WT", "and", "iniA", ":", ":", "hyg", "grown", "in", "low", "iron", "conditions", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "of", "mycobactin", "extracted", "from", "two", "independent", "cultures", ".", "C", ".", "The", "Mtb", "siderophore", "synthesis", "mutant", "(", "ST142", ")", "was", "cultured", "in", "low", "iron", "MM", "(", "medium", ")", "plain", "or", "supplemented", "with", "MEV", "preparations", "derived", "from", "equal", "number", "of", "Mtb", "WT", ",", "iniA", ":", ":", "hyg", "and", "complemented", "strains", "grown", "in", "low", "iron", "MM", ".", "ST142", "growth", "was", "determined", "based", "on", "the", "number", "of", "viable", "cells", "detected", "by", "the", "resazurine", "cell", "viability", "assay", ".", "MEV", "obtained", "from", "three", "independent", "cultures", "were", "tested", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Mycobactin synthesized by Mtb WT and iniA::hyg grown in low iron conditions. Data are presented as the mean of mycobactin extracted from two independent cultures.C. The Mtb siderophore synthesis mutant (ST142) was cultured in low iron MM (medium) plain or supplemented with MEV preparations derived from equal number of Mtb WT, iniA::hyg and complemented strains grown in low iron MM. ST142 growth was determined based on the number of viable cells detected by the resazurine cell viability assay. MEV obtained from three independent cultures were tested."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Representative", "Immunodot", "-", "blot", "of", "bacterial", "antigens", "associated", "with", "EVs", "isolated", "from", "the", "culture", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "Mtb", "WT", ",", "iniA", ":", "hyg", "and", "complemented", "strains", "versus", "uninfected", "cells", "(", "UI", ")", ".", "Anti", "-", "MEV", "specific", "antiserum", "was", "used", "for", "detection", ".", "The", "decreasing", "black", "bar", "indicates", "that", "increasing", "dilutions", "were", "spotted", "onto", "the", "membrane", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", "with", "independent", "cultures", ".", "B", ".", "Number", "of", "nanoparticles", "per", "mL", "determined", "by", "Zeta", "View", "NTA", "in", "three", "EV", "preparations", "derived", "from", "the", "culture", "supernatans", "of", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "Mtb", "WT", ",", "iniA", ":", "hyg", "and", "iniA", ":", ":", "hyg", "complemented", "strains", ".", "C", ".", "Representative", "Western", "blot", "of", "total", "EVs", "isolated", "from", "the", "CSF", "of", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "Mtb", "WT", ",", "iniA", ":", ":", "hyg", "and", "complemented", "strains", "versus", "uninfected", "cells", "(", "UI", ")", "detecting", "the", "exosome", "marker", "CD9", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "twice", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Representative Immunodot-blot of bacterial antigens associated with EVs isolated from the culture supernatants of THP-1 cells infected with Mtb WT, iniA:hyg and complemented strains versus uninfected cells (UI). Anti-MEV specific antiserum was used for detection. The decreasing black bar indicates that increasing dilutions were spotted onto the membrane. The experiment was repeated three times with independent cultures.B. Number of nanoparticles per mL determined by Zeta View NTA in three EV preparations derived from the culture supernatans of THP-1 cells infected with Mtb WT, iniA:hyg and iniA::hyg complemented strains.C. Representative Western blot of total EVs isolated from the CSF of THP-1 cells infected with Mtb WT, iniA::hyg and complemented strains versus uninfected cells (UI) detecting the exosome marker CD9. The experiment was repeated twice with similar results."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Changes", "in", "the", "expression", "of", "cytokines", "in", "THP1", "macrophages", "(", "left", ")", "and", "PBMCs", "(", "right", ")", "upon", "treatment", "with", "full", "-", "length", "S1", "subunit", "at", "1", "µg", "/", "ml", "for", "24", "hr", ".", "Data", "information", ",", "E", ".", "Effect", "of", "an", "anti", "-", "RBD", "antibody", "on", "S1", "subunit", "stimulated", "changes", "in", "the", "expression", "of", "cytokines", "in", "PBMCs", ".", "Left", ",", "a", "schematic", "showing", "the", "domain", "structure", "of", "S1", "spike", "protein", "and", "anti", "-", "RBD", "antibody", ".", "Right", ",", "changes", "in", "cytokine", "gene", "expression", "in", "response", "to", "S1", "spike", "protein", "in", "the", "presence", "or", "abscene", "of", "anti", "-", "RBD", "antibody", ".", "Gene", "expression", "was", "measured", "by", "qPCR", ".", "Cytokine", "release", "in", "the", "conditioned", "media", "was", "measured", "by", "Luminex", ".", "Full", "-", "length", "S1", "and", "S1", "subunits", "are", "purified", "from", "HEK293", "cells", ".", "Data", "information", ",", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", ";", "in", "(", "D", ")", ",", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "of", "20", "individual", "donors", ".", "Error", "bars", "denote", "SEM", ".", "∗", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "Multiple", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Changes in the expression of cytokines in THP1 macrophages (left) and PBMCs (right) upon treatment with full-length S1 subunit at 1 µg/ml for 24 hr. Data information,E. Effect of an anti-RBD antibody on S1 subunit stimulated changes in the expression of cytokines in PBMCs. Left, a schematic showing the domain structure of S1 spike protein and anti-RBD antibody. Right, changes in cytokine gene expression in response to S1 spike protein in the presence or abscene of anti-RBD antibody. Gene expression was measured by qPCR. Cytokine release in the conditioned media was measured by Luminex. Full-length S1 and S1 subunits are purified from HEK293 cells. Data information, data are shown as the mean of three technical replicates; in (D), data are shown as the mean of 20 individual donors. Error bars denote SEM. ∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, Multiple t-test."}
{"words": ["Figure", "2C", ".", "Validation", "of", "predicted", "kinases", "as", "drivers", "of", "cytokine", "release", "by", "siRNAs", "in", "THP1", "cells", ".", "Cytokine", "release", "was", "measured", "by", "Luminex", "and", "normalized", "to", "scrambled", "siRNA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C. Validation of predicted kinases as drivers of cytokine release by siRNAs in THP1 cells. Cytokine release was measured by Luminex and normalized to scrambled siRNA."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "Comparison", "of", "kinase", "inhibition", "profile", "of", "Ponatinib", "and", "Baricitinib", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. Comparison of kinase inhibition profile of Ponatinib and Baricitinib."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Dose", "-", "response", "curves", "of", "ponatinib", "treatment", "on", "SARS", "-", "Cov2", "NTD", "(", "Wuhan", ")", "-", "mediated", "cytokine", "release", "in", "PBMCs", ".", "Right", ",", "a", "table", "showing", "EC50", "(", "nM", ")", "values", "of", "ponatinib", "-", "mediated", "inhibition", "of", "cytokine", "release", "in", "response", "to", "indicated", "SARS", "-", "Cov2", "variant", "NTD", "treatments", "in", "PBMCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Dose-response curves of ponatinib treatment on SARS-Cov2 NTD (Wuhan)-mediated cytokine release in PBMCs. Right, a table showing EC50 (nM) values of ponatinib-mediated inhibition of cytokine release in response to indicated SARS-Cov2 variant NTD treatments in PBMCs."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Comparison", "of", "LPS", "and", "full", "length", "S1", "spike", "protein", "-", "mediated", "changes", "in", "cytokines", "in", "THP1", "macrophages", ".", "Data", "information", ",", ",", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", ".", "Error", "bars", "denote", "SEM", ".", "D", ".", "Representative", "H", "&", "E", "images", "showing", "Ponatinib", "alleviates", "LPS", "-", "induced", "inflammatory", "cell", "infiltration", ",", "septal", "thickening", ",", "alveolar", "edema", "in", "mouse", "lungs", ".", "Scale", "bars", "100", "µm", "(", "upper", ")", "and", "50", "µm", "(", "lower", ")", ".", "E", ".", "Plots", "showing", "pre", "-", "treatment", "(", "60", "min", ")", "with", "Ponatinib", "(", "35", "mg", "/", "Kg", ")", "inhibits", "LPS", "-", "induced", "cytokine", "release", "in", "BALF", ".", "Cytokine", "levels", "were", "measured", "using", "Luminex", ".", "Data", "information", ",", "data", "are", "mean", "of", "five", "biological", "replicates", "from", "two", "independent", "studies", ",", "error", "bars", "denote", "SEM", ".", "∗", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Comparison of LPS and full length S1 spike protein-mediated changes in cytokines in THP1 macrophages. Data information, , data are shown as the mean of three technical replicates. Error bars denote SEM.D. Representative H&E images showing Ponatinib alleviates LPS-induced inflammatory cell infiltration, septal thickening, alveolar edema in mouse lungs. Scale bars 100 µm (upper) and 50 µm (lower).E. Plots showing pre-treatment (60 min) with Ponatinib (35 mg/Kg) inhibits LPS-induced cytokine release in BALF. Cytokine levels were measured using Luminex. Data information, data are mean of five biological replicates from two independent studies, error bars denote SEM. ∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, Welch's t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "ULK1", "or", "control", "empty", "vector", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblot", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Flag", "-", "AMPKα2", "and", "HA", "-", "ULK1", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "using", "anti", "-", "Flag", "antibody", "followed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "/", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "293T", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "Flag", "-", "AMPKα2", "or", "Flag", "-", "AMPKβ1", ".", "After", "24", "h", ",", "immunoprecipitation", "was", "performed", "using", "anti", "-", "Flag", "or", "control", "anti", "-", "HA", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "ULK1", "and", "anti", "-", "Flag", "polyclonal", "antibodies", ".", "(", "D", ")", "293T", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "ULK1", "polyclonal", "antibody", "or", "control", "preimmune", "rabbit", "serum", "(", "NRS", ")", ",", "followed", "by", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "-", "ULK1", "and", "anti", "-", "AMPKα", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "293T", "cells", "were", "infected", "with", "ULK1", "shRNA", "or", "control", "shRNA", "lentiviruses", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "control", "rabbit", "IgG", "or", "anti", "-", "AMPKα", "antibody", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "ULK1", "and", "anti", "-", "AMPKα", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "Purified", "His6", "-", "AMPKα1", "/", "β1", "/", "γ1", "fusion", "proteins", "(", "250", "ng", ")", "were", "mixed", "with", "purified", "His6", "-", "tagged", "ULK1", "(", "1", "µg", ")", "or", "Bcl", "-", "XL", "(", "200", "ng", ")", "proteins", "in", "1", "%", "Triton", "X", "-", "100", "lysis", "buffer", "containing", "protease", "inhibitors", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "ULK1", "antibody", ".", "The", "resulting", "protein", "complexes", "and", "10", "%", "of", "the", "input", "proteins", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "His", "-", "Tag", "polyclonal", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) 293T cells were transfected with Flag-ULK1 or control empty vector and subjected to immunoprecipitation with anti-Flag antibody, followed by immunoblot analysis with the indicated antibodies.(B) 293T cells were co-transfected with Flag-AMPKα2 and HA-ULK1. Cell lysates were subjected to immunoprecipitation using anti-Flag antibody followed by SDS-PAGE/immunoblot analysis with anti-HA and anti-Flag antibodies.(C) 293T cells were transiently transfected with Flag-AMPKα2 or Flag-AMPKβ1. After 24 h, immunoprecipitation was performed using anti-Flag or control anti-HA antibodies and analyzed by immunoblotting with anti-ULK1 and anti-Flag polyclonal antibodies.(D) 293T cell lysates were subjected to immunoprecipitation with anti-ULK1 polyclonal antibody or control preimmune rabbit serum (NRS), followed by immunoblot analysis with anti-ULK1 and anti-AMPKα antibodies.(E) 293T cells were infected with ULK1 shRNA or control shRNA lentiviruses and subjected to immunoprecipitation with control rabbit IgG or anti-AMPKα antibody followed by immunoblotting with anti-ULK1 and anti-AMPKα antibodies.(F) Purified His6-AMPKα1/β1/γ1 fusion proteins (250 ng) were mixed with purified His6-tagged ULK1 (1 µg) or Bcl-XL (200 ng) proteins in 1% Triton X-100 lysis buffer containing protease inhibitors and subjected to immunoprecipitation with anti-ULK1 antibody. The resulting protein complexes and 10% of the input proteins were analyzed by immunoblotting with anti-His-Tag polyclonal antibody."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ",", "C", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "vector", "or", "HA", "-", "tagged", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "deletion", "mutants", "of", "ULK1", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "The", "resulting", "immune", "complexes", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "specific", "for", "mTOR", ",", "raptor", ",", "AMPKα", "or", "HA", "-", "tag", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B, C) 293T cells were transfected with empty vector or HA-tagged wild type (WT) or deletion mutants of ULK1 and subjected to immunoprecipitation with anti-HA antibody. The resulting immune complexes were analyzed by immunoblotting with antibodies specific for mTOR, raptor, AMPKα or HA-tag."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "vector", "or", "HA", "-", "tagged", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "deletion", "mutant", "(", "Δ654", "-", "828", ")", "ULK1", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "U", "-", "2OS", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "were", "infected", "with", "lentivirus", "expressing", "human", "Ulk1", "shRNA", "(", "shhUlk1", ")", "or", "scrambled", "shRNA", "(", "shScr", ")", "and", "subjected", "to", "selection", "with", "1", "µg", "/", "ml", "puromycin", "for", "5", "days", ".", "The", "cells", "were", "then", "transfected", "with", "wild", "type", "mouse", "Ulk1", "(", "mUlk1", ")", ",", "mUlk1", "Δ654", "-", "828", "or", "control", "empty", "vector", "for", "24", "h", ",", "incubated", "in", "serum", "-", "free", "DMEM", "overnight", ",", "and", "cultured", "in", "complete", "medium", "with", "or", "without", "10", "mM", "metformin", "for", "20", "h", ".", "The", "images", "were", "obtained", "using", "a", "fluorescence", "microscope", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "The", "number", "of", "GFP", "-", "LC3", "dots", "per", "GFP", "-", "positive", "cell", "in", "(", "B", ")", "was", "quantified", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "81", ")", ".", "(", "D", ")", "U", "-", "2OS", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "were", "transfected", "with", "0", ",", "2", "or", "4", "µg", "of", "pcDNA3", "encoding", "HA", "-", "tagged", "ULK1", "deletion", "mutant", "(", "554", "-", "828", ")", ".", "The", "total", "amount", "of", "plasmid", "DNA", "used", "for", "each", "transfection", "was", "normalized", "at", "4", "µg", "with", "empty", "vector", ".", "After", "24", "h", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "starved", "in", "nutrient", "-", "free", "medium", "for", "1", ".", "5", "h", ",", "fixed", "in", "4", "%", "paraformaldehyde", ",", "and", "analyzed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "The", "number", "of", "GFP", "-", "LC3", "dots", "per", "GFP", "-", "positive", "cell", "was", "quantified", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "100", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "and", "the", "asterisks", "indicate", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) 293T cells were transfected with empty vector or HA-tagged wild type (WT) or deletion mutant (Δ654-828) ULK1 and subjected to immunoprecipitation with anti-HA antibody followed by immunoblotting with the indicated antibodies.(B) U-2OS cells stably expressing GFP-LC3 were infected with lentivirus expressing human Ulk1 shRNA (shhUlk1) or scrambled shRNA (shScr) and subjected to selection with 1 µg/ml puromycin for 5 days. The cells were then transfected with wild type mouse Ulk1 (mUlk1), mUlk1 Δ654-828 or control empty vector for 24 h, incubated in serum-free DMEM overnight, and cultured in complete medium with or without 10 mM metformin for 20 h. The images were obtained using a fluorescence microscope. The scale bars represent 10 µm.(C) The number of GFP-LC3 dots per GFP-positive cell in (B) was quantified (mean ± s.d.; n = 81).(D) U-2OS cells stably expressing GFP-LC3 were transfected with 0, 2 or 4 µg of pcDNA3 encoding HA-tagged ULK1 deletion mutant (554-828). The total amount of plasmid DNA used for each transfection was normalized at 4 µg with empty vector. After 24 h transfection, the cells were starved in nutrient-free medium for 1.5 h, fixed in 4% paraformaldehyde, and analyzed by fluorescence microscopy. The number of GFP-LC3 dots per GFP-positive cell was quantified (mean ± s.d.; n = 100). Statistical significance was determined by Student's t-test and the asterisks indicate P<0.0001."}
{"words": ["Figure", "4", "293", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "ULK1", "were", "treated", "with", "1", "mM", "AICAR", "for", "the", "indicated", "times", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "or", "control", "anti", "-", "FLAG", "antibodies", ".", "The", "resulting", "immune", "complexes", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4  293 cells stably expressing HA-ULK1 were treated with 1 mM AICAR for the indicated times and subjected to immunoprecipitation with anti-HA or control anti-FLAG antibodies. The resulting immune complexes were analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "TSC2", "−", "/", "−", ",", "p53", "−", "/", "−", "MEFs", "stably", "reconstituted", "with", "wild", "-", "type", "raptor", "or", "S722A", "/", "S792A", "mutant", "raptor", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", ",", "treated", "with", "2", "mM", "AICAR", "or", "control", "vehicle", "for", "4", "h", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "fluorescent", "microscopy", ".", "The", "number", "of", "GFP", "-", "LC3", "dots", "per", "GFP", "-", "positive", "cell", "was", "counted", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "60", ")", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "TSC2", "−", "/", "−", ",", "p53", "−", "/", "−", "MEFs", "stably", "reconstituted", "with", "wild", "-", "type", "raptor", "or", "S722A", "/", "S792A", "mutant", "raptor", "were", "treated", "with", "2", "mM", "AICAR", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "lysates", "were", "prepared", "in", "RIPA", "buffer", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "levels", "of", "p62", "are", "listed", "relative", "to", "those", "of", "untreated", "WT", "raptor", "cells", ",", "which", "were", "set", "as", "1", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) TSC2−/−, p53−/− MEFs stably reconstituted with wild-type raptor or S722A/S792A mutant raptor were transfected with GFP-LC3, treated with 2 mM AICAR or control vehicle for 4 h, and then analyzed by fluorescent microscopy. The number of GFP-LC3 dots per GFP-positive cell was counted (mean ± s.d.; n = 60). The scale bars represent 10 µm.(B) TSC2−/−, p53−/− MEFs stably reconstituted with wild-type raptor or S722A/S792A mutant raptor were treated with 2 mM AICAR for the indicated times. Cell lysates were prepared in RIPA buffer and analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies. The levels of p62 are listed relative to those of untreated WT raptor cells, which were set as 1."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Clonal", "cell", "lines", "expressing", "p53", "-", "Venus", "were", "engineered", "to", "monitor", "p53", "expression", "dynamics", "(", "\"", "input", "\"", ")", "and", "two", "canonically", "regulated", "p53", "target", "promoters", "expressing", "mCherry", "(", "\"", "output", "\"", ")", "in", "response", "to", "Nutlin", "-", "3", "treatment", ".", "(", "D", ")", "Representative", "phase", "contrast", "and", "yellow", "fluorescent", "(", "indicating", "p53", "-", "Venus", "levels", ")", "images", "at", "the", "indicated", "time", "points", "for", "a", "cell", "exposed", "to", "the", "\"", "natural", "dynamics", "\"", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "p53", "-", "Venus", "expression", "in", "response", "to", "the", "\"", "natural", "dynamics", "\"", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", ".", "Single", "cell", "traces", "(", "gray", ";", "E", ")", "and", "the", "mean", "(", "red", ";", "E", ")", "are", "shown", "for", "p53", "-", "Venus", "expression", "in", "response", "to", "each", "Nutlin", "-", "3", "regimen", ".", "Heat", "map", "(", "F", ")", "shows", "an", "alternative", "representation", "of", "all", "traces", "as", "shown", "in", "(", "E", ")", ".", "N", "=", "51", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Clonal cell lines expressing p53-Venus were engineered to monitor p53 expression dynamics (\"input\") and two canonically regulated p53 target promoters expressing mCherry (\"output\") in response to Nutlin-3 treatment.(D) Representative phase contrast and yellow fluorescent (indicating p53-Venus levels) images at the indicated time points for a cell exposed to the \"natural dynamics\" Nutlin-3 dosing regimen.(E-F) p53-Venus expression in response to the \"natural dynamics\" Nutlin-3 dosing regimen. Single cell traces (gray; E) and the mean (red; E) are shown for p53-Venus expression in response to each Nutlin-3 regimen. Heat map (F) shows an alternative representation of all traces as shown in (E). N = 51 cells."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "phase", "contrast", ",", "yellow", "fluorescent", "(", "indicating", "p53", "-", "Venus", "levels", ")", ",", "and", "red", "fluorescent", "(", "indicating", "reporter", "mCherry", "levels", ")", "images", "at", "the", "indicated", "time", "points", "for", "MDM2", "promoter", "reporter", "cells", "exposed", "to", "the", "\"", "natural", "dynamics", "\"", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", ".", "(", "B", "-", "G", ")", "Single", "cell", "traces", "of", "mCherry", "expression", "for", "the", "\"", "responding", "\"", "(", "light", "gray", ")", "or", "\"", "not", "responding", "\"", "(", "dark", "gray", ")", "MDM2", "promoter", "or", "CDKN1A", "promoter", "cells", "exposed", "to", "the", "natural", "dynamics", "(", "B", ")", ",", "low", "amplitude", "(", "D", ")", ",", "high", "amplitude", "(", "D", ")", ",", "high", "frequency", "(", "E", ")", ",", "low", "frequency", "/", "short", "duration", "(", "F", ")", ",", "or", "long", "duration", "(", "G", ")", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimens", ".", "The", "average", "trace", "for", "responding", "and", "not", "responding", "cells", "is", "shown", "in", "red", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "Heat", "maps", "show", "alternative", "representation", "of", "all", "single", "cell", "traces", "below", "each", "associated", "time", "course", "plot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative phase contrast, yellow fluorescent (indicating p53-Venus levels), and red fluorescent (indicating reporter mCherry levels) images at the indicated time points for MDM2 promoter reporter cells exposed to the \"natural dynamics\" Nutlin-3 dosing regimen.(B-G) Single cell traces of mCherry expression for the \"responding\" (light gray) or \"not responding\" (dark gray) MDM2 promoter or CDKN1A promoter cells exposed to the natural dynamics (B), low amplitude (D), high amplitude (D), high frequency (E), low frequency/short duration (F), or long duration (G) Nutlin-3 dosing regimens. The average trace for responding and not responding cells is shown in red and blue, respectively. Heat maps show alternative representation of all single cell traces below each associated time course plot."}
{"words": ["Figure", "3Dose", "-", "response", "curves", "representing", "the", "rate", "of", "mCherry", "expression", "from", "the", "MDM2", "(", "pink", "dots", ")", "and", "CDKN1A", "(", "purple", "dots", ")", "promoters", "as", "a", "function", "of", "total", "p53", "levels", ".", "Values", "of", "expression", "levels", "were", "averaged", "across", "all", "cells", "in", "the", "first", "15", "-", "h", "response", "to", "the", "long", "duration", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", ".", "Solid", "black", "lines", "represent", "the", "best", "fit", "to", "a", "Hill", "function", "model", "of", "promoter", "activation", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "the", "half", "-", "maximal", "threshold", "of", "p53", "levels", "for", "promoter", "activation", "and", "the", "half", "maximal", "promoter", "activity", "for", "each", "promoter", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Dose-response curves representing the rate of mCherry expression from the MDM2 (pink dots) and CDKN1A (purple dots) promoters as a function of total p53 levels. Values of expression levels were averaged across all cells in the first 15-h response to the long duration Nutlin-3 dosing regimen. Solid black lines represent the best fit to a Hill function model of promoter activation. Dashed lines indicate the half-maximal threshold of p53 levels for promoter activation and the half maximal promoter activity for each promoter."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", "-", "G", ")", "Effects", "of", "p53", "duration", "modulation", "on", "target", "promoter", "activation", "in", "terms", "of", "the", "mean", "timing", "(", "B", ",", "E", ")", ",", "magnitude", "(", "C", ",", "F", ")", ",", "and", "rate", "(", "D", ",", "G", ")", "for", "the", "MDM2", "(", "B", "-", "D", ")", "and", "CDKN1A", "(", "E", "-", "G", ")", "promoters", "in", "response", "to", "short", "(", "light", "green", ")", "and", "long", "(", "dark", "green", ")", "p53", "durations", ".", "N", "=", "at", "least", "45", "cells", "per", "condition", ",", "error", "bars", "=", "SEM", ".", "(", "H", ")", "Mean", "nuclear", "MDM2", "-", "YFP", "levels", "in", "single", "cells", "at", "times", "corresponding", "to", "the", "first", "pulse", "(", "5", ".", "5", "h", ")", "or", "second", "pulse", "(", "11", "h", ")", "of", "p53", "expression", "in", "response", "to", "natural", "and", "long", "duration", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimens", ".", "N", "=", "at", "least", "40", "cells", "per", "condition", ",", "error", "bars", "=", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B-G) Effects of p53 duration modulation on target promoter activation in terms of the mean timing (B, E), magnitude (C, F), and rate (D, G) for the MDM2 (B-D) and CDKN1A (E-G) promoters in response to short (light green) and long (dark green) p53 durations. N = at least 45 cells per condition, error bars = SEM.(H) Mean nuclear MDM2-YFP levels in single cells at times corresponding to the first pulse (5.5 h) or second pulse (11 h) of p53 expression in response to natural and long duration Nutlin-3 dosing regimens. N = at least 40 cells per condition, error bars = SEM."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Effects", "of", "p53", "frequency", "modulation", "on", "target", "promoter", "activation", "in", "terms", "of", "the", "mean", "timing", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "magnitude", "(", "B", ",", "E", ")", ",", "and", "rate", "(", "C", ",", "F", ")", "for", "the", "MDM2", "(", "A", "-", "C", ")", "and", "CDKN1A", "(", "D", "-", "F", ")", "promoters", "in", "response", "to", "low", "(", "light", "blue", ")", ",", "natural", "(", "medium", "blue", ")", ",", "high", "(", "dark", "blue", ")", "p53", "frequencies", ".", "N", "=", "at", "least", "45", "cells", "per", "condition", ",", "error", "bars", "=", "SEM", ".", "(", "H", ")", "Percentage", "of", "responding", "cells", "for", "the", "MDM2", "and", "CDKN1A", "promoters", "in", "response", "to", "low", ",", "natural", ",", "and", "high", "frequency", "p53", "pulses", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Effects of p53 frequency modulation on target promoter activation in terms of the mean timing (A, D), magnitude (B, E), and rate (C, F) for the MDM2 (A-C) and CDKN1A (D-F) promoters in response to low (light blue), natural (medium blue), high (dark blue) p53 frequencies. N = at least 45 cells per condition, error bars = SEM.(H) Percentage of responding cells for the MDM2 and CDKN1A promoters in response to low, natural, and high frequency p53 pulses."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "phase", "contrast", ",", "red", "fluorescence", "(", "indicating", "geminin", "-", "mCherry", "levels", ")", ",", "and", "yellow", "fluorescence", "(", "indicating", "p53", "-", "Venus", "levels", ")", "images", "of", "cells", "in", "response", "to", "a", "low", "(", "A", ")", "or", "high", "(", "B", ")", "frequency", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", "over", "40", "h", ".", "(", "C", ")", "Geminin", "-", "mCherry", "traces", "in", "single", "cells", "treated", "with", "the", "low", ",", "natural", ",", "or", "high", "frequency", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimens", ".", "N", "=", "at", "least", "50", "cells", "per", "condition", ".", "Percentage", "of", "cells", "undergoing", "cell", "division", "(", "D", ")", "within", "the", "40", "h", "imaging", "in", "response", "to", "the", "low", ",", "natural", ",", "and", "high", "frequency", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimensPercentage", "of", "cells", "positive", "for", "geminin", "-", "mCherry", "expression", "(", "E", ")", "within", "the", "40", "h", "imaging", "in", "response", "to", "the", "low", ",", "natural", ",", "and", "high", "frequency", "Nutlin", "-", "3", "dosing"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-B) Representative phase contrast, red fluorescence (indicating geminin-mCherry levels), and yellow fluorescence (indicating p53-Venus levels) images of cells in response to a low (A) or high (B) frequency Nutlin-3 dosing regimen over 40 h.(C) Geminin-mCherry traces in single cells treated with the low, natural, or high frequency Nutlin-3 dosing regimens. N = at least 50 cells per condition.Percentage of cells undergoing cell division (D) within the 40 h imaging in response to the low, natural, and high frequency Nutlin-3 dosing regimensPercentage of cells positive for geminin-mCherry expression (E) within the 40 h imaging in response to the low, natural, and high frequency Nutlin-3 dosing regimens"}
{"words": ["Figure", "1B", "HeLa", "cells", "expressing", "the", "indicated", "GFP", "-", "tagged", "Nups", "were", "semi", "-", "permeabilized", "and", "incubated", "with", "mitotic", "HeLa", "cell", "extract", "at", "30ºC", ".", "NPC", "disassembly", "was", "followed", "by", "monitoring", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "respective", "Nups", "at", "the", "nuclear", "rim", "and", "influx", "of", "TRITC", "-", "dextran", ".", "Scale", "bar", ",", "30", "μm", ".", "C", "Quantification", "of", "dextran", "-", "positive", "nuclei", "over", "time", "of", "the", "experiments", "in", "(", "B", ")", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "n", ">", "100", "cells", ".", "Error", "bars", ",", "SEM", ".", "E", "Quantification", "of", "3GFP", "-", "Nup133", ",", "GFP", "-", "Nup107", "and", "2GFP", "-", "Nup58", "intensity", "at", "the", "NE", "over", "time", "of", "the", "experiments", "in", "(", "B", ")", ".", "Error", "bars", ",", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B HeLa cells expressing the indicated GFP-tagged Nups were semi-permeabilized and incubated with mitotic HeLa cell extract at 30ºC. NPC disassembly was followed by monitoring the fluorescence intensity of the respective Nups at the nuclear rim and influx of TRITC-dextran. Scale bar, 30 μm.C Quantification of dextran-positive nuclei over time of the experiments in (B). N = 3 biological replicates, n > 100 cells. Error bars, SEM.E Quantification of 3GFP-Nup133, GFP-Nup107 and 2GFP-Nup58 intensity at the NE over time of the experiments in (B). Error bars, SEM."}
{"words": ["Figure", "2B", "Input", ",", "light", "and", "dense", "fractions", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "samples", "were", "derived", "from", "the", "same", "experiment", "but", "processed", "using", "several", "gels", "and", "blots", ".", "C", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "Nups", "in", "the", "light", "fractions", "relative", "to", "the", "total", "amount", "of", "Nups", "over", "all", "fractions", ".", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ",", "except", "for", "Nup214", "(", "N", "=", "2", "biological", "replicates", ")", ".", "Error", "bars", ",", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Input, light and dense fractions were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies. The samples were derived from the same experiment but processed using several gels and blots.C Quantification of the percentage of Nups in the light fractions relative to the total amount of Nups over all fractions. N = 4 biological replicates, except for Nup214 (N = 2 biological replicates). Error bars, SEM."}
{"words": ["Figure", "3B", "Confocal", "images", "of", "metaphase", "-", "arrested", "HeLa", "cells", "expressing", "3GFP", "-", "Nup133", ",", "GFP", "-", "Nup107", ",", "GFP", "-", "Nup53", "or", "2GFP", "-", "Nup58", "that", "were", "either", "directly", "fixed", "(", "untreated", ")", "or", "first", "semi", "-", "permeabilized", "and", "then", "fixed", ".", "The", "ER", "was", "visualized", "by", "immunostaining", "with", "an", "antibody", "targeting", "calnexin", ";", "DNA", "was", "visualized", "with", "Hoechst", "(", "visible", "only", "in", "the", "merged", "channels", ")", ".", "Representative", "images", "of", "3", "biological", "replicates", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "and", "inset", "scale", "bar", ",", "1", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Confocal images of metaphase-arrested HeLa cells expressing 3GFP-Nup133, GFP-Nup107, GFP-Nup53 or 2GFP-Nup58 that were either directly fixed (untreated) or first semi-permeabilized and then fixed. The ER was visualized by immunostaining with an antibody targeting calnexin; DNA was visualized with Hoechst (visible only in the merged channels). Representative images of 3 biological replicates. Scale bar, 10 μm and inset scale bar, 1 μm."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "2D", "dSTORM", "images", "of", "interphase", "(", "A", ")", "or", "metaphase", "(", "B", ")", "U2OS", "cells", "expressing", "SNAP", "-", "tagged", "Nup96", ".", "Cells", "were", "semi", "-", "permeabilized", "with", "digitonin", "and", "Nup96", "was", "labelled", "with", "the", "BG", "-", "AF647", "SNAP", "dye", ".", "The", "SMLM", "data", "was", "reconstructed", "using", "Thunderstorm", ".", "Left", "panels", "were", "rendered", "to", "black", "and", "white", "and", "enhanced", "for", "viewing", "purposes", ".", "Insets", "(", "yellow", "dashed", "boxes", ")", "are", "displayed", "to", "the", "right", ".", "Insets", "in", "(", "A", ")", "show", "ring", "-", "shaped", "structures", "built", "by", "Y", "-", "complexes", "in", "interphase", "cells", ".", "Insets", "in", "(", "B", ")", "represents", "mitotic", "clusters", "outside", "the", "spindle", "area", "(", "class", "1", ",", "inset", "1", ")", "and", "at", "kinetochores", "(", "class", "2", ")", ".", "Scale", "bar", "(", "left", "panels", ")", ",", "10", "μm", ".", "Representative", "images", "of", "4", "biological", "replicates", ".", "Inset", "scale", "bars", ",", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B 2D dSTORM images of interphase (A) or metaphase (B) U2OS cells expressing SNAP-tagged Nup96. Cells were semi-permeabilized with digitonin and Nup96 was labelled with the BG-AF647 SNAP dye. The SMLM data was reconstructed using Thunderstorm. Left panels were rendered to black and white and enhanced for viewing purposes. Insets (yellow dashed boxes) are displayed to the right. Insets in (A) show ring-shaped structures built by Y-complexes in interphase cells. Insets in (B) represents mitotic clusters outside the spindle area (class 1, inset 1) and at kinetochores (class 2). Scale bar (left panels), 10 μm. Representative images of 4 biological replicates. Inset scale bars, 200 nm."}
{"words": ["Figure", "5A", "2D", "dSTORM", "images", "of", "a", "metaphase", "-", "arrested", "U2OS", "cell", "expressing", "Nup96", "with", "a", "SNAP", "-", "tag", ",", "labelled", "with", "BG", "-", "Alexa", "Fluor", "647", "(", "orange", ")", ",", "in", "combination", "with", "confocal", "imaging", "of", "the", "ER", "immunostained", "for", "Climp63", "(", "red", ")", "and", "phospho", "-", "histone", "H3", "(", "cyan", ")", "to", "label", "DNA", ".", "Inset", "1", "(", "mitotic", "clusters", ")", "and", "inset", "2", "(", "kinetochores", ")", "are", "indicated", "with", "white", "dashed", "boxes", ".", "SMLM", "data", "was", "reconstructed", "using", "Thunderstorm", ".", "Representative", "images", "of", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Inset", "scale", "bars", ",", "200", "nm", ".", "C", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "localizations", "in", "interphase", "NPCs", "(", "NPC", ")", ",", "mitotic", "clusters", "and", "kinetochores", "of", "the", "experiments", "in", "(", "A", ")", "using", "DBSCAN", ".", "Error", "bars", ",", "SD", ".", "D", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "protein", "copies", "in", "interphase", "NPCs", "(", "NPC", ")", ",", "mitotic", "clusters", "and", "kinetochores", "of", "the", "experiments", "in", "(", "A", ")", "using", "DBSCAN", ".", "Error", "bars", ",", "SD", ".", "E", "Quantification", "of", "the", "cluster", "width", "of", "interphase", "NPCs", "(", "NPC", ")", ",", "mitotic", "clusters", "and", "kinetochores", "of", "the", "experiments", "in", "(", "A", ")", "using", "DBSCAN", ".", "Error", "bars", ",", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A 2D dSTORM images of a metaphase-arrested U2OS cell expressing Nup96 with a SNAP-tag, labelled with BG-Alexa Fluor 647 (orange), in combination with confocal imaging of the ER immunostained for Climp63 (red) and phospho-histone H3 (cyan) to label DNA. Inset 1 (mitotic clusters) and inset 2 (kinetochores) are indicated with white dashed boxes. SMLM data was reconstructed using Thunderstorm. Representative images of N = 4 biological replicates. Scale bars, 10 μm. Inset scale bars, 200 nm.C Quantification of the number of localizations in interphase NPCs (NPC), mitotic clusters and kinetochores of the experiments in (A) using DBSCAN. Error bars, SD. D Quantification of the number of protein copies in interphase NPCs (NPC), mitotic clusters and kinetochores of the experiments in (A) using DBSCAN. Error bars, SD. E Quantification of the cluster width of interphase NPCs (NPC), mitotic clusters and kinetochores of the experiments in (A) using DBSCAN. Error bars, SD."}
{"words": ["Figure", "1A", "Generation", "of", "myeloid", "cells", "genetically", "inactivated", "for", "Elp3", ".", "Elp3", "mRNA", "and", "protein", "levels", "were", "assessed", "by", "Real", "-", "Time", "PCR", "with", "extracts", "isolated", "from", "peritoneal", "macrophages", "of", "Elp3Control", "and", "Elp3", "∆", "Mye", "mice", ".", "mRNA", "levels", "in", "Elp3Control", "mice", "were", "set", "to", "1", "and", "levels", "in", "other", "experimental", "conditions", "were", "relative", "to", "that", "after", "normalization", "with", "Gapdh", "mRNA", "levels", "(", "n", "=", "3", "mice", ";", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "Student", "T", "test", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "An", "anti", "-", "Elp3", "western", "blot", "(", "WB", ")", "is", "also", "illustrated", ".", "The", "anti", "-", "Gapdh", "blot", "is", "shown", "for", "normalization", "purposes", ".", "C", "and", "D", "Defective", "mTORC2", "signaling", "upon", "Elp3", "deficiency", "in", "myeloid", "cells", ".", "Peritoneal", "macrophages", "from", "Elp3Control", "and", "Elp3", "∆", "Mye", "mice", "were", "isolated", "and", "cultured", "ex", "-", "vivo", ".", "They", "were", "untreated", "or", "stimulated", "with", "a", "combination", "of", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "and", "IFNγ", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "periods", "of", "time", "and", "the", "resulting", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", ".", "F", "mTORC2", "activation", "by", "M1", "polarization", "signals", "relies", "on", "Ctu2", ".", "Control", "and", "Ctu2", "-", "depleted", "bone", "marrow", "-", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "(", "SiRNA", "-", "mediated", "depletions", ")", "were", "treated", "or", "not", "with", "IFNγ", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", "and", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "and", "the", "resulting", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Generation of myeloid cells genetically inactivated for Elp3. Elp3 mRNA and protein levels were assessed by Real-Time PCR with extracts isolated from peritoneal macrophages of Elp3Control and Elp3∆Mye mice. mRNA levels in Elp3Control mice were set to 1 and levels in other experimental conditions were relative to that after normalization with Gapdh mRNA levels (n = 3 mice; mean +/- SD, Student T test, ***= p< 0.001). An anti-Elp3 western blot (WB) is also illustrated. The anti-Gapdh blot is shown for normalization purposes.C and D Defective mTORC2 signaling upon Elp3 deficiency in myeloid cells. Peritoneal macrophages from Elp3Control and Elp3∆Mye mice were isolated and cultured ex-vivo. They were untreated or stimulated with a combination of LPS (100 ng/ml) and IFNγ (50 ng/ml) for the indicated periods of time and the resulting cell extracts were subjected to WB analyses.F mTORC2 activation by M1 polarization signals relies on Ctu2. Control and Ctu2-depleted bone marrow-derived macrophages (BMDMs) (SiRNA-mediated depletions) were treated or not with IFNγ (50 ng/ml) and LPS (100 ng/ml) and the resulting cell extracts were subjected to WB analyses."}
{"words": ["Figure", "2C", "Elp3", "deficiency", "in", "myeloid", "cells", "exacerbates", "the", "decrease", "of", "colon", "length", "upon", "DSS", "administration", "(", "n", "=", "7", "mice", ";", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "E", "More", "severe", "histological", "score", "in", "mice", "lacking", "Elp3", "in", "myeloid", "cells", "upon", "DSS", "administration", ".", "Representative", "intestinal", "crypts", "from", "the", "indicated", "genotypes", "are", "illustrated", ".", "The", "histological", "score", "was", "established", "as", "described", "in", "methods", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "genotype", ";", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "Student", "T", "test", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "F", "Increased", "infiltration", "of", "iNOS", "+", "/", "CD68", "+", "cells", "upon", "DSS", "administration", "in", "Elp3", "∆", "Mye", "mice", ".", "The", "percentage", "of", "iNOS", "+", "in", "CD68", "+", "cells", "was", "established", "in", "both", "genotypes", "treated", "with", "DSS", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "genotype", ";", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "Student", "T", "test", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Anti", "-", "iNOS", "and", "-", "CD68", "immunofluorescence", "analyses", "carried", "out", "in", "intestinal", "crypts", "from", "both", "genotypes", "are", "illustrated", ".", "G", "Patients", "suffering", "from", "ulcerative", "colitis", "(", "UC", ")", "show", "reduced", "levels", "of", "both", "Elp1", "and", "Elp3", ".", "The", "central", "band", "represents", "the", "mean", "value", "of", "relative", "expression", "in", "the", "investigated", "cohort", ".", "Boxes", "represent", "75th", "and", "25th", "percentile", ".", "Whiskers", "represent", "maximum", "and", "minimum", "values", "before", "the", "upper", "and", "lower", "fence", ",", "respectively", "(", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "(", "GSE9452", "-", "GEO", "DataSets", ",", "Definition", "of", "an", "ulcerative", "colitis", "pre", "-", "inflammatory", "state", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C Elp3 deficiency in myeloid cells exacerbates the decrease of colon length upon DSS administration (n = 7 mice; mean +/- SD, **= p< 0.01).E More severe histological score in mice lacking Elp3 in myeloid cells upon DSS administration. Representative intestinal crypts from the indicated genotypes are illustrated. The histological score was established as described in methods (n = 5 mice per genotype; mean +/- SD, Student T test, *= p< 0.05).F Increased infiltration of iNOS+/CD68+ cells upon DSS administration in Elp3∆Mye mice. The percentage of iNOS+ in CD68+ cells was established in both genotypes treated with DSS (n = 7 mice per genotype; mean +/- SD, Student T test, **= p< 0.01). Anti-iNOS and -CD68 immunofluorescence analyses carried out in intestinal crypts from both genotypes are illustrated.G Patients suffering from ulcerative colitis (UC) show reduced levels of both Elp1 and Elp3. The central band represents the mean value of relative expression in the investigated cohort. Boxes represent 75th and 25th percentile. Whiskers represent maximum and minimum values before the upper and lower fence, respectively (**= p< 0.01, ***= p<0.001) (GSE9452-GEO DataSets, Definition of an ulcerative colitis pre-inflammatory state)."}
{"words": ["Figure", "3A", "IL", "-", "4", "and", "IL", "-", "13", "induce", "the", "expression", "of", "tRNA", "-", "modifying", "enzymes", "in", "macrophages", ".", "Peritoneal", "macrophages", "were", "untreated", "(", "«", "Control", "»", ")", "or", "stimulated", "with", "IL", "-", "4", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", ",", "IL", "-", "13", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "or", "with", "both", "cytokines", "for", "24", "hours", "and", "cell", "extracts", "from", "the", "resulting", "cells", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", ".", "B", "The", "pool", "of", "thiolated", "tRNAs", "in", "macrophages", "is", "enhanced", "by", "IL", "-", "4", "/", "IL", "-", "13", "but", "decreased", "by", "LPS", "/", "IFNγ", ".", "On", "the", "left", ",", "Northern", "blot", "analysis", "assessing", "t", ":", "Q", "(", "UUG", ")", "tRNA", "thiolation", "in", "Thioglycollate", "-", "elicited", "peritoneal", "macrophages", "subjected", "to", "the", "indicated", "treatments", "for", "24", "hours", ".", "On", "the", "right", ",", "quantification", "of", "t", ":", "Q", "(", "UUG", ")", "tRNA", "thiolation", ",", "calculated", "as", "the", "ration", "of", "thiolated", "over", "nonthiolated", "t", ":", "Q", "(", "UUG", ")", ",", "in", "the", "indicated", "experimental", "conditions", ".", "C", "Elp3", "induction", "by", "IL", "-", "4", "/", "IL", "-", "13", "occurs", "through", "a", "PI3K", "-", "dependent", "pathway", ".", "Peritoneal", "macrophages", "were", "pretreated", "with", "DMSO", "(", "control", "vehicle", ")", "or", "with", "Wortmannin", "(", "200", "nM", ")", "for", "one", "hour", "and", "subsequently", "left", "untreated", "or", "stimulated", "with", "IL", "-", "4", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "/", "IL", "-", "13", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "periods", "of", "time", ".", "Cell", "extracts", "from", "the", "resulting", "cells", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", ".", "E", "Rictor", "but", "not", "Raptor", "deficiency", "impairs", "Elp3", "expression", ".", "BMDMs", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "and", "the", "resulting", "cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "IL", "-", "4", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "/", "IL", "-", "13", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "for", "24", "hours", ".", "Cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", ".", "F", "IL", "-", "4", "/", "IL", "-", "13", "rely", "on", "Stat6", "to", "induce", "Elp3", "expression", ".", "Peritoneal", "macrophages", "were", "pretreated", "with", "the", "control", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "or", "with", "the", "Stat6", "pharmacological", "inhibitor", "AS1517499", "(", "5", "μM", ")", "for", "one", "hour", "and", "subsequently", "left", "unstimulated", "or", "treated", "with", "IL", "-", "4", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "/", "IL", "-", "13", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "periods", "of", "time", ".", "Cell", "extracts", "from", "the", "resulting", "cells", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", ".", "Elp3", "deficiency", "in", "myeloid", "cells", "impairs", "multiple", "signaling", "pathways", "triggered", "by", "IL", "-", "4", "(", "H", ",", ",", "IL", "-", "13", "(", "H", ")", "or", "by", "both", "cytokines", "(", "H", ")", ".", "Peritoneal", "macrophages", "isolated", "from", "the", "indicated", "mouse", "genotypes", "were", "untreated", "or", "stimulated", "with", "IL", "-", "4", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "(", "H", ",", "IL", "-", "13", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "(", "H", ")", "or", "with", "both", "cytokines", "(", "H", ")", "for", "8", "hours", "(", "H", ")", "and", "the", "resulting", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", ".", "J", "Elp3", "deficiency", "in", "myeloid", "cells", "impairs", "multiple", "signaling", "pathways", "triggered", "by", "IL", "-", "4", "I", "and", "J", ")", "Peritoneal", "macrophages", "isolated", "from", "the", "indicated", "mouse", "genotypes", "were", "untreated", "or", "stimulated", "with", "IL", "-", "4", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", ",", "I", "and", "J", ")", ",", "or", "for", "the", "indicated", "periods", "of", "time", "(", "I", "and", "J", ")", "and", "the", "resulting", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", ".", "L", "Elp3", "promotes", "M2", "macrophage", "polarization", ".", "Peritoneal", "macrophages", "isolated", "from", "the", "indicated", "mouse", "genotypes", "were", "untreated", "or", "stimulated", "with", "IL", "-", "4", "/", "IL", "-", "13", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "for", "24", "hours", "and", "the", "resulting", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A IL-4 and IL-13 induce the expression of tRNA-modifying enzymes in macrophages. Peritoneal macrophages were untreated (« Control ») or stimulated with IL-4 (10 ng/ml), IL-13 (10 ng/ml) or with both cytokines for 24 hours and cell extracts from the resulting cells were subjected to WB analyses.B The pool of thiolated tRNAs in macrophages is enhanced by IL-4/IL-13 but decreased by LPS/IFNγ. On the left, Northern blot analysis assessing t:Q(UUG) tRNA thiolation in Thioglycollate-elicited peritoneal macrophages subjected to the indicated treatments for 24 hours. On the right, quantification of t:Q(UUG) tRNA thiolation, calculated as the ration of thiolated over nonthiolated t:Q(UUG), in the indicated experimental conditions.C Elp3 induction by IL-4/IL-13 occurs through a PI3K-dependent pathway. Peritoneal macrophages were pretreated with DMSO (control vehicle) or with Wortmannin (200 nM) for one hour and subsequently left untreated or stimulated with IL-4 (10 ng/ml)/IL-13 (10 ng/ml) for the indicated periods of time. Cell extracts from the resulting cells were subjected to WB analyses.E Rictor but not Raptor deficiency impairs Elp3 expression. BMDMs were transfected with the indicated siRNAs and the resulting cells were treated or not with IL-4 (10 ng/ml)/IL-13 (10 ng/ml) for 24 hours. Cell extracts were subjected to WB analyses.F IL-4/IL-13 rely on Stat6 to induce Elp3 expression. Peritoneal macrophages were pretreated with the control vehicle (DMSO) or with the Stat6 pharmacological inhibitor AS1517499 (5 μM) for one hour and subsequently left unstimulated or treated with IL-4 (10 ng/ml)/IL-13 (10 ng/ml) for the indicated periods of time. Cell extracts from the resulting cells were subjected to WB analyses.Elp3 deficiency in myeloid cells impairs multiple signaling pathways triggered by IL-4 (H, , IL-13 (H) or by both cytokines (H). Peritoneal macrophages isolated from the indicated mouse genotypes were untreated or stimulated with IL-4 (10 ng/ml) (H, IL-13 (10 ng/ml) (H) or with both cytokines (H) for 8 hours (H) and the resulting cell extracts were subjected to WB analyses.J Elp3 deficiency in myeloid cells impairs multiple signaling pathways triggered by IL-4 I and J) Peritoneal macrophages isolated from the indicated mouse genotypes were untreated or stimulated with IL-4 (10 ng/ml) , I and J), or for the indicated periods of time (I and J) and the resulting cell extracts were subjected to WB analyses.L Elp3 promotes M2 macrophage polarization. Peritoneal macrophages isolated from the indicated mouse genotypes were untreated or stimulated with IL-4/IL-13 (10 ng/ml) for 24 hours and the resulting cell extracts were subjected to WB analyses."}
{"words": ["Figure", "4B", "Defective", "induction", "of", "Pparγ", "by", "IL", "-", "4", "/", "IL", "-", "13", "upon", "Elp3", "deficiency", ".", "Cell", "extracts", "from", "peritoneal", "macrophages", "of", "Elp3Control", "and", "Elp3", "∆", "Mye", "mice", "treated", "or", "not", "with", "IL", "-", "4", "/", "IL", "-", "13", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Defective induction of Pparγ by IL-4/IL-13 upon Elp3 deficiency. Cell extracts from peritoneal macrophages of Elp3Control and Elp3∆Mye mice treated or not with IL-4/IL-13 were subjected to WB analyses."}
{"words": ["Figure", "7A", "The", "induction", "of", "Ric8b", "expression", "by", "IL", "-", "4", "relies", "on", "Elp3", ".", "BMDMs", "from", "the", "indicated", "genotypes", "were", "treated", "or", "not", "with", "IL", "-", "4", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "up", "to", "24", "hours", "and", "the", "resulting", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", ".", "B", "Elp3", "promotes", "Ric8B", "mRNA", "translation", ".", "BMDMs", "from", "Elp3Control", "and", "Elp3", "∆", "Mye", "mice", "were", "treated", "by", "IL", "-", "4", "for", "24", "hours", ",", "followed", "by", "a", "treatment", "with", "10", " ", "μg", "/", "ml", "puromycin", "for", "5", " ", "minutes", ".", "To", "detect", "newly", "synthesized", "Ric8b", "proteins", ",", "a", "Puro", "-", "PLA", "assay", "was", "conducted", ".", "Representative", "images", "detecting", "Ric8b", "(", "Red", ")", "and", "α", "-", "Tubulin", "+", "microtubules", "(", "green", ")", "in", "BMDMs", "are", "illustrated", ".", "On", "the", "right", ",", "the", "graph", "shows", "a", "quantification", "of", "signals", "for", "Ric8b", "in", "α", "-", "Tubulin", "+", "areas", ".", "A", "random", "of", "six", "different", "areas", "were", "counted", "(", "6", "technical", "replicates", ",", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "C", "Ric8b", "is", "a", "direct", "target", "of", "Elp3", ".", "BMDMs", "from", "Elp3Control", "and", "Elp3", "∆", "Mye", "mice", "were", "infected", "with", "a", "lentiviral", "GFP", "construct", "(", "negative", "control", ")", ",", "Flag", "-", "Ric8b", "WT", "or", "with", "Flag", "-", "Ricb", "MUT", ",", "as", "indicated", "and", "the", "resulting", "protein", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", "to", "assess", "Ric8b", "and", "Elp3", "protein", "levels", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "D", "and", "E", "Ric8b", "promotes", "IL", "-", "4", "-", "dependent", "mTORC2", "activation", ".", "Control", "or", "Ric8b", "-", "depleted", "BMDMs", "were", "treated", "or", "not", "with", "IL", "-", "4", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "periods", "of", "time", "and", "the", "resulting", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A The induction of Ric8b expression by IL-4 relies on Elp3. BMDMs from the indicated genotypes were treated or not with IL-4 (10 ng/ml) up to 24 hours and the resulting cell extracts were subjected to WB analyses.B Elp3 promotes Ric8B mRNA translation. BMDMs from Elp3Control and Elp3∆Mye mice were treated by IL-4 for 24 hours, followed by a treatment with 10 μg/ml puromycin for 5 minutes. To detect newly synthesized Ric8b proteins, a Puro-PLA assay was conducted. Representative images detecting Ric8b (Red) and α-Tubulin+ microtubules (green) in BMDMs are illustrated. On the right, the graph shows a quantification of signals for Ric8b in α-Tubulin+ areas. A random of six different areas were counted (6 technical replicates, mean +/- SD, Student's t-test, *= p< 0.05).C Ric8b is a direct target of Elp3. BMDMs from Elp3Control and Elp3∆Mye mice were infected with a lentiviral GFP construct (negative control), Flag-Ric8b WT or with Flag-Ricb MUT, as indicated and the resulting protein extracts were subjected to WB analyses to assess Ric8b and Elp3 protein levels. Gapdh was used as a loading control.D and E Ric8b promotes IL-4-dependent mTORC2 activation. Control or Ric8b-depleted BMDMs were treated or not with IL-4 (10 ng/ml) for the indicated periods of time and the resulting cell extracts were subjected to WB analyses."}
{"words": ["Figure", "8C", "Elp3", "promotes", "mitochondrial", "translation", ".", "BMDMs", "from", "the", "indicated", "genotypes", "were", "treated", "or", "not", "with", "IL", "-", "4", "/", "IL", "-", "13", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "hours", "and", "the", "resulting", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "WB", "analyses", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8C Elp3 promotes mitochondrial translation. BMDMs from the indicated genotypes were treated or not with IL-4/IL-13 (10 ng/ml) for the indicated hours and the resulting cell extracts were subjected to WB analyses."}
{"words": ["Figure", "9D", "Elp3", "expression", "in", "myeloid", "cells", "maintains", "the", "pool", "of", "tumor", "-", "associated", "macrophages", "(", "TAMs", ")", ".", "The", "number", "of", "TAMs", ",", "defined", "as", "CD301", "+", "/", "F4", "/", "80", "+", "cells", "among", "F4", "/", "80", "+", "cells", "was", "quantified", "in", "intestinal", "crypts", "from", "both", "Apc", "+", "/", "Min", "Elp3Control", "and", "Apc", "+", "/", "Min", "Elp3", "∆", "Mye", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "genotype", ";", "mean", "+", "/", "-", "SD", ",", "Student", "T", "test", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Representative", "immunofluorescence", "analyses", "are", "illustrated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9D Elp3 expression in myeloid cells maintains the pool of tumor-associated macrophages (TAMs). The number of TAMs, defined as CD301+/F4/80+ cells among F4/80+ cells was quantified in intestinal crypts from both Apc+/Min Elp3Control and Apc+/Min Elp3∆Mye mice (n = 5 mice per genotype; mean +/- SD, Student T test, *= p< 0.05). Representative immunofluorescence analyses are illustrated."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Typical", "examples", "of", "stage", "1", "(", "day", "0", ")", ",", "stage", "2", "(", "day", "7", ")", "and", "stage", "3", "(", "day", "12", ")", "human", "iPSC", "-", "derived", "NSCs", "/", "neurons", "immunostained", "for", "γ", "-", "Tubulin", "and", "Centrin", ",", "marked", "by", "arrows", ".", "Cells", "were", "co", "-", "immunostained", "with", "Ki67", "and", "DAPI", "(", "day", "0", ")", "or", "Trim46", "and", "MAP2", "(", "day", "7", "and", "12", ")", "to", "define", "their", "neuronal", "stages", ".", "Arrowheads", "mark", "the", "AIS", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", "in", "overview", ",", "2µm", "in", "zooms", ".", "D", ".", "3D", "STED", "imaging", "of", "αTubulin", "in", "stage", "1", "(", "day", "0", ")", ",", "stage", "2", "(", "day", "7", ")", "and", "stage", "3", "(", "day", "13", ")", "hiPSC", "-", "derived", "neurons", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", "in", "overview", ",", "1µm", "in", "zoom", ".", "F", ".", "Typical", "examples", "of", "centrosomes", "of", "human", "iPSC", "-", "derived", "NSCs", "(", "day", "0", ")", "with", "STED", "imaging", "of", "Trim46", "and", "Centrin", "immunostaining", ",", "and", "confocal", "imaging", "of", "γ", "-", "Tubulin", "immunostaining", ".", "Scale", "bar", "=", "1µm", ".", "G", ".", "Typical", "examples", "of", "stage", "2", "and", "stage", "3", "human", "iPSC", "-", "derived", "neurons", "immunostained", "for", "Trim46", "and", "MAP2", ".", "Inserts", "represent", "centrosomes", ".", "Zooms", "on", "the", "right", "represent", "a", "non", "-", "polarized", "neurite", "or", "a", "developing", "axon", "in", "stage", "2", "or", "stage", "3", "neurons", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "=", "20µm", "in", "overview", ",", "1µm", "in", "insert", ",", "10µm", "in", "zoom", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Typical examples of stage 1 (day 0), stage 2 (day 7) and stage 3 (day 12) human iPSC-derived NSCs/neurons immunostained for γ-Tubulin and Centrin, marked by arrows. Cells were co-immunostained with Ki67 and DAPI (day 0) or Trim46 and MAP2 (day 7 and 12) to define their neuronal stages. Arrowheads mark the AIS. Scale bar = 10µm in overview, 2µm in zooms.D. 3D STED imaging of αTubulin in stage 1 (day 0), stage 2 (day 7) and stage 3 (day 13) hiPSC-derived neurons. Scale bar = 5µm in overview, 1µm in zoom.F. Typical examples of centrosomes of human iPSC-derived NSCs (day 0) with STED imaging of Trim46 and Centrin immunostaining, and confocal imaging of γ-Tubulin immunostaining. Scale bar = 1µm.G. Typical examples of stage 2 and stage 3 human iPSC-derived neurons immunostained for Trim46 and MAP2. Inserts represent centrosomes. Zooms on the right represent a non-polarized neurite or a developing axon in stage 2 or stage 3 neurons, respectively. Scale bar = 20µm in overview, 1µm in insert, 10µm in zoom."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Typical", "examples", "of", "Centrinone", "-", "B", "treated", "or", "control", "human", "iPSC", "-", "derived", "NSCs", "immunostained", "for", "Pericentrin", "and", "Centrin", ".", "Inserts", "represent", "centriole", "(", "s", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", "in", "overview", ",", "2µm", "in", "inserts", ".", "B", ".", "Quantifications", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "0", ",", "1", "or", "2", "centrioles", "per", "cell", "after", "0", "(", "control", ")", ",", "2", "or", "5", "days", "Centrinone", "-", "B", "treatment", "and", "prior", "to", "neuronal", "induction", ".", "n", "=", "48", "-", "51", "cells", "in", "2", "independent", "experiments", ".", "C", "Data", "information", ":", "Data", "represents", "mean", "±", "SEM", ".", "Chi", "-", "square", "-", "test", "including", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Bonferroni", "correction", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "p", ">", "0", ".", "05C", ".", "Typical", "examples", "of", "Centrinone", "-", "B", "treated", "or", "control", "human", "iPSC", "-", "derived", "neurons", "(", "12", "-", "15", "days", ")", "immunostained", "for", "AnkG", ",", "Trim46", ",", "MAP2", "and", "Centrin", ".", "Arrowheads", "mark", "AIS", "structures", ",", "arrows", "mark", "centrosomes", ".", "Inserts", "represent", "centrosomes", ",", "zooms", "on", "the", "right", "represent", "AIS", "structures", ".", "Scale", "bar", "=", "20µm", "in", "overview", ",", "2µm", "in", "insert", ",", "10µm", "in", "zooms", ".", "M", ".", "AP", "threshold", ",", "amplitude", "and", "after", "-", "hyperpolarization", "recorded", "in", "Centrinone", "-", "B", "treated", "(", "n", "=", "43", "cells", "in", "3", "independent", "experiments", ")", "and", "control", "human", "iPSC", "-", "derived", "neuron", "cultures", "(", "n", "=", "59", "cells", "in", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represents", "mean", "±", "SEM", ".", "Chi", "-", "square", "-", "test", "including", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Mann", "Whitney", "test", "after", "-", "hyperpolarization", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "M", ":", "threshold", ",", "AP", "amplitude", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "p", ">", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Typical examples of Centrinone-B treated or control human iPSC-derived NSCs immunostained for Pericentrin and Centrin. Inserts represent centriole(s). Scale bar = 5µm in overview, 2µm in inserts. B. Quantifications of the percentage of cells with 0, 1 or 2 centrioles per cell after 0 (control), 2 or 5 days Centrinone-B treatment and prior to neuronal induction. n = 48-51 cells in 2 independent experiments. C Data information: Data represents mean ± SEM. Chi-square-test including post-hoc analysis with Bonferroni correction *** p<0.001, ** p<0.01, * p < 0.05, ns p>0.05C. Typical examples of Centrinone-B treated or control human iPSC-derived neurons (12-15 days) immunostained for AnkG, Trim46, MAP2 and Centrin. Arrowheads mark AIS structures, arrows mark centrosomes. Inserts represent centrosomes, zooms on the right represent AIS structures. Scale bar = 20µm in overview, 2µm in insert, 10µm in zooms.M. AP threshold, amplitude and after-hyperpolarization recorded in Centrinone-B treated (n = 43 cells in 3 independent experiments) and control human iPSC-derived neuron cultures (n = 59 cells in 4 independent experiments). Data information: Data represents mean ± SEM. Chi-square-test including post-hoc analysis with Mann Whitney test after-hyperpolarization Student's t test (M: threshold, AP amplitude). *** p<0.001, ** p<0.01, * p < 0.05, ns p>0.05"}
{"words": ["Figure", "3D", ".", "Representative", "images", "of", "fan", "-", "like", "growth", "cones", "at", "day", "5", "of", "control", "and", "Centrinone", "-", "B", "treated", "neurons", "in", "untreated", ",", "or", "nocodazole", "-", "treated", "conditions", ".", "Growth", "cone", "visualized", "by", "immunostaining", "for", "phalloidin", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", ".", "E", ".", "Quantifications", "of", "the", "average", "area", "(", "µm²", ")", "of", "growth", "cones", "of", "control", "and", "Centrinone", "-", "B", "treated", "neurons", "in", "untreated", ",", "or", "nocodazole", "-", "treated", "conditions", "at", "different", "time", "points", ".", "n", "=", "25", "-", "83", "growth", "cones", "in", "3", "independent", "experiments", ".", "F", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "including", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "analysis", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "p", "≥", "0", ".", "05F", ".", "Representative", "images", "of", "different", "growth", "cone", "morphological", "categories", ":", "fan", "-", "like", ",", "torpedo", "-", "like", "and", "bulb", "-", "like", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", ".", "G", ".", "Quantifications", "of", "the", "ratios", "of", "different", "subtypes", "(", "fan", "-", "like", ",", "torpedo", "-", "like", ",", "bulb", "-", "like", ")", "of", "growth", "cones", "of", "control", "and", "Centrinone", "-", "B", "treated", "neurons", "in", "untreated", ",", "or", "nocodazole", "-", "treated", "conditions", "at", "different", "time", "points", ".", "H", ".", "Quantifications", "of", "the", "average", "area", "(", "µm²", ")", "of", "different", "subtypes", "(", "fan", "-", "like", ",", "torpedo", "-", "like", ",", "bulb", "-", "like", ")", "of", "growth", "cones", "of", "control", "and", "Centrinone", "-", "B", "treated", "neurons", "in", "untreated", ",", "or", "nocodazole", "-", "treated", "conditions", "at", "different", "time", "points", ".", "n", "=", "5", "-", "55", "growth", "cones", "in", "3", "independent", "experiments", ".", "Da", "Data", "information", ":", "Chi", "-", "square", "-", "test", "including", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Bonferroni", "correction", "(", "G", ")", ",", "One", "-", "way", "ANOVA", "including", "Sidak", "'", "s", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "H", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "p", "≥", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D. Representative images of fan-like growth cones at day 5 of control and Centrinone-B treated neurons in untreated, or nocodazole-treated conditions. Growth cone visualized by immunostaining for phalloidin. Scale bar = 5µm. E. Quantifications of the average area (µm²) of growth cones of control and Centrinone-B treated neurons in untreated, or nocodazole-treated conditions at different time points. n = 25-83 growth cones in 3 independent experiments. F Data information: Data represent mean ± SEM. One-way ANOVA including Tukey's post-hoc analysis *** p<0.001, ** p<0.005, * p < 0.05, ns p≥0.05F. Representative images of different growth cone morphological categories: fan-like, torpedo-like and bulb-like. Scale bar = 5µm. G. Quantifications of the ratios of different subtypes (fan-like, torpedo-like, bulb-like) of growth cones of control and Centrinone-B treated neurons in untreated, or nocodazole-treated conditions at different time points. H. Quantifications of the average area (µm²) of different subtypes (fan-like, torpedo-like, bulb-like) of growth cones of control and Centrinone-B treated neurons in untreated, or nocodazole-treated conditions at different time points. n = 5-55 growth cones in 3 independent experiments. Da Data information: Chi-square-test including post-hoc analysis with Bonferroni correction (G), One-way ANOVA including Sidak's post-hoc analysis (H). *** p<0.001, ** p<0.005, * p < 0.05, ns p≥0.05"}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Example", "stills", "from", "a", "spinning", "-", "disk", "time", "-", "lapse", "recording", "of", "a", "neurite", "transfected", "with", "mRFP", "and", "GFP", "-", "MT", "+", "TIP", ".", "The", "top", "panel", "is", "a", "still", "of", "a", "neurite", "in", "mRFP", ",", "showing", "neurite", "morphology", ".", "The", "other", "panels", "show", "moving", "GFP", "-", "MT", "+", "TIP", "comets", "pointing", "in", "either", "an", "anterograde", "direction", "(", "green", "arrowheads", ")", "or", "retrograde", "direction", "(", "blue", "arrowheads", ")", ".", "P", "indicates", "the", "proximal", "direction", "and", "D", "the", "distal", "direction", "of", "the", "neurite", ".", "Timestamp", "in", "minutes", ":", "seconds", "given", "on", "bottom", "right", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "B", ".", "Kymographs", "and", "schematic", "representations", "of", "time", "-", "lapse", "recordings", "of", "the", "distal", "axon", "as", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "for", "different", "time", "points", "(", "day", "7", ";", "day", "13", ")", "and", "conditions", "(", "control", ";", "Centrinone", "-", "B", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "C", "J", ".", "Example", "stills", "from", "a", "spinning", "-", "disk", "time", "-", "lapse", "recording", "of", "a", "neurite", "transfected", "with", "mRFP", "and", "GFP", "-", "MT", "+", "TIP", ".", "Red", "line", "denotes", "the", "location", "of", "LS", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "K", ".", "Kymographs", "and", "schematic", "representations", "of", "time", "-", "lapse", "recordings", "of", "the", "distal", "axon", "as", "shown", "in", "(", "J", ")", "following", "LS", ",", "for", "different", "time", "points", "(", "day", "7", ";", "day", "13", ")", "and", "conditions", "(", "control", ";", "Centrinone", "-", "B", ")", ".", "Red", "line", "and", "red", "arrowhead", "denote", "location", "and", "time", "of", "LS", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "L"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Example stills from a spinning-disk time-lapse recording of a neurite transfected with mRFP and GFP-MT+TIP. The top panel is a still of a neurite in mRFP, showing neurite morphology. The other panels show moving GFP-MT+TIP comets pointing in either an anterograde direction (green arrowheads) or retrograde direction (blue arrowheads). P indicates the proximal direction and D the distal direction of the neurite. Timestamp in minutes:seconds given on bottom right. Scale bar = 5 µm. B. Kymographs and schematic representations of time-lapse recordings of the distal axon as shown in (A), for different time points (day 7; day 13) and conditions (control; Centrinone-B). Scale bar = 5 µm. C J. Example stills from a spinning-disk time-lapse recording of a neurite transfected with mRFP and GFP-MT+TIP. Red line denotes the location of LS. Scale bar = 5 µm. K. Kymographs and schematic representations of time-lapse recordings of the distal axon as shown in (J) following LS, for different time points (day 7; day 13) and conditions (control; Centrinone-B). Red line and red arrowhead denote location and time of LS. Scale bar = 5 µm. L "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Representative", "images", "showing", "the", "myogenic", "differentiation", ",", "as", "assessed", "by", "immunostaining", "for", "MyHC", "(", "green", ")", ",", "of", "human", "MuSCs", "(", "hMuSCs", ")", "isolated", "from", "muscle", "biopsies", "of", "DMD", "patients", ",", "either", "before", "the", "beginning", "of", "the", "clinical", "trial", "(", "hMuSCs", "(", "-", ")", ")", "or", "after", "1", "year", "of", "treatment", "with", "Givinostat", "(", "hMuSCs", "Giv", "(", "-", ")", ")", ".", "Cells", "were", "cultured", "alone", "or", "(", "only", "for", "hMuSCs", "-", ")", "in", "transwell", "co", "-", "culture", "with", "FAPs", "isolated", "from", "the", "same", "patients", "and", "exposed", "in", "vitro", "to", "Giv", "(", "+", "ehFAPs", "Giv", "Vitro", ")", "or", "control", "vehicle", "(", "+", "ehFAPs", ")", ".", "The", "upper", "panels", "represent", "myogenic", "differentiation", "of", "DMD", "-", "1", "patient", ";", "bottom", "panels", "represent", "myogenic", "differentiation", "of", "DMD", "-", "2", "patient", ".", "Dose", "and", "timing", "of", "Giv", "treatment", "as", "described", "in", "Bettica", "et", "al", ".", ",", "2016", "(", "23", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "showing", "the", "myogenic", "differentiation", "of", "MuSCs", "isolated", "from", "1", ".", "5", "month", "old", "mdx", "mice", ",", "as", "assessed", "by", "immunostaining", "for", "MyHC", "(", "green", ")", ".", "MuSCs", "were", "cultured", "alone", "(", "-", ")", "or", "in", "transwell", "co", "-", "culture", "with", "mdx", "FAPs", ",", "which", "were", "pretreated", "with", "DMSO", "or", "GW4869", "(", "GW", "10mM", "added", "to", "FAPs", "30", "minutes", "before", "starting", "the", "co", "-", "culture", "with", "MuSCs", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "D", ")", "Graph", "showing", "the", "fusion", "index", "of", "MuSCs", "in", "the", "conditions", "described", "in", "(", "C", ")", ",", "(", "n", "=", "5", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Star", "(", "*", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "Tukey", "test", "relative", "to", "MuSCs", "cultured", "alone", "(", "-", ")", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "Hash", "(", "#", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "Tukey", "test", "relative", "to", "MuSCs", "in", "co", "-", "cultured", "with", "FAPs", "not", "treated", "(", "DMSO", ")", ",", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "§", "represents", "statistical", "analysis", "by", "2Way", "Anova", "test", ";", "§", "§", "§", "p", "<", "0", ",", "001", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "All", "data", "correspond", "to", "the", "average", "±", "SEM", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "PKH", "-", "67", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "staining", "in", "a", "transwell", "co", "-", "culture", "between", "MuSCs", "and", "FAPs", "isolated", "from", "1", ".", "5", "month", "old", "mdx", "mice", ".", "FAPs", "exposed", "to", "PKH", "-", "67", "prior", "to", "the", "co", "-", "culture", "with", "MuSCs", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "F", ")", "Graph", "showing", "the", "percentage", "of", "PKH", "-", "67", "positive", "MuSCs", "after", "the", "co", "-", "culture", "with", "FAPs", ",", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Star", "(", "*", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "t", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "All", "data", "correspond", "to", "the", "average", "±", "SEM", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "of", "myogenic", "differentiation", "of", "mdx", "MuSCs", ",", "as", "assessed", "by", "immunostaining", "for", "MyHC", "(", "green", ")", ".", "MuSCs", "were", "cultured", "either", "alone", "(", "-", ")", "or", "incubated", "with", "EVs", "isolated", "from", "1", ".", "5", "month", "old", "mdx", "mice", "(", "EVs", "FAPs", ")", "treated", "with", "vehicle", "(", "CTR", ")", "or", "exposed", "to", "TSA", "in", "vivo", "(", "TSA", ")", "or", "in", "vitro", "(", "TSA", "vitro", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "H", ")", "Graph", "showing", "the", "fusion", "index", "of", "MuSCs", "in", "the", "condition", "described", "in", "(", "G", ")", ",", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Star", "(", "*", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "Tukey", "test", "on", "the", "%", "of", "n", ">", "5", "(", "%", "of", "nuclei", "that", "were", "MyHC", "+", "inside", "myotubes", "containing", "more", "than", "5", "nuclei", ")", "relative", "to", "MuSCs", "cultured", "alone", "(", "-", ")", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ",", "0001", ";", "Hash", "(", "#", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "Tukey", "test", "relative", "to", "EVs", "FAPs", "CTR", ",", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ",", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", ";", "§", "represents", "statistical", "analysis", "by", "2way", "Anova", "test", ",", "§", "§", "§", "§", "p", "<", "0", ",", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "All", "data", "correspond", "to", "the", "average", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Representative images showing the myogenic differentiation, as assessed by immunostaining for MyHC (green), of human MuSCs (hMuSCs) isolated from muscle biopsies of DMD patients, either before the beginning of the clinical trial (hMuSCs (-)) or after 1 year of treatment with Givinostat (hMuSCs Giv (-)). Cells were cultured alone or (only for hMuSCs -) in transwell co-culture with FAPs isolated from the same patients and exposed in vitro to Giv (+ehFAPs Giv Vitro) or control vehicle (+ehFAPs). The upper panels represent myogenic differentiation of DMD-1 patient; bottom panels represent myogenic differentiation of DMD-2 patient. Dose and timing of Giv treatment as described in Bettica et al., 2016 (23). Scale bar = 50 μm.(C) Representative images showing the myogenic differentiation of MuSCs isolated from 1.5 month old mdx mice, as assessed by immunostaining for MyHC (green). MuSCs were cultured alone (-) or in transwell co-culture with mdx FAPs, which were pretreated with DMSO or GW4869 (GW 10mM added to FAPs 30 minutes before starting the co-culture with MuSCs). Scale bar = 50 μm. (D) Graph showing the fusion index of MuSCs in the conditions described in (C), (n=5, biological replicates). Star (*) indicates statistical analysis by Tukey test relative to MuSCs cultured alone (-), ** p < 0.01; Hash (#) indicates statistical analysis by Tukey test relative to MuSCs in co-cultured with FAPs not treated (DMSO), # p<0.05; § represents statistical analysis by 2Way Anova test; §§§ p < 0,001. Data information: Nuclei were counterstained with DAPI (blue). All data correspond to the average ± SEM.(E) Representative images of PKH-67 (green) and DAPI (blue) staining in a transwell co-culture between MuSCs and FAPs isolated from 1.5 month old mdx mice. FAPs exposed to PKH-67 prior to the co-culture with MuSCs. Scale bar = 50 μm. (F) Graph showing the percentage of PKH-67 positive MuSCs after the co-culture with FAPs, (n=3, biological replicates). Star (*) indicates statistical analysis by t-test;**** p < 0.0001. Data information: Nuclei were counterstained with DAPI (blue). All data correspond to the average ± SEM.(G) Representative images of myogenic differentiation of mdx MuSCs, as assessed by immunostaining for MyHC (green). MuSCs were cultured either alone (-) or incubated with EVs isolated from 1.5 month old mdx mice (EVs FAPs) treated with vehicle (CTR) or exposed to TSA in vivo (TSA) or in vitro (TSA vitro). Scale bar = 50 μm. (H) Graph showing the fusion index of MuSCs in the condition described in (G), (n=3, biological replicates). Star (*) indicates statistical analysis by Tukey test on the % of n>5 (% of nuclei that were MyHC+ inside myotubes containing more than 5 nuclei) relative to MuSCs cultured alone (-), **p <0.01, ****p<0,0001; Hash (#) indicates statistical analysis by Tukey test relative to EVs FAPs CTR, ##p <0.01, ###p<0,001; ns= not significant; § represents statistical analysis by 2way Anova test, §§§§p < 0,0001. Data information: Nuclei were counterstained with DAPI (blue). All data correspond to the average ± SEM."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Graph", "showing", "the", "relative", "expression", "of", "Drosha", "in", "FAPs", "after", "Drosha", "down", "-", "regulation", "by", "siRNA", "(", "n", "=", "4", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Values", "correspond", "to", "the", "average", "±", "SEM", ".", "Star", "(", "*", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "t", "-", "test", "relative", "to", "FAPs", "TSA", "treated", "and", "transfected", "with", "scramble", "(", "Scr", ")", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "myogenic", "differentiation", "of", "MuSCs", "assessed", "by", "immunostaining", "for", "MyHC", "(", "green", ")", ".", "MuSCs", "were", "cultured", "alone", "(", "-", ")", "or", "in", "transwell", "co", "-", "culture", "with", "FAPs", "isolated", "from", "mdx", "mice", "treated", "either", "with", "vehicle", "(", "+", "FAPs", "CTR", ")", "or", "TSA", "(", "0", ".", "6", "mg", "/", "kg", "/", "day", "for", "15", "days", "by", "i", ".", "p", ".", ")", "(", "+", "FAPs", "TSA", ")", ",", "and", "transfected", "with", "scramble", "(", "Scr", "siRNA", ")", "or", "Drosha", "siRNA", "(", "Drosha", "siRNA", ")", "prior", "to", "co", "-", "culture", "with", "MuSCs", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "miR", "-", "206", "-", "3p", "(", "violet", ")", "immunohistochemistry", "in", "vastus", "medialis", "bioptic", "samples", "of", "Control", "and", "DMD", "patients", "at", "different", "ages", ":", "1", "year", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "4", "years", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "9", "years", "old", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "F", ")", "Graph", "representing", "miR", "-", "206", "-", "3p", "violet", "area", "quantification", "relative", "to", "(", "E", ")", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "of", "immunofluorescence", "for", "eMyHC", "(", "red", ")", "and", "Laminin", "(", "green", ")", "in", "conditions", "described", "in", "(", "E", ")", ".", "(", "H", ")", "Graph", "showing", "the", "percentage", "of", "eMyHC", "positive", "fibers", "of", "condition", "described", "in", "(", "G", ")", ".", "(", "I", ")", "Representative", "images", "of", "Masson", "'", "s", "Trichrome", "staining", "in", "conditions", "described", "in", "(", "E", ")", ".", "(", "J", ")", "Graph", "showing", "the", "fibrotic", "area", "quantification", "of", "conditions", "described", "in", "(", "I", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Graph showing the relative expression of Drosha in FAPs after Drosha down-regulation by siRNA (n=4, biological replicates). Values correspond to the average ± SEM. Star (*) indicates statistical analysis by t-test relative to FAPs TSA treated and transfected with scramble (Scr); **p<0.01.(B) Representative images of myogenic differentiation of MuSCs assessed by immunostaining for MyHC (green). MuSCs were cultured alone (-) or in transwell co-culture with FAPs isolated from mdx mice treated either with vehicle (+FAPs CTR) or TSA (0.6 mg/kg/day for 15 days by i.p.) (+FAPs TSA), and transfected with scramble (Scr siRNA) or Drosha siRNA (Drosha siRNA) prior to co-culture with MuSCs. Scale bar = 50 μm.(E) Representative images of miR-206-3p (violet) immunohistochemistry in vastus medialis bioptic samples of Control and DMD patients at different ages: 1 year (n=2), 4 years (n=3) and 9 years old (n=2). (F) Graph representing miR-206-3p violet area quantification relative to (E). (G) Representative images of immunofluorescence for eMyHC (red) and Laminin (green) in conditions described in (E). (H) Graph showing the percentage of eMyHC positive fibers of condition described in (G). (I) Representative images of Masson's Trichrome staining in conditions described in (E). (J) Graph showing the fibrotic area quantification of conditions described in (I). "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "Sca", "-", "1", "(", "green", ")", ",", "Laminin", "(", "white", ")", ",", "DAPI", "(", "blue", ")", "immunofluorescence", ",", "and", "miR", "-", "206", "-", "3p", "(", "violet", ")", "immunohistochemistry", "on", "10", "uM", "sequencial", "cryosections", "of", "Tibialis", "Anterior", "(", "TA", ")", "of", "young", "mdx", "mice", "(", "CTR", ")", "and", "after", "TSA", "treatment", "(", "TSA", ")", "(", "0", ".", "6", "mg", "/", "kg", "/", "day", "for", "15", "days", "by", "i", ".", "p", ".", ")", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "25", "μm", ".", "(", "C", ")", "Graph", "representing", "the", "miR", "-", "206", "-", "3p", "relative", "expression", "in", "EVs", "isolated", "from", "muscle", "interstitium", "of", "tibialis", "anterior", "from", "wild", "type", "mice", "(", "CTR", ")", ",", "mdx", "young", "and", "old", "mice", "(", "control", "-", "CTR", "-", "and", "TSA", "treated", ")", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Star", "(", "*", ")", "indicates", "Tukey", "analysis", "compared", "to", "wild", "type", "mice", "(", "CTR", ")", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "hash", "(", "#", ")", "indicates", "Tukey", "analysis", "compared", "to", "mdx", "young", "CTR", ",", "#", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "§", "represents", "statistical", "analysis", "by", "Anova", "test", ".", "§", "§", "§", "§", "p", "<", "0", ",", "0001", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "CD90", "(", "green", ")", ",", "Dapi", "(", "blue", ")", "and", "miR", "-", "206", "-", "3p", "(", "violet", ")", "immunohistochemistry", "in", "brachial", "biceps", "bioptic", "samples", "of", "DMD", "patient", "before", "(", "CTR", ")", "and", "after", "Givinostat", "treatment", "(", "GIV", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "F", ")", "Graph", "showing", "the", "relative", "expression", "of", "miR", "-", "206", "-", "3p", "in", "EVs", "isolated", "from", "a", "human", "population", "of", "muscle", "resident", "cells", "enriched", "in", "FAPs", "(", "ehFAPs", ")", "isolated", "from", "biopsies", "of", "two", "DMD", "patients", "(", "DMD", "-", "1", "and", "DMD", "-", "2", ")", "before", "(", "CTR", ")", "and", "after", "(", "GIV", ")", "Givinostat", "treatment", ",", "Two", "technical", "replicates", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative images of Sca-1 (green), Laminin (white), DAPI (blue) immunofluorescence, and miR-206-3p (violet) immunohistochemistry on 10 uM sequencial cryosections of Tibialis Anterior (TA) of young mdx mice (CTR) and after TSA treatment (TSA) (0.6 mg/kg/day for 15 days by i.p.) (n=6). Scale bar = 25 μm.(C) Graph representing the miR-206-3p relative expression in EVs isolated from muscle interstitium of tibialis anterior from wild type mice (CTR), mdx young and old mice (control -CTR- and TSA treated) (n=4). Star (*) indicates Tukey analysis compared to wild type mice (CTR), ****p < 0.0001; hash (#) indicates Tukey analysis compared to mdx young CTR, #### p<0.0001. § represents statistical analysis by Anova test. §§§§ p<0,0001.(D) Representative images of CD90 (green), Dapi (blue) and miR-206-3p (violet) immunohistochemistry in brachial biceps bioptic samples of DMD patient before (CTR) and after Givinostat treatment (GIV). Scale bar = 50 μm.(F) Graph showing the relative expression of miR-206-3p in EVs isolated from a human population of muscle resident cells enriched in FAPs (ehFAPs) isolated from biopsies of two DMD patients (DMD-1 and DMD-2) before (CTR) and after (GIV) Givinostat treatment, Two technical replicates are shown."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "mdx", "muscles", "injected", "with", "PKH67", "-", "labeled", "EVs", "isolated", "from", "FAPs", "of", "1", ".", "5", "month", "old", "mdx", "mice", "exposed", "to", "TSA", ".", "The", "left", "panel", "shows", "the", "percentage", "of", "PKH", "-", "67", "positive", "cells", "in", "whole", "muscle", ".", "The", "right", "panel", "shows", "the", "percentage", "of", "the", "PKH", "-", "67", "positive", "MuSCs", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "PKH", "-", "67", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "staining", "in", "MuSCs", "freshly", "isolated", "from", "muscles", "previously", "injected", "with", "PKH67", "-", "labeled", "EVs", ".", "Scale", "bar", "=", "25", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "(", "C", ")", "Graph", "showing", "the", "relative", "expression", "of", "miR", "-", "206", "-", "3p", "in", "MuSCs", "isolated", "as", "described", "in", "(", "A", "and", "B", ")", "and", "in", "MuSCs", "from", "muscles", "injected", "with", "PKH67", "-", "labeled", "EVs", "isolated", "from", "FAPs", "of", "1", ".", "5", "month", "old", "mdx", "mice", "exposed", "to", "TSA", ",", "and", "then", "transfected", "or", "not", "with", "Drosha", "siRNA", "(", "siRNA", "Drosha", ")", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Star", "(", "*", ")", "means", "significance", "relative", "to", "MuSCs", "that", "not", "uptake", "PKH67", "-", "labled", "EVs", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Hash", "(", "#", ")", "means", "significance", "compared", "to", "MuSCs", "that", "uptake", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", ",", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "§", "indicates", "Anova", "analysis", ",", "§", "§", "p", "<", "0", ",", "01", ".", "(", "D", ")", "Graph", "showing", "the", "expression", "levels", "of", "miR", "-", "206", "-", "3p", "and", "miR", "-", "145", "-", "5p", "in", "FAPs", "treated", "or", "not", "with", "TSA", "after", "antagomiR", "treatment", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Star", "(", "*", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "t", "-", "test", "relative", "to", "FAPs", "-", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "E", ")", "Graph", "showing", "the", "expression", "levels", "of", "miR", "-", "206", "-", "3p", "and", "miR", "-", "145", "-", "5p", "in", "FAPs", "-", "derived", "EVs", "treated", "or", "not", "with", "TSA", "after", "antagomiR", "treatment", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Star", "(", "*", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "t", "-", "test", "relative", "to", "FAPs", "-", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Stainings", "and", "relative", "measurements", "on", "Tibialis", "Anterior", "muscle", "transversal", "sections", "of", "1", ".", "5", "months", "old", "mdx", "mice", "treated", "daily", "for", "21", "days", "with", "intra", "-", "peritoneal", "injection", "of", "vehicle", "(", "CTR", ")", "or", "TSA", ",", "or", "once", "a", "week", "with", "intramuscular", "injections", "(", "Tibialis", "Anterior", ")", "of", "EVs", "derived", "from", "FAPs", "(", "EVs", "-", "FAPs", ")", "exposed", "or", "not", "to", "TSA", "in", "vivo", "(", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", "-", ",", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "-", ")", "EVs", "derived", "from", "FAPs", "control", "transfected", "with", "the", "antagomiR", "-", "206", "(", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", "A", "-", "206", ")", "and", "of", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "transfected", "with", "antagomiR", "-", "206", "and", "antagomiR", "-", "145", "(", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "A", "-", "206", ",", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "A", "-", "145", ")", ".", "EVs", "were", "injected", "every", "seven", "days", "and", "sacrificed", "after", "21", "days", "of", "treatment", "(", "n", "=", "5", "for", "CTR", ",", "TSA", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", "and", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "while", "for", "AntagomiRs", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "immunofluorescence", "for", "embryonic", "myosin", "heavy", "chain", "(", "eMyHC", "-", "red", ")", "and", "laminin", "(", "Lam", "-", "cyan", ")", "stainings", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "G", ")", "Graph", "showing", "the", "quantification", "of", "cross", "-", "sectional", "area", "(", "CSA", ")", ".", "(", "H", ")", "Graph", "showing", "the", "quantification", "of", "muscle", "regeneration", "(", "eMyHC", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Stainings", "and", "relative", "measurements", "on", "Tibialis", "Anterior", "muscle", "transversal", "sections", "of", "1", ".", "5", "months", "old", "mdx", "mice", "treated", "daily", "for", "21", "days", "with", "intra", "-", "peritoneal", "injection", "of", "vehicle", "(", "CTR", ")", "or", "TSA", ",", "or", "once", "a", "week", "with", "intramuscular", "injections", "(", "Tibialis", "Anterior", ")", "of", "EVs", "derived", "from", "FAPs", "(", "EVs", "-", "FAPs", ")", "exposed", "or", "not", "to", "TSA", "in", "vivo", "(", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", "-", ",", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "-", ")", "EVs", "derived", "from", "FAPs", "control", "transfected", "with", "the", "antagomiR", "-", "206", "(", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", "A", "-", "206", ")", "and", "of", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "transfected", "with", "antagomiR", "-", "206", "and", "antagomiR", "-", "145", "(", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "A", "-", "206", ",", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "A", "-", "145", ")", ".", "EVs", "were", "injected", "every", "seven", "days", "and", "sacrificed", "after", "21", "days", "of", "treatment", "(", "n", "=", "5", "for", "CTR", ",", "TSA", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", "and", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "while", "for", "AntagomiRs", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "I", ")", "Representative", "images", "of", "Masson", "'", "s", "Trichrome", "staining", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "J", ")", "Graph", "showing", "the", "quantifications", "of", "muscle", "fiber", "area", "fraction", "(", "MFAF", ")", ".", "(", "K", ")", "Graph", "showing", "the", "quantifications", "of", "fibrotic", "area", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Stainings", "and", "relative", "measurements", "on", "Tibialis", "Anterior", "muscle", "transversal", "sections", "of", "1", ".", "5", "months", "old", "mdx", "mice", "treated", "daily", "for", "21", "days", "with", "intra", "-", "peritoneal", "injection", "of", "vehicle", "(", "CTR", ")", "or", "TSA", ",", "or", "once", "a", "week", "with", "intramuscular", "injections", "(", "Tibialis", "Anterior", ")", "of", "EVs", "derived", "from", "FAPs", "(", "EVs", "-", "FAPs", ")", "exposed", "or", "not", "to", "TSA", "in", "vivo", "(", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", "-", ",", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "-", ")", "EVs", "derived", "from", "FAPs", "control", "transfected", "with", "the", "antagomiR", "-", "206", "(", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", "A", "-", "206", ")", "and", "of", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "transfected", "with", "antagomiR", "-", "206", "and", "antagomiR", "-", "145", "(", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "A", "-", "206", ",", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "A", "-", "145", ")", ".", "EVs", "were", "injected", "every", "seven", "days", "and", "sacrificed", "after", "21", "days", "of", "treatment", "(", "n", "=", "5", "for", "CTR", ",", "TSA", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", "and", "EVs", "-", "FAPs", "TSA", "while", "for", "AntagomiRs", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "L", ")", "Representative", "images", "of", "myeloperoxidase", "staining", "(", "MPO", "-", "red", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "M", ")", "Graph", "showing", "the", "quantifications", "of", "inflammation", "(", "MPO", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Flow cytometry analysis of mdx muscles injected with PKH67-labeled EVs isolated from FAPs of 1.5 month old mdx mice exposed to TSA. The left panel shows the percentage of PKH-67 positive cells in whole muscle. The right panel shows the percentage of the PKH-67 positive MuSCs.(B) Representative images of PKH-67 (green) and DAPI (blue) staining in MuSCs freshly isolated from muscles previously injected with PKH67-labeled EVs. Scale bar = 25 μm. Data information: Nuclei were counterstained with DAPI (blue).(C) Graph showing the relative expression of miR-206-3p in MuSCs isolated as described in (A and B) and in MuSCs from muscles injected with PKH67-labeled EVs isolated from FAPs of 1.5 month old mdx mice exposed to TSA, and then transfected or not with Drosha siRNA (siRNA Drosha) (n=4). Star (*) means significance relative to MuSCs that not uptake PKH67-labled EVs, **p < 0.01. Hash (#) means significance compared to MuSCs that uptake EVs-FAPs TSA, ##p < 0.01. § indicates Anova analysis, §§p<0,01.(D) Graph showing the expression levels of miR-206-3p and miR-145-5p in FAPs treated or not with TSA after antagomiR treatment (n=3, biological replicates). Star (*) indicates statistical analysis by t-test relative to FAPs -; *p<0.05, **p<0.01(E) Graph showing the expression levels of miR-206-3p and miR-145-5p in FAPs-derived EVs treated or not with TSA after antagomiR treatment (n=3, biological replicates). Star (*) indicates statistical analysis by t-test relative to FAPs -; *p<0.05.Stainings and relative measurements on Tibialis Anterior muscle transversal sections of 1.5 months old mdx mice treated daily for 21 days with intra-peritoneal injection of vehicle (CTR) or TSA, or once a week with intramuscular injections (Tibialis Anterior) of EVs derived from FAPs (EVs-FAPs) exposed or not to TSA in vivo (EVs-FAPs CTR -, EVs-FAPs TSA -) EVs derived from FAPs control transfected with the antagomiR-206 (EVs-FAPs CTR A-206) and of EVs-FAPs TSA transfected with antagomiR-206 and antagomiR-145 (EVs-FAPs TSA A-206, EVs-FAPs TSA A-145). EVs were injected every seven days and sacrificed after 21 days of treatment (n=5 for CTR, TSA EVs-FAPs CTR and EVs-FAPs TSA while for AntagomiRs n=3, biological replicates). (F) Representative images of immunofluorescence for embryonic myosin heavy chain (eMyHC-red) and laminin (Lam-cyan) stainings. Scale bar = 50 μm. (G) Graph showing the quantification of cross-sectional area (CSA). (H) Graph showing the quantification of muscle regeneration (eMyHC). Data information: Nuclei were counterstained with DAPI (blue).Stainings and relative measurements on Tibialis Anterior muscle transversal sections of 1.5 months old mdx mice treated daily for 21 days with intra-peritoneal injection of vehicle (CTR) or TSA, or once a week with intramuscular injections (Tibialis Anterior) of EVs derived from FAPs (EVs-FAPs) exposed or not to TSA in vivo (EVs-FAPs CTR -, EVs-FAPs TSA -) EVs derived from FAPs control transfected with the antagomiR-206 (EVs-FAPs CTR A-206) and of EVs-FAPs TSA transfected with antagomiR-206 and antagomiR-145 (EVs-FAPs TSA A-206, EVs-FAPs TSA A-145). EVs were injected every seven days and sacrificed after 21 days of treatment (n=5 for CTR, TSA EVs-FAPs CTR and EVs-FAPs TSA while for AntagomiRs n=3, biological replicates). (I) Representative images of Masson's Trichrome staining. Scale bar = 50 μm. (J) Graph showing the quantifications of muscle fiber area fraction (MFAF). (K) Graph showing the quantifications of fibrotic area. Data information: Nuclei were counterstained with DAPI (blue).Stainings and relative measurements on Tibialis Anterior muscle transversal sections of 1.5 months old mdx mice treated daily for 21 days with intra-peritoneal injection of vehicle (CTR) or TSA, or once a week with intramuscular injections (Tibialis Anterior) of EVs derived from FAPs (EVs-FAPs) exposed or not to TSA in vivo (EVs-FAPs CTR -, EVs-FAPs TSA -) EVs derived from FAPs control transfected with the antagomiR-206 (EVs-FAPs CTR A-206) and of EVs-FAPs TSA transfected with antagomiR-206 and antagomiR-145 (EVs-FAPs TSA A-206, EVs-FAPs TSA A-145). EVs were injected every seven days and sacrificed after 21 days of treatment (n=5 for CTR, TSA EVs-FAPs CTR and EVs-FAPs TSA while for AntagomiRs n=3, biological replicates). (L) Representative images of myeloperoxidase staining (MPO-red). Scale bar = 50 μm. (M) Graph showing the quantifications of inflammation (MPO). Data information: Nuclei were counterstained with DAPI (blue)."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Representative", "images", "of", "myogenic", "differentiation", "of", "MuSCs", "assessed", "by", "immunostaining", "for", "MyHC", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "MuSCs", "were", "cultured", "alone", "(", "-", ")", "or", "with", "EVs", "(", "EVs", "FAPs", ")", "isolated", "from", "FAPs", "in", "vivo", "exposed", "or", "not", "to", "TSA", "(", "CTR", "and", "TSA", ")", "and", "transfected", "or", "not", "with", "Antagomir", "-", "206", "(", "-", "and", "A", "-", "206", ")", ".", "(", "n", "=", "7", "for", "all", "samples", ",", "but", "antagomir", "'", "s", "samples", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "C", ")", "Graph", "relative", "to", "Notch3", "expression", "in", "MuSCs", "isolated", "from", "1", ".", "5", "month", "old", "mdx", "mice", "treated", "either", "with", "vehicle", "(", "CTR", ")", "or", "TSA", "(", "TSA", ")", ",", "and", "in", "EVs", "derived", "from", "FAPs", "(", "EVs", "-", "FAPs", ")", "isolated", "from", "1", ".", "5", "month", "old", "mdx", "mice", "treated", "either", "with", "vehicle", "(", "CTR", ")", "or", "TSA", "(", "TSA", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Star", "(", "*", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "Tukey", "test", "relative", "to", "mdx", "vehicle", "treated", "mdx", "mice", "(", "CTR", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ";", ".", "hash", "(", "#", ")", "means", "significance", "compared", "to", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", ",", "#", "#", "p", "<", "0", ",", "01", ".", "§", "indicates", "significance", "by", "Anova", "test", ";", "§", "§", "p", ">", "0", ",", "01", ".", "(", "D", ")", "Graph", "relative", "to", "Notch1", "expression", "in", "MuSCs", "isolated", "from", "1", ".", "5", "month", "old", "mdx", "mice", "treated", "either", "with", "vehicle", "(", "CTR", ")", "or", "TSA", "(", "TSA", ")", ",", "and", "in", "EVs", "derived", "from", "FAPs", "(", "EVs", "-", "FAPs", ")", "isolated", "from", "1", ".", "5", "month", "old", "mdx", "mice", "treated", "either", "with", "vehicle", "(", "CTR", ")", "or", "TSA", "(", "TSA", ")", "n", "=", "3", ".", "Star", "(", "*", ")", "indicates", "statistical", "analysis", "by", "Tukey", "test", "relative", "to", "mdx", "vehicle", "treated", "mdx", "mice", "(", "CTR", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ";", ".", "hash", "(", "#", ")", "means", "significance", "compared", "to", "EVs", "-", "FAPs", "CTR", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "§", "indicates", "significance", "by", "Anova", "test", ";", "§", "§", "p", ">", "0", ",", "01", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "showing", "myofibers", "cultured", "alone", "(", "Ctr", ")", "or", "with", "extracellular", "vesicles", "(", "F", ")", "From", "left", "to", "right", ":", "representative", "images", "of", "myofibers", "cultured", "for", "24", "hours", "alone", "(", "-", ")", "or", "with", "conditioned", "media", "of", "FAPs", "that", "were", "previously", "exposed", "or", "not", "to", "TSA", "and", "GW4869", "(", "MEDIA", "-", "FAPs", ")", "or", "extracellular", "vesicles", "(", "EVs", "-", "FAPs", ")", "collected", "from", "FAPs", "exposed", "or", "not", "to", "TSA", "in", "vivo", "(", "CTR", "and", "TSA", ")", "and", "transfected", "with", "antagomiR", "-", "206", "(", "TSA", "A", "-", "206", ")", ".", "Myofibers", "have", "been", "stained", "for", "EdU", "(", "Cyan", ")", ",", "immunofluorescence", "with", "Pax7", "(", "green", ")", ",", "MyoD", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "25", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Representative images of myogenic differentiation of MuSCs assessed by immunostaining for MyHC (green). Nuclei were counterstained with DAPI (blue). MuSCs were cultured alone (-) or with EVs (EVs FAPs) isolated from FAPs in vivo exposed or not to TSA (CTR and TSA) and transfected or not with Antagomir-206 (- and A-206). (n=7 for all samples, but antagomir's samples n=3, biological replicates). Scale bar =50 μm.(C) Graph relative to Notch3 expression in MuSCs isolated from 1.5 month old mdx mice treated either with vehicle (CTR) or TSA (TSA), and in EVs derived from FAPs (EVs-FAPs) isolated from 1.5 month old mdx mice treated either with vehicle (CTR) or TSA (TSA) (n=3). Star (*) indicates statistical analysis by Tukey test relative to mdx vehicle treated mdx mice (CTR); *p<0,05;. hash (#) means significance compared to EVs-FAPs CTR, ##p<0,01. § indicates significance by Anova test; §§ p>0,01.(D) Graph relative to Notch1 expression in MuSCs isolated from 1.5 month old mdx mice treated either with vehicle (CTR) or TSA (TSA), and in EVs derived from FAPs (EVs-FAPs) isolated from 1.5 month old mdx mice treated either with vehicle (CTR) or TSA (TSA) n=3. Star (*) indicates statistical analysis by Tukey test relative to mdx vehicle treated mdx mice (CTR); *p<0,05;. hash (#) means significance compared to EVs-FAPs CTR; *p < 0.05. § indicates significance by Anova test; §§ p>0,01.(E) Representative images showing myofibers cultured alone (Ctr) or with extracellular vesicles(F) From left to right: representative images of myofibers cultured for 24 hours alone (-) or with conditioned media of FAPs that were previously exposed or not to TSA and GW4869 (MEDIA-FAPs) or extracellular vesicles (EVs-FAPs) collected from FAPs exposed or not to TSA in vivo (CTR and TSA) and transfected with antagomiR-206 (TSA A-206). Myofibers have been stained for EdU(Cyan), immunofluorescence with Pax7 (green), MyoD (red). Nuclei were counterstained with DAPI (blue). (n=3). Scale bar = 25 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Colocalization", "analysis", "of", "KIF3A", "/", "B", "/", "KAP3", "with", "APC", "by", "immunostaining", "of", "hippocampal", "primary", "neurons", ".", "(", "D", ")", "Pull", "-", "down", "analysis", "of", "the", "binding", "of", "APCARM", "with", "KIF3", "/", "KAP3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Colocalization analysis of KIF3A/B/KAP3 with APC by immunostaining of hippocampal primary neurons.(D) Pull-down analysis of the binding of APCARM with KIF3/KAP3."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "D", ")", "XL", "-", "MS", "analysis", "of", "the", "interaction", "sites", "between", "KIF3", "/", "KAP3", "and", "APCARM", ".", "Two", "crosslinked", "site", "pairs", "were", "found", "to", "correspond", "to", "the", "possible", "KIF3", "/", "KAP3", "-", "APCARM", "binding", "region", "marked", "by", "asterisks", "in", "C", ".", "Cartoon", "diagrams", ",", "sequence", "alignment", "and", "LC", "-", "MS", "data", "are", "shown", "with", "crosslinked", "sites", "highlighted", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(D) XL-MS analysis of the interaction sites between KIF3/KAP3 and APCARM. Two crosslinked site pairs were found to correspond to the possible KIF3/KAP3-APCARM binding region marked by asterisks in C. Cartoon diagrams, sequence alignment and LC-MS data are shown with crosslinked sites highlighted."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "HS", "-", "AFM", "imaging", "of", "KIF3", "/", "KAP3", "-", "APC", "particles", ".", "(", "B", ")", "Time", "lapse", "HS", "-", "AFM", "images", "of", "a", "representative", "ABK", "-", "APCARM", "particle", "with", "a", "continuous", "tapping", "force", ".", "(", "C", ")", "Representative", "HS", "-", "AFM", "images", "of", "ABK", "-", "APCARM", "illustrating", "the", "dissociation", "dynamic", ".", "Continuous", "tapping", "of", "AFM", "triggered", "the", "dissociation", "of", "APCARM", "from", "ABK", ".", "Red", "arrows", "indicate", "the", "binding", "interface", "between", "ABK", "and", "ABK", "-", "APCARM", ".", "(", "D", ")", "Statistical", "analysis", "of", "the", "AFM", "-", "based", "ABK", "and", "ABK", "-", "APCARM", "particle", "conformations", ".", "200", "frames", "extracted", "from", "three", "independent", "AFM", "movies", "of", "ABK", "and", "ABK", "-", "APCARM", "were", "used", "for", "the", "analysis", ".", "Distance", "from", "the", "coiled", "coil", "distal", "tip", "to", "the", "docking", "domain", "(", "length", "of", "the", "protrusion", "as", "shown", "by", "the", "dotted", "lines", ")", "was", "calculated", "and", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "Data", "derived", "from", "each", "of", "the", "three", "movies", "were", "indicated", "by", "circles", ",", "triangles", "and", "rectangles", ",", "respectively", ".", "Based", "on", "the", "distal", "-", "center", "distance", ",", "particle", "conformations", "were", "classified", "into", "three", "forms", ",", "L", "(", "cargo", "-", "locked", "globular", "form", ")", ",", "T", "(", "Transitional", "curved", "form", ")", "and", "D", "(", "cargo", "-", "docked", "elongated", "form", ")", ".", "Unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "evaluate", "the", "statistical", "significance", ".", "The", "solid", "and", "dotted", "lines", "indicate", "the", "median", "and", "quartiles", ",", "respectively", ".", "The", "AFM", "images", "shown", "here", "are", "re", "-", "used", "in", "the", "figure", "5A", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) HS-AFM imaging of KIF3/KAP3-APC particles.(B) Time lapse HS-AFM images of a representative ABK-APCARM particle with a continuous tapping force.(C) Representative HS-AFM images of ABK-APCARM illustrating the dissociation dynamic. Continuous tapping of AFM triggered the dissociation of APCARM from ABK. Red arrows indicate the binding interface between ABK and ABK-APCARM.(D) Statistical analysis of the AFM-based ABK and ABK-APCARM particle conformations. 200 frames extracted from three independent AFM movies of ABK and ABK-APCARM were used for the analysis. Distance from the coiled coil distal tip to the docking domain (length of the protrusion as shown by the dotted lines) was calculated and shown as violin plots. Data derived from each of the three movies were indicated by circles, triangles and rectangles, respectively. Based on the distal-center distance, particle conformations were classified into three forms, L (cargo-locked globular form), T (Transitional curved form) and D (cargo-docked elongated form). Unpaired t test was used to evaluate the statistical significance. The solid and dotted lines indicate the median and quartiles, respectively. The AFM images shown here are re-used in the figure 5A."}
{"words": ["figf1", "(", "b", ")", "SAR405", "inhibits", "the", "function", "of", "Vps34", "in", "the", "GFP", "-", "FYVE", "cellular", "assay", ".", "HeLa", "cells", "stably", "transfected", "with", "GFP", "-", "FYVE", "were", "incubated", "with", "DMSO", "(", "left", ")", "or", "with", "1", "μM", "SAR405", "(", "right", ")", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "and", "nuclei", "were", "stained", "using", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ")", ".", "Fluorescence", "was", "analyzed", "using", "an", "imaging", "cytometer", "(", "X40", ")", ".", "One", "representative", "image", "out", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "depicted", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "(", "c", ")", "SAR405", "does", "not", "prevent", "phosphorylation", "of", "Akt", "and", "S6", ".", "U87MG", "cells", "were", "treated", "with", "SAR405", "or", "PI103", "for", "2", "h", "at", "the", "indicated", "concentrations", ".", "The", "effect", "of", "compounds", "on", "phosphorylated", "Akt", "(", "p", "-", "Akt", ")", "Ser473", "and", "Thr308", "residues", ",", "total", "Akt", "and", "on", "phosphorylated", "S6", "(", "Ser240", "and", "Ser244", "residues", ")", "and", "total", "S6", "protein", "was", "measured", "using", "western", "blotting", ".", "One", "representative", "experiment", "from", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Full", "-", "length", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(b) SAR405 inhibits the function of Vps34 in the GFP-FYVE cellular assay. HeLa cells stably transfected with GFP-FYVE were incubated with DMSO (left) or with 1 μM SAR405 (right) for 2 h. Cells were fixed, and nuclei were stained using Hoechst 33342 (blue). Fluorescence was analyzed using an imaging cytometer (X40). One representative image out of three independent experiments is depicted. Scale bars, 20 μm.(c) SAR405 does not prevent phosphorylation of Akt and S6. U87MG cells were treated with SAR405 or PI103 for 2 h at the indicated concentrations. The effect of compounds on phosphorylated Akt (p-Akt) Ser473 and Thr308 residues, total Akt and on phosphorylated S6 (Ser240 and Ser244 residues) and total S6 protein was measured using western blotting. One representative experiment from at least two independent experiments is shown. Full-length blots are shown in Supplementary Figure 6."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "SAR405", "induces", "late", "endosome", "-", "lysosome", "swelling", ".", "RKO", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "upper", "panels", ")", "or", "with", "10", "μM", "SAR405", "for", "16", "h", "(", "lower", "panels", ")", ".", "The", "late", "endosomes", "-", "lysosomes", "compartment", "was", "assessed", "using", "Lysotracker", "green", "(", "left", ")", "or", "Alexa", "488", "-", "conjugated", "anti", "-", "Lamp1", "antibodies", "(", "right", ")", ",", "as", "indicated", ".", "Nuclei", "were", "stained", "using", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ")", ".", "One", "representative", "image", "chosen", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "showing", "fluorescence", "imaged", "using", "a", "Zeiss", "microscope", "(", "X40", ")", ",", "is", "shown", "for", "each", "condition", ".", "Arrows", "indicate", "accumulation", "of", "swollen", "late", "endosome", "-", "lysosomes", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "(", "b", ")", "SAR405", "triggers", "accumulation", "of", "p62", ".", "RKO", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentration", "of", "Vps34", "inhibitor", "for", "24", "h", ".", "The", "effect", "on", "the", "p62", "biomarker", "was", "analyzed", "by", "western", "blotting", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Full", "-", "length", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "14", ".", "(", "c", ")", "SAR405", "affects", "the", "maturation", "of", "cathepsin", "D", "(", "cat", "D", ")", ".", "RKO", "cells", "were", "treated", "at", "the", "indicated", "concentrations", "of", "SAR405", "for", "24", "h", ".", "The", "different", "forms", "of", "cathepsin", "D", "(", "PPCD", ",", "pre", "-", "pro", "-", "catD", ")", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Full", "-", "length", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "16", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) SAR405 induces late endosome-lysosome swelling. RKO cells were treated with DMSO (upper panels) or with 10 μM SAR405 for 16 h (lower panels). The late endosomes-lysosomes compartment was assessed using Lysotracker green (left) or Alexa 488-conjugated anti-Lamp1 antibodies (right), as indicated. Nuclei were stained using Hoechst 33342 (blue). One representative image chosen from three independent experiments, showing fluorescence imaged using a Zeiss microscope (X40), is shown for each condition. Arrows indicate accumulation of swollen late endosome-lysosomes. Scale bars, 20 μm.(b) SAR405 triggers accumulation of p62. RKO cells were treated with the indicated concentration of Vps34 inhibitor for 24 h. The effect on the p62 biomarker was analyzed by western blotting. GAPDH was used as a loading control. The results are representative of at least two independent experiments. Full-length blots are shown in Supplementary Figure 14.(c) SAR405 affects the maturation of cathepsin D (cat D). RKO cells were treated at the indicated concentrations of SAR405 for 24 h. The different forms of cathepsin D (PPCD, pre-pro-catD) were analyzed by western blotting. GAPDH was used as a loading control. The results are representative of at least two independent experiments. Full-length blots are shown in Supplementary Figure 16."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "GFP", "-", "LC3", "HeLa", "cells", "were", "cultured", "in", "fed", "conditions", "or", "starved", "using", "EBSS", "plus", "10", "μM", "hydroxychloroquine", "and", "treated", "with", "Vps34", "inhibitor", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "and", "nuclei", "were", "stained", "using", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ")", ".", "One", "representative", "image", ",", "acquired", "with", "an", "iCyte", "imaging", "cytometer", ",", "for", "three", "independent", "experiments", "is", "depicted", "(", "X40", ")", ".", "White", "arrows", "indicate", "GFP", "-", "LC3", "spots", ",", "which", "correspond", "to", "the", "autophagosomes", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "b", ")", "Histograms", "show", "the", "percentage", "of", "positive", "cells", "and", "GFP", "intensity", ",", "measured", "using", "an", "imaging", "cytometer", "for", "different", "compound", "concentrations", "on", "GFP", "-", "LC3", "HeLa", "cells", ".", "Black", "and", "gray", "histograms", "correspond", "to", "fed", "and", "starved", "conditions", ",", "respectively", ".", "For", "GFP", "intensity", ",", "the", "values", "were", "normalized", "to", "1", "for", "fed", "conditions", ".", "Data", "show", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "c", ")", "Wild", "-", "type", "HeLa", "and", "H1299", "cell", "lines", "were", "cultured", "either", "in", "fed", "or", "starved", "conditions", "with", "EBSS", "and", "10", "μM", "hydroxychloroquine", "(", "HCQ", ")", ",", "as", "indicated", ".", "Cells", "were", "treated", "at", "the", "same", "time", "with", "SAR405", "at", "different", "concentrations", ".", "LC3", "-", "II", "was", "measured", "by", "western", "blotting", ",", "and", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "One", "representative", "experiment", "for", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Full", "-", "length", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "18", ".", "(", "d", ")", "Histograms", "show", "the", "LC3", "-", "II", "/", "GAPDH", "ratio", "for", "each", "condition", "in", "the", "two", "cell", "lines", ".", "Black", "and", "gray", "histograms", "correspond", "to", "fed", "condition", "and", "EBSS", "conditions", ",", "respectively", ".", "The", "addition", "of", "hydroxychloroquine", "at", "10", "μM", "is", "indicated", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "1", "for", "fed", "conditions", ".", "Data", "show", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) GFP-LC3 HeLa cells were cultured in fed conditions or starved using EBSS plus 10 μM hydroxychloroquine and treated with Vps34 inhibitor. Cells were fixed, and nuclei were stained using Hoechst 33342 (blue). One representative image, acquired with an iCyte imaging cytometer, for three independent experiments is depicted (X40). White arrows indicate GFP-LC3 spots, which correspond to the autophagosomes. Scale bars, 10 μm. (b) Histograms show the percentage of positive cells and GFP intensity, measured using an imaging cytometer for different compound concentrations on GFP-LC3 HeLa cells. Black and gray histograms correspond to fed and starved conditions, respectively. For GFP intensity, the values were normalized to 1 for fed conditions. Data show mean ± s.d. for three independent experiments.(c) Wild-type HeLa and H1299 cell lines were cultured either in fed or starved conditions with EBSS and 10 μM hydroxychloroquine (HCQ), as indicated. Cells were treated at the same time with SAR405 at different concentrations. LC3-II was measured by western blotting, and GAPDH was used as a loading control. One representative experiment for three independent experiments is shown. Full-length blots are shown in Supplementary Figure 18. (d) Histograms show the LC3-II/GAPDH ratio for each condition in the two cell lines. Black and gray histograms correspond to fed condition and EBSS conditions, respectively. The addition of hydroxychloroquine at 10 μM is indicated. Values were normalized to 1 for fed conditions. Data show mean ± s.d. for three independent experiments."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "GFP", "-", "LC3", "H1299", "cells", "were", "treated", "with", "1", "μM", "of", "the", "catalytic", "mTOR", "inhibitor", "AZD8055", "in", "fed", "conditions", "with", "DMSO", "(", "left", ")", "or", "with", "1", "μM", "SAR405", "(", "right", ")", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "and", "nuclei", "were", "stained", "using", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ")", ".", "One", "representative", "image", "of", "cells", "out", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "acquired", "using", "an", "iCyte", "imaging", "cytometer", ",", "is", "shown", "(", "X40", ")", ".", "White", "arrows", "indicate", "the", "GFP", "-", "LC3", "spots", ",", "which", "correspond", "to", "the", "autophagosomes", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "b", ")", "Histograms", "show", "the", "percentage", "of", "positive", "cells", "(", "top", ")", "and", "the", "GFP", "intensity", "(", "bottom", ")", ",", "as", "measured", "using", "an", "imaging", "cytometer", ".", "Treatment", "of", "GFP", "-", "LC3", "H1299", "in", "fed", "conditions", "with", "1", "μM", "of", "AZD8055", "and", "different", "concentrations", "of", "SAR405", "is", "indicated", ".", "For", "GFP", "intensity", ",", "the", "values", "were", "normalized", "to", "1", "for", "fed", "conditions", ".", "Data", "show", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "c", ")", "The", "concentration", "needed", "to", "reach", "40", "%", "inhibition", "(", "IC40", ")", "of", "cell", "proliferation", "is", "indicated", ".", "The", "top", "histograms", "indicate", "the", "IC40", "of", "SAR405", "as", "a", "single", "agent", "and", "in", "combination", "with", "everolimus", "in", "the", "three", "cell", "lines", ".", "The", "bottom", "histograms", "indicate", "the", "IC40", "of", "everolimus", "as", "a", "single", "agent", "and", "in", "combination", "with", "SAR405", ".", "The", "IC40", "values", "for", "the", "combination", "of", "the", "two", "compounds", "were", "determined", "using", "rays", "with", "an", "effective", "fraction", "∼", "0", ".", "5", ",", "corresponding", "to", "compounds", "that", "are", "in", "equipotent", "proportion", "in", "the", "mixture", "(", "Supplementary", "Fig", ".", "20", ")", ".", "The", "absolute", "IC40", "determination", "of", "both", "compounds", "is", "represented", "as", "the", "geometric", "mean", "from", "two", "or", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) GFP-LC3 H1299 cells were treated with 1 μM of the catalytic mTOR inhibitor AZD8055 in fed conditions with DMSO (left) or with 1 μM SAR405 (right). Cells were fixed, and nuclei were stained using Hoechst 33342 (blue). One representative image of cells out of three independent experiments, acquired using an iCyte imaging cytometer, is shown (X40). White arrows indicate the GFP-LC3 spots, which correspond to the autophagosomes. Scale bars, 10 μm. (b) Histograms show the percentage of positive cells (top) and the GFP intensity (bottom), as measured using an imaging cytometer. Treatment of GFP-LC3 H1299 in fed conditions with 1 μM of AZD8055 and different concentrations of SAR405 is indicated. For GFP intensity, the values were normalized to 1 for fed conditions. Data show mean ± s.d. for three independent experiments.(c) The concentration needed to reach 40% inhibition (IC40) of cell proliferation is indicated. The top histograms indicate the IC40 of SAR405 as a single agent and in combination with everolimus in the three cell lines. The bottom histograms indicate the IC40 of everolimus as a single agent and in combination with SAR405. The IC40 values for the combination of the two compounds were determined using rays with an effective fraction ∼0.5, corresponding to compounds that are in equipotent proportion in the mixture (Supplementary Fig. 20). The absolute IC40 determination of both compounds is represented as the geometric mean from two or three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2Figure", "2", ".", "SPOP", "localizes", "to", "nuclear", "speckles", "or", "other", "nuclear", "bodies", ".", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "fixed", "NIH", "3T3", "cells", "transiently", "expressing", "(", "A", ")", "full", "length", "HA", "-", "SPOP", ",", "(", "B", ")", "GFP", "-", "Gli31455", ",", "and", "(", "C", ")", "HA", "-", "SPOP", "+", "GFP", "-", "Gli31", "-", "455", "are", "shown", ".", "DAPI", "was", "used", "to", "stain", "the", "nucleus", ",", "SPOP", "localization", "was", "identified", "using", "a", "anti", "-", "HA", "antibody", ",", "nuclear", "speckle", "localization", "was", "identified", "using", "a", "anti", "-", "SC", "-", "35", "antibody", ",", "and", "Gli31", "-", "455", "localization", "was", "identified", "via", "GFP", "fluorescence", ".", "SPOP", "co", "-", "localizes", "with", "a", "marker", "for", "nuclear", "speckles", "or", "with", "the", "substrate", "Gli31455", ".", "The", "areas", "with", "overlapping", "HA", "-", "and", "GFP", "signal", "contain", "75", "%", "of", "the", "punctate", "HA", "signal", ",", "and", "100", "%", "of", "the", "punctate", "GFP", "signal", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Figure 2. SPOP localizes to nuclear speckles or other nuclear bodies. Confocal microscopy images of fixed NIH 3T3 cells transiently expressing (A) full length HA-SPOP, (B) GFP-Gli31455, and (C) HA-SPOP+GFP-Gli31-455 are shown. DAPI was used to stain the nucleus, SPOP localization was identified using a anti-HA antibody, nuclear speckle localization was identified using a anti-SC-35 antibody, and Gli31-455 localization was identified via GFP fluorescence. SPOP co-localizes with a marker for nuclear speckles or with the substrate Gli31455. The areas with overlapping HA- and GFP signal contain 75% of the punctate HA signal, and 100% of the punctate GFP signal."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "B", ")", "NIH", "3T3", "cells", "were", "(", "A", ")", "co", "-", "transfected", "with", "constructs", "expressing", "full", "length", "SPOP", "and", "GFP", "-", "Gli31455", "or", "(", "B", ")", "transfected", "with", "a", "construct", "expressing", "SC", "-", "35", "-", "GFP", ",", "and", "GFP", "fluorescence", "was", "monitored", "in", "live", "cells", ".", "(", "A", ")", "Snapshots", "were", "taken", "from", "individual", "timepoints", "as", "noted", "in", "the", "Figure", "to", "show", "photobleaching", "(", "at", "0", "s", ")", ",", "recovery", ",", "and", "nuclear", "body", "fusion", "events", ".", "The", "arrow", "in", "each", "panel", "points", "to", "the", "body", "that", "was", "photobleached", "and", "subsequently", "fuses", "with", "another", "body", ".", "These", "data", "were", "not", "used", "to", "calculate", "the", "average", "recovery", "time", "as", "the", "fusion", "event", "precludes", "accurate", "measurement", "of", "fluorescence", "recovery", ".", "(", "B", ")", "Snapshots", "at", "indicated", "timepoints", "show", "a", "nuclear", "speckle", "fusion", "event", ".", "Additional", "images", "are", "shown", "in", "Fig", "EV1", ".", "(", "C", ")", "Individual", "nuclear", "speckles", "were", "photobleached", "and", "FRAP", "was", "monitored", "for", "90", "sec", ".", "Data", "from", "45", "individual", "cells", "and", "FRAP", "events", "were", "corrected", "for", "background", ",", "normalized", "to", "the", "minimum", "and", "maximum", "intensity", ",", "and", "the", "mean", "is", "shown", "with", "error", "bars", "representing", "the", "standard", "error", "of", "the", "mean", ".", "The", "mean", "characteristic", "recovery", "time", "is", "indicated", "±", "SEM", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Nuclear", "bodies", "are", "close", "to", "spherical", ".", "(", "D", ")", "Aspect", "ratios", "for", "speckles", "observed", "in", "NIH", "3T3", "cells", "transfected", "with", "constructs", "expressing", "HA", "-", "SPOP", "(", "151", "cells", ")", "(", "D", ")", ",", "or", "GFP", "-", "Gli31", "-", "455", "and", "HA", "-", "SPOP", "(", "155", "cells", ")", "(", "E", ")", "were", "calculated", "as", "described", "previously", "(", "Brangwynne", "et", "al", ",", "2011", ")", ".", "Representative", "individual", "images", "of", "cells", "are", "shown", "as", "insets", "in", "each", "panel", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-B) NIH 3T3 cells were (A) co-transfected with constructs expressing full length SPOP and GFP-Gli31455 or (B) transfected with a construct expressing SC-35-GFP, and GFP fluorescence was monitored in live cells. (A) Snapshots were taken from individual timepoints as noted in the Figure to show photobleaching (at 0 s), recovery, and nuclear body fusion events. The arrow in each panel points to the body that was photobleached and subsequently fuses with another body. These data were not used to calculate the average recovery time as the fusion event precludes accurate measurement of fluorescence recovery. (B) Snapshots at indicated timepoints show a nuclear speckle fusion event. Additional images are shown in Fig EV1.(C) Individual nuclear speckles were photobleached and FRAP was monitored for 90 sec. Data from 45 individual cells and FRAP events were corrected for background, normalized to the minimum and maximum intensity, and the mean is shown with error bars representing the standard error of the mean. The mean characteristic recovery time is indicated ± SEM.(D-E) Nuclear bodies are close to spherical. (D) Aspect ratios for speckles observed in NIH 3T3 cells transfected with constructs expressing HA-SPOP (151 cells) (D), or GFP-Gli31-455 and HA-SPOP (155 cells) (E) were calculated as described previously (Brangwynne et al, 2011). Representative individual images of cells are shown as insets in each panel."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "SEC", "chromatograms", "of", "given", "loading", "concentrations", "of", "SPOP28", "-", "359", "are", "shown", ".", "The", "concentrations", "were", "normalized", "to", "the", "monomer", "molecular", "weight", ",", "i", ".", "e", ".", ",", "identical", "concentrations", "of", "dimeric", "SPOP", "ΔBACK", "(", "see", "Fig", "EV2", ")", "and", "oligomeric", "SPOP28", "-", "359", "contain", "identical", "numbers", "of", "protomers", ".", "(", "B", ")", "SEC", "chromatograms", "for", "SPOP", "constructs", "defective", "in", "self", "-", "association", "in", "one", "or", "both", "oligomerization", "domains", "are", "shown", ".", "Proteins", "were", "injected", "at", "the", "same", "loading", "concentration", "(", "533", "µM", ")", "and", "the", "elution", "volume", "of", "globular", "molecular", "weight", "standards", "is", "noted", "above", "the", "graph", ".", "(", "C", ")", "SEC", "chromatograms", "of", "SPOP28", "-", "359", "(", "200", "µM", ")", ",", "SPOP", "mutBACK", "(", "718", "µM", ")", ",", "and", "mixtures", "of", "the", "two", "(", "ratios", "given", "in", "the", "Figure", ",", "SPOP", "at", "200", "µM", ")", "are", "shown", ".", "The", "elution", "volume", "of", "globular", "molecular", "weight", "standards", "is", "noted", "above", "the", "graph", ".", "(", "D", ")", "Constructs", "for", "expressing", "full", "-", "length", "HA", "-", "SPOP", "or", "HA", "-", "SPOP", "mutants", "capable", "of", "oligomerization", "through", "only", "one", "(", "or", "neither", ")", "of", "the", "self", "-", "association", "domains", "were", "transfected", "into", "NIH", "3T3", "cells", ".", "DAPI", "was", "used", "to", "stain", "the", "nucleus", "and", "SPOP", "localization", "was", "identified", "using", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "Experiments", "were", "performed", "at", "least", "twice", "on", "four", "biological", "samples", ".", "Multiple", "cells", "were", "examined", "and", "representative", "cells", "are", "shown", ".", "For", "additional", "images", "see", "Appendix", "Fig", "S3", ".", "Scale", "bar", "represents", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) SEC chromatograms of given loading concentrations of SPOP28-359 are shown. The concentrations were normalized to the monomer molecular weight, i.e., identical concentrations of dimeric SPOP ΔBACK (see Fig EV2) and oligomeric SPOP28-359 contain identical numbers of protomers. (B) SEC chromatograms for SPOP constructs defective in self-association in one or both oligomerization domains are shown. Proteins were injected at the same loading concentration (533 µM) and the elution volume of globular molecular weight standards is noted above the graph. (C) SEC chromatograms of SPOP28-359 (200 µM), SPOP mutBACK (718 µM), and mixtures of the two (ratios given in the Figure, SPOP at 200 µM) are shown. The elution volume of globular molecular weight standards is noted above the graph.(D) Constructs for expressing full-length HA-SPOP or HA-SPOP mutants capable of oligomerization through only one (or neither) of the self-association domains were transfected into NIH 3T3 cells. DAPI was used to stain the nucleus and SPOP localization was identified using an anti-HA antibody. Experiments were performed at least twice on four biological samples. Multiple cells were examined and representative cells are shown. For additional images see Appendix Fig S3. Scale bar represents 5 µm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Substrate", "binding", "was", "assayed", "by", "anisotropy", "using", "a", "fluorescently", "labeled", "substrate", "peptide", ".", "All", "SPOP", "proteins", "bound", "substrate", "with", "an", "affinity", "similar", "to", "that", "of", "SPOP28", "-", "359", "(", "4", "-", "8", "µM", ",", "see", "Table", "2", ")", ".", "Experimental", "data", "are", "shown", "as", "circles", ";", "the", "solid", "lines", "are", "fits", "to", "eq", ".", "2", "(", "Roehrl", "et", "al", ",", "2004", ")", ".", "(", "B", ")", "In", "vitro", "crosslinking", "assays", "were", "performed", "for", "SPOP28", "-", "359", "and", "each", "mutant", "at", "30", "μM", "protein", "with", "the", "amide", "-", "specific", "BS3", "crosslinker", ".", "Crosslinking", "for", "SPOP", "ΔBACK", "and", "MATH", "domain", "are", "shown", "to", "demonstrate", "that", "crosslinking", "conditions", "do", "not", "lead", "to", "non", "-", "specific", "crosslinking", "of", "protein", "species", ".", "(", "C", ")", "Crosslinking", "reactions", "were", "performed", "on", "whole", "cell", "lysates", "from", "cells", "expressing", "wild", "type", "SPOP", ",", "SPOP", "mutBACK", ",", "SPOP", "mutBTB", ",", "or", "SPOP", "mutBTB", "-", "BACK", ".", "SPOP1", ",", "SPOP2", "and", "SPOPn", "identify", "SPOP", "monomers", ",", "dimers", "and", "larger", "species", ",", "respectively", ".", "For", "loading", "levels", "see", "Appendix", "Fig", "S4", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Substrate binding was assayed by anisotropy using a fluorescently labeled substrate peptide. All SPOP proteins bound substrate with an affinity similar to that of SPOP28-359 (4-8 µM, see Table 2). Experimental data are shown as circles; the solid lines are fits to eq. 2 (Roehrl et al, 2004).(B) In vitro crosslinking assays were performed for SPOP28-359 and each mutant at 30 μM protein with the amide-specific BS3 crosslinker. Crosslinking for SPOP ΔBACK and MATH domain are shown to demonstrate that crosslinking conditions do not lead to non-specific crosslinking of protein species. (C) Crosslinking reactions were performed on whole cell lysates from cells expressing wild type SPOP, SPOP mutBACK, SPOP mutBTB, or SPOP mutBTB-BACK. SPOP1, SPOP2 and SPOPn identify SPOP monomers, dimers and larger species, respectively. For loading levels see Appendix Fig S4."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "SV", "-", "AUC", "data", "for", "0", ".", "2", "nM", "AF488", "-", "SPOP", "ΔBACK", ".", "Fluorescence", "scans", "were", "collected", "for", "12", "h", "and", "are", "plotted", "against", "distance", "from", "the", "axis", "of", "rotation", "(", "circles", ")", ".", "The", "data", "were", "subjected", "to", "standard", "c", "(", "s", ")", "analysis", "in", "SEDFIT", "(", "Schuck", ",", "2000", ")", "and", "the", "results", "of", "this", "fit", "are", "shown", "(", "solid", "lines", ",", "rainbow", "color", "scheme", ")", ".", "(", "B", ")", "Sedimentation", "coefficient", "distributions", "for", "a", "selection", "of", "values", "from", "the", "dilution", "series", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "The", "isotherm", "of", "weighted", "-", "average", "s", "-", "values", "vs", ".", "concentration", "(", "black", "circles", ")", ",", "was", "fit", "to", "a", "dimer", "self", "-", "association", "model", "and", "reveals", "a", "KD", "of", "1", ".", "11", "nM", ",", "[", "95", "%", "confidence", "interval", "0", ".", "88", ",", "1", ".", "40", "nM", "]", "(", "solid", "line", ")", ".", "(", "D", ")", "The", "BACK", "domain", "dimerizes", "with", "micromolar", "affinity", ".", "Experimental", "weight", "-", "average", "molar", "mass", "(", "Mw", ")", "from", "CG", "-", "MALS", "for", "SPOP", "mutBTB", "(", "black", "circles", ")", "was", "fitted", "to", "a", "self", "-", "association", "model", "(", "see", "text", "for", "details", ")", "for", "BACK", "-", "BACK", "dimerization", "(", "black", "line", ")", "yielding", "a", "KD", "of", "36", "±", "3", "µM", "(", "average", "and", "standard", "deviation", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Fits", "to", "the", "monomer", "/", "dimer", "equilibrium", "model", "and", "to", "alternative", "monomer", "/", "trimer", ",", "tetramer", "and", "pentamer", "equilibrium", "models", "are", "depicted", "as", "black", "solid", "line", "and", "as", "dashed", "and", "grey", "lines", ",", "respectively", ".", "Residuals", "for", "all", "models", "are", "depicted", "in", "the", "lower", "panel", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) SV-AUC data for 0.2 nM AF488-SPOP ΔBACK. Fluorescence scans were collected for 12 h and are plotted against distance from the axis of rotation (circles). The data were subjected to standard c(s) analysis in SEDFIT (Schuck, 2000) and the results of this fit are shown (solid lines, rainbow color scheme).(B) Sedimentation coefficient distributions for a selection of values from the dilution series are shown.(C) The isotherm of weighted-average s-values vs. concentration (black circles), was fit to a dimer self-association model and reveals a KD of 1.11 nM, [95% confidence interval 0.88, 1.40 nM] (solid line).(D) The BACK domain dimerizes with micromolar affinity. Experimental weight-average molar mass (Mw) from CG-MALS for SPOP mutBTB (black circles) was fitted to a self-association model (see text for details) for BACK-BACK dimerization (black line) yielding a KD of 36 ± 3 µM (average and standard deviation from 3 independent experiments). Fits to the monomer/dimer equilibrium model and to alternative monomer/trimer, tetramer and pentamer equilibrium models are depicted as black solid line and as dashed and grey lines, respectively. Residuals for all models are depicted in the lower panel."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Experimental", "weight", "-", "average", "molar", "mass", "(", "Mw", ")", "from", "CG", "-", "MALS", "for", "SPOP28", "-", "359", "(", "orange", "circles", ")", "was", "fitted", "to", "an", "isodesmic", "self", "-", "association", "model", "in", "which", "SPOP", "dimers", "are", "the", "self", "-", "associating", "unit", "(", "orange", "line", ")", ".", "The", "largest", "SPOP", "oligomer", "taken", "into", "account", "was", "an", "undecamer", "of", "SPOP", "dimers", "(", "(", "SPOP2", ")", "11", ")", ".", "The", "fits", "from", "three", "independent", "experiments", "yielded", "a", "KD2", "of", "2", ".", "4", "±", "0", ".", "4", "µM", ".", "Lines", "for", "fits", "of", "the", "data", "to", "self", "-", "association", "models", "that", "assume", "formation", "of", "individual", "oligomeric", "species", "instead", "of", "isodesmic", "self", "-", "association", "are", "shown", "for", "reference", "(", "gray", "lines", ")", ".", "(", "C", ")", "Experimental", "weight", "-", "average", "molar", "mass", "(", "Mw", ")", "from", "CG", "-", "MALS", "data", "(", "circles", ")", "and", "fits", "(", "solid", "lines", ")", "are", "depicted", "for", "each", "SPOP", "construct", "assayed", ",", "showing", "that", "a", "progressive", "increase", "in", "SPOP", "oligomer", "size", "is", "observed", "only", "when", "both", "self", "-", "association", "domains", "are", "interaction", "-", "competent", ".", "This", "Figure", "is", "comprised", "of", "data", "shown", "in", "Figures", "6D", ",", "7B", ",", "and", "Appendix", "Fig", "S5A", "for", "direct", "comparison", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Experimental weight-average molar mass (Mw) from CG-MALS for SPOP28-359 (orange circles) was fitted to an isodesmic self-association model in which SPOP dimers are the self-associating unit (orange line). The largest SPOP oligomer taken into account was an undecamer of SPOP dimers ((SPOP2)11). The fits from three independent experiments yielded a KD2 of 2.4 ± 0.4 µM. Lines for fits of the data to self-association models that assume formation of individual oligomeric species instead of isodesmic self-association are shown for reference (gray lines).(C) Experimental weight-average molar mass (Mw) from CG-MALS data (circles) and fits (solid lines) are depicted for each SPOP construct assayed, showing that a progressive increase in SPOP oligomer size is observed only when both self-association domains are interaction-competent. This Figure is comprised of data shown in Figures 6D, 7B, and Appendix Fig S5A for direct comparison."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Native", "MS", "spectrum", "of", "30", "µM", "SPOP28", "-", "359", "confirms", "that", "SPOP", "self", "-", "associates", "through", "addition", "of", "dimers", ".", "The", "increase", "in", "mass", "indicates", "that", "the", "dimer", "is", "the", "stable", "building", "block", "within", "the", "assemblies", ".", "(", "C", ")", "Concentration", "-", "dependence", "of", "the", "SPOP", "oligomer", "size", "distribution", "(", "mole", "fraction", ")", "from", "isodesmic", "modeling", "of", "CG", "-", "MALS", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Native MS spectrum of 30 µM SPOP28-359 confirms that SPOP self-associates through addition of dimers. The increase in mass indicates that the dimer is the stable building block within the assemblies.(C) Concentration-dependence of the SPOP oligomer size distribution (mole fraction) from isodesmic modeling of CG-MALS data."}
{"words": ["Figure", "9Figure", "9", ".", "The", "self", "-", "association", "deficient", "SPOP", "mutant", "mutBTB", "has", "a", "substrate", "degradation", "defect", "in", "vivo", ".", "UAS", "transgenes", "were", "expressed", "under", "the", "control", "of", "an", "epithelial", "driver", "C765", "-", "Gal4", "in", "Drosophila", "melanogaster", ".", "(", "A", ")", "UAS", "vector", "served", "as", "a", "control", "and", "yielded", "a", "normal", "wing", ".", "Longitudinal", "veins", "are", "denoted", "by", "numbers", "1", "-", "5", ".", "Expression", "of", "(", "B", ")", "SPOP", "WT", "resulted", "in", "a", "modest", "Hh", "loss", "-", "of", "function", "phenotype", "with", "fusion", "of", "LV3", "and", "LV4", "(", "arrow", ")", ".", "(", "C", ")", "mutBTB", "acts", "in", "a", "dominant", "-", "negative", "manner", ",", "as", "evidenced", "by", "a", "modest", "Hh", "gain", "-", "of", "function", "phenotype", "with", "expansion", "of", "the", "LV3", "-", "LV4", "intervein", "space", ".", "Expression", "of", "(", "D", ")", "mutBACK", "and", "(", "E", ")", "mutBTB", "-", "BACK", "does", "not", "induce", "a", "wing", "patterning", "defect", ".", "~", "50", "animals", "each", "were", "analyzed", "from", "two", "independent", "crosses", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9Figure 9. The self-association deficient SPOP mutant mutBTB has a substrate degradation defect in vivo. UAS transgenes were expressed under the control of an epithelial driver C765-Gal4 in Drosophila melanogaster. (A) UAS vector served as a control and yielded a normal wing. Longitudinal veins are denoted by numbers 1-5. Expression of (B) SPOP WT resulted in a modest Hh loss-of function phenotype with fusion of LV3 and LV4 (arrow). (C) mutBTB acts in a dominant-negative manner, as evidenced by a modest Hh gain-of function phenotype with expansion of the LV3-LV4 intervein space. Expression of (D) mutBACK and (E) mutBTB-BACK does not induce a wing patterning defect. ~50 animals each were analyzed from two independent crosses."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "Reconstructed", "MSOT", "images", "(", "800", "nm", ")", "without", "and", "with", "linear", "unmixing", "data", "in", "the", "neck", "and", "the", "upper", "and", "lower", "abdominal", "areas", ",", "showing", "the", "ROIs", "for", "the", "liver", ",", "kidney", ",", "iBAT", ",", "rpWAT", ",", "aorta", ",", "and", "SV", ".", "Unmixing", "result", ":", "blue", "for", "Hb", ",", "red", "for", "HbO2", ",", "yellow", "for", "lipid", ".", "The", "colour", "bar", "shows", "the", "colour", "coding", "of", "MSOT", "a", ".", "u", ".", "from", "0", "to", "maximum", "(", "bottom", "to", "top", ")", "(", "maximum", "value", "neck", "/", "upper", "abdominal", "/", "lower", "abdominal", ":", "Hb", ":", "2", ".", "5", "/", "3", ".", "5", "/", "0", ".", "9", ";", "HbO2", ":", "2", ".", "9", "/", "4", ".", "9", "/", "2", ".", "5", ";", "Lipid", ":", "24000", "/", "19000", "/", "13000", ")", "Scale", "bar", ":", "4", "mm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, Reconstructed MSOT images (800 nm) without and with linear unmixing data in the neck and the upper and lower abdominal areas, showing the ROIs for the liver, kidney, iBAT, rpWAT, aorta, and SV. Unmixing result: blue for Hb, red for HbO2, yellow for lipid. The colour bar shows the colour coding of MSOT a.u. from 0 to maximum (bottom to top) (maximum value neck/upper abdominal/lower abdominal: Hb: 2.5/3.5/0.9; HbO2:2.9/4.9/2.5; Lipid: 24000/19000/13000) Scale bar: 4 mm."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "Reconstructed", "MSOT", "image", "(", "800", "nm", ")", "with", "linear", "unmixing", "data", "of", "Hb", ",", "HbO2", ",", "and", "lipid", "from", "chow", "and", "HFD", "-", "fed", "mice", ".", "The", "colour", "bar", "shows", "the", "colour", "coding", "of", "MSOT", "a", ".", "u", ".", "from", "0", "to", "maximum", "(", "bottom", "to", "top", ")", "(", "maximum", "value", "chow", "/", "HFD", ":", "Hb", ":", "1", ".", "3", "/", "0", ".", "6", ";", "HbO2", ":", "1", ".", "8", "/", "0", ".", "9", ";", "Lipid", ":", "27000", "/", "27000", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "4", "mm", ".", "D", ",", "Tissue", "oxygenation", "(", "sO2", ")", "and", "total", "blood", "volume", "(", "TBV", ")", "results", "from", "liver", ",", "kidney", ",", "iBAT", ",", "and", "rpWAT", ",", "Each", "dot", "represents", "data", "from", "one", "animal", ",", "in", "total", "8", "animals", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "(", "+", "/", "-", "95", "%", "confidence", ")", ".", "The", "unpaired", "t", "test", "was", "used", "to", "verify", "the", "statistical", "significance", ".", "Data", "information", ":", "In", "the", "figure", ",", "A", ".", "U", ".", "=", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, Reconstructed MSOT image (800 nm) with linear unmixing data of Hb, HbO2, and lipid from chow and HFD-fed mice. The colour bar shows the colour coding of MSOT a.u. from 0 to maximum (bottom to top) (maximum value chow/HFD: Hb: 1.3/0.6; HbO2: 1.8/0.9; Lipid: 27000/27000). Scale bar: 4 mm.D, Tissue oxygenation (sO2) and total blood volume (TBV) results from liver, kidney, iBAT, and rpWAT, Each dot represents data from one animal, in total 8 animals (n = 8). Data represent the mean (+/- 95% confidence). The unpaired t test was used to verify the statistical significance. Data information: In the figure, A.U. = arbitrary units. "}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "Oil", "-", "red", "-", "O", "staining", "of", "control", "(", "healthy", ")", "and", "steatotic", "liver", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "B", ",", "Reconstructed", "MSOT", "image", "(", "800", "nm", ")", "with", "linear", "unmixing", "and", "difference", "value", "of", "lipid", "in", "lower", "abdominal", "section", ".", "Unmixing", "result", ":", "blue", "for", "Hb", ",", "red", "for", "HbO2", ",", "yellow", "for", "lipid", ",", "jet", "for", "700", "nm", "-", "930", "nm", "difference", ".", "The", "colour", "bar", "shows", "the", "colour", "coding", "of", "MSOT", "a", ".", "u", ".", "from", "0", "to", "maximum", "(", "bottom", "to", "top", ")", "(", "Maximum", "value", "control", "/", "steatosis", ":", "Hb", ":", "1", ".", "1", "/", "0", ".", "5", ";", "HbO2", ":", "1", ".", "9", "/", "0", ".", "8", ";", "Lipid", ":", "21000", "/", "24000", ";", "700", "-", "900nm", ":", "3000", "/", "3000", ")", "Scale", "bar", ":", "4", "mm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, Oil-red-O staining of control (healthy) and steatotic liver. Scale bar: 100 µm.B, Reconstructed MSOT image (800 nm) with linear unmixing and difference value of lipid in lower abdominal section. Unmixing result: blue for Hb, red for HbO2, yellow for lipid, jet for 700 nm - 930 nm difference. The colour bar shows the colour coding of MSOT a.u. from 0 to maximum (bottom to top) (Maximum value control/steatosis: Hb: 1.1/0.5; HbO2: 1.9/0.8; Lipid: 21000/24000; 700-900nm: 3000/3000) Scale bar: 4 mm."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "HE", "staining", "of", "livers", "with", "grade", "0", "-", "3", "steatosis", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "E", ",", "Reconstructed", "MSOT", "image", "(", "800", "nm", ")", "with", "linear", "unmixing", "data", "of", "Hb", ",", "HbO2", ",", "and", "lipid", "from", "chow", "and", "HFD", "-", "fed", "mice", ".", "Unmixing", "result", ":", "blue", "for", "Hb", ",", "red", "for", "HbO2", ",", "yellow", "for", "lipid", ".", "The", "colour", "bar", "shows", "the", "colour", "coding", "of", "MSOT", "a", ".", "u", ".", "from", "0", "to", "maximum", "(", "bottom", "to", "top", ")", "(", "Maximum", "value", "chow", "1", "month", "/", "chow", "2", "month", "/", "chow", "3", "month", "/", "HFD", "1", "month", "/", "HFD", "2", "month", "/", "HFD", "3", "month", ":", "Hb", ":", "2", ".", "5", "/", "1", ".", "9", "/", "2", ".", "9", "/", "2", ".", "7", "/", "1", ".", "8", "/", "1", ".", "3", ";", "HbO2", ":", "2", ".", "8", "/", "2", ".", "6", "/", "2", ".", "8", "/", "3", ".", "1", "/", "2", ".", "1", "/", "1", ".", "9", ";", "Lipid", ":", "27000", "/", "19000", "/", "29000", "/", "32000", "/", "26000", "/", "27000", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "4", "mm", ".", "F", ",", "Longitudinal", "track", "of", "lipid", "in", "mouse", "livers", ".", "Each", "line", "represents", "data", "from", "one", "animal", ".", "Each", "data", "point", "is", "from", "a", "single", "measurement", "of", "each", "animal", "at", "each", "time", "point", ".", "All", "animals", "have", "grade", "3", "steatosis", "at", "the", "endpoint", "confirmed", "by", "histology", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, HE staining of livers with grade 0 - 3 steatosis. Scale bar: 100 µm.E, Reconstructed MSOT image (800 nm) with linear unmixing data of Hb, HbO2, and lipid from chow and HFD-fed mice. Unmixing result: blue for Hb, red for HbO2, yellow for lipid. The colour bar shows the colour coding of MSOT a.u. from 0 to maximum (bottom to top) (Maximum value chow 1 month/ chow 2 month/ chow 3 month/HFD 1 month/HFD 2 month/HFD 3 month: Hb: 2.5/1.9/2.9/2.7/1.8/1.3; HbO2: 2.8/2.6/2.8/3.1/2.1/1.9; Lipid: 27000/19000/29000/ 32000/26000/27000). Scale bar: 4 mm.F, Longitudinal track of lipid in mouse livers. Each line represents data from one animal. Each data point is from a single measurement of each animal at each time point. All animals have grade 3 steatosis at the endpoint confirmed by histology."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "Reconstructed", "MSOT", "image", "(", "800", "nm", ")", "with", "linear", "unmixing", "data", "of", "ICG", "from", "mice", "with", "and", "without", "steatosis", ".", "The", "colour", "bar", "shows", "the", "colour", "coding", "of", "MSOT", "a", ".", "u", ".", "from", "0", "to", "maximum", "(", "bottom", "to", "top", ")", "(", "Maximum", "value", "control", "/", "steatosis", ":", "0", ".", "07", "/", "0", ".", "02", ")", "Scale", "bar", ":", "4", "mm", ".", "E", ",", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "and", "HE", "staining", "images", "of", "control", "and", "steatotic", "liver", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, Reconstructed MSOT image (800 nm) with linear unmixing data of ICG from mice with and without steatosis. The colour bar shows the colour coding of MSOT a.u. from 0 to maximum (bottom to top) (Maximum value control/steatosis: 0.07/0.02) Scale bar: 4 mm.E, Representative fluorescence microscopy and HE staining images of control and steatotic liver. Scale bar: 100 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", "FBN2", "mRNA", "levels", "in", "multiple", "human", "tissues", ".", "Human", "tissue", "cDNAs", "were", "used", "as", "templates", "for", "PCR", "of", "FBN2", ",", "followed", "by", "agarose", "gel", "analyses", ".", "GAPDH", "levels", "served", "as", "loading", "controls", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "2", ")", ".", "B", "FBN2", "mRNA", "levels", "in", "mouse", "tissues", "based", "on", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Data", "were", "normalized", "based", "on", "levels", "in", "adipose", "tissues", ".", "C", "Comparison", "of", "FBN2", "transcript", "levels", "between", "human", "and", "mouse", "placentas", ".", "Common", "primers", "for", "FBN2", "and", "GAPDH", "in", "both", "species", "were", "used", "for", "RT", "-", "PCR", "analyses", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "D", "Immuno", "-", "histochemical", "detection", "of", "placensin", "in", "human", "placental", "villi", "obtained", "from", "women", "at", "9", "and", "38", "weeks", "of", "pregnancy", ".", "During", "early", "pregnancy", ",", "placensin", "immunostaining", "was", "found", "in", "cytotrophoblasts", "(", "c", ")", ",", "whereas", "syncytiotrophoblasts", "(", "s", ")", "showed", "weak", "staining", ".", "At", "38", "weeks", "of", "pregnancy", ",", "strong", "placensin", "signals", "were", "detected", "in", "both", "syncytiotrophoblasts", "and", "cytotrophoblasts", "(", "arrows", ")", ".", "Staining", "using", "E", "-", "cadherin", "antibodies", "confirmed", "the", "identity", "of", "cytotrophoblasts", "(", "Inset", "showing", "higher", "magnification", "E", "-", "cadherin", "(", "E", "-", "Cad", ")", "staining", ")", ".", "Lower", "panels", "depict", "sections", "stained", "with", "nonimmune", "IgG", "as", "negative", "controls", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "E", "Immunoblotting", "of", "placensin", "in", "human", "placental", "villi", "(", "term", "pregnancy", ")", ".", "Samples", "from", "three", "individual", "patients", "were", "processed", "with", "or", "without", "N", "-", "glycosidase", "pre", "-", "treatment", "to", "reveal", "untreated", "and", "deglycosylated", "placensin", ".", "F", "For", "prokaryotic", "cell", "expression", ",", "a", "cDNA", "fragment", "corresponding", "to", "residues", "2779", "to", "2912", "of", "the", "human", "FBN2", "coding", "region", "was", "appended", "with", "GST", "and", "6", "-", "histidine", "tags", "and", "sub", "-", "cloned", "into", "the", "PGEX", "-", "6P", "-", "1", "vector", "for", "expression", "in", "E", ".", "coli", ".", "Left", "panel", ":", "Coomassie", "blue", "staining", "of", "proteins", "in", "the", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "before", "and", "after", "digestion", "with", "the", "PreScission", "protease", ".", "1", ":", "Flow", "through", ";", "2", ":", "Washes", ";", "3", ":", "Before", "PreScission", "treatment", ";", "4", ":", "After", "PreScission", "treatment", ".", "Right", "panel", ":", "Immunoblotting", "using", "placensin", "antibodies", ".", "G", "Immunoblotting", "of", "recombinant", "placensin", "generated", "in", "E", ".", "coli", ".", "and", "CHO", "cells", ".", "For", "CHO", "cell", "expression", ",", "placensin", "cDNA", "sequence", "was", "subcloned", "into", "an", "adenoviral", "vector", "pAV", "[", "Exp", "]", "-", "CMV", "downstream", "of", "the", "IgK", "signal", "peptide", "under", "the", "control", "of", "the", "CMV", "promoter", "for", "infection", "of", "cells", "before", "immunoblotting", "of", "media", "2", "days", "later", ".", "Recombinant", "placensin", "proteins", "secreted", "from", "CHO", "cells", "(", "b", ")", "showed", "higher", "molecular", "weight", "than", "those", "from", "bacteria", "(", "a", ")", ".", "Following", "treatment", "with", "N", "-", "glycosidase", "to", "remove", "N", "-", "linked", "carbohydrate", "side", "chains", ",", "prokaryotic", "-", "and", "eukaryotic", "cell", "-", "derived", "placensin", "proteins", "showed", "similar", "sizes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A FBN2 mRNA levels in multiple human tissues. Human tissue cDNAs were used as templates for PCR of FBN2, followed by agarose gel analyses. GAPDH levels served as loading controls (biological replicates, n=2).B FBN2 mRNA levels in mouse tissues based on quantitative RT-PCR. Data were normalized based on levels in adipose tissues.C Comparison of FBN2 transcript levels between human and mouse placentas. Common primers for FBN2 and GAPDH in both species were used for RT-PCR analyses (biological replicates, n=3) .D Immuno-histochemical detection of placensin in human placental villi obtained from women at 9 and 38 weeks of pregnancy. During early pregnancy, placensin immunostaining was found in cytotrophoblasts (c), whereas syncytiotrophoblasts (s) showed weak staining. At 38 weeks of pregnancy, strong placensin signals were detected in both syncytiotrophoblasts and cytotrophoblasts (arrows). Staining using E-cadherin antibodies confirmed the identity of cytotrophoblasts (Inset showing higher magnification E-cadherin (E-Cad) staining). Lower panels depict sections stained with nonimmune IgG as negative controls. Scale bars, 100 μm.E Immunoblotting of placensin in human placental villi (term pregnancy). Samples from three individual patients were processed with or without N-glycosidase pre-treatment to reveal untreated and deglycosylated placensin.F For prokaryotic cell expression, a cDNA fragment corresponding to residues 2779 to 2912 of the human FBN2 coding region was appended with GST and 6-histidine tags and sub-cloned into the PGEX-6P-1 vector for expression in E. coli. Left panel: Coomassie blue staining of proteins in the SDS-PAGE gel before and after digestion with the PreScission protease. 1: Flow through; 2: Washes; 3: Before PreScission treatment; 4: After PreScission treatment. Right panel: Immunoblotting using placensin antibodies.G Immunoblotting of recombinant placensin generated in E. coli. and CHO cells. For CHO cell expression, placensin cDNA sequence was subcloned into an adenoviral vector pAV[Exp]-CMV downstream of the IgK signal peptide under the control of the CMV promoter for infection of cells before immunoblotting of media 2 days later. Recombinant placensin proteins secreted from CHO cells (b) showed higher molecular weight than those from bacteria (a). Following treatment with N-glycosidase to remove N-linked carbohydrate side chains, prokaryotic- and eukaryotic cell-derived placensin proteins showed similar sizes."}
{"words": ["Figure", "3A", "Prokaryotic", "cell", "-", "derived", "placensin", "stimulated", "cAMP", "production", "(", "at", "10", "min", ".", ")", ",", "and", "PKA", "activity", "(", "at", "30", "min", ".", ")", "by", "primary", "mouse", "hepatocytes", "and", "hepatocyte", "-", "derived", "AML12", "cells", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "B", "Placensin", "stimulation", "of", "glucose", "secretion", "(", "at", "5h", ")", "and", "key", "gluconeogenesis", "gene", "transcripts", "(", "at", "1h", ")", "in", "both", "cell", "types", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "Transcript", "levels", "for", "PEPCK", "and", "G6Pase", "were", "determined", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Treatment", "with", "glucagon", "(", "10", "nM", ")", "served", "as", "positive", "controls", ".", "C", "Liver", "from", "adult", "female", "mice", "was", "perfused", "in", "situ", "with", "placensin", "(", "1", ".", "0", "ug", "/", "pulse", ")", "or", "PBS", "before", "measurement", "of", "hepatic", "glucose", "output", "from", "inferior", "vena", "cava", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "D", "Adult", "female", "mice", "were", "injected", "intraperitoneally", "with", "placensin", "(", "30", "ug", "/", "injection", ")", "with", "blood", "sampling", "at", "different", "time", "points", "for", "glucose", "levels", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "5", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Prokaryotic cell-derived placensin stimulated cAMP production (at 10 min.), and PKA activity (at 30 min.) by primary mouse hepatocytes and hepatocyte-derived AML12 cells (biological replicates, n=5).B Placensin stimulation of glucose secretion (at 5h) and key gluconeogenesis gene transcripts (at 1h) in both cell types (biological replicates, n=4). Transcript levels for PEPCK and G6Pase were determined using quantitative RT-PCR. Treatment with glucagon (10 nM) served as positive controls.C Liver from adult female mice was perfused in situ with placensin (1.0 ug/pulse) or PBS before measurement of hepatic glucose output from inferior vena cava (biological replicates, n=3).D Adult female mice were injected intraperitoneally with placensin (30 ug/injection) with blood sampling at different time points for glucose levels (biological replicates, n=5)."}
{"words": ["Figure", "4A", "Left", "panel", ":", "Immunoblotting", "of", "placensin", "content", "in", "HTR", "-", "8", "/", "SVneo", ",", "but", "not", "BeWo", ",", "JAR", ",", "and", "JEG3", ",", "cells", ".", "Right", "panel", ":", "Time", "-", "dependent", "secretion", "of", "placensin", "by", "HTR", "-", "8", "/", "SVneo", ",", "but", "not", "JAR", ",", "cells", "monitored", "using", "an", "ELISA", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "B", "Knockdown", "of", "FBN2", "in", "HTR", "-", "8", "/", "SVneo", "cells", "led", "to", "decreases", "in", "FBN2", "transcripts", "and", "placensin", "secretion", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "FBN2", "siRNA", "(", "SiFBN2", ";", "20", "nM", ")", "or", "control", "siRNA", "(", "SiC", ";", "20", "nM", ")", "for", "6h", ".", "Following", "media", "change", ",", "cells", "and", "conditioned", "media", "were", "collected", "at", "48h", "after", "incubation", ".", "Placensin", "transcripts", "and", "proteins", "were", "determined", "by", "RT", "-", "PCR", "and", "ELISA", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "8", ")", ",", "respectively", ".", "Lower", "panel", ":", "immunoblotting", "of", "secreted", "placensin", "by", "HTR", "-", "8", "/", "Svneo", ".", "C", "Placensin", "stimulation", "of", "cAMP", "production", "and", "PKA", "activities", "by", "HTR", "-", "8", "/", "SVneo", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "placensin", "for", "10", "min", ".", "before", "cAMP", "measurement", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "For", "PKA", "activities", ",", "cells", "were", "treated", "with", "placensin", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", "for", "30", "min", ".", "Treatment", "with", "forskolin", "(", "10", "uM", ")", "served", "as", "positive", "controls", ".", "D", "Placensin", "stimulation", "of", "transcript", "levels", "for", "MMP9", "but", "not", "MMP2", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "12", ")", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "placensin", "for", "24h", "before", "RT", "-", "PCR", "analyses", "of", "transcript", "levels", ".", "E", "Placensin", "stimulation", "of", "MMP9", ",", "but", "not", "MMP2", ",", "activities", "without", "affecting", "cell", "proliferation", ".", "After", "24h", "of", "treatment", "with", "placensin", ",", "media", "were", "collected", "for", "zymographic", "and", "densitometric", "analyses", "as", "well", "as", "determination", "of", "total", "cell", "numbers", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "F", "Placensin", "stimulation", "of", "HTR", "-", "8", "/", "SVneo", "cell", "invasion", ".", "After", "placensin", "treatment", "for", "24h", ",", "cell", "invasiveness", "was", "determined", "using", "the", "Transwell", "assay", "(", "left", "panel", ":", "micrographs", "of", "cells", ";", "right", "panel", ":", "fold", "changes", "in", "number", "of", "migrated", "cells", ",", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "mitomycin", "C", "to", "rule", "out", "effects", "on", "cell", "proliferation", ".", "Scale", "bars", ":", "100μm", ".", "C", ":", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Left panel: Immunoblotting of placensin content in HTR-8/SVneo, but not BeWo, JAR, and JEG3, cells. Right panel: Time-dependent secretion of placensin by HTR-8/SVneo, but not JAR, cells monitored using an ELISA (biological replicates, n=4-5).B Knockdown of FBN2 in HTR-8/SVneo cells led to decreases in FBN2 transcripts and placensin secretion. Cells were treated with FBN2 siRNA (SiFBN2; 20 nM) or control siRNA (SiC; 20 nM) for 6h. Following media change, cells and conditioned media were collected at 48h after incubation. Placensin transcripts and proteins were determined by RT-PCR and ELISA (biological replicates, n=8), respectively. Lower panel: immunoblotting of secreted placensin by HTR-8/Svneo.C Placensin stimulation of cAMP production and PKA activities by HTR-8/SVneo cells. Cells were treated with placensin for 10 min. before cAMP measurement (biological replicates, n=5). For PKA activities, cells were treated with placensin (50 ng/ml) for 30 min. Treatment with forskolin (10 uM) served as positive controls.D Placensin stimulation of transcript levels for MMP9 but not MMP2(biological replicates, n=12). Cells were treated with placensin for 24h before RT-PCR analyses of transcript levels.E Placensin stimulation of MMP9, but not MMP2, activities without affecting cell proliferation. After 24h of treatment with placensin, media were collected for zymographic and densitometric analyses as well as determination of total cell numbers (biological replicates, n=4).F Placensin stimulation of HTR-8/SVneo cell invasion. After placensin treatment for 24h, cell invasiveness was determined using the Transwell assay (left panel: micrographs of cells; right panel: fold changes in number of migrated cells, biological replicates, n=4). Cells were incubated with mitomycin C to rule out effects on cell proliferation. Scale bars: 100μm. C: control."}
{"words": ["Figure", "5A", "Immunoblotting", "of", "serum", "placensin", "from", "patients", "at", "second", "trimester", "(", "1", "-", "3", ")", ",", "term", "pregnancy", "(", "4", "-", "6", ")", "using", "specific", "placensin", "antibodies", ".", "B", "Serum", "levels", "of", "placensin", "and", "glucagon", "at", "different", "weeks", "of", "pregnancy", "measured", "using", "specific", "ELISA", "in", "normal", "and", "GDM", "patients", ".", "Numbers", "in", "parentheses", "represent", "number", "of", "patients", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Immunoblotting of serum placensin from patients at second trimester (1-3), term pregnancy (4-6) using specific placensin antibodies.B Serum levels of placensin and glucagon at different weeks of pregnancy measured using specific ELISA in normal and GDM patients. Numbers in parentheses represent number of patients."}
{"words": ["Figure", "1stoichiometry", "'", "s", "for", "B56α", "measured", "by", "ITC", ".", "Global", "direct", "fitting", "shown", "for", "one", "experiment", "(", "reverse", ")", ".", "Each", "dot", "is", "the", "integrated", "heat", "per", "injection", "and", "the", "error", "bars", "represent", "uncertainty", "with", "this", "integrated", "value", ".", "The", "experiment", "was", "done", "in", "both", "direct", "(", "B56", "in", "cell", ")", "and", "reverse", "(", "B56", "in", "syringe", ")", "with", "similar", "results", ".", "C", ")", "Time", "from", "Nuclear", "envelope", "breakdown", "(", "NEBD", ")", "to", "mitotic", "exit", "of", "cells", "expressing", "the", "indicated", "B56", "inhibitors", "with", "each", "circle", "representing", "a", "single", "cell", ".", "Only", "cells", "with", "similar", "expression", "levels", "of", "the", "various", "B56", "inhibitor", "constructs", "were", "analysed", ".", "Median", "time", "is", "indicated", "by", "red", "line", ".", "­", "A", "representative", "result", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "At", "least", "25", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "in", "the", "experiment", "shown", ".", "A", "Mann", "-", "Whitney", "U", "‐", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "(", "ns", ":", "non", "‐", "significant", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ")", ".", "D", ")", "Volcano", "plot", "representing", "mass", "spectrometry", "identified", "proteins", "co", "-", "purifying", "with", "B56", "inhibitor", "versus", "control", "inhibitor", "from", "HeLa", "cells", ".", "PP2A", "-", "B56", "subunits", "co", "-", "purifying", "with", "the", "B56", "inhibitor", "are", "indicated", ".", "E", ")", "and", "F", ")", "Competition", "assay", "in", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "RFP", "-", "tagged", "B56", "inhibitor", "(", "LxxIxE", ")", "or", "control", "inhibitor", "(", "AxxAxA", ")", ".", "YFP", "-", "B56α", "was", "transfected", "into", "and", "subsequently", "purified", "from", "these", "cell", "lines", ".", "Loss", "of", "binding", "of", "indicated", "proteins", "determined", "by", "either", "mass", "spectrometry", "(", "pink", "-", "B56", "SLIM", "containing", "protein", "and", "known", "B56", "interactor", ";", "blue", "-", "known", "B56", "interactor", ",", "green", "-", "B56", "SLIM", "containing", "protein", ")", "(", "E", ")", "or", "Western", "blotting", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1stoichiometry's for B56α measured by ITC. Global direct fitting shown for one experiment (reverse). Each dot is the integrated heat per injection and the error bars represent uncertainty with this integrated value. The experiment was done in both direct (B56 in cell) and reverse (B56 in syringe) with similar results.C) Time from Nuclear envelope breakdown (NEBD) to mitotic exit of cells expressing the indicated B56 inhibitors with each circle representing a single cell. Only cells with similar expression levels of the various B56 inhibitor constructs were analysed. Median time is indicated by red line. ­A representative result from at least three independent experiments is shown. At least 25 cells were counted per condition in the experiment shown. A Mann-Whitney U‐test was used for statistical analysis (ns: non‐significant, ***P ≤ 0.001).D) Volcano plot representing mass spectrometry identified proteins co-purifying with B56 inhibitor versus control inhibitor from HeLa cells. PP2A-B56 subunits co-purifying with the B56 inhibitor are indicated.E) and F) Competition assay in HeLa cells stably expressing RFP-tagged B56 inhibitor (LxxIxE) or control inhibitor (AxxAxA). YFP-B56α was transfected into and subsequently purified from these cell lines. Loss of binding of indicated proteins determined by either mass spectrometry (pink - B56 SLIM containing protein and known B56 interactor; blue - known B56 interactor, green - B56 SLIM containing protein) (E) or Western blotting (F)."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "B", ")", "Schematic", "of", "synchronisation", "protocol", "for", "G1", "/", "S", "(", "A", ")", "or", "mitotic", "(", "B", ")", "arrested", "cells", "and", "accompanying", "volcano", "plot", "of", "phosphorylation", "sites", "quantified", ".", "The", "phosphorylation", "sites", "showing", "an", "increase", "in", "the", "presence", "of", "the", "B56", "inhibitor", "are", "shown", "in", "light", "grey", ".", "Phosphorylation", "sites", "in", "a", "protein", "containing", "an", "LxxIxE", "motif", "are", "coloured", "pink", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-B) Schematic of synchronisation protocol for G1/S (A) or mitotic (B) arrested cells and accompanying volcano plot of phosphorylation sites quantified. The phosphorylation sites showing an increase in the presence of the B56 inhibitor are shown in light grey. Phosphorylation sites in a protein containing an LxxIxE motif are coloured pink."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Michaelis", "-", "Menten", "kinetic", "parameters", "of", "purified", "PP2A", "-", "B56α", "and", "PP2A", "-", "B55α", "holoenzymes", "were", "determined", "against", "the", "indicated", "phospho", "-", "peptides", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "shown", "in", "plots", "as", "black", "bars", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "B", "-", "D", ")", "In", "vitro", "dephosphorylation", "by", "the", "PP2A", "-", "B55α", "and", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzymes", "of", "panels", "of", "phosphorylated", "peptides", "as", "indicated", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "shown", "in", "plots", "as", "black", "bars", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Michaelis-Menten kinetic parameters of purified PP2A-B56α and PP2A-B55α holoenzymes were determined against the indicated phospho-peptides. Mean and standard deviation shown in plots as black bars (n=3 independent experiments)B-D) In vitro dephosphorylation by the PP2A-B55α and PP2A-B56α holoenzymes of panels of phosphorylated peptides as indicated. Mean and standard deviation shown in plots as black bars (n=3 independent experiments)"}
{"words": ["Figure", "4B", ")", "The", "indicated", "YFP", "-", "FoxO3", "constructs", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ",", "purified", "using", "YFP", "resin", "and", "PP2A", "-", "B56", "binding", "determined", "by", "Western", "blotting", ".", "PP2A", "-", "A", ";", "scaffold", "subunit", ".", "C", ")", "-", "D", ")", "YFP", "-", "FoxO3", "constructs", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", "and", "lysates", "(", "pS413", ")", "or", "YFP", "purifications", "(", "pS253", ")", "were", "subjected", "to", "Western", "Blotting", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "phosphoantibodies", ".", "Quantifications", "arise", "from", "five", "(", "pS413", ")", "or", "three", "(", "pS253", ")", "independent", "experiments", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "shown", "in", "plots", "as", "black", "bars", ".", "E", ")", "Steady", "-", "state", "localization", "of", "the", "indicated", "YFP", "-", "FOXO3", "variants", "in", "HeLa", "cells", ".", "Each", "data", "point", "represents", "quantification", "from", "a", "single", "cell", ".", "­", "A", "representative", "result", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "At", "least", "25", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "in", "the", "experiment", "shown", ".", "Scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", "significance", "values", ";", "∗", "p", "<", "0", ".", "02", ",", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "0002", ".", "F", ")", "Dephosphorylation", "by", "the", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzyme", "complex", "of", "substrates", "with", "increasing", "length", "between", "phosphorylation", "sites", "and", "binding", "motifs", "as", "depicted", ".", "Engineered", "substrates", "containing", "three", "TP", "sites", "were", "phosphorylated", "with", "radioactive", "ATP", "using", "Cdk1", "and", "incubated", "with", "the", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzyme", ".", "Removal", "of", "radioactive", "phosphate", "was", "monitored", "over", "time", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "from", "3", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B) The indicated YFP-FoxO3 constructs were transfected into HeLa cells, purified using YFP resin and PP2A-B56 binding determined by Western blotting. PP2A-A; scaffold subunit.C) - D) YFP-FoxO3 constructs were transfected into HeLa cells and lysates (pS413) or YFP purifications (pS253) were subjected to Western Blotting and probed with the indicated phosphoantibodies. Quantifications arise from five (pS413) or three (pS253) independent experiments. Mean and standard deviation shown in plots as black bars.E) Steady-state localization of the indicated YFP-FOXO3 variants in HeLa cells. Each data point represents quantification from a single cell. ­A representative result from at least three independent experiments is shown. At least 25 cells were counted per condition in the experiment shown. Scale bar is 10 μm. Mann-Whitney test significance values; ∗p < 0.02, ∗∗∗p < 0.0002.F) Dephosphorylation by the PP2A-B56α holoenzyme complex of substrates with increasing length between phosphorylation sites and binding motifs as depicted. Engineered substrates containing three TP sites were phosphorylated with radioactive ATP using Cdk1 and incubated with the PP2A-B56α holoenzyme. Removal of radioactive phosphate was monitored over time. Mean and standard deviation from 3 experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "5B", ")", "KD", "values", "obtained", "by", "ITC", "measurements", "with", "full", "-", "length", "recombinant", "B56α", "and", "indicated", "ADAM17", "variant", "peptides", ".", "C", ")", "The", "indicated", "full", "-", "length", "murine", "Myc", "-", "ADAM17", "derivatives", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "-", "B56α", ".", "YFP", "-", "B56α", "was", "purified", "(", "IP", ")", "and", "ADAM17", "binding", "determined", "by", "Western", "blotting", ".", "PP2A", "-", "C", ";", "catalytic", "subunit", ",", "PP2A", "-", "A", ";", "scaffold", "subunit", ".", "D", ")", "Dephosphorylation", "by", "the", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzyme", "complex", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "GST", "-", "ADAM17", "(", "V724", "-", "C827", ")", "fragments", ".", "The", "GST", "-", "ADAM17", "(", "V724", "-", "C827", ")", "substrates", "was", "phosphorylated", "with", "radioactive", "ATP", "using", "Protein", "Kinase", "A", "and", "incubated", "with", "the", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzyme", ".", "Removal", "of", "radioactive", "phosphate", "was", "monitored", "over", "time", ".", "The", "mean", "and", "Standard", "deviation", "of", "4", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "E", ")", "Protein", "expression", "of", "ADAM17", "variants", "in", "the", "DLD", "-", "1", "Adam17", "-", "/", "-", "cell", "line", ",", "determined", "by", "Western", "blot", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "an", "internal", "loading", "control", ".", "F", ")", "Amphiregulin", "(", "AREG", ")", "shedding", "measured", "by", "ELISA", "of", "conditioned", "media", "from", "untreated", ",", "H2O2", "treated", "or", "irradiated", "with", "x", "-", "ray", "DLD", "-", "1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "(", "clone", "#", "1", ")", "expressing", "full", "-", "length", "ADAM17", "variants", "(", "wt", ",", "I762A", "or", "LEE", ")", ".", "Two", "sided", ",", "unpaired", "Students", "t", "-", "test", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "indicated", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "G", ")", "Exogenous", "wt", "and", "I762A", "full", "length", "ADAM17", "was", "immuno", "-", "purified", "from", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "treated", "with", "H2O2", "and", "subjected", "to", "label", "-", "free", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "to", "determine", "differential", "phosphorylation", "status", "of", "T735", "and", "S808", "(", "S811", "in", "murine", "ADAM17", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B) KD values obtained by ITC measurements with full-length recombinant B56α and indicated ADAM17 variant peptides.C) The indicated full-length murine Myc-ADAM17 derivatives were transfected into HeLa cells stably expressing YFP-B56α. YFP-B56α was purified (IP) and ADAM17 binding determined by Western blotting. PP2A-C; catalytic subunit, PP2A-A; scaffold subunit.D) Dephosphorylation by the PP2A-B56α holoenzyme complex of the indicated phosphorylated GST-ADAM17 (V724-C827) fragments. The GST-ADAM17 (V724-C827) substrates was phosphorylated with radioactive ATP using Protein Kinase A and incubated with the PP2A-B56α holoenzyme. Removal of radioactive phosphate was monitored over time. The mean and Standard deviation of 4 independent experiments are shown.E) Protein expression of ADAM17 variants in the DLD-1 Adam17-/- cell line, determined by Western blot. GAPDH was used as an internal loading control.F) Amphiregulin (AREG) shedding measured by ELISA of conditioned media from untreated, H2O2 treated or irradiated with x-ray DLD-1 Adam17-/- cells (clone #1) expressing full-length ADAM17 variants (wt, I762A or LEE). Two sided, unpaired Students t-test test was applied to test for significant differences *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Mean and standard deviation indicated from at least three independent experiments.G) Exogenous wt and I762A full length ADAM17 was immuno-purified from Adam17-/- cells treated with H2O2 and subjected to label-free LC-MS/MS to determine differential phosphorylation status of T735 and S808 (S811 in murine ADAM17)."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "EGFR", "activation", "in", "the", "ADAM17", "variant", "expressing", "DLD", "-", "1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "upon", "H2O2", "treatment", ",", "determined", "by", "Western", "blot", "and", "quantified", "below", "as", "the", "ratio", "of", "EGFR", "autophosphorylated", "at", "Tyr1068", "to", "total", "EGFR", ".", "Two", "sided", ",", "unpaired", "Students", "t", "-", "test", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "indicated", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "B", ")", "Cell", "proliferation", "and", "C", ")", "Matrigel", "invasion", "of", "the", "ADAM17", "variant", "expressing", "DLD", "-", "1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", ".", "Two", "sided", ",", "unpaired", "Students", "t", "-", "test", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "indicated", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ")", "Protein", "expression", "of", "the", "ADAM17", "variants", "in", "the", "mouse", "breast", "cancer", "cell", "line", "4T1", "Adam17", "-", "/", "-", ",", "determined", "by", "Western", "blot", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "an", "internal", "loading", "control", ".", "E", ")", "Average", "tumor", "volume", "±", "SEM", "of", "4T1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "expressing", "the", "ADAM17", "variants", "injected", "into", "the", "mammary", "fat", "pad", "of", "Balb", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "10", "for", "each", "group", ")", ".", "Indicated", "significances", "are", "between", "the", "I762A", "and", "LEE", "tumors", ".", "Two", "sided", ",", "unpaired", "Students", "t", "-", "test", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Mean", "and", "standard", "error", "of", "the", "mean", "indicated", ".", "F", ")", "Survival", "curve", "of", "the", "tumor", "bearing", "mice", "injected", "with", "4T1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "expressing", "the", "ADAM17", "variants", "(", "n", "=", "10", "for", "each", "group", ")", ".", "The", "indicated", "significances", "are", "between", "the", "LEE", "and", "wt", "tumor", "bearing", "mice", ",", "and", "the", "LEE", "and", "I762A", "tumor", "bearing", "mice", ".", "Log", "-", "rank", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) EGFR activation in the ADAM17 variant expressing DLD-1 Adam17-/- cells upon H2O2 treatment, determined by Western blot and quantified below as the ratio of EGFR autophosphorylated at Tyr1068 to total EGFR. Two sided, unpaired Students t-test test was applied to test for significant differences *p<0.05, **p<0.01. Mean and standard deviation indicated from three independent experiments.(B, C) B) Cell proliferation and C) Matrigel invasion of the ADAM17 variant expressing DLD-1 Adam17-/- cells. Two sided, unpaired Students t-test test was applied to test for significant differences *p<0.05, **p<0.01. Mean and standard deviation indicated from three independent experiments.D) Protein expression of the ADAM17 variants in the mouse breast cancer cell line 4T1 Adam17-/-, determined by Western blot. GAPDH was used as an internal loading control.E) Average tumor volume ± SEM of 4T1 Adam17-/- cells expressing the ADAM17 variants injected into the mammary fat pad of Balb/c mice (n=10 for each group). Indicated significances are between the I762A and LEE tumors. Two sided, unpaired Students t-test test was applied to test for significant differences *p<0.05. Mean and standard error of the mean indicated.F) Survival curve of the tumor bearing mice injected with 4T1 Adam17-/- cells expressing the ADAM17 variants (n=10 for each group). The indicated significances are between the LEE and wt tumor bearing mice, and the LEE and I762A tumor bearing mice. Log-rank test was applied to test for significant differences. *p<0.05."}
{"words": ["Figure", "1C", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "BMP2", "for", "1", "h", ".", "D", ".", "Cells", "were", "stimulated", "with", "increasing", "(", "doubling", ")", "doses", "of", "BMP4", "/", "7", "(", "0", ".", "625", "-", "20", "ng", "/", "mL", ")", "for", "1", "h", ".", "Data", "information", ":", "In", "all", "cases", ",", "whole", "cell", "extracts", "were", "Western", "blotted", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "levels", "of", "pSMAD1", "/", "5", "relative", "to", "Actin", "were", "determined", "and", "are", "expressed", "as", "a", "fold", "change", "relative", "to", "the", "parental", "HEK293T", "untreated", "sample", "or", "normalized", "to", "the", "20", "ng", "/", "mL", "ligand", "dose", "in", "parental", "HEK293T", "cells", "Act", ",", "Activin", "A", ";", "Par", ",", "parental", "HEK293T", "cells", ",", "KO1", ",", "ACVR1", "KO", "clone", "1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C. Cells were treated with BMP2 for 1 h. D. Cells were stimulated with increasing (doubling) doses of BMP4/7 (0.625-20 ng/mL) for 1 h. Data information: In all cases, whole cell extracts were Western blotted using the indicated antibodies. Representative experiments are shown. The levels of pSMAD1/5 relative to Actin were determined and are expressed as a fold change relative to the parental HEK293T untreated sample or normalized to the 20 ng/mL ligand dose in parental HEK293T cells Act, Activin A; Par, parental HEK293T cells, KO1, ACVR1 KO clone 1."}
{"words": ["Figure", "2", ",", "B", ".", "Parental", "HEK293T", ",", "HET", "and", "HOM1", "cells", "were", "treated", "with", "BMP2", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Quantifications", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "Data", "information", ":", "quantifications", "are", "the", "average", "normalized", "intensities", "±", "SEM", "of", "independent", "experiments", "in", "B", ",", "the", "quantifications", "are", "expressed", "as", "fold", "changes", "relative", "to", "1", "h", "of", "ligand", "stimulation", ".", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "The", "p", "-", "values", "are", "from", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", ".", "In", "all", "panels", ",", "Western", "blots", "of", "whole", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "D", ".", "Parental", "HEK293T", ",", "S2", "/", "3", "dKO1", "and", "HOM1", "cells", "were", "treated", "with", "Activin", "A", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Data", "information", ":", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "The", "p", "-", "values", "are", "from", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", ".", "In", "D", "quantifications", "are", "from", "a", "representative", "experiment", "and", "are", "the", "intensities", "of", "pSMAD1", "/", "5", "normalized", "to", "Actin", ",", "expressed", "as", "fold", "change", "relative", "to", "untreated", "cells", "for", "each", "clone", ".", "In", "all", "panels", ",", "Western", "blots", "of", "whole", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "antibodies", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2, B. Parental HEK293T, HET and HOM1 cells were treated with BMP2 for the indicated times. Quantifications are shown on the right. Data information: quantifications are the average normalized intensities ± SEM of independent experiments in B , the quantifications are expressed as fold changes relative to 1 h of ligand stimulation. ns, not significant; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001. The p-values are from two-way ANOVA with Dunnett's post-hoc test. In all panels, Western blots of whole cell lysates were probed with the antibodies indicated.D. Parental HEK293T, S2/3 dKO1 and HOM1 cells were treated with Activin A for the indicated times. Data information: ns, not significant; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001. The p-values are from two-way ANOVA with Dunnett's post-hoc test. In D quantifications are from a representative experiment and are the intensities of pSMAD1/5 normalized to Actin, expressed as fold change relative to untreated cells for each clone. In all panels, Western blots of whole cell lysates were probed with the antibodies indicated."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "Parental", "HEK293T", ",", "HET", "and", "HOM1", "cells", "were", "treated", "with", "either", "Activin", "A", "or", "BMP4", "/", "7", "(", "both", "at", "20", "ng", "/", "mL", ")", "for", "1", "h", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "either", "1", "µM", "LDN", "-", "193189", "or", "10", "µM", "SB", "-", "431542", ".", "Quantifications", "are", "the", "levels", "of", "pSMAD1", "/", "5", "normalized", "to", "the", "loading", "control", "(", "Actin", "or", "Tubulin", ")", ",", "expressed", "as", "fold", "change", "relative", "to", "untreated", "for", "each", "clone", ".", "Quantifications", "are", "the", "average", "normalized", "intensities", "±", "SEM", "of", "3", "-", "5", "independent", "experiments", ".", "Note", "that", "the", "Activin", "A", "quantifications", "also", "includes", "data", "generated", "with", "high", "dose", "Activin", "A", "in", "Fig", ".", "3A", "as", "they", "are", "independent", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "In", "all", "panels", ",", "Western", "blots", "of", "whole", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "hi", ",", "high", ";", "Act", ",", "Activin", "A", ";", "SB", ",", "SB", "-", "431542", ";", "LDN", ",", "LDN", "-", "193189", ".", "The", "p", "-", "values", "(", "for", "A", ",", "B", "and", "D", ")", "are", "from", "a", "t", "-", "test", "with", "Holm", "-", "Sidak", "correction", ",", "for", "comparison", "between", "indicated", "pairs", ".", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "The", "p", "-", "values", "in", "C", "are", "from", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "correction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. Parental HEK293T, HET and HOM1 cells were treated with either Activin A or BMP4/7 (both at 20 ng/mL) for 1 h, in the presence or absence of either 1 µM LDN-193189 or 10 µM SB-431542. Quantifications are the levels of pSMAD1/5 normalized to the loading control (Actin or Tubulin), expressed as fold change relative to untreated for each clone. Quantifications are the average normalized intensities ± SEM of 3-5 independent experiments. Note that the Activin A quantifications also includes data generated with high dose Activin A in Fig. 3A as they are independent replicates. Data information: In all panels, Western blots of whole cell lysates were probed with the antibodies indicated. hi, high; Act, Activin A; SB, SB-431542; LDN, LDN-193189. The p-values (for A, B and D) are from a t-test with Holm-Sidak correction, for comparison between indicated pairs. ns, not significant; *, p< 0.05; **, p<0.01, ***, p<0.001; ****, p<0.0001. The p-values in C are from two-way ANOVA with Tukey's post hoc correction."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Parental", "HEK293T", ",", "ACVR2A", "KO", ",", "ACVR2B", "KO", ",", "ACVR2A", "/", "B", "dKO", ",", "HOM1", ",", "HOM1", "ACVR2A", "KO", ",", "HOM1", "ACVR2B", "KO", ",", "HOM1", "ACVR2A", "/", "B", "dKO", "cells", "were", "treated", "with", "Activin", "A", "or", "BMP2", "for", "1", "h", ".", "Data", "information", ":", "In", "all", "panels", ",", "Western", "blots", "of", "whole", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "Representative", "experiments", "are", "shown", ".", "Par", ",", "parental", "HEK293T", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Parental HEK293T, ACVR2A KO, ACVR2B KO, ACVR2A/B dKO, HOM1, HOM1 ACVR2A KO, HOM1 ACVR2B KO, HOM1 ACVR2A/B dKO cells were treated with Activin A or BMP2 for 1 h. Data information: In all panels, Western blots of whole cell lysates were probed with the antibodies indicated. Representative experiments are shown. Par, parental HEK293T cells."}
{"words": ["Figure", "5C", ".", "NIH", "-", "3T3", "cells", "were", "either", "untransfected", "or", "transfected", "with", "either", "FLAG", "-", "SMAD1", "or", "GFP", "-", "SMAD3", "together", "with", "Opto", "-", "ACVR1B", "*", ".", "Post", "transfection", ",", "cells", "were", "either", "kept", "in", "the", "dark", "or", "exposed", "to", "blue", "light", "for", "1", "h", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "50", "µM", "SB", "-", "505124", "or", "1", "µM", "LDN", "-", "193189", ".", "Data", "information", ":", "In", "all", "panels", ",", "Western", "blots", "of", "whole", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "antibodies", "against", "pSMAD1", "/", "5", "(", "that", "detected", "both", "endogenous", "and", "pFLAG", "-", "SMAD1", ")", ",", "SMAD1", "(", "which", "detects", "both", "endogenous", "and", "FLAG", "-", "SMAD1", ")", ",", "HA", "(", "which", "detects", "the", "Opto", "-", "receptors", ")", ",", "pSMAD3", "(", "which", "detects", "pGFP", "-", "SMAD3", ")", ",", "SMAD3", "(", "which", "detects", "GFP", "-", "SMAD3", ")", "and", "either", "Tubulin", "or", "Actin", "as", "the", "loading", "controls", ".", "Lane", "numbers", "are", "given", "below", "each", "blot", "for", "clarity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C. NIH-3T3 cells were either untransfected or transfected with either FLAG-SMAD1 or GFP-SMAD3 together with Opto-ACVR1B*. Post transfection, cells were either kept in the dark or exposed to blue light for 1 h, in the presence or absence of 50 µM SB-505124 or 1 µM LDN-193189. Data information: In all panels, Western blots of whole cell lysates were probed with antibodies against pSMAD1/5 (that detected both endogenous and pFLAG-SMAD1), SMAD1 (which detects both endogenous and FLAG-SMAD1), HA (which detects the Opto-receptors), pSMAD3 (which detects pGFP-SMAD3), SMAD3 (which detects GFP-SMAD3) and either Tubulin or Actin as the loading controls. Lane numbers are given below each blot for clarity. "}
{"words": ["Figure", "6H", ".", "Average", "brightness", "of", "His", "-", "Activin", "A", "-", "Atto647N", "in", "conditions", "(", "A", "-", "G", ")", ".", "Means", "±", "SEM", "are", "plotted", ".", "Each", "point", "represents", "one", "analyzed", "image", ",", "collected", "from", "2", "-", "3", "biological", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "In", "H", "and", "I", "the", "p", "values", "are", "from", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "correction", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "I", ".", "Average", "brightness", "of", "His", "-", "Activin", "A", "-", "Atto647N", "in", "ICR", "-", "B169", "and", "HSJD", "-", "DIPG", "-", "007", "cells", "alone", "or", "with", "pre", "-", "incubation", "with", "1", ".", "5", "µg", "/", "mL", "of", "rhACVR2A", "Fc", "and", "15", "µg", "/", "mL", "of", "rhACVR2B", "Fc", ".", "Source", "data", "is", "in", "Fig", ".", "EV4B", "-", "F", ".", "Means", "±", "SEM", "are", "plotted", ".", "Each", "point", "represents", "one", "analyzed", "image", ",", "collected", "from", "2", "-", "4", "biological", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "In", "H", "and", "I", "the", "p", "values", "are", "from", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "correction", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6H. Average brightness of His-Activin A-Atto647N in conditions (A-G). Means ± SEM are plotted. Each point represents one analyzed image, collected from 2-3 biological replicates. Data information: In H and I the p values are from one-way ANOVA with Tukey's post hoc correction. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.I. Average brightness of His-Activin A-Atto647N in ICR-B169 and HSJD-DIPG-007 cells alone or with pre-incubation with 1.5 µg/mL of rhACVR2A Fc and 15 µg/mL of rhACVR2B Fc. Source data is in Fig. EV4B-F. Means ± SEM are plotted. Each point represents one analyzed image, collected from 2-4 biological replicates. Data information: In H and I the p values are from one-way ANOVA with Tukey's post hoc correction. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", ".", "HEK293T", "HOM1", "cells", "were", "plated", "on", "a", "planar", "lipid", "bilayer", "containing", "(", "NIP", ")", "1", "-", "H12", "-", "Hylight647", "(", "A", ")", "or", "His", "-", "Activin", "A", "-", "Atto647N", "(", "B", ")", "and", "an", "automated", "time", "-", "lapse", "was", "started", ",", "where", "2", "-", "4", "positions", "within", "a", "well", "were", "imaged", "every", "40", "s", "during", "a", "27", "-", "min", "time", "period", ";", "3", "time", "points", "from", "one", "position", "are", "shown", ".", "TIRF", ",", "upper", "panels", ",", "brightfield", ",", "lower", "panels", ".", "The", "cluster", "intensities", "from", "all", "positions", "were", "quantified", "at", "6", "time", "points", "indicated", "(", "right", "panel", ")", "and", "plotted", "as", "individual", "cluster", "values", ".", "The", "horizontal", "gray", "bar", "denotes", "the", "mean", ".", "Cells", "+", "bilayer", "denotes", "bilayer", "areas", "under", "the", "cells", ",", "as", "identified", "from", "the", "brightfield", "images", ",", "and", "bilayer", "denotes", "areas", "where", "no", "cells", "were", "present", ".", "A", "representative", "experiment", "from", "2", "biological", "replicates", "quantified", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", ".", "In", "B", ",", "the", "region", "under", "cell", "2", "is", "shown", "enlarged", "in", "the", "top", "right", "-", "hand", "corner", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, B. HEK293T HOM1 cells were plated on a planar lipid bilayer containing (NIP)1-H12-Hylight647 (A) or His-Activin A-Atto647N (B) and an automated time-lapse was started, where 2-4 positions within a well were imaged every 40 s during a 27-min time period; 3 time points from one position are shown. TIRF, upper panels, brightfield, lower panels. The cluster intensities from all positions were quantified at 6 time points indicated (right panel) and plotted as individual cluster values. The horizontal gray bar denotes the mean. Cells + bilayer denotes bilayer areas under the cells, as identified from the brightfield images, and bilayer denotes areas where no cells were present. A representative experiment from 2 biological replicates quantified is shown. Scale bar 10 μm. In B, the region under cell 2 is shown enlarged in the top right-hand corner."}
{"words": ["Figure", "1b", ".", "In", "vitro", "activity", ".", "Left", "y", "-", "axis", ":", "13C2", "-", "oxalate", "in", "mM", ",", "right", "y", "-", "axis", ":", "13C", "-", "formate", "in", "mM", ",", "x", "-", "axis", ":", "time", "in", "minutes", ".", "SYNB8802", "(", "blue", ",", "circles", ",", "solid", "line", ":", "oxalate", ",", "dotted", "line", ":", "formate", ")", "The", "control", "EcN", "(", "pink", ",", "triangle", ",", "solid", "line", ":", "oxalate", ",", "dotted", "line", ":", "formate", ")", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "run", "and", "plotted", "separately", ".", "c", ".", "In", "vitro", "simulation", "(", "IVS", ")", ".", "Left", "y", "-", "axis", ":", "Rate", "of", "oxalate", "degradation", "in", "μmol", "/", "h", "/", "109", "cells", ".", "X", "-", "axis", "=", "time", "in", "hours", ".", "Left", "X", "-", "axis", "0", "-", "4", "hours", ",", "Right", "X", "-", "axis", "6", "-", "48", "h", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "run", "and", "plotted", "separately", ".", "Data", "points", "in", "the", "orange", "box", "represent", "incubation", "in", "simulated", "gastric", "fluid", "(", "SGF", ")", ".", "Data", "points", "in", "the", "light", "blue", "box", "represent", "incubation", "in", "simulated", "intestinal", "fluid", "(", "SIF", ")", ".", "Data", "points", "in", "the", "pink", "box", "represent", "incubation", "in", "simulated", "colonic", "fluid", "(", "SCF", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1b. In vitro activity. Left y-axis: 13C2-oxalate in mM, right y-axis: 13C-formate in mM, x-axis: time in minutes. SYNB8802 (blue, circles, solid line: oxalate, dotted line: formate) The control EcN (pink, triangle, solid line: oxalate, dotted line: formate). Three biological replicates were run and plotted separately.c. In vitro simulation (IVS). Left y-axis: Rate of oxalate degradation in μmol/h/109 cells. X-axis = time in hours. Left X-axis 0 - 4 hours, Right X-axis 6 - 48 h. Three biological replicates were run and plotted separately. Data points in the orange box represent incubation in simulated gastric fluid (SGF). Data points in the light blue box represent incubation in simulated intestinal fluid (SIF). Data points in the pink box represent incubation in simulated colonic fluid (SCF)."}
{"words": ["Figure", "2b", ".", "Acute", "mouse", "study", "of", "UOx", "lowering", "with", "SYNB8802", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "the", "urinary", "13", "C2", "-", "oxalate", "normalized", "to", "creatine", ".", "The", "x", "-", "axis", "shows", "the", "two", "groups", ",", "EcN", "(", "control", ",", "pink", ")", "vs", "SYNB8802AbxR", "(", "light", "blue", ";", "n", "=", "15", "mice", "per", "group", ")", ".", "Individual", "dots", "represent", "each", "metabolic", "cage", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "metabolic", "cage", ")", ".", "Error", "bars", "are", "calculated", "as", "SEM", ".", "(", "unpaired", "t", "-", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "d", ".", "Nonhuman", "primate", "model", "development", "study", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "urinary", "oxalate", "normalized", "to", "creatine", ".", "X", "-", "axis", "shows", "baseline", "urinary", "oxalate", "levels", "after", "overnight", "fast", ",", "and", "urinary", "oxalate", "measured", "6", "hours", "post", "administration", "of", "either", "a", "spinach", "preparation", "(", "triangle", ",", "pink", ")", "or", "water", "(", "circle", ",", "blue", ")", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "group", ")", ".", "Individual", "dots", "represent", "individual", "animals", ".", "Error", "bars", "are", "calculated", "as", "SEM", ".", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "analysis", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "f", ".", "Urinary", "recovery", "of", "oxalate", "in", "nonhuman", "primates", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "change", "in", "urinary", "oxalate", "from", "vehicle", "control", ".", "The", "x", "-", "axis", "shows", "vehicle", "(", "control", ",", "grey", ")", "and", "increasing", "doses", "of", "SYNB8802AbxR", "(", "n", "=", "24", "for", "vehicle", ",", "n", "=", "6", "for", "treatment", "groups", ")", ".", "Individual", "dots", "represent", "normalized", "urinary", "oxalate", "for", "each", "individual", "animal", ".", "Error", "bars", "are", "calculated", "as", "SEM", ".", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "g", ".", "Urinary", "recovery", "of", "13C2", "oxalate", "in", "nonhuman", "primates", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "change", "in", "urinary", "13C2", "-", "oxalate", "from", "vehicle", "control", ".", "The", "x", "-", "axis", "shows", "vehicle", "(", "control", ",", "grey", ")", "and", "increasing", "doses", "of", "SYNB8802AbxR", "(", "n", "=", "24", "for", "vehicle", ",", "n", "=", "6", "for", "treatmentgroups", ")", ".", "Individual", "dots", "represent", "normalized", "urinary", "13C2", "-", "oxalate", "for", "each", "individual", "animal", ".", "Error", "bars", "are", "calculated", "as", "SEM", ".", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "analysis", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2b. Acute mouse study of UOx lowering with SYNB8802. The y-axis shows the urinary 13 C2-oxalate normalized to creatine. The x-axis shows the two groups, EcN (control, pink) vs SYNB8802AbxR (light blue; n = 15 mice per group). Individual dots represent each metabolic cage (n = 3 mice per metabolic cage). Error bars are calculated as SEM. (unpaired t-test with Welch's correction, **** p < 0.0001)d. Nonhuman primate model development study. The y-axis shows urinary oxalate normalized to creatine. X-axis shows baseline urinary oxalate levels after overnight fast, and urinary oxalate measured 6 hours post administration of either a spinach preparation (triangle, pink) or water (circle, blue) (n=6 for each group). Individual dots represent individual animals. Error bars are calculated as SEM. (Two-way ANOVA followed by Sidak's multiple comparison analysis, **** p < 0.0001).f. Urinary recovery of oxalate in nonhuman primates. The y-axis shows change in urinary oxalate from vehicle control. The x-axis shows vehicle (control, grey) and increasing doses of SYNB8802AbxR (n = 24 for vehicle, n = 6 for treatment groups). Individual dots represent normalized urinary oxalate for each individual animal. Error bars are calculated as SEM. (One-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison analysis, * p < 0.05)g. Urinary recovery of 13C2 oxalate in nonhuman primates. The y-axis shows change in urinary 13C2-oxalate from vehicle control. The x-axis shows vehicle (control, grey) and increasing doses of SYNB8802AbxR (n = 24 for vehicle, n = 6 for treatmentgroups). Individual dots represent normalized urinary 13C2-oxalate for each individual animal. Error bars are calculated as SEM. (One-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison analysis, ** p < 0.01)"}
{"words": ["Figure", "1G", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "siRNA", "knockdown", "of", "p53", "expression", "in", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Β", "-", "actin", "serves", "as", "an", "internal", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1G) Western blot analysis of siRNA knockdown of p53 expression in three biological replicates (n=3). Β-actin serves as an internal loading control."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Images", "represent", "localization", "of", "KTR", "for", "ERK", ",", "JNK", ",", "or", "p38", "under", "basal", "growth", "conditions", ".", "Scales", "bars", "=", "20µm", ".", "C", "-", "E", ")", "Kinase", "activity", "for", "ERK", "(", "C", ")", ",", "JNK", "(", "D", ")", ",", "or", "p38", "(", "E", ")", "in", "three", "representative", "single", "cells", "(", "upper", "panels", ")", "in", "response", "to", "400", "ng", "/", "ml", "NCS", "(", "blue", ")", "or", "300", "µM", "H2O2", "(", "red", ")", "as", "measured", "by", "C", "/", "N", "ratio", ".", "Lower", "panel", "shows", "mean", "C", "/", "N", "ratio", "in", "response", "to", "400", "ng", "/", "ml", "NCS", "(", "blue", ")", "or", "300", "µM", "H2O2", "(", "red", ")", ".", "Thick", "line", "represents", "mean", "with", "shaded", "area", "=", "SD", ".", "N", "for", "each", "condition", "and", "kinase", "is", "shown", "in", "population", "average", "plots", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Images represent localization of KTR for ERK, JNK, or p38 under basal growth conditions. Scales bars=20µm.C-E) Kinase activity for ERK (C), JNK (D), or p38 (E) in three representative single cells (upper panels) in response to 400 ng/ml NCS (blue) or 300 µM H2O2 (red) as measured by C/N ratio. Lower panel shows mean C/N ratio in response to 400 ng/ml NCS (blue) or 300 µM H2O2 (red). Thick line represents mean with shaded area=SD. N for each condition and kinase is shown in population average plots."}
{"words": ["Figure", "3C", "-", "E", ")", "Mean", "kinase", "activation", "for", "ERK", "€", ",", "JNK", "(", "D", ")", ",", "or", "p38", "(", "E", ")", "in", "both", "live", "(", "grey", ")", "and", "dead", "(", "red", ")", "cells", "measured", "over", "24", "-", "hours", "in", "response", "to", "H2O2", ".", "Shaded", "areas", "=", "SD", ".", "N", "for", "each", "condition", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C-E) Mean kinase activation for ERK €, JNK (D), or p38 (E) in both live (grey) and dead (red) cells measured over 24-hours in response to H2O2. Shaded areas=SD. N for each condition is shown."}
{"words": ["Figure", "6D", ")", "Mean", "JNK", "activity", "as", "measured", "by", "C", "/", "N", "ratio", "(", "bold", "line", ")", "±", "SD", "(", "shaded", "area", ")", "in", "response", "to", "300", "µM", "H2O2", "with", "or", "without", "p38", "inhibition", "(", "grey", ")", ".", "Bar", "graph", "shows", "integrated", "JNK", "activity", "(", "C", "/", "N", "ratio", ")", "over", "24", "-", "hours", ".", "Data", "represents", "mean", "±", "SD", ".", "The", "number", "of", "analyzed", "cells", ",", "n", ",", "is", "shown", "for", "each", "condition", ".", "Statistics", "performed", "using", "2", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "=", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D) Mean JNK activity as measured by C/N ratio (bold line)±SD (shaded area) in response to 300 µM H2O2 with or without p38 inhibition (grey). Bar graph shows integrated JNK activity (C/N ratio) over 24-hours. Data represents mean±SD. The number of analyzed cells, n, is shown for each condition. Statistics performed using 2-tailed t-test. Data information: ** p<0.01, *** p<0.001, ns=not significant."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "immunostaining", "demonstrate", "that", "FKRP", "-", "iPSCs", "express", "specific", "pluripotency", "-", "associated", "markers", ",", "including", "NANOG", ",", "OCT4", ",", "Tra", "-", "1", "-", "60", "and", "SSEA4", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "C", ")", "FKRP", "-", "iPSCs", "have", "a", "normal", "karyotype", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "D", ")", "In", "vitro", "differentiation", "of", "FKRP", "-", "iPSCs", "to", "cells", "representing", "ectoderm", "(", "β", "-", "III", "Tubulin", ",", "Tuj1", ")", ",", "mesoderm", "(", "SMA", ",", "smooth", "muscle", "actin", ")", "and", "endoderm", "(", "AFP", ",", "α", "-", "fetoprotein", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Representative images of immunostaining demonstrate that FKRP-iPSCs express specific pluripotency-associated markers, including NANOG, OCT4, Tra-1-60 and SSEA4. Data information: Scale bars, 50 μm.(C) FKRP-iPSCs have a normal karyotype. Data information: Scale bars, 50 μm.(D) In vitro differentiation of FKRP-iPSCs to cells representing ectoderm (β-III Tubulin, Tuj1), mesoderm (SMA, smooth muscle actin) and endoderm (AFP, α-fetoprotein). Data information: Scale bars, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Sequence", "analysis", "shows", "precise", "biallelic", "correction", "of", "the", "FKRP", "mutation", "in", "three", "independently", "corrected", "iPSC", "clones", "(", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", ")", ",", "compared", "with", "their", "parental", "FKRPA455D", "-", "iPSCs", ".", "Selection", "cassette", "excision", "sites", "are", "identified", "in", "the", "corrected", "-", "iPSC", "lines", ".", "(", "D", ")", "CRISPR", "/", "Cas9", "corrected", "-", "iPSC", "lines", "show", "a", "normal", "karyotype", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Sequence analysis shows precise biallelic correction of the FKRP mutation in three independently corrected iPSC clones (5D17, 5D23 and 3B17), compared with their parental FKRPA455D-iPSCs. Selection cassette excision sites are identified in the corrected-iPSC lines.(D) CRISPR/Cas9 corrected-iPSC lines show a normal karyotype."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "Representative", "images", "of", "NSCs", "derived", "from", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "iPSC", "lines", "expressing", "SOX1", ",", "SOX2", "and", "nestin", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Quantification", "of", "percentage", "of", "SOX1", "+", "(", "C", ")", "and", "SOX2", "+", "(", "D", ")", "cells", "in", "culture", ".", "The", "efficiency", "of", "neural", "induction", "is", "more", "than", "99", "%", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "iPSC", "(", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", ")", "lines", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "n", "=", "4", "technical", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "FKRP", "-", "and", "corrected", "NSC", "lines", "can", "be", "further", "differentiated", "to", "cortical", "neural", "progenitor", "cells", ",", "expressing", "PAX6", ",", "OTX2", "and", "vimentin", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "Quantification", "of", "percentage", "of", "PAX6", "+", "(", "G", ")", "and", "OTX2", "+", "(", "H", ")", "cells", "in", "culture", ".", "About", "91", "-", "98", "%", "of", "cells", "derived", "from", "FKRP", ",", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", "NSC", "lines", "express", "PAX6", "(", "G", ")", ".", "About", "93", "-", "96", "%", "of", "cells", "derived", "from", "FKRP", ",", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", "NSC", "lines", "express", "OTX2", "(", "H", ")", ".", "Of", "the", "OTX2", "+", "population", ",", "about", "60", "-", "67", "%", "cells", "are", "also", "Ki67", "+", "cycling", "progenitors", "(", "I", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "n", "=", "4", "technical", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "J", "and", "K", ")", "Glutamatergic", "projection", "neurons", "derived", "from", "FKRP", "and", "corrected", "(", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", ")", "progenitor", "cells", ".", "The", "vast", "majority", "of", "neurons", "contain", "vGlut1", "+", "punctae", "in", "their", "neurites", "(", "labelled", "by", "Tuj1", ")", ".", "Right", "panels", "are", "enlarged", "images", "from", "the", "insets", "of", "left", "panels", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A and B) Representative images of NSCs derived from FKRP- and corrected-iPSC lines expressing SOX1, SOX2 and nestin. (C and D) Quantification of percentage of SOX1+ (C) and SOX2+ (D) cells in culture. The efficiency of neural induction is more than 99% in FKRP- and corrected-iPSC (5D17, 5D23 and 3B17) lines. Data are mean ± s.d. n = 4 technical replicates. Data information: Scale bars, 50 μm.(E and F) FKRP- and corrected NSC lines can be further differentiated to cortical neural progenitor cells, expressing PAX6, OTX2 and vimentin. (G-I) Quantification of percentage of PAX6+ (G) and OTX2+ (H) cells in culture. About 91-98% of cells derived from FKRP, 5D17, 5D23 and 3B17 NSC lines express PAX6 (G). About 93-96% of cells derived from FKRP, 5D17, 5D23 and 3B17 NSC lines express OTX2 (H). Of the OTX2+ population, about 60-67% cells are also Ki67+ cycling progenitors (I). Data are mean ± s.d. n = 4 technical replicates. Data information: Scale bars, 50 μm.(J and K) Glutamatergic projection neurons derived from FKRP and corrected (5D17, 5D23 and 3B17) progenitor cells. The vast majority of neurons contain vGlut1+ punctae in their neurites (labelled by Tuj1). Right panels are enlarged images from the insets of left panels. Data information: Scale bars, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Molecular", "weight", "of", "glycosylated", "α", "-", "dystroglycan", "(", "IIH6", "epitope", ")", "in", "WT", "-", "iPSC", "derived", "cortical", "neurons", "is", "similar", "to", "that", "in", "the", "mouse", "brain", "(", "~", "120", "kDa", ")", "and", "lower", "than", "that", "in", "the", "mouse", "muscle", "(", "~", "156kDa", ")", ".", "IIH6", "reactivity", "was", "almost", "not", "detected", "in", "cortical", "neurons", "derived", "from", "FKRP", "-", "iPSCs", ".", "Note", "that", "the", "β", "-", "Actin", "antibody", "does", "not", "cross", "-", "react", "with", "the", "muscle", "sample", ".", "(", "B", ")", "Representative", "immunoblots", "show", "that", "targeted", "gene", "correction", "of", "FKRP", "restores", "IIH6", "reactivity", "in", "iPSC", "-", "derived", "cortical", "neurons", ".", "Intensities", "of", "IIH6", "reactivity", "are", "normalized", "to", "β", "-", "Actin", "expression", ",", "indicating", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "t", "-", "test", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "(", "C", ")", "Representative", "laminin", "overlays", "show", "that", "targeted", "gene", "correction", "restores", "laminin", "-", "binding", "activity", "in", "iPSC", "-", "derived", "cortical", "neurons", ".", "Intensities", "of", "laminin", "-", "binding", "activity", "are", "normalized", "to", "β", "-", "dystroglycan", ",", "indicating", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "t", "-", "test", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Molecular weight of glycosylated α-dystroglycan (IIH6 epitope) in WT-iPSC derived cortical neurons is similar to that in the mouse brain (~120 kDa) and lower than that in the mouse muscle (~156kDa). IIH6 reactivity was almost not detected in cortical neurons derived from FKRP-iPSCs. Note that the β-Actin antibody does not cross-react with the muscle sample.(B) Representative immunoblots show that targeted gene correction of FKRP restores IIH6 reactivity in iPSC-derived cortical neurons. Intensities of IIH6 reactivity are normalized to β-Actin expression, indicating mean ± s.d. (n = 3 biological replicates; t-test; ** p<0.01)(C) Representative laminin overlays show that targeted gene correction restores laminin-binding activity in iPSC-derived cortical neurons. Intensities of laminin-binding activity are normalized to β-dystroglycan, indicating mean ± s.d. (n = 3 biological replicates; t-test; * p<0.05)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "Dose", "response", "curve", ".", "H2K", "2B4", "cells", "were", "treated", "with", "serial", "dilutions", "of", "11", "hit", "compounds", "for", "24", "h", "and", "fixed", ",", "stained", "and", "imaged", "as", "described", "above", ".", "The", "average", "values", "and", "standard", "deviations", "of", "the", "mean", "fluorescent", "intensities", "of", "technical", "triplicates", "were", "calculated", "and", "a", "non", "-", "linear", "regression", "curve", "was", "fitted", "for", "the", "3", "compounds", "showing", "the", "highest", "increase", "in", "α", "-", "dystroglycan", "glycosylation", "(", "IIH6", "immunostaining", ")", ".", "Representative", "images", "of", "cells", "treated", "with", "5", "µM", "of", "the", "respective", "compounds", "as", "well", "as", "EC50", "values", "are", "shown", ".", "HPFPTzone", ":", "(", "5Z", ")", "-", "5", "-", "[", "(", "3", "-", "ethoxy", "-", "4", "-", "hydroxy", "-", "phenyl", ")", "methylene", "]", "-", "3", "-", "(", "4", "-", "fluorophenyl", ")", "-", "2", "-", "thioxo", "-", "thiazolidin", "-", "4", "-", "one", ".", "4BPPNit", ":", "4", "-", "(", "4", "-", "bromophenyl", ")", "-", "6", "-", "ethylsulfanyl", "-", "2", "-", "oxo", "-", "3", ",", "4", "-", "dihydro", "-", "1H", "-", "pyridine", "-", "5", "-", "carbonitrile", ".", "DPPTzone", ":", "(", "5E", ")", "-", "5", "-", "[", "(", "2", ",", "5", "-", "dimethyl", "-", "1", "-", "phenyl", "-", "pyrrol", "-", "3", "-", "yl", ")", "methylene", "]", "-", "3", "-", "phenyl", "-", "2", "-", "thioxo", "-", "thiazolidin", "-", "4", "-", "one", ".", "Regression", "curve", "and", "EC50", "values", "were", "calculated", "using", "GraphPad", "Prism", "7", "software", ".", "In", "images", "shown", ",", "green", "represents", "glycosylated", "α", "-", "dystroglycan", "and", "blue", "Hoechst", "staining", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "(", "E", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "confirmed", "that", "4BPPNit", "treatment", "(", "20", "µM", ")", "significantly", "increased", "IIH6", "-", "reactive", "glycan", "in", "mouse", "H2K", "2B4", "cells", ",", "compared", "with", "untreated", "cells", ".", "There", "was", "no", "significant", "difference", "in", "the", "percentage", "of", "IIH6", "-", "positive", "cells", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "6", ",", "triplicates", "of", "2", "independent", "experiments", ";", "t", "-", "test", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) Dose response curve. H2K 2B4 cells were treated with serial dilutions of 11 hit compounds for 24 h and fixed, stained and imaged as described above. The average values and standard deviations of the mean fluorescent intensities of technical triplicates were calculated and a non-linear regression curve was fitted for the 3 compounds showing the highest increase in α-dystroglycan glycosylation (IIH6 immunostaining). Representative images of cells treated with 5 µM of the respective compounds as well as EC50 values are shown. HPFPTzone: (5Z)-5-[(3-ethoxy-4-hydroxy-phenyl)methylene]-3-(4-fluorophenyl)-2-thioxo-thiazolidin-4-one. 4BPPNit: 4-(4-bromophenyl)-6-ethylsulfanyl-2-oxo-3,4-dihydro-1H-pyridine-5-carbonitrile. DPPTzone: (5E)-5-[(2,5-dimethyl-1-phenyl-pyrrol-3-yl)methylene]-3-phenyl-2-thioxo-thiazolidin-4-one. Regression curve and EC50 values were calculated using GraphPad Prism 7 software. In images shown, green represents glycosylated α-dystroglycan and blue Hoechst staining. Scale bar, 50 µm.(E) Flow cytometry analysis confirmed that 4BPPNit treatment (20 µM) significantly increased IIH6-reactive glycan in mouse H2K 2B4 cells, compared with untreated cells. There was no significant difference in the percentage of IIH6-positive cells. Values indicate mean ± s.e.m. (n= 6, triplicates of 2 independent experiments; t-test; NS, not significant; ** p<0.01)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "FKRP", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", "showed", "increased", "IIH6", "reactivity", ",", "compared", "with", "untreated", "control", "cells", ".", "Note", "that", "the", "augmented", "IIH6", "reactivity", "by", "4BPPNit", "is", "much", "weaker", "than", "the", "that", "in", "CRISPR", "-", "corrected", "NSCs", ".", "Under", "the", "same", "exposure", "time", ",", "the", "signal", "intensity", "of", "IIH6", "reactivity", "is", "saturated", "in", "corrected", "-", "NSCs", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "glycosylation", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "(", "B", ")", "Representative", "immunoblots", "with", "the", "IIH6", "antibody", "using", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", "for", "24", ",", "48", "and", "72", "h", ",", "and", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "glycosylation", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "Note", "that", "the", "left", "and", "right", "panels", "of", "the", "immunoblots", "are", "not", "equivalent", "exposure", "time", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "α", "-", "dystroglycan", "glycosylation", "(", "IIH6", ")", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "glycosylation", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "or", "4", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "laminin", "-", "binding", "analysis", "using", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", "and", "DMSO", "only", "controls", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "laminin", "-", "binding", "activities", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "laminin", "-", "binding", "activity", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "Note", "that", "the", "left", "and", "right", "panels", "of", "the", "immunoblots", "are", "not", "equivalent", "exposure", "time", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "or", "4", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunoblots", "with", "the", "AF6868", "antibody", "detecting", "both", "α", "-", "dystroglycan", "core", "protein", "and", "β", "-", "dystroglycan", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", "and", "DMSO", "only", "controls", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "α", "-", "dystroglycan", "core", "protein", "and", "β", "-", "dystroglycan", "expression", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "protein", "expression", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "or", "4", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) FKRP-NSCs treated with 4BPPNit showed increased IIH6 reactivity, compared with untreated control cells. Note that the augmented IIH6 reactivity by 4BPPNit is much weaker than the that in CRISPR-corrected NSCs. Under the same exposure time, the signal intensity of IIH6 reactivity is saturated in corrected-NSCs. Data information: Intensities of glycosylation are normalized to GAPDH protein expression.(B) Representative immunoblots with the IIH6 antibody using FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit for 24, 48 and 72 h, and DMSO only controls. Data information: Intensities of glycosylation are normalized to GAPDH protein expression. Note that the left and right panels of the immunoblots are not equivalent exposure time.(C) Quantification of α-dystroglycan glycosylation (IIH6), compared with DMSO only controls. Data information: Intensities of glycosylation are normalized to GAPDH protein expression. Values indicate mean ± s.d. (n= 3 or 4 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01).(D) Representative immunoblots of laminin-binding analysis using FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit and DMSO only controls. (E) Quantification of laminin-binding activities, compared with DMSO only controls. Data information: Intensities of laminin-binding activity are normalized to GAPDH protein expression. Note that the left and right panels of the immunoblots are not equivalent exposure time. Values indicate mean ± s.d. (n= 3 or 4 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01).(F) Representative immunoblots with the AF6868 antibody detecting both α-dystroglycan core protein and β-dystroglycan in FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit and DMSO only controls. (G) Quantification of α-dystroglycan core protein and β-dystroglycan expression, compared with DMSO only controls.Data information: Intensities of protein expression are normalized to GAPDH protein expression. Values indicate mean ± s.d. (n= 3 or 4 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "DAG1", "gene", "expression", "analysis", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Gene", "expression", "levels", "are", "normalized", "to", "ACTB", "gene", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "B", ")", "FKRP", "gene", "expression", "analysis", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Gene", "expression", "levels", "are", "normalized", "to", "ACTB", "gene", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "C", ")", "LARGE1", "gene", "expression", "analysis", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Gene", "expression", "levels", "are", "normalized", "to", "ACTB", "gene", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) DAG1 gene expression analysis in FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit, compared with DMSO only controls. Data information: Gene expression levels are normalized to ACTB gene expression. Values indicate mean ± s.e.m. (n= 6 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01(B) FKRP gene expression analysis in FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit, compared with DMSO only controls. Data information: Gene expression levels are normalized to ACTB gene expression. Values indicate mean ± s.e.m. (n= 6 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01).(C) LARGE1 gene expression analysis in FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit, compared with DMSO only controls. Data information: Gene expression levels are normalized to ACTB gene expression. Values indicate mean ± s.e.m. (n= 6 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01). "}
{"words": ["Figure", "1MDM", "were", "incubated", "with", "1", ",", "25D3", "for", "4", "h", "before", "infection", "with", "HIV", "and", "/", "or", "M", ".", "tuberculosis", "(", "TB", ")", "for", "3", "h", ",", "washed", "then", "incubated", "with", "or", "without", "1", ",", "25D3", "for", "7", "days", ".", "(", "A", ")", "Top", ",", "extracellular", "release", "of", "HIV", "p24", "antigen", "into", "the", "cell", "supernatant", "at", "days", "0", ",", "4", "and", "7", "was", "detected", "by", "ELISA", ".", "Bottom", ",", "MDM", "were", "harvested", "and", "stained", "for", "HIV", "p17", ".", "Histograms", "are", "shown", "for", "a", "representative", "donor", ".", "(", "B", ")", "Top", ",", "cells", "were", "lysed", "after", "3", "h", "exposure", "to", "infectious", "agents", "or", "at", "the", "completion", "of", "the", "infection", "phase", ".", "Intracellular", "mycobacteria", "were", "harvested", "and", "assayed", "for", "mycobacterial", "growth", "at", "day", "0", "and", "day", "7", ".", "Bottom", ",", "MDM", "were", "harvested", "and", "stained", "for", "mycobacterium", ".", "Histograms", "are", "shown", "for", "a", "representative", "donor", ".", "(", "C", ")", "Cell", "lysates", "from", "panel", "B", "were", "diluted", "and", "run", "in", "a", "MGIT", "960", ".", "Bar", "and", "line", "graphs", "are", "reported", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ".", "§", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1MDM were incubated with 1,25D3 for 4 h before infection with HIV and/or M. tuberculosis (TB) for 3 h, washed then incubated with or without 1,25D3 for 7 days. (A) Top, extracellular release of HIV p24 antigen into the cell supernatant at days 0, 4 and 7 was detected by ELISA. Bottom, MDM were harvested and stained for HIV p17. Histograms are shown for a representative donor.(B) Top, cells were lysed after 3 h exposure to infectious agents or at the completion of the infection phase. Intracellular mycobacteria were harvested and assayed for mycobacterial growth at day 0 and day 7. Bottom, MDM were harvested and stained for mycobacterium. Histograms are shown for a representative donor.(C) Cell lysates from panel B were diluted and run in a MGIT 960. Bar and line graphs are reported as mean ± s.e.m. of three independent experiments performed in triplicate. § P<0.05; * P<0.001."}
{"words": ["Figure", "2HIV", "and", "/", "or", "M", ".", "tuberculosis", "(", "TB", ")", "infected", "MDM", "were", "treated", "for", "7", "days", "with", "100", "pmol", "/", "L", "1", ",", "25D3", ".", "(", "A", ")", "Cells", "were", "lysed", "and", "immunoblots", "of", "LC3B", "isoforms", "using", "antibody", "to", "LC3B", "or", "β", "-", "actin", "performed", ".", "B", ")", "Cells", "were", "incubated", "with", "10", "µg", "/", "mL", "pepstatin", "A", "for", "4", "h", "on", "day", "7", "prior", "to", "lysis", ".", "Immunoblots", "of", "LC3B", "isoforms", "using", "antibody", "to", "LC3B", "or", "β", "-", "actin", ".", "C", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "saponin", "-", "resistant", "LC3B", "-", "II", "in", "macrophages", "after", "1", ",", "25D3", "treatment", "for", "7", "d", ".", "Representative", "histograms", "of", "cells", "displaying", "saponin", "-", "resistant", "LC3B", "-", "II", "from", "three", "donors", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "saponin", "-", "resistant", "LC3B", "-", "II", "in", "macrophages", "after", "1", ",", "25D3", "treatment", "for", "7", "d", "followed", "by", "10", "µg", "/", "mL", "pepstatin", "A", "for", "a", "further", "4", "h", ".", "Representative", "histograms", "of", "cells", "displaying", "saponin", "-", "resistant", "LC3B", "-", "II", "from", "three", "donors", "are", "shown", ".", "(", "E", ")", "Immunoblots", "of", "p62", "using", "antibody", "to", "p62", "or", "β", "-", "actin", "7", "d", "after", "macrophages", "treated", "with", "1", ",", "25D3", ".", "(", "F", ")", "At", "7", "d", "post", "-", "infection", ",", "aliquots", "of", "supernatant", "taken", "before", "the", "addition", "of", "WST", "-", "1", "were", "tested", "for", "lactate", "dehydrogenase", "(", "LDH", ")", "spectrophotometrically", "using", "the", "LDHPLUS", "assay", ".", "For", "the", "last", "hour", "cells", "were", "incubated", "with", "WST", "-", "1", ",", "and", "the", "reduction", "of", "the", "WST", "-", "1", "reagent", "to", "its", "formazan", "product", "was", "monitored", "spectrophotometrically", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2HIV and/or M. tuberculosis (TB) infected MDM were treated for 7 days with 100 pmol/L 1,25D3. (A) Cells were lysed and immunoblots of LC3B isoforms using antibody to LC3B or β-actin performed.B) Cells were incubated with 10 µg/mL pepstatin A for 4 h on day 7 prior to lysis. Immunoblots of LC3B isoforms using antibody to LC3B or β-actin.C) Flow cytometry analysis of saponin-resistant LC3B-II in macrophages after 1,25D3 treatment for 7 d. Representative histograms of cells displaying saponin-resistant LC3B-II from three donors are shown.(D) Flow cytometry analysis of saponin-resistant LC3B-II in macrophages after 1,25D3 treatment for 7 d followed by 10 µg/mL pepstatin A for a further 4 h. Representative histograms of cells displaying saponin-resistant LC3B-II from three donors are shown.(E) Immunoblots of p62 using antibody to p62 or β-actin 7 d after macrophages treated with 1,25D3.(F) At 7 d post-infection, aliquots of supernatant taken before the addition of WST-1 were tested for lactate dehydrogenase (LDH) spectrophotometrically using the LDHPLUS assay. For the last hour cells were incubated with WST-1, and the reduction of the WST-1 reagent to its formazan product was monitored spectrophotometrically."}
{"words": ["Figure", "31", ",", "25D3", "induces", "autophagy", "in", "human", "macrophages", "co", "-", "infected", "with", "HIV", "and", "M", ".", "tuberculosis", ".", "HIV", "(", "A", ")", ",", "M", ".", "tuberculosis", "(", "TB", ")", "(", "B", ")", ",", "and", "HIV", "/", "TB", "dual", "infected", "MDM", "(", "C", ")", "were", "treated", "for", "7", "days", "with", "100", "pmol", "/", "L", "1", ",", "25D3", ",", "harvested", "and", "stained", "for", "HIVp17", ",", "mycobacteria", ",", "and", "saponin", "-", "resistant", "LC3B", "-", "II", ".", "Representative", "density", "plots", "from", "three", "donors", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "HIV", "/", "M", ".", "tuberculosis", "infected", "MDM", "(", "C", ")", "were", "treated", "for", "7", "days", "with", "100", "pmol", "/", "L", "1", ",", "25D3", ",", "harvested", "and", "stained", "for", "HIVp17", ",", "mycobacteria", ",", "and", "saponin", "-", "resistant", "LC3B", "-", "II", ".", "Left", ",", "representative", "density", "plots", "from", "three", "donors", "from", "HIV", "/", "M", ".", "tuberculosis", "infected", "MDM", "are", "shown", "for", "HIV", "/", "M", ".", "tuberculosis", "co", "-", "infection", ".", "Right", ",", "histograms", "of", "saponin", "-", "resistant", "LC3B", "-", "II", "in", "macrophages", "that", "were", "HIV", "+", "M", ".", "tuberculosis", "−", "or", "HIV", "+", "day", "7", "+", "at", "day", "7", "post", "-", "infection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 31,25D3 induces autophagy in human macrophages co-infected with HIV and M. tuberculosis.HIV (A), M. tuberculosis (TB) (B), and HIV/TB dual infected MDM (C) were treated for 7 days with 100 pmol/L 1,25D3, harvested and stained for HIVp17, mycobacteria, and saponin-resistant LC3B-II. Representative density plots from three donors are shown. (D) HIV/M. tuberculosis infected MDM (C) were treated for 7 days with 100 pmol/L 1,25D3, harvested and stained for HIVp17, mycobacteria, and saponin-resistant LC3B-II. Left, representative density plots from three donors from HIV/M. tuberculosis infected MDM are shown for HIV/M. tuberculosis co-infection. Right, histograms of saponin-resistant LC3B-II in macrophages that were HIV+M. tuberculosis− or HIV+day 7+ at day 7 post-infection."}
{"words": ["Figure", "4MDM", "were", "transduced", "with", "non", "-", "specific", "scrambled", "shRNA", "(", "shNS", ")", "or", "Beclin", "-", "1", "shRNA", "(", "shBCLN1", ")", "and", "selected", "using", "puromycin", "resistance", ".", "Five", "days", "later", ",", "cells", "were", "incubated", "with", "100", "pmol", "/", "L", "1", ",", "25D3", "or", "vehicle", "control", "for", "4", "h", "before", "infection", "with", "HIV", "and", "/", "or", "M", ".", "tuberculosis", "(", "TB", ")", "for", "3", "h", ".", "Cells", "were", "then", "washed", "and", "incubated", "with", "100", "pmol", "/", "L", "1", ",", "25D3", "or", "vehicle", "control", "for", "7", "days", ".", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "performed", "using", "antibodies", "raised", "to", "Beclin", "-", "1", "or", "β", "-", "actin", "after", "initial", "pathogen", "exposure", "(", "Day", "0", ")", "or", "after", "7", "days", ".", "(", "B", ")", "ELISA", "performed", "for", "HIV", "p24", "antigen", "release", "over", "7", "d", ".", "(", "C", ")", "Intracellular", "mycobacteria", "were", "harvested", "and", "assayed", "for", "mycobacterial", "growth", "by", "cfu", "enumeration", "at", "day", "0", "and", "day", "7", ".", "D", ")", "Intracellular", "mycobacteria", "harvested", "and", "assayed", "for", "viability", "based", "on", "time", "to", "positivity", "(", "75", "growth", "units", ")", "at", "day", "0", "and", "day", "7", "using", "the", "MGIT", "960", ".", "All", "bar", "and", "line", "graphs", "are", "reported", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ".", "§", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4MDM were transduced with non-specific scrambled shRNA (shNS) or Beclin-1 shRNA (shBCLN1) and selected using puromycin resistance. Five days later, cells were incubated with 100 pmol/L 1,25D3 or vehicle control for 4 h before infection with HIV and/or M. tuberculosis (TB) for 3 h. Cells were then washed and incubated with 100 pmol/L 1,25D3 or vehicle control for 7 days. (A) Immunoblot analysis performed using antibodies raised to Beclin-1 or β-actin after initial pathogen exposure (Day 0) or after 7 days.(B) ELISA performed for HIV p24 antigen release over 7 d.(C) Intracellular mycobacteria were harvested and assayed for mycobacterial growth by cfu enumeration at day 0 and day 7.D) Intracellular mycobacteria harvested and assayed for viability based on time to positivity (75 growth units) at day 0 and day 7 using the MGIT 960. All bar and line graphs are reported as mean ± s.e.m. of three independent experiments performed in triplicate. § P<0.05; * P<0.001."}
{"words": ["Figure", "5MDM", "were", "transduced", "with", "non", "-", "specific", "scrambled", "shRNA", "(", "shNS", ")", "or", "ATG5", "shRNA", "(", "shATG5", ")", "and", "selected", "using", "puromycin", "resistance", ".", "Five", "days", "later", ",", "cells", "were", "incubated", "with", "100", "pmol", "/", "L", "1", ",", "25D3", "or", "vehicle", "control", "for", "4", "h", "before", "infection", "with", "HIV", "and", "/", "or", "M", ".", "tuberculosis", "(", "TB", ")", "for", "3", "h", ".", "Cells", "were", "then", "washed", "and", "incubated", "with", "100", "pmol", "/", "L", "1", ",", "25D3", "or", "vehicle", "control", "for", "7", "days", ".", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "performed", "using", "antibodies", "raised", "to", "ATG5", "or", "β", "-", "actin", "after", "initial", "pathogen", "exposure", "(", "Day", "0", ")", "or", "after", "7", "days", "(", "B", ")", "ELISA", "performed", "for", "HIV", "p24", "antigen", "release", "over", "7", "d", ".", "(", "C", ")", "Intracellular", "mycobacteria", "were", "harvested", "and", "assayed", "for", "mycobacterial", "growth", "by", "cfu", "enumeration", "at", "day", "0", "and", "day", "7", ".", "(", "(", "D", ")", "Intracellular", "mycobacteria", "harvested", "and", "assayed", "for", "viability", "based", "on", "time", "to", "positivity", "(", "75", "growth", "units", ")", "at", "day", "0", "and", "day", "7", "using", "the", "MGIT", "960", ".", "All", "bar", "and", "line", "graphs", "are", "reported", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ".", "§", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5MDM were transduced with non-specific scrambled shRNA (shNS) or ATG5 shRNA (shATG5) and selected using puromycin resistance. Five days later, cells were incubated with 100 pmol/L 1,25D3 or vehicle control for 4 h before infection with HIV and/or M. tuberculosis (TB) for 3 h. Cells were then washed and incubated with 100 pmol/L 1,25D3 or vehicle control for 7 days. (A) Immunoblot analysis performed using antibodies raised to ATG5 or β-actin after initial pathogen exposure (Day 0) or after 7 days(B) ELISA performed for HIV p24 antigen release over 7 d.(C) Intracellular mycobacteria were harvested and assayed for mycobacterial growth by cfu enumeration at day 0 and day 7. ((D) Intracellular mycobacteria harvested and assayed for viability based on time to positivity (75 growth units) at day 0 and day 7 using the MGIT 960. All bar and line graphs are reported as mean ± s.e.m. of three independent experiments performed in triplicate. § P<0.05; * P<0.001."}
{"words": ["Figure", "6MDM", "were", "pretreated", "with", "bafilomycin", "A1", "(", "Baf", "A1", ")", "before", "treatment", "with", "1", ",", "25D3", "and", "subsequent", "infection", "with", "HIV", "and", "/", "or", "M", ".", "tuberculosis", "(", "TB", ")", ".", "(", "A", ")", "ELISA", "performed", "for", "HIV", "p24", "antigen", "release", "at", "days", "0", ",", "4", "and", "7", ".", "(", "B", ")", "Intracellular", "mycobacteria", "were", "harvested", "and", "assayed", "for", "mycobacterial", "growth", "by", "cfu", "enumeration", "at", "day", "0", "and", "7", ".", "(", "C", ")", "Intracellular", "mycobacteria", "harvested", "and", "assayed", "for", "viability", "using", "the", "MGIT", "960", "based", "on", "time", "to", "positivity", "at", "day", "0", "and", "7", ".", "All", "bar", "and", "line", "graphs", "are", "reported", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ".", "§", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6MDM were pretreated with bafilomycin A1 (Baf A1) before treatment with 1,25D3 and subsequent infection with HIV and/or M. tuberculosis (TB). (A) ELISA performed for HIV p24 antigen release at days 0, 4 and 7.(B) Intracellular mycobacteria were harvested and assayed for mycobacterial growth by cfu enumeration at day 0 and 7.(C) Intracellular mycobacteria harvested and assayed for viability using the MGIT 960 based on time to positivity at day 0 and 7. All bar and line graphs are reported as mean ± s.e.m. of three independent experiments performed in triplicate. § P<0.05; * P<0.01."}
{"words": ["Figure", "7SID", "26681509", "inhibits", "the", "1", ",", "25D3", "mediated", "inhibition", "of", "HIV", "and", "M", ".", "tuberculosis", "replication", ".", "MDM", "were", "pretreated", "with", "SID", "26681509", "(", "SID", ")", "before", "treatment", "with", "1", ",", "25D3", "and", "subsequent", "infection", "with", "HIV", "and", "/", "or", "M", ".", "tuberculosis", "(", "TB", ")", ".", "(", "A", ")", "ELISA", "performed", "for", "HIV", "p24", "antigen", "release", "at", "days", "0", ",", "4", "and", "7", ".", "B", ")", "Intracellular", "mycobacteria", "were", "harvested", "and", "assayed", "for", "mycobacterial", "growth", "by", "cfu", "enumeration", "at", "day", "0", "and", "7", ".", "(", "C", ")", "Intracellular", "mycobacteria", "harvested", "and", "assayed", "for", "viability", "using", "the", "MGIT", "960", "based", "on", "time", "to", "positivity", "at", "day", "0", "and", "7", ".", "All", "bar", "and", "line", "graphs", "are", "reported", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ".", "§", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7SID 26681509 inhibits the 1,25D3 mediated inhibition of HIV and M. tuberculosis replication.MDM were pretreated with SID 26681509 (SID) before treatment with 1,25D3 and subsequent infection with HIV and/or M. tuberculosis (TB). (A) ELISA performed for HIV p24 antigen release at days 0, 4 and 7.B) Intracellular mycobacteria were harvested and assayed for mycobacterial growth by cfu enumeration at day 0 and 7.(C) Intracellular mycobacteria harvested and assayed for viability using the MGIT 960 based on time to positivity at day 0 and 7. All bar and line graphs are reported as mean ± s.e.m. of three independent experiments performed in triplicate. § P<0.05; * P<0.01."}
{"words": ["Figure", "8Inhibition", "of", "HIV", "and", "M", ".", "tuberculosis", "by", "1", ",", "25D3", "is", "CAMP", "and", "autophagy", "dependent", ".", "MDM", "were", "transduced", "with", "non", "-", "specific", "scrambled", "shRNA", "(", "shNS", ")", "or", "CAMP", "shRNA", "(", "shCAMP", ")", "and", "selected", "using", "puromycin", "resistance", ".", "Five", "days", "later", ",", "cells", "were", "incubated", "with", "100", "pmol", "/", "L", "1", ",", "25D3", "or", "vehicle", "control", "for", "4", "h", "before", "infection", "with", "HIV", "and", "/", "or", "M", ".", "tuberculosis", "(", "TB", ")", "for", "3", "h", ".", "Cells", "were", "then", "washed", "and", "incubated", "with", "100", "pmol", "/", "L", "1", ",", "25D3", "or", "vehicle", "control", "for", "7", "days", ".", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "performed", "using", "antibodies", "raised", "to", "CAMP", "or", "β", "-", "actin", "after", "initial", "pathogen", "exposure", "(", "Day", "0", ")", "or", "after", "7", "days", ".", "(", "B", ")", "Day", "7", "HIV", "-", "1Ba", "-", "L", "and", "TB", "co", "-", "infected", "cells", "were", "harvested", "and", "stained", "for", "saponin", "-", "resistant", "LC3B", "-", "II", "at", "day", "7", ".", "A", "representative", "histogram", "from", "three", "donors", "are", "shown", ".", "C", ")", "ELISA", "performed", "for", "HIV", "p24", "antigen", "release", "over", "7", "d", ".", "(", "D", ")", "Intracellular", "mycobacteria", "were", "harvested", "and", "assayed", "for", "mycobacterial", "growth", "by", "cfu", "enumeration", "at", "day", "0", "and", "day", "7", ".", "All", "bar", "and", "line", "graphs", "are", "reported", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Inhibition of HIV and M. tuberculosis by 1,25D3 is CAMP and autophagy dependent.MDM were transduced with non-specific scrambled shRNA (shNS) or CAMP shRNA (shCAMP) and selected using puromycin resistance. Five days later, cells were incubated with 100 pmol/L 1,25D3 or vehicle control for 4 h before infection with HIV and/or M. tuberculosis (TB) for 3 h. Cells were then washed and incubated with 100 pmol/L 1,25D3 or vehicle control for 7 days. (A) Immunoblot analysis performed using antibodies raised to CAMP or β-actin after initial pathogen exposure (Day 0) or after 7 days.(B) Day 7 HIV-1Ba-L and TB co-infected cells were harvested and stained for saponin-resistant LC3B-II at day 7. A representative histogram from three donors are shown.C) ELISA performed for HIV p24 antigen release over 7 d.(D) Intracellular mycobacteria were harvested and assayed for mycobacterial growth by cfu enumeration at day 0 and day 7. All bar and line graphs are reported as mean ± s.e.m. of three independent experiments performed in triplicate. * P<0.001."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "highlighted", "genes", "enriched", "in", "either", "the", "somata", "or", "processes", "at", "the", "transcript", "or", "protein", "level", ".", "(", "Upper", "row", ":", "Scatterplots", "of", "transcript", "level", ";", "n", "=", "2", ";", "crossbar", "represents", "mean", ".", "Lower", "row", ":", "Boxplot", "of", "protein", "levels", ";", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(F) Quantification of the highlighted genes enriched in either the somata or processes at the transcript or protein level. (Upper row: Scatterplots of transcript level; n=2; crossbar represents mean. Lower row: Boxplot of protein levels; n=4)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Volcano", "plots", "representing", "transcript", "down", "-", "(", "red", ")", "or", "up", "-", "regulation", "(", "yellow", ")", "after", "48", "hours", "PTX", "in", "the", "somatic", "and", "process", "compartment", ".", "Representative", "transcripts", "are", "highlighted", "and", "labelled", ".", "Linear", "model", "was", "used", "to", "fit", "transcriptome", "data", "and", "subsequently", "contrasted", "using", "likelihood", "ratio", "testing", "for", "PTX", "-", "treatment", "effects", "across", "compartments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Volcano plots representing transcript down- (red) or up-regulation (yellow) after 48 hours PTX in the somatic and process compartment. Representative transcripts are highlighted and labelled. Linear model was used to fit transcriptome data and subsequently contrasted using likelihood ratio testing for PTX-treatment effects across compartments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Real", "-", "time", "quantitative", "PCR", "(", "RT", "-", "qPCR", ")", "of", "transcripts", "changing", "differentially", "between", "compartments", "using", "the", "compartmentalized", "cultures", "after", "48", "hours", "PTX", "-", "treatment", ".", "n", "=", "8", "independent", "biological", "replicates", "(", "except", "for", "Plk2", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "where", "one", "measurement", "couldn", "'", "t", "be", "performed", "due", "to", "insufficient", "cDNA", ")", ";", "PTX", "-", "effect", "was", "assessed", "by", "three", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "single", "-", "molecule", "FISH", "(", "smFISH", ")", "in", "either", "control", "or", "48", "h", "PTX", "-", "treated", "rat", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV20", ")", "using", "probes", "specific", "for", "Add2", ",", "Dnajc6", "and", "Sort1", "(", "green", ")", ".", "MAP2", "immunostaining", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "visualize", "neuronal", "somata", "and", "dendrites", ".", "Inserts", "at", "higher", "magnification", "illustrate", "PTX", "-", "dependent", "changes", "in", "dendritic", "RNA", "puncta", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "B", ".", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "independet", "biological", "replicates", "with", "8", "-", "10", "cells", "averaged", "per", "condition", "and", "replicate", ";", "two", "-", "sample", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) of transcripts changing differentially between compartments using the compartmentalized cultures after 48 hours PTX-treatment. n=8 independent biological replicates (except for Plk2 (n=7), where one measurement couldn't be performed due to insufficient cDNA); PTX-effect was assessed by three-way ANOVA followed by Tukey's post-hoc multiple comparison test; *p < 0.05; **p < 0.01.(B) Representative images of single-molecule FISH (smFISH) in either control or 48 h PTX-treated rat hippocampal neurons (DIV20) using probes specific for Add2, Dnajc6 and Sort1 (green). MAP2 immunostaining (red) was used to visualize neuronal somata and dendrites. Inserts at higher magnification illustrate PTX-dependent changes in dendritic RNA puncta. Scale bar = 10 μm. (C) Quantification of B. (n=3-4 independet biological replicates with 8-10 cells averaged per condition and replicate; two-sample Student's t-test; *p < 0.05; **p < 0.01). B"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "D", ")", "Representative", "plots", "of", "genes", "changing", "after", "PTX", "at", "the", "transcript", "and", "protein", "level", ".", "(", "Upper", "row", ":", "Scatterplots", "of", "transcript", "level", ";", "n", "=", "2", ";", "crossbar", "represents", "mean", ".", "Lower", "row", ":", "Boxplot", "of", "protein", "levels", ";", "n", "=", "4", ")", ".", "Boxplots", ":", "central", "line", ":", "median", ";", "box", ":", "25th", "to", "75th", "percentile", ";", "whiskers", ":", "until", "last", "data", "point", "within", "1", ".", "5x", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(D) Representative plots of genes changing after PTX at the transcript and protein level. (Upper row: Scatterplots of transcript level; n=2; crossbar represents mean. Lower row: Boxplot of protein levels; n=4). Boxplots: central line: median; box: 25th to 75th percentile; whiskers: until last data point within 1.5x interquartile range (IQR)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "pictures", "of", "nascent", "Camk2a", "-", "peptides", "in", "mock", "-", "and", "PTX", "-", "treated", "neurons", ".", "Upper", "Panels", ":", "Representative", "overview", "images", "with", "merged", "channels", "(", "grey", ":", "MAP2", "-", "staining", ",", "red", ":", "Duolink", "-", "PLA", "signal", ",", "blue", ":", "Hoechst", "nuclear", "staining", ")", ".", "Middle", "Panels", ":", "Magnifications", "of", "boxed", "areas", "marked", "in", "(", "A", ")", ".", "MAP2", "signal", "was", "used", "to", "outline", "somata", "and", "dendritic", "processes", "(", "white", "lines", ")", ".", "Lower", "Panels", ":", "Negative", "control", "of", "puromycin", "-", "untreated", "cells", "with", "representative", "Duolink", "-", "signal", "in", "dendrite", "and", "soma", ",", "respectively", ".", "(", "Scale", "bars", ":", "in", "overview", "images", "20", "μm", ",", "in", "inserts", "of", "higher", "magnification", "5", "μm", ")", ".", "(", "B", ")", "Same", "as", "A", "with", "nascent", "Synapsin1", "-", "peptides", ".", "("], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative pictures of nascent Camk2a-peptides in mock- and PTX-treated neurons. Upper Panels: Representative overview images with merged channels (grey: MAP2-staining, red: Duolink-PLA signal, blue: Hoechst nuclear staining). Middle Panels: Magnifications of boxed areas marked in (A). MAP2 signal was used to outline somata and dendritic processes (white lines). Lower Panels: Negative control of puromycin-untreated cells with representative Duolink-signal in dendrite and soma, respectively. (Scale bars: in overview images 20 μm, in inserts of higher magnification 5 μm). (B) Same as A with nascent Synapsin1-peptides. ("}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "Enrichment", "analysis", "for", "RBP", "motifs", "in", "down", "-", "and", "up", "-", "regulated", "genes", "in", "either", "compartment", ".", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "was", "used", "to", "perform", "enrichment", "analysis", ";", "FDR", "-", "corrected", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) Enrichment analysis for RBP motifs in down- and up-regulated genes in either compartment. Fisher's exact test was used to perform enrichment analysis; FDR-corrected."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "a", ".", "b", ".", "c", ".", "d", ".", "Chest", "computed", "tomographic", "scans", "of", "Patient", "1", "were", "obtained", "on", "the", "day", "of", "admission", "(", "day", "6", "after", "the", "onset", "of", "illness", ")", ".", "Bilateral", "focal", "consolidation", ",", "lobar", "consolidation", ",", "and", "patchy", "consolidation", "were", "clearly", "observed", ",", "especially", "in", "the", "lower", "lung", ".", "e", ".", "Chest", "radiograph", "of", "patient", "1", "was", "obtained", "on", "day", "5", "after", "admission", "(", "day", "11", "after", "the", "onset", "of", "illness", ")", ".", "Bilateral", "diffuse", "patchy", "and", "fuzzy", "shadow", "were", "observed", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.a. b. c. d. Chest computed tomographic scans of Patient 1 were obtained on the day of admission (day 6 after the onset of illness). Bilateral focal consolidation, lobar consolidation, and patchy consolidation were clearly observed, especially in the lower lung.e. Chest radiograph of patient 1 was obtained on day 5 after admission (day 11 after the onset of illness). Bilateral diffuse patchy and fuzzy shadow were observed."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "miRNA", "abundance", "in", "RNA", "-", "sequencing", "samples", "from", "murine", ",", "porcine", ",", "and", "bovine", "oocytes", "Each", "graph", "shows", "on", "the", "y", "-", "axis", "reads", "per", "million", "of", "19", "-", "32", "nt", "reads", "for", "miRNAs", "and", "on", "the", "x", "-", "axis", "miRNAs", "ordered", "by", "name", ".", "(", "C", ")", "qPCR", "quantification", "of", "ssc", "-", "miR", "-", "205", "and", "bta", "-", "miR", "-", "10b", "miRNAs", "in", "murine", "(", "M", ".", "m", ".", ")", ",", "porcine", "(", "S", ".", "s", ".", ")", ",", "and", "bovine", "(", "B", ".", "t", ".", ")", "oocytes", ",", "respectively", ".", "Shown", "are", "a", "mean", "values", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "=", "SD", ".", "Detailed", "information", "concerning", "miRNA", "quantification", "is", "provided", "in", "the", "Methods", "section", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) miRNA abundance in RNA-sequencing samples from murine, porcine, and bovine oocytes Each graph shows on the y-axis reads per million of 19-32 nt reads for miRNAs and on the x-axis miRNAs ordered by name.(C) qPCR quantification of ssc-miR-205 and bta-miR-10b miRNAs in murine (M.m.), porcine (S.s.), and bovine (B.t.) oocytes, respectively. Shown are a mean values from three independent experiments. Error bars = SD. Detailed information concerning miRNA quantification is provided in the Methods section."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "bta", "-", "miR", "-", "10b", "and", "ssc", "-", "miR", "-", "205", "miRNAs", "efficiently", "repress", "microinjected", "NanoLuc", "luciferase", "reporters", "carrying", "a", "perfectly", "complementary", "(", "1x", "perfect", ")", "miRNA", "binding", "site", "or", "four", "partially", "complementary", "(", "bulged", ")", "miRNA", "binding", "sites", ".", "Error", "bars", "=", "SD", ".", "Each", "data", "point", "represents", "a", "value", "obtained", "from", "five", "microinjected", "oocytes", ".", "Data", "were", "collected", "in", "two", "microinjection", "sessions", ",", "each", "microinjection", "session", "used", "a", "new", "batch", "of", "in", "vitro", "transcribed", "reporter", "mRNAs", ".", "Data", "information", ":", "asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "(", "p", "-", "value", ")", "of", "one", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "B", ")", "De", "-", "repression", "of", "predicted", "ssc", "-", "miR", "-", "205", "targets", ".", "In", "three", "independent", "microinjection", "experiments", ",", "ssc", "-", "miR", "-", "205", "was", "inhibited", "by", "a", "microinjected", "antisense", "oligonucleotide", "inhibitor", "and", "target", "levels", "were", "assessed", "24", "hours", "after", "microinjection", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Error", "bars", "=", "SD", ".", "Data", "information", ":", "asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "(", "p", "-", "value", ")", "of", "one", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "C", ")", "Inhibition", "of", "ssc", "-", "miR", "-", "205", "by", "a", "microinjected", "antisense", "oligonucleotide", "inhibitor", "results", "in", "reduced", "development", "to", "the", "blastocyst", "stage", ".", "Shown", "is", "development", "of", "microinjected", "oocytes", "to", "the", "blastocyst", "stage", "relative", "to", "water", "-", "injected", "oocytes", ".", "Five", "independent", "experiments", "(", "represented", "by", "individual", "data", "points", ")", "were", "performed", ",", "~", "50", "porcine", "oocytes", "were", "microinjected", "in", "each", "group", "in", "each", "experiment", ".", "Difference", "between", "let", "-", "7a", "and", "miR", "-", "205", "inhibitors", "effects", "is", "statistically", "significant", "(", "two", "-", "tailed", "paired", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "016", ")", ".", "Error", "bars", "=", "SD", ".", "Data", "information", ":", "asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "(", "p", "-", "value", ")", "of", "one", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) bta-miR-10b and ssc-miR-205 miRNAs efficiently repress microinjected NanoLuc luciferase reporters carrying a perfectly complementary (1x perfect) miRNA binding site or four partially complementary (bulged) miRNA binding sites. Error bars = SD. Each data point represents a value obtained from five microinjected oocytes. Data were collected in two microinjection sessions, each microinjection session used a new batch of in vitro transcribed reporter mRNAs. Data information: asterisks indicate statistical significance (p-value) of one-tailed t-test, (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).(B) De-repression of predicted ssc-miR-205 targets. In three independent microinjection experiments, ssc-miR-205 was inhibited by a microinjected antisense oligonucleotide inhibitor and target levels were assessed 24 hours after microinjection by RT-qPCR. Error bars = SD. Data information: asterisks indicate statistical significance (p-value) of one-tailed t-test, (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).(C) Inhibition of ssc-miR-205 by a microinjected antisense oligonucleotide inhibitor results in reduced development to the blastocyst stage. Shown is development of microinjected oocytes to the blastocyst stage relative to water-injected oocytes. Five independent experiments (represented by individual data points) were performed, ~50 porcine oocytes were microinjected in each group in each experiment. Difference between let-7a and miR-205 inhibitors effects is statistically significant (two-tailed paired t-test p-value = 0.016). Error bars = SD. Data information: asterisks indicate statistical significance (p-value) of one-tailed t-test, (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "ssc", "-", "miR", "-", "205", "turnover", ".", "Fully", "-", "grown", "transcriptionally", "quiescent", "oocytes", "were", "cultured", "for", "indicated", "periods", "of", "time", "and", "selected", "miRNAs", "were", "quantified", "by", "RT", "-", "qPCR", "in", "four", "(", "ssc", "-", "let", "-", "7a", ")", ",", "five", "(", "ssc", "-", "miR", "-", "22", ")", "or", "six", "(", "ssc", "-", "mir10b", "and", "ssc", "-", "miR", "-", "205", ")", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "=", "SD", ".", "(", "B", ")", "Comparison", "of", "mean", "relative", "changes", "of", "miRNA", "level", "at", "20", "h", "of", "culture", "ssc", "-", "miR", "-", "205", "in", "oocytes", "is", "less", "than", "ssc", "-", "miR", "-", "10b", ",", "ssc", "-", "miR", "-", "22", ",", "or", "ssc", "-", "let", "-", "7a", ".", "Error", "bars", "=", "SD", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "(", "p", "-", "value", ")", "of", "one", "-", "tailed", "paired", "t", "-", "test", ",", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "C", ")", "Treatment", "by", "sodium", "periodate", "followed", "by", "qPCR", "does", "not", "support", "2", "'", "-", "OH", "modification", "of", "either", "ssc", "-", "miR", "-", "205", "or", "bta", "-", "miR", "-", "10b", "miRNA", ".", "Shown", "are", "relative", "levels", "of", "the", "sodium", "periodate", "-", "treated", "samples", "to", "non", "-", "treated", "samples", ",", "which", "were", "set", "to", "one", ".", "The", "experiment", "was", "performed", "three", "times", ".", "Error", "bars", "=", "SD", ".", "Efficiency", "of", "periodate", "treatment", "was", "confirmed", "using", "non", "-", "methylated", "and", "methylated", "miR", "-", "221", "RNA", "oligonucleotides", "(", "D", ")", "3", "′", "tailing", "of", "small", "RNAs", "in", "murine", ",", "bovine", ",", "and", "porcine", "oocytes", "Shown", "are", "percentages", "of", "miRNAs", "tailed", "at", "3", "′", "end", "with", "mono", "-", "and", "oligonucleotides", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) ssc-miR-205 turnover. Fully-grown transcriptionally quiescent oocytes were cultured for indicated periods of time and selected miRNAs were quantified by RT-qPCR in four (ssc-let-7a), five (ssc-miR-22) or six (ssc-mir10b and ssc-miR-205) independent experiments. Error bars = SD.(B) Comparison of mean relative changes of miRNA level at 20 h of culture ssc-miR-205 in oocytes is less than ssc-miR-10b, ssc-miR-22, or ssc-let-7a. Error bars = SD. Asterisks indicate statistical significance (p-value) of one-tailed paired t-test, (*p < 0.05, **p < 0.01).(C) Treatment by sodium periodate followed by qPCR does not support 2'-OH modification of either ssc-miR-205 or bta-miR-10b miRNA. Shown are relative levels of the sodium periodate-treated samples to non-treated samples, which were set to one. The experiment was performed three times. Error bars = SD. Efficiency of periodate treatment was confirmed using non-methylated and methylated miR-221 RNA oligonucleotides(D) 3′ tailing of small RNAs in murine, bovine, and porcine oocytes Shown are percentages of miRNAs tailed at 3′ end with mono- and oligonucleotides."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Jac1488", "was", "imported", "into", "purified", "mitochondria", "for", "indicated", "times", "and", "treated", "with", "Proteinase", "K", "(", "PK", ")", "or", "left", "untreated", "as", "indicated", ".", "For", "comparison", ",", "47", "pmol", "of", "precursor", "were", "loaded", "(", "lane", "1", ")", ".", "Prec", ".", ",", "purified", "precursor", "protein", ";", "p", ",", "precursor", ";", "m", ",", "mature", "protein", ";", "∆", "ψ", ",", "membrane", "potential", ".", "C", ".", "Jac1488", "import", "into", "mitochondria", "as", "in", "B", ",", "right", "side", ";", "Jac1488", "protein", "dilution", "series", ",", "left", "side", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "import", "of", "Jac1488", "(", "maximal", "signal", "at", "15", "min", "import", "time", ",", "100", "%", ")", ";", "error", "bars", "indicate", "(", "SEM", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "absolute", "imported", "amounts", "in", "picomoles", "Jac1488", "per", "µg", "of", "mitochondria", ";", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Jac1488 was imported into purified mitochondria for indicated times and treated with Proteinase K (PK) or left untreated as indicated. For comparison, 47 pmol of precursor were loaded (lane 1). Prec., purified precursor protein; p, precursor; m, mature protein; ∆ψ, membrane potential.C. Jac1488 import into mitochondria as in B, right side; Jac1488 protein dilution series, left side.D. Quantification of import of Jac1488 (maximal signal at 15 min import time, 100%); error bars indicate (SEM) (n=3). E. Quantification of absolute imported amounts in picomoles Jac1488 per µg of mitochondria; error bars indicate SEM (n=3)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Steady", "state", "protein", "levels", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Tim50", "-", "depleted", "mitochondria", "visualized", "by", "Western", "blotting", "and", "immunodetection", "with", "indicated", "antisera", ".", "B", ".", "Jac1488", "was", "imported", "into", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Tim50", "-", "depleted", "mitochondria", "for", "indicated", "times", "and", "samples", "were", "treated", "with", "Proteinase", "K", ".", "p", ",", "precursorC", ".", "Quantification", "of", "Jac1488", "import", "into", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Tim50", "-", "depleted", "mitochondria", ".", "The", "amount", "of", "imported", "protease", "-", "protected", "protein", "in", "WT", "mitochondria", "at", "15", "min", "was", "set", "to", "100", "%", ";", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", ".", "[", "35S", "]", "Jac1", "was", "imported", "into", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Tim50", "-", "depleted", "mitochondria", "for", "indicated", "times", "and", "samples", "were", "treated", "with", "Proteinase", "K", ".", "p", ",", "precursor", ";", "m", ",", "mature", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "[", "35S", "]", "Jac1", "import", "into", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Tim50", "-", "depleted", "mitochondria", ".", "The", "amount", "of", "imported", "protease", "-", "protected", "protein", "in", "WT", "mitochondria", "at", "15", "min", "was", "set", "to", "100", "%", ";", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "F", ".", "Steady", "state", "protein", "levels", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "tim44", "-", "804", "mitochondria", "visualized", "by", "Western", "blotting", "and", "immunodetection", "with", "indicated", "antisera", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Steady state protein levels in wild-type (WT) and Tim50-depleted mitochondria visualized by Western blotting and immunodetection with indicated antisera.B. Jac1488 was imported into wild-type (WT) and Tim50-depleted mitochondria for indicated times and samples were treated with Proteinase K. p, precursorC. Quantification of Jac1488 import into wild-type (WT) and Tim50-depleted mitochondria. The amount of imported protease-protected protein in WT mitochondria at 15 min was set to 100%; error bars indicate SEM (n=3).D. [35S]Jac1 was imported into wild-type (WT) and Tim50-depleted mitochondria for indicated times and samples were treated with Proteinase K. p, precursor; m, mature.E. Quantification of [35S]Jac1 import into wild-type (WT) and Tim50-depleted mitochondria. The amount of imported protease-protected protein in WT mitochondria at 15 min was set to 100%; error bars indicate SEM (n=3).F. Steady state protein levels in wild-type (WT) and tim44-804 mitochondria visualized by Western blotting and immunodetection with indicated antisera."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "Purified", "pAmJac1", "was", "conjugated", "with", "different", "fluorophores", "as", "indicated", ".", "Detected", "without", "bleed", "through", "under", "fluorescence", "imaging", "conditions", ".", "C", ".", "Jac1488", "and", "pAmJac1", "conjugated", "to", "DyLight", "488", ",", "680", ",", "and", "800", "were", "imported", "into", "wild", "-", "type", "mitochondria", "for", "indicated", "times", "and", "samples", "were", "treated", "with", "Proteinase", "K", ".", "Prec", ".", ",", "purified", "precursor", "protein", ";", "p", ",", "precursor", ";", "m", ",", "mature", ".", "E", ".", "Jac1488", "and", "pImJac1", "conjugated", "to", "DyLight", "488", ",", "680", "and", "800", "were", "imported", "into", "wild", "-", "type", "mitochondria", "for", "indicated", "times", "and", "samples", "treated", "with", "Proteinase", "K", ".", "Prec", ".", ",", "purified", "precursor", "protein", ";", "p", ",", "precursor", ";", "m", ",", "mature", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. Purified pAmJac1 was conjugated with different fluorophores as indicated. Detected without bleed through under fluorescence imaging conditions.C. Jac1488 and pAmJac1 conjugated to DyLight 488, 680, and 800 were imported into wild-type mitochondria for indicated times and samples were treated with Proteinase K. Prec., purified precursor protein; p, precursor; m, mature.E. Jac1488 and pImJac1 conjugated to DyLight 488, 680 and 800 were imported into wild-type mitochondria for indicated times and samples treated with Proteinase K. Prec., purified precursor protein; p, precursor; m, mature."}
{"words": ["Figure", "4D", ".", "Quantification", "of", "picomoles", "of", "pAmJac1680", "imported", "per", "µg", "mitochondria", "as", "assessed", "in", "96", "-", "well", "format", ";", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "E", ".", "pAmJac1680", "was", "imported", "into", "purified", "mitochondria", "and", "samples", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "or", "in", "96", "-", "well", "format", ".", "The", "amount", "of", "imported", ",", "protease", "-", "protected", "samples", "at", "15", "min", "was", "set", "to", "100", "%", "in", "each", "case", ";", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "8", "for", "96", "-", "well", "plate", "analysis", ",", "n", "=", "3", "for", "SDS", "-", "PAGE", ")", ".", "G", ".", "pAmJac1680", "was", "imported", "into", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Tim50", "-", "depleted", "mitochondria", "for", "indicated", "times", "and", "samples", "treated", "with", "proteinase", "K", ".", "Samples", "were", "analyzed", "in", "96", "-", "well", "format", "and", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "The", "amount", "of", "imported", "protease", "-", "protected", "protein", "in", "WT", "mitochondria", "at", "15", "min", "was", "set", "to", "100", "%", ";", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "5", "for", "96", "-", "well", "plate", "analysis", ",", "n", "=", "4", "for", "SDS", "-", "PAGE", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D. Quantification of picomoles of pAmJac1680 imported per µg mitochondria as assessed in 96-well format; error bars indicate SEM (n=8).E. pAmJac1680 was imported into purified mitochondria and samples analyzed by SDS-PAGE or in 96-well format. The amount of imported, protease-protected samples at 15 min was set to 100% in each case; error bars indicate SEM (n=8 for 96-well plate analysis, n=3 for SDS-PAGE).G. pAmJac1680 was imported into wild-type (WT) and Tim50-depleted mitochondria for indicated times and samples treated with proteinase K. Samples were analyzed in 96-well format and by SDS-PAGE. The amount of imported protease-protected protein in WT mitochondria at 15 min was set to 100%; error bars indicate SEM (n=5 for 96-well plate analysis, n=4 for SDS-PAGE)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Atp5488", "(", "left", "panel", ")", "or", "[", "35S", "]", "Atp5", "(", "right", "panel", ")", "were", "imported", "into", "mitochondria", "for", "indicated", "times", "and", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "a", "membrane", "potential", "(", "∆", "ψ", ")", ".", "After", "proteinase", "K", "treatment", ",", "samples", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "Page", "and", "analyzed", "by", "fluorescence", "scanning", "or", "digital", "autoradiography", ".", "Prec", ".", ",", "purified", "precursor", "protein", ";", "p", ",", "precursor", ";", "m", ",", "mature", "protein", ".", "B", ".", "Import", "of", "Atp5488", "with", "increasing", "concentrations", "of", "CCCP", "to", "study", "dependency", "of", "import", "on", "membrane", "potential", "(", "∆", "ψ", ")", ".", "P", ",", "precursor", ";", "m", ",", "mature", "protein", ".", "D", ".", "[", "35S", "]", "Atp5", "was", "imported", "with", "increasing", "CCCP", "concentrations", "as", "described", "in", "B", ".", "Samples", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "digital", "autoradiography", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "import", "of", "[", "35S", "]", "Atp5", "with", "increasing", "CCCP", "concentrations", ".", "The", "amount", "of", "imported", "protease", "-", "protected", "protein", "in", "the", "absence", "of", "CCCP", "was", "set", "to", "100", "%", ";", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "G", ".", "Atp5488", "(", "left", "panel", ")", "or", "[", "35S", "]", "Atp5", "(", "right", "panel", ")", "were", "imported", "into", "wild", "-", "type", "and", "atp21", "∆", "mitochondria", "for", "indicated", "times", "and", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "a", "membrane", "potential", "(", "∆", "ψ", ")", ".", "After", "proteinase", "K", "treatment", ",", "samples", "were", "solubilized", "in", "digitonin", "buffer", "and", "separated", "by", "BN", "-", "PAGE", ".", "Aliquots", "of", "the", "samples", "was", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "(", "lower", "panels", ")", ".", "Subsequently", "proteins", "were", "visualized", "by", "fluorescence", "scanning", "or", "digital", "autoradiography", ".", "Complex", "V", "dimer", ",", "(", "CVD", ")", "and", "monomer", "(", "CVM", ")", ".", "Prec", ".", ",", "purified", "precursor", ";", "p", ",", "precursor", ";", "m", ",", "mature", "protein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Atp5488 (left panel) or [35S]Atp5 (right panel) were imported into mitochondria for indicated times and in the presence or absence of a membrane potential (∆ψ). After proteinase K treatment, samples were separated by SDS-Page and analyzed by fluorescence scanning or digital autoradiography. Prec., purified precursor protein; p, precursor; m, mature protein.B. Import of Atp5488 with increasing concentrations of CCCP to study dependency of import on membrane potential (∆ψ). P, precursor; m, mature protein.D. [35S]Atp5 was imported with increasing CCCP concentrations as described in B. Samples were separated by SDS-PAGE and analyzed by digital autoradiography. E. Quantification of import of [35S]Atp5 with increasing CCCP concentrations. The amount of imported protease-protected protein in the absence of CCCP was set to 100%; error bars indicate SEM (n=3).G. Atp5488 (left panel) or [35S]Atp5 (right panel) were imported into wild-type and atp21∆ mitochondria for indicated times and in the presence or absence of a membrane potential (∆ψ). After proteinase K treatment, samples were solubilized in digitonin buffer and separated by BN-PAGE. Aliquots of the samples was analyzed by SDS-PAGE (lower panels). Subsequently proteins were visualized by fluorescence scanning or digital autoradiography. Complex V dimer, (CVD) and monomer (CVM). Prec., purified precursor ; p, precursor; m, mature protein."}
{"words": ["Figure", "1A", "Co", "‐", "localization", "of", "endogenous", "TBC1D5", "and", "VPS35", "with", "mCherry", "‐", "ATG9A", ",", "in", "steady", "state", "and", "autophagy", "induced", "by", "mTOR", "inhibitor", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", ".", "B", ",", "C", "Quantification", "of", "co", "‐", "localization", "experiments", "presented", "in", "(", "A", ")", ".", "D", "Co", "‐", "immunoprecipitation", "of", "HA", "‐", "Flag", "‐", "TBC1D5", "with", "myc", "‐", "VPS29", ",", "transiently", "overexpressed", "in", "293T", "cells", ",", "DMSO", "or", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", "treated", ".", "E", ",", "F", "Co", "‐", "immunoprecipitation", "of", "endogenous", "TBC1D5", "and", "ATG9A", "with", "myc", "‐", "VPS29", "(", "E", ")", "transiently", "overexpressed", "in", "293T", "cells", "or", "with", "HA", "‐", "Flag", "‐", "VPS35", "(", "F", ")", "transiently", "overexpressed", "in", "293T", "cells", ",", "treated", "with", "DMSO", "or", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", ".", "G", "Co", "‐", "immunoprecipitation", "of", "endogenous", "VPS29", "and", "ATG9A", "with", "HA", "‐", "Flag", "‐", "TBC1D5stably", "expressed", "in", "293T", "cells", ",", "treated", "with", "DMSO", "or", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", ".", "H", "Co", "‐", "immunoprecipitation", "of", "endogenous", "ULK1", "and", "pATG13", "(", "Ser318", ")", "with", "HA", "‐", "Flag", "‐", "TBC1D5", ",", "stably", "expressed", "in", "T", "‐", "REx", "293T", "cells", ",", "induced", "by", "doxycycline", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", "for", "20", "h", "prior", "to", "DMSO", "or", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", "treatment", ".", "I", "Magnified", "still", "images", "extracted", "from", "Supplementary", "Movie", "S2", ".", "mCherry", "‐", "TBC1D5", "co", "‐", "localizes", "with", "GFP", "‐", "ATG9", "upon", "autophagy", "induction", "by", "mTOR", "inhibitor", ",", "KU0063794", ".", "H", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "endogenous", "ULK1", "and", "pATG13", "(", "Ser318", ")", "with", "HA", "-", "Flag", "-", "TBC1D5", ",", "stably", "expressed", "in", "T", "-", "REx", "293T", "cells", ",", "induced", "by", "doxycycline", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", "for", "20", "h", "prior", "to", "DMSO", "or", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Co‐localization of endogenous TBC1D5 and VPS35 with mCherry‐ATG9A, in steady state and autophagy induced by mTOR inhibitor KU0063794 (6 h).B, C Quantification of co‐localization experiments presented in (A).D Co‐immunoprecipitation of HA‐Flag‐TBC1D5 with myc‐VPS29, transiently overexpressed in 293T cells, DMSO or KU0063794 (6 h) treated.E, F Co‐immunoprecipitation of endogenous TBC1D5 and ATG9A with myc‐VPS29(E) transiently overexpressed in 293T cells or with HA‐Flag‐VPS35 (F) transiently overexpressed in 293T cells, treated with DMSO or KU0063794 (6 h).G Co‐immunoprecipitation of endogenous VPS29 and ATG9A with HA‐Flag‐TBC1D5stably expressed in 293T cells, treated with DMSO or KU0063794 (6 h).H Co‐immunoprecipitation of endogenous ULK1 and pATG13 (Ser318) with HA‐Flag‐TBC1D5, stably expressed in T‐REx 293T cells, induced by doxycycline (50 ng/ml) for 20 h prior to DMSO or KU0063794 (6 h) treatment.I Magnified still images extracted from Supplementary Movie S2. mCherry‐TBC1D5 co‐localizes with GFP‐ATG9 upon autophagy induction by mTOR inhibitor, KU0063794.H Co-immunoprecipitation of endogenous ULK1 and pATG13 (Ser318) with HA-Flag-TBC1D5, stably expressed in T-REx 293T cells, induced by doxycycline (50 ng/ml) for 20 h prior to DMSO or KU0063794 (6 h) treatment."}
{"words": ["Figure", "2A", "Lysates", "of", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "VPS29", "or", "TBC1D5", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", ",", "lysed", "in", "RIPA", "buffer", "(", "1", "%", "SDS", ")", "and", "lysates", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", ".", "B", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "mCherry", "‐", "ATG9", "were", "depleted", "of", "VPS29", "and", "TBC1D5", "using", "shRNAs", ",", "treated", "with", "DMSO", "or", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", ",", "fixed", "with", "2", "%", "PFA", ",", "and", "immunostained", "with", "anti", "‐", "LAMP1", "antibody", ".", "C", "Quantification", "of", "ATG9", "vesicular", "structures", "in", "cells", "from", "(", "B", ")", "under", "non", "‐", "stimulated", "conditions", ".", "D", "Quantification", "of", "ATG9", "and", "LAMP1", "co", "‐", "localization", "in", "cells", "presented", "in", "(", "B", ")", ".", "E", "Quantification", "of", "ATG9", "and", "LAMP1", "co", "−", "localization", "in", "cells", "stably", "depleted", "for", "TBC1D5", "(", "shRNA", "#", "1", ")", "or", "VPS29", "(", "shRNA", "#", "2", ")", ",", "transiently", "transfected", "with", "myc", "−", "TBC1D5", "plasmid", "resistant", "to", "TBC1D5", "shRNA", "#", "1", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", ",", "20", "h", "post", "−", "transfection", ",", "fixed", ",", "and", "immunostained", "with", "anti", "−", "LAMP1", "and", "anti", "−", "myc", "antibodies", ".", "F", "Control", "shRNA", "and", "U2OS", "cell", "lysates", "depleted", "for", "TBC1D5", "(", "shRNA", "#", "1", ")", ",", "transfected", "with", "empty", "plasmid", "or", "with", "shRNA", "‐", "resistant", "myc", "‐", "TBC1D5", ".", "G", "Immunofluorescence", "of", "TBC1D5", "(", "shRNA", "#", "1", ")", "cells", "transiently", "transfected", "with", "shRNA", "‐", "resistant", "myc", "‐", "TBC1D5", ",", "treated", "with", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", ".", "20", "h", "post", "‐", "transfection", "cells", "were", "treated", ",", "subsequently", "fixed", ",", "and", "immunostained", "with", "anti", "‐", "myc", "and", "anti", "‐", "LAMP1", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Lysates of U2OS cells stably expressing control shRNA or shRNA targeting VPS29 or TBC1D5. Cells were treated with DMSO or KU0063794 (6 h), lysed in RIPA buffer (1% SDS) and lysates were subjected to SDS-PAGE.B U2OS cells stably expressing mCherry‐ATG9 were depleted of VPS29 and TBC1D5 using shRNAs, treated with DMSO or KU0063794 (6 h), fixed with 2% PFA, and immunostained with anti‐LAMP1 antibody.C Quantification of ATG9 vesicular structures in cells from (B) under non‐stimulated conditions.D Quantification of ATG9 and LAMP1 co‐localization in cells presented in (B).E Quantification of ATG9 and LAMP1 co−localization in cells stably depleted for TBC1D5 (shRNA#1) or VPS29 (shRNA#2), transiently transfected with myc−TBC1D5 plasmid resistant to TBC1D5 shRNA#1. Cells were treated with KU0063794 (6 h), 20 h post−transfection, fixed, and immunostained with anti−LAMP1 and anti−myc antibodies.F Control shRNA and U2OS cell lysates depleted for TBC1D5 (shRNA#1), transfected with empty plasmid or with shRNA‐resistant myc‐TBC1D5.G Immunofluorescence of TBC1D5 (shRNA#1) cells transiently transfected with shRNA‐resistant myc‐TBC1D5, treated with KU0063794 (6 h). 20 h post‐transfection cells were treated, subsequently fixed, and immunostained with anti‐myc and anti‐LAMP1 antibodies."}
{"words": ["Figure", "3A", "HA", "‐", "Flag", "‐", "TBC1D5", "expression", "was", "induced", "in", "T", "‐", "REx", "HeLa", "cells", "for", "20", "h", ",", "lysates", "were", "subjected", "to", "GSTpull", "‐", "down", ",", "−", "AP2M1", ".", "Co", "‐", "precipitatedTBC1D5", "was", "detected", "with", "anti", "−", "Flag", "antibody", ".", "B", "Control", "cells", "and", "TBC1D5", "(", "shRNA", "#", "1", ")", "U2OS", "cell", "lysates", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", ",", "subsequently", "blotted", "with", "endogenous", "antibodies", "for", "AP2", "subunits", "AP2A1", "and", "AP2M1", ".", "C", "Immunofluorescent", "staining", "of", "AP2A1", "in", "U2OS", "shRNA", "control", ",", "or", "shRNA", "#", "1", "TBC1D5", "cells", "treated", "with", "KU0063974", "or", "DMSO", "(", "6", "h", ")", ".", "D", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "HA", "‐", "Flag", "‐", "ATG9A", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "endogenous", "AP2A1", "and", "TBC1D5", ".", "Regions", "of", "co", "‐", "localization", "are", "indicated", "with", "arrows", ".", "E", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "HA", "‐", "Flag", "‐", "ATG9A", "were", "starved", "in", "EBSS", "(", "4", "h", ")", "or", "treated", "with", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", ",", "subsequently", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "‐", "AP2A1", "antibody", ".", "F", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "mCherry", "‐", "ATG9A", "were", "treated", "with", "KU0063794", "(", "6", "h", ")", ",", "lysed", "in", "co", "‐", "immunoprecipitation", "buffer", ".", "Lysates", "from", "DMSO", "‐", "or", "KU0063794", "‐", "treated", "cells", "were", "split", "and", "equal", "volumes", "were", "incubated", "with", "RFP", "‐", "Trap", "beads", "or", "GFP", "‐", "Trap", "beads", ",", "or", "agarose", "as", "a", "negative", "control", ",", "overnight", "at", "4", "°", "C", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A HA‐Flag‐TBC1D5 expression was induced in T‐REx HeLa cells for 20 h, lysates were subjected to GSTpull‐down, −AP2M1. Co‐precipitatedTBC1D5 was detected with anti−Flag antibody.B Control cells and TBC1D5 (shRNA#1) U2OS cell lysates subjected to SDS-PAGE, subsequently blotted with endogenous antibodies for AP2 subunits AP2A1 and AP2M1.C Immunofluorescent staining of AP2A1 in U2OS shRNA control, or shRNA#1 TBC1D5 cells treated with KU0063974 or DMSO (6 h).D U2OS cells stably expressing HA‐Flag‐ATG9A were fixed and stained for endogenous AP2A1 and TBC1D5. Regions of co‐localization are indicated with arrows.E U2OS cells stably expressing HA‐Flag‐ATG9A were starved in EBSS (4 h) or treated with KU0063794 (6 h), subsequently fixed and stained with anti‐AP2A1 antibody.F U2OS cells stably expressing mCherry‐ATG9A were treated with KU0063794 (6 h), lysed in co‐immunoprecipitation buffer. Lysates from DMSO‐ or KU0063794‐treated cells were split and equal volumes were incubated with RFP‐Trap beads or GFP‐Trap beads, or agarose as a negative control, overnight at 4°C. Precipitated proteins were analyzed by SDS-PAGE."}
{"words": ["Figure", "4A", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "HA", "‐", "Flag", "‐", "ATG9A", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "AP2A1", "(", "40", "nM", ")", ",", "or", "siRNA", "AllStar", "control", "(", "40", "nM", ")", "were", "treated", "with", "KU0063794", "or", "DMSO", "(", "6", "h", ")", "4", "days", "post", "‐", "transfection", ",", "fixed", ",", "and", "stained", "with", "anti", "‐", "HA", "antibody", ".", "B", "Co", "‐", "localization", "of", "HA", "‐", "Flag", "‐", "ATG9A", "with", "TGN46", ".", "C", "Lysates", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "AP2A1", ",", "or", "siRNA", "control", "AllStars", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "D", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "mCherry", "−", "ATG9", "were", "transiently", "transfected", "with", "GFP", "−", "Dynamin", "2", "or", "GFP", "−", "Dynamin", "2", "(", "K44A", ")", ",", "20", "h", "post", "−", "transfection", "cells", "were", "fixed", "and", "with", "anti", "−", "TBC1D5", "antibody", ".", "ATG9A", "and", "Dynamin", "2co", "−", "localization", "is", "indicated", "by", "arrows", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A U2OS cells stably expressing HA‐Flag‐ATG9A transfected with siRNA targeting AP2A1 (40 nM), or siRNA AllStar control (40 nM) were treated with KU0063794 or DMSO (6 h) 4 days post‐transfection, fixed, and stained with anti‐HA antibody.B Co‐localization of HA‐Flag‐ATG9A with TGN46.C Lysates of U2OS cells transfected with siRNA targeting AP2A1, or siRNA control AllStars analyzed by SDS-PAGE.D U2OS cells stably expressing mCherry−ATG9 were transiently transfected with GFP−Dynamin 2 or GFP−Dynamin 2 (K44A), 20 h post−transfection cells were fixed and with anti−TBC1D5 antibody. ATG9A and Dynamin 2co−localization is indicated by arrows."}
{"words": ["Figure", "5A", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "HA", "−", "Flag", "−", "ATG9A", "treated", "with", "DMSO", "or", "Dynasore", "(", "100", "μM", ")", "15", "min", ",", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "−", "HA", "and", "anti", "−", "TBC1D5", "antibodies", ".", "B", "Quantification", "of", "ATG9Aand", "AP2A1co", "‐", "localization", "from", "experiment", "in", "(", "A", ")", ",", "pictures", "from", "3", "independent", "experiments", "were", "analyzed", "and", "co", "‐", "localization", "quantified", ",", "statistics", "is", "calculated", "as", "described", "in", "Supplementary", "Materials", "and", "Methods", ".", "C", "RGB", "‐", "line", "profile", "across", "the", "vesicle", "indicated", "with", "arrow", "in", "(", "B", ")", ";", "red", "-", "AP2A1", ";", "green", "-", "ATG9A", ";", "blue", "-", "TBC1D5", ".", "D", "Quantification", "of", "ATG9A", "and", "AP2", "co", "‐", "localization", ".", "Cells", "were", "starved", "in", "EBSS", "media", "(", "45", "min", ")", "or", "pretreated", "with", "Dynasore", "(", "15", "min", ")", "and", "subsequently", "starved", "for", "45", "min", "in", "combination", "with", "Dynasore", ".", "Control", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ".", "E", "Quantification", "of", "LC3", "puncta", "in", "cells", "stably", "expressing", "HA", "‐", "Flag", "‐", "ATG9A", ",", "treated", "and", "presented", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "100", "cells", "were", "quantified", "in", "3", "independent", "experiments", ".", "F", "T", "‐", "REx", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", "Control", "oligo", "or", "siRNA", "oligo", "#", "1", "targeting", "(", "40", "nM", ")", ".", "72", "h", "post", "−", "transfection", ",", "expression", "of", "HA", "‐", "Flag", "−", "TBC1D5", "was", "induced", "with", "doxycycline", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", ",", "and", "96", "h", "post", "−", "transfection", "cells", "were", "treated", "with", "Dynasore", "for", "15", "min", ",", "or", "pretreated", "with", "Dynasore", "and", "subsequently", "starved", "in", "combination", "with", "Dynasore", "for", "additional", "45", "min", ".", "Cells", "were", "lysed", "in", "co", "‐", "immunoprecipitation", "buffer", ",", "and", "lysates", "were", "incubated", "with", "Myc", "antibody", "or", "M2", "antibody", "coupled", "with", "agarose", "overnight", "at", "4", "°", "C", ".", "Beads", "were", "washed", "3", "times", "with", "incubation", "buffer", "and", "subjected", "to", "SDS", "‐", "PAGE", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A U2OS cells stably expressing HA−Flag−ATG9A treated with DMSO or Dynasore (100 μM) 15 min, fixed and immunostained with anti−HA and anti−TBC1D5 antibodies.B Quantification of ATG9Aand AP2A1co‐localization from experiment in (A), pictures from 3 independent experiments were analyzed and co‐localization quantified, statistics is calculated as described in Supplementary Materials and Methods.C RGB‐line profile across the vesicle indicated with arrow in (B); red-AP2A1; green-ATG9A; blue-TBC1D5.D Quantification of ATG9A and AP2 co‐localization. Cells were starved in EBSS media (45 min) or pretreated with Dynasore (15 min) and subsequently starved for 45 min in combination with Dynasore. Control cells were treated with DMSO.E Quantification of LC3 puncta in cells stably expressing HA‐Flag‐ATG9A, treated and presented as in (D). 100 cells were quantified in 3 independent experiments.F T‐REx HeLa cells were transfected with siRNA Control oligo or siRNA oligo#1 targeting (40 nM). 72 h post−transfection, expression of HA‐Flag−TBC1D5 was induced with doxycycline (50 ng/ml), and 96 h post−transfection cells were treated with Dynasore for 15 min, or pretreated with Dynasore and subsequently starved in combination with Dynasore for additional 45 min. Cells were lysed in co‐immunoprecipitation buffer, and lysates were incubated with Myc antibody or M2 antibody coupled with agarose overnight at 4°C. Beads were washed 3 times with incubation buffer and subjected to SDS‐PAGE."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Clone", "P15", "induces", "HA", "-", "LC3", "lipidation", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "P15", "plus", "plasmids", "expressing", "HA", "-", "LC3A", "and", "/", "or", "the", "apoptotic", "inhibitor", "p35", "(", "as", "shown", ")", ",", "and", "lysed", "for", "western", "blotting", "against", "the", "indicated", "molecules", "(", "anti", "‐", "HA", "for", "HA", "-", "LC3A", ")", ".", "The", "figure", "shows", "that", "expression", "of", "P15", "induces", "HA", "-", "LC3A", "conversion", "to", "a", "lower", "molecular", "weight", "form", "indicative", "of", "protein", "lipidation", ".", "This", "activity", "remains", "unchanged", "by", "p35", ".", "(", "B", ")", "P15", "induces", "GFP", "-", "LC3", "translocation", "to", "a", "vesiculated", "pattern", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "mixed", "with", "vectors", "expressing", "GFP", "-", "LC3A", "and", "p35", ".", "The", "known", "autophagic", "inducer", "bNIP3L", "constituted", "a", "positive", "control", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "pictures", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "TMEM59", "induces", "HA", "-", "LC3", "lipidation", "in", "different", "cell", "lines", "lacking", "the", "SV40", "large", "T", "−", "antigen", "plasmid", "amplification", "system", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "the", "shown", "plasmids", ",", "vectors", "expressing", "HA", "-", "LC3A", "(", "left", ")", "or", "HA", "-", "LC3B", "(", "right", ")", "and", "GST", "(", "as", "transfection", "control", ")", ",", "and", "lysed", "for", "western", "blotting", "against", "the", "indicated", "molecules", ".", "(", "D", ")", "TMEM59", "induces", "GFP", "-", "LC3", "activation", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "and", "GFP", "-", "LC3A", "(", "top", ")", "or", "GFP", "-", "LC3B", "(", "bottom", ")", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "pictures", "are", "shown", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "phenotype", "in", "D", ".", "The", "number", "of", "GFP", "-", "LC3", "‐", "positive", "vesicles", "per", "transfected", "cell", "was", "scored", "for", "at", "least", "fifty", "cells", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "one", "representative", "experiment", "of", "three", "repetitions", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Clone P15 induces HA-LC3 lipidation. 293T cells were transfected with P15 plus plasmids expressing HA-LC3A and/or the apoptotic inhibitor p35 (as shown), and lysed for western blotting against the indicated molecules (anti‐HA for HA-LC3A). The figure shows that expression of P15 induces HA-LC3A conversion to a lower molecular weight form indicative of protein lipidation. This activity remains unchanged by p35.(B) P15 induces GFP-LC3 translocation to a vesiculated pattern. 293T cells were transfected with the indicated plasmids mixed with vectors expressing GFP-LC3A and p35. The known autophagic inducer bNIP3L constituted a positive control. Representative confocal microscopy pictures are shown.(C) TMEM59 induces HA-LC3 lipidation in different cell lines lacking the SV40 large T−antigen plasmid amplification system. Cells were transfected with the shown plasmids, vectors expressing HA-LC3A (left) or HA-LC3B (right) and GST (as transfection control), and lysed for western blotting against the indicated molecules.(D) TMEM59 induces GFP-LC3 activation. 293 cells were transfected with the indicated plasmids and GFP-LC3A (top) or GFP-LC3B (bottom). Representative confocal microscopy pictures are shown.(E) Quantification of the phenotype in D. The number of GFP-LC3‐positive vesicles per transfected cell was scored for at least fifty cells. Data are expressed as means ±s.d. of one representative experiment of three repetitions.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "TMEM59", "ID", "is", "required", "for", "HA", "-", "LC3", "lipidation", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "full", "‐", "length", "TMEM59", "(", "FL", ")", "or", "a", "deleted", "version", "lacking", "the", "ID", "(", "ΔID", ",", "Δ263", "-", "323", ")", ",", "HA", "-", "LC3A", "(", "left", ")", "or", "HA", "-", "LC3B", "(", "right", ")", "and", "GST", ".", "Cells", "were", "lysed", "for", "western", "blotting", "against", "the", "shown", "molecules", ".", "(", "B", ")", "The", "ID", "is", "necessary", "for", "GFP", "-", "LC3", "activation", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "TMEM59", "constructs", "and", "GFP", "-", "LC3A", "or", "GFP", "-", "LC3B", "(", "as", "indicated", ")", ".", "Representative", "confocal", "pictures", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "phenotype", "in", "B", ".", "Scoring", "and", "data", "expression", "were", "as", "in", "Figure", "1E", ".", "(", "D", ")", "TMEM59", "ID", "(", "amino", "acids", "263", "-", "323", ")", "suffices", "for", "HA", "-", "LC3A", "lipidation", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "CD16", ":", "7", "chimera", "(", "Control", ":", "empty", "chimera", ")", "and", "vectors", "encoding", "HA", "-", "LC3A", "and", "GST", ",", "subjected", "to", "aggregation", "with", "the", "shown", "amounts", "of", "anti", "‐", "CD16", "antibody", "and", "lysed", "for", "western", "blotting", ".", "The", "right", "panel", "shows", "control", "WBs", "demonstrating", "equal", "loading", "(", "ACTIN", ")", ",", "transfection", "(", "GST", ")", "and", "chimera", "expression", "(", "CD16", ")", "in", "unaggregated", "samples", ",", "as", "all", "experimental", "points", "per", "chimera", "derive", "from", "a", "single", "transfection", ".", "(", "E", ")", "Comparable", "surface", "levels", "of", "CD16", ":", "7", "constructs", ".", "Transfected", "293", "cells", "were", "processed", "for", "anti", "‐", "CD16", "flow", "cytometry", ".", "The", "graph", "displays", "percentages", "of", "positive", "cells", "(", "left", "axis", ")", "and", "means", "of", "fluorescence", "of", "positive", "cells", "(", "MF", ",", "right", "axis", ")", "obtained", "from", "triplicates", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "the", "triplicates", ".", "(", "F", ")", "The", "ID", "suffices", "for", "HA", "-", "LC3B", "lipidation", ".", "(", "G", ")", "The", "ID", "suffices", "for", "GFP", "-", "LC3", "activation", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "chimeras", "and", "GFP", "-", "LC3A", "or", "GFP", "-", "LC3B", ",", "aggregated", "and", "mounted", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "pictures", "are", "shown", ".", "Activated", "GFP", "-", "LC3", "appears", "as", "a", "collapsed", "mass", "of", "indiscernible", "vacuoles", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "phenotype", "in", "G", ".", "As", "individual", "vesicles", "could", "not", "be", "counted", ",", "quantification", "was", "done", "as", "the", "percentage", "of", "transfected", "cells", "showing", "redistributed", "GFP", "-", "LC3", ".", "At", "least", "10", "different", "fields", "were", "counted", "(", "about", "400", "cells", ")", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "the", "triplicates", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) TMEM59 ID is required for HA-LC3 lipidation. 293 cells were transfected with full‐length TMEM59 (FL) or a deleted version lacking the ID (ΔID, Δ263-323), HA-LC3A (left) or HA-LC3B (right) and GST. Cells were lysed for western blotting against the shown molecules.(B) The ID is necessary for GFP-LC3 activation. 293 cells were transfected with the indicated TMEM59 constructs and GFP-LC3A or GFP-LC3B (as indicated). Representative confocal pictures are shown.(C) Quantification of the phenotype in B. Scoring and data expression were as in Figure 1E.(D) TMEM59 ID (amino acids 263-323) suffices for HA-LC3A lipidation. 293 cells were transfected with the indicated CD16:7 chimera (Control: empty chimera) and vectors encoding HA-LC3A and GST, subjected to aggregation with the shown amounts of anti‐CD16 antibody and lysed for western blotting. The right panel shows control WBs demonstrating equal loading (ACTIN), transfection (GST) and chimera expression (CD16) in unaggregated samples, as all experimental points per chimera derive from a single transfection.(E) Comparable surface levels of CD16:7 constructs. Transfected 293 cells were processed for anti‐CD16 flow cytometry. The graph displays percentages of positive cells (left axis) and means of fluorescence of positive cells (MF, right axis) obtained from triplicates. Data are expressed as means ±s.d. of the triplicates.(F) The ID suffices for HA-LC3B lipidation.(G) The ID suffices for GFP-LC3 activation. 293 cells were transfected with the indicated chimeras and GFP-LC3A or GFP-LC3B, aggregated and mounted. Representative confocal microscopy pictures are shown. Activated GFP-LC3 appears as a collapsed mass of indiscernible vacuoles.(H) Quantification of the phenotype in G. As individual vesicles could not be counted, quantification was done as the percentage of transfected cells showing redistributed GFP-LC3. At least 10 different fields were counted (about 400 cells). The experiment was repeated three times. Data are expressed as means ±s.d. of the triplicates.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ")", "Ability", "of", "serial", "C", "‐", "terminal", "deletions", "of", "TMEM59", "to", "activate", "LC3", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "TMEM59", "C", "‐", "terminal", "deletions", ",", "HA", "-", "LC3A", "(", "A", ")", "or", "HA", "-", "LC3B", "(", "B", ")", "and", "GST", ",", "and", "lysed", "for", "western", "blotting", "against", "the", "indicated", "molecules", ".", "(", "C", ")", "Amino", "acids", "263", "-", "281", "retain", "the", "full", "potential", "of", "TMEM59", "ID", "to", "promote", "HA", "-", "LC3", "conversion", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "shown", "CD16", ":", "7", "chimeras", ",", "HA", "-", "LC3A", "or", "HA", "-", "LC3B", "(", "as", "indicated", ")", "and", "GST", ",", "and", "subjected", "to", "anti", "‐", "CD16", "aggregation", "before", "lysing", "them", "for", "western", "blotting", ".", "The", "lower", "panels", "show", "control", "WBs", "(", "unaggregated", "samples", ")", ".", "D", "Amino", "acids", "263", "-", "281", "suffice", "for", "GFP", "-", "LC3", "activation", "and", "retain", "the", "full", "potential", "of", "TMEM59", "ID", "to", "promote", "GFP", "-", "LC3", "activation", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "CD16", ":", "7", "chimeras", "and", "GFP", "-", "LC3A", "or", "GFP", "-", "LC3B", "(", "as", "indicated", ")", ",", "and", "subjected", "to", "anti", "‐", "CD16", "aggregation", "before", "fixing", "them", "for", "microscopy", ".", "The", "graph", "shows", "percentages", "of", "transfected", "cells", "exhibiting", "redistributed", "GFP", "-", "LC3", ".", "Quantification", "and", "data", "expression", "were", "done", "as", "in", "Figure", "2H", ".", "(", "E", ")", "Amino", "acids", "282", "-", "323", "of", "TMEM59", "lack", "LC3", "activation", "potential", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "shown", "chimeras", ",", "HA", "-", "LC3A", "or", "HA", "-", "LC3B", "and", "GST", ",", "and", "processed", "for", "western", "blotting", "against", "the", "indicated", "molecules", ".", "Control", "WBs", "of", "unaggregated", "samples", "are", "shown", "in", "the", "lower", "panels", ".", "(", "F", ")", "Surface", "expression", "levels", "of", "CD16", ":", "7", "chimeras", ".", "Procedures", "and", "data", "expression", "were", "as", "in", "Figure", "2E", ".", "The", "figure", "shows", "that", "the", "functional", "differences", "observed", "between", "CD16", ":", "7", "chimeras", "(", "C", "-", "E", ")", "are", "not", "caused", "by", "differential", "surface", "expression", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A, B) Ability of serial C‐terminal deletions of TMEM59 to activate LC3. 293 cells were transfected with the indicated TMEM59 C‐terminal deletions, HA-LC3A (A) or HA-LC3B (B) and GST, and lysed for western blotting against the indicated molecules.(C) Amino acids 263-281 retain the full potential of TMEM59 ID to promote HA-LC3 conversion. 293 cells were transfected with the shown CD16:7 chimeras, HA-LC3A or HA-LC3B (as indicated) and GST, and subjected to anti‐CD16 aggregation before lysing them for western blotting. The lower panels show control WBs (unaggregated samples).D Amino acids 263-281 suffice for GFP-LC3 activation and retain the full potential of TMEM59 ID to promote GFP-LC3 activation. 293 cells were transfected with the indicated CD16:7 chimeras and GFP-LC3A or GFP-LC3B (as indicated), and subjected to anti‐CD16 aggregation before fixing them for microscopy. The graph shows percentages of transfected cells exhibiting redistributed GFP-LC3. Quantification and data expression were done as in Figure 2H.(E) Amino acids 282-323 of TMEM59 lack LC3 activation potential. 293 cells were transfected with the shown chimeras, HA-LC3A or HA-LC3B and GST, and processed for western blotting against the indicated molecules. Control WBs of unaggregated samples are shown in the lower panels.(F) Surface expression levels of CD16:7 chimeras. Procedures and data expression were as in Figure 2E. The figure shows that the functional differences observed between CD16:7 chimeras (C-E) are not caused by differential surface expression."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Endocytic", "vesicles", "containing", "aggregated", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "become", "labelled", "with", "GFP", "-", "LC3", ".", "JAR", "cells", "were", "transfected", "with", "vectors", "expressing", "the", "indicated", "CD16", ":", "7", "chimeras", "and", "GFP", "-", "LC3A", ",", "and", "subjected", "to", "anti", "‐", "CD16", "aggregation", "for", "8", "h", "before", "staining", "for", "the", "endocytosed", "chimera", "(", "red", ")", ".", "Representative", "confocal", "pictures", "are", "shown", ".", "The", "inset", "highlights", "a", "vesicle", "where", "the", "peripheral", "GFP", "-", "LC3", "staining", "is", "particularly", "distinguishable", ".", "The", "right", "panel", "displays", "control", "WBs", "showing", "that", "chimera", "aggregation", "for", "8", "h", "activates", "HA", "-", "LC3A", "conversion", "in", "JAR", "cells", ".", "(", "B", ")", "Colocalization", "of", "endocytosed", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "with", "EEA1", "and", "CD63", ".", "JAR", "cells", "were", "transfected", "with", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "and", "subjected", "to", "aggregation", "before", "staining", "them", "for", "the", "endocytosed", "chimera", "(", "red", ")", "and", "EEA1", "or", "CD63", "(", "green", ";", "FITC", "‐", "coupled", "primary", "antibodies", ")", ",", "as", "indicated", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "pictures", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "Immunoelectron", "microscopy", "assay", "showing", "that", "endocytosed", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "localizes", "to", "LC3", "−", "labelled", ",", "single", "−", "membrane", "vesicles", ".", "JAR", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "chimera", "and", "a", "construct", "expressing", "human", "IgG1", "fused", "to", "LC3A", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "anti", "−", "CD16", "aggregation", "for", "8", "h", "and", "processed", "for", "immunoelectron", "microscopy", ".", "Thick", "gold", "signal", "(", "18", "nm", ")", ":", "aggregated", ",", "endocytosed", "chimera", ";", "thin", "gold", "signal", "(", "12", "nm", ")", ":", "IgG1", "-", "LC3", ".", "Arrows", "indicate", "single", "membrane", "(", "black", ")", "or", "IgG1", "-", "LC3A", "(", "white", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "400", "nm", ".", "(", "D", ")", "Lysosomal", "inhibition", "increases", "HA", "-", "LC3II", "levels", "promoted", "by", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "chimera", "and", "HA", "-", "LC3A", ",", "and", "subjected", "to", "anti", "−", "CD16", "aggregation", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "bafilomycin", "(", "200", "nM", ",", "added", "4", "h", "post", "aggregation", ")", "before", "lysing", "them", "for", "western", "blotting", "against", "the", "indicated", "molecules", ".", "(", "E", ")", "Aggregation", "of", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "promotes", "its", "own", "degradation", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", ",", "aggregated", "and", "lysed", "for", "western", "blotting", ".", "Shown", "are", "overexposed", "anti", "‐", "CD16", "WBs", ".", "(", "F", ")", "Degradation", "of", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "is", "inhibited", "by", "ATG5", "depletion", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "and", "subsequently", "with", "the", "shown", "CD16", ":", "7", "constructs", ",", "aggregated", "and", "lysed", "for", "anti", "‐", "CD16", "western", "blotting", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "right", "panel", "displays", "control", "WBs", "showing", "ATG5", "depletion", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Endocytic vesicles containing aggregated CD16:7-263-281 become labelled with GFP-LC3. JAR cells were transfected with vectors expressing the indicated CD16:7 chimeras and GFP-LC3A, and subjected to anti‐CD16 aggregation for 8 h before staining for the endocytosed chimera (red). Representative confocal pictures are shown. The inset highlights a vesicle where the peripheral GFP-LC3 staining is particularly distinguishable. The right panel displays control WBs showing that chimera aggregation for 8 h activates HA-LC3A conversion in JAR cells.(B) Colocalization of endocytosed CD16:7-263-281 with EEA1 and CD63. JAR cells were transfected with CD16:7-263-281 and subjected to aggregation before staining them for the endocytosed chimera (red) and EEA1 or CD63 (green; FITC‐coupled primary antibodies), as indicated. Representative confocal microscopy pictures are shown.(C) Immunoelectron microscopy assay showing that endocytosed CD16:7-263-281 localizes to LC3−labelled, single−membrane vesicles. JAR cells were transfected with the CD16:7-263-281 chimera and a construct expressing human IgG1 fused to LC3A. Cells were subjected to anti−CD16 aggregation for 8 h and processed for immunoelectron microscopy. Thick gold signal (18 nm): aggregated, endocytosed chimera; thin gold signal (12 nm): IgG1-LC3. Arrows indicate single membrane (black) or IgG1-LC3A (white). Scale bar: 400 nm.(D) Lysosomal inhibition increases HA-LC3II levels promoted by CD16:7-263-281. 293 cells were transfected with the indicated chimera and HA-LC3A, and subjected to anti−CD16 aggregation in the absence or presence of bafilomycin (200 nM, added 4 h post aggregation) before lysing them for western blotting against the indicated molecules.(E) Aggregation of CD16:7-263-281 promotes its own degradation. 293 cells were transfected with the indicated constructs, aggregated and lysed for western blotting. Shown are overexposed anti‐CD16 WBs.(F) Degradation of CD16:7-263-281 is inhibited by ATG5 depletion. 293 cells were transfected with the indicated siRNAs and subsequently with the shown CD16:7 constructs, aggregated and lysed for anti‐CD16 western blotting (left panel). The right panel displays control WBs showing ATG5 depletion.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Identification", "of", "critical", "amino", "acids", "for", "HA", "-", "LC3", "conversion", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "mutants", "and", "HA", "-", "LC3A", ",", "subjected", "to", "anti", "‐", "CD16", "aggregation", "and", "lysed", "for", "western", "blotting", "against", "the", "indicated", "molecules", ".", "Asterisks", "mark", "mutations", "with", "reduced", "activity", ".", "Shown", "is", "one", "representative", "experiment", "of", "six", "repetitions", ".", "(", "B", ")", "Identification", "of", "critical", "amino", "acids", "for", "GFP", "-", "LC3", "activation", "and", "colocalization", "with", "the", "endocytosed", "chimera", ".", "JAR", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "mutants", "and", "GFP", "-", "LC3A", ",", "aggregated", "and", "stained", "for", "the", "endocytosed", "chimera", "(", "red", ")", ".", "Preparations", "were", "scored", "by", "blindly", "counting", "the", "number", "of", "red", "vesicles", "(", "chimera", ")", "and", "green", "vesicles", "(", "GFP", "-", "LC3A", ")", "per", "cell", ",", "as", "well", "as", "the", "number", "of", "red", "vesicles", "colocalizing", "with", "green", "ones", ".", "The", "percentage", "of", "green", "vesicles", "colocalizing", "with", "red", "ones", "was", "close", "to", "100", "%", "for", "all", "mutants", ",", "that", "is", ",", "virtually", "no", "GFP", "-", "LC3A", "vesicles", "were", "unrelated", "to", "endocytosed", "chimera", "(", "not", "shown", ")", ".", "At", "least", "50", "cells", "were", "scored", "per", "experimental", "point", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ".", "The", "graph", "shows", "the", "number", "of", "GFP", "-", "LC3A", "vesicles", "per", "cell", "expressed", "as", "the", "percentage", "of", "the", "value", "obtained", "for", "the", "wild", "−", "type", "chimera", "(", "left", "axis", ")", ",", "and", "the", "percentage", "of", "chimera", "vesicles", "labelled", "with", "GFP", "-", "LC3A", "(", "right", "axis", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "the", "triplicates", ".", "Asterisks", "indicate", "significant", "differences", "with", "respect", "to", "wild", "−", "type", "values", "(", "paired", "Student", "'", "s", "t", "−", "test", ";", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "confocal", "microscopy", "pictures", "of", "the", "phenotype", "produced", "by", "the", "indicated", "mutations", ".", "Procedures", "were", "as", "in", "B", ".", "(", "D", ")", "Simultaneous", "mutation", "of", "the", "four", "essential", "amino", "acids", "to", "alanine", "blocks", "HA", "-", "LC3", "conversion", "induced", "by", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", ".", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "chimeras", "(", "4M", ",", "quadruple", "mutant", ")", "and", "HA", "-", "LC3A", ",", "aggregated", "and", "lysed", "for", "western", "blotting", ".", "(", "E", ")", "Simultaneous", "mutation", "of", "the", "four", "essential", "amino", "acids", "blocks", "GFP", "-", "LC3", "activation", "and", "colocalization", "with", "the", "endocytosed", "chimera", ".", "JAR", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "constructs", "and", "GFP", "-", "LC3A", ",", "aggregated", "and", "stained", "for", "the", "endocytosed", "chimera", "(", "red", ")", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "images", "are", "shown", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "phenotype", "in", "E", ".", "Data", "gathering", "and", "expression", "were", "as", "in", "B", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Identification of critical amino acids for HA-LC3 conversion. 293 cells were transfected with the indicated CD16:7-263-281 mutants and HA-LC3A, subjected to anti‐CD16 aggregation and lysed for western blotting against the indicated molecules. Asterisks mark mutations with reduced activity. Shown is one representative experiment of six repetitions.(B) Identification of critical amino acids for GFP-LC3 activation and colocalization with the endocytosed chimera. JAR cells were transfected with the indicated CD16:7-263-281 mutants and GFP-LC3A, aggregated and stained for the endocytosed chimera (red). Preparations were scored by blindly counting the number of red vesicles (chimera) and green vesicles (GFP-LC3A) per cell, as well as the number of red vesicles colocalizing with green ones. The percentage of green vesicles colocalizing with red ones was close to 100% for all mutants, that is, virtually no GFP-LC3A vesicles were unrelated to endocytosed chimera (not shown). At least 50 cells were scored per experimental point. The experiment was repeated three times. The graph shows the number of GFP-LC3A vesicles per cell expressed as the percentage of the value obtained for the wild−type chimera (left axis), and the percentage of chimera vesicles labelled with GFP-LC3A (right axis). Data are expressed as means ±s.d. of the triplicates. Asterisks indicate significant differences with respect to wild−type values (paired Student's t−test; P<0.01).(C) Representative confocal microscopy pictures of the phenotype produced by the indicated mutations. Procedures were as in B.(D) Simultaneous mutation of the four essential amino acids to alanine blocks HA-LC3 conversion induced by CD16:7-263-281. 293 cells were transfected with the indicated chimeras (4M, quadruple mutant) and HA-LC3A, aggregated and lysed for western blotting.(E) Simultaneous mutation of the four essential amino acids blocks GFP-LC3 activation and colocalization with the endocytosed chimera. JAR cells were transfected with the indicated CD16:7-263-281 constructs and GFP-LC3A, aggregated and stained for the endocytosed chimera (red). Representative confocal microscopy images are shown.(F) Quantification of the phenotype in E. Data gathering and expression were as in B.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Apposition", "events", "between", "GFP", "-", "ATG16L1", "and", "endocytosed", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", ".", "JAR", "cells", "were", "transfected", "with", "CD16", ":", "7", "-", "263", "-", "281", "and", "GFP", "-", "ATG16L1", "or", "GFP", "-", "BECLIN", "(", "as", "indicated", ")", ",", "aggregated", "for", "4", "h", "and", "stained", "for", "the", "endocytosed", "chimera", "(", "red", ")", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "pictures", "are", "shown", ".", "Two", "different", "examples", "are", "provided", "for", "GFP", "-", "ATG16L1", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", ",", "lysed", "and", "subjected", "to", "GST", "immunoprecipitation", "using", "agarose", "beads", "coupled", "to", "glutathione", "(", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TL", ",", "total", "lysate", ")", ".", "Shown", "are", "WBs", "against", "the", "indicated", "molecules", ".", "(", "B", ")", "AU", "-", "ATG16L1", "co", "‐", "precipitates", "with", "wild", "‐", "type", "(", "WT", ")", "TMEM59", "-", "GST", "but", "not", "with", "a", "mutated", "version", "where", "the", "four", "essential", "amino", "acids", "were", "mutated", "to", "alanine", "(", "TMEM59", "-", "4M", "-", "GST", ")", ".", "(", "C", ")", "Full", "‐", "length", "TMEM59", "and", "TMEM59", "-", "Δ282", "co", "‐", "precipitate", "with", "GST", "-", "ATG16L1", ",", "whereas", "the", "respective", "4M", "versions", "do", "not", ".", "(", "D", ")", "AU", "-", "ATG16L1", "co", "‐", "precipitates", "with", "a", "fusion", "protein", "between", "GST", "and", "the", "minimal", "active", "peptide", "of", "TMEM59", "(", "GST", "-", "263", "-", "281", ")", ",", "but", "not", "with", "a", "4M", "version", "(", "GST", "-", "263", "-", "281", "-", "4M", ")", "or", "a", "GST", "fusion", "protein", "with", "the", "inactive", "portion", "of", "TMEM59", "-", "ID", "(", "GST", "-", "282", "-", "323", ")", ".", "(", "E", ")", "HA", "-", "ATG16L1", "expressed", "in", "bacteria", "co", "−", "precipitates", "with", "a", "GST", "-", "263", "-", "281", "recombinant", "protein", "purified", "from", "bacterial", "cultures", ",", "but", "not", "with", "a", "4M", "version", "of", "the", "same", "construct", "or", "GST", "-", "282", "-", "323", ".", "The", "indicated", "GST", "partners", "were", "expressed", "in", "bacteria", "and", "purified", "using", "agarose", "beads", "coupled", "to", "glutathione", ".", "The", "loaded", "beads", "were", "then", "used", "for", "HA", "-", "ATG16L1", "pull", "−", "down", "from", "crude", "bacterial", "lysates", ".", "Shown", "are", "WBs", "against", "the", "indicated", "molecules", "(", "PD", ",", "pull", "−", "down", ")", ".", "A", "Coomasie", "staining", "of", "a", "protein", "gel", "with", "the", "purified", "GST", "fusion", "proteins", "is", "shown", ".", "The", "right", "panel", "compares", "the", "amount", "of", "HA", "-", "ATG16L1", "pulled", "down", "by", "GST", "-", "263", "-", "281", "with", "the", "signal", "provided", "by", "direct", "anti", "−", "HA", "immunoprecipitation", ".", "This", "result", "shows", "that", "about", "20", "-", "25", "%", "of", "the", "available", "HA", "-", "ATG16L1", "protein", "is", "precipitated", "by", "GST", "-", "263", "-", "281", ".", "Asterisks", "indicate", "irrelevant", "bands", "in", "B", "and", "D", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Apposition events between GFP-ATG16L1 and endocytosed CD16:7-263-281. JAR cells were transfected with CD16:7-263-281 and GFP-ATG16L1 or GFP-BECLIN (as indicated), aggregated for 4 h and stained for the endocytosed chimera (red). Representative confocal microscopy pictures are shown. Two different examples are provided for GFP-ATG16L1.(B-D) 293T cells were transfected with the indicated constructs, lysed and subjected to GST immunoprecipitation using agarose beads coupled to glutathione (IP, immunoprecipitation; TL, total lysate). Shown are WBs against the indicated molecules. (B) AU-ATG16L1 co‐precipitates with wild‐type (WT) TMEM59-GST but not with a mutated version where the four essential amino acids were mutated to alanine (TMEM59-4M-GST). (C) Full‐length TMEM59 and TMEM59-Δ282 co‐precipitate with GST-ATG16L1, whereas the respective 4M versions do not. (D) AU-ATG16L1 co‐precipitates with a fusion protein between GST and the minimal active peptide of TMEM59 (GST-263-281), but not with a 4M version (GST-263-281-4M) or a GST fusion protein with the inactive portion of TMEM59-ID (GST-282-323).(E) HA-ATG16L1 expressed in bacteria co−precipitates with a GST-263-281 recombinant protein purified from bacterial cultures, but not with a 4M version of the same construct or GST-282-323. The indicated GST partners were expressed in bacteria and purified using agarose beads coupled to glutathione. The loaded beads were then used for HA-ATG16L1 pull−down from crude bacterial lysates. Shown are WBs against the indicated molecules (PD, pull−down). A Coomasie staining of a protein gel with the purified GST fusion proteins is shown. The right panel compares the amount of HA-ATG16L1 pulled down by GST-263-281 with the signal provided by direct anti−HA immunoprecipitation. This result shows that about 20-25% of the available HA-ATG16L1 protein is precipitated by GST-263-281. Asterisks indicate irrelevant bands in B and D.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "F", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", ",", "lysed", "and", "subjected", "to", "GST", "immunoprecipitation", "with", "agarose", "beads", "coupled", "to", "glutathione", ".", "Shown", "are", "WBs", "against", "the", "indicated", "molecules", ".", "(", "A", ")", "A", "deleted", "version", "of", "ATG16L1", "lacking", "the", "WD", "domain", "(", "HA", "-", "ATG16L1", "-", "ΔWD", ")", "does", "not", "co", "‐", "precipitate", "with", "TMEM59", "-", "GST", ".", "(", "B", ")", "TMEM59", "does", "not", "co", "‐", "precipitate", "with", "ATG16L1", "-", "ΔWD", "fused", "to", "GST", ".", "(", "C", ")", "The", "WD", "domain", "of", "ATG16L1", "(", "HA", "-", "ATG16L1", "-", "WD", ")", "suffices", "to", "co", "‐", "precipitate", "with", "TMEM59", "-", "GST", ".", "(", "D", ")", "TMEM59", "co", "‐", "precipitates", "with", "ATG16L1", "-", "WD", "fused", "to", "GST", ".", "(", "E", ")", "HA", "-", "ATG16L1", "-", "WD", "does", "not", "bind", "a", "4M", "version", "of", "TMEM59", "-", "GST", ".", "(", "F", ")", "TMEM59", "-", "4M", "does", "not", "co", "‐", "precipitate", "with", "the", "ATG16L1", "-", "WD", "fused", "to", "GST", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-F) 293T cells were transfected with the indicated constructs, lysed and subjected to GST immunoprecipitation with agarose beads coupled to glutathione. Shown are WBs against the indicated molecules. (A) A deleted version of ATG16L1 lacking the WD domain (HA-ATG16L1-ΔWD) does not co‐precipitate with TMEM59-GST. (B) TMEM59 does not co‐precipitate with ATG16L1-ΔWD fused to GST. (C) The WD domain of ATG16L1 (HA-ATG16L1-WD) suffices to co‐precipitate with TMEM59-GST. (D) TMEM59 co‐precipitates with ATG16L1-WD fused to GST. (E) HA-ATG16L1-WD does not bind a 4M version of TMEM59-GST. (F) TMEM59-4M does not co‐precipitate with the ATG16L1-WD fused to GST.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "C", ",", "D", ",", "E", ",", "G", ",", "H", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", ",", "lysed", "and", "subjected", "to", "GST", "immunoprecipitation", "with", "agarose", "beads", "coupled", "to", "glutathione", ".", "Shown", "are", "WBs", "against", "the", "indicated", "molecules", ".", "(", "C", ")", "The", "N", "‐", "terminal", "CARD", "of", "NOD2", "(", "NOD2", "-", "CARD1", "-", "HA", ")", ",", "but", "not", "the", "CARD", "of", "NOD1", "(", "NOD1", "-", "CARD", "-", "HA", ")", ",", "co", "‐", "precipitates", "with", "GST", "-", "ATG16L1", ".", "(", "D", ")", "The", "ID", "of", "TLR2", "(", "HA", "-", "TLR2", "-", "ID", ")", "co", "‐", "precipitates", "with", "GST", "-", "ATG16L1", ".", "(", "E", ")", "Mutated", "versions", "(", "MUT", ")", "of", "NOD2", "-", "CARD1", "-", "HA", "and", "HA", "-", "TLR2", "-", "ID", "(", "as", "shown", ")", "do", "not", "co", "‐", "precipitate", "with", "GST", "-", "ATG16L1", ".", "(", "F", ")", "Amino", "‐", "acid", "sequences", "of", "T3JAM", "and", "DEDD2", "including", "the", "motif", ".", "Residues", "identified", "by", "the", "Prosite", "algorithm", "are", "highlighted", ".", "(", "G", ")", "Wild", "‐", "type", "(", "WT", ")", "versions", "of", "HA", "-", "T3JAM", "and", "HA", "-", "DEDD2", "(", "as", "indicated", ")", "co", "‐", "precipitate", "with", "GST", "-", "ATG16L1", ".", "(", "H", ")", "Mutated", "versions", "(", "MUT", ")", "of", "HA", "-", "T3JAM", "and", "HA", "-", "DEDD2", "do", "not", "co", "‐", "precipitate", "with", "GST", "-", "ATG16L1", ".", "Asterisks", "indicate", "irrelevant", "bands", "in", "C", ",", "D", "and", "G", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(C, D, E, G, H) 293T cells were transfected with the indicated constructs, lysed and subjected to GST immunoprecipitation with agarose beads coupled to glutathione. Shown are WBs against the indicated molecules. (C) The N‐terminal CARD of NOD2 (NOD2-CARD1-HA), but not the CARD of NOD1 (NOD1-CARD-HA), co‐precipitates with GST-ATG16L1. (D) The ID of TLR2 (HA-TLR2-ID) co‐precipitates with GST-ATG16L1. (E) Mutated versions (MUT) of NOD2-CARD1-HA and HA-TLR2-ID (as shown) do not co‐precipitate with GST-ATG16L1. (F) Amino‐acid sequences of T3JAM and DEDD2 including the motif. Residues identified by the Prosite algorithm are highlighted. (G) Wild‐type (WT) versions of HA-T3JAM and HA-DEDD2 (as indicated) co‐precipitate with GST-ATG16L1. (H) Mutated versions (MUT) of HA-T3JAM and HA-DEDD2 do not co‐precipitate with GST-ATG16L1. Asterisks indicate irrelevant bands in C, D and G.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", ")", "The", "right", "panel", "shows", "successful", "TMEM59", "depletion", "(", "rabbit", "anti", "‐", "TMEM59immunoprecipitation", "plus", "chicken", "anti", "‐", "TMEM59WB", ")", ".", "(", "A", ")", "Depletion", "of", "TMEM59", "inhibits", "LC3II", "generation", "by", "SA", "at", "early", "infection", "times", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "and", ",", "48", "h", "later", ",", "infected", "with", "the", "bacteria", "(", "SA", ")", "for", "the", "shown", "times", "before", "lysing", "them", "for", "western", "blotting", "against", "the", "indicated", "molecules", ".", "The", "right", "panel", "shows", "successful", "TMEM59", "depletion", "(", "rabbit", "anti", "‐", "TMEM59", "immunoprecipitation", "plus", "chicken", "anti", "‐", "TMEM59", "WB", ")", ".", "(", "B", ")", "Colocalization", "events", "between", "bacteria", "(", "GFP", "labelled", ")", ",", "TMEM59", "-", "HA", "and", "Cherry", "-", "LC3A", "in", "infected", "cells", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "TMEM59", "-", "HA", "and", "Cherry", "-", "LC3A", "were", "infected", "for", "the", "indicated", "times", "(", "moi", "=", "10", ")", ",", "and", "processed", "for", "anti", "‐", "HA", "immunofluorescence", ".", "Representative", "confocal", "images", "are", "shown", ".", "The", "GFP", ",", "anti", "‐", "HA", "(", "Cy5", ")", "and", "DAPI", "signals", "were", "pseudocolored", "in", "blue", ",", "green", "and", "white", ",", "respectively", ".", "Asterisks", "indicate", "overlay", "images", ":", "(", "*", ")", ",", "Cherry", "-", "LC3A", "/", "TMEM59", ";", "(", "*", "*", ")", ",", "Cherry", "-", "LC3A", "/", "TMEM59", "/", "bacteria", ";", "(", "*", "*", "*", ")", ",", "Cherry", "-", "LC3A", "/", "TMEM59", "/", "bacteria", "/", "DAPI", ".", "(", "C", ")", "Colocalization", "between", "bacteria", ",", "TMEM59", "-", "HA", "and", "Cherry", "-", "ATG16L1", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "TMEM59", "-", "HA", "and", "Cherry", "-", "ATG16L1", "were", "infected", "with", "SA", "(", "2", "h", ",", "moi", "=", "10", ")", ",", "and", "processed", "for", "anti", "‐", "HA", "immunofluorescence", ".", "Shown", "are", "confocal", "pictures", "displaying", "two", "representative", "examples", ".", "Asterisks", "indicate", "overlays", "as", "in", "B", ".", "(", "D", ")", "SA", "promotes", "co", "‐", "precipitation", "of", "endogenous", "ATG16L1", "with", "endogenous", "TMEM59", ".", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "SA", "(", "2", "h", ",", "moi", "=", "10", ")", ",", "lysed", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "‐", "TMEM59", "antibodies", "or", "irrelevant", "protein", "G", "beads", "(", "as", "indicated", ")", ".", "Immunoprecipitates", "were", "processed", "for", "western", "blotting", ".", "The", "right", "panel", "shows", "control", "WBs", "of", "the", "lysates", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "(", "E", ")", "Depletion", "of", "TMEM59", "reduces", "recovery", "of", "SA", "from", "infected", "cells", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ",", "infected", "with", "SA", "96", "h", "later", "(", "5", "h", ",", "moi", "=", "0", ".", "1", ")", "and", "lysed", "for", "CFU", "evaluation", ".", "The", "experiment", "was", "carried", "out", "three", "independent", "times", ".", "The", "right", "panel", "shows", "successful", "TMEM59", "depletion", "(", "anti", "‐", "TMEM59", "immunoprecipitation", "plus", "anti", "‐", "TMEM59", "WB", ")", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", ".", "(", "E", ")", "Depletion", "of", "TMEM59", "reduces", "recovery", "of", "SA", "from", "infected", "cells", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ",", "infected", "with", "SA", "96", "h", "later", "(", "5", "h", ",", "moi", "=", "0", ".", "1", ")", "and", "lysed", "for", "CFU", "evaluation", ".", "The", "experiment", "was", "carried", "out", "three", "independent", "times", ".", "The", "graph", "displays", "average", "CFU", "counts", "obtained", "for", "the", "10", "−", "1", "dilution", "of", "the", "relevant", "extracts", ",", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "the", "three", "data", "sets", ".", "Asterisks", "indicate", "significant", "differences", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "paired", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A) The right panel shows successful TMEM59 depletion (rabbit anti‐TMEM59immunoprecipitation plus chicken anti‐TMEM59WB).(A) Depletion of TMEM59 inhibits LC3II generation by SA at early infection times. HeLa cells were transfected with the indicated siRNAs and, 48 h later, infected with the bacteria (SA) for the shown times before lysing them for western blotting against the indicated molecules. The right panel shows successful TMEM59 depletion (rabbit anti‐TMEM59 immunoprecipitation plus chicken anti‐TMEM59 WB).(B) Colocalization events between bacteria (GFP labelled), TMEM59-HA and Cherry-LC3A in infected cells. HeLa cells stably expressing TMEM59-HA and Cherry-LC3A were infected for the indicated times (moi=10), and processed for anti‐HA immunofluorescence. Representative confocal images are shown. The GFP, anti‐HA (Cy5) and DAPI signals were pseudocolored in blue, green and white, respectively. Asterisks indicate overlay images: (*), Cherry-LC3A/TMEM59; (**), Cherry-LC3A/TMEM59/bacteria; (***), Cherry-LC3A/TMEM59/bacteria/DAPI.(C) Colocalization between bacteria, TMEM59-HA and Cherry-ATG16L1. HeLa cells stably expressing TMEM59-HA and Cherry-ATG16L1 were infected with SA (2 h, moi=10), and processed for anti‐HA immunofluorescence. Shown are confocal pictures displaying two representative examples. Asterisks indicate overlays as in B.(D) SA promotes co‐precipitation of endogenous ATG16L1 with endogenous TMEM59. HeLa cells were infected with SA (2 h, moi=10), lysed and subjected to immunoprecipitation with anti‐TMEM59 antibodies or irrelevant protein G beads (as indicated). Immunoprecipitates were processed for western blotting. The right panel shows control WBs of the lysates used for immunoprecipitation.(E) Depletion of TMEM59 reduces recovery of SA from infected cells. HeLa cells were transfected with the indicated siRNAs, infected with SA 96 h later (5 h, moi=0.1) and lysed for CFU evaluation. The experiment was carried out three independent times. The right panel shows successful TMEM59 depletion (anti‐TMEM59 immunoprecipitation plus anti‐TMEM59 WB).Source data for this figure is available on the online supplementary information page.(E) Depletion of TMEM59 reduces recovery of SA from infected cells. HeLa cells were transfected with the indicated siRNAs, infected with SA 96 h later (5 h, moi=0.1) and lysed for CFU evaluation. The experiment was carried out three independent times. The graph displays average CFU counts obtained for the 10−1 dilution of the relevant extracts, ±s.d. of the three data sets. Asterisks indicate significant differences (P<0.01, paired Student's t‐test)."}
{"words": ["Figure", "2Evaluation", "of", "expression", "by", "RNA", "-", "Seq", "and", "number", "of", "peptides", "required", "to", "detect", "an", "annotated", "protein", "by", "MS", "in", "M", ".", "pneumoniae", ".", "The", "plot", "represents", "the", "relationship", "between", "expression", "levels", "(", "average", "expression", "from", "RNA", "-", "Seq", "data", ")", "and", "number", "of", "possible", "unique", "tryptic", "peptides", "(", "UTPs", ")", "for", "two", "sets", "of", "studied", "proteins", ":", "detected", "(", "blue", "dots", ")", "and", "not", "detected", "(", "orange", "dots", ")", "by", "MS", ".", "B", ")", "Evaluation", "of", "thresholds", "and", "artefactual", "signals", "in", "MS", "data", ".", "The", "histogram", "represents", "the", "total", "number", "of", "SEP", "proteins", "detected", "in", "116", "shotgun", "MS", "experiments", "with", "1", "UTP", ",", "1", "UTP", "and", "1NUTP", ",", "or", "≥", "2", "UTPs", "for", "three", "categories", ".", "Color", "code", ":", "annotated", "(", "blue", "bars", ")", ",", "putative", "new", "(", "orange", "bars", ")", ",", "and", "decoy", "set", "(", "gray", "bars", ")", ".", "C", ")", "Number", "of", "SEPs", "detected", "by", "increasing", "the", "number", "of", "experiments", ".", "Color", "code", "is", "the", "same", "as", "in", "panels", "B", ".", "Each", "line", "represents", "the", "accumulated", "number", "of", "different", "SEPs", "detected", "(", "Y", "-", "axis", ")", "when", "combining", "1", "to", "116", "MS", "datasets", "(", "X", "-", "axis", ")", "from", "M", ".", "pneumoniae", ".", "Each", "line", "has", "an", "associated", "error", "that", "is", "shaded", "and", "represents", "the", "standard", "deviation", "within", "combinations", "of", "datasets", "(", "e", ".", "g", ".", ",", "x", "=", "80", "will", "present", "the", "average", "number", "of", "proteins", "detected", "taking", "every", "combination", "of", "datasets", "in", "groups", "of", "80", "samples", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Evaluation of expression by RNA-Seq and number of peptides required to detect an annotated protein by MS in M. pneumoniae. The plot represents the relationship between expression levels (average expression from RNA-Seq data) and number of possible unique tryptic peptides (UTPs) for two sets of studied proteins: detected (blue dots) and not detected (orange dots) by MS. B) Evaluation of thresholds and artefactual signals in MS data. The histogram represents the total number of SEP proteins detected in 116 shotgun MS experiments with 1 UTP, 1 UTP and 1NUTP, or ≥2 UTPs for three categories. Color code: annotated (blue bars), putative new (orange bars), and decoy set (gray bars). C) Number of SEPs detected by increasing the number of experiments. Color code is the same as in panels B. Each line represents the accumulated number of different SEPs detected (Y-axis) when combining 1 to 116 MS datasets (X-axis) from M. pneumoniae. Each line has an associated error that is shaded and represents the standard deviation within combinations of datasets (e.g., x=80 will present the average number of proteins detected taking every combination of datasets in groups of 80 samples)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "PolyP", "accumulation", "in", "vivo", ".", "The", "polyP", "content", "of", "wild", "-", "type", "cells", "was", "set", "to", "100", "%", ".", "Knockout", "of", "Vtc1", ",", "Vtc2", ",", "Vtc3", "or", "Vtc4", "impacts", "cellular", "polyP", "levels", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "biological", "replicates", "n", "=", "3", ")", ".", "PolyP", "synthesis", "curves", "of", "purified", "endogenous", "Vtc4", "/", "Vtc3", "/", "Vtc1", "and", "Vtc4", "/", "Vtc2", "/", "Vtc1", "complexes", "at", "different", "ATP", "concentrations", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "10", "mM", "InsP6", "in", "vitro", ".", "PolyP", "synthesis", "by", "isolated", "vacuoles", "carrying", "VTC", "complexes", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "1", "µM", "5", "-", "InsP7", "in", "vitro", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) PolyP accumulation in vivo. The polyP content of wild-type cells was set to 100%. Knockout of Vtc1, Vtc2, Vtc3 or Vtc4 impacts cellular polyP levels. Data show the mean±s.d (biological replicates n=3).PolyP synthesis curves of purified endogenous Vtc4/Vtc3/Vtc1 and Vtc4/Vtc2/Vtc1 complexes at different ATP concentrations in the absence or presence of 10 mM InsP6 in vitro.PolyP synthesis by isolated vacuoles carrying VTC complexes in the absence or presence of 1 µM 5-InsP7 in vitro."}
{"words": ["Figure", "3Profile", "of", "the", "pore", "radius", "of", "the", "Vtc4", "/", "Vtc3", "/", "Vtc1", "complex", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Profile of the pore radius of the Vtc4/Vtc3/Vtc1 complex."}
{"words": ["Figure", "4Cellular", "polyP", "content", "of", "Vtc4p", "point", "mutants", "expressed", "under", "the", "control", "of", "their", "native", "promoters", "in", "the", "vtc4Δ", "background", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "biological", "replicates", "n", "=", "3", ")", ".", "Cellular", "polyP", "content", "of", "VTC4", "and", "VTC3", "point", "mutants", "expressed", "under", "the", "control", "of", "their", "native", "promoters", "in", "the", "vtc4Δ", "and", "vtc3Δ", "(", "vtc2Δ", ")", "backgrounds", ",", "respectively", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "biological", "replicates", "n", "=", "3", ")", ".", "Cellular", "polyP", "content", "of", "VTC4", "point", "mutants", "expressed", "under", "the", "control", "of", "their", "native", "promoters", "in", "the", "vtc4Δ", "backgrounds", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "biological", "replicates", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Cellular polyP content of Vtc4p point mutants expressed under the control of their native promoters in the vtc4Δ background. Data show the mean±s.d (biological replicates n=3).Cellular polyP content of VTC4 and VTC3 point mutants expressed under the control of their native promoters in the vtc4Δ and vtc3Δ(vtc2Δ) backgrounds, respectively. Data show the mean±s.d (biological replicates n=3).Cellular polyP content of VTC4 point mutants expressed under the control of their native promoters in the vtc4Δ backgrounds. Data show the mean±s.d (biological replicates n=3)."}
{"words": ["Figure", "5PolyP", "synthesis", "by", "isolated", "vacuoles", "carrying", "Vtc4", "(", "ΔSPX", ")", "/", "Vtc3", "/", "Vtc1", "complex", ",", "Vtc4", "/", "Vtc3", "(", "ΔSPX", ")", "/", "Vtc1", "complex", "or", "Vtc4", "/", "Vtc3", "/", "Vtc1", "complex", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "1", "μM", "5", "-", "InsP7", "or", "1", ",", "5", "-", "InsP8", "in", "vitro", ".", "The", "reaction", "system", "is", "detailed", "in", "Methods", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "biological", "replicates", "n", "=", "3", ")", ".", "PolyP", "synthesis", "by", "isolated", "vacuoles", "carrying", "Vtc4", "/", "Vtc3", "(", "R223E", ")", "/", "Vtc1", "complex", ",", "Vtc4", "/", "Vtc3", "(", "R226E", ")", "/", "Vtc1", "complex", "or", "Vtc4", "/", "Vtc3", "/", "Vtc1", "complex", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "1", "μM", "5", "-", "InsP7", "or", "1", ",", "5", "-", "InsP8", "in", "vitro", ".", "The", "reaction", "system", "is", "detailed", "in", "Methods", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "biological", "replicates", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5PolyP synthesis by isolated vacuoles carrying Vtc4(ΔSPX)/Vtc3/Vtc1 complex, Vtc4/Vtc3(ΔSPX)/Vtc1 complex or Vtc4/Vtc3/Vtc1 complex in the absence or presence of 1 μM 5-InsP7 or 1,5-InsP8 in vitro. The reaction system is detailed in Methods. Data show the mean±s.d (biological replicates n=3).PolyP synthesis by isolated vacuoles carrying Vtc4/Vtc3(R223E)/Vtc1 complex, Vtc4/Vtc3(R226E)/Vtc1 complex or Vtc4/Vtc3/Vtc1 complex in the absence or presence of 1 μM 5-InsP7 or 1,5-InsP8 in vitro. The reaction system is detailed in Methods. Data show the mean±s.d (biological replicates n=3)."}
{"words": ["Figure", "6PolyP", "synthesis", "curves", "of", "purified", "endogenous", "Vtc4", "/", "Vtc3", "/", "Vtc1", "and", "truncated", "Vtc4", "/", "Vtc3", "(", "Δlp", ")", "/", "Vtc1", "complexes", "at", "different", "ATP", "concentrations", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "10", "mM", "InsP6", "in", "vitro", ".", "The", "reaction", "system", "is", "detailed", "in", "Methods", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "biological", "replicates", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "PolyP", "synthesis", "by", "isolated", "vacuoles", "carrying", "Vtc4", "/", "Vtc3", "(", "CL2", "-", "Ala6", ")", "/", "Vtc1", "complex", ",", "Vtc4", "/", "Vtc3", "(", "CL2", "-", "Asp6", ")", "/", "Vtc1", "complex", "or", "Vtc4", "/", "Vtc3", "/", "Vtc1", "complex", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "1", "μM", "5", "-", "InsP7", "or", "1", ",", "5", "-", "InsP8", "in", "vitro", ".", "The", "reaction", "system", "is", "detailed", "in", "Methods", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "biological", "replicates", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6PolyP synthesis curves of purified endogenous Vtc4/Vtc3/Vtc1 and truncated Vtc4/Vtc3(Δlp)/Vtc1 complexes at different ATP concentrations in the absence or presence of 10 mM InsP6 in vitro. The reaction system is detailed in Methods. Data show the mean±s.d (biological replicates n=3). (D) PolyP synthesis by isolated vacuoles carrying Vtc4/Vtc3(CL2-Ala6)/Vtc1 complex, Vtc4/Vtc3(CL2-Asp6)/Vtc1 complex or Vtc4/Vtc3/Vtc1 complex in the absence or presence of 1 μM 5-InsP7 or 1,5-InsP8 in vitro. The reaction system is detailed in Methods. Data show the mean±s.d (biological replicates n=3)."}
{"words": ["Figure", "7Cellular", "polyP", "content", "of", "VTC4", ",", "VTC3", "and", "VTC1", "point", "mutants", "expressed", "under", "the", "control", "of", "their", "native", "promoters", "in", "the", "vtc4Δ", ",", "vtc3Δ", "(", "vtc2Δ", ")", "and", "vtc1Δ", "backgrounds", ",", "respectively", ".", "Δ", "indicates", "that", "the", "entire", "subunit", "was", "knocked", "out", ".", "FL", "indicates", "full", "length", ",", "indicating", "that", "the", "subunit", "has", "not", "been", "modified", "in", "any", "way", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "biological", "replicates", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Cellular polyP content of VTC4, VTC3 and VTC1 point mutants expressed under the control of their native promoters in the vtc4Δ, vtc3Δ(vtc2Δ) and vtc1Δ backgrounds, respectively. Δ indicates that the entire subunit was knocked out. FL indicates full length, indicating that the subunit has not been modified in any way. Data show the mean±s.d (biological replicates n=3)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "HeLa", "cells", "transiently", "transfected", "with", "GST", "-", "GFP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "and", "immunostained", "with", "PRC1", "and", "CENP", "-", "C", ",", "scale", "bar", "10μm", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "E", ")", "Top", ",", "Representative", "images", "of", "live", "HeLa", "cells", "in", "cytokinesis", "transiently", "transfected", "with", "GFP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "and", "mutants", "(", "green", ")", ",", "incubated", "with", "SiR", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "Bottom", ",", "linescans", "showing", "the", "fluorescence", "intensity", "average", "and", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", "for", "the", "GFP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "and", "mutants", "and", "tubulin", "across", "the", "cell", "midbody", ".", "For", "GFP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", ",", "n", "is", "the", "number", "of", "cells", ".", "n", "=", "11", "and", "for", "the", "GFP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "mutants", "FDN2661LTT", ",", "YF2660AA", ",", "FF2644AA", ",", "n", "=", "15", ",", "16", "and", "25", "respectively", ".", "Biological", "independent", "replicates", "were", "respectively", "2", ",", "3", ",", "2", "and", "1", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Representative images of HeLa cells transiently transfected with GST-GFP-CENP-E2605-2701 and immunostained with PRC1 and CENP-C, scale bar 10μm (n=4).(E) Top, Representative images of live HeLa cells in cytokinesis transiently transfected with GFP-CENP-E2605-2701 and mutants (green), incubated with SiR-tubulin (red). Scale bar, 10μm. Bottom, linescans showing the fluorescence intensity average and standard error of the mean (SEM) for the GFP-CENP-E2605-2701 and mutants and tubulin across the cell midbody. For GFP-CENP-E2605-2701, n is the number of cells. n=11 and for the GFP-CENP-E2605-2701 mutants FDN2661LTT, YF2660AA, FF2644AA, n= 15, 16 and 25 respectively. Biological independent replicates were respectively 2, 3, 2 and 1."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Top", ".", "Size", "-", "exclusion", "chromatography", "elution", "profile", "of", "MBP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "(", "green", ")", ",", "PRC11", "-", "168", "(", "pink", ")", "and", "MBP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "/", "PRC11", "-", "168", "(", "orange", ")", ".", "Bottom", ",", "Coomassie", "-", "stained", "gel", "showing", "the", "size", "-", "exclusion", "chromatography", "profile", "of", "PRC11", "-", "168", "(", "pink", ")", ",", "MBP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "(", "green", ")", "and", "MBP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "/", "PRC11", "-", "168", "(", "orange", ")", ".", "A", "shift", "in", "the", "elution", "volume", "was", "only", "seen", "in", "the", "presence", "of", "both", "CENP", "-", "E", "and", "PRC1", ".", "(", "B", ")", "Top", ".", "Size", "-", "exclusion", "chromatography", "elution", "profile", "of", "MBP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701FDN", "(", "green", ")", "and", "MBP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "FDN", "/", "PRC11", "-", "168", "(", "orange", ")", ".", "Bottom", ",", "Coomassie", "-", "stained", "gel", "showing", "the", "size", "-", "exclusion", "chromatography", "profile", "of", "MBP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701FDN", "(", "green", ")", "and", "MBP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "FDN", "/", "PRC11", "-", "168", "(", "orange", ")", ".", "No", "shift", "in", "the", "elution", "profile", "was", "observed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Top. Size-exclusion chromatography elution profile of MBP-CENP-E2605-2701 (green), PRC11-168 (pink) and MBP-CENP-E2605-2701/PRC11-168 (orange). Bottom, Coomassie-stained gel showing the size-exclusion chromatography profile of PRC11-168 (pink), MBP-CENP-E2605-2701 (green) and MBP-CENP-E2605-2701/PRC11-168 (orange). A shift in the elution volume was only seen in the presence of both CENP-E and PRC1. (B) Top. Size-exclusion chromatography elution profile of MBP-CENP-E2605-2701FDN (green) and MBP-CENP-E2605-2701 FDN/PRC11-168 (orange). Bottom, Coomassie-stained gel showing the size-exclusion chromatography profile of MBP-CENP-E2605-2701FDN (green) and MBP-CENP-E2605-2701 FDN/PRC11-168 (orange). No shift in the elution profile was observed."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "live", "HeLa", "cells", "in", "mitosis", "transiently", "transfected", "with", "either", "GFP", "-", "Kif4A1133", "-", "1165", "or", "GFP", "-", "Kif4A1133", "-", "1232", "incubated", "with", "SiR", "-", "Tubulin", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "Quantification", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "Kif4A1133", "-", "1165", "(", "n", "=", "12", ")", "or", "GFP", "-", "Kif4A1133", "-", "1232", "(", "n", "=", "13", ")", "localization", "to", "the", "central", "spindle", ".", "Data", "represented", "from", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "A", "shift", "in", "the", "elution", "volume", "was", "only", "seen", "in", "the", "presence", "of", "both", "Kif4A", "and", "PRC1", ".", "Size", "-", "exclusion", "chromatography", "elution", "profile", "of", "GST", "-", "Kif4A1133", "-", "1232", "(", "green", ")", "and", "PRC11", "-", "168", "(", "pink", ")", ",", "or", "together", "(", "orange", ")", ".", "Bottom", ",", "Coomassie", "-", "stained", "gel", "showing", "the", "size", "-", "exclusion", "chromatography", "profile", "of", "GST", "-", "Kif4A1133", "-", "1232", "(", "green", ")", ",", "PRC11", "-", "168", "(", "pink", ")", "and", "GST", "-", "Kif4A1133", "-", "1232", "/", "PRC11", "-", "168", "(", "orange", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Representative images of live HeLa cells in mitosis transiently transfected with either GFP-Kif4A1133-1165 or GFP-Kif4A1133-1232 incubated with SiR-Tubulin. Scale bar, 10μm. Quantification of cells with GFP-Kif4A1133-1165 (n=12) or GFP-Kif4A1133-1232 (n=13) localization to the central spindle. Data represented from 2 independent experiments.(C) A shift in the elution volume was only seen in the presence of both Kif4A and PRC1. Size-exclusion chromatography elution profile of GST-Kif4A1133-1232 (green) and PRC11-168 (pink), or together (orange). Bottom, Coomassie-stained gel showing the size-exclusion chromatography profile of GST-Kif4A1133-1232 (green), PRC11-168(pink) and GST-Kif4A1133-1232/PRC11-168 (orange)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "GFP", "-", "PRC1", "(", "magenta", ")", "mixed", "with", "rhodamine", "-", "microtubules", ".", "Fire", "blue", "-", "green", "intensity", "LUT", "used", "to", "show", "tubulin", "intensity", "and", "microtubule", "overlaps", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "647GST", "-", "CENP", "-", "E2639", "-", "2671", "(", "yellow", ")", "mixed", "with", "rhodamine", "-", "microtubules", ".", "(", "D", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "stained", "for", "DNA", ",", "microtubules", ",", "PRC1", "and", "with", "Alexa647", "-", "labelled", "GST", "-", "CENP", "-", "E2639", "-", "2671", "showing", "it", "also", "recognizes", "PRC1", "in", "cells", ".", "Experiments", "were", "repeated", ">", "3", "times", ".", "(", "F", ")", "Representative", "kymograph", "showing", "microtubule", "-", "microtubule", "sliding", "in", "the", "presence", "of", "2", ".", "5", "nM", "PRC1", "and", "50", "nM", "full", "-", "length", "CENP", "-", "E", ".", "(", "G", ")", "Example", "kymograph", "showing", "a", "free", "microtubule", "sliding", "until", "reaching", "the", "end", "of", "the", "immobilized", "microtubule", "where", "it", "slows", "down", "to", "a", "stall", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative images of GFP-PRC1 (magenta) mixed with rhodamine-microtubules. Fire blue-green intensity LUT used to show tubulin intensity and microtubule overlaps. (B) Representative images of 647GST-CENP-E2639-2671 (yellow) mixed with rhodamine-microtubules.(D) Representative immunofluorescence images of HeLa cells stained for DNA, microtubules, PRC1 and with Alexa647-labelled GST-CENP-E2639-2671 showing it also recognizes PRC1 in cells. Experiments were repeated >3 times.(F) Representative kymograph showing microtubule-microtubule sliding in the presence of 2.5 nM PRC1 and 50 nM full-length CENP-E. (G) Example kymograph showing a free microtubule sliding until reaching the end of the immobilized microtubule where it slows down to a stall."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ")", "Live", "-", "cell", "imaging", "of", "metaphase", "spindles", "in", "HeLa", "cells", "transiently", "transfected", "wild", "-", "type", ",", "phosphomimetic", "and", "non", "-", "phosphorylatable", "mutants", "of", "GFP", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "(", "monomeric", ")", "and", "GFP", "-", "GST", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "(", "dimeric", ")", "and", "stained", "for", "tubulin", "using", "SiR", "-", "Tubulin", ".", "The", "fraction", "of", "cells", "localizing", "to", "the", "overlapping", "microtubules", "is", "represented", "as", "a", "percentage", ".", "Scalebar", ",", "10", "μm", ".", "(", "G", ")", "Bar", "graph", "showing", "mean", "and", "standard", "error", "for", "GFP", "fluorescence", "intensity", "at", "peak", "fluorescence", "for", "GFP", "-", "GST", "-", "CENP", "-", "E2605", "-", "2701", "and", "mutants", "at", "9", ".", "7μm", ",", "quantified", "in", "F", ".", "Asterisks", "indicate", "ordinary", "One", "-", "way", "Anova", "test", "significance", "value", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D) Live-cell imaging of metaphase spindles in HeLa cells transiently transfected wild-type, phosphomimetic and non-phosphorylatable mutants of GFP-CENP-E2605-2701 (monomeric) and GFP-GST-CENP-E2605-2701 (dimeric) and stained for tubulin using SiR-Tubulin. The fraction of cells localizing to the overlapping microtubules is represented as a percentage. Scalebar, 10 μm.(G) Bar graph showing mean and standard error for GFP fluorescence intensity at peak fluorescence for GFP-GST-CENP-E2605-2701 and mutants at 9.7μm, quantified in F. Asterisks indicate ordinary One-way Anova test significance value. ****P<0.0001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ",", "C", ")", "Elution", "profile", "from", "a", "size", "-", "exclusion", "chromatography", "(", "SEC", ",", "black", "line", ",", "left", "y", "-", "axis", ")", "run", "with", "subsequent", "multi", "-", "angle", "light", "scattering", "(", "MALS", ",", "right", "y", "-", "axis", ")", "analysis", "for", "PRC11", "-", "168", "and", "PRC11", "-", "168", "MEE", ".", "Outcome", "of", "the", "MALS", "analysis", "for", "the", "peak", "is", "presented", "in", "pink", "(", "molecular", "weight", ",", "right", "y", "-", "axis", ")", ".", "(", "D", ")", "Fire", "purple", "-", "yellow", "intensity", "LUT", "used", "to", "show", "tubulin", "intensity", "and", "microtubule", "overlaps", ".", "Microtubules", "are", "shown", "alone", "or", "incubated", "with", "2", ".", "5", "nM", "full", "-", "length", "PRC1", "WT", "or", "PRC1", "MEE", ".", "Scalebar", ",", "10", "μm", ".", "Experiment", "was", "replicated", "2", "times", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B, C) Elution profile from a size-exclusion chromatography (SEC, black line, left y-axis) run with subsequent multi-angle light scattering (MALS, right y-axis) analysis for PRC11-168 and PRC11-168 MEE. Outcome of the MALS analysis for the peak is presented in pink (molecular weight, right y-axis).(D) Fire purple-yellow intensity LUT used to show tubulin intensity and microtubule overlaps. Microtubules are shown alone or incubated with 2.5 nM full-length PRC1 WT or PRC1 MEE. Scalebar, 10 μm. Experiment was replicated 2 times."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "in", "late", "anaphase", "and", "telophase", ",", "expressing", "GFP", "-", "PRC1", "-", "WT", "or", "-", "MEE", "and", "depleted", "for", "endogenous", "PRC1", "using", "a", "PRC1", "siRNA", "and", "a", "PRC1", "sgRNA", "after", "doxycycline", "-", "induced", "Cas", "9", "expression", ".", "Microtubules", ",", "GFP", "and", "CENP", "-", "E", "are", "in", "white", ",", "green", "and", "red", "respectively", ".", "DNA", "is", "in", "blue", ".", "(", "B", ")", "Graph", "showing", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "a", "PRC1", "-", "localized", "at", "the", "site", "of", "abscission", "for", "cells", "treated", "in", "(", "A", ")", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "are", "presented", ",", "n", "=", "156", "and", "141", "for", "cells", "expressing", "PRC1", "-", "WT", "and", "-", "MEE", "respectively", ".", "Data", "from", "4", "biological", "replicates", "and", "1", "technical", "replicate", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "T", "-", "test", "significance", "value", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ")", "Graph", "showing", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "CENP", "-", "E", "localized", "at", "the", "abscission", "site", "for", "cells", "treated", "in", "(", "A", ")", ",", "mean", "and", "standard", "deviation", "are", "presented", ",", "n", "=", "58", "and", "66", "for", "cells", "expressing", "PRC1", "-", "WT", "and", "-", "MEE", "respectively", ".", "Data", "from", "2", "biological", "replicates", ".", "p", "-", "value", "(", "p", "=", "0", ".", "11", ")", "calculated", "for", "an", "unpaired", "T", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "Representative", "live", "-", "cell", "images", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "PRC1", "-", "WT", "or", "-", "MEE", "and", "depleted", "for", "endogenous", "PRC1", "using", "a", "PRC1", "siRNA", "and", "a", "PRC1", "sgRNA", "after", "doxycycline", "-", "induced", "Cas", "9", "expression", ".", "Microtubules", "(", "SiR", "-", "Tubulin", ")", "and", "DNA", "(", "SPY650", ")", "are", "shown", "in", "red", ".", "The", "cell", "membrane", "(", "CellMask", ")", "is", "highlighted", "in", "white", "and", "GFP", "-", "PRC1", "is", "in", "green", ".", "Scalebar", ",", "10", "μm", ".", "(", "J", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "GFP", "-", "PRC1", "-", "WT", "or", "-", "MEE", "after", "72", "hours", "siRNA", "depletion", "and", "doxycycline", "-", "induced", "knockout", "of", "endogenous", "PRC1", ".", "DNA", ",", "microtubules", "and", "GFP", "-", "PRC1", "/", "GFP", "-", "PRC1", "-", "MEE", "are", "in", "blue", ",", "red", "and", "green", "respectively", ".", "Scalebar", ",", "10μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Representative immunofluorescence images of HeLa cells in late anaphase and telophase, expressing GFP-PRC1-WT or -MEE and depleted for endogenous PRC1 using a PRC1 siRNA and a PRC1 sgRNA after doxycycline-induced Cas 9 expression. Microtubules, GFP and CENP-E are in white, green and red respectively. DNA is in blue. (B) Graph showing the percentage of cells with a PRC1-localized at the site of abscission for cells treated in (A). Mean and standard deviation are presented, n= 156 and 141 for cells expressing PRC1-WT and -MEE respectively. Data from 4 biological replicates and 1 technical replicate. Asterisks indicate a T-test significance value. ****P<0.0001. (C) Graph showing the percentage of cells with CENP-E localized at the abscission site for cells treated in (A), mean and standard deviation are presented, n= 58 and 66 for cells expressing PRC1-WT and -MEE respectively. Data from 2 biological replicates. p-value (p=0.11) calculated for an unpaired T-test.(G) Representative live-cell images of HeLa cells expressing GFP-PRC1-WT or -MEE and depleted for endogenous PRC1 using a PRC1 siRNA and a PRC1 sgRNA after doxycycline-induced Cas 9 expression. Microtubules (SiR-Tubulin) and DNA (SPY650) are shown in red. The cell membrane (CellMask) is highlighted in white and GFP-PRC1 is in green. Scalebar, 10 μm.(J) Representative immunofluorescence images of cells expressing GFP-PRC1-WT or -MEE after 72 hours siRNA depletion and doxycycline-induced knockout of endogenous PRC1. DNA, microtubules and GFP-PRC1/GFP-PRC1-MEE are in blue, red and green respectively. Scalebar, 10μm."}
{"words": ["Figure", "1G", ".", "Endogenous", "MITOL", "enhances", "the", "K48", "-", "polyubiquitin", "chains", "of", "Parkin", ".", "WT", "or", "MITOL", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "Parkin", "were", "treated", "with", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "for", "indicated", "time", ".", "MG132", "(", "30", "μM", ")", "was", "added", "3", "h", "after", "CCCP", "treatment", ".", "Lysates", "of", "cells", "were", "fractionated", "into", "cytosolic", ",", "mitochondrial", "and", "ER", "fractions", ",", "and", "then", "subjected", "to", "an", "IP", "-", "IB", "assay", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "K48", "-", "polyubiquitin", "chains", "were", "immunoblotted", "with", "K48", "-", "specific", "ubiquitin", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1G. Endogenous MITOL enhances the K48-polyubiquitin chains of Parkin. WT or MITOL KO HeLa cells stably expressing HA-Parkin were treated with CCCP (10 µM) for indicated time. MG132 (30 μM) was added 3 h after CCCP treatment. Lysates of cells were fractionated into cytosolic, mitochondrial and ER fractions, and then subjected to an IP-IB assay with the indicated antibodies. K48-polyubiquitin chains were immunoblotted with K48-specific ubiquitin antibody."}
{"words": ["Figure", "2E", ".", "MITOL", "regulates", "mitophagy", ".", "MITOL", "WT", "HeLa", "cells", ",", "MITOL", "KO", "HeLa", "cells", "and", "KO", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "MITOL", "WT", "plasmids", "0", ".", "5µg", "(", "+", ")", "and", "5µg", "(", "+", "+", ")", "stably", "expressing", "HA", "‐", "Parkin", "and", "mt", "‐", "Keima", "were", "treated", "with", "CCCP", "(", "10µM", ")", "for", "8h", ".", "Then", ",", "mKeima", "was", "measured", "at", "488", "(", "pH", "7", ")", "and", "561", "(", "pH", "4", ")", "nm", "lasers", "using", "Flow", "Cytometer", ".", "Percentages", "of", "mitophagy", "were", "calculated", "from", "30", ",", "000", "cells", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "For", "statistical", "analysis", ",", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "test", "was", "performed", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2E. MITOL regulates mitophagy. MITOL WT HeLa cells, MITOL KO HeLa cells and KO HeLa cells transfected with MITOL WT plasmids 0.5µg (+) and 5µg (++) stably expressing HA‐Parkin and mt‐Keima were treated with CCCP (10µM) for 8h. Then, mKeima was measured at 488 (pH 7) and 561 (pH 4) nm lasers using Flow Cytometer. Percentages of mitophagy were calculated from 30,000 cells in each independent experiment. Data represent the mean ± SD of three independent experiments. For statistical analysis, a one-way ANOVA with Tukey post-test was performed, **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "Endogenous", "MITOL", "translocates", "to", "the", "ER", "in", "later", "phase", "of", "mitophagy", ".", "EGFP", "-", "MITOL", "knock", "in", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "HA", "-", "Parkin", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "as", "indicated", "times", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Colocalization", "was", "quantified", "by", "Manders", "'", "s", "coefficient", ".", "Means", "±", "SEM", "of", "more", "than", "10", "cells", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "For", "statistical", "analysis", ",", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "were", "performed", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", "represents", "1", "μm", ".", "E", ".", "ER", "-", "localized", "MITOL", "is", "transported", "from", "the", "mitochondria", ",", "and", "is", "not", "newly", "synthesized", "protein", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "Parkin", "were", "co", "-", "transfected", "with", "vectors", "for", "MITOL", "-", "KikGR", "and", "FLAG", "-", "FKBP38", ".", "After", "ultraviolet", "light", "(", "365", "nm", ")", "exposure", "to", "the", "whole", "plate", ",", "cells", "were", "incubated", "with", "or", "without", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "for", "indicated", "time", ",", "and", "monitored", "for", "red", "and", "green", "KikGR", "fluorescence", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Higher", "magnification", "images", "of", "the", "boxed", "regions", "are", "shown", "in", "the", "small", "panel", ".", "Right", "panel", "is", "schematic", "experimental", "model", "for", "KikGR", "in", "this", "study", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. Endogenous MITOL translocates to the ER in later phase of mitophagy. EGFP-MITOL knock in HeLa cells were transfected with HA-Parkin and treated with DMSO or CCCP (10 µM) as indicated times. Cells were fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with the indicated antibodies. Colocalization was quantified by Manders's coefficient. Means ± SEM of more than 10 cells obtained from three independent experiments. For statistical analysis, a one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test were performed, ****P < 0.0001. Scale bar represents 1 μm.E. ER-localized MITOL is transported from the mitochondria, and is not newly synthesized protein. HeLa cells stably expressing HA-Parkin were co-transfected with vectors for MITOL-KikGR and FLAG-FKBP38. After ultraviolet light (365 nm) exposure to the whole plate, cells were incubated with or without CCCP (10 µM) for indicated time, and monitored for red and green KikGR fluorescence. Scale bar, 10 μm. Higher magnification images of the boxed regions are shown in the small panel. Right panel is schematic experimental model for KikGR in this study."}
{"words": ["Figure", "4C", ".", "Phosphorylated", "Parkin", "accumulates", "in", "the", "ER", "fraction", "in", "the", "absence", "of", "MITOL", ".", "WT", "or", "MITOL", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "Parkin", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "for", "48", "h", ".", "Lysates", "of", "cells", "were", "fractionated", "into", "cytosolic", ",", "mitochondrial", "and", "ER", "fractions", ",", "and", "then", "subjected", "to", "an", "IB", "assay", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Phospho", "-", "Ser65", "-", "Parkin", "is", "detected", "by", "using", "specific", "antibody", ".", "Right", "panels", "are", "the", "quantification", "of", "IB", "about", "Phospho", "-", "Ser65", "-", "Parkin", "protein", "levels", "of", "the", "ER", "fraction", ".", "The", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "For", "statistical", "analysis", ",", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "test", "was", "performed", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "D", ".", "Parkin", "is", "detected", "at", "the", "ER", "in", "the", "absence", "of", "MITOL", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "vectors", "for", "KikGR", "-", "Parkin", ".", "After", "ultraviolet", "light", "(", "365", "nm", ")", "exposure", "to", "the", "whole", "plate", ",", "cells", "were", "incubated", "with", "or", "without", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "for", "indicated", "time", ",", "and", "monitored", "for", "red", "and", "green", "KikGR", "fluorescence", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Higher", "magnification", "images", "of", "the", "boxed", "regions", "are", "shown", "in", "the", "small", "panel", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C. Phosphorylated Parkin accumulates in the ER fraction in the absence of MITOL. WT or MITOL KO HeLa cells stably expressing HA-Parkin were treated with DMSO or CCCP (10 µM) for 48 h. Lysates of cells were fractionated into cytosolic, mitochondrial and ER fractions, and then subjected to an IB assay with the indicated antibodies. Phospho-Ser65-Parkin is detected by using specific antibody. Right panels are the quantification of IB about Phospho-Ser65-Parkin protein levels of the ER fraction. The data represent the mean ± SD for three independent experiments. For statistical analysis, a one-way ANOVA with Tukey post-test was performed, **P < 0.01.D. Parkin is detected at the ER in the absence of MITOL. HeLa cells were transfected with vectors for KikGR-Parkin. After ultraviolet light (365 nm) exposure to the whole plate, cells were incubated with or without CCCP (10 µM) for indicated time, and monitored for red and green KikGR fluorescence. Scale bar, 10 μm. Higher magnification images of the boxed regions are shown in the small panel."}
{"words": ["Figure", "5D", ".", "MITOL", "KO", "increases", "degradation", "of", "ER", "targeting", "FKBP38", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "Parkin", "were", "transfected", "with", "mitochondrial", "targeting", "FLAG", "-", "FKBP38", "(", "FKBP38ActA", ")", "and", "ER", "targeting", "FLAG", "-", "FKBP38", "(", "FKBP38IYFFT", ")", ",", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "for", "24", "h", ".", "Lysates", "of", "cells", "were", "subjected", "to", "an", "IB", "assay", "with", "FLAG", "antibodies", "for", "organelle", "targeting", "FKBP38", "or", "indicated", "antibodies", ".", "Another", "cell", "lysates", "were", "subsequently", "separated", "on", "a", "Phos", "-", "tag", "gel", ",", "followed", "by", "IB", "with", "anti", "-", "Parkin", "antibodies", "(", "Phos", "-", "tag", ")", ".", "E", "-", "G", ".", "MITOL", "partly", "prevents", "CCCP", "-", "induced", "cell", "death", "by", "reducing", "Parkin", "-", "mediated", "degradation", "of", "FKBP38", ".", "WT", "or", "MITOL", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "Parkin", "and", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "vectors", ",", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "for", "counting", "the", "percentage", "of", "dead", "cells", "using", "fluorescence", "microscopy", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "independent", "experiments", "(", ">", "100", "individual", "cells", "were", "counted", ")", ".", "For", "statistical", "analysis", ",", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "test", "was", "performed", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "KR", ",", "FKBP38", "K271", "/", "273R", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5D. MITOL KO increases degradation of ER targeting FKBP38. HeLa cells stably expressing HA-Parkin were transfected with mitochondrial targeting FLAG-FKBP38 (FKBP38ActA) and ER targeting FLAG-FKBP38 (FKBP38IYFFT), and treated with DMSO or CCCP (10 µM) for 24 h. Lysates of cells were subjected to an IB assay with FLAG antibodies for organelle targeting FKBP38 or indicated antibodies. Another cell lysates were subsequently separated on a Phos-tag gel, followed by IB with anti-Parkin antibodies (Phos-tag).E-G. MITOL partly prevents CCCP-induced cell death by reducing Parkin-mediated degradation of FKBP38. WT or MITOL KO HeLa cells stably expressing HA-Parkin and HeLa cells were transfected with the indicated vectors, and treated with DMSO or CCCP (10 µM) for 24 h. Cells were stained with propidium iodide (PI) for counting the percentage of dead cells using fluorescence microscopy. Data represent the mean ± SD of five independent experiments (>100 individual cells were counted). For statistical analysis, a one-way ANOVA with Tukey post-test was performed, **P < 0.01. KR, FKBP38 K271/273R."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Mislocalization", "of", "Bcl", "-", "2", "is", "observed", "in", "MITOL", "KO", "cells", "in", "mitophagy", ".", "WT", "or", "MITOL", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "Parkin", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "Bcl2", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cells", "were", "immunostained", "with", "indicated", "antibody", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "μm", ".", "B", ".", "MITOL", "prevents", "caspase", "-", "dependent", "cell", "death", "in", "mitophagy", ".", "WT", "or", "MITOL", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "Parkin", "and", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "with", "or", "without", "Z", "-", "VAD", "-", "FMK", "(", "10", "μM", ")", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "for", "counting", "fluorescence", "microscopy", "of", "the", "percentage", "of", "dead", "cells", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "(", ">", "100", "individual", "cells", "were", "counted", ")", ".", "For", "statistical", "analysis", ",", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "test", "was", "performed", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "C", ".", "Cell", "death", "in", "mitophagy", "caused", "by", "MITOL", "deficiency", "depends", "on", "calcium", "leak", ".", "WT", "and", "MITOL", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "Parkin", "or", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "CCCP", "(", "10", "µM", ")", "with", "or", "without", "BAPTA", "-", "AM", "(", "10", "μM", ")", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "for", "counting", "fluorescence", "microscopy", "of", "the", "percentage", "of", "dead", "cells", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "(", ">", "100", "individual", "cells", "were", "counted", ")", ".", "For", "statistical", "analysis", ",", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "test", "was", "performed", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Mislocalization of Bcl-2 is observed in MITOL KO cells in mitophagy. WT or MITOL KO HeLa cells stably expressing HA-Parkin were transfected with FLAG-Bcl2 and treated with DMSO or CCCP (10 µM) for the indicated times. Cells were immunostained with indicated antibody. Scale bar, 1 μm.B. MITOL prevents caspase-dependent cell death in mitophagy. WT or MITOL KO HeLa cells stably expressing HA-Parkin and HeLa cells were treated with DMSO or CCCP (10 µM) with or without Z-VAD-FMK (10 μM) for 24 h. Cells were stained with propidium iodide (PI) for counting fluorescence microscopy of the percentage of dead cells. Data represent the mean ± SD of three independent experiments (>100 individual cells were counted). For statistical analysis, a one-way ANOVA with Tukey post-test was performed, **P < 0.01. C. Cell death in mitophagy caused by MITOL deficiency depends on calcium leak. WT and MITOL KO HeLa cells stably expressing HA-Parkin or HeLa cells were treated with DMSO or CCCP (10 µM) with or without BAPTA-AM (10 μM) for 24 h. Cells were stained with propidium iodide (PI) for counting fluorescence microscopy of the percentage of dead cells. Data represent the mean ± SD of three independent experiments (>100 individual cells were counted). For statistical analysis, a one-way ANOVA with Tukey post-test was performed, **P < 0.01. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "E", ")", "Northern", "blot", "analysis", "of", "circBtnl1", "in", "different", "tissues", "of", "two", "-", "month", "-", "old", "mice", ",", "18S", "RNA", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "F", "，", "G", ")", "RNA", "fluorescence", "in", "situ", "hybridization", "of", "circBtnl1", "in", "small", "intestine", "tissues", "(", "F", ")", "and", "organoid", "(", "G", ")", ".", "Green", "region", "shows", "the", "distribution", "of", "circBtnl1", "using", "antisense", "probe", ",", "gray", "region", "shows", "the", "nuclei", "staining", "by", "DAPI", ".", "For", "(", "F", ")", "，", "scale", "bars", "，", "5um", ";", "for", "(", "G", ")", "，", "scale", "bars", "，", "20", "um", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(E) Northern blot analysis of circBtnl1 in different tissues of two-month-old mice, 18S RNA served as a loading control.(F， G) RNA fluorescence in situ hybridization of circBtnl1 in small intestine tissues (F) and organoid (G). Green region shows the distribution of circBtnl1 using antisense probe, gray region shows the nuclei staining by DAPI. For (F)，scale bars，5um; for (G)，scale bars，20 um."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "Ki67", "staining", "of", "in", "small", "intestinal", "tissues", "from", "circBtnl1", "+", "/", "+", "and", "circBtnl1", "-", "/", "-", "mice", ".", "For", "all", "representative", "images", ",", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "were", "performed", "with", "similar", "results", ".", "For", "every", "microscope", "field", ",", "average", "Ki67", "+", "ISC", "numbers", "per", "crypt", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "in", "right", "panel", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "E", ")", "H", "&", "E", "staining", "of", "small", "intestine", "tissues", "from", "indicated", "mice", "at", "different", "time", "points", "(", "D0", "-", "D7", ")", "after", "8", "Gy", "radiation", "damage", ".", "Number", "of", "crypts", "were", "calculated", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "in", "right", "panel", ".", "n", "=", "5", "fields", "were", "calculated", "for", "each", "group", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "G", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "ISCs", "makers", "Olmf4", "in", "organoids", "from", "circBtnl1", "+", "/", "+", "and", "circBtnl1", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "30", "μm", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "with", "similar", "results", ",", "and", "representative", "experiments", "are", "shown", ".", "For", "every", "microscope", "field", ",", "average", "Olmf4", "+", "ISC", "numbers", "per", "crypt", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "in", "right", "panel", "in", "right", "panel", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Representative images of Ki67 staining of in small intestinal tissues from circBtnl1+/+ and circBtnl1-/- mice. For all representative images, at least three independent experiments were performed with similar results. For every microscope field, average Ki67+ ISC numbers per crypt are shown as means ± SD. **P < 0.01 by two-tailed Student's t-test in right panel. Scale bar, 50 μm.(E) H&E staining of small intestine tissues from indicated mice at different time points (D0 - D7) after 8 Gy radiation damage. Number of crypts were calculated as means ± SD. **P < 0.01 by two-tailed Student's t-test in right panel. n = 5 fields were calculated for each group. Scale bar, 50 μm.(G) Confocal microscopy of ISCs makers Olmf4 in organoids from circBtnl1+/+ and circBtnl1-/- mice. Scale bars, 30 μm. Three independent experiments were performed with similar results, and representative experiments are shown. For every microscope field, average Olmf4+ ISC numbers per crypt are shown as means ± SD. **P < 0.01 by two-tailed Student's t-test in right panel in right panel."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ",", "C", ")", "CircBtnl1", "was", "co", "-", "localized", "with", "Ddx3y", "protein", "in", "small", "intestine", "tissue", "(", "B", ")", "and", "organoid", "(", "C", ")", "by", "RNA", "FISH", ",", "followed", "by", "immunofluorescence", "staining", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "(", "G", ")", "Electrophoretic", "mobility", "shift", "assay", "(", "EMSA", ")", "using", "biotin", "-", "labeled", "circBtnl1", "and", "recombinant", "Ddx3y", ".", "(", "H", ")", "Truncated", "fragments", "of", "biotinylated", "circBtnl1", "were", "incubated", "with", "small", "intestine", "crypts", "lysates", ",", "followed", "by", "RNA", "pulldown", "assay", "and", "Western", "blot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B, C) CircBtnl1 was co-localized with Ddx3y protein in small intestine tissue (B) and organoid (C) by RNA FISH, followed by immunofluorescence staining. Scale bars, 5 μm.(G) Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) using biotin-labeled circBtnl1 and recombinant Ddx3y.(H) Truncated fragments of biotinylated circBtnl1 were incubated with small intestine crypts lysates, followed by RNA pulldown assay and Western blot."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Small", "intestine", "crypt", "cells", "were", "isolated", "from", "circBtnl1", "+", "/", "+", "and", "circBtnl1", "-", "/", "-", "two", "-", "month", "-", "old", "mice", ",", "followed", "by", "RNA", "extraction", "and", "q", "-", "PCR", "analysis", "for", "top", "ten", "upregulated", "transcription", "factors", ".", "n", "=", "3", "independent", "samples", ".", "Results", "of", "relative", "fold", "changes", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "Immunoblotting", "analysis", "of", "Ddx3y", "in", "RNA", "pull", "-", "down", "samples", "by", "Atf4", "sense", ",", "antisense", "and", "control", "probes", "in", "mice", "ISCs", ".", "(", "E", ")", "Immunoblotting", "analysis", "of", "Ddx3y", "in", "RNA", "pull", "-", "down", "samples", "by", "Atf4", "and", "control", "probes", "in", "circBtnl1", "+", "/", "+", "and", "circBtnl1", "-", "/", "-", "mice", "ISCs", ".", "(", "J", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "ATF4", "in", "Ddx3y", "knockdown", "and", "overexpression", "organoids", "from", "circBtnl1", "+", "/", "+", "and", "circBtnl1", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "(", "K", ",", "L", ")", "Expression", "levels", "of", "Ddx3y", "and", "Atf4", "in", "circBtnl1", "+", "/", "+", "and", "circBtnl1", "-", "/", "-", "ISCs", "were", "examined", "by", "real", "-", "time", "PCR", "(", "K", ")", "and", "Western", "blot", "(", "L", ")", ",", "three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "Results", "of", "relative", "fold", "changes", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", ",", "not", "significant", ",", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Small intestine crypt cells were isolated from circBtnl1+/+ and circBtnl1-/- two-month-old mice, followed by RNA extraction and q-PCR analysis for top ten upregulated transcription factors. n = 3 independent samples. Results of relative fold changes are shown as means ± SD. **P < 0.01 by two-tailed Student's t-test.(D) Immunoblotting analysis of Ddx3y in RNA pull-down samples by Atf4 sense, antisense and control probes in mice ISCs. (E) Immunoblotting analysis of Ddx3y in RNA pull-down samples by Atf4 and control probes in circBtnl1+/+ and circBtnl1-/- mice ISCs.(J) Confocal microscopy of ATF4 in Ddx3y knockdown and overexpression organoids from circBtnl1+/+ and circBtnl1-/- mice. Scale bars, 20 μm.(K, L) Expression levels of Ddx3y and Atf4 in circBtnl1+/+ and circBtnl1-/- ISCs were examined by real-time PCR (K) and Western blot (L), three independent experiments were performed. Results of relative fold changes are shown as means ± SD. ** P < 0.01, NS, not significant, by two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ",", "E", ")", "ChIP", "assay", "was", "performed", "using", "anti", "-", "H3K4me3", "(", "D", ")", "or", "anti", "-", "H3K27me3", "(", "E", ")", "with", "circBtnl1", "+", "/", "+", "and", "circBtnl1", "-", "/", "-", "ISCs", "lysates", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "Sox9", "in", "Atf4", "knockdown", "(", "Atf4", "KD", ")", "organoids", "from", "circBtnl1", "+", "/", "+", "and", "circBtnl1", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "30", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D, E) ChIP assay was performed using anti-H3K4me3 (D) or anti-H3K27me3 (E) with circBtnl1+/+ and circBtnl1-/- ISCs lysates. **P < 0.01 by two-tailed Student's t-test. Data are representative of at least three independent experiments.(H) Confocal microscopy of Sox9 in Atf4 knockdown (Atf4 KD) organoids from circBtnl1+/+ and circBtnl1-/- mice. Scale bars, 30 μm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "D", ")", "H", "&", "E", "staining", "of", "small", "intestinal", "tissues", "from", "indicated", "mice", ".", "Two", "-", "month", "-", "old", "mice", "were", "used", "and", "n", "=", "3", "fields", "were", "taken", "for", "each", "group", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Number", "of", "crypts", "were", "calculated", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "in", "right", "panel", ".", "(", "E", ")", "H", "&", "E", "staining", "of", "intestinal", "tissues", "from", "indicated", "mice", "at", "different", "time", "points", "after", "8", "Gy", "of", "radiation", "damage", ".", "Two", "-", "month", "-", "old", "mice", "were", "used", "and", "n", "=", "3", "fields", "were", "taken", "for", "each", "group", ".", "Number", "of", "crypts", "were", "calculated", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "in", "right", "panel", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "F", ")", "Representative", "organoid", "images", "of", "circBtnl1", "+", "/", "+", ";", "sgSox9", "and", "circBtnl1", "-", "/", "-", ";", "sgSox9", "mice", ",", "sgCtrl", "served", "as", "control", ".", "Organoid", "formation", "ratios", "(", "n", "=", "3", ")", "are", "shown", ".", "Organoid", "formation", "ratios", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(D) H&E staining of small intestinal tissues from indicated mice. Two-month-old mice were used and n = 3 fields were taken for each group. Scale bar, 100 μm. Number of crypts were calculated as means ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by two-tailed Student's t-test in right panel.(E) H&E staining of intestinal tissues from indicated mice at different time points after 8 Gy of radiation damage. Two-month-old mice were used and n = 3 fields were taken for each group. Number of crypts were calculated as means ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by two-tailed Student's t-test in right panel. Scale bar, 50 μm.(F) Representative organoid images of circBtnl1+/+; sgSox9 and circBtnl1-/-; sgSox9 mice, sgCtrl served as control. Organoid formation ratios (n = 3) are shown. Organoid formation ratios are shown as mean ± s. d. *P < 0.05 by two-tailed Student's t-test. Scale bars, 200 μm."}
{"words": ["f1", "(", "a", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "combined", "male", "and", "female", "WT", "and", "Atg5Tg", "mice", "no", ".", "25", "(", "P0", ".", "001", ";", "n", "=", "65", "for", "WT", "mice", "and", "n", "=", "70", "for", "Atg5Tg", "mice", ")", ".", "(", "b", ",", "c", ")", "Lifespan", "extension", "in", "male", "Atg5Tg", "mice", "no", ".", "25", "(", "P0", ".", "001", ";", "n", "=", "32", "for", "WT", "mice", "and", "n", "=", "36", "for", "Atg5Tg", "mice", "no", ".", "25", ")", "(", "b", ")", "and", "female", "Atg5Tg", "mice", "no", ".", "25", "(", "P0", ".", "001", ";", "n", "=", "33", "for", "WT", "mice", "and", "n", "=", "34", "for", "Atg5Tg", "mice", "no", ".", "25", ")", "(", "c", ")", ".", "(", "d", "-", "f", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "combined", "male", "and", "female", "WT", "and", "Atg5Tg", "mice", "no", ".", "43", "(", "d", ")", ",", "no", ".", "47", "(", "e", ")", "and", "no", ".", "471", "(", "f", ")", "(", "P0", ".", "001", ";", "n", "=", "25", "for", "WT", "mice", "and", "n", "=", "30", "for", "Atg5Tg", "mice", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "the", "log", "-", "rank", "test", ".", "(", "g", ")", "Expression", "levels", "of", "Atg5", "and", "Atg12", "-", "Atg5", "conjugate", ",", "the", "conversion", "of", "LC3", "I", "into", "LC3", "II", ",", "and", "p62", "level", "in", "the", "hearts", "of", "Atg5", "Tg", "mice", ".", "Whole", "-", "tissue", "extracts", "were", "prepared", "from", "3", "-", "month", "-", "old", "Atg5", "Tg", "mice", "and", "WT", "littermates", ",", "and", "analysed", "by", "western", "blotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "β", "-", "Actin", "served", "as", "a", "control", ".", "(", "h", ")", "Densitometric", "analysis", "of", "the", "signals", "on", "the", "blots", "shown", "in", "(", "g", ")", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1(a) Kaplan-Meier survival curves of combined male and female WT and Atg5Tg mice no. 25 (P0.001; n=65 for WT mice and n=70 for Atg5Tg mice). (b,c) Lifespan extension in male Atg5Tg mice no. 25 (P0.001; n=32 for WT mice and n=36 for Atg5Tg mice no. 25) (b) and female Atg5Tg mice no. 25 (P0.001; n=33 for WT mice and n=34 for Atg5Tg mice no. 25) (c). (d-f) Kaplan-Meier survival curves of combined male and female WT and Atg5Tg mice no. 43 (d), no. 47 (e) and no. 471 (f) (P0.001; n=25 for WT mice and n=30 for Atg5Tg mice). P-values were calculated using the log-rank test.(g) Expression levels of Atg5 and Atg12-Atg5 conjugate, the conversion of LC3 I into LC3 II, and p62 level in the hearts of Atg5 Tg mice. Whole-tissue extracts were prepared from 3-month-old Atg5 Tg mice and WT littermates, and analysed by western blotting using the indicated antibodies. β-Actin served as a control. (h) Densitometric analysis of the signals on the blots shown in (g). The bars represent the mean±s.d. (n=3)."}
{"words": ["f2", "(", "a", ")", "Western", "blot", "analysis", "showing", "enhanced", "levels", "of", "Atg5", ",", "Atg12", "-", "Atg5", "conjugate", "and", "LC3", "conversion", ",", "and", "reduced", "p62", "levels", "in", "the", "indicated", "tissues", "of", "18", "-", "month", "-", "old", "Atg5", "Tg", "mice", "no", ".", "25", "(", "T", ")", "and", "WT", "mice", "(", "W", ")", ".", "(", "b", ")", "Densitometric", "analysis", "of", "the", "signals", "on", "the", "blots", "shown", "in", "(", "a", ")", ".", "(", "c", ")", "Electron", "microscopy", "images", "of", "autophagosomes", "(", "arrows", ")", "and", "late", "-", "autophagic", "compartments", "(", "arrowheads", ")", "in", "the", "liver", "tissues", "of", "18", "-", "month", "-", "old", "Atg5", "Tg", "mice", "no", ".", "25", "and", "WT", "mice", ".", "Scale", "bars", "are", "indicated", ".", "(", "d", ")", "The", "numbers", "of", "autophagosomes", "and", "autolysosomes", "per", "cell", "(", "n", "=", "50", ")", "in", "the", "electron", "microscopic", "images", "shown", "in", "(", "c", ")", "were", "counted", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "e", ")", "Fluorogenic", "comparison", "of", "basal", "autophagy", "activity", "between", "GFP", "-", "LC3", "Tg", "mice", "and", "Atg5", "/", "GFP", "-", "LC3", "double", "Tg", "mice", ".", "Whole", "bodies", "of", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "(", "left", ")", "and", "female", "(", "right", ")", "GFP", "-", "LC3", "Tg", "(", "LC3", ")", ",", "and", "LC3", "/", "LC3", "-", "LC3Tg", "mice", "(", "Atg5", "/", "LC3", ")", "were", "visualized", "using", "a", "Kodak", "Image", "Station", "4000MM", "equipped", "with", "a", "filter", "set", "for", "FITC", "(", "Kodak", "Molecular", "Imaging", "Software", ",", "Version", "4", ".", "0", ")", ".", "(", "f", ")", "Western", "blot", "analysis", "showing", "autophagy", "markers", "in", "the", "liver", "of", "GFP", "-", "LC3", "mice", ".", "GFP", "-", "LC3", "mice", "were", "injected", "for", "5", "days", "with", "siRNA", "-", "Atg5", "or", "Atg5", "-", "HA", "cDNA", "through", "the", "tail", "vein", ".", "Whole", "-", "liver", "tissue", "lysates", "were", "prepared", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "β", "-", "Actin", "served", "as", "a", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(a) Western blot analysis showing enhanced levels of Atg5, Atg12-Atg5 conjugate and LC3 conversion, and reduced p62 levels in the indicated tissues of 18-month-old Atg5 Tg mice no. 25 (T) and WT mice (W). (b) Densitometric analysis of the signals on the blots shown in (a).(c) Electron microscopy images of autophagosomes (arrows) and late-autophagic compartments (arrowheads) in the liver tissues of 18-month-old Atg5 Tg mice no. 25 and WT mice. Scale bars are indicated. (d) The numbers of autophagosomes and autolysosomes per cell (n=50) in the electron microscopic images shown in (c) were counted. The bars represent the mean±s.d. ***P0.0001 versus control; Student's t-test.(e) Fluorogenic comparison of basal autophagy activity between GFP-LC3 Tg mice and Atg5/GFP-LC3 double Tg mice. Whole bodies of 8-week-old male (left) and female (right) GFP-LC3 Tg (LC3), and LC3/LC3-LC3Tg mice (Atg5/LC3) were visualized using a Kodak Image Station 4000MM equipped with a filter set for FITC (Kodak Molecular Imaging Software, Version 4.0).(f) Western blot analysis showing autophagy markers in the liver of GFP-LC3 mice. GFP-LC3 mice were injected for 5 days with siRNA-Atg5 or Atg5-HA cDNA through the tail vein. Whole-liver tissue lysates were prepared and subjected to immunoblotting using the indicated antibodies. β-Actin served as a control."}
{"words": ["f3", "(", "a", ")", "Representative", "physical", "pictures", "of", "18", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "mice", "fed", "with", "a", "regular", "diet", ".", "(", "b", ")", "Body", "weight", "chart", "of", "ageing", "-", "induced", "obesity", "in", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "mice", ".", "The", "mice", "were", "fed", "with", "a", "regular", "diet", "for", "24", "months", "(", "n", "=", "180", "-", "-", "250", ")", "and", "their", "body", "weights", "were", "monitored", "monthly", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", ".", "(", "c", ")", "Average", "daily", "oral", "food", "intake", "normalized", "to", "body", "weight", ",", "measured", "on", "regular", "diet", ".", "The", "food", "intake", "of", "mice", "(", "n", "=", "18", "-", "24", ")", "was", "measured", "for", "2", "weeks", "at", "3", "-", ",", "6", "-", ",", "12", "-", "and", "18", "-", "month", "-", "old", "age", ".", "d", ")", "Quantification", "of", "gonadal", "fat", "pads", "from", "18", "-", "month", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "11", ")", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "Quantification", "of", "visceral", "(", "e", ")", "and", "subcutaneous", "(", "f", ")", "fat", "pads", "of", "18", "-", "month", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "g", ")", "Enhanced", "glucose", "tolerance", "of", "Atg5", "Tg", "mice", ".", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "mice", "were", "starved", "overnight", "and", "then", "given", "with", "an", "i", ".", "p", "injection", "of", "glucose", "(", "1", " ", "mg", " ", "g", "−", "1", "body", "weight", ")", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "12", "-", "week", "-", "old", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "mice", "(", "n", "=", "12", ")", ".", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "P0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "h", ")", "Enhanced", "insulin", "sensitivity", "of", "Atg5", "Tg", "mice", ".", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "mice", "were", "starved", "for", "6", " ", "h", "and", "then", "i", ".", "p", "injected", "with", "0", ".", "75", " ", "IU", "soluble", "insulin", ".", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "P0", ".", "001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "i", ")", "Plasma", "levels", "of", "triglycerol", "(", "TG", ")", "in", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "mice", ".", "The", "mice", "were", "fasted", "for", "3", " ", "h", "before", "measurement", ".", "Young", "mice", "(", "4", "-", "week", "old", ",", "n", "=", "8", ")", ";", "old", "mice", "(", "18", "-", "month", "old", ",", "n", "=", "8", ")", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "j", ")", "Plasma", "leptin", "levels", "in", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "mice", "(", "n", "=", "8", "-", "12", ")", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "(", "k", ")", "GSH", "/", "GSSG", "ratio", "in", "the", "liver", "(", "n", "=", "4", "males", ",", "three", "times", "trial", ")", ".", "*", "*", "P0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "l", ")", "Respiration", "rates", "of", "mitochondria", "in", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "MEFs", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "m", ")", "Wire", "-", "hang", "endurance", "test", "of", "Atg5", "Tg", "and", "WT", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "All", "the", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a) Representative physical pictures of 18-month-old WT and Atg5 Tg mice fed with a regular diet. (b) Body weight chart of ageing-induced obesity in WT and Atg5 Tg mice. The mice were fed with a regular diet for 24 months (n=180--250) and their body weights were monitored monthly. The bars represent the mean±s.d. ***P0.0001 versus control; Student's t-test.. (c) Average daily oral food intake normalized to body weight, measured on regular diet. The food intake of mice (n=18-24) was measured for 2 weeks at 3-, 6-, 12- and 18-month-old age.d) Quantification of gonadal fat pads from 18-month-old mice (n=11). ***P0.0001 versus control; Student's t-test. (e,f) Quantification of visceral (e) and subcutaneous (f) fat pads of 18-month-old mice (n=6). ***P0.0001 versus control; Student's t-test.(g) Enhanced glucose tolerance of Atg5 Tg mice. WT and Atg5 Tg mice were starved overnight and then given with an i.p injection of glucose (1 mg g−1 body weight). The results are the mean±s.d. of 12-week-old WT and Atg5 Tg mice (n=12). *P0.01, **P0.001, ***P0.0001 versus control; Student's t-test.(h) Enhanced insulin sensitivity of Atg5 Tg mice. WT and Atg5 Tg mice were starved for 6 h and then i.p injected with 0.75 IU soluble insulin. *P0.01, **P0.001 versus control; Student's t-test.(i) Plasma levels of triglycerol (TG) in WT and Atg5 Tg mice. The mice were fasted for 3 h before measurement. Young mice (4-week old, n=8); old mice (18-month old, n=8). ***P0.0001 versus control; Student's t-test(j) Plasma leptin levels in WT and Atg5 Tg mice (n=8-12). ***P0.0001 versus control; Student's t-test. ((k) GSH/GSSG ratio in the liver (n=4 males, three times trial). **P0.001, ***P0.0001 versus control; Student's t-test.(l) Respiration rates of mitochondria in WT and Atg5 Tg MEFs (n=2).(m) Wire-hang endurance test of Atg5 Tg and WT mice (n=10). All the bars represent the mean±s.d. ***P0.0001 versus control; Student's t-test."}
{"words": ["f4", "(", "a", ")", "Comparison", "of", "Atg12", "-", "Atg5", "conjugate", "levels", "in", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "MEFs", "by", "western", "blot", "analysis", ".", "MEFs", "from", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "mice", "were", "cultured", "at", "embryonic", "day", "13", ",", "after", "which", "cell", "extracts", "were", "examined", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "Atg5", "and", "anti", "-", "β", "-", "actin", "antibodies", ".", "(", "b", ")", "Increased", "conversion", "of", "LC3", "and", "reduced", "expression", "of", "p62", "in", "Atg5", "Tg", "MEFs", "no", ".", "6", "by", "rapamycin", "and", "/", "or", "Baf", ".", "A1", ".", "WT", "MEFs", "no", ".", "1", "and", "Atg5", "Tg", "MEFs", "no", ".", "6", "in", "passage", "number", "3", "were", "incubated", "for", "48", " ", "h", "with", "10", " ", "μM", "rapamycin", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "Baf", ".", "A1", ",", "and", "cell", "extracts", "were", "then", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "The", "signals", "on", "the", "blot", "were", "quantified", "by", "densitometric", "analysis", "and", "represented", "as", "the", "ratio", "of", "p62", "to", "β", "-", "actin", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Increased", "resistance", "of", "Atg5", "Tg", "MEFs", "to", "oxidative", "stress", ".", "WT", "MEFs", "no", ".", "1", "and", "Atg5", "Tg", "MEFs", "no", ".", "6", "were", "treated", "for", "24", " ", "h", "with", "50", ",", "100", ",", "200", "and", "300", " ", "μM", "H2O2", "(", "c", ")", "or", "300", " ", "μM", "H2O2", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "5", " ", "mM", "3", "-", "MA", "or", "20", " ", "nM", "Baf", ".", "A1", "(", "Baf", ".", "A1", ")", "(", "d", ")", ".", "Cell", "viability", "was", "assessed", "by", "propidium", "iodide", "staining", ".", "The", "values", "are", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "P0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", "versus", "control", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "e", ")", "Representative", "photographs", "showing", "the", "resistance", "of", "Atg5", "Tg", "MEFs", "to", "oxidative", "stress", ".", "Primary", "cultured", "WT", "and", "Atg5", "Tg", "MEFs", "were", "treated", "with", "300", " ", "μM", "H2O2", "for", "24", " ", "h", "and", "then", "observed", "under", "a", "light", "microscope", ".", "Scale", "bars", ",", "50", " ", "μm", ".", "(", "f", ")", "Effect", "of", "oxidative", "stress", "on", "the", "autophagy", "activity", "in", "Atg5", "Tg", "MEFs", ".", "WT", "MEFs", "no", ".", "1", "and", "Atg5", "Tg", "MEFs", "no", ".", "6", "were", "treated", "with", "100", " ", "μM", "H2O2", "for", "24", " ", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "20", " ", "nM", "Baf", ".", "A1", ",", "and", "cell", "extracts", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "About", "10", "and", "30", " ", "μg", "of", "proteins", "were", "used", "for", "LC3", "(", "upper", "panel", ")", "and", "p62", "(", "bottom", "panel", ")", "detection", ",", "respectively", ".", "β", "-", "Actin", "served", "as", "a", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4(a) Comparison of Atg12-Atg5 conjugate levels in WT and Atg5 Tg MEFs by western blot analysis. MEFs from WT and Atg5 Tg mice were cultured at embryonic day 13, after which cell extracts were examined by western blot analysis using anti-Atg5 and anti-β-actin antibodies.(b) Increased conversion of LC3 and reduced expression of p62 in Atg5 Tg MEFs no. 6 by rapamycin and/or Baf.A1. WT MEFs no. 1 and Atg5 Tg MEFs no. 6 in passage number 3 were incubated for 48 h with 10 μM rapamycin in the absence or presence of Baf.A1, and cell extracts were then analysed by western blotting. The signals on the blot were quantified by densitometric analysis and represented as the ratio of p62 to β-actin.(c,d) Increased resistance of Atg5 Tg MEFs to oxidative stress. WT MEFs no. 1 and Atg5 Tg MEFs no. 6 were treated for 24 h with 50, 100, 200 and 300 μM H2O2 (c) or 300 μM H2O2 in the absence or presence of 5 mM 3-MA or 20 nM Baf.A1 (Baf.A1) (d). Cell viability was assessed by propidium iodide staining. The values are the mean±s.e.m. (n=3). **P0.001, ***P0.0001 versus control; Student's t-test.(e) Representative photographs showing the resistance of Atg5 Tg MEFs to oxidative stress. Primary cultured WT and Atg5 Tg MEFs were treated with 300 μM H2O2 for 24 h and then observed under a light microscope. Scale bars, 50 μm.(f) Effect of oxidative stress on the autophagy activity in Atg5 Tg MEFs. WT MEFs no. 1 and Atg5 Tg MEFs no. 6 were treated with 100 μM H2O2 for 24 h in the presence or absence of 20 nM Baf.A1, and cell extracts were analysed by western blotting. About 10 and 30 μg of proteins were used for LC3 (upper panel) and p62 (bottom panel) detection, respectively. β-Actin served as a control."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "images", "for", "the", "TIF", "analysis", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Shown", "are", "POT1Y223C", "/", "-", "hESCs", "and", "an", "unedited", "wild", "-", "type", "hESC", "clone", "(", "WT", "/", "WT", ")", "isolated", "in", "parallel", ",", "as", "well", "as", "a", "POT1", "WT", "/", "Q623H", "hESC", "and", "a", "contemporaneously", "isolated", "hECS", "clones", "(", "WT", "/", "WT", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "10µm", ".", "Box", "and", "whisker", "plot", "(", "showing", "min", ",", "max", "and", "average", ")", "quantifying", "telomere", "-", "dysfunction", "induced", "foci", "(", "TIF", ")", "in", "two", "POT1", "Y223C", "/", "-", "hESC", "lines", ",", "one", "POT1", "Q623H", "/", "Q623H", ",", "and", "one", "POT1WT", "/", "Q623H", "hESC", "lines", "compared", "to", "wild", "-", "type", "unedited", "control", "hESCs", ".", "Cells", "were", "analyzed", "3", "months", "post", "targeting", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "TRF1", "and", "γ", "-", "H2Ax", ".", "POT1Y223C", "/", "-", "cells", "have", "increased", "TIFs", "compared", "to", "an", "unedited", "wild", "-", "type", "cell", "clone", ",", "isolated", "and", "cultured", "in", "parallel", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "one", "biological", "replicate", ")", ".", "Images", "of", "telomere", "and", "centromere", "FISH", "on", "metaphase", "spreads", "of", "cell", "lines", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Cy3", "Tel", "-", "C", "PNA", "probes", "were", "used", ".", "Arrows", "indicate", "chromosomal", "abnormalities", ".", "E", ")", "Quantification", "of", "chromosomal", "abnormalities", "as", "determined", "by", "FISH", "analysis", "in", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative images for the TIF analysis shown in (C). Shown are POT1Y223C/- hESCs and an unedited wild-type hESC clone (WT/WT) isolated in parallel, as well as a POT1 WT/Q623H hESC and a contemporaneously isolated hECS clones (WT/WT). Scale bars = 10µm.   Box and whisker plot (showing min, max and average) quantifying telomere-dysfunction induced foci (TIF) in two POT1 Y223C/- hESC lines, one POT1 Q623H/Q623H, and one POT1WT/Q623H hESC lines compared to wild-type unedited control hESCs. Cells were analyzed 3 months post targeting. Cells were stained for TRF1 and γ-H2Ax. POT1Y223C/- cells have increased TIFs compared to an unedited wild-type cell clone, isolated and cultured in parallel (P<0.01, two-tailed Mann-Whitney test, one biological replicate).   Images of telomere and centromere FISH on metaphase spreads of cell lines as in (B). Cy3 Tel-C PNA probes were used. Arrows indicate chromosomal abnormalities. E) Quantification of chromosomal abnormalities as determined by FISH analysis in (D). "}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Quantification", "of", "telomere", "length", "data", "from", "two", "STELA", "experiments", "using", "the", "same", "genomic", "DNA", ",", "shown", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "Appendix", "Figure", "2C", ")", ".", "Indicated", "in", "red", "is", "the", "mean", "telomere", "length", "and", "the", "error", "bars", "indicate", "the", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Quantification of telomere length data from two STELA experiments using the same genomic DNA, shown in (A) and (Appendix Figure 2C). Indicated in red is the mean telomere length and the error bars indicate the standard deviation."}
{"words": ["Figure", "3B", ")", "TIF", "analysis", "of", "wild", "-", "type", ",", "POT1WT", "/", "Y223C", "hESCs", ",", "and", "the", "indicated", "controls", "using", "antibodies", "against", "TRF1", "and", "γ", "-", "H2AX", ".", "Scale", "bars", "=", "10µm", ".", "Lentiviral", "expression", "of", "TPP1", "∆", "PBD", "served", "as", "a", "positive", "control", "to", "demonstrate", "that", "cells", "have", "an", "intact", "telomere", "DNA", "damage", "response", ".", "TPP1", "∆", "PBD", "infected", "cells", "were", "analyzed", "72h", "post", "infection", "and", "without", "selection", ".", "E", ")", "Quantification", "of", "two", "STELA", "experiments", ",", "including", "that", "shown", "in", "(", "D", ")", ".", "Indicated", "in", "red", "is", "the", "mean", "telomere", "length", "and", "the", "error", "bars", "indicate", "the", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B) TIF analysis of wild-type, POT1WT/Y223C hESCs, and the indicated controls using antibodies against TRF1 and γ-H2AX. Scale bars = 10µm. Lentiviral expression of TPP1∆PBD served as a positive control to demonstrate that cells have an intact telomere DNA damage response. TPP1∆PBD infected cells were analyzed 72h post infection and without selection.E) Quantification of two STELA experiments, including that shown in (D). Indicated in red is the mean telomere length and the error bars indicate the standard deviation."}
{"words": ["Figure", "4D", ")", "Quantification", "of", "edited", "or", "unedited", "colonies", "isolated", "in", "the", "in", "vitro", "differentiation", "described", "in", "(", "C", ")", "WT", ":", "wild", "-", "type", ",", "MT", ":", "mutant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D) Quantification of edited or unedited colonies isolated in the in vitro differentiation described in (C) WT: wild-type, MT: mutant."}
{"words": ["Figure", "5C", ")", "Representative", "genotyping", "outcomes", "of", "hCD34", "+", "cells", "nucleofected", "sgRNA", "-", "1", ",", "xenografted", "and", "isolated", "from", "the", "bone", "marrow", "16", "weeks", "after", "transplantation", "into", "mice", "determined", "by", "NGS", ".", "Data", "information", ":", "The", "vertical", "dashed", "line", "shows", "the", "site", "of", "CAS9", "cut", "and", "the", "base", "pairs", "noted", "in", "red", "show", "insertion", ".", "A", "dash", "inside", "a", "gray", "box", "indicates", "a", "deleted", "base", "pair", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C) Representative genotyping outcomes of hCD34+ cells nucleofected sgRNA-1, xenografted and isolated from the bone marrow 16 weeks after transplantation into mice determined by NGS. Data information: The vertical dashed line shows the site of CAS9 cut and the base pairs noted in red show insertion. A dash inside a gray box indicates a deleted base pair."}
{"words": ["Figure", "6B", ")", "Telomere", "restriction", "fragment", "assay", "for", "the", "five", "subjects", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Mean", "telomere", "length", "is", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B) Telomere restriction fragment assay for the five subjects shown in (A). Mean telomere length is indicated."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Representative", "micrographs", "of", "human", "skin", "sections", "stained", "with", "hematoxylin", "-", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "(", "left", ")", "and", "anti", "-", "IL", "-", "38", "antibody", "(", "right", ")", "from", "normal", "patients", "(", "n", "=", "11", ")", "and", "tumors", "of", "cSCC", "patients", "(", "n", "=", "13", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "the", "quantification", "of", "mean", "IL", "-", "38", "expression", "per", "high", "-", "powered", "field", "in", "tissues", ".", "(", "B", ")", "Relative", "expression", "of", "IL", "-", "38", "in", "human", "normal", "tissues", "(", "n", "=", "9", ")", "and", "cSCC", "(", "n", "=", "18", ")", "were", "analyzed", "using", "Geo", "Datasets", "(", "GSE98767", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "All", "data", "are", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "p", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "The", "dorsal", "hair", "of", "normal", "C57", "/", "BL6", "mice", "were", "shaved", "and", "treated", "with", "DMBA", "/", "TPA", "twice", "a", "week", "for", "32", "weeks", "to", "induce", "skin", "tumors", ".", "(", "C", ")", "Representative", "micrographs", "of", "mouse", "normal", "skin", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "tumor", "(", "n", "=", "6", ")", "sections", "stained", "with", "anti", "-", "IL", "-", "38", "antibody", ".", "The", "graph", "shows", "the", "quantification", "of", "mean", "IL", "-", "38", "expression", "per", "high", "-", "powered", "field", "in", "tissues", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "(", "D", ")", "Relative", "expression", "levels", "of", "Il", "-", "38", "in", "normal", "skin", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "tumors", "(", "n", "=", "5", ")", "of", "mice", "were", "quantified", "using", "qPCR", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "All", "data", "are", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "p", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "F", ")", "Representative", "western", "blot", "bands", "indicating", "IL", "-", "38", "in", "mouse", "normal", "skin", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "DMBA", "/", "TPA", "-", "induced", "tumors", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "graph", "shows", "the", "quantification", "of", "mean", "IL", "-", "38", "expression", "in", "tissues", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "All", "data", "are", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "p", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Representative micrographs of human skin sections stained with hematoxylin-eosin (H&E) (left) and anti-IL-38 antibody (right) from normal patients (n = 11) and tumors of cSCC patients (n = 13). Scale bars represent 100 μm. The graph shows the quantification of mean IL-38 expression per high-powered field in tissues. (B) Relative expression of IL-38 in human normal tissues (n = 9) and cSCC (n = 18) were analyzed using Geo Datasets (GSE98767). Error bars represent the mean ± SD. All data are biological replicates. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; p values were calculated using Student's t test.(C and D) The dorsal hair of normal C57/BL6 mice were shaved and treated with DMBA/TPA twice a week for 32 weeks to induce skin tumors. (C) Representative micrographs of mouse normal skin (n = 6) and tumor (n = 6) sections stained with anti-IL-38 antibody. The graph shows the quantification of mean IL-38 expression per high-powered field in tissues. Scale bars represent 100 μm. (D) Relative expression levels of Il-38 in normal skin (n = 5) and tumors (n = 5) of mice were quantified using qPCR. Error bars represent the mean ± SD. All data are biological replicates. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; p values were calculated using Student's t test.(F) Representative western blot bands indicating IL-38 in mouse normal skin (n = 3) and DMBA/TPA-induced tumors (n = 3). The graph shows the quantification of mean IL-38 expression in tissues. Error bars represent the mean ± SD. All data are biological replicates. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; p values were calculated using Student's t test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Representative", "photographs", "of", "Il", "-", "38f", "/", "f", "(", "n", "=", "12", ")", "and", "K14Cre", "/", "+", "-", "Il", "-", "38f", "/", "f", "mice", "(", "n", "=", "8", ")", "treated", "with", "DMBA", "/", "TPA", "for", "32", "weeks", ".", "White", "triangles", "indicate", "the", "tumors", "on", "the", "back", "of", "mice", ".", "(", "C", "Average", "tumor", "number", "(", "C", ")", "per", "mouse", "from", "Il", "-", "38f", "/", "f", "(", "n", "=", "12", ")", "and", "K14Cre", "/", "+", "-", "Il", "-", "38f", "/", "f", "mice", "(", "n", "=", "8", ")", "treated", "with", "DMBA", "/", "TPA", ".", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "C", ")", "All", "data", "are", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "p", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "test", "("], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Representative photographs of Il-38f/f (n = 12) and K14Cre/+-Il-38f/f mice (n = 8) treated with DMBA/TPA for 32 weeks. White triangles indicate the tumors on the back of mice. (C Average tumor number (C) per mouse from Il-38f/f (n = 12) and K14Cre/+-Il-38f/f mice (n = 8) treated with DMBA/TPA.. Error bars represent the mean ± SD (C) All data are biological replicates. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; p values were calculated using Student's t test (C"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "immunohistochemical", "staining", "micrographs", "of", "γH2AX", "in", "the", "skin", "of", "Il", "-", "38f", "/", "f", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "K14Cre", "/", "+", "-", "Il", "-", "38f", "/", "f", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", "after", "treated", "with", "DMBA", "for", "24h", ".", "Red", "triangles", "indicate", "the", "γH2AX", "+", "positive", "cells", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "the", "number", "of", "γH2AX", "+", "cells", "per", "high", "-", "powered", "field", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "All", "data", "are", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "p", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative immunohistochemical staining micrographs of γH2AX in the skin of Il-38f/f (n = 5) and K14Cre/+-Il-38f/f (n = 5) mice after treated with DMBA for 24h. Red triangles indicate the γH2AX+ positive cells. Scale bars represent 100 μm. The graph shows the number of γH2AX+ cells per high-powered field. Data information: Error bars represent the mean ± SD. All data are biological replicates. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; p values were calculated using Student's t test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "The", "dorsal", "hair", "of", "normal", "C57", "/", "BL6", "mice", "were", "shaved", "and", "treated", "with", "DMBA", "/", "TPA", "twice", "a", "week", "for", "3", "weeks", "to", "induce", "the", "skin", "inflammation", ".", "(", "A", ")", "Representative", "micrograph", "sections", "stained", "with", "hematoxylin", "-", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "from", "the", "skin", "of", "Il", "-", "38f", "/", "f", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "K14Cre", "/", "+", "-", "Il", "-", "38f", "/", "f", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "average", "epidermal", "thickness", ".", "B", ")", "The", "dorsal", "hair", "of", "normal", "C57", "/", "BL6", "mice", "were", "shaved", "and", "treated", "with", "DMBA", "/", "TPA", "twice", "a", "week", "for", "3", "weeks", "to", "induce", "the", "skin", "inflammation", ".", "(", "B", ")", "Representative", "micrograph", "sections", "stained", "with", "anti", "-", "Ki67", "antibody", "from", "the", "skin", "of", "Il", "-", "38f", "/", "f", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "K14Cre", "/", "+", "-", "Il", "-", "38f", "/", "f", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "average", "numbers", "of", "Ki67", "+", "cells", "per", "high", "-", "powered", "field", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "Representative", "images", "of", "the", "scratch", "assay", "(", "left", ")", "and", "wound", "closure", "rate", "(", "right", ")", "of", "A431", "cells", "(", "n", "=", "5", ")", "after", "overexpression", "(", "G", ")", "or", "knockdown", "(", "H", ")", "of", "IL", "-", "38", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "All", "data", "are", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "p", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "NC", ",", "Negative", "control", ";", "LV", ",", "Lentivirus", ";", "Oe", ",", "Overexpression", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "Representative", "western", "blot", "bands", "indicating", "cyclin", "E", "and", "cyclin", "A", "in", "A431", "cells", "after", "IL", "-", "38", "overexpression", "(", "I", ")", "or", "knockdown", "(", "J", ")", ".", "NC", ",", "Negative", "control", ";", "LV", ",", "Lentivirus", ";", "Oe", ",", "Overexpression", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A The dorsal hair of normal C57/BL6 mice were shaved and treated with DMBA/TPA twice a week for 3 weeks to induce the skin inflammation. (A) Representative micrograph sections stained with hematoxylin-eosin (H&E) from the skin of Il-38f/f (n = 5) and K14Cre/+-Il-38f/f mice (n = 5) Scale bars represent 100 μm. The graph shows average epidermal thickness.B) The dorsal hair of normal C57/BL6 mice were shaved and treated with DMBA/TPA twice a week for 3 weeks to induce the skin inflammation. (B) Representative micrograph sections stained with anti-Ki67 antibody from the skin of Il-38f/f (n = 6) and K14Cre/+-Il-38f/f mice (n = 6). Scale bars represent 100 μm. The graph shows average numbers of Ki67+ cells per high-powered field.(G and H) Representative images of the scratch assay (left) and wound closure rate (right) of A431 cells (n = 5) after overexpression (G) or knockdown (H) of IL-38. Error bars represent the mean ± SD. All data are biological replicates. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; p values were calculated using Student's t test. NC, Negative control; LV, Lentivirus; Oe, Overexpression.(I and J) Representative western blot bands indicating cyclin E and cyclin A in A431 cells after IL-38 overexpression (I) or knockdown (J). NC, Negative control; LV, Lentivirus; Oe, Overexpression."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "and", "B", ")", "Pull", "-", "down", "assay", "of", "IL", "-", "38", "(", "1", "-", "152", "aa", ")", "(", "A", ")", "or", "IL", "-", "38", "(", "20", "-", "152", "aa", ")", "(", "B", ")", "with", "IL", "-", "1Rrp2", "-", "Fc", ",", "IL", "-", "1RAPL1", "-", "Fc", ",", "IL1RAcp", "-", "Fc", ",", "and", "IgG", "-", "Fc", "fusion", "proteins", ".", "(", "C", ")", "Cell", "extracts", "prepared", "from", "293T", "cells", "transfected", "with", "a", "mock", "mammalian", "expression", "vector", "(", "left", ")", "or", "an", "expression", "vector", "encoding", "IL", "-", "1Rrp2", "(", "right", ")", "were", "probed", "using", "anti", "-", "phospho", "-", "JNK", ",", "anti", "-", "JNK", ",", "or", "anti", "-", "β", "-", "actin", "antibodies", "after", "stimulation", "with", "IL", "-", "38", "(", "200", "ng", "/", "ml", ")", "or", "IL", "-", "36β", "(", "200", "ng", "/", "ml", ")", "at", "different", "times", ".", "(", "D", ")", "Cell", "extracts", "prepared", "from", "293T", "cells", "transfected", "with", "an", "expression", "vector", "encoding", "IL", "-", "1Rrp2", "were", "probed", "using", "anti", "-", "phospho", "-", "JNK", ",", "anti", "-", "JNK", ",", "or", "anti", "-", "β", "-", "actin", "antibodies", "after", "stimulation", "with", "IL", "-", "38", "at", "different", "concentrations", ".", "(", "F", ")", "Cell", "extracts", "prepared", "from", "293T", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "full", "-", "length", "or", "deletion", "mutants", "of", "IL", "-", "1Rrp2", ",", "were", "probed", "using", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "β", "-", "actin", "antibodies", ".", "Oe", ",", "overexpression", ".", "(", "G", ")", "Cell", "extracts", "prepared", "from", "293T", "cells", "transfected", "with", "full", "-", "length", "or", "deletion", "mutants", "of", "IL", "-", "1Rrp2", "were", "probed", "using", "anti", "-", "phospho", "-", "JNK", ",", "anti", "-", "JNK", ",", "or", "anti", "-", "β", "-", "actin", "antibodies", "after", "stimulation", "with", "IL", "-", "38", "(", "200", "ng", "/", "ml", ")", "at", "different", "times", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A and B) Pull-down assay of IL-38 (1-152 aa) (A) or IL-38 (20-152 aa) (B) with IL-1Rrp2-Fc, IL-1RAPL1-Fc, IL1RAcp-Fc, and IgG-Fc fusion proteins.(C) Cell extracts prepared from 293T cells transfected with a mock mammalian expression vector (left) or an expression vector encoding IL-1Rrp2 (right) were probed using anti-phospho-JNK, anti-JNK, or anti-β-actin antibodies after stimulation with IL-38 (200 ng/ml) or IL-36β (200 ng/ml) at different times.(D) Cell extracts prepared from 293T cells transfected with an expression vector encoding IL-1Rrp2 were probed using anti-phospho-JNK, anti-JNK, or anti-β-actin antibodies after stimulation with IL-38 at different concentrations.(F) Cell extracts prepared from 293T cells transfected with HA-tagged full-length or deletion mutants of IL-1Rrp2, were probed using anti-HA or anti-β-actin antibodies. Oe, overexpression.(G) Cell extracts prepared from 293T cells transfected with full-length or deletion mutants of IL-1Rrp2 were probed using anti-phospho-JNK, anti-JNK, or anti-β-actin antibodies after stimulation with IL-38 (200 ng/ml) at different times."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "images", "of", "the", "scratch", "assay", "(", "left", ")", "and", "wound", "closure", "rate", "(", "right", ")", "of", "A431", "cells", "(", "n", "=", "5", ")", "treated", "with", "recombinant", "IL", "-", "38", "(", "200", "ng", "/", "mL", ")", "(", "F", ")", "after", "IL", "-", "1Rrp2", "interference", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "All", "data", "are", "biological", "replicates", ".", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "p", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative images of the scratch assay (left) and wound closure rate (right) of A431 cells (n = 5) treated with recombinant IL-38 (200 ng/mL) (F) after IL-1Rrp2 interference. Error bars represent the mean ± SD. All data are biological replicates. ns, not significant; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; p values were calculated using one-way ANOVA , F"}
{"words": ["Figure", "7Representative", "images", "of", "the", "scratch", "assay", "(", "left", ")", "and", "wound", "closure", "rate", "(", "right", ")", "of", "A431", "cells", "(", "n", "=", "5", ")", "treated", "with", "recombinant", "IL", "-", "38", "(", "200", "ng", "/", "mL", ")", "(", "F", ")", "after", "JNK", "interference", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "All", "data", "are", "biological", "replicates", ".", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "p", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative images of the scratch assay (left) and wound closure rate (right) of A431 cells (n = 5) treated with recombinant IL-38 (200 ng/mL) (F) after JNK interference. Error bars represent the mean ± SD. All data are biological replicates. ns, not significant; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; p values were calculated using one-way ANOVA , F"}
{"words": ["Figure", "1Expression", "of", "Tardbp", ",", "total", "Sort1", "and", "exon", "17b", "Sort1", "mRNAs", "quantified", "by", "Q", "-", "PCR", "in", "primary", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "either", "scrambled", "or", "Tardbp", "shRNA", "lentiviruses", ".", "Values", "were", "first", "normalized", "to", "Gapdh", "mRNA", "levels", ",", "then", "plotted", "as", "average", "±", "SEM", "relative", "to", "the", "value", "of", "scrambled", "shRNA", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Western", "blots", "of", "cell", "lysates", "and", "culture", "supernatants", "showing", "TDP", "-", "43", "and", "Sortilin", "expression", "in", "primary", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "scrambled", "or", "Tardbp", "shRNA", "lentiviruses", ".", "Uninfected", "cultures", "were", "used", "as", "an", "additional", "control", ".", "β", "-", "actin", "immunoblotting", "and", "Coomasise", "Blue", "staining", "were", "used", "to", "control", "equal", "loading", "of", "lysates", "and", "supernatants", ",", "respectively", ".", "Molecular", "weights", "are", "indicated", "in", "kDa", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Representative", "photomicrographs", "of", "cultured", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "scrambled", "or", "Tardbp", "shRNA", "lentiviruses", ",", "immunolabled", "for", "BDNF", "(", "green", ")", ",", "SCG2", "(", "red", ")", "and", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "orthogonal", "views", "(", "dashed", "lines", ")", "showing", "colocalization", "of", "BDNF", "and", "SCG2", "in", "the", "soma", "(", "white", "arrows", ")", ".", "Colocalization", "between", "BDNF", "and", "SCG2", "-", "positive", "vesicles", "expressed", "as", "percentage", "of", "total", "BDNF", "immunoreactivity", "±", "SEM", "in", "cultured", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "scrambled", "or", "Tardbp", "shRNA", "lentiviruses", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "n", ">", "50", "individual", "cells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Colocalization", "between", "BDNF", "and", "SCG2", "-", "positive", "vesicles", "in", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "scrambled", "or", "Tardbp", "shRNA", "lentiviruses", "together", "with", "either", "EGFP", "or", "Sortilin", "rescue", "viruses", ".", "Histogram", "bars", "show", "average", "±", "SEM", "BDNF", "/", "SCG2", "colocalization", "expressed", "as", "percentage", "of", "total", "BDNF", "immunoreactivity", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "n", ">", "50", "individual", "cells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "BDNF", "secretion", "induced", "by", "KCl", "treatment", "assessed", "by", "in", "-", "situ", "BDNF", "ELISA", "in", "cultured", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "scrambled", "or", "Tardbp", "shRNA", "lentiviruses", ".", "Histogram", "bars", "show", "average", "±", "SEM", "BDNF", "levels", "normalized", "to", "a", "standard", "curve", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "BDNF", "secretion", "in", "cultured", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "scrambled", "(", "left", ")", "or", "Tardbp", "(", "right", ")", "shRNA", "lentiviruses", "together", "with", "either", "EGFP", ",", "Sort1", "shRNA", "or", "Sortilin", "rescue", "viruses", ".", "Histogram", "bars", "show", "average", "±", "SEM", "BDNF", "levels", "normalized", "to", "a", "standard", "curve", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Expression of Tardbp, total Sort1 and exon 17b Sort1 mRNAs quantified by Q-PCR in primary hippocampal neurons infected with either scrambled or Tardbp shRNA lentiviruses. Values were first normalized to Gapdh mRNA levels, then plotted as average ± SEM relative to the value of scrambled shRNA (N=3 independent experiments; n=3 wells per condition in each experiment). ***, p<0.001. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Western blots of cell lysates and culture supernatants showing TDP-43 and Sortilin expression in primary hippocampal neurons infected with scrambled or Tardbp shRNA lentiviruses. Uninfected cultures were used as an additional control. β-actin immunoblotting and Coomasise Blue staining were used to control equal loading of lysates and supernatants, respectively. Molecular weights are indicated in kDa. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Representative photomicrographs of cultured hippocampal neurons infected with scrambled or Tardbp shRNA lentiviruses, immunolabled for BDNF (green), SCG2 (red) and counterstained with DAPI (blue) in orthogonal views (dashed lines) showing colocalization of BDNF and SCG2 in the soma (white arrows).Colocalization between BDNF and SCG2-positive vesicles expressed as percentage of total BDNF immunoreactivity ±SEM in cultured hippocampal neurons infected with scrambled or Tardbp shRNA lentiviruses (N=3 independent experiments, n>50 individual cells per condition in each experiment). **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Colocalization between BDNF and SCG2-positive vesicles in hippocampal neurons infected with scrambled or Tardbp shRNA lentiviruses together with either EGFP or Sortilin rescue viruses. Histogram bars show average ± SEM BDNF/SCG2 colocalization expressed as percentage of total BDNF immunoreactivity (N=3 independent experiments, n>50 individual cells per condition in each experiment). **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.BDNF secretion induced by KCl treatment assessed by in-situ BDNF ELISA in cultured hippocampal neurons infected with scrambled or Tardbp shRNA lentiviruses. Histogram bars show average ± SEM BDNF levels normalized to a standard curve (N=3 independent experiments; n=3 wells per condition in each experiment). *, p<0.05; ***, p<0.001. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.BDNF secretion in cultured hippocampal neurons infected with scrambled (left) or Tardbp (right) shRNA lentiviruses together with either EGFP, Sort1 shRNA or Sortilin rescue viruses. Histogram bars show average ± SEM BDNF levels normalized to a standard curve (N=3 independent experiments; n=3 wells per condition in each experiment). ***, p<0.001. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "photomicrographs", "of", "TDP", "-", "43", "(", "green", ")", "and", "NeuN", "(", "red", ")", "immunohistochemistry", "in", "hippocampal", "CA1", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ".", "Arrows", "denote", "areas", "of", "depleted", "TDP", "-", "43", "immunoreactivity", "in", "the", "mutant", ".", "Percentage", "of", "TDP", "-", "43", "positive", "cells", "relative", "to", "NeuN", "cells", "in", "CA1", "and", "the", "remaining", "hippocampus", "(", "HC", "[", "-", "CA1", "]", ")", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ";", "5", "sections", "per", "mouse", ")", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "TDP", "-", "43", "intensity", "in", "TDP", "-", "43", "/", "NeuN", "double", "-", "positive", "cells", "in", "CA1", "and", "the", "remaining", "hippocampus", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ";", "5", "sections", "per", "mouse", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Expression", "of", "Tardbp", "mRNA", "in", "micro", "-", "dissected", "CA1", "and", "the", "remaining", "hippocampus", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", "quantified", "by", "Q", "-", "PCR", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "relative", "to", "levels", "in", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ",", "after", "normalization", "to", "Gapdh", "mRNA", ".", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Western", "blots", "of", "micro", "-", "dissected", "CA1", "and", "the", "remaining", "hippocampus", "showing", "expression", "of", "TDP", "-", "43", ",", "full", "-", "length", "and", "truncated", "(", "soluble", ")", "Sortilin", ",", "and", "GAPDH", "in", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ".", "Bands", "corresponding", "to", "soluble", "Sortilin", "are", "indicated", "(", "black", "arrows", ")", ".", "GAPDH", "immunoblotting", "was", "used", "to", "control", "for", "equal", "loading", ".", "Molecular", "weights", "are", "indicated", "in", "kDa", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "TDP", "-", "43", "expression", "in", "micro", "-", "dissected", "CA1", "and", "the", "remaining", "hippocampus", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SD", "of", "densitometry", "relative", "to", "GAPDH", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Expression", "of", "exon", "17b", "Sort1", "and", "total", "Sort1", "mRNAs", "in", "micro", "-", "dissected", "CA1", "and", "the", "remaining", "hippocampus", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", "quantified", "by", "Q", "-", "PCR", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SD", "relative", "to", "levels", "in", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ",", "after", "normalization", "to", "Gapdh", "mRNA", ".", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Expression", "of", "full", "-", "length", "(", "left", ")", "and", "truncated", "(", "soluble", ",", "right", ")", "Sortilin", "protein", "in", "micro", "-", "dissected", "CA1", "and", "the", "remaining", "hippocampus", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SD", "of", "densitometry", "relative", "to", "GAPDH", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative photomicrographs of TDP-43 (green) and NeuN (red) immunohistochemistry in hippocampal CA1 of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice. Arrows denote areas of depleted TDP-43 immunoreactivity in the mutant.Percentage of TDP-43 positive cells relative to NeuN cells in CA1 and the remaining hippocampus (HC [-CA1]) of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice. Results are presented as average ± SEM (N=3 mice per condition; 5 sections per mouse). **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.TDP-43 intensity in TDP-43/NeuN double-positive cells in CA1 and the remaining hippocampus of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice. Results are presented as average ± SEM (N=3 mice per condition; 5 sections per mouse). *, p<0.05; **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Expression of Tardbp mRNA in micro-dissected CA1 and the remaining hippocampus of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice quantified by Q-PCR. Results are presented as average ± SEM relative to levels in Tardbpfx/fx mice, after normalization to Gapdh mRNA. (N=3 mice per condition; **, p<0.01). Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Western blots of micro-dissected CA1 and the remaining hippocampus showing expression of TDP-43, full-length and truncated (soluble) Sortilin, and GAPDH in Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice. Bands corresponding to soluble Sortilin are indicated (black arrows). GAPDH immunoblotting was used to control for equal loading. Molecular weights are indicated in kDa. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.TDP-43 expression in micro-dissected CA1 and the remaining hippocampus of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice. Results are presented as average ± SD of densitometry relative to GAPDH (N=3 mice per condition; **, p<0.01). Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Expression of exon 17b Sort1 and total Sort1 mRNAs in micro-dissected CA1 and the remaining hippocampus of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice quantified by Q-PCR. Results are presented as average ± SD relative to levels in Tardbpfx/fx mice, after normalization to Gapdh mRNA. (N=3 mice per condition; **, p<0.01 Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Expression of full-length (left) and truncated (soluble, right) Sortilin protein in micro-dissected CA1 and the remaining hippocampus of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice. Results are presented as average ± SD of densitometry relative to GAPDH (N=3 mice per condition; **, p<0.01). Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "photomicrograph", "of", "Golgi", "staining", "in", "hippocampus", "of", "a", "Tardbpfx", "/", "fx", "mouse", ".", "Sholl", "analysis", "of", "apical", "and", "basal", "dendritic", "arbors", "of", "CA1", "pyramidal", "neurons", "from", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ",", "20", "neurons", "per", "mouse", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "High", "-", "magnification", "representative", "photomicrograph", "of", "Golgi", "staining", "of", "the", "dendritic", "arbour", "of", "a", "CA1", "pyramidal", "neuron", "in", "a", "Tardbpfx", "/", "fx", "mouse", ".", "Black", "arrows", "denote", "selected", "dendritic", "spines", ".", "Spine", "density", "in", "apical", "and", "basal", "dendrites", "of", "CA1", "pyramidal", "neurons", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SD", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ",", "15", "sections", "per", "mouse", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Representative", "photomicrographs", "of", "a", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "hippocampus", "after", "stereotaxic", "injection", "of", "EGFP", "-", "expressing", "lentivirus", "immunostained", "for", "EGFP", "(", "green", ")", "and", "NeuN", "(", "red", ")", ",", "and", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "injected", "area", "within", "CA1", "is", "indicated", "in", "the", "merged", "panel", ".", "Expression", "of", "Tardbp", "(", "left", ")", ",", "total", "Sort1", "(", "center", ")", "and", "exon", "17b", "Sort1", "(", "right", ")", "mRNAs", "quantified", "by", "Q", "-", "PCR", "in", "micro", "-", "dissected", "CA1", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", "after", "injection", "of", "EGFP", "-", "expressing", "lentivirus", "or", "Sortilin", "rescue", "virus", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "relative", "to", "levels", "in", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", "injected", "with", "EGFP", "virus", ",", "after", "normalization", "to", "Gapdh", "mRNA", ".", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ")", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Spine", "density", "in", "apical", "dendrites", "of", "CA1", "pyramidal", "neurons", "of", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", "after", "injection", "of", "EGFP", "-", "expressing", "lentivirus", "or", "Sortilin", "rescue", "virus", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "(", "N", "=", "3", "mice", "per", "condition", ",", "15", "sections", "per", "mouse", ")", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative photomicrograph of Golgi staining in hippocampus of a Tardbpfx/fx mouse.Sholl analysis of apical and basal dendritic arbors of CA1 pyramidal neurons from Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice. Results are presented as average ± SEM (N=3 mice per condition, 20 neurons per mouse). *, p<0.05; **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.High-magnification representative photomicrograph of Golgi staining of the dendritic arbour of a CA1 pyramidal neuron in a Tardbpfx/fx mouse. Black arrows denote selected dendritic spines.Spine density in apical and basal dendrites of CA1 pyramidal neurons of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice. Results are presented as average ± SD (N=3 mice per condition, 15 sections per mouse; *, p<0.05; **, p<0.01). Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Representative photomicrographs of a CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx hippocampus after stereotaxic injection of EGFP-expressing lentivirus immunostained for EGFP (green) and NeuN (red), and counterstained with DAPI (blue). The injected area within CA1 is indicated in the merged panel.Expression of Tardbp (left), total Sort1 (center) and exon 17b Sort1 (right) mRNAs quantified by Q-PCR in micro-dissected CA1 of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice after injection of EGFP-expressing lentivirus or Sortilin rescue virus. Results are presented as average ± SEM relative to levels in Tardbpfx/fx mice injected with EGFP virus, after normalization to Gapdh mRNA. (N=3 mice per condition). **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Spine density in apical dendrites of CA1 pyramidal neurons of Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice after injection of EGFP-expressing lentivirus or Sortilin rescue virus. Results are presented as average ± SEM (N=3 mice per condition, 15 sections per mouse). **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis."}
{"words": ["Figure", "4Percentage", "of", "change", "in", "field", "excitatory", "postsynaptic", "potential", "(", "fEPSP", ")", "recorded", "from", "hippocampal", "area", "CA1", "after", "theta", "-", "burst", "stimulation", "(", "TBS", ")", "in", "Schaffer", "collaterals", "of", "hippocampal", "slices", "from", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "normalised", "to", "t", "=", "0", "±", "SEM", "(", "N", "=", "7", "slices", "from", "3", "mice", "per", "condition", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Percentage", "fEPSP", "change", "in", "CA1", "after", "TBS", "in", "Schaffer", "collaterals", "of", "hippocampal", "slices", "from", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", "stereotactically", "injected", "with", "EGFP", "-", "expressing", "lentivirus", "or", "Sortilin", "rescue", "virus", "(", "red", ")", "superimposed", "to", "the", "same", "data", "shown", "in", "panel", "(", "a", ")", "(", "black", ")", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "normalised", "to", "t", "=", "0", "±", "SEM", "(", "N", "=", "7", "slices", "from", "3", "mice", "per", "condition", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Percentage", "fEPSP", "change", "in", "CA1", "after", "TBS", "in", "Schaffer", "collaterals", "of", "hippocampal", "slices", "from", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", "under", "control", "conditions", "(", "black", ")", "or", "with", "BDNF", "(", "200ng", "/", "ml", ")", "perfused", "from", "t", "=", "0", "(", "green", ")", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "normalised", "to", "t", "=", "0", "±", "SEM", "(", "N", "=", "7", "slices", "from", "3", "mice", "per", "condition", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Percentage", "of", "total", "time", "spent", "in", "the", "target", "quadrant", "or", "in", "the", "remaining", "three", "quadrants", "of", "the", "Barnes", "maze", "for", "Tardbpfx", "/", "fx", "and", "CamKIIaCRE", ";", "Tardbpfx", "/", "fx", "mice", "at", "3", "different", "probe", "times", ":", "20", "-", "30", "min", "after", "first", "training", "session", "(", "short", "-", "term", "memory", ")", "and", "24h", "or", "14", "days", "after", "last", "training", "session", "(", "long", "-", "term", "or", "remote", "memory", ",", "respectively", ")", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "(", "N", "=", "8", "mice", "per", "condition", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Percentage of change in field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) recorded from hippocampal area CA1 after theta-burst stimulation (TBS) in Schaffer collaterals of hippocampal slices from Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice. Results are presented as average normalised to t=0 ± SEM (N=7 slices from 3 mice per condition). *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Percentage fEPSP change in CA1 after TBS in Schaffer collaterals of hippocampal slices from Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice stereotactically injected with EGFP-expressing lentivirus or Sortilin rescue virus (red) superimposed to the same data shown in panel (a) (black). Results are presented as average normalised to t=0 ± SEM (N=7 slices from 3 mice per condition). *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Percentage fEPSP change in CA1 after TBS in Schaffer collaterals of hippocampal slices from Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice under control conditions (black) or with BDNF (200ng/ml) perfused from t=0 (green). Results are presented as average normalised to t=0 ± SEM (N=7 slices from 3 mice per condition). *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Percentage of total time spent in the target quadrant or in the remaining three quadrants of the Barnes maze for Tardbpfx/fx and CamKIIaCRE;Tardbpfx/fx mice at 3 different probe times: 20-30 min after first training session (short-term memory) and 24h or 14 days after last training session (long-term or remote memory, respectively). Results are presented as average ± SEM (N=8 mice per condition; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001). Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis."}
{"words": ["Figure", "5Representative", "photomicrographs", "of", "cultured", "hippocampal", "neurons", "immunostained", "for", "TDP", "-", "43", "(", "green", ")", ",", "FLAG", "(", "red", ")", "and", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "control", "conditions", "(", "untransduced", ")", "or", "infected", "with", "lentivirus", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "human", "TDP", "-", "43", "12xQN", "construct", ".", "TDP", "-", "43", "intensity", "in", "cell", "nuclei", "of", "untransduced", "or", "TDP", "-", "43", "12xQN", "-", "infected", "hippocampal", "neurons", "normalized", "to", "mean", "nuclear", "intensity", "in", "untransduced", "neurons", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "B", ")", "Expression", "of", "Tardbp", "(", "left", ")", ",", "total", "Sort1", "(", "center", ")", "and", "exon", "17b", "Sort1", "(", "right", ")", "mRNAs", "quantified", "by", "Q", "-", "PCR", "in", "hippocampal", "neurons", "untransduced", "(", "control", ")", "or", "infected", "with", "lentiviruses", "expressing", "Tardbp", "shRNA", "or", "human", "TDP", "-", "43", "12xQN", "constructs", ".", "Values", "were", "first", "normalized", "to", "Gapdh", "mRNA", "levels", ",", "then", "plotted", "as", "average", "±", "SEM", "relative", "to", "levels", "in", "untransduced", "neurons", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysisBDNF", "secretion", "induced", "by", "KCl", "treatment", "as", "assessed", "by", "in", "-", "situ", "BDNF", "ELISA", "in", "cultured", "hippocampal", "neurons", "untransduced", "(", "control", ")", "or", "infected", "with", "lentiviruses", "expressing", "Tardbp", "shRNA", "or", "human", "TDP", "-", "43", "12xQN", "constructs", ".", "Histogram", "bars", "show", "average", "±", "SEM", "BDNF", "levels", "normalized", "to", "a", "standard", "curve", "(", "N", "=", "5", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "5", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysisBDNF", "secretion", "in", "cultured", "hippocampal", "neurons", "untransduced", "(", "control", ")", "or", "infected", "with", "lentiviruses", "expressing", "Tardbp", "shRNA", "or", "human", "TDP", "-", "43", "12xQN", "constructs", "together", "with", "either", "EGFP", "or", "Sortilin", "rescue", "viruses", ".", "Histogram", "bars", "show", "average", "±", "SEM", "BDNF", "levels", "normalized", "to", "a", "standard", "curve", "(", "N", "=", "5", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "5", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative photomicrographs of cultured hippocampal neurons immunostained for TDP-43 (green), FLAG (red) and counterstained with DAPI (blue) in control conditions (untransduced) or infected with lentivirus expressing FLAG-tagged human TDP-43 12xQN construct.TDP-43 intensity in cell nuclei of untransduced or TDP-43 12xQN-infected hippocampal neurons normalized to mean nuclear intensity in untransduced neurons. Results are presented as average ± SEM (N=3 independent experiments; n=3 wells per condition in each experiment). Student's t-test; **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using Student's t-test (B)Expression of Tardbp (left), total Sort1 (center) and exon 17b Sort1 (right) mRNAs quantified by Q-PCR in hippocampal neurons untransduced (control) or infected with lentiviruses expressing Tardbp shRNA or human TDP-43 12xQN constructs. Values were first normalized to Gapdh mRNA levels, then plotted as average ± SEM relative to levels in untransduced neurons (N=3 independent experiments; n=3 wells per condition in each experiment). 1-way ANOVA with Tukey's post-hoc; **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysisBDNF secretion induced by KCl treatment as assessed by in-situ BDNF ELISA in cultured hippocampal neurons untransduced (control) or infected with lentiviruses expressing Tardbp shRNA or human TDP-43 12xQN constructs. Histogram bars show average ± SEM BDNF levels normalized to a standard curve (N=5 independent experiments; n=5 wells per condition in each experiment). **, p<0.01; ***, p<0.001. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysisBDNF secretion in cultured hippocampal neurons untransduced (control) or infected with lentiviruses expressing Tardbp shRNA or human TDP-43 12xQN constructs together with either EGFP or Sortilin rescue viruses. Histogram bars show average ± SEM BDNF levels normalized to a standard curve (N=5 independent experiments; n=5 wells per condition in each experiment). **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis"}
{"words": ["Figure", "6Expression", "of", "Tardbp", "(", "left", ")", ",", "total", "Sort1", "(", "center", ")", "and", "exon", "17b", "Sort1", "(", "right", ")", "mRNAs", "quantified", "by", "Q", "-", "PCR", "in", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "Tardbp", "shRNA", "and", "mutant", "human", "TARDBP", "lentivirus", "constructs", "as", "indicated", ".", "Absolute", "levels", "of", "mouse", "Tardbp", "and", "human", "TARDBP", "mRNAs", "were", "determined", "using", "a", "standard", "curve", "and", "added", "together", "to", "assess", "total", "Tardbp", "mRNA", "levels", "relative", "to", "control", "uninfected", "cells", "after", "normalization", "to", "Gapdh", "mRNA", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Western", "blots", "of", "cell", "lysates", "showing", "total", "TDP", "-", "43", "expression", "in", "primary", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "Tardbp", "shRNA", "and", "mutant", "human", "TARDBP", "lentivirus", "constructs", "as", "indicated", ".", "The", "antibody", "used", "here", "detects", "both", "mouse", "and", "human", "TDP", "-", "43", "proteins", ".", "GAPDH", "immunoblotting", "was", "used", "to", "control", "for", "equal", "loading", ".", "Molecular", "weights", "are", "noted", "in", "kDa", ".", "Bands", "corresponding", "to", "mouse", "and", "human", "TDP", "-", "43", "are", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "BDNF", "secretion", "induced", "by", "KCl", "treatment", "assessed", "by", "in", "-", "situ", "BDNF", "ELISA", "in", "cultured", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "Tardbp", "shRNA", "and", "mutant", "human", "TARDBP", "lentivirus", "constructs", "as", "indicated", ".", "Histogram", "bars", "show", "average", "±", "SEM", "BDNF", "levels", "normalized", "to", "a", "standard", "curve", "(", "N", "=", "5", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "5", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "BDNF", "secretion", "induced", "by", "KCl", "treatment", "in", "cultured", "hippocampal", "neurons", "infected", "with", "Tardbp", "shRNA", "and", "mutant", "human", "TARDBP", "lentivirus", "constructs", "together", "with", "either", "EGFP", "or", "Sortilin", "rescue", "viruses", ".", "Histogram", "bars", "show", "average", "±", "SEM", "BDNF", "levels", "normalized", "to", "a", "standard", "curve", "(", "N", "=", "5", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "5", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "Expression", "of", "TARDBP", "(", "left", ")", ",", "total", "SORT1", "(", "center", ")", "and", "exon", "17b", "SORT1", "(", "right", ")", "mRNAs", "quantified", "by", "Q", "-", "PCR", "in", "human", "neurons", "derived", "from", "the", "indicated", "stem", "cells", "carrying", "either", "wild", "type", "Met337", "(", "grey", "bars", ")", "or", "disease", "-", "associated", "Val337", "(", "black", "bars", ")", "TARDBP", "alleles", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "3", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", ".", "BDNF", "secretion", "in", "stem", "-", "cell", "derived", "human", "neurons", "carrying", "wild", "type", "Met337or", "Val337", "TARDBP", "alleles", ",", "infected", "with", "proBDNF", "lentivirus", "5", "days", "prior", "to", "depolarization", "by", "KCl", "treatment", ".", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "SEM", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "5", "wells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Data", "information", ":", "Results", "are", "presented", "as", "average", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "All", "statistical", "tests", "were", "performed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "post", "hoc", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Expression of Tardbp (left), total Sort1 (center) and exon 17b Sort1 (right) mRNAs quantified by Q-PCR in hippocampal neurons infected with Tardbp shRNA and mutant human TARDBP lentivirus constructs as indicated. Absolute levels of mouse Tardbp and human TARDBP mRNAs were determined using a standard curve and added together to assess total Tardbp mRNA levels relative to control uninfected cells after normalization to Gapdh mRNA. Results are presented as average ± SEM (N=3 independent experiments; n=3 wells per condition in each experiment). *, p<0.05; **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Western blots of cell lysates showing total TDP-43 expression in primary hippocampal neurons infected with Tardbp shRNA and mutant human TARDBP lentivirus constructs as indicated. The antibody used here detects both mouse and human TDP-43 proteins. GAPDH immunoblotting was used to control for equal loading. Molecular weights are noted in kDa. Bands corresponding to mouse and human TDP-43 are indicated. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.BDNF secretion induced by KCl treatment assessed by in-situ BDNF ELISA in cultured hippocampal neurons infected with Tardbp shRNA and mutant human TARDBP lentivirus constructs as indicated. Histogram bars show average ± SEM BDNF levels normalized to a standard curve (N=5 independent experiments; n=5 wells per condition in each experiment). *, p<0.05; ***, p<0.001 Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.BDNF secretion induced by KCl treatment in cultured hippocampal neurons infected with Tardbp shRNA and mutant human TARDBP lentivirus constructs together with either EGFP or Sortilin rescue viruses. Histogram bars show average ± SEM BDNF levels normalized to a standard curve (N=5 independent experiments; n=5 wells per condition in each experiment). *, p<0.05; **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.Expression of TARDBP (left), total SORT1 (center) and exon 17b SORT1 (right) mRNAs quantified by Q-PCR in human neurons derived from the indicated stem cells carrying either wild type Met337 (grey bars) or disease-associated Val337 (black bars) TARDBP alleles. Results are presented as average ± SEM (N=3 independent experiments; n=3 wells per condition in each experiment). *, p<0.05; **, p<0.01. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis.BDNF secretion in stem-cell derived human neurons carrying wild type Met337or Val337 TARDBP alleles, infected with proBDNF lentivirus 5 days prior to depolarization by KCl treatment. Results are presented as average ± SEM (N=3 independent experiments; n=5 wells per condition in each experiment). **, p<0.01; ***, p<0.001. Data information: Results are presented as average ± standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using 2-way ANOVA with Sidak post hoc analysis."}
{"words": ["Figure", "1Asynchronously", "growing", "human", "U", "-", "2", "OS", "cells", "were", "treated", "with", "0", ".", "5", "Gy", "of", "IR", ",", "allowed", "to", "recover", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ",", "and", "stained", "for", "53BP1", "and", "DNA", "content", "for", "cell", "cycle", "resolved", "quantification", "of", "53BP1", "foci", "in", "individual", "cells", "by", "QIBC", ".", "Representative", "images", "from", "the", "QIBC", "analysis", "in", "(", "A", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "0", ".", "5", "Gy", "of", "IR", "in", "absence", "or", "presence", "of", "0", ".", "4", "M", "sorbitol", ",", "fixed", "1h", "later", ",", "and", "53BP1", "assembly", "at", "DSBs", "was", "analyzed", "by", "QIBC", ".", "Treatments", "as", "in", "(", "C", ")", ";", "RIF1", "accumulation", "at", "DSBs", "was", "analyzed", "by", "QIBC", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Asynchronously growing human U-2 OS cells were treated with 0.5 Gy of IR, allowed to recover for the indicated time periods, and stained for 53BP1 and DNA content for cell cycle resolved quantification of 53BP1 foci in individual cells by QIBC.Representative images from the QIBC analysis in (A). Scale bars, 10 μm.Cells were treated with 0.5 Gy of IR in absence or presence of 0.4 M sorbitol, fixed 1h later, and 53BP1 assembly at DSBs was analyzed by QIBC. Treatments as in (C); RIF1 accumulation at DSBs was analyzed by QIBC."}
{"words": ["Figure", "2U", "-", "2", "OS", "cells", "were", "treated", "with", "0", ".", "5", "Gy", "of", "IR", ",", "allowed", "to", "recover", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ",", "stained", "for", "53BP1", "and", "MDC1", ",", "and", "analyzed", "by", "QIBC", ".", "53BP1", "foci", "intensities", "are", "plotted", "against", "MDC1", "foci", "intensities", ",", "and", "representative", "images", "are", "shown", ".", "U", "-", "2", "OS", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "MDC1", "or", "GFP", "-", "53BP1", "were", "treated", "with", "1", "Gy", "of", "IR", "and", "analyzed", "by", "live", "cell", "microscopy", "at", "15", "min", "intervals", ".", "Representative", "images", "are", "provided", "and", "kinetics", "of", "GFP", "-", "MDC1", "and", "GFP", "-", "53BP1", "foci", "formation", "and", "dissolution", "are", "shown", "as", "single", "cell", "tracks", ".", "Bold", "lines", "represent", "averages", "from", "n", "=", "29", "for", "GFP", "-", "MDC1", "and", "n", "=", "18", "for", "GFP", "-", "53BP1", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2U-2 OS cells were treated with 0.5 Gy of IR, allowed to recover for the indicated time periods, stained for 53BP1 and MDC1, and analyzed by QIBC. 53BP1 foci intensities are plotted against MDC1 foci intensities, and representative images are shown.U-2 OS cells stably expressing GFP-MDC1 or GFP-53BP1 were treated with 1 Gy of IR and analyzed by live cell microscopy at 15 min intervals. Representative images are provided and kinetics of GFP-MDC1 and GFP-53BP1 foci formation and dissolution are shown as single cell tracks. Bold lines represent averages from n=29 for GFP-MDC1 and n=18 for GFP-53BP1 cells."}
{"words": ["Figure", "3U", "-", "2", "OS", "cells", "were", "treated", "with", "1", "Gy", "of", "IR", "and", "fixed", "at", "the", "indicated", "time", "-", "points", ".", "Mean", "53BP1", "foci", "intensity", "was", "analyzed", "from", "more", "than", "1500", "cells", "per", "time", "-", "point", ".", "Mean", "(", "solid", "line", ")", "and", "standard", "deviation", "from", "the", "mean", "(", "dashed", "lines", ")", "are", "indicated", ".", "The", "same", "cells", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "analyzed", "for", "mean", "MDC1", "foci", "intensity", ".", "Mean", "(", "solid", "line", ")", "and", "standard", "deviation", "from", "the", "mean", "(", "dashed", "lines", ")", "are", "indicated", ".", "GFP", "-", "53BP1", "cells", "were", "treated", "with", "25", "ng", "/", "ml", "NCS", "to", "induce", "DNA", "breaks", "and", "imaged", "at", "30", "minutes", "intervals", ".", "Examples", "of", "GFP", "-", "53BP1", "fusions", "(", "green", "arrowheads", "and", "magnified", "regions", ")", "and", "fissions", "(", "blue", "arrowheads", "and", "magnified", "regions", ")", "are", "shown", ".", "53BP1", "-", "RFP", "cells", ",", "in", "which", "the", "endogenous", "53BP1", "gene", "locus", "had", "been", "engineered", "by", "CRISPR", "/", "Cas9", "to", "express", "53BP1", "-", "mScarlet", "from", "the", "natural", "promoter", ",", "were", "treated", "with", "NCS", "(", "25", "ng", "/", "ml", ")", "and", "imaged", "at", "30", "minutes", "intervals", ".", "Examples", "of", "53BP1", "fusions", "(", "green", "arrowheads", "and", "magnified", "regions", ")", "and", "fissions", "(", "blue", "arrowheads", "and", "magnified", "regions", ")", "are", "shown", "on", "the", "left", "and", "in", "higher", "magnification", "on", "the", "right", ".", "GFP", "-", "53BP1", "cells", "were", "left", "untreated", ",", "or", "treated", "with", "APH", "(", "0", ".", "5", "μM", ")", "or", "ATRi", "(", "1", "μM", ")", "to", "induce", "replication", "stress", "-", "associated", "heritable", "DNA", "lesions", ",", "and", "cells", "were", "imaged", "at", "30", "minutes", "intervals", ".", "Examples", "of", "53BP1", "fusions", "(", "green", "arrowheads", "and", "magnified", "regions", ")", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3U-2 OS cells were treated with 1 Gy of IR and fixed at the indicated time-points. Mean 53BP1 foci intensity was analyzed from more than 1500 cells per time-point. Mean (solid line) and standard deviation from the mean (dashed lines) are indicated. The same cells as in (A) were analyzed for mean MDC1 foci intensity. Mean (solid line) and standard deviation from the mean (dashed lines) are indicated.GFP-53BP1 cells were treated with 25 ng/ml NCS to induce DNA breaks and imaged at 30 minutes intervals. Examples of GFP-53BP1 fusions (green arrowheads and magnified regions) and fissions (blue arrowheads and magnified regions) are shown.53BP1-RFP cells, in which the endogenous 53BP1 gene locus had been engineered by CRISPR/Cas9 to express 53BP1-mScarlet from the natural promoter, were treated with NCS (25 ng/ml) and imaged at 30 minutes intervals. Examples of 53BP1 fusions (green arrowheads and magnified regions) and fissions (blue arrowheads and magnified regions) are shown on the left and in higher magnification on the right.GFP-53BP1 cells were left untreated, or treated with APH (0.5 μM) or ATRi (1 μM) to induce replication stress-associated heritable DNA lesions, and cells were imaged at 30 minutes intervals. Examples of 53BP1 fusions (green arrowheads and magnified regions) are shown."}
{"words": ["Figure", "4Light", "-", "induced", "optoDroplet", "formation", "of", "Cry2", "-", "mCherry", "-", "53BP1", ",", "Cry2", "-", "mCherry", "-", "53BP1", "W1495A", ",", "and", "Cry2", "-", "mCherry", "-", "MDC1", ".", "Cells", "were", "imaged", "at", "15", "seconds", "intervals", ".", "Representative", "images", "of", "optoDroplet", "formation", "before", "and", "6", "minutes", "after", "light", "induction", "are", "shown", ".", "Quantifications", "from", "single", "-", "cell", "QIBC", "analysis", "of", "2", "-", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", "with", "mean", "(", "solid", "line", ")", "and", "standard", "deviation", "from", "the", "mean", "(", "dashed", "lines", ")", "indicated", ".", "Cry2", "-", "mCherry", "-", "53BP1", "W1495A", "optoDroplet", "fusion", "at", "15", "seconds", "time", "resolution", ".", "Fusing", "optodroplets", "are", "highlighted", "by", "green", "arrowheads", "and", "in", "the", "magnified", "insets", ".", "Light", "-", "induced", "optoDroplet", "formation", "of", "the", "indicated", "Cry2", "-", "mCherry", "-", "53BP1", "constructs", ".", "Cells", "were", "imaged", "at", "15", "seconds", "intervals", ".", "Representative", "images", "and", "quantifications", "of", "optoDroplet", "formation", "before", "and", "6", "minutes", "after", "light", "induction", "are", "shown", ".", "Quantifications", "from", "single", "-", "cell", "QIBC", "analysis", "of", "2", "-", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", "with", "mean", "(", "solid", "line", ")", "and", "standard", "deviation", "from", "the", "mean", "(", "dashed", "lines", ")", "indicated", ".", "Red", "bars", "indicate", "the", "part", "of", "53BP1", "that", "was", "expressed", "as", "Cry2", "-", "mCherry", "fusion", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Light-induced optoDroplet formation of Cry2-mCherry-53BP1, Cry2-mCherry-53BP1 W1495A, and Cry2-mCherry-MDC1. Cells were imaged at 15 seconds intervals. Representative images of optoDroplet formation before and 6 minutes after light induction are shown. Quantifications from single-cell QIBC analysis of 2-3 independent experiments are shown with mean (solid line) and standard deviation from the mean (dashed lines) indicated.Cry2-mCherry-53BP1 W1495A optoDroplet fusion at 15 seconds time resolution. Fusing optodroplets are highlighted by green arrowheads and in the magnified insets.Light-induced optoDroplet formation of the indicated Cry2-mCherry-53BP1 constructs. Cells were imaged at 15 seconds intervals. Representative images and quantifications of optoDroplet formation before and 6 minutes after light induction are shown. Quantifications from single-cell QIBC analysis of 2-3 independent experiments are shown with mean (solid line) and standard deviation from the mean (dashed lines) indicated. Red bars indicate the part of 53BP1 that was expressed as Cry2-mCherry fusion."}
{"words": ["Figure", "5Cry2", "-", "mCherry", "-", "53BP1", "1203", "-", "1972", "W1495A", "optoDroplets", "undergo", "fusion", "events", "upon", "light", "induction", ".", "Fusing", "optodroplets", "are", "highlighted", "by", "green", "arrowheads", "and", "in", "the", "magnified", "insets", ".", "Concentration", "-", "dependent", "optoDroplet", "formation", "exemplified", "by", "two", "neighboring", "cells", "that", "differ", "in", "their", "Cry2", "-", "mCherry", "-", "53BP1", "1203", "-", "1972", "W1495A", "expression", "level", ".", "Cells", "were", "imaged", "at", "15", "seconds", "intervals", ".", "Quantifications", "of", "optoDroplet", "formation", "in", "lowly", "expressing", "cells", "(", "mClow", ")", "and", "highly", "expressing", "cells", "(", "mChigh", ")", "from", "single", "-", "cell", "QIBC", "analysis", "of", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", "with", "mean", "(", "solid", "line", ")", "and", "standard", "deviation", "from", "the", "mean", "(", "dashed", "lines", ")", "indicated", ".", "Cry2", "-", "mEGFP", "-", "53BP1", "1203", "-", "1972", "W1495A", "assembles", "into", "FokI", "-", "induced", "DNA", "repair", "compartments", "within", "seconds", "after", "light", "induction", ".", "FokI", "was", "induced", "for", "1h", "where", "indicated", "before", "cells", "were", "light", "-", "activated", "and", "imaged", "at", "15", "seconds", "intervals", ".", "Red", "arrowheads", "mark", "the", "FokI", "-", "induced", "lesion", "with", "mCherry", "accumulation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Cry2-mCherry-53BP1 1203-1972 W1495A optoDroplets undergo fusion events upon light induction. Fusing optodroplets are highlighted by green arrowheads and in the magnified insets.Concentration-dependent optoDroplet formation exemplified by two neighboring cells that differ in their Cry2-mCherry-53BP1 1203-1972 W1495A expression level. Cells were imaged at 15 seconds intervals. Quantifications of optoDroplet formation in lowly expressing cells (mClow) and highly expressing cells (mChigh) from single-cell QIBC analysis of 3 independent experiments are shown with mean (solid line) and standard deviation from the mean (dashed lines) indicated.Cry2-mEGFP-53BP1 1203-1972 W1495A assembles into FokI-induced DNA repair compartments within seconds after light induction. FokI was induced for 1h where indicated before cells were light-activated and imaged at 15 seconds intervals. Red arrowheads mark the FokI-induced lesion with mCherry accumulation."}
{"words": ["Figure", "6Cry2", "-", "mCherry", "-", "53BP1", "1203", "-", "1972", "W1495A", "optoDroplets", "were", "induced", "as", "indicated", "and", "fixed", "5", "minutes", "later", ".", "Endogenous", "BRCA1", "and", "p53", "were", "co", "-", "stained", ".", "As", "in", "(", "A", ")", ",", "comparing", "Cry2", "-", "mCherry", "-", "53BP1", "constructs", "with", "and", "without", "the", "BRCT", "domains", ".", "Quantifications", "of", "p53", "assembly", "into", "53BP1", "optoDroplets", "from", "single", "-", "cell", "QIBC", "analysis", "of", "500", "-", "600", "cells", "per", "condition", "are", "shown", "below", "with", "mean", "(", "solid", "line", ")", "and", "standard", "deviation", "from", "the", "mean", "(", "dashed", "lines", ")", "indicated", ".", "Red", "bars", "indicate", "the", "part", "of", "53BP1", "that", "was", "expressed", "as", "Cry2", "-", "mCherry", "fusion", ".", "Western", "blot", "of", "p53", "induction", "upon", "DNA", "damage", "(", "10", "Gy", ",", "2h", ")", "with", "and", "without", "0", ".", "4", "M", "Sorbitol", ".", "qPCR", "of", "p21", "induction", "upon", "DNA", "damage", "(", "10", "Gy", ",", "2h", ")", "with", "and", "without", "0", ".", "4", "M", "sorbitol", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "is", "indicated", ".", "Western", "blot", "of", "p21", "induction", "upon", "DNA", "damage", "(", "10", "Gy", ",", "2h", ")", "with", "and", "without", "0", ".", "4", "M", "sorbitol", ".", "QIBC", "cell", "cycle", "analysis", "based", "on", "DNA", "content", "and", "nuclear", "Cyclin", "A", "levels", "upon", "DNA", "damage", "with", "and", "without", "0", ".", "4", "M", "sorbitol", ".", "Cells", "were", "irradiated", "with", "2", "Gy", "in", "absence", "or", "presence", "of", "0", ".", "4", "M", "sorbitol", ".", "After", "1h", "of", "recovery", ",", "sorbitol", "-", "containing", "medium", "was", "exchanged", "with", "fresh", "medium", ",", "and", "cells", "were", "allowed", "to", "recover", "for", "an", "additional", "7h", ".", "Percentages", "in", "G1", "and", "S", "/", "G2", "are", "provided", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Cry2-mCherry-53BP1 1203-1972 W1495A optoDroplets were induced as indicated and fixed 5 minutes later. Endogenous BRCA1 and p53 were co-stained.As in (A), comparing Cry2-mCherry-53BP1 constructs with and without the BRCT domains. Quantifications of p53 assembly into 53BP1 optoDroplets from single-cell QIBC analysis of 500-600 cells per condition are shown below with mean (solid line) and standard deviation from the mean (dashed lines) indicated. Red bars indicate the part of 53BP1 that was expressed as Cry2-mCherry fusion.Western blot of p53 induction upon DNA damage (10 Gy, 2h) with and without 0.4 M Sorbitol.qPCR of p21 induction upon DNA damage (10 Gy, 2h) with and without 0.4 M sorbitol. Mean ± standard deviation is indicated.Western blot of p21 induction upon DNA damage (10 Gy, 2h) with and without 0.4 M sorbitol.QIBC cell cycle analysis based on DNA content and nuclear Cyclin A levels upon DNA damage with and without 0.4 M sorbitol. Cells were irradiated with 2 Gy in absence or presence of 0.4 M sorbitol. After 1h of recovery, sorbitol-containing medium was exchanged with fresh medium, and cells were allowed to recover for an additional 7h. Percentages in G1 and S/G2 are provided."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", "-", "J", ")", "All", "panels", "show", "Drosophila", "3rd", "instar", "larval", "eye", "imaginal", "discs", "with", "eyeless", "-", "Flippase", "-", "induced", "clones", "of", "cells", "homozygous", "for", "EMC3Δ4", "labelled", "by", "the", "absence", "of", "ubiGFP", "(", "green", ")", ".", "The", "red", "channel", "shows", "ELAV", ",", "which", "labels", "the", "nuclei", "of", "photoreceptor", "cells", ".", "All", "UAS", "constructs", "were", "expressed", "under", "the", "control", "of", "GMR", "-", "GAL4", ".", "(", "C", ")", "Expression", "of", "UAS", "-", "Rh1", "(", "4C5", ",", "in", "blue", ")", "and", "(", "D", ")", "Na", "+", "K", "+", "ATPase", "(", "A5", "-", "C", ",", "in", "blue", ")", "is", "strongly", "reduced", "in", "EMC3Δ4", "homozygous", "mutant", "cells", ".", "(", "E", ")", "Expression", "of", "UAS", "-", "Xport", "-", "A", "-", "HA", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "and", "(", "F", ")", "UAS", "-", "fan", "-", "HA", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "is", "strongly", "reduced", "in", "EMC3Δ4", "homozygous", "mutant", "cells", ".", "(", "G", ")", "Expression", "of", "UAS", "-", "rtv", "-", "HA", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "and", "(", "H", ")", "hid", "(", "anti", "-", "hid", ",", "in", "blue", ")", "is", "increased", "in", "EMC3Δ4", "homozygous", "mutant", "cells", ".", "(", "I", "-", "J", ")", "Normal", "expression", "of", "two", "TA", "proteins", "in", "EMC3Δ4", "homozygous", "mutant", "cells", ".", "(", "I", ")", "UAS", "-", "CG8814", "-", "HA", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "is", "a", "TA", "protein", "containing", "a", "TMD", "of", "low", "hydrophobicity", "(", "J", ")", "UAS", "-", "Syx13", "-", "HA", "is", "a", "TA", "protein", "with", "high", "hydrophobicity", "TMD", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C-J) All panels show Drosophila 3rd instar larval eye imaginal discs with eyeless-Flippase-induced clones of cells homozygous for EMC3Δ4 labelled by the absence of ubiGFP (green). The red channel shows ELAV, which labels the nuclei of photoreceptor cells. All UAS constructs were expressed under the control of GMR-GAL4. (C) Expression of UAS-Rh1 (4C5, in blue) and (D) Na+K+ATPase (A5-C, in blue) is strongly reduced in EMC3Δ4 homozygous mutant cells. (E) Expression of UAS-Xport-A-HA (anti-HA, in blue) and (F) UAS-fan-HA (anti-HA, in blue) is strongly reduced in EMC3Δ4 homozygous mutant cells. (G) Expression of UAS-rtv-HA (anti-HA, in blue) and (H) hid (anti-hid, in blue) is increased in EMC3Δ4 homozygous mutant cells. (I-J) Normal expression of two TA proteins in EMC3Δ4 homozygous mutant cells. (I) UAS-CG8814-HA (anti-HA, in blue) is a TA protein containing a TMD of low hydrophobicity (J) UAS-Syx13-HA is a TA protein with high hydrophobicity TMD. Scale bars represent 10 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", "-", "D", ")", "-", "Immunostaining", "of", "3rd", "instar", "larval", "eye", "imaginal", "discs", "with", "eyeless", "-", "Flippase", "-", "induced", "clones", "of", "cells", "homozygous", "for", "EMC3Δ4", ",", "labelled", "by", "the", "absence", "of", "ubiGFP", "(", "green", ")", "shows", "reduced", "expression", "of", "(", "B", ")", "UAS", "-", "HA", "-", "Xport", "-", "A", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "but", "normal", "expression", "of", "(", "C", ")", "UAS", "-", "HA", "-", "Xport", "-", "A4L", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "or", "(", "D", ")", "UAS", "-", "Xport", "-", "A4L", "-", "HA", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "in", "EMC3", "mutant", "homozygous", "cells", ".", "ELAV", "(", "red", "in", "B", "and", "C", ")", "marks", "photoreceptor", "cells", "and", "Na", "+", "K", "+", "ATPase", "(", "red", "in", "D", ")", "acts", "as", "a", "positive", "control", "for", "the", "presence", "of", "EMC3Δ4", "homozygous", "mutant", "clones", ".", "The", "UAS", "constructs", "were", "expressed", "under", "the", "control", "of", "GMR", "-", "GAL4", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Immunostaining", "of", "mosaic", "adult", "retina", "with", "eyeless", "-", "Flippase", "-", "induced", "clones", "of", "cells", "homozygous", "for", "EMC3e02662", ",", "labelled", "by", "the", "absence", "of", "RFP", "(", "red", ")", ",", "show", "loss", "of", "(", "E", ")", "UAS", "-", "HA", "-", "Xport", "-", "A", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "in", "EMC3", "mutant", "homozygous", "cells", ".", "(", "F", ")", "Expression", "of", "UAS", "-", "HA", "-", "Xport", "-", "A4L", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "is", "normal", "in", "EMC3e02662", "homozygous", "mutant", "clones", ".", "The", "rhabdomeres", "are", "stained", "for", "actin", "(", "Phalloidin", ",", "in", "green", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B-D) - Immunostaining of 3rd instar larval eye imaginal discs with eyeless-Flippase-induced clones of cells homozygous for EMC3Δ4, labelled by the absence of ubiGFP (green) shows reduced expression of (B) UAS-HA-Xport-A (anti-HA, in blue) but normal expression of (C) UAS-HA-Xport-A4L (anti-HA, in blue) or (D) UAS-Xport-A4L-HA (anti-HA, in blue) in EMC3 mutant homozygous cells. ELAV (red in B and C) marks photoreceptor cells and Na+K+ATPase (red in D) acts as a positive control for the presence of EMC3Δ4 homozygous mutant clones. The UAS constructs were expressed under the control of GMR-GAL4. Scale bars represent 10 μm.(E-F) Immunostaining of mosaic adult retina with eyeless-Flippase-induced clones of cells homozygous for EMC3e02662, labelled by the absence of RFP (red), show loss of (E) UAS-HA-Xport-A (anti-HA, in blue) in EMC3 mutant homozygous cells. (F) Expression of UAS-HA-Xport-A4L (anti-HA, in blue) is normal in EMC3e02662 homozygous mutant clones. The rhabdomeres are stained for actin (Phalloidin, in green). Scale bars represent 10 μm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", "-", "D", ")", "Histograms", "of", "flow", "cytometry", "data", "monitoring", "the", "fluorescence", "protein", "ratio", "in", "the", "indicated", "U2OS", "cell", "lines", "for", "each", "construct", ".", "\"", "EMC5KO", "+", "EV", "\"", "indicates", "a", "knockout", "of", "EMC5", "stably", "harbouring", "empty", "vector", ",", "while", "'", "'", "EMC5KO", "+", "EMC5", "\"", "indicates", "EMC5KO", "cells", "rescued", "by", "inducible", "re", "-", "expression", "of", "a", "stably", "integrated", "EMC5", ".", "(", "E", "-", "G", ")", "Histograms", "of", "flow", "cytometry", "data", "monitoring", "the", "fluorescence", "protein", "ratio", "in", "the", "indicated", "U2OS", "cell", "lines", "for", "each", "construct", ".", "\"", "EMC6KO", "+", "EV", "\"", "indicates", "a", "knockout", "of", "EMC6", "stably", "harbouring", "empty", "vector", ",", "while", "'", "'", "EMC6KO", "+", "EMC6", "\"", "indicates", "EMC6KO", "cells", "rescued", "by", "re", "-", "expression", "of", "a", "stably", "integrated", "EMC6", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B-D) Histograms of flow cytometry data monitoring the fluorescence protein ratio in the indicated U2OS cell lines for each construct. \"EMC5KO+EV\" indicates a knockout of EMC5 stably harbouring empty vector, while ''EMC5KO+EMC5\" indicates EMC5KO cells rescued by inducible re-expression of a stably integrated EMC5. (E-G) Histograms of flow cytometry data monitoring the fluorescence protein ratio in the indicated U2OS cell lines for each construct. \"EMC6KO+EV\" indicates a knockout of EMC6 stably harbouring empty vector, while ''EMC6KO+EMC6\" indicates EMC6KO cells rescued by re-expression of a stably integrated EMC6."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", "-", "G", ")", "(", "C", "-", "D", ",", "F", ")", "Western", "-", "Blot", "of", "WT", "and", "EMC6KO", "(", "6KO", ")", "U2OS", "cell", "lines", "transiently", "transfected", "with", "the", "opsin", "-", "tagged", "constructs", "probed", "for", "HA", ".", "When", "indicated", ",", "denatured", "samples", "were", "treated", "with", "PNGase", "to", "confirm", "glycosylation", ".", "Glycosylated", "proteins", "shift", "upwards", "in", "the", "gel", "and", "are", "indicated", "by", "arrows", "(", "", ")", ".", "(", "E", ",", "G", ")", "Western", "-", "Blot", "of", "WT", "and", "EMC6KO", "(", "6KO", ")", "U2OS", "cell", "lines", "transiently", "transfected", "with", "the", "opsin", "-", "tagged", "constructs", "probed", "for", "Actin", "and", "EMC6", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C-G) (C-D, F) Western-Blot of WT and EMC6KO (6KO) U2OS cell lines transiently transfected with the opsin-tagged constructs probed for HA. When indicated, denatured samples were treated with PNGase to confirm glycosylation. Glycosylated proteins shift upwards in the gel and are indicated by arrows (). (E, G) Western-Blot of WT and EMC6KO (6KO) U2OS cell lines transiently transfected with the opsin-tagged constructs probed for Actin and EMC6."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "B", ")", "Immunostaining", "of", "3rd", "instar", "larval", "eye", "imaginal", "discs", "with", "eyeless", "-", "Flippase", "-", "induced", "clones", "of", "cells", "homozygous", "for", "EMC3Δ4", ",", "labelled", "by", "the", "absence", "of", "ubiGFP", "(", "green", ")", "show", "loss", "of", "(", "A", ")", "UAS", "-", "Xport", "-", "A", "-", "HA", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "and", "UAS", "-", "Rh1", "(", "4C5", ",", "in", "red", ")", ".", "(", "B", ")", "Expression", "of", "UAS", "-", "Xport", "-", "A4L", "(", "anti", "-", "HA", ",", "in", "blue", ")", "and", "UAS", "-", "Rh1", "(", "4C5", ",", "in", "red", ")", "is", "observed", "in", "EMC3Δ4", "homozygous", "cells", ".", "The", "UAS", "constructs", "were", "expressed", "under", "the", "control", "of", "GMR", "-", "GAL4", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Immunostaining", "of", "mosaic", "adult", "retinas", "with", "eyeless", "-", "Flippase", "-", "induced", "clones", "of", "cells", "homozygous", "for", "EMC3e02662", ",", "labelled", "by", "the", "absence", "of", "RFP", "(", "red", ")", ",", "show", "loss", "of", "(", "C", ")", "TRP", "(", "Mab83F6", ",", "in", "blue", ")", "when", "UAS", "-", "HA", "-", "Xport", "-", "A", "is", "expressed", ".", "(", "D", ")", "Expression", "of", "TRP", "(", "Mab83F6", ",", "in", "blue", ")", "is", "observed", "in", "EMC3e02662", "homozygous", "cells", ",", "when", "HA", "-", "Xport", "-", "A4L", "is", "expressed", ".", "The", "rhabdomeres", "are", "stained", "for", "actin", "(", "Phalloidin", ",", "in", "green", ")", ".", "The", "UAS", "constructs", "were", "expressed", "under", "the", "control", "of", "Rh1", "-", "GAL4", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-B) Immunostaining of 3rd instar larval eye imaginal discs with eyeless-Flippase-induced clones of cells homozygous for EMC3Δ4, labelled by the absence of ubiGFP (green) show loss of (A) UAS-Xport-A-HA (anti-HA, in blue) and UAS-Rh1 (4C5, in red). (B) Expression of UAS-Xport-A4L (anti-HA, in blue) and UAS-Rh1 (4C5, in red) is observed in EMC3Δ4 homozygous cells. The UAS constructs were expressed under the control of GMR-GAL4. Scale bars represent 10 μm.(C-D) Immunostaining of mosaic adult retinas with eyeless-Flippase-induced clones of cells homozygous for EMC3e02662, labelled by the absence of RFP (red), show loss of (C) TRP (Mab83F6, in blue) when UAS-HA-Xport-A is expressed. (D) Expression of TRP (Mab83F6, in blue) is observed in EMC3e02662 homozygous cells, when HA-Xport-A4L is expressed. The rhabdomeres are stained for actin (Phalloidin, in green). The UAS constructs were expressed under the control of Rh1-GAL4. Scale bars represent 10 μm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "E", "-", "G", ")", "Western", "blot", "of", "fly", "heads", "labelled", "for", "V5", ",", "TRP", ",", "Rh1", ",", "Xport", "-", "A", "(", "Xp", "-", "A", ")", "and", "tubulin", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "of", "fly", "heads", "expressing", "Rh1Gal4", "(", "driver", ")", "(", "left", ")", "or", "Rh1", "TMD1", "-", "V5", "(", "right", ")", "in", "Xport", "-", "A", "heterozygous", "(", "Xport", "-", "A1", "/", "TM6B", ")", "or", "homozygous", "mutant", "flies", "(", "Xport", "-", "A1", "/", "Xport", "-", "A1", ")", ".", "Extracts", "were", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "with", "PNGase", "F", "enzyme", "(", "lanes", "2", ",", "4", ",", "6", "and", "8", ")", ".", "For", "Rh1Gal4", ",", "4", "fly", "heads", "were", "loaded", "per", "well", ",", "while", "for", "Rh1", "TMD1", "-", "V5", ",", "8", "fly", "heads", "were", "loaded", "per", "well", ".", "(", "F", ")", "Immunoblot", "of", "fly", "heads", "expressing", "Rh1", "TMD1", "-", "3", "-", "V5", "in", "Xport", "-", "A", "heterozygous", "(", "Xport", "-", "A1", "/", "TM6B", ")", "or", "homozygous", "mutant", "flies", "(", "Xport", "-", "A1", "/", "Xport", "-", "A1", ")", ".", "Extracts", "were", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "with", "PNGase", "F", "enzyme", "(", "lanes", "2", "and", "4", ")", ".", "Eight", "fly", "heads", "were", "loaded", "per", "lane", ".", "(", "G", ")", "Immunoblot", "of", "fly", "heads", "expressing", "Rh1", "TMD1", "-", "5", "-", "V5", "in", "Xport", "-", "A", "heterozygote", "(", "Xport", "-", "A1", "/", "TM6B", ")", "or", "homozygous", "mutant", "flies", "(", "Xport", "-", "A1", "/", "Xport", "-", "A1", ")", ".", "Extracts", "were", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "with", "either", "Endo", "-", "H", "(", "lanes", "2", "and", "5", ")", "or", "PNGase", "F", "enzyme", "(", "lanes", "3", "and", "6", ")", ".", "Each", "lane", "contains", "approximately", "2", ",", "5", "fly", "heads", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(E-G) Western blot of fly heads labelled for V5, TRP, Rh1, Xport-A (Xp-A) and tubulin. (E) Immunoblot of fly heads expressing Rh1Gal4 (driver) (left) or Rh1 TMD1-V5 (right) in Xport-A heterozygous (Xport-A1/TM6B) or homozygous mutant flies (Xport-A1/Xport-A1). Extracts were untreated (-) or treated (+) with PNGase F enzyme (lanes 2, 4, 6 and 8). For Rh1Gal4, 4 fly heads were loaded per well, while for Rh1 TMD1-V5, 8 fly heads were loaded per well. (F) Immunoblot of fly heads expressing Rh1 TMD1-3-V5 in Xport-A heterozygous (Xport-A1/TM6B) or homozygous mutant flies (Xport-A1/Xport-A1). Extracts were untreated (-) or treated (+) with PNGase F enzyme (lanes 2 and 4). Eight fly heads were loaded per lane. (G) Immunoblot of fly heads expressing Rh1 TMD1-5-V5 in Xport-A heterozygote (Xport-A1/TM6B) or homozygous mutant flies (Xport-A1/Xport-A1). Extracts were untreated (-) or treated (+) with either Endo-H (lanes 2 and 5) or PNGase F enzyme (lanes 3 and 6). Each lane contains approximately 2,5 fly heads."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "The", "upper", "panel", "showing", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "four", "identified", "LUAD", "-", "associated", "RBPs", "(", "ADARB1", ",", "CELF2", ",", "QKI", "and", "ZFP36", ")", "mRNA", "levels", "in", "61", "LUAD", "tissues", "and", "matched", "paracarcinoma", "tissues", ".", "The", "lower", "panel", "showing", "relative", "mRNA", "expression", "(", "T", "/", "N", ")", "of", "the", "four", "RBPs", "in", "metastatic", "(", "n", "=", "28", ")", "and", "non", "-", "metastatic", "(", "n", "=", "33", ")", "LUAD", "tissues", ".", "LUAD", "tissues", "were", "classified", "into", "metastatic", "and", "non", "-", "metastatic", "tissues", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "T", ",", "LUAD", "tissues", ";", "N", ",", "paracarcinoma", "tissues", ".", "Y", "axis", "represents", "the", "log10", "transformed", "fold", "change", "of", "mRNA", "expression", "(", "T", "/", "N", ")", "of", "four", "RBPs", ".", "(", "E", "-", "G", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "LC", ",", "LUAD", "and", "LUSC", "patients", "(", "n", "=", "1540", ",", "n", "=", "865", "and", "n", "=", "675", ",", "respectively", ")", "with", "high", "or", "low", "expression", "levels", "of", "QKI", ".", "The", "log", "-", "rank", "test", "was", "used", "to", "analyze", "the", "difference", "between", "two", "groups", ".", "(", "H", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "endogenous", "mRNA", "levels", "of", "QKI", "-", "5", ",", "QKI", "-", "6", ",", "and", "QKI", "-", "7", "in", "human", "bronchial", "epithelial", "cell", "line", "BEAS", "-", "2B", ",", "LUAD", "cell", "lines", "A549", "and", "H1299", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) The upper panel showing qRT-PCR analysis of four identified LUAD-associated RBPs (ADARB1, CELF2, QKI and ZFP36) mRNA levels in 61 LUAD tissues and matched paracarcinoma tissues. The lower panel showing relative mRNA expression (T/N) of the four RBPs in metastatic (n = 28) and non-metastatic (n = 33) LUAD tissues. LUAD tissues were classified into metastatic and non-metastatic tissues as described in Materials and Methods. T, LUAD tissues; N, paracarcinoma tissues. Y axis represents the log10 transformed fold change of mRNA expression (T/N) of four RBPs.(E-G) Kaplan-Meier survival curves of LC, LUAD and LUSC patients (n=1540, n=865 and n=675, respectively) with high or low expression levels of QKI. The log-rank test was used to analyze the difference between two groups.(H) qRT-PCR analysis of endogenous mRNA levels of QKI-5, QKI-6, and QKI-7 in human bronchial epithelial cell line BEAS-2B, LUAD cell lines A549 and H1299."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "J", ")", "In", "vitro", "RNA", "pull", "-", "down", "assays", "were", "performed", "using", "biotin", "-", "labeled", "TGFβR1", "3", "'", "UTR", "segments", "in", "A549", "and", "H1299", "cells", ".", "After", "pull", "-", "down", ",", "endogenous", "QKI", "-", "5", "enrichments", "were", "detected", "by", "western", "blot", "analyses", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "the", "protein", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(J) In vitro RNA pull-down assays were performed using biotin-labeled TGFβR1 3' UTR segments in A549 and H1299 cells. After pull-down, endogenous QKI-5 enrichments were detected by western blot analyses. β-actin was used as the protein control."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "qRT", "-", "PCR", "and", "western", "blot", "analyses", "of", "TGFβR1", "mRNA", "and", "protein", "levels", "in", "QKI", "-", "5", "-", "overexpressing", "A549", "and", "H1299", "cells", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Expression", "of", "TGFβR1", "mRNA", "and", "protein", "in", "QKI", "-", "5", "-", "silenced", "A549", "and", "H1299", "cells", ".", "(", "K", ")", "QKI", "-", "5", "-", "overexpressing", "A549", "and", "H1299", "cells", "were", "treated", "and", "subjected", "to", "qRT", "-", "PCR", "assays", "to", "detect", "the", "mRNA", "expression", "of", "downstream", "genes", "of", "the", "TGF", "-", "β", "/", "SMAD", "signaling", ",", "including", "PAI", "-", "1", ",", "Slug", ",", "Snail", ",", "E", "-", "cadherin", ",", "and", "/", "or", "N", "-", "cadherin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A and B) qRT-PCR and western blot analyses of TGFβR1 mRNA and protein levels in QKI-5-overexpressing A549 and H1299 cells. (C and D) Expression of TGFβR1 mRNA and protein in QKI-5-silenced A549 and H1299 cells.(K) QKI-5-overexpressing A549 and H1299 cells were treated and subjected to qRT-PCR assays to detect the mRNA expression of downstream genes of the TGF-β/SMAD signaling, including PAI-1, Slug, Snail, E-cadherin, and/or N-cadherin."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", "-", "F", ")", "Wound", "-", "healing", "migration", "assays", "were", "performed", "on", "QKI", "-", "5", "-", "overexpressing", "A549", "and", "H1299", "cells", "as", "well", "as", "control", "cells", "The", "wound", "healing", "was", "recorded", "(", "C", "and", "E", ")", "and", "quantitatively", "measured", "(", "D", "and", "F", ")", "at", "least", "six", "times", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "In", "the", "presence", "or", "absence", "of", "TGF", "-", "β1", ",", "QKI", "-", "5", "-", "overexpressing", "A549", "and", "H1299", "cells", "were", "allowed", "to", "migrate", "through", "a", "polycarbonate", "membrane", "in", "Transwells", ".", "After", "24", "h", ",", "migrated", "cells", "were", "stained", ",", "photographed", "and", "counted", "in", "at", "least", "four", "random", "fields", "under", "a", "light", "microscope", ".", "Representative", "images", "(", "left", ")", "and", "the", "migrated", "cell", "numbers", "(", "right", ")", "were", "presented", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "QKI", "-", "5", "-", "overexpressing", "A549", "and", "H1299", "cells", "were", "treated", "and", "allowed", "to", "invade", "through", "Matrigel", "-", "coated", "membrane", "in", "Transwells", ".", "Invasive", "cells", "were"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C-F) Wound-healing migration assays were performed on QKI-5-overexpressing A549 and H1299 cells as well as control cells The wound healing was recorded (C and E) and quantitatively measured (D and F) at least six times.(G and H) In the presence or absence of TGF-β1, QKI-5-overexpressing A549 and H1299 cells were allowed to migrate through a polycarbonate membrane in Transwells. After 24 h, migrated cells were stained, photographed and counted in at least four random fields under a light microscope. Representative images (left) and the migrated cell numbers (right) were presented. (I and J) QKI-5-overexpressing A549 and H1299 cells were treated and allowed to invade through Matrigel-coated membrane in Transwells. Invasive cells were determined"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "E", ")", "H", "&", "E", "staining", "was", "performed", "for", "the", "evaluation", "of", "lung", "micrometastases", ".", "Representative", "images", "showing", "micrometastases", "of", "lung", "tissues", "from", "a", "pair", "of", "mice", "Blue", "and", "red", "arrowheads", "indicate", "lung", "micrometastases", "of", "vector", "group", "and", "QKI", "-", "5", "-", "overexpressing", "group", ",", "respectively", ".", "(", "F", ")", "Dot", "plots", "showing", "the", "difference", "of", "the", "micrometastases", "counts", "in", "lung", "tissues", "between", "QKI", "-", "5", "-", "overexpressing", "group", "and", "vector", "control", "group", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "G", ")", "Representative", "microscopic", "photographs", "of", "H", "&", "E", "staining", "for", "liver", "micrometastases", "in", "a", "pair", "of", "mice", "Blue", "and", "red", "arrowheads", "indicate", "liver", "micrometastases", ".", "(", "H", ")", "Dot", "plots", "showing", "the", "difference", "of", "the", "micrometastases", "counts", "in", "liver", "tissues", "between", "QKI", "-", "5", "-", "overexpressing", "group", "and", "control", "vector", "group", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(E) H&E staining was performed for the evaluation of lung micrometastases. Representative images showing micrometastases of lung tissues from a pair of mice Blue and red arrowheads indicate lung micrometastases of vector group and QKI-5-overexpressing group, respectively. (F) Dot plots showing the difference of the micrometastases counts in lung tissues between QKI-5-overexpressing group and vector control group (n = 10 mice per group). (G) Representative microscopic photographs of H&E staining for liver micrometastases in a pair of mice Blue and red arrowheads indicate liver micrometastases. (H) Dot plots showing the difference of the micrometastases counts in liver tissues between QKI-5-overexpressing group and control vector group (n = 10 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", "-", "F", ")", "In", "the", "presence", "or", "absence", "of", "TGF", "-", "β1", ",", "the", "migratory", "and", "invasive", "capabilities", "of", "above", "-", "treated", "A549", "and", "H1299", "cells", "were", "evaluated", "by", "Transwell", "assays", "Migrated", "and", "invasive", "cells", "were", "stained", "and", "counted", "under", "a", "light", "microscope", ".", "(", "J", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "LUAD", "patients", "(", "n", "=", "865", ")", "with", "high", "or", "low", "expression", "levels", "of", "TGFβR1", ".", "The", "log", "-", "rank", "test", "was", "used", "to", "compare", "the", "difference", "between", "two", "groups", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C-F) In the presence or absence of TGF-β1, the migratory and invasive capabilities of above-treated A549 and H1299 cells were evaluated by Transwell assays Migrated and invasive cells were stained and counted under a light microscope.(J) Kaplan-Meier survival curves of LUAD patients (n=865) with high or low expression levels of TGFβR1. The log-rank test was used to compare the difference between two groups."}
{"words": ["Figure", "7qRT", "-", "PCR", "analyses", "of", "mRNA", "expression", "of", "QKI", "-", "5", "in", "A549", "cells", "transfected", "with", "siRNAs", "of", "TFs", ",", "which", "have", "potential", "binding", "sites", "in", "QKI", "-", "5", "promoter", ".", "(", "E", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "QKI", "-", "5", "protein", "levels", "in", "KLF6", "-", "silenced", "A549", "cells", ".", "(", "F", ")", "An", "overview", "of", "KLF6", "-", "ChIP", "-", "seq", "data", "(", "GSE96355", ")", "is", "illustrated", "using", "Integrative", "Genomics", "Viewer", "(", "IGV", ")", "software", ".", "An", "obvious", "peak", "was", "detected", "at", "position", "-", "100", "to", "+", "100", "in", "the", "QKI", "-", "5", "promoter", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "KLF6", "mRNA", "in", "61", "LUAD", "tissues", "and", "matched", "paracarcinoma", "tissues", "(", "I", ")", "T", ",", "LUAD", "tissues", ";", "N", ",", "paracarcinoma", "tissues", ".", "Y", "axis", "represents", "the", "log10", "transformed", "fold", "change", "of", "mRNA", "expression", "of", "KLF6", ".", "Central", "dotted", "line", "of", "the", "violin", "plot", "represents", "median", ",", "and", "upper", "and", "lower", "dotted", "line", "represents", "quartile", "(", "I", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7qRT-PCR analyses of mRNA expression of QKI-5 in A549 cells transfected with siRNAs of TFs, which have potential binding sites in QKI-5 promoter.(E) Western blot analysis of QKI-5 protein levels in KLF6-silenced A549 cells.(F) An overview of KLF6-ChIP-seq data (GSE96355) is illustrated using Integrative Genomics Viewer (IGV) software. An obvious peak was detected at position -100 to +100 in the QKI-5 promoter.qRT-PCR analysis of KLF6 mRNA in 61 LUAD tissues and matched paracarcinoma tissues (I) T, LUAD tissues; N, paracarcinoma tissues. Y axis represents the log10 transformed fold change of mRNA expression of KLF6. Central dotted line of the violin plot represents median, and upper and lower dotted line represents quartile (I)."}
{"words": ["Figure", "1C", ".", "HEK293", "cells", "were", "incubated", "with", "5", "µg", "of", "purified", "EVCx43", "-", "or", "EVCx43", "+", "for", "24", "h", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Bafilomycin", "A1", "(", "Baf", ")", "in", "the", "last", "6", "h", ".", "The", "levels", "of", "LC3", "were", "analyzed", "by", "WB", "and", "are", "depicted", "on", "graph", "(", "LC3", "-", "II", ";", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "p", "-", "values", "were", "derived", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "in", "all", "graphs", ".", "E", ".", "HEK293", "cells", "were", "incubated", "with", "EVCx43", "-", "or", "EVCx43", "+", "for", "24", "h", "before", "WB", "analysis", "of", "ATP2A2", "/", "SERCA2", ",", "a", "predicted", "target", "of", "miRNAs", "enriched", "in", "Cx43", "-", "containing", "EV", ".", "Graph", "depicts", "quantification", "of", "ATP2A2", "/", "SERCA2", "levels", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "p", "-", "values", "were", "derived", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "in", "all", "graphs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C. HEK293 cells were incubated with 5 µg of purified EVCx43- or EVCx43+ for 24 h, in the presence or absence of Bafilomycin A1 (Baf) in the last 6 h. The levels of LC3 were analyzed by WB and are depicted on graph (LC3-II; n=4 biological replicates). Data information: p-values were derived by Mann-Whitney test. Bars and error bars indicate mean ± SD in all graphs.E. HEK293 cells were incubated with EVCx43- or EVCx43+ for 24 h before WB analysis of ATP2A2/SERCA2, a predicted target of miRNAs enriched in Cx43-containing EV. Graph depicts quantification of ATP2A2/SERCA2 levels (n=4 biological replicates). Data information: p-values were derived by Mann-Whitney test. Bars and error bars indicate mean ± SD in all graphs."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Cx43", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "HEK293Cx43", "+", "cells", ",", "after", "which", "interaction", "with", "hnRNPA2B1", "and", "hnRNPQ", "was", "analyzed", "by", "WB", ".", "B", ".", "Co", "-", "localization", "between", "Cx43", "(", "green", ")", "and", "hnRNPA2B1", "or", "hnRNPQ", "(", "red", ")", "in", "C33a", "cells", "was", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", "10", "μm", ".", "Arrowheads", "in", "the", "inset", "images", "highlight", "co", "-", "localization", "between", "Cx43", "and", "hnRNPs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Cx43 was immunoprecipitated (IP) from HEK293Cx43+ cells, after which interaction with hnRNPA2B1 and hnRNPQ was analyzed by WB.B. Co-localization between Cx43 (green) and hnRNPA2B1 or hnRNPQ (red) in C33a cells was analyzed by confocal microscopy. Scale bars 10 μm. Arrowheads in the inset images highlight co-localization between Cx43 and hnRNPs."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Cell", "free", "EV", "biogenesis", "was", "assessed", "by", "relative", "protection", "of", "Cx43", "-", "luciferase", ".", "Reactions", "were", "incubated", "at", "4ºC", "or", "30ºC", "in", "the", "presence", "of", "membranes", "derived", "from", "HEK293Cx43", "-", "transiently", "transfected", "with", "Cx43", "-", "luciferase", "and", "cytosol", "from", "HEK293Cx43", "-", "cells", ",", "except", "in", "the", "negative", "control", ".", "1", "%", "TX100", "was", "used", "to", "disrupt", "membranes", ",", "where", "indicated", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "p", "-", "values", "were", "derived", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "in", "all", "graphs", ".", "B", ".", "Crude", "membranes", "and", "cytosol", "from", "broken", "HEK293Cx43", "+", "or", "HEK293Cx43", "-", "cells", "were", "mixed", "in", "an", "ATP", "regenerating", "system", ",", "supplemented", "with", "synthetic", "miR", "-", "133b", "or", "miR", "-", "509", "-", "3p", ",", "as", "indicated", ".", "Graph", "depicts", "the", "indicated", "miRNAs", "levels", ",", "assessed", "by", "RT", "-", "qPCR", "and", "represented", "as", "percent", "protected", "after", "RNAse", "I", "digestion", "of", "unincorporated", "miRNAs", "(", "n", "=", "7", "-", "8", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "p", "-", "values", "were", "derived", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "in", "all", "graphs", ".", "C", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "endogenous", "miR", "-", "133b", "and", "miR", "-", "509", "-", "3p", "following", "UV", "crosslinking", "immunoprecipitation", "(", "CLIP", ")", "of", "Cx43", "(", "n", "=", "3", "-", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "p", "-", "values", "were", "derived", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "in", "all", "graphs", ".", "D", ".", "WB", "analysis", "for", "Cx43", "in", "samples", "derived", "by", "miRNAs", "pulldowns", "performed", "with", "whole", "lysates", "of", "HEK293Cx43", "+", "cells", "and", "biotinylated", "miR", "-", "133b", "and", "miR", "-", "509", "-", "3p", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "p", "-", "values", "were", "derived", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "in", "all", "graphs", ".", "EMSA", "was", "performed", "using", "either", "Cy3", "-", "labeled", "miR", "-", "133b", "(", "E", ",", "and", "Cx43", "produced", "by", "in", "vitro", "translation", "inserted", "into", "lipid", "nanodiscs", ",", "For", "competition", "EMSA", ",", "an", "excess", "of", "unlabeled", "miR", "-", "133b", "was", "used", "(", "competitor", ")", ".", "Empty", "nanodiscs", "were", "used", "to", "control", "unspecific", "binding", ".", "EMSA", "was", "performed", "using", "either", "Cy3", "-", "labeled", "miR", "-", "133b", "F", ")", "and", "Cx43", "produced", "by", "in", "vitro", "translation", "inserted", "into", "lipid", "nanodiscs", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "recombinant", "GST", "-", "hnRNPA2B1", "or", "GST", "-", "hnRNPQ", ",", "as", "indicated", ".", "EMSA", "was", "performed", "using", "either", "Cy3", "-", "labeled", "miR", "-", "509", "-", "3p", "(", "G", "and", "Cx43", "produced", "by", "in", "vitro", "translation", "inserted", "into", "lipid", "nanodiscs", ",", "For", "competition", "EMSA", ",", "an", "excess", "of", "unlabeled", "miR", "-", "133b", "or", "miR", "-", "509", "-", "3p", "was", "used", "(", "competitor", ")", ".", "Empty", "nanodiscs", "were", "used", "to", "control", "unspecific", "binding", ".", "EMSA", "was", "performed", "using", "either", "Cy3", "-", "labeled", "miR", "-", "509", "-", "3p", "H", ")", "and", "Cx43", "produced", "by", "in", "vitro", "translation", "inserted", "into", "lipid", "nanodiscs", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "recombinant", "GST", "-", "hnRNPA2B1", "or", "GST", "-", "hnRNPQ", ",", "as", "indicated", ".", "I", ".", "EMSA", "was", "performed", "using", "either", "Cy3", "-", "labeled", "wild", "type", "or", "mutant", "miR", "-", "199a", "-", "3p", ",", "and", "Cx43", "-", "enriched", "membranes", "prepared", "from", "C33a", "parental", "cells", "(", "Cx43", "+", ")", ".", "Cx43", "-", "membranes", "were", "used", "to", "control", "unspecific", "binding", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Cell free EV biogenesis was assessed by relative protection of Cx43-luciferase. Reactions were incubated at 4ºC or 30ºC in the presence of membranes derived from HEK293Cx43- transiently transfected with Cx43-luciferase and cytosol from HEK293Cx43- cells, except in the negative control. 1% TX100 was used to disrupt membranes, where indicated (n=3 biological replicates). Data information: p-values were derived by Mann-Whitney test. Bars and error bars indicate mean ± SD in all graphs.B. Crude membranes and cytosol from broken HEK293Cx43+ or HEK293Cx43- cells were mixed in an ATP regenerating system, supplemented with synthetic miR-133b or miR-509-3p, as indicated. Graph depicts the indicated miRNAs levels, assessed by RT-qPCR and represented as percent protected after RNAse I digestion of unincorporated miRNAs (n=7-8 biological replicates). Data information: p-values were derived by Mann-Whitney test. Bars and error bars indicate mean ± SD in all graphs.C. Co-immunoprecipitation of endogenous miR-133b and miR-509-3p following UV crosslinking immunoprecipitation (CLIP) of Cx43 (n=3-5 biological replicates). Data information: p-values were derived by Mann-Whitney test. Bars and error bars indicate mean ± SD in all graphs.D. WB analysis for Cx43 in samples derived by miRNAs pulldowns performed with whole lysates of HEK293Cx43+ cells and biotinylated miR-133b and miR-509-3p (n=5 biological replicates). Data information: p-values were derived by Mann-Whitney test. Bars and error bars indicate mean ± SD in all graphs.EMSA was performed using either Cy3-labeled miR-133b (E , and Cx43 produced by in vitro translation inserted into lipid nanodiscs, For competition EMSA, an excess of unlabeled miR-133b was used (competitor). Empty nanodiscs were used to control unspecific binding.EMSA was performed using either Cy3-labeled miR-133b F) and Cx43 produced by in vitro translation inserted into lipid nanodiscs, in the presence or absence of recombinant GST-hnRNPA2B1 or GST-hnRNPQ, as indicated.EMSA was performed using either Cy3-labeled miR-509-3p (G and Cx43 produced by in vitro translation inserted into lipid nanodiscs, For competition EMSA, an excess of unlabeled miR-133b or miR-509-3p was used (competitor). Empty nanodiscs were used to control unspecific binding.EMSA was performed using either Cy3-labeled miR-509-3p H) and Cx43 produced by in vitro translation inserted into lipid nanodiscs, in the presence or absence of recombinant GST-hnRNPA2B1 or GST-hnRNPQ, as indicated.I. EMSA was performed using either Cy3-labeled wild type or mutant miR-199a-3p, and Cx43-enriched membranes prepared from C33a parental cells (Cx43+). Cx43- membranes were used to control unspecific binding."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "maximum", "projection", "images", "of", "microscopy", "-", "based", "miRNA", "-", "protein", "interaction", "using", "beads", "coated", "with", "GST", "-", "tagged", "NT", "/", "CT", "-", "Cx43", ",", "hnRNPA2B1", "or", "hnRNPQ", ",", "as", "indicated", ",", "following", "the", "addition", "of", "Cy3", "-", "labelled", "miR", "-", "133b", "or", "miR", "-", "509", "-", "3p", ".", "Graph", "depicts", "quantification", "of", "total", "fluorescence", "/", "bead", ",", "as", "a", "measure", "of", "protein", "-", "miRNAs", "binding", ".", "Scale", "bars", "50", "μm", "(", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ";", "average", "of", "23", "beads", "analyzed", "/", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "p", "-", "values", "were", "derived", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "(", "Dunn", "'", "s", "post", "-", "hoc", ")", "test", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", "in", "all", "graphs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative maximum projection images of microscopy-based miRNA-protein interaction using beads coated with GST-tagged NT/CT-Cx43, hnRNPA2B1 or hnRNPQ, as indicated, following the addition of Cy3-labelled miR-133b or miR-509-3p. Graph depicts quantification of total fluorescence/bead, as a measure of protein-miRNAs binding. Scale bars 50 μm (n=2 biological replicates; average of 23 beads analyzed/condition). Data information: p-values were derived by Kruskal-Wallis (Dunn's post-hoc) test. Bars and error bars indicate mean ± SD in all graphs."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Equal", "amounts", "of", "EVCx43", "+", "and", "EVCx43", "-", "labelled", "with", "SYTO", "®", "RNASelect", "™", "green", "fluorescent", "stain", "were", "incubated", "with", "HEK293Cx43", "+", "cells", "for", "30", "min", ",", "at", "37ºC", ".", "Scale", "bars", "10", "μm", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "p", "-", "values", "were", "derived", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Equal amounts of EVCx43+ and EVCx43- labelled with SYTO® RNASelect™ green fluorescent stain were incubated with HEK293Cx43+ cells for 30 min, at 37ºC. Scale bars 10 μm (n=5 biological replicates). p-values were derived by Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "1A", "Left", ",", "kymograph", "from", "sequential", "epifluorescence", "(", "20", "×", ")", "images", "showing", "cytosolic", "Ca2", "+", "oscillations", "in", "speed", "‐", "fluctuating", "immature", "DC", "after", "slow", "motility", "phases", "(", "upper", "and", "lower", "panel", ")", "and", "a", "change", "in", "direction", "(", "lower", "panel", ")", ".", "DCs", "were", "loaded", "with", "the", "Ca2", "+", "dye", "Oregon", "GreenBAPTA", "1", "‐", "AM", ",", "introduced", "in", "micro", "‐", "channels", ",", "and", "imaged", "every", "10", "s", ".", "Right", ",", "sequential", "epifluorescence", "(", "20", "×", ")", "images", "(", "1", "image", "/", "20", "s", "is", "shown", ")", ".", "Instantaneous", "velocities", "and", "intracellular", "calcium", "oscillations", "were", "measured", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "B", ",", "C", "Mean", "cell", "velocity", "of", "immature", "DCs", "(", "n", ">", "125", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ")", "(", "B", ")", "or", "CD8", "+", "T", "lymphocytes", "(", "n", ">", "40", "cells", "from", "one", "experiment", ")", "(", "C", ")", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "with", "or", "without", "BAPTA", ".", "Boxes", "illustrate", "10", "-", "90", "percentiles", "of", "values", ",", "and", "whiskers", "represent", "the", "range", "of", "values", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "a", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ".", "D", "Mean", "intracellular", "calcium", "concentration", "in", "speed", "‐", "fluctuating", "(", "ΔV", "/", "V0", ">", "0", ".", "3", ";", "ΔV", "/", "V0", "relative", "speed", "variation", "divided", "by", "the", "global", "median", "velocity", ")", "and", "non", "‐", "speed", "‐", "fluctuating", "(", "ΔV", "/", "V0", "0", ".", "3", ")", "immature", "DCs", "(", "n", "=", "187", "cells", "from", "more", "than", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "a", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "E", ",", "F", "Velocity", "fluctuations", "(", "ΔV", "/", "V0", ")", "(", "E", ")", "or", "mean", "Ca2", "+", "activities", "(", "F", ")", "displayed", "by", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "in", "the", "presence", "of", "100", "ng", "/", "ml", "CCL3", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "a", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "with", "respect", "to", "non", "‐", "treated", "DCs", "(", "NT", ")", ".", "G", "Mean", "Ca2", "+", "activities", "during", "phases", "of", "fast", "(", ">", "50", "%", "of", "max", "velocity", ")", "and", "slow", "(", "50", "%", "of", "max", "velocity", ")", "motility", "in", "speed", "‐", "fluctuating", "DCs", "(", "Supplementary", "Fig", "S2F", ")", "(", "n", "=", "64", "cells", ",", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Activities", "were", "normalized", "to", "the", "mean", "Ca2", "+", "activity", "shown", "by", "each", "cell", "during", "the", "entire", "movie", ".", "The", "P", "‐", "value", "was", "calculated", "using", "a", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Left, kymograph from sequential epifluorescence (20×) images showing cytosolic Ca2+ oscillations in speed‐fluctuating immature DC after slow motility phases (upper and lower panel) and a change in direction (lower panel). DCs were loaded with the Ca2+ dye Oregon GreenBAPTA 1‐AM, introduced in micro‐channels, and imaged every 10 s. Right, sequential epifluorescence (20×) images (1 image/20 s is shown). Instantaneous velocities and intracellular calcium oscillations were measured as described in Materials and Methods. Scale bar: 10 μm.B, C Mean cell velocity of immature DCs (n > 125 cells from two independent experiments) (B) or CD8+T lymphocytes (n > 40 cells from one experiment) (C) migrating in micro‐channels with or without BAPTA. Boxes illustrate 10-90 percentiles of values, and whiskers represent the range of values. P‐values were calculated using a Kruskal-Wallis test.D Mean intracellular calcium concentration in speed‐fluctuating (ΔV/V0 > 0.3; ΔV/V0 relative speed variation divided by the global median velocity) and non‐speed‐fluctuating (ΔV/V0 0.3) immature DCs (n = 187 cells from more than three independent experiments). P‐values were calculated using a Mann-Whitney test.E, F Velocity fluctuations (ΔV/V0) (E) or mean Ca2+ activities (F) displayed by DCs migrating in micro‐channels in the presence of 100 ng/ml CCL3. P‐values were calculated using a Mann-Whitney test, with respect to non‐treated DCs (NT).G Mean Ca2+ activities during phases of fast (> 50% of max velocity) and slow ( 50% of max velocity) motility in speed‐fluctuating DCs (Supplementary Fig S2F) (n = 64 cells, from three independent experiments). Activities were normalized to the mean Ca2+ activity shown by each cell during the entire movie. The P‐value was calculated using a Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "2A", "Relative", "gene", "expression", "of", "IP3R1", "(", "blue", ")", ",", "IP3R2", "(", "red", ")", ",", "and", "IP3R3", "(", "green", ")", "in", "IP3R", "‐", "silenced", "DCs", ".", "DCs", "were", "infected", "with", "two", "lentiviruses", "encoding", "for", "different", "shRNAs", "for", "IP3R", "isoforms", ".", "ShScramble", "‐", "infected", "DCs", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "Gene", "expression", "was", "determined", "by", "a", "quantitative", "PCR", ".", "It", "was", "calculated", "with", "respect", "to", "GAPDH", "expression", "and", "normalized", "to", "the", "levels", "observed", "in", "the", "shScramble", ".", "The", "median", "plus", "standard", "deviation", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "B", "Immunoblot", "for", "IP3R", "type", "1", "and", "IP3R", "type", "3", "in", "IP3R", "‐", "silenced", "DCs", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "IP3R3", "appears", "as", "two", "bands", "as", "previously", "described", "(", "22", ")", ".", "C", "Immunoblot", "for", "IP3R", "type", "1", "(", "top", ")", "and", "IP3R", "type", "3", "(", "bottom", ")", "in", "DCs", "transduced", "with", "lentivirus", "encoding", "for", "different", "IP3R", "shRNAs", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "D", "Relative", "IP3R2", "expression", "in", "ShScramble", "‐", "infected", "DCs", "(", "gray", ")", ",", "shIP3R1", "(", "blue", ")", ",", "and", "IP3R3", "(", "green", ")", "‐", "silenced", "DCs", ".", "The", "experiment", "was", "performed", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "F", "Transmigration", "assay", "of", "shScramble", "‐", ",", "IP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ")", "‐", ",", "IP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", "(", "red", ")", "‐", ",", "and", "IP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "expressing", "DCs", ".", "Cells", "were", "loaded", "in", "the", "upper", "chamber", "of", "a", "5", "‐", "μm", "pore", "collagen", "‐", "coated", "transwell", "assay", ",", "recovered", "from", "the", "upper", "and", "lower", "chambers", "after", "16", "h", ",", "and", "counted", ".", "The", "median", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "G", "Quantification", "of", "the", "mean", "cell", "velocity", "of", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", "(", "red", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "silenced", "immature", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", ".", "shScramble", "‐", "infected", "DCs", "were", "used", "as", "a", "control", "(", "gray", ")", "(", "n", ">", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "and", "two", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", ")", ".", "Boxes", "illustrate", "10", "-", "90", "percentiles", "of", "values", ",", "and", "whiskers", "represent", "the", "range", "of", "values", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "a", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ".", "H", "Quantification", "of", "the", "mean", "cell", "velocity", "of", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "silenced", "immature", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "in", "the", "presence", "of", "2", "mM", "BAPTA", ".", "shScramble", "‐", "infected", "DCs", "were", "used", "as", "a", "control", "(", "gray", ")", "(", "n", ">", "70", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "a", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Relative gene expression of IP3R1 (blue), IP3R2 (red), and IP3R3 (green) in IP3R‐silenced DCs. DCs were infected with two lentiviruses encoding for different shRNAs for IP3R isoforms. ShScramble‐infected DCs were used as a control. Gene expression was determined by a quantitative PCR. It was calculated with respect to GAPDH expression and normalized to the levels observed in the shScramble. The median plus standard deviation of three independent experiments are shown.B Immunoblot for IP3R type 1 and IP3R type 3 in IP3R‐silenced DCs. Actin was used as a control. IP3R3 appears as two bands as previously described (22).C Immunoblot for IP3R type 1 (top) and IP3R type 3 (bottom) in DCs transduced with lentivirus encoding for different IP3R shRNAs. Actin was used as a control.D Relative IP3R2 expression in ShScramble‐infected DCs (gray), shIP3R1 (blue), and IP3R3 (green)‐silenced DCs. The experiment was performed as described in (A).F Transmigration assay of shScramble‐, IP3R(1,3)A (blue)‐, IP3R(2,3)B (red)‐, and IP3R(1,3)C (green)‐expressing DCs. Cells were loaded in the upper chamber of a 5‐μm pore collagen‐coated transwell assay, recovered from the upper and lower chambers after 16 h, and counted. The median from three independent experiments is shown.G Quantification of the mean cell velocity of shIP3R(1,3)A (blue)‐, shIP3R(2,3)B (red)‐, and shIP3R(1,3)C (green)‐silenced immature DCs migrating in micro‐channels. shScramble‐infected DCs were used as a control (gray) (n > 100 cells from three independent experiments for shIP3R(1,3)A and shIP3R(1,3)C and two independent experiments for shIP3R(2,3)B). Boxes illustrate 10-90 percentiles of values, and whiskers represent the range of values. P‐values were calculated using a Kruskal-Wallis test.H Quantification of the mean cell velocity of shIP3R(1,3)C (green)‐silenced immature DCs migrating in micro‐channels in the presence of 2 mM BAPTA. shScramble‐infected DCs were used as a control (gray) (n > 70 cells from two independent experiments). P‐values were calculated using a Kruskal-Wallis test."}
{"words": ["Figure", "3Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", "(", "red", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "(", "n", ">", "100", "cells", "per", "condition", "from", "3", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "and", "two", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", ")", ".", "A", "Velocity", "fluctuations", "(", "ΔV", "/", "V0", ")", "of", "immature", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", ".", "Boxes", "illustrate", "10", "-", "90", "percentiles", "of", "values", ",", "and", "whiskers", "represent", "the", "range", "of", "values", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "a", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ".", "Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", "(", "red", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "(", "n", ">", "100", "cells", "per", "condition", "from", "3", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "and", "two", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", ")", ".", "B", "Dot", "plot", "showing", "velocity", "fluctuations", "and", "migration", "speeds", "of", "shScramble", "(", "gray", ")", "‐", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "expressing", "DCs", ".", "Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", "(", "red", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "(", "n", ">", "100", "cells", "per", "condition", "from", "3", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "and", "two", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", ")", ".", "C", "Inverted", "sequential", "epifluorescence", "images", "(", "20", "×", ")", "of", "a", "representative", "control", "DC", "(", "left", ")", "and", "an", "immature", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "‐", "silenced", "DC", "(", "right", ")", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", ".", "DCs", "were", "differentiated", "from", "LifeAct", "‐", "GFP", "transgenic", "mice", "and", "imaged", "every", "2", ".", "2", "min", ".", "Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", "(", "red", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "(", "n", ">", "100", "cells", "per", "condition", "from", "3", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "and", "two", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", ")", ".", "D", "Percentage", "of", "DCs", "changing", "their", "direction", "of", "locomotion", "while", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "with", "a", "paired", "test", "with", "respect", "to", "the", "shScramble", "condition", ".", "Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", "(", "red", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "(", "n", ">", "100", "cells", "per", "condition", "from", "3", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "and", "two", "independent", "experiments", "for", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", ")", ".", "E", "Dot", "plot", "showing", "the", "frequency", "of", "changes", "in", "direction", "of", "immature", "DCs", "while", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", ".", "Bars", "show", "the", "mean", "plus", "the", "standard", "deviation", ".", "A", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "was", "applied", "for", "statistical", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Analysis of shScramble (gray)‐, shIP3R(1,3)A (blue)‐, shIP3R(2,3)B (red)‐, and shIP3R(1,3)C (green)‐expressing DCs migrating in micro‐channels (n > 100 cells per condition from 3 independent experiments for shIP3R(1,3)A and shIP3R(1,3)C and two independent experiments for shIP3R(2,3)B).A Velocity fluctuations (ΔV/V0) of immature DCs migrating in micro‐channels. Boxes illustrate 10-90 percentiles of values, and whiskers represent the range of values. P‐values were calculated using a Kruskal-Wallis test.Analysis of shScramble (gray)‐, shIP3R(1,3)A (blue)‐, shIP3R(2,3)B (red)‐, and shIP3R(1,3)C (green)‐expressing DCs migrating in micro‐channels (n > 100 cells per condition from 3 independent experiments for shIP3R(1,3)A and shIP3R(1,3)C and two independent experiments for shIP3R(2,3)B).B Dot plot showing velocity fluctuations and migration speeds of shScramble (gray)‐ and shIP3R(1,3)C (green)‐expressing DCs.Analysis of shScramble (gray)‐, shIP3R(1,3)A (blue)‐, shIP3R(2,3)B (red)‐, and shIP3R(1,3)C (green)‐expressing DCs migrating in micro‐channels (n > 100 cells per condition from 3 independent experiments for shIP3R(1,3)A and shIP3R(1,3)C and two independent experiments for shIP3R(2,3)B).C Inverted sequential epifluorescence images (20×) of a representative control DC (left) and an immature shIP3R(1,3)C‐silenced DC (right) migrating in micro‐channels. DCs were differentiated from LifeAct‐GFP transgenic mice and imaged every 2.2 min.Analysis of shScramble (gray)‐, shIP3R(1,3)A (blue)‐, shIP3R(2,3)B (red)‐, and shIP3R(1,3)C (green)‐expressing DCs migrating in micro‐channels (n > 100 cells per condition from 3 independent experiments for shIP3R(1,3)A and shIP3R(1,3)C and two independent experiments for shIP3R(2,3)B).D Percentage of DCs changing their direction of locomotion while migrating in micro‐channels. P‐values were calculated with a paired test with respect to the shScramble condition.Analysis of shScramble (gray)‐, shIP3R(1,3)A (blue)‐, shIP3R(2,3)B (red)‐, and shIP3R(1,3)C (green)‐expressing DCs migrating in micro‐channels (n > 100 cells per condition from 3 independent experiments for shIP3R(1,3)A and shIP3R(1,3)C and two independent experiments for shIP3R(2,3)B).E Dot plot showing the frequency of changes in direction of immature DCs while migrating in micro‐channels. Bars show the mean plus the standard deviation. A Kruskal-Wallis test was applied for statistical analysis."}
{"words": ["Figure", "4Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ",", "n", "=", "2", ",", "400", "cells", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ",", "n", "=", "1", ",", "611", "cells", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ",", "n", "=", "1", ",", "454", "cells", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "the", "device", "described", "in", "Supplementary", "Fig", "S3I", ",", "stained", "with", "Hoechst", "and", "imaged", "every", "2", "min", "during", "24", "h", "at", "10", "×", "magnification", ".", "Values", "were", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Cell", "trajectories", "were", "obtained", "by", "tracking", "their", "nucleus", ".", "A", "Graph", "showing", "the", "DC", "mean", "instantaneous", "speed", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "with", "a", "t", "‐", "test", "analysis", ".", "B", "Mean", "instantaneous", "speed", "distribution", "of", "migrating", "DCs", ".", "Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ",", "n", "=", "2", ",", "400", "cells", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ",", "n", "=", "1", ",", "611", "cells", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ",", "n", "=", "1", ",", "454", "cells", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "the", "device", "described", "in", "Supplementary", "Fig", "S3I", ",", "stained", "with", "Hoechst", "and", "imaged", "every", "2", "min", "during", "24", "h", "at", "10", "×", "magnification", ".", "Values", "were", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Cell", "trajectories", "were", "obtained", "by", "tracking", "their", "nucleus", ".", "C", "Representation", "of", "individual", "DC", "trajectories", ".", "Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ",", "n", "=", "2", ",", "400", "cells", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ",", "n", "=", "1", ",", "611", "cells", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ",", "n", "=", "1", ",", "454", "cells", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "the", "device", "described", "in", "Supplementary", "Fig", "S3I", ",", "stained", "with", "Hoechst", "and", "imaged", "every", "2", "min", "during", "24", "h", "at", "10", "×", "magnification", ".", "Values", "were", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Cell", "trajectories", "were", "obtained", "by", "tracking", "their", "nucleus", ".", "D", "Path", "persistence", "(", "calculated", "as", "the", "ratio", "between", "the", "effective", "length", "and", "the", "total", "length", "of", "the", "cell", "trajectory", ")", "of", "migrating", "DCs", ".", "P", "‐", "values", "were", "determined", "with", "a", "t", "‐", "test", "analysis", ".", "Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ",", "n", "=", "2", ",", "400", "cells", ")", "‐", ",", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "(", "blue", ",", "n", "=", "1", ",", "611", "cells", ")", "‐", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ",", "n", "=", "1", ",", "454", "cells", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "the", "device", "described", "in", "Supplementary", "Fig", "S3I", ",", "stained", "with", "Hoechst", "and", "imaged", "every", "2", "min", "during", "24", "h", "at", "10", "×", "magnification", ".", "Values", "were", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Cell", "trajectories", "were", "obtained", "by", "tracking", "their", "nucleus", ".", "E", "Bars", "showing", "the", "proportion", "of", "the", "effective", "length", "displacement", "(", "L", ")", "of", "DCs", ".", "A", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "(", "P", "‐", "value", "2", ".", "2", "×", "10", "−", "16", ")", "was", "used", "for", "statistics", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Analysis of shScramble (gray, n = 2,400 cells)‐, shIP3R(1,3)A (blue, n = 1,611 cells)‐, and shIP3R(1,3)C (green, n = 1,454 cells)‐expressing DCs migrating in the device described in Supplementary Fig S3I, stained with Hoechst and imaged every 2 min during 24 h at 10× magnification. Values were obtained from three independent experiments. Cell trajectories were obtained by tracking their nucleus.A Graph showing the DC mean instantaneous speed. P‐values were calculated with a t‐test analysis.B Mean instantaneous speed distribution of migrating DCs.Analysis of shScramble (gray, n = 2,400 cells)‐, shIP3R(1,3)A (blue, n = 1,611 cells)‐, and shIP3R(1,3)C (green, n = 1,454 cells)‐expressing DCs migrating in the device described in Supplementary Fig S3I, stained with Hoechst and imaged every 2 min during 24 h at 10× magnification. Values were obtained from three independent experiments. Cell trajectories were obtained by tracking their nucleus.C Representation of individual DC trajectories.Analysis of shScramble (gray, n = 2,400 cells)‐, shIP3R(1,3)A (blue, n = 1,611 cells)‐, and shIP3R(1,3)C (green, n = 1,454 cells)‐expressing DCs migrating in the device described in Supplementary Fig S3I, stained with Hoechst and imaged every 2 min during 24 h at 10× magnification. Values were obtained from three independent experiments. Cell trajectories were obtained by tracking their nucleus.D Path persistence (calculated as the ratio between the effective length and the total length of the cell trajectory) of migrating DCs. P‐values were determined with a t‐test analysis.Analysis of shScramble (gray, n = 2,400 cells)‐, shIP3R(1,3)A (blue, n = 1,611 cells)‐, and shIP3R(1,3)C (green, n = 1,454 cells)‐expressing DCs migrating in the device described in Supplementary Fig S3I, stained with Hoechst and imaged every 2 min during 24 h at 10× magnification. Values were obtained from three independent experiments. Cell trajectories were obtained by tracking their nucleus.E Bars showing the proportion of the effective length displacement (L) of DCs. A Fisher's exact test (P‐value 2.2 × 10−16) was used for statistics."}
{"words": ["Figure", "5A", "Immunoblot", "showing", "the", "intracellular", "levels", "of", "phosphorylated", "MLC", "in", "DCs", "transduced", "with", "the", "shScramble", "or", "shRNAs", "for", "IP3Rs", "(", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "A", "′", ",", "shIP3R", "(", "2", ",", "3", ")", "B", "′", ",", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "′", ")", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "B", "Inverted", "sequential", "epifluorescence", "images", "(", "20", "×", ")", "showing", "myosin", "IIA", "‐", "GFP", "localization", "of", "a", "representative", "shScramble", "(", "left", ")", "‐", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "‐", "expressing", "DC", "(", "right", ")", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", ".", "Myosin", "IIA", "‐", "GFP", "knock", "‐", "in", "DCs", "were", "imaged", "every", "1", "min", "(", "1", "out", "of", "2", "images", "is", "shown", ")", ".", "Asterisks", "highlight", "changes", "of", "direction", "during", "locomotion", ".", "C", ",", "D", "Myosin", "IIA", "‐", "GFP", "localization", "(", "red", ")", "versus", "velocity", "fluctuations", "(", "blue", ",", "ΔV", "/", "V0", ")", "in", "a", "representative", "shScramble", "‐", "transduced", "DC", "(", "C", ")", "or", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "‐", "silenced", "(", "D", ")", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", ".", "DCs", "were", "recorded", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "E", "Quantification", "of", "the", "interval", "between", "curves", "(", "highlighted", "in", "D", ")", "obtained", "for", "myosin", "IIA", "positioning", "and", "velocity", "from", "shScramble", "‐", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "‐", "expressing", "DCs", ".", "Cells", "were", "recorded", "as", "in", "(", "B", ")", "(", "n", "=", "20", "cells", "from", "two", "experiments", ")", ".", "The", "Mann", "-", "Whitney", "test", "was", "applied", "for", "statistical", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Immunoblot showing the intracellular levels of phosphorylated MLC in DCs transduced with the shScramble or shRNAs for IP3Rs (shIP3R(1,3)A′, shIP3R(2,3)B′, and shIP3R(1,3)C′). Actin was used as a control.B Inverted sequential epifluorescence images (20×) showing myosin IIA‐GFP localization of a representative shScramble (left)‐ and shIP3R(1,3)C‐expressing DC (right) migrating in micro‐channels. Myosin IIA‐GFP knock‐in DCs were imaged every 1 min (1 out of 2 images is shown). Asterisks highlight changes of direction during locomotion.C, D Myosin IIA‐GFP localization (red) versus velocity fluctuations (blue, ΔV/V0) in a representative shScramble‐transduced DC (C) or shIP3R(1,3)C‐silenced (D) migrating in micro‐channels. DCs were recorded as in (B).E Quantification of the interval between curves (highlighted in D) obtained for myosin IIA positioning and velocity from shScramble‐ and shIP3R(1,3)C‐expressing DCs. Cells were recorded as in (B) (n = 20 cells from two experiments). The Mann-Whitney test was applied for statistical analysis."}
{"words": ["Figure", "6A", "Immunoblot", "showing", "the", "intracellular", "levels", "of", "phosphorylated", "MLC", "in", "DCs", "treated", "overnight", "with", "increasing", "amounts", "of", "the", "MLCK", "inhibitor", ",", "ML7", ".", "B", ",", "C", "Analysis", "of", "immature", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "in", "the", "presence", "of", "ML7", "or", "DMSO", "as", "a", "control", "(", "n", ">", "170", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "Velocity", "fluctuations", "(", "ΔV", "/", "V0", ")", "of", "immature", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "(", "B", ")", ".", "Whiskers", "show", "10", "-", "90", "percentiles", "plus", "the", "median", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "a", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ".", "Frequency", "of", "changes", "(", "C", ")", "in", "direction", "of", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", ".", "Mean", "plus", "SD", "are", "shown", ".", "A", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "was", "applied", "for", "statistical", "analysis", ".", "D", ",", "E", "Analysis", "of", "shScramble", "(", "gray", ")", "‐", "and", "shIP3R", "(", "1", ",", "3", ")", "C", "(", "green", ")", "‐", "expressing", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "in", "the", "presence", "of", "20", "μM", "ML7", "(", "n", ">", "70", "cells", "per", "condition", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Velocity", "fluctuations", "(", "ΔV", "/", "V0", ")", "of", "immature", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", "(", "D", ")", ".", "Boxes", "illustrate", "10", "-", "90", "percentiles", "of", "values", ",", "and", "whiskers", "represent", "the", "range", "of", "values", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "a", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ".", "Frequency", "of", "changes", "(", "E", ")", "in", "direction", "observed", "in", "DCs", "migrating", "in", "micro", "‐", "channels", ".", "Means", "plus", "SD", "are", "shown", ".", "A", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "was", "applied", "for", "statistical", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Immunoblot showing the intracellular levels of phosphorylated MLC in DCs treated overnight with increasing amounts of the MLCK inhibitor, ML7.B, C Analysis of immature DCs migrating in micro‐channels in the presence of ML7 or DMSO as a control (n > 170 cells from two independent experiments). Velocity fluctuations (ΔV/V0) of immature DCs migrating in micro‐channels (B). Whiskers show 10-90 percentiles plus the median. P‐values were calculated using a Kruskal-Wallis test. Frequency of changes (C) in direction of DCs migrating in micro‐channels. Mean plus SD are shown. A Kruskal-Wallis test was applied for statistical analysis.D, E Analysis of shScramble (gray)‐ and shIP3R(1,3)C (green)‐expressing DCs migrating in micro‐channels in the presence of 20 μM ML7 (n > 70 cells per condition from 3 independent experiments). Velocity fluctuations (ΔV/V0) of immature DCs migrating in micro‐channels (D). Boxes illustrate 10-90 percentiles of values, and whiskers represent the range of values. P‐values were calculated using a Kruskal-Wallis test. Frequency of changes (E) in direction observed in DCs migrating in micro‐channels. Means plus SD are shown. A Kruskal-Wallis test was applied for statistical analysis."}
{"words": ["Figure", "2Cumulative", "distribution", "function", "of", "differential", "ribosome", "occupancy", "as", "detected", "by", "ribosome", "profiling", "in", "miRNA", "_", "KO", "mutants", "versus", "WT", ".", "Of", "759", "predicted", "miRNA", "target", "genes", ",", "728", "(", "96", "%", ")", "were", "detectable", "in", "the", "ribosome", "profiling", "data", "and", "appear", "in", "the", "plot", ".", "Data", "information", ":", "In", "A", ",", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "applied", "to", "assess", "the", "significance", "for", "the", "increase", "in", "ribosome", "occupancy", "of", "the", "728", "/", "759", "miRNA", "targets", "(", "p", "-", "value", "<", "1e51", "for", "every", "mutant", ")", ".", "Top", ":", "Immunoblot", "analysis", "of", "CIC", "in", "WT", ",", "Drosha", "_", "KO", ",", "Dicer", "_", "KO", "and", "Ago2", "&", "1", "_", "KO", "mESCs", ".", "TUBULIN", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Blot", "is", "a", "representative", "image", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Bottom", ":", "Bar", "graph", "showing", "quantification", "of", "CIC", "intensity", ",", "normalized", "to", "TUBULIN", "and", "relative", "to", "the", "WT", "sample", "in", "three", "biological", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Bar", "graph", "in", "Fig", "2F", "shows", "mean", "intensity", "of", "CIC", "signal", "±", "SD", "normalized", "to", "TUBULIN", ".", "Values", "are", "relative", "to", "WT", ",", "which", "was", "set", "to", "1", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "comparing", "each", "value", "to", "the", "WT", ".", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Cumulative distribution function of differential ribosome occupancy as detected by ribosome profiling in miRNA_KO mutants versus WT. Of 759 predicted miRNA target genes, 728 (96%) were detectable in the ribosome profiling data and appear in the plot. Data information: In A, student's t-test was applied to assess the significance for the increase in ribosome occupancy of the 728/759 miRNA targets (p-value<1e51 for every mutant).Top: Immunoblot analysis of CIC in WT, Drosha_KO, Dicer_KO and Ago2&1_KO mESCs. TUBULIN was used as a loading control. Blot is a representative image of three biological replicates. Bottom: Bar graph showing quantification of CIC intensity, normalized to TUBULIN and relative to the WT sample in three biological replicates. Data information: Bar graph in Fig 2F shows mean intensity of CIC signal ± SD normalized to TUBULIN. Values are relative to WT, which was set to 1. P-values were calculated using a student's t-test comparing each value to the WT. *p-value<0.05."}
{"words": ["Figure", "3MA", "plot", "of", "the", "DGE", "analysis", "in", "miR", "-", "290", "-", "295", "_", "KO", "mESCs", ".", "Data", "information", ":", "In", "A", ",", "significant", "genes", "in", "MA", "plot", "were", "determined", "using", "an", "adjusted", "p", "-", "value", "of", "0", ".", "1", ".", "F", ",", "G", ".", "Integrated", "data", "for", "Tfap4", "gene", "shows", "multiple", "lines", "of", "evidence", "for", "its", "regulation", "by", "miR", "-", "290", "-", "295", ".", "In", "addition", "to", "the", "data", "shown", "and", "described", "in", "Fig", "1D", ",", "E", ",", "a", "second", "AGO2", "-", "binding", "dataset", ",", "based", "on", "cross", "-", "linking", "immunoprecipitation", "and", "sequencing", "(", "CLIP", "-", "seq", ")", ",", "has", "been", "integrated", ".", "Response", "elements", "for", "miR", "-", "290", "-", "295", "cluster", "members", "are", "denoted", "in", "red", "and", "labeled", ".", "Top", ":", "Immunoblot", "analysis", "of", "TFAP4", "in", "WT", ",", "Drosha", "_", "KO", ",", "Dicer", "_", "KO", ",", "Ago2", "&", "1", "_", "KO", "and", "miR", "-", "290", "-", "295", "_", "KO", "mESCs", ".", "LAMINB1", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Blot", "is", "a", "representative", "image", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Bottom", ":", "Bar", "graph", "showing", "quantification", "of", "CIC", "intensity", ",", "normalized", "to", "LAMINB1", "and", "relative", "to", "the", "WT", "sample", "in", "three", "biological", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "In", "H", "bar", "graphs", "show", "mean", "intensity", "of", "TFAP4", "signal", "±", "SD", "normalized", "to", "LAMINB1", "Values", "are", "relative", "to", "WT", "or", "the", "negative", "control", "mimic", ",", "which", "was", "set", "to", "1", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "comparing", "each", "value", "to", "the", "WT", ".", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ".", "Top", ":", "Immunoblot", "analysis", "of", "TFAP4", "after", "transfection", "of", "miRNA", "mimics", "(", "miR", "-", "291a", "-", "5p", ",", "miR", "-", "291a", "-", "3p", "and", "miR", "-", "291a", "-", "5p", "+", "miR", "-", "291a", "-", "3p", "combined", ")", "in", "miR", "-", "290", "-", "295", "_", "KO", "mESCs", ".", "Immunoblots", "were", "stained", "with", "Coomassie", "blue", "dye", "as", "a", "loading", "control", ".", "Blot", "is", "a", "representative", "image", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Bottom", ":", "Bar", "graph", "showing", "quantification", "of", "TFAP4", "intensity", ",", "normalized", "to", "Coomassie", "and", "relative", "to", "the", "WT", "sample", "in", "three", "biological", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "In", "I", ",", "bar", "graphs", "show", "mean", "intensity", "of", "TFAP4", "signal", "±", "SD", "normalized", "to", "Coomassie", ".", "Values", "are", "relative", "to", "WT", "or", "the", "negative", "control", "mimic", ",", "which", "was", "set", "to", "1", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "comparing", "each", "value", "to", "the", "WT", ".", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ".", "Top", ":", "Mature", "sequences", "of", "5p", "and", "3p", "miRNAs", "of", "the", "miR", "-", "290", "-", "295", "family", "and", "the", "mature", "sequence", "of", "the", "human", "miR", "-", "302c", "-", "3p", ".", "Colors", "indicate", "identical", "seed", "sequences", ".", "Bottom", ":", "AGO2", "CLIP", "-", "seq", "shows", "a", "peak", "at", "the", "miR", "-", "302c", "-", "3p", "binding", "site", "on", "human", "TFAP4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3MA plot of the DGE analysis in miR-290-295_KO mESCs. Data information: In A, significant genes in MA plot were determined using an adjusted p-value of 0.1.F, G. Integrated data for Tfap4 gene shows multiple lines of evidence for its regulation by miR-290-295. In addition to the data shown and described in Fig 1D, E, a second AGO2-binding dataset, based on cross-linking immunoprecipitation and sequencing (CLIP-seq), has been integrated. Response elements for miR-290-295 cluster members are denoted in red and labeled.Top: Immunoblot analysis of TFAP4 in WT, Drosha_KO, Dicer_KO, Ago2&1_KO and miR-290-295_KO mESCs. LAMINB1 was used as a loading control. Blot is a representative image of three biological replicates. Bottom: Bar graph showing quantification of CIC intensity, normalized to LAMINB1 and relative to the WT sample in three biological replicates. Data information: In H bar graphs show mean intensity of TFAP4 signal ± SD normalized to LAMINB1 Values are relative to WT or the negative control mimic, which was set to 1. P-values were calculated using a student's t-test comparing each value to the WT. *p-value<0.05, **p-value<0.01, ****p-value<0.0001.Top: Immunoblot analysis of TFAP4 after transfection of miRNA mimics (miR-291a-5p, miR-291a-3p and miR-291a-5p+miR-291a-3p combined) in miR-290-295_KO mESCs. Immunoblots were stained with Coomassie blue dye as a loading control. Blot is a representative image of three biological replicates. Bottom: Bar graph showing quantification of TFAP4 intensity, normalized to Coomassie and relative to the WT sample in three biological replicates. Data information: In I, bar graphs show mean intensity of TFAP4 signal ± SD normalized to Coomassie. Values are relative to WT or the negative control mimic, which was set to 1. P-values were calculated using a student's t-test comparing each value to the WT. *p-value<0.05, **p-value<0.01, ****p-value<0.0001.Top: Mature sequences of 5p and 3p miRNAs of the miR-290-295 family and the mature sequence of the human miR-302c-3p. Colors indicate identical seed sequences. Bottom: AGO2 CLIP-seq shows a peak at the miR-302c-3p binding site on human TFAP4."}
{"words": ["Figure", "4Immunoblot", "validation", "of", "siPOOL", "-", "mediated", "knock", "down", "of", "Tfap4", ".", "TFAP4", "levels", "were", "compared", "between", "untreated", "WT", "versus", "miR", "-", "290", "-", "295", "_", "KO", "cells", "treated", "with", "a", "negative", "control", "and", "a", "Tfap4", "-", "targeted", "siPOOL", ".", "Immunoblots", "were", "stained", "with", "Coomassie", "blue", "dye", "as", "a", "loading", "control", ".", "Blot", "is", "a", "representative", "image", "of", "two", "biological", "replicates", ".", "Scatterplot", "of", "DEG", "in", "miR", "-", "290", "-", "295", "_", "KO", "control", "versus", "siPOOL", "-", "Tfap4", ".", "SiPOOL", "experiments", "were", "performed", "in", "miR", "-", "290", "-", "295", "_", "KO", "cells", "and", "DE", "was", "assessed", "relative", "to", "a", "negative", "control", "siPOOL", "transfection", ".", "Only", "genes", "that", "are", "statistically", "significantly", "differentially", "expressed", "in", "miR", "-", "290", "-", "295", "_", "KO", "are", "shown", ".", "Genes", "predicted", "to", "be", "targeted", "by", "miR", "-", "290", "-", "295", "are", "marked", "in", "blue", ".", "Genes", "are", "defined", "as", "rescued", "(", "orange", ")", "if", "the", "log2FoldChange", "-", "ratio", "between", "miR", "-", "290", "-", "295", "_", "KO", "control", "and", "siPOOL", "-", "Tfap4", "is", "in", "the", "range", "[", "-", "2", ",", "-", "1", "/", "2", "]", ".", "Tfap4", "is", "marked", "by", "a", "red", "dot", ".", "Representative", "images", "of", "NANOG", "(", "red", ")", "and", "OCT4", "(", "green", ")", "immunofluorescence", "staining", "in", "WT", ",", "Drosha", "_", "KO", "and", "Drosha", "&", "Tfap4", "_", "KO", "mESCs", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "NANOG", "fluorescence", "signal", "intensity", "in", "WT", ",", "Drosha", "_", "KO", "and", "Drosha", "&", "Tfap4", "_", "KO", "mESCs", "show", "no", "significant", "rescue", "of", "NANOG", "intensity", "in", "Drosha", "&", "Tfap4", "_", "KO", "Data", "information", ":", "In", "E", ",", "box", "plots", "show", "nuclear", "intensity", "of", "NANOG", "in", "~", "300", "cells", "per", "genotype", ".", "P", "-", "values", "were", "generated", "using", "ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ".", "In", "panel", "E", ",", "the", "box", "plot", "'", "s", "central", "band", "represents", "the", "median", "relative", "intensity", "for", "each", "genotype", ".", "The", "boxes", "represent", "the", "interquartile", "range", "and", "the", "whiskers", "represent", "the", "maximum", "and", "minimum", "relative", "intensity", "values", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunoblot validation of siPOOL-mediated knock down of Tfap4. TFAP4 levels were compared between untreated WT versus miR-290-295_KO cells treated with a negative control and a Tfap4-targeted siPOOL. Immunoblots were stained with Coomassie blue dye as a loading control. Blot is a representative image of two biological replicates.Scatterplot of DEG in miR-290-295_KO control versus siPOOL-Tfap4. SiPOOL experiments were performed in miR-290-295_KO cells and DE was assessed relative to a negative control siPOOL transfection. Only genes that are statistically significantly differentially expressed in miR-290-295_KO are shown. Genes predicted to be targeted by miR-290-295 are marked in blue. Genes are defined as rescued (orange) if the log2FoldChange-ratio between miR-290-295_KO control and siPOOL-Tfap4 is in the range [-2, -1/2]. Tfap4 is marked by a red dot.Representative images of NANOG (red) and OCT4 (green) immunofluorescence staining in WT, Drosha_KO and Drosha & Tfap4_KO mESCs. Scale bar = 20 μm. Quantification of NANOG fluorescence signal intensity in WT, Drosha_KO and Drosha & Tfap4_KO mESCs show no significant rescue of NANOG intensity in Drosha & Tfap4_KO Data information: In E, box plots show nuclear intensity of NANOG in ~300 cells per genotype. P-values were generated using ordinary one-way ANOVA. ****p-value<0.0001. In panel E, the box plot's central band represents the median relative intensity for each genotype. The boxes represent the interquartile range and the whiskers represent the maximum and minimum relative intensity values. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "Two", "-", "color", "dSTORM", "imaging", "of", "RIM1", "/", "2", "and", "gephyrin", "in", "cryosections", ".", "From", "left", "to", "right", ":", "rendered", "images", "of", "RIM1", "/", "2", "and", "gephyrin", "clusters", "showing", "the", "aligned", "SSDs", "(", "arrows", ")", ";", "gephyrin", "SSDs", "segmented", "by", "watershed", "outlined", "with", "different", "colors", ";", "RIM1", "/", "2", "SSDs", "outlined", "with", "different", "colors", ";", "binary", "SSDs", "of", "gephyrin", "and", "RIM1", "/", "2", ".", "Inhibitory", "synapses", "were", "identified", "by", "the", "gephyrin", "clusters", "in", "the", "epifluorescence", "images", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "RIM1", "/", "2", "was", "labelled", "with", "Alexa", "647", ",", "gephyrin", "(", "mAb7a", ")", "with", "Cy3B", "in", "these", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) Two-color dSTORM imaging of RIM1/2 and gephyrin in cryosections. From left to right: rendered images of RIM1/2 and gephyrin clusters showing the aligned SSDs (arrows); gephyrin SSDs segmented by watershed outlined with different colors; RIM1/2 SSDs outlined with different colors; binary SSDs of gephyrin and RIM1/2. Inhibitory synapses were identified by the gephyrin clusters in the epifluorescence images. Scale bar: 200 nm. RIM1/2 was labelled with Alexa 647, gephyrin (mAb7a) with Cy3B in these experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "C", ")", "Alignment", "of", "SSDs", "of", "pre", "-", "synaptic", "RIM1", "/", "2", "and", "SSDs", "of", "post", "-", "synaptic", "gephyrin", ",", "GlyRs", ",", "and", "GABAARs", ",", "respectively", ".", "(", "A1", "-", "C1", ")", "Distances", "were", "measured", "between", "the", "intensity", "peaks", "of", "paired", "SSDs", "in", "rendered", "dual", "-", "color", "dSTORM", "images", "(", "yellow", "line", ",", "values", "given", "in", "mean", "±", "SD", ")", ".", "RIM1", "/", "2", "was", "labelled", "with", "Alexa", "647", "and", "gephyrin", "(", "mAb7a", ")", "with", "Cy3B", "in", "(", "A1", ")", ".", "RIM1", "/", "2", "was", "labelled", "with", "Cy3B", ",", "while", "GlyRs", "or", "GABAARs", "were", "labelled", "with", "Alexa", "647", "in", "(", "B1", ")", "and", "(", "C1", ")", ".", "(", "A2", "-", "C2", ")", "Trans", "-", "synaptic", "alignment", "of", "SSDs", "of", "gephyrin", ",", "GlyRs", ",", "GABAARs", "and", "RIM1", "/", "2", ".", "SSDs", "were", "segmented", "by", "H", "-", "watershed", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "synapses", ":", "n", "=", "48", "(", "A1", ",", "A2", ")", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "no", "treatment", ")", ",", "n", "=", "30", "(", "B1", ",", "B2", ")", "from", "two", "experiments", "with", "TTX", "treatment", ",", "n", "=", "16", "(", "C1", ",", "C2", ")", "from", "two", "experiments", "with", "TTX", ".", "Only", "synapses", "with", "side", "view", "profiles", "were", "included", ".", "All", "images", "are", "adjusted", "to", "the", "same", "scale", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-C) Alignment of SSDs of pre-synaptic RIM1/2 and SSDs of post-synaptic gephyrin, GlyRs, and GABAARs, respectively. (A1-C1) Distances were measured between the intensity peaks of paired SSDs in rendered dual-color dSTORM images (yellow line, values given in mean ± SD). RIM1/2 was labelled with Alexa 647 and gephyrin (mAb7a) with Cy3B in (A1). RIM1/2 was labelled with Cy3B, while GlyRs or GABAARs were labelled with Alexa 647 in (B1) and (C1). (A2-C2) Trans-synaptic alignment of SSDs of gephyrin, GlyRs, GABAARs and RIM1/2. SSDs were segmented by H-watershed. Data are plotted as mean ± SD. Number of synapses: n = 48 (A1, A2) from three independent experiments (no treatment), n = 30 (B1, B2) from two experiments with TTX treatment, n = 16 (C1, C2) from two experiments with TTX. Only synapses with side view profiles were included. All images are adjusted to the same scale. Scale bar: 200 nm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "dSTORM", "images", "of", "GlyRs", "and", "GABAARs", "at", "synapses", "in", "side", "view", "(", "A", ")", "or", "en", "face", "view", "(", "B", ")", ".", "The", "top", "row", "of", "images", "shows", "the", "pointillist", "representation", "of", "the", "detections", ",", "the", "second", "row", "the", "rendered", "images", "and", "the", "bottom", "row", "the", "corresponding", "segmented", "SSDs", ".", "GlyRs", "were", "labelled", "with", "Alexa", "647", "and", "GABAARs", "with", "Cy3B", "in", "these", "experiments", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-B) Representative dSTORM images of GlyRs and GABAARs at synapses in side view (A) or en face view (B). The top row of images shows the pointillist representation of the detections, the second row the rendered images and the bottom row the corresponding segmented SSDs. GlyRs were labelled with Alexa 647 and GABAARs with Cy3B in these experiments. Scale bar: 200 nm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Triple", "immuno", "-", "labelling", "of", "gephyrin", ",", "GlyRs", "and", "GABAARs", "at", "mixed", "inhibitory", "synapses", "(", "arrow", ")", "imaged", "with", "conventional", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Triple immuno-labelling of gephyrin, GlyRs and GABAARs at mixed inhibitory synapses (arrow) imaged with conventional fluorescence microscopy. Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "5Characterization", "of", "the", "nanoscale", "organization", "of", "GABAARs", "and", "GlyRs", "at", "mixed", "inhibitory", "synapses", ".", "(", "A", ")", "Synaptic", "receptor", "cluster", "rendered", "from", "detections", "of", "both", "GABAARs", "(", "labelled", "with", "Alexa", "647", ")", "and", "GlyRs", "(", "labelled", "with", "Cy3B", ")", ".", "(", "B", ")", "Detections", "of", "GABAARs", "(", "red", "dots", ")", "and", "GlyRs", "(", "blue", "dots", ")", "overlaid", "with", "binary", "synaptic", "mask", "(", "white", ")", ".", "Sub", "-", "synaptic", "characterization", "of", "GABAAR", "and", "GlyR", "domains", ".", "(", "F", ")", "Watershed", "segmentation", "of", "sub", "-", "synaptic", "domains", "(", "SSDs", ")", ".", "Each", "SSD", "is", "shown", "in", "different", "colors", ".", "(", "G", ")", "Detections", "of", "GABAARs", "(", "red", "dots", ")", "and", "GlyRs", "(", "blue", "dots", ")", "overlaid", "with", "SSDs", "(", "white", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Characterization of the nanoscale organization of GABAARs and GlyRs at mixed inhibitory synapses. (A) Synaptic receptor cluster rendered from detections of both GABAARs (labelled with Alexa 647) and GlyRs (labelled with Cy3B). (B) Detections of GABAARs (red dots) and GlyRs (blue dots) overlaid with binary synaptic mask (white).Sub-synaptic characterization of GABAAR and GlyR domains. (F) Watershed segmentation of sub-synaptic domains (SSDs). Each SSD is shown in different colors. (G) Detections of GABAARs (red dots) and GlyRs (blue dots) overlaid with SSDs (white)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "The", "number", "of", "receptor", "SSDs", ",", "segmented", "from", "the", "combined", "receptor", "clusters", "of", "GABAARs", "and", "GlyRs", ",", "was", "decreased", "after", "4", "-", "AP", "treatment", "(", "MW", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "B", ")", "This", "was", "mostly", "due", "to", "the", "loss", "of", "GABAAR", "SSDs", "that", "were", "segmented", "from", "the", "rendered", "images", "of", "GABAAR", "detections", "only", "(", "MW", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "C", ")", "The", "number", "of", "GlyR", "SSDs", "(", "based", "on", "GlyR", "detections", ")", "were", "only", "marginally", "reduced", "(", "MW", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Data", "information", ":", "Number", "of", "synapses", ":", "n", "=", "452", "in", "TTX", ",", "n", "=", "583", "in", "4", "-", "AP", "condition", ",", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) The number of receptor SSDs, segmented from the combined receptor clusters of GABAARs and GlyRs, was decreased after 4-AP treatment (MW test, p < 0.0001). (B) This was mostly due to the loss of GABAAR SSDs that were segmented from the rendered images of GABAAR detections only (MW, ****p < 0.0001). (C) The number of GlyR SSDs (based on GlyR detections) were only marginally reduced (MW, **p < 0.01). Data information: Number of synapses: n = 452 in TTX, n = 583 in 4-AP condition, from three independent experiments. Mean ± SEM. "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "C", ")", "Reduced", "immuno", "-", "reactivity", "of", "S270", "phosphorylated", "gephyrin", "but", "not", "total", "gephyrin", "levels", "after", "4", "-", "AP", "treatment", ",", "revealed", "by", "conventional", "fluorescence", "microscopy", "(", "KS", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "in", "B1", "and", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "B2", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "C", ")", ".", "Total", "gephyrin", "was", "probed", "with", "polyclonal", "rabbit", "primary", "antibody", "(", "rbGPHN", ")", ",", "and", "pS270", "phosphorylated", "gephyrin", "with", "monoclonal", "mouse", "primary", "antibody", "(", "m7a", ")", ".", "Number", "of", "synapses", ":", "n", "=", "4040", "in", "TTX", "and", "n", "=", "3818", "in", "4", "-", "AP", "conditions", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Reduced", "numbers", "of", "pS270", "gephyrin", "(", "m7a", ")", "detections", "were", "recorded", "by", "dSTORM", "for", "the", "entire", "synaptic", "area", "(", "D", ",", "KS", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "The", "number", "of", "detections", "of", "pS270", "gephyrin", "per", "SSD", "(", "E", ",", "KS", ",", "p", "=", "0", ".", "18", ")", "and", "the", "number", "of", "SSDs", "(", "F", ",", "MW", ",", "p", "=", "0", ".", "11", ")", "were", "not", "changed", "by", "4", "-", "AP", "treatment", ".", "Gephyrin", "was", "probed", "with", "mAb7a", "antibody", "and", "Alexa", "647", "dye", ".", "Number", "of", "synapses", ":", "n", "=", "810", "in", "TTX", "and", "n", "=", "727", "in", "4", "-", "AP", "conditions", "from", "three", "independent", "experiments", ";", "(", "F", ")", "mean", "±", "SEM", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-C) Reduced immuno-reactivity of S270 phosphorylated gephyrin but not total gephyrin levels after 4-AP treatment, revealed by conventional fluorescence microscopy (KS test, p < 0.001 in B1 and p < 0.0001 in B2, p < 0.0001 in C). Total gephyrin was probed with polyclonal rabbit primary antibody (rbGPHN), and pS270 phosphorylated gephyrin with monoclonal mouse primary antibody (m7a). Number of synapses: n = 4040 in TTX and n = 3818 in 4-AP conditions from two independent experiments. Scale bar: 2 µm.(D-F) Reduced numbers of pS270 gephyrin (m7a) detections were recorded by dSTORM for the entire synaptic area (D, KS test, p < 0.01). The number of detections of pS270 gephyrin per SSD (E, KS, p = 0.18) and the number of SSDs (F, MW, p = 0.11) were not changed by 4-AP treatment. Gephyrin was probed with mAb7a antibody and Alexa 647 dye. Number of synapses: n = 810 in TTX and n = 727 in 4-AP conditions from three independent experiments; (F) mean ± SEM. Scale bar: 100 nm."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "C", ")", "A", ")", "Bilateral", "bowing", "deformity", "and", "short", "femora", "and", "tibiae", "with", "atypical", "growth", "plates", ",", "and", "B", ")", "short", "and", "bowed", "humerus", "at", "age", "4", ".", "5", "years", ",", "C", ")", "vertebral", "fractures", "(", "arrows", ")", "on", "lateral", "imaging", "at", "age", "9", "years", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-C) A) Bilateral bowing deformity and short femora and tibiae with atypical growth plates, and B) short and bowed humerus at age 4.5 years, C) vertebral fractures (arrows) on lateral imaging at age 9 years."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "H", ")", "Transiliac", "bone", "sample", "of", "the", "patient", "at", "age", "of", "10", "years", "viewed", "in", "the", "light", "microscope", ".", "A", "-", "E", ")", "Goldner", "stained", "sections", ",", "F", "-", "H", ")", ":", "Giemsa", "stained", "sections", ".", "A", ")", "Overview", "of", "the", "entire", "sample", "shows", "scarcity", "of", "mineralized", "bone", "(", "stained", "in", "green", ")", ".", "Black", "arrowheads", "point", "towards", "the", "very", "thin", "cortices", "(", "right", "side", ",", "only", "a", "fractured", "cortex", "is", "visible", ")", ".", "B", ")", "Trabecular", "features", "are", "mostly", "small", "and", "isolated", ".", "C", ")", "Black", "arrows", "point", "toward", "three", "bone", "resorbing", "osteoclasts", "leading", "to", "the", "disconnection", "of", "two", "trabecular", "features", ".", "D", ")", "Cortical", "bone", "viewed", "under", "polarized", "light", ":", "white", "arrows", "point", "towards", "collagen", "fibers", "arranged", "in", "a", "parallel", "concentric", "way", "around", "osteon", "next", "to", "a", "region", "where", "collagen", "fibers", "are", "randomly", "arranged", ",", "as", "typical", "for", "woven", "bone", "(", "white", "asterisk", ")", ".", "E", ")", "Detail", "from", "cortical", "bone", "showing", "roundish", "cells", "on", "the", "periosteal", "side", "surrounded", "by", "a", "mainly", "red", ",", "thus", ",", "poorly", "mineralized", "matrix", "(", "white", "stars", ")", ".", "F", ")", ",", "G", ")", "Details", "from", "the", "cortex", "in", "Giemsa", "stained", "section", "show", "areas", "with", "unmineralized", "cartilage", "(", "black", "arrows", ")", "and", "mineralized", "woven", "bone", "and", "or", "mineralized", "cartilage", "(", "dark", "purple", ",", "black", "asterisks", ")", ",", "mineralized", "bone", "is", "stained", "pink", ".", "H", ")", "Trabecular", "feature", "with", "mineralized", "cartilage", "inclusion", "stained", "deep", "purple", "(", "arrowhead", ")", ",", "surrounded", "by", "bone", "tissue", "stained", "pink", ".", "Note", "many", "osteoblasts", "on", "the", "trabecular", "surface", "(", "black", "arrows", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-H) Transiliac bone sample of the patient at age of 10 years viewed in the light microscope. A-E) Goldner stained sections, F-H): Giemsa stained sections. A) Overview of the entire sample shows scarcity of mineralized bone (stained in green). Black arrowheads point towards the very thin cortices (right side, only a fractured cortex is visible). B) Trabecular features are mostly small and isolated. C) Black arrows point toward three bone resorbing osteoclasts leading to the disconnection of two trabecular features. D) Cortical bone viewed under polarized light: white arrows point towards collagen fibers arranged in a parallel concentric way around osteon next to a region where collagen fibers are randomly arranged, as typical for woven bone (white asterisk). E) Detail from cortical bone showing roundish cells on the periosteal side surrounded by a mainly red, thus, poorly mineralized matrix (white stars). F), G) Details from the cortex in Giemsa stained section show areas with unmineralized cartilage (black arrows) and mineralized woven bone and or mineralized cartilage (dark purple, black asterisks), mineralized bone is stained pink. H) Trabecular feature with mineralized cartilage inclusion stained deep purple (arrowhead), surrounded by bone tissue stained pink. Note many osteoblasts on the trabecular surface (black arrows)"}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Family", "pedigree", "with", "SEC16B", "homozygosity", "in", "the", "patient", "and", "heterozygosity", "in", "the", "mother", "and", "one", "brother", ".", "B", ")", "Validation", "of", "the", "SEC16B", "mutation", "by", "Sanger", "sequencing", ".", "Sanger", "sequencing", "of", "gDNA", "of", "the", "patient", ",", "brother", ",", "mother", "and", "healthy", "control", ".", "Magnification", "of", "the", "electropherogram", "shows", "the", "position", "c", ".", "424", "and", "the", "base", "change", "CT", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Family pedigree with SEC16B homozygosity in the patient and heterozygosity in the mother and one brother. B) Validation of the SEC16B mutation by Sanger sequencing. Sanger sequencing of gDNA of the patient, brother, mother and healthy control. Magnification of the electropherogram shows the position c.424 and the base change CT."}
{"words": ["Figure", "4C", "-", "F", ")", "C", ")", "COL1A1", "and", "COL1A2", "expression", "in", "the", "ER", "of", "SEC16B", "patient", "and", "control", "fibroblasts", "assessed", "by", "western", "blotting", ".", "KDEL", ",", "Calnexin", ",", "BIP", "and", "PDI", ",", "all", "ER", "-", "resident", "proteins", "were", "used", "as", "ER", "markers", ".", "E", ")", "Golgi", "complex", "was", "isolated", "according", "to", "the", "method", "described", "in", "Current", "Protocols", "in", "Cell", "Biology", ",", "Unit", "3", ".", "9", "from", "healthy", "control", "cells", "and", "patient", "derived", "fibroblasts", ".", "Subsequently", ",", "COL1A1", "and", "COL1A2", "expression", "in", "the", "Golgi", "complex", "of", "SEC16B", "patient", "and", "control", "fibroblasts", "were", "determined", "by", "western", "blotting", ".", "GM130", "(", "Golgi", "-", "resident", "protein", ")", "was", "used", "as", "marker", "for", "Golgi", "complex", ".", "All", "cells", "were", "treated", "with", "ascorbic", "acid", "0", ".", "05", "mg", "/", "ml", "for", "20", "hours", "before", "the", "Golgi", "complex", "was", "isolated", ".", "D", ",", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "bands", "that", "was", "done", "with", "Bio", "-", "Rad", "Image", "Lab", "6", ".", "1", "software", "to", "calculate", "the", "expression", "levels", ".", "COL1A1", "and", "COL1A2", "band", "intensities", "were", "either", "normalized", "to", "(", "D", ")", "calnexin", "or", "(", "F", ")", "GM130", ".", "The", "normalized", "intensities", "were", "reported", "as", "fold", "change", "patient", "to", "control", "cells", ".", "Columns", "represent", "the", "mean", "of", "three", "(", "D", ")", "or", "two", "(", "F", ")", "independent", "experiments", "(", "raw", "values", ":", "0", ".", "27", "and", "0", ".", "53", "for", "COL1A1", "and", "0", ".", "29", ",", "0", ".", "21", "for", "COL1A2", ")", "respectively", ".", "Biological", "replicates", "were", "performed", ";", "bars", ",", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "*", "significant", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "differences", "obtained", "by", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C-F) C) COL1A1 and COL1A2 expression in the ER of SEC16B patient and control fibroblasts assessed by western blotting. KDEL, Calnexin, BIP and PDI, all ER-resident proteins were used as ER markers. E) Golgi complex was isolated according to the method described in Current Protocols in Cell Biology, Unit 3.9 from healthy control cells and patient derived fibroblasts. Subsequently, COL1A1 and COL1A2 expression in the Golgi complex of SEC16B patient and control fibroblasts were determined by western blotting. GM130 (Golgi-resident protein) was used as marker for Golgi complex. All cells were treated with ascorbic acid 0.05 mg/ml for 20 hours before the Golgi complex was isolated. D, F) Quantification of the bands that was done with Bio-Rad Image Lab 6.1 software to calculate the expression levels. COL1A1 and COL1A2 band intensities were either normalized to (D) calnexin or (F) GM130. The normalized intensities were reported as fold change patient to control cells. Columns represent the mean of three (D) or two (F) independent experiments (raw values: 0.27 and 0.53 for COL1A1 and 0.29, 0.21 for COL1A2) respectively. Biological replicates were performed; bars, standard error of the mean (SEM); *significant (p < 0.05) differences obtained by using unpaired two-tailed t test"}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Patient", "and", "control", "fibroblasts", "were", "plated", "on", "glass", "cover", "slips", ".", "After", "24", "hours", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "SEC31", "to", "label", "ERES", ".", "The", "scale", "bars", "are", "10", "µm", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "ERES", "per", "area", "from", "cells", "processed", ".", "The", "values", "are", "from", "four", "independent", "experiments", ",", "biological", "replicates", ".", "71", "cell", "per", "experiment", "were", "acquired", ".", "Bars", "are", "means", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "*", "significant", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "differences", "obtained", "by", "using", "a", "paired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "C", ")", "Patient", "and", "control", "fibroblasts", "were", "electroporated", "with", "plasmids", "encoding", "mCherry", "-", "tagged", "Mannosidase", "II", "(", "ManII", ")", "as", "part", "of", "a", "RUSH", "construct", ".", "After", "24", "hours", ",", "cells", "were", "fixed", "(", "T0", ")", "or", "treated", "with", "40", "mM", "biotin", "for", "20", "minutes", "(", "T20", ")", "followed", "by", "fixation", "and", "immunostaining", "for", "GM130", "to", "label", "the", "Golgi", "complex", ".", "The", "scale", "bars", "are", "10", "µm", ".", "D", ")", "quantification", "of", "59", "to", "81", "cells", "from", "three", "independent", "RUSH", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "Biological", "replicates", "were", "performed", ".", "Central", "band", "represents", "the", "median", ".", "Whiskers", "are", "minimum", "and", "maximum", "values", ".", "Outliers", "are", "defined", "as", "greater", "than", "1", ".", "5", "fold", "of", "upper", "quartiles", ".", "*", "*", "highly", "significant", "(", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "differences", "obtained", "by", "unpaired", "two", "tailed", "t", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Patient and control fibroblasts were plated on glass cover slips. After 24 hours, cells were fixed and stained for SEC31 to label ERES. The scale bars are 10 µm. B) Quantification of the number of ERES per area from cells processed. The values are from four independent experiments, biological replicates. 71 cell per experiment were acquired. Bars are means ± standard error of the mean (SEM); *significant (p < 0.05) differences obtained by using a paired two-tailed t-test.C) Patient and control fibroblasts were electroporated with plasmids encoding mCherry-tagged Mannosidase II (ManII) as part of a RUSH construct. After 24 hours, cells were fixed (T0) or treated with 40 mM biotin for 20 minutes (T20) followed by fixation and immunostaining for GM130 to label the Golgi complex. The scale bars are 10 µm. D) quantification of 59 to 81 cells from three independent RUSH experiments (biological replicates). Biological replicates were performed. Central band represents the median. Whiskers are minimum and maximum values. Outliers are defined as greater than 1.5 fold of upper quartiles.** highly significant (p < 0.005) differences obtained by unpaired two tailed t-test"}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Micrograph", "of", "thin", "-", "section", "electron", "microscopy", "for", "fibroblasts", "from", "SEC16B", "mutant", "patient", "cells", "and", "healthy", "control", "cells", ".", "Arrows", "point", "to", "rER", ",", "arrowheads", "to", "MVBs", "/", "MLBs", ",", "star", "indicates", "autophagosome", ".", "Scale", "bar", "is", "1", "µm", ".", "Summary", "of", "the", "number", "of", "the", "autophagosomes", ".", "C", ")", "Western", "blotting", "anaylsis", "of", "autophagy", "marker", "LC3B", ".", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "bands", ".", "Columns", "represent", "the", "mean", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "biological", "replicates", "were", "performed", ";", "bars", ",", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "*", "significant", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "differences", "obtained", "by", "using", "unpaired", "two", "tailed", "t", "-", "test", ".", "E", ")", "24", "hours", "after", "plating", "of", "patient", "and", "control", "fibroblasts", ",", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "10mM", "thapsigargin", ",", "or", "1", "mg", "/", "ml", "tunicamycin", "for", "6", "hours", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "immunoblotted", "for", "XBP1s", "as", "a", "marker", "for", "ER", "stress", "and", "for", "vinculin", "to", "ensure", "equal", "loading", ".", "F", ")", "Western", "blotting", "anaylsis", "of", "apoptosis", "marker", "cleaved", "caspase", "3", "show", "enhanced", "expression", "in", "patient", "cells", "when", "compared", "to", "healthy", "control", ".", "A", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Biological", "replicates", "were", "performed", ".", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "bands", ".", "All", "band", "intensities", "were", "normalized", "to", "those", "of", "Actin", "and", "reported", "as", "fold", "change", "patient", "to", "control", "cells", ".", "Columns", "represent", "the", "mean", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "biological", "replicates", "were", "performed", ";", "bars", ",", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "*", "significant", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "differences", "obtained", "by", "using", "unpaired", "two", "tailed", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Micrograph of thin-section electron microscopy for fibroblasts from SEC16B mutant patient cells and healthy control cells. Arrows point to rER, arrowheads to MVBs/MLBs, star indicates autophagosome. Scale bar is 1 µm. Summary of the number of the autophagosomes.C) Western blotting anaylsis of autophagy marker LC3B. D) Quantification of the bands. Columns represent the mean of three independent experiments, biological replicates were performed; bars, standard error of the mean (SEM); *significant (p < 0.05) differences obtained by using unpaired two tailed t-test.E) 24 hours after plating of patient and control fibroblasts, cells were treated with DMSO, 10mM thapsigargin, or 1 mg/ml tunicamycin for 6 hours. Cells were lysed and immunoblotted for XBP1s as a marker for ER stress and for vinculin to ensure equal loading.F) Western blotting anaylsis of apoptosis marker cleaved caspase 3 show enhanced expression in patient cells when compared to healthy control. A representative experiment out of three independent experiments is shown. Biological replicates were performed. G) Quantification of the bands. All band intensities were normalized to those of Actin and reported as fold change patient to control cells. Columns represent the mean of three independent experiments, biological replicates were performed; bars, standard error of the mean (SEM); *significant (p < 0.05) differences obtained by using unpaired two tailed t-test."}
{"words": ["Figure", "7Patient", "cells", "were", "either", "transfected", "with", "pCDNA3", "empty", "vector", "(", "empty", "vector", ")", "or", "pcDNA3", "which", "encodes", "wt", "SEC16B", "(", "TF", ")", ".", "Cells", "were", "then", "selected", "with", "puromycin", "and", "single", "colonies", "were", "picked", "up", "and", "expanded", ".", "Established", "single", "colonies", "were", "used", ".", "B", ")", "Immunofluorescence", "labeling", "of", "the", "control", "and", "the", "patient", "fibroblasts", "for", "COL1A1", "marker", "proα1", "(", "I", ")", "and", "rough", "ER", "marker", "KDEL", ".", "The", "staining", "showed", "that", "while", "COL1A1", "is", "accumulated", "in", "the", "ER", "of", "patient", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", ",", "it", "is", "not", "accumulated", "in", "the", "ER", "of", "the", "patient", "cells", "transfected", "with", "SEC16B", "wt", ".", "Scale", "bar", "is", "25", "µmPatient", "cells", "were", "either", "transfected", "with", "pCDNA3", "empty", "vector", "(", "empty", "vector", ")", "or", "pcDNA3", "which", "encodes", "wt", "SEC16B", "(", "TF", ")", ".", "Cells", "were", "then", "selected", "with", "puromycin", "and", "single", "colonies", "were", "picked", "up", "and", "expanded", ".", "Established", "single", "colonies", "were", "used", ".", "D", ")", "LC3B", "showed", "reduced", "expression", "in", "the", "TF", "SEC16B", "mutant", "cells", "(", "similar", "to", "expression", "in", "healthy", "control", "Fig", ".", "5B", ")", "when", "compared", "to", "empty", "vector", "transfected", "patient", "cells", ".", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "bands", ".", "All", "band", "intensities", "were", "normalized", "to", "those", "of", "Actin", "and", "reported", "as", "fold", "change", "patient", "to", "control", "cells", ".", "Columns", "represent", "the", "mean", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "biological", "replicates", "were", "performed", ";", "bars", ",", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "*", "*", "highly", "significant", "(", "p", "<", "0", ".", "001", "differences", "obtained", "by", "using", "unpaired", "two", "tailed", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Patient cells were either transfected with pCDNA3 empty vector (empty vector) or pcDNA3 which encodes wt SEC16B (TF). Cells were then selected with puromycin and single colonies were picked up and expanded. Established single colonies were used. B) Immunofluorescence labeling of the control and the patient fibroblasts for COL1A1 marker proα1 (I) and rough ER marker KDEL. The staining showed that while COL1A1 is accumulated in the ER of patient cells transfected with empty vector, it is not accumulated in the ER of the patient cells transfected with SEC16B wt. Scale bar is 25 µmPatient cells were either transfected with pCDNA3 empty vector (empty vector) or pcDNA3 which encodes wt SEC16B (TF). Cells were then selected with puromycin and single colonies were picked up and expanded. Established single colonies were used. D) LC3B showed reduced expression in the TF SEC16B mutant cells (similar to expression in healthy control Fig. 5B) when compared to empty vector transfected patient cells. E) Quantification of the bands. All band intensities were normalized to those of Actin and reported as fold change patient to control cells. Columns represent the mean of three independent experiments, biological replicates were performed; bars, standard error of the mean (SEM); **highly significant (p < 0.001 differences obtained by using unpaired two tailed t-test."}
{"words": ["Figure", "8A", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "GFP", "-", "tagged", "SEC16B", "-", "R142W", ".", "After", "24", "hours", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "against", "SEC13", "to", "label", "ERES", ".", "Green", "color", "shows", "SEC16B", "-", "R142W", "expression", ",", "red", "colors", "shows", "SEC13", "expression", "and", "yellow", "color", "shows", "the", "overlap", "of", "the", "two", "colors", ".", "The", "scale", "bars", "are", "10", "µm", ".", "D", ")", "HepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", ".", "After", "48h", ",", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "signal", "sequence", "GFP", "(", "ssGFP", ")", "as", "part", "of", "a", "RUSH", "construct", ".", "After", "24", "hours", ",", "cells", "were", "treated", "with", "40", "mM", "biotin", "for", "15", "minutes", "followed", "by", "fixation", "and", "immunostaining", "for", "GM130", "to", "label", "the", "Golgi", "complex", ".", "The", "scale", "bars", "are", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A) HeLa cells were transfected with plasmids encoding GFP-tagged SEC16B-R142W. After 24 hours, cells were fixed and immunostained against SEC13 to label ERES. Green color shows SEC16B-R142W expression, red colors shows SEC13 expression and yellow color shows the overlap of the two colors. The scale bars are 10 µm.D) HepG2 cells were transfected with the indicated siRNA. After 48h, cells were transfected with plasmids encoding signal sequence GFP (ssGFP) as part of a RUSH construct. After 24 hours, cells were treated with 40 mM biotin for 15 minutes followed by fixation and immunostaining for GM130 to label the Golgi complex. The scale bars are 10 µm."}
{"words": ["Figure", "1Ability", "of", "the", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "DNA", "vaccine", "OC", "-", "2", ".", "4", "to", "induce", "antibodies", "against", "S", "protein", "of", "the", "huCoV", "-", "19", "/", "WH01", "(", "B", ")", "and", "Beta", "variants", "(", "D", ")", "Ability", "of", "the", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "DNA", "vaccine", "OC", "-", "2", ".", "4", "to", "induce", "antibodies", "against", "S", "protein", "the", "ability", "to", "neutralize", "these", "viruses", "in", "vitro", "(", "C", "and", "E", ")", ".", "Also", "shown", "is", "the", "ability", "of", "the", "universal", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "DNA", "vaccine", "OC", "-", "2", ".", "4", "to", "prime", "and", "boost", "antibodies", "to", "S", "protein", "(", "huCoV", "-", "19", "/", "WH01", ")", "following", "priming", "with", "a", "recombinant", "S", "protein", "in", "adjuvant", "(", "F", ")", "Also", "shown", "is", "the", "ability", "of", "the", "universal", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "DNA", "vaccine", "OC", "-", "2", ".", "4", "to", "prime", "the", "ability", "of", "these", "antibodies", "to", "neutralize", "the", "Delta", "and", "Omicron", "variants", "in", "vitro", "(", "G", ")", ".", "Finally", ",", "three", "doses", "of", "the", "universal", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "DNA", "vaccine", "OC", "-", "2", ".", "4", "induce", "antibodies", "that", "cross", "react", "with", "S", "proteins", "from", "the", "huCoV", "-", "19", "/", "WH01", ",", "Beta", ",", "and", "Delta", "variants", "in", "mice", "(", "H", ")", ",", "four", "840", "µg", "doses", "of", "the", "same", "vaccine", "induces", "antibodies", "in", "female", "Zeeland", "White", "rabbits", "that", "neutralize", "both", "the", "Delta", "and", "Omicron", "variants", "in", "vitro", "(", "I", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Ability of the SARS-CoV-2 DNA vaccine OC-2.4 to induce antibodies against S protein of the huCoV-19/WH01 (B) and Beta variants (D)Ability of the SARS-CoV-2 DNA vaccine OC-2.4 to induce antibodies against S protein the ability to neutralize these viruses in vitro (C and E).Also shown is the ability of the universal SARS-CoV-2 DNA vaccine OC-2.4 to prime and boost antibodies to S protein (huCoV-19/WH01) following priming with a recombinant S protein in adjuvant (F)Also shown is the ability of the universal SARS-CoV-2 DNA vaccine OC-2.4 to prime the ability of these antibodies to neutralize the Delta and Omicron variants in vitro (G).Finally, three doses of the universal SARS-CoV-2 DNA vaccine OC-2.4 induce antibodies that cross react with S proteins from the huCoV-19/WH01, Beta, and Delta variants in mice (H),four 840 µg doses of the same vaccine induces antibodies in female Zeeland White rabbits that neutralize both the Delta and Omicron variants in vitro (I)."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "D", ")", "T", "cell", "responses", "as", "determined", "by", "ELISpot", "in", "Balb", "/", "c", "mice", "immunized", "three", "times", "with", "either", "spike", "protein", "in", "QS21", "adjuvant", "(", "rS", "/", "QS21", ";", "A", ")", ",", "50µg", "universal", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "vaccine", "OC", "-", "2", ".", "4", "(", "B", ")", ",", "primed", "with", "rS", "/", "QS21", "and", "boosted", "with", "two", "doses", "of", "OC", "-", "2", ".", "4", "(", "C", ")", ",", "or", "empty", "pVAX", "plasmid", "(", "D", ")", ",", "using", "in", "vivo", "electroporation", ".", "Spleens", "were", "harvested", "and", "individual", "mice", "were", "analyzed", "for", "the", "presence", "of", "IFNγ", "producing", "T", "cells", "using", "the", "indicated", "antigens", ".", "Data", "has", "been", "given", "as", "the", "number", "of", "IFNγ", "producing", "(", "spot", "forming", ")", "cells", "(", "SFCs", ")", "per", "million", "splenocytes", ".", "Each", "color", "indicate", "an", "individual", "mice", ".", "E", "-", "H", ")", "Also", "shown", "is", "analysis", "of", "T", "cell", "responses", "in", "New", "Zeeland", "White", "rabbits", ",", "which", "were", "immunized", "four", "times", "with", "either", "vehicle", "only", "(", "E", ")", ",", "or", "84µg", "(", "F", ")", "or", "840", "µg", "(", "G", ")", "universal", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "DNA", "vaccine", "OC", "-", "2", ".", "4", "using", "in", "vivo", "electroporation", ".", "Peripheral", "blood", "mononuclear", "cells", "(", "PBMCs", ")", "were", "harvested", "and", "analysed", "for", "presence", "of", "IFNγ", "producing", "T", "cells", "using", "the", "indicated", "antigens", ".", "Data", "has", "been", "given", "as", "the", "number", "of", "IFNγ", "SFCs", "per", "million", "PBMCs", ".", "The", "dotted", "line", "indicates", "the", "50", "SFC", "cut", "off", ".", "Also", "shown", "(", "H", ")", "is", "the", "cumulated", "IFNγ", "SFCs", "per", "million", "PBMCs", "to", "the", "RBD", ",", "M", "and", "N", "peptide", "pools", "added", "together", "for", "each", "group", "of", "immunized", "rabbits", "(", "84µg", "DNA", ",", "840µg", "DNA", ",", "and", "vehicle", "only", ")", "at", "each", "time", "point", "(", "day", ")", ".", "The", "numbers", "on", "the", "x", "-", "axis", "of", "graphs", "A", ")", "to", "D", ")", "indicates", "the", "number", "of", "the", "respective", "peptide", "pool", "(", "WH1", "variant", ")", "covering", "a", "part", "of", "the", "indicated", "protein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-D) T cell responses as determined by ELISpot in Balb/c mice immunized three times with either spike protein in QS21 adjuvant (rS/QS21; A), 50µg universal SARS-CoV-2 vaccine OC-2.4 (B), primed with rS/QS21 and boosted with two doses of OC-2.4 (C), or empty pVAX plasmid (D), using in vivo electroporation. Spleens were harvested and individual mice were analyzed for the presence of IFNγ producing T cells using the indicated antigens. Data has been given as the number of IFNγ producing (spot forming) cells (SFCs) per million splenocytes. Each color indicate an individual mice.E-H) Also shown is analysis of T cell responses in New Zeeland White rabbits, which were immunized four times with either vehicle only (E), or 84µg (F) or 840 µg (G) universal SARS-CoV-2 DNA vaccine OC-2.4 using in vivo electroporation. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were harvested and analysed for presence of IFNγ producing T cells using the indicated antigens. Data has been given as the number of IFNγ SFCs per million PBMCs. The dotted line indicates the 50 SFC cut off. Also shown (H) is the cumulated IFNγ SFCs per million PBMCs to the RBD, M and N peptide pools added together for each group of immunized rabbits (84µg DNA, 840µg DNA, and vehicle only) at each time point (day). The numbers on the x-axis of graphs A) to D) indicates the number of the respective peptide pool (WH1 variant) covering a part of the indicated protein."}
{"words": ["Figure", "3Three", "doses", "of", "respective", "vaccine", "fully", "or", "partially", "protected", "the", "mice", "against", "severe", "disease", "as", "determined", "by", "histological", "scoring", "of", "brochial", "and", "alveolar", "lung", "tissues", "(", "b", ")", "Three", "doses", "of", "respective", "vaccine", "fully", "or", "partially", "protected", "the", "mice", "against", "severe", "disease", "as", "percent", "weight", "loss", "(", "c", ")", ".", "D", ")", "Three", "doses", "of", "respective", "vaccine", "also", "protect", "against", "viral", "replication", "in", "the", "nose", ",", "lungs", "and", "spleen", ".", "Values", "have", "been", "given", "as", "cycle", "times", "(", "CT", ")", ",", "where", "lower", "values", "indicate", "a", "higher", "viral", "load", ".", "Statistical", "comparisons", "in", "the", "graph", "are", "shown", "with", "lines", "with", "one", "asterisc", "indicating", "p", "<", "0", ",", "05", "and", "two", "asterics", "p", "<", "0", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Three doses of respective vaccine fully or partially protected the mice against severe disease as determined by histological scoring of brochial and alveolar lung tissues (b)Three doses of respective vaccine fully or partially protected the mice against severe disease as percent weight loss (c).D) Three doses of respective vaccine also protect against viral replication in the nose, lungs and spleen. Values have been given as cycle times (CT), where lower values indicate a higher viral load. Statistical comparisons in the graph are shown with lines with one asterisc indicating p<0,05 and two asterics p<0,01"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Human", "myeloid", "cells", "and", "lymphoid", "cells", "were", "purified", "from", "PBMCs", "using", "a", "cell", "sorter", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "these", "primary", "cells", "and", "primary", "AECs", "to", "perform", "chip", "hybridization", "and", "microarray", "analysis", ".", "The", "profile", "of", "EphA2", "expression", "in", "different", "cells", "is", "indicated", ".", "(", "B", ")", "Murine", "B", "cells", "and", "T", "cells", "were", "purified", "from", "spleens", "using", "a", "cell", "sorter", ",", "total", "RNA", "was", "isolated", "from", "murine", "B", "cells", ",", "T", "cells", ",", "BMDCs", ",", "BMDMs", ",", "AMs", "and", "AECs", ".", "Shown", "is", "mean", "±", "SD", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "The", "profile", "of", "EphA2", "expression", "in", "different", "cells", "is", "indicated", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "EphA2", "and", "β", "-", "actin", "in", "BMDCs", ",", "BMDMs", ",", "AMs", ",", "and", "AECs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Human myeloid cells and lymphoid cells were purified from PBMCs using a cell sorter. Total RNA was isolated from these primary cells and primary AECs to perform chip hybridization and microarray analysis.The profile of EphA2 expression in different cells is indicated. (B) Murine B cells and T cells were purified from spleens using a cell sorter, total RNA was isolated from murine B cells, T cells, BMDCs, BMDMs, AMs and AECs. Shown is mean ± SD. Data represent three independent biological replicates.The profile of EphA2 expression in different cells is indicated. (C) Immunoblot analysis of EphA2 and β-actin in BMDCs, BMDMs, AMs, and AECs."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "D", ")", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", ",", "IL", "-", "18", ",", "IFN", "-", "β", "and", "IL", "-", "6", "in", "supernatant", "of", "AEC", "cells", ",", "which", "were", "stimulated", "for", "16", "h", "with", "RNA", "virus", "reovirus", "(", "MOI", "=", "5", ")", "or", "DNA", "virus", "HSV", "-", "1", "(", "MOI", "=", "5", ")", ".", "n", "=", "3", "primary", "samples", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "Mock", "indicated", "unstimulated", "cells", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "NS", "means", "no", "statistical", "difference", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "IL", "-", "1β", "and", "caspase", "-", "1", "in", "AECs", "cell", "lysate", "or", "cell", "supernatant", ",", "β", "-", "actin", "served", "as", "a", "loading", "control", "throughout", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "Mock", "indicated", "unstimulated", "cells", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "NS", "means", "no", "statistical", "difference", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-D) ELISA of IL-1β, IL-18, IFN-β and IL-6 in supernatant of AEC cells, which were stimulated for 16 h with RNA virus reovirus (MOI=5) or DNA virus HSV-1 (MOI=5). n = 3 primary samples. Data information: Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. Mock indicated unstimulated cells. **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). NS means no statistical difference. Data represent three independent biological replicates.(E) Immunoblot analysis of IL-1β and caspase-1 in AECs cell lysate or cell supernatant, β-actin served as a loading control throughout. Data information: Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. Mock indicated unstimulated cells. **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). NS means no statistical difference. Data represent three independent biological replicates. "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "B", ")", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "and", "IL", "-", "18", "in", "BALF", "samples", "were", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "kockout", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "strain", ")", "on", "day", "1", "and", "day", "3", "after", "intranasal", "infection", "with", "reovirus", "(", "4", "×", "104", "PFU", "per", "mouse", ")", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "Cell", "number", "of", "BALF", "samples", "were", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "kockout", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "strain", ")", "on", "day", "1", "and", "day", "3", "after", "intranasal", "infection", "with", "reovirus", "(", "4", "×", "104", "PFU", "per", "mouse", ")", ".", "Shown", "is", "mean", "±", "SD", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "Cell", "number", "and", "category", "of", "BALF", "samples", "were", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "kockout", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "strain", ")", "on", "day", "1", "and", "day", "3", "after", "intranasal", "infection", "with", "reovirus", "(", "4", "×", "104", "PFU", "per", "mouse", ")", ".", "Shown", "is", "mean", "±", "SD", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "F", ")", "Hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "-", "staining", "of", "lung", "sections", "were", "from", "EphA2", "+", "/", "+", "and", "EphA2", "−", "/", "−", "mice", "intranasally", "infected", "with", "reovirus", "(", "4", "×", "104", "PFU", "per", "mouse", ")", "on", "day", "0", ",", "day", "1", "and", "day", "3", ".", "Scale", "bars", "represent", "200μm", ".", "(", "G", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "EphA2", "and", "IL", "-", "1β", "in", "lung", "homogenates", "were", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "kockout", "(", "KO", ")", "mice", "on", "day", "1", "and", "day", "3", "of", "intranasal", "infection", "with", "reovirus", "(", "4", "×", "104", "PFU", "per", "mouse", ")", ",", "β", "-", "actin", "served", "as", "a", "loading", "control", "throughout", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-B) ELISA of IL-1β and IL-18 in BALF samples were from wild-type (WT) and EphA2-kockout (KO) mice (n=3 per strain) on day 1 and day 3 after intranasal infection with reovirus (4×104 PFU per mouse). Data information: Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. *P<0.05, **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). Data represent three independent biological replicates.Cell number of BALF samples were from wild-type (WT) and EphA2-kockout (KO) mice (n=3 per strain) on day 1 and day 3 after intranasal infection with reovirus (4×104 PFU per mouse). Shown is mean ± SD. Data information: Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. *P<0.05, **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). Data represent three independent biological replicates.Cell number and category of BALF samples were from wild-type (WT) and EphA2-kockout (KO) mice (n=3 per strain) on day 1 and day 3 after intranasal infection with reovirus (4×104 PFU per mouse). Shown is mean ± SD. Data information: Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. *P<0.05, **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). Data represent three independent biological replicates.(F) Hematoxylin and eosin (H&E)-staining of lung sections were from EphA2+/+ and EphA2−/− mice intranasally infected with reovirus (4×104 PFU per mouse) on day 0, day 1 and day 3. Scale bars represent 200μm.(G) Immunoblot analysis of EphA2 and IL-1β in lung homogenates were from wild-type (WT) and EphA2-kockout (KO) mice on day 1 and day 3 of intranasal infection with reovirus (4×104 PFU per mouse), β-actin served as a loading control throughout."}
{"words": ["Figure", "4Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "mRNA", "encoding", "various", "cytokines", "(", "IL", "-", "4", ",", "IL", "-", "5", ",", "IL", "-", "13", "in", "lung", "samples", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "knockout", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "4", "per", "strain", ")", "sensitized", "with", "ova", ";", "results", "presented", "relative", "to", "β", "-", "actin", ".", "Shown", "is", "mean", "±", "SD", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "or", "four", "independent", "biological", "replicates", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "mRNA", "encoding", "various", "cytokines", "IL", "-", "33", ")", "in", "lung", "samples", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "knockout", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "4", "per", "strain", ")", "sensitized", "with", "ova", ";", "results", "presented", "relative", "to", "β", "-", "actin", ".", "Shown", "is", "mean", "±", "SD", ".", "(", "C", ")", "ELISA", "analysis", "of", "IL", "-", "33", "in", "lung", "tissue", "homogenate", "samples", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "knockout", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "strain", ")", "sensitized", "with", "ova", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "or", "four", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "D", "-", "G", ")", "ELISA", "analysis", "of", "IL", "-", "4", ",", "IL", "-", "13", ",", "IL", "-", "1β", "and", "IL", "-", "18", "in", "lung", "tissue", "homogenate", "samples", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "knockout", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "strain", ")", "sensitized", "with", "ova", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "or", "four", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "H", ")", "Cell", "number", "and", "category", "of", "BALF", "samples", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "knockout", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "strain", ")", "sensitized", "with", "ova", ".", "Shown", "is", "mean", "±", "SD", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "or", "four", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "I", ")", "H", "&", "E", "staining", "and", "PAS", "staining", "of", "lung", "sections", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EphA2", "-", "knockout", "(", "KO", ")", "mice", "sensitized", "with", "ova", ".", "Scale", "bars", "represent", "200μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Quantitative RT-PCR analysis of mRNA encoding various cytokines (IL-4, IL-5, IL-13 in lung samples from wild-type (WT) and EphA2-knockout (KO) mice (n=4 per strain) sensitized with ova; results presented relative to β-actin. Shown is mean ± SD. Data information: Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. *P<0.05, **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). Data represent three or four independent biological replicates.Quantitative RT-PCR analysis of mRNA encoding various cytokines IL-33) in lung samples from wild-type (WT) and EphA2-knockout (KO) mice (n=4 per strain) sensitized with ova; results presented relative to β-actin. Shown is mean ± SD. (C) ELISA analysis of IL-33 in lung tissue homogenate samples from wild-type (WT) and EphA2-knockout (KO) mice (n=3 per strain) sensitized with ova. Data information: Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. *P<0.05, **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). Data represent three or four independent biological replicates.(D-G) ELISA analysis of IL-4, IL-13, IL-1β and IL-18 in lung tissue homogenate samples from wild-type (WT) and EphA2-knockout (KO) mice (n=3 per strain) sensitized with ova. Data information: Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. *P<0.05, **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). Data represent three or four independent biological replicates.(H) Cell number and category of BALF samples from wild-type (WT) and EphA2-knockout (KO) mice (n=3 per strain) sensitized with ova. Shown is mean ± SD. Data information: Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. *P<0.05, **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). Data represent three or four independent biological replicates.(I) H&E staining and PAS staining of lung sections from wild-type (WT) and EphA2-knockout (KO) mice sensitized with ova. Scale bars represent 200μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "proteins", "precipitated", "with", "anti", "-", "EphA2", "or", "IgG", "(", "control", ")", "were", "from", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "AECs", "from", "wild", "-", "type", "mice", "stimulated", "with", "reovirus", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "3", "h", ".", "Input", ",", "10", "%", "of", "the", "AECs", "lysate", ".", "Data", "information", ":", "The", "position", "of", "protein", "markers", "(", "shown", "in", "kDa", ")", "is", "indicated", "on", "the", "right", "-", "hand", "side", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "C", ")", "The", "indicated", "plasmids", "of", "HA", "-", "tagged", "full", "-", "length", "EphA2", "and", "EphA2", "truncation", "mutants", "were", "respectively", "transfected", "into", "HEK293T", "cells", "along", "with", "Myc", "-", "tagged", "NLRP3", ",", "and", "then", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "and", "anti", "-", "Myc", "Antibody", ".", "Data", "information", ":", "The", "position", "of", "protein", "markers", "(", "shown", "in", "kDa", ")", "is", "indicated", "on", "the", "right", "-", "hand", "side", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "D", ")", "The", "indicated", "plasmids", "of", "HA", "-", "tagged", "full", "-", "length", "NLRP3", "and", "NLRP3", "truncation", "mutants", "were", "respectively", "transfected", "into", "HEK293T", "cells", "along", "with", "Myc", "-", "tagged", "EphA2", ",", "and", "then", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "and", "anti", "-", "Myc", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "The", "position", "of", "protein", "markers", "(", "shown", "in", "kDa", ")", "is", "indicated", "on", "the", "right", "-", "hand", "side", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "E", ")", "Colocalization", "of", "endogenous", "EphA2", "and", "NLRP3", "in", "AEC", "cells", ".", "AEC", "cells", "were", "unstimulated", "or", "stimulated", "with", "reovirus", "for", "2h", "before", "confocal", "microscopy", "analysis", ".", "EphA2", "was", "stained", "with", "rabbit", "anti", "-", "EphA2", "(", "1", ":", "500", ")", ",", "followed", "by", "Alexa", "Fluor", "594", "goat", "anti", "-", "rabbit", "secondary", "antibody", "(", "red", ")", ",", "while", "NLRP3", "was", "stained", "with", "mouse", "anti", "-", "NLRP3", "(", "1", ":", "500", ")", ",", "followed", "by", "Alexa", "Fluor", "488", "goat", "anti", "-", "mouse", "secondary", "antibody", "(", "green", ")", ".", "DAPI", "(", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ")", "served", "as", "the", "nuclei", "marker", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "20μm", ".", "The", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "and", "the", "Mander", "'", "s", "overlap", "coefficient", "in", "the", "upper", "red", "box", "are", "0", ".", "5", ",", "and", "0", ".", "95", "respectively", ",", "and", "the", "lower", "red", "box", "0", ".", "78", ",", "and", "0", ".", "94", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunoblot analysis of proteins precipitated with anti-EphA2 or IgG (control) were from whole-cell lysates of AECs from wild-type mice stimulated with reovirus (MOI=5) for 3 h. Input, 10% of the AECs lysate. Data information: The position of protein markers (shown in kDa) is indicated on the right-hand side. Data are representative of three independent biological replicates.(C) The indicated plasmids of HA-tagged full-length EphA2 and EphA2 truncation mutants were respectively transfected into HEK293T cells along with Myc-tagged NLRP3, and then cell lysates were immunoprecipitated with anti-Myc antibody, followed by western blot analysis with anti-HA antibody and anti-Myc Antibody. Data information: The position of protein markers (shown in kDa) is indicated on the right-hand side. Data are representative of three independent biological replicates.(D) The indicated plasmids of HA-tagged full-length NLRP3 and NLRP3 truncation mutants were respectively transfected into HEK293T cells along with Myc-tagged EphA2, and then cell lysates were immunoprecipitated with anti-Myc antibody, followed by western blot analysis with anti-HA antibody and anti-Myc antibody. Data information: The position of protein markers (shown in kDa) is indicated on the right-hand side. Data are representative of three independent biological replicates.(E) Colocalization of endogenous EphA2 and NLRP3 in AEC cells. AEC cells were unstimulated or stimulated with reovirus for 2h before confocal microscopy analysis. EphA2 was stained with rabbit anti-EphA2 (1:500), followed by Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit secondary antibody (red), while NLRP3 was stained with mouse anti-NLRP3 (1:500), followed by Alexa Fluor 488 goat anti-mouse secondary antibody (green). DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) served as the nuclei marker (blue). Scale bars represent 20μm. The Pearson's correlation coefficient and the Mander's overlap coefficient in the upper red box are 0.5, and 0.95 respectively, and the lower red box 0.78, and 0.94 respectively."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "The", "indicated", "plasmids", "of", "Myc", "-", "tagged", "NLRP3", "and", "GFP", "-", "tagged", "EphA2", "were", "transfected", "into", "HEK293T", "cells", "and", "then", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "the", "anti", "-", "Myc", "antibody", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "with", "the", "anti", "-", "p", "-", "Tyr", "antibody", ",", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Myc", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "p", "-", "Tyr", "of", "NLRP3", "precipitated", "with", "anti", "-", "NLRP3", "antibody", "in", "AECs", "without", "(", "Ctrl", ")", "or", "with", "LPS", "stimulation", "or", "reovirus", "(", "Reo", ")", "infection", ".", "(", "C", ")", "The", "indicated", "plasmids", "of", "Myc", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "NLRP3", "or", "its", "mutants", "Y132F", ",", "Y164F", ",", "Y251F", ",", "Y570F", "and", "Y589F", "were", "respectively", "transfected", "into", "HEK293T", "cells", "along", "with", "GFP", "-", "tagged", "EphA2", ",", "and", "then", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "the", "anti", "-", "Myc", "antibody", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "with", "the", "anti", "-", "p", "-", "Tyr", "antibody", ",", "anti", "-", "HA", "antibody", "and", "anti", "-", "Myc", "antibody", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "EphA2", ",", "ASC", ",", "NLRP3", ",", "caspase", "-", "1", "and", "IL", "-", "1β", "in", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "200ng", "EphA2", ",", "40ng", "ASC", ",", "40ng", "caspase", "-", "1", "and", "200ng", "IL", "-", "1β", ",", "vector", "or", "wild", "NLPR3", "or", "Y132F", "as", "indicated", ".", "The", "position", "of", "protein", "markers", "(", "shown", "in", "kDa", ")", "is", "indicated", "on", "the", "right", "-", "hand", "side", ".", "(", "E", ")", "Densitometry", "analysis", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "NS", "means", "no", "statistical", "difference", ".", "Shown", "is", "mean", "±", "SD", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) The indicated plasmids of Myc-tagged NLRP3 and GFP-tagged EphA2 were transfected into HEK293T cells and then cell lysates were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody, followed by western blot analysis with the anti-p-Tyr antibody, anti-GFP and anti-Myc.(B) Immunoblot analysis of p-Tyr of NLRP3 precipitated with anti-NLRP3 antibody in AECs without (Ctrl) or with LPS stimulation or reovirus (Reo) infection.(C) The indicated plasmids of Myc-tagged wild-type NLRP3 or its mutants Y132F, Y164F, Y251F, Y570F and Y589F were respectively transfected into HEK293T cells along with GFP-tagged EphA2, and then cell lysates were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody, followed by western blot analysis with the anti-p-Tyr antibody, anti-HA antibody and anti-Myc antibody.(D) Immunoblot analysis of EphA2, ASC, NLRP3, caspase-1 and IL-1β in HEK293T cells were co-transfected with 200ng EphA2, 40ng ASC, 40ng caspase-1 and 200ng IL-1β, vector or wild NLPR3 or Y132F as indicated. The position of protein markers (shown in kDa) is indicated on the right-hand side.(E) Densitometry analysis *P<0.05 (unpaired t test). NS means no statistical difference. Shown is mean ± SD. Data represent three independent biological replicates."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "B", ")", "Confocal", "microscopy", "analysis", "of", "AEC", "cells", "uninfected", "or", "infected", "with", "reovirus", "at", "multiplicity", "of", "infection", "(", "MOI", ")", "of", "20", "for", "3h", ".", "AECs", "primed", "with", "LPS", "and", "stimulated", "with", "ATP", "for", "30", "min", "severed", "as", "a", "positive", "control", ".", "ASC", "was", "stained", "with", "mouse", "anti", "-", "ASC", "(", "1", ":", "200", ")", ",", "followed", "by", "Alexa", "Fluor", "488", "goat", "anti", "-", "mouse", "secondary", "antibody", "(", "green", ")", ".", "DAPI", "served", "as", "the", "nuclei", "marker", "(", "blue", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "represent", "50μm", ".", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Confocal", "microscopy", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "flag", "-", "ASC", "and", "Myc", "-", "tagged", "vector", "or", "Myc", "-", "tagged", "NLRP3", "or", "Myc", "-", "tagged", "NLRP3", "Y132F", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "flag", "(", "1", ":", "200", ")", ",", "anti", "-", "Myc", "(", "1", ":", "200", ")", ",", "followed", "by", "Alexa", "Fluor", "488", "goat", "anti", "-", "rabbit", "secondary", "antibody", "(", "green", ")", "or", "Alexa", "Fluor", "594", "goat", "anti", "-", "mouse", "secondary", "antibody", "(", "red", ")", ".", "DAPI", "served", "as", "the", "nuclei", "marker", "(", "blue", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "represent", "50μm", ".", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", ";", "small", "horizontal", "lines", "indicate", "the", "average", "of", "triplicates", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-B) Confocal microscopy analysis of AEC cells uninfected or infected with reovirus at multiplicity of infection (MOI) of 20 for 3h. AECs primed with LPS and stimulated with ATP for 30 min severed as a positive control. ASC was stained with mouse anti-ASC (1:200), followed by Alexa Fluor 488 goat anti-mouse secondary antibody (green). DAPI served as the nuclei marker (blue). Data information: Scale bars represent 50μm. Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). Data represent three independent biological replicates.(C-D) Confocal microscopy analysis of HEK293T cells transfected with flag-ASC and Myc-tagged vector or Myc-tagged NLRP3 or Myc-tagged NLRP3 Y132F. Cells were stained with anti-flag (1:200), anti-Myc (1:200), followed by Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody (green) or Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary antibody (red). DAPI served as the nuclei marker (blue). Data information: Scale bars represent 50μm. Each symbol represents an independent experiment; small horizontal lines indicate the average of triplicates. **P <0.01 and ***P<0.001 (unpaired t test). Data represent three independent biological replicates."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "B", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "and", "primary", "cortical", "neurons", "were", "treated", "with", "1", "μM", "α", "-", "syn", "fibrils", "(", "A", ")", "or", "monomers", "(", "B", ")", "for", "30", "min", ".", "The", "cells", "were", "lysed", "and", "Western", "blot", "was", "performed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "to", "PBS", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "C", ".", "Frontal", "cortices", "of", "A53T", "α", "-", "syn", "heterozygous", "transgenic", "mice", "and", "control", "mice", "at", "the", "age", "of", "9", "months", "(", "old", ")", "or", "2", "months", "(", "young", ")", "were", "lysed", "and", "Western", "blot", "was", "performed", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "WT", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "FcγRIIB", "KD", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "treated", "with", "1", "μM", "α", "-", "syn", "fibrils", "for", "30", "min", ".", "The", "cells", "were", "lysed", "and", "Western", "blot", "was", "performed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "PBS", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "SHP", "-", "1", "KD", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "treated", "with", "1", "μM", "α", "-", "syn", "fibrils", "for", "30", "min", ".", "The", "cells", "were", "lysed", "and", "Western", "blot", "was", "performed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "PBS", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "SHP", "-", "2", "KD", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "treated", "with", "1", "μM", "α", "-", "syn", "fibrils", "for", "30", "min", ".", "The", "cells", "were", "lysed", "and", "Western", "blot", "was", "performed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "PBS", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "with", "20", "μM", "NSC87877", ",", "10", "μM", "SSG", "and", "1", "μM", "PHPS", "-", "1", "were", "treated", "with", "1", "μM", "α", "-", "syn", "fibrils", "for", "30", "min", ".", "The", "cells", "were", "lysed", "and", "Western", "blot", "was", "performed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "PBS", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-B. SH-SY5Y cells and primary cortical neurons were treated with 1 μM α-syn fibrils (A) or monomers (B) for 30 min. The cells were lysed and Western blot was performed with the indicated antibodies. Images are representative of three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01 compared to PBS, unpaired t-test.C. Frontal cortices of A53T α-syn heterozygous transgenic mice and control mice at the age of 9 months (old) or 2 months (young) were lysed and Western blot was performed with the indicated antibodies (n=3). *** P < 0.001 compared to WT, unpaired t-test.FcγRIIB KD SH-SY5Y cells were treated with 1 μM α-syn fibrils for 30 min. The cells were lysed and Western blot was performed with the indicated antibodies. Images are representative of three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05 compared to PBS, one-way ANOVA.SHP-1 KD SH-SY5Y cells were treated with 1 μM α-syn fibrils for 30 min. The cells were lysed and Western blot was performed with the indicated antibodies. Images are representative of three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05 compared to PBS, one-way ANOVA.SHP-2 KD SH-SY5Y cells were treated with 1 μM α-syn fibrils for 30 min. The cells were lysed and Western blot was performed with the indicated antibodies. Images are representative of three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05 compared to PBS, one-way ANOVA.SH-SY5Y cells with 20 μM NSC87877, 10 μM SSG and 1 μM PHPS-1 were treated with 1 μM α-syn fibrils for 30 min. The cells were lysed and Western blot was performed with the indicated antibodies. Images are representative of three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05 compared to PBS, one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "2SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "cocultured", "with", "differentiated", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "in", "the", "presence", "of", "5", "μM", "saracatinib", "(", "sara", ")", "or", "10", "μM", "SKI", "-", "1", "for", "12", "h", ".", "The", "cells", "in", "the", "lower", "chamber", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "EGFP", "antibody", ".", "The", "intensity", "was", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "four", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "against", "PBS", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "NT", ",", "c", "-", "src", "KD", "#", "1", "and", "#", "2", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "cocultured", "with", "differentiated", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "for", "12", "h", ",", "and", "then", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "EGFP", "antibody", ".", "Values", "were", "derived", "from", "four", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "NT", "cells", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "D", ".", "primary", "cortical", "neurons", "were", "cocultured", "with", "differentiated", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "in", "the", "presence", "of", "5", "μM", "saracatinib", "(", "sara", ")", "or", "10", "μM", "SKI", "-", "1", "for", "12", "h", ".", "The", "cells", "in", "the", "lower", "chamber", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "EGFP", "antibody", ".", "The", "intensity", "was", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "four", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "against", "PBS", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", ",", "E", ".", "primary", "cortical", "neurons", "downregulating", "c", "-", "src", "were", "cocultured", "with", "differentiated", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "for", "12", "h", ",", "and", "then", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "EGFP", "antibody", ".", "Values", "were", "derived", "from", "four", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "NT", "cells", "one", "-", "way", "ANOVA", "unpaired", "t", "-", "testSH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "of", "WT", "c", "-", "src", ",", "Y529F", "c", "-", "src", "(", "kinase", "active", ")", ",", "or", "K297M", "c", "-", "src", "(", "kinase", "dead", ")", "tagged", "with", "EGFP", ".", "After", "1", "day", ",", "the", "cells", "were", "cocultured", "with", "differentiated", "α", "-", "syn", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "for", "12", "h", "and", "then", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "α", "-", "syn", "antibody", ".", "The", "intensity", "was", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "mock", "positive", "cells", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "G", ".", "FcγRIIB", "KD", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "of", "WT", "c", "-", "src", ",", "Y529F", "c", "-", "src", "(", "kinase", "active", ")", ",", "or", "K297M", "c", "-", "src", "(", "kinase", "dead", ")", "tagged", "with", "EGFP", ".", "After", "1", "day", ",", "the", "cells", "were", "cocultured", "with", "differentiated", "α", "-", "syn", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "for", "12", "h", "and", "then", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "α", "-", "syn", "antibody", ".", "The", "intensity", "was", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "mock", "positive", "cells", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2SH-SY5Y cells were cocultured with differentiated A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells in the presence of 5 μM saracatinib (sara) or 10 μM SKI-1 for 12 h. The cells in the lower chamber were fixed and immunostained with anti-EGFP antibody. The intensity was analyzed. Values were derived from four independent experiments (n=4). *** P < 0.001 against PBS, one-way ANOVA.NT, c-src KD #1 and #2 SH-SY5Y cells were cocultured with differentiated A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells for 12 h, and then fixed and immunostained with anti-EGFP antibody. Values were derived from four independent experiments (n=4). *** P < 0.001 compared to NT cells, one-way ANOVA, D. primary cortical neurons were cocultured with differentiated A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells in the presence of 5 μM saracatinib (sara) or 10 μM SKI-1 for 12 h. The cells in the lower chamber were fixed and immunostained with anti-EGFP antibody. The intensity was analyzed. Values were derived from four independent experiments (n=4). *** P < 0.001 against PBS, one-way ANOVA., E. primary cortical neurons downregulating c-src were cocultured with differentiated A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells for 12 h, and then fixed and immunostained with anti-EGFP antibody. Values were derived from four independent experiments (n=4). *** P < 0.001 compared to NT cells one-way ANOVA unpaired t-testSH-SY5Y cells were transfected with plasmids of WT c-src, Y529F c-src (kinase active), or K297M c-src (kinase dead) tagged with EGFP. After 1 day, the cells were cocultured with differentiated α-syn OE SH-SY5Y cells for 12 h and then fixed and immunostained with anti-α-syn antibody. The intensity was analyzed. Values were derived from three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, * P < 0.05 compared to mock positive cells, one-way ANOVA.G. FcγRIIB KD SH-SY5Y cells were transfected with plasmids of WT c-src, Y529F c-src (kinase active), or K297M c-src (kinase dead) tagged with EGFP. After 1 day, the cells were cocultured with differentiated α-syn OE SH-SY5Y cells for 12 h and then fixed and immunostained with anti-α-syn antibody. The intensity was analyzed. Values were derived from three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, * P < 0.05 compared to mock positive cells, one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "and", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "mCherry", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "cocultured", "in", "the", "presence", "of", "5", "μM", "saracatinib", "(", "sara", ")", "or", "10", "μM", "SKI", "-", "1", ",", "respectively", ",", "with", "50", "μM", "RA", "for", "5", "days", ".", "C", ".", "NT", "or", "c", "-", "src", "KD", "#", "1", "or", "#", "2", "/", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "and", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "mCherry", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "cocultured", "with", "50", "μM", "RA", "for", "5", "days", ".", "The", "samples", "were", "observed", "under", "confocal", "microscopy", ",", "and", "the", "number", "of", "cells", "containing", "double", "fluorescence", "labeled", "puncta", "were", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "PBS", "or", "NT", "cells", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. A53T α-syn-EGFP and A53T α-syn-mCherry OE SH-SY5Y cells were cocultured in the presence of 5 μM saracatinib (sara) or 10 μM SKI-1, respectively, with 50 μM RA for 5 days.C. NT or c-src KD #1 or #2 /A53T α-syn-EGFP and A53T α-syn-mCherry OE SH-SY5Y cells were cocultured with 50 μM RA for 5 days. The samples were observed under confocal microscopy, and the number of cells containing double fluorescence labeled puncta were analyzed. Values were derived from five independent experiments (n=5). *** P < 0.001 compared to PBS or NT cells, one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Differentiated", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "incubated", "with", "5", "μM", "saracatinib", "(", "sara", ")", "or", "10", "μM", "SKI", "-", "1", "for", "12", "h", ".", "B", ".", "Differentiated", "NT", ",", "c", "-", "src", "KD", "#", "1", "or", "c", "-", "src", "KD", "#", "2", "/", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "cultured", "12", "h", ".", "Levels", "of", "α", "-", "syn", "in", "culture", "media", "were", "then", "measured", "using", "ELISA", ".", "Values", "were", "derived", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "to", "control", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "D", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "in", "the", "lower", "chamber", "were", "cocultured", "with", "differentiated", "NT", ",", "c", "-", "src", "KD", "#", "1", "or", "c", "-", "src", "KD", "#", "2", "/", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "for", "12", "h", ".", "The", "cells", "in", "the", "lower", "chamber", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "EGFP", "antibody", ".", "The", "intensity", "was", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "NT", "cells", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "E", ".", "Differentiated", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "incubated", "with", "5", "μM", "saracatinib", "(", "sara", ")", "or", "10", "μM", "SKI", "-", "1", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "or", "50", "μM", "bafilomycin", "A1", "(", "BafA", ")", "for", "12", "h", ".", "Differentiated", "NT", "and", "c", "-", "src", "KD", "/", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "incubated", "with", "50", "μM", "BafA", "for", "12", "h", ".", "Western", "blot", "was", "performed", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "G", ".", "NT", "and", "c", "-", "src", "KD", "primary", "neurons", "were", "incubated", "with", "50", "μM", "BafA", "for", "12", "h", ".", "Western", "blot", "was", "performed", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "H", ".", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "cocultured", "with", "differentiated", "A53T", "α", "-", "syn", "-", "EGFP", "OE", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "or", "50", "μM", "BafA", "for", "12", "h", ".", "The", "cells", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "EGFP", "antibody", ".", "The", "intensity", "was", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Differentiated A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells were incubated with 5 μM saracatinib (sara) or 10 μM SKI-1 for 12 h.B. Differentiated NT, c-src KD #1 or c-src KD#2/A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells were cultured 12 h. Levels of α-syn in culture media were then measured using ELISA. Values were derived from three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01 compared to control, one-way ANOVA.D. SH-SY5Y cells in the lower chamber were cocultured with differentiated NT, c-src KD #1 or c-src KD #2/ A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells for 12 h. The cells in the lower chamber were immunostained with anti-EGFP antibody. The intensity was analyzed. Values were derived from five independent experiments (n=5). *** P < 0.001 compared to NT cells, one-way ANOVA.E. Differentiated A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells were incubated with 5 μM saracatinib (sara) or 10 μM SKI-1 in the presence of DMSO or 50 μM bafilomycin A1 (BafA) for 12 h.Differentiated NT and c-src KD/A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells were incubated with 50 μM BafA for 12 h. Western blot was performed. Data are representative of three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05, one-way ANOVA.G. NT and c-src KD primary neurons were incubated with 50 μM BafA for 12 h. Western blot was performed. Data are representative of three independent experiments (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05, one-way ANOVA.H. SH-SY5Y cells were cocultured with differentiated A53T α-syn-EGFP OE SH-SY5Y cells in the presence of DMSO or 50 μM BafA for 12 h. The cells were immunostained with anti-EGFP antibody. The intensity was analyzed. Values were derived from three independent experiments (n=3). ** P < 0.01, one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "5SH", "-", "SY5Y", "cells", "in", "the", "presence", "of", "5", "μM", "saracatinib", ",", "10", "μM", "SKI", "-", "1", "were", "incubated", "with", "1", "μM", "α", "-", "syn", "fibrils", "for", "30", "min", "and", "these", "cells", "were", "further", "incubated", "with", "50", "nM", "BODIPY", "FL", "C5", "-", "LacCer", "and", "2", ".", "5", "μg", "/", "ml", "rhodamine", "-", "conjugated", "transferrin", "for", "20", "min", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "observed", "under", "confocal", "microscopy", ".", "The", "intensity", "was", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "control", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "B", ".", "NT", ",", "c", "-", "src", "KD", "#", "1", "or", "c", "-", "src", "KD", "#", "2", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "incubated", "with", "1", "μM", "α", "-", "syn", "fibrils", "for", "30", "min", "and", "these", "cells", "were", "further", "incubated", "with", "50", "nM", "BODIPY", "FL", "C5", "-", "LacCer", "and", "2", ".", "5", "μg", "/", "ml", "rhodamine", "-", "conjugated", "transferrin", "for", "20", "min", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "observed", "under", "confocal", "microscopy", ".", "The", "intensity", "was", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "control", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5SH-SY5Y cells in the presence of 5 μM saracatinib, 10 μM SKI-1 were incubated with 1 μM α-syn fibrils for 30 min and these cells were further incubated with 50 nM BODIPY FL C5-LacCer and 2.5 μg/ml rhodamine-conjugated transferrin for 20 min. The cells were fixed and observed under confocal microscopy. The intensity was analyzed. Values were derived from five independent experiments (n=5). *** P< 0.001 compared to control, one-way ANOVA.B. NT, c-src KD #1 or c-src KD #2 SH-SY5Y cells were incubated with 1 μM α-syn fibrils for 30 min and these cells were further incubated with 50 nM BODIPY FL C5-LacCer and 2.5 μg/ml rhodamine-conjugated transferrin for 20 min. The cells were fixed and observed under confocal microscopy. The intensity was analyzed. Values were derived from five independent experiments (n=5). *** P< 0.001 compared to control, one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "6Two", "to", "three", "-", "month", "-", "old", "hemizygous", "M83", "mice", "were", "injected", "into", "the", "striatum", "with", "sterile", "PBS", "or", "10", "μg", "of", "recombinant", "α", "-", "syn", "fibrils", ".", "The", "mice", "were", "treated", "with", "saracatinib", "at", "10", "mg", "/", "kg", "/", "day", "by", "oral", "gavage", "for", "4", "weeks", ".", "B", ".", "Fixed", "brain", "tissues", "containing", "the", "frontal", "cortex", "and", "the", "striatum", "were", "lysed", ".", "Western", "blot", "was", "performed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Values", "were", "derived", "from", "three", "individual", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Two", "to", "three", "-", "month", "-", "old", "hemizygous", "M83", "mice", "were", "injected", "into", "the", "striatum", "with", "sterile", "PBS", "or", "10", "μg", "of", "recombinant", "α", "-", "syn", "fibrils", ".", "The", "mice", "were", "treated", "with", "saracatinib", "at", "10", "mg", "/", "kg", "/", "day", "by", "oral", "gavage", "for", "4", "weeks", ".", "C", ".", "Immunohistochemistry", "of", "pSer129", "α", "-", "syn", "was", "performed", ".", "Arrow", "indicates", "pSer129", "α", "-", "syn", "positive", "inclusion", ".", "Scale", "bar", "indicates", "50", "μm", ".", "D", ".", "Scoring", "of", "pSer129", "immunoreactivity", "in", "the", "cortex", "and", "the", "striatum", "of", "both", "regions", ".", "Values", "were", "derived", "from", "eight", "individual", "mice", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "PBS", "group", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Two to three-month-old hemizygous M83 mice were injected into the striatum with sterile PBS or 10 μg of recombinant α-syn fibrils. The mice were treated with saracatinib at 10 mg/kg/day by oral gavage for 4 weeks. B. Fixed brain tissues containing the frontal cortex and the striatum were lysed. Western blot was performed with indicated antibodies. Values were derived from three individual mice (n=3).Two to three-month-old hemizygous M83 mice were injected into the striatum with sterile PBS or 10 μg of recombinant α-syn fibrils. The mice were treated with saracatinib at 10 mg/kg/day by oral gavage for 4 weeks. C. Immunohistochemistry of pSer129 α-syn was performed. Arrow indicates pSer129 α-syn positive inclusion. Scale bar indicates 50 μm. D. Scoring of pSer129 immunoreactivity in the cortex and the striatum of both regions. Values were derived from eight individual mice (n=8). *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05 compared to PBS group, unpaired t-test. Data are expressed as mean ± SEM. "}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Immunohistochemistry", "of", "GFAP", "was", "performed", ".", "GFAP", "intensities", "in", "the", "cortex", "and", "the", "striatum", "were", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "three", "individual", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "B", ".", "Immunohistochemistry", "of", "IBA", "-", "1", "and", "MHC", "Class", "II", "were", "performed", ".", "Arrow", "indicates", "MHC", "class", "II", "positive", "cells", ".", "Numbers", "of", "MCH", "class", "II", "positive", "cells", "in", "the", "cortex", "and", "the", "striatum", "were", "analyzed", ".", "Values", "were", "derived", "from", "three", "individual", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Immunohistochemistry of GFAP was performed. GFAP intensities in the cortex and the striatum were analyzed. Values were derived from three individual mice (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05, one-way ANOVA.B. Immunohistochemistry of IBA-1 and MHC Class II were performed. Arrow indicates MHC class II positive cells. Numbers of MCH class II positive cells in the cortex and the striatum were analyzed. Values were derived from three individual mice (n=3). *** P < 0.001, ** P < 0.01, one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "RNA", "-", "seq", "of", "whole", "blood", "from", "symptomatic", "(", "n", "=", "26", ";", "median", "8", "days", "PIO", ")", "and", "asymptomatic", "(", "n", "=", "30", ";", "median", "3", "days", "post", "-", "hospital", "admission", ")", "COVID", "-", "19", "patients", "at", "the", "acute", "phase", "of", "infection", "(", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "PCR", "-", "positive", ")", "was", "performed", ".", "Only", "samples", "with", "RNA", "integrity", "number", ">", "6", "were", "sent", "for", "sequencing", "and", "included", "in", "the", "analysis", ".", "Volcano", "plot", "indicating", "DEGs", "between", "asymptomatic", "and", "symptomatic", "COVID", "-", "19", "patients", ",", "with", "thresholds", "of", "FDR", "<", "0", ".", "05", "and", "|", "FC", "|", ">", "2", ".", "Numbers", "of", "over", "-", "expressed", "and", "under", "-", "expressed", "genes", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. RNA-seq of whole blood from symptomatic (n=26; median 8 days PIO) and asymptomatic (n=30; median 3 days post-hospital admission) COVID-19 patients at the acute phase of infection (SARS-CoV-2 PCR-positive) was performed. Only samples with RNA integrity number >6 were sent for sequencing and included in the analysis. Volcano plot indicating DEGs between asymptomatic and symptomatic COVID-19 patients, with thresholds of FDR < 0.05 and |FC| > 2. Numbers of over-expressed and under-expressed genes are indicated."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "Network", "analysis", "of", "significant", "immune", "mediators", "between", "symptomatic", "and", "asymptomatic", "COVID", "-", "19", "patients", ".", "Interactive", "relationships", "between", "the", "cytokines", "or", "chemokines", "were", "determined", "by", "STRING", "(", "Search", "Tool", "for", "the", "Retrieval", "of", "Interacting", "Genes", "/", "Proteins", ")", "analysis", ",", "with", "a", "confidence", "threshold", "of", "0", ".", "5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. Network analysis of significant immune mediators between symptomatic and asymptomatic COVID-19 patients. Interactive relationships between the cytokines or chemokines were determined by STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/ Proteins) analysis, with a confidence threshold of 0.5."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "specific", "CD4", "+", "non", "T", "follicular", "helper", "(", "TFH", ")", "cells", "from", "symptomatic", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "asymptomatic", "COVID", "-", "19", "(", "n", "=", "5", ")", "patients", "were", "characterized", "with", "flow", "cytometry", "based", "on", "the", "expression", "of", "IL", "-", "17a", ",", "IFN", "-", "γ", ",", "TNF", "-", "⍺", ",", "IL", "-", "4", "and", "IL", "-", "10", "upon", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "peptide", "stimulation", ".", "Representative", "plot", "overlay", "of", "unstimulated", "(", "black", ")", "on", "peptide", "stimulated", "(", "red", ")", "was", "performed", "on", "asymptomatic", "patient", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. SARS-CoV-2 specific CD4+ non T follicular helper (TFH) cells from symptomatic (n=5) and asymptomatic COVID-19 (n=5) patients were characterized with flow cytometry based on the expression of IL-17a, IFN-γ, TNF-⍺, IL-4 and IL-10 upon SARS-CoV-2 peptide stimulation. Representative plot overlay of unstimulated (black) on peptide stimulated (red) was performed on asymptomatic patient. Data are presented as Mean ± SD **P<0.01 (Mann-Whitney U test)."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", ".", "(", "A", ")", "IgG", "and", "(", "B", ")", "IgM", "responses", "were", "analysed", "by", "screening", "plasma", "samples", "of", "asymptomatic", "(", "n", "=", "39", ",", "median", "study", "day", "29", ")", "and", "symptomatic", "(", "n", "=", "57", ",", "median", "study", "day", "31", ")", "COVID", "-", "19", "patients", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B. (A) IgG and (B) IgM responses were analysed by screening plasma samples of asymptomatic (n=39, median study day 29) and symptomatic (n=57, median study day 31) COVID-19 patients. Data are presented as Mean ± SD ***P<0.001 (Mann-Whitney U test)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Flow", "cytometry", "acquisition", "of", "patient", "whole", "blood", "was", "performed", "and", "number", "of", "mature", "and", "immature", "neutrophils", "were", "compared", "between", "asymptomatic", "(", "n", "=", "16", ")", "and", "symptomatic", "(", "n", "=", "52", ")", "COVID", "-", "19", "patients", "and", "healthy", "controls", "(", "n", "=", "17", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", ")", ".", "B", ".", "Mass", "cytometry", "was", "performed", "on", "PBMCs", "obtained", "from", "acute", "asymptomatic", "(", "n", "=", "19", ")", "and", "acute", "symptomatic", "(", "n", "=", "37", ")", "COVID", "-", "19", "patients", "and", "healthy", "donors", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "Monocytes", "were", "characterized", "based", "on", "their", "CD14", "and", "CD16", "expression", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", ")", ".", "C", ".", "Classical", ",", "intermediate", "and", "non", "-", "classical", "monocytes", "were", "further", "defined", "in", "acute", "asymptomatic", "(", "n", "=", "19", ")", "and", "acute", "symptomatic", "(", "n", "=", "37", ")", "COVID", "-", "19", "patients", "and", "healthy", "donors", "(", "n", "=", "10", ")", "with", "inflammatory", "marker", "CD169", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", ")", ".", "D", ".", "Expression", "data", "of", "genes", "associated", "with", "inflammatory", "monocytes", ",", "activated", "neutrophils", "and", "pro", "-", "inflammatory", "cytokines", "were", "compared", "between", "acute", "asymptomatic", "(", "n", "=", "30", ")", "and", "asymptomatic", "(", "n", "=", "26", ")", "COVID", "-", "19", "patients", "and", "were", "represented", "by", "ratio", "with", "respect", "to", "expression", "in", "asymptomatic", "patients", ".", "Bar", "graphs", "show", "DEGs", "with", "FDR", "adjusted", "P", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "fold", "change", "values", "are", "represented", "in", "the", "log2", "scale", ".", "E", ".", "Pro", "-", "inflammatory", "associated", "immune", "mediator", "levels", "in", "plasma", "fraction", "samples", "from", "first", "collection", "timepoint", "during", "hospital", "admission", "were", "quantified", "with", "45", "-", "plex", "microbead", "-", "based", "immunoassay", ".", "Immune", "mediator", "levels", "were", "compared", "between", "asymptomatic", "patients", "(", "n", "=", "48", ")", "and", "symptomatic", "patients", "stratified", "by", "COVID", "-", "19", "severity", "(", "mild", ",", "n", "=", "61", ";", "moderate", ",", "n", "=", "43", ";", "severe", ",", "n", "=", "68", ")", ".", "Immune", "mediator", "levels", "for", "healthy", "controls", "(", "HC", ")", "(", "n", "=", "23", ")", "are", "indicated", "by", "the", "black", "dotted", "line", ".", "Patient", "samples", "with", "concentrations", "out", "of", "measurement", "range", "are", "presented", "as", "the", "value", "of", "Limit", "of", "Quantification", "(", "LOQ", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Flow cytometry acquisition of patient whole blood was performed and number of mature and immature neutrophils were compared between asymptomatic (n=16) and symptomatic (n=52) COVID-19 patients and healthy controls (n=17). Data are presented as Mean ± SD *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Kruskal-Wallis test with Dunn's multiple comparison).B. Mass cytometry was performed on PBMCs obtained from acute asymptomatic (n=19) and acute symptomatic (n=37) COVID-19 patients and healthy donors (n=10). Monocytes were characterized based on their CD14 and CD16 expression. Data are presented as Mean ± SD **P<0.01; ***P<0.001 (Kruskal-Wallis test with Dunn's multiple comparison). C. Classical, intermediate and non-classical monocytes were further defined in acute asymptomatic (n=19) and acute symptomatic (n=37) COVID-19 patients and healthy donors (n=10) with inflammatory marker CD169. Data are presented as Mean ± SD **P<0.01; ***P<0.001 (Kruskal-Wallis test with Dunn's multiple comparison).D. Expression data of genes associated with inflammatory monocytes, activated neutrophils and pro-inflammatory cytokines were compared between acute asymptomatic (n=30) and asymptomatic (n=26) COVID-19 patients and were represented by ratio with respect to expression in asymptomatic patients. Bar graphs show DEGs with FDR adjusted P value < 0.05 and fold change values are represented in the log2 scale.E. Pro-inflammatory associated immune mediator levels in plasma fraction samples from first collection timepoint during hospital admission were quantified with 45-plex microbead-based immunoassay. Immune mediator levels were compared between asymptomatic patients (n=48) and symptomatic patients stratified by COVID-19 severity (mild, n=61; moderate, n=43; severe, n=68). Immune mediator levels for healthy controls (HC) (n=23) are indicated by the black dotted line. Patient samples with concentrations out of measurement range are presented as the value of Limit of Quantification (LOQ). Data are presented as Mean ± SD *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (One-way ANOVA with post hoc t test)."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Growth", "factors", "in", "the", "plasma", "of", "asymptomatic", "(", "n", "=", "48", ")", ",", "symptomatic", "patients", "(", "n", "=", "173", ")", "and", "healthy", "controls", "(", "n", "=", "23", ")", "were", "analyzed", "by", "Luminex", ".", "A", "ratio", "of", "VEGF", "-", "A", "/", "VEGF", "-", "D", "was", "calculated", "and", "used", "to", "perform", "receiver", "operating", "characteristics", "analysis", ".", "The", "area", "under", "the", "curve", "was", "shown", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", ")", ".", "B", ".", "RNAseq", "analysis", "was", "performed", "on", "whole", "blood", "and", "selected", "transcripts", "that", "are", "overexpressed", "in", "asymptomatic", "patients", "over", "symptomatic", "patients", "are", "shown", ".", "Genes", "with", "false", "discovery", "rate", "less", "than", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ",", "0", ".", "01", "(", "*", "*", ")", "or", "0", ".", "001", "(", "*", "*", "*", ")", "are", "indicated", ".", "C", ".", "Cell", "counts", "of", "DCs", ",", "CD4", "T", "cells", ",", "CD8", "T", "cells", "and", "B", "cells", "that", "express", "specific", "chemokine", "markers", "between", "asymptomatic", "(", "n", "=", "19", ")", ",", "symptomatic", "patients", "(", "n", "=", "37", ")", "and", "healthy", "controls", "(", "n", "=", "10", ")", "are", "analyzed", "by", "CyTOF", "and", "shown", ".", "Data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Growth factors in the plasma of asymptomatic (n=48), symptomatic patients (n=173) and healthy controls (n=23) were analyzed by Luminex. A ratio of VEGF-A/VEGF-D was calculated and used to perform receiver operating characteristics analysis. The area under the curve was shown. Data are presented as Mean ± SD **P<0.01; ***P<0.001 (Kruskal-Wallis test with Dunn's multiple comparison).B. RNAseq analysis was performed on whole blood and selected transcripts that are overexpressed in asymptomatic patients over symptomatic patients are shown. Genes with false discovery rate less than 0.05 (*), 0.01 (**) or 0.001 (***) are indicated.C. Cell counts of DCs, CD4 T cells, CD8 T cells and B cells that express specific chemokine markers between asymptomatic (n=19), symptomatic patients (n=37) and healthy controls (n=10) are analyzed by CyTOF and shown. Data are presented as Mean ± SD. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Kruskal-Wallis test with Dunn's multiple comparison)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Pull", "-", "down", "assays", "of", "yTBP", "(", "61", "-", "240", ")", "with", "Kap95p", ",", "Kap114p", "and", "Kap121p", ".", "GST", "-", "fused", "yTBP", "(", "61", "-", "240", ")", "was", "incubated", "with", "recombinant", "Kap95p", ",", "Kap114p", "and", "Kap121p", ".", "Unbound", "(", "S", ")", "and", "bound", "(", "B", ")", "samples", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "stained", "with", "Coomassie", "blue", ".", "B", ".", "Band", "intensities", "of", "Kap", "-", "βs", "from", "the", "SDS", "-", "PAGE", "gels", "in", "(", "A", ")", "were", "quantified", "and", "normalized", "by", "GST", "-", "yTBP", "intensity", ".", "Quantitative", "plots", "show", "percent", "Kap", "-", "βs", "binding", "on", "yTBP", ".", "C", "-", "E", ".", "ITC", "titration", "curves", "(", "upper", ")", "and", "binding", "isotherms", "(", "lower", ")", "of", "(", "C", ")", "Kap114p", ",", "(", "D", ")", "Kap95p", ",", "and", "(", "E", ")", "Kap121p", "with", "yTBP", "(", "61", "-", "240", ")", ".", "Salt", "concentration", "and", "Kd", "values", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Pull-down assays of yTBP (61-240) with Kap95p, Kap114p and Kap121p. GST-fused yTBP (61-240) was incubated with recombinant Kap95p, Kap114p and Kap121p. Unbound (S) and bound (B) samples were analyzed by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. B. Band intensities of Kap -βs from the SDS-PAGE gels in (A) were quantified and normalized by GST-yTBP intensity. Quantitative plots show percent Kap-βs binding on yTBP.C-E. ITC titration curves (upper) and binding isotherms (lower) of (C) Kap114p, (D) Kap95p, and (E) Kap121p with yTBP (61-240). Salt concentration and Kd values are indicated."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", ".", "Purified", "recombinant", "Kap114p", "was", "mixed", "with", "RanQ69L", "or", "yTBP", "and", "analyzed", "by", "SEC", ".", "SEC", "(", "Superdex", "200", ")", "elution", "profiles", "of", "the", "(", "A", ")", "Kap114p", "", "RanQ69L", "and", "(", "B", ")", "Kap114p", "", "yTBP", "complexes", ".", "Peak", "fractions", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "stained", "with", "Coomassie", "blue", ".", "The", "void", "volume", "(", "Vo", ")", "of", "the", "peak", "fraction", "and", "absorbance", "(", "a", ".", "u", ".", ")", "at", "280", "nm", "for", "each", "complex", "is", "indicated", ".", "SV", "-", "AUC", "analysis", "of", "(", "C", ")", "yTBP", "The", "experimental", "data", "were", "analyzed", "using", "the", "Sedfit", "program", "and", "are", "presented", "above", "molecular", "weights", "calculated", "using", "standards", "(", "in", "brackets", ")", ".", "SV", "-", "AUC", "(", "D", ")", "Kap114p", "and", "(", "E", ")", "the", "Kap114p", "", "yTBP", "complex", ".", "The", "experimental", "data", "were", "analyzed", "using", "the", "Sedfit", "program", "and", "are", "presented", "above", "molecular", "weights", "calculated", "using", "standards", "(", "in", "brackets", ")", ".", "F", ".", "SE", "-", "AUC", "analysis", "of", "the", "Kap114p", "", "yTBP", "complex", ".", "The", "average", "molecular", "mass", "determined", "by", "the", "Sedfit", "program", "was", "~", "133", ".", "5", " ", "kDa", ".", "The", "lower", "panel", "shows", "the", "residual", "difference", "(", "standard", "deviation", ")", "between", "experimental", "and", "fitted", "values", ".", "Plots", "of", "the", "distance", "distribution", "function", "P", "(", "r", ")", "for", "the", "(", "G", ")", "Kap114p", "", "RanQ69L", "complexes", "derived", "from", "experimental", "SAXS", "data", "using", "the", "GNOM", "program", ".", "Rg", "-", "based", "dimensionless", "Kratky", "plot", "of", "the", "Kap114p", "", "RanQ69L", "(", "H", ")", "complexes", ".", "Intersection", "of", "the", "two", "dotted", "gray", "lines", "indicates", "features", "of", "a", "compact", "protein", ".", "The", "ab", "initio", "envelopes", "determined", "by", "GASBOR", "for", "the", "(", "I", ")", "Kap114p", "", "RanQ69L", "complexes", ".", "Models", "of", "the", "(", "J", ")", "Kap114p", "", "RanQ69L", "complexes", "derived", "from", "SAXS", "profiles", "using", "FoXSDock", "and", "docked", "into", "the", "ab", "initio", "envelopes", "obtained", "from", "GASBOR", ".", "Plots", "of", "the", "distance", "distribution", "function", "P", "(", "r", ")", "for", "the", "(", "K", ")", "Kap114p", "", "yTBP", "complexes", "derived", "from", "experimental", "SAXS", "data", "using", "the", "GNOM", "program", ".", "Rg", "-", "based", "dimensionless", "Kratky", "plot", "of", "the", "Kap114p", "", "yTBP", "(", "L", ")", "complexes", ".", "Intersection", "of", "the", "two", "dotted", "gray", "lines", "indicates", "features", "of", "a", "compact", "protein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B. Purified recombinant Kap114p was mixed with RanQ69L or yTBP and analyzed by SEC. SEC (Superdex 200) elution profiles of the (A) Kap114pRanQ69L and (B) Kap114pyTBP complexes. Peak fractions were analyzed by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. The void volume (Vo) of the peak fraction and absorbance (a.u.) at 280 nm for each complex is indicated.SV-AUC analysis of (C) yTBP The experimental data were analyzed using the Sedfit program and are presented above molecular weights calculated using standards (in brackets).SV-AUC (D) Kap114p and (E) the Kap114pyTBP complex. The experimental data were analyzed using the Sedfit program and are presented above molecular weights calculated using standards (in brackets).F. SE-AUC analysis of the Kap114pyTBP complex. The average molecular mass determined by the Sedfit program was ~133.5  kDa. The lower panel shows the residual difference (standard deviation) between experimental and fitted values.Plots of the distance distribution function P(r) for the (G) Kap114pRanQ69L complexes derived from experimental SAXS data using the GNOM program. Rg-based dimensionless Kratky plot of the Kap114pRanQ69L (H) complexes. Intersection of the two dotted gray lines indicates features of a compact protein.The ab initio envelopes determined by GASBOR for the (I) Kap114pRanQ69L complexes. Models of the (J) Kap114pRanQ69L complexes derived from SAXS profiles using FoXSDock and docked into the ab initio envelopes obtained from GASBOR.Plots of the distance distribution function P(r) for the (K) Kap114pyTBP complexes derived from experimental SAXS data using the GNOM program. Rg-based dimensionless Kratky plot of the Kap114pyTBP (L) complexes. Intersection of the two dotted gray lines indicates features of a compact protein."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "Pull", "-", "down", "assays", "of", "yTBP", "with", "Kap114p", ",", "Kap114p", "(", "Δ347", "-", "371", ")", "and", "Kap114p", "(", "Δ899", "-", "956", ")", ".", "GST", "-", "fused", "yTBP", "(", "61", "-", "240", ")", "was", "incubated", "with", "recombinant", "Kap114p", ",", "Kap114p", "(", "Δ347", "-", "371", ")", "and", "Kap114p", "(", "Δ899", "-", "956", ")", ".", "Unbound", "(", "S", ")", "and", "bound", "(", "B", ")", "samples", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "stained", "with", "Coomassie", "blue", ".", "C", ".", "Band", "intensities", "of", "Kap", "-", "βs", "from", "the", "SDS", "-", "PAGE", "gels", "in", "(", "B", ")", "were", "quantified", "and", "normalized", "by", "GST", "-", "yTBP", "intensity", ".", "Quantitative", "plots", "show", "percent", "Kap", "-", "βs", "binding", "on", "yTBP", ".", "D", ",", "E", ".", "ITC", "titration", "curves", "(", "upper", ")", "and", "binding", "isotherms", "(", "lower", ")", "of", "(", "D", ")", "Kap114p", "(", "Δ347", "-", "371", ")", "and", "(", "E", ")", "Kap114p", "(", "Δ899", "-", "956", ")", "with", "yTBP", "(", "61", "-", "240", ")", ".", "Salt", "concentration", "and", "Kd", "values", "are", "indicated", ".", "F", ".", "Relative", "fluorescence", "GFP", "intensities", "in", "the", "nucleus", "and", "cytoplasm", "of", "wild", "type", ",", "KAP114", "knockout", "strains", ",", "and", "KAP114", "knockout", "strains", "rescued", "by", "KAP114", "deletion", "mutants", ".", "G", ".", "His", "-", "tagged", "RanQ69L", "was", "incubated", "with", "recombinant", "Kap114p", ",", "Kap114p", "(", "Δ347", "-", "371", ")", "and", "Kap114p", "(", "Δ899", "-", "956", ")", ".", "Unbound", "(", "S", ")", "and", "bound", "(", "B", ")", "samples", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "stained", "with", "Coomassie", "blue", ".", "H", ".", "Band", "intensities", "of", "Kap", "-", "βs", "from", "the", "SDS", "-", "PAGE", "gels", "in", "(", "G", ")", "were", "quantified", "and", "normalized", "by", "His", "-", "Ran", "intensity", ".", "Quantitative", "plots", "show", "percent", "Kap", "-", "βs", "binding", "on", "His", "-", "Ran", ".", "I", ".", "GST", "pull", "-", "down", "assays", "of", "yTBP", "(", "61", "-", "240", ")", "with", "Kap114p", "or", "Kap114p", "(", "Δ347", "-", "371", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "RanQ69L", ".", "GST", "-", "fused", "yTBP", "(", "61", "-", "240", ")", "was", "incubated", "with", "recombinant", "Kap114p", "and", "His", "-", "tagged", "RanQ69L", "at", "a", "molar", "ratio", "of", "1", ":", "4", ":", "8", "Kap114p", ":", "yTBP", ":", "RanQ69L", ".", "Unbound", "(", "S", ")", "and", "bound", "(", "B", ")", "samples", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "stained", "with", "Coomassie", "blue", ".", "J", ".", "Analysis", "of", "Kap114p", "dissociation", "from", "yTBP", "in", "the", "presence", "of", "RanQ69L", ".", "Band", "intensities", "of", "Kap114p", "and", "Kap114p", "(", "Δ347", "-", "371", ")", "from", "the", "SDS", "-", "PAGE", "gels", "were", "used", "to", "determine", "the", "average", "fraction", "of", "bound", "protein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. Pull-down assays of yTBP with Kap114p, Kap114p (Δ347-371) and Kap114p (Δ899-956). GST-fused yTBP (61-240) was incubated with recombinant Kap114p, Kap114p (Δ347-371) and Kap114p (Δ899-956). Unbound (S) and bound (B) samples were analyzed by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. C. Band intensities of Kap-βs from the SDS-PAGE gels in (B) were quantified and normalized by GST-yTBP intensity. Quantitative plots show percent Kap-βs binding on yTBP.D, E. ITC titration curves (upper) and binding isotherms (lower) of (D) Kap114p (Δ347-371) and (E) Kap114p (Δ899-956) with yTBP (61-240). Salt concentration and Kd values are indicated.F. Relative fluorescence GFP intensities in the nucleus and cytoplasm of wild type, KAP114 knockout strains, and KAP114 knockout strains rescued by KAP114 deletion mutants.G. His-tagged RanQ69L was incubated with recombinant Kap114p, Kap114p (Δ347-371) and Kap114p (Δ899-956). Unbound (S) and bound (B) samples were analyzed by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. H. Band intensities of Kap-βs from the SDS-PAGE gels in (G) were quantified and normalized by His-Ran intensity. Quantitative plots show percent Kap-βs binding on His-Ran. I. GST pull-down assays of yTBP (61-240) with Kap114p or Kap114p (Δ347-371) in the presence or absence of RanQ69L. GST-fused yTBP (61-240) was incubated with recombinant Kap114p and His-tagged RanQ69L at a molar ratio of 1:4:8 Kap114p:yTBP:RanQ69L. Unbound (S) and bound (B) samples were analyzed by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. J. Analysis of Kap114p dissociation from yTBP in the presence of RanQ69L. Band intensities of Kap114p and Kap114p (Δ347-371) from the SDS-PAGE gels were used to determine the average fraction of bound protein. "}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "EMSA", "analysis", "of", "yTBP", "binding", "to", "DNA", ".", "We", "incubated", "5", "nM", "FAM", "-", "labeled", "oligonucleotide", "(", "TGTATGTATATAAAAC", ")", "with", "indicated", "concentrations", "of", "purified", "yTBP", "(", "0", ".", "125", "to", "8", "μM", ")", "and", "then", "analyzed", "binding", "by", "6", "%", "non", "-", "denaturing", "PAGE", ".", "Band", "intensities", "of", "free", "DNA", "from", "the", "gels", "(", "Top", "panel", ")", "were", "quantified", "and", "plotted", "(", "Bottom", "panel", ")", ".", "C", ".", "Indicated", "concentrations", "(", "0", ".", "25", "to", "16", "μM", ")", "of", "purified", "recombinant", "Kap114p", "were", "incubated", "with", "yTBP", "(", "4", "μM", ")", "and", "FAM", "-", "labeled", "DNA", "(", "5", "nM", ")", ",", "followed", "by", "native", "PAGE", "analysis", ".", "Kap114p", "(", "16", "μM", ")", "was", "incubated", "with", "DNA", "without", "yTBP", "as", "a", "control", ".", "Band", "intensities", "of", "free", "DNA", "from", "the", "gels", "(", "Top", "panel", ")", "were", "quantified", "and", "plotted", "(", "Bottom", "panel", ")", ".", "D", ".", "Super", "-", "shift", "EMSA", "analysis", "of", "TFIIA", "binding", "to", "yTBP", "", "DNA", "complex", ".", "We", "incubated", "5", "nM", "FAM", "-", "labeled", "DNA", "and", "yTBP", "(", "0", ".", "5", "μM", ")", "with", "indicated", "concentrations", "of", "purified", "TFIIA", "(", "0", ".", "08", "to", "5", "μM", ")", "and", "then", "analyzed", "binding", "by", "6", "%", "non", "-", "denaturing", "PAGE", ".", "Band", "intensities", "of", "free", "DNA", "from", "the", "gels", "(", "Top", "panel", ")", "were", "quantified", "and", "plotted", "(", "Bottom", "panel", ")", ".", "E", ".", "Indicated", "concentrations", "(", "0", ".", "06", "to", "4", "μM", ")", "of", "purified", "Kap114p", "were", "added", "to", "the", "reaction", "containing", "0", ".", "5", "μM", "of", "TFIIA", ",", "yTBP", "and", "FAM", "-", "labeled", "DNA", "(", "TGTATGTATATAAAAC", ")", ",", "before", "conducting", "native", "PAGE", "analysis", ".", "TFIIA", "and", "Kap114p", "(", "4", "μM", ")", "were", "incubated", "with", "DNA", "without", "yTBP", "as", "a", "control", ".", "Band", "intensities", "of", "free", "DNA", "from", "the", "gels", "(", "Top", "panel", ")", "were", "quantified", "and", "plotted", "(", "Bottom", "panel", ")", ".", "Electrophoretic", "bands", "containing", "protein", "-", "DNA", "complex", "and", "free", "DNA", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. EMSA analysis of yTBP binding to DNA. We incubated 5 nM FAM-labeled oligonucleotide (TGTATGTATATAAAAC) with indicated concentrations of purified yTBP (0.125 to 8 μM) and then analyzed binding by 6% non-denaturing PAGE. Band intensities of free DNA from the gels (Top panel) were quantified and plotted (Bottom panel).C. Indicated concentrations (0.25 to 16 μM) of purified recombinant Kap114p were incubated with yTBP (4 μM) and FAM-labeled DNA (5 nM), followed by native PAGE analysis. Kap114p (16 μM) was incubated with DNA without yTBP as a control. Band intensities of free DNA from the gels (Top panel) were quantified and plotted (Bottom panel).D. Super-shift EMSA analysis of TFIIA binding to yTBPDNA complex. We incubated 5 nM FAM-labeled DNA and yTBP (0.5 μM) with indicated concentrations of purified TFIIA (0.08 to 5 μM) and then analyzed binding by 6% non-denaturing PAGE. Band intensities of free DNA from the gels (Top panel) were quantified and plotted (Bottom panel).E. Indicated concentrations (0.06 to 4 μM) of purified Kap114p were added to the reaction containing 0.5 μM of TFIIA, yTBP and FAM-labeled DNA (TGTATGTATATAAAAC), before conducting native PAGE analysis. TFIIA and Kap114p (4 μM) were incubated with DNA without yTBP as a control. Band intensities of free DNA from the gels (Top panel) were quantified and plotted (Bottom panel). Electrophoretic bands containing protein-DNA complex and free DNA are indicated."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Wild", "type", "and", "KAP114", "knockout", "strains", "were", "diluted", "serially", "and", "spotted", "onto", "YPD", "plates", "in", "the", "presence", "of", "1", ".", "5", "M", "NaCl", ".", "B", ".", "The", "KAP114", "knockout", "strain", "was", "transformed", "with", "vector", "control", "(", "lane", "2", ")", "and", "a", "plasmid", "containing", "wild", "type", "KAP114", ",", "KAP114", "(", "Δ347", "-", "371", ")", ",", "or", "KAP114", "(", "Δ899", "-", "956", ")", "(", "lanes", "3", "-", "5", ")", ".", "Wild", "type", "and", "KAP114", "knockout", "strains", "containing", "plasmids", "were", "serially", "diluted", "and", "grown", "in", "minimal", "medium", "plates", "supplemented", "with", "1", ".", "5", "M", "NaCl", ".", "Growth", "temperatures", "are", "indicated", ".", "C", ".", "A", "heatmap", "generated", "by", "three", "independent", "biological", "replicates", "shows", "gene", "expression", "profiles", "of", "wild", "type", "and", "KAP114", "knockout", "strains", "grown", "in", "the", "presence", "of", "1", ".", "5", "M", "NaCl", ".", "The", "Log2", "(", "fold", "-", "change", ")", "values", "and", "the", "color", "scale", "are", "shown", ".", "E", ",", "F", ".", "(", "E", ")", "qPCR", "analysis", "of", "gene", "expression", "in", "the", "KAP114", "knockout", "strains", "(", "green", "bars", ")", "compared", "to", "wild", "type", "(", "black", "bars", ")", "under", "regular", "conditions", ".", "(", "F", ")", "qPCR", "analysis", "of", "gene", "expression", "in", "the", "KAP114", "knockout", "strain", "(", "green", "bars", ")", "compared", "to", "wild", "type", "(", "black", "bars", ")", "grown", "in", "high", "salt", "conditions", ".", "qPCR", "fold", "-", "changes", "in", "mRNA", "expression", "are", "relative", "to", "control", "(", "YPD", "media", ",", "black", "bars", ")", ".", "Actin", "was", "used", "as", "the", "internal", "control", ".", "G", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "assays", "showing", "yTBP", "-", "GFP", "binding", "to", "the", "promoter", "of", "indicated", "genes", "in", "wild", "type", "and", "KAP114", "knockout", "strains", "grown", "in", "high", "salt", "conditions", "(", "light", "green", "bars", ")", "compared", "to", "under", "regular", "conditions", "(", "black", "bars", ")", ".", "Chip", "-", "qPCR", "fold", "-", "enrichment", "is", "relative", "to", "control", "(", "YPD", "media", ",", "black", "bars", ")", ".", "H", ".", "Endogenous", "Ran", ",", "GFP", "-", "yTBP", "and", "proliferating", "cell", "nuclear", "antigen", "(", "PCNA", ";", "loading", "control", ")", "in", "nuclear", "fractions", "isolated", "from", "wild", "type", "yeast", "grown", "in", "regular", "and", "high", "salt", "conditions", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "antibodies", "for", "Ran", ",", "GFP", "and", "PCNA", ".", "I", ",", "J", ".", "Analysis", "of", "Ran", "and", "GFP", "-", "yTBP", "in", "nuclear", "fractions", "isolated", "from", "wild", "type", "yeast", "grown", "in", "regular", "and", "high", "salt", "conditions", ".", "The", "combined", "bar", "and", "scatter", "plot", "shows", "the", "band", "intensity", "ratios", "of", "Ran", "(", "I", ")", "and", "GFP", "-", "yTBP", "(", "J", ")", "over", "PCNA", ".", "Each", "dot", "represents", "an", "individual", "data", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Wild type and KAP114 knockout strains were diluted serially and spotted onto YPD plates in the presence of 1.5 M NaCl.B. The KAP114 knockout strain was transformed with vector control (lane 2) and a plasmid containing wild type KAP114, KAP114 (Δ347-371), or KAP114 (Δ899-956) (lanes 3-5). Wild type and KAP114 knockout strains containing plasmids were serially diluted and grown in minimal medium plates supplemented with 1.5 M NaCl. Growth temperatures are indicated.C. A heatmap generated by three independent biological replicates shows gene expression profiles of wild type and KAP114 knockout strains grown in the presence of 1.5 M NaCl. The Log2 (fold-change) values and the color scale are shown.E, F. (E) qPCR analysis of gene expression in the KAP114 knockout strains (green bars) compared to wild type (black bars) under regular conditions. (F) qPCR analysis of gene expression in the KAP114 knockout strain (green bars) compared to wild type (black bars) grown in high salt conditions. qPCR fold-changes in mRNA expression are relative to control (YPD media, black bars). Actin was used as the internal control.G. ChIP-qPCR assays showing yTBP-GFP binding to the promoter of indicated genes in wild type and KAP114 knockout strains grown in high salt conditions (light green bars) compared to under regular conditions (black bars). Chip-qPCR fold-enrichment is relative to control (YPD media, black bars).H. Endogenous Ran, GFP-yTBP and proliferating cell nuclear antigen (PCNA; loading control) in nuclear fractions isolated from wild type yeast grown in regular and high salt conditions were analyzed by Western blot using antibodies for Ran, GFP and PCNA. I, J. Analysis of Ran and GFP-yTBP in nuclear fractions isolated from wild type yeast grown in regular and high salt conditions. The combined bar and scatter plot shows the band intensity ratios of Ran (I) and GFP-yTBP (J) over PCNA. Each dot represents an individual data point. "}
{"words": ["Figure", "1SUMO", "conjugation", "assays", "performed", "under", "multiple", "turnover", "conditions", "using", "wild", "-", "type", "or", "mutant", "forms", "of", "RPA", ",", "SUMO", "and", "Siz2", ".", "Only", "the", "80", "-", "minute", "time", "points", "are", "presented", "to", "highlight", "the", "formation", "of", "Rfa1", "-", "SUMO", "and", "Siz2", "-", "SUMO", "species", ".", "The", "complete", "time", "series", "are", "presented", "in", "Appendix", "Fig", "S1", ".", "Bands", "for", "Mw", "marker", "are", "fully", "annotated", "in", "Figure", "1B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1SUMO conjugation assays performed under multiple turnover conditions using wild-type or mutant forms of RPA, SUMO and Siz2. Only the 80-minute time points are presented to highlight the formation of Rfa1-SUMO and Siz2-SUMO species. The complete time series are presented in Appendix Fig S1. Bands for Mw marker are fully annotated in Figure 1B."}
{"words": ["Figure", "2SUMO", "conjugation", "assays", "performed", "under", "multiple", "turnover", "conditions", "using", "Siz2", "∆", "CT", "and", "different", "RPA", "-", "DNA", "complexes", ".", "SDS", "-", "PAGE", "gels", "were", "stained", "with", "Coomassie", ".", "Bands", "for", "Mw", "marker", "are", "fully", "annotated", "in", "Figure", "1B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2SUMO conjugation assays performed under multiple turnover conditions using Siz2∆CT and different RPA-DNA complexes. SDS-PAGE gels were stained with Coomassie. Bands for Mw marker are fully annotated in Figure 1B."}
{"words": ["Figure", "3Plot", "showing", "the", "initial", "rate", "of", "SUMO", "conjugation", "versus", "RPA", "-", "DNA", "concentration", "as", "obtained", "from", "single", "-", "turnover", "reactions", "to", "measure", "rates", "of", "SUMO", "conjugation", "to", "Rfa1", "with", "different", "RPA", "-", "DNA", "complexes", ".", "Representative", "gels", "are", "shown", "in", "Appendix", "Fig", "S4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Plot showing the initial rate of SUMO conjugation versus RPA-DNA concentration as obtained from single-turnover reactions to measure rates of SUMO conjugation to Rfa1 with different RPA-DNA complexes. Representative gels are shown in Appendix Fig S4."}
{"words": ["Figure", "4SUMO", "conjugation", "assays", "performed", "under", "multiple", "turnover", "conditions", "using", "RPA", "complexes", "with", "or", "without", "the", "WH", "domain", "of", "Rfa2", "in", "presence", "of", "Siz2", "∆", "CT", "lacking", "(", "A", ")", "or", "including", "(", "B", ")", "its", "SAP", "domain", ".", "In", "both", "cases", ",", "reactions", "were", "done", "in", "technical", "triplicate", "and", "SDS", "-", "PAGE", "gels", "were", "stained", "with", "SYPRO", ".", "Only", "one", "representative", "gel", "is", "shown", ".", "Bands", "for", "Mw", "marker", "are", "fully", "annotated", "in", "Figure", "1B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4SUMO conjugation assays performed under multiple turnover conditions using RPA complexes with or without the WH domain of Rfa2 in presence of Siz2∆CT lacking (A) or including (B) its SAP domain. In both cases, reactions were done in technical triplicate and SDS-PAGE gels were stained with SYPRO. Only one representative gel is shown. Bands for Mw marker are fully annotated in Figure 1B."}
{"words": ["Figure", "6SUMO", "conjugation", "assays", "performed", "under", "multiple", "turnover", "conditions", "as", "in", "Fig", "4", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "technical", "triplicates", "(", "six", "times", "for", "WT", ")", ".", "The", "structural", "models", "highlight", "the", "position", "of", "the", "mutations", "using", "a", "homology", "model", "of", "the", "SAP", "domain", "of", "Siz2", "obtained", "using", "the", "structure", "of", "Siz1", "(", "PDB", "2RNN", ")", "as", "a", "template", ".", "A", "dashed", "box", "indicates", "the", "relative", "position", "of", "residues", "that", "undergo", "chemical", "shift", "perturbation", "upon", "DNA", "binding", "according", "to", "(", "Suzuki", "et", "al", ",", "2009", ")", ".", "Bands", "for", "Mw", "marker", "are", "fully", "annotated", "in", "Figure", "1B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6SUMO conjugation assays performed under multiple turnover conditions as in Fig 4. Experiments were performed in technical triplicates (six times for WT). The structural models highlight the position of the mutations using a homology model of the SAP domain of Siz2 obtained using the structure of Siz1 (PDB 2RNN) as a template. A dashed box indicates the relative position of residues that undergo chemical shift perturbation upon DNA binding according to (Suzuki et al, 2009). Bands for Mw marker are fully annotated in Figure 1B."}
{"words": ["Figure", "7SUMO", "conjugation", "assays", "performed", "under", "multiple", "turnover", "conditions", "as", "in", "Fig", "4", "and", "using", "different", "Siz2", "∆", "CT", "variants", ".", "The", "structural", "models", "highlight", "the", "position", "of", "the", "mutations", "using", "a", "homology", "model", "of", "the", "SAP", "domain", "of", "Siz2", "obtained", "using", "the", "structure", "of", "Siz1", "(", "PDB", "2RNN", ")", "as", "a", "template", ".", "A", "dashed", "box", "indicates", "the", "relative", "position", "of", "residues", "that", "undergo", "chemical", "shift", "perturbation", "upon", "DNA", "binding", "according", "to", "(", "Suzuki", "et", "al", ",", "2009", ")", ".", "Bands", "for", "Mw", "marker", "are", "fully", "annotated", "in", "Figure", "1B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7SUMO conjugation assays performed under multiple turnover conditions as in Fig 4 and using different Siz2∆CT variants. The structural models highlight the position of the mutations using a homology model of the SAP domain of Siz2 obtained using the structure of Siz1 (PDB 2RNN) as a template. A dashed box indicates the relative position of residues that undergo chemical shift perturbation upon DNA binding according to (Suzuki et al, 2009). Bands for Mw marker are fully annotated in Figure 1B."}
{"words": ["Figure", "8Electrophoretic", "mobility", "shift", "assays", "(", "EMSA", ")", "to", "assess", "binding", "of", "RPA", "or", "SUMO", "-", "RPA", "to", "25nM", "single", "-", "stranded", "6", "-", "FAM", "-", "labeled", "32dT", "DNA", "and", "displacement", "of", "SUMO", "-", "RPA", "from", "25nM", "SUMO", "-", "RPA", "bound", "to", "single", "-", "stranded", "6", "-", "FAM", "-", "labeled", "32dT", "DNA", "by", "RPA", "and", "vice", "versa", ".", "All", "titrations", "were", "done", "in", "technical", "triplicates", ".", "One", "representative", "gel", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) to assess binding of RPA or SUMO-RPA to 25nM single-stranded 6-FAM-labeled 32dT DNA and displacement of SUMO-RPA from 25nM SUMO-RPA bound to single-stranded 6-FAM-labeled 32dT DNA by RPA and vice versa. All titrations were done in technical triplicates. One representative gel is shown."}
{"words": ["Figure", "9Electrophoretic", "mobility", "shift", "assays", "(", "EMSA", ")", "performed", "with", "10", "nM", "6", "-", "FAM", "-", "ds20ss32", ",", "a", "6", "-", "FAM", "-", "labeled", "20", "-", "mer", "dsDNA", "with", "a", "32", "nucleotide", "3", "'", "overhang", "and", "its", "complexes", "with", "RPA", ",", "RPA", "with", "K170", "-", "SUMO", "modified", "Rfa1", "or", "RPA", "reconstituted", "with", "∆", "WH", "-", "Rfa2", "and", "serially", "diluted", "Siz2", ".", "All", "titrations", "were", "done", "in", "technical", "triplicates", ".", "One", "representative", "gel", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) performed with 10 nM 6-FAM-ds20ss32, a 6-FAM-labeled 20-mer dsDNA with a 32 nucleotide 3' overhang and its complexes with RPA, RPA with K170-SUMO modified Rfa1 or RPA reconstituted with ∆WH-Rfa2 and serially diluted Siz2. All titrations were done in technical triplicates. One representative gel is shown."}
{"words": ["Figure", "1C", ".", "Total", "USV", "number", "in", "YFO", "and", "AFO", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "in", "the", "box", "plot", "or", "pie", "chart", "format", ".", "The", "central", "band", "in", "each", "box", "represents", "the", "median", ";", "boxes", "indicate", "the", "middle", "quartiles", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "the", "minimum", "and", "maximum", "values", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "determined", "using", "Student", "'", "s", "or", "Welch", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C. Total USV number in YFO and AFO. Data information: Data are presented in the box plot or pie chart format. The central band in each box represents the median; boxes indicate the middle quartiles, and whiskers extend to the minimum and maximum values. *p<0.05, determined using Student's or Welch t-test."}
{"words": ["Figure", "2D", ".", "A", "heat", "map", "of", "the", "16", "hyper", "-", "and", "96", "hypo", "-", "methylated", "DMRs", "in", "sperm", "from", "aged", "mice", "ordered", "by", "their", "chromosomal", "positions", ".", "M", "indicates", "the", "average", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D. A heat map of the 16 hyper- and 96 hypo-methylated DMRs in sperm from aged mice ordered by their chromosomal positions. M indicates the average."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Volcano", "plot", "for", "DEGs", "in", "the", "embryonic", "brain", "of", "YFO", "and", "AFO", "at", "E14", ".", "5", "(", "n", "=", "3", "in", "each", "group", ")", ".", "Green", "lines", "indicate", "a", "twofold", "change", "and", "p", "=", "0", ".", "01", ".", "Orange", "dots", "indicate", "REST", "/", "NRSF", "target", "genes", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "in", "the", "volcano", "plot", "or", "line", "chart", "format", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "determined", "by", "nominal", "GSEA", "p", "-", "value", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Volcano plot for DEGs in the embryonic brain of YFO and AFO at E14.5 (n=3 in each group). Green lines indicate a twofold change and p=0.01. Orange dots indicate REST/NRSF target genes. Data information: Data are presented in the volcano plot or line chart format. *p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, determined by nominal GSEA p-value."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Volcano", "plot", "for", "DEGs", "in", "the", "embryonic", "brain", "of", "YFO", "and", "AFO", "at", "E11", ".", "5", "(", "n", "=", "3", "in", "each", "group", ")", ".", "Green", "lines", "indicate", "a", "twofold", "change", "and", "p", "=", "0", ".", "01", ".", "Orange", "dots", "indicate", "REST", "/", "NRSF", "target", "genes", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "in", "the", "volcano", "plot", "or", "line", "chart", "format", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "determined", "by", "volcano", "or", "nominal", "GSEA", "P", "-", "value", ".", "NES", ",", "normalized", "enrichment", "score", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Volcano plot for DEGs in the embryonic brain of YFO and AFO at E11.5 (n=3 in each group). Green lines indicate a twofold change and p=0.01. Orange dots indicate REST/NRSF target genes. Data information: Data are presented in the volcano plot or line chart format. *p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, determined by volcano or nominal GSEA P-value. NES, normalized enrichment score."}
{"words": ["Figure", "6C", ".", "Immunostaining", "for", "cortical", "layer", "markers", "in", "the", "postnatal", "brain", "of", "YFO", "and", "AFO", "(", "representative", "magnified", "images", "of", "the", "white", "boxes", "in", "panel", "A", ")", ".", "Satb2", "+", "/", "Ctip2", "-", ":", "layer", "2", "-", "4", ",", "Ctip2high", ":", "layer", "5", ",", "Satb2", "-", "/", "Ctip2", "-", ":", "layer", "6", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "F", ".", "Cell", "number", "in", "each", "cortical", "layer", "in", "the", "postnatal", "brain", "of", "YFO", "and", "AFO", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "determined", "using", "Student", "t", "-", "test", ".", "D", ".", "Immunostaining", "for", "another", "cortical", "layer", "markers", "in", "the", "postnatal", "brain", "of", "YFO", "and", "AFO", "(", "representative", "magnified", "images", "of", "the", "white", "boxes", "in", "panel", "A", ")", ".", "Tbr1", "-", "/", "Ctip2", "-", ":", "layer", "2", "-", "4", ",", "Ctip2high", ":", "layer", "5", ",", "Tbr1", "+", "/", "Ctip2", "-", ":", "layer", "6", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "G", ".", "Cell", "density", "in", "each", "cortical", "layer", "in", "the", "postnatal", "brain", "of", "YFO", "and", "AFO", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "determined", "using", "Student", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C. Immunostaining for cortical layer markers in the postnatal brain of YFO and AFO (representative magnified images of the white boxes in panel A). Satb2+/Ctip2-: layer 2-4, Ctip2high: layer 5, Satb2-/Ctip2-: layer 6. Scale bar: 100 μm. F. Cell number in each cortical layer in the postnatal brain of YFO and AFO. Data information: All data are presented as the mean ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, determined using Student t-test.D. Immunostaining for another cortical layer markers in the postnatal brain of YFO and AFO (representative magnified images of the white boxes in panel A). Tbr1-/Ctip2-: layer 2-4, Ctip2high: layer 5, Tbr1+/Ctip2-: layer 6. Scale bar: 100 μm. G. Cell density in each cortical layer in the postnatal brain of YFO and AFO. Data information: All data are presented as the mean ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, determined using Student t-test."}
{"words": ["Figure", "7C", ".", "Representative", "image", "of", "5", "-", "mC", "immunofluorescence", "in", "the", "sperm", "of", "saline", "-", "and", "5", "-", "Aza", "-", "treated", "mice", "(", "ST", "and", "AT", ",", "respectively", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "D", ".", "Quantification", "analysis", "of", "5", "-", "mC", "immunofluorescence", "in", "individual", "sperm", "cells", "from", "STO", "(", "n", "=", "1", ",", "673", "sperm", "from", "4", "male", "mice", ")", "and", "ATO", "(", "n", "=", "2", ",", "675", "sperm", "from", "4", "male", "mice", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "in", "the", "box", "plot", "format", ".", "The", "central", "band", "in", "each", "box", "represents", "the", "median", ",", "boxes", "indicate", "the", "middle", "quartiles", ",", "whiskers", "extended", "to", "the", "minimum", "and", "maximum", "values", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "determined", "using", "Student", "'", "s", "or", "Welch", "t", "-", "test", ".", "F", ".", "Overall", "USV", "number", "in", "STO", "and", "ATO", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "in", "the", "box", "plot", "format", ".", "The", "central", "band", "in", "each", "box", "represents", "the", "median", ",", "boxes", "indicate", "the", "middle", "quartiles", ",", "whiskers", "extended", "to", "the", "minimum", "and", "maximum", "values", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "determined", "using", "Student", "'", "s", "or", "Welch", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7C. Representative image of 5-mC immunofluorescence in the sperm of saline- and 5-Aza-treated mice (ST and AT, respectively). Scale bar: 100 μm. D. Quantification analysis of 5-mC immunofluorescence in individual sperm cells from STO (n=1,673 sperm from 4 male mice) and ATO (n=2,675 sperm from 4 male mice).Data information: All data are presented in the box plot format. The central band in each box represents the median, boxes indicate the middle quartiles, whiskers extended to the minimum and maximum values. *p<0.05 and **p<0.01, determined using Student's or Welch t-test.F. Overall USV number in STO and ATO. Data information: All data are presented in the box plot format. The central band in each box represents the median, boxes indicate the middle quartiles, whiskers extended to the minimum and maximum values. *p<0.05 and **p<0.01, determined using Student's or Welch t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Distribution", "of", "antimycin", "A", "resistance", "scores", "for", "wild", "isolates", ",", "compared", "to", "standard", "laboratory", "strain", "(", "red", "vertical", "line", ")", ".", "Resistance", "scores", "are", "the", "ratio", "of", "fitness", "on", "rich", "glucose", "media", "with", "vs", "without", "500", "µg", "/", "L", "antimycin", "A", ".", "Fitness", "was", "estimated", "based", "on", "colony", "size", "on", "solid", "media", ",", "corrected", "for", "spatial", "and", "plate", "effects", "After", "quality", "control", ",", "we", "obtained", "quantitative", "fitness", "scores", "for", "154", "strains", ",", "with", "a", "signal", "-", "to", "-", "noise", "ratio", "of", "29", ".", "8", "and", "an", "unexplained", "variance", "of", "0", ".", "12", ".", "(", "B", ")", "Volcano", "plot", "of", "a", "genome", "-", "wide", "association", "using", "mixed", "-", "model", "linear", "regression", "of", "antimycin", "A", "resistance", "for", "118", ",", "527", "genetic", "variants", ".", "Variants", "with", "moderate", "or", "high", "impact", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Red", "dot", ":", "the", "variant", "at", "locus", "I", ":", "3845516", ",", "which", "causes", "a", "T343A", "change", "in", "the", "Pyk1", "amino", "-", "acid", "sequence", ".", "This", "variant", "was", "among", "the", "top", "scoring", "(", "effect", "size", "=", "-", "0", ".", "645", ",", "rank", "34", ";", "p", "=", "0", ".", "0008", ",", "rank", "70", ")", ".", "(", "C", ")", "Boxplot", "showing", "antimycin", "A", "resistance", "for", "154", "strains", "grouped", "by", "the", "two", "alleles", "at", "the", "pyk1", "locus", ".", "Strains", "carrying", "a", "C", "at", "this", "genomic", "locus", "(", "orange", "box", ")", "generally", "have", "higher", "antimycin", "resistance", "than", "strains", "carrying", "the", "reference", "allele", "T", "(", "blue", "box", ")", ".", "As", "is", "standard", ",", "this", "boxplot", "and", "all", "other", "boxplots", "in", "this", "manuscript", "show", "the", "median", "of", "the", "data", "as", "central", "line", ",", "the", "quartiles", "as", "box", "and", "the", "extend", "of", "the", "rest", "of", "the", "distribution", "as", "whiskers", ".", "Points", "which", "are", "1", ".", "5", "times", "the", "inter", "-", "quartile", "range", "beyond", "the", "high", "and", "low", "quartiles", "are", "considered", "outliers", "and", "shown", "individually", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Distribution of antimycin A resistance scores for wild isolates, compared to standard laboratory strain (red vertical line). Resistance scores are the ratio of fitness on rich glucose media with vs without 500 µg/L antimycin A. Fitness was estimated based on colony size on solid media, corrected for spatial and plate effects After quality control, we obtained quantitative fitness scores for 154 strains, with a signal-to-noise ratio of 29.8 and an unexplained variance of 0.12.(B) Volcano plot of a genome-wide association using mixed-model linear regression of antimycin A resistance for 118,527 genetic variants. Variants with moderate or high impact are shown in blue. Red dot: the variant at locus I:3845516, which causes a T343A change in the Pyk1 amino-acid sequence. This variant was among the top scoring (effect size=-0.645, rank 34; p=0.0008, rank 70).(C) Boxplot showing antimycin A resistance for 154 strains grouped by the two alleles at the pyk1 locus. Strains carrying a C at this genomic locus (orange box) generally have higher antimycin resistance than strains carrying the reference allele T (blue box). As is standard, this boxplot and all other boxplots in this manuscript show the median of the data as central line, the quartiles as box and the extend of the rest of the distribution as whiskers. Points which are 1.5 times the inter-quartile range beyond the high and low quartiles are considered outliers and shown individually."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Left", "boxplot", ":", "two", "glycolytic", "intermediates", "directly", "upstream", "of", "PYK", "were", "strongly", "depleted", "in", "the", "A", "-", "strain", "(", "nT", "-", "strain", "=", "9", ",", "nA", "-", "strain", "=", "8", ")", ".", "Right", "barplot", ":", "PYK", "activity", "was", "directly", "measured", "using", "a", "lactate", "dehydrogenase", "-", "coupled", "colorimetric", "enzyme", "activity", "assay", ",", "showing", "the", "mean", "and", "standard", "deviation", "of", "substrate", "conversion", "rate", "for", "3", "biological", "replicates", ",", "each", "measured", "in", "technical", "duplicates", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "keys", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", "(", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "(", "C", ")", "Concentrations", "of", "fructose", "-", "1", ",", "6", "-", "bisphosphate", ",", "which", "correlate", "with", "glycolytic", "flux", ",", "are", "significantly", "higher", "in", "A", "-", "strain", "(", "ratio", "=", "1", ".", "35", ",", "nT", "-", "strain", "=", "9", ",", "nA", "-", "strain", "=", "8", ")", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "keys", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", "(", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "(", "D", ")", "Boxplots", "for", "selected", "metabolomics", "data", "indicate", "differences", "in", "energy", "and", "redox", "status", "between", "T", "-", "and", "A", "-", "strains", "(", "nT", "-", "strain", "=", "9", ",", "nA", "-", "strain", "=", "8", ")", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "keys", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", "(", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "(", "E", ")", "Heatmap", "of", "the", "432", "genes", "that", "are", "differentially", "expressed", "at", "the", "RNA", "level", "between", "the", "T", "-", "and", "A", "-", "strains", "(", "FDR", "<", "10", "%", ")", "and", "are", "measured", "in", "all", "four", "conditions", "(", "columns", ")", ".", "First", "column", ":", "genes", "ordered", "by", "increasing", "fold", "-", "changes", "for", "RNAs", "(", "computed", "as", "log2", "[", "T", "]", "-", "log2", "[", "A", "]", ")", ".", "Second", "column", ":", "fold", "-", "changes", "for", "proteins", "(", "computed", "as", "log2", "[", "T", "]", "-", "log2", "[", "A", "]", ")", ".", "Third", "column", ":", "fold", "-", "changes", "for", "RNAs", "in", "cells", "treated", "with", "rapamycin", "&", "caffeine", "(", "TORC1", "inhibition", ";", "computed", "as", "log2", "[", "treatment", "]", "-", "log2", "[", "control", "]", ")", "(", "data", "from", "ref", ".", "(", "Rallis", "et", "al", ",", "2013", ")", ")", ".", "Fourth", "column", ":", "fold", "-", "changes", "for", "RNAs", "in", "cells", "treated", "with", "H2O2", "(", "oxidative", "stress", ";", "computed", "as", "log2", "[", "treatment", "]", "-", "log2", "[", "control", "]", ")", "(", "data", "from", "Chen", "et", "al", ",", "2003", ")", ".", "Log2", "fold", "-", "changes", "are", "capped", "at", "absolute", "values", "of", "1", "for", "all", "columns", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Left boxplot: two glycolytic intermediates directly upstream of PYK were strongly depleted in the A-strain (nT-strain=9, nA-strain=8). Right barplot: PYK activity was directly measured using a lactate dehydrogenase-coupled colorimetric enzyme activity assay, showing the mean and standard deviation of substrate conversion rate for 3 biological replicates, each measured in technical duplicates. Data information: Significance keys: * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.0005 (Welch's t-test)(C) Concentrations of fructose-1,6-bisphosphate, which correlate with glycolytic flux, are significantly higher in A-strain (ratio = 1.35, nT-strain=9, nA-strain=8). Data information: Significance keys: * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.0005 (Welch's t-test)(D) Boxplots for selected metabolomics data indicate differences in energy and redox status between T- and A-strains (nT-strain=9, nA-strain=8). Data information: Significance keys: * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.0005 (Welch's t-test)(E) Heatmap of the 432 genes that are differentially expressed at the RNA level between the T- and A-strains (FDR <10%) and are measured in all four conditions (columns). First column: genes ordered by increasing fold-changes for RNAs (computed as log2[T]-log2[A]). Second column: fold-changes for proteins (computed as log2[T]-log2[A]). Third column: fold-changes for RNAs in cells treated with rapamycin & caffeine (TORC1 inhibition; computed as log2[treatment]-log2[control]) (data from ref. (Rallis et al, 2013)). Fourth column: fold-changes for RNAs in cells treated with H2O2 (oxidative stress; computed as log2[treatment]-log2[control]) (data from Chen et al, 2003). Log2 fold-changes are capped at absolute values of 1 for all columns."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Growth", "measured", "by", "optical", "density", "(", "OD", ")", "at", "600nm", "for", "3", "biological", "replicates", "each", "of", "the", "T", "-", "and", "A", "-", "strains", "over", "6", "hrs", "of", "exponential", "growth", "in", "YES", "media", ".", "The", "x", "-", "axis", "refers", "to", "the", "time", "since", "inoculation", "of", "the", "culture", ".", "(", "B", ")", "The", "same", "data", "as", "in", "(", "A", ")", "plotted", "on", "a", "log2", "scale", "(", "solid", "lines", ")", "with", "lines", "fitted", "(", "dotted", "lines", ")", ".", "The", "doubling", "time", "is", "the", "inverse", "of", "the", "slope", ".", "(", "C", ")", "Media", "samples", "were", "taken", "from", "the", "same", "cultures", "(", "n", "=", "3", "for", "both", "strains", ")", "at", "the", "8", "hr", "timepoint", "and", "the", "remaining", "glucose", "was", "quantified", ".", "The", "consumed", "glucose", "was", "calculated", "based", "on", "the", "amount", "of", "glucose", "measured", "in", "the", "same", ",", "fresh", "media", "and", "normalised", "to", "the", "OD", "of", "each", "culture", "at", "the", "time", "of", "sampling", ".", "(", "D", ")", "Oxygen", "consumption", "rates", "in", "A", "-", "and", "T", "-", "strains", "(", "ratio", "of", "means", "=", "0", ".", "65", ",", "p", "=", "0", ".", "0002", ",", "Welch", "'", "s", "T", "-", "test", ",", "3", "biological", "replicates", ",", "each", "measured", "in", "technical", "duplicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "Vertical", "bars", "show", "the", "mean", "of", "the", "data", ".", "Error", "bars", "and", "shaded", "areas", "in", "all", "cases", "denote", "standard", "deviation", ".", "Significance", "keys", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", "(", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Culture", "dry", "weight", "after", "24", "hrs", "was", "measured", "reported", "as", "a", "fraction", "of", "the", "weight", "of", "glucose", "put", "into", "the", "media", "for", "3", "biological", "replicates", "per", "strain", ".", "Data", "information", ":", "Vertical", "bars", "show", "the", "mean", "of", "the", "data", ".", "Error", "bars", "and", "shaded", "areas", "in", "all", "cases", "denote", "standard", "deviation", ".", "Significance", "keys", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", "(", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Growth measured by optical density (OD) at 600nm for 3 biological replicates each of the T- and A-strains over 6 hrs of exponential growth in YES media. The x-axis refers to the time since inoculation of the culture. (B) The same data as in (A) plotted on a log2 scale (solid lines) with lines fitted (dotted lines). The doubling time is the inverse of the slope. (C) Media samples were taken from the same cultures (n=3 for both strains) at the 8 hr timepoint and the remaining glucose was quantified. The consumed glucose was calculated based on the amount of glucose measured in the same, fresh media and normalised to the OD of each culture at the time of sampling.(D) Oxygen consumption rates in A- and T-strains (ratio of means=0.65, p=0.0002, Welch's T-test, 3 biological replicates, each measured in technical duplicates). Data information: Vertical bars show the mean of the data. Error bars and shaded areas in all cases denote standard deviation. Significance keys: * p<0.05, *** p<0.0005 (Welch's t-test).(E) Culture dry weight after 24 hrs was measured reported as a fraction of the weight of glucose put into the media for 3 biological replicates per strain. Data information: Vertical bars show the mean of the data. Error bars and shaded areas in all cases denote standard deviation. Significance keys: * p<0.05, *** p<0.0005 (Welch's t-test)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Spot", "assays", "on", "solid", "media", "from", "a", "three", "-", "fold", "dilution", "series", "of", "exponential", "cultures", "at", "the", "same", "cell", "density", "in", "96", "-", "well", "plates", "(", "3", "biological", "replicates", "of", "each", "strain", ")", "and", "spotted", "in", "16", "technical", "replicates", "(", "each", "dilution", "in", "4x4", "square", ")", ".", "The", "A", "-", "strain", "is", "more", "resistant", "to", "antimycin", "A", "but", "less", "resistant", "to", "oxidative", "stress", "triggered", "by", "H2O2", "or", "diamide", ".", "A", "control", "without", "toxin", "(", "left", ")", "was", "included", "in", "each", "batch", "of", "spot", "assays", "performed", "and", "a", "representative", "image", "is", "shown", "here", ".", "(", "B", ")", "Fitness", "(", "approximated", "by", "maximum", "slope", "of", "smoothed", "growth", "curves", ")", "of", "A", "-", "and", "T", "-", "strains", "on", "12", "carbon", "sources", ",", "with", "either", "yeast", "extract", "(", "YE", ")", "or", "ammonium", "(", "NH4", ")", ",", "with", "or", "without", "0", ".", "1", "%", "priming", "glucose", "to", "support", "initial", "growth", ".", "For", "all", "48", "conditions", ",", "two", "biological", "replicates", "of", "A", "-", "and", "T", "-", "strains", "were", "grown", "in", "technical", "quadruplicates", "each", ".", "Dotted", "lines", "in", "panels", "mark", "a", "fitness", "ratio", "of", "1", "(", "i", ".", "e", ".", ",", "same", "fitness", ")", ".", "(", "C", ")", "Fitness", "of", "A", "-", "and", "T", "-", "strains", "on", "95", "nitrogen", "sources", "on", "Biolog", "Phenotype", "MicroArrays", ".", "Conditions", "with", "no", "substantial", "growth", "were", "excluded", "(", "black", "circles", ",", "maximum", "slope", "<", "0", ".", "015", ")", ".", "Red", "lines", "show", "arbitrary", "significance", "cut", "-", "off", ",", "put", "at", "|", "log2", "(", "A", "-", "strain", "/", "T", "-", "strain", ")", "|", ">", "0", ".", "75", ".", "(", "D", ")", "Fitness", "of", "A", "-", "and", "T", "-", "strains", "on", "72", "different", "drugs", "and", "toxins", ",", "at", "4", "concentrations", "each", ",", "on", "Biolog", "Phenotype", "MicroArrays", ".", "(", "Results", "for", "benzamidine", "were", "inconclusive", ",", "with", "both", "strains", "comparatively", "resistant", "in", "one", "concentration", "each", ".", ")", "(", "E", ")", "Spot", "assays", "to", "validate", "selected", "results", "Several", "assays", "were", "performed", "with", "both", "h", "-", "and", "h90", "strains", ",", "and", "no", "mating", "-", "type", "specific", "differences", "were", "evident", "between", "the", "two", "sets", "of", "allele", "-", "swap", "strains", ".", "(", "F", ")", "Chronological", "lifespan", "of", "A", "-", "and", "T", "-", "strains", ",", "i", ".", "e", ".", "the", "proportion", "of", "non", "-", "dividing", "cells", "in", "stationary", "phase", "that", "maintain", "proliferative", "potential", "after", "refeeding", ".", "The", "data", "show", "colony", "forming", "units", "(", "CFUs", ")", "per", "ml", "of", "culture", "over", "7", "days", "of", "stationary", "phase", "in", "glucose", "-", "depleted", "rich", "media", ".", "Three", "biological", "repeats", "were", "carried", "out", "for", "both", "strains", ",", "with", "each", "repeat", "measured", "as", "technical", "triplicates", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "biological", "replicates", ".", "(", "G", ")", "Boxplot", "showing", "resistance", "to", "3mM", "H2O2", "grouped", "by", "pyk1", "allele", "for", "156", "strains", "from", "our", "collection", ".", "The", "T", "-", "strains", "had", "a", "higher", "mean", "fitness", "in", "H2O2", "than", "the", "A", "-", "strains", "(", "1", ".", "01", "±", "0", ".", "06", "vs", "0", ".", "95", "±", "0", ".", "11", ";", "p", "=", "0", ".", "0021", ",", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "The", "resistance", "score", "was", "obtained", "as", "for", "antimycin", "A", ".", "(", "H", ")", "Boxplot", "showing", "growth", "fitness", "on", "rich", "media", ",", "grouped", "by", "pyk1", "allele", "for", "158", "S", ".", "pombe", "strains", "(", "0", ".", "88", "±", "0", ".", "16", "vs", "0", ".", "94", "±", "0", ".", "24", ";", "p", "=", "0", ".", "18", ",", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Spot assays on solid media from a three-fold dilution series of exponential cultures at the same cell density in 96-well plates (3 biological replicates of each strain) and spotted in 16 technical replicates (each dilution in 4x4 square). The A-strain is more resistant to antimycin A but less resistant to oxidative stress triggered by H2O2 or diamide. A control without toxin (left) was included in each batch of spot assays performed and a representative image is shown here.(B) Fitness (approximated by maximum slope of smoothed growth curves) of A- and T-strains on 12 carbon sources, with either yeast extract (YE) or ammonium (NH4), with or without 0.1% priming glucose to support initial growth. For all 48 conditions, two biological replicates of A- and T-strains were grown in technical quadruplicates each. Dotted lines in panels mark a fitness ratio of 1 (i.e., same fitness).(C) Fitness of A- and T-strains on 95 nitrogen sources on Biolog Phenotype MicroArrays. Conditions with no substantial growth were excluded (black circles, maximum slope <0.015). Red lines show arbitrary significance cut-off, put at |log2(A-strain/T-strain)|>0.75.(D) Fitness of A- and T-strains on 72 different drugs and toxins, at 4 concentrations each, on Biolog Phenotype MicroArrays. (Results for benzamidine were inconclusive, with both strains comparatively resistant in one concentration each.)(E) Spot assays to validate selected results Several assays were performed with both h- and h90 strains, and no mating-type specific differences were evident between the two sets of allele-swap strains.(F) Chronological lifespan of A- and T-strains, i.e. the proportion of non-dividing cells in stationary phase that maintain proliferative potential after refeeding. The data show colony forming units (CFUs) per ml of culture over 7 days of stationary phase in glucose-depleted rich media. Three biological repeats were carried out for both strains, with each repeat measured as technical triplicates. Error bars represent standard error of the biological replicates.(G) Boxplot showing resistance to 3mM H2O2 grouped by pyk1 allele for 156 strains from our collection. The T-strains had a higher mean fitness in H2O2 than the A-strains (1.01±0.06 vs 0.95±0.11; p=0.0021, Welch's t-test). The resistance score was obtained as for antimycin A.(H) Boxplot showing growth fitness on rich media, grouped by pyk1 allele for 158 S. pombe strains (0.88±0.16 vs 0.94±0.24; p=0.18, Welch's t-test)."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Log", "(", "odds", "enrichment", ")", "scores", "for", "charged", "GKs", "in", "the", "flanks", "of", "the", "30", "%", "strongest", "versus", "the", "30", "%", "weakest", "APRs", "in", "the", "E", ".", "coli", "cytoplasmic", "proteome", ".", "Whiskers", "indicate", "95", "%", "confidence", "intervals", "for", "no", "enrichment", "as", "determined", "through", "bootstrapping", "analysis", ".", "C", ")", "Percentual", "difference", "in", "non", "-", "synonymous", "mutation", "rate", "in", "E", ".", "coli", "for", "GK", "versus", "background", "i", ".", "e", ".", "versus", "the", "corresponding", "residue", "in", "non", "-", "gatekeeper", "positions", ".", "D", ")", "Percentual", "difference", "in", "non", "-", "synonymous", "mutation", "rate", "in", "mammalian", "species", "for", "GK", "versus", "background", "i", ".", "e", ".", "versus", "the", "corresponding", "residue", "in", "non", "-", "gatekeeper", "positions", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Log(odds enrichment) scores for charged GKs in the flanks of the 30 % strongest versus the 30 % weakest APRs in the E. coli cytoplasmic proteome. Whiskers indicate 95 % confidence intervals for no enrichment as determined through bootstrapping analysis.C) Percentual difference in non-synonymous mutation rate in E. coli for GK versus background i.e. versus the corresponding residue in non-gatekeeper positions.D) Percentual difference in non-synonymous mutation rate in mammalian species for GK versus background i.e. versus the corresponding residue in non-gatekeeper positions."}
{"words": ["Figure", "3B", ")", "Time", "-", "resolved", "Dynamic", "Light", "Scattering", "(", "DLS", ")", "analysis", "indicating", "average", "particle", "size", "over", "time", "for", "each", "of", "the", "peptides", "in", "the", "β", "-", "Gal", "peptide", "set", "(", "aggregating", "core", "sequence", "SVIIWSLGN", ")", ".", "C", ")", "ThT", "binding", "kinetics", "of", "the", "β", "-", "Gal", "peptide", "set", ".", "Background", "-", "corrected", "fluorescence", "over", "time", "is", "shown", "for", "3", "independent", "repeats", ".", "D", ")", "pFTAA", "binding", "kinetics", "of", "the", "β", "-", "Gal", "peptide", "set", ".", "Background", "-", "corrected", "fluorescence", "over", "time", "is", "shown", "for", "3", "independent", "repeats", ".", "E", ")", "End", "-", "point", "solubility", "analysis", "quantifying", "the", "concentration", "of", "peptide", "remaining", "in", "the", "supernatant", "following", "ultracentrifugation", "for", "the", "β", "-", "Gal", "peptide", "set", ".", "Bars", "depict", "mean", "concentration", ",", "whiskers", "indicate", "standard", "deviation", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "through", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", ".", "P", "-", "values", "for", "significant", "differences", "are", "indicated", ".", "F", ")", "TEM", "images", "of", "the", "β", "-", "Gal", "peptide", "set", "after", "3", "days", "incubation", ".", "Top", "panels", "give", "an", "overview", "image", "of", "one", "square", "in", "a", "TEM", "grid", ",", "lower", "panel", "shows", "enlarged", "image", "(", "magnification", "12000X", ")", ".", "Scale", "bars", "indicate", "12", "µm", "(", "top", "row", ")", "or", "1", "µm", "(", "bottom", "row", ")", ".", "H", ")", "Violin", "and", "boxplots", "showing", "the", "distribution", "of", "end", "-", "point", "solubilities", "across", "11", "aggregating", "cores", ",", "grouped", "by", "GK", ".", "The", "dotted", "line", "indicates", "a", "concentration", "of", "µM", ",", "corresponding", "to", "completely", "insoluble", "peptides", ".", "I", ")", "Solubility", "analysis", "of", "the", "in", "vitro", "solubility", "screen", "performed", "by", "Niwa", "et", "al", "(", "Niwa", "et", "al", ",", "2009", ")", ".", "Left", "panel", "shows", "combined", "box", "-", "and", "violin", "plots", "depicting", "the", "solubility", "distributions", "of", "proteins", "containing", "at", "least", "one", "strong", "APR", "(", "TANGO", "score", ">", "70", ")", "not", "protected", "by", "any", "negative", "GKs", "(", "red", ")", "versus", "proteins", "where", "all", "strong", "APRs", "are", "flanked", "by", "at", "least", "one", "negative", "charge", "(", "blue", ")", ".", "The", "right", "panel", "shows", "a", "control", "analysis", ",", "in", "which", "proteins", "were", "classified", "by", "the", "occurrence", "of", "at", "least", "one", "strong", "APR", "(", "TANGO", "score", ">", "70", ")", "not", "flanked", "by", "any", "positive", "GKs", "(", "red", ")", "versus", "proteins", "where", "all", "strong", "APRs", "are", "flanked", "by", "at", "least", "one", "positive", "charge", "(", "blue", ")", ".", "The", "upper", "boxplot", "whiskers", "indicate", "the", "largest", "value", "no", "further", "than", "1", ".", "5", "times", "the", "Inter", "-", "Quartile", "Range", "(", "IQR", ")", "from", "the", "upper", "hinge", ",", "the", "lower", "whiskers", "show", "the", "smallest", "value", "at", "least", "1", ".", "5", "*", "IQR", "from", "the", "lower", "hinge", ".", "Notches", "extend", "1", ".", "58", "*", "IQR", "/", "sqrt", "(", "n", ")", "from", "either", "side", "of", "the", "median", "and", "represent", "a", "95", "%", "confidence", "interval", "for", "the", "median", "value", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "through", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "a", "post", "-", "hoc", "Wilcoxon", "analysis", "for", "pairwise", "testing", ".", "P", "-", "values", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B) Time-resolved Dynamic Light Scattering (DLS) analysis indicating average particle size over time for each of the peptides in the β-Gal peptide set (aggregating core sequence SVIIWSLGN).C) ThT binding kinetics of the β-Gal peptide set. Background-corrected fluorescence over time is shown for 3 independent repeats.D) pFTAA binding kinetics of the β-Gal peptide set. Background-corrected fluorescence over time is shown for 3 independent repeats.E) End-point solubility analysis quantifying the concentration of peptide remaining in the supernatant following ultracentrifugation for the β-Gal peptide set. Bars depict mean concentration, whiskers indicate standard deviation (n=4). Statistical significance was determined through two-way ANOVA with Bonferroni's correction for multiple comparisons. P-values for significant differences are indicated.F) TEM images of the β-Gal peptide set after 3 days incubation. Top panels give an overview image of one square in a TEM grid, lower panel shows enlarged image (magnification 12000X). Scale bars indicate 12 µm (top row) or 1 µm (bottom row).H) Violin and boxplots showing the distribution of end-point solubilities across 11 aggregating cores, grouped by GK. The dotted line indicates a concentration of µM, corresponding to completely insoluble peptides.I) Solubility analysis of the in vitro solubility screen performed by Niwa et al (Niwa et al, 2009). Left panel shows combined box- and violin plots depicting the solubility distributions of proteins containing at least one strong APR (TANGO score > 70) not protected by any negative GKs (red) versus proteins where all strong APRs are flanked by at least one negative charge (blue). The right panel shows a control analysis, in which proteins were classified by the occurrence of at least one strong APR (TANGO score > 70) not flanked by any positive GKs (red) versus proteins where all strong APRs are flanked by at least one positive charge (blue). The upper boxplot whiskers indicate the largest value no further than 1.5 times the Inter-Quartile Range (IQR) from the upper hinge, the lower whiskers show the smallest value at least 1.5 * IQR from the lower hinge. Notches extend 1.58 * IQR / sqrt(n) from either side of the median and represent a 95% confidence interval for the median value. Statistical significance was determined through Kruskal-Wallis test with a post-hoc Wilcoxon analysis for pairwise testing. P-values are indicated."}
{"words": ["Figure", "4D", ")", "Time", "-", "resolved", "Dynamic", "Light", "Scattering", "(", "DLS", ")", "analysis", "showing", "average", "particle", "radius", "over", "time", "for", "the", "β", "-", "Gal", "peptides", "flanked", "by", "both", "natural", "and", "non", "-", "natural", "GKs", ",", "at", "increasing", "NaCl", "concentrations", "(", "indicated", "in", "µM", ")", ".", "Structures", "of", "the", "amino", "acids", "flanking", "the", "aggregating", "core", "are", "indicated", "on", "the", "right", "-", "hand", "side", ",", "the", "sequence", "of", "the", "aggregating", "core", "is", "indicated", "below", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D) Time-resolved Dynamic Light Scattering (DLS) analysis showing average particle radius over time for the β-Gal peptides flanked by both natural and non-natural GKs, at increasing NaCl concentrations (indicated in µM). Structures of the amino acids flanking the aggregating core are indicated on the right-hand side, the sequence of the aggregating core is indicated below."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "DnaK", "binding", "to", "cellulose", "-", "bound", "peptide", "array", ".", "Sequences", "of", "the", "aggregating", "cores", "are", "indicated", "in", "the", "top", "of", "the", "panel", ",", "the", "GKs", "flanking", "them", "in", "each", "instance", "are", "indicated", "above", "the", "blots", ".", "C", ")", "Representative", "Western", "blot", "of", "in", "vitro", "translation", "analysis", "of", "folding", "-", "incompetent", "model", "constructs", ".", "Bands", "show", "Total", "(", "T", ")", "and", "Soluble", "(", "S", ")", "fractions", "after", "centrifugation", "at", "21", ",", "000", "g", "for", "30", "mins", ".", "\"", "+", "Dnak", "\"", "indicates", "addition", "of", "either", "DnaK", "mix", "-", "containing", "DnaK", ",", "DnaJ", "and", "GrpE", ".", "D", ")", "Bar", "plots", "showing", "mean", "solubility", "as", "determined", "through", "quantification", "of", "western", "blot", "in", "(", "C", ")", ",", "whiskers", "indicate", "standard", "deviation", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Statistically", "significant", "differences", "between", "the", "-", "DnaK", "and", "+", "DnaK", "conditions", "were", "determined", "through", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", ".", "P", "-", "values", "for", "significant", "differences", "are", "indicated", ".", "E", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "the", "solubility", "analysis", "of", "GK", "variants", "upon", "overexpression", "in", "E", ".", "coli", "K12", ".", "Bands", "show", "Soluble", "(", "Sol", ")", "and", "Pellet", "fractions", "after", "centrifugation", "at", "17", ",", "100", "g", "for", "15", "mins", ".", "\"", "-", "DnaK", "\"", "indicates", "expression", "in", "E", ".", "coli", "K12", "DnaK", "knockout", "line", ",", "\"", "+", "Dnak", "\"", "indicates", "co", "-", "expression", "of", "pKJE7", ",", "encoding", "DnaK", ",", "DnaJ", "and", "GrpE", ".", "F", ")", "Barplots", "showing", "mean", "solubility", "as", "determined", "through", "quantification", "of", "western", "blot", "bands", "in", "(", "E", ")", ",", "whiskers", "indicate", "standard", "deviation", "(", "n", "=", "7", ",", "except", "for", "the", "AA", "construct", ",", "where", "n", "=", "4", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "through", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "P", "-", "values", "are", "indicated", ".", "G", ")", "Structured", "Illumination", "Microsopy", "(", "SIM", ")", "images", "of", "E", ".", "coli", "after", "three", "hours", "of", "expression", "of", "one", "of", "the", "GK", "variants", ".", "GFP", "fluorescence", "is", "shown", "in", "green", ".", "\"", "ΔDnaK", "\"", "indicates", "expression", "in", "E", ".", "coli", "K12", "DnaK", "knockout", "line", ",", "\"", "+", "Dnak", "\"", "indicates", "co", "-", "expression", "of", "pKJE7", ",", "encoding", "DnaK", ",", "DnaJ", "and", "GrpE", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) DnaK binding to cellulose-bound peptide array. Sequences of the aggregating cores are indicated in the top of the panel, the GKs flanking them in each instance are indicated above the blots.C) Representative Western blot of in vitro translation analysis of folding-incompetent model constructs. Bands show Total (T) and Soluble (S) fractions after centrifugation at 21,000 g for 30 mins. \"+ Dnak\" indicates addition of either DnaK mix - containing DnaK, DnaJ and GrpE.D) Bar plots showing mean solubility as determined through quantification of western blot in (C), whiskers indicate standard deviation (n=4). Statistically significant differences between the -DnaK and +DnaK conditions were determined through two-way ANOVA with Bonferroni's correction for multiple comparisons. P-values for significant differences are indicated.E) Representative western blot of the solubility analysis of GK variants upon overexpression in E. coli K12. Bands show Soluble (Sol) and Pellet fractions after centrifugation at 17,100 g for 15 mins. \"-DnaK\" indicates expression in E. coli K12 DnaK knockout line, \"+ Dnak\" indicates co-expression of pKJE7, encoding DnaK, DnaJ and GrpE.F) Barplots showing mean solubility as determined through quantification of western blot bands in (E), whiskers indicate standard deviation (n=7, except for the AA construct, where n=4). Statistical significance was determined through two-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons test. P-values are indicated.G) Structured Illumination Microsopy (SIM) images of E. coli after three hours of expression of one of the GK variants. GFP fluorescence is shown in green. \"ΔDnaK\" indicates expression in E. coli K12 DnaK knockout line, \"+ Dnak\" indicates co-expression of pKJE7, encoding DnaK, DnaJ and GrpE."}
{"words": ["Figure", "1Plasma", "corticosterone", "levels", "at", "baseline", ",", "30", "minutes", "after", "induction", "of", "stress", "by", "placing", "mice", "in", "a", "clean", "cage", ",", "and", "after", "90", "minutes", "upon", "return", "in", "the", "home", "cage", ".", "DEX", "mice", "received", "an", "injection", "of", "dexamethasone", "at", "0", ".", "1", "mg", "/", "kg", "body", "weight", "150", "minutes", "before", "collecting", "the", "first", "blood", "sample", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "Flox", "and", "GRBATKO", "mice", "were", "injected", "with", "0", ".", "02", "mg", "/", "kg", "dexamethasone", "and", "the", "procedure", "described", "in", "(", "A", ")", "was", "followed", "to", "induce", "stress", "in", "order", "to", "detect", "potential", "differences", "between", "Flox", "and", "GRBATKO", "mice", "which", "could", "have", "been", "obscured", "by", "the", "higher", "concentration", "used", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "6", "-", "7", "animals", "per", "group", ")", ".", "GR", "mRNA", "levels", "in", "BAT", "of", "Flox", "and", "GRBATKO", "mice", ".", "Organs", "were", "harvested", "in", "the", "stressed", "condition", "after", "placing", "mice", "for", "30", "minutes", "in", "a", "clean", "cage", ".", "Half", "of", "the", "animals", "received", "a", "dexamethasone", "injection", "180", "minutes", "before", "onset", "of", "the", "procedure", ",", "controls", "received", "an", "injection", "with", "saline", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "Serum", "corticosterone", "levels", "under", "stressed", "conditions", "in", "Flox", "and", "GRBATKO", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "Blood", "glucose", "levels", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "animals", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Plasma corticosterone levels at baseline, 30 minutes after induction of stress by placing mice in a clean cage, and after 90 minutes upon return in the home cage. DEX mice received an injection of dexamethasone at 0.1 mg/kg body weight 150 minutes before collecting the first blood sample (n = 5-6 animals per group). Flox and GRBATKO mice were injected with 0.02 mg/kg dexamethasone and the procedure described in (A) was followed to induce stress in order to detect potential differences between Flox and GRBATKO mice which could have been obscured by the higher concentration used in (A) (n = 6-7 animals per group).GR mRNA levels in BAT of Flox and GRBATKO mice. Organs were harvested in the stressed condition after placing mice for 30 minutes in a clean cage. Half of the animals received a dexamethasone injection 180 minutes before onset of the procedure, controls received an injection with saline (n = 5-6 animals per group).Serum corticosterone levels under stressed conditions in Flox and GRBATKO mice (n = 5-6 animals per group). Blood glucose levels (n = 5-6 animals per group)."}
{"words": ["Figure", "2Knockdown", "of", "GR", "in", "BAT", "assessed", "by", "immunoblotting", ".", "Β", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Quantification", "of", "immunoblot", "in", "(", "A", ")", "using", "Image", "Lab", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "Body", "temperature", "over", "the", "course", "of", "the", "cold", "exposure", ",", "determined", "daily", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "Body", "weight", "at", "the", "end", "of", "the", "cold", "exposure", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "BAT", "weight", "at", "the", "end", "of", "the", "cold", "exposure", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "Representative", "Hematoxilin", "and", "eosin", "staining", "image", "of", "BAT", "of", "cold", "-", "exposed", "Flox", "and", "GRBATKO", "mice", ".", "Scale", "bar", "50", "µm", ".", "Triglyceride", "content", "in", "BAT", "from", "Flox", "and", "GRBATKO", "animals", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "Heatmap", "of", "mean", "gene", "expression", "fold", "changes", "in", "thermogenic", "marker", "genes", "based", "on", "BAT", "microarray", "analysis", "comparing", "GRBATKO", "vs", "Flox", "control", "animals", ",", "indicating", "unchanged", "thermogenic", "marker", "gene", "expression", ".", "Color", "gradient", "ranges", "from", "2", "-", "fold", "higher", "expression", "in", "GRBATKO", "over", "Flox", "controls", "(", "red", ")", "to", "0", ".", "1", "-", "fold", "(", "lower", ")", "expression", "(", "blue", ")", "(", "n", "=", "4", "animals", "per", "group", ")", ".", "Volcano", "plot", "from", "microarray", "gene", "expression", "data", "as", "in", "(", "I", ")", ",", "with", "cut", "-", "off", "values", "for", "the", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "1", "and", "fold", "change", ">", "1", ".", "5", ".", "Serum", "corticosterone", "levels", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Knockdown of GR in BAT assessed by immunoblotting. Β-Tubulin was used as loading control. Quantification of immunoblot in (A) using Image Lab (n = 6 animals per group).Body temperature over the course of the cold exposure, determined daily (n = 6 animals per group).Body weight at the end of the cold exposure (n = 6 animals per group).BAT weight at the end of the cold exposure (n = 6 animals per group).Representative Hematoxilin and eosin staining image of BAT of cold-exposed Flox and GRBATKO mice. Scale bar 50 µm.Triglyceride content in BAT from Flox and GRBATKO animals (n = 5-6 animals per group).Heatmap of mean gene expression fold changes in thermogenic marker genes based on BAT microarray analysis comparing GRBATKO vs Flox control animals, indicating unchanged thermogenic marker gene expression. Color gradient ranges from 2-fold higher expression in GRBATKO over Flox controls (red) to 0.1-fold (lower) expression (blue) (n = 4 animals per group).Volcano plot from microarray gene expression data as in (I), with cut-off values for the adjusted p-value <0.1 and fold change >1.5.Serum corticosterone levels (n = 6 animals per group)."}
{"words": ["Figure", "3Body", "weight", "after", "16", "h", "fasting", "and", "6", "h", "chow", "refeeding", "at", "22", "°", "C", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", "Body", "temperature", "assessed", "after", "16", "h", "fasting", "and", "subsequent", "refeeding", "for", "6", "h", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "Blood", "glucose", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "Serum", "insulin", "and", "corticosterone", "levels", "determined", "by", "ELISA", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "Serum", "NEFA", "and", "triglycerides", "concentration", "in", "Flox", "and", "GRBATKO", "mice", "after", "fasting", "and", "refeeding", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Body weight after 16 h fasting and 6 h chow refeeding at 22°C (n = 6 animals per group)Body temperature assessed after 16 h fasting and subsequent refeeding for 6 h (n = 6 animals per group).Blood glucose (n = 6 per group).Serum insulin and corticosterone levels determined by ELISA (n = 6 animals per group).Serum NEFA and triglycerides concentration in Flox and GRBATKO mice after fasting and refeeding (n = 6 animals per group)."}
{"words": ["Figure", "4Body", "weight", "gain", "over", "a", "24", "-", "week", "period", "of", "high", "-", "fat", "feeding", "(", "n", "=", "13", "-", "14", "animals", "per", "group", ")", ".", "Panel", "shows", "experimental", "design", "for", "Figures", "4", "-", "6", ".", "Oxygen", "consumption", "over", "a", "90", "-", "hour", "period", ".", "Grays", "columns", "indicate", "dark", "phase", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "mice", "per", "group", ")", ".", "Average", "oxygen", "consumption", "specified", "for", "light", "phase", ",", "dark", "phase", ",", "and", "total", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "animals", "per", "genotype", ")", ".", "Total", "oxygen", "consumption", "plotted", "against", "body", "weight", "indicating", "that", "lower", "energy", "expenditure", "in", "GRBATKO", "animals", "is", "independent", "of", "body", "weight", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "animals", "per", "group", ")", ".", "Locomotor", "activity", "over", "a", "90", "-", "hour", "period", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "animals", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Body weight gain over a 24-week period of high-fat feeding (n = 13-14 animals per group). Panel shows experimental design for Figures 4-6.Oxygen consumption over a 90-hour period. Grays columns indicate dark phase (n = 6-8 mice per group). Average oxygen consumption specified for light phase, dark phase, and total (n = 6-8 animals per genotype).Total oxygen consumption plotted against body weight indicating that lower energy expenditure in GRBATKO animals is independent of body weight (n = 6-8 animals per group).Locomotor activity over a 90-hour period (n = 6-8 animals per group)."}
{"words": ["Figure", "5Intraperitoneal", "GTT", "after", "19", "weeks", "of", "HFD", "-", "feeding", ",", "glucose", "injections", "at", "1", ".", "5", "mg", "per", "g", "of", "body", "weight", "(", "n", "=", "11", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "Area", "under", "the", "curve", "calculated", "from", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "11", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "Plasma", "insulin", "levels", "during", "GTT", "(", "n", "=", "11", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "Intraperitoneal", "ITT", "after", "20", "weeks", "of", "high", "-", "fat", "diet", "intervention", ".", "Insulin", "was", "adjusted", "to", "1", "mU", "per", "g", "of", "body", "weight", "(", "n", "=", "11", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "Area", "under", "the", "curve", "determined", "from", "(", "D", ")", "(", "n", "=", "11", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "Plasma", "insulin", "levels", "after", "a", "5", "-", "hour", "fast", ",", "before", "injecting", "insulin", "(", "n", "=", "11", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Intraperitoneal GTT after 19 weeks of HFD-feeding, glucose injections at 1.5 mg per g of body weight (n = 11-13 animals per group). Area under the curve calculated from (A) (n = 11-13 animals per group).Plasma insulin levels during GTT (n = 11-13 animals per group).Intraperitoneal ITT after 20 weeks of high-fat diet intervention. Insulin was adjusted to 1 mU per g of body weight (n = 11-13 animals per group). Area under the curve determined from (D) (n = 11-13 animals per group).Plasma insulin levels after a 5-hour fast, before injecting insulin (n = 11-13 animals per group)."}
{"words": ["Figure", "6Body", "weight", "in", "Flox", "and", "GRBATKO", "after", "24", "weeks", "of", "high", "-", "fat", "feeding", "(", "n", "=", "10", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "BAT", "and", "iWAT", "weight", "in", "Flox", "and", "GRBATKO", "mice", "fed", "HFD", "for", "24", "weeks", "(", "n", "=", "10", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "GR", "levels", "in", "BAT", "after", "24", "weeks", "high", "-", "fat", "feeding", "(", "n", "=", "10", "-", "13", "mice", "per", "group", ")", ".", "Representative", "H", "&", "E", "stained", "sections", "of", "BAT", "from", "Flox", "and", "GRBATKO", "animals", ".", "Scale", "bar", "100", "µm", ".", "Triglyceride", "content", "in", "BAT", "per", "gram", "of", "wet", "tissue", "(", "n", "=", "10", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "thermogenic", "marker", "gene", "expression", "in", "BAT", "of", "Flox", "and", "GRBATKO", "mice", "after", "high", "-", "fat", "feeding", "(", "n", "=", "9", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "Representative", "immunohistochemistry", "for", "UCP1", "in", "BAT", ".", "Scale", "bar", "100", "µm", ".", "Serum", "insulin", "levels", "determined", "by", "ELISA", "(", "n", "=", "10", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", ".", "Blood", "glucose", "in", "Flox", "and", "GRBATKO", "animals", "after", "24", "weeks", "HFD", "(", "n", "=", "10", "-", "13", "animals", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Body weight in Flox and GRBATKO after 24 weeks of high-fat feeding (n = 10-13 animals per group).BAT and iWAT weight in Flox and GRBATKO mice fed HFD for 24 weeks (n = 10-13 animals per group).GR levels in BAT after 24 weeks high-fat feeding (n=10-13 mice per group).Representative H&E stained sections of BAT from Flox and GRBATKO animals. Scale bar 100 µm.Triglyceride content in BAT per gram of wet tissue (n = 10-13 animals per group).qRT-PCR analysis of thermogenic marker gene expression in BAT of Flox and GRBATKO mice after high-fat feeding (n = 9-13 animals per group).Representative immunohistochemistry for UCP1 in BAT. Scale bar 100 µm.Serum insulin levels determined by ELISA (n = 10-13 animals per group).Blood glucose in Flox and GRBATKO animals after 24 weeks HFD (n = 10-13 animals per group)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Heat", "map", "representation", "of", "the", "TNF", "-", "α", "-", "up", "-", "regulated", "genes", ".", "Genes", "were", "classified", "based", "on", "the", "TNF", "-", "α", "-", "treated", "time", "points", ",", "using", "the", "algorithm", "\"", "HOPACH", "\"", ".", "(", "B", ")", "Heat", "map", "showing", "down", "-", "regulated", "miRNAs", "at", "4", "hrs", ",", "but", "not", "24", "hrs", ",", "after", "TNF", "-", "α", "treatment", ".", "The", "middle", "column", "indicates", "the", "fold", "-", "change", "values", "(", "control", "/", "TNF", ")", "at", "4", "hrs", ".", "The", "right", "column", "indicates", "the", "relative", "expression", "level", "of", "each", "miRNA", "from", "the", "FANTOM5", "database", "(", "Consortium", "et", "al", ",", "2014", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "the", "top", "three", "most", "down", "-", "regulated", "miRNAs", "which", "were", "reported", "to", "be", "expressed", "in", "human", "endothelial", "cells", "(", "ECs", ")", "according", "to", "the", "FANTOM5", "database", ".", "(", "C", ")", "Bar", "plots", "showing", "mean", "mRNA", "levels", "of", "vascular", "cell", "adhesion", "molecule", "-", "1", "(", "VCAM1", ")", ",", "intracellular", "adhesion", "molecule", "-", "1", "(", "ICAM1", ")", ",", "and", "E", "-", "selectin", "(", "SELE", ")", ",", "measured", "4", "hrs", "after", "stimulation", "of", "human", "ECs", "with", "or", "without", "TNF", "-", "α", "±", "miR", "-", "3679", "-", "5p", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SE", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", "mimics", "(", "-", ")", ".", "†", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "‡", "P", "=", "0", ".", "203", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "mimics", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Tukey", "-", "Kramer", "test", ".", "(", "D", ")", "Western", "blots", "for", "VCAM1", ",", "ICAM", ",", "SELE", ",", "and", "β", "-", "actin", "(", "ACTB", ")", "in", "lysates", "from", "ECs", "treated", "with", "or", "without", "TNF", "-", "α", "(", "4", "hrs", ")", "±", "miR", "-", "3679", "-", "5p", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "(", "top", ")", "and", "bar", "plot", "quantification", "(", "bottom", ")", "showing", "the", "adhesion", "of", "calcein", "-", "labeled", "U937", "monocytes", "to", "ECs", "treated", "with", "or", "without", "TNF", "-", "α", "±", "miR", "-", "3679", "-", "5p", ".", "Scale", "bar", "represents", "250", "μm", ".", "Graphs", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", "mimics", "(", "-", ")", ".", "†", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "mimics", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Tukey", "-", "Kramer", "test", ".", "(", "F", ")", "The", "scatter", "plot", "shows", "the", "correlation", "of", "RNA", "immunoprecipitation", "(", "RIP", ")", "　", "followed", "by", "microarray", "data", "from", "two", "replicate", "screens", "for", "the", "identification", "of", "miR", "-", "3679", "-", "5p", "target", "genes", ".", "Genes", "up", "-", "and", "down", "-", "regulated", "by", "miR", "-", "3679", "-", "5p", "treatment", "(", "|", "average", "Log2FC", "|", ">", "1", ")", "are", "indicated", "in", "red", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "(", "J", "and", "K", ")", "Effect", "of", "miR", "-", "3679", "-", "5p", "mimics", "(", "J", ")", "or", "miR", "-", "3679", "-", "5p", "inhibitor", "(", "K", ")", "on", "luciferase", "activity", "in", "pmirGLO", "-", "transfected", "ECs", "expressing", "the", "3", "′", "UTR", "of", "KDM7A", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SE", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "control", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "M", "and", "N", ")", "The", "effect", "of", "miR", "-", "3679", "-", "5p", "mimics", "(", "M", ")", "or", "miR", "-", "3679", "-", "5p", "inhibitor", "(", "N", ")", "on", "luciferase", "activity", "in", "pmirGLO", "-", "transfected", "ECs", "expressing", "the", "3", "′", "UTR", "of", "UTX", "was", "measured", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SE", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "control", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Heat map representation of the TNF-α-up-regulated genes. Genes were classified based on the TNF-α-treated time points, using the algorithm \"HOPACH\".(B) Heat map showing down-regulated miRNAs at 4 hrs, but not 24 hrs, after TNF-α treatment. The middle column indicates the fold-change values (control/TNF) at 4 hrs. The right column indicates the relative expression level of each miRNA from the FANTOM5 database (Consortium et al, 2014). Asterisks indicate the top three most down-regulated miRNAs which were reported to be expressed in human endothelial cells (ECs) according to the FANTOM5 database.(C) Bar plots showing mean mRNA levels of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM1), intracellular adhesion molecule-1 (ICAM1), and E-selectin (SELE), measured 4 hrs after stimulation of human ECs with or without TNF-α ± miR-3679-5p. Data are shown as means ± SE (n=3). *P < 0.05 compared to TNF-α (-) mimics (-). † P < 0.05 and ‡ P = 0.203 compared to TNF-α (+) mimics (-). Statistical differences were analyzed by the Tukey-Kramer test.(D) Western blots for VCAM1, ICAM, SELE, and β-actin (ACTB) in lysates from ECs treated with or without TNF-α (4 hrs) ± miR-3679-5p.(E) Representative images (top) and bar plot quantification (bottom) showing the adhesion of calcein-labeled U937 monocytes to ECs treated with or without TNF-α ± miR-3679-5p. Scale bar represents 250 μm. Graphs are representative of three independent experiments. Data are shown as means ± SD. *P < 0.05 compared to TNF-α (-) mimics (-). † P < 0.05 compared to TNF-α (+) mimics (-). Statistical differences were analyzed by the Tukey-Kramer test.(F) The scatter plot shows the correlation of RNA immunoprecipitation (RIP)　followed by microarray data from two replicate screens for the identification of miR-3679-5p target genes. Genes up- and down-regulated by miR-3679-5p treatment (|average Log2FC|>1) are indicated in red and blue, respectively.(J and K) Effect of miR-3679-5p mimics (J) or miR-3679-5p inhibitor (K) on luciferase activity in pmirGLO-transfected ECs expressing the 3′ UTR of KDM7A. Data are shown as means ± SE (n=3). *P < 0.05 compared to control. Statistical differences were analyzed by the Student's t test.(M and N) The effect of miR-3679-5p mimics (M) or miR-3679-5p inhibitor (N) on luciferase activity in pmirGLO-transfected ECs expressing the 3′ UTR of UTX was measured. Data are shown as means ± SE (n=3). *P < 0.05 compared to control. Statistical differences were analyzed by the Student's t test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Heat", "map", "representation", "of", "RNA", "-", "seq", "results", ".", "The", "p65", "-", "dependent", "genes", "(", "total", "123", ";", "defined", "as", "genes", "up", "-", "regulated", "more", "than", "2", "-", "fold", "via", "TNF", "-", "α", "treatment", "and", "down", "-", "regulated", "more", "than", "0", ".", "75", "-", "fold", "via", "BAY", "11", "-", "7082", "treatment", ")", "were", "classified", "based", "on", "the", "alteration", "patterns", "by", "the", "siRNA", "knockdown", "of", "KDM7A", ",", "UTX", ",", "and", "both", ",", "using", "the", "algorithm", "\"", "HOPACH", "\"", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "Bar", "plot", "showing", "mean", "mRNA", "levels", "of", "VCAM1", ",", "ICAM1", ",", "and", "SELE", "measured", "4", "hrs", "after", "stimulation", "of", "ECs", "with", "or", "without", "TNF", "-", "α", "±", "(", "siKDM7A", "+", "siUTX", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SE", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", "siKDM7A", "+", "siUTX", "(", "-", ")", ".", "†", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "siKDM7A", "+", "siUTX", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Tukey", "-", "Kramer", "test", ".", "(", "F", ")", "Western", "blots", "for", "VCAM1", ",", "ICAM", ",", "SELE", ",", "and", "ACTB", "in", "lysates", "from", "ECs", "treated", "with", "or", "without", "TNF", "-", "α", "(", "4", "hrs", ")", "±", "(", "siKDM7A", "+", "siUTX", ")", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "(", "top", ")", "and", "bar", "plot", "quantification", "(", "bottom", ")", "showing", "the", "adhesion", "of", "calcein", "-", "labeled", "U937", "monocytes", "to", "ECs", "treated", "with", "or", "without", "TNF", "-", "α", "±", "(", "siKDM7A", "+", "siUTX", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "250", "μm", ".", "Graphs", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", "siKDM7A", "+", "siUTX", "(", "-", ")", ".", "†", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "siKDM7A", "+", "siUTX", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Tukey", "-", "Kramer", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Heat map representation of RNA-seq results. The p65-dependent genes (total 123; defined as genes up-regulated more than 2-fold via TNF-α treatment and down-regulated more than 0.75-fold via BAY 11-7082 treatment) were classified based on the alteration patterns by the siRNA knockdown of KDM7A, UTX, and both, using the algorithm \"HOPACH\".(C-E) Bar plot showing mean mRNA levels of VCAM1, ICAM1, and SELE measured 4 hrs after stimulation of ECs with or without TNF-α ± (siKDM7A+siUTX). Data are shown as means ± SE (n=3). *P < 0.05 compared to TNF-α (-) siKDM7A+siUTX (-). † P < 0.05 compared to TNF-α (+) siKDM7A+siUTX (-). Statistical differences were analyzed by the Tukey-Kramer test.(F) Western blots for VCAM1, ICAM, SELE, and ACTB in lysates from ECs treated with or without TNF-α (4 hrs) ± (siKDM7A+siUTX).(G) Representative images (top) and bar plot quantification (bottom) showing the adhesion of calcein-labeled U937 monocytes to ECs treated with or without TNF-α ± (siKDM7A+siUTX). Scale bar represents 250 μm. Graphs are representative of three independent experiments. Data are shown as means ± SD. *P < 0.05 compared to TNF-α (-) siKDM7A+siUTX (-). † P < 0.05 compared to TNF-α (+) siKDM7A+siUTX (-). Statistical differences were analyzed by the Tukey-Kramer test."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "Scatter", "plots", "showing", "the", "connection", "between", "KDM7A", "or", "UTX", "binding", "and", "RNA", "expression", "in", "TNF", "-", "α", "-", "stimulated", "ECs", ".", "The", "X", "and", "Y", "axes", "indicate", "the", "log2", "ratio", "of", "fragments", "per", "kilobase", "of", "exon", "per", "million", "mapped", "sequence", "reads", "(", "FPKM", ")", "values", "and", "the", "ChIP", "-", "seq", "signals", "(", "TNF", "-", "α", "60min", "/", "0min", ")", "for", "KDM7A", "(", "A", ")", "and", "UTX", "(", "B", ")", ",", "respectively", ".", "Genes", "with", "more", "than", "a", "1", ".", "5", "-", "fold", "increase", "in", "FPKM", "values", "(", "light", "red", "dots", ")", "satisfying", "a", "0", ".", "5", "-", "fold", "increase", "in", "ChIP", "-", "seq", "signals", "are", "indicated", "as", "dark", "red", "dots", ".", "Genes", "with", "a", "1", ".", "5", "-", "fold", "decrease", "in", "FPKM", "values", "(", "light", "blue", "dots", ")", "satisfying", "a", "0", ".", "5", "-", "fold", "decrease", "in", "ChIP", "-", "seq", "signals", "are", "indicated", "as", "dark", "blue", "dots", ".", "These", "genes", "are", "defined", "as", "the", "target", "genes", "for", "KDM7A", "(", "A", ")", "and", "UTX", "(", "B", ")", ",", "respectively", ".", "The", "names", "of", "representative", "genes", "are", "shown", "in", "the", "graphs", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Metagene", "representations", "of", "KDM7A", "(", "C", ")", "and", "UTX", "(", "D", ")", "ChIP", "-", "seq", "signals", "in", "units", "of", "read", "count", "per", "million", "mapped", "reads", "at", "a", "meta", "composite", "of", "the", "genomic", "regions", "around", "the", "TNF", "-", "α", "-", "up", "-", "regulated", "genes", ".", "(", "F", ")", "Heat", "map", "of", "H3K27ac", "(", "green", ")", ",", "p65", "(", "yellow", ")", ",", "KDM7A", "(", "red", ")", ",", "and", "UTX", "(", "purple", ")", "levels", "in", "resting", "and", "TNF", "-", "α", "-", "stimulated", "ECs", ".", "Each", "row", "shows", "±", "10", "kb", "centered", "on", "the", "KDM7A", "(", "top", ")", "or", "UTX", "(", "bottom", ")", "peak", ".", "Rows", "are", "ordered", "by", "max", "KDM7A", "or", "UTX", "signal", "in", "each", "region", ".", "The", "ChIP", "-", "seq", "signal", "is", "depicted", "by", "color", "scaled", "intensities", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "Gene", "tracks", "of", "ChIP", "-", "seq", "signals", "for", "H3K27Ac", ",", "p65", ",", "KDM7A", ",", "and", "UTX", ",", "and", "RNA", "-", "seq", "signals", "around", "the", "VCAM1", "(", "G", ")", "and", "SELE", "(", "H", ")", "loci", "in", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", "and", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "ECs", ".", "ChIP", "-", "Seq", "and", "RNA", "-", "seq", "signals", "are", "visualized", "by", "Integrated", "Genome", "Viewer", "(", "http", ":", "/", "/", "software", ".", "broadinstitute", ".", "org", "/", "software", "/", "igv", "/", ")", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "of", "p65", "(", "I", ")", "and", "KDM7A", "(", "J", ")", "at", "the", "VCAM1", "TSS", ",", "normalized", "to", "input", ".", "Graphs", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", ".", "†", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "siKDM7A", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Tukey", "-", "Kramer", "test", ".", "(", "K", "and", "L", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "of", "p65", "(", "K", ")", "and", "UTX", "(", "L", ")", "at", "the", "SELE", "TSS", ",", "normalized", "to", "input", ".", "Graphs", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Tukey", "-", "Kramer", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A and B) Scatter plots showing the connection between KDM7A or UTX binding and RNA expression in TNF-α-stimulated ECs. The X and Y axes indicate the log2 ratio of fragments per kilobase of exon per million mapped sequence reads (FPKM) values and the ChIP-seq signals (TNF-α 60min/0min) for KDM7A (A) and UTX (B), respectively. Genes with more than a 1.5-fold increase in FPKM values (light red dots) satisfying a 0.5-fold increase in ChIP-seq signals are indicated as dark red dots. Genes with a 1.5-fold decrease in FPKM values (light blue dots) satisfying a 0.5-fold decrease in ChIP-seq signals are indicated as dark blue dots. These genes are defined as the target genes for KDM7A (A) and UTX (B), respectively. The names of representative genes are shown in the graphs.(C and D) Metagene representations of KDM7A (C) and UTX (D) ChIP-seq signals in units of read count per million mapped reads at a meta composite of the genomic regions around the TNF-α-up-regulated genes.(F) Heat map of H3K27ac (green), p65 (yellow), KDM7A (red), and UTX (purple) levels in resting and TNF-α-stimulated ECs. Each row shows ± 10 kb centered on the KDM7A (top) or UTX (bottom) peak. Rows are ordered by max KDM7A or UTX signal in each region. The ChIP-seq signal is depicted by color scaled intensities.(G and H) Gene tracks of ChIP-seq signals for H3K27Ac, p65, KDM7A, and UTX, and RNA-seq signals around the VCAM1 (G) and SELE (H) loci in TNF-α (-) and TNF-α (+) ECs. ChIP-Seq and RNA-seq signals are visualized by Integrated Genome Viewer (http://software.broadinstitute.org/software/igv/).(I and J) ChIP-qPCR of p65 (I) and KDM7A (J) at the VCAM1 TSS, normalized to input. Graphs are representative of three independent experiments. Data are shown as means ± SD. *P < 0.05 compared to TNF-α (-). † P < 0.05 compared to TNF-α (+) siKDM7A (-). Statistical differences were analyzed by the Tukey-Kramer test.(K and L) ChIP-qPCR of p65 (K) and UTX (L) at the SELE TSS, normalized to input. Graphs are representative of three independent experiments. Data are shown as means ± SD. *P < 0.05 compared to TNF-α (-). Statistical differences were analyzed by the Tukey-Kramer test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "and", "B", ")", "Boxplots", "of", "the", "log2", "fold", "change", "of", "ChIP", "-", "seq", "enrichment", "of", "H3K9me2", "in", "KDM7A", "target", "genes", "(", "A", ")", "and", "that", "of", "H3K27me3", "in", "UTX", "target", "genes", "(", "B", ")", "with", "TNF", "-", "α", "treatment", "(", "TNF", "+", ")", "and", "control", "(", "TNF", "-", ")", ".", "The", "horizontal", "line", "within", "the", "box", "represents", "the", "median", "sample", "value", ".", "The", "ends", "of", "the", "box", "represent", "the", "3rd", "and", "1st", "quantiles", ".", "The", "whiskers", "extend", "from", "the", "ends", "of", "the", "box", "to", "the", "outermost", "data", "point", "that", "falls", "within", "the", "distances", "computed", "as", "follows", ":", "3rd", "quartile", "+", "1", ".", "5", "*", "(", "interquartile", "range", ")", "and", "1st", "quartile", "-", "1", ".", "5", "*", "(", "interquartile", "range", ")", ".", "Each", "dot", "in", "the", "box", "plot", "shows", "data", "for", "one", "single", "target", "gene", ".", "Genes", "colored", "red", "represent", "the", "top", "five", "downregulated", "target", "genes", "with", "TNF", "-", "α", "-", "treatment", ",", "as", "compared", "to", "control", ".", "Graphs", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Gene", "tracks", "of", "ChIP", "-", "seq", "signals", "for", "H3K9me2", "and", "H3K27me3", "around", "the", "VCAM1", "locus", "in", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", "and", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "ECs", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "enrichment", "(", "percent", "input", ")", "of", "H3K9me2", "(", "D", ")", "and", "H3K27me3", "(", "E", ")", "around", "the", "VCAM1", "locus", ".", "Primer", "pairs", "targeting", "distinct", "regions", "are", "listed", "on", "the", "X", "axis", ".", "Graphs", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "F", ")", "Gene", "tracks", "of", "ChIP", "-", "seq", "signals", "for", "H3K9me2", "and", "H3K27me3", "around", "the", "SELE", "locus", "in", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", "and", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "ECs", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "enrichment", "(", "percent", "input", ")", "of", "H3K9me2", "(", "G", ")", "and", "H3K27me3", "(", "H", ")", "around", "the", "SELE", "locus", ".", "Primer", "pairs", "targeting", "distinct", "regions", "are", "listed", "on", "the", "X", "axis", ".", "Graphs", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "enrichment", "(", "percent", "input", ")", "of", "H3K9me2", "and", "H3K27me3", "around", "the", "HOXA13", "(", "I", ")", "and", "GATA4", "(", "J", ")", "loci", ".", "Graphs", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "K", "and", "L", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "enrichment", "(", "percent", "input", ")", "of", "H3K9me2", "around", "VCAM1", "-", "11kb", "(", "K", ")", "and", "H3K27me3", "around", "SELE", "-", "12kb", "(", "L", ")", ".", "Graphs", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", ".", "†", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "siKDM7A", "(", "-", ")", "or", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "siUTX", "(", "-", ")", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Tukey", "-", "Kramer", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A and B) Boxplots of the log2 fold change of ChIP-seq enrichment of H3K9me2 in KDM7A target genes (A) and that of H3K27me3 in UTX target genes (B) with TNF-α treatment (TNF+) and control (TNF-). The horizontal line within the box represents the median sample value. The ends of the box represent the 3rd and 1st quantiles. The whiskers extend from the ends of the box to the outermost data point that falls within the distances computed as follows: 3rd quartile + 1.5*(interquartile range) and 1st quartile - 1.5*(interquartile range). Each dot in the box plot shows data for one single target gene. Genes colored red represent the top five downregulated target genes with TNF-α-treatment, as compared to control. Graphs are representative of two independent experiments.(C) Gene tracks of ChIP-seq signals for H3K9me2 and H3K27me3 around the VCAM1 locus in TNF-α (-) and TNF-α (+) ECs.(D and E) ChIP-qPCR showing enrichment (percent input) of H3K9me2 (D) and H3K27me3 (E) around the VCAM1 locus. Primer pairs targeting distinct regions are listed on the X axis. Graphs are representative of three independent experiments. Data are shown as means ± SD. *P < 0.05 compared to TNF-α (-). Statistical differences were analyzed by the Student's t test.(F) Gene tracks of ChIP-seq signals for H3K9me2 and H3K27me3 around the SELE locus in TNF-α (-) and TNF-α (+) ECs.(G and H) ChIP-qPCR showing enrichment (percent input) of H3K9me2 (G) and H3K27me3 (H) around the SELE locus. Primer pairs targeting distinct regions are listed on the X axis. Graphs are representative of three independent experiments. Data are shown as means ± SD. *P < 0.05 compared to TNF-α (-). Statistical differences were analyzed by the Student's t test.(I and J) ChIP-qPCR showing enrichment (percent input) of H3K9me2 and H3K27me3 around the HOXA13 (I) and GATA4 (J) loci. Graphs are representative of three independent experiments. Data are shown as means ± SD. *P < 0.05 compared to TNF-α (-). Statistical differences were analyzed by the Student's t test.(K and L) ChIP-qPCR showing enrichment (percent input) of H3K9me2 around VCAM1 -11kb (K) and H3K27me3 around SELE -12kb (L). Graphs are representative of three independent experiments. Data are shown as means ± SD. *P < 0.05 compared to TNF-α (-). † P < 0.05 compared to TNF-α (+) siKDM7A (-) or TNF-α (+) siUTX (-). Statistical differences were analyzed by the Tukey-Kramer test."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Plot", "of", "enhancers", "defined", "in", "TNF", "-", "α", "-", "treated", "ECs", ",", "ranked", "by", "increasing", "bromodomain", "-", "containing", "protein", "4", "(", "BRD4", ")", "signal", ".", "Super", "enhancers", "(", "SEs", ")", "were", "defined", "by", "ROSE", "(", "Loven", "et", "al", ",", "2013", ",", "Whyte", "et", "al", ",", "2013", ")", ",", "based", "on", "the", "ChIP", "-", "Seq", "signals", "for", "BRD4", "(", "Brown", "et", "al", ",", "2014", ")", ".", "SEs", "are", "indicated", "by", "dashed", "lines", "and", "are", "colored", "yellow", ".", "The", "numbers", "show", "the", "total", "SEs", "and", "their", "classification", "based", "on", "KDM7A", "and", "UTX", "binding", ".", "Representative", "SE", "-", "related", "genes", "are", "indicated", "in", "the", "graph", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Metagene", "representations", "of", "KDM7A", "(", "B", ")", "and", "UTX", "(", "C", ")", "ChIP", "-", "seq", "signals", "in", "units", "of", "read", "count", "per", "million", "mapped", "reads", ",", "at", "a", "meta", "composite", "of", "SEs", "and", "typical", "enhancers", "(", "TEs", ")", ".", "TEs", "were", "obtained", "from", "the", "pre", "-", "compiled", "HUVEC", "ngsplotdb", "(", "https", ":", "/", "/", "github", ".", "com", "/", "shenlab", "-", "sinai", "/", "ngsplot", ")", ".", "(", "D", ")", "Pirate", "plots", "showing", "ChIA", "-", "PET", "interaction", "changes", "at", "control", "-", "specific", ",", "common", ",", "and", "TNF", "-", "α", "-", "specific", "SEs", ".", "The", "Y", "axis", "indicates", "the", "log2", "ratio", "of", "ChIA", "-", "PET", "signals", "(", "TNF", "-", "α", "60", "min", "/", "0", "min", ")", ".", "The", "central", "bar", "indicates", "the", "average", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Bean", "plots", "showing", "ChIA", "-", "PET", "interaction", "changes", "at", "KDM7A", "(", "E", ")", "and", "UTX", "(", "F", ")", "binding", "sites", ".", "The", "Y", "axis", "indicates", "the", "log2", "ratio", "of", "ChIA", "-", "PET", "signals", "(", "TNF", "-", "α", "60", "min", "/", "0", "min", ")", ".", "The", "central", "bar", "indicates", "the", "median", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "ChIA", "-", "PET", "interactions", "of", "active", "RNA", "pol", "II", "around", "the", "VCAM1", "(", "G", ")", "and", "IL8", "(", "H", ")", "loci", "integrated", "with", "the", "ChIP", "-", "seq", "profiles", "of", "KDM7A", ",", "UTX", ",", "and", "BRD4", ",", "and", "RNA", "-", "seq", "profiles", "in", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", "and", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "ECs", ".", "ChIA", "-", "PET", "interactions", "were", "visualized", "by", "the", "WashU", "Epigenome", "Browser", "(", "http", ":", "/", "/", "epigenomegateway", ".", "wustl", ".", "edu", "/", "browser", "/", ")", ".", "Interactions", "detected", "by", "ChIA", "-", "PET", "are", "depicted", "with", "purple", "lines", ".", "Red", "bars", "show", "TNF", "-", "α", "-", "specific", "SEs", ".", "(", "I", "-", "K", ")", "Gene", "tracks", "of", "ChIP", "-", "seq", "signals", "for", "H3K9me2", "and", "H3K27me3", "around", "VCAM1", "(", "I", ")", ",", "IL8", "(", "J", ")", ",", "and", "SELE", "(", "K", ")", "in", "TNF", "-", "α", "(", "-", ")", "and", "TNF", "-", "α", "(", "+", ")", "ECs", ".", "Red", "bars", "show", "TNF", "-", "α", "-", "specific", "SEs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Plot of enhancers defined in TNF-α-treated ECs, ranked by increasing bromodomain-containing protein 4 (BRD4) signal. Super enhancers (SEs) were defined by ROSE (Loven et al, 2013, Whyte et al, 2013), based on the ChIP-Seq signals for BRD4 (Brown et al, 2014). SEs are indicated by dashed lines and are colored yellow. The numbers show the total SEs and their classification based on KDM7A and UTX binding. Representative SE-related genes are indicated in the graph.(B and C) Metagene representations of KDM7A (B) and UTX (C) ChIP-seq signals in units of read count per million mapped reads, at a meta composite of SEs and typical enhancers (TEs). TEs were obtained from the pre-compiled HUVEC ngsplotdb (https://github.com/shenlab-sinai/ngsplot).(D) Pirate plots showing ChIA-PET interaction changes at control-specific, common, and TNF-α-specific SEs. The Y axis indicates the log2 ratio of ChIA-PET signals (TNF-α 60 min/0 min). The central bar indicates the average.(E and F) Bean plots showing ChIA-PET interaction changes at KDM7A (E) and UTX (F) binding sites. The Y axis indicates the log2 ratio of ChIA-PET signals (TNF-α 60 min/0 min). The central bar indicates the median.(G and H) ChIA-PET interactions of active RNA pol II around the VCAM1 (G) and IL8 (H) loci integrated with the ChIP-seq profiles of KDM7A, UTX, and BRD4, and RNA-seq profiles in TNF-α (-) and TNF-α (+) ECs. ChIA-PET interactions were visualized by the WashU Epigenome Browser (http://epigenomegateway.wustl.edu/browser/). Interactions detected by ChIA-PET are depicted with purple lines. Red bars show TNF-α-specific SEs.(I-K) Gene tracks of ChIP-seq signals for H3K9me2 and H3K27me3 around VCAM1 (I), IL8 (J), and SELE (K) in TNF-α (-) and TNF-α (+) ECs. Red bars show TNF-α-specific SEs."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Representative", "snapshot", "from", "the", "IVM", "analysis", "of", "leukocyte", "adhesive", "interactions", "in", "the", "femoral", "arteries", ".", "Margins", "of", "vessels", "are", "indicated", "with", "dashed", "lines", ".", "White", "spots", "represent", "fluorescently", "labeled", "leukocytes", "visualized", "by", "the", "intravenous", "injection", "of", "rhodamine", "6G", ".", "(", "C", ")", "Quantitative", "analyses", "of", "leukocyte", "adhesive", "interactions", "in", "the", "femoral", "arteries", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SE", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "the", "vehicle", "+", "TNF", "-", "α", "group", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "See", "also", "Movies", "EV1", "and", "2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Representative snapshot from the IVM analysis of leukocyte adhesive interactions in the femoral arteries. Margins of vessels are indicated with dashed lines. White spots represent fluorescently labeled leukocytes visualized by the intravenous injection of rhodamine 6G.(C) Quantitative analyses of leukocyte adhesive interactions in the femoral arteries. Data are shown as means ± SE (n=3/group). *P < 0.05 compared to the vehicle + TNF-α group. Statistical differences were analyzed by the Student's t test. See also Movies EV1 and 2."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "Representative", "immunoblots", "(", "n", "=", "3", ")", "showing", "phosphorylation", "state", "of", "Smad2", "and", "JNK", "during", "TGF", "-", "β", "-", "induced", "EMT", "in", "NMuMG", "cells", ".", "Lamin", "B", "serves", "as", "loading", "control", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "one", "set", "of", "representative", "immunoblots", "(", "in", "figure", "D", ")", "and", "its", "graphical", "representation", "showing", "dynamic", "of", "Smad2", "and", "JNK", "activation", "during", "TGF", "-", "β", "-", "induced", "EMT", "in", "NMuMG", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunohistochemistry", "image", "for", "pSmad2", "and", "pJNK", "in", "non", "-", "invasive", "(", "n", "=", "34", ")", "and", "invasive", "(", "n", "=", "14", ")", "breast", "cancer", "samples", ".", "Scale", "bars", "for", "10X", "and", "40X", "images", "are", "200", "µm", "and", "50", "µm", "respectively", ".", "(", "H", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "for", "changes", "in", "the", "localization", "and", "expression", "levels", "of", "EMT", "markers", "in", "epithelialNMuMG", "cells", "(", "d0", ")", "and", "cells", "treated", "with", "TGF", "-", "β", "for", "seven", "days", "in", "the", "presence", "of", "JNK", "inhibitor", "(", "d7", "JNKi", ")", "or", "control", "(", "d7", "DMSO", ")", ".", "Staining", "was", "performed", "with", "antibodies", "against", "Fibronectin", "1", ",", "with", "Phalloidin", "to", "visualize", "the", "actin", "cytoskeleton", "and", "against", "Paxillin", "to", "detect", "focal", "adhesion", "plaques", ".", "It", "is", "important", "to", "note", "that", "the", "untreated", "epithelial", "cells", "are", "highly", "proliferative", "and", "appear", "small", "in", "size", ",", "round", "in", "shape", "and", "adhere", "to", "surrounding", "cells", "whereas", "day", "7", "TGF", "-", "β", "-", "treated", "(", "mesenchymal", ")", "cells", "are", "much", "bigger", "in", "size", ",", "elongated", "in", "shape", "and", "detached", "from", "the", "nearby", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ",", "63X", "magnification", ".", "(", "I", ")", "mRNA", "levels", "for", "classical", "EMT", "markers", "in", "cells", "treated", "as", "in", "(", "F", ")", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCRs", "relative", "to", "Ctcf", "and", "fold", "change", "as", "compare", "to", "untreated", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Mean", "and", "SEM", "is", "plotted", "from", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "J", ")", "Transwell", "migration", "assay", "for", "NMuMG", "cells", "treated", "as", "in", "G", ".", "Plotted", "Mean", "±", "SEM", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) Representative immunoblots (n=3) showing phosphorylation state of Smad2 and JNK during TGF-β-induced EMT in NMuMG cells. Lamin B serves as loading control.(E) Quantification of one set of representative immunoblots (in figure D) and its graphical representation showing dynamic of Smad2 and JNK activation during TGF-β-induced EMT in NMuMG.(F) Representative immunohistochemistry image for pSmad2 and pJNK in non-invasive (n=34) and invasive (n=14) breast cancer samples. Scale bars for 10X and 40X images are 200 µm and 50 µm respectively.(H) Immunofluorescence microscopy for changes in the localization and expression levels of EMT markers in epithelialNMuMG cells (d0) and cells treated with TGF-β for seven days in the presence of JNK inhibitor (d7 JNKi) or control (d7 DMSO). Staining was performed with antibodies against Fibronectin 1, with Phalloidin to visualize the actin cytoskeleton and against Paxillin to detect focal adhesion plaques. It is important to note that the untreated epithelial cells are highly proliferative and appear small in size, round in shape and adhere to surrounding cells whereas day 7 TGF- β-treated (mesenchymal) cells are much bigger in size, elongated in shape and detached from the nearby cells. Scale bar, 100 μm, 63X magnification.(I) mRNA levels for classical EMT markers in cells treated as in (F) were measured by qRT-PCRs relative to Ctcf and fold change as compare to untreated and plotted on the y-axis. Mean and SEM is plotted from three independent biological replicates.(J) Transwell migration assay for NMuMG cells treated as in G. Plotted Mean ± SEM of three biological replicates. * p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.001, Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "(", "E", ")", "ChIP", "assay", "using", "H3K27me3", "-", "specific", "antibody", "in", "epithelial", "cells", "(", "day", "0", ")", ")", "or", "NMuMG", "cells", "treated", "for", "seven", "days", "with", "TGF", "-", "β", "(", "mesenchymal", ")", "and", "DMSO", "or", "JNKi", ".", "qRT", "-", "PCRs", "were", "performed", "for", "indicated", "gene", "promoters", "and", "enrichments", "are", "plotted", "on", "the", "right", "y", "-", "axis", "as", "ratio", "of", "precipitated", "DNA", "(", "bound", ")", "to", "total", "input", "DNA", ".", "On", "the", "left", "y", "-", "axis", "RNA", "levels", "of", "analyzed", "genes", "derived", "from", "RNA", "-", "seq", "data", "(", "fold", "change", "to", "untreated", "normalized", "tag", "counts", ")", "are", "plotted", ".", "Mean", "and", "SEM", "is", "plotted", "from", "two", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "F", ")", "FAIRE", "assay", "was", "performed", "in", "cells", "treated", "as", "in", "(", "D", ")", "and", "qRT", "-", "PCRs", "were", "performed", "for", "the", "same", "gene", "promoters", "and", "plotted", "as", "in", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2. (E) ChIP assay using H3K27me3-specific antibody in epithelial cells (day 0)) or NMuMG cells treated for seven days with TGF-β (mesenchymal) and DMSO or JNKi. qRT-PCRs were performed for indicated gene promoters and enrichments are plotted on the right y-axis as ratio of precipitated DNA (bound) to total input DNA. On the left y-axis RNA levels of analyzed genes derived from RNA-seq data (fold change to untreated normalized tag counts ) are plotted. Mean and SEM is plotted from two independent biological replicates.(F) FAIRE assay was performed in cells treated as in (D) and qRT-PCRs were performed for the same gene promoters and plotted as in (E)."}
{"words": ["Figure", "3JNK", "-", "induced", "transcription", "factors", "are", "critically", "required", "for", "EMT", ".", "(", "A", ")", "Venn", "diagram", "showing", "overlap", "of", "genes", "upregulated", "upon", "JNKi", "treatment", "during", "EMT", "and", "downregulated", "during", "normal", "EMT", "at", "day", "7", "that", "contains", "5", "transcription", "factors", ".", "Right", "panel", "shows", "RNA", "levels", "(", "normalized", "tag", "counts", ")", "for", "these", "factors", ".", "(", "B", ")", "Same", "overlap", "as", "in", "(", "A", ")", "for", "genes", "downregulated", "upon", "JNKi", "treatment", "during", "EMT", "and", "upregulated", "during", "normal", "EMT", ".", "Right", "panel", "displays", "RNA", "levels", "as", "in", "(", "A", ")", "for", "10", "transcription", "factors", "identified", "in", "this", "overlap", ".", "(", "C", ")", "Representative", "bright", "field", "and", "immunofluorescence", "images", "for", "localization", "and", "expression", "levels", "of", "EMT", "marker", "proteins", "after", "four", "days", "(", "d4", ")", "of", "siRNA", "-", "mediated", "depletion", "of", "factors", "compared", "to", "non", "-", "targeting", "control", "(", "NTC", ")", ".", "Staining", "was", "performed", "with", "antibodies", "against", "epithelial", "markers", "E", "-", "cadherin", "and", "ZO1", ",", "mesenchymal", "markers", "Fibronectin", "1", ",", "with", "Phalloidin", "to", "visualize", "the", "actin", "cytoskeleton", "and", "against", "Paxillin", "to", "detect", "focal", "adhesion", "plaques", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ",", "40X", "magnification", ".", "Plotted", "Mean", "±", "SEM", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3JNK-induced transcription factors are critically required for EMT. (A) Venn diagram showing overlap of genes upregulated upon JNKi treatment during EMT and downregulated during normal EMT at day 7 that contains 5 transcription factors. Right panel shows RNA levels (normalized tag counts) for these factors.(B) Same overlap as in (A) for genes downregulated upon JNKi treatment during EMT and upregulated during normal EMT. Right panel displays RNA levels as in (A) for 10 transcription factors identified in this overlap.(C) Representative bright field and immunofluorescence images for localization and expression levels of EMT marker proteins after four days (d4) of siRNA-mediated depletion of factors compared to non-targeting control (NTC). Staining was performed with antibodies against epithelial markers E-cadherin and ZO1, mesenchymal markers Fibronectin 1, with Phalloidin to visualize the actin cytoskeleton and against Paxillin to detect focal adhesion plaques. Scale bar, 100 μm, 40X magnification. Plotted Mean ± SEM of three biological replicates. * p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.001, Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "4Depletion", "of", "Prkrir", ",", "Pcbp4", "and", "Tsc22d1", "rescues", "TGF", "-", "β", "-", "induced", "reduction", "in", "the", "rate", "of", "cell", "division", ".", "(", "A", ")", "Lineage", "trees", "tracked", "by", "live", "imaging", "under", "control", ",", "Non", "treated", "control", "(", "NTC", ")", "and", "siRNA", "-", "mediated", "depletion", "of", "factors", "(", "X", "=", "cell", "death", "/", "cells", "could", "not", "be", "tracked", "till", "the", "end", ")", ".", "(", "B", ")", "Average", "number", "of", "rounds", "of", "division", "per", "clone", "in", "NTC", "compared", "with", "control", "and", "siRNA", "-", "mediated", "depletion", "of", "factors", "(", "ANOVA", ",", "Tukeys", "post", "-", "test", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Depletion of Prkrir, Pcbp4 and Tsc22d1 rescues TGF-β-induced reduction in the rate of cell division. (A) Lineage trees tracked by live imaging under control, Non treated control (NTC) and siRNA-mediated depletion of factors (X= cell death/cells could not be tracked till the end).(B) Average number of rounds of division per clone in NTC compared with control and siRNA-mediated depletion of factors (ANOVA, Tukeys post-test, *=p<0.05,**=p<0.01)."}
{"words": ["Figure", "5PRKRIR", ",", "PCBP4", "and", "TSC22D1", "are", "crucial", "for", "maintenance", "of", "the", "mesenchymal", "fate", ".", "(", "A", ")", "Scratch", "assay", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", "treated", "for", "four", "days", "with", "DMSO", "or", "JNKi", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ";", "20", "X", "magnification", ".", "Mean", "and", "SEM", "is", "plotted", "from", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "B", ")", "mRNA", "levels", "for", "key", "EMT", "marker", "genes", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "treated", "with", "DMSO", "or", "JNKi", "for", "4", "days", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "relative", "to", "Ctcf", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Mean", "and", "SEM", "is", "plotted", "from", "three", "independent", "biological", "replicates", "(", "C", ")", "mRNA", "levels", "for", "transcription", "factors", "in", "isogenic", "epithelial", "(", "MDA", "-", "MB", "-", "361", ")", "and", "mesenchymal", "(", "MDA", "-", "MB", "-", "231", ")", "breast", "cancer", "cells", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "relative", "to", "Ctcf", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Mean", "and", "SEM", "is", "plotted", "from", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "D", ")", "Scratch", "assay", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", "transfected", "with", "NTC", "or", "siRNA", "against", "PRKRIR", ",", "NFIL3", ",", "PCBP4", "and", "TSC22D1", "for", "4", "days", "as", "in", "A", ".", "Mean", "and", "SEM", "is", "plotted", "from", "three", "independent", "biological", "replicates", "as", "bar", "plot", "on", "right", ".", "(", "E", ")", "Invasion", "assay", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", "treated", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Mean", "and", "SEM", "is", "plotted", "from", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "F", ")", "mRNA", "levels", "of", "key", "EMT", "marker", "genes", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "and", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "transfected", "with", "either", "empty", "vector", "or", "vector", "overexpressing", "PCBP4", "or", "TSC22D1", "for", "48", "hours", "and", "then", "treated", "with", "the", "JNK", "inhibitor", "(", "SP600125", ")", "for", "24", "hours", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCRs", "relative", "to", "Ctcf", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Mean", "and", "SEM", "is", "plotted", "from", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "Plotted", "Mean", "±", "SEM", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5PRKRIR, PCBP4 and TSC22D1 are crucial for maintenance of the mesenchymal fate. (A) Scratch assay in MDA-MB-231 cells treated for four days with DMSO or JNKi. Scale bar, 200 μm; 20 X magnification. Mean and SEM is plotted from three independent biological replicates.(B) mRNA levels for key EMT marker genes in MDA-MB-231 treated with DMSO or JNKi for 4 days were measured by qRT-PCR relative to Ctcf and plotted on the y-axis. Mean and SEM is plotted from three independent biological replicates(C) mRNA levels for transcription factors in isogenic epithelial (MDA-MB-361) and mesenchymal (MDA-MB-231) breast cancer cells were measured by qRT-PCR relative to Ctcf and plotted on the y-axis. Mean and SEM is plotted from three independent biological replicates.(D) Scratch assay in MDA-MB-231 cells transfected with NTC or siRNA against PRKRIR, NFIL3, PCBP4 and TSC22D1 for 4 days as in A. Mean and SEM is plotted from three independent biological replicates as bar plot on right .(E) Invasion assay in MDA-MB-231 cells treated as in (D). Mean and SEM is plotted from three independent biological replicates.(F) mRNA levels of key EMT marker genes in MDA-MB-231 and MDA-MB-231 transfected with either empty vector or vector overexpressing PCBP4 or TSC22D1 for 48 hours and then treated with the JNK inhibitor (SP600125) for 24 hours were measured by qRT-PCRs relative to Ctcf and plotted on the y-axis. Mean and SEM is plotted from three independent biological replicates. Plotted Mean ± SEM of three biological replicates. * p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.001, Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "mRNA", "levels", "for", "representative", "genes", "highlighted", "in", "(", "A", ")", "for", "cells", "treated", "like", "in", "(", "Fig", "5D", ")", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "relative", "to", "Ctcf", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Mean", "and", "SEM", "is", "plotted", "from", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "F", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "showing", "localization", "of", "Tsc22d1", "in", "NMuMG", "cells", "following", "transient", "expression", "of", "Flag", "-", "HA", "tagged", "Tsc22d1", "and", "detection", "using", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ",", "Bar", "plot", "shows", "quantification", "of", "Tsc22d1", "localization", "with", "respect", "to", "DAPI", "density", "within", "the", "nucleus", ".", "Y", "-", "axis", "shows", "the", "percentage", "of", "total", "fluorescence", "intensity", "for", "Tsc22d1", "in", "DAPI", "dense", "and", "light", "regions", ".", "SEM", "is", "derived", "from", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "G", ")", "ChIP", "assay", "using", "anti", "-", "Flag", "antibody", "following", "expression", "of", "Flag", "-", "HA", "tagged", "TSC22D1", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", ".", "Quantitative", "PCRs", "were", "performed", "for", "indicated", "gene", "promoters", "and", "enrichments", "are", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", "as", "ratio", "of", "precipitated", "DNA", "(", "bound", ")", "to", "total", "input", "DNA", "and", "then", "further", "divided", "by", "the", "same", "obtained", "in", "the", "empty", "vector", "transfected", "cells", ".", "SEM", "is", "derived", "from", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "H", ")", "mRNA", "levels", "for", "PRKRIR", ",", "PCBP4", ",", "TSC22D1", "in", "non", "-", "invasive", "(", "DCIS", ")", "(", "n", "=", "20", ")", "and", "invasive", "tumor", "(", "n", "=", "20", ")", "samples", "were", "measured", "by", "qRT", "PCRs", "relative", "to", "TBP", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "ZEB1", "was", "used", "as", "an", "established", "positive", "control", "for", "invasive", "tumors", ".", "Plotted", "Mean", "±", "SEM", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) mRNA levels for representative genes highlighted in (A) for cells treated like in (Fig 5D) were measured by qRT-PCR relative to Ctcf and plotted on the y-axis. Mean and SEM is plotted from three independent biological replicates.F) Representative immunofluorescence images showing localization of Tsc22d1 in NMuMG cells following transient expression of Flag-HA tagged Tsc22d1 and detection using an anti-Flag antibody, Bar plot shows quantification of Tsc22d1 localization with respect to DAPI density within the nucleus. Y-axis shows the percentage of total fluorescence intensity for Tsc22d1 in DAPI dense and light regions. SEM is derived from independent biological replicates.(G) ChIP assay using anti-Flag antibody following expression of Flag-HA tagged TSC22D1 in MDA-MB-231 cells. Quantitative PCRs were performed for indicated gene promoters and enrichments are plotted on the y-axis as ratio of precipitated DNA (bound) to total input DNA and then further divided by the same obtained in the empty vector transfected cells. SEM is derived from independent biological replicates.(H) mRNA levels for PRKRIR, PCBP4, TSC22D1 in non-invasive (DCIS) (n=20) and invasive tumor (n=20) samples were measured by qRT PCRs relative to TBP and plotted on the y-axis. ZEB1 was used as an established positive control for invasive tumors. Plotted Mean ± SEM of three biological replicates. * p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.001, Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "7Newly", "identified", "transcription", "factors", "are", "similarly", "upregulated", "during", "neurogenesis", "and", "function", "in", "neuronalmigration", ".", "(", "A", ")", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "for", "key", "EMT", "markers", "in", "embryonic", "stem", "cells", "(", "ES", ")", ",", "neuronal", "progenitors", "(", "NP", ")", "and", "terminally", "differentiated", "neurons", "(", "TN", ")", ".", "mRNA", "levels", "were", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", "relative", "to", "Ctcf", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "from", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "B", ")", "Western", "blot", "analyzing", "total", "JNK", "and", "phospho", "-", "JNK", "(", "p", "-", "JNK", ")", "during", "neuronal", "differentiation", "of", "stem", "cells", ".", "β", "-", "actin", "serve", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "RNA", "levels", "of", "Pcbp4", ",", "Prkrir", "and", "Tsc22d1", "during", "neuronal", "differentiation", "as", "shown", "in", "A", ",", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", "relative", "to", "Ctcf", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "from", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "D", ")", "RNA", "levels", "of", "Pcbp4", ",", "Prkrir", ",", "Tsc22d1", ",", "represented", "by", "average", "counts", "derived", "from", "previously", "published", "microarray", "data", "of", "independent", "biological", "replicates", "from", "neurons", "treated", "with", "DMSO", "or", "JNK", "inhibitor", "SP600125", "(", "JNKi", ")", "for", "6", "hours", ".", "(", "E", ")", "RNA", "levels", "of", "Tsc22d1", "and", "three", "Tsc22d1", "target", "genes", "during", "various", "stages", "of", "neuronal", "differentiation", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", "relative", "to", "Ctcf", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "from", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "F", ")", "RNA", "levels", "of", "Tsc22d1", "and", "the", "same", "three", "target", "genes", "is", "shown", "as", "average", "normalized", "tag", "counts", "derived", "from", "RNA", "-", "seq", "data", "from", "Ventricular", "Zone", "(", "VZ", ")", ",", "Sub", "-", "Ventricular", "Zone", "(", "SVZ", ")", "and", "Cortical", "plate", "(", "CP", ")", "of", "E14", ".", "5", "mouse", "Cortex", ".", "(", "G", ")", "RNA", "levels", "of", "genes", "shown", "in", "Figure", "(", "E", ")", ",", "represented", "by", "average", "normalized", "tag", "counts", "derived", "from", "RNA", "-", "seq", "data", "of", "TGF", "-", "β", "-", "induced", "EMT", "in", "NMuMG", "cells", "and", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "(", "I", ")", "A", "representative", "image", "from", "immunofluorescence", "analysis", "performed", "with", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Tbr1", "antibody", "that", "shows", "retention", "of", "GFP", "positive", "cells", "below", "the", "Tbr1", "layer", "in", "Tsc22d1", "knockdown", "brain", "as", "compared", "to", "the", "control", "brain", ".", "The", "bar", "plot", "on", "the", "right", "side", "shows", "quantification", "of", "migrated", "GFP", "positive", "cells", "in", "control", "and", "Tsc22d1", "depleted", "mouse", "brain", "with", "respect", "to", "the", "Tbr1", "staining", ".", "y", "axis", "represent", "percentage", "of", "cells", "above", "or", "below", "the", "Tbr1", "stain", "region", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "from", "3", "independent", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Newly identified transcription factors are similarly upregulated during neurogenesis and function in neuronalmigration. (A) RT-qPCR analysis for key EMT markers in embryonic stem cells (ES), neuronal progenitors (NP) and terminally differentiated neurons (TN). mRNA levels were measured by RT-qPCR relative to Ctcf and plotted on the y-axis. Error bars represent SEM from independent biological replicates.(B) Western blot analyzing total JNK and phospho-JNK (p-JNK) during neuronal differentiation of stem cells. β-actin serve as a loading control.(C) RNA levels of Pcbp4, Prkrir and Tsc22d1 during neuronal differentiation as shown in A, measured by RT-qPCR relative to Ctcf and plotted on the y-axis. Error bars represent SEM from independent biological replicates.(D) RNA levels of Pcbp4, Prkrir, Tsc22d1, represented by average counts derived from previously published microarray data of independent biological replicates from neurons treated with DMSO or JNK inhibitor SP600125 (JNKi) for 6 hours.(E) RNA levels of Tsc22d1 and three Tsc22d1 target genes during various stages of neuronal differentiation shown in (A), measured by RT-qPCR relative to Ctcf and plotted on the y-axis. Error bars represent SEM from independent biological replicates.(F) RNA levels of Tsc22d1 and the same three target genes is shown as average normalized tag counts derived from RNA-seq data from Ventricular Zone (VZ), Sub-Ventricular Zone (SVZ) and Cortical plate (CP) of E14.5 mouse Cortex.(G) RNA levels of genes shown in Figure (E), represented by average normalized tag counts derived from RNA-seq data of TGF-β-induced EMT in NMuMG cells and plotted on the y-axis. Error bars represent SEM from three biological replicates.(I) A representative image from immunofluorescence analysis performed with anti-GFP and anti-Tbr1 antibody that shows retention of GFP positive cells below the Tbr1 layer in Tsc22d1 knockdown brain as compared to the control brain. The bar plot on the right side shows quantification of migrated GFP positive cells in control and Tsc22d1 depleted mouse brain with respect to the Tbr1 staining. y axis represent percentage of cells above or below the Tbr1 stain region. Error bars represent SEM from 3 independent biological replicates. * p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.001, Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "To", "assign", "identities", "to", "these", "germ", "cell", "subclusters", ",", "the", "violin", "plots", "were", "used", "to", "visualize", "the", "distribution", "of", "normalized", "typical", "marker", "genes", "expression", "levels", ".", "(", "E", ")", "The", "expression", "of", "GSC", "maintenance", "genes", "(", "aret", ",", "Mei", "-", "P26", ",", "egg", ",", "Myc", "and", "Hrb98DE", ")", "and", "differentiation", "genes", "(", "bam", ",", "bgcn", ",", "out", ",", "twin", "and", "Set1", ")", "along", "the", "primary", "branch", "(", "dotted", "circle", "line", ")", "in", "pseudotime", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) To assign identities to these germ cell subclusters, the violin plots were used to visualize the distribution of normalized typical marker genes expression levels.(E) The expression of GSC maintenance genes (aret, Mei-P26, egg, Myc and Hrb98DE) and differentiation genes (bam, bgcn, out, twin and Set1) along the primary branch (dotted circle line) in pseudotime."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "The", "typical", "phenotypes", "of", "germaria", "in", "selected", "RNAi", "lines", "stained", "with", "anti", "-", "α", "-", "Spectrin", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "pMad", "(", "red", ")", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "E", ")", "The", "heat", "map", "of", "SCENIC", "analysis", "of", "the", "GSC", ",", "undifferentiated", "germ", "cell", "-", "1", ",", "undifferentiated", "germ", "cell", "-", "2", ",", "early", "nurse", "cell", ",", "oocyte", "and", "later", "nurse", "cell", "subclusters", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) The typical phenotypes of germaria in selected RNAi lines stained with anti-α-Spectrin (green) and anti-pMad (red). The scale bar is 10 μm.(E) The heat map of SCENIC analysis of the GSC, undifferentiated germ cell-1, undifferentiated germ cell-2, early nurse cell, oocyte and later nurse cell subclusters."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "The", "expression", "patterns", "of", "candidate", "marker", "genes", "were", "validated", "by", "using", "in", "situ", "hybridization", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "C", "-", "C", "'", ")", "Immunofluorescence", "staining", "with", "anti", "-", "TfIIA", "-", "S", "on", "wild", "type", "and", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "TfIIA", "-", "S", "-", "RNAi", "(", "negative", "control", ")", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "E", "-", "E", "'", ")", "Immunofluorescence", "staining", "with", "anti", "-", "eggpl", "on", "wild", "type", "and", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", "-", "RNAi", "(", "negative", "control", ")", "ovary", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "F", ")", "The", "overexpression", "of", "GFP", "(", "green", ")", "and", "eggpl", "in", "Sf9", "cell", "line", "in", "vitro", ".", "The", "anti", "-", "eggpl", "(", "red", ")", "was", "used", "to", "detect", "the", "eggpl", "protein", ",", "and", "Hoechst", "(", "blue", ")", "was", "used", "to", "label", "the", "nucleus", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) The expression patterns of candidate marker genes were validated by using in situ hybridization. The scale bar is 10 μm.(C-C') Immunofluorescence staining with anti-TfIIA-S on wild type and nos-Gal4>UAS-TfIIA-S-RNAi (negative control). The scale bar is 10 μm.(E-E') Immunofluorescence staining with anti-eggpl on wild type and nos-Gal4>UAS-eggpl-RNAi (negative control) ovary. The scale bar is 10 μm.(F) The overexpression of GFP (green) and eggpl in Sf9 cell line in vitro. The anti-eggpl (red) was used to detect the eggpl protein, and Hoechst (blue) was used to label the nucleus. The scale bar is 10 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "A", "'", ")", "The", "mRNA", "in", "situ", "hybridization", "of", "eggpl", "(", "green", ")", "on", "wild", "type", "and", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", "-", "RNAi", "(", "negative", "control", ")", "line", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Immunofluorescence", "staining", "with", "anti", "-", "α", "-", "Spectrin", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "Vasa", "(", "red", ")", "on", "eggpl", "-", "in", "situ", "(", "green", ")", "labeled", "tissues", "respectively", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "eggpl", "-", "in", "situ", "(", "green", ")", "signals", ".", "(", "F", "and", "H", ")", "The", "mRNA", "in", "situ", "hybridization", "of", "eggpl", "(", "green", ")", "on", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", "-", "RNAi", "(", "negative", "control", ")", "(", "F", ")", "and", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", "-", "GFP", "lines", "(", "H", ")", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "G", ")", "The", "anti", "-", "GFP", ",", "anti", "-", "α", "-", "Spectrin", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "Bam", "(", "blue", ")", "were", "used", "to", "stain", "on", "eggpl", ":", ":", "GFP", "knock", "-", "in", "line", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "I", ")", "Double", "staining", "with", "eggpl", "in", "situ", "and", "anti", "-", "GFP", "on", "eggpl", "knock", "-", "in", "lines", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "eggpl", "-", "in", "situ", "(", "green", ")", "signals", ".", "(", "K", ")", "The", "phenotypes", "of", "wild", "type", ",", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", "-", "RNAi", "line", "and", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", ":", ":", "GFP", "line", "staining", "with", "anti", "-", "α", "-", "Spectrin", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "pMad", "(", "red", ")", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "L", ")", "The", "average", "number", "of", "GSC", "and", "CB", "in", "nos", "-", "Gal4", "line", ",", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", "-", "RNAi", "line", "and", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", ":", ":", "GFP", "line", "on", "2", "day", ",", "7", "day", ",", "14", "day", "and", "21", "day", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±", "SEM", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "ns", "indicates", "no", "significant", "difference", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "≥", "72", ",", "biological", "replicates", ".", "(", "Q", ")", "The", "statistical", "analysis", "of", "the", "average", "number", "of", "GSCs", "and", "CBs", "and", "Cysts", "in", "eggpl", "[", "1", "]", "line", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±", "SEM", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "ns", "indicates", "no", "significant", "difference", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "≥", "104", ",", "biological", "replicates", ".", "(", "R", ")", "The", "average", "number", "of", "apoptotic", "germ", "cells", "in", "wild", "type", ",", "nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", "-", "RNAi", "line", "and", "eggpl", "[", "1", "]", "line", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±", "SEM", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "ns", "indicates", "no", "significant", "difference", "(", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "3", ")", ",", "and", "N", "represents", "the", "total", "number", "of", "counted", "ovarioles", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-A') The mRNA in situ hybridization of eggpl (green) on wild type and nos-Gal4>UAS-eggpl-RNAi (negative control) line. The scale bar is 10 μm. (B-C) Immunofluorescence staining with anti-α-Spectrin (red) and anti-Vasa (red) on eggpl-in situ (green) labeled tissues respectively. The scale bar is 10 μm. The dashed line indicates the eggpl-in situ (green) signals.(F and H) The mRNA in situ hybridization of eggpl (green) on nos-Gal4>UAS-eggpl-RNAi (negative control) (F) and nos-Gal4>UAS-eggpl-GFP lines (H). The scale bar is 10 μm. (G) The anti-GFP, anti-α-Spectrin (red) and anti-Bam (blue) were used to stain on eggpl::GFP knock-in line. The scale bar is 10 μm. (I) Double staining with eggpl in situ and anti-GFP on eggpl knock-in lines. The scale bar is 10 μm. The dashed line indicates the eggpl-in situ (green) signals.(K) The phenotypes of wild type, nos-Gal4>UAS-eggpl-RNAi line and nos-Gal4>UAS-eggpl::GFP line staining with anti-α-Spectrin (green), anti-pMad (red). The scale bar is 10 μm.(L) The average number of GSC and CB in nos-Gal4 line, nos-Gal4>UAS-eggpl-RNAi line and nos-Gal4>UAS-eggpl::GFP line on 2 day, 7 day, 14 day and 21 day. Error bars show mean ± SEM, one-way ANOVA, ns indicates no significant difference, *P<0.05, ***P<0.001, n ≥ 72, biological replicates.(Q) The statistical analysis of the average number of GSCs and CBs and Cysts in eggpl[1] line. Error bars show mean ± SEM, one-way ANOVA, ns indicates no significant difference, ***P<0.001, n ≥ 104, biological replicates.(R) The average number of apoptotic germ cells in wild type, nos-Gal4>UAS-eggpl-RNAi line and eggpl[1] line. Error bars show mean ± SEM, one-way ANOVA, ns indicates no significant difference (biological replicates, n=3), and N represents the total number of counted ovarioles."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "staining", "with", "anti", "-", "α", "-", "Spectrin", "(", "red", ")", ",", "anti", "-", "Vasa", "(", "blue", ")", "and", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", "on", "adult", "ovary", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Immunofluorescence", "staining", "on", "PGCs", "of", "larvae", "ovary", ".", "The", "scale", "bar", "is", "20", "μm", ".", "(", "C", ")", "Immunofluorescence", "staining", "on", "GSCs", "and", "early", "spermatogonia", "in", "adult", "testis", ".", "The", "scale", "bar", "is", "20", "μm", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "staining", "on", "PGCs", "of", "larvae", "testis", "tissue", ".", "The", "scale", "bar", "is", "20", "μm", ".", "(", "E", ")", "Immunofluorescence", "staining", "with", "anti", "-", "α", "-", "Spectrin", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "Vasa", "(", "green", ")", "on", "testis", "from", "wild", "type", "or", "eggpl", "[", "1", "]", "flies", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Immunofluorescence staining with anti-α-Spectrin (red), anti-Vasa (blue) and anti-GFP (green) on adult ovary. The scale bar is 10 μm. (B) Immunofluorescence staining on PGCs of larvae ovary. The scale bar is 20 μm. (C) Immunofluorescence staining on GSCs and early spermatogonia in adult testis. The scale bar is 20 μm.(D) Immunofluorescence staining on PGCs of larvae testis tissue. The scale bar is 20 μm. (E) Immunofluorescence staining with anti-α-Spectrin (red) and anti-Vasa (green) on testis from wild type or eggpl[1] flies. The scale bar is 10 μm."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "staining", "with", "anti", "-", "BrdU", "(", "red", ")", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "The", "oviposition", "of", "wild", "type", ",", "Nos", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "eggpl", "-", "RNAi", "and", "eggpl", "[", "1", "]", "line", "over", "21", "days", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±", "SEM", ",", "3", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "were", "performed", ",", "and", "there", "were", "10", "female", "and", "5", "male", "adult", "flies", "in", "each", "biological", "replicate", ".", "(", "F", ")", "Immunofluorescence", "staining", "with", "anti", "-", "GFP", "on", "germaria", "from", "eggpl", ":", ":", "GFP", "knock", "-", "in", "flies", "with", "or", "without", "feeding", "fresh", "yeast", "paste", "on", "day", "2", "-", ",", "7", "-", ",", "14", "-", "and", "21", ".", "The", "dotted", "line", "indicates", "the", "examined", "area", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "GFP", "intensity", "mean", "in", "the", "eggpl", ":", ":", "GFP", "knock", "-", "in", "line", ".", "The", "central", "band", "indicates", "the", "median", ",", "the", "box", "length", "indicates", "the", "interquartile", "range", ",", "and", "the", "upper", "and", "whisker", "indicate", "the", "maximum", "and", "minimum", "value", "respectively", ".", "The", "10", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "10", ")", "were", "performed", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "examined", "area", ".", "(", "H", "-", "I", ")", "Images", "of", "ovaries", "or", "mature", "eggs", "from", "flies", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "feeding", "conditions", ",", "and", "days", "post", "-", "eclosion", "showing", "comparisons", "of", "the", "overall", "ovary", "sizes", "(", "F", ")", "and", "the", "numbers", "of", "retained", "matured", "eggs", "(", "G", ")", ".", "The", "scar", "bar", "is", "500", "μm", ".", "(", "J", "-", "K", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "ovary", "size", "(", "H", ")", "and", "the", "number", "of", "retained", "mature", "eggs", ".", "(", "I", ")", "under", "different", "food", "conditions", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±", "SEM", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "ns", "indicates", "no", "significant", "difference", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "The", "3", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "were", "performed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Immunofluorescence staining with anti-BrdU (red). The scale bar is 10 μm.(B) The oviposition of wild type, Nos-Gal4>UAS-eggpl-RNAi and eggpl[1] line over 21 days. Error bars show mean ± SEM, 3 biological replicates (n=3) were performed, and there were 10 female and 5 male adult flies in each biological replicate.(F) Immunofluorescence staining with anti-GFP on germaria from eggpl::GFP knock-in flies with or without feeding fresh yeast paste on day 2-, 7-, 14- and 21. The dotted line indicates the examined area. The scale bar is 10 μm. (G) Quantification of the GFP intensity mean in the eggpl::GFP knock-in line. The central band indicates the median, the box length indicates the interquartile range, and the upper and whisker indicate the maximum and minimum value respectively. The 10 biological replicates (n=10) were performed, one-way ANOVA, ***P<0.001. The dashed line indicates the examined area.(H-I) Images of ovaries or mature eggs from flies of the indicated genotypes, feeding conditions, and days post-eclosion showing comparisons of the overall ovary sizes (F) and the numbers of retained matured eggs (G). The scar bar is 500 μm. (J-K) Quantitative analysis of the ovary size (H) and the number of retained mature eggs. (I) under different food conditions. Error bars show mean ± SEM, one-way ANOVA, ns indicates no significant difference, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. The 3 biological replicates (n=3) were performed."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "GFP", "signal", "in", "germaria", "from", "eggpl", ":", ":", "GFP", "knock", "-", "in", "flies", "of", "the", "indicated", "genotypes", "under", "different", "conditions", ".", "The", "central", "band", "indicates", "the", "median", ",", "the", "box", "length", "indicates", "the", "interquartile", "range", ",", "and", "the", "upper", "and", "whisker", "indicate", "the", "maximum", "and", "minimum", "value", "respectively", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "10", ",", "biological", "replicates", ".", "(", "C", ")", "Immunofluorescence", "staining", "with", "anti", "-", "GFP", "on", "germaria", "with", "or", "without", "feeding", "fresh", "yeast", "paste", "on", "7th", "day", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "examined", "area", ".", "The", "scale", "bar", "is", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(B) Quantification of the GFP signal in germaria from eggpl::GFP knock-in flies of the indicated genotypes under different conditions. The central band indicates the median, the box length indicates the interquartile range, and the upper and whisker indicate the maximum and minimum value respectively, one-way ANOVA, **P<0.01, ***P<0.001, n = 10, biological replicates.(C) Immunofluorescence staining with anti-GFP on germaria with or without feeding fresh yeast paste on 7th day. The dashed line indicates the examined area. The scale bar is 10 μm."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "and", "ATF4", "in", "melanoma", "cells", "treated", "with", "NT", "-", "siRNA", "(", "-", ")", "or", "siASNS", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", "for", "72", "hr", ".", "Reverse", "transcription", "with", "quantitative", "PCR", "(", "RT", "-", "qPCR", ")", "of", "the", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", "(", "B", ")", "C", ".", "Reverse", "transcription", "with", "quantitative", "PCR", "(", "RT", "-", "qPCR", ")", "of", "the", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siATF4", ",", "or", "both", "(", "C", ")", ".", "D", ".", "Immunoblotting", "of", "ATF4", "and", "ASNS", "in", "melanoma", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siATF4", ",", "or", "both", ".", "E", ".", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siATF4", ",", "or", "both", ".", "F", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "in", "melanoma", "cells", "treated", "for", "72", "hr", "with", "siASNS", ",", "L", "-", "Asn", ",", "or", "both", "(", "G", ")", "H", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "in", "A375", "cells", "treated", "as", "indicated", "for", "72", "hr", "(", "H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Immunoblotting of c-MYC and ATF4 in melanoma cells treated with NT-siRNA (-) or siASNS (#1 or #2) for 72 hr.Reverse transcription with quantitative PCR (RT-qPCR) of the indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS (#1 or #2) (B)C. Reverse transcription with quantitative PCR (RT-qPCR) of the indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS, siATF4, or both (C).D. Immunoblotting of ATF4 and ASNS in melanoma cells 72 hr after treatment with siASNS, siATF4, or both.E. Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, siATF4, or both.F. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS (#1 or #2).Immunoblotting of c-MYC in melanoma cells treated for 72 hr with siASNS, L-Asn, or both (G)H. Immunoblotting of c-MYC in A375 cells treated as indicated for 72 hr (H)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "in", "A375", "cells", "treated", "with", "NT", "-", "siRNA", "or", "siASNS", "for", "24", "hr", "followed", "by", "cycloheximide", "treatment", "for", "indicated", "timepoints", "(", "left", ")", ".", "Plot", "showing", "relative", "protein", "levels", "of", "c", "-", "MYC", "(", "y", "-", "axis", ")", "as", "a", "function", "of", "time", "lapsed", "(", "x", "-", "axis", ")", "in", "the", "left", "panel", "(", "right", ")", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "melanoma", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "NT", "-", "siRNA", "(", "-", ")", "or", "siASNS", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", "(", "B", "and", "C", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "melanoma", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "PLX", "-", "4032", ",", "or", "both", "(", "D", ")", ".", "E", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "cultured", "in", "L", "-", "Asn", "and", "treated", "with", "L", "-", "A", "'", "ase", ",", "PLX", "-", "4032", ",", "or", "both", "for", "72", "hr", ".", "F", ".", "A375", "cells", "were", "treated", "with", "siASNS", ",", "SCH772984", ",", "or", "both", "for", "72", "hr", "followed", "by", "immunoblotting", "of", "phosphorylated", "and", "total", "GSK3", "-", "β", ".", "G", ".", "A375", "cells", "were", "treated", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", "for", "72", "hr", "followed", "by", "immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", ".", "H", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", ".", "I", ".", "A375", "cells", "were", "treated", "as", "indicated", "for", "72", "hr", "followed", "by", "immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", ".", "J", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "and", "HA", "proteins", "in", "A375", "cells", "treated", "as", "indicated", "for", "72", "hr", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblotting of c-MYC in A375 cells treated with NT-siRNA or siASNS for 24 hr followed by cycloheximide treatment for indicated timepoints (left). Plot showing relative protein levels of c-MYC (y-axis) as a function of time lapsed (x-axis) in the left panel (right).Immunoblotting of indicated proteins in melanoma cells 72 hr after treatment with NT-siRNA (-) or siASNS (#1 or #2) (B and C)Immunoblotting of indicated proteins in melanoma cells 72 hr after treatment with siASNS, PLX-4032, or both (D).E. Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells cultured in L-Asn and treated with L-A'ase, PLX-4032, or both for 72 hr.F. A375 cells were treated with siASNS, SCH772984, or both for 72 hr followed by immunoblotting of phosphorylated and total GSK3-β.G. A375 cells were treated with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both for 72 hr followed by immunoblotting of indicated proteins.H. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both.I. A375 cells were treated as indicated for 72 hr followed by immunoblotting of c-MYC.J. Immunoblotting of c-MYC and HA proteins in A375 cells treated as indicated for 72 hr."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "melanoma", "cells", "treated", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", ",", "or", "a", "combination", "of", "siASNS", "and", "sicMYC", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", "for", "72", "hr", ".", "B", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "or", "both", ".", "C", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "melanoma", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "PLX", "-", "4032", ",", "or", "a", "combination", "of", "siASNS", "and", "sicMYC", ",", "or", "siASNS", "and", "PLX", "-", "4032", ".", "D", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", ".", "E", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "after", "36", "hr", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", ".", "F", ".", "A375", "cells", "were", "treated", "as", "indicated", "for", "72", "hr", "followed", "by", "immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", ".", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "or", "both", "(", "G", ")", ",", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", "(", "H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Immunoblotting of indicated proteins in melanoma cells treated with siASNS, sicMYC (#1 or #2), or a combination of siASNS and sicMYC (#1 or #2) for 72 hr.B. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS, sicMYC, or both.C. Immunoblotting of indicated proteins in melanoma cells 72 hr after treatment with siASNS, sicMYC, PLX-4032, or a combination of siASNS and sicMYC, or siASNS and PLX-4032.D. Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both.E. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells after 36 hr treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both.F. A375 cells were treated as indicated for 72 hr followed by immunoblotting of indicated proteins.Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, sicMYC, or both (G),Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both (H)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC1A5", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "a", "combination", "of", "siASNS", "and", "siSLC1A5", ",", "or", "siASNS", "and", "siSLC7A5", ".", "B", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "after", "36", "hr", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "both", ".", "C", ".", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "both", ".", "D", ".", "GC", "-", "MS", "-", "based", "estimation", "of", "intracellular", "amino", "acid", "levels", "in", "A375", "cells", "treated", "with", "siASNS", ",", "siATF4", ",", "or", "both", "(", "top", "left", ")", ";", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "or", "both", "(", "top", "right", ")", ";", "siASNS", ",", "siSLC1A5", ",", "or", "both", "(", "bottom", "left", ")", ";", "or", "siASNS", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "both", "(", "bottom", "right", ")", ".", "The", "fold", "change", "is", "relative", "to", "NT", "-", "siRNA", "-", "treated", "A375", "cells", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "(", "E", ")", ",", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", ",", "treatment", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "or", "bothImmunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", ",", "siASNS", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "both", "(", "G", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", "siASNS", ",", "BCH", ",", "or", "both", "(", "H", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", "(", "I", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", ",", "siASNS", "or", "indicated", "combinations", "(", "J", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC3A2", ",", "or", "both", "(", "K", ")", ".", "L", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "after", "36", "hr", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC3A2", ",", "or", "both", ".", "M", ".", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC3A2", ",", "or", "both", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after treatment with siASNS, siSLC1A5, siSLC7A5, or a combination of siASNS and siSLC1A5, or siASNS and siSLC7A5.B. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells after 36 hr treatment with siASNS, siSLC7A5, or both.C. Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, siSLC7A5, or both.D. GC-MS-based estimation of intracellular amino acid levels in A375 cells treated with siASNS, siATF4, or both (top left); siASNS, sicMYC, or both (top right); siASNS, siSLC1A5, or both (bottom left); or siASNS, siSLC7A5, or both (bottom right). The fold change is relative to NT-siRNA-treated A375 cells.Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment (E),Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after , treatment with siASNS, sicMYC, or bothImmunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with , siASNS, siSLC7A5, or both (G)Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with siASNS, BCH, or both (H)Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both (I)Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with , siASNS or indicated combinations (J)Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with siASNS, siSLC3A2, or both (K).L. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells after 36 hr treatment with siASNS, siSLC3A2, or both.M. Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, siSLC3A2, or both."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Confocal", "microscopy", "image", "of", "PD", "myotubes", "(", "cl", ".", "3LE8", ")", "infected", "for", "72", " ", "h", "with", "adenovirus", "containing", "TFEB", "(", "PD", " ", "+", " ", "Ad", "-", "TFEB", "72", " ", "h", ")", "shows", "a", "dramatic", "reduction", "in", "the", "number", "of", "large", "LAMP1", "-", "positive", "lysosomes", "(", "red", ")", "compared", "to", "that", "in", "untreated", "(", "PD", ")", "or", "adenovirus", "(", "PD", " ", "+", " ", "Ad", "-", "null", ")", "-", "treated", "PD", "myotubes", ".", "WT", "myotubes", "are", "shown", "on", "the", "left", "panel", ".", "Nuclei", "are", "stained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "TFEB", "was", "detected", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", "(", "green", ")", ".", "B", ".", "Distribution", "of", "lysosomal", "size", "differs", "significantly", "in", "Ad", "-", "null", "and", "Ad", "-", "TFEB", "PD", "myotubes", "(", "p", " ", "=", " ", "6", ".", "32", " ", "×", " ", "10", "−", "8", ";", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "test", ")", ".", "Lysosomal", "size", "is", "expressed", "as", "number", "of", "pixels", "representing", "lysosomal", "area", "(", "LAMP1", "-", "positive", "structures", ")", ".", "The", "median", "lysosomal", "size", "of", "Ad", "-", "TFEB", "infected", "myotubes", "(", "m", " ", "=", " ", "367", ".", "13", "pixels", ",", "n", " ", "=", " ", "703", ",", "range", "208", "-", "2659", ")", "was", "significantly", "lower", "than", "that", "of", "Ad", "-", "null", "infected", "myotubes", "(", "m", " ", "=", " ", "491", ".", "16", "pixels", ",", "n", " ", "=", " ", "1395", ",", "range", "200", "-", "2857", ";", "p", " ", "=", " ", "6", ".", "5", " ", "×", " ", "10", "−", "12", ";", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", ")", ".", "C", ".", "Confocal", "microscopy", "image", "of", "PD", "myotubes", "infected", "for", "24", " ", "h", "with", "Ad", "-", "TFEB", "shows", "relocation", "of", "lysosomes", "to", "the", "plasma", "membrane", "(", "top", ")", ".", "Images", "showing", "LAMP1", "staining", "(", "red", ")", "on", "plasma", "membrane", "in", "a", "PD", "myotube", "infected", "with", "Ad", "-", "TFEB", "(", "bottom", ";", "arrows", ")", "but", "not", "in", "a", "non", "-", "infected", "cell", "(", "middle", ")", ".", "Non", "-", "permeabilized", "cells", "were", "incubated", "with", "anti", "-", "LAMP1", "antibody", "at", "4", "°", "C", "for", "40", " ", "min", ",", "followed", "by", "fixation", "and", "staining", "with", "secondary", "antibody", ".", "D", ".", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "live", "non", "-", "infected", "PD", "myotubes", "(", "left", ")", "or", "PD", "myotubes", "infected", "for", "72", " ", "h", "with", "Ad", "-", "TFEB", "(", "right", ")", "show", "a", "dramatic", "reduction", "in", "the", "amount", "of", "accumulated", "glycogen", "in", "TFEB", "-", "treated", "cells", ".", "The", "cells", "were", "incubated", "with", "the", "fluorescent", "glucose", "(", "2", "-", "NBDG", ";", "green", ")", ",", "extensively", "washed", ",", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Bar", ":", "10", " ", "µm", "for", "all", "panels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Confocal microscopy image of PD myotubes (cl. 3LE8) infected for 72 h with adenovirus containing TFEB (PD + Ad-TFEB 72 h) shows a dramatic reduction in the number of large LAMP1-positive lysosomes (red) compared to that in untreated (PD) or adenovirus (PD + Ad-null)-treated PD myotubes. WT myotubes are shown on the left panel. Nuclei are stained with Hoechst (blue). TFEB was detected with anti-Flag antibody (green).B. Distribution of lysosomal size differs significantly in Ad-null and Ad-TFEB PD myotubes (p = 6.32 × 10−8; Kolmogorov-Smirnov test). Lysosomal size is expressed as number of pixels representing lysosomal area (LAMP1-positive structures). The median lysosomal size of Ad-TFEB infected myotubes (m = 367.13 pixels, n = 703, range 208-2659) was significantly lower than that of Ad-null infected myotubes (m = 491.16 pixels, n = 1395, range 200-2857; p = 6.5 × 10−12; Wilcoxon rank sum test).C. Confocal microscopy image of PD myotubes infected for 24 h with Ad-TFEB shows relocation of lysosomes to the plasma membrane (top). Images showing LAMP1 staining (red) on plasma membrane in a PD myotube infected with Ad-TFEB (bottom; arrows) but not in a non-infected cell (middle). Non-permeabilized cells were incubated with anti-LAMP1 antibody at 4°C for 40 min, followed by fixation and staining with secondary antibody.D. Confocal microscopy images of live non-infected PD myotubes (left) or PD myotubes infected for 72 h with Ad-TFEB (right) show a dramatic reduction in the amount of accumulated glycogen in TFEB-treated cells. The cells were incubated with the fluorescent glucose (2-NBDG; green), extensively washed, and analysed by confocal microscopy. Bar: 10 µm for all panels."}
{"words": ["Figure", "2Confocal", "microscopy", "of", "live", "unstained", "fibres", "from", "a", "GFP", "-", "LC3", ":", "WT", "mouse", "(", "WT", ")", "and", "from", "untreated", "(", "GAA", "−", "/", "−", ")", "or", "ERT", "-", "treated", "(", "GAA", "−", "/", "−", ";", "+", "ERT", ")", "GFP", "-", "LC3", ":", "GAA", "−", "/", "−", "mice", ".", "Images", "show", "typical", "centrally", "located", "autophagic", "build", "-", "up", "with", "multiple", "clusters", "of", "LC3", "-", "positive", "autophagosomes", ".", "Structures", "like", "these", "are", "never", "seen", "in", "WT", "muscle", ".", "Autophagic", "build", "-", "up", "is", "present", "virtually", "in", "all", "fibres", "derived", "from", "EDL", "or", "gastrocnemiusmuscles", "(", "not", "shown", ")", ",", "but", "only", "in", "60", "-", "70", "%", "of", "FDBfibres", ".", "Labelled", "recombinant", "human", "GAA", "(", "red", ")", "was", "administered", "i", ".", "v", ".", "into", "3", "-", "4", "month", "-", "old", "GFP", "-", "LC3", ":", "GAA", "−", "/", "−", "mice", "(", "n", " ", "=", " ", "5", ")", "at", "a", "dose", "of", "100", " ", "mg", "/", "kg", "twice", "with", "a", "24", " ", "h", "interval", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "the", "next", "day", ",", "and", "live", "fibres", "(", "shown", "for", "EDLmuscle", ")", "were", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "The", "labelled", "recombinant", "GAA", "was", "detected", "almost", "exclusively", "in", "the", "autophagic", "vesicles", ".", "At", "least", "500", "fibres", "were", "analysed", "for", "each", "condition", ".", "Bar", ":", "10", " ", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Confocal microscopy of live unstained fibres from a GFP-LC3:WT mouse (WT) and from untreated (GAA−/−) or ERT-treated (GAA−/−; +ERT) GFP-LC3:GAA−/− mice. Images show typical centrally located autophagic build-up with multiple clusters of LC3-positive autophagosomes. Structures like these are never seen in WT muscle. Autophagic build-up is present virtually in all fibres derived from EDL or gastrocnemiusmuscles (not shown), but only in 60-70% of FDBfibres. Labelled recombinant human GAA (red) was administered i.v. into 3-4 month-old GFP-LC3:GAA−/− mice (n = 5) at a dose of 100 mg/kg twice with a 24 h interval. Mice were sacrificed the next day, and live fibres (shown for EDLmuscle) were analysed by confocal microscopy. The labelled recombinant GAA was detected almost exclusively in the autophagic vesicles. At least 500 fibres were analysed for each condition. Bar: 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Immunostaining", "of", "non", "-", "infected", "cells", "(", "day", "13", "in", "differentiation", "medium", ")", "and", "cells", "infected", "with", "a", "mutant", "form", "of", "TFEB", "(", "TFEBmt", ")", "with", "LAMP1", "(", "red", ")", "and", "Flag", "(", "green", ")", ".", "Ad", "-", "TFEBmt", "was", "added", "to", "the", "myotubes", "for", "72", " ", "h", "on", "day", "10", "in", "differentiation", "medium", ".", "Ad", "-", "TFEBmt", "-", "infected", "cells", "show", "massive", "accumulation", "of", "TFEB", "in", "the", "nuclei", "and", "significant", "reduction", "in", "lysosomal", "size", ",", "similar", "to", "that", "seen", "with", "TFEB", ".", "B", ".", "Western", "blot", "of", "cell", "lysates", "confirms", "the", "presence", "of", "TFEB", "in", "the", "nuclear", "fraction", ";", "the", "different", "intensities", "of", "the", "two", "bands", "corresponding", "to", "LAMP1", "protein", "in", "untreated", "and", "TFEBmt", "-", "treated", "samples", "may", "reflect", "the", "differences", "in", "the", "glycosylation", "pattern", ".", "C", ".", "Western", "blot", "of", "protein", "lysates", "from", "untreated", ",", "Ad", "-", "null", ",", "TFEB", ",", "and", "TFEBmt", "-", "treated", "myotubes", "with", "anti", "-", "caspase", "-", "3", "antibody", ".", "No", "activated", "(", "cleaved", ")", "products", "are", "detected", "in", "any", "condition", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "D", ".", "TUNEL", "assay", "shows", "the", "presence", "of", "some", "apoptotic", "cells", "in", "Ad", "-", "TFEB", "-", "infected", "cultures", ",", "but", "not", "in", "control", "cultures", "infected", "with", "adenovirus", "alone", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "Bar", ":", "10", " ", "µm", "for", "all", "panels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Immunostaining of non-infected cells (day 13 in differentiation medium) and cells infected with a mutant form of TFEB (TFEBmt) with LAMP1 (red) and Flag (green). Ad-TFEBmt was added to the myotubes for 72 h on day 10 in differentiation medium. Ad-TFEBmt-infected cells show massive accumulation of TFEB in the nuclei and significant reduction in lysosomal size, similar to that seen with TFEB.B. Western blot of cell lysates confirms the presence of TFEB in the nuclear fraction; the different intensities of the two bands corresponding to LAMP1 protein in untreated and TFEBmt-treated samples may reflect the differences in the glycosylation pattern.C. Western blot of protein lysates from untreated, Ad-null, TFEB, and TFEBmt-treated myotubes with anti-caspase-3 antibody. No activated (cleaved) products are detected in any condition. α-Tubulin was used as a loading control.D. TUNEL assay shows the presence of some apoptotic cells in Ad-TFEB-infected cultures, but not in control cultures infected with adenovirus alone (n = 3). Bar: 10 µm for all panels."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "live", "fibres", "derived", "from", "3", "to", "4", "month", "-", "old", "GFP", "-", "LC3", ":", "WT", "(", "top", "left", ")", ",", "untreated", "GFP", "-", "LC3", ":", "GAA", "−", "/", "−", "(", "bottom", "left", ")", "or", "TFEB", "-", "treated", "GFP", "-", "LC3", ":", "GAA", "−", "/", "−", "(", "right", ")", "mice", ".", "All", "fibres", "were", "transfected", "with", "mCherry", "-", "LAMP1", "to", "visualize", "lysosomes", "(", "red", ")", ".", "The", "effects", "of", "TFEB", "are", "clearly", "visible", "-", "overall", "reduction", "in", "lysosomal", "size", ",", "appearance", "of", "normal", "size", "lysosomes", "(", "similar", "to", "those", "in", "the", "WT", ")", ",", "and", "lysosomal", "docking", "to", "the", "plasma", "membrane", "(", "inset", ")", ".", "Bar", ":", "10", " ", "µm", ".", "B", ".", "FDBmuscle", "of", "a", "GAA", "−", "/", "−", "mouse", "was", "transfected", "with", "both", "GFP", "-", "TFEB", "and", "mCherry", "-", "LAMP1", "(", "GAA", "−", "/", "−", " ", "+", " ", "GFP", "-", "TFEB", ")", ".", "Images", "were", "taken", "before", "(", "left", ")", "and", "after", "4", " ", "h", "(", "right", ")", "of", "time", "-", "lapse", "microscopy", ".", "Lysosomal", "clearance", "is", "visible", "in", "the", "TFEB", "-", "transfected", "fibre", "at", "both", "time", "points", ".", "Lysosomes", "appear", "to", "\"", "exit", "\"", "the", "fibre", "(", "inset", "and", "arrow", ")", "at", "the", "4", " ", "h", "time", "point", "when", "TFEB", "is", "activated", "as", "evidenced", "by", "its", "nuclear", "translocation", "(", "green", "nuclei", ")", ".", "Bar", ":", "10", " ", "µm", ".", "C", ".", "The", "mean", "maximum", "velocity", "of", "lysosomes", "(", "top", ")", "and", "the", "number", "of", "large", "(", ">", "3", ".", "5", " ", "µm", ")", "lysosomes", "(", "bottom", ")", "in", "untreated", "and", "TFEB", "-", "treated", "PD", "fibres", "(", "note", ":", "all", "data", "for", "Flag", "-", "and", "GFP", "-", "TFEB", "-", "treated", "fibres", "are", "pooled", ")", ".", "Lysosomal", "velocities", "were", "calculated", "from", "time", "-", "lapse", "images", "using", "ImageJ", "software", "with", "the", "manual", "tracking", "plug", "-", "in", ".", "For", "each", "condition", "the", "trajectories", "of", "multiple", "lysosomes", "were", "followed", "(", "n", " ", "=", " ", "26", "untreated", ";", "n", " ", "=", " ", "43", "TFEB", "-", "treated", ")", "and", "the", "three", "highest", "velocity", "measurements", "per", "lysosome", "were", "recorded", ".", "In", "TFEB", "-", "treated", "fibres", ",", "the", "maximum", "velocity", "of", "lysosomes", "was", "significantly", "increased", "(", "p", " ", "=", " ", "2", ".", "07", " ", "×", " ", "10", "−", "17", ")", "and", "the", "number", "of", "large", "lysosomes", "was", "significantly", "decreased", "(", "p", " ", "=", " ", "1", ".", "0", " ", "×", " ", "10", "−", "3", ")", ".", "Ten", "untreated", "and", "24", "TFEB", "-", "treated", "fibres", "were", "analysed", "for", "the", "size", "calculations", ".", "*", "indicates", "statistically", "significant", "differences", "(", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "95", "%", "confidence", "intervals", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Confocal microscopy images of live fibres derived from 3 to 4 month-old GFP-LC3:WT (top left), untreated GFP-LC3:GAA−/− (bottom left) or TFEB-treated GFP-LC3:GAA−/− (right) mice. All fibres were transfected with mCherry-LAMP1 to visualize lysosomes (red). The effects of TFEB are clearly visible - overall reduction in lysosomal size, appearance of normal size lysosomes (similar to those in the WT), and lysosomal docking to the plasma membrane (inset). Bar: 10 µm.B. FDBmuscle of a GAA−/− mouse was transfected with both GFP-TFEB and mCherry-LAMP1 (GAA−/− + GFP-TFEB). Images were taken before (left) and after 4 h (right) of time-lapse microscopy. Lysosomal clearance is visible in the TFEB-transfected fibre at both time points. Lysosomes appear to \"exit\" the fibre (inset and arrow) at the 4 h time point when TFEB is activated as evidenced by its nuclear translocation (green nuclei). Bar: 10 µm.C. The mean maximum velocity of lysosomes (top) and the number of large (>3.5 µm) lysosomes (bottom) in untreated and TFEB-treated PD fibres (note: all data for Flag- and GFP-TFEB-treated fibres are pooled). Lysosomal velocities were calculated from time-lapse images using ImageJ software with the manual tracking plug-in. For each condition the trajectories of multiple lysosomes were followed (n = 26 untreated; n = 43 TFEB-treated) and the three highest velocity measurements per lysosome were recorded. In TFEB-treated fibres, the maximum velocity of lysosomes was significantly increased (p = 2.07 × 10−17) and the number of large lysosomes was significantly decreased (p = 1.0 × 10−3). Ten untreated and 24 TFEB-treated fibres were analysed for the size calculations. * indicates statistically significant differences (p ≤ 0.001; Student's t-test). Error bars represent 95% confidence intervals."}
{"words": ["Figure", "5Confocal", "microscopy", "images", "of", "live", "fibres", "from", "GFP", "-", "LC3", ":", "GAA", "−", "/", "−", "mice", ".", "Muscle", "was", "transfected", "with", "mCherry", "-", "LAMP1", "only", ".", "The", "image", "(", "a", "single", "frame", "from", "the", "time", "-", "lapse", "series", "presented", "in", "Movie", "5", ")", "shows", "lysosomes", "(", "red", ")", ",", "LC3", "-", "positive", "autophagosomes", "(", "green", ")", "and", "a", "number", "of", "autolysosomes", "(", "yellow", ")", ".", "Muscle", "was", "transfected", "with", "Flag", "-", "TFEB", "and", "mCherry", "-", "LAMP1", ".", "Massive", "formation", "of", "autolysosomes", "is", "indicated", "by", "yellow", "structures", ";", "the", "three", "lower", "panels", "provide", "a", "snapshot", "of", "the", "process", "of", "exocytosis", ".", "The", "structures", "at", "the", "plasma", "membrane", "are", "labelled", "with", "both", "LC3", "and", "LAMP1", ",", "indicating", "that", "they", "represent", "amphisomes", "(", "a", "product", "of", "fusion", "between", "autophagic", "vesicles", "and", "late", "endosomes", ")", "or", "autolysosomes", "(", "a", "product", "of", "fusion", "between", "autophagic", "vesicles", "and", "lysosomes", ")", ".", "Bar", ":", "10", " ", "µm", "for", "all", "panels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Confocal microscopy images of live fibres from GFP-LC3:GAA−/− mice.Muscle was transfected with mCherry-LAMP1 only. The image (a single frame from the time-lapse series presented in Movie 5) shows lysosomes (red), LC3-positive autophagosomes (green) and a number of autolysosomes (yellow).Muscle was transfected with Flag-TFEB and mCherry-LAMP1. Massive formation of autolysosomes is indicated by yellow structures; the three lower panels provide a snapshot of the process of exocytosis. The structures at the plasma membrane are labelled with both LC3 and LAMP1, indicating that they represent amphisomes (a product of fusion between autophagic vesicles and late endosomes) or autolysosomes (a product of fusion between autophagic vesicles and lysosomes). Bar: 10 µm for all panels."}
{"words": ["Figure", "6Confocal", "microscopy", "images", "of", "live", "fibres", "from", "muscle", "-", "specific", "autophagy", "-", "deficient", "GAA", "−", "/", "−", "mice", "(", "Atg7", ":", "GAA", "DKO", ")", ".", "Muscle", "was", "transfected", "with", "mCherry", "-", "LAMP1", "only", ".", "Muscle", "was", "transfected", "with", "GFP", "-", "TFEB", "and", "mCherry", "-", "LAMP1", "(", "Atg7", ":", "GAA", "DKO", "+", "GFP", "-", "TFEB", ")", ".", "The", "TFEB", "-", "transfected", "fibres", "show", "realignment", "of", "the", "lysosomes", "and", "membrane", "detachment", "(", "most", "striking", "in", "top", "and", "bottom", "panels", ")", "similar", "to", "those", "in", "TFEB", "-", "transfected", "fibres", "from", "PD", "mice", "(", "see", "Fig", "4B", "inset", ")", ".", "Lysosomes", "can", "be", "seen", "in", "the", "space", "between", "the", "fibre", "and", "plasma", "membrane", "(", "arrows", ")", ".", "Bar", ":", "10", " ", "µm", "for", "all", "panels", ".", "The", "mean", "maximum", "velocity", "of", "lysosomes", "(", "top", ")", "and", "the", "number", "of", "large", "(", ">", "3", ".", "5", " ", "µm", ")", "lysosomes", "(", "bottom", ")", "in", "untreated", "and", "TFEB", "-", "treated", "autophagy", "-", "deficient", "Atg7", ":", "GAA", "DKO", "fibres", ".", "The", "increase", "in", "maximum", "velocity", "(", "41", "%", ")", "is", "significant", "(", "p", " ", "=", " ", "2", ".", "729", " ", "×", " ", "10", "−", "18", ";", "n", " ", "=", " ", "57", "lysosomes", "for", "untreated", ";", "n", " ", "=", " ", "52", "lysosomes", "for", "TFEB", "-", "treated", ")", ",", "but", "there", "is", "only", "a", "slight", "trend", "toward", "smaller", "lysosomal", "size", "(", "p", " ", "=", " ", "7", ".", "0", " ", "×", " ", "10", "−", "2", ";", "n", " ", "=", " ", "10", "fibres", "for", "untreated", ";", "n", " ", "=", " ", "21", "fibres", "for", "TFEB", "-", "treated", ")", ".", "The", "corresponding", "values", "from", "GAA", "−", "/", "−", "mice", "are", "presented", "for", "comparison", "(", "for", "TFEB", "-", "treated", "condition", ":", "n", " ", "=", " ", "19", "lysosomes", "for", "velocity", "measurements", ",", "and", "n", " ", "=", " ", "10", "fibres", "for", "the", "lysosomal", "size", "measurements", ")", ".", "*", "indicates", "statistically", "significant", "differences", "(", "p", " ", "≤", " ", "1", ".", "0", " ", "×", " ", "10", "−", "5", "for", "the", "top", "panel", "and", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "01", "for", "the", "lower", "panel", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Confocal microscopy images of live fibres from muscle-specific autophagy-deficient GAA−/− mice (Atg7:GAA DKO).Muscle was transfected with mCherry-LAMP1 only.Muscle was transfected with GFP-TFEB and mCherry-LAMP1 (Atg7:GAA DKO +GFP-TFEB). The TFEB-transfected fibres show realignment of the lysosomes and membrane detachment (most striking in top and bottom panels) similar to those in TFEB-transfected fibres from PD mice (see Fig 4B inset). Lysosomes can be seen in the space between the fibre and plasma membrane (arrows). Bar: 10 µm for all panels.The mean maximum velocity of lysosomes (top) and the number of large (>3.5 µm) lysosomes (bottom) in untreated and TFEB-treated autophagy-deficient Atg7:GAA DKO fibres. The increase in maximum velocity (41%) is significant (p = 2.729 × 10−18; n = 57 lysosomes for untreated; n = 52 lysosomes for TFEB-treated), but there is only a slight trend toward smaller lysosomal size (p = 7.0 × 10−2; n = 10 fibres for untreated; n = 21 fibres for TFEB-treated). The corresponding values from GAA−/− mice are presented for comparison (for TFEB-treated condition: n = 19 lysosomes for velocity measurements, and n = 10 fibres for the lysosomal size measurements). * indicates statistically significant differences (p ≤ 1.0 × 10−5 for the top panel and p ≤ 0.01 for the lower panel; Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Glycogen", "assay", "in", "TFEB", "-", "injected", "gastrocnemii", "and", "in", "the", "contralateral", "muscles", ".", "In", "TFEB", "-", "injected", "musclesglycogen", "levels", "were", "significantly", "decreased", "compared", "to", "those", "in", "untreated", "muscles", ".", "*", "indicates", "statistically", "significant", "differences", "(", "p", " ", "=", " ", "1", ".", "0", " ", "×", " ", "10", "−", "4", ";", "n", " ", "=", " ", "6", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", ".", "PAS", "staining", "of", "TFEB", "-", "treated", "muscle", "shows", "a", "reduction", "of", "lysosomalglycogen", "stores", "(", "puncta", ")", "compared", "to", "those", "in", "untreated", "muscle", ".", "Original", "magnification", ":", "20", "×", ".", "C", ".", "LAMP1", "staining", "of", "TFEB", "-", "injected", "gastrocnemii", "and", "of", "the", "contralateral", "untreated", "muscles", ".", "In", "TFEB", "-", "treated", "muscles", ",", "the", "size", "of", "LAMP1", "-", "positive", "vesicles", "was", "reduced", ".", "Bar", ":", "2", " ", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Glycogen assay in TFEB-injected gastrocnemii and in the contralateral muscles. In TFEB-injected musclesglycogen levels were significantly decreased compared to those in untreated muscles. * indicates statistically significant differences (p = 1.0 × 10−4; n = 6; Student's t-test).B. PAS staining of TFEB-treated muscle shows a reduction of lysosomalglycogen stores (puncta) compared to those in untreated muscle. Original magnification: 20×.C. LAMP1 staining of TFEB-injected gastrocnemii and of the contralateral untreated muscles. In TFEB-treated muscles, the size of LAMP1-positive vesicles was reduced. Bar: 2 µm."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "EM", "images", "of", "muscle", "injected", "with", "either", "AAV", "-", "GFP", "(", "untreated", ")", "or", "AAV", "-", "TFEB", "(", "TFEB", "-", "treated", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "glycogen", "-", "containing", "lysosomes", ".", "Bar", ":", "1", ".", "5", " ", "µm", "(", "upper", "panels", ")", "and", "0", ".", "45", " ", "µm", "(", "lower", "panels", ")", ".", "Higher", "magnification", "images", "(", "lower", "panels", ")", "show", "that", "glycogen", "particles", "are", "less", "densely", "packed", "in", "TFEB", "-", "treated", "muscle", ".", "Black", "arrows", "indicate", "autophagosome", "profiles", ";", "the", "white", "empty", "arrow", "shows", "remnants", "of", "mitochondria", "engulfed", "by", "the", "lysosome", ".", "B", ".", "Graphical", "presentations", "of", "lysosomal", "length", "(", "average", " ", "±", " ", "SE", ";", "n", " ", "=", " ", "100", "lysosomes", ";", "p", " ", "=", " ", "6", ".", "31", " ", "×", " ", "10", "−", "5", ")", ",", "the", "number", "of", "lysosomes", "per", "5", " ", "µm2", "area", "of", "muscle", "fibre", "section", "(", "average", " ", "±", " ", "SE", ";", "n", " ", "=", " ", "50", "fields", ";", "p", " ", "=", " ", "4", ".", "80", " ", "×", " ", "10", "−", "3", ")", ",", "and", "the", "number", "of", "autophagosomes", "flanking", "glycogen", "-", "containing", "lysosomes", "(", "average", " ", "±", " ", "SE", ";", "n", " ", "=", " ", "100", "lysosomes", ";", "p", " ", "=", " ", "4", ".", "39", " ", "×", " ", "10", "−", "5", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "each", "comparison", ".", "C", ".", "Graphical", "presentations", "of", "mitochondrial", "size", "(", "average", " ", "±", " ", "SE", ";", "n", " ", "=", " ", "100", ")", "and", "the", "number", "of", "mitochondria", "per", "5", " ", "µm2", "area", "of", "muscle", "fibre", "section", "(", "average", " ", "±", " ", "SE", ";", "n", " ", "=", " ", "50", "fields", ")", ".", "The", "differences", "were", "not", "significant", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "p", " ", "=", " ", "3", ".", "65", " ", "×", " ", "10", "−", "1", "and", "4", ".", "27", " ", "×", " ", "10", "−", "1", ",", "respectively", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. EM images of muscle injected with either AAV-GFP (untreated) or AAV-TFEB (TFEB-treated). Asterisks indicate glycogen-containing lysosomes. Bar: 1.5 µm (upper panels) and 0.45 µm (lower panels). Higher magnification images (lower panels) show that glycogen particles are less densely packed in TFEB-treated muscle. Black arrows indicate autophagosome profiles; the white empty arrow shows remnants of mitochondria engulfed by the lysosome.B. Graphical presentations of lysosomal length (average ± SE; n = 100 lysosomes; p = 6.31 × 10−5), the number of lysosomes per 5 µm2 area of muscle fibre section (average ± SE; n = 50 fields; p = 4.80 × 10−3), and the number of autophagosomes flanking glycogen-containing lysosomes (average ± SE; n = 100 lysosomes; p = 4.39 × 10−5 < 0.001). Student's t-test was used for each comparison.C. Graphical presentations of mitochondrial size (average ± SE; n = 100) and the number of mitochondria per 5 µm2 area of muscle fibre section (average ± SE; n = 50 fields). The differences were not significant by Student's t-test (p = 3.65 × 10−1 and 4.27 × 10−1, respectively)."}
{"words": ["Figure", "1A", "Phenotypes", "of", "WT", "(", "Col", "-", "0", ")", ",", "two", "gso1", "mutant", "alleles", "(", "gso1", "-", "1", ",", "gso1", "-", "3", ")", "and", "two", "independent", "complementation", "lines", "(", "com", "-", "1", ",", "com", "-", "2", ")", ".", "Seedlings", "were", "grown", "on", "1", "/", "2", "MS", "for", "6", "days", "and", "then", "transferred", "to", "1", "/", "2", "MS", "medium", "supplemented", "with", "or", "without", "100", "mM", "NaCl", "for", "10", "days", ".", "B", ",", "C", "Primary", "root", "length", "and", "seedling", "fresh", "weight", "of", "seedlings", "depicted", "in", "(", "A", ")", "were", "measured", "at", "day", "10", "after", "transfer", ".", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "10", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Phenotypes of WT (Col-0), two gso1 mutant alleles (gso1-1, gso1-3) and two independent complementation lines (com-1, com-2). Seedlings were grown on 1/2 MS for 6 days and then transferred to 1/2 MS medium supplemented with or without 100 mM NaCl for 10 days. B,C Primary root length and seedling fresh weight of seedlings depicted in (A) were measured at day 10 after transfer. (mean ± SEM, n = 10, P < 0.05, two-way ANOVA)"}
{"words": ["Figure", "2A", "Co", "-", "IP", "of", "GSO1", "and", "SOS2", "using", "Arabidopsis", "protoplasts", "transiently", "expressing", "Myc", "-", "GSO1KD", "(", "GSO1", "kinase", "domain", ")", "and", "Flag", "-", "SOS2", ",", "Flag", "-", "HA", "-", "SOS3", "or", "Flag", "-", "SCaBP8", ".", "Protein", "extracts", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "C", "High", "resolution", "localization", "analyses", "of", "SOS2", "and", "GSO1", "expressed", "under", "their", "respective", "native", "promoter", "at", "1", ".", "5", "mm", "from", "the", "quiescent", "center", ".", "Propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "was", "used", "to", "stain", "the", "cell", "wall", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "(", "BF", ":", "brightfield", ")", "D", "Phenotypes", "of", "WT", "(", "Col", "-", "0", ")", ",", "gso1", "-", "3", ",", "sos2", "-", "2", "and", "gso1", "-", "3", "sos2", "-", "2", ".", "Seedlings", "were", "grown", "on", "1", "/", "2", "MS", "medium", "for", "6", "days", "and", "then", "transferred", "to", "1", "/", "2", "MS", "supplemented", "with", "or", "without", "extra", "NaCl", "for", "10", "days", ".", "E", ",", "F", "Primary", "root", "length", "and", "fresh", "weight", "of", "seedlings", "depicted", "in", "(", "D", ")", "were", "measured", "at", "day", "7", "after", "transfer", ".", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "10", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Co-IP of GSO1 and SOS2 using Arabidopsis protoplasts transiently expressing Myc-GSO1KD (GSO1 kinase domain) and Flag-SOS2, Flag-HA-SOS3 or Flag-SCaBP8. Protein extracts were immunoprecipitated with anti-Myc antibody and immunoblotted with anti-Myc antibody or anti-Flag antibody.C High resolution localization analyses of SOS2 and GSO1 expressed under their respective native promoter at 1.5 mm from the quiescent center. Propidium iodide (PI) was used to stain the cell wall. Scale bars: 100 µm. (BF: brightfield)D Phenotypes of WT (Col-0), gso1-3, sos2-2 and gso1-3 sos2-2. Seedlings were grown on 1/2 MS medium for 6 days and then transferred to 1/2 MS supplemented with or without extra NaCl for 10 days. E,F Primary root length and fresh weight of seedlings depicted in (D) were measured at day 7 after transfer. (mean ± SEM, n = 10, P < 0.05, two-way ANOVA)"}
{"words": ["Figure", "3A", "Yeast", "strain", "JP837", "cells", "transformed", "with", "empty", "vectors", "(", "control", ")", "or", "the", "indicated", "combinations", "of", "Arabidopsis", "genes", "were", "grown", "on", "AP", "medium", "supplemented", "with", "or", "without", "100", "mM", "NaCl", "for", "3", "days", "at", "28", "℃", ".", "(", "M", ":", "myristoylation", "motif", ",", "KD", ":", "kinase", "domain", ")", "G", "-", "L", "Phenotypes", ",", "primary", "root", "length", "and", "seedling", "fresh", "weight", "of", "indicated", "plant", "lines", "grown", "on", "1", "/", "2", "MS", "medium", "for", "6", "days", "and", "then", "transferred", "to", "1", "/", "2", "MS", "medium", "supplemented", "with", "100", "mM", "NaCl", "for", "7", "days", ".", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "10", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Yeast strain JP837 cells transformed with empty vectors (control) or the indicated combinations of Arabidopsis genes were grown on AP medium supplemented with or without 100 mM NaCl for 3 days at 28℃. (M: myristoylation motif, KD: kinase domain)G-L Phenotypes, primary root length and seedling fresh weight of indicated plant lines grown on 1/2 MS medium for 6 days and then transferred to 1/2 MS medium supplemented with 100 mM NaCl for 7 days. (mean ± SEM, n = 10, P < 0.05, one-way ANOVA)"}
{"words": ["Figure", "4A", "Coomassie", "Brilliant", "Blue", "stain", "(", "CBB", ")", "and", "autoradiograph", "of", "in", "vitro", "kinase", "assay", "combining", "the", "indicated", "combinations", "of", "SOS2", "/", "SOS2K40N", "and", "GSO1KD", "/", "GSO1KDK979N", ".", "B", "Immunoblot", "using", "anti", "-", "Myc", "antibody", "and", "CBB", "and", "autoradiograph", "from", "kinase", "assays", "combining", "Myc", "-", "SOS2", "with", "SOS1C300", "as", "substrate", ".", "10", "-", "day", "-", "old", "seedlings", "stably", "expressing", "Pro35S", ":", "6Myc", "-", "SOS2", "in", "Col", "-", "0", "or", "gso1", "-", "3", "were", "treated", "with", "or", "without", "100", "mM", "NaCl", "for", "12", "h", ",", "and", "Myc", "-", "SOS2", "protein", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "C", "-", "Myc", "antibody", "-", "conjugated", "agarose", "from", "roots", "was", "used", "in", "the", "assays", ".", "Signal", "strength", "of", "the", "phosphorylation", "bands", "has", "been", "calculated", "relative", "to", "the", "left", "lane", ".", "C", "CBB", "and", "autoradiograph", "of", "in", "vitro", "kinase", "assays", "combining", "GSO1KD", "(", "kinase", "domain", ")", "with", "SOS2K40N", "or", "SOS2T16AK40N", ".", "D", "CBB", "and", "autoradiograph", "of", "in", "vitro", "kinase", "assays", "using", "SOS2", "p", "-", "site", "variants", "addressing", "autophosphorylation", "activity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Coomassie Brilliant Blue stain (CBB) and autoradiograph of in vitro kinase assay combining the indicated combinations of SOS2/SOS2K40N and GSO1KD/GSO1KDK979N.B Immunoblot using anti-Myc antibody and CBB and autoradiograph from kinase assays combining Myc-SOS2 with SOS1C300 as substrate. 10-day-old seedlings stably expressing Pro35S:6Myc-SOS2 in Col-0 or gso1-3 were treated with or without 100 mM NaCl for 12 h, and Myc-SOS2 protein immunoprecipitated with anti-C-Myc antibody-conjugated agarose from roots was used in the assays. Signal strength of the phosphorylation bands has been calculated relative to the left lane.C CBB and autoradiograph of in vitro kinase assays combining GSO1KD (kinase domain) with SOS2K40N or SOS2T16AK40N. D CBB and autoradiograph of in vitro kinase assays using SOS2 p-site variants addressing autophosphorylation activity."}
{"words": ["Figure", "5A", "Phenotypes", "of", "WT", "(", "Col", "-", "0", ")", ",", "gso1", "-", "3", ",", "esb1", ",", "and", "casp1", "casp3", ".", "Seedlings", "were", "grown", "on", "1", "/", "2", "MS", "for", "6", "days", "and", "then", "transferred", "to", "1", "/", "2", "MS", "medium", "with", "or", "without", "100", "mM", "NaCl", "for", "10", "days", ".", "B", ",", "C", "Primary", "root", "length", "and", "seedling", "fresh", "weight", "of", "seedlings", "depicted", "in", "(", "A", ")", "were", "measured", "at", "day", "10", "after", "transfer", ".", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "12", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "G", "Phenotypes", "of", "WT", "(", "Col", "-", "0", ")", ",", "cif1", "cif2", ",", "and", "gso1", "-", "3", ".", "Seedlings", "were", "grown", "on", "1", "/", "2", "MS", "medium", "for", "6", "days", "and", "then", "transferred", "to", "1", "/", "2", "MS", "medium", "supplemented", "with", "or", "without", "100", "mM", "NaCl", "for", "10", "days", ".", "J", "Quantification", "of", "Fluorol", "Yellow", "fluorescence", "intensity", "indicating", "amounts", "of", "suberin", "accumulation", "in", "maximum", "projections", "of", "z", "-", "stacks", "in", "the", "first", "mm", "of", "the", "continuously", "suberized", "endodermis", "in", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Seedlings", "were", "grown", "on", "1", "/", "2", "MS", "for", "5", "days", "and", "then", "treated", "with", "the", "indicated", "NaCl", "concentrations", "for", "2", "days", ".", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "-", "5", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "post", "hoc", "Tukey", "Kramer", "test", ",", "different", "letters", "indicate", "significant", "difference", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Phenotypes of WT (Col-0), gso1-3, esb1, and casp1 casp3. Seedlings were grown on 1/2 MS for 6 days and then transferred to 1/2 MS medium with or without 100 mM NaCl for 10 days. B, C Primary root length and seedling fresh weight of seedlings depicted in (A) were measured at day 10 after transfer. (mean ± SEM, n = 12, two-way ANOVA, P < 0.05)G Phenotypes of WT (Col-0), cif1 cif2, and gso1-3. Seedlings were grown on 1/2 MS medium for 6 days and then transferred to 1/2 MS medium supplemented with or without 100 mM NaCl for 10 days.J Quantification of Fluorol Yellow fluorescence intensity indicating amounts of suberin accumulation in maximum projections of z-stacks in the first mm of the continuously suberized endodermis in the indicated genotypes. Seedlings were grown on 1/2 MS for 5 days and then treated with the indicated NaCl concentrations for 2 days. (mean ± SEM, n = 3-5, P < 0.05, one-way ANOVA and post hoc Tukey Kramer test, different letters indicate significant difference)"}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "D", "Protein", "accumulation", "(", "A", ",", "C", ",", "D", ")", "or", "gene", "expression", "(", "B", ")", "of", "SOS2", ",", "CIF2", ",", "GSO1", ",", "and", "SGN1", "displayed", "as", "false", "color", "fluorescence", "intensity", ".", "Seedlings", "from", "the", "indicated", "plant", "lines", "were", "grown", "on", "1", "/", "2", "MS", "for", "4", "-", "5", "days", "and", "then", "transferred", "to", "1", "/", "2", "MS", "with", "or", "without", "100", "mM", "NaCl", "for", "1", "day", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "µm", ".", "E", "-", "H", "Longitudinal", "quantification", "of", "protein", "accumulation", "or", "gene", "expression", "depicted", "in", "(", "A", "-", "D", ")", "represented", "as", "8", "-", "bit", "fluorescence", "intensity", ".", "(", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "4", "-", "5", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-D Protein accumulation (A, C, D) or gene expression (B) of SOS2, CIF2, GSO1, and SGN1 displayed as false color fluorescence intensity. Seedlings from the indicated plant lines were grown on 1/2 MS for 4-5 days and then transferred to 1/2 MS with or without 100 mM NaCl for 1 day. Scale bars: 200 µm.E-H Longitudinal quantification of protein accumulation or gene expression depicted in (A-D) represented as 8-bit fluorescence intensity. (Mean ± SEM, n = 4-5)"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "In", "vivo", "fundusimage", "of", "an", "AAV", "-", "injected", "rd1mouse", "expressing", "ReaChR", "-", "mCitrine", "driven", "by", "the", "hSyn", "promoter", "(", "AAV2", "-", "hSyn", ":", "ReaChR", "-", "mCitrine", ")", ";", "transduced", "RGCs", "are", "visible", "as", "green", "puncta", ".", "(", "B", ")", "Live", "2", "-", "photon", "image", "showing", "that", "ReaChR", "-", "mCitrine", "expression", "is", "restricted", "to", "RGC", "-", "membranes", "and", "their", "dendritic", "processes", ".", "(", "C", ")", "Confocal", "image", "of", "a", "vertical", "retinal", "section", "expressing", "ReaChR", "-", "mCitrine", ".", "Endogenous", "mCitrine", "(", "mCit", ")", "fluorescence", ",", "is", "localized", "to", "RGCmembranes", "as", "well", "as", "RGCdendritic", "processes", "(", "see", "also", "Fig", "EV1A", ")", ";", "blue", ":", "DAPI", "(", "to", "visualize", "retinalnuclei", ")", ";", "inner", "nuclear", "layer", "(", "INL", ")", ";", "inner", "plexiform", "layer", "(", "IPL", ")", "and", "ganglion", "cell", "layer", "(", "GCL", ")", ";", "scale", "bars", "=", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) In vivo fundusimage of an AAV-injected rd1mouse expressing ReaChR-mCitrine driven by the hSyn promoter (AAV2-hSyn:ReaChR-mCitrine); transduced RGCs are visible as green puncta.(B) Live 2-photon image showing that ReaChR-mCitrine expression is restricted to RGC-membranes and their dendritic processes.(C) Confocal image of a vertical retinal section expressing ReaChR-mCitrine. Endogenous mCitrine (mCit) fluorescence, is localized to RGCmembranes as well as RGCdendritic processes (see also Fig EV1A); blue: DAPI (to visualize retinalnuclei); inner nuclear layer (INL); inner plexiform layer (IPL) and ganglion cell layer (GCL); scale bars = 10 µm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Light", "sensitivity", ":", "Photocurrents", "of", "a", "ReaChR", "-", "expressing", "RGC", "stimulated", "with", "varying", "light", "intensities", "at", "590", "nm", "(", "~", "1013", "−", "1018", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", ".", "(", "B", ")", "ReaChR", "-", "induced", "photocurrents", "as", "a", "function", "of", "light", "intensity", "(", "590", "nm", ",", "n", "=", "7", "cells", ",", "mean", "photocurrent", "amplitude", "at", "4", ".", "2", "×", "1017", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", "was", "−", "349", "±", "192", "pA", ")", ".", "At", "the", "bottom", ",", "the", "sensitivity", "range", "for", "wild", "-", "type", "cones", "(", "Nikonov", "et", "al", ",", "2006", ")", "is", "shown", "in", "comparison", "to", "the", "sensitivity", "range", "of", "ReaChR", "expressing", "RGCs", ".", "The", "dashed", "blue", "and", "orange", "line", "indicate", "the", "maximum", "light", "intensities", "allowed", "in", "the", "human", "eye", "at", "470nm", "and", "590", "nm", ",", "respectively", "(", "EU", "-", "Directive", ",", "2006", ";", "ICNIRP", ",", "2013", ")", ".", "(", "C", ")", "Photocurrent", "action", "spectrum", "of", "a", "ReaChR", "-", "expressing", "RGC", "(", "1", ".", "2", "×", "1016", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", ".", "(", "D", ")", "Normalized", "action", "spectrums", "of", "ReaChR", "-", "RGCs", ".", "Solid", "line", "represents", "patch", "-", "clamp", "data", "(", "n", "=", "8", "cells", ";", "1", ".", "2", "×", "1016", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", ".", "The", "mean", "photocurrent", "amplitude", "at", "550", "nm", "was", "−", "324", "±", "97", "pA", ".", "Dashed", "line", "represents", "multi", "-", "electrode", "array", "data", "(", "n", "=", "168", "cells", ";", "~", "1016", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", ".", "(", "E", ")", "Temporal", "properties", ".", "Modulation", "of", "ReaChR", "-", "induced", "photocurrents", "at", "increasing", "stimulation", "frequencies", "(", "patch", "-", "clamp", "recording", "from", "a", "ReaChR", "-", "expressing", "RGC", ";", "at", "22", "Hz", "magnified", "trace", "is", "shown", ";", "1", ".", "3", "×", "1016", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", ".", "(", "F", ")", "Spiking", "modulation", "ratio", "of", "ReaChR", "-", "RGCs", "quantified", "from", "multi", "-", "electrode", "array", "demonstrates", "reliable", "spike", "triggering", "at", "frequencies", "up", "to", "30", "Hz", "(", "297", "cells", ",", "1", ".", "3", "×", "1016", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Light sensitivity: Photocurrents of a ReaChR-expressing RGC stimulated with varying light intensities at 590 nm (~1013 − 1018 photons cm-2 s-1).(B) ReaChR-induced photocurrents as a function of light intensity (590 nm, n = 7 cells, mean photocurrent amplitude at 4.2 × 1017 photons cm-2 s-1 was −349 ± 192 pA). At the bottom, the sensitivity range for wild-type cones (Nikonov et al, 2006) is shown in comparison to the sensitivity range of ReaChR expressing RGCs. The dashed blue and orange line indicate the maximum light intensities allowed in the human eye at 470nm and 590 nm, respectively (EU-Directive, 2006; ICNIRP, 2013).(C) Photocurrent action spectrum of a ReaChR-expressing RGC (1.2 × 1016 photons cm-2 s-1). (D) Normalized action spectrums of ReaChR-RGCs. Solid line represents patch-clamp data (n = 8 cells; 1.2 × 1016 photons cm-2 s-1). The mean photocurrent amplitude at 550 nm was −324 ± 97 pA. Dashed line represents multi-electrode array data (n = 168 cells; ~1016 photons cm-2 s-1).(E) Temporal properties. Modulation of ReaChR-induced photocurrents at increasing stimulation frequencies (patch-clamp recording from a ReaChR-expressing RGC; at 22 Hz magnified trace is shown; 1.3×1016 photons cm-2 s-1). (F) Spiking modulation ratio of ReaChR-RGCs quantified from multi-electrode array demonstrates reliable spike triggering at frequencies up to 30 Hz (297 cells, 1.3 × 1016 photons cm-2 s-1)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Examples", "of", "local", "field", "potential", "(", "LFP", ")", "traces", "in", "response", "to", "light", "flashes", "at", "595", "nm", "(", "light", "stimulus", "is", "shown", "as", "orange", "bar", ";", "1", ".", "25", "×", "1017", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", ".", "(", "B", ")", "Spike", "raster", "plots", "in", "response", "to", "200", "repetitions", "of", "the", "same", "light", "stimulus", ".", "(", "C", ")", "Averaged", "spike", "responses", "shown", "as", "peristimulus", "time", "histograms", "(", "PSTH", ",", "bin", "size", ":", "5", "ms", ")", "based", "on", "the", "spike", "raster", "plots", ".", "Top", "-", "row", ":", "WT", "-", "mice", ",", "middle", "row", ":", "rd1", "control", "mice", ",", "bottom", "-", "row", ":", "ReaChR", "-", "treated", "rd1", "mice", ".", "(", "D", ")", "ReaChR", "-", "induced", "cortical", "responses", "(", "spikes", "and", "LFP", ")", "as", "a", "function", "of", "light", "intensity", "at", "(", "595", "nm", ")", "demonstrating", "that", "ReaChR", "-", "treated", "rd1", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "can", "detect", "light", "in", "the", "visual", "cortex", "at", "intensities", "well", "below", "the", "safety", "threshold", "allowed", "for", "the", "humanretina", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Examples of local field potential (LFP) traces in response to light flashes at 595 nm (light stimulus is shown as orange bar; 1.25 × 1017 photons cm-2 s-1). (B) Spike raster plots in response to 200 repetitions of the same light stimulus. (C) Averaged spike responses shown as peristimulus time histograms (PSTH, bin size: 5 ms) based on the spike raster plots. Top-row: WT-mice, middle row: rd1 control mice, bottom-row: ReaChR-treated rd1 mice. (D) ReaChR-induced cortical responses (spikes and LFP) as a function of light intensity at (595 nm) demonstrating that ReaChR-treated rd1 mice (n = 4) can detect light in the visual cortex at intensities well below the safety threshold allowed for the humanretina. Data presented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Locomotory", "behavior", "of", "a", "representative", "rd1", "and", "ReaChR", "-", "treated", "mouse", "during", "illumination", "with", "light", "at", "590", "nm", "in", "an", "open", "field", "arena", "(", "irradiance", "measured", "at", "the", "level", "of", "the", "mice", "'", "s", "eyes", "was", "~", "1015", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ",", "cumulative", "activity", "trajectories", "are", "shown", "as", "red", "traces", "after", "2", "min", "of", "illumination", ")", ",", "see", "also", "EV", "Movie", "1", "and", "EV", "Movie", "2", ".", "(", "B", ")", "Mean", "velocities", "of", "the", "ReaChR", "-", "treated", "and", "rd1mice", "analyzed", "over", "a", "duration", "of", "2", "min", "at", "light", "onset", ".", "The", "mean", "velocity", "of", "ReaChR", "-", "treated", "mice", "were", "significantly", "reduced", "than", "rd1mice", "(", "P", "=", "0", ".", "006", ",", "one", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", "upon", "illumination", ".", "Mean", "±", "SEM", "are", "shown", "for", "each", "group", ".", "ReaChR", "-", "treated", "rd1", "(", "n", "=", "11", ")", ",", "rd1", "(", "n", "=", "12", ")", ".", "(", "C", ")", "Light", "/", "dark", "box", "test", ".", "Percentage", "of", "time", "mice", "spent", "in", "the", "light", "compartment", "as", "a", "function", "of", "light", "intensity", "(", "WT", ",", "n", "=", "9", ";", "rd1", ",", "n", "=", "9", ";", "ReaChR", "-", "treated", "n", "=", "7", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "are", "shown", "for", "each", "group", ".", "(", "D", ")", "Percentage", "of", "time", "rd1", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "WT", "(", "n", "=", "9", ")", "and", "ReaChR", "-", "treated", "(", "n", "=", "7", ")", "mice", "spent", "in", "the", "light", "compartment", "for", "an", "illumination", "intensity", "of", "2", ".", "11", "×", "1015", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ".", "Both", "WT", "as", "well", "as", "ReaChR", "-", "treated", "mice", "spent", "significantly", "less", "time", "in", "the", "light", "compartment", "than", "the", "rd1mice", "(", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "*", "*", "*", "and", "*", "*", "*", "*", "indicates", "significance", "levels", "determined", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "for", "rd1", "vs", ".", "WT", "and", "rd1", "vs", ".", "ReaChR", "-", "treated", ".", "See", "also", "EV", "Movie", "3", "for", "the", "response", "of", "a", "representative", "ReaChR", "-", "treated", "rd1", "mouse", "plotted", "in", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Locomotory behavior of a representative rd1 and ReaChR-treated mouse during illumination with light at 590 nm in an open field arena (irradiance measured at the level of the mice's eyes was ~1015 photons cm-2 s-1, cumulative activity trajectories are shown as red traces after 2 min of illumination), see also EV Movie 1 and EV Movie 2. (B) Mean velocities of the ReaChR-treated and rd1mice analyzed over a duration of 2 min at light onset. The mean velocity of ReaChR-treated mice were significantly reduced than rd1mice (P = 0.006, one-tailed t-test) upon illumination. Mean ± SEM are shown for each group. ReaChR-treated rd1 (n = 11), rd1 (n = 12).(C) Light/dark box test. Percentage of time mice spent in the light compartment as a function of light intensity (WT, n = 9; rd1, n = 9; ReaChR-treated n = 7). Mean ± SEM are shown for each group. (D) Percentage of time rd1 (n = 9), WT (n = 9) and ReaChR-treated (n = 7) mice spent in the light compartment for an illumination intensity of 2.11 × 1015 photons cm-2 s-1. Both WT as well as ReaChR-treated mice spent significantly less time in the light compartment than the rd1mice (P < 0.0001, ordinary one-way ANOVA). *** and **** indicates significance levels determined by Tukey's multiple comparisons test for rd1 vs. WT and rd1 vs. ReaChR-treated. See also EV Movie 3 for the response of a representative ReaChR-treated rd1 mouse plotted in (D)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Vertical", "section", "of", "macaqueretinal", "explant", "transfected", "with", "AAV2", "hSyn", ":", "ReaChR", "-", "mCit", "after", "10", "days", "of", "incubation", "exhibiting", "mCitrine", "expresssion", "densely", "in", "neuronal", "processes", "in", "the", "GCL", ".", "(", "B", ")", "Vertical", "section", "of", "macaqueretinal", "explant", "transfected", "with", "AAV8", "Y447", "733F", "-", "CAG", ":", "ReaChR", "-", "GFP", "after", "3", "days", "of", "incubation", ".", "GFP", "expression", "was", "primarily", "observed", "in", "the", "cell", "bodies", "but", "also", "in", "processes", "of", "RGCs", ";", "green", ":", "endogenous", "GFP", "fluorescence", ";", "blue", ":", "DAPI", ";", "outer", "nuclear", "layer", "(", "ONL", ")", ".", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Averaged", "spike", "responses", "obtained", "from", "multi", "-", "electrode", "array", "recordings", "shown", "as", "PSTH", "of", "4", ",", "8", "and", "2", "cells", "respectively", "of", "three", "different", "macaques", "(", "580", "nm", ";", "1", ".", "24", "×", "1017", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", ".", "PSTHs", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "dashed", "lines", ",", "calculated", "over", "responding", "cells", ")", ".", "Raster", "plots", "of", "a", "representative", "cell", "from", "each", "individual", "macaque", "are", "shown", "below", "(", "10", "stimulus", "-", "repetitions", ")", ".", "(", "D", ")", "Action", "spectrum", "of", "ReaChR", "in", "primate", "RGCs", "from", "multi", "-", "electrode", "array", "recordings", ".", "Data", "is", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "the", "normalized", "firing", "rate", ",", "averaged", "from", "three", "individual", "macaques", "(", "28", "cells", ",", "error", "bars", "calculated", "over", "cells", ")", ",", "see", "also", "Fig", "EV2B", "for", "action", "spectrums", "of", "three", "individual", "macaques", "obtained", "from", "multi", "-", "electrode", "array", "recordings", ".", "(", "E", ")", "Responses", "(", "Hz", ")", "of", "a", "ReaChR", "-", "expressing", "RGC", "(", "patch", "clamp", "recording", ",", "in", "cell", "-", "attached", "mode", ")", "to", "flicker", "stimulations", "at", "increasing", "frequencies", "(", "2", "−", "22", "Hz", ";", "1", ".", "3", "×", "1016", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Vertical section of macaqueretinal explant transfected with AAV2 hSyn:ReaChR-mCit after 10 days of incubation exhibiting mCitrine expresssion densely in neuronal processes in the GCL. (B) Vertical section of macaqueretinal explant transfected with AAV8 Y447 733F-CAG:ReaChR-GFP after 3 days of incubation. GFP expression was primarily observed in the cell bodies but also in processes of RGCs; green: endogenous GFP fluorescence; blue: DAPI; outer nuclear layer (ONL). scale bars = 10 µm.(C) Averaged spike responses obtained from multi-electrode array recordings shown as PSTH of 4, 8 and 2 cells respectively of three different macaques (580 nm; 1.24 × 1017 photons cm-2 s-1). PSTHs are presented as mean ± SEM (dashed lines, calculated over responding cells). Raster plots of a representative cell from each individual macaque are shown below (10 stimulus-repetitions).(D) Action spectrum of ReaChR in primate RGCs from multi-electrode array recordings. Data is shown as mean ± SEM of the normalized firing rate, averaged from three individual macaques (28 cells, error bars calculated over cells), see also Fig EV2B for action spectrums of three individual macaques obtained from multi-electrode array recordings. (E) Responses (Hz) of a ReaChR-expressing RGC (patch clamp recording, in cell-attached mode) to flicker stimulations at increasing frequencies (2−22 Hz; 1.3 × 1016 photons cm-2 s-1)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Brightfield", "image", "of", "the", "retinal", "explant", "showing", "the", "macula", "(", "yellow", "pigmented", ")", "with", "the", "approximate", "location", "of", "the", "multi", "-", "electrode", "array", "chip", "indicated", ".", "(", "C", ")", "Infrared", "image", "of", "the", "explant", "pressed", "against", "the", "multi", "-", "electrode", "array", ";", "the", "black", "dashed", "line", "depicts", "the", "'", "electrophysiological", "boundary", "'", "of", "the", "para", "-", "fovea", "based", "on", "the", "absence", "of", "RGC", "-", "spike", "trains", "(", "scale", "bar", ":", "100", "µm", ";", "see", "also", "Fig", "EV3A", "and", "B", ")", ".", "Voltage", "trace", "of", "a", "para", "-", "foveal", "RGC", "stimulated", "with", "orange", "light", "(", "600", "nm", ";", "1", ".", "1", "×", "1017", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Individual", "electrodes", "that", "recorded", "ReaChR", "-", "responding", "cells", "are", "indicated", "in", "green", ".", "(", "D", ")", "Action", "spectrum", "of", "ReaChR", "constructed", "from", "(", "6", "cells", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "error", "bars", "calculated", "over", "cells", ")", "exhibiting", "peak", "activity", "at", "550", "nm", "(", "1", ".", "1", "×", "1017", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", "similar", "to", "what", "was", "observed", "in", "mice", "and", "in", "the", "macaqueretinae", ".", "(", "E", ")", "Peristimulus", "time", "histograms", "constructed", "for", "wavelengths", "400", "to", "650", "nm", "(", "1", ".", "1", "×", "1017", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", "demonstrate", "ReaChR", "-", "evoked", "spike", "trains", "(", "under", "L", "-", "AP4", ")", "in", "the", "humanretina", "(", "6", "cells", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "error", "bars", "calculated", "over", "cells", ")", ",", "bin", "size", ":", "100", "ms", ";", "Bottom", ":", "Raster", "plots", "of", "the", "light", "responses", "of", "a", "representative", "spike", "-", "sorted", "cell", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Brightfield image of the retinal explant showing the macula (yellow pigmented) with the approximate location of the multi-electrode array chip indicated.(C) Infrared image of the explant pressed against the multi-electrode array; the black dashed line depicts the 'electrophysiological boundary' of the para-fovea based on the absence of RGC-spike trains (scale bar: 100 µm; see also Fig EV3A and B). Voltage trace of a para-foveal RGC stimulated with orange light (600 nm; 1.1 × 1017 photons cm-2 s-1) is shown on the right. Individual electrodes that recorded ReaChR-responding cells are indicated in green.(D) Action spectrum of ReaChR constructed from (6 cells, mean ± SEM, error bars calculated over cells) exhibiting peak activity at 550 nm (1.1 × 1017 photons cm-2 s-1) similar to what was observed in mice and in the macaqueretinae.(E) Peristimulus time histograms constructed for wavelengths 400 to 650 nm (1.1 × 1017 photons cm-2 s-1) demonstrate ReaChR-evoked spike trains (under L-AP4) in the humanretina (6 cells, mean ± SEM, error bars calculated over cells), bin size: 100 ms; Bottom: Raster plots of the light responses of a representative spike-sorted cell."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Confocal", "image", "of", "the", "central", "retina", ",", "exhibiting", "endogenous", "ReaChR", "-", "mCitrine", "fluorescence", "(", "mCit", ")", "in", "ganglion", "cells", ",", "located", "within", "~", "500", "µm", "from", "the", "center", "of", "the", "foveal", "pit", ",", "a", "part", "of", "the", "humanretina", "where", "midget", "cell", "density", "is", "estimated", "to", "be", "~", "95", "%", "of", "total", "RGC", "population", "(", "Dacey", ",", "1993", ")", "(", "arrowhead", ":", "soma", ";", "arrow", ":", "dendritic", "arbor", ")", ".", "The", "dashed", "line", "illustrates", "the", "beginning", "of", "the", "foveal", "slope", "leading", "towards", "the", "'", "cone", "-", "only", "'", "foveal", "pit", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "image", "of", "the", "same", "explant", "at", "a", "higher", "retinal", "eccentricity", "(", "3", "-", "4", "mm", "from", "the", "foveal", "center", ")", "showing", "ReaChR", "-", "mCitrine", "fluorescence", "in", "RGCs", "with", "larger", "dendritic", "arbors", ".", "The", "endogenous", "mCitrine", "was", "not", "amplified", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "PR", ":", "Photoreceptors", ",", "GC", ":", "Ganglion", "cells", ",", "DAPI", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Confocal image of the central retina, exhibiting endogenous ReaChR-mCitrine fluorescence (mCit) in ganglion cells, located within ~500 µm from the center of the foveal pit, a part of the humanretina where midget cell density is estimated to be ~95% of total RGC population (Dacey, 1993) (arrowhead: soma; arrow: dendritic arbor). The dashed line illustrates the beginning of the foveal slope leading towards the 'cone-only' foveal pit. (B) Confocal image of the same explant at a higher retinal eccentricity (3-4 mm from the foveal center) showing ReaChR-mCitrine fluorescence in RGCs with larger dendritic arbors. The endogenous mCitrine was not amplified. Scale bars: 10 µm. PR: Photoreceptors, GC: Ganglion cells, DAPI (blue)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Humanretinal", "explant", ",", "prepared", "from", "the", "far", "periphery", ",", "infected", "with", "an", "AAV8", "Y447", "733F", "-", "CAG", ":", "ReaChR", "-", "GFP", ",", "placed", "on", "a", "multi", "-", "electrode", "array", "chip", "(", "left", ")", ";", "GFP", "epifluorescence", "of", "the", "same", "explant", "following", "12", "days", "of", "incubation", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "The", "location", "of", "two", "cells", "that", "responded", "to", "repeated", "2", "s", "full", "field", "stimulations", "of", "orange", "light", "(", "600", "nm", ")", "are", "highlighted", ".", "(", "B", ")", "The", "corresponding", "voltage", "traces", "show", "that", "the", "responses", "in", "the", "far", "peripheral", "humanretina", "are", "more", "transient", ",", "compared", "to", "the", "experiments", "from", "the", "human", "para", "-", "fovea", "(", "see", "Fig", "6C", "and", "E", ",", "Fig", "EV3B", ")", "where", "only", "sustained", "light", "responses", "were", "evoked", ".", "The", "light", "response", "of", "cell", "(", "2", ")", "was", "restricted", "to", "a", "burst", "of", "action", "potentials", "fired", "within", "the", "initial", "~", "300", "ms", "in", "response", "to", "a", "2", "s", "full", "field", "600", "nm", "light", "stimulus", ".", "(", "C", ")", "Peristimulus", "time", "histograms", "constructed", "for", "wavelengths", "from", "400", "to", "650", "nm", "(", "1", ".", "1", "×", "1017", "photons", "cm", "-", "2", "s", "-", "1", ")", "demonstrate", "AAV", "-", "ReaChR", "-", "evoked", "spike", "trains", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "error", "bars", "calculated", "over", "3", "-", "4", "cells", ",", "bin", "size", ":", "100", "ms", ")", "Bottom", ":", "Raster", "plots", "of", "the", "light", "responses", "of", "a", "representative", "spike", "-", "sorted", "cell", ".", "All", "recordings", "were", "performed", "under", "pharmacological", "blockade", "of", "photoreceptor", "input", "(", "50", "µM", "L", "-", "AP4", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Humanretinal explant, prepared from the far periphery, infected with an AAV8 Y447 733F-CAG :ReaChR-GFP, placed on a multi-electrode array chip (left); GFP epifluorescence of the same explant following 12 days of incubation is shown on the right. Scale bars: 100 µm. The location of two cells that responded to repeated 2 s full field stimulations of orange light (600 nm) are highlighted.(B) The corresponding voltage traces show that the responses in the far peripheral humanretina are more transient, compared to the experiments from the human para-fovea (see Fig 6C and E, Fig EV3B) where only sustained light responses were evoked. The light response of cell (2) was restricted to a burst of action potentials fired within the initial ~300 ms in response to a 2 s full field 600 nm light stimulus.(C) Peristimulus time histograms constructed for wavelengths from 400 to 650 nm (1.1 × 1017 photons cm-2 s-1) demonstrate AAV-ReaChR-evoked spike trains (mean ± SEM, error bars calculated over 3-4 cells, bin size: 100 ms) Bottom: Raster plots of the light responses of a representative spike-sorted cell. All recordings were performed under pharmacological blockade of photoreceptor input (50 µM L-AP4)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Histograms", "of", "crossovers", "(", "blue", ")", "per", "F2", "individual", "in", "the", "indicated", "populations", ",", "with", "the", "Poisson", "expectation", "plotted", "in", "red", ".", "Mean", "values", "are", "indicated", "by", "the", "black", "dotted", "lines", ".", "The", "genome", "average", "SNPs", "/", "kb", "for", "each", "cross", "are", "printed", "above", "the", "plots", ".", "B", ".", "Crossovers", "per", "200", "kb", "per", "F2", "plotted", "along", "the", "Arabidopsis", "chromosomes", ".", "Mean", "values", "are", "shown", "by", "horizontal", "dashed", "lines", ".", "SNPs", "per", "200", "kb", "are", "plotted", "and", "shaded", "in", "colour", "(", "Col", "×", "Ws", "(", "purple", ")", ",", "Col", "×", "Bur", "(", "Lawrence", "et", "al", ",", "2019", ")", "(", "dark", "green", ")", ",", "Col", "×", "Ct", "(", "light", "blue", ")", ",", "Col", "×", "Ler", "F2", "populations", "with", "17", ",", "077", "(", "red", ")", "and", "1", ",", "840", "(", "blue", ")", "crossovers", "(", "Serra", "et", "al", ",", "2018b", ";", "Rowan", "et", "al", ",", "2019", ")", "and", "Col", "×", "CLC", "(", "pink", "/", "light", "green", ",", "where", "pink", "indicates", "Cvi", "SNPs", "and", "green", "indicates", "Ler", "SNPs", ")", ")", ".", "The", "positions", "of", "telomeres", "(", "TEL", ")", "and", "centromeres", "(", "CEN", ")", "are", "indicated", ".", "The", "number", "of", "crossovers", "analysed", "is", "printed", "inset", ".", "C", ".", "Data", "as", "for", "B", ",", "but", "analyzing", "crossovers", "(", "lines", ")", "or", "SNPs", "(", "shading", ")", "along", "proportionally", "scaled", "chromosome", "arms", ",", "orientated", "from", "telomere", "(", "TEL", ")", "to", "centromere", "(", "CEN", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Histograms of crossovers (blue) per F2 individual in the indicated populations, with the Poisson expectation plotted in red. Mean values are indicated by the black dotted lines. The genome average SNPs/kb for each cross are printed above the plots.B. Crossovers per 200 kb per F2 plotted along the Arabidopsis chromosomes. Mean values are shown by horizontal dashed lines. SNPs per 200 kb are plotted and shaded in colour (Col×Ws (purple), Col×Bur (Lawrence et al, 2019) (dark green), Col×Ct (light blue), Col×Ler F2 populations with 17,077 (red) and 1,840 (blue) crossovers (Serra et al, 2018b; Rowan et al, 2019) and Col×CLC (pink/light green, where pink indicates Cvi SNPs and green indicates Ler SNPs)). The positions of telomeres (TEL) and centromeres (CEN) are indicated. The number of crossovers analysed is printed inset. C. Data as for B, but analyzing crossovers (lines) or SNPs (shading) along proportionally scaled chromosome arms, orientated from telomere (TEL) to centromere (CEN)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Crossover", "frequency", "normalised", "by", "the", "number", "of", "F2", "individuals", ",", "and", "SNP", "density", "in", "100", "kilobase", "(", "kb", ")", "adjacent", "windows", "were", "calculated", "for", "each", "population", "and", "ranked", "into", "percentiles", "according", "to", "SNP", "density", ".", "Centromeric", "regions", "were", "excluded", "from", "analysis", "(", "Underwood", "et", "al", ",", "2018", ")", ".", "The", "Spearman", "'", "s", "rank", "correlation", "coefficient", "(", "r", ")", "between", "SNP", "density", "and", "crossover", "frequency", "is", "printed", "inset", ".", "Trend", "lines", "were", "fitted", "in", "ggplot", "using", "a", "generalized", "additive", "model", "(", "GAM", ")", "with", "the", "formula", "y", "~", "poly", "(", "x", ",", "2", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Crossover frequency normalised by the number of F2 individuals, and SNP density in 100 kilobase (kb) adjacent windows were calculated for each population and ranked into percentiles according to SNP density. Centromeric regions were excluded from analysis (Underwood et al, 2018). The Spearman's rank correlation coefficient (r) between SNP density and crossover frequency is printed inset. Trend lines were fitted in ggplot using a generalized additive model (GAM) with the formula y~poly(x,2)."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "SNPs", "/", "kb", "in", "physical", "windows", "of", "increasing", "size", "(", "kb", ")", "around", "crossover", "midpoints", "(", "red", ")", ",", "or", "for", "matched", "randomly", "chosen", "positions", "(", "grey", ")", ".", "Printed", "above", "the", "plot", "for", "each", "window", "are", "circles", "coloured", "green", "if", "crossover", "SNPs", "/", "kb", "values", "are", "significantly", "different", "to", "random", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "or", "red", "if", "not", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", "(", "Bonferroni", "adjusted", "t", "-", "tests", ")", ".", "The", "population", "(", "Col", "×", "Ws", ",", "Col", "×", "Bur", "(", "Lawrence", "et", "al", ",", "2019", ")", ",", "Col", "×", "Ct", ",", "Col", "×", "Ler", "(", "Serra", "et", "al", ",", "2018b", ";", "Rowan", "et", "al", ",", "2019", ")", "and", "Col", "×", "CLC", ")", "is", "printed", "above", "each", "plot", ",", "and", "the", "number", "of", "positions", "analysed", "is", "printed", "inset", ".", "B", ".", "As", "for", "A", ",", "but", "analyzing", "the", "indicated", "Col", "/", "Ler", "transition", "and", "transversion", "polymorphisms", "around", "Col", "×", "Ler", "crossovers", "(", "Rowan", "et", "al", ",", "2019", ")", "(", "red", ")", ",", "or", "the", "same", "number", "of", "random", "positions", "(", "grey", ")", ".", "C", ".", "As", "for", "A", ",", "but", "analysing", "Col", "/", "Ler", "SNPs", "/", "kb", "around", "crossovers", "from", "wild", "type", ",", "HEI10", "-", "OE", ",", "recq4a", "recq4b", "or", "HEI10", "-", "OE", "recq4a", "recq4b", "(", "Serra", "et", "al", ",", "2018b", ")", ".", "All", "populations", "were", "generated", "from", "Col", "×", "Ler", "hybrids", ".", "Printed", "beneath", "are", "the", "estimated", "average", "numbers", "of", "Class", "I", "and", "Class", "II", "crossovers", "per", "meiosis", "for", "each", "genotype", ",", "measured", "via", "genotyping", "-", "by", "-", "sequencing", "(", "Serra", "et", "al", ",", "2018b", ";", "Ziolkowski", "et", "al", ",", "2017", ")", ".", "To", "the", "right", "are", "plots", "showing", "the", "significance", "of", "SNPs", "/", "kb", "differences", "between", "crossover", "sets", ",", "across", "the", "windows", "tested", "(", "Bonferroni", "adjusted", "t", "-", "tests", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. SNPs/kb in physical windows of increasing size (kb) around crossover midpoints (red), or for matched randomly chosen positions (grey). Printed above the plot for each window are circles coloured green if crossover SNPs/kb values are significantly different to random (P<0.05), or red if not (P>0.05) (Bonferroni adjusted t-tests). The population (Col×Ws, Col×Bur (Lawrence et al, 2019), Col×Ct, Col×Ler (Serra et al, 2018b; Rowan et al, 2019) and Col×CLC) is printed above each plot, and the number of positions analysed is printed inset.B. As for A, but analyzing the indicated Col/Ler transition and transversion polymorphisms around Col×Ler crossovers (Rowan et al, 2019) (red), or the same number of random positions (grey).C. As for A, but analysing Col/Ler SNPs/kb around crossovers from wild type, HEI10-OE, recq4a recq4b or HEI10-OE recq4a recq4b (Serra et al, 2018b). All populations were generated from Col×Ler hybrids. Printed beneath are the estimated average numbers of Class I and Class II crossovers per meiosis for each genotype, measured via genotyping-by-sequencing (Serra et al, 2018b; Ziolkowski et al, 2017). To the right are plots showing the significance of SNPs/kb differences between crossover sets, across the windows tested (Bonferroni adjusted t-tests)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Histograms", "of", "observed", "crossovers", "per", "F2", "individual", "in", "the", "indicated", "wild", "type", "and", "msh2", "populations", ",", "from", "Col", "×", "Ct", ",", "Col", "×", "Ler", "and", "Col", "×", "CLC", "crosses", "(", "blue", ")", ".", "The", "Poisson", "expectation", "is", "plotted", "in", "red", ".", "Data", "from", "HEI10", "-", "OE", ",", "recq4a", "recq4b", "and", "HEI10", "-", "OE", "recq4a", "recq4b", "F2", "populations", "are", "also", "shown", "for", "comparison", "(", "Serra", "et", "al", ",", "2018b", ";", "Ziolkowski", "et", "al", ",", "2017", ")", ".", "Mean", "values", "are", "indicated", "by", "black", "dotted", "lines", ".", "B", ".", "Crossovers", "per", "200", "kb", "per", "F2", "plotted", "along", "the", "Arabidopsis", "chromosomes", ",", "with", "mean", "values", "shown", "by", "horizontal", "dashed", "lines", ".", "Data", "are", "shown", "for", "wild", "type", "(", "red", ")", "and", "msh2", "(", "blue", ")", "crossovers", "generated", "from", "Col", "×", "Ct", ",", "Col", "×", "Ler", "and", "Col", "×", "CLC", "hybrids", ".", "SNPs", "per", "200", "kb", "are", "shaded", "in", "colour", "(", "blue", "=", "Col", "/", "Ct", ",", "green", "=", "Col", "/", "Ler", ",", "pink", "=", "Col", "/", "Cvi", ")", ".", "The", "positions", "of", "telomeres", "(", "TEL", ")", "and", "centromeres", "(", "CEN", ")", "are", "labeled", ".", "The", "number", "of", "crossovers", "analysed", "is", "printed", "inset", ".", "C", ".", "Data", "as", "for", "B", ",", "but", "analyzing", "crossovers", "in", "wild", "type", "(", "red", ")", "and", "msh2", "(", "blue", ")", ",", "or", "SNPs", "along", "proportionally", "scaled", "chromosome", "arms", "orientated", "from", "telomeres", "(", "TEL", ")", "to", "centromeres", "(", "CEN", ")", ".", "Crossover", "data", "from", "HEI10", "-", "OE", ",", "recq4a", "recq4b", "and", "HEI10", "-", "OE", "recq4a", "recq4b", "Col", "×", "Ler", "F2", "populations", "are", "also", "shown", "(", "Serra", "et", "al", ",", "2018b", ";", "Ziolkowski", "et", "al", ",", "2017", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Histograms of observed crossovers per F2 individual in the indicated wild type and msh2 populations, from Col×Ct, Col×Ler and Col×CLC crosses (blue). The Poisson expectation is plotted in red. Data from HEI10-OE, recq4a recq4b and HEI10-OE recq4a recq4b F2 populations are also shown for comparison (Serra et al, 2018b; Ziolkowski et al, 2017). Mean values are indicated by black dotted lines.B. Crossovers per 200 kb per F2 plotted along the Arabidopsis chromosomes, with mean values shown by horizontal dashed lines. Data are shown for wild type (red) and msh2 (blue) crossovers generated from Col×Ct, Col×Ler and Col×CLC hybrids. SNPs per 200 kb are shaded in colour (blue=Col/Ct, green=Col/Ler, pink=Col/Cvi). The positions of telomeres (TEL) and centromeres (CEN) are labeled. The number of crossovers analysed is printed inset. C. Data as for B, but analyzing crossovers in wild type (red) and msh2 (blue), or SNPs along proportionally scaled chromosome arms orientated from telomeres (TEL) to centromeres (CEN). Crossover data from HEI10-OE, recq4a recq4b and HEI10-OE recq4a recq4b Col×Ler F2 populations are also shown (Serra et al, 2018b; Ziolkowski et al, 2017)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Histograms", "showing", "the", "mean", "distance", "(", "megabases", ",", "Mb", ")", "of", "observed", "double", "crossovers", "(", "DCO", ",", "red", "vertical", "line", ")", ",", "compared", "to", "2", ",", "000", "matched", "sets", "of", "randomly", "generated", "distances", "(", "RAN", ",", "black", ")", ".", "The", "mean", "distance", "of", "the", "random", "sets", "is", "shown", "in", "by", "the", "vertical", "grey", "line", ".", "B", ".", "SNPs", "/", "kb", "values", "were", "calculated", "in", "physical", "windows", "of", "increasing", "size", "(", "kb", ")", "around", "crossover", "midpoints", "in", "wild", "type", "(", "red", ")", "and", "msh2", "(", "blue", ")", ".", "The", "same", "values", "were", "calculated", "for", "matched", "randomly", "chosen", "positions", "(", "grey", ")", ".", "Printed", "above", "the", "plot", "for", "each", "window", "are", "circles", "that", "are", "coloured", "green", "if", "crossover", "SNPs", "/", "kb", "values", "are", "significantly", "different", "to", "random", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "or", "red", "if", "not", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", "(", "Bonferroni", "adjusted", "t", "-", "tests", ")", ".", "The", "population", "analysed", "(", "Col", "×", "Ct", ",", "Col", "×", "Ler", ",", "Col", "×", "CLC", ")", "and", "its", "genome", "average", "SNP", "frequency", "(", "SNPs", "/", "kb", ")", "is", "printed", "above", "the", "plots", "and", "the", "number", "of", "crossover", "positions", "analysed", "is", "printed", "inset", ".", "Beneath", "are", "plots", "showing", "the", "significance", "of", "SNPs", "/", "kb", "differences", "around", "crossovers", "between", "the", "indicated", "genotypes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Histograms showing the mean distance (megabases, Mb) of observed double crossovers (DCO, red vertical line), compared to 2,000 matched sets of randomly generated distances (RAN, black). The mean distance of the random sets is shown in by the vertical grey line.B. SNPs/kb values were calculated in physical windows of increasing size (kb) around crossover midpoints in wild type (red) and msh2 (blue). The same values were calculated for matched randomly chosen positions (grey). Printed above the plot for each window are circles that are coloured green if crossover SNPs/kb values are significantly different to random (P<0.05), or red if not (P>0.05) (Bonferroni adjusted t-tests). The population analysed (Col×Ct, Col×Ler, Col×CLC) and its genome average SNP frequency (SNPs/kb) is printed above the plots and the number of crossover positions analysed is printed inset. Beneath are plots showing the significance of SNPs/kb differences around crossovers between the indicated genotypes."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Representative", "DAPI", "-", "stained", "spreads", "of", "pachytene", ",", "diakinesis", ",", "metaphase", "-", "I", ",", "dyad", "and", "tetrad", "meiotic", "stages", ",", "for", "wild", "type", "and", "msh2", ",", "in", "Col", "×", "Ler", "or", "Col", "×", "CLC", "hybrid", "backgrounds", ".", "B", ".", "Male", "meiocytes", "immunostained", "for", "MSH2", "(", "red", ")", "and", "ASY1", "(", "green", ")", ",", "and", "stained", "for", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "wild", "type", "(", "Col", ")", "or", "msh2", ".", "C", ".", "As", "for", "B", ",", "but", "immunostaining", "wild", "type", "male", "meiocytes", "for", "MSH2", "(", "red", ")", ",", "MSH4", "(", "green", ")", "and", "staining", "chromatin", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Representative DAPI-stained spreads of pachytene, diakinesis, metaphase-I, dyad and tetrad meiotic stages, for wild type and msh2, in Col×Ler or Col×CLC hybrid backgrounds.B. Male meiocytes immunostained for MSH2 (red) and ASY1 (green), and stained for DAPI (blue) in wild type (Col) or msh2.C. As for B, but immunostaining wild type male meiocytes for MSH2 (red), MSH4 (green) and staining chromatin with DAPI (blue)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Crossover", "frequency", "(", "black", ")", "and", "SNP", "density", "(", "purple", ")", "per", "200", "kb", "measured", "from", "the", "Col", "×", "Ct", "F2", "population", ".", "The", "position", "of", "the", "centromere", "(", "CEN", ",", "vertical", "dashed", "line", ")", "and", "420", "FTL", "transgenes", "(", "red", "and", "green", "vertical", "lines", ")", "used", "to", "measure", "crossover", "frequency", "are", "indicated", ".", "B", ".", "Plots", "of", "chromosome", "3", "showing", "positions", "of", "Col", "/", "Col", "(", "black", ")", "or", "Col", "/", "Ct", "(", "purple", ")", "homozygous", "or", "heterozygous", "genotypes", "at", "the", "indicated", "marker", "positions", "(", "circles", ")", ".", "The", "positions", "of", "the", "420", "FTL", "transgenes", "are", "indicated", "(", "red", "and", "green", "vertical", "lines", ")", ".", "C", ".", "420", "crossover", "frequency", "(", "cM", ")", "in", "the", "HOM", "-", "HOM", ",", "HET", "-", "HET", ",", "HET", "-", "HOM", ",", "HOM", "-", "HET", "genotypes", "shown", "in", "B", ",", "in", "either", "wild", "type", "or", "msh2", ".", "Values", "for", "replicate", "individuals", "are", "plotted", ",", "in", "addition", "to", "the", "mean", "(", "red", ")", ".", "D", ".", "As", "for", "C", ",", "but", "comparing", "genotypes", "in", "wild", "type", "or", "HEI10", "-", "OE", "backgrounds", ".", "Values", "for", "replicate", "individuals", "are", "plotted", ",", "in", "addition", "to", "the", "mean", "(", "red", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Crossover frequency (black) and SNP density (purple) per 200 kb measured from the Col×Ct F2 population. The position of the centromere (CEN, vertical dashed line) and 420 FTL transgenes (red and green vertical lines) used to measure crossover frequency are indicated.B. Plots of chromosome 3 showing positions of Col/Col (black) or Col/Ct (purple) homozygous or heterozygous genotypes at the indicated marker positions (circles). The positions of the 420 FTL transgenes are indicated (red and green vertical lines).C. 420 crossover frequency (cM) in the HOM-HOM, HET-HET, HET-HOM, HOM-HET genotypes shown in B, in either wild type or msh2. Values for replicate individuals are plotted, in addition to the mean (red).D. As for C, but comparing genotypes in wild type or HEI10-OE backgrounds. Values for replicate individuals are plotted, in addition to the mean (red)."}
{"words": ["Figure", "8D", ".", "Plots", "of", "SNP", "density", "per", "10", "kb", "along", "the", "chromosomes", "for", "Arabidopsis", "Col", "×", "Ler", "and", "budding", "yeast", "S288c", "×", "SK1", "crosses", "(", "Cooper", "et", "al", ",", "2018", ")", ".", "Telomere", "positions", "are", "shown", "by", "vertical", "lines", ",", "and", "centromeres", "by", "vertical", "dashed", "lines", ".", "Centromeres", "are", "also", "labeled", "above", "the", "plots", "in", "red", ",", "as", "'", "CEN", "'", "or", "'", "C", "'", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8D. Plots of SNP density per 10 kb along the chromosomes for Arabidopsis Col×Ler and budding yeast S288c×SK1 crosses (Cooper et al, 2018). Telomere positions are shown by vertical lines, and centromeres by vertical dashed lines. Centromeres are also labeled above the plots in red, as 'CEN' or 'C'."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "The", "list", "of", "co", "-", "precipitated", "proteins", "as", "determined", "by", "immunoprecipitation", "followed", "by", "mass", "spectrometry", "(", "IP", "-", "MS", ")", ".", "The", "SWR1", "subunits", "not", "shared", "by", "the", "ISWI", "complexes", "are", "shown", "in", "blue", ";", "The", "DDT", "domain", "-", "containing", "ISWI", "specific", "subunits", "are", "shown", "in", "orange", ";", "CHR11", "and", "CHR17", "are", "shared", "subunits", "of", "the", "SWR1", "and", "ISWI", "complexes", "and", "are", "shown", "in", "green", ".", "(", "C", ")", "Determination", "of", "the", "interaction", "of", "MBD9", "with", "HTA9", ",", "HTA11", ",", "PIE1", ",", "CHR11", ",", "and", "CHR17", "by", "co", "-", "immunoprecipitation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) The list of co-precipitated proteins as determined by immunoprecipitation followed by mass spectrometry (IP-MS). The SWR1 subunits not shared by the ISWI complexes are shown in blue; The DDT domain-containing ISWI specific subunits are shown in orange; CHR11 and CHR17 are shared subunits of the SWR1 and ISWI complexes and are shown in green. (C) Determination of the interaction of MBD9 with HTA9, HTA11, PIE1, CHR11, and CHR17 by co-immunoprecipitation. "}
{"words": ["Figure", "2", "Determination", "of", "the", "interaction", "of", "PIE1", "-", "Flag", ",", "MBD9", "-", "Myc", ",", "and", "CHR11", "-", "HA", "by", "in", "vitro", "pull", "down", "assays", ".", "PIE1", "-", "Flag", ",", "MBD9", "-", "Myc", ",", "and", "CHR11", "-", "HA", "were", "expressed", "from", "yeast", "and", "subjected", "to", "the", "pull", "down", "assays", ".", "Anti", "-", "Flag", "agaroses", "were", "independently", "used", "in", "the", "pull", "down", "assays", ".", "C", ")", "Determination", "of", "the", "interaction", "of", "MBD9", "-", "Myc", ",", "and", "CHR11", "-", "HA", "by", "in", "vitro", "pull", "down", "assays", ".", "MBD9", "-", "Myc", ",", "and", "CHR11", "-", "HA", "were", "expressed", "from", "yeast", "and", "subjected", "to", "the", "pull", "down", "assays", ".", "anti", "-", "HA", "(", "C", ")", "agaroses", "were", "independently", "used", "in", "the", "pull", "down", "assays", ".", "D", ")", "he", "effect", "of", "the", "pie1", "and", "mbd9", "-", "1", "mutations", "on", "the", "formation", "of", "the", "SWR1", "complex", "as", "determined", "by", "IP", "-", "MS", ".", "Transgenic", "plants", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "MBD9", ",", "PIE1", ",", "and", "CHR11", "in", "the", "WT", "and", "mutant", "backgrounds", "were", "subjected", "to", "the", "IP", "-", "MS", "experiment", "with", "anti", "-", "Flag", "agarose", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 Determination of the interaction of PIE1-Flag, MBD9-Myc, and CHR11-HA by in vitro pull down assays. PIE1-Flag, MBD9-Myc, and CHR11-HA were expressed from yeast and subjected to the pull down assays. Anti-Flag agaroses were independently used in the pull down assays.  C) Determination of the interaction of MBD9-Myc, and CHR11-HA by in vitro pull down assays. MBD9-Myc, and CHR11-HA were expressed from yeast and subjected to the pull down assays. anti-HA (C) agaroses were independently used in the pull down assays.  D) he effect of the pie1 and mbd9-1 mutations on the formation of the SWR1 complex as determined by IP-MS. Transgenic plants expressing Flag-tagged MBD9, PIE1, and CHR11 in the WT and mutant backgrounds were subjected to the IP-MS experiment with anti-Flag agarose. "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Morphological", "phenotypes", "of", "the", "WT", ",", "chr11", "/", "17", ",", "pie1", ",", "swc2", ",", "and", "rin2", "mutant", "plants", ".", "Shown", "are", "24", "-", "day", "-", "old", "plants", ".", "The", "top", "panel", "shows", "the", "phenotypes", "of", "plants", "in", "the", "soil", ";", "the", "bottom", "panel", "shows", "the", "phenotypes", "of", "plants", "on", "the", "black", "cloth", ".", "(", "B", ")", "Shown", "are", "rosette", "leaves", "of", "the", "WT", ",", "pie1", ",", "swc2", ",", "and", "rin2", "mutant", "plants", ".", "Rosette", "leaves", "were", "cut", "from", "bolting", "plants", ".", "(", "C", ")", "The", "early", "-", "flowering", "phenotype", "of", "the", "mbd9", "-", "1", ",", "mbd9", "-", "3", ",", "mbd9", "-", "4", "and", "hta9", "-", "1", "/", "11", "-", "1", "mutants", "compared", "to", "the", "WT", ".", "24", "-", "day", "-", "old", "plants", "in", "soil", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "Numbers", "of", "rosette", "leaves", "of", "the", "WT", "and", "mutant", "plants", "shortly", "after", "bolting", ".", "Rosette", "leaves", "from", "at", "least", "20", "plants", "were", "counted", "for", "each", "genotype", ".", "Values", "are", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "E", ")", "Determination", "of", "the", "effect", "of", "the", "arp4", "-", "1", ",", "arp6", "and", "swc6", "-", "1", "mutations", "on", "flowering", "time", ".", "The", "top", "panel", "shows", "the", "number", "of", "rosette", "leaves", "in", "the", "WT", ",", "arp4", "-", "1", ",", "arp6", ",", "and", "swc6", "-", "1", "mutant", "plants", ";", "the", "bottom", "panel", "shows", "a", "photograph", "of", "the", "plants", ".", "Rosette", "leaves", "from", "at", "least", "20", "plants", "were", "counted", "for", "each", "genotype", ".", "Values", "are", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "F", ")", "Determination", "of", "the", "effect", "of", "the", "tra1a", "and", "tra1b", "mutations", "on", "flowering", "time", ".", "The", "top", "panel", "shows", "numbers", "of", "rosette", "leaves", "of", "the", "WT", ",", "tra1a", "-", "1", ",", "tra1a", "-", "2", ",", "and", "tra1b", "mutant", "plants", ";", "the", "bottom", "panel", "shows", "a", "photograph", "of", "the", "plants", ".", "Rosette", "leaves", "from", "at", "least", "20", "null", "were", "counted", "for", "each", "genotype", ".", "Values", "are", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 (A) Morphological phenotypes of the WT, chr11/17, pie1, swc2, and rin2 mutant plants. Shown are 24-day-old plants. The top panel shows the phenotypes of plants in the soil; the bottom panel shows the phenotypes of plants on the black cloth.  (B) Shown are rosette leaves of the WT, pie1, swc2, and rin2 mutant plants. Rosette leaves were cut from bolting plants.  (C) The early-flowering phenotype of the mbd9-1, mbd9-3, mbd9-4 and hta9-1/11-1 mutants compared to the WT. 24-day-old plants in soil are shown.  (D) Numbers of rosette leaves of the WT and mutant plants shortly after bolting. Rosette leaves from at least 20 plants were counted for each genotype. Values are mean ± SD. ** P<0.01, student's t test.  (E) Determination of the effect of the arp4-1, arp6 and swc6-1 mutations on flowering time. The top panel shows the number of rosette leaves in the WT, arp4-1, arp6, and swc6-1 mutant plants; the bottom panel shows a photograph of the plants. Rosette leaves from at least 20 plants were counted for each genotype. Values are mean ± SD. ** P<0.01, student's t test.  (F) Determination of the effect of the tra1a and tra1b mutations on flowering time. The top panel shows numbers of rosette leaves of the WT, tra1a-1, tra1a-2, and tra1b mutant plants; the bottom panel shows a photograph of the plants. Rosette leaves from at least 20 null were counted for each genotype. Values are mean ± SD. ** P<0.01, student's t test. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Heat", "maps", "showing", "the", "effect", "of", "indicated", "mutations", "on", "the", "expression", "of", "differentially", "expressed", "genes", "identified", "in", "the", "mbd9", "-", "1", "mutant", ".", "The", "color", "bar", "shows", "log2", "(", "fold", "change", ")", ".", "Up", "-", "and", "down", "-", "regulation", "are", "shown", "by", "red", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "(", "C", ")", "Scatter", "plots", "showing", "that", "the", "expression", "pattern", "in", "the", "hta9", "-", "1", "/", "11", "-", "1", "mutant", "is", "correlated", "with", "that", "in", "the", "chr11", "/", "17", ",", "mbd9", "-", "1", ",", "and", "pie1", "mutants", ".", "The", "differentially", "expressed", "genes", "identified", "in", "the", "hta9", "-", "1", "/", "11", "-", "1", "mutant", "were", "subjected", "to", "the", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Heat maps showing the effect of indicated mutations on the expression of differentially expressed genes identified in the mbd9-1 mutant. The color bar shows log2(fold change). Up- and down-regulation are shown by red and blue, respectively. (C) Scatter plots showing that the expression pattern in the hta9-1/11-1 mutant is correlated with that in the chr11/17, mbd9-1, and pie1 mutants. The differentially expressed genes identified in the hta9-1/11-1 mutant were subjected to the analysis. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "The", "effect", "of", "indicated", "mutations", "on", "H2A", ".", "Z", "deposition", "as", "determined", "by", "immunoblotting", ".", "Chromatin", "-", "associated", "proteins", "were", "extracted", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "by", "the", "anti", "-", "H2A", ".", "Z", "antibody", ".", "The", "histone", "H4", "level", "was", "detected", "by", "the", "anti", "-", "H4", "antibody", "and", "indicated", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "B", ")", "Meta", "plots", "showing", "H2A", ".", "Z", "occupancy", "on", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", ".", "TSS", ",", "transcription", "start", "site", ";", "TTS", ",", "transcription", "termination", "site", ".", "RPKM", ",", "reads", "per", "kilobase", "per", "million", ".", "The", "H2A", ".", "Z", "ChIP", "-", "seq", "results", "were", "generated", "from", "two", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "D", ")", "Heat", "maps", "showing", "H2A", ".", "Z", "enrichment", "in", "the", "WT", ",", "pie1", ",", "chr11", "/", "17", ",", "and", "mbd9", "-", "1", "mutants", "over", "the", "PIE1", "(", "E", ")", "Shown", "are", "H2A", ".", "Z", "changes", "in", "the", "pie1", ",", "chr11", "/", "17", ",", "and", "mbd9", "-", "1", "mutants", "relative", "to", "the", "WT", ".", "PIE1", "-", "dependent", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", "were", "subjected", "to", "the", "analysis", "and", "sorted", "by", "H2A", ".", "Z", "density", "in", "the", "WT", ".", "The", "color", "bar", "shows", "log2", "(", "fold", "change", ")", ".", "(", "F", ")", "Meta", "plots", "showing", "CHR11", "and", "PIE1", "occupancy", "on", "PIE1", "-", "dependent", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", ".", "TSS", ",", "transcription", "start", "site", ";", "TTS", ",", "transcription", "termination", "site", ".", "The", "CHR11", "-", "Flag", "and", "PIE1", "-", "Flag", "ChIP", "-", "seq", "data", "are", "from", "two", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "G", ")", "Heat", "maps", "showing", "the", "enrichment", "of", "PIE1", "-", "Flag", "and", "CHR11", "-", "Flag", "over", "the", "PIE1", "-", "dependent", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", ".", "The", "peaks", "were", "sorted", "by", "H2A", ".", "Z", "density", "in", "the", "WT", ".", "(", "H", ")", "Box", "plot", "showing", "the", "enrichment", "of", "CHR11", "and", "PIE1", "over", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", "and", "non", "-", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", ".", "The", "log2", "(", "fold", "change", ")", "values", "of", "RPKM", "between", "the", "CHR11", "-", "Flag", "or", "PIE1", "-", "Flag", "signals", "and", "the", "WT", "signals", "are", "shown", ".", "Center", "lines", "and", "box", "edges", "represent", "medians", "and", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", ",", "respectively", ".", "Whiskers", "extend", "to", "minimum", "and", "maximum", "values", "within", "1", ".", "5", "times", "of", "the", "IQR", ".", "The", "data", "shown", "are", "from", "two", "independent", "biological", "replicates", ".", "The", "difference", "between", "the", "CHR11", "-", "Flag", "and", "PIE1", "-", "Flag", "ChIP", "-", "seq", "levels", "was", "determined", "by", "student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 (A) The effect of indicated mutations on H2A.Z deposition as determined by immunoblotting. Chromatin-associated proteins were extracted and subjected to immunoblotting by the anti-H2A.Z antibody. The histone H4 level was detected by the anti-H4 antibody and indicated as a loading control.  (B) Meta plots showing H2A.Z occupancy on H2A.Z target genes. TSS, transcription start site; TTS, transcription termination site. RPKM, reads per kilobase per million. The H2A.Z ChIP-seq results were generated from two independent biological replicates.  (D) Heat maps showing H2A.Z enrichment in the WT, pie1, chr11/17, and mbd9-1 mutants over the PIE1  (E) Shown are H2A.Z changes in the pie1, chr11/17, and mbd9-1 mutants relative to the WT. PIE1-dependent H2A.Z target genes were subjected to the analysis and sorted by H2A.Z density in the WT. The color bar shows log2(fold change).  (F) Meta plots showing CHR11 and PIE1 occupancy on PIE1-dependent H2A.Z target genes. TSS, transcription start site; TTS, transcription termination site. The CHR11-Flag and PIE1-Flag ChIP-seq data are from two independent biological replicates. (G) Heat maps showing the enrichment of PIE1-Flag and CHR11-Flag over the PIE1-dependent H2A.Z target genes. The peaks were sorted by H2A.Z density in the WT. (H) Box plot showing the enrichment of CHR11 and PIE1 over H2A.Z target genes and non-H2A.Z target genes. The log2(fold change) values of RPKM between the CHR11-Flag or PIE1-Flag signals and the WT signals are shown. Center lines and box edges represent medians and the interquartile range (IQR), respectively. Whiskers extend to minimum and maximum values within 1.5 times of the IQR. The data shown are from two independent biological replicates. The difference between the CHR11-Flag and PIE1-Flag ChIP-seq levels was determined by student's t test. ** P<0.01. "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Increasing", "amounts", "of", "CHR11", "(", "left", "panel", ")", "or", "PIE1", "(", "right", "panel", ")", "were", "incubated", "with", "end", "-", "positioned", "(", "lane", "1", "-", "4", "and", "9", "-", "12", ")", "or", "center", "-", "positioned", "(", "lane", "5", "-", "8", "and", "13", "-", "16", ")", "mono", "-", "nucleosomes", "in", "the", "presence", "of", "ATP", ".", "The", "sliding", "results", "were", "then", "visualized", "on", "native", "PAGE", "gels", "by", "EB", "staining", ".", "(", "B", ")", "Distribution", "of", "nucleosomes", "over", "TSS", "of", "all", "protein", "-", "coding", "genes", "in", "the", "WT", ",", "chr11", "/", "17", ",", "pie1", ",", "and", "mbd9", "-", "1", "mutants", ".", "The", "MNase", "-", "seq", "results", "were", "generated", "from", "two", "independent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Increasing amounts of CHR11 (left panel) or PIE1 (right panel) were incubated with end-positioned (lane 1-4 and 9-12) or center-positioned (lane 5-8 and 13-16) mono-nucleosomes in the presence of ATP. The sliding results were then visualized on native PAGE gels by EB staining.(B) Distribution of nucleosomes over TSS of all protein-coding genes in the WT, chr11/17, pie1, and mbd9-1 mutants. The MNase-seq results were generated from two independent biological replicates."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "Western", "blot", "showing", "no", "detectable", "Wbp2", "protein", "in", "4", "week", "old", "mutant", "brain", "compared", "to", "wt", "littermate", "controls", ".", "5μg", "of", "the", "protein", "lysate", "were", "subjected", "to", "10", "%", "SDS", "-", "PAGE", ".", "β", "-", "tubulin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Wbp2", "l", "and", "Wbp2", "s", "refer", "to", "the", "long", "and", "short", "isoforms", "respectively", ".", "C", ",", "Quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "showing", "severe", "knockdown", "of", "Wbp2", "transcription", "in", "4", "week", "old", "mutants", "(", "n", "=", "3", ")", "inner", "ears", "and", "eyes", ",", "compared", "to", "wt", "littermate", "controls", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Heterozygotes", "show", "intermediate", "levels", ".", "Hprt", "was", "used", "as", "a", "control", "and", "levels", "are", "normalised", "to", "wt", "levels", ".", "D", ",", "F", ",", "X", "-", "gal", "staining", "of", "Wbp2", "hets", "at", "P14", "showing", "Wbp2", "expression", "(", "blue", ")", "in", "all", "the", "main", "cochlear", "structures", ":", "the", "stria", "vascularis", "(", "black", "arrowhead", "in", "D", ")", ",", "spiral", "prominence", "(", "empty", "arrowhead", "in", "D", ")", ",", "Reissner", "'", "s", "membrane", "(", "arrow", "in", "D", ")", ",", "strong", "expression", "in", "the", "spiral", "ganglion", "cells", "(", "red", "arrowheads", "in", "E", ")", ",", "IHCs", "and", "OHCs", "in", "the", "organ", "of", "Corti", "(", "arrowheads", "in", "F", ")", ",", "pillar", "cells", "and", "spiral", "limbus", "(", "empty", "arrowhead", "in", "F", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "D", ":", "50μm", ",", "E", ",", "F", ":", "20μm", ".", "ihc", ":", "inner", "hair", "cells", ";", "ohc", ":", "outer", "hair", "cells", ".", "No", "X", "-", "gal", "staining", "is", "observed", "in", "wt", "controls", "(", "not", "shown", ")", ".", "The", "X", "-", "gal", "reaction", "is", "always", "cytoplasmic", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, Western blot showing no detectable Wbp2 protein in 4 week old mutant brain compared to wt littermate controls. 5μg of the protein lysate were subjected to 10% SDS-PAGE. β-tubulin was used as loading control. Wbp2 l and Wbp2 s refer to the long and short isoforms respectively.C, Quantitative real-time PCR showing severe knockdown of Wbp2 transcription in 4 week old mutants (n=3) inner ears and eyes, compared to wt littermate controls (n=3). Heterozygotes show intermediate levels. Hprt was used as a control and levels are normalised to wt levels.D, F, X-gal staining of Wbp2 hets at P14 showing Wbp2 expression (blue) in all the main cochlear structures: the stria vascularis (black arrowhead in D), spiral prominence (empty arrowhead in D), Reissner's membrane (arrow in D), strong expression in the spiral ganglion cells (red arrowheads in E), IHCs and OHCs in the organ of Corti (arrowheads in F), pillar cells and spiral limbus (empty arrowhead in F). Scale bars: D: 50μm, E,F: 20μm. ihc: inner hair cells; ohc: outer hair cells. No X-gal staining is observed in wt controls (not shown). The X-gal reaction is always cytoplasmic."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "E", "Mean", "ABR", "thresholds", "(", "±", "SD", ")", "for", "clicks", "and", "tone", "pips", "are", "plotted", "for", "wt", "(", "green", ")", ",", "het", "(", "blue", ")", "and", "hom", "(", "red", ")", "mice", "at", "ages", "A", ",", "P14", "(", "wt", ",", "n", "=", "3", ";", "het", ",", "n", "=", "8", ";", "hom", ",", "n", "=", "6", ")", ";", "B", ",", "4", "weeks", "(", "wt", ",", "n", "=", "38", ";", "het", ",", "n", "=", "26", ";", "hom", ",", "n", "=", "37", ")", ";", "C", ",", "14", "weeks", "(", "wt", ",", "n", "=", "10", ";", "hom", ",", "n", "=", "14", ")", ";", "D", ",", "28", "weeks", "(", "wt", ",", "n", "=", "15", ";", "het", ",", "n", "=", "5", ";", "hom", ",", "n", "=", "25", ")", ";", "E", ",", "44", "weeks", "(", "wt", ",", "n", "=", "9", ";", "het", ",", "n", "=", "2", ";", "hom", ",", "n", "=", "11", ")", ".", "Grey", "symbols", "and", "lines", "indicate", "thresholds", "of", "individual", "mutants", ".", "In", "B", ",", "open", "symbols", "represent", "thresholds", "under", "urethane", "anaesthesia", "(", "see", "methods", ")", ",", "showing", "no", "difference", "compared", "with", "ketamine", "/", "xylazine", "used", "for", "all", "other", "thresholds", ".", "F", ",", "Mean", "thresholds", "for", "mutants", "aged", "2", "weeks", "(", "yellow", ")", ",", "4", "weeks", "(", "purple", ")", ",", "14", "weeks", "(", "cyan", ")", ",", "28", "weeks", "(", "grey", ")", "and", "44", "weeks", "(", "black", ")", ".", "G", ",", "Averaged", "click", "-", "evoked", "ABR", "waveforms", "from", "4", "weeks", "old", "wt", "(", "n", "=", "23", ",", "green", ")", "and", "mutants", "(", "n", "=", "34", ",", "red", ")", ",", "at", "50dB", "sensation", "level", "(", "SL", ")", "(", "left", "panel", ")", ".", "SP", "and", "ABR", "Wave", "1", "(", "W1", ")", "are", "indicated", "by", "grey", "areas", ".", "Expanded", "averaged", "SP", "and", "ABR", "W1", "waveform", "patterns", "for", "10", "-", "60dB", "SL", "in", "10dB", "increments", "are", "plotted", "in", "green", "(", "wt", ";", "middle", "panel", ")", "and", "red", "(", "mutants", ";", "right", "panel", ")", ".", ",", "to", "illustrate", "the", "growth", "of", "SP", "and", "W1", "with", "stimulus", "level", ".", "H", ",", "I", ".", "Mean", "2f1", "-", "f2", "DPOAE", "thresholds", "(", "±", "SD", ")", "are", "plotted", "for", "wt", "(", "green", ")", ",", "heterozygote", "(", "blue", ")", "and", "homozygous", "(", "red", ")", "mice", "aged", "4", "weeks", "(", "H", ")", "or", "21", "weeks", "(", "I", ")", ",", "as", "a", "function", "of", "f2", "frequency", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A,E Mean ABR thresholds (± SD) for clicks and tone pips are plotted for wt (green), het (blue) and hom (red) mice at ages A, P14 (wt, n=3; het, n=8; hom, n=6); B, 4 weeks (wt, n=38; het, n=26; hom, n=37); C, 14 weeks (wt, n=10; hom, n=14); D, 28 weeks (wt, n=15; het, n=5; hom, n=25); E, 44 weeks (wt, n=9; het, n=2; hom, n=11). Grey symbols and lines indicate thresholds of individual mutants. In B, open symbols represent thresholds under urethane anaesthesia (see methods), showing no difference compared with ketamine/xylazine used for all other thresholds.F, Mean thresholds for mutants aged 2 weeks (yellow), 4 weeks (purple), 14 weeks (cyan), 28 weeks (grey) and 44 weeks (black).G, Averaged click-evoked ABR waveforms from 4 weeks old wt (n=23, green) and mutants (n=34, red), at 50dB sensation level (SL) (left panel). SP and ABR Wave 1 (W1) are indicated by grey areas. Expanded averaged SP and ABR W1 waveform patterns for 10-60dB SL in 10dB increments are plotted in green (wt; middle panel) and red (mutants; right panel)., to illustrate the growth of SP and W1 with stimulus level.H, I. Mean 2f1-f2 DPOAE thresholds (± SD) are plotted for wt (green), heterozygote (blue) and homozygous (red) mice aged 4 weeks (H) or 21 weeks (I), as a function of f2 frequency."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Pure", "tone", "audiogram", "recorded", "from", "one", "of", "the", "probands", ",", "showing", "severe", "to", "profound", "bilateral", "asymmetric", "hearing", "loss", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Pure tone audiogram recorded from one of the probands, showing severe to profound bilateral asymmetric hearing loss."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Agarose", "gel", "trace", "of", "cDNA", "obtained", "from", "mouse", "wt", "P28", "inner", "ear", "(", "IE", ")", ",", "P28", "brain", ",", "adult", "and", "P4", "organ", "of", "Corti", "(", "OC", ")", ".", "Results", "show", "expression", "of", "two", "Wbp2", "isoforms", "in", "the", "brain", "at", "P28", "and", "very", "faint", "band", "for", "the", "short", "isoform", "together", "with", "a", "strong", "band", "for", "the", "long", "isoform", "in", "the", "inner", "ear", "at", "P28", ".", "If", "we", "look", "at", "just", "the", "organ", "of", "Corti", "(", "adult", "and", "P4", ")", ",", "we", "observe", "a", "strong", "band", "for", "the", "long", "isoform", "in", "the", "P4", "OC", "and", "an", "almost", "undetectable", "band", "for", "the", "short", "isoform", ",", "which", "was", "not", "even", "picked", "up", "by", "sequencing", "(", "see", "C", ")", ".", "Wbp2", "l", ":", "long", "isoform", "(", "550", "bp", ")", ";", "Wbp2", "s", ":", "short", "isoform", "(", "480", "bp", ")", ".", "D", ".", "Western", "blot", "showing", "the", "predominant", "presence", "of", "the", "Wbp2", "long", "isoform", "in", "the", "cochlea", "at", "P28", ",", "with", "a", "short", "trace", "of", "the", "short", "isoform", "showing", "up", "only", "when", "a", "higher", "concentration", "of", "protein", "lysate", "(", "20μg", ")", "is", "loaded", ".", "Both", "isoform", "are", "absent", "in", "the", "Wbp2", "-", "deficient", "mouse", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Wbp2", "l", ":", "long", "isoform", ";", "Wbp2", "s", ":", "short", "isoform", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Agarose gel trace of cDNA obtained from mouse wt P28 inner ear (IE), P28 brain, adult and P4 organ of Corti (OC). Results show expression of two Wbp2 isoforms in the brain at P28 and very faint band for the short isoform together with a strong band for the long isoform in the inner ear at P28. If we look at just the organ of Corti (adult and P4), we observe a strong band for the long isoform in the P4 OC and an almost undetectable band for the short isoform, which was not even picked up by sequencing (see C). Wbp2 l: long isoform (550 bp); Wbp2 s: short isoform (480 bp).D. Western blot showing the predominant presence of the Wbp2 long isoform in the cochlea at P28, with a short trace of the short isoform showing up only when a higher concentration of protein lysate (20μg) is loaded. Both isoform are absent in the Wbp2-deficient mouse. Gapdh was used as a loading control. Wbp2 l: long isoform; Wbp2 s: short isoform."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "At", "P14", ",", "afferent", "terminals", "below", "IHCs", "are", "slightly", "swollen", "in", "the", "mutants", "(", "neurofilament", "labelling", "in", "green", ",", "arrowheads", "to", "compare", ";", "CtBP2", "labels", "ribbons", "and", "IHCnuclei", "in", "red", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", ".", "At", "P28", ",", "Neurofilament", "/", "CtBP2", "labelling", "in", "the", "organ", "of", "Corti", "of", "4", "week", "old", "Wbp2", "-", "deficient", "mice", "and", "littermate", "controls", "shows", "severe", "swelling", "of", "IHCafferent", "terminals", "in", "the", "mutants", ",", "especially", "in", "the", "24kHz", "region", "(", "yellow", "arrowheads", ")", ".", "The", "pre", "-", "synaptic", "ribbons", "do", "not", "look", "as", "well", "aligned", "to", "the", "terminals", "in", "the", "mutants", "(", "white", "arrows", ")", ".", "At", "this", "stage", ",", "we", "also", "observe", "swelling", "of", "OHCafferent", "terminals", "in", "the", "24kHz", "region", "(", "empty", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "ihc", ":", "IHCnucleus", ";", "p", ":", "pillar", "side", ";", "m", ":", "modiolar", "side", ".", "B", ".", "Counts", "of", "pre", "-", "synaptic", "ribbons", "per", "IHC", "in", "the", "8", ",", "18", "and", "24kHz", "regions", ",", "showing", "no", "difference", "between", "mutants", "and", "controls", "at", "P28", ".", "C", ".", "TEM", "of", "the", "organ", "of", "Corti", "performed", "at", "P28", "showing", "swollen", "afferent", "terminals", "below", "inner", "and", "outer", "hair", "cells", "(", "arrowheads", "for", "comparisons", "between", "mutants", "and", "controls", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "D", ".", "Neurofilament", "/", "CtBP2", "labelling", "shows", "swollen", "and", "retracting", "terminals", "(", "white", "arrows", ")", ",", "especially", "in", "the", "24kHz", "regions", "in", "the", "mutants", "at", "8", "weeks", "(", "arrows", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "10μm", ".", "E", ".", "Counts", "of", "pre", "-", "synaptic", "ribbons", "in", "the", "8", ",", "18", "and", "24kHz", "regions", ",", "showing", "no", "difference", "in", "their", "number", "per", "IHC", "in", "the", "mutants", "compared", "to", "littermate", "controls", "at", "8", "weeks", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. At P14, afferent terminals below IHCs are slightly swollen in the mutants (neurofilament labelling in green, arrowheads to compare; CtBP2 labels ribbons and IHCnuclei in red). Scale bars: 10 μm. At P28,Neurofilament/CtBP2 labelling in the organ of Corti of 4 week old Wbp2-deficient mice and littermate controls shows severe swelling of IHCafferent terminals in the mutants, especially in the 24kHz region (yellow arrowheads). The pre-synaptic ribbons do not look as well aligned to the terminals in the mutants (white arrows). At this stage, we also observe swelling of OHCafferent terminals in the 24kHz region (empty arrowheads). Scale bars: 5 μm. ihc: IHCnucleus; p: pillar side; m: modiolar side.B. Counts of pre-synaptic ribbons per IHC in the 8, 18 and 24kHz regions, showing no difference between mutants and controls at P28.C. TEM of the organ of Corti performed at P28 showing swollen afferent terminals below inner and outer hair cells (arrowheads for comparisons between mutants and controls). Scale bars: 5 μm.D. Neurofilament/CtBP2 labelling shows swollen and retracting terminals (white arrows), especially in the 24kHz regions in the mutants at 8 weeks (arrows). Scale bars: 10μm.E. Counts of pre-synaptic ribbons in the 8, 18 and 24kHz regions, showing no difference in their number per IHC in the mutants compared to littermate controls at 8 weeks."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "We", "arrayed", "synapse", "images", "aligned", "by", "ascending", "size", "of", "the", "post", "-", "synaptic", "site", "after", "GluR2", "/", "3", "and", "CtBP2", "labelling", ".", "This", "is", "a", "composite", "image", "made", "of", "several", "synapses", "taken", "from", "a", "single", "IHC", "from", "a", "single", "wt", "and", "a", "single", "hom", ",", "representing", "double", "labelling", "experiments", "performed", "on", "3", "mutants", "and", "3", "controls", ".", "Synapses", "in", "the", "mutants", "show", "abnormal", "morphology", "and", "smaller", "green", "patches", ",", "suggesting", "reduced", "expression", "of", "the", "GluR2", "/", "3", "AMPA", "receptor", "subunits", ".", "Scale", "bar", "at", "bottom", "right", ":", "1μm", ".", "B", "-", "G", ".", "TEM", "images", "of", "IHC", "ribbon", "synapses", "of", "wt", "(", "B", ",", "arrowheads", "for", "synaptic", "vesicles", ")", "and", "homs", "(", "C", "-", "G", ")", "at", "4", "weeks", "of", "age", ",", "showing", "a", "representative", "array", "of", "synaptic", "phenotypes", "in", "the", "24", "kHz", "cochlear", "region", "of", "mutants", ".", "While", "in", "C", "and", "D", "the", "ribbons", "look", "slightly", "abnormal", "in", "size", "with", "misplaced", "synaptic", "vesicles", "(", "arrowheads", "in", "C", ")", ",", "we", "also", "observe", "orphan", "post", "-", "synaptic", "densities", "surrounded", "by", "floating", "synaptic", "vesicles", "(", "arrowheads", "in", "E", ")", ",", "ribbons", "with", "synaptic", "membranes", "(", "arrow", "in", "F", ")", "that", "have", "detached", "from", "the", "IHC", "membrane", "(", "the", "asterisk", "labels", "the", "original", "position", "of", "the", "synapse", "before", "detachment", ")", "and", "are", "floating", "in", "the", "swollen", "nerve", "terminal", "(", "F", ")", ",", "ribbons", "(", "arrow", "in", "G", ")", "that", "are", "detached", "from", "their", "densities", "(", "asterisk", "in", "G", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "B", "-", "E", ":", "200", "nm", ";", "F", ",", "G", ":", "500", "nm", ".", "nt", ":", "nerve", "terminal", ";", "psd", ":", "post", "-", "synaptic", "density", ";", "snt", ":", "swollen", "nerve", "terminal", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. We arrayed synapse images aligned by ascending size of the post-synaptic site after GluR2/3 and CtBP2 labelling. This is a composite image made of several synapses taken from a single IHC from a single wt and a single hom, representing double labelling experiments performed on 3 mutants and 3 controls. Synapses in the mutants show abnormal morphology and smaller green patches, suggesting reduced expression of the GluR2/3 AMPA receptor subunits. Scale bar at bottom right: 1μm.B-G. TEM images of IHC ribbon synapses of wt (B, arrowheads for synaptic vesicles) and homs (C-G) at 4 weeks of age, showing a representative array of synaptic phenotypes in the 24 kHz cochlear region of mutants. While in C and D the ribbons look slightly abnormal in size with misplaced synaptic vesicles (arrowheads in C), we also observe orphan post-synaptic densities surrounded by floating synaptic vesicles (arrowheads in E), ribbons with synaptic membranes (arrow in F) that have detached from the IHC membrane (the asterisk labels the original position of the synapse before detachment) and are floating in the swollen nerve terminal (F), ribbons (arrow in G) that are detached from their densities (asterisk in G). Scale bars: B-E: 200 nm; F,G: 500 nm. nt: nerve terminal; psd: post-synaptic density; snt: swollen nerve terminal."}
{"words": ["Figure", "7B", ",", "Quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "showing", "reduced", "mRNA", "levels", "for", "Esr1", ",", "Esr2", "and", "Pgr", "and", "upregulation", "of", "Shank3", "and", "Psd", "-", "95", "in", "cochleae", "of", "4", "week", "old", "Wbp2", "-", "deficient", "mice", "compared", "to", "littermate", "controls", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Hprt", "is", "used", "as", "relative", "control", ".", "Error", "bars", ":", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "student", "t", "test", ":", "p", "=", "0", ".", "03", "for", "Psd", "-", "95", ";", "p", "=", "0", ".", "007", "for", "Shank3", ";", "p", "=", "0", ".", "03", "for", "Esr2", ";", "p", "=", "0", ".", "0016", "for", "Esr1", ";", "p", "=", "0", ".", "037", "for", "Pgr", ".", "C", ",", "Synapses", "from", "one", "mutant", "and", "one", "control", "IHC", "at", "4", "weeks", "of", "age", "after", "Psd", "-", "95", "and", "CtBP2", "labelling", ",", "showing", "stronger", "Psd", "-", "95", "expression", "in", "the", "mutants", "compared", "to", "controls", ",", "representing", "double", "labelling", "experiments", "performed", "on", "3", "mutants", "and", "3", "controls", ".", "P", "indicates", "direction", "of", "pillar", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "10μm", ".", "D", ",", "Quantification", "of", "Psd95", "fluorescence", "in", "IHC", "synapses", ",", "representing", "expression", "in", "the", "apical", "(", "9kHz", "best", "frequency", "region", "of", "the", "cochlea", ")", "and", "basal", "(", "24kHz", "best", "frequency", "region", "of", "the", "cochlea", ")", "regions", "at", "4", "weeks", "old", ".", "Data", "from", "2", "wt", "and", "2", "homs", "were", "analysed", "(", "16", "synapses", "per", "cochlear", "region", "per", "mouse", ")", ".", "AU", ",", "Arbitrary", "Units", ".", "Wt", ":", "24kHz", "22", ".", "41", "±", "10", ".", "70", ",", "9kHz", "11", ".", "045", "±", "2", ".", "128", ";", "Mutants", ":", "24kHz", "66", ".", "73", "±", "13", ".", "70", ",", "p", "=", "0", ".", "069", ";", "9kHz", ":", "26", ".", "02", "±", "5", ".", "79", "p", "=", "0", ".", "075", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B, Quantitative real-time PCR showing reduced mRNA levels for Esr1, Esr2 and Pgr and upregulation of Shank3 and Psd-95 in cochleae of 4 week old Wbp2-deficient mice compared to littermate controls (n=3 for each genotype). Hprt is used as relative control. Error bars: ±SD. Two-tailed student t test: p=0.03 for Psd-95; p=0.007 for Shank3; p=0.03 for Esr2; p=0.0016 for Esr1; p=0.037 for Pgr.C, Synapses from one mutant and one control IHC at 4 weeks of age after Psd-95 and CtBP2 labelling, showing stronger Psd-95 expression in the mutants compared to controls, representing double labelling experiments performed on 3 mutants and 3 controls. P indicates direction of pillar cells. Scale bar: 10μm.D, Quantification of Psd95 fluorescence in IHC synapses, representing expression in the apical (9kHz best frequency region of the cochlea) and basal (24kHz best frequency region of the cochlea) regions at 4 weeks old . Data from 2 wt and 2 homs were analysed (16 synapses per cochlear region per mouse). AU, Arbitrary Units.Wt: 24kHz 22.41±10.70, 9kHz 11.045±2.128; Mutants: 24kHz 66.73±13.70, p=0.069; 9kHz: 26.02±5.79 p=0.075."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Silver", "staining", "of", "proteins", "extracted", "from", "N2A", "mouse", "neuronal", "cells", "expressing", "Flag", "-", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", "and", "captured", "through", "consecutive", "anti", "-", "Flag", "and", "anti", "-", "HA", "affinity", "purification", "steps", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "HA", "-", "immunoprecipitated", "proteins", "and", "lysate", "of", "HEK293", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", "and", "/", "or", "Flag", "-", "tagged", "SMCR8", "and", "/", "or", "Flag", "-", "tagged", "WDR41", ".", "(", "C", ")", "Coomassie", "blue", "staining", "of", "Nickel", "-", "NTA", "affinity", "purification", "of", "HIS", "-", "C9ORF72", ",", "SMCR8", "and", "WDR41", "co", "-", "expressed", "in", "baculovirus", "infected", "insect", "cells", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "HA", "-", "immunoprecipitated", "proteins", "and", "lysate", "of", "HEK293", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", "and", "HA", "-", "tagged", "SMCR8", "with", "various", "Flag", "-", "tagged", "Rab", "GTPases", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "against", "endogenous", "C9orf72", ",", "Wdr41", ",", "Rab8a", ",", "Rab39b", ",", "Rab5", "and", "Rab7", "of", "control", "(", "IgG", "alone", ")", "or", "endogenous", "Smcr8", "immunoprecipitated", "from", "adult", "mouse", "brain", ".", "(", "F", ")", "αP32", "-", "radiolabelled", "GDP", "release", "from", "GST", "-", "tagged", "purified", "RAB8a", "as", "a", "function", "of", "increased", "concentration", "of", "either", "recombinant", "purified", "C9ORF72", "alone", "or", "in", "complex", "with", "SMCR8", "and", "WDR41", ".", "(", "G", ")", "Identical", "GDP", "release", "assay", "as", "in", "(", "F", ")", "but", "using", "recombinant", "purified", "GST", "-", "tagged", "RAB39b", "instead", "of", "RAB8a", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Silver staining of proteins extracted from N2A mouse neuronal cells expressing Flag-HA-tagged C9ORF72 and captured through consecutive anti-Flag and anti-HA affinity purification steps.(B) Immunoblot analysis of HA-immunoprecipitated proteins and lysate of HEK293 cells co-expressing HA-tagged C9ORF72 and/ or Flag-tagged SMCR8 and/or Flag-tagged WDR41.(C) Coomassie blue staining of Nickel-NTA affinity purification of HIS-C9ORF72, SMCR8 and WDR41 co-expressed in baculovirus infected insect cells.(D) Immunoblot analysis of HA-immunoprecipitated proteins and lysate of HEK293 cells co-expressing HA-tagged C9ORF72 and HA-tagged SMCR8 with various Flag-tagged Rab GTPases.(E) Immunoblot against endogenous C9orf72, Wdr41, Rab8a, Rab39b, Rab5 and Rab7 of control (IgG alone) or endogenous Smcr8 immunoprecipitated from adult mouse brain.(F)αP32-radiolabelled GDP release from GST-tagged purified RAB8a as a function of increased concentration of either recombinant purified C9ORF72 alone or in complex with SMCR8 and WDR41.(G) Identical GDP release assay as in (F) but using recombinant purified GST-tagged RAB39b instead of RAB8a. Error bars indicate s.e.m. Experiments were repeated 3 times (n=3)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "organotypic", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transfected", "with", "GFP", "-", "RFP", "-", "LC3B", "and", "transduced", "with", "lentivirus", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", "and", "treated", "or", "not", "with", "Torin", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "LC3B", "puncta", ".", "(", "B", ")", "Upper", "panel", ",", "immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "LC3B", "(", "Map1lc3b", ")", ",", "C9orf72", "and", "control", "Actin", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transduced", "with", "lentivirus", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", "and", "treated", "or", "not", "with", "Torin", ".", "Lower", "panel", ",", "real", "time", "RT", "-", "qPCR", "quantification", "of", "endogenous", "C9orf72", "mRNA", "expression", "relative", "to", "Rplp0", "mRNA", ".", "(", "C", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "endogenous", "P62", "(", "Sqstm1", ")", "on", "organotypic", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transduced", "with", "lentiviral", "particles", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "P62", "aggregates", ".", "(", "D", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "transfected", "constructs", "(", "Green", ")", "and", "endogenous", "P62", "(", "Sqstm1", ",", "red", ")", "on", "GT1", "-", "7", "neuronal", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "C9orf72", "and", "plasmids", "expressing", "control", "GFP", ",", "HA", "tagged", "wild", "type", "or", "mutant", "RAB39b", "(", "CA", ",", "Q68L", "or", "CN", ",", "S22N", ")", ",", "RAB8a", "or", "RAB7", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "P62", "aggregates", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Student", "T", "-", "test", ",", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Left panel, representative images of organotypic cultures of E18 mouse cortical neurons transfected with GFP-RFP-LC3B and transduced with lentivirus expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72 mRNA and treated or not with Torin. Right panel, quantification of LC3B puncta.(B) Upper panel, immunoblot analysis of endogenous LC3B (Map1lc3b), C9orf72 and control Actin of E18 mouse cortical neurons transduced with lentivirus expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72 mRNA and treated or not with Torin. Lower panel, real time RT-qPCR quantification of endogenous C9orf72 mRNA expression relative to Rplp0 mRNA.(C) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of endogenous P62 (Sqstm1) on organotypic cultures of E18 mouse cortical neurons transduced with lentiviral particles expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72. Right panel, quantification of P62 aggregates.(D) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of transfected constructs (Green) and endogenous P62 (Sqstm1, red) on GT1-7 neuronal cells transfected with siRNA targeting C9orf72 and plasmids expressing control GFP, HA tagged wild type or mutant RAB39b (CA, Q68L or CN, S22N), RAB8a or RAB7. Right panel, quantification of P62 aggregates. Scale bars, 10 µm. Nuclei were counterstained with DAPI. Error bars indicate s.e.m. Student T-test, * indicates p<0.05, *** indicates p<0.001. n=3."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "HA", "-", "immunoprecipitated", "proteins", "and", "lysate", "of", "HEK293", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", "and", "HA", "-", "tagged", "SMCR8", "with", "Flag", "-", "tagged", "TBK1", ",", "NAP1", ",", "TANK", "or", "SINTBAD", ".", "(", "B", ")", "Immunoprecipitated", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", ",", "HA", "-", "tagged", "SMCR8", "and", "HA", "-", "tagged", "WDR41", "expressed", "in", "HEK293", "were", "subjected", "to", "in", "vitro", "TBK1", "kinase", "assay", "in", "the", "presence", "of", "γP32", "-", "radiolabelled", "ATP", ".", "Proteins", "were", "separated", "by", "SDS", "page", "migration", "and", "phosphorylation", "was", "detected", "by", "autoradiography", "(", "upper", "panel", ")", ",", "while", "expression", "was", "detected", "by", "western", "blotting", "(", "lower", "panel", ")", ".", "(", "C", ")", "Mass", "spectrometry", "identification", "of", "SMCR8", "phosphorylation", "sites", "by", "in", "vitro", "TBK1", "kinase", "assay", "of", "HIS", "-", "tagged", "C9ORF72", ":", "SMCR8", ":", "WDR41", "complex", "purified", "from", "baculovirus", "infected", "insect", "cells", ".", "(", "D", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "transfected", "constructs", "(", "Green", ")", "and", "endogenous", "P62", "(", "Sqstm1", ",", "red", ")", "on", "GT1", "-", "7", "neuronal", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "the", "3", "'", "UTR", "of", "Smcr8", "mRNA", "and", "plasmids", "expressing", "control", "GFP", ",", "HA", "tagged", "wild", "type", "or", "mutant", "SMCR8", "(", "TA", ",", "S402A", "and", "T796A", ";", "TD", ",", "S402D", "and", "T796D", ";", "UD", ",", "S400D", ",", "S492D", ",", "S562D", "and", "T666D", ")", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "P62", "aggregates", ".", "(", "E", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "transfected", "constructs", "(", "Green", ")", "and", "endogenous", "P62", "(", "Sqstm1", ",", "red", ")", "on", "GT1", "-", "7", "neuronal", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "Tbk1", "and", "plasmids", "expressing", "control", "GFP", ",", "HA", "tagged", "wild", "type", "or", "mutant", "SMCR8", "or", "RAB39b", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "P62", "aggregates", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Student", "T", "-", "test", ",", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunoblot analysis of HA-immunoprecipitated proteins and lysate of HEK293 cells co-expressing HA-tagged C9ORF72 and HA-tagged SMCR8 with Flag-tagged TBK1, NAP1, TANK or SINTBAD.(B) Immunoprecipitated HA-tagged C9ORF72, HA-tagged SMCR8 and HA-tagged WDR41 expressed in HEK293 were subjected to in vitro TBK1 kinase assay in the presence of γP32-radiolabelled ATP. Proteins were separated by SDS page migration and phosphorylation was detected by autoradiography (upper panel), while expression was detected by western blotting (lower panel).(C) Mass spectrometry identification of SMCR8 phosphorylation sites by in vitro TBK1 kinase assay of HIS-tagged C9ORF72:SMCR8:WDR41 complex purified from baculovirus infected insect cells.(D) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of transfected constructs (Green) and endogenous P62 (Sqstm1, red) on GT1-7 neuronal cells transfected with siRNA targeting the 3'UTR of Smcr8 mRNA and plasmids expressing control GFP, HA tagged wild type or mutant SMCR8 (TA, S402A and T796A; TD, S402D and T796D; UD, S400D, S492D, S562D and T666D). Right panel, quantification of P62 aggregates.(E) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of transfected constructs (Green) and endogenous P62 (Sqstm1, red) on GT1-7 neuronal cells transfected with siRNA targeting Tbk1 and plasmids expressing control GFP, HA tagged wild type or mutant SMCR8 or RAB39b. Right panel, quantification of P62 aggregates. Scale bars, 10 µm. Nuclei were counterstained with DAPI. Error bars indicate s.e.m. Student T-test, * indicates p<0.05, *** indicates p<0.001. n=3."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "Tdp", "-", "43", ",", "C9orf72", "and", "control", "Gapdh", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transduced", "with", "lentivirus", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", ".", "(", "B", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "endogenous", "phosphorylated", "Ser409", "/", "410", "-", "Tdp", "-", "43", "on", "primary", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transduced", "with", "lentiviral", "particles", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "cytoplasmic", "Tdp", "-", "43", "aggregates", ".", "(", "C", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "D169G", "mutant", "GFP", "-", "tagged", "TDP", "-", "43", "on", "primary", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transfected", "with", "either", "HA", "-", "tagged", "control", "or", "HA", "-", "C9ORF72", "plasmid", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "cells", "with", "cytoplasmic", "aggregates", "of", "TDP", "-", "43", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Student", "T", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Immunoblot analysis of endogenous Tdp-43, C9orf72 and control Gapdh of E18 mouse cortical neurons transduced with lentivirus expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72 mRNA.(B) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of endogenous phosphorylated Ser409/410-Tdp-43 on primary cultures of E18 mouse cortical neurons transduced with lentiviral particles expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72. Right panel, quantification of cytoplasmic Tdp-43 aggregates.(C) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of D169G mutant GFP-tagged TDP-43 on primary cultures of E18 mouse cortical neurons transfected with either HA-tagged control or HA-C9ORF72 plasmid. Right panel, quantification of cells with cytoplasmic aggregates of TDP-43. Scale bars, 10 µm. Nuclei were counterstained with DAPI. Error bars indicate s.e.m. Student T-test, *** indicates p<0.001. n=3."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "organotypic", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "ATXN2", "with", "control", "(", "Q22x", ")", "or", "intermediate", "(", "Q30x", ")", "polyQ", "size", "and", "transduced", "with", "lentivirus", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "ATXN2", "aggregates", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "(", "B", ")", "Cell", "viability", "(", "tetrazolium", "assay", ")", "of", "GT1", "-", "7", "neuronal", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "ATXN2", "with", "control", "(", "Q22x", ")", "or", "intermediate", "(", "Q30x", ")", "polyQ", "size", "and", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Student", "T", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "3", ".", "(", "C", ")", "Tracing", "of", "the", "swimming", "trajectories", "of", "48", "hours", "post", "-", "fertilization", "zebrafish", "larvae", "following", "light", "touch", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "touch", "-", "evoked", "swimming", "distance", "(", "D", ")", ",", "average", "velocity", "(", "E", ")", ",", "and", "maximum", "velocity", "attained", "(", "F", ")", "shows", "significant", "functional", "impairment", "of", "the", "zebrafish", "injected", "with", "HA", "-", "tagged", "ATXN2", "with", "intermediate", "length", "of", "polyQ", "(", "Q30x", ")", "and", "antisense", "morpholino", "oligonucleotides", "(", "AMOs", ")", "against", "C9orf72", "compared", "to", "control", "HA", "-", "tagged", "ATXN2", "(", "Q22x", ")", "or", "to", "the", "sole", "injection", "of", "AMO", "against", "C9orf72", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "of", "motor", "neurons", "visualized", "with", "anti", "-", "Sv2", "immunohistochemistry", "show", "severe", "axonopathy", "in", "fish", "injected", "with", "both", "ATXN2", "Q30x", "and", "AMO", "against", "C9orf72", "compared", "to", "zebrafish", "injected", "with", "control", "ATXN2", "Q22x", "or", "with", "AMO", "against", "C9orf72", "alone", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "motor", "neuron", "axonal", "length", "demonstrates", "a", "significant", "decrease", "of", "axonal", "length", "in", "48", "hours", "post", "-", "fertilization", "zebrafish", "larvae", "injected", "with", "both", "ATXN2", "Q30x", "and", "AMO", "against", "C9orf72", "compared", "to", "controls", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Left panel, representative images of organotypic cultures of E18 mouse cortical neurons co-transfected with HA-tagged ATXN2 with control (Q22x) or intermediate (Q30x) polyQ size and transduced with lentivirus expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72 mRNA. Right panel, quantification of ATXN2 aggregates. Scale bars, 10 µm. Nuclei were counterstained with DAPI.(B) Cell viability (tetrazolium assay) of GT1-7 neuronal cells co-transfected with HA-tagged ATXN2 with control (Q22x) or intermediate (Q30x) polyQ size and control siRNA or siRNA targeting C9orf72 mRNA. Error bars indicate s.e.m. Student T-test, *** indicates p<0.001. n=3.(C) Tracing of the swimming trajectories of 48 hours post-fertilization zebrafish larvae following light touch. (D-F) Quantification of the touch-evoked swimming distance (D), average velocity (E), and maximum velocity attained (F) shows significant functional impairment of the zebrafish injected with HA-tagged ATXN2 with intermediate length of polyQ (Q30x) and antisense morpholino oligonucleotides (AMOs) against C9orf72 compared to control HA-tagged ATXN2 (Q22x) or to the sole injection of AMO against C9orf72.(G) Representative images of motor neurons visualized with anti-Sv2 immunohistochemistry show severe axonopathy in fish injected with both ATXN2 Q30x and AMO against C9orf72 compared to zebrafish injected with control ATXN2 Q22x or with AMO against C9orf72 alone. (H) Quantification of the motor neuron axonal length demonstrates a significant decrease of axonal length in 48 hours post-fertilization zebrafish larvae injected with both ATXN2 Q30x and AMO against C9orf72 compared to controls. Error bars indicate s.e.m. One-way ANOVA, ** indicates p<0.01. n=3."}
{"words": ["Figure", "1Cell", "surface", "H2", "-", "Kb", "levels", "of", "wild", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "transduced", "with", "control", "vector", "or", "a", "vector", "expressing", "hβ2m", "were", "analyzed", ".", "Cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "by", "wild", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "expressing", "hβ2m", "were", "compared", "to", "control", "BMDC", ",", "by", "measuring", "IL", "-", "2", "production", "by", "a", "Kb", "-", "SIINFEKL", "specific", "T", "-", "cell", "hybridoma", "(", "B3Z", ")", "cultured", "with", "paraformaldehyde", "fixed", "BMDC", "that", "were", "incubated", "with", "varying", "numbers", "of", "OVA", "-", "coated", "latex", "beads", "for", "6hr", ",", "prior", "to", "fixation", ".", "The", "effect", "of", "hβ2m", "on", "the", "presentation", "of", "peptides", "derived", "from", "endogenous", "antigen", "was", "assessed", "by", "measuring", "IL", "-", "2", "levels", "in", "the", "culture", "supernatant", "of", "the", "B3Z", "hybridoma", "incubated", "with", "fixed", "VV", "-", "OVA", "infected", "WT", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "transduced", "with", "control", "vector", "or", "hβ2m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Cell surface H2-Kb levels of wild type and TAP1-/- BMDC transduced with control vector or a vector expressing hβ2m were analyzed.Cross-presentation of OVA by wild type and TAP1-/- BMDC expressing hβ2m were compared to control BMDC, by measuring IL-2 production by a Kb-SIINFEKL specific T-cell hybridoma (B3Z) cultured with paraformaldehyde fixed BMDC that were incubated with varying numbers of OVA-coated latex beads for 6hr, prior to fixation.The effect of hβ2m on the presentation of peptides derived from endogenous antigen was assessed by measuring IL-2 levels in the culture supernatant of the B3Z hybridoma incubated with fixed VV-OVA infected WT and TAP1-/- BMDC transduced with control vector or hβ2m."}
{"words": ["Figure", "2Surface", "H2", "-", "Kb", "levels", "of", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Surface", "H2", "-", "Kb", "levels", "of", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Surface", "H2", "-", "Kb", "levels", "of", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "by", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "and", "IL", "-", "2", "release", "is", "shownCross", "-", "presentation", "of", "OVA", "by", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "and", "IL", "-", "2", "release", "is", "shownCross", "-", "presentation", "of", "OVA", "by", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "and", "IL", "-", "2", "release", "is"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Surface H2-Kb levels of wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed by flow cytometry.Surface H2-Kb levels of wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed by flow cytometry.Surface H2-Kb levels of wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed by flow cytometry.Cross-presentation of OVA by wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed and IL-2 release is shownCross-presentation of OVA by wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed and IL-2 release is shownCross-presentation of OVA by wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed and IL-2 release is shown"}
{"words": ["Figure", "3TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "transduced", "with", "vector", "control", "(", "A", ")", "or", "hβ2m", "(", "C", ")", "were", "incubated", "with", "varying", "concentrations", "of", "Epoxomicin", "for", "6hr", "in", "absence", "or", "presence", "of", "exogenously", "added", "Kb", "-", "binding", "SIINFEKL", "peptide", "and", "analyzed", "for", "surface", "expression", "of", "Kb", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "plots", "are", "shown", "(", "A", ",", "C", ")", ".", "The", "impact", "of", "Epoxomicin", "on", "cell", "surface", "Kb", "was", "analyzed", "by", "plotting", "Kb", "surface", "expression", "on", "cells", "incubated", "with", "Epoxomicin", ",", "normalized", "to", "that", "on", "cell", "incubated", "without", "Epoxomicin", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "B", ",", "D", ")", ".", "The", "effect", "of", "Epoxomicin", "on", "cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "-", "coated", "beads", "by", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "expressing", "hβ2m", "was", "determined", "by", "incubating", "the", "BMDC", "with", "OVA", "coated", "latex", "beads", "in", "the", "presence", "of", "varying", "doses", "of", "Epoxomicin", "and", "10μM", "gB", "peptide", ".", "After", "6hrs", "the", "cells", "were", "fixed", ",", "incubated", "with", "B3Z", "cells", "and", "IL", "-", "2", "production", "was"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3TAP1-/- BMDC transduced with vector control (A) or hβ2m (C) were incubated with varying concentrations of Epoxomicin for 6hr in absence or presence of exogenously added Kb-binding SIINFEKL peptide and analyzed for surface expression of Kb by flow cytometry. Representative plots are shown (A, C). The impact of Epoxomicin on cell surface Kb was analyzed by plotting Kb surface expression on cells incubated with Epoxomicin, normalized to that on cell incubated without Epoxomicin (n=3) (B, D).The effect of Epoxomicin on cross-presentation of OVA-coated beads by TAP1-/- BMDC expressing hβ2m was determined by incubating the BMDC with OVA coated latex beads in the presence of varying doses of Epoxomicin and 10μM gB peptide. After 6hrs the cells were fixed, incubated with B3Z cells and IL-2 production was measured"}
{"words": ["Figure", "4293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "co", "-", "expressing", "empty", "vector", "or", "Rab", "mutants", "(", "Rab5ACA", ",", "Rab22ACA", ",", "Rab7ADN", ")", "individually", ",", "with", "either", "LacZ", "as", "a", "control", "or", "US6", "were", "analyzed", "for", "cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "using", "B3Z", "cells", ".", "The", "effects", "of", "US6", "on", "cross", "-", "presentation", "were", "analyzed", "by", "plotting", "the", "mean", "percentage", "of", "IL", "-", "2", "release", "by", "cells", "co", "-", "expressing", "US6", "(", "A", ")", "with", "control", "vector", "or", "Rab", "mutants", "compared", "to", "cells", "co", "-", "expressing", "LacZ", "with", "control", "vector", "or", "Rab", "mutants", ",", "respectively", ".", "293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "co", "-", "expressing", "empty", "vector", "or", "Rab", "mutants", "(", "Rab5ACA", ",", "Rab22ACA", ",", "Rab7ADN", ")", "individually", ",", "with", "either", "LacZ", "as", "a", "control", "or", "ICP47", "(", "B", ")", ",", "were", "analyzed", "for", "cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "using", "B3Z", "cells", ".", "The", "effects", "of", "ICP47", "on", "cross", "-", "presentation", "were", "analyzed", "by", "plotting", "the", "mean", "percentage", "of", "IL", "-", "2", "release", "by", "cells", "co", "-", "expressing", "ICP47", "(", "B", ")", "with", "control", "vector", "or", "Rab", "mutants", "compared", "to", "cells", "co", "-", "expressing", "LacZ", "with", "control", "vector", "or", "Rab", "mutants", ",", "respectively", ".", "293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "expressing", "Rab5ACA", "were", "incubated", "with", "opsonized", "OVA", "coated", "latex", "beads", "in", "the", "presence", "of", "varying", "doses", "of", "Epoxomicin", ".", "After", "6hrs", "the", "cells", "were", "fixed", ",", "incubated", "with", "B3Z", "cells", "and", "IL", "-", "2", "production", "was", "measured", ".", "293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "expressing", "Rab22ACA", "were", "incubated", "with", "opsonized", "OVA", "coated", "latex", "beads", "in", "the", "presence", "of", "varying", "doses", "of", "Epoxomicin", ".", "After", "6hrs", "the", "cells", "were", "fixed", ",", "incubated", "with", "B3Z", "cells", "and", "IL", "-", "2", "production", "was", "measured", ".", "293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "expressing", "Rab7ADN", "(", "E", ")", "were", "incubated", "with", "opsonized", "OVA", "coated", "latex", "beads", "in", "the", "presence", "of", "varying", "doses", "of", "Epoxomicin", ".", "After", "6hrs", "the", "cells", "were", "fixed", ",", "incubated", "with", "B3Z", "cells", "and", "IL", "-", "2", "production", "was", "measured", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4293T-FcR-Kb cells co-expressing empty vector or Rab mutants (Rab5ACA, Rab22ACA, Rab7ADN) individually, with either LacZ as a control or US6 were analyzed for cross-presentation of OVA using B3Z cells. The effects of US6 on cross-presentation were analyzed by plotting the mean percentage of IL-2 release by cells co-expressing US6 (A) with control vector or Rab mutants compared to cells co-expressing LacZ with control vector or Rab mutants, respectively.293T-FcR-Kb cells co-expressing empty vector or Rab mutants (Rab5ACA, Rab22ACA, Rab7ADN) individually, with either LacZ as a control or ICP47 (B), were analyzed for cross-presentation of OVA using B3Z cells. The effects of ICP47 on cross-presentation were analyzed by plotting the mean percentage of IL-2 release by cells co-expressing ICP47 (B) with control vector or Rab mutants compared to cells co-expressing LacZ with control vector or Rab mutants, respectively.293T-FcR-Kb cells expressing Rab5ACA were incubated with opsonized OVA coated latex beads in the presence of varying doses of Epoxomicin. After 6hrs the cells were fixed, incubated with B3Z cells and IL-2 production was measured.293T-FcR-Kb cells expressing Rab22ACA were incubated with opsonized OVA coated latex beads in the presence of varying doses of Epoxomicin. After 6hrs the cells were fixed, incubated with B3Z cells and IL-2 production was measured.293T-FcR-Kb cells expressing Rab7ADN (E) were incubated with opsonized OVA coated latex beads in the presence of varying doses of Epoxomicin. After 6hrs the cells were fixed, incubated with B3Z cells and IL-2 production was measured."}
{"words": ["Figure", "5EM", "micrographs", "of", "double", "immuno", "-", "gold", "labeling", "using", "antibodies", "against", "immunoproteasome", "subunit", "LMP2", "and", "the", "endolysosomal", "membrane", "marker", "LAMP1", "in", "BMDC", ",", "WT", "MEF", "and", "LMP2", "KO", "MEF", ".", "Large", "gold", "particles", "(", "15", "nm", ",", "black", "arrow", "head", ")", "labels", "LMP2", "and", "small", "gold", "particles", "labels", "LAMP1", "(", "5", "nm", ",", "white", "arrow", "head", ")", "(", "Scale", "bars", "=", "500nm", ")", ".", "The", "insets", "are", "the", "magnification", "of", "region", "of", "interest", "containing", "LAMP1", "positive", "vacuole", "(", "Scale", "bars", "=", "100nm", ")", ",", "marked", "by", "the", "black", "rectangle", ".", "The", "distribution", "of", "LMP2", "positive", "signals", "(", "n", "=", "22", "images", ")", "assessed", "by", "plotting", "the", "number", "of", "gold", "particles", "labeling", "LMP2", "within", "the", "LAMP1", "positive", "membrane", "compartment", "versus", "those", "outside", "the", "LAMP1", "positive", "organelles", ".", "Immuno", "-", "gold", "labeling", "with", "antibodies", "against", "constitutive", "proteasome", "subunits", ",", "α5", ",", "β5", "and", "19", "S2", "(", "15", "nm", ",", "black", "arrow", "head", ")", ",", "co", "-", "labeled", "with", "an", "anti", "-", "LAMP1", "antibody", "(", "5", "nm", ",", "white", "arrow", "head", ")", "in", "BMDC", "(", "Scale", "bars", "=", "500nm", ")", ".", "Regions", "of", "interest", "containing", "LAMP1", "positive", "vacuoles", "are", "marked", "by", "the", "black", "rectangles", "and", "magnified", "in", "the", "insets", "(", "Scale", "bars", "=", "100nm", ")", ".", "Immuno", "-", "electron", "microscopy", "images", "(", "n", "=", "23", ")", "were", "analyzed", "by", "plotting", "the", "total", "number", "of", "gold", "particles", "labeling", "proteasome", "subunits", "inside", "and", "outside", "the", "LAMP1", "positive", "membrane", "compartments", "(", "D", ")", ".", "These", "data", "are", "also", "presented", "as", "the", "percentage", "of", "the", "total", "gold", "particles", "that", "are", "within", "the", "LAMP1", "positive", "organelle", "(", "E", ")", ".", "BMDC", "transduced", "with", "genes", "encoding", "GFP", ",", "GFP", "-", "Rab5ACA", "and", "GFP", "-", "Rab22ACA", "under", "the", "control", "of", "an", "inducible", "promoter", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "LMP2", "and", "LAMP1", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", "24hr", "after", "doxycycline", "induction", "and", "4hr", "after", "Alexa", "647", "-", "OVA", "coated", "bead", "uptake", ".", "A", "single", "optical", "section", "of", "10", "optical", "sections", "of", "a", "representative", "cell", "are", "shown", "(", "Scale", "Bar", "10μm", ")", ".", "Region", "of", "interest", "containing", "LAMP1", "positive", "vacuole", "containing", "beads", "coated", "with", "Alexa", "-", "647", "conjugated", "OVA", ",", "marked", "by", "white", "rectangles", ",", "are", "magnified", "as", "inset", "(", "Scale", "bars", "=", "1μm", ")", "BMDC", "transduced", "with", "genes", "encoding", "GFP", ",", "GFP", "-", "Rab5ACA", "and", "GFP", "-", "Rab22ACA", "under", "the", "control", "of", "an", "inducible", "promoter", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "LMP2", "and", "LAMP1", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", "3D", "-", "rendering", "of", "10", "optical", "sections", "of", "a", "representative", "cell", "are", "shown", "(", "Scale", "Bar", "10μm", ")", ".", "Region", "of", "interest", "containing", "LAMP1", "positive", "vacuole", "containing", "beads", "coated", "with", "Alexa", "-", "647", "conjugated", "OVA", ",", "marked", "by", "white", "rectangles", ",", "are", "magnified", "as", "inset", "(", "Scale", "bars", "=", "1μm", ")", "The", "same", "cells", "were", "analyzed", "for", "LMP2", "fluorescence", "intensity", "within", "the", "phagosomal", "lumen", "as", "defined", "by", "a", "region", "of", "interest", "positive", "for", "Alexa", "647", "-", "OVA", "enclosed", "within", "a", "limiting", "membrane", "positive", "for", "LAMP1", ".", "The", "fluorescence", "intensity", "of", "LMP2", "within", "the", "phagosomal", "lumen", "normalized", "to", "Alexa647", "-", "OVA", "was", "calculated", "and", "data", "compiled", "from", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", "are", "plotted", "(", "H", ")", ".", "For", "each", "transduced", "cell", "type", ",", "images", "of", "at", "the", "least", "27", "cells", "acquired", "across", "three", "independent", "experiments", "were", "analyzed", "and", "each", "cell", "is", "represented", "as", "a", "data", "point", ".", "BMDC", "co", "-", "expressing", "LMP2", "-", "RFP", "and", "GFP", "-", "Rab5ACA", "were", "live", "imaged", "16hr", "after", "doxycycline", "induction", "and", "30min", "post", "uptake", "of", "Alexa647", "coated", "latex", "beads", "(", "Bar", "10μm", ")", ".", "Images", "were", "acquired", "every", "3min", "and", "images", "taken", "at", "12min", "interval", "are", "presented", "(", "I", "-", "K", ")", ".", "The", "arrowheads", "in", "panel", "(", "I", "and", "J", ")", "mark", "the", "phagosome", "or", "vacuoles", "containing", "LMP2", ",", "respectively", ".", "BMDC", "co", "-", "expressing", "LMP2", "-", "RFP", "and", "GFP", "-", "Rab22ACA", "(", "J", ",", "K", ")", "were", "live", "imaged", "16hr", "after", "doxycycline", "induction", "and", "30min", "post", "uptake", "of", "Alexa647", "coated", "latex", "beads", "(", "Bar", "10μm", ")", ".", "Images", "were", "acquired", "every", "3min", "and", "images", "taken", "at", "12min", "interval", "are", "presented", "(", "I", "-", "K", ")", ".", "The", "arrowheads", "in", "panel", "(", "I", "and", "J", ")", "mark", "the", "phagosome", "or", "vacuoles", "containing", "LMP2", ",", "respectively", ".", "The", "boxed", "region", "in", "panel", "(", "J", ")", "marks", "a", "phagosome", "that", "has", "been", "enlarged", "in", "panel", "(", "K", ")", "(", "Bar", "1μm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5EM micrographs of double immuno-gold labeling using antibodies against immunoproteasome subunit LMP2 and the endolysosomal membrane marker LAMP1 in BMDC, WT MEF and LMP2 KO MEF. Large gold particles (15 nm, black arrow head) labels LMP2 and small gold particles labels LAMP1 (5 nm, white arrow head) (Scale bars = 500nm). The insets are the magnification of region of interest containing LAMP1 positive vacuole (Scale bars = 100nm), marked by the black rectangle.The distribution of LMP2 positive signals (n = 22 images) assessed by plotting the number of gold particles labeling LMP2 within the LAMP1 positive membrane compartment versus those outside the LAMP1 positive organelles.Immuno-gold labeling with antibodies against constitutive proteasome subunits, α5, β5 and 19 S2 (15 nm, black arrow head), co-labeled with an anti-LAMP1 antibody (5 nm, white arrow head) in BMDC (Scale bars = 500nm). Regions of interest containing LAMP1 positive vacuoles are marked by the black rectangles and magnified in the insets (Scale bars = 100nm).Immuno-electron microscopy images (n = 23) were analyzed by plotting the total number of gold particles labeling proteasome subunits inside and outside the LAMP1 positive membrane compartments (D). These data are also presented as the percentage of the total gold particles that are within the LAMP1 positive organelle (E).BMDC transduced with genes encoding GFP, GFP-Rab5ACA and GFP-Rab22ACA under the control of an inducible promoter were fixed and stained for LMP2 and LAMP1 and analyzed by confocal microscopy 24hr after doxycycline induction and 4hr after Alexa 647-OVA coated bead uptake. A single optical section of 10 optical sections of a representative cell are shown (Scale Bar 10μm). Region of interest containing LAMP1 positive vacuole containing beads coated with Alexa-647 conjugated OVA, marked by white rectangles, are magnified as inset (Scale bars = 1μm)BMDC transduced with genes encoding GFP, GFP-Rab5ACA and GFP-Rab22ACA under the control of an inducible promoter were fixed and stained for LMP2 and LAMP1 and analyzed by confocal microscopy 3D-rendering of 10 optical sections of a representative cell are shown (Scale Bar 10μm). Region of interest containing LAMP1 positive vacuole containing beads coated with Alexa-647 conjugated OVA, marked by white rectangles, are magnified as inset (Scale bars = 1μm)The same cells were analyzed for LMP2 fluorescence intensity within the phagosomal lumen as defined by a region of interest positive for Alexa 647-OVA enclosed within a limiting membrane positive for LAMP1. The fluorescence intensity of LMP2 within the phagosomal lumen normalized to Alexa647-OVA was calculated and data compiled from independent experiments (n=3) are plotted (H).For each transduced cell type, images of at the least 27 cells acquired across three independent experiments were analyzed and each cell is represented as a data point.BMDC co-expressing LMP2-RFP and GFP-Rab5ACA were live imaged 16hr after doxycycline induction and 30min post uptake of Alexa647 coated latex beads (Bar 10μm). Images were acquired every 3min and images taken at 12min interval are presented (I-K). The arrowheads in panel (I and J) mark the phagosome or vacuoles containing LMP2, respectively.BMDC co-expressing LMP2-RFP and GFP-Rab22ACA (J, K) were live imaged 16hr after doxycycline induction and 30min post uptake of Alexa647 coated latex beads (Bar 10μm). Images were acquired every 3min and images taken at 12min interval are presented (I-K). The arrowheads in panel (I and J) mark the phagosome or vacuoles containing LMP2, respectively. The boxed region in panel (J) marks a phagosome that has been enlarged in panel (K) (Bar 1μm)."}
{"words": ["Figure", "6Activity", "of", "proteasomes", "within", "the", "phagosomes", "was", "determined", "by", "measuring", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "fluorogenic", "proteasome", "substrate", "incubated", "with", "latex", "beads", "from", "detergent", "-", "treated", "phagosomes", "treated", "or", "untreated", "with", "Epoxomicin", ".", "The", "fluorescence", "intensities", "were", "measured", "at", "1hr", "intervals", "and", "values", "plotted", "represent", "the", "ratio", "of", "the", "signals", "in", "the", "absence", "versus", "the", "presence", "of", "EpoxomicinIntraluminal", "proteasome", "dependent", "degradation", "of", "phagocytosed", "antigen", "was", "measured", "by", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "phagocytosed", "latex", "beads", "covalently", "conjugated", "with", "Alexa647", "-", "OVA", ".", "Latex", "beads", "were", "extracted", "by", "mechanical", "disruption", "of", "BMDC", "and", "incubated", "with", "ATP", ",", "lysosomal", "protease", "inhibitor", "cocktail", "and", "varying", "dose", "of", "Epoxomicin", "at", "37oC", "for", "16hrs", ".", "Post", "incubation", "latex", "beads", "were", "treated", "with", "detergent", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "(", "B", ")", ".", "The", "mean", "of", "Alexa647", "fluorescence", "associated", "with", "the", "latex", "beads", "incubated", "with", "Epoxomicin", "were", "normalized", "to", "fluorescence", "of", "untreated", "beads", "from", "independent", "experiments", "were", "plotted", "(", "n", "=", "4", ")", "(", "C", ")", ".", "Ubiquitination", "of", "phagosomal", "cargo", "within", "the", "phagosomes", "was", "assessed", "by", "measuring", "the", "acquisition", "of", "GFP", "fluorescence", "by", "phagocytosed", "latex", "beads", "conjugated", "with", "OVA", "post", "-", "detergent", "extraction", "from", "BMDC", "expressing", "GFP", "or", "GFP", "-", "Ub", "(", "D", ")", ".", "The", "mean", "of", "fluorescence", "intensities", "of", "GFP", "on", "the", "beads", "from", "independent", "experiments", "was", "plotted", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Activity of proteasomes within the phagosomes was determined by measuring the fluorescence intensity of fluorogenic proteasome substrate incubated with latex beads from detergent-treated phagosomes treated or untreated with Epoxomicin. The fluorescence intensities were measured at 1hr intervals and values plotted represent the ratio of the signals in the absence versus the presence of EpoxomicinIntraluminal proteasome dependent degradation of phagocytosed antigen was measured by flow cytometric analysis of phagocytosed latex beads covalently conjugated with Alexa647-OVA. Latex beads were extracted by mechanical disruption of BMDC and incubated with ATP, lysosomal protease inhibitor cocktail and varying dose of Epoxomicin at 37oC for 16hrs. Post incubation latex beads were treated with detergent and analyzed by flow cytometry (B). The mean of Alexa647 fluorescence associated with the latex beads incubated with Epoxomicin were normalized to fluorescence of untreated beads from independent experiments were plotted (n=4) (C).Ubiquitination of phagosomal cargo within the phagosomes was assessed by measuring the acquisition of GFP fluorescence by phagocytosed latex beads conjugated with OVA post-detergent extraction from BMDC expressing GFP or GFP-Ub (D). The mean of fluorescence intensities of GFP on the beads from independent experiments was plotted (E)."}
{"words": ["Figure", "2Whole", "cell", "extracts", "of", "High", "Five", "insect", "cells", "individually", "expressing", "FLAG", "-", "SHLD3", ",", "Strep", "-", "RIF1", ",", "and", "6xHis", "-", "REV7", "through", "baculovirus", "infection", "were", "combined", "and", "subjected", "to", "FLAG", "immunoprecipitation", "or", "streptactin", "pulldown", "and", "immunoblotted", "for", "REV7", "or", "the", "Strep", "or", "FLAG", "epitopes", ".", "Results", "are", "representative", "of", "three", "biologically", "independent", "experiments", ".", "IB", ":", "immunoblot", ",", "FL", ":", "full", "-", "length", ".", "For", "SHLD3", ",", "N", "and", "C", "correspond", "to", "residues", "1", "-", "125", "and", "126", "-", "250", ",", "respectively", ".", "Representative", "micrographs", "of", "the", "LacR", "/", "LacO", "assay", "using", "mCherry", "-", "LacR", "-", "RIF1N", "as", "bait", "to", "evaluate", "chromatin", "recruitment", "of", "eGFP", "-", "tagged", "SHLD3", "variants", ".", "SHLD3", ":", "residues", "2", "-", "250", ".", "SHLD3N", ":", "residues", "2", "-", "125", ".", "SHLD3C", ":", "residues", "126", "-", "250", ".", "RIF1N", ":", "residues", "1", "-", "967", ".", "Quantification", "of", "LacR", "/", "LacO", "assay", "measuring", "chromatin", "recruitment", "of", "eGFP", "-", "tagged", "SHLD3", "variants", "to", "LacO", "arrays", "by", "mCherry", "-", "LacR", "-", "RIF1N", ".", "GFP", "intensities", "are", "presented", "as", "a", "ratio", "between", "the", "average", "fluorescence", "intensity", "within", "the", "mCherry", "-", "labeled", "LacR", "focus", "and", "the", "average", "nuclear", "intensity", ".", "Bars", "represent", "means", "(", "n", "=", "138", ",", "126", ",", "129", ",", "137", "for", "eGFP", ",", "eGFP", "-", "SHLD3", ",", "eGFP", "-", "SHLD3N", ",", "eGFP", "-", "SHLD3C", "from", "3", "biologically", "independent", "experiments", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "against", "empty", "vector", "control", "or", "full", "-", "length", "eGFP", "-", "SHLD3", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "ns", ":", "P", ">", "0", ".", "05", ".", "Representative", "micrographs", "of", "the", "LacR", "-", "FokI", "assay", "to", "evaluate", "DNA", "damage", "recruitment", "of", "eGFP", "-", "tagged", "SHLD3", "variants", "after", "induction", "of", "LacR", "-", "FokI", "expression", ".", "Quantification", "of", "LacR", "-", "FokI", "assay", "evaluating", "recruitment", "of", "eGFP", "-", "tagged", "SHLD3", "variants", "to", "FokI", "-", "induced", "DSBs", "at", "LacO", "arrays", ".", "GFP", "intensities", "are", "presented", "as", "a", "ratio", "between", "the", "average", "fluorescence", "intensity", "within", "the", "mCherry", "-", "labeled", "LacR", "-", "FokI", "focus", "and", "the", "average", "nuclear", "intensity", ".", "Bars", "represent", "mean", "(", "n", "=", "143", ",", "147", ",", "147", ",", "141", "for", "eGFP", ",", "eGFP", "-", "SHLD3", ",", "eGFP", "-", "SHLD3N", ",", "eGFP", "-", "SHLD3C", "from", "3", "biologically", "independent", "experiments", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "against", "empty", "vector", "control", "or", "full", "-", "length", "eGFP", "-", "SHLD3", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "ns", ":", "P", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Whole cell extracts of High Five insect cells individually expressing FLAG-SHLD3, Strep-RIF1, and 6xHis-REV7 through baculovirus infection were combined and subjected to FLAG immunoprecipitation or streptactin pulldown and immunoblotted for REV7 or the Strep or FLAG epitopes. Results are representative of three biologically independent experiments. IB: immunoblot, FL: full-length. For SHLD3, N and C correspond to residues 1-125 and 126-250, respectively.Representative micrographs of the LacR/LacO assay using mCherry-LacR-RIF1N as bait to evaluate chromatin recruitment of eGFP-tagged SHLD3 variants. SHLD3: residues 2-250. SHLD3N: residues 2-125. SHLD3C: residues 126-250. RIF1N: residues 1-967.Quantification of LacR/LacO assay measuring chromatin recruitment of eGFP-tagged SHLD3 variants to LacO arrays by mCherry-LacR-RIF1N. GFP intensities are presented as a ratio between the average fluorescence intensity within the mCherry-labeled LacR focus and the average nuclear intensity. Bars represent means (n = 138, 126, 129, 137 for eGFP, eGFP-SHLD3, eGFP-SHLD3N, eGFP-SHLD3C from 3 biologically independent experiments). Analysis was performed by Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparisons against empty vector control or full-length eGFP-SHLD3. ****: P < 0.0001. ns: P > 0.05.Representative micrographs of the LacR-FokI assay to evaluate DNA damage recruitment of eGFP-tagged SHLD3 variants after induction of LacR-FokI expression.Quantification of LacR-FokI assay evaluating recruitment of eGFP-tagged SHLD3 variants to FokI-induced DSBs at LacO arrays. GFP intensities are presented as a ratio between the average fluorescence intensity within the mCherry-labeled LacR-FokI focus and the average nuclear intensity. Bars represent mean (n = 143, 147, 147, 141 for eGFP, eGFP-SHLD3, eGFP-SHLD3N, eGFP-SHLD3C from 3 biologically independent experiments). Analysis was performed by Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparisons against empty vector control or full-length eGFP-SHLD3. ****: P < 0.0001. ns: P > 0.05."}
{"words": ["Figure", "3Whole", "cell", "extracts", "of", "High", "Five", "insect", "cells", "individually", "expressing", "the", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "indicated", "alanine", "substitution", "FLAG", "-", "SHLD3C", "(", "residues", "126", "-", "250", ")", "variants", "and", "Strep", "-", "RIF1N", "(", "residues", "1", "-", "980", ")", "through", "baculovirus", "infection", "were", "combined", "and", "subjected", "to", "FLAG", "immunoprecipitation", "or", "streptactin", "pulldown", "and", "immunoblotted", "for", "the", "Strep", "or", "FLAG", "epitopes", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "two", "biologically", "independent", "experiments", ".", "IB", ":", "immunoblot", ".", "IP", ":", "immunoprecipitation", ".", "Quantification", "of", "LacR", "/", "LacO", "assay", "measuring", "recruitment", "of", "eGFP", "-", "SHLD3C", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "alanine", "substitution", "variants", "to", "LacO", "arrays", "in", "U2OS", "2", "-", "6", "-", "3", "cells", "by", "mCherry", "-", "LacR", "-", "RIF1N", ".", "GFP", "intensities", "are", "presented", "as", "a", "ratio", "between", "the", "average", "fluorescence", "intensity", "within", "the", "mCherry", "-", "labeled", "LacR", "-", "RIF1N", "focus", "and", "the", "average", "nuclear", "intensity", ".", "Bars", "represent", "means", "(", "n", "=", "134", ",", "125", ",", "120", ",", "130", ",", "104", ",", "129", ",", "117", "for", "EV", ",", "WT", ",", "S131A", ",", "W132A", ",", "R166A", ",", "N201A", ",", "D216A", "from", "3", "biologically", "independent", "experiments", ")", ".", "EV", ":", "empty", "vector", ".", "Analysis", "was", "performed", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "against", "empty", "vector", "and", "WT", "controls", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "*", "*", "*", ":", "P", "=", "0", ".", "0004", ".", "*", "*", ":", "P", "=", "0", ".", "002", ".", "*", ":", "P", "=", "0", ".", "02", ".", "ns", ":", "P", ">", "0", ".", "05", ".", "Quantification", "of", "LacR", "-", "FokI", "assay", "measuring", "recruitment", "of", "eGFP", "-", "SHLD3C", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "alanine", "substitution", "variants", "to", "sites", "of", "DNA", "double", "-", "strand", "breaks", "induced", "by", "mCherry", "-", "LacR", "-", "FokI", "in", "U2OS", "2", "-", "6", "-", "3", "cells", ".", "GFP", "intensities", "are", "presented", "as", "a", "ratio", "between", "the", "average", "fluorescence", "intensity", "within", "the", "mCherry", "-", "labeled", "LacR", "-", "FokI", "focus", "and", "the", "average", "nuclear", "intensity", ".", "Bars", "represent", "means", "(", "n", "=", "103", ",", "136", ",", "159", ",", "151", ",", "139", ",", "145", ",", "140", "for", "EV", ",", "WT", ",", "S131A", ",", "W132A", ",", "R166A", ",", "N201A", ",", "D216A", "from", "3", "biologically", "independent", "experiments", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "against", "empty", "vector", "and", "WT", "controls", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "ns", ":", "P", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Whole cell extracts of High Five insect cells individually expressing the wild-type (WT) or indicated alanine substitution FLAG-SHLD3C (residues 126-250) variants and Strep-RIF1N (residues 1-980) through baculovirus infection were combined and subjected to FLAG immunoprecipitation or streptactin pulldown and immunoblotted for the Strep or FLAG epitopes. The results are representative of two biologically independent experiments. IB: immunoblot. IP: immunoprecipitation.Quantification of LacR/LacO assay measuring recruitment of eGFP-SHLD3C wild-type (WT) or alanine substitution variants to LacO arrays in U2OS 2-6-3 cells by mCherry-LacR-RIF1N. GFP intensities are presented as a ratio between the average fluorescence intensity within the mCherry-labeled LacR-RIF1N focus and the average nuclear intensity. Bars represent means (n = 134, 125, 120, 130, 104, 129, 117 for EV, WT, S131A, W132A, R166A, N201A, D216A from 3 biologically independent experiments). EV: empty vector. Analysis was performed by Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparisons against empty vector and WT controls. ****: P < 0.0001. ***: P = 0.0004. **: P = 0.002. *: P = 0.02. ns: P > 0.05.Quantification of LacR-FokI assay measuring recruitment of eGFP-SHLD3C wild-type (WT) or alanine substitution variants to sites of DNA double-strand breaks induced by mCherry-LacR-FokI in U2OS 2-6-3 cells. GFP intensities are presented as a ratio between the average fluorescence intensity within the mCherry-labeled LacR-FokI focus and the average nuclear intensity. Bars represent means (n = 103, 136, 159, 151, 139, 145, 140 for EV, WT, S131A, W132A, R166A, N201A, D216A from 3 biologically independent experiments). Analysis was performed by Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparisons against empty vector and WT controls. ****: P < 0.0001. ns: P > 0.05."}
{"words": ["Figure", "4Representative", "micrographs", "of", "immunofluorescence", "experiments", "(", "from", "3", "biologically", "independent", "experiments", ")", "analyzing", "localization", "of", "SHLD3", "to", "53BP1", "bodies", "in", "RPE", "SHLD3", "-", "KO", "cells", ".", "3xFLAG", "-", "SHLD3", "-", "complemented", "RPE", "SHLD3", "-", "KO", "cells", "were", "treated", "with", "200", "nM", "aphidicolin", "(", "Aphi", ")", "for", "24", "h", "and", "processed", "for", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "antibodies", "against", "53BP1", ",", "FLAG", ",", "and", "cyclin", "A", ".", "53BP1", "bodies", "are", "defined", "as", "distinct", "foci", "visible", "in", "cyclin", "A", "-", "negative", "cells", ".", "Quantification", "of", "FLAG", "and", "53BP1", "colocalization", "from", "A", "performed", "in", "CellProfiler", ".", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficients", "(", "PCC", ")", "were", "calculated", "for", "pixels", "within", "each", "cyclin", "A", "-", "negative", ",", "53BP1", "body", "-", "positive", "nucleus", "between", "the", "53BP1", "and", "FLAG", "channels", ".", "Each", "point", "represents", "the", "PCC", "value", "of", "an", "individual", "nucleus", ".", "Bars", "represent", "means", ".", "(", "n", "=", "120", ",", "130", "for", "EV", ",", "SHLD3", "from", "three", "biologically", "independent", "experiments", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Representative", "micrographs", "of", "immunofluorescence", "experiments", "analyzing", "localization", "of", "FLAG", "-", "SHLD3", "alanine", "substitution", "variants", "stably", "expressed", "in", "RPE", "SHLD3", "-", "KO", "cells", "by", "lentivirus", "transduction", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "200", "nM", "Aphi", "for", "24", "hours", "and", "processed", "for", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "antibodies", "raised", "against", "53BP1", ",", "FLAG", ",", "and", "cyclin", "A", ".", "53BP1", "bodies", "are", "defined", "as", "distinct", "foci", "visible", "in", "cyclin", "A", "-", "negative", "cells", ".", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "containing", "the", "indicated", "number", "of", "53BP1", "bodies", "in", "RPE", "WT", "and", "SHLD3", "-", "KO", "cells", "with", "or", "without", "24", "-", "hour", "200", "nM", "Aphi", "treatment", ".", "Bars", "represent", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "biologically", "independent", "experiments", "with", "≥", "30", "nuclei", "imaged", "each", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative micrographs of immunofluorescence experiments (from 3 biologically independent experiments) analyzing localization of SHLD3 to 53BP1 bodies in RPE SHLD3-KO cells. 3xFLAG-SHLD3-complemented RPE SHLD3-KO cells were treated with 200 nM aphidicolin (Aphi) for 24 h and processed for immunofluorescence microscopy using antibodies against 53BP1, FLAG, and cyclin A. 53BP1 bodies are defined as distinct foci visible in cyclin A-negative cells. Quantification of FLAG and 53BP1 colocalization from A performed in CellProfiler. Pearson's correlation coefficients (PCC) were calculated for pixels within each cyclin A-negative, 53BP1 body-positive nucleus between the 53BP1 and FLAG channels. Each point represents the PCC value of an individual nucleus. Bars represent means. (n = 120, 130 for EV, SHLD3 from three biologically independent experiments). Analysis was performed using two-tailed Mann-Whitney test. ****: P < 0.0001.Representative micrographs of immunofluorescence experiments analyzing localization of FLAG-SHLD3 alanine substitution variants stably expressed in RPE SHLD3-KO cells by lentivirus transduction. Cells were treated with 200 nM Aphi for 24 hours and processed for immunofluorescence microscopy using antibodies raised against 53BP1, FLAG, and cyclin A. 53BP1 bodies are defined as distinct foci visible in cyclin A-negative cells.Quantification of the percentage of cells containing the indicated number of 53BP1 bodies in RPE WT and SHLD3-KO cells with or without 24-hour 200 nM Aphi treatment. Bars represent means ± s.d. (n = 3 biologically independent experiments with ≥ 30 nuclei imaged each)."}
{"words": ["Figure", "5Left", ":", "Representation", "of", "the", "region", "of", "the", "RIF1", "N", "-", "terminal", "HEAT", "repeats", "that", "is", "predicted", "to", "bind", "the", "SHLD3", "eIF4E", "-", "like", "domain", ".", "Residues", "1", "-", "173", "are", "highlighted", ".", "Right", ":", "Quantification", "of", "LacR", "/", "LacO", "assay", "measuring", "eGFP", "-", "SHLD3", "recruitment", "to", "LacO", "arrays", "in", "U2OS", "2", "-", "6", "-", "3", "cells", "by", "the", "indicated", "truncated", "mCherry", "-", "LacR", "-", "RIF1N", "variants", ".", "GFP", "intensities", "are", "presented", "as", "a", "ratio", "between", "the", "average", "fluorescence", "intensity", "within", "the", "mCherry", "-", "labeled", "LacR", "-", "RIF1N", "focus", "and", "the", "average", "nuclear", "intensity", ".", "Bars", "represent", "means", "(", "n", "=", "148", ",", "123", ",", "122", "for", "EV", ",", "1", "-", "567", ",", "174", "-", "567", "from", "3", "biologically", "independent", "experiments", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "using", "Mann", "-", "Whitney", "two", "-", "tailed", "test", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Whole", "cell", "extracts", "of", "High", "Five", "insect", "cells", "individually", "expressing", "the", "FLAG", "-", "SHLD3C", "(", "residues", "126", "-", "250", ")", "and", "the", "indicated", "alanine", "substitution", "Strep", "-", "RIF1", "(", "residues", "1", "-", "980", ")", "variants", "through", "baculovirus", "infection", "were", "combined", "and", "subjected", "to", "FLAG", "immunoprecipitation", "or", "streptactin", "pulldown", "and", "immunoblotted", "for", "the", "Strep", "or", "FLAG", "epitopes", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "two", "biologically", "independent", "experiments", ".", "IB", ":", "immunoblot", ".", "IP", ":", "immunoprecipitation", ".", "Representative", "micrographs", "of", "UV", "laser", "microirradiation", "experiments", "measuring", "DNA", "damage", "recruitment", "of", "REV7", "in", "U2OS", "2", "-", "6", "-", "3", "cells", "with", "endogenously", "mutated", "RIF1", ".", "DNA", "damage", "was", "induced", "in", "U2OS", "2", "-", "6", "-", "3", "cells", "through", "irradiation", "in", "the", "form", "of", "linear", "stripes", "and", "analyzed", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "with", "RIF1", "and", "REV7", "antibodies", ".", "Quantification", "of", "UV", "laser", "microirradiation", "immunofluorescence", "experiment", "measuring", "DNA", "damage", "recruitment", "of", "REV7", "in", "U2OS", "2", "-", "6", "-", "3", "cells", "with", "endogenously", "mutated", "RIF1", ".", "REV7", "immunofluorescence", "intensities", "are", "presented", "as", "a", "ratio", "between", "the", "average", "fluorescence", "intensity", "within", "the", "RIF1", "-", "labeled", "irradiation", "stripe", "and", "the", "average", "nuclear", "intensity", ".", "Only", "nuclei", "containing", "RIF1", "stripes", "are", "quantified", ".", "Bars", "represent", "means", "(", "n", "=", "206", ",", "215", "for", "RIF1WT", ",", "RIF1D28N", "from", "2", "biologically", "independent", "experiments", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "using", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Left: Representation of the region of the RIF1 N-terminal HEAT repeats that is predicted to bind the SHLD3 eIF4E-like domain. Residues 1-173 are highlighted. Right: Quantification of LacR/LacO assay measuring eGFP-SHLD3 recruitment to LacO arrays in U2OS 2-6-3 cells by the indicated truncated mCherry-LacR-RIF1N variants. GFP intensities are presented as a ratio between the average fluorescence intensity within the mCherry-labeled LacR-RIF1N focus and the average nuclear intensity. Bars represent means (n = 148, 123, 122 for EV, 1-567, 174-567 from 3 biologically independent experiments). Analysis was performed using Mann-Whitney two-tailed test. ****: P < 0.001.Whole cell extracts of High Five insect cells individually expressing the FLAG-SHLD3C (residues 126-250) and the indicated alanine substitution Strep-RIF1 (residues 1-980) variants through baculovirus infection were combined and subjected to FLAG immunoprecipitation or streptactin pulldown and immunoblotted for the Strep or FLAG epitopes. The results are representative of two biologically independent experiments. IB: immunoblot. IP: immunoprecipitation.Representative micrographs of UV laser microirradiation experiments measuring DNA damage recruitment of REV7 in U2OS 2-6-3 cells with endogenously mutated RIF1. DNA damage was induced in U2OS 2-6-3 cells through irradiation in the form of linear stripes and analyzed by immunofluorescence microscopy with RIF1 and REV7 antibodies. Quantification of UV laser microirradiation immunofluorescence experiment measuring DNA damage recruitment of REV7 in U2OS 2-6-3 cells with endogenously mutated RIF1. REV7 immunofluorescence intensities are presented as a ratio between the average fluorescence intensity within the RIF1-labeled irradiation stripe and the average nuclear intensity. Only nuclei containing RIF1 stripes are quantified. Bars represent means (n = 206, 215 for RIF1WT, RIF1D28N from 2 biologically independent experiments). Analysis was performed using Welch's t-test. ****: P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "6Quantification", "of", "class", "switch", "recombination", "in", "stimulated", "CH12F3", "Shld3", "-", "/", "-", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "FLAG", "-", "SHLD3", "variants", "through", "lentiviral", "transduction", ".", "Bars", "represent", "means", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "biologically", "independent", "experiments", ".", "Analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "against", "Shld3", "-", "/", "-", "cells", "complemented", "with", "wild", "-", "type", "SHLD3", ".", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", ":", "P", ">", "0", ".", "05", ".", "Competitive", "growth", "assay", "of", "RPE", "BRCA1", "-", "KO", "SHLD3", "-", "KO", "cells", "complemented", "with", "3xFLAG", "-", "SHLD3", "variants", ".", "Growth", "of", "the", "indicated", "eGFP", "-", "expressing", "cells", "were", "compared", "to", "mCherry", "-", "expressing", "RPE", "BRCA1", "-", "KO", "SHLD3", "-", "KO", "cells", "transduced", "with", "empty", "vector", "after", "mixing", "1", ":", "1", "in", "24", "-", "well", "plates", ".", "Plates", "were", "imaged", "1", ",", "5", ",", "9", ",", "and", "13", "days", "after", "plating", ".", "Dotted", "black", "lines", "represent", "an", "eGFP", ":", "mCherry", "ratio", "of", "1", ".", "Points", "represent", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "biologically", "independent", "experiments", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "using", "a", "one", "sample", "t", "-", "test", "against", "a", "hypothetical", "eGFP", ":", "mCherry", "ratio", "value", "of", "1", "for", "the", "day", "13", "time", "point", ".", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ":", "P", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Quantification of class switch recombination in stimulated CH12F3 Shld3-/- cells stably expressing the indicated FLAG-SHLD3 variants through lentiviral transduction. Bars represent means ± s.d., n = 3 biologically independent experiments. Analysis was performed using one-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons test against Shld3-/- cells complemented with wild-type SHLD3. **: P < 0.01, *: P < 0.05, ns: P > 0.05.Competitive growth assay of RPE BRCA1-KO SHLD3-KO cells complemented with 3xFLAG-SHLD3 variants. Growth of the indicated eGFP-expressing cells were compared to mCherry-expressing RPE BRCA1-KO SHLD3-KO cells transduced with empty vector after mixing 1:1 in 24-well plates. Plates were imaged 1, 5, 9, and 13 days after plating. Dotted black lines represent an eGFP:mCherry ratio of 1. Points represent means ± s.d. (n = 3 biologically independent experiments). Analysis was performed using a one sample t-test against a hypothetical eGFP:mCherry ratio value of 1 for the day 13 time point. **: P < 0.01, ns: P > 0.05."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "IHC", "for", "CDC50A", "and", "RIM1", "on", "cultured", "neurons", "at", "DIV21", ".", "The", "left", "panel", "shows", "CDC50A", "is", "expressed", "in", "both", "neuronal", "soma", "and", "processes", ".", "The", "right", "panel", "exhibits", "CDC50A", "colocalize", "to", "pre", "-", "synapses", "alongside", "neuronal", "processes", ".", "MAP2", ",", "Microtubule", "-", "associated", "protein", "2", ",", "was", "used", "to", "identify", "neuronal", "cells", "and", "trace", "dendritic", "processes", ".", "RIM1", "is", "an", "active", "zone", "protein", ",", "which", "marks", "pre", "-", "synapses", ".", "Left", "scale", "bar", "=", "50", "µm", ";", "right", "scale", "bar", "=", "2", "µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "RIM1", "+", "pre", "-", "synapses", "colocalizing", "to", "CDC50A", ".", "N", "=", "3", "for", "biological", "replicates", ".", "(", "E", ")", "IHC", "for", "CDC50A", "and", "vGluT2", "in", "the", "developmental", "dLGN", "at", "P14", ",", "P21", "and", "P30", ".", "The", "left", "panels", "show", "the", "overview", "of", "immunostaining", "in", "the", "dLGN", ",", "scale", "bar", "=", "200", "µm", ".", "The", "right", "panels", "are", "the", "zoomed", "-", "in", "images", ",", "scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "Arrows", "indicate", "the", "colocalized", "CDC50A", "and", "vGluT2", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "CDC50A", "+", "/", "vGlut2", "+", "synapses", ".", "The", "result", "shows", "that", "a", "significantly", "higher", "percentage", "of", "CDC50A", "+", "/", "vGlut2", "+", "synapses", "at", "P21", "and", "P30", "than", "P14", ".", "N", "=", "6", "for", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) IHC for CDC50A and RIM1 on cultured neurons at DIV21. The left panel shows CDC50A is expressed in both neuronal soma and processes. The right panel exhibits CDC50A colocalize to pre-synapses alongside neuronal processes. MAP2, Microtubule-associated protein 2, was used to identify neuronal cells and trace dendritic processes. RIM1 is an active zone protein, which marks pre-synapses. Left scale bar = 50 µm; right scale bar = 2 µm. (C) Quantification of the percentage of RIM1+ pre-synapses colocalizing to CDC50A. N = 3 for biological replicates. (E) IHC for CDC50A and vGluT2 in the developmental dLGN at P14, P21 and P30. The left panels show the overview of immunostaining in the dLGN, scale bar = 200 µm. The right panels are the zoomed-in images, scale bar = 5 µm. Arrows indicate the colocalized CDC50A and vGluT2. (F) Quantification of the percentage of CDC50A+/vGlut2+ synapses. The result shows that a significantly higher percentage of CDC50A+/vGlut2+ synapses at P21 and P30 than P14. N = 6 for biological replicates. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "IHC", "for", "CDC50A", ".", "CDC50A", "protein", "intensities", "were", "reduced", "after", "neuronal", "inactivation", "(", "day", "7", ")", ",", "and", "was", "recovered", "after", "removing", "neuronal", "inhibitors", "(", "day", "13", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "D", ")", "Relative", "CDC50A", "intensities", "of", "neurons", ".", "N", "=", "5", "for", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SD", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "5", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Holm", "-", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "(", "E", ")", "CDC50A", "expression", "at", "RGC", "inputs", "after", "5", "-", "day", "consecutive", "TTX", "treatment", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "CDC50A", "+", "/", "vGlut2", "+", "synapses", ".", "N", "=", "5", "for", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SD", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "'", "s", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) IHC for CDC50A. CDC50A protein intensities were reduced after neuronal inactivation (day 7), and was recovered after removing neuronal inhibitors (day 13). Scale bar, 10 µm. (D) Relative CDC50A intensities of neurons. N = 5 for biological replicates, mean ± SD, * p < 0.5, **** p < 0.0001 by one-way ANOVA with Holm-Sidak's multiple comparisons test. (E) CDC50A expression at RGC inputs after 5-day consecutive TTX treatment. Scale bar, 10 µm. (F) Quantification of the percentage of CDC50A+/vGlut2+ synapses. N = 5 for biological replicates, mean ± SD, **** p < 0.0001 by Student's test. "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunostaining", "of", "CDC50A", "on", "Cdc50a", "knockdown", "neurons", "and", "controls", ".", "Accell", "Cdc50a", "siRNA", "pool", "was", "used", "to", "knock", "down", "Cdc50a", "in", "neurons", "for", "7", "days", ".", "CDC50A", "expression", "alongside", "neuronal", "processed", "was", "reduced", "after", "Cdc50a", "siRNA", "treatment", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "D", ")", "IHC", "of", "Cdc50a", "-", "RNAi", "neurons", "exhibited", "pSIVA", "colocalized", "with", "synapsin", "I", ",", "a", "general", "synapse", "marker", ".", "The", "dotted", "square", "was", "zoomed", "-", "in", "shown", "on", "the", "right", "side", ".", "Arrows", "indicated", "where", "pSIVA", "colocalized", "with", "synapsin", "I", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunostaining of CDC50A on Cdc50a knockdown neurons and controls. Accell Cdc50a siRNA pool was used to knock down Cdc50a in neurons for 7 days. CDC50A expression alongside neuronal processed was reduced after Cdc50a siRNA treatment. Scale bar, 10 µm.(D) IHC of Cdc50a-RNAi neurons exhibited pSIVA colocalized with synapsin I, a general synapse marker. The dotted square was zoomed-in shown on the right side. Arrows indicated where pSIVA colocalized with synapsin I. Scale bar, 5 µm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "D", ")", "Representative", "IHC", "images", "of", "CDC50A", "expression", "at", "synapses", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Arrows", "indicate", "VGluT2", "+", "RGC", "inputs", ".", "(", "E", ")", "Relative", "CDC50A", "expression", "at", "mCherry", "+", "synapses", "in", "Cdc50a", "RNAi", "mice", "and", "controls", ".", "N", "=", "3", "for", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SD", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "F", ")", "PSIVA", "staining", "in", "the", "dLGN", ".", "Exposed", "PS", "was", "detected", "by", "pSIVA", "on", "RGC", "inputs", "in", "Cdc50a", "-", "RNAi", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Arrows", "indicate", "pSIVA", "+", "/", "mCherry", "+", "RGC", "inputs", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "pSIVA", "+", "/", "mCherry", "+", "RGC", "inputs", "in", "total", "mCherry", "+", "RGC", "inputs", ".", "N", "=", "4", "for", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(D) Representative IHC images of CDC50A expression at synapses. Scale bar, 5 µm. Arrows indicate VGluT2+ RGC inputs. (E) Relative CDC50A expression at mCherry+ synapses in Cdc50a RNAi mice and controls. N = 3 for biological replicates, mean ± SD, * p < 0.05 by Student's t-test. (F) PSIVA staining in the dLGN. Exposed PS was detected by pSIVA on RGC inputs in Cdc50a-RNAi mice. Scale bar, 5 µm. Arrows indicate pSIVA+/mCherry+ RGC inputs. (G) Quantification of the percentage of pSIVA+/mCherry+ RGC inputs in total mCherry+ RGC inputs. N = 4 for biological replicates, mean ± SEM, **p < 0.01 by Student's t-test. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "F", ")", "Maximum", "intensity", "z", "-", "projection", "images", "of", "vGluT2", "+", "synapses", "in", "the", "core", "region", "of", "Cdc50a", "RNAi", "mice", "and", "controls", ".", "Right", "panel", "showed", "enlarged", "synapses", "in", "the", "boxed", "region", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "(", "H", ")", "Maximum", "intensity", "z", "-", "projection", "images", "of", "vGluT2", "+", "synapses", "in", "the", "shell", "region", ".", "Enlarged", "images", "(", "right", "panel", ")", "shows", "large", "\"", "complex", "encapsulated", "\"", "boutons", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "vGluT2", "+", "synapse", "density", ".", "N", "=", "3", "for", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SD", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(F) Maximum intensity z-projection images of vGluT2+ synapses in the core region of Cdc50a RNAi mice and controls. Right panel showed enlarged synapses in the boxed region. Scale bar, 20 µm.(H) Maximum intensity z-projection images of vGluT2+ synapses in the shell region. Enlarged images (right panel) shows large \"complex encapsulated\" boutons. Scale bar, 20 µm. (I) Quantification of vGluT2+ synapse density. N = 3 for biological replicates, mean ± SD, Student's t-test. "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "D", ")", "Images", "of", "CTB488", "and", "CTB647", "labeling", "of", "RGC", "inputs", "in", "the", "dLGN", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "CTB488", "+", "inputs", "(", "non", "-", "infected", "areas", ")", "versus", "CTB647", "+", "inputs", "(", "infected", "areas", ")", "in", "Cdc50a", "RNAi", "mice", "and", "controls", ".", "N", "=", "3", "for", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(D) Images of CTB488 and CTB647 labeling of RGC inputs in the dLGN. Scale bar, 20 µm. (E) Quantification of CTB488+ inputs (non-infected areas) versus CTB647+ inputs (infected areas) in Cdc50a RNAi mice and controls. N = 3 for biological replicates, mean ± SEM, **** p < 0.0001, two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "The", "confocal", "images", ",", "3D", "-", "rendered", "images", "and", "orthogonal", "views", "of", "microglia", "engulfing", "vGluT2", "+", "synapses", "in", "controls", "and", "Cdc50a", "-", "RNAi", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) The confocal images, 3D-rendered images and orthogonal views of microglia engulfing vGluT2+ synapses in controls and Cdc50a-RNAi mice. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "IHC", "images", "for", "vGluT2", "staining", "in", "the", "dLGN", "of", "microglial", "Gpr56", "conditional", "knockout", "mice", "(", "Gpr56fl", "/", "fl", ";", "Cx3cr1cre", "/", "+", ")", "and", "controls", "(", "Gpr56", "+", "/", "+", ";", "Cx3cr1cre", "/", "+", ")", ".", "Both", "mice", "were", "intravitreally", "injected", "with", "AAV2", "carrying", "Cdc50a", "shRNA", ".", "The", "yellow", "squares", "indicated", "the", "AAV2", "non", "-", "infected", "areas", "and", "the", "dotted", "outlines", "indicated", "the", "AAV2", "infected", "areas", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "µm", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "images", "of", "vGluT2", "+", "synapses", "in", "the", "AAV2", "non", "-", "infected", "areas", "and", "infected", "areas", "of", "the", "dLGN", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "vGluT2", "+", "synapses", "in", "the", "non", "-", "infected", "areas", "and", "infected", "areas", "of", "microglial", "GPR56", "conditional", "knockout", "mice", "and", "controls", ".", "N", "=", "4", "for", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SD", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) IHC images for vGluT2 staining in the dLGN of microglial Gpr56 conditional knockout mice (Gpr56fl/fl; Cx3cr1cre/+) and controls (Gpr56+/+; Cx3cr1cre/+). Both mice were intravitreally injected with AAV2 carrying Cdc50a shRNA. The yellow squares indicated the AAV2 non-infected areas and the dotted outlines indicated the AAV2 infected areas. Scale bar, 200 µm.(B) Confocal images of vGluT2+ synapses in the AAV2 non-infected areas and infected areas of the dLGN. Scale bar, 20 µm. (C) Quantification of vGluT2+ synapses in the non-infected areas and infected areas of microglial GPR56 conditional knockout mice and controls. N = 4 for biological replicates, mean ± SD, * p<0.05, **** p < 0.0001 by two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. "}
{"words": ["Figure", "2RNAPII", "-", "RBP", "-", "RNA", "complex", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "RNAPII", "antibody", "or", "control", "antibody", "(", "cont", ")", ",", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", ".", "The", "input", "lanes", "contained", "0", ".", "4", "%", "of", "lysates", "used", "in", "the", "immunoprecipitation", "experiments", ".", "Generation", "of", "tRIP", "-", "seq", "libraries", "of", "RNAPII", "-", "RBP", "-", "RNA", "complexes", ".", "After", "UV", "crosslinking", ",", "protein", "-", "RNA", "complexes", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "RNAPII", "(", "1st", "IP", ")", ".", "RNA", "of", "the", "isolated", "RNAPII", "-", "RBP", "-", "RNA", "complexes", "was", "partially", "digested", "with", "RNase", "on", "beads", ",", "and", "RBP", "-", "RNA", "complexes", "dissociated", "from", "the", "bead", "were", "further", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "FUS", "or", "anti", "-", "U1C", "antibody", "bound", "to", "the", "other", "beads", "(", "2nd", "IP", ")", ".", "The", "immunoprecipitated", "FUS", "-", "RNA", "or", "U1C", "-", "RNA", "complex", "was", "treated", "with", "TEX", ",", "and", "then", "subjected", "to", "tRIP", "-", "seq", "library", "generation", ".", "The", "bottom", "panels", "show", "PCR", "-", "amplification", "of", "tRIP", "-", "seq", "libraries", "generated", "from", "RNAPII", "-", "FUS", "-", "RNA", "complex", "(", "left", "panel", ")", "and", "RNAPII", "-", "U1C", "-", "RNA", "complex", "(", "right", "panel", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2RNAPII-RBP-RNA complex was immunoprecipitated by anti-RNAPII antibody or control antibody (cont), and subjected to immunoblotting. The input lanes contained 0.4% of lysates used in the immunoprecipitation experiments.Generation of tRIP-seq libraries of RNAPII-RBP-RNA complexes. After UV crosslinking, protein-RNA complexes were immunoprecipitated with anti-RNAPII (1st IP). RNA of the isolated RNAPII-RBP-RNA complexes was partially digested with RNase on beads, and RBP-RNA complexes dissociated from the bead were further immunoprecipitated with anti-FUS or anti-U1C antibody bound to the other beads (2nd IP). The immunoprecipitated FUS-RNA or U1C-RNA complex was treated with TEX, and then subjected to tRIP-seq library generation. The bottom panels show PCR-amplification of tRIP-seq libraries generated from RNAPII-FUS-RNA complex (left panel) and RNAPII-U1C-RNA complex (right panel)."}
{"words": ["Figure", "4PolyA", "-", "seq", "was", "performed", "using", "N2A", "cells", "to", "examine", "the", "effect", "of", "downregulation", "of", "FUS", "and", "U1", "snRNP", "on", "polyA", "site", "usage", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "siRNA", "against", "Fus", "(", "siFus", ")", "and", "/", "or", "U1", "antisense", "morpholino", "(", "U1AS", ")", ".", "Control", "cells", "(", "Cont", ")", "were", "treated", "with", "both", "control", "siRNA", "and", "control", "antisense", "morpholino", ".", "A", ".", "Correlation", "of", "changes", "in", "polyA", "site", "usage", "between", "U1", "-", "inhibition", "and", "Fus", "-", "silencing", ".", "Fold", "change", "in", "the", "RPM", "of", "a", "polyA", "site", "between", "siFus", "and", "Cont", "(", "siFus", "/", "Cont", ")", "was", "plotted", "against", "that", "between", "U1AS", "and", "Cont", "(", "U1AS", "/", "Cont", ")", ".", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "(", "r", ")", "and", "the", "slope", "of", "the", "regression", "line", "are", "shown", ".", "B", ".", "Correlation", "of", "changes", "in", "polyA", "site", "usage", "between", "U1", "-", "inhibition", "alone", "and", "the", "combination", "of", "Fus", "-", "silencing", "and", "U1", "-", "inhibition", ".", "Fold", "change", "in", "the", "RPM", "of", "a", "polyA", "site", "between", "siFus", "+", "U1AS", "and", "Cont", "(", "siFus", "+", "U1AS", "/", "Cont", ")", "was", "plotted", "against", "that", "between", "U1AS", "and", "Cont", "(", "U1AS", "/", "Cont", ")", ".", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "(", "r", ")", "and", "the", "slope", "of", "the", "regression", "line", "are", "shown", ".", "A", "slope", "of", "1", ".", "0", "indicates", "that", "Fus", "-", "silencing", "has", "no", "additive", "effect", "on", "U1", "-", "inhibition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4PolyA-seq was performed using N2A cells to examine the effect of downregulation of FUS and U1 snRNP on polyA site usage. Cells were treated with siRNA against Fus (siFus) and/or U1 antisense morpholino (U1AS). Control cells (Cont) were treated with both control siRNA and control antisense morpholino. A. Correlation of changes in polyA site usage between U1-inhibition and Fus-silencing. Fold change in the RPM of a polyA site between siFus and Cont (siFus/Cont) was plotted against that between U1AS and Cont (U1AS/Cont). Pearson's correlation coefficient (r) and the slope of the regression line are shown. B. Correlation of changes in polyA site usage between U1-inhibition alone and the combination of Fus-silencing and U1-inhibition. Fold change in the RPM of a polyA site between siFus+U1AS and Cont (siFus+U1AS/Cont) was plotted against that between U1AS and Cont (U1AS/Cont). Pearson's correlation coefficient (r) and the slope of the regression line are shown. A slope of 1.0 indicates that Fus-silencing has no additive effect on U1-inhibition."}
{"words": ["Figure", "6Localization", "of", "FUS", "in", "R495X", "_", "N2A", "cells", "(", "R495X", ")", ",", "and", "wild", "-", "type", "N2A", "cells", "(", "WT", ")", ".", "Cells", "were", "fractionated", "to", "separate", "nucleus", "and", "cytoplasm", ".", "Equal", "proportion", "of", "cell", "extracts", "from", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "fractions", "were", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Interactions", "between", "FUS", "and", "U1", "snRNP", "in", "the", "R495X", "_", "N2A", "cells", "(", "R495X", ")", "and", "wild", "-", "type", "N2A", "cells", "(", "WT", ")", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "U1", "-", "70K", "antibody", "or", "a", "control", "antibody", "(", "cont", ")", ",", "and", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Effects", "of", "the", "R495X", "mutation", "on", "four", "categories", "of", "polyA", "sites", ".", "Four", "categories", "of", "polyA", "sites", "are", "comprised", "of", "(", "1", ")", "FUS", "-", "repressed", "(", "rep", ")", "/", "U1", "-", "repressed", "sites", ",", "(", "2", ")", "FUS", "-", "activated", "(", "act", ")", "/", "U1", "-", "repressed", "sites", ",", "(", "3", ")", "FUS", "-", "repressed", "/", "U1", "-", "activated", "sites", ",", "and", "(", "4", ")", "FUS", "-", "activated", "/", "U1", "-", "activated", "sites", ",", "according", "to", "Fig", "4A", ".", "Fold", "change", "of", "each", "polyA", "site", "usage", "by", "the", "R495X", "mutation", "(", "R495X", "/", "WT", ")", "is", "shown", "in", "violin", "plots", ".", "Bars", "indicate", "the", "median", "and", "95", "%", "confidential", "intervals", "for", "each", "category", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "based", "on", "the", "Steel", "-", "Dwass", "test", "for", "comparing", "all", "6", "pairs", "of", "categories", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Localization of FUS in R495X_N2A cells (R495X), and wild-type N2A cells (WT). Cells were fractionated to separate nucleus and cytoplasm. Equal proportion of cell extracts from nuclear and cytoplasmic fractions were immunoblotted with indicated antibodies.Interactions between FUS and U1 snRNP in the R495X_N2A cells (R495X) and wild-type N2A cells (WT). Total cell lysates were immunoprecipitated with anti-U1-70K antibody or a control antibody (cont), and immunoblotted with indicated antibodies.Effects of the R495X mutation on four categories of polyA sites. Four categories of polyA sites are comprised of (1) FUS-repressed (rep) /U1-repressed sites, (2) FUS-activated (act) /U1-repressed sites, (3) FUS-repressed/U1-activated sites, and (4) FUS-activated/U1-activated sites, according to Fig 4A. Fold change of each polyA site usage by the R495X mutation (R495X/WT) is shown in violin plots. Bars indicate the median and 95% confidential intervals for each category. *** p < 0.001, **** p < 0.0001, based on the Steel-Dwass test for comparing all 6 pairs of categories."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "photomicrographs", "showing", "coronal", "slices", "from", "8W", "hGFAP", "‐", "tTA", ";", "H2B", "‐", "GFP", "mice", "with", "and", "without", "doxycycline", "treatment", ",", "upon", "immunofluorescent", "staining", "with", "the", "stem", "cell", "marker", "Nestin", "(", "red", ")", ".", "DAPI", "was", "used", "for", "nuclear", "counterstain", ".", "Cross", "indicates", "slice", "directions", ":", "M", "=", "medial", ",", "D", "=", "dorsal", ",", "V", "=", "ventral", ",", "L", "=", "lateral", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "Nestin", "expression", "in", "apical", "and", "basal", "cells", "in", "doxycycline", "-", "treated", "and", "untreated", "animals", ".", "N", "=", "3", "(", "-", "Doxy", ")", ",", "N", "=", "4", "(", "+", "Doxy", ")", ".", "Data", "information", ":", "N", "number", "refers", "to", "biological", "replicates", ";", "for", "each", "biological", "replicate", ",", "at", "least", "three", "technical", "replicates", "were", "performed", ".", "Data", "is", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "and", "#", "indicate", "significance", ":", "between", "apical", "and", "basal", "(", "*", ")", "and", "between", "doxycycline", "treatments", "(", "#", ")", ";", "*", "/", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "B", ")", "(", "C", ")", "Same", "as", "(", "A", ")", ",", "with", "addition", "of", "the", "primary", "cilia", "marker", "AC3", "(", "yellow", ")", ".", "Arrows", "indicate", "Nestin", "-", "positive", "(", "white", ")", "and", "GFP", "-", "positive", "(", "green", ")", "cells", "with", "primary", "cilium", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "ciliated", "GFP", "+", "NSCs", "in", "apical", "and", "basal", "cell", "layer", "as", "percentage", "of", "total", "apical", "/", "basal", "GFP", "+", "cells", ".", "N", "=", "7", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "primary", "cilia", "on", "cells", "in", "the", "apical", "or", "basal", "cell", "layer", "according", "to", "stem", "cell", "marker", ";", "N", "=", "7", ".", "Data", "information", ":", "N", "number", "refers", "to", "biological", "replicates", ";", "for", "each", "biological", "replicate", ",", "at", "least", "three", "technical", "replicates", "were", "performed", ".", "Data", "is", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "and", "#", "indicate", "significance", ":", "between", "apical", "and", "basal", "(", "*", ")", ";", "*", "/", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative confocal photomicrographs showing coronal slices from 8W hGFAP‐tTA;H2B‐GFP mice with and without doxycycline treatment, upon immunofluorescent staining with the stem cell marker Nestin (red). DAPI was used for nuclear counterstain. Cross indicates slice directions: M = medial, D = dorsal, V = ventral, L = lateral. Scale bar = 20 µm. (B) Quantification of Nestin expression in apical and basal cells in doxycycline-treated and untreated animals. N = 3 (- Doxy), N = 4 (+ Doxy). Data information: N number refers to biological replicates; for each biological replicate, at least three technical replicates were performed. Data is represented as mean ± SEM. * and # indicate significance: between apical and basal (*) and between doxycycline treatments (#); */#p<0.05, **p<0.01, by one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test (B)(C) Same as (A), with addition of the primary cilia marker AC3 (yellow). Arrows indicate Nestin-positive (white) and GFP-positive (green) cells with primary cilium. Scale bar = 10 µm. (D) Quantification of ciliated GFP+ NSCs in apical and basal cell layer as percentage of total apical/basal GFP+ cells. N = 7. (E) Quantification of primary cilia on cells in the apical or basal cell layer according to stem cell marker; N = 7. Data information: N number refers to biological replicates; for each biological replicate, at least three technical replicates were performed. Data is represented as mean ± SEM. * and # indicate significance: between apical and basal (*) ; */#p<0.05, **p<0.01, by two-tailed unpaired student's t-test (D)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Repesentative", "confocal", "photomicrographs", "of", "coronal", "sections", "of", "the", "SVZ", "of", "8W", "hGFAP", "-", "H2BGFP", "mice", ",", "which", "had", "been", "administered", "doxycycline", "(", "Doxy", ")", "as", "indicated", ".", "Nuclear", "GFP", "expression", "and", "Ki67", "immunoreactivity", "are", "shown", "in", "green", "and", "red", ",", "respectively", ".", "DAPI", "counterstaining", "of", "the", "nuclei", "is", "blue", ".", "Scale", "bar", "indicates", "20", "µm", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Quantitative", "analyses", "of", "the", "number", "of", "apical", "and", "basal", "cells", "expressing", "GFP", "(", "G", "+", ")", "or", "not", "(", "G", "-", ")", ";", "N", "=", "8", "(", "B", ")", ",", "and", "Ki67", "immunoreactivity", "in", "these", "populations", ";", "N", "≥", "4", "(", "C", ")", ".", "Data", "information", ":", "N", "number", "refers", "to", "biological", "replicates", ";", "for", "each", "biological", "replicate", "at", "least", "three", "technical", "replicates", "were", "performed", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "indicates", "significance", "between", "doxycycline", "treated", "and", "nontreated", "specimens", "with", "apical", "or", "basal", "cell", "populations", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "determined", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Repesentative confocal photomicrographs of coronal sections of the SVZ of 8W hGFAP-H2BGFP mice, which had been administered doxycycline (Doxy) as indicated. Nuclear GFP expression and Ki67 immunoreactivity are shown in green and red, respectively. DAPI counterstaining of the nuclei is blue. Scale bar indicates 20 µm.(B, C) Quantitative analyses of the number of apical and basal cells expressing GFP (G+) or not (G-); N = 8 (B), and Ki67 immunoreactivity in these populations; N ≥ 4 (C). Data information: N number refers to biological replicates; for each biological replicate at least three technical replicates were performed. Bars represent mean ± SEM. * indicates significance between doxycycline treated and nontreated specimens with apical or basal cell populations. * p<0.05, ***p<0.001, determined by two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Representative", "micrographs", "of", "the", "OB", "of", "AAV", "-", "GFP", "-", "injected", "animals", ",", "at", "14", "days", "(", "14D", ")", "and", "6", "weeks", "(", "6W", ")", "after", "virus", "injection", ".", "Scale", "bar", "indicates", "20", "µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "GFP", "+", "and", "/", "or", "DCX", "+", "cells", "in", "the", "OB", ",", "as", "percentage", "of", "total", "DAPI", "cells", "N", "≥", "5", ".", "Data", "information", ":", "N", "number", "refers", "to", "biological", "replicates", ";", "for", "each", "biological", "replicate", "at", "least", "three", "technical", "replicates", "were", "performed", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "indicates", "significance", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "determined", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "coronal", "slices", "of", "the", "core", "of", "the", "olfactory", "bulb", "(", "OB", ")", "obtained", "from", "RiboTag", "mice", "injected", "with", "AVV", "-", "hGFAP", "-", "mycCRE", "particles", ".", "In", "(", "E", ")", "mice", "were", "analysed", "16", "weeks", "after", "injection", "in", "the", "lateral", "ventricle", "or", "in", "the", "lateral", "corner", "as", "indicated", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "µm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "RiboTag", "-", "HA", "(", "HA", ")", "+", "and", "/", "or", "DCX", "+", "cells", "in", "the", "OB", "in", "N", "≥", "2", ".", "Data", "information", ":", "N", "number", "refers", "to", "biological", "replicates", ";", "for", "each", "biological", "replicate", "at", "least", "three", "technical", "replicates", "were", "performed", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "indicates", "significance", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "determined", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Representative micrographs of the OB of AAV-GFP-injected animals, at 14 days (14D) and 6 weeks (6W) after virus injection. Scale bar indicates 20 µm. (C) Quantification of GFP+ and/or DCX+ cells in the OB, as percentage of total DAPI cells N ≥ 5. Data information: N number refers to biological replicates; for each biological replicate at least three technical replicates were performed. Bars represent mean ± SEM.* indicates significance: *p<0.05, determined by two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test.Representative confocal images of coronal slices of the core of the olfactory bulb (OB) obtained from RiboTag mice injected with AVV-hGFAP-mycCRE particles. In (E) mice were analysed 16 weeks after injection in the lateral ventricle or in the lateral corner as indicated. Scale bars = 20 µm. (F) Quantification of RiboTag-HA (HA)+ and/or DCX+ cells in the OB in N ≥ 2. Data information: N number refers to biological replicates; for each biological replicate at least three technical replicates were performed. Bars represent mean ± SEM.* indicates significance: *p<0.05, determined by two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ",", "B", ")", "Representative", "micrographs", "of", "the", "V", "-", "SVZ", "of", "mice", "injected", "with", "an", "AAV", "overexpressing", "GFP", "and", "a", "shRNA", "against", "Hes1", "(", "AAV", "Hes1", "-", "sh", ")", "or", "a", "scrambled", "sequence", "(", "AAV", "sc", "-", "sh", ")", ".", "Coronal", "sections", "were", "stained", "with", "either", "notch", "intracellular", "domain", "(", "NICD", ",", "A", ")", "or", "Ki67", "to", "visualize", "cycling", "cells", "(", "B", ")", ".", "DAPI", "was", "used", "for", "nuclear", "counterstain", ",", "scale", "bars", "indicate", "20", "µm", ".", "Arrows", "indicate", "apical", "GFP", "+", "(", "white", ")", "and", "basal", "GFP", "-", "(", "yellow", ")", "cells", "displaying", "NICD", "staining", ".", "Quantification", "of", "fold", "change", "in", "NICD", "-", "levels", ";", "N", "=", "3", "(", "C", ")", ",", "Ki67", "+", "cells", ";", "N", "=", "5", "(", "D", ")", "Data", "information", ":", "N", "number", "refers", "to", "biological", "replicates", ";", "for", "each", "biological", "replicate", "at", "least", "three", "technical", "replicates", "were", "performed", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "determined", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A, B) Representative micrographs of the V-SVZ of mice injected with an AAV overexpressing GFP and a shRNA against Hes1 (AAV Hes1-sh) or a scrambled sequence (AAV sc-sh). Coronal sections were stained with either notch intracellular domain (NICD, A) or Ki67 to visualize cycling cells (B). DAPI was used for nuclear counterstain, scale bars indicate 20 µm. Arrows indicate apical GFP+ (white) and basal GFP- (yellow) cells displaying NICD staining. Quantification of fold change in NICD-levels; N = 3 (C), Ki67+ cells; N = 5 (D) Data information: N number refers to biological replicates; for each biological replicate at least three technical replicates were performed. Bars represent mean ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, determined by two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test"}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "Misreading", "(", "A", ")", "were", "measured", "by", "dual", "luciferase", "gain", "-", "of", "-", "function", "assays", "using", "wild", "-", "type", "mitohybrid", "ribosomes", "(", "n", "=", "8", "misreading", ",", "mutant", "A1555G", "mitohybrid", "ribosomes", "(", "n", "=", "8", "misreading", ",", "E", ".", "coli", "wild", "-", "type", "ribosomes", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "E", ".", "coli", "mutant", "A127Y", "ribosomes", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "M", ".", "smegmatis", "merodiploid", "wild", "-", "type", "ribosomes", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "and", "M", ".", "smegmatis", "merodiploid", "mutant", "S152Y", "ribosomes", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "Mistranslation", "was", "determined", "by", "assessing", "the", "misreading", "at", "His245", "(", "CAC", "codon", ")", "of", "the", "F", "-", "luc", "gene", "that", "was", "replaced", "by", "the", "near", "-", "cognate", "codon", "CGC", "or", "the", "non", "-", "cognate", "codon", "AGA", ",", "both", "encoding", "for", "Arg", ".", "Results", "are", "derived", "by", "calculating", "mutant", "hFluc", "/", "hRluc", "activity", "related", "to", "wild", "-", "type", "hFluc", "/", "hRluc", "activity", ".", "read", "-", "through", "(", "B", ")", "were", "measured", "by", "dual", "luciferase", "gain", "-", "of", "-", "function", "assays", "using", "wild", "-", "type", "mitohybrid", "ribosomes", "n", "=", "4", "read", "-", "through", ")", ",", "mutant", "A1555G", "mitohybrid", "ribosomes", "n", "=", "4", "read", "-", "through", ")", ",", "E", ".", "coli", "wild", "-", "type", "ribosomes", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "E", ".", "coli", "mutant", "A127Y", "ribosomes", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "M", ".", "smegmatis", "merodiploid", "wild", "-", "type", "ribosomes", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "and", "M", ".", "smegmatis", "merodiploid", "mutant", "S152Y", "ribosomes", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "To", "determine", "read", "-", "through", "the", "Asp357", "(", "GAC", "codon", ")", "of", "the", "F", "-", "luc", "gene", "was", "replaced", "by", "the", "nonsense", "TGA", "stop", "codon", ".", "Results", "are", "derived", "by", "calculating", "mutant", "hFluc", "/", "hRluc", "activity", "related", "to", "wild", "-", "type", "hFluc", "/", "hRluc", "activity", ".", "C", "Ratio", "of", "35S", "-", "Cysteine", "and", "35S", "-", "Methionine", "incorporation", "by", "in", "-", "vitro", "translation", "using", "wild", "-", "type", "mitohybrid", "ribosomes", ",", "mutant", "A1555G", "mitohybrid", "ribosomes", ",", "and", "MT", "-", "CO1", "mRNA", ".", "Following", "immunoprecipitation", ",", "the", "MT", "-", "CO1", "band", "was", "quantified", "by", "autoradiography", ",", "wild", "-", "type", "mitohybrid", "ribosomes", "were", "set", "as", "1", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "Ratio", "of", "35S", "-", "Cysteine", "and", "35S", "-", "Methionine", "incorporation", "by", "in", "-", "vitro", "translation", "in", "the", "presence", "of", "tobramycin", "using", "wild", "-", "type", "mitohybrid", "ribosomes", ",", "mutant", "A1555G", "mitohybrid", "ribosomes", ",", "and", "MT", "-", "CO1", "mRNA", ";", "the", "MT", "-", "CO1", "band", "was", "quantified", "by", "autoradiography", ".", "E", "Misreading", "of", "wild", "-", "type", "mitohybrid", "ribosomes", "and", "mutant", "A1555G", "mitohybrid", "ribosomes", "in", "the", "presence", "of", "tobramycin", ".", "Misreading", "was", "assessed", "by", "dual", "luciferase", "assay", ",", "and", "results", "derived", "by", "calculating", "mutant", "hFluc", "/", "hRluc", "activity", "related", "to", "wild", "-", "type", "hFluc", "/", "hRluc", "activity", ".", "F", "In", "-", "vitro", "translation", "of", "MT", "-", "CO1", "-", "TGA", "mRNA", "and", "MT", "-", "CO1", "-", "AGA", "mRNA", "using", "mutant", "A1555G", "mitohybrid", "ribosomes", "in", "the", "presence", "of", "tobramycin", "(", "0", "-", "20", "µM", ")", ".", "Autoradiography", "of", "immunoprecipitated", "MT", "-", "CO1", "proteins", ";", "top", ":", "35S", "-", "Met", "labelling", ",", "bottom", ":", "14C", "-", "Lys", "labelling", ".", "In", "-", "organello", "translated", "35S", "-", "Met", "labelled", "MT", "-", "CO1", "was", "used", "as", "a", "marker", ".", "*", "MT", "-", "CO1", ",", "*", "*", "MT", "-", "CO1", "extended", "by", "read", "-", "through", ",", "MT", "-", "CO1", "AGA", "-", "polyA", "and", "MT", "-", "CO1", "TGA", "-", "polyA", "constructs", "used", "for", "in", "-", "vitro", "translation", "are", "schematized", ".", "G", "Ratio", "of", "14C", "-", "Lys", "and", "35S", "-", "Met", "labelled", "immunoprecipitated", "MT", "-", "CO1", "proteins", ".", "In", "-", "vitro", "translation", "using", "MT", "-", "CO1", "-", "TGA", "mRNA", ",", "MT", "-", "CO1", "-", "AGA", "mRNA", ",", "and", "mutant", "A1555G", "mitohybrid", "ribosomes", "in", "the", "presence", "of", "tobramycin", "(", "0", "-", "20", "µM", ")", ".", "The", "corresponding", "MT", "-", "CO1", "band", "was", "quantified", "by", "autoradiography", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, Misreading (A) were measured by dual luciferase gain-of-function assays using wild-type mitohybrid ribosomes (n=8 misreading, mutant A1555G mitohybrid ribosomes (n=8 misreading, E. coli wild-type ribosomes (n=9), E.coli mutant A127Y ribosomes (n=9), M. smegmatis merodiploid wild-type ribosomes (n=9), and M. smegmatis merodiploid mutant S152Y ribosomes (n=9). Mistranslation was determined by assessing the misreading at His245 (CAC codon) of the F-luc gene that was replaced by the near-cognate codon CGC or the non-cognate codon AGA, both encoding for Arg. Results are derived by calculating mutant hFluc/hRluc activity related to wild-type hFluc/hRluc activity.read-through (B) were measured by dual luciferase gain-of-function assays using wild-type mitohybrid ribosomes n=4 read-through), mutant A1555G mitohybrid ribosomes n=4 read-through), E. coli wild-type ribosomes (n=9), E.coli mutant A127Y ribosomes (n=9), M. smegmatis merodiploid wild-type ribosomes (n=9), and M. smegmatis merodiploid mutant S152Y ribosomes (n=9). To determine read-through the Asp357 (GAC codon) of the F-luc gene was replaced by the nonsense TGA stop codon. Results are derived by calculating mutant hFluc/hRluc activity related to wild-type hFluc/hRluc activity.C Ratio of 35S-Cysteine and 35S-Methionine incorporation by in-vitro translation using wild-type mitohybrid ribosomes, mutant A1555G mitohybrid ribosomes, and MT-CO1 mRNA. Following immunoprecipitation, the MT-CO1 band was quantified by autoradiography, wild-type mitohybrid ribosomes were set as 1 (n=3), error bars indicate SEM; ****p<0.001 (Student's t-test).D Ratio of 35S-Cysteine and 35S-Methionine incorporation by in-vitro translation in the presence of tobramycin using wild-type mitohybrid ribosomes, mutant A1555G mitohybrid ribosomes, and MT-CO1 mRNA; the MT-CO1 band was quantified by autoradiography.E Misreading of wild-type mitohybrid ribosomes and mutant A1555G mitohybrid ribosomes in the presence of tobramycin. Misreading was assessed by dual luciferase assay, and results derived by calculating mutant hFluc/hRluc activity related to wild-type hFluc/hRluc activity.F In-vitro translation of MT-CO1-TGA mRNA and MT-CO1-AGA mRNA using mutant A1555G mitohybrid ribosomes in the presence of tobramycin (0 - 20 µM). Autoradiography of immunoprecipitated MT-CO1 proteins; top: 35S-Met labelling, bottom: 14C-Lys labelling. In-organello translated 35S-Met labelled MT-CO1 was used as a marker. * MT-CO1, ** MT-CO1 extended by read-through, MT-CO1 AGA-polyA and MT-CO1 TGA-polyA constructs used for in-vitro translation are schematized.G Ratio of 14C-Lys and 35S-Met labelled immunoprecipitated MT-CO1 proteins. In-vitro translation using MT-CO1-TGA mRNA, MT-CO1-AGA mRNA, and mutant A1555G mitohybrid ribosomes in the presence of tobramycin (0 - 20 µM). The corresponding MT-CO1 band was quantified by autoradiography."}
{"words": ["Figure", "2A", "Autoradiography", "of", "in", "-", "organello", "mitochondrial", "translation", "products", "derived", "from", "HEK293", "wild", "-", "type", "cells", "in", "the", "presence", "of", "tobramycin", ",", "incorporation", "of", "35S", "-", "Met", "and", "35S", "-", "Cys", "in", "MT", "-", "CO1", "protein", ".", "Following", "in", "-", "organello", "translation", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "and", "analyzed", "by", "autoradiography", ".", "Lane", "1", ",", "3", ":", "controls", ";", "lanes", "2", ",", "4", ":", "in", "-", "organello", "translation", "in", "the", "presence", "of", "1000", "µM", "tobramycin", ".", "MT", "-", "CO1", "bands", "were", "quantified", "and", "ratio", "of", "35S", "-", "Cys", "/", "35S", "-", "Met", "calculated", ",", "the", "35S", "-", "Cys", "/", "35S", "-", "Met", "ratio", "in", "the", "absence", "of", "tobramycin", "was", "set", "as", "1", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "B", "Ratios", "of", "35S", "-", "Cys", "/", "35S", "-", "Met", "labelled", "MT", "-", "CO1", "and", "MT", "-", "CO2", "proteins", "synthesized", "in", "in", "-", "organello", "translation", "and", "effect", "of", "tobramycin", ".", "Following", "in", "-", "organello", "translation", "in", "the", "presence", "of", "tobramycin", "(", "1000", "µM", ",", "2000", "µM", ")", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "and", "analyzed", "by", "autoradiography", ".", "MT", "-", "CO1", "and", "MT", "-", "CO2", "bands", "were", "quantified", "and", "ratio", "of", "35S", "-", "Cys", "/", "35S", "-", "Met", "incorporation", "calculated", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", ",", "not", "significant", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Ratio", "of", "35S", "-", "Cys", "and", "35S", "-", "Met", "labelled", "MT", "-", "CO1", "protein", "synthesized", "in", "in", "-", "organello", "translation", "using", "mitochondria", "from", "HEK293", "MRPS5", "wild", "-", "type", "cells", "and", "HEK", "MRPS5", "mutant", "V336Y", "cells", ".", "Following", "in", "-", "organello", "translation", ",", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "and", "analyzed", "by", "autoradiography", ".", "MT", "-", "CO1", "bands", "quantified", "and", "ratios", "calculated", ".", "The", "ratio", "of", "the", "MRPS5", "wild", "-", "type", "was", "set", "as", "1", "(", "n", "=", "8", "clones", ")", ",", "error", "bars", "indicate", "SD", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "Autoradiography", "of", "in", "-", "organello", "mitochondrial", "translation", "products", "derived", "from", "HEK293", "MRPS5", "wild", "-", "type", "cells", "in", "the", "presence", "of", "tobramycin", "(", "0", "-", "750", "µM", ")", ".", "Proteins", "were", "35S", "-", "Met", "labeled", "and", "loaded", "either", "directly", "on", "SDS", "-", "PAGE", "(", "total", ",", "top", ")", "or", "following", "poly", "-", "lysine", "immunoprecipitation", "(", "bottom", ")", ".", "*", "MT", "-", "CO1", "and", "*", "*", "MT", "-", "CO1", "with", "poly", "-", "lysine", "extension", ".", "E", "Quantification", "of", "MT", "-", "CO1", "proteins", "in", "HEK293", "MRPS5", "wild", "-", "type", "cells", "and", "HEK293", "MRPS5", "mutant", "V336Y", "cells", ".", "In", "-", "organello", "mitochondrial", "translation", "in", "the", "presence", "of", "35S", "-", "Met", "and", "750", "µM", "tobramycin", ".", "Proteins", "were", "loaded", "either", "directly", "on", "SDS", "-", "PAGE", "(", "total", ")", "or", "following", "poly", "-", "lysine", "immunoprecipitation", "and", "analyzed", "by", "autoradiography", ".", "For", "total", "protein", "samples", "the", "MT", "-", "CO1", "band", "was", "quantified", ",", "for", "poly", "-", "lysine", "immunoprecipitated", "samples", "the", "extended", "MT", "-", "CO1", "band", "was", "quantified", "and", "the", "ratio", "of", "extended", "MT", "-", "CO1", "/", "total", "MT", "-", "CO1", "calculated", ".", "The", "ratio", "of", "MRPS5", "wild", "-", "type", "was", "set", "as", "1", "(", "MRPS5", "wild", "-", "type", ",", "n", "=", "5", "clones", ",", "MRPS5", "V336Y", ",", "n", "=", "7", "clones", ")", ",", "error", "bars", "indicate", "SD", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Autoradiography of in-organello mitochondrial translation products derived from HEK293 wild-type cells in the presence of tobramycin, incorporation of 35S-Met and 35S-Cys in MT-CO1 protein. Following in-organello translation proteins were immunoprecipitated and analyzed by autoradiography. Lane 1, 3: controls; lanes 2, 4: in-organello translation in the presence of 1000 µM tobramycin. MT-CO1 bands were quantified and ratio of 35S-Cys / 35S-Met calculated, the 35S-Cys / 35S-Met ratio in the absence of tobramycin was set as 1 (n=3), error bars indicate SEM.B Ratios of 35S-Cys / 35S-Met labelled MT-CO1 and MT-CO2 proteins synthesized in in-organello translation and effect of tobramycin. Following in-organello translation in the presence of tobramycin (1000 µM, 2000 µM) proteins were immunoprecipitated and analyzed by autoradiography. MT-CO1 and MT-CO2 bands were quantified and ratio of 35S-Cys / 35S-Met incorporation calculated (n=3), error bars indicate SEM; *p<0.05, ns, not significant (Student's t-test).Ratio of 35S-Cys and 35S-Met labelled MT-CO1 protein synthesized in in-organello translation using mitochondria from HEK293 MRPS5 wild-type cells and HEK MRPS5 mutant V336Y cells. Following in-organello translation, proteins were immunoprecipitated and analyzed by autoradiography. MT-CO1 bands quantified and ratios calculated. The ratio of the MRPS5 wild-type was set as 1 (n=8 clones), error bars indicate SD; ***p<0.0001 (Student's t-test).D Autoradiography of in-organello mitochondrial translation products derived from HEK293 MRPS5 wild-type cells in the presence of tobramycin (0-750 µM). Proteins were 35S-Met labeled and loaded either directly on SDS-PAGE (total, top) or following poly-lysine immunoprecipitation (bottom). * MT-CO1 and ** MT-CO1 with poly-lysine extension.E Quantification of MT-CO1 proteins in HEK293 MRPS5 wild-type cells and HEK293 MRPS5 mutant V336Y cells. In-organello mitochondrial translation in the presence of 35S-Met and 750 µM tobramycin. Proteins were loaded either directly on SDS-PAGE (total) or following poly-lysine immunoprecipitation and analyzed by autoradiography. For total protein samples the MT-CO1 band was quantified, for poly-lysine immunoprecipitated samples the extended MT-CO1 band was quantified and the ratio of extended MT-CO1/total MT-CO1 calculated. The ratio of MRPS5 wild-type was set as 1 (MRPS5 wild-type, n=5 clones, MRPS5 V336Y, n=7 clones), error bars indicate SD; ***p<0.0001 (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "3A", "Generation", "time", "(", "n", "=", "8", "clones", ",", "±", "SD", ")", ".", "B", "Whole", "cell", "in", "-", "vivo", "mitochondrial", "translation", "as", "determined", "by", "35S", "-", "Met", "incorporation", "(", "n", "=", "4", "clones", ",", "±", "SEM", ")", ".", "C", "Autoradiography", "of", "in", "-", "organello", "translation", "using", "35S", "-", "Met", "labelling", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Generation time (n=8 clones, ± SD).B Whole cell in-vivo mitochondrial translation as determined by 35S-Met incorporation (n=4 clones, ± SEM).C Autoradiography of in-organello translation using 35S-Met labelling."}
{"words": ["Figure", "4Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "was", "measured", "in", "freshly", "isolated", "mitochondria", "from", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "mouse", "cortex", ".", "A", "OCR", "in", "brain", "mitochondria", "from", "19", "-", "months", "mutant", "mice", "(", "black", "circle", ")", "compared", "with", "OCR", "from", "wild", "-", "type", "mice", "(", "white", "circle", ")", ".", "The", "sequential", "injection", "of", "mitochondrial", "substrates", "and", "inhibitors", "is", "indicated", "by", "dotted", "lines", "Values", "corresponding", "to", "the", "different", "respiratory", "states", "are", "shown", ".", "Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "was", "measured", "in", "freshly", "isolated", "mitochondria", "from", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "mouse", "cortex", ".", "Baseline", "OCR", ",", "effect", "of", "age", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "genotype", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "was", "measured", "in", "freshly", "isolated", "mitochondria", "from", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "mouse", "cortex", ".", "C", "State", "3", "OCR", "(", "after", "addition", "of", "ADP", ")", ",", "effect", "of", "age", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "and", "genotype", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "was", "measured", "in", "freshly", "isolated", "mitochondria", "from", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "mouse", "cortex", ".", "D", "State", "3", "uncoupled", "OCR", "(", "state", "3u", "after", "addition", "of", "FCCP", ")", ",", "effect", "of", "genotype", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "age", "-", "genotype", "interaction", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "E", "Ratio", "of", "mitochondrial", "complex", "IV", "and", "complex", "II", "activities", ".", "F", "ATP", "levels", ".", "G", "Superoxide", "anion", "radicals", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Oxygen consumption rate (OCR) was measured in freshly isolated mitochondria from wild-type and mutant mouse cortex. A OCR in brain mitochondria from 19-months mutant mice (black circle) compared with OCR from wild-type mice (white circle). The sequential injection of mitochondrial substrates and inhibitors is indicated by dotted lines Values corresponding to the different respiratory states are shown.Oxygen consumption rate (OCR) was measured in freshly isolated mitochondria from wild-type and mutant mouse cortex. Baseline OCR, effect of age (p<0.0001) and genotype (p<0.05).Oxygen consumption rate (OCR) was measured in freshly isolated mitochondria from wild-type and mutant mouse cortex. C State 3 OCR (after addition of ADP), effect of age (p<0.001) and genotype (p<0.0001).Oxygen consumption rate (OCR) was measured in freshly isolated mitochondria from wild-type and mutant mouse cortex. D State 3 uncoupled OCR (state 3u after addition of FCCP), effect of genotype (p<0.0001) and age-genotype interaction (p<0.0001).E Ratio of mitochondrial complex IV and complex II activities.F ATP levels.G Superoxide anion radicals."}
{"words": ["Figure", "5A", "Average", "distance", "to", "center", "as", "measure", "of", "anxiety", "in", "the", "open", "field", "(", "ANOVA", ":", "genotype", "F1", ",", "24", "=", "16", ".", "24", "p", "=", "0", ".", "0005", ",", "age", "F2", ",", "24", "=", "5", ".", "217", "p", "=", "0", ".", "0131", ")", ".", "Mutants", "show", "increased", "anxiety", "levels", "at", "9", "-", "and", "14", "-", "months", ".", "B", "Estimated", "frequency", "of", "rearing", "activity", "as", "measure", "of", "exploratory", "drive", "in", "the", "open", "field", "(", "ANOVA", ":", "genotype", "F1", ",", "24", "=", "39", ".", "40", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "age", "x", "genotype", "F2", ",", "26", "=", "8", ".", "204", "p", "=", "0", ".", "0017", ")", ".", "Mutants", "showed", "little", "exploratory", "activity", "at", "9", "-", "and", "14", "-", "months", ".", "C", "Light", "-", "dark", "transition", "test", ",", "%", "time", "spent", "in", "the", "bright", "compartment", "(", "ANOVA", ":", "genotype", "F1", ",", "16", "=", "7", ".", "393", "p", "=", "0", ".", "0152", ")", ".", "Reduced", "scores", "at", "9", "-", "months", "old", "animals", "indicate", "increased", "anxiety", ".", "D", "Exploratory", "corner", "visits", "in", "dark", "and", "light", "phase", "during", "adaptation", "to", "the", "IntelliCage", "(", "ANOVA", ":", "phase", "F1", ",", "18", "=", "617", ".", "2", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Corner", "visits", "during", "the", "dark", "phase", "as", "a", "correlate", "of", "exploratory", "activity", "showed", "premature", "reduction", "in", "9", "-", "months", "old", "animals", ".", "E", "Learning", "in", "the", "hippocampus", "-", "dependent", "IntelliCage", "serial", "reversal", "task", "(", "ANOVA", ":", "day", "F2", ",", "56", "=", "26", ".", "71", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Scores", "provided", "no", "evidence", "for", "a", "mutation", "effect", "on", "learning", "rate", "or", "performance", ".", "F", "Learning", "in", "the", "hippocampus", "-", "dependent", "IntelliCage", "chaining", "task", "(", "ANOVA", ":", "day", "F2", ",", "54", "=", "450", ".", "1", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Scores", "provided", "no", "evidence", "for", "a", "mutation", "effect", "on", "learning", "rate", "or", "performance", ".", "G", "Water", "-", "maze", "place", "navigation", ",", "swim", "path", "during", "acquisition", "and", "reversal", "(", "ANOVA", ":", "day", "F4", ",", "104", "=", "21", ".", "14", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "genotype", "F1", ",", "26", "=", "13", ".", "11", "p", "=", "0", ".", "0013", ",", "age", "x", "genotype", "F2", ",", "26", "=", "8", ".", "204", "p", "=", "0", ".", "0017", ")", ".", "All", "groups", "learned", ":", "controls", "showed", "reduced", "performance", "with", "increasing", "age", ",", "mutants", "showed", "poor", "performance", "already", "at", "9", "-", "and", "14", "-", "months", ".", "H", "Number", "of", "wall", "approaches", "as", "indicator", "of", "poor", "coping", "with", "the", "test", "and", "non", "-", "spatial", "strategy", "choice", "(", "ANOVA", ":", "genotype", "F1", ",", "26", "=", "18", ".", "31", "p", "=", "0", ".", "0002", ",", "age", "F2", ",", "26", "=", "4", ".", "486", "p", "=", "0", ".", "0212", ",", "age", "x", "genotype", "F2", ",", "26", "=", "7", ".", "068", "p", "=", "0", ".", "0035", ")", ".", "Number", "of", "wall", "approaches", "increased", "with", "age", "in", "controls", "and", "was", "prematurely", "increased", "in", "mutants", "at", "9", "-", "and", "14", "-", "months", ".", "Water", "-", "maze", "probe", "trial", ",", "spatial", "retention", "score", "for", "target", "zones", "1", "-", "3", "comprising", "5", ",", "10", "and", "10", "%", "of", "the", "pool", "surface", "versus", "remaining", "75", "%", "of", "surface", "(", "ANOVA", ":", "zone", "F3", ",", "78", "=", "36", ".", "04", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "genotype", "x", "zone", "F3", ",", "78", "=", "7", ".", "807", "p", "=", "0", ".", "0001", ")", ".", "Spatial", "selectivity", "declined", "with", "age", "in", "controls", "and", "was", "prematurely", "reduced", "in", "mutants", "at", "9", "-", "and", "14", "-", "months", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Average distance to center as measure of anxiety in the open field (ANOVA: genotype F1,24=16.24 p=0.0005, age F2,24=5.217 p=0.0131). Mutants show increased anxiety levels at 9- and 14-months.B Estimated frequency of rearing activity as measure of exploratory drive in the open field (ANOVA: genotype F1, 24=39.40 p<0.0001, age x genotype F2,26=8.204 p=0.0017). Mutants showed little exploratory activity at 9- and 14-months.C Light-dark transition test, % time spent in the bright compartment (ANOVA: genotype F1,16=7.393 p=0.0152). Reduced scores at 9-months old animals indicate increased anxiety.D Exploratory corner visits in dark and light phase during adaptation to the IntelliCage (ANOVA: phase F1,18=617.2 p<0.0001). Corner visits during the dark phase as a correlate of exploratory activity showed premature reduction in 9-months old animals.E Learning in the hippocampus-dependent IntelliCage serial reversal task (ANOVA: day F2,56=26.71 p<0.0001). Scores provided no evidence for a mutation effect on learning rate or performance.F Learning in the hippocampus-dependent IntelliCage chaining task (ANOVA: day F2,54=450.1 p<0.0001). Scores provided no evidence for a mutation effect on learning rate or performance.G Water-maze place navigation, swim path during acquisition and reversal (ANOVA: day F4,104=21.14 p<0.0001, genotype F1,26=13.11 p=0.0013, age x genotype F2,26=8.204 p=0.0017). All groups learned: controls showed reduced performance with increasing age, mutants showed poor performance already at 9- and 14-months.H Number of wall approaches as indicator of poor coping with the test and non-spatial strategy choice (ANOVA: genotype F1,26=18.31 p=0.0002, age F2,26=4.486 p=0.0212, age x genotype F2,26=7.068 p=0.0035). Number of wall approaches increased with age in controls and was prematurely increased in mutants at 9- and 14-months.Water-maze probe trial, spatial retention score for target zones 1-3 comprising 5, 10 and 10% of the pool surface versus remaining 75% of surface (ANOVA: zone F3,78=36.04 p<0.0001, genotype x zone F3,78=7.807 p=0.0001). Spatial selectivity declined with age in controls and was prematurely reduced in mutants at 9- and 14-months."}
{"words": ["Figure", "6Noise", "exposure", "and", "ABR", "measurements", ".", "Exposure", "of", "mice", "to", "broadband", "noise", "(", "2", "-", "10", "kHz", ")", "of", "either", "108", "or", "110", "dB", "SPL", "resulted", "in", "elevations", "of", "auditory", "thresholds", ".", "Thresholds", "in", "Mrps5V338Y", "/", "V338Y", "mutant", "mice", "(", "black", "bars", ")", "were", "significantly", "higher", "after", "exposure", "than", "thresholds", "in", "littermates", "(", "open", "bars", ")", ",", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "for", "combined", "108", "and", "110", "dB", "data", ")", ".", "Frequencies", "of", "12", ",", "24", "and", "32", "kHz", "were", "selected", "for", "measurement", "to", "cover", "the", "mid", "-", "frequency", "to", "high", "-", "frequency", "regions", "of", "the", "cochlea", ".", "n", "=", "6", "for", "baseline", "littermates", ";", "n", "=", "6", "for", "baseline", "mutants", ";", "n", "=", "3", "for", "all", "noise", "exposures", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Noise exposure and ABR measurements. Exposure of mice to broadband noise (2-10 kHz) of either 108 or 110 dB SPL resulted in elevations of auditory thresholds. Thresholds in Mrps5V338Y/V338Y mutant mice (black bars) were significantly higher after exposure than thresholds in littermates (open bars), (p<0.0001, two-way ANOVA for combined 108 and 110 dB data). Frequencies of 12, 24 and 32 kHz were selected for measurement to cover the mid-frequency to high-frequency regions of the cochlea. n=6 for baseline littermates; n=6 for baseline mutants; n=3 for all noise exposures."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Fed", "rat", "liver", "lysosomes", "were", "extracted", "with", "1", "%", "of", "the", "indicated", "detergents", "and", "then", "subjected", "to", "sucrose", "gradient", "centrifugation", ".", "Aliquots", "collected", "from", "top", "to", "bottom", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "for", "LAMP", "‐", "2A", "and", "flotillin", "‐", "1", ".", "Stars", "indicate", "the", "aliquots", "of", "the", "gradient", "of", "translucent", "appearance", "(", "highly", "enriched", "in", "lipids", ")", ".", "(", "B", ")", "The", "distribution", "of", "LAMP", "‐", "2A", "through", "the", "sucrose", "gradient", "after", "extraction", "with", "1", "%", "Triton", "X", "‐", "114", "was", "calculated", "from", "the", "densitometric", "quantification", "of", "immunoblots", "as", "the", "one", "shown", "here", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "the", "total", "lysosomal", "levels", "and", "are", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "of", "four", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Fed rat liver lysosomes were extracted with 1% of the indicated detergents and then subjected to sucrose gradient centrifugation. Aliquots collected from top to bottom were subjected to SDS-PAGE and immunoblotted for LAMP‐2A and flotillin‐1. Stars indicate the aliquots of the gradient of translucent appearance (highly enriched in lipids).(B) The distribution of LAMP‐2A through the sucrose gradient after extraction with 1% Triton X‐114 was calculated from the densitometric quantification of immunoblots as the one shown here. Values are expressed as percentage of the total lysosomal levels and are mean+s.e. of four experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Lysosomes", "from", "livers", "of", "fed", "(", "Fed", ")", "or", "24", "h", "starved", "rats", "(", "Stv", ")", "were", "extracted", "with", "1", "%", "Triton", "X", "‐", "114", "and", "processed", "as", "in", "Figure", "1", "or", "the", "aliquots", "in", "the", "translucent", "region", "were", "pooled", "together", "as", "the", "detergent", "‐", "resistant", "(", "DR", ")", "fraction", ",", "and", "anything", "below", "this", "fraction", "was", "pooled", ",", "as", "the", "solubilized", "fraction", "(", "Sol", ")", "(", "B", ")", ".", "Lanes", "5", "-", "6", "are", "one", "‐", "tenth", "of", "the", "amount", "of", "lysosomes", "loaded", "in", "the", "gradient", ".", "(", "C", ")", "Distribution", "of", "LAMP", "‐", "2A", "(", "L", "‐", "2A", ")", "and", "flotillin", "‐", "1", "(", "Flot", "‐", "1", ")", "in", "fed", "rats", "liver", "lysosomes", "extracted", "with", "1", "%", "Triton", "X", "‐", "114", "at", "4", "or", "37", "°", "C", ".", "DR", "fractions", "were", "pooled", "as", "in", "(", "B", ")", ",", "and", "the", "aliquots", "below", "this", "region", "were", "divided", "in", "three", "fractions", "(", "a", "soluble", "(", "Sol", ";", "aliquot", "15", ")", "and", "two", "intermediate", "fractions", "(", "light", ":", "aliquots", "11", "-", "12", ";", "heavy", ":", "aliquots", "13", "-", "14", ")", ".", "(", "D", ")", "Fed", "ratliverlysosomes", "were", "incubated", "with", "MBCD", "or", "filipin", ",", "as", "described", "under", "Material", "and", "methods", ",", "and", "then", "processed", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "The", "mean", "value", "of", "the", "densitometric", "quantification", "of", "the", "LAMP", "‐", "from", "two", "experiments", "is", "shown", "at", "the", "bottom", "in", "(", "C", ")", "and", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Lysosomes from livers of fed (Fed) or 24 h starved rats (Stv) were extracted with 1% Triton X‐114 and processed as in Figure 1 or the aliquots in the translucent region were pooled together as the detergent‐resistant (DR) fraction, and anything below this fraction was pooled, as the solubilized fraction (Sol) (B). Lanes 5-6 are one‐tenth of the amount of lysosomes loaded in the gradient.(C) Distribution of LAMP‐2A (L‐2A) and flotillin‐1 (Flot‐1) in fed rats liver lysosomes extracted with 1% Triton X‐114 at 4 or 37°C. DR fractions were pooled as in (B), and the aliquots below this region were divided in three fractions (a soluble (Sol; aliquot 15) and two intermediate fractions (light: aliquots 11-12; heavy: aliquots 13-14).(D) Fed ratliverlysosomes were incubated with MBCD or filipin, as described under Material and methods, and then processed as in (C). The mean value of the densitometric quantification of the LAMP‐ from two experiments is shown at the bottom in (C) and (D)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Lysosomalmembranes", "from", "fed", "ratlivers", "and", "their", "corresponding", "1", "%", "Triton", "X", "‐", "114", "‐", "resistant", "regions", ",", "isolated", "as", "described", "under", "Material", "and", "methods", ",", "were", "subjected", "to", "one", "(", "left", ")", "‐", "or", "two", "‐", "dimensional", "(", "right", ")", "electrophoresis", "and", "stained", "with", "Sypro", "Ruby", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "for", "the", "indicated", "proteins", "of", "the", "detergent", "resistant", "(", "DR", ")", ",", "intermediate", "(", "Int", ")", "and", "solubilized", "(", "Sol", ")", "fractions", "of", "lysosomal", "membranes", "obtained", "as", "in", "Figure", "2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Lysosomalmembranes from fed ratlivers and their corresponding 1% Triton X‐114‐resistant regions, isolated as described under Material and methods, were subjected to one (left)‐ or two‐dimensional (right) electrophoresis and stained with Sypro Ruby.(B) Immunoblot for the indicated proteins of the detergent resistant (DR), intermediate (Int) and solubilized (Sol) fractions of lysosomal membranes obtained as in Figure 2."}
{"words": ["Figure", "4LAMP", "‐", "2A", "localizes", "in", "cholesterol", "‐", "and", "GM", "‐", "1", "‐", "enriched", "intracellular", "membrane", "domains", ".", "Mouse", "fibroblasts", "grown", "on", "coverslips", "in", "the", "presence", "(", "+", ")", "or", "absence", "(", "−", ")", "of", "serum", "were", "fixed", "and", "labeled", "with", "filipin", "(", "red", ")", "(", "A", ")", "or", "incubated", "with", "Texas", "‐", "Red", "‐", "cholera", "toxin", "B", "subunit", "to", "label", "GM", "‐", "1", "‐", "enriched", "membrane", "regions", "(", "red", ")", "and", "then", "fixed", ".", "(", "B", ")", "Both", "groups", "of", "cells", "were", "then", "subjected", "to", "indirect", "immunofluorescence", "for", "LAMP", "‐", "2A", "(", "green", ")", ".", "Where", "indicated", ",", "cells", "were", "treated", "with", "MBCD", "(", "25", "mM", ")", "for", "30", "min", "before", "fixation", ".", "The", "merged", "images", "of", "both", "fluorophores", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "Insets", "show", "vesicles", "at", "higher", "magnification", ".", "Bar", ":", "10", "μm", ".", "The", "quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "the", "two", "fluorophores", "is", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "of", "percentage", "of", "colocalization", "in", "20", "-", "40", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4LAMP‐2A localizes in cholesterol‐ and GM‐1‐enriched intracellular membrane domains. Mouse fibroblasts grown on coverslips in the presence (+) or absence (−) of serum were fixed and labeled with filipin (red) (A) or incubated with Texas‐Red‐cholera toxin B subunit to label GM‐1‐enriched membrane regions (red) and then fixed.(B) Both groups of cells were then subjected to indirect immunofluorescence for LAMP‐2A (green). Where indicated, cells were treated with MBCD (25 mM) for 30 min before fixation. The merged images of both fluorophores are shown on the right. Insets show vesicles at higher magnification. Bar: 10 μm.The quantification of the colocalization of the two fluorophores is shown in (C). Values are expressed as the mean+s.e. of percentage of colocalization in 20-40 cells."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ",", "B", ")", "Regions", "of", "the", "lysosomalmembrane", "resistant", "to", "1", "%", "Triton", "X", "‐", "114", "recovered", "from", "the", "sucrose", "gradients", "were", "fixed", "and", "processed", "for", "electron", "microscopy", "(", "A", ")", "or", "visualized", "without", "fixation", "by", "electron", "microscopy", "(", "B", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "membrane", "bilayer", ".", "(", "C", ")", "Intact", "ratliverlysosomes", "(", "top", ")", "and", "DR", "regions", "of", "the", "lysosomal", "membranes", "(", "bottom", ")", "were", "fixed", "and", "subjected", "to", "immunogold", "labeling", "for", "LAMP", "‐", "2A", "and", "LAMP", "‐", "2B", ",", "and", "a", "gold", "‐", "conjugated", "secondary", "antibody", "as", "described", "under", "Material", "and", "methods", ".", "Top", "right", "panels", "show", "'", "clusters", "'", "of", "gold", "particles", "(", "black", "arrows", ")", "in", "individual", "lysosomes", "at", "higher", "magnification", ".", "Graph", "shows", "the", "labeling", "density", "(", "gold", "particles", "per", "μm", ")", "in", "the", "indicated", "fractions", "for", "both", "proteins", ".", "Values", "are", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "from", "the", "quantification", "of", "15", "different", "micrographs", ".", "(", "D", ")", "Intact", "rat", "liver", "lysosomes", "were", "fixed", "and", "subjected", "to", "double", "immunogold", "labeling", "for", "LAMP", "‐", "2A", "and", "flotillin", "‐", "1", ".", "Representative", "lysosomes", "are", "shown", ".", "Far", "right", "panel", ":", "zoomed", "‐", "in", "image", "of", "the", "distribution", "of", "LAMP", "‐", "2A", "in", "regions", "containing", "(", "black", "arrows", ")", "and", "not", "containing", "(", "white", "arrows", ")", "flotillin", "‐", "1", ".", "Bars", ":", "0", ".", "2", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A, B) Regions of the lysosomalmembrane resistant to 1% Triton X‐114 recovered from the sucrose gradients were fixed and processed for electron microscopy (A) or visualized without fixation by electron microscopy (B). Arrows point to the membrane bilayer.(C) Intact ratliverlysosomes (top) and DR regions of the lysosomal membranes (bottom) were fixed and subjected to immunogold labeling for LAMP‐2A and LAMP‐2B, and a gold‐conjugated secondary antibody as described under Material and methods. Top right panels show 'clusters' of gold particles (black arrows) in individual lysosomes at higher magnification. Graph shows the labeling density (gold particles per μm) in the indicated fractions for both proteins. Values are mean+s.e. from the quantification of 15 different micrographs.(D) Intact rat liver lysosomes were fixed and subjected to double immunogold labeling for LAMP‐2A and flotillin‐1. Representative lysosomes are shown. Far right panel: zoomed‐in image of the distribution of LAMP‐2A in regions containing (black arrows) and not containing (white arrows) flotillin‐1. Bars: 0.2 μm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Fed", "ratliverlysosomes", "were", "incubated", "in", "an", "isotonic", "buffer", "without", "additions", ",", "or", "in", "the", "presence", "of", "ratlivercytosol", "(", "25", "μg", ")", ",", "glyceraldehyde", "‐", "3", "‐", "phosphate", "dehydrogenase", "(", "GAPDH", ")", "(", "25", "μg", ")", ",", "GST", "‐", "hsc70", "(", "10", "μg", "/", "ml", ")", ",", "ATP", "(", "5", "mM", ")", "or", "the", "indicated", "combinations", "for", "15", "min", "at", "37", "°", "C", ".", "Lysosomes", "incubated", "directly", "with", "apyrase", "or", "with", "cytosol", "treated", "with", "apyrase", "are", "shown", "in", "the", "right", "bottom", "panel", ".", "At", "the", "end", "of", "the", "incubation", ",", "lysosomes", "were", "subjected", "to", "Triton", "X", "‐", "114", "extraction", ",", "apyrase", "density", "gradient", "centrifugation", "and", "immunoblot", "as", "in", "Figure", "2C", ".", "Graph", "shows", "changes", "in", "LAMP", "‐", "2A", "distribution", "expressed", "as", "times", "the", "value", "in", "untreated", "lysosomes", "and", "are", "the", "mean", "of", "the", "densitometric", "quantification", "of", "3", "-", "6", "experiments", "as", "the", "one", "shown", "here", ".", "Because", "all", "the", "incubations", "were", "performed", "in", "the", "presence", "of", "protease", "inhibitors", ",", "total", "levels", "of", "LAMP", "‐", "2A", "in", "lysosomes", "remained", "constant", "throughout", "the", "incubation", ".", "(", "B", ")", "Lysosomes", "from", "livers", "of", "fed", "rats", ",", "untreated", "or", "treated", "with", "paraquat", "(", "+", "PQ", ")", ",", "were", "processed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Graph", "shows", "changes", "in", "LAMP", "‐", "2A", "distribution", "induced", "by", "the", "PQ", "treatment", ",", "expressed", "as", "times", "the", "value", "in", "untreated", "animals", "and", "are", "the", "mean", "of", "three", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Lysosomes", "with", "high", "(", "CMA", "+", ")", "and", "low", "(", "CMA", "−", ")", "ability", "for", "CMA", "isolated", "from", "livers", "of", "fed", "or", "48", "h", "starved", "rats", "were", "processed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Top", "left", ":", "Levels", "of", "two", "CMA", "components", "(", "LAMP", "‐", "2A", "and", "hsc70", ")", "and", "of", "an", "unrelated", "lysosomalmembrane", "protein", "(", "LAMP", "‐", "1", ")", "in", "each", "of", "the", "four", "groups", "of", "lysosomes", ".", "Bottom", "left", ":", "Percentage", "of", "total", "lysosomal", "LAMP", "‐", "2A", "present", "in", "each", "fraction", ",", "determined", "by", "densitometric", "quantification", "of", "the", "immunoblots", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Fed ratliverlysosomes were incubated in an isotonic buffer without additions, or in the presence of ratlivercytosol (25 μg), glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase (GAPDH) (25 μg), GST‐hsc70 (10 μg/ml), ATP (5 mM) or the indicated combinations for 15 min at 37°C. Lysosomes incubated directly with apyrase or with cytosol treated with apyrase are shown in the right bottom panel. At the end of the incubation, lysosomes were subjected to Triton X‐114 extraction, apyrase density gradient centrifugation and immunoblot as in Figure 2C. Graph shows changes in LAMP‐2A distribution expressed as times the value in untreated lysosomes and are the mean of the densitometric quantification of 3-6 experiments as the one shown here. Because all the incubations were performed in the presence of protease inhibitors, total levels of LAMP‐2A in lysosomes remained constant throughout the incubation.(B) Lysosomes from livers of fed rats, untreated or treated with paraquat (+PQ), were processed as in (A). Graph shows changes in LAMP‐2A distribution induced by the PQ treatment, expressed as times the value in untreated animals and are the mean of three experiments.(C) Lysosomes with high (CMA+) and low (CMA−) ability for CMA isolated from livers of fed or 48 h starved rats were processed as in (A). Top left: Levels of two CMA components (LAMP‐2A and hsc70) and of an unrelated lysosomalmembrane protein (LAMP‐1) in each of the four groups of lysosomes. Bottom left: Percentage of total lysosomal LAMP‐2A present in each fraction, determined by densitometric quantification of the immunoblots."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Degradation", "of", "long", "‐", "lived", "proteins", "in", "mouse", "fibroblasts", "(", "NIH3T3", "cells", ")", "treated", "or", "not", "with", "25", "mM", "MBCD", ".", "Where", "indicated", ",", "15", "mM", "NH4Cl", "/", "100", "μM", "leupeptin", "(", "NH4Cl", "+", "Leup", ")", "were", "added", "into", "the", "medium", ".", "Values", "are", "the", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "of", "three", "experiments", "with", "triplicate", "samples", ".", "(", "B", ")", "Effect", "of", "MBCD", "on", "total", "rates", "of", "protein", "degradation", ",", "measured", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "in", "wild", "‐", "type", "mouse", "fibroblasts", "and", "in", "fibroblasts", "stably", "RNA", "interfered", "for", "LAMP", "‐", "2A", "(", "LAMP", "‐", "2A", "(", "−", ")", ")", ".", "The", "ratio", "of", "degradation", "in", "MBCD", "‐", "treated", "and", "untreated", "cells", "is", "shown", "for", "cells", "maintained", "with", "or", "without", "10", "mM", "3", "‐", "methyladenine", "(", "3MA", ")", ".", "(", "C", ")", "Proteolysis", "of", "[", "14C", "]", "GAPDH", "or", "a", "pool", "of", "[", "3H", "]", "labeled", "cytosolic", "proteins", "(", "pool", "proteins", ")", "by", "isolated", "rat", "liver", "lysosomes", ",", "treated", "or", "not", "with", "MBCD", ".", "Broken", ":", "lysosomes", "disrupted", "by", "a", "hypotonic", "shock", "before", "the", "incubation", "with", "the", "radiolabeled", "proteins", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "the", "degradation", "by", "untreated", "lysosomes", "and", "are", "the", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "of", "three", "experiments", "with", "triplicate", "samples", ".", "(", "D", ")", "Lysosomal", "-", "mitochondrial", "fractions", "were", "isolated", "from", "mouse", "fibroblasts", "untreated", "or", "loaded", "with", "cholesterol", "(", "50", "μM", ")", ".", "Top", ":", "Distribution", "of", "LAMP", "‐", "2A", "after", "Triton", "X", "‐", "114", "extraction", "and", "sucrose", "density", "gradient", "centrifugation", ".", "Bottom", ":", "Ability", "of", "intact", "or", "disrupted", "lysosomal", "-", "mitochondrial", "fractions", "to", "proteolize", "[", "14C", "]", "GAPDH", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "the", "degradation", "in", "fractions", "from", "untreated", "cells", "and", "are", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "of", "triplicate", "samples", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Degradation of long‐lived proteins in mouse fibroblasts (NIH3T3 cells) treated or not with 25 mM MBCD. Where indicated, 15 mM NH4Cl/100 μM leupeptin (NH4Cl+Leup) were added into the medium. Values are the mean+s.e. of three experiments with triplicate samples.(B) Effect of MBCD on total rates of protein degradation, measured as in (A), in wild‐type mouse fibroblasts and in fibroblasts stably RNA interfered for LAMP‐2A (LAMP‐2A(−)). The ratio of degradation in MBCD‐treated and untreated cells is shown for cells maintained with or without 10 mM 3‐methyladenine (3MA).(C) Proteolysis of [14C]GAPDH or a pool of [3H]labeled cytosolic proteins (pool proteins) by isolated rat liver lysosomes, treated or not with MBCD. Broken: lysosomes disrupted by a hypotonic shock before the incubation with the radiolabeled proteins. Values are expressed as percentage of the degradation by untreated lysosomes and are the mean+s.e. of three experiments with triplicate samples.(D) Lysosomal-mitochondrial fractions were isolated from mouse fibroblasts untreated or loaded with cholesterol (50 μM). Top: Distribution of LAMP‐2A after Triton X‐114 extraction and sucrose density gradient centrifugation. Bottom: Ability of intact or disrupted lysosomal-mitochondrial fractions to proteolize [14C]GAPDH. Values are expressed as percentage of the degradation in fractions from untreated cells and are the mean±s.e. of triplicate samples."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Lysosomes", "from", "mouse", "fibroblasts", "transfected", "with", "wild", "‐", "type", "hLAMP", "‐", "2A", "and", "maintained", "in", "the", "presence", "(", "Serum", "+", ")", "or", "absence", "(", "serum", "−", ")", "of", "serum", "were", "collected", "by", "centrifugation", "and", "subjected", "to", "Triton", "X", "‐", "114", "extraction", ",", "sucrose", "density", "gradient", "centrifugation", "and", "immunobloting", "for", "human", "(", "hL2A", ")", "or", "mouse", "(", "mL2A", ")", "LAMP", "‐", "2A", ".", "Lane", "1", ":", "homogenate", ".", "(", "B", ")", "Amino", "-", "acid", "sequence", "of", "the", "transmembrane", "and", "cytosolic", "region", "of", "hLAMP", "-", "2A", "and", "the", "mutations", "performed", ".", "Replaced", "amino", "acids", "are", "shadowed", ".", "(", "C", ")", "Lysosomes", "from", "mouse", "fibroblasts", "transfected", "with", "the", "indicated", "forms", "of", "hLAMP", "‐", "2A", "and", "maintained", "in", "the", "presence", "of", "serum", "were", "processed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "D", ")", "The", "percentage", "of", "total", "lysosomal", "hLAMP", "‐", "2A", "present", "in", "each", "fraction", "was", "determined", "by", "densitometric", "quantification", "of", "immunoblots", "as", "the", "ones", "shown", "here", ".", "Values", ",", "corrected", "for", "the", "amount", "of", "mLAMP", "‐", "2A", "in", "each", "fraction", ",", "are", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "of", "3", "-", "4", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Changes", "in", "hLAMP", "‐", "2A", "distribution", "induced", "by", "serum", "removal", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "times", "the", "values", "in", "cells", "maintained", "in", "the", "presence", "of", "serum", "and", "are", "the", "mean", "of", "two", "experiments", ".", "Changes", "in", "the", "three", "nonDR", "regions", "are", "shown", "together", "(", "no", "DR", ")", ".", "(", "F", ")", "Proteolysis", "of", "a", "pool", "of", "3", "[", "H", "]", "labeled", "cytosolic", "proteins", "by", "intact", "(", "left", ")", "or", "disrupted", "(", "right", ")", "lysosomes", "isolated", "from", "untransfected", "mouse", "fibroblasts", "(", "none", ")", "or", "fibroblasts", "transfected", "with", "wild", "‐", "type", "(", "WT", ")", "or", "the", "indicated", "mutant", "forms", "of", "hLAMP", "‐", "2A", ".", "Values", "are", "the", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "of", "two", "experiments", "with", "triplicate", "samples", ".", "(", "G", ")", "Part", "of", "the", "lysosomes", "from", "(", "F", ")", "was", "treated", "with", "MBCD", "before", "the", "incubation", "with", "the", "radiolabeled", "proteins", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "degradation", "by", "untreated", "lysosomes", "and", "are", "the", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "of", "two", "experiments", "with", "triplicate", "samples", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Lysosomes from mouse fibroblasts transfected with wild‐type hLAMP‐2A and maintained in the presence (Serum+) or absence (serum−) of serum were collected by centrifugation and subjected to Triton X‐114 extraction, sucrose density gradient centrifugation and immunobloting for human (hL2A) or mouse (mL2A) LAMP‐2A. Lane 1: homogenate.(B) Amino-acid sequence of the transmembrane and cytosolic region of hLAMP-2A and the mutations performed. Replaced amino acids are shadowed.(C) Lysosomes from mouse fibroblasts transfected with the indicated forms of hLAMP‐2A and maintained in the presence of serum were processed as in (A).(D) The percentage of total lysosomal hLAMP‐2A present in each fraction was determined by densitometric quantification of immunoblots as the ones shown here. Values, corrected for the amount of mLAMP‐2A in each fraction, are mean+s.e. of 3-4 experiments.(E) Changes in hLAMP‐2A distribution induced by serum removal. Values are expressed as times the values in cells maintained in the presence of serum and are the mean of two experiments. Changes in the three nonDR regions are shown together (no DR).(F) Proteolysis of a pool of 3[H]labeled cytosolic proteins by intact (left) or disrupted (right) lysosomes isolated from untransfected mouse fibroblasts (none) or fibroblasts transfected with wild‐type (WT) or the indicated mutant forms of hLAMP‐2A. Values are the mean+s.e. of two experiments with triplicate samples.(G) Part of the lysosomes from (F) was treated with MBCD before the incubation with the radiolabeled proteins. Values are expressed as percentage of degradation by untreated lysosomes and are the mean+s.e. of two experiments with triplicate samples."}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", ")", "The", "Triton", "X", "‐", "114", "‐", "resistant", "and", "soluble", "regions", "of", "the", "lysosomalmembrane", "were", "subjected", "to", "centrifugation", "through", "a", "continuous", "(", "10", "-", "80", "%", ")", "sucrose", "density", "gradient", ",", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblot", "for", "LAMP", "‐", "2A", ".", "The", "molecular", "weight", "range", "of", "each", "fraction", "is", "as", "follows", ":", "fraction", "1", "(", "100", "kDa", ")", ";", "fraction", "2", "(", "100", "-", "200", "kDa", ")", ";", "fraction", "3", "(", "200", "-", "400", "kDa", ")", ";", "fraction", "4", "(", "400", "-", "600", "kDa", ")", ";", "fraction", "5", "(", ">", "600", "kDa", ")", ".", "(", "B", ")", "Fed", "rat", "liver", "lysosomes", "were", "incubated", "with", "1", "mM", "CaCl2", "(", "+", "Ca2", "+", ")", "in", "an", "isotonic", "buffer", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "a", "cocktail", "of", "protease", "inhibitors", "(", "PI", ")", ".", "Samples", "were", "subjected", "to", "Triton", "X", "‐", "114", "extraction", ",", "sucrose", "density", "gradients", "centrifugation", "and", "LAMP", "‐", "2A", "immunoblot", ".", "(", "C", ")", "Fed", "rat", "liver", "lysosomes", "treated", "or", "not", "with", "25", "mM", "MBCD", "were", "incubated", "in", "an", "isotonic", "buffer", "for", "30", "min", "and", "then", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunobloted", "with", "antibodies", "against", "the", "cytosolic", "(", "Top", ";", "L", "‐", "2A", ")", "and", "luminal", "(", "Bottom", ";", "L", "‐", "2", ")", "regions", "of", "LAMP", "‐", "2A", ".", "Arrow", ":", "LAMP", "‐", "2A", "proteolytic", "fragment", "(", "Cuervo", "and", "Dice", ",", "2000a", ")", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Rat", "liver", "lysosomes", "incubated", "or", "not", "with", "1", "mM", "CaCl2", "(", "+", "Ca2", "+", ")", "were", "subjected", "to", "Triton", "X", "‐", "114", "extraction", "and", "sucrose", "density", "gradients", "centrifugation", ".", "Levels", "of", "cathepsin", "A", "(", "D", ")", "and", "carboxypeptidase", "A", "activity", "(", "E", ")", "were", "measured", "in", "each", "fraction", "by", "immunoblot", "or", "using", "a", "standardized", "colorimetric", "assay", ",", "respectively", ".", "Values", "in", "(", "E", ")", "are", "expressed", "as", "times", "the", "activity", "in", "untreated", "membranes", "and", "are", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "of", "two", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A) The Triton X‐114‐resistant and soluble regions of the lysosomalmembrane were subjected to centrifugation through a continuous (10-80%) sucrose density gradient, SDS-PAGE and immunoblot for LAMP‐2A. The molecular weight range of each fraction is as follows: fraction 1 (100 kDa); fraction 2 (100-200 kDa); fraction 3 (200-400 kDa); fraction 4 (400-600 kDa); fraction 5 (>600 kDa).(B) Fed rat liver lysosomes were incubated with 1 mM CaCl2 (+Ca2+) in an isotonic buffer in the absence or presence of a cocktail of protease inhibitors (PI). Samples were subjected to Triton X‐114 extraction, sucrose density gradients centrifugation and LAMP‐2A immunoblot.(C) Fed rat liver lysosomes treated or not with 25 mM MBCD were incubated in an isotonic buffer for 30 min and then subjected to SDS-PAGE and immunobloted with antibodies against the cytosolic (Top; L‐2A) and luminal (Bottom; L‐2) regions of LAMP‐2A. Arrow: LAMP‐2A proteolytic fragment (Cuervo and Dice, 2000a).(D, E) Rat liver lysosomes incubated or not with 1 mM CaCl2 (+Ca2+) were subjected to Triton X‐114 extraction and sucrose density gradients centrifugation. Levels of cathepsin A (D) and carboxypeptidase A activity (E) were measured in each fraction by immunoblot or using a standardized colorimetric assay, respectively. Values in (E) are expressed as times the activity in untreated membranes and are mean+s.e. of two experiments."}
{"words": ["Figure", "1C", ".", "Cathepsin", "activity", "assay", "in", "WT", "and", "Tpl2", "[", "D270A", "]", "BMDMs", "0", ".", "5", "h", "after", "uptake", "of", "latex", "beads", ".", "BMDMs", "were", "stained", "with", "the", "Magic", "Red", "cathepsin", "L", "substrate", "(", "red", ")", ".", "Average", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "cathepsin", "probe", "per", "cell", "was", "quantified", "(", "n", "=", "40", "-", "51", "cells", ")", ".", "E", ".", "pH", "assay", "in", "WT", "and", "Tpl2", "[", "D270A", "]", "BMDMs", "upon", "0", ".", "5", "h", "after", "incubation", "with", "latex", "beads", ".", "BMDMs", "were", "stained", "with", "the", "LysoTracker", "Red", "DND", "-", "99", "dye", "(", "red", ")", ".", "Average", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "Lysotracker", "Red", "probe", "per", "cell", "was", "quantified", "(", "n", "=", "95", "-", "126", "cells", ")", ".", "Data", "information", ":", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "shown", ".", "Error", "bars", "and", "shaded", "areas", "represent", "SEM", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "G", ".", "Reactive", "oxygen", "species", "assay", "in", "WT", "and", "Tpl2", "[", "D270A", "]", "BMDMs", "upon", "0", ".", "5", "h", "after", "incubation", "with", "latex", "beads", ".", "BMDMs", "were", "stained", "with", "the", "ROS", "Deep", "Red", "dye", ".", "Average", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "ROS", "Deep", "Red", "probe", "per", "cell", "was", "quantified", "(", "n", "=", "80", "-", "110", "cells", ")", "Data", "information", ":", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "shown", ".", "Error", "bars", "and", "shaded", "areas", "represent", "SEM", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C. Cathepsin activity assay in WT and Tpl2[D270A] BMDMs 0.5 h after uptake of latex beads. BMDMs were stained with the Magic Red cathepsin L substrate (red). Average fluorescence intensity of the cathepsin probe per cell was quantified (n = 40-51 cells). E. pH assay in WT and Tpl2[D270A] BMDMs upon 0.5 h after incubation with latex beads. BMDMs were stained with the LysoTracker Red DND-99 dye (red). Average fluorescence intensity of the Lysotracker Red probe per cell was quantified (n = 95-126 cells). Data information: One representative experiment out of three shown. Error bars and shaded areas represent SEM. **** P < 0.0001. Student's unpaired t-test.G. Reactive oxygen species assay in WT and Tpl2[D270A] BMDMs upon 0.5 h after incubation with latex beads. BMDMs were stained with the ROS Deep Red dye. Average fluorescence intensity of the ROS Deep Red probe per cell was quantified (n = 80-110 cells) Data information: One representative experiment out of three shown. Error bars and shaded areas represent SEM. **** P < 0.0001. Student's unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "2Experiments", "were", "performed", "using", "murine", "BMDMs", ".", "(", "C", ")", "Cell", "extracts", "from", "LPS", "-", "stimulated", "Nfkb1", "[", "SSAA", "]", "and", "Nfkb1", "[", "SSAA", "]", "/", "Tpl2", "[", "D270A", "]", "BMDMs", "were", "immunoblotted", "for", "the", "indicated", "antigens", ".", "Experiments", "were", "performed", "using", "human", "primary", "monocyte", "-", "derived", "macrophages", ".", "(", "K", ")", "Cell", "extracts", "from", "LPS", "-", "stimulated", ",", "inhibitor", "-", "treated", "primary", "human", "macrophages", "were", "immunoblotted", "for", "p", "-", "ERK1", "/", "2", ",", "ERK1", "/", "2", ",", "p", "-", "p38", ",", "p38", "and", "HSP90", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Experiments were performed using murine BMDMs. (C) Cell extracts from LPS-stimulated Nfkb1[SSAA] and Nfkb1[SSAA]/Tpl2[D270A] BMDMs were immunoblotted for the indicated antigens.Experiments were performed using human primary monocyte-derived macrophages. (K) Cell extracts from LPS-stimulated, inhibitor-treated primary human macrophages were immunoblotted for p-ERK1/2, ERK1/2, p-p38, p38 and HSP90."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "Protein", "intensities", "of", "V", "-", "ATPase", "subunits", "from", "phagosomes", "purified", "from", "WT", "and", "Tpl2", "[", "D270A", "]", "BMDMs", ",", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "D", ".", "Protein", "intensities", "of", "RAB5", "and", "LAMP", "-", "1", "from", "phagosome", "proteome", "analysis", "of", "WT", "and", "Tpl2", "[", "D270A", "]", "BMDMs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "(", "left", ")", ".", "Immunoblot", "of", "isolated", "phagosomes", "from", "WT", "and", "Tpl2", "[", "D270A", "]", "BMDMs", "probed", "for", "RAB5", ",", "LAMP", "-", "1", "and", "vimentin", ".", "Phagosomal", "fractions", "of", "two", "biological", "replicates", "were", "pooled", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "shown", "(", "right", ")", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. Protein intensities of V-ATPase subunits from phagosomes purified from WT and Tpl2[D270A] BMDMs, (n = 3 biological replicates). Data information: Data were analysed by Student's t-test. Error bars represent SEM. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001.D. Protein intensities of RAB5 and LAMP-1 from phagosome proteome analysis of WT and Tpl2[D270A] BMDMs (n = 3 biological replicates) (left). Immunoblot of isolated phagosomes from WT and Tpl2[D270A] BMDMs probed for RAB5, LAMP-1 and vimentin. Phagosomal fractions of two biological replicates were pooled. One representative experiment out of two shown (right) (n = 2). Data information: Data were analysed by Student's t-test. Error bars represent SEM. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001. "}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "TPL", "-", "2", "-", "dependent", "phosphoproteome", "following", "phagocytosis", "of", "latex", "beads", "(", "0", ".", "5", "h", ")", "was", "determined", "by", "TMT", "mass", "spectrometry", ".", "Volcano", "plot", "representing", "the", "significance", "(", "-", "log10", "P", "-", "values", "after", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "vs", ".", "phosphorylation", "fold", "change", "(", "Welch", "difference", "ratios", ")", "between", "WT", "and", "Tpl2", "[", "D270A", "]", "BMDMs", ".", "Five", "biological", "replicates", "were", "analysed", "per", "genotype", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Three", "of", "the", "most", "highly", "and", "significantly", "downregulated", "phospho", "-", "sites", "in", "Tpl2", "[", "D270A", "]", "BMDMs", "relative", "to", "WT", ",", "as", "well", "as", "unaltered", "DMXL1", "phospho", "-", "sites", ",", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. TPL-2-dependent phosphoproteome following phagocytosis of latex beads (0.5 h) was determined by TMT mass spectrometry. Volcano plot representing the significance (-log10 P-values after Welch's t-test) vs. phosphorylation fold change (Welch difference ratios) between WT and Tpl2[D270A] BMDMs. Five biological replicates were analysed per genotype (n = 5). Three of the most highly and significantly downregulated phospho-sites in Tpl2[D270A] BMDMs relative to WT, as well as unaltered DMXL1 phospho-sites, are shown."}
{"words": ["Figure", "5BMDMs", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "infected", "with", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "(", "MOI", "10", ")", "for", "1", "h", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "YFP", "+", "BMDMs", "labelled", "with", "Magic", "Red", "cathepsin", "L", "substrate", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "nuclear", "stain", ")", "1h", "post", "-", "infection", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "Magic", "Red", "cathepsin", "L", "staining", "from", "panel", "(", "A", ")", ".", "Average", "fluorescence", "intensity", "of", "Magic", "Red", "cathepsin", "L", "substrate", "per", "cell", "relative", "to", "fluorescence", "intensity", "of", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "(", "n", "=", "26", "-", "29", "cells", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "Magic", "Red", "cathepsin", "L", "staining", "co", "-", "localised", "with", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "from", "panel", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "26", "-", "29", "cells", ")", ".", "Data", "information", ":", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "BMDMs", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "infected", "with", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "(", "MOI", "10", ")", "for", "1", "h", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "YFP", "+", "BMDMs", "labelled", "with", "LysoTracker", "Red", "DND", "-", "99", "dye", "(", "red", ")", "and", "DAPI", ",", "1h", "post", "-", "infection", "with", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "(", "green", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "LysoTracker", "Red", "signal", "from", "panel", "(", "D", ")", ".", "Average", "fluorescence", "intensity", "of", "LysoTracker", "Red", "per", "cell", "relative", "to", "fluorescence", "intensity", "of", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "(", "n", "=", "66", "-", "98", "cells", ")", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "LysoTracker", "Red", "co", "-", "localisation", "with", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "from", "panel", "(", "D", ")", "(", "n", "=", "66", "-", "98", "cells", ")", ".", "Data", "information", ":", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "BMDMs", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "infected", "with", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "(", "MOI", "10", ")", "for", "1", "h", ".", "(", "H", ")", "Representative", "images", "of", "BMDMs", "stained", "with", "an", "anti", "-", "EEA1", "antibody", "(", "red", ")", "and", "DAPI", ",", "1h", "post", "-", "infection", "with", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "(", "green", ")", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "EEA1", "+", "S", ".", "aureus", "-", "containing", "phagosomes", "from", "panel", "(", "G", ")", "(", "n", "=", "27", "cells", ")", ".", "(", "J", ")", "Representative", "images", "of", "BMDMs", "stained", "with", "an", "anti", "-", "LAMP", "-", "1", "antibody", "(", "red", ")", "and", "DAPI", ",", "1h", "post", "-", "infection", "with", "YFP", "-", "S", ".", "aureus", "(", "green", ")", ".", "(", "K", ")", "Quantification", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "S", ".", "aureus", "phagosomes", "from", "panel", "(", "I", ")", "(", "n", "=", "25", "cells", ")", ".", "Data", "information", ":", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5BMDMs of the indicated genotypes were infected with YFP-S. aureus (MOI 10) for 1 h. (B) Representative images of YFP+ BMDMs labelled with Magic Red cathepsin L substrate (red) and DAPI (nuclear stain) 1h post-infection. (C) Quantification of Magic Red cathepsin L staining from panel (A). Average fluorescence intensity of Magic Red cathepsin L substrate per cell relative to fluorescence intensity of YFP-S.aureus (n = 26-29 cells). (D) Quantification of Magic Red cathepsin L staining co-localised with YFP-S. aureus from panel (A) (n = 26-29 cells). Data information: One representative experiment out of three shown. Error bars represent SEM. P < 0.01, **** P < 0.0001. Student's unpaired t-test.BMDMs of the indicated genotypes were infected with YFP-S. aureus (MOI 10) for 1 h. (E) Representative images of YFP+ BMDMs labelled with LysoTracker Red DND-99 dye (red) and DAPI, 1h post-infection with YFP-S. aureus (green).(F) Quantification of LysoTracker Red signal from panel (D). Average fluorescence intensity of LysoTracker Red per cell relative to fluorescence intensity of YFP-S. aureus (n = 66-98 cells). (G) Quantification of LysoTracker Red co-localisation with YFP-S. aureus from panel (D) (n = 66-98 cells). Data information: One representative experiment out of three shown. Error bars represent SEM. P < 0.01, **** P < 0.0001. Student's unpaired t-test.BMDMs of the indicated genotypes were infected with YFP-S. aureus (MOI 10) for 1 h. (H) Representative images of BMDMs stained with an anti-EEA1 antibody (red) and DAPI, 1h post-infection with YFP-S. aureus (green). (I) Quantification of EEA1+ S. aureus-containing phagosomes from panel (G) (n = 27 cells). (J) Representative images of BMDMs stained with an anti-LAMP-1 antibody (red) and DAPI, 1h post-infection with YFP-S. aureus (green). (K) Quantification of LAMP-1+ S. aureus phagosomes from panel (I) (n = 25 cells). Data information: One representative experiment out of three shown. Error bars represent SEM. P < 0.01, **** P < 0.0001. Student's unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "6E", ".", "BMDMs", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "infected", "with", "GFP", "-", "C", ".", "rodentium", "(", "MOI", "2", ")", "for", "0", ".", "5h", ".", "C", ".", "rodentium", "CFU", "were", "assessed", "at", "2", "h", "after", "infection", "and", "normalised", "to", "CFU", "at", "0", ".", "5", "h", "(", "n", "=", "12", ";", "2", "biological", "and", "6", "technical", "replicates", "per", "condition", "per", "experiment", ")", ".", "As", "a", "control", ",", "WT", "cells", "were", "treated", "with", "bafilomycin", "A", ".", "Data", "information", ":", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "F", ".", "Representative", "images", "of", "GFP", "+", "BMDMs", "labelled", "with", "LysoTracker", "Red", "DND", "-", "99", "dye", "(", "red", ")", "and", "DAPI", ",", "1h", "post", "-", "infection", "with", "GFP", "-", "C", ".", "rodentium", "(", "green", ")", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "LysoTracker", "Red", "co", "-", "localisation", "with", "GFP", "-", "C", ".", "rodentium", "from", "panel", "(", "F", ")", "(", "n", "=", "54", "-", "63", "cells", ")", ".", "Data", "information", ":", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "P", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6E. BMDMs of the indicated genotypes were infected with GFP-C. rodentium (MOI 2) for 0.5h. C. rodentium CFU were assessed at 2 h after infection and normalised to CFU at 0.5 h (n = 12; 2 biological and 6 technical replicates per condition per experiment). As a control, WT cells were treated with bafilomycin A. Data information: One representative experiment out of three shown. Error bars represent SEM. ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001, not significant (ns). one-way ANOVA.  F. Representative images of GFP+ BMDMs labelled with LysoTracker Red DND-99 dye (red) and DAPI, 1h post-infection with GFP-C. rodentium (green). G. Quantification of LysoTracker Red co-localisation with GFP- C. rodentium from panel (F) (n = 54-63 cells). Data information: One representative experiment out of three shown. Error bars represent SEM. ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001, not significant (ns). P one-way ANOVA.  "}
{"words": ["Figure", "1Kaplan", "Meier", "plots", "representing", "the", "survival", "difference", "between", "SKCM", "patients", "stratified", "according", "to", "the", "40", "%", "highest", "or", "lowest", "BNIP3", "expression", ".", "Representative", "images", "of", "BNIP3", "immunostaining", "in", "a", "benign", "nevus", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "primary", "melanoma", "and", "their", "paired", "metastasis", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "In", "the", "representative", "pictures", ",", "nevi", "or", "tumor", "tissue", "is", "circled", "in", "yellow", "and", "highlighted", "with", "a", "yellow", "asterisk", "(", "*", ")", ".", "Histopathological", "scoring", "of", "BNIP3", "protein", "levels", "in", "nevi", "and", "melanoma", "patients", "with", "paired", "primary", "and", "metastases", "harboring", "weak", "and", "in", "gradient", "(", "+", "/", "-", ")", ",", "weak", "and", "homogeneous", "(", "+", ")", "or", "strong", "and", "homogeneous", "(", "+", "+", ")", "BNIP3", "protein", "levels", "based", "on", "histopathological", "staining", "intensity", "and", "distribution", "scoring", ".", "Scale", "bars", "represent", "150µm", ".", "Representative", "images", "of", "BNIP3", "immunohistochemistry", "in", "TMAs", "containing", "(", "n", "=", "158", ")", "melanoma", "metastases", "and", "related", "Kaplan", "Meier", "plot", "of", "survival", "difference", "comparing", "melanoma", "patients", "with", "different", "BNIP3", "histopathological", "scores", ".", "Scale", "bars", "represent", "50µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Kaplan Meier plots representing the survival difference between SKCM patients stratified according to the 40% highest or lowest BNIP3 expression.Representative images of BNIP3 immunostaining in a benign nevus (n=5), primary melanoma and their paired metastasis (n=7). In the representative pictures, nevi or tumor tissue is circled in yellow and highlighted with a yellow asterisk (*). Histopathological scoring of BNIP3 protein levels in nevi and melanoma patients with paired primary and metastases harboring weak and in gradient (+/-), weak and homogeneous (+) or strong and homogeneous (++) BNIP3 protein levels based on histopathological staining intensity and distribution scoring. Scale bars represent 150µm.Representative images of BNIP3 immunohistochemistry in TMAs containing (n=158) melanoma metastases and related Kaplan Meier plot of survival difference comparing melanoma patients with different BNIP3 histopathological scores. Scale bars represent 50µm."}
{"words": ["Figure", "2Growth", "curves", "of", "B16", "-", "F10", "tumors", "generated", "with", "cells", "transduced", "with", "either", "empty", "vector", "(", "CntlKD", ")", ",", "shRNA", "against", "BNIP3", "(", "BNIP3KD", ")", "or", "ATG5", "(", "ATG5KD", ")", "(", "n", "=", "7", "per", "condition", ")", "and", "analyzed", "with", "a", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Haematoxylin", "and", "eosin", "staining", "of", "sections", "representative", "of", "CntlKD", ",", "BNIP3KD", "or", "ATG5KD", "B16", "-", "F10", "tumors", ".", "Necrotic", "areas", "are", "highlighted", "with", "an", "asterisk", "(", "*", ")", ".", "Quantification", "of", "TUNEL", "+", "tumor", "area", "(", "representing", "the", "fraction", "of", "dying", "/", "dead", "cell", "population", ")", "of", "CntlKD", ",", "BNIP3KD", "or", "ATG5KD", "B16", "-", "F10", "tumors", "(", "n", "=", "5", "per", "condition", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "Ki67", "+", "cells", "within", "the", "tumor", "area", "(", "representing", "the", "fraction", "of", "proliferative", "cell", "populations", "in", "non", "-", "necrotic", "areas", ")", "of", "CntlKD", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "BNIP3KD", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "ATG5KD", "(", "n", "=", "8", ")", "B16", "-", "F10", "tumors", ".", "Immunofluorescent", "staining", "for", "Ki67", "(", "red", ")", "representative", "of", "CntlKD", ",", "BNIP3KD", "or", "ATG5KD", "B16", "-", "F10", "tumor", "sections", ".", "Immunofluorescent", "staining", "for", "LC3B", "(", "orange", "granularity", ")", "representative", "of", "CntlKD", ",", "BNIP3KD", "or", "ATG5KD", "B16", "-", "F10", "tumor", "sections", ".", "A", "zoomed", "-", "in", "area", "is", "shown", "in", "the", "lower", "-", "left", "corner", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Growth curves of B16-F10 tumors generated with cells transduced with either empty vector (CntlKD), shRNA against BNIP3 (BNIP3KD) or ATG5 (ATG5KD) (n=7 per condition) and analyzed with a two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.Haematoxylin and eosin staining of sections representative of CntlKD, BNIP3KD or ATG5KD B16-F10 tumors. Necrotic areas are highlighted with an asterisk (*). Quantification of TUNEL+ tumor area (representing the fraction of dying/dead cell population) of CntlKD, BNIP3KD or ATG5KD B16-F10 tumors (n= 5 per condition). Quantification of the Ki67+ cells within the tumor area (representing the fraction of proliferative cell populations in non-necrotic areas) of CntlKD (n=7), BNIP3KD (n=6) and ATG5KD (n=8) B16-F10 tumors.Immunofluorescent staining for Ki67 (red) representative of CntlKD, BNIP3KD or ATG5KD B16-F10 tumor sections. Immunofluorescent staining for LC3B (orange granularity) representative of CntlKD, BNIP3KD or ATG5KD B16-F10 tumor sections. A zoomed-in area is shown in the lower-left corner."}
{"words": ["Figure", "3Confocal", "microscopy", "images", "of", "co", "-", "localization", "analysis", "of", "the", "BNIP3", "-", "proficient", "(", "shCntl", ",", "n", "=", "27", "cells", ")", "or", "deficient", "(", "shBNIP3", ",", "n", "=", "31", "cells", ")", "B16", "-", "F10", "cells", "transiently", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", "and", "immunostained", "for", "TOMM20", "(", "mitochondrial", "marker", ")", ".", "Colocalization", "events", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "(", "green", ")", "with", "TOMM20", "(", "red", ")", "are", "highlighted", "with", "white", "arrows", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "colocalizing", "with", "TOMM20", "was", "calculated", "in", "n", "cells", "from", "3", "biologically", "independent", "experiments", "and", "analyzed", "with", "Mann", "-", "Whitney", "'", "s", "non", "-", "parametric", "test", ".", "Scale", "bars", "represent", "10µm", ".", "Glut1", ",", "Hk2", ",", "Pkm1", ",", "Pkm2", ",", "Pdk1", ",", "Mct1", ",", "Ldha", ",", "Ldhb", "and", "Mct4", "transcript", "levels", "measured", "by", "qPCR", "from", "the", "corresponding", "B16", "-", "F10", "cell", "lysates", ".", "Transcript", "expression", "is", "represented", "as", "the", "fold", "-", "change", "relative", "to", "their", "corresponding", "shCntl", "value", ".", "Heatmap", "shows", "the", "average", "values", "in", "each", "condition", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "they", "were", "analyzed", "with", "a", "one", "-", "sample", "T", "-", "test", "only", "against", "shCntl", ",", "except", "for", "Glut1", "shATG5", "that", "was", "analyzed", "with", "a", "Wilcoxon", "rank", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Confocal microscopy images of co-localization analysis of the BNIP3-proficient (shCntl, n=27 cells) or deficient (shBNIP3, n=31 cells) B16-F10 cells transiently transfected with GFP-LC3 and immunostained for TOMM20 (mitochondrial marker). Colocalization events of GFP-LC3 puncta (green) with TOMM20 (red) are highlighted with white arrows. The percentage of GFP-LC3 puncta colocalizing with TOMM20 was calculated in n cells from 3 biologically independent experiments and analyzed with Mann-Whitney's non-parametric test. Scale bars represent 10µm.Glut1, Hk2, Pkm1, Pkm2, Pdk1, Mct1, Ldha, Ldhb and Mct4 transcript levels measured by qPCR from the corresponding B16-F10 cell lysates. Transcript expression is represented as the fold-change relative to their corresponding shCntl value. Heatmap shows the average values in each condition (n=4) and they were analyzed with a one-sample T-test only against shCntl, except for Glut1 shATG5 that was analyzed with a Wilcoxon rank test."}
{"words": ["Figure", "4Immunoblot", "detection", "of", "Hydroxylated", "HIF", "-", "1α", "(", "HIF", "-", "1α", "-", "OH", ")", ",", "total", "HIF", "-", "1α", ",", "LDHA", "and", "ACTIN", "protein", "levels", "from", "lysates", "of", "B16", "-", "F10", "cells", "(", "n", "=", "4", ")", "or", "B16", "-", "F10", "tumors", "[", "CntlKD", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "BNIP3KD", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "ATG5KD", "(", "n", "=", "7", ")", "]", ")", ".", "The", "HIF", "-", "1α", "-", "OH", "/", "HIF", "-", "1α", "ratio", "is", "shown", "in", "a", "bar", "graph", "below", ".", "Densitometric", "quantifications", "relative", "to", "ACTIN", "levels", "are", "shown", "below", "each", "corresponding", "band", ".", "Analysis", "was", "performed", "as", "indicated", "in", "the", "Data", "Information", "section", ",", "unless", "for", "HIF", "-", "1α", "/", "Actin", "ratio", "(", "in", "vivo", ")", ",", "which", "was", "analyzed", "with", "Kruskal", "-", "Wallis", "non", "-", "parametric", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "and", "LDHA", "/", "Actin", "ratio", "for", "shATG5", "condition", "(", "in", "vitro", ")", ",", "which", "was", "analyzed", "with", "Wilcoxon", "'", "s", "rank", "test", ".", "Immunohistochemical", "staining", "for", "HIF", "-", "1α", "(", "brown", ")", "representative", "from", "CntlKD", ",", "BNIP3KD", "and", "ATG5KD", ",", "B16", "-", "F10", "tumor", "tissues", ".", "Higher", "magnification", "of", "the", "highlighted", "(", "with", "a", "white", "square", ")", "stained", "sections", "is", "shown", "below", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunoblot detection of Hydroxylated HIF-1α (HIF-1α-OH), total HIF-1α, LDHA and ACTIN protein levels from lysates of B16-F10 cells (n=4) or B16-F10 tumors [CntlKD (n=5), BNIP3KD (n=5) and ATG5KD (n=7)]). The HIF-1α-OH /HIF-1α ratio is shown in a bar graph below. Densitometric quantifications relative to ACTIN levels are shown below each corresponding band. Analysis was performed as indicated in the Data Information section, unless for HIF-1α/Actin ratio (in vivo), which was analyzed with Kruskal-Wallis non-parametric test with Dunn's multiple comparisons test, and LDHA/Actin ratio for shATG5 condition (in vitro), which was analyzed with Wilcoxon's rank test.Immunohistochemical staining for HIF-1α (brown) representative from CntlKD, BNIP3KD and ATG5KD, B16-F10 tumor tissues. Higher magnification of the highlighted (with a white square) stained sections is shown below."}
{"words": ["Figure", "5Immunoblot", "detection", "of", "Hydroxylated", "HIF", "-", "1α", "(", "HIF", "-", "1α", "-", "OH", ")", ",", "total", "HIF", "-", "1α", ",", "LDHA", ",", "PHD2", "and", "ACTIN", "protein", "levels", "from", "normoxic", "lysates", "of", "B16", "-", "F10", "cells", "transfected", "in", "presence", "of", "non", "-", "targeting", "siRNA", "sequences", "(", "Scr", ")", "or", "siRNA", "against", "PHD2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Immunoblot detection of Hydroxylated HIF-1α (HIF-1α-OH), total HIF-1α, LDHA, PHD2 and ACTIN protein levels from normoxic lysates of B16-F10 cells transfected in presence of non-targeting siRNA sequences (Scr) or siRNA against PHD2."}
{"words": ["Figure", "6Relative", "intracellular", "Fe2", "+", "levels", "in", "normoxic", "B16", "-", "F10", "cells", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Representative", "pictures", "of", "FerroOrange", "intensity", "are", "shown", "on", "the", "left", "and", "analyzed", "using", "a", "RM", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "Geisser", "-", "Greenhouse", "correction", ")", "with", "Holm", "-", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Scale", "bars", "represent", "50µm", ".", "Immunoblot", "detection", "of", "Hydroxylated", "HIF", "-", "1α", "(", "HIF", "-", "1α", "-", "OH", ")", ",", "total", "HIF", "-", "1α", ",", "LDHA", ",", "NCOA4", "and", "ACTIN", "levels", "from", "normoxic", "lysates", "of", "B16", "-", "F10", "cells", "transfected", "in", "presence", "of", "non", "-", "targeting", "siRNA", "sequences", "(", "Scr", ")", "or", "siRNA", "against", "NCOA4", "(", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Relative intracellular Fe2+ levels in normoxic B16-F10 cells (n=4). Representative pictures of FerroOrange intensity are shown on the left and analyzed using a RM one-way ANOVA (Geisser-Greenhouse correction) with Holm-Sidak's multiple comparisons test. Scale bars represent 50µm.Immunoblot detection of Hydroxylated HIF-1α (HIF-1α-OH), total HIF-1α, LDHA, NCOA4 and ACTIN levels from normoxic lysates of B16-F10 cells transfected in presence of non-targeting siRNA sequences (Scr) or siRNA against NCOA4 (n=4)."}
{"words": ["Figure", "7Growth", "curves", "of", "B16", "-", "F10", "tumors", "generated", "by", "shCntl", "or", "shBNIP3", "cells", "expressing", "Luciferase", "(", "Luc", ")", "or", "an", "undegradable", "HIF", "-", "1α", "(", "HIF", "-", "1α", "-", "AA", ")", "construct", "(", "n", "=", "7", "for", "CntlKD", "Luc", "/", "BNIP3KD", "HIF", "-", "1α", "-", "AA", ",", "n", "=", "8", "CntlKD", "HIF", "-", "1α", "-", "AA", "and", "n", "=", "5", "for", "BNIP3KD", "Luc", ")", "and", "analyzed", "with", "a", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Representative", "double", "immunostaining", "for", "CD31", "and", "αSMA", "in", "B16", "-", "F10", "tumors", "(", "n", "=", "5", "per", "condition", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "50µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Growth curves of B16-F10 tumors generated by shCntl or shBNIP3 cells expressing Luciferase (Luc) or an undegradable HIF-1α (HIF-1α-AA) construct (n=7 for CntlKD Luc/BNIP3KD HIF-1α-AA, n=8 CntlKD HIF-1α-AA and n=5 for BNIP3KD Luc) and analyzed with a two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. Representative double immunostaining for CD31 and αSMA in B16-F10 tumors (n=5 per condition). Scale bars represent 50µm."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "200", "nM", "siRNAs", "per", "well", ".", "After", "24", "h", ",", "the", "cells", "were", "infected", "with", "HIV", "-", "luc", "/", "2019", "-", "nCoV", "pseudoviruses", ".", "After", "washing", "and", "incubation", "with", "fresh", "medium", "for", "48", "h", ",", "the", "intracellular", "luciferase", "activity", "was", "measured", ".", "Ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "this", "analysis", ".", "The", "results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "and", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.HEK293T cells were transfected with 200 nM siRNAs per well. After 24 h, the cells were infected with HIV-luc/2019-nCoV pseudoviruses. After washing and incubation with fresh medium for 48 h, the intracellular luciferase activity was measured. Ordinary one-way ANOVA test was used for this analysis. The results are shown as the mean and SEM. *P< 0.05."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "assay", ".", "B", ",", "Teicoplanin", "inhibit", "the", "entry", "of", "2019", "-", "nCoV", "and", "SARS", "-", "nCoV", ".", "Chemical", "structure", "of", "teicoplanin", "(", "Left", ")", ".", "A549", "cells", "were", "seeded", "in", "a", "96", "-", "well", "plate", ",", "and", "24", "h", "later", ",", "the", "cells", "were", "infected", "with", "HIV", "-", "luc", "/", "2019", "-", "nCoV", ",", "HIV", "-", "luc", "/", "SARS", "-", "nCoV", "or", "HIV", "-", "luc", "/", "VSVG", "pseudoviruses", ".", "After", "washing", "and", "incubation", "with", "fresh", "medium", "for", "48", "h", ",", "the", "intracellular", "luciferase", "activity", "was", "measured", ".", "Ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "this", "analysis", ".", "The", "results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "and", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "C", ",", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "HIV", "-", "luc", "/", "2019", "-", "nCoV", "pseudoviruses", "and", "then", "incubated", "with", "teicoplanin", "at", "various", "concentrations", ".", "The", "intracellular", "luciferase", "activity", "was", "measured", "at", "48", "h", "post", "-", "infection", ".", "The", "IC50", "was", "calculated", "using", "GraphPad", "Prism", "software", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.assay.B, Teicoplanin inhibit the entry of 2019-nCoV and SARS-nCoV. Chemical structure of teicoplanin (Left). A549 cells were seeded in a 96-well plate, and 24 h later, the cells were infected with HIV-luc/2019-nCoV, HIV-luc/SARS-nCoV or HIV-luc/VSVG pseudoviruses. After washing and incubation with fresh medium for 48 h, the intracellular luciferase activity was measured. Ordinary one-way ANOVA test was used for this analysis. The results are shown as the mean and SEM. *P< 0.05.C, A549 cells were infected with HIV-luc/2019-nCoV pseudoviruses and then incubated with teicoplanin at various concentrations. The intracellular luciferase activity was measured at 48 h post-infection. The IC50 was calculated using GraphPad Prism software."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "types", ".", "A", ",", "HEK293T", "cells", "were", "infected", "with", "HIV", "-", "luc", "/", "2019", "-", "nCoV", "pseudoviruses", "and", "then", "incubated", "with", "teicoplanin", "at", "various", "concentrations", ".", "The", "intracellular", "luciferase", "activity", "was", "measured", "at", "48", "h", "post", "-", "infection", ".", "The", "IC50", "was", "calculated", "using", "GraphPad", "Prism", "software", ".", "Bsoftware", ".", "B", ",", "Huh7", "cells", "were", "infected", "with", "HIV", "-", "luc", "/", "2019", "-", "nCoV", "pseudoviruses", "and", "then", "incubated", "with", "teicoplanin", "at", "various", "concentrations", ".", "The", "intracellular", "luciferase", "activity", "was", "measured", "at", "48", "h", "post", "-", "infection", ".", "The", "IC50", "was", "calculated", "using", "GraphPad", "Prism", "software", ".", "CA549", "cells", "were", "incubated", "with", "dalbavancin", "(", "D", ")", "at", "various", "concentrations", "and", "infected", "with", "HIV", "-", "luc", "/", "2019", "-", "nCoV", "pseudoviruses", ".", "The", "intracellular", "luciferase", "activity", "was", "measured", "at", "48", "h", "post", "-", "infection", ".", "Ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "this", "analysis", ".", "dalbavancinD", ",", "A549", "cells", "were", "incubated", "with", "vancomycin", "at", "various", "concentrations", "and", "infected", "with", "HIV", "-", "luc", "/", "2019", "-", "nCoV", "pseudoviruses", ".", "The", "intracellular", "luciferase", "activity", "was", "measured", "at", "48", "h", "post", "-", "infection", ".", "Ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "this", "analysis", ".", "Left", ":", "Chemical", "structure", "of"], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.types.A, HEK293T cells were infected with HIV-luc/2019-nCoV pseudoviruses and then incubated with teicoplanin at various concentrations. The intracellular luciferase activity was measured at 48 h post-infection. The IC50 was calculated using GraphPad Prism software.Bsoftware.B, Huh7 cells were infected with HIV-luc/2019-nCoV pseudoviruses and then incubated with teicoplanin at various concentrations. The intracellular luciferase activity was measured at 48 h post-infection. The IC50 was calculated using GraphPad Prism software.CA549 cells were incubated with dalbavancin (D) at various concentrations and infected with HIV-luc/2019-nCoV pseudoviruses. The intracellular luciferase activity was measured at 48 h post-infection. Ordinary one-way ANOVA test was used for this analysis. dalbavancinD, A549 cells were incubated with vancomycin at various concentrations and infected with HIV-luc/2019-nCoV pseudoviruses. The intracellular luciferase activity was measured at 48 h post-infection. Ordinary one-way ANOVA test was used for this analysis. Left: Chemical structure of vancomycin"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "NIH3T3", "fibroblasts", "co", "-", "expressing", "DsRed", "-", "CA7", "and", "EGFP", "-", "CA2", "(", "n", "=", "4", "independent", "replicates", ")", ".", "(", "B", "-", "E", ")", "Co", "-", "localization", "of", "EGFP", "and", "the", "two", "CA", "isoforms", "with", "filamentous", "actin", "studied", "in", "fibroblasts", "expressing", "(", "B", ")", "EGFP", ",", "(", "C", ")", "EGFP", "-", "CA2", ",", "or", "(", "D", ",", "E", ")", "EGFP", "-", "CA7", "and", "stained", "with", "phalloidin", "-", "594", "to", "visualize", "F", "-", "actin", "(", "n", "=", "4", ",", "10", "and", "8", "independent", "replicates", ",", "respectively", ")", ".", "A", "magnification", "of", "the", "area", "marked", "with", "the", "yellow", "rectangle", "in", "(", "C", ")", "and", "(", "D", ")", "shows", "the", "localization", "of", "EGFP", "-", "CA2", "and", "EGFP", "-", "CA7", "compared", "to", "phalloidin", "-", "594", ".", "(", "E", ")", "EGFP", "-", "CA7", "caused", "a", "prominent", "overexpression", "phenotype", "with", "thick", "and", "curvy", "cytosolic", "actin", "bundles", "(", "arrow", ")", "and", "plasmalemmal", "protrusions", "(", "arrowhead", ")", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "The", "normalized", "fluorescence", "emission", "intensity", "profiles", "for", "F", "-", "actin", "(", "red", "line", ")", "and", "(", "F", ")", "EGFP", ",", "(", "G", ")", "EGFP", "-", "CA2", ",", "or", "(", "H", ")", "EGFP", "-", "CA7", "(", "black", "line", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) NIH3T3 fibroblasts co-expressing DsRed-CA7 and EGFP-CA2 (n = 4 independent replicates).(B-E) Co-localization of EGFP and the two CA isoforms with filamentous actin studied in fibroblasts expressing (B) EGFP, (C) EGFP-CA2, or (D, E) EGFP-CA7 and stained with phalloidin-594 to visualize F-actin (n = 4, 10 and 8 independent replicates, respectively). A magnification of the area marked with the yellow rectangle in (C) and (D) shows the localization of EGFP-CA2 and EGFP-CA7 compared to phalloidin-594. (E) EGFP-CA7 caused a prominent overexpression phenotype with thick and curvy cytosolic actin bundles (arrow) and plasmalemmal protrusions (arrowhead).(F-H) The normalized fluorescence emission intensity profiles for F-actin (red line) and (F) EGFP, (G) EGFP-CA2, or (H) EGFP-CA7 (black line)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Actin", "co", "-", "sedimentation", "assay", "shows", "that", "CA7", "binds", "to", "F", "-", "actin", ".", "The", "binding", "is", "enhanced", "at", "more", "acidic", "pH", "(", "6", ".", "5", "vs", ".", "7", ".", "4", ")", "n", "=", "3", "independent", "replicates", "at", "each", "actin", "concentration", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "Fluorescence", "time", "‐", "lapse", "images", "of", "F", "-", "actin", "bundling", "in", "an", "in", "vitro", "bundling", "assay", ".", "A", "mixture", "of", "unlabeled", "and", "Rhodamine", "labelled", "non", "-", "muscle", "actin", "was", "polymerized", "in", "the", "absence", "(", "PBS", "control", ",", "upper", "panel", ")", "or", "presence", "of", "mCA7", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Numbers", "in", "images", "indicate", "the", "time", "after", "the", "onset", "of", "the", "experiment", "(", "0", ",", "5", "and", "23", "min", ")", ".", "Intensity", "based", "Fire", "-", "coloring", "(", "Fiji", ")", "was", "used", "to", "visualize", "intensity", "changes", ".", "Scale", "bar", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "mean", "increase", "in", "filament", "length", "(", "n", "=", "10", "filaments", "at", "each", "time", "point", ")", "and", "the", "mean", "relative", "fluorescence", "intensity", "values", "of", "cross", "-", "sections", "for", "individual", "filaments", "/", "bundles", "(", "n", "=", "30", "-", "31", ")", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "mCA7", "(", "1", ".", "12", "µM", ")", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "using", "a", "general", "mixed", "model", "with", "time", "as", "a", "within", "-", "unit", "factor", "and", "the", "presence", "of", "CA7", "as", "a", "between", "-", "unit", "factor", ".", "n", "=", "3", "independent", "repetitions", ",", "experiment", "repeats", "were", "included", "as", "a", "covariate", "and", "were", "non", "-", "significant", ".", "(", "D", ")", "Kymographs", "showing", "different", "time", "points", "in", "the", "line", "of", "interest", "(", "line", "width", "1", "µm", ")", "from", "the", "experiments", "analyzed", "in", "(", "C", ")", ".", "Kymographs", "were", "generated", "with", "Fiji", "Multi", "Kymograph", "function", ".", "Total", "time", "is", "159", "frames", "=", "26", ".", "5", "minutes", ".", "Scale", "bar", "5", "μm", "(", "full", "height", "is", "20", "μm", ")", ".", "F", "-", "actin", "bundles", "can", "be", "detected", "as", "clear", "lines", "in", "kymographs", ".", "(", "E", ")", "Fluorescence", "time", "‐", "lapse", "images", "of", "F", "-", "actin", "bundling", "in", "an", "in", "vitro", "bundling", "assay", ".", "A", "mixture", "of", "unlabeled", "and", "Rhodamine", "labelled", "non", "-", "muscle", "actin", "was", "polymerized", "in", "the", "presence", "of", "mCA7", "(", "0", ".", "11", "µM", ")", ".", "Numbers", "above", "images", "indicate", "the", "time", "after", "the", "onset", "of", "the", "experiment", "(", "22", "min", "-", "23", "min", "20", "sec", ")", ".", "Intensity", "based", "Fire", "-", "coloring", "(", "Fiji", ")", "was", "used", "to", "visualize", "intensity", "changes", ".", "White", "arrows", "highlight", "the", "bundling", "filaments", ".", "Scale", "bar", "5", "μm", ".", "This", "is", "a", "representative", "video", "from", "8", "similar", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Actin co-sedimentation assay shows that CA7 binds to F-actin. The binding is enhanced at more acidic pH (6.5 vs. 7.4) n = 3 independent replicates at each actin concentration, two-way ANOVA, P < 0.001.(B) Fluorescence time‐lapse images of F-actin bundling in an in vitro bundling assay. A mixture of unlabeled and Rhodamine labelled non-muscle actin was polymerized in the absence (PBS control, upper panel) or presence of mCA7 (lower panel). Numbers in images indicate the time after the onset of the experiment (0, 5 and 23 min). Intensity based Fire-coloring (Fiji) was used to visualize intensity changes. Scale bar 10 µm. (C) Quantification of the mean increase in filament length (n = 10 filaments at each time point) and the mean relative fluorescence intensity values of cross-sections for individual filaments /bundles (n = 30 - 31) in the absence and presence of mCA7 (1.12 µM). The data were analyzed using a general mixed model with time as a within-unit factor and the presence of CA7 as a between-unit factor. n = 3 independent repetitions, experiment repeats were included as a covariate and were non-significant. (D) Kymographs showing different time points in the line of interest (line width 1 µm) from the experiments analyzed in (C). Kymographs were generated with Fiji Multi Kymograph function. Total time is 159 frames = 26.5 minutes. Scale bar 5 μm (full height is 20 μm). F-actin bundles can be detected as clear lines in kymographs.(E) Fluorescence time‐lapse images of F-actin bundling in an in vitro bundling assay. A mixture of unlabeled and Rhodamine labelled non-muscle actin was polymerized in the presence of mCA7 (0.11 µM). Numbers above images indicate the time after the onset of the experiment (22 min -23 min 20 sec). Intensity based Fire-coloring (Fiji) was used to visualize intensity changes. White arrows highlight the bundling filaments. Scale bar 5 μm. This is a representative video from 8 similar experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ")", "NIH3T3", "cells", "transfected", "with", "DsRed", "(", "A", ")", "or", "DsRed", "-", "CA7", "(", "B", ")", "were", "incubated", "in", "growth", "medium", "with", "5", "µM", "Latrunculin", "B", "for", "0", ",", "2", ",", "5", ",", "10", ",", "or", "30", "minutes", ",", "or", "in", "an", "equal", "amount", "of", "DMSO", "for", "60", "minutes", ".", "Analyses", "of", "experiments", "show", "that", "in", "cells", "transfected", "with", "DsRed", "-", "CA7", "F", "-", "actin", "structures", "collapse", "more", "slowly", "(", "0", "min", ":", "83", "%", "\"", "normal", "\"", ";", "2", "min", ":", "80", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "44", ";", "5", "min", ":", "74", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "39", ";", "10", "min", ":", "27", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "08", ";", "30", "min", ":", "16", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "02", ";", "DMSO", ":", "82", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "99", ";", "tested", "against", "0", "min", "with", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", "than", "in", "the", "DsRed", "-", "transfected", "ones", "(", "0", "min", ":", "89", "%", "\"", "normal", "\"", ";", "2", "min", ":", "48", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "14", ";", "5", "min", ":", "31", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "04", ";", "10", "min", ":", "2", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "001", ";", "30", "min", ":", "0", ".", "7", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "001", ";", "DMSO", ":", "88", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "8", ";", "tested", "against", "0", "min", "with", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "For", "the", "analysis", ",", "cells", "were", "categorized", "to", "three", "groups", "as", "\"", "normal", "\"", ",", "\"", "some", "shape", "/", "F", "-", "actin", "left", "\"", "and", "\"", "round", "\"", ".", "The", "upper", "panel", "shows", "example", "images", "of", "the", "cells", "in", "all", "three", "categories", "for", "(", "A", ")", "DsRed", "-", "or", "(", "B", ")", "DsRed", "-", "CA7", "transfected", "cells", "(", "actin", "visualized", "with", "Phalloidin", "-", "488", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A,B) NIH3T3 cells transfected with DsRed (A) or DsRed-CA7 (B) were incubated in growth medium with 5 µM Latrunculin B for 0, 2, 5, 10, or 30 minutes, or in an equal amount of DMSO for 60 minutes. Analyses of experiments show that in cells transfected with DsRed-CA7 F-actin structures collapse more slowly (0 min: 83% \"normal\"; 2 min: 80%, p = 0.44; 5 min: 74%, p = 0.39; 10 min: 27%, p = 0.08; 30 min: 16%, p = 0.02; DMSO: 82%, p = 0.99; tested against 0 min with two-way ANOVA, Dunnett's multiple comparison test) than in the DsRed-transfected ones (0 min: 89% \"normal\"; 2 min: 48%, p = 0.14; 5 min: 31%, p = 0.04; 10 min: 2%, p = 0.001; 30 min: 0.7%, p = 0.001; DMSO: 88%, p = 0.8; tested against 0 min with two-way ANOVA, Dunnett's multiple comparison test) . For the analysis, cells were categorized to three groups as \"normal\", \"some shape/F-actin left\" and \"round\". The upper panel shows example images of the cells in all three categories for (A) DsRed- or (B) DsRed-CA7 transfected cells (actin visualized with Phalloidin-488)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "NIH3T3", "fibroblasts", "expressing", "EGFP", "-", "CA7", "-", "mutant1", "(", "A", ")", ",", "EGFP", "-", "CA7", "-", "mutant2", "(", "B", ")", ",", "and", "EGFP", "-", "CA7", "-", "mutant3", "(", "C", ")", ".", "F", "-", "actin", "is", "visualized", "with", "Phalloidin", "-", "594", ".", "In", "the", "right", "-", "most", "panel", "of", "(", "A", "-", "C", ")", "are", "the", "normalized", "fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "the", "mutated", "CA7", "EGFP", "signal", "(", "black", ")", "and", "actin", "(", "red", ")", "and", "the", "yellow", "line", "in", "left", "-", "most", "panels", "indicates", "the", "cross", "-", "section", "from", "which", "the", "pixel", "intensities", "were", "measured", ".", "Scale", "bars", "20", "µm", ".", "(", "D", ")", "Analysis", "of", "the", "mutated", "CA7", "and", "F", "-", "actin", "co", "-", "localization", "in", "cultured", "fibroblasts", ".", "Scatterplots", "of", "fluorescent", "intensities", "per", "pixel", "(", "EGFP", "vs", ".", "Phalloidin", "-", "594", ")", "along", "a", "cross", "section", "through", "a", "representative", "cell", ".", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "(", "r", ")", "for", "the", "analyzed", "cell", "is", "given", "in", "each", "panel", ".", "(", "E", ")", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "values", "calculated", "for", "the", "depicted", "constructs", "and", "compared", "to", "CA7", ".", "F", "-", "actin", "had", "a", "strong", "positive", "correlation", "coefficient", "with", "EGFP", "-", "CA7", "(", "r", "=", "0", ".", "91", "±", "0", ".", "02", ",", "n", "=", "26", "cells", ")", ".", "Neither", "EGFP", "alone", "(", "r", "=", "0", ".", "01", "±", "0", ".", "03", ",", "n", "=", "56", ")", "nor", "EGFP", "-", "CA2", "(", "r", "=", "0", ".", "09", "±", "0", ".", "03", ",", "n", "=", "53", ")", "co", "-", "localized", "with", "F", "-", "actin", "(", "P", "<", "0", ".", "0001", "for", "both", "constructs", ",", "when", "compared", "to", "CA7", ")", ".", "From", "the", "five", "mutated", "CA7", "constructs", ",", "EGFP", "-", "CA7", "-", "mutant1", "(", "r", "=", "0", ".", "51", "±", "0", ".", "04", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "25", ")", "and", "EGFP", "-", "CA7", "-", "mutant3", "(", "r", "=", "0", ".", "72", "±", "0", ".", "03", ",", "P", "=", "0", ".", "05", ",", "n", "=", "21", ")", "co", "-", "localized", "less", "with", "F", "-", "actin", "actin", "when", "compared", "to", "CA7", ".", "The", "co", "-", "localization", "of", "the", "other", "four", "mutated", "CA7", "constructs", ",", "EGFP", "-", "CA7", "-", "mutant2", "(", "r", "=", "0", ".", "92", "±", "0", ".", "02", ",", "P", "=", "0", ".", "99", ",", "n", "=", "18", ")", ",", "EGFP", "-", "CA7", "-", "R223E", "(", "r", "=", "0", ".", "86", "±", "0", ".", "02", ",", "P", "=", "0", ".", "99", ",", "n", "=", "24", ")", "and", "EGFP", "-", "CA7", "-", "H96", "/", "98C", "(", "r", "=", "0", ".", "79", "±", "0", ".", "04", ",", "P", "=", "0", ".", "14", ",", "n", "=", "18", ")", "did", "not", "differ", "significantly", "from", "that", "of", "CA7", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "did", "not", "pass", "Shapiro", "-", "Wilk", "test", "for", "normality", ",", "statistical", "comparison", "against", "CA7", "was", "done", "with", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", "corrected", "for", "multiple", "comparisons", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) NIH3T3 fibroblasts expressing EGFP-CA7-mutant1 (A), EGFP-CA7-mutant2 (B), and EGFP-CA7-mutant3 (C). F-actin is visualized with Phalloidin-594. In the right-most panel of (A-C) are the normalized fluorescence intensity profiles of the mutated CA7 EGFP signal (black) and actin (red) and the yellow line in left-most panels indicates the cross-section from which the pixel intensities were measured. Scale bars 20 µm.(D) Analysis of the mutated CA7 and F-actin co-localization in cultured fibroblasts. Scatterplots of fluorescent intensities per pixel (EGFP vs. Phalloidin-594) along a cross section through a representative cell. Pearson's correlation coefficient (r) for the analyzed cell is given in each panel.(E) Pearson's correlation coefficient values calculated for the depicted constructs and compared to CA7. F-actin had a strong positive correlation coefficient with EGFP-CA7 (r = 0.91 ± 0.02, n = 26 cells). Neither EGFP alone (r = 0.01 ± 0.03, n = 56) nor EGFP-CA2 (r = 0.09 ± 0.03, n = 53) co-localized with F-actin (P < 0.0001 for both constructs, when compared to CA7). From the five mutated CA7 constructs, EGFP-CA7-mutant1 (r= 0.51 ± 0.04, P < 0.0001, n = 25) and EGFP-CA7-mutant3 (r = 0.72 ± 0.03, P = 0.05, n = 21) co-localized less with F-actin actin when compared to CA7. The co-localization of the other four mutated CA7 constructs, EGFP-CA7-mutant2 (r = 0.92 ± 0.02, P = 0.99, n = 18), EGFP-CA7-R223E (r = 0.86 ± 0.02, P = 0.99, n = 24) and EGFP-CA7-H96/98C (r = 0.79 ± 0.04, P = 0.14, n = 18) did not differ significantly from that of CA7. Data are shown as mean ± SEM. Data did not pass Shapiro-Wilk test for normality, statistical comparison against CA7 was done with Kruskall-Wallis test corrected for multiple comparisons."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Isoform", "-", "specific", "subcellular", "localization", "shown", "in", "cultured", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV14", ")", "co", "-", "expressing", "DsRed", "-", "CA7", "(", "left", ")", "and", "EGFP", "-", "CA2", "(", "middle", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "precocious", "in", "vivo", "expression", "of", "(", "B", ")", "EGFP", "-", "CA2", "and", "(", "C", ")", "EGFP", "-", "CA7", "in", "P40", "mouse", "cortical", "layer", "2", "/", "3", "pyramidal", "neurons", ".", "Neurons", "were", "transfected", "at", "E14", ".", "5", "with", "EGFP", "-", "CA2", "or", "EGFP", "-", "CA7", "using", "in", "utero", "electroporation", "and", "images", "were", "taken", "from", "fixed", "slices", ".", "Right", "panels", "in", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", "show", "higher", "magnification", "of", "the", "primary", "apical", "dendrite", "marked", "with", "a", "box", ".", "(", "D", ")", "The", "expression", "of", "EGFP", "-", "CA7", "disrupted", "the", "normal", "spine", "morphology", "and", "induced", "the", "formation", "of", "thick", ",", "filopodia", "-", "like", "protrusions", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Isoform-specific subcellular localization shown in cultured hippocampal neurons (DIV14) co-expressing DsRed-CA7 (left) and EGFP-CA2 (middle).(B,C) Representative confocal images of precocious in vivo expression of (B) EGFP-CA2 and (C) EGFP-CA7 in P40 mouse cortical layer 2/3 pyramidal neurons. Neurons were transfected at E14.5 with EGFP-CA2 or EGFP-CA7 using in utero electroporation and images were taken from fixed slices. Right panels in (B) and (C) show higher magnification of the primary apical dendrite marked with a box. (D) The expression of EGFP-CA7 disrupted the normal spine morphology and induced the formation of thick, filopodia-like protrusions. "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Comparison", "of", "mEPSCs", "in", "cortical", "layer", "2", "/", "3", "pyramidal", "neurons", "from", "P30", "-", "P40", "WT", "and", "CA7", "KO", "mice", ".", "Sample", "traces", "of", "mEPSC", "recordings", "from", "WT", "and", "CA7", "KO", "neurons", ",", "low", "-", "pas", "filtered", "at", "1", "kHz", "(", "left", ")", ".", "The", "data", "are", "summarized", "in", "the", "bar", "diagrams", "(", "right", ")", ".", "mEPSC", "frequency", "(", "P", "=", "0", ".", "63", ")", "and", "amplitude", "(", "P", "=", "0", ".", "90", ")", "were", "not", "significantly", "different", "between", "WT", "and", "CA7", "KO", "and", "neurons", "(", "n", "=", "7", "and", "5", "neurons", ",", "respectively", ",", "Student", "'", "s", "independent", "samples", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "apical", "dendrites", "from", "Lucifer", "Yellow", "injected", "cortical", "layer", "2", "/", "3", "pyramidal", "neurons", "from", "WT", "and", "CA7", "KO", "mice", ".", "The", "dendritic", "spine", "density", "and", "spine", "head", "size", "were", "examined", "in", "fixed", "slice", "preparations", "from", "P34", "-", "P37", "mice", ".", "Scale", "bar", "2", "µm", ".", "(", "C", ")", "Summary", "of", "the", "spine", "density", "analysis", "done", "from", "the", "Lucifer", "Yellow", "injected", "neurons", ".", "Spine", "density", "was", "a", "higher", "in", "CA7", "KO", "neurons", "both", "in", "apical", "and", "basal", "dendrites", "(", "n", "=", "28", "neurons", "for", "both", ")", "compared", "to", "WT", "(", "n", "=", "29", "neurons", "for", "apical", "and", "n", "=", "30", "for", "basal", "dendrite", "analysis", ")", "(", "P", "=", "0", ".", "000002", "for", "apical", "dendrites", ",", "analyzed", "with", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "and", "P", "=", "6", ",", "8", "x", "10", "-", "8", "for", "basal", "dendrites", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Welch", "-", "correction", ".", ")", "A", "total", "of", "8279", "spines", "were", "analyzed", "from", "four", "CA7", "KO", "mice", "and", "8730", "spines", "from", "two", "WT", "control", "mice", ".", "(", "D", ")", "The", "spine", "head", "width", "distribution7differed", "significantly", "between", "the", "genotypes", "(", "n", "=", "467", "spines", "from", "WT", "and", "n", "=", "421", "spines", "from", "CA7", "KO", "animals", ",", "15", "neurons", "analyzed", "from", "both", "genotypes", ",", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", "with", "continuity", "correction", ",", "W", "=", "134540", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Comparison of mEPSCs in cortical layer 2/3 pyramidal neurons from P30 - P40 WT and CA7 KO mice. Sample traces of mEPSC recordings from WT and CA7 KO neurons, low-pas filtered at 1 kHz (left). The data are summarized in the bar diagrams (right). mEPSC frequency (P = 0.63) and amplitude (P = 0.90) were not significantly different between WT and CA7 KO and neurons (n = 7 and 5 neurons, respectively, Student's independent samples t-test).(B) Representative confocal images of apical dendrites from Lucifer Yellow injected cortical layer 2/3 pyramidal neurons from WT and CA7 KO mice. The dendritic spine density and spine head size were examined in fixed slice preparations from P34 - P37 mice. Scale bar 2 µm.(C) Summary of the spine density analysis done from the Lucifer Yellow injected neurons. Spine density was a higher in CA7 KO neurons both in apical and basal dendrites (n = 28 neurons for both) compared to WT (n= 29 neurons for apical and n=30 for basal dendrite analysis) (P = 0.000002 for apical dendrites, analyzed with Mann-Whitney test, and P = 6,8 x 10-8 for basal dendrites, Student's t-test with Welch-correction.) A total of 8279 spines were analyzed from four CA7 KO mice and 8730 spines from two WT control mice.(D) The spine head width distribution7differed significantly between the genotypes (n= 467 spines from WT and n = 421 spines from CA7 KO animals, 15 neurons analyzed from both genotypes, Wilcoxon rank sum test with continuity correction, W = 134540, P < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "1MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "were", "intravenously", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "2", "×", "108", "PFU", "/", "mouse", ")", ",", "and", "serum", "samples", "were", "collected", "at", "12", "hpi", "(", "hours", "post", "-", "infection", ")", ".", "(", "A", ")", "Virus", "titer", "was", "analyzed", "in", "a", "plaque", "assay", ".", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "were", "intravenously", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "2", "×", "108", "PFU", "/", "mouse", ")", ",", "and", "serum", "samples", "were", "collected", "at", "12", "hpi", "(", "hours", "post", "-", "infection", ")", ".", "(", "B", ")", "Secretion", "of", "IFN", "-", "β", ",", "IL", "-", "6", ",", "IL", "-", "12", ",", "and", "TNFα", "was", "measured", "in", "specific", "ELISAs", ".", "C", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "6", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "6", ")", "mice", "were", "intravenously", "injected", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "200", "μg", "/", "mouse", ")", ".", "Serum", "samples", "were", "collected", "at", "2", "hpi", "and", "secretion", "of", "IFN", "-", "β", ",", "IL", "-", "6", ",", "IL", "-", "12", ",", "and", "TNFα", "was", "measured", "in", "specific", "ELISAs", ".", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "were", "intraperitoneally", "challenged", "with", "1", "×", "106", "CFU", "of", "Listeria", "monocytogenes", ".", "(", "D", ")", "The", "percentage", "of", "surviving", "mice", "(", "D", ",", "log", "-", "rank", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "were", "intraperitoneally", "challenged", "with", "1", "×", "106", "CFU", "of", "Listeria", "monocytogenes", ".", "body", "weight", "changes", "for", "each", "group", "(", "E", ")", "are", "shown", ".", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "were", "intraperitoneally", "challenged", "with", "1", "×", "106", "CFU", "of", "Listeria", "monocytogenes", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "At", "3", "dpc", ",", "the", "bacterial", "load", "in", "the", "spleen", "(", "F", ")", "and", "liver", "(", "G", ")", "was", "examined", ".", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "were", "intraperitoneally", "challenged", "with", "1", "×", "106", "CFU", "of", "Listeria", "monocytogenes", ".", "(", "H", "-", "J", ")", "Amount", "of", "IL", "-", "6", ",", "IL", "-", "12", ",", "CCL5", ",", "and", "CXCL10", "in", "serum", "(", "H", ")", ",", "spleen", "(", "I", ")", ",", "and", "liver", "(", "J", ")", "of", "mice", "in", "each", "group", "at", "24", "hpc", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1MARCH2+/+ (n = 8) or MARCH2-/- (n = 8) mice were intravenously infected with VSV-GFP (2 × 108 PFU/mouse), and serum samples were collected at 12 hpi (hours post-infection). (A) Virus titer was analyzed in a plaque assay.MARCH2+/+ (n = 8) or MARCH2-/- (n = 8) mice were intravenously infected with VSV-GFP (2 × 108 PFU/mouse), and serum samples were collected at 12 hpi (hours post-infection). (B) Secretion of IFN-β, IL-6, IL-12, and TNFα was measured in specific ELISAs.C MARCH2+/+ (n = 6) or MARCH2-/- (n = 6) mice were intravenously injected with poly(I:C) (200 μg/mouse). Serum samples were collected at 2 hpi and secretion of IFN-β, IL-6, IL-12, and TNFα was measured in specific ELISAs.MARCH2+/+ (n = 8) or MARCH2-/- (n = 8) mice were intraperitoneally challenged with 1 × 106 CFU of Listeria monocytogenes. (D) The percentage of surviving mice (D, log-rank test, **P < 0.01)MARCH2+/+ (n = 8) or MARCH2-/- (n = 8) mice were intraperitoneally challenged with 1 × 106 CFU of Listeria monocytogenes. body weight changes for each group (E) are shown.MARCH2+/+ (n = 8) or MARCH2-/- (n = 8) mice were intraperitoneally challenged with 1 × 106 CFU of Listeria monocytogenes. (F, G) At 3 dpc, the bacterial load in the spleen (F) and liver (G) was examined.MARCH2+/+ (n = 8) or MARCH2-/- (n = 8) mice were intraperitoneally challenged with 1 × 106 CFU of Listeria monocytogenes. (H-J) Amount of IL-6, IL-12, CCL5, and CXCL10 in serum (H), spleen (I), and liver (J) of mice in each group at 24 hpc."}
{"words": ["Figure", "2MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "were", "challenged", "intraperitoneally", "with", "LPS", "(", "24", "mg", "/", "kg", ")", ".", "Percentage", "of", "surviving", "mice", "(", "A", ",", "log", "-", "rank", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "were", "challenged", "intraperitoneally", "with", "LPS", "(", "24", "mg", "/", "kg", ")", ".", "body", "weight", "changes", "(", "B", ")", "in", "each", "groups", ".", "C", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "4", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", "were", "challenged", "intraperitoneally", "with", "LPS", "(", "24", "mg", "/", "kg", ")", ".", "Representing", "slides", "of", "H", "&", "E", "staining", "of", "spleen", "sections", "from", "each", "group", ".", "Scale", "bar", ",", "6mm", ".", "D", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "6", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "6", ")", "mice", "were", "challenged", "intraperitoneally", "with", "LPS", "(", "24", "mg", "/", "kg", ")", ".", "Levels", "of", "IL", "-", "6", ",", "TNF", "-", "α", ",", "CXCL", "-", "10", ",", "CCL", "-", "5", "in", "serum", "from", "mice", "in", "each", "groups", "were", "measured", "at12", "hpc", "by", "ELISA", ".", "E", ",", "F", "MARCH2", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "5", ")", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", "were", "challenged", "intraperitoneally", "with", "LPS", "(", "24", "mg", "/", "kg", ")", ".", "cDNA", "was", "prepared", "from", "total", "RNA", "extracted", "from", "spleen", "and", "liver", "of", "mice", ".", "Expression", "of", "mRNA", "encoding", "IL", "-", "6", ",", "TNF", "-", "α", ",", "CXCL10", ",", "IL", "-", "1β", "in", "spleen", "(", "E", ")", "and", "liver", "(", "F", ")", "from", "mice", "in", "each", "group", "was", "examined", "at", "6", "hpc", "by", "qPCR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2MARCH2+/+ (n = 8) or MARCH2-/- (n = 8) mice were challenged intraperitoneally with LPS (24 mg/kg). Percentage of surviving mice (A, log-rank test, **P < 0.01)MARCH2+/+ (n = 8) or MARCH2-/- (n = 8) mice were challenged intraperitoneally with LPS (24 mg/kg). body weight changes (B) in each groups.C MARCH2+/+ (n = 4) or MARCH2-/- (n = 4) mice were challenged intraperitoneally with LPS (24 mg/kg). Representing slides of H&E staining of spleen sections from each group. Scale bar, 6mm.D MARCH2+/+ (n = 6) or MARCH2-/- (n = 6) mice were challenged intraperitoneally with LPS (24 mg/kg). Levels of IL-6, TNF-α, CXCL-10, CCL-5 in serum from mice in each groups were measured at12 hpc by ELISA.E, F MARCH2+/+ (n = 5) or MARCH2-/- (n = 5) mice were challenged intraperitoneally with LPS (24 mg/kg). cDNA was prepared from total RNA extracted from spleen and liver of mice. Expression of mRNA encoding IL-6, TNF-α, CXCL10, IL-1β in spleen (E) and liver (F) from mice in each group was examined at 6 hpc by qPCR."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "C", "BMDMs", "isolated", "from", "MARCH2", "+", "/", "+", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "mice", "were", "infected", "with", "PR8", "-", "GFP", "(", "A", ",", "MOI", "=", "3", ")", ",", "VSV", "-", "GFP", "(", "B", ",", "MOI", "=", "5", ")", ",", "or", "HSV", "-", "GFP", "(", "C", ",", "MOI", "=", "3", ")", ",", "and", "virus", "titer", "was", "measured", "in", "a", "plaque", "assay", ".", "D", ",", "E", "BMDMs", "isolated", "from", "MARCH2", "+", "/", "+", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "mice", "were", "infected", "with", "viruses", "or", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "80", "µg", "/", "ml", ")", "or", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", ".", "The", "concentration", "of", "secreted", "IFN", "-", "β", "(", "D", ")", "and", "IL", "-", "6", "(", "E", ")", "in", "the", "supernatants", "was", "measured", "in", "an", "ELISA", ".", "PBMCs", "isolated", "from", "whole", "peripheral", "blood", "from", "MARCH2", "+", "/", "+", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "mice", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", ".", "(", "F", ")", "The", "virus", "titer", "was", "measured", "in", "a", "plaque", "assay", ".", "PBMCs", "isolated", "from", "whole", "peripheral", "blood", "from", "MARCH2", "+", "/", "+", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "mice", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", ".", "(", "G", ")", "Concentration", "of", "IFN", "-", "β", "and", "IL", "-", "6", "in", "the", "supernatant", "was", "measured", "in", "an", "ELISA", ".", "PMs", "isolated", "from", "MARCH2", "+", "/", "+", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "mice", "infected", "with", "CVB", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "3", ")", ".", "(", "H", ")", "Virus", "titer", "was", "measured", "in", "a", "plaque", "assay", ".", "PMs", "isolated", "from", "MARCH2", "+", "/", "+", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "mice", "infected", "with", "CVB", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "3", ")", ".", "(", "I", ")", "Concentration", "of", "IFN", "-", "β", "and", "IL", "-", "6", "in", "the", "supernatant", "was", "measured", "in", "an", "ELISA", ".", "J", ",", "K", "BMDMs", "(", "J", ")", "or", "PMs", "(", "K", ")", "isolated", "from", "MARCH2", "+", "/", "+", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "mice", "were", "infected", "with", "Salmonella", "typhimurium", "or", "L", ".", "monocytogenes", ",", "or", "treated", "with", "LPS", "or", "zymosan", ".", "The", "concentration", "of", "IL", "-", "6", "and", "IL", "-", "12", "in", "supernatant", "was", "analyzed", "in", "an", "ELISA", ".", "L", ",", "M", "RAW", "264", ".", "7", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "si", "-", "control", ")", "or", "MARCH2", "-", "specific", "siRNA", "(", "si", "-", "MARCH2", ")", "were", "infected", "with", "PR8", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", ",", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "0", ".", "5", ")", ",", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "20", "µg", "/", "ml", ")", "or", "HSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", "and", "IFN", "-", "β", "(", "L", ")", ",", "and", "IL", "-", "6", "(", "M", ")", "levels", "in", "the", "supernatant", "were", "measured", "in", "an", "ELISA", ".", "N", "RAW", "264", ".", "7", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "si", "-", "control", ")", "or", "MARCH2", "-", "specific", "siRNA", "(", "si", "-", "MARCH2", ")", "were", "infected", "with", "S", ".", "typhimurium", ",", "or", "L", ".", "monocytogenes", ",", "or", "treated", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "or", "zymosan", "(", "100", "µg", "/", "ml", ")", "and", "IL", "-", "6", "secretion", "into", "the", "cell", "supernatant", "was", "measured", "in", "an"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-C BMDMs isolated from MARCH2+/+ or MARCH2-/- mice were infected with PR8-GFP (A, MOI=3), VSV-GFP (B, MOI = 5), or HSV-GFP (C, MOI = 3), and virus titer was measured in a plaque assay.D, E BMDMs isolated from MARCH2+/+ or MARCH2-/- mice were infected with viruses or treated with poly(I:C) (80 µg/ml) or poly (dA:dT) (1 µg/ml). The concentration of secreted IFN-β (D) and IL-6 (E) in the supernatants was measured in an ELISA.PBMCs isolated from whole peripheral blood from MARCH2+/+ or MARCH2-/- mice were infected with VSV-GFP (MOI =1). (F) The virus titer was measured in a plaque assay.PBMCs isolated from whole peripheral blood from MARCH2+/+ or MARCH2-/- mice were infected with VSV-GFP (MOI =1). (G) Concentration of IFN-β and IL-6 in the supernatant was measured in an ELISA.PMs isolated from MARCH2+/+ or MARCH2-/- mice infected with CVB-GFP (MOI = 3). (H) Virus titer was measured in a plaque assay.PMs isolated from MARCH2+/+ or MARCH2-/- mice infected with CVB-GFP (MOI = 3). (I) Concentration of IFN-β and IL-6 in the supernatant was measured in an ELISA.J, K BMDMs (J) or PMs (K) isolated from MARCH2+/+ or MARCH2-/- mice were infected with Salmonella typhimurium or L. monocytogenes, or treated with LPS or zymosan. The concentration of IL-6 and IL-12 in supernatant was analyzed in an ELISA.L, M RAW 264.7 cells transfected with control siRNA (si-control) or MARCH2-specific siRNA (si-MARCH2) were infected with PR8-GFP (MOI = 1), VSV-GFP (MOI = 0.5), poly (I:C) (20 µg/ml) or HSV-GFP (MOI = 1) poly (dA:dT) (1 µg/ml) and IFN-β (L), and IL-6 (M) levels in the supernatant were measured in an ELISA.N RAW 264.7 cells transfected with control siRNA (si-control) or MARCH2-specific siRNA (si-MARCH2) were infected with S. typhimurium, or L. monocytogenes, or treated with LPS (100 ng/ml) or zymosan (100 µg/ml) and IL-6 secretion into the cell supernatant was measured in an ELISA"}
{"words": ["Figure", "4HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "firefly", "luciferase", "reporter", "plasmid", "encoding", "the", "IFN", "-", "β", "promoter", ",", "plus", "a", "TK", "renilla", "plasmid", "and", "an", "increasing", "dose", "of", "flag", "-", "tagged", "MARCH2", "plasmid", "(", "50", ",", "100", ",", "200", ",", "400", "ng", ")", "plus", "expression", "plasmids", "for", "RIG", "-", "I", "2CARD", ",", "RIG", "-", "I", ",", "MDA", "-", "5", ",", "MAVS", "or", "stimulated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ",", "for", "24", "h", ".", "Results", "are", "expressed", "relative", "to", "those", "of", "renilla", "luciferase", "alone", "(", "Internal", "control", ")", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "firefly", "luciferase", "reporter", "plasmid", "encoding", "the", "IFN", "-", "β", "promoter", "plus", "a", "TK", "renilla", "plasmid", "and", "an", "increasing", "dose", "of", "flag", "-", "tagged", "MARCH2", "plasmid", "(", "50", ",", "100", ",", "200", ",", "400", "ng", ")", "plus", "expression", "plasmids", "for", "TBK1", "TRIF", ",", "for", "24", "h", ".", "Results", "are", "expressed", "relative", "to", "those", "of", "renilla", "luciferase", "alone", "(", "Internal", "control", ")", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "firefly", "luciferase", "reporter", "plasmid", "encoding", "the", "the", "NF", "-", "κB", "promoter", "plus", "a", "TK", "renilla", "plasmid", "and", "an", "increasing", "dose", "of", "flag", "-", "tagged", "MARCH2", "plasmid", "(", "50", ",", "100", ",", "200", ",", "400", "ng", ")", "plus", "expression", "plasmids", "for", "TRAF", "6", ",", "TRAF", "2", ",", "NEMO", "for", "24", "h", ".", "Results", "are", "expressed", "relative", "to", "those", "of", "renilla", "luciferase", "alone", "(", "Internal", "control", ")", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "firefly", "luciferase", "reporter", "plasmid", "encoding", "the", "NF", "-", "κB", "promoter", "plus", "a", "TK", "renilla", "plasmid", "and", "an", "increasing", "dose", "of", "flag", "-", "tagged", "MARCH2", "plasmid", "(", "50", ",", "100", ",", "200", ",", "400", "ng", ")", "plus", "expression", "plasmids", "for", "TBK1", "TRIF", ",", "for", "24", "h", ".", "Results", "are", "expressed", "relative", "to", "those", "of", "renilla", "luciferase", "alone", "(", "Internal", "control", ")", ".", "Interaction", "between", "MARCH2", "and", "NEMO", "in", "response", "to", "viral", "infection", ".", "HEK293T", "cells", "(", "E", ")", "were", "infected", "with", "NDV", "-", "GFP", "in", "a", "time", "-", "dependent", "manner", "in", "the", "presence", "of", "MG132", "(", "proteasome", "inhibitor", ",", "10", "μM", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "NEMO", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "MARCH2", "antibody", ".", "Interaction", "between", "MARCH2", "and", "NEMO", "in", "response", "to", "viral", "infection", ".", "Raw264", ".", "7", "cells", "(", "F", ")", "were", "infected", "with", "NDV", "-", "GFP", "in", "a", "time", "-", "dependent", "manner", "in", "the", "presence", "of", "MG132", "(", "proteasome", "inhibitor", ",", "10", "μM", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "NEMO", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "MARCH2", "antibody", ".", "G", "Confocal", "microscopy", "was", "conducted", "to", "examine", "time", "-", "dependent", "colocalization", "of", "MARCH2", "and", "NEMO", "in", "HeLa", "cells", "upon", "NDV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "in", "the", "presence", "of", "MG132", "(", "10", "μM", ")", ".", "Arrow", "indicates", "the", "co", "-", "localized", "NEMO", "and", "MARCH2", "protein", ".", "Interaction", "between", "MARCH2", "and", "NEMO", "in", "response", "to", "bacterial", "infection", ".", "Raw264", ".", "7", "cells", "were", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", "(", "H", ")", "or", "S", ".", "typhimurium", "(", "I", ")", "in", "a", "time", "-", "dependent", "manner", "in", "the", "presence", "of", "MG132", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "NEMO", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "MARCH2", "antibody", ".", "J", "Confocal", "microscopy", "was", "conducted", "to", "examine", "time", "-", "dependent", "colocalization", "of", "MARCH2", "and", "NEMO", "in", "HeLa", "cells", "expressing", "TLR2", "upon", "zymosan", "treatment", "(", "100", "μg", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "of", "MG132", "(", "10", "μM", ")", ".", "Arrow", "indicates", "the", "co", "-", "localized", "NEMO", "and", "MARCH2", "protein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4HEK293T cells were transfected with a firefly luciferase reporter plasmid encoding the IFN-β promoter , plus a TK renilla plasmid and an increasing dose of flag-tagged MARCH2 plasmid (50, 100, 200, 400 ng) plus expression plasmids for RIG-I 2CARD, RIG-I, MDA-5, MAVS or stimulated with poly (I:C), for 24 h. Results are expressed relative to those of renilla luciferase alone (Internal control).HEK293T cells were transfected with a firefly luciferase reporter plasmid encoding the IFN-β promoter plus a TK renilla plasmid and an increasing dose of flag-tagged MARCH2 plasmid (50, 100, 200, 400 ng) plus expression plasmids for TBK1 TRIF , for 24 h. Results are expressed relative to those of renilla luciferase alone (Internal control).HEK293T cells were transfected with a firefly luciferase reporter plasmid encoding the the NF-κB promoter plus a TK renilla plasmid and an increasing dose of flag-tagged MARCH2 plasmid (50, 100, 200, 400 ng) plus expression plasmids for TRAF 6, TRAF 2, NEMO for 24 h. Results are expressed relative to those of renilla luciferase alone (Internal control).HEK293T cells were transfected with a firefly luciferase reporter plasmid encoding the NF-κB promoter plus a TK renilla plasmid and an increasing dose of flag-tagged MARCH2 plasmid (50, 100, 200, 400 ng) plus expression plasmids for TBK1 TRIF , for 24 h. Results are expressed relative to those of renilla luciferase alone (Internal control).Interaction between MARCH2 and NEMO in response to viral infection. HEK293T cells (E) were infected with NDV-GFP in a time-dependent manner in the presence of MG132 (proteasome inhibitor, 10 μM). Cell lysates were subjected to immunoprecipitation with an anti-NEMO antibody, followed by immunoblotting with an anti-MARCH2 antibody.Interaction between MARCH2 and NEMO in response to viral infection. Raw264.7 cells (F) were infected with NDV-GFP in a time-dependent manner in the presence of MG132 (proteasome inhibitor, 10 μM). Cell lysates were subjected to immunoprecipitation with an anti-NEMO antibody, followed by immunoblotting with an anti-MARCH2 antibody.G Confocal microscopy was conducted to examine time-dependent colocalization of MARCH2 and NEMO in HeLa cells upon NDV infection (MOI = 1) in the presence of MG132 (10 μM). Arrow indicates the co-localized NEMO and MARCH2 protein.Interaction between MARCH2 and NEMO in response to bacterial infection. Raw264.7 cells were infected with L. monocytogenes (H) or S. typhimurium (I) in a time-dependent manner in the presence of MG132. Cell lysates were subjected to immunoprecipitation with an anti-NEMO antibody, followed by immunoblotting with an anti-MARCH2 antibody.J Confocal microscopy was conducted to examine time-dependent colocalization of MARCH2 and NEMO in HeLa cells expressing TLR2 upon zymosan treatment (100 μg/ml) in the presence of MG132 (10 μM). Arrow indicates the co-localized NEMO and MARCH2 protein."}
{"words": ["Figure", "5NEMO", "degradation", "assay", ".", "(", "A", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "different", "doses", "of", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "in", "the", "presence", "HA", "-", "tagged", "NEMO", "plasmid", ".", "NEMO", "degradation", "assay", ".", "(", "B", ")", "MARCH2", "+", "/", "+", "and", "MARCH2", "-", "/", "-", "HEK293T", "cells", "were", "infected", "with", "PR8", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", "in", "time", "-", "dependent", "manner", ".", "Cells", "were", "harvested", "following", "infection", ",", "NEMO", "expression", "level", ",", "total", "and", "phosphorylated", "IRF", "-", "3", ",", "and", "TBK", "-", "1", "were", "measured", "by", "immunoblotting", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "to", "confirm", "equal", "loading", "of", "protein", ".", "C", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "a", "Strep", "-", "tagged", "empty", "vector", "or", "MARCH2", "together", "with", "GST", "-", "tagged", "NEMO", "were", "treated", "with", "MG132", "(", "10", "μM", ")", ",", "chloroquine", ",", "NH4Cl", ",", "or", "Z", "-", "VAD", "for", "6", "h", "before", "harvest", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "D", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "different", "doses", "of", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "together", "with", "and", "GST", "-", "tagged", "NEMO", "plasmid", ".", "MG132", "(", "10", "μM", ")", "was", "added", "to", "cells", "for", "6", "h", "prior", "to", "harvest", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "E", "Confocal", "microscopy", "was", "used", "to", "examine", "colocalization", "of", "MARCH2", "and", "NEMO", "in", "HeLa", "cells", "upon", "NDV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "MG132", "(", "10", "μM", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "Arrow", "indicates", "the", "co", "-", "localized", "NEMO", "and", "MARCH2", "protein", ".", "F", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Strep", "-", "tagged", "empty", "vector", "or", "MARCH2", "with", "GST", "-", "tagged", "NEMO", "and", "each", "different", "HA", "-", "tagged", "ubiquitin", "mutants", "(", "indicated", "lysine", "(", "K", ")", "only", ",", "other", "lysines", "(", "K", ")", "mutated", "to", "arginines", "(", "R", ")", "were", "treated", "with", "MG132", "(", "10", "μM", ")", "for", "6", "h", "before", "harvest", ".", "Lysates", "were", "subjected", "to", "pull", "down", "with", "GST", "beads", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "determined", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "G", "NEMO", "ubiquitination", "assay", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "different", "doses", "of", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "in", "the", "presence", "of", "a", "HA", "-", "tagged", "NEMO", "plasmid", ".", "Lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "K48", "antibody", ".", "MARCH2", "+", "/", "+", "HEK293T", "cells", "harboring", "empty", "vector", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "HEK293T", "cells", "harboring", "empty", "vector", ",", "Flag", "-", "tagged", "MARCH2", ",", "or", "MARCH2CCH", "(", "a", "mutant", "harboring", "mutations", "in", "residues", "within", "the", "catalytic", "domain", ":", "C64S", ",", "C67S", ",", "and", "H90Q", ")", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "0", ".", "05", ")", ".", "Viral", "replication", "was", "assessed", "under", "a", "fluorescence", "microscope", "(", "H", ")", "MARCH2", "+", "/", "+", "HEK293T", "cells", "harboring", "empty", "vector", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "HEK293T", "cells", "harboring", "empty", "vector", ",", "Flag", "-", "tagged", "MARCH2", ",", "or", "MARCH2CCH", "(", "a", "mutant", "harboring", "mutations", "in", "residues", "within", "the", "catalytic", "domain", ":", "C64S", ",", "C67S", ",", "and", "H90Q", ")", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "0", ".", "05", ")", ".", "by", "measuring", "GFP", "expression", "using", "a", "fluorescence", "modulatorMARCH2", "+", "/", "+", "HEK293T", "cells", "harboring", "empty", "vector", "or", "MARCH2", "-", "/", "-", "HEK293T", "cells", "harboring", "empty", "vector", ",", "Flag", "-", "tagged", "MARCH2", ",", "or", "MARCH2CCH", "(", "a", "mutant", "harboring", "mutations", "in", "residues", "within", "the", "catalytic", "domain", ":", "C64S", ",", "C67S", ",", "and", "H90Q", ")", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "J", ")", "Levels", "of", "IFN", "-", "β", "(", "top", ")", "and", "IL", "-", "6", "(", "bottom", ")", "in", "cell", "supernatants", "were", "measured", "in", "an", "ELISA", ".", "K", "In", "vitro", "ubiquitination", "assay", "for", "NEMO", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "NEMO", ",", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "or", "MARCH2CCH", "individually", ".", "Immunoprecipitates", "were", "incubated", "with", "a", "reaction", "mixture", "containing", "ubiquitin", ",", "E1", ",", "and", "UbcH6", "(", "E2", ")", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "K48", "-", "linkage", "specific", "polyubiquitin", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5NEMO degradation assay. (A) HEK293T cells were transfected with different doses of Strep-tagged MARCH2 in the presence HA-tagged NEMO plasmid.NEMO degradation assay. (B) MARCH2+/+ and MARCH2-/- HEK293T cells were infected with PR8-GFP (MOI=1) in time-dependent manner. Cells were harvested following infection, NEMO expression level, total and phosphorylated IRF-3, and TBK-1 were measured by immunoblotting. β-actin was used to confirm equal loading of protein.C HEK293T cells transfected with a Strep-tagged empty vector or MARCH2 together with GST-tagged NEMO were treated with MG132 (10 μM), chloroquine, NH4Cl, or Z-VAD for 6 h before harvest. Whole cell lysates were subjected to immunoblotting with indicated antibodies.D HEK293T cells were transfected with different doses of Strep-tagged MARCH2 together with and GST-tagged NEMO plasmid. MG132 (10 μM) was added to cells for 6 h prior to harvest. Whole cell lysates were subjected to immunoblotting with the indicated antibodies.E Confocal microscopy was used to examine colocalization of MARCH2 and NEMO in HeLa cells upon NDV infection (MOI = 1) in the presence or absence of MG132 (10 μM). Scale bar, 10μm. Arrow indicates the co-localized NEMO and MARCH2 protein.F HEK293T cells transfected with Strep-tagged empty vector or MARCH2 with GST-tagged NEMO and each different HA-tagged ubiquitin mutants (indicated lysine (K) only, other lysines (K) mutated to arginines (R) were treated with MG132 (10 μM) for 6 h before harvest. Lysates were subjected to pull down with GST beads, followed by immunoblotting with an anti-HA antibody. Whole cell lysates were determined by immunoblotting with the indicated antibodies.G NEMO ubiquitination assay. HEK293T cells were transfected with different doses of Strep-tagged MARCH2 in the presence of a HA-tagged NEMO plasmid. Lysates were immunoprecipitated with anti-HA antibody followed by immunoblotting with anti-K48 antibody.MARCH2+/+ HEK293T cells harboring empty vector or MARCH2-/- HEK293T cells harboring empty vector, Flag-tagged MARCH2, or MARCH2CCH (a mutant harboring mutations in residues within the catalytic domain: C64S, C67S, and H90Q) were infected with VSV-GFP (MOI = 0.05). Viral replication was assessed under a fluorescence microscope (H)MARCH2+/+ HEK293T cells harboring empty vector or MARCH2-/- HEK293T cells harboring empty vector, Flag-tagged MARCH2, or MARCH2CCH (a mutant harboring mutations in residues within the catalytic domain: C64S, C67S, and H90Q) were infected with VSV-GFP (MOI = 0.05). by measuring GFP expression using a fluorescence modulatorMARCH2+/+ HEK293T cells harboring empty vector or MARCH2-/- HEK293T cells harboring empty vector, Flag-tagged MARCH2, or MARCH2CCH (a mutant harboring mutations in residues within the catalytic domain: C64S, C67S, and H90Q) were infected with VSV-GFP (MOI = 0.05). (J) Levels of IFN-β (top) and IL-6 (bottom) in cell supernatants were measured in an ELISA.K In vitro ubiquitination assay for NEMO. HEK293T cells were transfected with GST-tagged NEMO, Strep-tagged MARCH2 or MARCH2CCH individually. Immunoprecipitates were incubated with a reaction mixture containing ubiquitin, E1, and UbcH6 (E2), followed by immunoblotting with an anti-K48-linkage specific polyubiquitin antibody."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "domain", "constructs", "together", "with", "GST", "-", "tagged", "NEMO", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "a", "Strep", "-", "PD", "assay", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "GST", "antibody", ".", "(", "D", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "NEMO", "domain", "constructs", "together", "with", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "-", "TM", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "a", "Strep", "-", "PD", "assay", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "GST", "antibody", ".", "(", "F", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "NEMO", "domain", "constructs", "together", "with", "GST", "-", "tagged", "MARCH2", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "a", "GST", "-", "PD", "assay", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "G", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "His", "-", "tagged", "ubiquitin", "and", "HA", "-", "tagged", "NEMO", "WT", "or", "NEMO", "lacking", "the", "CC1", "domain", "together", "with", "Strep", "-", "tagged", "empty", "vector", "or", "MARCH2", "were", "treated", "with", "MG132", "(", "10", "μM", ")", "for", "6", "h", "before", "harvest", ".", "Lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "His", "antibody", ".", "WCL", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "Strep", ",", "or", "anti", "-", "β", "-", "actin", "antibody", ".", "(", "I", ")", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "NEMO", "mutants", "together", "with", "Strep", "-", "tagged", "empty", "vector", "or", "MARCH2", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "GST", ",", "anti", "-", "Strep", ",", "or", "anti", "-", "β", "-", "actin", "antibody", ".", "J", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "ubiquitin", "and", "GST", "-", "tagged", "NEMO", "mutants", "together", "with", "Strep", "-", "tagged", "empty", "vector", "or", "MARCH2", "were", "subjected", "to", "pulldown", "with", "GST", "beads", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Lys48", "(", "K48", ")", "-", "linkage", "specific", "polyubiquitin", "(", "K48", "-", "ub", ")", ",", "anti", "-", "Lys63", "(", "K63", ")", "-", "linkage", "specific", "polyubiquitin", "(", "K63", "-", "ub", ")", ",", "or", "anti", "-", "Strep", "antibody", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "determined", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) HEK293T cells were transfected with Strep-tagged MARCH2 domain constructs together with GST-tagged NEMO. Whole cell lysates were subjected to a Strep-PD assay, followed by immunoblotting with an anti-GST antibody.(D) HEK293T cells were transfected with GST-tagged NEMO domain constructs together with Strep-tagged MARCH2-TM. Whole cell lysates were subjected to a Strep-PD assay, followed by immunoblotting with an anti-GST antibody.(F) HEK293T cells were transfected with HA-tagged NEMO domain constructs together with GST-tagged MARCH2. Whole cell lysates were subjected to a GST-PD assay, followed by immunoblotting with an anti-HA antibody.G HEK293T cells transfected with His-tagged ubiquitin and HA-tagged NEMO WT or NEMO lacking the CC1 domain together with Strep-tagged empty vector or MARCH2 were treated with MG132 (10 μM) for 6 h before harvest. Lysates were subjected to immunoprecipitation with an anti-HA antibody, followed by immunoblotting with an anti-His antibody. WCL were subjected to immunoblotting with anti-HA, anti-Strep, or anti-β-actin antibody.(I) HEK293T cells transfected with GST-tagged NEMO mutants together with Strep-tagged empty vector or MARCH2 were subjected to immunoblotting with anti-GST, anti-Strep, or anti-β-actin antibody.J HEK293T cells transfected with HA-tagged ubiquitin and GST-tagged NEMO mutants together with Strep-tagged empty vector or MARCH2 were subjected to pulldown with GST beads, followed by immunoblotting with anti-Lys48 (K48)-linkage specific polyubiquitin (K48-ub), anti-Lys63 (K63)-linkage specific polyubiquitin (K63-ub), or anti-Strep antibody. Whole cell lysates were determined by immunoblotting with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "7A", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "NEMO", "-", "WT", "and", "its", "point", "mutants", "with", "or", "without", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "B", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "NEMO", "-", "WT", "and", "its", "point", "mutants", "together", "with", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "in", "the", "presence", "of", "MG132", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "a", "GST", "-", "PD", "assay", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "K48", "linkage", "specific", "polyubiquitin", "antibody", ".", "C", "In", "vitro", "ubiquitination", "assay", "for", "NEMO", "-", "K326R", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "NEMO", ",", "GST", "-", "tagged", "NEMO", "-", "K326R", "or", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "individually", ".", "Immunoprecipitates", "were", "incubated", "with", "a", "reaction", "mixture", "containing", "ubiquitin", ",", "E1", ",", "and", "UbcH6", "(", "E2", ")", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "K48", "-", "linkage", "specific", "polyubiquitin", "antibody", ".", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "empty", "vector", ",", "NEMO", "-", "WT", ",", "or", "NEMO", "-", "K326R", ",", "with", "or", "without", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Viral", "replication", "was", "determined", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "D", ")", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "empty", "vector", ",", "NEMO", "-", "WT", ",", "or", "NEMO", "-", "K326R", ",", "with", "or", "without", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", ".", ",", "fluorescence", "absorbance", "(", "E", ")", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "empty", "vector", ",", "NEMO", "-", "WT", ",", "or", "NEMO", "-", "K326R", ",", "with", "or", "without", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", ".", "plaque", "assay", "(", "F", ")", ".", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "GST", "-", "tagged", "empty", "vector", ",", "NEMO", "-", "WT", ",", "or", "NEMO", "-", "K326R", ",", "with", "or", "without", "Strep", "-", "tagged", "MARCH2", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", ".", "(", "G", ")", "IFN", "-", "β", "and", "IL", "-", "6", "in", "the", "cell", "supernatants", "were", "measured", "in", "an", "ELISA", ".", "H", ",", "I", "IFN", "-", "β", "(", "H", ")", "and", "NF", "-", "κB", "(", "I", ")", "luciferase", "reporter", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A HEK293T cells were transfected with GST-tagged NEMO-WT and its point mutants with or without Strep-tagged MARCH2. Whole cell lysates were subjected to immunoblotting with the indicated antibodies.B HEK293T cells were transfected with GST-tagged NEMO-WT and its point mutants together with Strep-tagged MARCH2 in the presence of MG132. Whole cell lysates were subjected to a GST-PD assay, followed by immunoblotting with an anti-K48 linkage specific polyubiquitin antibody.C In vitro ubiquitination assay for NEMO-K326R. HEK293T cells were transfected with GST-tagged NEMO, GST-tagged NEMO-K326R or Strep-tagged MARCH2 individually. Immunoprecipitates were incubated with a reaction mixture containing ubiquitin, E1, and UbcH6 (E2), followed by immunoblotting with an anti-K48-linkage specific polyubiquitin antibody.HEK293T cells transfected with GST-tagged empty vector, NEMO-WT, or NEMO-K326R, with or without Strep-tagged MARCH2 were infected with VSV-GFP. (D-F) Viral replication was determined by fluorescence microscopy (D)HEK293T cells transfected with GST-tagged empty vector, NEMO-WT, or NEMO-K326R, with or without Strep-tagged MARCH2 were infected with VSV-GFP. , fluorescence absorbance (E)HEK293T cells transfected with GST-tagged empty vector, NEMO-WT, or NEMO-K326R, with or without Strep-tagged MARCH2 were infected with VSV-GFP. plaque assay (F).HEK293T cells transfected with GST-tagged empty vector, NEMO-WT, or NEMO-K326R, with or without Strep-tagged MARCH2 were infected with VSV-GFP. (G) IFN-β and IL-6 in the cell supernatants were measured in an ELISA.H, I IFN-β (H) and NF-κB (I) luciferase reporter assay."}
{"words": ["Figure", "1HUVECs", "transfected", "with", "control", "or", "CEP41", "siRNAs", "were", "scratched", "(", "0", "h", ")", "to", "induce", "wounding", "and", "then", "incubated", "for", "12", "h", "to", "allow", "wound", "closure", ".", "The", "wound", "margins", "were", "observed", "every", "4", "h", "in", "the", "CEP41", "#", "1", "and", "#", "2", "siRNA", "-", "transfected", "cells", "and", "compared", "to", "those", "of", "control", "cells", ".", "Representative", "images", "of", "cells", "subjected", "to", "the", "wound", "closure", "assay", "in", "(", "A", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "600", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "extent", "of", "wound", "closure", "in", "(", "B", ")", "presented", "graphically", "by", "measuring", "the", "distance", "between", "the", "dotted", "lines", "at", "each", "time", "point", ".", "The", "siRNA", "-", "transfected", "HUVECs", "were", "plated", "inside", "a", "transwell", "chamber", "and", "incubated", "with", "serum", "for", "18", "h", ".", "The", "cells", "that", "invaded", "were", "observed", "after", "staining", "with", "crystal", "violet", "(", "CV", ")", "solution", ".", "Scale", "bars", ",", "600", "μm", ".", "The", "numbers", "of", "cells", "that", "invaded", "in", "each", "field", "of", "view", "was", "counted", "with", "the", "ImageJ", "software", "in", "(", "D", ")", ".", "Tubulogenesis", "of", "control", "and", "CEP41", "-", "knockdown", "cells", "for", "18", "h", "was", "compared", "via", "an", "in", "vitro", "angiogenesis", "assay", ".", "Scale", "bars", ",", "600", "μm", ".", "Quantification", "of", "tube", "node", "numbers", "in", "(", "F", ")", "and", "tube", "length", "in", "(", "G", ")", "from", "each", "field", "of", "view", "using", "the", "ImageJ", "angiogenesis", "analyzer", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "The", "graph", "compares", "the", "relative", "length", "of", "control", "cells", "and", "CEP41", "-", "knockdown", "cells", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "five", "independent", "experiments", "with", "≥", "5", "tubulogenesis", "regions", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1HUVECs transfected with control or CEP41 siRNAs were scratched (0 h) to induce wounding and then incubated for 12 h to allow wound closure. The wound margins were observed every 4 h in the CEP41#1 and #2 siRNA-transfected cells and compared to those of control cells. Representative images of cells subjected to the wound closure assay in (A). Scale bars, 600 μm. Quantification of the extent of wound closure in (B) presented graphically by measuring the distance between the dotted lines at each time point.The siRNA-transfected HUVECs were plated inside a transwell chamber and incubated with serum for 18 h. The cells that invaded were observed after staining with crystal violet (CV) solution. Scale bars, 600 μm. The numbers of cells that invaded in each field of view was counted with the ImageJ software in (D).Tubulogenesis of control and CEP41-knockdown cells for 18 h was compared via an in vitro angiogenesis assay. Scale bars, 600 μm. Quantification of tube node numbers in (F) and tube length in (G) from each field of view using the ImageJ angiogenesis analyzer at the indicated time points. The graph compares the relative length of control cells and CEP41-knockdown cells. Data are shown as mean ± SD of five independent experiments with ≥ 5 tubulogenesis regions per condition."}
{"words": ["Figure", "2Blood", "vessels", "were", "observed", "in", "MOs", "(", "control", ",", "cep41", "AUG", "(", "2", ".", "5", "ng", ")", ",", "or", "cep41", "SB", "(", "2", "ng", ")", ")", "-", "injected", "or", "cep41", "-", "mutated", "Tg", "(", "kdrl", ":", "eGFP", ")", "zebrafish", "at", "40", "hours", "post", "-", "fertilization", "(", "hpf", ")", "by", "fluorescent", "microscopy", ".", "Asterisks", "and", "arrowheads", "indicate", "impaired", "ISVs", "and", "DLAVs", ",", "respectively", ".", "The", "representative", "images", "for", "analysis", "of", "ISV", "lumen", "diameter", "are", "indicated", "by", "dotted", "rectangles", ".", "A", ",", "anterior", ";", "P", ",", "posterior", ";", "DLAV", ",", "dorsal", "longitudinal", "anastomotic", "vessel", ";", "ISV", ",", "intersegmental", "vessel", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "ISV", "lumen", "diameter", "in", "(", "B", ")", ",", "the", "numbers", "of", "defective", "ISVs", "in", "(", "C", ")", ",", "the", "numbers", "of", "embryos", "with", "aberrant", "DLAVs", "in", "(", "D", ")", ",", "and", "the", "numbers", "of", "ruptured", "DLAVs", "in", "(", "E", ")", "from", "data", "observed", "in", "equivalent", "fields", "of", "view", "(", "within", "eight", "somites", ")", ".", "The", "severity", "of", "blood", "vessel", "defects", "in", "cep41", "-", "deficient", "zebrafish", ":", "B", "(", "narrowed", "ISVs", ")", "<", "C", "(", "shorten", ",", "fused", ",", "and", "missing", "ISVs", ")", "<", "D", "and", "E", "(", "ruptured", "DLAVs", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "20", "embryos", "per", "condition", ".", "CV", "protrusions", "(", "arrowheads", ")", "and", "vascular", "loops", "(", "asterisks", ")", "were", "observed", "in", "zebrafish", "at", "35", "hpf", ".", "The", "images", "within", "the", "dotted", "rectangles", "are", "magnified", "in", "the", "right", "panels", ".", "A", ",", "anterior", ";", "P", ",", "posterior", ";", "CA", ",", "caudal", "artery", ";", "CV", ",", "caudal", "vein", ".", "Scale", "bars", ",", "40", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "length", "of", "the", "CV", "protrusions", "in", "(", "G", ")", "presented", "graphically", "by", "measuring", "them", "in", "equivalent", "fields", "of", "view", "(", "within", "five", "somites", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Blood vessels were observed in MOs (control, cep41 AUG (2.5 ng), or cep41 SB (2 ng))-injected or cep41-mutated Tg(kdrl:eGFP) zebrafish at 40 hours post-fertilization (hpf) by fluorescent microscopy. Asterisks and arrowheads indicate impaired ISVs and DLAVs, respectively. The representative images for analysis of ISV lumen diameter are indicated by dotted rectangles. A, anterior; P, posterior; DLAV, dorsal longitudinal anastomotic vessel; ISV, intersegmental vessel. Scale bars, 100 μm. Quantification of ISV lumen diameter in (B), the numbers of defective ISVs in (C), the numbers of embryos with aberrant DLAVs in (D), and the numbers of ruptured DLAVs in (E) from data observed in equivalent fields of view (within eight somites). The severity of blood vessel defects in cep41-deficient zebrafish: B (narrowed ISVs) < C (shorten, fused, and missing ISVs) < D and E (ruptured DLAVs). Data are shown as mean ± SD of three independent experiments with ≥ 20 embryos per condition.CV protrusions (arrowheads) and vascular loops (asterisks) were observed in zebrafish at 35 hpf. The images within the dotted rectangles are magnified in the right panels. A, anterior; P, posterior; CA, caudal artery; CV, caudal vein. Scale bars, 40 μm. Quantification of the length of the CV protrusions in (G) presented graphically by measuring them in equivalent fields of view (within five somites)."}
{"words": ["Figure", "3Control", "or", "CEP41", "siRNA", "-", "transfected", "HUVECs", "were", "immunostained", "with", "Ac", "-", "Tub", "-", "or", "GT335", "-", "specific", "antibodies", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "rectangles", "indicate", "the", "representative", "cells", "from", "each", "immunostaining", "experiment", "presented", "as", "magnified", "images", "in", "the", "right", "panels", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "ciliated", "cell", "numbers", "in", "the", "images", "in", "(", "A", ")", "from", "the", "results", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "200", "cells", "per", "condition", "(", "mean", "±", "SD", ")", "in", "(", "B", ")", ".", "Wild", "-", "type", "and", "cep41", "-", "deficient", "Tg", "(", "kdrl", ":", "eGFP", ")", "zebrafish", "embryos", "were", "fixed", "for", "immunostaining", "with", "Ac", "-", "Tub", "-", "or", "GT335", "-", "specific", "antibodies", "at", "28", "hpf", "in", "(", "C", ")", ".", "The", "rectangles", "indicate", "the", "arterial", "cilia", "(", "AC", ")", "and", "venous", "cilia", "(", "VC", ")", "in", "zebrafish", "endothelial", "cells", "(", "EC", ")", ".", "Magnified", "representative", "images", "are", "displayed", "in", "the", "right", "panels", ".", "Scale", "bars", ",", "40", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "labeled", "cilia", "observed", "in", "equivalent", "fields", "of", "view", "are", "presented", "graphically", "in", "(", "D", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "median", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "≥", "20", "embryos", "per", "condition", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Control or CEP41 siRNA-transfected HUVECs were immunostained with Ac-Tub- or GT335-specific antibodies in (A). The rectangles indicate the representative cells from each immunostaining experiment presented as magnified images in the right panels. Scale bars, 20 μm. Quantification of the ciliated cell numbers in the images in (A) from the results of three independent experiments with ≥ 200 cells per condition (mean ± SD) in (B).Wild-type and cep41-deficient Tg(kdrl:eGFP) zebrafish embryos were fixed for immunostaining with Ac-Tub- or GT335-specific antibodies at 28 hpf in (C). The rectangles indicate the arterial cilia (AC) and venous cilia (VC) in zebrafish endothelial cells (EC). Magnified representative images are displayed in the right panels. Scale bars, 40 μm. Quantification of the labeled cilia observed in equivalent fields of view are presented graphically in (D). Data are shown as median of three independent experiments (n ≥ 20 embryos per condition)."}
{"words": ["Figure", "4HUVECs", "transfected", "with", "CCP5", "and", "/", "or", "CEP41", "siRNAs", "were", "scratched", "and", "incubated", "to", "evaluate", "wound", "closure", ".", "The", "extent", "of", "wound", "closure", "in", "co", "-", "transfected", "cells", "with", "CCP5", "and", "CEP41", "siRNAs", "was", "compared", "with", "that", "in", "control", "or", "CEP41", "siRNA", "-", "transfected", "cells", "at", "the", "indicated", "time", "points", "(", "A", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "600", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "extent", "of", "wound", "closure", "in", "(", "A", ")", "is", "presented", "graphically", "by", "measuring", "the", "distance", "between", "the", "dotted", "lines", "at", "each", "time", "point", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "≥", "3", "scratches", "per", "experimental", "condition", ")", ".", "The", "indicated", "siRNA", "-", "transfected", "HUVECs", "were", "subjected", "to", "in", "vitro", "angiogenesis", "assays", ".", "Tubulogenesis", "of", "HUVECs", "depleted", "for", "CEP41", "and", "CCP5", "was", "compared", "to", "that", "of", "control", ",", "CEP41", "single", "-", "knockdown", ",", "or", "CCP5", "single", "-", "knockdown", "cells", "(", "C", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "600", "μm", ".", "Quantification", "of", "tube", "node", "number", "in", "(", "D", ")", "and", "tube", "length", "in", "(", "E", ")", "from", "data", "examined", "within", "equivalent", "fields", "of", "view", "at", "the", "indicated", "time", "points", "using", "the", "ImageJ", "angiogenesis", "analyzer", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "five", "independent", "experiments", "with", "≥", "5", "tubulogenesis", "regions", "per", "condition", ".", "The", "blood", "vessels", "in", "the", "trunks", "of", "cep41", "-", "mutant", "/", "morphant", "zebrafish", "were", "compared", "to", "those", "of", "zebrafish", "co", "-", "injected", "with", "ccp5", "MOs", "(", "2", "ng", ")", "at", "40", "hpf", "in", "(", "F", ")", ".", "Asterisks", "and", "arrowheads", "indicate", "impaired", "ISVs", "and", "DLAVs", ",", "respectively", ".", "A", ",", "anterior", ";", "P", ",", "posterior", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "defective", "ISVs", "and", "DLAVs", "from", "data", "observed", "in", "equivalent", "fields", "of", "view", "(", "within", "eight", "somites", ")", ".", "Data", "are", "median", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "20", "embryos", "per", "condition", ".", "HUVECs", "co", "-", "transfected", "with", "CEP41", "and", "CCP5", "siRNAs", "were", "immunostained", "with", "ARL13b", "-", "and", "GT335", "-", "specific", "antibodies", ".", "The", "staining", "results", "were", "compared", "to", "those", "of", "control", ",", "single", "CEP41", ",", "or", "CCP5", "siRNA", "-", "transfected", "cells", ".", "Representative", "images", "indicated", "with", "rectangles", "appear", "in", "magnified", "images", "in", "the", "lower", "panels", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "relative", "intensity", "of", "GT335", "/", "ARL13b", "signals", "in", "the", "cilia", "ciliary", "length", "(", "J", ")", "in", "images", "(", "H", ")", "are", "the", "result", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "200", "cells", "per", "condition", "(", "median", ")", ".", "*", "*"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4HUVECs transfected with CCP5 and/or CEP41 siRNAs were scratched and incubated to evaluate wound closure. The extent of wound closure in co-transfected cells with CCP5 and CEP41 siRNAs was compared with that in control or CEP41 siRNA-transfected cells at the indicated time points (A). Scale bars, 600 μm. Quantification of the extent of wound closure in (A) is presented graphically by measuring the distance between the dotted lines at each time point in (B). Data are shown as mean ± SD of three independent experiments (n ≥ 3 scratches per experimental condition).The indicated siRNA-transfected HUVECs were subjected to in vitro angiogenesis assays. Tubulogenesis of HUVECs depleted for CEP41 and CCP5 was compared to that of control, CEP41 single-knockdown, or CCP5 single-knockdown cells (C). Scale bars, 600 μm. Quantification of tube node number in (D) and tube length in (E) from data examined within equivalent fields of view at the indicated time points using the ImageJ angiogenesis analyzer. Data are shown as mean ± SD of five independent experiments with ≥ 5 tubulogenesis regions per condition.The blood vessels in the trunks of cep41-mutant/morphant zebrafish were compared to those of zebrafish co-injected with ccp5 MOs (2 ng) at 40 hpf in (F). Asterisks and arrowheads indicate impaired ISVs and DLAVs, respectively. A, anterior; P, posterior. Scale bars, 100 μm. Quantification of the number of defective ISVs and DLAVs from data observed in equivalent fields of view (within eight somites). Data are median of three independent experiments with ≥ 20 embryos per condition.HUVECs co-transfected with CEP41 and CCP5 siRNAs were immunostained with ARL13b- and GT335-specific antibodies. The staining results were compared to those of control, single CEP41, or CCP5 siRNA-transfected cells. Representative images indicated with rectangles appear in magnified images in the lower panels. Scale bars, 20 μm. Quantification of relative intensity of GT335/ARL13b signals in the cilia ciliary length (J) in images (H) are the result of three independent experiments with ≥ 200 cells per condition (median). **"}
{"words": ["Figure", "5Control", "or", "CEP41", "siRNA", "-", "transfected", "HUVECs", "cultivated", "under", "either", "static", "or", "shear", "stress", "states", "and", "examined", "in", "a", "wound", "healing", "assay", "in", "(", "A", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "600", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "extent", "of", "wound", "closure", "in", "(", "A", ")", "displayed", "graphically", "by", "measuring", "the", "distance", "between", "the", "lines", "at", "the", "indicated", "time", "points", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "≥", "3", "scratches", "per", "experimental", "condition", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "the", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ":", "non", "-", "significant", ")", ".", "in", "vitro", "angiogenesis", "assay", "was", "performed", "in", "static", "or", "shear", "stress", "-", "exposed", "HUVECs", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "for", "18", "h", "in", "(", "C", ")", ".", "in", "vitro", "angiogenesis", "assay", "was", "performed", "in", "static", "or", "shear", "stress", "-", "exposed", "HUVECs", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "for", "18", "h", "in", "(", "C", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "600", "μm", ".", "Quantification", "of", "tube", "node", "number", "in", "(", "D", ")", "and", "tube", "length", "in", "(", "E", ")", "from", "data", "examined", "within", "equivalent", "fields", "of", "view", "at", "each", "time", "point", "using", "the", "ImageJ", "angiogenesis", "analyzer", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "five", "independent", "experiments", "with", "≥", "5", "tubulogenesis", "regions", "per", "condition", ".", "Control", "or", "CEP41", "-", "deficient", "HUVECs", "cultivated", "under", "laminar", "shear", "stress", "and", "immunostained", "with", "ARL13b", "-", "specific", "antibodies", "to", "measure", "deciliation", ".", "Representative", "images", "are", "indicated", "by", "rectangles", "with", "numbers", "and", "shown", "in", "magnified", "images", "in", "the", "right", "panels", ".", "The", "resulting", "data", "were", "compared", "to", "those", "of", "cells", "under", "static", "conditions", "in", "(", "F", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "ARL13b", "-", "positive", "ciliary", "cells", "(", "G", ")", "and", "of", "relative", "intensity", "of", "GT335", "/", "ARL13b", "signals", "in", "the", "cilia", "(", "H", ")", "in", "images", "(", "F", ")", "is", "the", "results", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "200", "cells", "per", "condition", "(", "mean", "±", "SD", "(", "G", ")", ",", "median", "(", "H", ")", ")", ".", "*", "Control", ",", "CEP41", "-", ",", "or", "CCP5", "-", "depleted", "hTERT", "-", "RPE1", "cells", "cultured", "under", "serum", "starvation", "for", "48", "h", "and", "fixed", "at", "18", "h", "after", "serum", "retrieval", "for", "immunostaining", "with", "both", "ARL13b", "-", "and", "GT335", "-", "specific", "antibodies", "in", "(", "I", ")", ".", "Images", "of", "the", "results", "18", "h", "after", "serum", "addition", ".", "Representative", "cells", "are", "indicated", "by", "rectangles", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "ARL13b", "-", "positive", "ciliated", "cells", "(", "J", ")", "and", "relative", "intensity", "of", "GT335", "/", "ARL13b", "signals", "in", "the", "cilia", "(", "K", ")", "under", "either", "serum", "starvation", "or", "serum", "retrieval", "(", "18", "h", ")", "conditions", "are", "the", "results", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "200", "cells", "per", "condition", "(", "mean", "±", "SD", "(", "J", ")", ",", "median", "(", "K", ")", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Control or CEP41 siRNA-transfected HUVECs cultivated under either static or shear stress states and examined in a wound healing assay in (A). Scale bars, 600 μm. Quantification of the extent of wound closure in (A) displayed graphically by measuring the distance between the lines at the indicated time points in (B). Data are presented as mean ± SD of three independent experiments (n ≥ 3 scratches per experimental condition). Statistical significance was determined using the two-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test (***P < 0.01, ns: non-significant).in vitro angiogenesis assay was performed in static or shear stress-exposed HUVECs transfected with the indicated siRNAs for 18 h in (C).in vitro angiogenesis assay was performed in static or shear stress-exposed HUVECs transfected with the indicated siRNAs for 18 h in (C). Scale bars, 600 μm. Quantification of tube node number in (D) and tube length in (E) from data examined within equivalent fields of view at each time point using the ImageJ angiogenesis analyzer. Data are shown as mean ± SD of five independent experiments with ≥ 5 tubulogenesis regions per condition.Control or CEP41-deficient HUVECs cultivated under laminar shear stress and immunostained with ARL13b-specific antibodies to measure deciliation. Representative images are indicated by rectangles with numbers and shown in magnified images in the right panels. The resulting data were compared to those of cells under static conditions in (F). Scale bars, 20 μm. Quantification of ARL13b-positive ciliary cells (G) and of relative intensity of GT335/ARL13b signals in the cilia (H) in images (F) is the results of three independent experiments with ≥ 200 cells per condition (mean ± SD (G), median (H)). *Control, CEP41-, or CCP5-depleted hTERT-RPE1 cells cultured under serum starvation for 48 h and fixed at 18 h after serum retrieval for immunostaining with both ARL13b- and GT335-specific antibodies in (I). Images of the results 18 h after serum addition. Representative cells are indicated by rectangles. Scale bars, 20 μm. Quantification of ARL13b-positive ciliated cells (J) and relative intensity of GT335/ARL13b signals in the cilia (K) under either serum starvation or serum retrieval (18 h) conditions are the results of three independent experiments with ≥ 200 cells per condition (mean ± SD (J), median (K))."}
{"words": ["Figure", "6VEGFA", "(", "A", ")", "and", "VEGFR2", "(", "B", ")", "mRNA", "levels", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "control", "or", "CEP41", "-", "knockdown", "HUVECs", "under", "static", "or", "shear", "stress", "conditions", ".", "The", "expression", "of", "GAPDH", "was", "quantified", "for", "the", "normalization", "of", "the", "qRT", "-", "PCR", "results", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "with", "the", "Brown", "-", "Forsythe", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "T3", "post", "hoc", "test", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "non", "-", "significant", ")", ".", "Immunoblot", "assays", "for", "phospho", "-", "AURKA", "and", "AURKA", "were", "performed", "in", "HUVECs", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "Protein", "levels", "were", "normalized", "against", "β", "-", "ACTIN", "in", "the", "same", "blots", ".", "Immunoblot", "assays", "for", "phospho", "-", "AURKA", "and", "AURKA", "were", "performed", "in", "hTERT", "-", "RPE1", "cells", "(", "D", ")", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "Protein", "levels", "were", "normalized", "against", "β", "-", "ACTIN", "in", "the", "same", "blots", ".", "The", "mRNA", "levels", "of", "zebrafish", "vegfa", "(", "E", ")", "and", "vegfr2", "(", "F", ")", "were", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "eGFP", "-", "positive", "ECs", "of", "control", "-", "or", "cep41", "-", "MO", "-", "injected", "Tg", "(", "kdrl", ":", "eGFP", ")", "zebrafish", "at", "18", "hpf", "(", "low", "shear", "stress", ")", "and", "26", "hpf", "(", "high", "shear", "stress", ")", ".", "The", "expression", "of", "vegfa", "and", "vegfr2", "was", "quantified", "in", "neuronal", "cells", "from", "control", "MO", "-", "injected", "zebrafish", "for", "comparisons", "with", "that", "of", "ECs", ".", "The", "expression", "of", "zebrafish", "β", "-", "actin", "was", "quantified", "for", "the", "normalization", "of", "those", "qRT", "-", "PCR", "results", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "the", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "non", "-", "significant", ")", ".", "Tg", "(", "kdrl", ":", "eGFP", ")", "zebrafish", "were", "injected", "with", "control", "-", "or", "cep41", "-", "MOs", "and", "subjected", "to", "immunostaining", "with", "phospho", "-", "AURKA", "-", "specific", "antibodies", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "at", "26", "hpf", ".", "The", "insets", "indicate", "the", "representative", "area", "from", "each", "immunostaining", "experiment", "and", "the", "red", "dots", "indicate", "EC", "aurka", "activation", ".", "Scale", "bars", ",", "40", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "phospho", "-", "aurka", "-", "positive", "ECs", "(", "H", ")", "in", "equivalent", "fields", "of", "view", "for", "each", "MO", "-", "injected", "zebrafish", "in", "images", "in", "(", "G", ")", "are", "the", "result", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "10", "embryos", "per", "condition", ".", "The", "top", "and", "bottom", "whiskers", "represent", "the", "maximum", "and", "minimum", "values", ",", "respectively", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ")", ".", "CEP41", "-", "depleted", "hTERT", "-", "RPE1", "cells", "were", "transfected", "with", "vectors", "encoding", "nothing", "(", "MOCK", ")", ",", "AURKA", "-", "T288D", ",", "or", "AURKA", "-", "K162R", "and", "then", "immunostained", "with", "ARL13b", "-", "specific", "antibodies", "after", "serum", "starvation", "or", "serum", "retrieval", ".", "Images", "were", "taken", "from", "the", "results", "of", "staining", "done", "18", "h", "after", "serum", "retrieval", ".", "Rectangles", "indicate", "the", "representative", "cells", "that", "appear", "in", "the", "magnified", "images", "in", "the", "right", "panels", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "A", "quantification", "of", "ARL13b", "-", "labeled", "ciliated", "cells", "under", "the", "indicated", "conditions", "in", "(", "J", ")", ".", "These", "are", "the", "results", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "200", "cells", "per", "condition", "(", "mean", "±", "SD", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ":", "non", "-", "significant", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ")", ".", "Control", "and", "CEP41", "-", "deficient", "HUVECs", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "encoding", "nothing", "(", "MOCK", ")", ",", "AURKA", ",", "AURKA", "-", "T288D", ",", "or", "AURKA", "-", "K162R", "and", "subjected", "to", "an", "in", "vitro", "angiogenesis", "assay", "for", "18", "h", "under", "static", "(", "K", ",", "L", ")", "or", "shear", "stress", "(", "M", ",", "N", ")", "states", ".", "Quantification", "of", "tube", "node", "number", "in", "(", "K", ",", "M", ")", "and", "tube", "length", "in", "(", "L", ",", "N", ")", "from", "data", "examined", "within", "equivalent", "fields", "of", "view", "at", "each", "time", "point", "using", "the", "ImageJ", "angiogenesis", "analyzer", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "five", "independent", "experiments", "with", "≥", "5", "tubulogenesis", "regions", "per", "condition", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "the", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "non", "-", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6VEGFA (A) and VEGFR2 (B) mRNA levels quantified by qRT-PCR in control or CEP41-knockdown HUVECs under static or shear stress conditions. The expression of GAPDH was quantified for the normalization of the qRT-PCR results. Data are shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical significance was determined with the Brown-Forsythe ANOVA followed by Dunnett's T3 post hoc test (**P < 0.01, ***P < 0.001, ns: non-significant).Immunoblot assays for phospho-AURKA and AURKA were performed in HUVECs transfected with the indicated siRNAs. Protein levels were normalized against β-ACTIN in the same blots.Immunoblot assays for phospho-AURKA and AURKA were performed in hTERT-RPE1 cells (D) transfected with the indicated siRNAs. Protein levels were normalized against β-ACTIN in the same blots.The mRNA levels of zebrafish vegfa (E) and vegfr2 (F) were quantified by qRT-PCR in eGFP-positive ECs of control- or cep41-MO-injected Tg(kdrl:eGFP) zebrafish at 18 hpf (low shear stress) and 26 hpf (high shear stress). The expression of vegfa and vegfr2 was quantified in neuronal cells from control MO-injected zebrafish for comparisons with that of ECs. The expression of zebrafish β-actin was quantified for the normalization of those qRT-PCR results. Data are shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical significance was determined using the one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test (***P < 0.001, ns: non-significant).Tg(kdrl:eGFP) zebrafish were injected with control- or cep41-MOs and subjected to immunostaining with phospho-AURKA-specific antibodies (red) and DAPI at 26 hpf. The insets indicate the representative area from each immunostaining experiment and the red dots indicate EC aurka activation. Scale bars, 40 μm. Quantification of the phospho-aurka-positive ECs (H) in equivalent fields of view for each MO-injected zebrafish in images in (G) are the result of three independent experiments with ≥ 10 embryos per condition. The top and bottom whiskers represent the maximum and minimum values, respectively. **P < 0.01 (Unpaired Student's t-test with Welch's correction).CEP41-depleted hTERT-RPE1 cells were transfected with vectors encoding nothing (MOCK), AURKA-T288D, or AURKA-K162R and then immunostained with ARL13b-specific antibodies after serum starvation or serum retrieval. Images were taken from the results of staining done 18 h after serum retrieval. Rectangles indicate the representative cells that appear in the magnified images in the right panels. Scale bars, 20 μm. A quantification of ARL13b-labeled ciliated cells under the indicated conditions in (J). These are the results of three independent experiments with ≥ 200 cells per condition (mean ± SD). *P < 0.05, ***P < 0.01, ns: non-significant (Two-way ANOVA with Tukey's post hoc test).Control and CEP41-deficient HUVECs were transfected with expression vectors encoding nothing (MOCK), AURKA, AURKA-T288D, or AURKA-K162R and subjected to an in vitro angiogenesis assay for 18 h under static (K, L) or shear stress (M, N) states. Quantification of tube node number in (K, M) and tube length in (L, N) from data examined within equivalent fields of view at each time point using the ImageJ angiogenesis analyzer. Data are shown as mean ± SD of five independent experiments with ≥ 5 tubulogenesis regions per condition. Statistical significance was determined using the two-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: non-significant)."}
{"words": ["Figure", "7The", "control", "or", "CEP41", "siRNA", "-", "transfected", "HUVECs", "were", "cultivated", "under", "hypoxia", "(", "1", "%", "O2", ")", "and", "their", "whole", "cell", "lysates", "were", "used", "for", "immunoblot", "assays", "of", "CEP41", ",", "phospho", "-", "AURKA", ",", "and", "AURKA", ".", "The", "resulting", "data", "were", "also", "compared", "to", "those", "of", "normoxic", "cells", ".", "Protein", "levels", "were", "normalized", "against", "β", "-", "ACTIN", "in", "the", "same", "blots", ".", "VEGFA", "(", "B", ")", "and", "VEGFR2", "(", "C", ")", "mRNA", "levels", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "using", "cDNA", "from", "normoxic", "and", "hypoxic", "controls", "or", "CEP41", "-", "depleted", "cells", ".", "The", "expression", "of", "GAPDH", "was", "quantified", "for", "the", "normalization", "of", "those", "qRT", "-", "PCR", "results", ".", "Tg", "(", "kdrl", ":", "eGFP", ")", "zebrafish", "were", "injected", "with", "control", "-", "or", "cep41", "-", "MOs", "and", "then", "incubated", "under", "hypoxia", "at", "28", "hpf", "(", "a", "stage", "of", "high", "shear", "stress", ")", "for", "2", "h", ".", "They", "were", "subjected", "to", "immunostaining", "with", "phospho", "-", "AURKA", "-", "specific", "antibodies", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "at", "30", "hpf", ".", "The", "insets", "indicate", "the", "representative", "areas", "from", "each", "immunostaining", "and", "red", "dots", "indicate", "activated", "aurka", "within", "ECs", ".", "Scale", "bars", ",", "40", "μm", ".", "Quantification", "of", "phospho", "-", "aurka", "-", "positive", "ECs", "(", "E", ")", "in", "equivalent", "fields", "of", "view", "for", "each", "MO", "-", "injected", "zebrafish", "in", "(", "D", ")", "are", "the", "result", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "20", "embryos", "per", "condition", ".", "The", "top", "and", "bottom", "whiskers", "represent", "the", "maximum", "and", "minimum", "values", ",", "respectively", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Zebrafish", "vegfa", "mRNA", "levels", "were", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "eGFP", "-", "positive", "ECs", "of", "control", "-", "or", "cep41", "-", "MO", "-", "injected", "Tg", "(", "kdrl", ":", "eGFP", ")", "zebrafish", "subjected", "to", "either", "normoxia", "or", "hypoxia", "at", "30", "hpf", ".", "The", "expression", "of", "zebrafish", "β", "-", "actin", "was", "quantified", "for", "the", "normalization", "of", "these", "qRT", "-", "PCR", "results", ".", "vegfr2", "(", "G", ")", "mRNA", "levels", "were", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "eGFP", "-", "positive", "ECs", "of", "control", "-", "or", "cep41", "-", "MO", "-", "injected", "Tg", "(", "kdrl", ":", "eGFP", ")", "zebrafish", "subjected", "to", "either", "normoxia", "or", "hypoxia", "at", "30", "hpf", ".", "The", "expression", "of", "zebrafish", "β", "-", "actin", "was", "quantified", "for", "the", "normalization", "of", "these", "qRT", "-", "PCR", "results", ".", "Control", "and", "CEP41", "-", "deficient", "HUVECs", ",", "transfected", "with", "expression", "vectors", "encoding", "nothing", "(", "MOCK", ")", ",", "AURKA", ",", "AURKA", "-", "T288D", ",", "HIF1α", ",", "or", "HIF1α", "with", "CEP41", "were", "cultivated", "under", "hypoxia", "and", "subjected", "to", "an", "in", "vitro", "angiogenesis", "assay", "for", "18", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "400", "μm", ".", "Control", "and", "CEP41", "-", "deficient", "HUVECs", ",", "transfected", "with", "expression", "vectors", "encoding", "nothing", "(", "MOCK", ")", ",", "AURKA", ",", "AURKA", "-", "T288D", ",", "HIF1α", ",", "or", "HIF1α", "with", "CEP41", "were", "cultivated", "under", "hypoxia", "and", "subjected", "to", "an", "in", "vitro", "angiogenesis", "assay", "for", "18", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "400", "μm", ".", "Quantification", "of", "tube", "node", "number", "in", "(", "I", ")", "and", "tube", "length", "in", "(", "J", ")", "from", "data", "examined", "within", "equivalent", "fields", "of", "view", "at", "each", "time", "point", "using", "the", "ImageJ", "angiogenesis", "analyzer", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "five", "independent", "experiments", "with", "≥", "5", "tubulogenesis", "regions", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7The control or CEP41 siRNA-transfected HUVECs were cultivated under hypoxia (1% O2) and their whole cell lysates were used for immunoblot assays of CEP41, phospho-AURKA, and AURKA. The resulting data were also compared to those of normoxic cells. Protein levels were normalized against β-ACTIN in the same blots.VEGFA (B) and VEGFR2 (C) mRNA levels were measured by qRT-PCR using cDNA from normoxic and hypoxic controls or CEP41-depleted cells. The expression of GAPDH was quantified for the normalization of those qRT-PCR results.Tg(kdrl:eGFP) zebrafish were injected with control- or cep41-MOs and then incubated under hypoxia at 28 hpf (a stage of high shear stress) for 2 h. They were subjected to immunostaining with phospho-AURKA-specific antibodies (red) and DAPI at 30 hpf. The insets indicate the representative areas from each immunostaining and red dots indicate activated aurka within ECs. Scale bars, 40 μm. Quantification of phospho-aurka-positive ECs (E) in equivalent fields of view for each MO-injected zebrafish in (D) are the result of three independent experiments with ≥ 20 embryos per condition. The top and bottom whiskers represent the maximum and minimum values, respectively. *P < 0.05 (Unpaired Student's t-test).Zebrafish vegfa mRNA levels were quantified by qRT-PCR in eGFP-positive ECs of control- or cep41-MO-injected Tg(kdrl:eGFP) zebrafish subjected to either normoxia or hypoxia at 30 hpf. The expression of zebrafish β-actin was quantified for the normalization of these qRT-PCR results.vegfr2 (G) mRNA levels were quantified by qRT-PCR in eGFP-positive ECs of control- or cep41-MO-injected Tg(kdrl:eGFP) zebrafish subjected to either normoxia or hypoxia at 30 hpf. The expression of zebrafish β-actin was quantified for the normalization of these qRT-PCR results.Control and CEP41-deficient HUVECs, transfected with expression vectors encoding nothing (MOCK), AURKA, AURKA-T288D, HIF1α, or HIF1α with CEP41 were cultivated under hypoxia and subjected to an in vitro angiogenesis assay for 18 h. Scale bars, 400 μm.Control and CEP41-deficient HUVECs, transfected with expression vectors encoding nothing (MOCK), AURKA, AURKA-T288D, HIF1α, or HIF1α with CEP41 were cultivated under hypoxia and subjected to an in vitro angiogenesis assay for 18 h. Scale bars, 400 μm. Quantification of tube node number in (I) and tube length in (J) from data examined within equivalent fields of view at each time point using the ImageJ angiogenesis analyzer. Data are shown as mean ± SD of five independent experiments with ≥ 5 tubulogenesis regions per condition."}
{"words": ["Figure", "8HUVECs", "transfected", "with", "control", "or", "CEP41", "siRNAs", "were", "cultivated", "under", "hypoxia", "and", "their", "whole", "cell", "lysates", "were", "used", "for", "immunoblot", "assays", "of", "HIF1α", ".", "The", "HIF1α", "expression", "of", "hypoxic", "cells", "was", "compared", "to", "that", "of", "normoxic", "cells", "and", "the", "protein", "levels", "were", "normalized", "against", "β", "-", "ACTIN", "in", "the", "same", "blot", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "assays", "using", "HIF1α", "-", ",", "and", "CEP41", "-", "specific", "antibodies", "were", "performed", "in", "HEK", "293T", "cells", "expressing", "GFP", "-", "CEP41", "under", "normoxia", "or", "hypoxia", ".", "An", "IP", "using", "IgG", "-", "specific", "antibodies", "was", "performed", "as", "a", "negative", "control", ".", "NOR", ",", "normoxia", ";", "HYP", ",", "hypoxia", ".", "The", "CEP41", "-", "depleted", "HUVECs", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "encoding", "nothing", "(", "MOCK", ")", ",", "CEP41", ",", "or", "HIF1α", "and", "cultivated", "under", "hypoxia", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "used", "for", "immunoblot", "assays", "for", "phospho", "-", "AURKA", "and", "AURKA", ",", "and", "the", "resulting", "data", "were", "compared", "to", "those", "of", "normoxic", "and", "hypoxic", "control", "cells", ".", "Protein", "levels", "were", "normalized", "against", "β", "-", "ACTIN", "in", "the", "same", "blots", ".", "NOR", ",", "normoxia", ";", "HYP", ",", "hypoxia", ".", "The", "CEP41", "-", "deficient", "HUVECs", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "encoding", "nothing", "(", "MOCK", ")", ",", "CEP41", ",", "HIF1α", ",", "or", "HIF1α", "with", "CEP41", "and", "exposed", "to", "hypoxia", ".", "VEGFA", "(", "E", ")", "and", "VEGFR2", "(", "F", ")", "mRNA", "levels", "were", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", "using", "cDNA", "from", "transfected", "cells", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "the", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "non", "-", "significant", ")", ".", "NOR", ",", "normoxia", ";", "HYP", ",", "hypoxia", ".", "Control", "or", "CEP41", "-", "depleted", "HUVECs", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "encoding", "nothing", "(", "MOCK", ")", "or", "HIF1α", "and", "treated", "with", "MG132", "or", "not", ",", "and", "then", "the", "cells", "were", "cultivated", "under", "hypoxia", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "used", "for", "immunoblot", "assays", "for", "HIF1α", ",", "phospho", "-", "AURKA", ",", "and", "AURKA", ",", "and", "the", "protein", "levels", "were", "normalized", "against", "β", "-", "ACTIN", "in", "the", "same", "blots", ".", "NOR", ",", "normoxia", ";", "HYP", ",", "hypoxia", ".", "Quantification", "of", "tube", "node", "number", "in", "(", "H", ")", "and", "tube", "length", "in", "(", "I", ")", "from", "in", "vitro", "angiogenesis", "assays", "with", "HIF1α", "#", "1", "or", "#", "2", "siRNAs", "-", "transfected", "HUVECs", "overexpressing", "nothing", "(", "MOCK", ")", "or", "CEP41", "under", "hypoxia", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "five", "independent", "experiments", "with", "≥", "5", "tubulogenesis", "regions", "per", "condition", ".", "VEGFA", "(", "J", ")", "and", "VEGFR2", "(", "K", ")", "mRNA", "levels", "were", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", "using", "cDNA", "from", "hypoxic", "HIF1α", "-", "depleted", "HUVECs", "transfected", "with", "control", "or", "CEP41", "expression", "vectors", ".", "The", "results", "were", "compared", "to", "those", "of", "control", "and", "normoxic", "HIF1α", "-", "depleted", "cells", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8HUVECs transfected with control or CEP41 siRNAs were cultivated under hypoxia and their whole cell lysates were used for immunoblot assays of HIF1α. The HIF1α expression of hypoxic cells was compared to that of normoxic cells and the protein levels were normalized against β-ACTIN in the same blot.Co-immunoprecipitation assays using HIF1α-, and CEP41-specific antibodies were performed in HEK 293T cells expressing GFP-CEP41 under normoxia or hypoxia. An IP using IgG-specific antibodies was performed as a negative control. NOR, normoxia; HYP, hypoxia.The CEP41-depleted HUVECs were transfected with expression vectors encoding nothing (MOCK), CEP41, or HIF1α and cultivated under hypoxia. Whole cell lysates were used for immunoblot assays for phospho-AURKA and AURKA, and the resulting data were compared to those of normoxic and hypoxic control cells. Protein levels were normalized against β-ACTIN in the same blots. NOR, normoxia; HYP, hypoxia.The CEP41-deficient HUVECs were transfected with expression vectors encoding nothing (MOCK), CEP41, HIF1α, or HIF1α with CEP41 and exposed to hypoxia. VEGFA (E) and VEGFR2 (F) mRNA levels were analyzed by qRT-PCR using cDNA from transfected cells. Data are shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical significance was determined using the one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test (***P < 0.001, ns: non-significant). NOR, normoxia; HYP, hypoxia.Control or CEP41-depleted HUVECs were transfected with expression vectors encoding nothing (MOCK) or HIF1α and treated with MG132 or not, and then the cells were cultivated under hypoxia. Whole cell lysates were used for immunoblot assays for HIF1α, phospho-AURKA, and AURKA, and the protein levels were normalized against β-ACTIN in the same blots. NOR, normoxia; HYP, hypoxia.Quantification of tube node number in (H) and tube length in (I) from in vitro angiogenesis assays with HIF1α #1 or #2 siRNAs-transfected HUVECs overexpressing nothing (MOCK) or CEP41 under hypoxia. Data are shown as mean ± SD of five independent experiments with ≥ 5 tubulogenesis regions per condition.VEGFA (J) and VEGFR2 (K) mRNA levels were analyzed by qRT-PCR using cDNA from hypoxic HIF1α-depleted HUVECs transfected with control or CEP41 expression vectors. The results were compared to those of control and normoxic HIF1α-depleted cells. Data are shown as mean ± SD of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Analysis", "of", "the", "single", "-", "cell", "transcriptomics", "dataset", "for", "the", "mouse", "visual", "cortex", "(", "Tasic", "et", "al", ",", "2016", ")", "revealed", "that", "the", "expression", "of", "the", "metabolism", "-", "associated", "gene", "Cox6a2", "is", "highly", "restricted", "to", "PV", "+", "interneurons", ".", "Cox6a2", "is", "expressed", "in", "all", "subtypes", "of", "PV", "+", "interneurons", "(", "marked", "in", "blue", "color", ")", "but", "rarely", "detected", "in", "other", "neuronal", "subtypes", "from", "the", "mouse", "visual", "cortex", ".", "Cox6a1", ",", "which", "encodes", "the", "other", "protein", "isoform", "of", "COX6A", ",", "is", "expressed", "in", "all", "subtypes", ".", "(", "B", "RT", "-", "PCR", "showing", "expression", "of", "Cox6a2", "in", "the", "brain", "and", "heart", ".", "C", ")", "Western", "-", "blot", "showing", "expression", "of", "Cox6a2", "in", "the", "brain", "and", "heart", ".", "(", "D", ")", "Western", "-", "blot", "analysis", "showed", "that", "COX6A2", "is", "first", "detected", "in", "the", "brain", "at", "postnatal", "day", "0", "(", "P0", ")", ".", "Then", ",", "COX6A2", "protein", "levels", "gradually", "increase", "until", "P60", ".", "COX6A2", "immunoreactivity", "is", "detected", "in", "PV", "+", "interneurons", "in", "different", "brain", "areas", "of", "adult", "mice", ",", "including", "the", "cortex", "(", "general", "overview", "in", "E", ",", "and", "single", "PV", "+", "interneuron", "magnification", "in", "F", ")", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", ".", "COX6A2", "immunoreactivity", "is", "detected", "in", "PV", "+", "interneurons", "in", "hippocampus", "(", "G", ")", "and", "striatum", "(", "H", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", ".", "(", "I", ",", "J", ")", "Quantifications", "showing", "almost", "100", "%", "of", "co", "-", "localization", "of", "COX6A2", "+", "cells", "and", "PV", "+", "cells", "in", "the", "somatosensory", "(", "SS", ")", "and", "motor", "(", "MT", ")", "cortices", ",", "and", "the", "hippocampus", "(", "HI", ")", "of", "adult", "mice", "(", "n", "animals", "=", "4", ",", "2", "months", "old", ",", "n", "sections", "=", "24", "SS", ",", "16", "MT", ",", "8", "HI", ")", ".", "(", "K", ")", "COX6A2", "immunoreactivity", "in", "the", "cortex", "at", "P9", "(", "n", "animals", "=", "2", ",", "n", "sections", "=", "12", "SS", ",", "8", "MT", ",", "4", "HI", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "Cox6a2", "positive", "cells", ".", "(", "L", "-", "N", ")", "As", "soon", "as", "parvalbumin", "immunoreactivity", "becomes", "visible", "at", "P13", ",", "almost", "100", "%", "of", "PV", "+", "cells", "are", "co", "-", "labelled", "with", "COX6A2", "immunoreactivity", "in", "the", "SS", "and", "MT", "cortices", ",", "and", "the", "HI", "of", "P13", "mice", "(", "n", "=", "2", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Analysis of the single-cell transcriptomics dataset for the mouse visual cortex (Tasic et al, 2016) revealed that the expression of the metabolism-associated gene Cox6a2 is highly restricted to PV+ interneurons. Cox6a2 is expressed in all subtypes of PV+ interneurons (marked in blue color) but rarely detected in other neuronal subtypes from the mouse visual cortex. Cox6a1, which encodes the other protein isoform of COX6A, is expressed in all subtypes.(B RT-PCR showing expression of Cox6a2 in the brain and heart.C) Western-blot showing expression of Cox6a2 in the brain and heart.(D) Western-blot analysis showed that COX6A2 is first detected in the brain at postnatal day 0 (P0). Then, COX6A2 protein levels gradually increase until P60.COX6A2 immunoreactivity is detected in PV+ interneurons in different brain areas of adult mice, including the cortex (general overview in E, and single PV+ interneuron magnification in F) White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells.COX6A2 immunoreactivity is detected in PV+ interneurons in hippocampus (G) and striatum (H). White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells.(I,J) Quantifications showing almost 100% of co-localization of COX6A2+ cells and PV+ cells in the somatosensory (SS) and motor (MT) cortices, and the hippocampus (HI) of adult mice (n animals=4, 2 months old, n sections=24 SS, 16 MT, 8 HI).(K) COX6A2 immunoreactivity in the cortex at P9 (n animals=2, n sections=12 SS, 8 MT, 4 HI). White arrowheads indicate Cox6a2 positive cells.(L-N) As soon as parvalbumin immunoreactivity becomes visible at P13, almost 100% of PV+ cells are co-labelled with COX6A2 immunoreactivity in the SS and MT cortices, and the HI of P13 mice (n=2)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "COX6A2", "immunoreactivity", "is", "virtually", "restricted", "to", "PV", "+", "interneurons", "in", "the", "somatosensory", "(", "SS", ")", "and", "motor", "(", "MT", ")", "cortices", ",", "and", "the", "hippocampus", "(", "HI", ")", "of", "adult", "rat", "(", "n", "animals", "=", "1", ",", "2", ".", "5", "months", "old", ",", "n", "sections", "=", "12", "SS", ",", "8", "MT", ",", "4", "HI", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "In", "the", "SS", "of", "adult", "rhesus", "monkey", ",", "COX6A2", "immunoreactivity", "is", "present", "exclusively", "in", "PV", "+", "cells", "(", "n", "animals", "=", "1", ",", "1", "-", "year", "-", "old", ",", "n", "sections", "=", "6", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "In", "adult", "humans", ",", "all", "cortical", "PV", "+", "interneurons", "from", "Brodmann", "areas", "9", "and", "10", "(", "BA9", "and", "BA10", ")", "are", "co", "-", "labelled", "with", "COX6A2", "immunoreactivity", ".", "However", ",", "PV", "+", "interneurons", "only", "represent", "60", "%", "of", "the", "cells", "in", "which", "COX6A2", "is", "detected", "(", "n", "human", "subjects", "=", "2", ",", "59", "-", "and", "69", "-", "year", "-", "old", ",", "n", "sections", "=", "6", "BA9", ",", "6", "BA10", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A,B) COX6A2 immunoreactivity is virtually restricted to PV+ interneurons in the somatosensory (SS) and motor (MT) cortices, and the hippocampus (HI) of adult rat (n animals=1, 2.5 months old, n sections=12 SS, 8 MT, 4 HI). White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells.(C,D) In the SS of adult rhesus monkey, COX6A2 immunoreactivity is present exclusively in PV+ cells (n animals=1, 1-year-old, n sections=6). White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells.(E,F) In adult humans, all cortical PV+ interneurons from Brodmann areas 9 and 10 (BA9 and BA10) are co-labelled with COX6A2 immunoreactivity. However, PV+ interneurons only represent 60% of the cells in which COX6A2 is detected (n human subjects=2, 59- and 69-year-old, n sections=6 BA9, 6 BA10). White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Images", "showing", "absence", "of", "COX6A2", "immunoreactivity", "in", "the", "cortex", "of", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Parvalbumin", "immunoreactivity", "in", "PV", "+", "interneurons", "was", "significantly", "decreased", "in", "the", "somatosensory", "cortex", "of", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "compared", "to", "wild", "-", "types", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "4", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "2", "-", "month", "-", "old", ")", ".", "C", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "In", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", ",", "cortical", "PV", "+", "interneurons", "showed", "a", "fewer", "number", "of", "synapses", "innervating", "principal", "neurons", "(", "n", "=", "3", "WT", ",", "3", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "2", "-", "month", "-", "old", ")", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "E", ")", "To", "analyze", "changes", "in", "oxidative", "stress", "in", "PV", "+", "interneurons", ",", "the", "somatosensory", "and", "motor", "cortices", "of", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "were", "stained", "with", "an", "antibody", "against", "8", "-", "OHdG", ",", "a", "marker", "of", "oxidative", "DNA", "damage", ".", "(", "F", ")", "8", "-", "OHdG", "immunoreactivity", "was", "significantly", "higher", "in", "PV", "+", "null", "in", "both", "cortices", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "4", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "2", "-", "month", "-", "old", ")", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "(", "G", ")", "The", "density", "of", "PNNs", "around", "PV", "+", "interneurons", "residing", "in", "the", "somatosensory", "and", "motor", "cortices", "was", "analyzed", "by", "measuring", "the", "immunoreactivity", "of", "WFA", "that", "stains", "PNNs", ".", "(", "H", ")", "WFA", "immunoreactivity", "around", "PV", "+", "cells", "was", "lower", "in", "both", "cortices", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "4", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "2", "-", "month", "-", "old", ")", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "tests", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Images showing absence of COX6A2 immunoreactivity in the cortex of Cox6a2-/- mice.(B,C) Parvalbumin immunoreactivity in PV+ interneurons was significantly decreased in the somatosensory cortex of Cox6a2-/- mice compared to wild-types (n=4 WT, 4 Cox6a2-/-; 2-month-old). C: two-tailed unpaired Student's t-test.(D) In Cox6a2-/- mice, cortical PV+ interneurons showed a fewer number of synapses innervating principal neurons (n=3 WT, 3 Cox6a2-/-; 2-month-old). Two-tailed unpaired Student's t-test.(E) To analyze changes in oxidative stress in PV+ interneurons, the somatosensory and motor cortices of WT and Cox6a2-/- mice were stained with an antibody against 8-OHdG, a marker of oxidative DNA damage. (F) 8-OHdG immunoreactivity was significantly higher in PV+ null in both cortices in Cox6a2-/- mice (n=4 WT, 4 Cox6a2-/-; 2-month-old). Two-tailed unpaired Mann-Whitney tests. (G) The density of PNNs around PV+ interneurons residing in the somatosensory and motor cortices was analyzed by measuring the immunoreactivity of WFA that stains PNNs. (H) WFA immunoreactivity around PV+ cells was lower in both cortices in Cox6a2-/- mice (n=4 WT, 4 Cox6a2-/-; 2-month-old). Two-tailed unpaired Mann-Whitney tests. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "PV", "+", "interneurons", "were", "sorted", "from", "cortices", "of", "PV", "-", "EGFP", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "at", "P15", "and", "processed", "for", "bulk", "RNA", "sequencing", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "6", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "P15", ")", ".", "Heatmap", "shows", "expression", "for", "top", "down", "-", "(", "red", ")", "and", "upregulated", "(", "blue", ")", "genes", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "relative", "to", "their", "WT", "counterparts", ".", "(", "B", ")", "Cox6a2", "expression", "was", "effectively", "abolished", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", ".", "In", "addition", ",", "Cox6a2", "knockout", "led", "to", "a", "decreased", "expression", "of", "Gad1", "and", "Gad2", "genes", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "6", "Cox6a2", "-", "/", "-", ")", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "(", "C", ")", "Changes", "in", "expression", "of", "oxidative", "stress", "-", "related", "genes", "(", "green", ")", ",", "genes", "coding", "for", "AMPA", "receptors", "(", "orange", ")", ",", "sodium", "channels", "(", "red", ")", ",", "potassium", "channels", "(", "magenta", ")", ",", "and", "internal", "calcium", "signaling", "proteins", "(", "blue", ")", ".", "Color", "scale", "bars", "show", "normalized", "read", "counts", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) PV+ interneurons were sorted from cortices of PV-EGFP WT and Cox6a2-/- mice at P15 and processed for bulk RNA sequencing (n= 4 WT, 6 Cox6a2-/-; P15). Heatmap shows expression for top down- (red) and upregulated (blue) genes in Cox6a2-/- PV+ interneurons relative to their WT counterparts.(B) Cox6a2 expression was effectively abolished in Cox6a2-/- PV+ interneurons. In addition, Cox6a2 knockout led to a decreased expression of Gad1 and Gad2 genes (n= 4 WT, 6 Cox6a2-/-). Two-tailed unpaired Mann-Whitney tests.(C) Changes in expression of oxidative stress-related genes (green), genes coding for AMPA receptors (orange), sodium channels (red), potassium channels (magenta), and internal calcium signaling proteins (blue). Color scale bars show normalized read counts."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "PV", "+", "interneurons", "from", "PV", "-", "CRE", "and", "PV", "-", "CRE", ";", "Cox6a2fl", "/", "fl", "mice", "showing", "PercevalHR", "fluorescence", "after", "excitation", "at", "930", "nm", "and", "840", "nm", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PercevalHR", "expressing", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "(", "E", ")", "PV", "+", "interneurons", "from", "PV", "-", "CRE", ";", "Cox6a2fl", "/", "fl", "mice", "exhibited", "significantly", "lower", "ATP", "-", "to", "-", "ADP", "ratios", "than", "PV", "+", "interneurons", "from", "PV", "-", "CRE", "mice", "throughout", "the", "entire", "duration", "of", "the", "recordings", "(", "23", "cells", "from", "4", "PV", "-", "CRE", "mice", ";", "15", "cells", "from", "6", "PV", "-", "CRE", ";", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D) Representative images of PV+ interneurons from PV-CRE and PV-CRE;Cox6a2fl/fl mice showing PercevalHR fluorescence after excitation at 930 nm and 840 nm. White arrowheads indicate PercevalHR expressing cells. Scale bar: 20 μm.(E) PV+ interneurons from PV-CRE;Cox6a2fl/fl mice exhibited significantly lower ATP-to-ADP ratios than PV+ interneurons from PV-CRE mice throughout the entire duration of the recordings (23 cells from 4 PV-CRE mice; 15 cells from 6 PV-CRE;Cox6a2-/- mice)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "The", "resting", "membrane", "potential", "and", "amplitude", "of", "action", "potentials", "in", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", ",", "respectively", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "The", "threshold", "for", "action", "potentials", "increased", "over", "maturation", "in", "WT", "but", "not", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", ".", "As", "a", "result", ",", "the", "threshold", "for", "action", "potentials", "was", "significantly", "lower", "in", "P34", "-", "45", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "when", "compared", "to", "their", "WT", "counterparts", ".", "D", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Trains", "of", "action", "potentials", "were", "evoked", "by", "2", "sec", "depolarizing", "current", "pulses", ".", "The", "amplitude", "difference", "(", "difference", "between", "the", "mean", "amplitude", "of", "1st", "-", "10th", "action", "potentials", "and", "190th", "-", "200th", "action", "potentials", ")", "was", "significantly", "higher", "in", "P34", "-", "45", "Cox6a2", "-", "/", "-", "compared", "to", "WT", "PV", "+", "interneurons", ".", "In", "addition", ",", "the", "amplitude", "difference", "decreased", "with", "maturation", "in", "WT", "but", "not", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", ".", "F", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "(", "G", ")", "While", "in", "WT", "PV", "+", "interneurons", "the", "maximal", "firing", "frequency", "increased", "during", "maturation", ",", "such", "increase", "was", "abolished", "by", "Cox6a2", "knockout", ".", "Thus", ",", "maximal", "firing", "frequency", "reached", "during", "2", "sec", "depolarizing", "current", "pulses", "was", "lower", "in", "P34", "-", "45", "Cox6a2", "-", "/", "-", "compared", "to", "WT", "PV", "+", "interneurons", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "(", "H", ")", "Recorded", "PV", "+", "interneurons", "were", "filled", "with", "biocytin", "and", "their", "dendritic", "morphology", "was", "reconstructed", "using", "Imaris", "software", ".", "Scale", "bars", ":", "30", "μm", ".", "(", "I", ",", "J", ")", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "showed", "a", "negative", "correlation", "between", "age", "and", "dendritic", "length", "and", "between", "age", "and", "full", "branch", "depth", "(", "maximal", "number", "of", "branches", "between", "the", "soma", "and", "a", "terminal", "dendritic", "point", ")", ",", "which", "contrasted", "with", "the", "expected", "positive", "correlation", "between", "these", "parameters", "in", "WT", "PV", "+", "interneurons", ".", "Linear", "regression", "of", "Pearson", "correlation", ".", "(", "K", ",", "L", ")", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "showed", "similar", "values", "for", "dendritic", "length", "and", "full", "branch", "depth", "at", "P22", "-", "P33", ".", "However", ",", "at", "P34", "-", "P45", ",", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "showed", "lower", "dendritic", "length", "and", "full", "branch", "depth", "than", "WT", "PV", "+", "interneurons", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", ".", "(", "M", ",", "N", ")", "While", "younger", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "have", "similar", "dendritic", "tree", "complexities", "(", "M", ")", ",", "at", "the", "later", "stage", "of", "maturation", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "show", "a", "reduction", "in", "dendritic", "tree", "complexity", "in", "comparison", "to", "WT", "PV", "+", "interneurons", "(", "N", ")", ".", "Multiple", "t", "-", "tests", ",", "two", "-", "stage", "step", "-", "up", "method", "of", "Benjamini", ",", "Krieger", "and", "Yekutieli", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A,B) The resting membrane potential and amplitude of action potentials in WT and Cox6a2-/- PV+ interneurons, respectively. Two-tailed unpaired Student's t-tests.(C,D) The threshold for action potentials increased over maturation in WT but not in Cox6a2-/- PV+ interneurons. As a result, the threshold for action potentials was significantly lower in P34-45 Cox6a2-/- PV+ interneurons when compared to their WT counterparts. D: two-tailed unpaired Student's t-tests.(E,F) Trains of action potentials were evoked by 2 sec depolarizing current pulses. The amplitude difference (difference between the mean amplitude of 1st-10th action potentials and 190th-200th action potentials) was significantly higher in P34-45 Cox6a2-/- compared to WT PV+ interneurons. In addition, the amplitude difference decreased with maturation in WT but not in Cox6a2-/- PV+ interneurons. F: two-tailed unpaired Mann-Whitney tests.(G) While in WT PV+ interneurons the maximal firing frequency increased during maturation, such increase was abolished by Cox6a2 knockout. Thus, maximal firing frequency reached during 2 sec depolarizing current pulses was lower in P34-45 Cox6a2-/- compared to WT PV+ interneurons. Two-tailed unpaired Student's t-tests.(H) Recorded PV+ interneurons were filled with biocytin and their dendritic morphology was reconstructed using Imaris software. Scale bars: 30 μm.(I,J) Cox6a2-/- PV+ interneurons showed a negative correlation between age and dendritic length and between age and full branch depth (maximal number of branches between the soma and a terminal dendritic point), which contrasted with the expected positive correlation between these parameters in WT PV+ interneurons. Linear regression of Pearson correlation.(K,L) WT and Cox6a2-/- PV+ interneurons showed similar values for dendritic length and full branch depth at P22-P33. However, at P34-P45, Cox6a2-/- PV+ interneurons showed lower dendritic length and full branch depth than WT PV+ interneurons. Two-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons tests.(M,N) While younger WT and Cox6a2-/- PV+ interneurons have similar dendritic tree complexities (M), at the later stage of maturation Cox6a2-/- PV+ interneurons show a reduction in dendritic tree complexity in comparison to WT PV+ interneurons (N). Multiple t-tests, two-stage step-up method of Benjamini, Krieger and Yekutieli."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "In", "the", "OFT", ",", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "travelled", "a", "longer", "distance", "and", "moved", "faster", "than", "WT", "mice", ".", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "also", "moved", "more", "often", "from", "the", "outer", "zone", "to", "the", "inner", "zone", "of", "the", "arena", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "(", "D", ")", "In", "the", "SIT", ",", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "also", "travelled", "a", "longer", "distance", "with", "higher", "mean", "velocity", "than", "WT", "mice", ".", "Additionally", ",", "both", "Cox6a2", "-", "/", "-", "and", "WT", "mice", "spent", "more", "time", "exploring", "the", "container", "with", "the", "stranger", "mouse", "than", "the", "empty", "container", ".", "Total", "distance", "moved", ",", "mean", "velocity", ",", "and", "f", "[", "number", "of", "crossings", "]", "outer", "to", "inner", "zone", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Social", "interaction", ":", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "(", "F", ")", "The", "startle", "responses", "were", "significantly", "lower", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "when", "the", "loud", "stimulus", "(", "120", "dB", ")", "was", "presented", "alone", "the", "first", "5", "times", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", ".", "(", "G", ")", "The", "PPI", "of", "the", "acoustic", "startle", "response", "was", "similar", "at", "all", "pre", "-", "pulses", "for", "Cox6a2", "-", "/", "-", "and", "WT", "mice", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) In the OFT, Cox6a2-/- mice travelled a longer distance and moved faster than WT mice. Cox6a2-/- mice also moved more often from the outer zone to the inner zone of the arena. Two-tailed unpaired Student's t-tests.(D) In the SIT, Cox6a2-/- mice also travelled a longer distance with higher mean velocity than WT mice. Additionally, both Cox6a2-/- and WT mice spent more time exploring the container with the stranger mouse than the empty container. Total distance moved, mean velocity, and f [number of crossings] outer to inner zone: two-tailed unpaired Student's t-test. Social interaction: two-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons test.(F) The startle responses were significantly lower in Cox6a2-/- mice when the loud stimulus (120 dB) was presented alone the first 5 times. Two-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons tests.(G) The PPI of the acoustic startle response was similar at all pre-pulses for Cox6a2-/- and WT mice. Two-way ANOVA followed by Sidak's multiple comparisons tests."}
{"words": ["Figure", "1Survival", "curves", "for", "control", "(", "n", "=", "23", "biological", "replicates", ")", ",", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "20", "biological", "replicates", ")", ",", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1", "/", "2", "/", "3fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "10", "biological", "replicates", ")", ".", "Paired", "male", "or", "female", "mice", "were", "used", "and", "no", "gender", "biases", "associated", "with", "genotypes", "were", "observed", ".", "Representative", "H", "&", "E", "staining", "of", "the", "lungs", "(", "top", "panel", ")", "and", "small", "intestine", "(", "bottom", "panel", ")", "and", "histopathological", "scoring", "of", "3", "months", "old", "control", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", "test", ".", "Scale", "bar", "=", "263", "and", "53", "µm", ",", "top", "and", "bottom", "panels", ",", "respectively", ".", ",", "Paired", "male", "or", "female", "mice", "were", "used", "and", "no", "gender", "biases", "associated", "with", "genotypes", "were", "observed", ".", "Frequency", "of", "FoxP3", "+", "cells", "among", "CD4", "+", "T", "cells", "in", "the", "thymus", "(", "n", "=", "6", "or", "10", "biological", "replicates", ")", ",", "peripheral", "lymph", "nodes", "(", "n", "=", "5", "or", "6", "biological", "replicates", ")", ",", "spleen", "(", "n", "=", "5", "or", "6", "biological", "replicates", ")", "and", "mesenteric", "lymph", "nodes", "(", "n", "=", "4", "or", "8", "biological", "replicates", ")", "pre", "-", "gated", "on", "live", "CD4", "+", "TCRβ", "+", "T", "cells", "and", "representative", "flow", "plots", "(", "bottom", ")", ".", "Data", "are", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", "test", ".", "Paired", "male", "or", "female", "mice", "were", "used", "and", "no", "gender", "biases", "associated", "with", "genotypes", "were", "observed", ".", "Absolute", "number", "of", "FoxP3", "+", "Tregs", "from", "the", "thymus", "(", "n", "=", "5", "or", "7", "biological", "replicates", ")", "and", "spleen", "(", "n", "=", "7", "or", "8", "biological", "replicates", ")", "of", "control", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "mice", ".", "Data", "is", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "t", "test", ".", "Paired", "male", "or", "female", "mice", "were", "used", "and", "no", "gender", "biases", "associated", "with", "genotypes", "were", "observed", ".", "Quantification", "of", "CD25", "MFI", "expression", "on", "FoxP3", "+", "T", "cells", "in", "the", "spleen", "of", "control", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "is", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "t", "test", ".", "Paired", "male", "or", "female", "mice", "were", "used", "and", "no", "gender", "biases", "associated", "with", "genotypes", "were", "observed", ".", "Quantification", "of", "FoxP3", "MFI", "expression", "on", "FoxP3", "+", "T", "cells", "in", "the", "spleen", "of", "control", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "is", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "t", "test", ".", "Quantification", "of", "ICOS", "MFI", "expression", "on", "FoxP3", "+", "T", "cells", "from", "the", "mesenteric", "lymph", "nodes", "of", "control", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "7", "biological", "replicates", ")", "mice", ".", "Data", "is", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "t", "test", ".", ",", "Paired", "male", "or", "female", "mice", "were", "used", "and", "no", "gender", "biases", "associated", "with", "genotypes", "were", "observed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Survival curves for control (n=23 biological replicates), Rorc(t)CreTg Tet1/3fl/fl(n=20 biological replicates), Rorc(t)CreTg Tet1/2/3fl/fl mice (n=10 biological replicates). Paired male or female mice were used and no gender biases associated with genotypes were observed.Representative H&E staining of the lungs (top panel) and small intestine (bottom panel) and histopathological scoring of 3 months old control (n=3 biological replicates) and Rorc(t)CreTg Tet1/3fl/fl mice (n=3 biological replicates). Data are means +/-SEM, One-Way ANOVA with uncorrected Fisher's LSD test. Scale bar = 263 and 53 µm, top and bottom panels, respectively. , Paired male or female mice were used and no gender biases associated with genotypes were observed.Frequency of FoxP3+ cells among CD4+ T cells in the thymus (n=6 or 10 biological replicates), peripheral lymph nodes (n=5 or 6 biological replicates), spleen (n=5 or 6 biological replicates) and mesenteric lymph nodes (n=4 or 8 biological replicates) pre-gated on live CD4+TCRβ+ T cells and representative flow plots (bottom). Data are means +/- SEM, One-Way ANOVA with uncorrected Fisher's LSD test. Paired male or female mice were used and no gender biases associated with genotypes were observed.Absolute number of FoxP3+ Tregs from the thymus (n=5 or 7 biological replicates) and spleen (n=7 or 8 biological replicates) of control Tet1/3fl/fl and Rorc(t)CreTg Tet1/3fl/fl mice. Data is means +/- SEM, unpaired Mann-Whitney t test. Paired male or female mice were used and no gender biases associated with genotypes were observed.Quantification of CD25 MFI expression on FoxP3+ T cells in the spleen of control Tet1/3fl/fl (n=4 biological replicates) and Rorc(t)CreTg Tet1/3fl/fl mice (n=4 biological replicates). Data is means +/- SEM, unpaired Mann-Whitney t test. Paired male or female mice were used and no gender biases associated with genotypes were observed.Quantification of FoxP3 MFI expression on FoxP3+ T cells in the spleen of control Tet1/3fl/fl (n=6 biological replicates) and Rorc(t)CreTg Tet1/3fl/fl mice (n=6 biological replicates). Data is means +/- SEM, unpaired Mann-Whitney t test.   Quantification of ICOS MFI expression on FoxP3+ T cells from the mesenteric lymph nodes of control Tet1/3fl/fl (n=5 biological replicates) and Rorc(t)CreTg Tet1/3fl/fl (n=7 biological replicates) mice. Data is means +/- SEM, unpaired Mann-Whitney t test.   , Paired male or female mice were used and no gender biases associated with genotypes were observed."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "flow", "plots", ",", "histogram", "and", "quantification", "of", "CD4", "gMFI", "expression", "in", "Treg", "cells", "activated", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "is", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Weight", "curve", "of", "female", "Rag", "-", "/", "-", "mice", "after", "T", "-", "cell", "transfer", "colitis", "induced", "via", "transfer", "of", "naïve", "WT", "CD45", ".", "1", "conventional", "CD4", "+", "T", "cells", "alone", "(", "n", "=", "5", "recipients", ")", "or", "in", "combination", "with", "Tregs", "isolated", "from", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "littermates", "(", "n", "=", "5", "recipients", "/", "group", ")", ".", "Data", "is", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Geisser", "-", "Greenhouse", "correction", ".", "Experiment", "was", "replicated", "2", "times", ".", "Representative", "flow", "plots", "and", "quantification", "of", "percent", "Tbet", "+", ",", "Rorγt", "+", "and", "FoxP3", "+", "of", "CD45", ".", "1", "CD4", "+", "effector", "cells", "isolated", "from", "the", "MLN", "of", "female", "Rag", "-", "/", "-", "mice", "7", "weeks", "post", "T", "cell", "transfer", "induced", "colitis", ".", "Respective", "cohorts", "were", "Naïve", "CD45", ".", "1", "T", "cells", "only", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", ",", "WT", "CD45", ".", "1", "+", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "Tregs", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", "and", "WT", "CD45", ".", "1", "+", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1", "/", "3fl", "/", "fl", "Tregs", "(", "n", "=", "4", "mice", ")", ".", "Cells", "were", "pre", "-", "gated", "on", "Live", "CD45", ".", "1", "+", "TCRβ", "+", "cells", ".", "Data", "is", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "Multiple", "comparison", "test", ".", "Experiment", "was", "replicated", "2", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative flow plots, histogram and quantification of CD4 gMFI expression in Treg cells activated as in (A). Data is means+/-SEM, unpaired t-test.Weight curve of female Rag-/- mice after T-cell transfer colitis induced via transfer of naïve WT CD45.1 conventional CD4+ T cells alone (n=5 recipients) or in combination with Tregs isolated from Tet1/3fl/fl and Rorc(t)CreTg Tet1/3fl/fl littermates (n=5 recipients/group). Data is means +/- SEM, Two-Way ANOVA with Geisser-Greenhouse correction. Experiment was replicated 2 times.Representative flow plots and quantification of percent Tbet+, Rorγt+ and FoxP3+ of CD45.1 CD4+ effector cells isolated from the MLN of female Rag-/- mice 7 weeks post T cell transfer induced colitis. Respective cohorts were Naïve CD45.1 T cells only (n=5 mice), WT CD45.1+ Tet1/3fl/fl Tregs (n=5 mice) and WT CD45.1+Rorc(t)CreTg Tet1/3fl/fl Tregs (n=4 mice). Cells were pre-gated on Live CD45.1+TCRβ+ cells. Data is means+/- SEM, Two-Way ANOVA with Tukey's Multiple comparison test. Experiment was replicated 2 times."}
{"words": ["Figure", "3Quantification", "of", "Live", "CD4", "+", "FoxP3", "+", "T", "cells", "absolute", "cell", "numbers", "in", "different", "organs", "of", "FoxP3Cre", "Tet1", "/", "3", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "and", "FoxP3Cre", "Tet1", "/", "3", "fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "male", "littermate", "mice", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", "test", ".", "Quantification", "of", "CD25", "-", "FoxP3lo", ",", "CD25", "+", "FoxP3", "-", "and", "CD25", "+", "FoxP3", "+", "cells", "among", "Live", "CD73", "-", "CD4", "+", "T", "cells", "thymocytes", "of", "control", "Tet3fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet3fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "mice", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Quantification", "of", "CD25", "-", "FoxP3lo", ",", "CD25", "+", "FoxP3", "-", "and", "CD25", "+", "FoxP3", "+", "cells", "among", "Live", "CD73", "-", "CD4", "+", "T", "cells", "thymocytes", "of", "control", "Tet1fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet1fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "paired", "male", "or", "female", "mice", "were", "used", "and", "no", "gender", "biases", "associated", "with", "genotypes", "were", "observed", ".", "Quantification", "of", "Nur77", "staining", "among", "TCRβhi", "CD69", "+", "CD4", "SP", "thymocytes", "from", "control", "Tet3fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Tet3fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "is", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "t", "-", "test", "Quantification", "of", "Nur77", "staining", "among", "TCRβhi", "CD69", "+", "CD4", "SP", "thymocytes", "from", "control", "Tet1fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "and", "Rorc", "(", "t", ")", "CreTg", "Te1fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "t", "-", "test", "paired", "male", "or", "female", "mice", "were", "used", "and", "no", "gender", "biases", "associated", "with", "genotypes", "were", "observed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Quantification of Live CD4+ FoxP3+ T cells absolute cell numbers in different organs of FoxP3Cre Tet1/3+/+ (n=3 biological replicates) and FoxP3Cre Tet1/3 fl/fl (n=3 biological replicates) male littermate mice. Data is shown as means+/- SEM, One-Way ANOVA with uncorrected Fisher's LSD test.Quantification of CD25-FoxP3lo, CD25+FoxP3- and CD25+FoxP3+ cells among Live CD73-CD4+ T cells thymocytes of control Tet3fl/fl (n=5 biological replicates) and Rorc(t)CreTg Tet3fl/fl mice (n=3 biological replicates) mice. Data is shown as means+/- SEM, Two-Way ANOVA with Sidak's multiple comparison test. Quantification of CD25-FoxP3lo, CD25+FoxP3- and CD25+FoxP3+ cells among Live CD73-CD4+ T cells thymocytes of control Tet1fl/fl (n=6 biological replicates) and Rorc(t)CreTg Tet1fl/fl mice (n=6 biological replicates). Data is shown as means+/- SEM, Two-Way ANOVA with Sidak's multiple comparison test. paired male or female mice were used and no gender biases associated with genotypes were observed.Quantification of Nur77 staining among TCRβhi CD69+ CD4 SP thymocytes from control Tet3fl/fl (n=5 biological replicates) and Rorc(t)CreTg Tet3fl/fl mice (n=3 biological replicates). Data is as means+/- SEM, unpaired two-tailed Mann-Whitney t-test Quantification of Nur77 staining among TCRβhi CD69+ CD4 SP thymocytes from control Tet1fl/fl (n=4 biological replicates) and Rorc(t)CreTg Te1fl/fl mice (n=3 biological replicates). Data is shown as means+/- SEM, unpaired two-tailed Mann-Whitney t-test paired male or female mice were used and no gender biases associated with genotypes were observed."}
{"words": ["Figure", "4Quantification", "of", "%", "FoxP3", "+", "cells", "72hrs", "post", "activation", "of", "sorted", "naïve", "CD4", "+", "T", "cells", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "CD28", "and", "20", "ng", "/", "mL", "TGF", "-", "β", "in", "the", "presence", "of", "absence", "of", "indicated", "amounts", "of", "rhIL", "-", "2", "for", "72hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "dose", ")", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", "of", "3", "independent", "samples", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "with", "uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", "test", ".", "IL", "-", "2", "mRNA", "quantification", "by", "qPCR", "in", "CD4", "+", "T", "cells", "post", "-", "activation", "at", "indicated", "time", "-", "points", "(", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "/", "genotype", ")", ".", "Cells", "were", "stimulated", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "CD28", "without", "exogenous", "IL", "-", "2", "or", "TGF", "-", "β", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "testIL", "-", "2", "quantification", "by", "ELISA", "in", "supernatants", "collected", "at", "48", "hours", "post", "activation", "of", "naïve", "CD4", "+", "T", "cells", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "CD28", "without", "exogenous", "IL", "-", "2", "and", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "20ng", "/", "mL", "TGF", "-", "β", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "testIL", "-", "2", "quantification", "by", "ELISA", "in", "supernatants", "collected", "at", "5", "hours", "post", "activation", "of", "naïve", "CD4", "T", "cells", "with", "PMA", "/", "Ionomycin", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "IL", "-", "2", "quantification", "by", "ELISA", "in", "supernatants", "collected", "at", "72hrs", "following", "activation", "of", "CD4", "T", "cells", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "CD28", "without", "exogenous", "IL", "-", "2", "or", "TGF", "-", "β", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "Multiple", "comparison", "test", ".", "Quantification", "of", "%", "FoxP3", "+", "cells", "among", "CD4", "T", "cells", "72hrs", "activation", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "CD28", "and", "20", "ng", "/", "mL", "TGF", "-", "β", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "50U", "rhIL", "-", "2", "for", "72hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "Multiple", "comparison", "test", ".", "Quantification", "of", "%", "FoxP3", "+", "cells", "among", "CD4", "T", "cells", "72hrs", "activation", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "CD28", "and", "20", "ng", "/", "mL", "TGF", "-", "β", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "50U", "rhIL", "-", "2", "for", "72hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "is", "shown", "as", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "Multiple", "comparison", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Quantification of % FoxP3+ cells 72hrs post activation of sorted naïve CD4+ T cells with anti-CD3/CD28 and 20 ng/mL TGF-β in the presence of absence of indicated amounts of rhIL-2 for 72hrs (n=3 biological replicates per dose). Data is shown as means+/-SEM of 3 independent samples, Two-Way ANOVA with uncorrected Fisher's LSD test.IL-2 mRNA quantification by qPCR in CD4+ T cells post-activation at indicated time-points (n=2 biological replicates/genotype). Cells were stimulated with anti-CD3/CD28 without exogenous IL-2 or TGF-β. Data is shown as means+/-SEM, Two-Way ANOVA with Sidak's multiple comparison testIL-2 quantification by ELISA in supernatants collected at 48 hours post activation of naïve CD4+ T cells with anti-CD3/CD28 without exogenous IL-2 and in the presence or absence of 20ng/mL TGF-β (n=4 biological replicates). Data is shown as means+/-SEM, Two-Way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison testIL-2 quantification by ELISA in supernatants collected at 5 hours post activation of naïve CD4 T cells with PMA/Ionomycin (n=7). Data is shown as means+/-SEM, Two-Way ANOVA with Sidak's multiple comparison test   IL-2 quantification by ELISA in supernatants collected at 72hrs following activation of CD4 T cells with anti-CD3/CD28 without exogenous IL-2 or TGF-β (n=3). Data is shown as means+/-SEM, One-Way ANOVA with Tukey's Multiple comparison test.  Quantification of % FoxP3+ cells among CD4 T cells 72hrs activation with anti-CD3/CD28 and 20 ng/mL TGF-β in the presence or absence of 50U rhIL-2 for 72hrs (n=3 biological replicates). Data is shown as means+/-SEM, One-Way ANOVA with Tukey's Multiple comparison test.   Quantification of % FoxP3+ cells among CD4 T cells 72hrs activation with anti-CD3/CD28 and 20 ng/mL TGF-β in the presence or absence of 50U rhIL-2 for 72hrs (n=3 biological replicates). Data is shown as means+/-SEM, One-Way ANOVA with Tukey's Multiple comparison test.  "}
{"words": ["Figure", "5Integrated", "genome", "viewer", "(", "IGV", ")", "browser", "tracks", "of", "the", "Lck", ",", "Fyn", "gene", "loci", "highlighting", "differential", "accessible", "regions", "(", "in", "red", "boxes", ")", "in", "biological", "replicates", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "activated", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "CD28", "and", "20", "ng", "/", "mL", "TGF", "-", "β", "+", "/", "-", "100U", "IL", "-", "2", ".", "Integrated", "genome", "viewer", "(", "IGV", ")", "browser", "tracks", "of", "the", "Itk", "gene", "loci", "highlighting", "differential", "accessible", "regions", "(", "in", "red", "boxes", ")", "in", "biological", "replicates", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "activated", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "CD28", "and", "20", "ng", "/", "mL", "TGF", "-", "β", "+", "/", "-", "100U", "IL", "-", "2", ".", "(", "G", ")", "IGV", "browser", "track", "of", "the", "IL", "-", "2", "locus", "showing", "accessibility", "peaks", "at", "the", "IL", "-", "2", "promoter", "region", "and", "upstream", "of", "the", "promoter", "(", "red", "arrow", ")", "in", "biological", "replicates", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "activated", "as", "in", "(", "B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Integrated genome viewer (IGV) browser tracks of the Lck, Fyn gene loci highlighting differential accessible regions (in red boxes) in biological replicates of CD4+ T cells activated with anti-CD3/CD28 and 20 ng/mL TGF-β +/- 100U IL-2.Integrated genome viewer (IGV) browser tracks of the Itk gene loci highlighting differential accessible regions (in red boxes) in biological replicates of CD4+ T cells activated with anti-CD3/CD28 and 20 ng/mL TGF-β +/- 100U IL-2.(G) IGV browser track of the IL-2 locus showing accessibility peaks at the IL-2 promoter region and upstream of the promoter (red arrow) in biological replicates of CD4+ T cells activated as in (B)."}
{"words": ["Figure", "1B", ")", "Analysis", "of", "puromycin", "incorporation", "in", "MelJuSo", "cells", "that", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "for", "30", "minutes", "(", "+", "HS", ")", ",", "and", "followed", "for", "4", "hours", "after", "heat", "shock", "(", "HS", "+", "4h", "Rec", ".", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "against", "puromycin", ",", "and", "GAPDH", "as", "loading", "control", ".", "C", ")", "Representative", "images", "of", "MelJuSo", "cells", "expressing", "Ub", "-", "YFP", ",", "which", "were", "either", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "for", "30", "minutes", "(", "+", "HS", ")", ",", "and", "followed", "for", "4", "hours", "after", "heat", "shock", "(", "HS", "+", "4h", "Rec", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B) Analysis of puromycin incorporation in MelJuSo cells that were left untreated (- HS), exposed to 43°C for 30 minutes (+ HS), and followed for 4 hours after heat shock (HS + 4h Rec.). The blots were probed with antibodies against puromycin, and GAPDH as loading control.C) Representative images of MelJuSo cells expressing Ub-YFP, which were either left untreated (- HS), exposed to 43 °C for 30 minutes (+ HS), and followed for 4 hours after heat shock (HS + 4h Rec.)."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "and", "B", ")", "Representative", "images", "of", "stress", "granule", "proficient", "(", "siControl", ")", "and", "deficient", "(", "siG3BP1", "/", "2", ")", "MelJuSo", "cells", "expressing", "the", "nuclear", "UPS", "reporter", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "(", "A", ")", "and", "the", "cytoplasmic", "UPS", "reporter", "NES", "-", "GFP", "-", "CL1", "(", "B", ")", ".", "The", "cells", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "for", "30", "minutes", "(", "HS", ")", ",", "or", "exposed", "to", "43", "°", "C", "for", "30", "minutes", "and", "followed", "by", "4", "hours", "recovery", "(", "HS", "+", "4h", "Rec", ".", ")", ".", "Nucleolar", "accumulation", "of", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "during", "the", "recovery", "is", "indicated", "by", "arrows", "in", "A", ")", ".", "C", ")", "and", "D", ")", "Quantifications", "of", "the", "mean", "cellular", "GFP", "fluorescence", "intensities", "of", "A", ")", "and", "B", ")", "normalized", "to", "untreated", "control", "cells", "(", "siControl", "-", "HS", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "relative", "fluorescence", "intensities", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "1000", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "nucleolar", "marker", "nucleolin", "and", "the", "nuclear", "UPS", "reporter", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "in", "control", "(", "siControl", ",", "left", "panel", ")", "and", "G3BP1", "/", "2", "-", "depleted", "(", "siGRBP1", "/", "2", ",", "right", "panel", ")", "MelJuSo", "cells", "exposed", "to", "a", "30", "min", "43", "°", "C", "heat", "shock", ",", "followed", "by", "4", "hours", "at", "37", "°", "C", "(", "Recovery", ")", ".", "Nucleolar", "accumulation", "of", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "is", "indicated", "by", "arrows", ".", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "nucleolus", "/", "nucleoplasm", "ratios", "of", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "intensities", "in", "images", "of", "experiment", "shown", "in", "E", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "ratio", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "100", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) and B) Representative images of stress granule proficient (siControl) and deficient (siG3BP1/2) MelJuSo cells expressing the nuclear UPS reporter NLS-GFP-CL1 (A) and the cytoplasmic UPS reporter NES-GFP-CL1 (B). The cells were left untreated (- HS), exposed to 43°C for 30 minutes (HS), or exposed to 43°C for 30 minutes and followed by 4 hours recovery (HS + 4h Rec.). Nucleolar accumulation of NLS-GFP-CL1 during the recovery is indicated by arrows in A). C) and D) Quantifications of the mean cellular GFP fluorescence intensities of A) and B) normalized to untreated control cells (siControl - HS). The frequency and distribution of the relative fluorescence intensities per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits. (n=3 independent experiments, >1000 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01, ns: not significant).E) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the nucleolar marker nucleolin and the nuclear UPS reporter NLS-GFP-CL1 in control (siControl, left panel) and G3BP1/2-depleted (siGRBP1/2, right panel) MelJuSo cells exposed to a 30 min 43°C heat shock, followed by 4 hours at 37°C (Recovery). Nucleolar accumulation of NLS-GFP-CL1 is indicated by arrows. F) Quantification of the nucleolus/nucleoplasm ratios of NLS-GFP-CL1 intensities in images of experiment shown in E). The frequency and distribution of the ratio per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits. (n=3 independent experiments, 100 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01)."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "stress", "granule", "marker", "TIA1", "and", "puromycin", "-", "labelled", "proteins", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "43", "°", "C", "heat", "shock", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "nucleus", "/", "cytoplasm", "ratios", "of", "puromycin", "intensities", "in", "images", "from", "A", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "ratio", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "stress", "granule", "marker", "TIA1", "and", "puromycin", "-", "labelled", "proteins", "in", "control", "(", "siControl", ")", "and", "Hsp70", "-", "depleted", "(", "siHsp70", ")", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "43", "°", "C", "heat", "shock", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "numbers", "of", "puromycin", "positive", "TIA", "dots", "per", "cell", "in", "images", "from", "E", ")", ".", "The", "numbers", "of", "positive", "foci", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "G", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "nucleolar", "marker", "nucleolin", "and", "puromycin", "-", "labelled", "proteins", "in", "control", "(", "siControl", ")", "and", "Hsp70", "-", "depleted", "(", "siHsp70", ")", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "43", "°", "C", "heat", "shock", ".", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "nucleolus", "/", "nucleoplasm", "ratio", "of", "puromycin", "intensities", "in", "images", "from", "G", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "ratio", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the stress granule marker TIA1 and puromycin-labelled proteins in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were subjected to 43°C heat shock. B) Quantification of the nucleus/cytoplasm ratios of puromycin intensities in images from A). The frequency and distribution of the ratio per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01).E) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the stress granule marker TIA1 and puromycin-labelled proteins in control (siControl) and Hsp70-depleted (siHsp70) U2OS cells. Cells were subjected to 43°C heat shock F) Quantification of the numbers of puromycin positive TIA dots per cell in images from E). The numbers of positive foci per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01).G) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the nucleolar marker nucleolin and puromycin-labelled proteins in control (siControl) and Hsp70-depleted (siHsp70) G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were subjected to 43°C heat shock. H) Quantification of the nucleolus/nucleoplasm ratio of puromycin intensities in images from G). The frequency and distribution of the ratio per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Mann-Whitney test, ** P<0.01)."}
{"words": ["Figure", "4B", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "HSF1", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", "directly", "after", "heat", "shock", "(", "+", "HS", ")", "and", "2", "hours", "after", "2", "hours", "recovery", "(", "HS", "+", "2h", "Recovery", ")", ".", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "HSF1", "foci", "per", "cell", "in", "images", "from", "B", ")", ",", "shown", "as", "box", "plot", "with", "median", "and", "5", "-", "95", "percentiles", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "300", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", "that", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "heat", "shocked", "(", "HS", ")", ",", "and", "followed", "for", "1", ",", "2", ",", "and", "4", "hours", "after", "heat", "shock", "(", "Rec", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "against", "HSF1", "and", "GAPDH", "(", "*", "indicated", "phosphorylated", "HSF1", ",", "and", "*", "*", "indicates", "unphosphorylated", "HSF1", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B) Representative confocal images of immunofluorescent staining of HSF1 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells directly after heat shock (+ HS) and 2 hours after 2 hours recovery (HS + 2h Recovery). C) Quantification of the number of HSF1 foci per cell in images from B), shown as box plot with median and 5-95 percentiles (n=3 independent experiments, >300 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01).D) Western blot analysis of parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells that were left untreated (- HS), heat shocked (HS), and followed for 1, 2, and 4 hours after heat shock (Rec). The blots were probed with antibodies against HSF1 and GAPDH (* indicated phosphorylated HSF1, and ** indicates unphosphorylated HSF1)."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "nucleolar", "marker", "nucleolin", "and", "SUMO2", "/", "3", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "a", "heat", "shock", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "nucleolus", "/", "nucleoplasm", "ratio", "of", "SUMO2", "/", "3", "intensities", "in", "images", "from", "A", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "ratio", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "C", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "PML", "bodies", "(", "PML", ")", "and", "SUMO2", "/", "3", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "heat", "shocked", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", ".", "Arrows", "indicate", "dots", "positive", "for", "PML", "and", "SUMO2", "/", "3", "staining", ".", "D", ")", "Quantification", "of", "SUMO2", "/", "3", "positive", "PML", "puncta", "in", "images", "from", "C", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "E", ")", "Analysis", "of", "SUMO2", "/", "3", "conjugates", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", "that", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "a", "heat", "shock", "(", "+", "HS", ")", ",", "and", "followed", "for", "2", "hours", "(", "2h", "Rec", ".", ")", "with", "or", "without", "100", "nM", "proteasome", "inhibitor", "epoxomicin", "(", "EPX", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the nucleolar marker nucleolin and SUMO2/3 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were subjected to a heat shock followed by 2 hours recovery. B) Quantification of the nucleolus/nucleoplasm ratio of SUMO2/3 intensities in images from A). The frequency and distribution of the ratio per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Mann-Whitney test, ** P<0.01).C) Representative confocal images of immunofluorescent staining of PML bodies (PML) and SUMO2/3 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were heat shocked followed by 2 hours recovery. Arrows indicate dots positive for PML and SUMO2/3 staining. D) Quantification of SUMO2/3 positive PML puncta in images from C). Data represent the mean ± SD (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Mann-Whitney test, ** P<0.01).E) Analysis of SUMO2/3 conjugates in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells that were left untreated (- HS), exposed to a heat shock (+ HS), and followed for 2 hours (2h Rec.) with or without 100 nM proteasome inhibitor epoxomicin (EPX)."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "SUMO2", "/", "3", "and", "TDP43", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "exposed", "to", "a", "heat", "shocked", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", ".", "Arrows", "indicate", "dots", "positive", "for", "TDP", "-", "43", "and", "SUMO2", "/", "3", "staining", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "SUMO2", "/", "3", "positive", "TDP43", "puncta", "in", "images", "from", "experiment", "shown", "in", "A", ")", ".", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "D", ")", "Analysis", "of", "detergent", "SDS", "and", "NP40", "soluble", "fractions", "of", "TDP43", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", "that", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "(", "+", "HS", ")", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", "(", "2h", "Rec", ".", ")", "in", "absence", "or", "presence", "of", "100", "nM", "proteasome", "inhibitor", "epoxomicin", "(", "EPX", ")", ".", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "TDP43", "band", "densities", "in", "the", "SDS", "-", "soluble", "fraction", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Representative confocal images of immunofluorescent staining of SUMO2/3 and TDP43 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were exposed to a heat shocked followed by 2 hours recovery. Arrows indicate dots positive for TDP-43 and SUMO2/3 staining. B) Quantification of the percentage of SUMO2/3 positive TDP43 puncta in images from experiment shown in A)..Data represent the mean ± SD (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Mann-Whitney test, ** P<0.01).D) Analysis of detergent SDS and NP40 soluble fractions of TDP43 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells that were left untreated (-HS), exposed to 43°C (+HS) followed by 2 hours recovery (2h Rec.) in absence or presence of 100 nM proteasome inhibitor epoxomicin (EPX). E) Quantification of the TDP43 band densities in the SDS-soluble fraction. Data represent the mean ± SD (n=3 independent experiments, Student's unpaired t-test, * P<0.05)."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "Analysis", "of", "SUMO2", "/", "3", "conjugates", "in", "control", "(", "siControl", ")", "or", "RNF4", "-", "depleted", "(", "siRNF4", ")", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "(", "+", "HS", ")", ",", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", "(", "HS", "+", "2h", "Rec", ".", ")", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "100", "nM", "proteasome", "inhibitor", "epoxomicin", "(", "EPX", ")", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "SUMO2", "/", "3", "band", "densities", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "control", "(", "siControl", ")", ",", "RNF4", "-", "depleted", "(", "siRNF4", ")", ",", "G3BP1", "/", "2", "-", "depleted", "(", "siG3BP1", "/", "2", ")", "and", "G3BP1", "/", "2", "+", "RNF4", "-", "depleted", "(", "siG3BP1", "/", "2", "+", "siRNF4", ")", "MelJuSo", "cells", "expressing", "the", "nuclear", "UPS", "reporter", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", ".", "Cells", "were", "exposed", "to", "heat", "shock", "followed", "by", "4", "hours", "recovery", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "the", "proteasome", "inhibitor", "epoxomicin", "(", "EPX", ")", ".", "The", "nucleolar", "marker", "nucleolin", "was", "stained", "by", "immunofluorescence", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) Analysis of SUMO2/3 conjugates in control (siControl) or RNF4-depleted (siRNF4) G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were left untreated (-HS), exposed to 43°C (+ HS), followed by 2 hours recovery (HS + 2h Rec.) in the absence or presence of 100 nM proteasome inhibitor epoxomicin (EPX). B) Quantification of the total SUMO2/3 band densities. Data represent the mean ± SD (n=3 independent experiments, *P<0.05).E) Representative confocal images of control (siControl), RNF4-depleted (siRNF4), G3BP1/2-depleted (siG3BP1/2) and G3BP1/2+RNF4-depleted (siG3BP1/2 + siRNF4) MelJuSo cells expressing the nuclear UPS reporter NLS-GFP-CL1. Cells were exposed to heat shock followed by 4 hours recovery in the absence or presence of the proteasome inhibitor epoxomicin (EPX). The nucleolar marker nucleolin was stained by immunofluorescence."}
{"words": ["Figure", "8A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "FLAG", "-", "tagged", "ubiquitin", "(", "FLAG", "-", "Ub", ")", "and", "mutant", "ataxin1", "(", "ATX1", ")", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "heat", "shock", "followed", "by", "4", "hours", "recovery", ".", "B", ")", "Frequency", "distribution", "of", "ataxin", "-", "1", "inclusions", "per", "cell", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A) Representative confocal images of immunofluorescent staining of FLAG-tagged ubiquitin (FLAG-Ub) and mutant ataxin1 (ATX1) in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were subjected to heat shock followed by 4 hours recovery. B) Frequency distribution of ataxin-1 inclusions per cell from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1Viability", "of", "single", "and", "double", "mutants", "of", "RNAPII", "and", "rad52Δ", ",", "mre11Δ", "and", "cdc44", "‐", "8", ".", "Tenfold", "serial", "dilutions", "of", "double", "mutants", "obtained", "by", "genetic", "crosses", "were", "tested", "for", "growth", "in", "plain", "SC", "medium", "or", "supplemented", "with", "10", "mM", "HU", "or", "0", ".", "005", "%", "MMS", ".", "Tetrad", "analysis", "of", "rpb1", "‐", "S751F", ",", "rad52Δ", "and", "mre11Δ", "crosses", ".", "Δ", "indicates", "double", "mutants", "that", "fail", "to", "grow", ".", "Tetrad", "analysis", "of", "rpb1", "‐", "S751F", "crossed", "by", "pol32Δ", "and", "rad51Δ", ".", "Δ", "indicates", "triple", "mutants", "that", "fail", "to", "grow", ".", "HU", "and", "MMS", "sensitivity", "of", "different", "mutant", "combinations", "of", "rpb1", "‐", "1", ",", "rpb1", "‐", "S751F", ",", "pol32Δ", "and", "rad51Δ", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Viability of single and double mutants of RNAPII and rad52Δ, mre11Δ and cdc44‐8. Tenfold serial dilutions of double mutants obtained by genetic crosses were tested for growth in plain SC medium or supplemented with 10 mM HU or 0.005% MMS.Tetrad analysis of rpb1‐S751F, rad52Δ and mre11Δ crosses. Δ indicates double mutants that fail to grow.Tetrad analysis of rpb1‐S751F crossed by pol32Δ and rad51Δ. Δ indicates triple mutants that fail to grow.HU and MMS sensitivity of different mutant combinations of rpb1‐1, rpb1‐S751F, pol32Δ and rad51Δ."}
{"words": ["Figure", "2Western", "blot", "against", "the", "phosphorylated", "form", "of", "histone", "H2A", "in", "the", "presence", "of", "100", "mM", "HU", "in", "asynchronously", "growing", "WT", "and", "RNAPII", "mutant", "cells", ".", "Ponceau", "staining", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "Rad52", "foci", "formation", "at", "30", "and", "37", "°", "C", ".", "Recombination", "frequencies", "between", "inverted", "repeats", "in", "WT", "and", "RNAPII", "mutants", "measured", "with", "the", "plasmid", "‐", "born", "pTINV", "system", ".", "Recombinants", "were", "selected", "as", "Leu", "+", ".", "Recombination", "frequencies", "using", "the", "direct", "‐", "repeat", "chromosomal", "system", "leu2", "‐", "k", ":", ":", "ADE2", "‐", "URA3", ":", ":", "leu2", "‐", "k", "in", "WT", "and", "RNAPII", "mutants", ".", "Deletion", "events", "were", "detected", "and", "quantified", "in", "media", "containing", "5", "‐", "fluorotic", "acid", "(", "FOA", ")", "and", "could", "be", "directly", "visualized", "as", "red", "sectors", ".", "Recombination", "frequencies", "between", "plasmid", "‐", "born", "direct", "repeats", "in", "WT", "and", "RNAPII", "mutants", ".", "The", "frequency", "of", "Leu", "+", "recombination", "was", "determined", "in", "the", "systems", "L", "‐", "lacZ", "and", "GL", "‐", "lacZ", ".", "Recombination", "frequencies", "are", "plotted", "as", "a", "function", "of", "the", "transcription", "levels", ".", "Low", "transcription", "refers", "to", "the", "GL", "‐", "lacZ", "systems", "in", "strains", "cultured", "in", "2", "%", "glucose", ";", "medium", "refers", "to", "L", "‐", "lacZ", "in", "2", "%", "glucose", ",", "and", "high", "to", "GL", "‐", "lacZ", "in", "2", "%", "galactose", ".", "Mitotic", "stability", "of", "centromeric", "plasmid", "pGAL", "‐", "lacZ", "in", "RNAPII", "mutants", ".", "Stability", "was", "analyzed", "in", "galactose", "after", "23", "generations", ".", "A", "small", "diagram", "of", "each", "system", "(", "not", "drawn", "to", "scale", ")", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Western blot against the phosphorylated form of histone H2A in the presence of 100 mM HU in asynchronously growing WT and RNAPII mutant cells. Ponceau staining is shown as a loading control.Rad52 foci formation at 30 and 37°C.Recombination frequencies between inverted repeats in WT and RNAPII mutants measured with the plasmid‐born pTINV system. Recombinants were selected as Leu+.Recombination frequencies using the direct‐repeat chromosomal system leu2‐k::ADE2‐URA3::leu2‐k in WT and RNAPII mutants. Deletion events were detected and quantified in media containing 5‐fluorotic acid (FOA) and could be directly visualized as red sectors.Recombination frequencies between plasmid‐born direct repeats in WT and RNAPII mutants. The frequency of Leu+ recombination was determined in the systems L‐lacZ and GL‐lacZ. Recombination frequencies are plotted as a function of the transcription levels. Low transcription refers to the GL‐lacZ systems in strains cultured in 2% glucose; medium refers to L‐lacZ in 2% glucose, and high to GL‐lacZ in 2% galactose.Mitotic stability of centromeric plasmid pGAL‐lacZ in RNAPII mutants. Stability was analyzed in galactose after 23 generations. A small diagram of each system (not drawn to scale) is shown."}
{"words": ["Figure", "3Recombination", "frequencies", "measured", "with", "the", "pTINV", "system", "in", "WT", ",", "rpb1", "‐", "1", ",", "mre11Δ", "and", "rpb1", "‐", "1", "mre11Δ", ".", "Rad52", "focus", "formation", "in", "asynchronously", "growing", "cells", "at", "30", "°", "C", ".", "Viability", "after", "different", "times", "in", "10", "mM", "HU", ".", "The", "same", "cultures", "without", "HU", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "The", "average", "values", "and", "standard", "deviations", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Rad52", "focus", "formation", "in", "asynchronously", "growing", "cells", "expressing", "normal", "or", "high", "levels", "of", "RNH1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Recombination frequencies measured with the pTINV system in WT, rpb1‐1, mre11Δ and rpb1‐1 mre11Δ.Rad52 focus formation in asynchronously growing cells at 30°C.Viability after different times in 10 mM HU. The same cultures without HU were used as a control. The average values and standard deviations from three independent experiments are shown.Rad52 focus formation in asynchronously growing cells expressing normal or high levels of RNH1."}
{"words": ["Figure", "4FACS", "analysis", "of", "cell", "cycle", "progression", "in", "rpb", "mutants", ".", "Cells", "were", "synchronized", "in", "G1", "with", "α", "‐", "factor", "and", "monitored", "at", "different", "times", "after", "release", "in", "the", "presence", "of", "40", "mM", "HU", ".", "Slowdown", "of", "RF", "progression", "through", "a", "chromosomal", "region", ".", "2D", "gel", "electrophoresis", "of", "replication", "intermediates", "of", "4", ".", "3", "‐", "kb", "PstI", "DNA", "fragments", "from", "WT", "and", "RNAPII", "mutants", "in", "the", "presence", "of", "40", "mM", "HU", "at", "different", "times", "after", "G1", "release", ".", "A", "black", "arrow", "indicates", "accumulation", "of", "long", "Y", "molecules", ",", "and", "a", "white", "one", "indicates", "the", "specific", "accumulation", "of", "X", "molecules", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4FACS analysis of cell cycle progression in rpb mutants. Cells were synchronized in G1 with α‐factor and monitored at different times after release in the presence of 40 mM HU.Slowdown of RF progression through a chromosomal region. 2D gel electrophoresis of replication intermediates of 4.3‐kb PstI DNA fragments from WT and RNAPII mutants in the presence of 40 mM HU at different times after G1 release. A black arrow indicates accumulation of long Y molecules, and a white one indicates the specific accumulation of X molecules."}
{"words": ["Figure", "5Analysis", "of", "replication", "by", "BrdU", "incorporation", ".", "Cells", "were", "synchronized", "in", "G1", "with", "α", "‐", "factor", "and", "released", "in", "the", "presence", "of", "BrdU", ".", "Samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "times", "and", "processed", "to", "measure", "BrdU", "incorporation", "by", "ChIP", "analysis", ".", "Replication", "was", "analyzed", "in", "two", "DNA", "regions", ",", "one", "covering", "the", "early", "origin", "ARS508", "and", "the", "SPF1", "gene", "and", "the", "other", "the", "late", "origin", "ARS603", "and", "the", "YFL034W", "gene", ".", "DNA", "combing", "analysis", "of", "replication", ".", "Graphs", "indicate", "the", "distribution", "of", "BrdU", "track", "length", "(", "kb", ")", "at", "60", "and", "120", "min", "after", "α", "‐", "factor", "release", "in", "the", "presence", "of", "40", "mM", "HU", ",", "the", "replication", "speed", "(", "kb", "/", "min", ")", "determined", "with", "the", "two", "time", "points", "analyzed", "and", "the", "inter", "‐", "origin", "distance", "(", "kb", ")", "at", "60", "min", "after", "release", ".", "The", "median", "test", "was", "applied", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Analysis of replication by BrdU incorporation. Cells were synchronized in G1 with α‐factor and released in the presence of BrdU. Samples were taken at the indicated times and processed to measure BrdU incorporation by ChIP analysis. Replication was analyzed in two DNA regions, one covering the early origin ARS508 and the SPF1 gene and the other the late origin ARS603 and the YFL034W gene.DNA combing analysis of replication. Graphs indicate the distribution of BrdU track length (kb) at 60 and 120 min after α‐factor release in the presence of 40 mM HU, the replication speed (kb/min) determined with the two time points analyzed and the inter‐origin distance (kb) at 60 min after release. The median test was applied."}
{"words": ["Figure", "6Dephosphorylation", "of", "Rad53", "after", "exposure", "to", "HU", ".", "WT", ",", "rpb1", "‐", "1", "and", "rpb1", "‐", "S751F", "cells", "were", "synchronized", "in", "G1", "with", "α", "‐", "factor", ".", "After", "G1", "release", ",", "cells", "were", "exposed", "to", "100", "mM", "HU", "for", "1", "h", ",", "washed", "to", "remove", "HU", "and", "cultured", "in", "HU", "‐", "free", "medium", "for", "the", "indicated", "periods", ".", "Western", "blot", "against", "Rad53", ",", "signal", "quantification", "(", "ratio", "Rad53", "‐", "P", "/", "total", "Rad53", "protein", ")", "and", "FACS", "profiles", "are", "shown", ".", "DNA", "repair", "of", "MMS", "damage", ".", "Chromosome", "VII", "species", "revealed", "by", "hybridization", "with", "ADE5", ",", "7", "probes", "in", "pulsed", "‐", "field", "gel", "electrophoresis", "(", "PFGE", ")", ".", "Asynchronously", "growing", "WT", "and", "rpb1", "cells", "were", "exposed", "to", "0", ".", "1", "%", "MMS", "for", "30", "min", ",", "washed", "to", "remove", "MMS", "and", "cultured", "in", "MMS", "‐", "free", "medium", "for", "the", "indicated", "periods", "to", "allow", "repair", ".", "Repair", "was", "calculated", "as", "the", "percentage", "of", "FLC", "appearing", "after", "MMS", "treatment", ".", "The", "FLC", "signal", "was", "quantified", "with", "respect", "to", "the", "total", "signal", "of", "each", "lane", ".", "Data", "show", "the", "mean", "and", "SD", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "NLC", ",", "nonlinear", "chromosome", ".", "FLC", ",", "full", "‐", "length", "linear", "chromosome", ".", "CF", ",", "chromosome", "fragment", "resulting", "from", "DNA", "breaks", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Dephosphorylation of Rad53 after exposure to HU. WT, rpb1‐1 and rpb1‐S751F cells were synchronized in G1 with α‐factor. After G1 release, cells were exposed to 100 mM HU for 1 h, washed to remove HU and cultured in HU‐free medium for the indicated periods. Western blot against Rad53, signal quantification (ratio Rad53‐P/total Rad53 protein) and FACS profiles are shown.DNA repair of MMS damage. Chromosome VII species revealed by hybridization with ADE5,7 probes in pulsed‐field gel electrophoresis (PFGE). Asynchronously growing WT and rpb1 cells were exposed to 0.1% MMS for 30 min, washed to remove MMS and cultured in MMS‐free medium for the indicated periods to allow repair. Repair was calculated as the percentage of FLC appearing after MMS treatment. The FLC signal was quantified with respect to the total signal of each lane. Data show the mean and SD of 3 independent experiments. NLC, nonlinear chromosome. FLC, full‐length linear chromosome. CF, chromosome fragment resulting from DNA breaks."}
{"words": ["Figure", "7Retention", "of", "RNAPII", "in", "the", "actively", "transcribed", "PMA1", "gene", "in", "RNAPII", "mutants", ".", "ChIP", "analysis", "of", "RNAPII", "in", "asynchronously", "growing", "WT", ",", "rpb1", "‐", "1", ",", "rpb1", "‐", "S751F", ",", "rpb2", "‐", "10", "and", "rpb9Δ", "cells", "at", "the", "PMA1", "gene", ".", "The", "scheme", "of", "the", "gene", "and", "the", "PCR", "‐", "amplified", "fragments", "are", "shown", ".", "Recruitment", "values", "were", "calculated", "from", "the", "amount", "of", "DNA", "present", "in", "each", "region", ",", "normalizing", "IP", "/", "input", "ratios", ",", "and", "relative", "to", "the", "amount", "of", "DNA", "of", "the", "intergenic", "region", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "Northern", "blot", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "PMA1", "gene", ".", "RNA", "was", "isolated", "from", "mid", "‐", "log", "phase", "cultures", "grown", "in", "YPD", "‐", "rich", "medium", ".", "As", "32P", "‐", "labeled", "DNA", "probes", ",", "an", "internal", "776", "‐", "bp", "PMA1", "fragment", "and", "an", "internal", "513", "‐", "bp", "SCR1", "fragment", "obtained", "by", "PCR", "were", "used", ".", "Bars", "indicate", "the", "SD", "of", "2", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Retention of RNAPII in the actively transcribed PMA1 gene in RNAPII mutants. ChIP analysis of RNAPII in asynchronously growing WT, rpb1‐1, rpb1‐S751F, rpb2‐10 and rpb9Δ cells at the PMA1 gene. The scheme of the gene and the PCR‐amplified fragments are shown. Recruitment values were calculated from the amount of DNA present in each region, normalizing IP/input ratios, and relative to the amount of DNA of the intergenic region. Error bars indicate the standard deviation (SD).Northern blot analysis of the expression of PMA1 gene. RNA was isolated from mid‐log phase cultures grown in YPD‐rich medium. As 32P‐labeled DNA probes, an internal 776‐bp PMA1 fragment and an internal 513‐bp SCR1 fragment obtained by PCR were used. Bars indicate the SD of 2 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "8Analysis", "of", "Rrm3", "recruitment", "in", "WT", "and", "rpb1", "‐", "1", ".", "Rrm3", "IP", "histogram", "bars", "in", "the", "y", "‐", "axis", "show", "the", "average", "signal", "log2", "ratio", "of", "loci", "enriched", "in", "the", "immunoprecipitated", "fraction", "along", "the", "indicated", "regions", "in", "the", "x", "‐", "axis", ".", "When", "the", "ratio", "fulfills", "the", "P", "‐", "value", "criteria", "(", "P", "0", ".", "01", ")", "it", "is", "shown", "in", "red", ".", "Composite", "profile", "of", "Rrm3", "occupancy", "across", "the", "average", "ORF", "plotted", "as", "Rrm3", "percentage", "of", "significant", "ChIP", "hits", "per", "segment", ".", "Each", "gene", "was", "divided", "into", "10", "equivalent", "segments", "from", "the", "start", "and", "end", "coordinates", "(", "segments", "2", "-", "10", ")", ".", "Two", "additional", "segments", "of", "the", "same", "size", "were", "considered", "upstream", "(", "5", "′", ")", "and", "downstream", "(", "3", "′", ")", "of", "each", "ORF", "(", "segments", "1", "and", "12", ",", "respectively", ")", ".", "The", "average", "signal", "log2", "ratio", "for", "Rrm3", "significant", "hits", "that", "map", "on", "each", "segment", "was", "plotted", ".", "Composite", "profile", "of", "Rrm3", "occupancy", "across", "the", "average", "ARS", "plotted", "as", "Rrm3", "percentage", "of", "significant", "ChIP", "hits", "per", "segment", ".", "Each", "ARS", "was", "divided", "into", "11", "equivalent", "segments", "from", "the", "start", "and", "end", "coordinates", ".", "The", "average", "signal", "log2", "ratio", "for", "Rrm3", "significant", "hits", "that", "map", "on", "each", "segment", "was", "plotted", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Analysis of Rrm3 recruitment in WT and rpb1‐1. Rrm3 IP histogram bars in the y‐axis show the average signal log2 ratio of loci enriched in the immunoprecipitated fraction along the indicated regions in the x‐axis. When the ratio fulfills the P‐value criteria (P 0.01) it is shown in red.Composite profile of Rrm3 occupancy across the average ORF plotted as Rrm3 percentage of significant ChIP hits per segment. Each gene was divided into 10 equivalent segments from the start and end coordinates (segments 2-10). Two additional segments of the same size were considered upstream (5′) and downstream (3′) of each ORF (segments 1 and 12, respectively). The average signal log2 ratio for Rrm3 significant hits that map on each segment was plotted.Composite profile of Rrm3 occupancy across the average ARS plotted as Rrm3 percentage of significant ChIP hits per segment. Each ARS was divided into 11 equivalent segments from the start and end coordinates. The average signal log2 ratio for Rrm3 significant hits that map on each segment was plotted."}
{"words": ["Figure", "1B", "-", "F", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "containing", "0", "-", "1", ",", "000", "nM", "dmPGE2", "or", "Iloprost", ".", "(", "B", ")", "Representative", "bright", "-", "field", "images", "of", "spheroids", "treated", "with", "dmPGE2", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "µm", ".", "B", "-", "F", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "containing", "0", "-", "1", ",", "000", "nM", "dmPGE2", "or", "Iloprost", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "average", "spheroid", "area", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "relative", "to", "spheroids", "treated", "with", "0", "nM", "dmPGE2", "(", "average", "area", "was", "3761", "µm2", "for", "0", "nM", "group", ";", "n", "=", "4", "images", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "B", "-", "F", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "containing", "0", "-", "1", ",", "000", "nM", "dmPGE2", "or", "Iloprost", ".", "(", "D", ")", "Representative", "histological", "sections", "of", "spheroids", "treated", "with", "1", "µM", "dmPGE2", "or", "an", "equivalent", "volume", "of", "DMSO", "and", "stained", "for", "hematoxylin", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "µm", ".", "B", "-", "F", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "containing", "0", "-", "1", ",", "000", "nM", "dmPGE2", "or", "Iloprost", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Cldn4mRNA", "relative", "to", "the", "0", "nM", "treatment", "group", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "B", "-", "F", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "containing", "0", "-", "1", ",", "000", "nM", "dmPGE2", "or", "Iloprost", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "average", "spheroid", "area", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "relative", "to", "spheroids", "treated", "with", "0", "nM", "Iloprost", "(", "n", "=", "4", "images", "from", "two", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B-F Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium containing 0-1,000 nM dmPGE2 or Iloprost. (B) Representative bright-field images of spheroids treated with dmPGE2. Scale bars, 200 µm.B-F Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium containing 0-1,000 nM dmPGE2 or Iloprost. (C) Quantification of average spheroid area ± s.e.m. relative to spheroids treated with 0 nM dmPGE2 (average area was 3761 µm2 for 0 nM group; n = 4 images from two independent experiments).B-F Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium containing 0-1,000 nM dmPGE2 or Iloprost. (D) Representative histological sections of spheroids treated with 1 µM dmPGE2 or an equivalent volume of DMSO and stained for hematoxylin. Scale bars, 100 µm.B-F Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium containing 0-1,000 nM dmPGE2 or Iloprost. (E) Quantification of the average expression ± s.e.m. of Cldn4mRNA relative to the 0 nM treatment group (n = 3 independent experiments).B-F Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium containing 0-1,000 nM dmPGE2 or Iloprost. (F) Quantification of average spheroid area ± s.e.m. relative to spheroids treated with 0 nM Iloprost (n = 4 images from two independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "2A", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Ptger1", ",", "Ptger2", ",", "Ptger3", ",", "Ptger4", ",", "and", "Ptgir", "mRNAs", "in", "whole", "-", "thickness", "lung", ",", "ileum", "or", "colon", "tissues", "or", "in", "jejunal", "spheroids", "cultured", "in", "stem", "cell", "(", "Stem", ")", ",", "WAE", "(", "dmPGE2", ")", "or", "enterocyte", "(", "EP4i", ")", "medium", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "fold", "change", "compared", "to", "lung", "tissue", ".", "n", ".", "d", ".", ",", "not", "detected", ".", "B", "-", "D", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "with", "DMSO", "only", "or", "with", "1", "µM", "dmPGE2", "and", "pharmacological", "inhibitors", "of", "EP1", "(", "EP1i", ",", "SC", "51322", ")", ",", "EP2", "(", "EP2i", ",", "PF", "04418948", ")", ",", "EP3", "(", "EP3i", ",", "L", "-", "798", ",", "106", ")", "or", "EP4", "(", "EP4i", ",", "L", "-", "161", ",", "982", ")", "at", "a", "concentration", "of", "10", "µM", "or", "an", "equivalent", "volume", "of", "DMSO", "vehicle", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "compared", "to", "the", "DMSO", "only", "group", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "(", "B", ")", "Representative", "bright", "field", "images", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "µm", ".", "B", "-", "D", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "with", "DMSO", "only", "or", "with", "1", "µM", "dmPGE2", "and", "pharmacological", "inhibitors", "of", "EP1", "(", "EP1i", ",", "SC", "51322", ")", ",", "EP2", "(", "EP2i", ",", "PF", "04418948", ")", ",", "EP3", "(", "EP3i", ",", "L", "-", "798", ",", "106", ")", "or", "EP4", "(", "EP4i", ",", "L", "-", "161", ",", "982", ")", "at", "a", "concentration", "of", "10", "µM", "or", "an", "equivalent", "volume", "of", "DMSO", "vehicle", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "compared", "to", "the", "DMSO", "only", "group", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "average", "spheroid", "area", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "relative", "to", "spheroids", "treated", "with", "DMSO", "alone", "(", "n", "=", "4", "images", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "B", "-", "D", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "with", "DMSO", "only", "or", "with", "1", "µM", "dmPGE2", "and", "pharmacological", "inhibitors", "of", "EP1", "(", "EP1i", ",", "SC", "51322", ")", ",", "EP2", "(", "EP2i", ",", "PF", "04418948", ")", ",", "EP3", "(", "EP3i", ",", "L", "-", "798", ",", "106", ")", "or", "EP4", "(", "EP4i", ",", "L", "-", "161", ",", "982", ")", "at", "a", "concentration", "of", "10", "µM", "or", "an", "equivalent", "volume", "of", "DMSO", "vehicle", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "compared", "to", "the", "DMSO", "only", "group", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Cldn4", "mRNA", "relative", "to", "stem", "cellspheroids", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "E", ",", "F", "Tat", "-", "Cre", "mediated", "recombination", "of", "Ptger4flox", "/", "flox", "(", "fl", "/", "fl", ")", "jejunal", "spheroids", "to", "generate", "Ptger4flox", "/", "Δ", "(", "fl", "/", "Δ", ")", "and", "Ptger4Δ", "/", "Δ", "(", "Δ", "/", "Δ", ")", "spheroid", "lines", ".", "(", "E", ")", "Schematic", "and", "representative", "PCR", "genotyping", "results", ".", "M", ",", "marker", "lane", ".", "bp", ",", "base", "pairs", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Ptger4", "mRNA", "in", "spheroids", "cultured", "in", "stem", "cell", "media", "relative", "to", "fl", "/", "fl", "genotype", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "post", "-", "test", "with", "the", "EP4i", "-", "treated", "fl", "/", "fl", "group", "set", "as", "the", "control", ".", "G", "-", "I", "Ptger4flox", "/", "flox", ",", "Ptger4flox", "/", "Δ", "and", "Ptger4Δ", "/", "Δ", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "with", "1", "µM", "dmPGE2", "or", "10", "µM", "EP4i", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "1", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "Representative", "bright", "-", "field", "images", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "µm", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "average", "spheroid", "area", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "4", "images", "per", "group", "from", "two", "independent", "experiments", ")", "relative", "to", "EP4i", "-", "treated", "Ptger4flox", "/", "flox", "spheroids", ".", "G", "-", "I", "Ptger4flox", "/", "flox", ",", "Ptger4flox", "/", "Δ", "and", "Ptger4Δ", "/", "Δ", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "with", "1", "µM", "dmPGE2", "or", "10", "µM", "EP4i", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "1", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "(", "I", ")", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Cldn4", "mRNA", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "relative", "to", "EP4i", "-", "treated", "Ptger4flox", "/", "flox", "spheroids", ".", "J", "-", "L", "Humanileal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "with", "1", "µM", "dmPGE2", "or", "10", "µM", "EP4i", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "1", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "(", "J", ")", "Representative", "bright", "-", "field", "images", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "µm", ".", "(", "K", ")", "Quantification", "of", "average", "spheroid", "area", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "4", "images", "per", "group", "from", "3", "independent", "donor", "lines", "examined", "over", "3", "passages", "each", ")", "relative", "to", "stem", "spheroids", ".", "J", "-", "L", "Humanileal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "with", "1", "µM", "dmPGE2", "or", "10", "µM", "EP4i", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "1", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "(", "L", ")", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "CLDN4", "mRNA", "(", "n", "=", "3", "independent", "donor", "lines", ")", "relative", "to", "stem", "spheroids", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Quantification of the average expression ± s.e.m. of Ptger1, Ptger2, Ptger3, Ptger4, and Ptgir mRNAs in whole-thickness lung, ileum or colon tissues or in jejunal spheroids cultured in stem cell (Stem), WAE (dmPGE2) or enterocyte (EP4i) medium (n = 3 independent experiments). Data are presented as fold change compared to lung tissue. n.d., not detected.B-D Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium with DMSO only or with 1 µM dmPGE2 and pharmacological inhibitors of EP1 (EP1i, SC 51322), EP2 (EP2i, PF 04418948), EP3 (EP3i, L-798,106) or EP4 (EP4i, L-161,982) at a concentration of 10 µM or an equivalent volume of DMSO vehicle. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 compared to the DMSO only group by one-way ANOVA and Dunnett's post-test. (B) Representative bright field images. Scale bars, 200 µm.B-D Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium with DMSO only or with 1 µM dmPGE2 and pharmacological inhibitors of EP1 (EP1i, SC 51322), EP2 (EP2i, PF 04418948), EP3 (EP3i, L-798,106) or EP4 (EP4i, L-161,982) at a concentration of 10 µM or an equivalent volume of DMSO vehicle. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 compared to the DMSO only group by one-way ANOVA and Dunnett's post-test. (C) Quantification of average spheroid area ± s.e.m. relative to spheroids treated with DMSO alone (n = 4 images from two independent experiments).B-D Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium with DMSO only or with 1 µM dmPGE2 and pharmacological inhibitors of EP1 (EP1i, SC 51322), EP2 (EP2i, PF 04418948), EP3 (EP3i, L-798,106) or EP4 (EP4i, L-161,982) at a concentration of 10 µM or an equivalent volume of DMSO vehicle. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 compared to the DMSO only group by one-way ANOVA and Dunnett's post-test. (D) Quantification of the average expression ± s.e.m. of Cldn4 mRNA relative to stem cellspheroids (n = 3 independent experiments).E, F Tat-Cre mediated recombination of Ptger4flox/flox (fl/fl) jejunal spheroids to generate Ptger4flox/Δ (fl/Δ) and Ptger4Δ/Δ (Δ/Δ) spheroid lines. (E) Schematic and representative PCR genotyping results. M, marker lane. bp, base pairs. (F) Quantification of the average expression ± s.e.m. of Ptger4 mRNA in spheroids cultured in stem cell media relative to fl/fl genotype (n = 3 independent experiments). **p<0.01, ****p<0.0001 by 2-way ANOVA and Dunnett's multiple comparisons post-test with the EP4i-treated fl/fl group set as the control.G-I Ptger4flox/flox, Ptger4flox/Δ and Ptger4Δ/Δ spheroids were cultured in differentiation medium with 1 µM dmPGE2 or 10 µM EP4i. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001 by 1-way ANOVA and Tukey's post-test. (G) Representative bright-field images. Scale bars, 200 µm. (H) Quantification of average spheroid area ± s.e.m. (n = 4 images per group from two independent experiments) relative to EP4i-treated Ptger4flox/flox spheroids.G-I Ptger4flox/flox, Ptger4flox/Δ and Ptger4Δ/Δ spheroids were cultured in differentiation medium with 1 µM dmPGE2 or 10 µM EP4i. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001 by 1-way ANOVA and Tukey's post-test. (I) average expression ± s.e.m. of Cldn4 mRNA (n = 3 independent experiments) relative to EP4i-treated Ptger4flox/flox spheroids.J-L Humanileal spheroids were cultured in differentiation medium with 1 µM dmPGE2 or 10 µM EP4i. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 by 1-way ANOVA and Tukey's post-test. (J) Representative bright-field images. Scale bars, 200 µm. (K) Quantification of average spheroid area ± s.e.m. (n = 4 images per group from 3 independent donor lines examined over 3 passages each) relative to stem spheroids.J-L Humanileal spheroids were cultured in differentiation medium with 1 µM dmPGE2 or 10 µM EP4i. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 by 1-way ANOVA and Tukey's post-test. (L) the average expression ± s.e.m. of CLDN4 mRNA (n = 3 independent donor lines) relative to stem spheroids."}
{"words": ["Figure", "3B", "Heatmap", "showing", "unsupervised", "hierarchical", "clustering", "of", "genes", "that", "were", "significantly", "(", "FDR", "-", "adjusted", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "differentially", "expressed", "between", "the", "three", "groups", "(", "n", "=", "4", "samples", "per", "treatment", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "Each", "column", "is", "one", "sample", "and", "each", "row", "is", "one", "gene", ".", "Red", "and", "blue", "indicate", "genes", "with", "enriched", "or", "de", "-", "enriched", "expression", "in", "a", "particular", "group", ",", "respectively", ".", "The", "dendrogram", "for", "the", "gene", "clustering", "is", "colored", "to", "highlight", "major", "gene", "clusters", "1", "-", "6", ".", "The", "number", "of", "probes", "in", "each", "cluster", "is", "in", "parentheses", ".", "E", ",", "F", "Spheroids", "were", "cultured", "as", "indicated", "for", "24", "hours", "followed", "by", "a", "1", "-", "hr", "pulse", "with", "EdU", "to", "mark", "the", "cells", "undergoing", "DNA", "synthesis", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "EdU", "staining", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "visualized", "with", "bisbenzimide", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "µm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "EdU", "-", "positive", "nuclei", "as", "a", "percent", "of", "the", "total", "nuclei", "(", "n", "=", "minimum", "of", "15", "spheroids", "counted", "per", "sample", "from", "2", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "1", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "G", "Graph", "of", "the", "fold", "change", "in", "background", "-", "subtracted", "luminescence", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "relative", "to", "0", "hr", "measurement", ")", "of", "Cdc25A", "-", "CBRLuc", "spheroids", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "with", "4", "technical", "replicates", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "dmPGE2", "-", "and", "EP4i", "-", "treated", "spheroids", "compared", "to", "stem", "cells", "by", "repeated", "measures", "2", "-", "way", "ANOVA", "(", "variable", "=", "treatment", ")", ".", "p", "<", "0", ".", "001", "at", "the", "16", "hr", ",", "20", "hr", "and", "24", "hr", "time", "points", "by", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", "comparing", "dmPGE2", "-", "treated", "and", "EP4i", "-", "treated", "spheroids", "to", "the", "stem", "cell", "control", ".", "H", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Lgr5", "and", "Mki67", "mRNAs", "in", "jejunal", "spheroids", "cultured", "in", "stem", "cell", "(", "Stem", ")", "or", "in", "differentiation", "medium", "with", "the", "indicated", "supplements", "relative", "to", "the", "stem", "cell", "group", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "n", ".", "d", ".", ",", "not", "detected", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Heatmap showing unsupervised hierarchical clustering of genes that were significantly (FDR-adjusted p<0.05) and differentially expressed between the three groups (n = 4 samples per treatment from two independent experiments). Each column is one sample and each row is one gene. Red and blue indicate genes with enriched or de-enriched expression in a particular group, respectively. The dendrogram for the gene clustering is colored to highlight major gene clusters 1-6. The number of probes in each cluster is in parentheses.E, F Spheroids were cultured as indicated for 24 hours followed by a 1-hr pulse with EdU to mark the cells undergoing DNA synthesis. (E) Representative images of EdU staining (red). Nuclei are visualized with bisbenzimide (blue). Scale bars, 20 µm. (F) Quantification of EdU-positive nuclei as a percent of the total nuclei (n = minimum of 15 spheroids counted per sample from 2 independent experiments). ****p<0.0001 by 1-way ANOVA and Tukey's post-test.G Graph of the fold change in background-subtracted luminescence ± s.e.m. (relative to 0 hr measurement) of Cdc25A-CBRLuc spheroids (n = 3 independent experiments with 4 technical replicates). ****p<0.0001 for dmPGE2- and EP4i-treated spheroids compared to stem cells by repeated measures 2-way ANOVA (variable = treatment). p<0.001 at the 16 hr, 20 hr and 24 hr time points by Dunnett's post-test comparing dmPGE2-treated and EP4i-treated spheroids to the stem cell control.H Quantification of the average expression ± s.e.m. of Lgr5 and Mki67 mRNAs in jejunal spheroids cultured in stem cell (Stem) or in differentiation medium with the indicated supplements relative to the stem cell group (n = 3 independent experiments). **p<0.01, ****p<0.0001 by one-way ANOVA and Dunnett's post-test. n.d., not detected."}
{"words": ["Figure", "4D", "Representative", "images", "of", "spheroids", "stained", "for", "Cldn4", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "visualized", "with", "bisbenzimide", "(", "blue", ")", "(", "n", "=", "2", "independent", "experiments", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "µm", ".", "E", ",", "F", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "as", "in", "Figure", "2B", "-", "D", ".", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Dpcr1", "(", "E", ")", "and", "Cd55b", "mRNAs", "relative", "to", "DMSO", "group", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "G", "-", "J", "Representative", "transmission", "electron", "microscopy", "(", "TEM", ")", "images", "of", "spheroids", "or", "an", "in", "vivo", "WAE", "cell", "from", "a", "biopsy", "-", "injured", "mousecolon", ".", "(", "G", ")", "The", "basal", "plasma", "membranes", "are", "outlined", "in", "orange", "solid", "lines", ",", "lateral", "plasma", "membranes", "are", "indicated", "with", "orange", "arrowheads", ",", "and", "nuclei", "are", "outlined", "with", "wide", "yellow", "dashed", "lines", ".", "Insets", "show", "a", "magnified", "view", "of", "the", "apical", "cell", "surface", ".", "G", "-", "J", "Representative", "transmission", "electron", "microscopy", "(", "TEM", ")", "images", "of", "spheroids", "or", "an", "in", "vivo", "WAE", "cell", "from", "a", "biopsy", "-", "injured", "mousecolon", ".", "Quantification", "of", "cytoplasmic", ":", "nuclear", "ratio", "(", "H", ")", "and", "microvillar", "length", "(", "I", ")", "from", "the", "TEM", "images", "(", "n", "=", "minimum", "of", "5", "images", "per", "group", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "1", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "G", "-", "J", "Representative", "transmission", "electron", "microscopy", "(", "TEM", ")", "images", "of", "spheroids", "or", "an", "in", "vivo", "WAE", "cell", "from", "a", "biopsy", "-", "injured", "mousecolon", ".", "(", "J", ")", "Higher", "power", "image", "of", "the", "cytoplasm", ".", "Single", "mitochondria", "are", "outlined", "with", "a", "narrow", "blue", "dashed", "line", ",", "vacuole", "structures", "are", "indicated", "with", "red", "asterisks", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "µm", ".", "K", "Representative", "image", "of", "a", "spheroid", "stained", "for", "β", "-", "catenin", "(", "green", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "visualized", "with", "bisbenzimide", "(", "blue", ")", ".", "A", "similarly", "stained", "section", "of", "a", "small", "intestinal", "ulcer", "is", "shown", "for", "comparison", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "apical", "cell", "membrane", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D Representative images of spheroids stained for Cldn4 (red). Nuclei are visualized with bisbenzimide (blue) (n = 2 independent experiments). Scale bars, 20 µm.E, F Jejunal spheroids were cultured as in Figure 2B-D. Quantification of the average expression ± s.e.m. of Dpcr1 (E) and Cd55b mRNAs relative to DMSO group (n = 3 independent experiments). *p<0.05, ****p<0.0001 by one-way ANOVA and Dunnett's post-test.G-J Representative transmission electron microscopy (TEM) images of spheroids or an in vivo WAE cell from a biopsy-injured mousecolon. (G) The basal plasma membranes are outlined in orange solid lines, lateral plasma membranes are indicated with orange arrowheads, and nuclei are outlined with wide yellow dashed lines. Insets show a magnified view of the apical cell surface.G-J Representative transmission electron microscopy (TEM) images of spheroids or an in vivo WAE cell from a biopsy-injured mousecolon. Quantification of cytoplasmic:nuclear ratio (H) and microvillar length (I) from the TEM images (n = minimum of 5 images per group). *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001 by 1-way ANOVA and Tukey's post-test.G-J Representative transmission electron microscopy (TEM) images of spheroids or an in vivo WAE cell from a biopsy-injured mousecolon. (J) Higher power image of the cytoplasm. Single mitochondria are outlined with a narrow blue dashed line, vacuole structures are indicated with red asterisks. Scale bars, 1 µm.K Representative image of a spheroid stained for β-catenin (green) and F-actin (red). Nuclei are visualized with bisbenzimide (blue). A similarly stained section of a small intestinal ulcer is shown for comparison. Arrowheads indicate the apical cell membrane. Scale bars, 50 µm."}
{"words": ["Figure", "5A", "Representative", "image", "of", "a", "spheroid", "stained", "for", "β", "-", "catenin", "(", "green", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "visualized", "with", "bisbenzimide", "(", "blue", ")", ".", "A", "similarly", "stained", "section", "of", "a", "mouse", "villus", "is", "shown", "for", "comparison", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "apical", "cell", "membrane", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", ".", "B", ",", "C", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "as", "indicated", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Fabp1", ",", "Ace2", ",", "and", "Maoa", "mRNAs", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "B", ",", "C", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "as", "indicated", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "spheroids", "stained", "for", "Ace2", "(", "green", ")", "and", "β", "-", "catenin", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "visualized", "with", "bisbenzimide", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "µm", ".", "F", ",", "G", "Representative", "TEM", "images", "of", "EP4i", "-", "treated", "spheroids", ".", "(", "F", ")", "The", "basal", "plasma", "membranes", "are", "outlined", "in", "orange", "solid", "lines", ",", "lateral", "plasma", "membranes", "are", "indicated", "with", "orange", "arrowheads", ",", "and", "nuclei", "are", "outlined", "with", "wide", "yellow", "dashed", "lines", ".", "Insets", "show", "a", "magnified", "view", "of", "the", "apical", "cell", "surface", ".", "(", "G", ")", "Higher", "power", "image", "of", "the", "cytoplasm", ".", "Single", "mitochondria", "are", "outlined", "with", "a", "narrow", "blue", "dashed", "line", ",", "vacuole", "structures", "are", "indicated", "with", "red", "asterisks", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "µm", ".", "H", "Graph", "of", "spheroid", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "to", "extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ")", "ratio", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01by", "1", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Representative image of a spheroid stained for β-catenin (green) and F-actin (red). Nuclei are visualized with bisbenzimide (blue). A similarly stained section of a mouse villus is shown for comparison. Arrowheads indicate the apical cell membrane. Scale bars, 50 µm.B, C Jejunal spheroids were cultured as indicated. (B) Quantification of the average expression ± s.e.m. of Fabp1, Ace2, and Maoa mRNAs (n = 3 independent experiments). *p<0.05, **p<0.01 by one-way ANOVA and Tukey's post-test.B, C Jejunal spheroids were cultured as indicated. (C) Representative images of spheroids stained for Ace2 (green) and β-catenin (red). Nuclei are visualized with bisbenzimide (blue). Scale bars, 20 µm.F, G Representative TEM images of EP4i-treated spheroids. (F) The basal plasma membranes are outlined in orange solid lines, lateral plasma membranes are indicated with orange arrowheads, and nuclei are outlined with wide yellow dashed lines. Insets show a magnified view of the apical cell surface. (G) Higher power image of the cytoplasm. Single mitochondria are outlined with a narrow blue dashed line, vacuole structures are indicated with red asterisks. Scale bars, 1 µm.H Graph of spheroid oxygen consumption rate (OCR) to extracellular acidification rate (ECAR) ratio expressed as mean ± s.e.m. (n = 3 independent experiments). **p<0.01by 1-way ANOVA and Tukey's post-test."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "D", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Dpcr1", "and", "Cd55b", "mRNAs", "(", "A", ",", "C", ",", "E", ")", "or", "Fabp1", "and", "Ace2", "mRNAs", "(", "B", ",", "D", ",", "F", ")", "in", "jejunal", "spheroids", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "containing", "EP4i", "or", "dmPGE2", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Gene", "expression", "analyzed", "2", ",", "6", ",", "12", "or", "24", "hours", "after", "the", "start", "of", "treatment", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "comparing", "the", "two", "treatment", "groups", "and", "†", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "†", "†", "†", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "†", "†", "†", "†", "p", "<", "0", ".", "0001", "compared", "to", "the", "2", "hr", "time", "point", "of", "the", "same", "medium", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "and", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Gene", "expression", "was", "analyzed", "after", "culturing", "spheroids", "in", "EP4i", "(", "E", ")", "or", "dmPGE2", "(", "P", ")", "for", "the", "first", "12", "hours", "followed", "by", "wash", "out", "and", "re", "-", "feeding", "with", "EP4i", "or", "dmPGE2", "for", "the", "second", "12", "hours", "as", "shown", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "E", ",", "F", "Gene", "expression", "was", "analyzed", "in", "Ptger4flox", "/", "flox", ",", "Ptger4flox", "/", "Δ", "and", "Ptger4Δ", "/", "Δspheroids", "and", "expressed", "as", "fold", "change", "relative", "to", "EP4i", "-", "treated", "Ptger4flox", "/", "flox", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", "comparing", "the", "genotypes", "within", "a", "treatment", "group", ".", "†", "†", "†", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "†", "†", "†", "†", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "and", "Sidak", "'", "s", "post", "-", "test", "comparing", "the", "effects", "of", "the", "treatments", "within", "a", "genotype", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-D Quantification of the average expression ± s.e.m. of Dpcr1 and Cd55b mRNAs (A, C, E) or Fabp1 and Ace2 mRNAs (B, D, F) in jejunal spheroids cultured in differentiation medium containing EP4i or dmPGE2. (A, B) Gene expression analyzed 2, 6, 12 or 24 hours after the start of treatment (n = 3 independent experiments). ***p<0.001, ****p<0.0001 comparing the two treatment groups and †p<0.05, †††p<0.001, ††††p<0.0001 compared to the 2 hr time point of the same medium by 2-way ANOVA and Sidak's multiple comparisons test. (C, D) Gene expression was analyzed after culturing spheroids in EP4i (E) or dmPGE2 (P) for the first 12 hours followed by wash out and re-feeding with EP4i or dmPGE2 for the second 12 hours as shown (n = 3 independent experiments). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and ****p<0.0001 by one-way ANOVA and Dunnett's post-test.E, F Gene expression was analyzed in Ptger4flox/flox, Ptger4flox/Δ and Ptger4Δ/Δspheroids and expressed as fold change relative to EP4i-treated Ptger4flox/flox (n = 3 independent experiments). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 by two-way ANOVA and Tukey's post-test comparing the genotypes within a treatment group. †††p<0.001, ††††p<0.0001 by two-way ANOVA and Sidak's post-test comparing the effects of the treatments within a genotype."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "containing", "10", "µM", "of", "Forskolin", "or", "an", "equivalent", "volume", "of", "DMSO", ".", "(", "A", ")", "Representative", "bright", "-", "field", "images", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "µm", ".", "A", ",", "B", "Jejunal", "spheroids", "were", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "containing", "10", "µM", "of", "Forskolin", "or", "an", "equivalent", "volume", "of", "DMSO", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Cldn4", "mRNA", "relative", "to", "the", "DMSO", "treatment", "group", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "DMSO", "group", "by", "unpaired", "t", "test", ".", "C", ",", "D", "Representative", "Western", "blots", "for", "β", "-", "catenin", "detected", "in", "nuclear", "(", "Nuc", ")", "and", "cytoplasmic", "(", "Cyt", ")", "protein", "lysates", ".", "Lamin", "A", "/", "C", "and", "Actin", "were", "used", "as", "loading", "controls", "for", "the", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "fractions", ",", "respectively", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "C", ")", "Spheroids", "were", "cultured", "in", "stem", ",", "enterocyte", "(", "EP4i", ")", "or", "WAE", "(", "dmPGE2", ")", "media", ".", "(", "D", ")", "Spheroids", "were", "cultured", "in", "enterocyte", "medium", "with", "DMSO", "or", "10", "µM", "CHIR", "99021", ".", "E", ",", "F", "Spheroids", "were", "cultured", "in", "enterocyte", "medium", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "CHIR", "99021", ".", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Cldn4", "(", "E", ")", "and", "Fabp1", "(", "F", ")", "mRNAs", "shown", "as", "fold", "change", "relative", "to", "0", "µM", "group", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "as", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "G", "Representative", "images", "of", "Ptger4Δ", "/", "Δspheroids", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "with", "DMSO", "or", "10", "µM", "CHIR", "99021", "and", "stained", "for", "β", "-", "catenin", "(", "green", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "visualized", "with", "bisbenzimide", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "µm", ".", "H", "Graph", "of", "TOPflash", "(", "TOP", ")", "to", "FOPflash", "(", "FOP", ")", "luciferase", "reporter", "ratios", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "in", "transfected", "293FT", "cells", "treated", "with", "conditioned", "mediums", "collected", "from", "L", "-", "WRN", "cells", "and", "diluted", "as", "indicated", ".", "L", "-", "WRN", "CM", "had", "been", "produced", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "porcupine", "inhibitor", "C59", "(", "10", "-", "fold", "dilutions", ",", "10", "µM", "to", "1", "pM", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "1", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", "compared", "to", "0", "%", "L", "-", "WRN", "CM", "group", ".", "I", ",", "J", "Spheroids", "were", "cultured", "in", "enterocyte", "media", ",", "WAE", "media", "or", "WAE", "media", "containing", "100", "pM", "C59", ".", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Cldn4", "(", "I", ")", "and", "Fabp1", "(", "J", ")", "mRNAs", "shown", "as", "fold", "change", "relative", "to", "EP4i", "group", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "as", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "K", "Quantification", "of", "the", "average", "expression", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Axin2", "mRNA", "in", "spheroids", "cultured", "in", "stem", "cell", "or", "in", "differentiation", "medium", "with", "the", "indicated", "supplements", "relative", "to", "stem", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "compared", "to", "stem", "cell", "group", "as", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, B Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium containing 10 µM of Forskolin or an equivalent volume of DMSO. (A) Representative bright-field images. Scale bars, 200 µm.A, B Jejunal spheroids were cultured in differentiation medium containing 10 µM of Forskolin or an equivalent volume of DMSO. (B) Quantification of the average expression ± s.e.m. of Cldn4 mRNA relative to the DMSO treatment group (n = 3 independent experiments). *p<0.05 compared to DMSO group by unpaired t test.C, D Representative Western blots for β-catenin detected in nuclear (Nuc) and cytoplasmic (Cyt) protein lysates. Lamin A/C and Actin were used as loading controls for the nuclear and cytoplasmic fractions, respectively (n = 3 independent experiments). (C) Spheroids were cultured in stem, enterocyte (EP4i) or WAE (dmPGE2) media. (D) Spheroids were cultured in enterocyte medium with DMSO or 10 µM CHIR 99021.E, F Spheroids were cultured in enterocyte medium with the indicated concentrations of CHIR 99021. Quantification of the average expression ± s.e.m. of Cldn4 (E) and Fabp1 (F) mRNAs shown as fold change relative to 0 µM group (n = 3 independent experiments). **p<0.01, ****p<0.0001 as determined by one-way ANOVA and Dunnett's post-test.G Representative images of Ptger4Δ/Δspheroids cultured in differentiation medium with DMSO or 10 µM CHIR 99021 and stained for β-catenin (green) and F-actin (red). Nuclei are visualized with bisbenzimide (blue). Scale bars, 20 µm.H Graph of TOPflash (TOP) to FOPflash (FOP) luciferase reporter ratios ± s.e.m. (n = 3 independent experiments) in transfected 293FT cells treated with conditioned mediums collected from L-WRN cells and diluted as indicated. L-WRN CM had been produced in the presence or absence of the porcupine inhibitor C59 (10-fold dilutions, 10 µM to 1 pM). *p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001 by 1-way ANOVA and Dunnett's post-test compared to 0% L-WRN CM group.I, J Spheroids were cultured in enterocyte media, WAE media or WAE media containing 100 pM C59. Quantification of the average expression ± s.e.m. of Cldn4 (I) and Fabp1 (J) mRNAs shown as fold change relative to EP4i group (n = 3 independent experiments). ***p<0.001, ****p<0.0001 as determined by one-way ANOVA and Tukey's post-test.K Quantification of the average expression ± s.e.m. of Axin2 mRNA in spheroids cultured in stem cell or in differentiation medium with the indicated supplements relative to stem (n = 3 independent experiments). ****p<0.0001 compared to stem cell group as determined by one-way ANOVA and Dunnett's post-test."}
{"words": ["Figure", "8A", "Representative", "whole", "-", "mount", "images", "of", "wounds", "from", "Ptger4flox", "/", "flox", "(", "Ptger4fl", "/", "fl", ")", "and", "Villin", "-", "Cre", "Ptger4flox", "/", "flox", "(", "VilCrePtger4fl", "/", "fl", ")", "mice", "four", "days", "post", "-", "biopsy", "injury", ".", "Scale", "bars", ",", "750", "µm", ".", "Wounds", "are", "outlined", "with", "a", "black", "dashed", "line", ".", "Asterisk", "indicates", "fibrin", "clot", ".", "B", ",", "C", "Quantification", "of", "percent", "healing", "(", "1", "-", "[", "Day", "4", "wound", "area", "/", "original", "wound", "area", "]", "x", "100", ")", "(", "B", ")", "and", "fibrin", "clot", "areas", "(", "C", ")", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "7", "-", "8", "mice", "per", "genotype", "with", "3", "-", "4", "wounds", "each", ",", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0270", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0057", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "D", ",", "E", "Representative", "images", "of", "serial", "wound", "tissue", "sections", "from", "the", "indicated", "genotypes", ".", "(", "D", ")", "Fluorescent", "images", "of", "sections", "stained", "for", "Claudin", "4", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "visualized", "with", "bisbenzimide", "(", "blue", ")", ".", "Epithelial", "crypts", "adjacent", "to", "the", "wound", "bed", "are", "indicated", "by", "dashed", "yellow", "lines", ".", "Layer", "of", "adherent", "WAE", "cells", "indicated", "by", "white", "arrowheads", ".", "Non", "-", "adherent", "residual", "WAE", "cells", "indicated", "by", "orange", "arrows", ".", "D", ",", "E", "Representative", "images", "of", "serial", "wound", "tissue", "sections", "from", "the", "indicated", "genotypes", ".", "(", "E", ")", "Grayscale", "images", "of", "hematoxylin", "and", "eosin", "-", "stained", "sections", ".", "Insets", "of", "the", "boxed", "regions", "show", "a", "higher", "magnification", "of", "the", "region", "typically", "containing", "WAE", "cells", "(", "red", "arrowheads", ",", "dashed", "line", "indicates", "border", "with", "wound", "bed", ")", ".", "Orange", "arrow", "indicates", "region", "of", "non", "-", "adherent", "residual", "WAE", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Representative whole-mount images of wounds from Ptger4flox/flox (Ptger4fl/fl) and Villin-Cre Ptger4flox/flox (VilCrePtger4fl/fl) mice four days post-biopsy injury. Scale bars, 750 µm. Wounds are outlined with a black dashed line. Asterisk indicates fibrin clot.B, C Quantification of percent healing (1 - [Day 4 wound area/original wound area] x 100) (B) and fibrin clot areas (C) ± s.e.m. (n = 7-8 mice per genotype with 3-4 wounds each, three independent experiments). *p=0.0270, **p=0.0057 by two-tailed unpaired t-test.D, E Representative images of serial wound tissue sections from the indicated genotypes. (D) Fluorescent images of sections stained for Claudin 4 (red). Nuclei are visualized with bisbenzimide (blue). Epithelial crypts adjacent to the wound bed are indicated by dashed yellow lines. Layer of adherent WAE cells indicated by white arrowheads. Non-adherent residual WAE cells indicated by orange arrows.D, E Representative images of serial wound tissue sections from the indicated genotypes. (E) Grayscale images of hematoxylin and eosin-stained sections. Insets of the boxed regions show a higher magnification of the region typically containing WAE cells (red arrowheads, dashed line indicates border with wound bed). Orange arrow indicates region of non-adherent residual WAE cells. Scale bars, 100 µm."}
{"words": ["Figure", "1B", "Cryosections", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "appropriate", "excitation", "wavelengths", "and", "emission", "filters", ".", "White", "boxes", "indicate", "the", "magnified", "area", "in", "the", "lower", "panel", ".", "All", "images", "were", "taken", "as", "\"", "multiple", "image", "alignments", "\"", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "and", "25", "µm", "in", "the", "upper", "and", "lower", "panel", ",", "respectively", ".", "C", "Whole", "brain", "and", "midbrain", "lysates", "of", "adult", "mice", "were", "prepared", "as", "outlined", ";", ".", "Total", "protein", "(", "20", "µg", ")", "was", "immunoblotted", "for", "MAD2", "or", "α", "-", "Tubulin", "and", "compared", "to", "HEK", "-", "293", "cell", "lysates", ".", "D", "Z", "-", "stacks", "of", "individual", "TPH", "+", "/", "MAD2", "+", "positive", "neurons", "were", "generated", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Intensity", "profiles", "of", "an", "average", "projection", "were", "generated", "using", "ImageJ", "/", "Plot", "Profile", "software", ".", "Scale", "bar", "represents", "20", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Cryosections were subjected to immunofluorescence microscopy using appropriate excitation wavelengths and emission filters. White boxes indicate the magnified area in the lower panel. All images were taken as \"multiple image alignments\". Scale bars represent 100 and 25 µm in the upper and lower panel, respectively.C Whole brain and midbrain lysates of adult mice were prepared as outlined ;. Total protein (20 µg) was immunoblotted for MAD2 or α-Tubulin and compared to HEK-293 cell lysates.D Z-stacks of individual TPH+/MAD2+ positive neurons were generated by confocal microscopy. Intensity profiles of an average projection were generated using ImageJ/Plot Profile software. Scale bar represents 20 µm."}
{"words": ["Figure", "2B", "-", "D", "GST", "pull", "-", "down", "experiments", "were", "conducted", "in", "duplicates", "using", "the", "indicated", "GST", "fusion", "proteins", ".", "Eluates", "(", "30", "%", ")", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "together", "with", "an", "aliquot", "(", "1", "%", ")", "of", "the", "input", ".", "Blots", "were", "stained", "with", "Ponceau", "S", "and", "MAD2", "was", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Densitometric", "signals", "were", "quantified", "using", "ImageJ", "software", ".", "Results", "were", "compared", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "tests", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", "-", "not", "significant", ";", "exact", "p", "-", "values", "are", "indicated", ";", "error", "bars", "represent", "SD", "of", "8", "independent", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "E", "Total", "cell", "lysates", "(", "5", "µg", ")", "of", "indicated", "transfections", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", ",", "using", "antibodies", "against", "YFP", "and", "MAD2", ".", "YFP", "-", "hMAD2", "-", "constructs", "were", "generated", "Whole", "cell", "lysates", "of", "transfected", "HEK", "-", "293", "cells", "were", "used", "for", "GST", "pull", "-", "down", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "posthoc", "comparison", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "-", "not", "significant", ";", "error", "bars", "represent", "SD", "of", "3", "independent", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B - D GST pull-down experiments were conducted in duplicates using the indicated GST fusion proteins. Eluates (30%) were subjected to immunoblotting together with an aliquot (1%) of the input. Blots were stained with Ponceau S and MAD2 was detected by immunoblotting. Densitometric signals were quantified using ImageJ software. Results were compared using unpaired two-tailed t-tests; ****p < 0.0001, ns - not significant; exact p-values are indicated; error bars represent SD of 8 independent biological replicates (n = 8).E Total cell lysates (5 µg) of indicated transfections were subjected to immunoblotting, using antibodies against YFP and MAD2.YFP-hMAD2-constructs were generated Whole cell lysates of transfected HEK-293 cells were used for GST pull-down experiments. One-way ANOVA with Dunnett's multiple posthoc comparison; ***p < 0.001, ns - not significant; error bars represent SD of 3 independent biological replicates (n = 3)."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "B", "Immunofluorescence", "of", "p31comet", "and", "BubR1", "in", "mouse", "dorsal", "raphe", ".", "White", "boxes", "indicate", "the", "magnified", "sections", "in", "the", "lower", "panels", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "and", "25", "µm", "in", "the", "upper", "and", "lower", "panels", ",", "respectively", ".", "C", "Co", "-", "immunoprecipitation", "experiments", "using", "lysates", "from", "HEK", "-", "293", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "YFP", "-", "tagged", "transporters", ".", "Eluates", "(", "20", "%", ")", "as", "well", "as", "0", ".", "1", "%", "total", "cell", "lysate", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "The", "immunoblot", "for", "mouse", "anti", "-", "β2", "-", "adaptin", "was", "subsequently", "used", "for", "incubation", "with", "rabbit", "anti", "-", "GFP", "primary", "and", "IRDye", "800CW", "anti", "-", "rabbit", "secondary", "antibody", ".", "IRDye", "signals", "were", "detected", "using", "the", "LI", "-", "COR", "Odyssey", "CLx", "imaging", "system", ".", "Densitometric", "signals", "were", "quantified", "using", "ImageJ", "software", ".", "HEK", "-", "293", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "-", "hSERT", "were", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "(", "\"", "C", "\"", "-", "ctrl", "siRNA", ";", "\"", "M", "\"", "-", "MAD2", "siRNA", ")", "and", "subjected", "to", "co", "-", "immunoprecipitation", ".", "All", "signals", "were", "normalized", "to", "YFP", "-", "SERT", ".", "Results", "were", "compared", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "tests", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", "-", "not", "significant", ";", "calculated", "p", "-", "values", "are", "indicated", ";", "error", "bars", "represent", "SD", "of", "7", "(", "BubR1", ")", ",", "8", "(", "β2", "-", "adaptin", ")", ",", "5", "(", "p31comet", ")", "and", "8", "(", "HSP70", ")", "independent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A - B Immunofluorescence of p31comet and BubR1 in mouse dorsal raphe. White boxes indicate the magnified sections in the lower panels. Scale bars represent 100 and 25 µm in the upper and lower panels, respectively.C Co-immunoprecipitation experiments using lysates from HEK-293 cells stably expressing the indicated YFP-tagged transporters. Eluates (20%) as well as 0.1% total cell lysate were analyzed by immunoblotting. The immunoblot for mouse anti-β2-adaptin was subsequently used for incubation with rabbit anti-GFP primary and IRDye 800CW anti-rabbit secondary antibody. IRDye signals were detected using the LI-COR Odyssey CLx imaging system. Densitometric signals were quantified using ImageJ software.HEK-293 cells stably expressing YFP-hSERT were transfected with indicated siRNAs (\"C\" - ctrl siRNA; \"M\" - MAD2 siRNA) and subjected to co-immunoprecipitation. All signals were normalized to YFP-SERT. Results were compared using unpaired two-tailed t-tests; ***p < 0.001, ****p < 0.0001, ns - not significant; calculated p-values are indicated; error bars represent SD of 7 (BubR1), 8 (β2-adaptin), 5 (p31comet) and 8 (HSP70) independent biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4A", "Radioactive", "substrate", "uptake", "was", "conducted", "KM", "and", "Vmax", "were", "determined", "by", "fitting", "the", "data", "to", "the", "equation", "of", "a", "rectangular", "hyperbola", ".", "Representative", "curves", "are", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "For", "comparison", "of", "Vmax", "paired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "was", "conducted", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "-", "not", "significant", ";", "exact", "p", "-", "value", "is", "indicated", ".", "Data", "are", "derived", "from", "6", "independent", "biological", "replicates", ".", "Lysates", "were", "prepared", "from", "an", "aliquot", "of", "the", "cells", ",", "which", "were", "used", "for", "the", "uptake", "assay", ",", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "to", "verify", "MAD2", "knockdown", ".", "Immunodetection", "of", "α", "-", "tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "B", "Cell", "surface", "biotinylation", "using", "HEK", "-", "293", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "-", "hSERT", "was", "performed", "Whole", "cell", "lysates", "and", "streptavidin", "-", "conjugated", "fractions", "(", "i", ".", "e", ".", ",", "surface", "protein", ")", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", ".", "C", "-", "D", "HEK", "-", "293", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "-", "hSERT", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ",", "imaged", "and", "analyzed", "Representative", "maximum", "intensity", "projections", "of", "Z", "-", "stacks", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "and", "20", "µm", "in", "full", "size", "images", "and", "zoomed", "areas", ",", "respectively", ".", "Intracellular", "SERT", "-", "signal", "was", "measured", "using", "ImageJ", "software", ".", "The", "dot", "plot", "in", "panel", "D", "shows", "values", "(", "presented", "as", "Log10", "to", "account", "for", "the", "large", "variation", "in", "the", "signal", ")", "from", "individual", "cells", "(", "Ctrl", "siRNA", "n", "=", "112", "cells", ";", "MAD2", "siRNA", "n", "=", "116", "cells", ")", "deriving", "from", "3", "independent", "biological", "replicates", ",", "the", "median", "and", "the", "interquartile", "range", ".", "The", "statistically", "significant", "difference", "was", "assessed", "by", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "the", "p", "-", "value", "is", "indicated", ".", "E", "-", "H", "HEK", "-", "293", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "-", "hSERT", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", ",", "subsequently", "co", "-", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "mCherry", "-", "Rab5", "(", "panel", "E", ")", "or", "mCherry", "-", "Rab7A", "(", "panel", "G", ")", "Manders", "'", "overlap", "coefficients", "for", "the", "fraction", "of", "mCherry", "overlapping", "YFP", "were", "calculated", "for", "multiple", "individual", "images", "using", "ImageJ", "/", "JACoP", ".", "Number", "of", "analyzed", "images", ":", "mCh", "-", "Rab5", "/", "ctrl", "-", "siRNA", "=", "38", ";", "mCh", "-", "Rab5", "/", "MAD2", "-", "siRNA", "=", "33", "(", "Panel", "F", ")", ";", "mCh", "-", "Rab7A", "/", "ctrl", "-", "siRNA", "=", "13", ";", "mCh", "-", "Rab7A", "/", "Mad2", "-", "siRNA", "=", "14", "(", "panel", "H", ")", ".", "Statistically", "significant", "differences", "were", "assessed", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "the", "p", "-", "values", "were", "below", "0", ".", "0001", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "of", "3", "independent", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "and", "20", "µm", "in", "full", "size", "images", "and", "zoomed", "areas", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Radioactive substrate uptake was conducted KM and Vmax were determined by fitting the data to the equation of a rectangular hyperbola. Representative curves are shown. Error bars represent SEM. For comparison of Vmax paired two-tailed t-test was conducted; **p < 0.01, ns - not significant; exact p-value is indicated. Data are derived from 6 independent biological replicates. Lysates were prepared from an aliquot of the cells, which were used for the uptake assay, and subjected to immunoblotting to verify MAD2 knockdown. Immunodetection of α-tubulin was used as a loading control.B Cell surface biotinylation using HEK-293 cells stably expressing YFP-hSERT was performed Whole cell lysates and streptavidin-conjugated fractions (i.e., surface protein) were subjected to immunoblotting.C - D HEK-293 cells stably expressing YFP-hSERT were transfected with the indicated siRNAs, imaged and analyzed Representative maximum intensity projections of Z-stacks are shown. Scale bars represent 50 and 20 µm in full size images and zoomed areas, respectively. Intracellular SERT-signal was measured using ImageJ software. The dot plot in panel D shows values (presented as Log10 to account for the large variation in the signal) from individual cells (Ctrl siRNA n = 112 cells; MAD2 siRNA n = 116 cells) deriving from 3 independent biological replicates, the median and the interquartile range. The statistically significant difference was assessed by an unpaired two-tailed t-test, the p-value is indicated.E - H HEK-293 cells stably expressing YFP-hSERT were transfected with the indicated siRNA, subsequently co-transfected with plasmids encoding mCherry-Rab5 (panel E) or mCherry-Rab7A (panel G) Manders' overlap coefficients for the fraction of mCherry overlapping YFP were calculated for multiple individual images using ImageJ/JACoP. Number of analyzed images: mCh-Rab5/ctrl-siRNA = 38; mCh-Rab5/MAD2-siRNA = 33 (Panel F); mCh-Rab7A/ctrl-siRNA = 13; mCh-Rab7A/Mad2-siRNA = 14 (panel H). Statistically significant differences were assessed by unpaired two-tailed t-test, the p-values were below 0.0001. Error bars represent SD of 3 independent biological replicates (n = 3). Scale bars represent 50 and 20 µm in full size images and zoomed areas, respectively."}
{"words": ["Figure", "5B", "Immunofluorescence", "images", "of", "rat", "primary", "dorsal", "raphe", "neurons", "were", "analyzed", "using", "ImageJ", "/", "JACoP", "software", ".", "Bars", "indicate", "Manders", "'", "overlap", "coefficients", "for", "the", "fraction", "of", "SERT", "overlapping", "with", "the", "denoted", "marker", "protein", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Number", "of", "analyzed", "cells", ":", "Rab11A", "n", "=", "20", ";", "Rab7A", "n", "=", "11", ";", "Rab4", "n", "=", "8", ";", "LAMP1", "n", "=", "12", ";", "Rab5", "n", "=", "14", ";", "beta", "-", "COP", "n", "=", "7", ";", "TGN38", "n", "=", "5", ";", "GM130", "n", "=", "11", ";", "SEC24C", "n", "=", "11", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "E", "Primary", "rat", "dorsal", "raphe", "neurons", "were", "cultured", "After", "14", "days", ",", "cells", "were", "infected", "with", "lentiviral", "particles", "encoding", "either", "scramble", "-", "shRNA", "or", "shRNA", "directed", "against", "MAD2", ".", "Five", "days", "after", "infection", ",", "cells", "were", "fixed", "in", "acetone", "/", "methanol", "(", "1", ":", "1", ")", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "with", "the", "indicated", "primary", "and", "secondary", "antibodies", ".", "Confocal", "images", "were", "captured", "on", "a", "Nikon", "A1", "laser", "scanning", "confocal", "microscope", "at", "either", "20", "×", "(", "Fig", ".", "5", "E", ",", "left", "panel", ")", "or", "60", "×", "(", "Fig", ".", "5", "E", ",", "right", "panel", ")", "magnification", ",", "representative", "images", "are", "shown", ".", "Due", "to", "imaging", "conditions", "the", "optical", "section", "thickness", "is", "increased", "at", "20", "×", "compared", "to", "60", "×", "magnification", ".", "Calibration", "bars", "in", "images", "showing", "rMAD2", "represent", "arbitrary", "fluorescence", "units", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "and", "10", "µm", "for", "20", "×", "and", "60", "×", "magnification", ",", "respectively", ".", "F", "Surface", "and", "intracellular", "SERT", "-", "signal", "from", "scramble", "-", "and", "MAD2", "-", "shRNA", "infected", "neurons", "(", "n", "=", "40", "and", "n", "=", "30", ",", "respectively", ")", "was", "quantified", "within", "regions", "of", "interest", "(", "ROIs", ")", "using", "ImageJ", "software", "and", "the", "resulting", "ratios", "compared", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "the", "p", "-", "value", "was", "below", "0", ".", "0001", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "The", "right", "part", "provides", "4", "additional", "representative", "images", "of", "both", ":", "scramble", "-", "shRNA", "and", "MAD2", "-", "shRNA", "expressing", "serotonergic", "neurons", "(", "SERT", ":", "orange", ",", "nuclei", ":", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "30", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Immunofluorescence images of rat primary dorsal raphe neurons were analyzed using ImageJ/JACoP software. Bars indicate Manders' overlap coefficients for the fraction of SERT overlapping with the denoted marker protein. One-way ANOVA and Tukey's multiple comparisons test; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Number of analyzed cells: Rab11A n = 20; Rab7A n = 11; Rab4 n = 8; LAMP1 n = 12; Rab5 n = 14; beta-COP n = 7; TGN38 n = 5; GM130 n = 11; SEC24C n= 11. Error bars represent SEM.E Primary rat dorsal raphe neurons were cultured After 14 days, cells were infected with lentiviral particles encoding either scramble-shRNA or shRNA directed against MAD2. Five days after infection, cells were fixed in acetone/methanol (1:1) and subjected to immunofluorescence with the indicated primary and secondary antibodies. Confocal images were captured on a Nikon A1 laser scanning confocal microscope at either 20× (Fig. 5 E, left panel) or 60× (Fig. 5 E, right panel) magnification, representative images are shown. Due to imaging conditions the optical section thickness is increased at 20× compared to 60× magnification. Calibration bars in images showing rMAD2 represent arbitrary fluorescence units. Scale bars represent 50 and 10 µm for 20× and 60× magnification, respectively.F Surface and intracellular SERT-signal from scramble- and MAD2-shRNA infected neurons (n = 40 and n = 30, respectively) was quantified within regions of interest (ROIs) using ImageJ software and the resulting ratios compared using an unpaired two-tailed t-test, the p-value was below 0.0001 (n = 4 biological replicates). Error bars represent SD. The right part provides 4 additional representative images of both: scramble-shRNA and MAD2-shRNA expressing serotonergic neurons (SERT: orange, nuclei: blue). Scale bars represent 30 µm."}
{"words": ["Figure", "1", " ", "(", "A", ")", " ", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "either", "a", "non", "-", "target", "dsRNA", "(", "NT", ")", "or", "one", "of", "the", "three", "siRNAs", "targeting", "LETM1", "(", "siR1", ",", "siR2", "or", "siR3", ")", "and", "labeled", "with", "anti", "-", "TOM20", "antibody", ".", "In", "siR1", "treated", "cells", ",", "the", "mitochondria", "formed", "a", "'", "honeycomb", "'", "of", "swollen", "distinct", "organelles", ";", "siR3", "resulted", "in", "giant", "organelles", "with", "a", "central", "region", "distinguished", "by", "reduced", "TOM20", ";", "siR2", ",", "produced", "relatively", "little", "swelling", "and", "the", "mitochondrial", "network", "was", "generally", "well", "preserved", ".", "The", "pronounced", "swelling", "induced", "by", "siR1", "significantly", "increased", "circularity", "(", "p", "=", "2", ".", "32E", "-", "58", ")", "(", "ImageJ", "analysis", ")", ",", "siR1", "circularity", "=", "0", ".", "683", "±", "0", ".", "012", "compared", "with", "0", ".", "414", "±", "0", ".", "008", "for", "the", "NT", ";", "where", "1", "=", "a", "perfect", "circle", ".", "Over", "150", "mitochondria", "were", "quantified", "in", "each", "cell", "type", ";", "data", "are", "means", "±", "SEM", ".", "Scale", "bar", "represents", "12", "µm", "in", "the", "main", "images", "and", "4", "µm", "in", "offset", "magnification", " ", " ", "(", "B", ")", " ", "35S", "labeling", "of", "de", "novo", " ", "mitochondrial", "protein", "synthesis", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Polypeptide", "assignments", "flank", "the", "gel", "images", ".", "Coomassie", "stained", "gels", "are", "used", "as", "loading", "controls", "and", "immunoblots", "indicate", "the", "efficiency", "of", "LETM1", "knockdown", " ", " ", "(", "D", ")", "Representative", "immunoblots", "for", "the", "OXPHOS", "proteins", "NDUFB8", "and", "COII", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "NT", "or", "siLETM1", "(", "siR1", ",", "siR2", "or", "siR3", ")", ".", "Vinculin", "and", "GAPDH", "are", "shown", "as", "loading", "controls", ".", "The", "mean", "relative", "abundances", "for", "respiratory", "subunits", "COII", "and", "NDUFB8", "are", "shown", "beneath", "the", "blots", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "8", "independent", "experiments", " ", " ", "(", "E", ")", " ", "Mitochondrial", " ", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "measured", "using", "a", "Seahorse", "flux", "analyzer", "before", "(", "basal", ")", "and", "after", "the", "addition", "(", "maximal", ")", "of", "the", "uncoupler", "FCCP", ",", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "NT", "or", "siLETM1", "(", "siR1", "or", "siR2", ")", ".", "Data", "are", "means", "±", "SEM", "of", "n", "=", "5", "experiments"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 (A) Immunofluorescence analysis of HeLa cells transfected with either a non-target dsRNA (NT) or one of the three siRNAs targeting LETM1 (siR1, siR2 or siR3) and labeled with anti-TOM20 antibody. In siR1 treated cells, the mitochondria formed a 'honeycomb' of swollen distinct organelles; siR3 resulted in giant organelles with a central region distinguished by reduced TOM20; siR2, produced relatively little swelling and the mitochondrial network was generally well preserved. The pronounced swelling induced by siR1 significantly increased circularity (p = 2.32E-58) (ImageJ analysis), siR1 circularity = 0.683 ±0.012 compared with 0.414 ±0.008 for the NT; where 1 = a perfect circle. Over 150 mitochondria were quantified in each cell type; data are means ± SEM. Scale bar represents 12 µm in the main images and 4 µm in offset magnification  (B) 35S labeling of de novo mitochondrial protein synthesis of HeLa cells transfected as in (A). Polypeptide assignments flank the gel images. Coomassie stained gels are used as loading controls and immunoblots indicate the efficiency of LETM1 knockdown  (D) Representative immunoblots for the OXPHOS proteins NDUFB8 and COII of HeLa cells transfected with NT or siLETM1 (siR1, siR2 or siR3). Vinculin and GAPDH are shown as loading controls. The mean relative abundances for respiratory subunits COII and NDUFB8 are shown beneath the blots. Data are expressed as mean ± SEM of n=8 independent experiments  (E) Mitochondrial oxygen consumption rate (OCR) measured using a Seahorse flux analyzer before (basal) and after the addition (maximal) of the uncoupler FCCP, in HeLa cells treated with NT or siLETM1 (siR1 or siR2). Data are means ± SEM of n=5 experiments "}
{"words": ["Figure", "3", " ", "(", "A", ")", " ", "LETM1", "expression", "was", "suppressed", "in", "HeLa", "cells", "by", "transfection", "with", "targeted", "siRNAs", "(", "siR1", ",", "siR2", "or", "siR3", ")", ".", "A", "non", "-", "target", "dsRNA", "(", "NT", ")", "served", "as", "control", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "immunolabeled", "with", "anti", "-", "DNA", "antibody", "(", "green", ")", ".", "A", "higher", "magnification", "of", "selected", "mtDNA", " ", "foci", "is", "shown", "beside", "each", "picture", ".", " ", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "cells", "in", "(", "A", ")", "displaying", "mtDNA", "abnormalities", ".", "At", "least", "50", "cells", "per", "siRNA", "were", "counted", "from", "4", "(", "siR2", ")", "and", "5", "(", "siR1", "or", "siR3", ")", "independent", "experiments", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", " ", " ", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "labeled", "with", "bromouridine", "(", "BrU", ")", "for", "60", "mins", ",", "144", "h", "after", "transfection", "with", "NT", "or", "siR2", "and", "stained", "with", "anti", "-", "BrdU", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "GRSF1", "(", "red", ")", "antibodies", ".", "Cell", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", " ", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "labeled", "with", "anti", "-", "DNA", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "GRSF1", "(", "red", ")", "antibodies", "144", "h", "after", "transfection", "with", "NT", "or", "siR3", ".", "Cell", "nuclei", "were", "stained", "blue", "with", "DAPI"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 (A) LETM1 expression was suppressed in HeLa cells by transfection with targeted siRNAs (siR1, siR2 or siR3). A non-target dsRNA (NT) served as control. Cells were fixed and immunolabeled with anti-DNA antibody (green). A higher magnification of selected mtDNA foci is shown beside each picture. (B) Quantification of cells in (A) displaying mtDNA abnormalities. At least 50 cells per siRNA were counted from 4 (siR2) and 5 (siR1 or siR3) independent experiments. Data are expressed as means ± SEM. ***P<0.001 (One-way ANOVA)  (C) HeLa cells were labeled with bromouridine (BrU) for 60 mins, 144 h after transfection with NT or siR2 and stained with anti-BrdU (green) and anti-GRSF1 (red) antibodies. Cell nuclei were stained with DAPI (blue)  (D) HeLa cells were labeled with anti-DNA (green) and anti-GRSF1 (red) antibodies 144 h after transfection with NT or siR3. Cell nuclei were stained blue with DAPI "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Steady", "state", "levels", "of", "LETM1", "protein", "in", "fibroblasts", "from", "controls", "(", "C1", "-", "C3", ")", ",", "WHS", "LETM1", "+", "/", "-", "(", "S1", ",", "S3", ",", "S4", ")", "and", "S5", "the", "sole", "case", "of", "WHS", "in", "this", "study", "whose", "deletion", "does", "not", "encompass", "LETM1", "(", "boxed", "in", "blue", ")", ".", "GAPDH", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", "(", "B", ")", "Immunofluoresence", "analysis", "of", "control", "(", "C1", ")", ",", "and", "WHS", "LETM1", "+", "/", "-", "S1", "-", "S4", ",", "fibroblasts", "with", "anti", "-", "TOM20", "antibody", ".", "Scale", "bars", "are", "8", "µm", "in", "the", "main", "images", "and", "3", "µm", "in", "offset", "merged", "magnifications", "(", "C", ")", "Electron", "micrographs", "of", "controls", "(", "C1", "and", "C2", ")", "and", "WHS", "LETM1", "+", "/", "+", "(", "S5", ")", "cells", ";", "side", "panels", "show", "zooms", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "2", "µm", ".", "Black", "arrows", "indicate", "the", "areas", "shown", "offset", "at", "higher", "magnification", "(", "D", ")", "Electron", "micrographs", "of", "WHS", "LETM1", "+", "/", "-", "S1", ",", "S3", "and", "S4", "cells", ".", "Black", "arrows", "indicate", "elongated", "and", "branched", "mitochondria", ";", "side", "panels", "show", "magnifications", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "2", "µm"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 (A) Steady state levels of LETM1 protein in fibroblasts from controls (C1-C3), WHS LETM1+/- (S1, S3, S4) and S5 the sole case of WHS in this study whose deletion does not encompass LETM1 (boxed in blue). GAPDH is shown as a loading control  (B) Immunofluoresence analysis of control (C1), and WHS LETM1+/- S1-S4, fibroblasts with anti-TOM20 antibody. Scale bars are 8 µm in the main images and 3 µm in offset merged magnifications  (C) Electron micrographs of controls (C1 and C2) and WHS LETM1+/+ (S5) cells; side panels show zooms. Scale bar: 0.2 µm. Black arrows indicate the areas shown offset at higher magnification (D) Electron micrographs of WHS LETM1+/- S1, S3 and S4 cells. Black arrows indicate elongated and branched mitochondria; side panels show magnifications. Scale bar: 0.2 µm "}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "mitochondrial", "lysates", "of", "HEK", "cells", "separated", "on", "a", "20", "-", "42", ".", "5", "%", "iodixanol", "gradients", "probed", "for", "LETM1", ",", "PDH", "and", "TFAM", "(", "B", ")", "Left", "panel", ":", "immunoblot", "analysis", "of", "total", "PDH", "protein", "levels", "and", "the", "inactive", "phosphorylated", "(", "repressed", "form", ")", ",", "PDHS293", ",", "in", "control", "(", "C1", ",", "C3", ")", ",", "WHS", "LETM1", "+", "/", "-", "(", "S1", ",", "S3", ",", "S4", ")", "and", "WHS", "LETM1", "+", "/", "+", "(", "S5", ")", "fibroblasts", ".", "Center", "and", "Right", "panels", ":", "Immunoblot", "analysis", "of", "PDK3", "in", "control", "(", "C1", "-", "C3", ")", ",", "WHS", "LETM1", "+", "/", "-", "(", "S1", ",", "S3", "and", "S4", ")", "and", "WHS", "LETM1", "+", "/", "+", "(", "S5", ")", "fibroblasts", "(", "C", ")", "Left", "panel", ":", "change", "in", "cell", "confluence", "of", "control", "(", "C1", "-", "C3", ")", ",", "WHS", "LETM1", "+", "/", "-", "(", "S1", "-", "S4", ")", "and", "WHS", "LETM1", "+", "/", "+", "(", "S5", ")", "fibroblasts", "grown", "in", "BHB", "over", "the", "course", "of", "188", "h", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Right", "panel", ":", "images", "of", "control", "and", "WHS", "LETM1", "+", "/", "-", "S4", "cells", "growing", "either", "in", "the", "presence", "of", "25", "mM", "glucose", "(", "HG", ")", "or", "BHB", "(", "KB", ")", "for", "6", "days", ".", "Scale", "bar", "300", "µm", "(", "D", ")", "Confocal", "images", "of", "control", "cells", "(", "C1", ")", "grown", "for", "24", "h", "in", "the", "presence", "of", "BHB", "and", "immunolabeled", "with", "anti", "-", "TOM20", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "DNA", "(", "green", ")", ",", "and", "DAPI", "stained", "(", "blue", ")", "(", "E", ")", "Proportion", "of", "cells", "that", "displayed", "mtDNA", "aggregation", "during", "the", "KB", "treatment", "(", "panel", "i", "-", "control", "cells", "(", "C1", ",", "C2", ")", ",", "and", "WHS", "LETM1", "+", "/", "+", "(", "S5", ")", "fibroblasts", ";", "panel", "ii", "-", "LETM1", "+", "/", "-", "(", "S1", ",", "S2", ",", "S4", ")", "fibroblasts", ")", ".", "At", "least", "50", "cells", "per", "cell", "line", "were", "counted", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8 (A) Representative immunoblots of mitochondrial lysates of HEK cells separated on a 20-42.5% iodixanol gradients probed for LETM1, PDH and TFAM  (B) Left panel: immunoblot analysis of total PDH protein levels and the inactive phosphorylated (repressed form), PDHS293, in control (C1, C3), WHS LETM1+/- (S1, S3, S4) and WHS LETM1+/+ (S5) fibroblasts. Center and Right panels: Immunoblot analysis of PDK3 in control (C1-C3), WHS LETM1+/- (S1, S3 and S4) and WHS LETM1+/+ (S5) fibroblasts  (C) Left panel: change in cell confluence of control (C1-C3), WHS LETM1+/- (S1-S4) and WHS LETM1+/+ (S5) fibroblasts grown in BHB over the course of 188 h. Data are expressed as means ± SEM of n=3 independent experiments. Right panel: images of control and WHS LETM1+/- S4 cells growing either in the presence of 25 mM glucose (HG) or BHB (KB) for 6 days. Scale bar 300 µm  (D) Confocal images of control cells (C1) grown for 24 h in the presence of BHB and immunolabeled with anti-TOM20 (red) and anti-DNA (green), and DAPI stained (blue)  (E) Proportion of cells that displayed mtDNA aggregation during the KB treatment (panel i - control cells (C1, C2), and WHS LETM1+/+ (S5) fibroblasts; panel ii - LETM1+/- (S1, S2, S4) fibroblasts). At least 50 cells per cell line were counted at the indicated time points. Data are expressed as mean ± SEM of n=3 independent experiments "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "a", ")", "Expression", "of", "H2B", "-", "mCherry", "under", "control", "of", "the", "CLV3", "promoter", "in", "14", "-", "d", "-", "old", "seedlings", ".", "Whole", "-", "mount", "immunostaining", "using", "α", "-", "mCherry", "antibodies", "and", "laser", "scanning", "microscopy", "(", "scale", "bar", "10", "μm", ")", ".", "(", "c", ")", "A", "representative", "example", "for", "enrichment", "of", "CLV3", "transcript", "in", "mCherry", "-", "positive", "nuclei", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "wt", "(", "N", "=", "1", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(a) Expression of H2B-mCherry under control of the CLV3 promoter in 14-d-old seedlings. Whole-mount immunostaining using α-mCherry antibodies and laser scanning microscopy (scale bar 10 μm).(c) A representative example for enrichment of CLV3 transcript in mCherry-positive nuclei determined by qRT-PCR and normalized to wt (N = 1)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "a", ")", "Expression", "of", "CLV3", ",", "mCherry", ",", "TEL2", ",", "PAN", ",", "and", "the", "meristem", "marker", "genes", "STM", "and", "KNAT1", ".", "Asterisks", "indicate", "timepoints", "of", "significantly", "different", "expression", "(", "Wald", "test", ",", "Benjamini", "&", "Hochberg", "corrected", ",", "q", "<", "0", ".", "05", ")", "between", "stem", "and", "non", "-", "stem", "cells", "for", "each", "time", "point", "(", "N", "=", "2", ")", ".", "+", "=", "stem", "cell", "nuclei", ";", "-", "=", "non", "-", "stem", "cell", "nuclei", ",", "E", "=", "nuclei", "from", "embryos", ",", "D7", "/", "14", "/", "35", "=", "nuclei", "from", "7", "/", "14", "/", "35", "day", "-", "old", "plants", ",", "S14", "=", "nuclei", "from", "14", "d", "-", "old", "above", "-", "ground", "seedlings", ".", "(", "c", ")", "Number", "of", "DEGs", "between", "stem", "and", "non", "-", "stem", "cells", "at", "each", "timepoint", ".", "The", "banded", "portion", "of", "the", "bars", "indicates", "the", "number", "of", "transcription", "factor", "genes", "(", "also", "in", "parenthesis", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(a) Expression of CLV3, mCherry, TEL2, PAN, and the meristem marker genes STM and KNAT1. Asterisks indicate timepoints of significantly different expression (Wald test, Benjamini & Hochberg corrected, q<0.05) between stem and non-stem cells for each time point (N = 2). + = stem cell nuclei; - = non-stem cell nuclei, E = nuclei from embryos, D7/14/35 = nuclei from 7/14/35 day-old plants, S14 = nuclei from 14 d-old above-ground seedlings.(c) Number of DEGs between stem and non-stem cells at each timepoint. The banded portion of the bars indicates the number of transcription factor genes (also in parenthesis)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "b", ")", "Expression", "of", "individual", "significantly", "up", "-", "regulated", "genes", "marked", "with", "#", "in", "(", "a", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "timepoints", "of", "significantly", "different", "expression", "(", "Wald", "test", ",", "Benjamini", "&", "Hochberg", "corrected", ",", "q", "<", "0", ".", "05", ")", "between", "stem", "and", "non", "-", "stem", "cells", "for", "each", "time", "point", "(", "N", "=", "2", ")", ".", "+", "=", "stem", "cells", ";", "-", "=", "non", "-", "stem", "cells", ",", "E", "=", "nuclei", "from", "embryos", ",", "D7", "/", "14", "/", "35", "=", "nuclei", "from", "7", "/", "14", "/", "35", "day", "-", "old", "plants", ",", "S14", "=", "nuclei", "from", "14", "d", "-", "old", "above", "-", "ground", "seedlings", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(b) Expression of individual significantly up-regulated genes marked with # in (a). Asterisks indicate timepoints of significantly different expression (Wald test, Benjamini & Hochberg corrected, q<0.05) between stem and non-stem cells for each time point (N = 2).+ = stem cells; - = non-stem cells, E = nuclei from embryos, D7/14/35 = nuclei from 7/14/35 day-old plants, S14 = nuclei from 14 d-old above-ground seedlings."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", ")", "Box", "plot", "summarizing", "differential", "expression", "of", "unambiguously", "mapped", "individual", "TEs", ",", "compared", "with", "all", "protein", "-", "coding", "genes", ",", "or", "housekeeping", "genes", ".", "Box", "plots", "outline", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "with", "the", "median", "and", "whiskers", "+", "/", "-", "1", ".", "5", "IQR", ".", "For", "all", "p", "-", "values", ",", "see", "also", "Appendix", "Table", "EV6", ".", "*", "*", "indicate", "a", "p", "-", "value", "smaller", "than", "1", ".", "01e", "-", "11", "(", "two", "sided", "non", "paired", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a) Box plot summarizing differential expression of unambiguously mapped individual TEs, compared with all protein-coding genes, or housekeeping genes. Box plots outline the interquartile range (IQR) with the median and whiskers +/- 1.5 IQR . For all p-values, see also Appendix Table EV6. ** indicate a p-value smaller than 1.01e-11 (two sided non paired Wilcoxon rank sum test)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "a", ")", "Increased", "expression", "of", "TEs", "in", "stem", "cells", "of", "D7", "seedlings", "according", "to", "qRT", "-", "PCR", ".", "Box", "plots", "outline", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "with", "the", "median", "and", "whiskers", "+", "/", "-", "1", ".", "5", "IQR", ".", "N", "=", "2", "(", "ATLANTYS3", ",", "ATCOPIA39", ",", "ATCOPIA49", ",", "ATCOPIA29", ",", "ATGP1", "-", "1", ")", ",", "N", "=", "3", "(", "VANDAL6", ",", "ATGP2", ",", "ATGP1", "-", "2", ",", "ATLINE1", ",", "ATGP1", "-", "3", ")", ",", "N", "=", "4", "(", "ATHILA6A", ",", "ATCOPIA83", ")", ",", "N", "=", "5", "(", "VANDAL12", ",", "ATHILA3", ",", "ATCOPIA22", ")", ",", "and", "N", "=", "6", "for", "CLAVATA", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "b", ")", "Heatmap", "of", "TE", "expression", "in", "several", "silencing", "mutants", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "relative", "to", "a", "housekeeping", "gene", ".", "To", "be", "able", "to", "display", "data", "in", "log", "-", "scale", "also", "for", "samples", "with", "zero", "expression", ",", "a", "value", "of", "1", ".", "0e", "-", "6", "(", "factor", "10", "smaller", "than", "the", "smallest", "value", ")", "was", "added", "to", "all", "values", ".", "Data", "for", "nuclei", "and", "CLV3", ":", ":", "H2BmCherry", "are", "the", "same", "as", "in", "(", "a", ")", ".", "For", "seedling", "samples", ",", "N", "=", "2", "(", "ATCOPIA49", ",", "ATHILA3", ")", ",", "N", "=", "3", "(", "ATCOPIA39", ",", "VANDAL6", ",", "ATGP2", ",", "ATLINE1", ",", "ATCOPIA29", ",", "ATGP1", "-", "1", ")", ",", "and", "N", "=", "4", "(", "ATLANTYS3", ",", "VANDAL12", ",", "ATGP1", "-", "2", ",", "ATHILA6A", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(a) Increased expression of TEs in stem cells of D7 seedlings according to qRT-PCR. Box plots outline the interquartile range (IQR) with the median and whiskers +/- 1.5 IQR. N = 2 (ATLANTYS3, ATCOPIA39, ATCOPIA49, ATCOPIA29, ATGP1-1), N = 3 (VANDAL6, ATGP2, ATGP1-2, ATLINE1, ATGP1-3), N = 4 (ATHILA6A, ATCOPIA83), N = 5 (VANDAL12, ATHILA3, ATCOPIA22), and N = 6 for CLAVATA. *p<0.01, **p<0.001 (t-test).(b) Heatmap of TE expression in several silencing mutants determined by qRT-PCR relative to a housekeeping gene. To be able to display data in log-scale also for samples with zero expression, a value of 1.0e-6 (factor 10 smaller than the smallest value) was added to all values. Data for nuclei and CLV3::H2BmCherry are the same as in (a). For seedling samples, N = 2 (ATCOPIA49, ATHILA3), N = 3 (ATCOPIA39, VANDAL6, ATGP2, ATLINE1, ATCOPIA29, ATGP1-1), and N = 4 (ATLANTYS3, VANDAL12, ATGP1-2, ATHILA6A)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "a", ")", "CG", ",", "CHG", ",", "and", "CHH", "methylation", "at", "chromosome", "3", "in", "stem", "and", "non", "-", "stem", "cells", ".", "The", "inset", "for", "CHG", "methylation", "shows", "a", "magnification", "of", "the", "pericentromeric", "region", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(a) CG, CHG, and CHH methylation at chromosome 3 in stem and non-stem cells. The inset for CHG methylation shows a magnification of the pericentromeric region."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "a", ")", "DNA", "methylation", "in", "%", "at", "CHG", "(", "left", ")", "and", "CHH", "(", "right", ")", "sites", "in", "TE", "with", "increased", "expression", "at", "D7", ",", "compared", "between", "developmental", "stages", "(", "D7", "/", "14", "/", "35", "=", "7", "/", "14", "/", "35", "day", "-", "old", "plants", ")", "and", "nuclei", "of", "stem", "(", "+", ")", "and", "non", "-", "stem", "(", "-", ")", "cells", ".", "(", "b", ")", "Genomic", "location", "of", "the", "TEs", "(", "blue", ")", "from", "(", "a", ")", "on", "the", "five", "chromosomes", ".", "Dark", "grey", "bars", "indicate", "the", "location", "of", "centromeres", "and", "blue", "lines", "indicate", "global", "TE", "density", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(a) DNA methylation in % at CHG (left) and CHH (right) sites in TE with increased expression at D7, compared between developmental stages (D7/14/35 = 7/14/35 day-old plants) and nuclei of stem (+) and non-stem (-) cells.(b) Genomic location of the TEs (blue) from (a) on the five chromosomes. Dark grey bars indicate the location of centromeres and blue lines indicate global TE density."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "a", ")", "DNA", "methylation", "differences", "between", "stem", "and", "non", "-", "stem", "cells", "and", "their", "enrichment", "within", "DMRs", "of", "different", "epigenetic", "mutants", "using", "permutation", "tests", "(", "data", "from", "Stroud", ",", "Greenberg", ",", "Feng", ",", "Bernatavichute", "and", "Jacobsen", "2013", ")", ".", "Mutants", "are", "in", "alphabetical", "order", "according", "to", "the", "gene", "acronym", ".", "Red", "indicates", "an", "enrichment", "of", "methylated", "DNA", "in", "the", "respective", "context", "and", "blue", "a", "depletion", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(a) DNA methylation differences between stem and non-stem cells and their enrichment within DMRs of different epigenetic mutants using permutation tests (data from Stroud, Greenberg, Feng, Bernatavichute and Jacobsen 2013). Mutants are in alphabetical order according to the gene acronym. Red indicates an enrichment of methylated DNA in the respective context and blue a depletion."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Microarray", "heat", "map", "showing", "the", "upregulation", "in", "expression", "of", "the", "11", "candidate", "genes", "in", "β", "cell", "-", "ablated", "versus", "control", "islets", ".", "Igfbp1a", "and", "b", "were", "the", "genes", "whose", "expression", "increased", "the", "most", "after", "β", "-", "cell", "ablation", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Representative", "images", "at", "6", "dpf", "of", "Tg", "(", "ins", ":", "kaede", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "CFP", "-", "NTR", ")", "transgenic", "larvae", "that", "had", "been", "injected", "at", "the", "1", "-", "2", "-", "cell", "stage", "with", "transposase", "mRNA", "(", "control", ")", "or", "transposase", "mRNA", "+", "bactin", ":", "igfbp1a", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", ",", "subjected", "to", "β", "-", "cell", "ablation", "by", "metronidazole", "(", "MTZ", ")", "during", "3", "-", "4", "dpf", ",", "and", "subsequently", "allowed", "to", "regenerate", "for", "2", "days", ".", "The", "GFP", "+", "heart", "(", "arrowhead", ")", "visualizes", "successful", "integration", "of", "the", "construct", ".", "Islets", "are", "indicated", "by", "white", "arrows", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "β", "-", "cell", "regeneration", "at", "6", "dpf", "in", "control", "(", "n", "=", "23", ")", ",", "bactin", ":", "igfbp1a", "-", "overexpressing", "(", "n", "=", "13", ")", ",", "and", "bactin", ":", "igfbp1b", "-", "overexpressing", "(", "n", "=", "8", ")", "Tg", "(", "ins", ":", "kaede", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "CFP", "-", "NTR", ")", "larvae", ";", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", ",", "ns", "=", "nonsignificant", "(", "P", "=", "0", ".", "3106", ")", ".", "(", "G", ")", "Immunohistochemistry", "showing", "Igfbp1", "protein", "expression", "in", "6", "dpf", "Tg", "(", "ins", ":", "GFP", ")", "following", "β", "-", "cell", "ablation", "between", "3", "-", "4", "dpf", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "(", "H", ")", "Both", "liver", "-", "specific", "(", "lfabp", "promoter", ";", "n", "=", "46", ")", "and", "widespread", "(", "bactin", "promoter", ";", "n", "=", "18", ")", "overexpression", "of", "igfbp1a", "increase", "β", "-", "cell", "regeneration", "when", "compared", "to", "control", "(", "n", "=", "77", ")", ".", "(", "I", "-", "M", ")", "Quantification", "of", "β", "cells", "with", "or", "without", "β", "-", "cell", "ablation", "and", "igfbp1a", "overexpression", "by", "confocal", "microscopy", ",", "which", "detects", "even", "weakly", "insulin", "-", "expressing", "β", "cells", ".", "Scale", "bars", ":", "15", "μm", ".", "See", "also", "Figure", "EV1", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Microarray heat map showing the upregulation in expression of the 11 candidate genes in β cell-ablated versus control islets. Igfbp1a and b were the genes whose expression increased the most after β-cell ablation.(D-E) Representative images at 6 dpf of Tg(ins:kaede);Tg(ins:CFP-NTR) transgenic larvae that had been injected at the 1-2-cell stage with transposase mRNA (control) or transposase mRNA + bactin:igfbp1a (bactin:igfbp1a), subjected to β-cell ablation by metronidazole (MTZ) during 3-4 dpf, and subsequently allowed to regenerate for 2 days. The GFP+ heart (arrowhead) visualizes successful integration of the construct. Islets are indicated by white arrows. Scale bars: 100 μm. (F) Quantification of β-cell regeneration at 6 dpf in control (n=23), bactin:igfbp1a-overexpressing (n=13), and bactin:igfbp1b-overexpressing (n=8) Tg(ins:kaede);Tg(ins:CFP-NTR) larvae; ***P=0.0002, ns= nonsignificant (P=0.3106).(G) Immunohistochemistry showing Igfbp1 protein expression in 6 dpf Tg(ins:GFP) following β-cell ablation between 3-4 dpf. Scale bar: 50 μm.(H) Both liver-specific (lfabp promoter; n=46) and widespread (bactin promoter; n=18) overexpression of igfbp1a increase β-cell regeneration when compared to control (n=77).(I-M) Quantification of β cells with or without β-cell ablation and igfbp1a overexpression by confocal microscopy, which detects even weakly insulin-expressing β cells. Scale bars: 15 μm. See also Figure EV1."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "C", ")", "Igfbp1a", "promotes", "β", "cell", "regeneration", ",", "rather", "than", "β", "cell", "survival", ".", "To", "trace", "β", "cells", ",", "we", "exposed", "Tg", "(", "ins", ":", "kaede", ")", "larvae", "to", "UV", "light", "(", "which", "causes", "the", "existing", "Kaede", "protein", "to", "switch", "from", "emitting", "green", "fluorescence", "to", "emitting", "red", "fluorescence", ")", "just", "before", "ablating", "the", "β", "cells", "by", "MTZ", "treatment", "from", "3", "-", "4", "dpf", ".", "After", "regeneration", ",", "the", "newly", "formed", "β", "cells", "are", "green", ",", "whereas", "the", "β", "cells", "that", "survived", "ablation", "are", "yellow", "(", "overlap", "of", "green", "and", "red", ")", ".", "(", "A", "&", "amp", ";", "amp", ";", "B", ")", "Representative", "confocal", "images", "at", "6", "dpf", "of", "control", "and", "bactin", ":", "igfbp1a", "-", "overexpressing", "Tg", "(", "ins", ":", "kaede", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "CFP", "-", "NTR", ")", "transgenic", "larvae", ";", "arrows", "indicate", "surviving", "(", "yellow", ")", "β", "cells", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "β", "cell", "regeneration", "(", "green", "bars", ")", "and", "β", "cell", "survival", "(", "yellow", "bars", ")", "per", "larva", "at", "6", "dpf", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ":", "n", "=", "20", "larvae", "in", "the", "control", "group", ";", "n", "=", "27", "larvae", "in", "the", "bactin", ":", "igfbp1a", "-", "overexpressing", "group", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Igfbp1a", "does", "not", "promote", "δ", "-", "cell", "regeneration", ".", "We", "treated", "control", "and", "bactin", ":", "igfbp1a", "-", "overexpressing", "Tg", "(", "sst", ":", "flag", "-", "NTR", ")", ";", "Tg", "(", "sst", ":", "dsRed", ")", "larvae", "with", "MTZ", "from", "3", "-", "4", "dpf", "to", "ablate", "δ", "cells", ",", "and", "then", "allowed", "them", "to", "regenerate", "until", "6", "dpf", ".", "(", "D", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "at", "6", "dpf", "of", "control", "and", "bactin", ":", "igfbp1a", "-", "overexpressing", "larvae", "showing", "comparable", "number", "of", "δ", "cells", "after", "2", "days", "of", "regeneration", ".", "Scale", "bars", ":", "15", "μm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "δ", "cells", "per", "δ", "-", "cell", "ablated", "larva", "at", "6", "dpf", "compared", "to", "the", "baseline", "number", "of", "δ", "cells", "in", "non", "-", "ablated", "control", "larvae", ".", "P", "=", "0", ".", "2325", ".", "n", "=", "13", "in", "the", "control", "group", ",", "n", "=", "7", "in", "the", "bactin", ":", "igfbp1a", "group", ".", "(", "G", ")", "Other", "Igfbps", "do", "not", "promote", "β", "-", "cell", "regeneration", ".", "We", "injected", "Tg", "(", "ins", ":", "kaede", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "CFP", "-", "NTR", ")", "transgenics", "with", "either", "transposase", "mRNA", "(", "control", ";", "n", "=", "31", ")", "or", "transposase", "mRNA", "+", "one", "of", "six", "different", "igfbps", ",", "igfbp2a", "(", "n", "=", "25", ")", ",", "igfbp2b", "(", "n", "=", "25", ")", ",", "igfbp3", "(", "n", "=", "26", ")", ",", "igfbp5a", "(", "n", "=", "17", ")", ",", "igfbp6b", "(", "n", "=", "34", ")", ",", "and", "igfbp7", "(", "n", "=", "17", ")", ",", "treated", "them", "with", "MTZ", "from", "3", "-", "4", "dpf", "to", "ablate", "their", "β", "cells", ",", "and", "then", "quantified", "their", "β", "cells", "after", "2", "days", "of", "regeneration", ",", "at", "6", "dpf", ";", "ns", "=", "nonsignificant", ";", "(", "igfbp2aP", "=", "0", ".", "986", ",", "igfbp2bP", "=", "0", ".", "037", ",", "igfbp3P", "=", "0", ".", "979", ",", "igfbp5aP", "=", "0", ".", "999", ",", "igfbp6bP", "=", "0", ".", "997", ",", "and", "igfbp7P", "=", "0", ".", "999", ")", ".", "(", "H", ")", "Tg", "(", "pcsk1", ":", "GFP", ")", "is", "expressed", "in", "regenerating", "β", "cells", "within", "the", "islet", "(", "arrowheads", ")", ",", "but", "not", "outside", "the", "islet", "(", "arrow", ")", ",", "at", "6", "dpf", "in", "larvae", "overexpressing", "igfbp1a", ".", "Scale", "bar", ":", "15", "μm", ".", "(", "I", "&", "amp", ";", "amp", ";", "J", ")", "Free", "-", "glucose", "levels", "during", "β", "-", "cell", "regeneration", "in", "control", "(", "bactin", ":", "mCherry", ")", "and", "bactin", ":", "igfbp1a", "-", "overexpressing", "Tg", "(", "ins", ":", "kaede", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "CFP", "-", "NTR", ")", "larvae", "(", "I", ")", ",", "as", "well", "as", "in", "Tg", "(", "ins", ":", "kaede", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "CFP", "-", "NTR", ")", "larvae", "injected", "in", "the", "pericardial", "sac", "at", "4", "dpf", "with", "1", "ng", "of", "recombinant", "mouse", "Igfbp1", "(", "J", ")", ".", "We", "treated", "larvae", "with", "MTZ", "from", "3", "-", "4", "dpf", "to", "ablate", "their", "β", "cells", ",", "and", "monitored", "their", "free", "-", "glucose", "levels", "at", "3", "-", "7", "dpf", ".", "Free", "-", "glucose", "levels", "were", "significantly", "lower", "after", "genetic", "igfbp1a", "overexpression", "or", "Igfbp1", "-", "protein", "injection", "(", "red", "lines", ")", "than", "in", "controls", "(", "black", "lines", ")", "at", "7", "and", "6", "dpf", ",", "respectively", ".", "Baseline", "reference", "levels", "of", "free", "glucose", "throughout", "development", "are", "shown", "for", "a", "different", "set", "of", "larvae", "without", "β", "-", "cell", "ablation", ".", "n", "=", "24", "larvae", "(", "four", "pools", "of", "six", "larvae", ")", "per", "data", "point", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-C) Igfbp1a promotes β cell regeneration, rather than β cell survival. To trace β cells, we exposed Tg(ins:kaede) larvae to UV light (which causes the existing Kaede protein to switch from emitting green fluorescence to emitting red fluorescence) just before ablating the β cells by MTZ treatment from 3-4 dpf. After regeneration, the newly formed β cells are green, whereas the β cells that survived ablation are yellow (overlap of green and red). (A&amp;amp;B) Representative confocal images at 6 dpf of control and bactin:igfbp1a-overexpressing Tg(ins:kaede);Tg(ins:CFP-NTR) transgenic larvae; arrows indicate surviving (yellow) β cells. Scale bars: 10 μm. (C) Quantification of β cell regeneration (green bars) and β cell survival (yellow bars) per larva at 6 dpf. ***P<0.001: n=20 larvae in the control group; n=27 larvae in the bactin:igfbp1a-overexpressing group.(D-F) Igfbp1a does not promote δ-cell regeneration. We treated control and bactin:igfbp1a-overexpressing Tg(sst:flag-NTR);Tg(sst:dsRed) larvae with MTZ from 3-4 dpf to ablate δ cells, and then allowed them to regenerate until 6 dpf. (D&amp;amp;E) Representative confocal images at 6 dpf of control and bactin:igfbp1a-overexpressing larvae showing comparable number of δ cells after 2 days of regeneration. Scale bars: 15 μm. (F) Quantification of the total number of δ cells per δ-cell ablated larva at 6 dpf compared to the baseline number of δ cells in non-ablated control larvae. P=0.2325. n=13 in the control group, n=7 in the bactin:igfbp1a group.(G) Other Igfbps do not promote β-cell regeneration. We injected Tg(ins:kaede);Tg(ins:CFP-NTR) transgenics with either transposase mRNA (control; n=31) or transposase mRNA + one of six different igfbps, igfbp2a (n=25), igfbp2b (n=25), igfbp3 (n=26), igfbp5a (n=17), igfbp6b (n=34), and igfbp7 (n=17), treated them with MTZ from 3-4 dpf to ablate their β cells, and then quantified their β cells after 2 days of regeneration, at 6 dpf; ns=nonsignificant; (igfbp2aP=0.986, igfbp2bP=0.037, igfbp3P=0.979, igfbp5aP=0.999, igfbp6bP=0.997, and igfbp7P=0.999).(H) Tg(pcsk1:GFP) is expressed in regenerating β cells within the islet (arrowheads), but not outside the islet (arrow), at 6 dpf in larvae overexpressing igfbp1a. Scale bar: 15 μm.(I&amp;amp;J) Free-glucose levels during β-cell regeneration in control (bactin:mCherry) and bactin:igfbp1a-overexpressing Tg(ins:kaede);Tg(ins:CFP-NTR) larvae (I), as well as in Tg(ins:kaede);Tg(ins:CFP-NTR) larvae injected in the pericardial sac at 4 dpf with 1 ng of recombinant mouse Igfbp1 (J). We treated larvae with MTZ from 3-4 dpf to ablate their β cells, and monitored their free-glucose levels at 3-7 dpf. Free-glucose levels were significantly lower after genetic igfbp1a overexpression or Igfbp1-protein injection (red lines) than in controls (black lines) at 7 and 6 dpf, respectively. Baseline reference levels of free glucose throughout development are shown for a different set of larvae without β-cell ablation. n=24 larvae (four pools of six larvae) per data point."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "C", ")", "Tg", "(", "ins", ":", "GFP", ")", ";", "Tg", "(", "tp1", ":", "H2B", "-", "mCherry", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "Flag", "-", "NTR", ")", "transgenics", ",", "with", "or", "without", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", ",", "were", "treated", "with", "MTZ", "from", "3", "-", "4", "dpf", "to", "ablate", "the", "β", "cells", ",", "and", "were", "then", "allowed", "to", "regenerate", "from", "4", "-", "6", "dpf", ".", "Representative", "confocal", "images", "at", "6", "dpf", "of", "control", "(", "A", ")", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "(", "B", ")", "larvae", "showing", "a", "modest", "number", "of", "ins", "+", "tp1", "+", "co", "-", "expressing", "cells", ",", "indicated", "by", "arrows", ",", "after", "2", "days", "of", "regeneration", ".", "Scale", "bars", ":", "15", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "β", "cells", "(", "green", "bars", ")", "at", "6", "dpf", ",", "and", "of", "β", "cells", "expressing", "Tg", "(", "tp1", ":", "H2B", "-", "mCherry", ")", ",", "i", ".", "e", ".", ",", "of", "ductal", "origin", "(", "yellow", "bars", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", "=", "nonsignificant", ".", "n", "=", "23", "larvae", "in", "the", "control", "group", ",", "n", "=", "17", "larvae", "in", "the", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "group", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Tg", "(", "ins", ":", "Venus", "-", "zGeminin", ")", "was", "examined", "in", "control", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "larvae", "at", "6", "dpf", ",", "after", "β", "-", "cell", "ablation", "3", "-", "4", "dpf", "by", "using", "Tg", "(", "ins", ":", "Flag", "-", "NTR", ")", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "at", "6", "dpf", "of", "control", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "larvae", "showing", "cell", "cycle", "activation", "of", "β", "cells", "in", "green", ".", "Scale", "bars", ":", "15", "μm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "β", "cells", "with", "activated", "cell", "cycle", "at", "6", "dpf", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "32", "larvae", "in", "the", "control", "group", ",", "n", "=", "41", "larvae", "in", "the", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "group", ".", "The", "number", "of", "β", "cells", "with", "activated", "cell", "cycle", "are", "displayed", "together", "with", "the", "total", "number", "of", "β", "cells", "in", "experiments", "with", "the", "same", "setup", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "=", "39", "larvae", "in", "the", "control", "group", ",", "n", "=", "33", "larvae", "in", "the", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "group", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "EdU", "was", "used", "as", "a", "marker", "for", "cell", "cycle", "progression", ".", "Tg", "(", "ins", ":", "H2B", "-", "GFP", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "Flag", "-", "NTR", ")", "transgenics", ",", "with", "or", "without", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", ",", "were", "treated", "with", "MTZ", "from", "3", "-", "4", "dpf", "to", "ablate", "their", "β", "cells", ",", "and", "subsequently", "incubated", "with", "EdU", "during", "regeneration", "from", "4", "-", "6", "dpf", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "Representative", "confocal", "images", "at", "6", "dpf", "of", "control", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "larvae", "showing", "β", "cells", "in", "green", "and", "the", "β", "cells", "that", "had", "incorporated", "EdU", "in", "yellow", "(", "green", "and", "red", "overlap", ";", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "β", "cells", "(", "green", "bars", ")", "at", "6", "dpf", ",", "and", "of", "β", "cells", "that", "incorporated", "EdU", "(", "yellow", "bars", ")", "during", "β", "-", "cell", "regeneration", "from", "4", "-", "6", "dpf", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "=", "nonsignificant", ".", "n", "=", "16", "in", "both", "the", "control", "and", "the", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "group", ".", "(", "J", "-", "L", ")", "Tg", "(", "ins", ":", "kaede", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "CFP", "-", "NTR", ")", "transgenics", ",", "with", "or", "without", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", ",", "were", "injected", "with", "a", "control", "morpholino", "or", "a", "morpholino", "that", "knocked", "down", "arx", ",", "which", "is", "necessary", "for", "α", "-", "cell", "differentiation", "and", "thus", "glucagon", "expression", "(", "J", "-", "K", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "(", "L", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "regenerating", "β", "cells", "at", "4", "dpf", "(", "after", "β", "-", "cell", "ablation", "at", "2", "-", "3", "dpf", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "=", "nonsignificant", ".", "n", "=", "42", ",", "20", ",", "48", "and", "20", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-C) Tg(ins:GFP);Tg(tp1:H2B-mCherry);Tg(ins:Flag-NTR) transgenics, with or without Tg(bactin:igfbp1a), were treated with MTZ from 3-4 dpf to ablate the β cells, and were then allowed to regenerate from 4-6 dpf. Representative confocal images at 6 dpf of control (A) and Tg(bactin:igfbp1a) (B) larvae showing a modest number of ins+ tp1+ co-expressing cells, indicated by arrows, after 2 days of regeneration. Scale bars: 15 μm. (C) Quantification of the total number of β cells (green bars) at 6 dpf, and of β cells expressing Tg(tp1:H2B-mCherry), i.e., of ductal origin (yellow bars). ****P<0.0001, ns= nonsignificant. n=23 larvae in the control group, n=17 larvae in the Tg(bactin:igfbp1a) group.(D-F) Tg(ins:Venus-zGeminin) was examined in control and Tg(bactin:igfbp1a) larvae at 6 dpf, after β-cell ablation 3-4 dpf by using Tg(ins:Flag-NTR). (D-E) Representative confocal images at 6 dpf of control and Tg(bactin:igfbp1a) larvae showing cell cycle activation of β cells in green. Scale bars: 15 μm. (F) Quantification of the total number of β cells with activated cell cycle at 6 dpf, ***P<0.001, n=32 larvae in the control group, n=41 larvae in the Tg(bactin:igfbp1a) group. The number of β cells with activated cell cycle are displayed together with the total number of β cells in experiments with the same setup, ****P<0.0001. n=39 larvae in the control group, n=33 larvae in the Tg(bactin:igfbp1a) group.(G-I) EdU was used as a marker for cell cycle progression. Tg(ins:H2B-GFP);Tg(ins:Flag-NTR) transgenics, with or without Tg(bactin:igfbp1a), were treated with MTZ from 3-4 dpf to ablate their β cells, and subsequently incubated with EdU during regeneration from 4-6 dpf. (G-H) Representative confocal images at 6 dpf of control and Tg(bactin:igfbp1a) larvae showing β cells in green and the β cells that had incorporated EdU in yellow (green and red overlap; arrowheads). Scale bars: 20 μm. (I) Quantification of the total number of β cells (green bars) at 6 dpf, and of β cells that incorporated EdU (yellow bars) during β-cell regeneration from 4-6 dpf. **P<0.01, ns= nonsignificant. n=16 in both the control and the Tg(bactin:igfbp1a) group.(J-L) Tg(ins:kaede);Tg(ins:CFP-NTR) transgenics, with or without Tg(bactin:igfbp1a), were injected with a control morpholino or a morpholino that knocked down arx, which is necessary for α-cell differentiation and thus glucagon expression (J-K). Scale bars: 20 μm. (L) Quantification of the total number of regenerating β cells at 4 dpf (after β-cell ablation at 2-3 dpf). ****P<0.0001, *P<0.05, ns=nonsignificant. n=42, 20, 48 and 20, respectively."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "-", "E", ")", "Control", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "-", "overexpressing", "larvae", "were", "treated", "with", "MTZ", "from", "3", "-", "4", "dpf", "to", "ablate", "β", "cells", ",", "and", "analyzed", "at", "6", "dpf", ",", "after", "2", "days", "of", "regeneration", ".", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "control", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "-", "overexpressing", "Tg", "(", "ins", ":", "dsRed", ")", ";", "Tg", "(", "gcg", ":", "GFP", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "Flag", "-", "NTR", ")", "larvae", ".", "A", "bihormonal", "glucagon", "-", "and", "insulin", "-", "expressing", "cell", "(", "gcg", "+", ";", "ins", "+", ")", "is", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "control", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "-", "overexpressing", "Tg", "(", "gcg", ":", "GFP", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "Flag", "-", "NTR", ")", "larvae", "stained", "for", "Pdx1", ".", "Pdx1", "-", "and", "glucagon", "-", "expressing", "cells", "(", "pdx1", "+", ";", "gcg", "+", ")", "are", "indicated", "by", "arrows", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "gcg", "+", ";", "ins", "+", "and", "pdx1", "+", ";", "gcg", "+", "cells", "in", "the", "control", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "group", ";", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "P", "=", "0", ".", "0012", ";", "n", "=", "18", "and", "18", "in", "the", "control", "groups", ",", "n", "=", "15", "and", "10", "in", "the", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "groups", ",", "for", "the", "gcg", "+", ";", "ins", "+", "and", "pdx1", "+", ";", "gcg", "+", "quantification", ",", "respectively", ".", "(", "F", "-", "I", ")", "Lineage", "-", "tracing", "evidence", "supports", "α", "-", "to", "β", "-", "cell", "transdifferentiation", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "insulin", "-", "expressing", "cells", "that", "originate", "from", "α", "-", "cells", ".", "Control", "larvae", ",", "n", "=", "13", ";", "bactin", ":", "igfbp1a", "larvae", ",", "n", "=", "16", ".", "P", "=", "0", ".", "0051", ".", "(", "F", "-", "I", ")", "Lineage", "-", "tracing", "evidence", "supports", "α", "-", "to", "β", "-", "cell", "transdifferentiation", ".", "(", "H", "-", "I", ")", "Representative", "confocal", "images", "at", "6", "dpf", "(", "after", "2", "days", "of", "regeneration", ")", "of", "control", "and", "bactin", ":", "igfbp1a", "-", "overexpressing", "larvae", "stained", "for", "insulin", ",", "glucagon", ",", "to", "-", "pro", ",", "and", "H2B", "-", "GFP", ".", "ins", "+", ";", "H2B", "-", "GFP", "+", "cells", "are", "indicated", "by", "the", "arrowheads", ",", "and", "H", "'", "and", "I", "'", "show", "staining", "against", "only", "insulin", "and", "H2B", "-", "GFP", ".", "Moreover", ",", "most", "insulin", "+", ";", "H2B", "-", "GFP", "+", "cells", "no", "longer", "express", "glucagon", ".", "Scale", "bars", ":", "15", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A-E) Control and Tg(bactin:igfbp1a)-overexpressing larvae were treated with MTZ from 3-4 dpf to ablate β cells, and analyzed at 6 dpf, after 2 days of regeneration. (A-B) Representative confocal images of control and Tg(bactin:igfbp1a)-overexpressing Tg(ins:dsRed);Tg(gcg:GFP);Tg(ins:Flag-NTR) larvae. A bihormonal glucagon- and insulin-expressing cell (gcg+;ins+) is indicated by an arrow. Scale bars: 20 μm. (C-D) Representative confocal images of control and Tg(bactin:igfbp1a)-overexpressing Tg(gcg:GFP);Tg(ins:Flag-NTR) larvae stained for Pdx1. Pdx1- and glucagon-expressing cells (pdx1+;gcg+) are indicated by arrows. Scale bars: 20 μm. (E) Quantification of gcg+;ins+ and pdx1+;gcg+ cells in the control and Tg(bactin:igfbp1a) group; P<0.001, P=0.0012; n=18 and 18 in the control groups, n=15 and 10 in the Tg(bactin:igfbp1a) groups, for the gcg+;ins+ and pdx1+;gcg+ quantification, respectively.(F-I) Lineage-tracing evidence supports α- to β-cell transdifferentiation. (G) Quantification of insulin-expressing cells that originate from α-cells. Control larvae, n=13; bactin:igfbp1a larvae, n=16. P=0.0051.(F-I) Lineage-tracing evidence supports α- to β-cell transdifferentiation. (H-I) Representative confocal images at 6 dpf (after 2 days of regeneration) of control and bactin:igfbp1a-overexpressing larvae stained for insulin, glucagon, to-pro, and H2B-GFP. ins+;H2B-GFP+ cells are indicated by the arrowheads, and H' and I' show staining against only insulin and H2B-GFP. Moreover, most insulin+;H2B-GFP+ cells no longer express glucagon. Scale bars: 15 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "H", ")", "PPP", ",", "an", "IGF1R", "inhibitor", ",", "promotes", "β", "-", "cell", "regeneration", ".", "Tg", "(", "ins", ":", "H2B", "-", "GFP", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "Flag", "-", "NTR", ")", "larvae", "were", "treated", "with", "MTZ", "from", "3", "-", "4", "dpf", "to", "ablate", "the", "β", "cells", "and", "then", "treated", "with", "EdU", "and", "DMSO", "or", "with", "EdU", "and", "PPP", "during", "regeneration", "from", "4", "-", "6", "dpf", ".", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "confocal", "images", "at", "6", "dpf", "of", "DMSO", "-", "and", "PPP", "-", "treated", "larvae", "displaying", "β", "cells", "in", "green", "and", "the", "β", "cells", "that", "had", "incorporated", "EdU", "as", "yellow", "overlap", "(", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "β", "cells", "(", "green", "bars", ")", "at", "6", "dpf", ",", "and", "β", "cells", "that", "had", "incorporated", "EdU", "(", "white", "bars", ")", "from", "4", "-", "6", "dpf", "during", "β", "-", "cell", "regeneration", ".", "P", "=", "0", ".", "0003", ",", "P", "=", "0", ".", "8607", "respectively", ".", "(", "D", ")", "Rate", "of", "β", "-", "cell", "proliferation", ",", "displayed", "as", "the", "percentage", "of", "β", "cells", "that", "incorporated", "EdU", ".", "P", "=", "0", ".", "1194", ".", "n", "=", "18", "larvae", "for", "the", "DMSO", "-", "treated", "group", ",", "n", "=", "17", "larvae", "for", "the", "PPP", "-", "treated", "group", ".", "(", "E", "-", "H", ")", "To", "examine", "whether", "PPP", "affected", "β", "-", "cell", "proliferation", "during", "regular", "development", ",", "Tg", "(", "ins", ":", "H2B", "-", "GFP", ")", "larvae", "were", "treated", "with", "EdU", "and", "DMSO", "or", "PPP", "from", "4", "-", "6", "dpf", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "6", "dpf", "DMSO", "-", "and", "PPP", "-", "treated", "larvae", "displaying", "β", "cells", "in", "green", "and", "the", "β", "cells", "that", "had", "incorporated", "EdU", "as", "yellow", "overlap", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "β", "cells", "(", "green", "bars", ")", "and", "β", "cells", "that", "had", "incorporated", "EdU", "(", "white", "bars", ")", "per", "larva", "from", "4", "-", "6", "dpf", ".", "P", "=", "0", ".", "9098", "and", "0", ".", "9976", ",", "respectively", ".", "(", "H", ")", "Rate", "of", "β", "cell", "proliferation", ",", "displayed", "as", "the", "percentage", "of", "β", "cells", "that", "incorporated", "EdU", ".", "P", "=", "0", ".", "7822", ".", "n", "=", "16", "larvae", "for", "DMSO", "-", "treated", "group", ",", "18", "larvae", "for", "PPP", "-", "treated", "group", ".", "(", "I", "-", "K", ")", "Activation", "of", "the", "Igf", "pathway", "reduces", "β", "-", "cell", "regeneration", ".", "Control", "and", "bactin", ":", "igf2a", "-", "overexpressing", "Tg", "(", "ins", ":", "H2B", "-", "GFP", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "Flag", "-", "NTR", ")", "larvae", "were", "treated", "with", "MTZ", "from", "3", "-", "4", "dpf", "to", "ablate", "β", "cells", "and", "subsequently", "let", "to", "regenerate", "from", "4", "-", "6", "dpf", ".", "(", "I", "-", "J", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "6", "dpf", "control", "and", "bactin", ":", "igf2a", "-", "overexpressing", "larva", "displaying", "β", "cells", "in", "green", ".", "Scale", "bars", ":", "15", "μm", ".", "(", "K", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "β", "cells", "per", "larva", "at", "6", "dpf", "following", "β", "cell", "regeneration", "from", "4", "-", "6", "dpf", ".", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "=", "28", "larvae", "for", "control", ",", "n", "=", "15", "larvae", "for", "bactin", ":", "igf2a", ".", "(", "L", "-", "P", ")", "No", "synergistic", "effect", "was", "observed", "for", "igfbp1a", "and", "PPP", ".", "Control", "and", "bactin", ":", "igfbp1a", "-", "overexpressing", "Tg", "(", "ins", ":", "H2B", "-", "GFP", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "Flag", "-", "NTR", ")", "larvae", "were", "treated", "with", "MTZ", "from", "3", "-", "4", "dpf", "to", "ablate", "β", "cells", "and", "subsequently", "treated", "with", "DMSO", "or", "PPP", "during", "regeneration", "from", "4", "-", "6", "dpf", ".", "(", "L", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "β", "cells", "per", "larva", ".", "n", ">", "10", "(", "n", "=", "23", ",", "20", ",", "14", ",", "13", ")", ".", "P", "=", "0", ".", "9546", ".", "(", "M", "-", "P", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "6", "dpf", "control", "or", "bactin", ":", "igfbp1a", "overexpressing", "larvae", "treated", "with", "either", "DMSO", "or", "PPP", ",", "displaying", "β", "cells", "after", "2", "days", "regeneration", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", ".", "See", "also", "Figure", "EV2", "EV3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-H) PPP, an IGF1R inhibitor, promotes β-cell regeneration. Tg(ins:H2B-GFP);Tg(ins:Flag-NTR) larvae were treated with MTZ from 3-4 dpf to ablate the β cells and then treated with EdU and DMSO or with EdU and PPP during regeneration from 4-6 dpf. (A-B) Representative confocal images at 6 dpf of DMSO- and PPP-treated larvae displaying β cells in green and the β cells that had incorporated EdU as yellow overlap (arrowheads). Scale bars: 20 μm. (C) Quantification of the total number of β cells (green bars) at 6 dpf, and β cells that had incorporated EdU (white bars) from 4-6 dpf during β-cell regeneration. P=0.0003, P=0.8607 respectively. (D) Rate of β-cell proliferation, displayed as the percentage of β cells that incorporated EdU. P=0.1194. n=18 larvae for the DMSO-treated group, n=17 larvae for the PPP-treated group. (E-H) To examine whether PPP affected β-cell proliferation during regular development, Tg(ins:H2B-GFP) larvae were treated with EdU and DMSO or PPP from 4-6 dpf. (E-F) Representative confocal images of 6 dpf DMSO- and PPP-treated larvae displaying β cells in green and the β cells that had incorporated EdU as yellow overlap. Scale bars: 20 μm. (G) Quantification of the total number of β cells (green bars) and β cells that had incorporated EdU (white bars) per larva from 4-6 dpf. P=0.9098 and 0.9976, respectively. (H) Rate of β cell proliferation, displayed as the percentage of β cells that incorporated EdU. P=0.7822. n=16 larvae for DMSO-treated group, 18 larvae for PPP-treated group.(I-K) Activation of the Igf pathway reduces β-cell regeneration. Control and bactin:igf2a-overexpressing Tg(ins:H2B-GFP);Tg(ins:Flag-NTR) larvae were treated with MTZ from 3-4 dpf to ablate β cells and subsequently let to regenerate from 4-6 dpf. (I-J) Representative confocal images of 6 dpf control and bactin:igf2a-overexpressing larva displaying β cells in green. Scale bars: 15 μm. (K) Quantification of the total number of β cells per larva at 6 dpf following β cell regeneration from 4-6 dpf. P<0.0001. n=28 larvae for control, n=15 larvae for bactin:igf2a.(L-P) No synergistic effect was observed for igfbp1a and PPP. Control and bactin:igfbp1a-overexpressing Tg(ins:H2B-GFP);Tg(ins:Flag-NTR) larvae were treated with MTZ from 3-4 dpf to ablate β cells and subsequently treated with DMSO or PPP during regeneration from 4-6 dpf. (L) Quantification of the total number of β cells per larva. n>10 (n=23, 20, 14, 13). P=0.9546. (M-P) Representative confocal images of 6 dpf control or bactin:igfbp1a overexpressing larvae treated with either DMSO or PPP, displaying β cells after 2 days regeneration. Scale bars: 10 μm. See also Figure EV2 EV3."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "confocal", "projections", "of", "the", "whole", "pancreas", "(", "dashed", "lines", ")", "of", "35", "-", "day", "-", "old", "Tg", "(", "ins", ":", "H2B", "-", "GFP", ")", ";", "Tg", "(", "ins", ":", "Flag", "-", "NTR", ")", "transgenics", ",", "with", "or", "without", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", ",", "that", "were", "subjected", "to", "β", "-", "cell", "ablation", "between", "day", "30", "-", "31", "and", "then", "allowed", "to", "regenerate", "for", "4", "days", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "(", "C", ")", "Body", "length", "of", "control", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "zebrafish", ";", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "D", "-", "H", ")", "Quantification", "of", "β", "-", "cell", "regeneration", "was", "automated", "with", "an", "ImageJ", "script", ".", "(", "D", ")", "Insulin", "-", "positive", "area", "per", "zebrafish", ".", "(", "E", ")", "Relative", "insulin", "-", "positive", "area", "per", "body", "length", ";", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "F", ")", "The", "percentage", "of", "the", "pancreas", "area", "that", "was", "insulin", "-", "positive", "was", "significantly", "larger", "in", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "than", "in", "controls", ";", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "G", ")", "The", "total", "number", "of", "recorded", "units", "of", "adjacent", "ins", ":", "H2B", "-", "GFP", "+", "pixels", "(", "units", "ranging", "from", "single", "β", "cells", "to", "β", "-", "cell", "clusters", ")", "did", "not", "differ", "between", "control", "and", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "zebrafish", ".", "(", "H", ")", "The", "size", "of", "recorded", "ins", ":", "H2B", "-", "GFP", "+", "units", "was", "on", "average", "larger", "in", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "than", "in", "controls", ";", "P", "=", "0", ".", "039", ".", "n", "=", "26", "in", "the", "control", "group", ",", "n", "=", "27", "in", "the", "Tg", "(", "bactin", ":", "igfbp1a", ")", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-B) Representative confocal projections of the whole pancreas (dashed lines) of 35-day-old Tg(ins:H2B-GFP);Tg(ins:Flag-NTR) transgenics, with or without Tg(bactin:igfbp1a), that were subjected to β-cell ablation between day 30-31 and then allowed to regenerate for 4 days. Scale bars represent 100 μm. (C) Body length of control and Tg(bactin:igfbp1a) zebrafish; P<0.0001. (D-H) Quantification of β-cell regeneration was automated with an ImageJ script. (D) Insulin-positive area per zebrafish. (E) Relative insulin-positive area per body length; P<0.01. (F) The percentage of the pancreas area that was insulin-positive was significantly larger in Tg(bactin:igfbp1a) than in controls; P<0.0001. (G) The total number of recorded units of adjacent ins:H2B-GFP+ pixels (units ranging from single β cells to β-cell clusters) did not differ between control and Tg(bactin:igfbp1a) zebrafish. (H) The size of recorded ins:H2B-GFP+ units was on average larger in Tg(bactin:igfbp1a) than in controls; P=0.039. n=26 in the control group, n=27 in the Tg(bactin:igfbp1a) group."}
{"words": ["Figure", "7Isolated", "islets", "from", "mice", "were", "treated", "for", "3", "days", "with", "recombinant", "mouseIGFBP1", "protein", ",", "respectively", ".", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "control", "and", "Igfbp1", "-", "treated", "mouse", "islets", ".", "gcg", "+", "ins", "+", "cells", "are", "indicated", "by", "arrows", ".", "Scale", "bars", ":", "25", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "gcg", "+", "ins", "+", "bihormonal", "cells", "per", "ins", "+", "cells", "in", "mouse", "islets", "after", "treatment", "with", "increasing", "concentrations", "of", "IGFBP1", ".", "P", "=", "0", ".", "7304", ",", "0", ".", "0023", ",", "0", ".", "0013", ",", "0", ".", "0410", ",", "respectively", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "β", "-", "cell", "proliferation", "in", "mouse", "islets", "after", "treatment", "with", "Igfbp1", ";", "data", "displayed", "as", "relative", "values", "so", "that", "the", "proliferation", "markers", "EdU", "and", "Ki67", "can", "be", "compared", ".", "Isolated", "islets", "from", "human", "donors", "were", "treated", "for", "3", "days", "with", "recombinant", "human", "IGFBP1", "protein", ",", "respectively", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "control", "or", "IGFBP1", "-", "treated", "human", "islets", ".", "A", "gcg", "+", "ins", "+", "cell", "is", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "For", "clarity", ",", "individual", "colors", "for", "denoting", "insulin", "(", "green", ")", ",", "glucagon", "(", "red", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "are", "also", "shown", "separately", ".", "Scale", "bars", ":", "15", "μm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "gcg", "+", "ins", "+", "bihormonal", "cells", "per", "ins", "+", "cells", "in", "human", "islets", "from", "5", "donors", ".", "P", "=", "0", ".", "0036", ".", "Co", "-", "expression", "of", "insulin", "and", "glucagon", "is", "indicative", "of", "transdifferentiation", ",", "which", "could", "reflect", "either", "α", "cells", "transdifferentiating", "to", "β", "cells", "or", "vice", "versa", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Isolated islets from mice were treated for 3 days with recombinant mouseIGFBP1 protein, respectively. (A-B) Representative confocal images of control and Igfbp1-treated mouse islets. gcg+ins+ cells are indicated by arrows. Scale bars: 25 μm. (C) Quantification of the percentage of gcg+ins+ bihormonal cells per ins+ cells in mouse islets after treatment with increasing concentrations of IGFBP1. P=0.7304, 0.0023, 0.0013, 0.0410, respectively. (D) Quantification of β-cell proliferation in mouse islets after treatment with Igfbp1; data displayed as relative values so that the proliferation markers EdU and Ki67 can be compared.Isolated islets from human donors were treated for 3 days with recombinant human IGFBP1 protein, respectively. (E-F) Representative confocal images of control or IGFBP1-treated human islets. A gcg+ins+ cell is indicated by an arrow. For clarity, individual colors for denoting insulin (green), glucagon (red), and DAPI (blue) are also shown separately. Scale bars: 15 μm. (G) Quantification of the percentage of gcg+ins+ bihormonal cells per ins+ cells in human islets from 5 donors. P=0.0036. Co-expression of insulin and glucagon is indicative of transdifferentiation, which could reflect either α cells transdifferentiating to β cells or vice versa."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Three", "glycosylated", "forms", "of", "endogenous", "SMO", "protein", "are", "shown", ".", "NIH3T3", "cells", "were", "harvested", "and", "treated", "with", "indicated", "glycosidases", ".", "Black", "bracket", "indicates", "mature", "glycosylated", "form", "and", "grey", "bracket", "indicates", "core", "glycosylated", "form", ".", "The", "representative", "results", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "PTCH1", "inhibited", "the", "Endo", "H", "-", "resistant", "glycosylation", "of", "SMO", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "SMO", "and", "PTCH1", "expression", "plasmids", ".", "After", "48", "h", ",", "the", "cells", "were", "harvested", ",", "lysed", ",", "and", "treated", "with", "indicated", "glycosidases", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "Endo", "H", "-", "resistant", "form", "of", "SMO", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "quantified", "by", "Image", "J", "and", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "total", "SMO", "protein", ".", "(", "E", ")", "Shh", "increased", "the", "Endo", "H", "-", "resistant", "form", "of", "SMO", ".", "Cells", "were", "transfected", "as", "indicated", "for", "24", "h", ",", "and", "incubated", "with", "ShhN", "conditioned", "medium", "for", "an", "additional", "24", "h", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "Endo", "H", "-", "resistant", "form", "of", "SMO", "shown", "in", "(", "E", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "quantified", "by", "Image", "J", "and", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "total", "SMO", "protein", ".", "(", "G", ")", "Shh", "increased", "the", "Endo", "H", "-", "resistant", "form", "of", "endogenous", "SMO", "in", "MEF", "cells", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Densitometric", "analysis", "of", "Endo", "H", "-", "resistant", "form", "of", "SMO", "shown", "in", "(", "G", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "quantified", "by", "Image", "J", "and", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "total", "SMO", "protein", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Three glycosylated forms of endogenous SMO protein are shown. NIH3T3 cells were harvested and treated with indicated glycosidases. Black bracket indicates mature glycosylated form and grey bracket indicates core glycosylated form. The representative results of three independent experiments are shown.(C) PTCH1 inhibited the Endo H-resistant glycosylation of SMO. HEK293T cells were co-transfected with the SMO and PTCH1 expression plasmids. After 48 h, the cells were harvested, lysed, and treated with indicated glycosidases. Results shown are representative of three independent experiments.(D) Quantification of Endo H-resistant form of SMO shown in (C). Three independent experiments were quantified by Image J and expressed as a percentage of the total SMO protein.(E) Shh increased the Endo H-resistant form of SMO. Cells were transfected as indicated for 24 h, and incubated with ShhN conditioned medium for an additional 24 h. Cells were harvested and analyzed as in (C). Results shown are representative of three independent experiments.(F) Quantification of Endo H-resistant form of SMO shown in (E). Three independent experiments were quantified by Image J and expressed as a percentage of the total SMO protein.(G) Shh increased the Endo H-resistant form of endogenous SMO in MEF cells. Results shown are representative of three independent experiments.(H) Densitometric analysis of Endo H-resistant form of SMO shown in (G). Three independent experiments were quantified by Image J and expressed as a percentage of the total SMO protein."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Biotinylation", "of", "SMO", "by", "SAR1B", "-", "BirA", "*", "(", "asterisk", "denotes", "the", "R118G", "mutation", "in", "BirA", ")", "in", "a", "proximity", "-", "dependent", "biotinylation", "assay", ".", "The", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "SMO", "and", "SAR1B", "-", "BirA", "*", "-", "FLAG", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "different", "doses", "of", "biotin", "for", "4", "h", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "lysates", "were", "dialyzed", "to", "remove", "free", "biotin", ".", "Biotinylated", "proteins", "were", "pulled", "down", "by", "streptavidin", "beads", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", ".", "(", "B", ")", "The", "cells", "were", "treated", "with", "different", "doses", "of", "biotin", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "harvested", ",", "lysed", ",", "and", "subjected", "to", "procedure", "as", "shown", "in", "Fig", ".", "2A", ".", "(", "B", ")", "The", "cells", "were", "treated", "with", "different", "doses", "of", "biotin", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "harvested", ",", "lysed", ",", "and", "subjected", "to", "procedure", "as", "shown", "in", "Fig", ".", "2A", ".", "(", "C", ")", "The", "GDP", "-", "locked", "SAR1B", "(", "G37A", ")", "-", "BirA", "*", "failed", "to", "label", "SMO", ",", "while", "the", "GTP", "-", "locked", "SAR1B", "(", "H79G", ")", "-", "BirA", "*", "could", "efficiently", "biotinylate", "SMO", ".", "The", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "SMO", "and", "indicated", "SAR1B", "-", "BirA", "*", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "15", "μM", "biotin", "for", "4", "h", ".", "Then", "experiments", "were", "carried", "out", "as", "described", "in", "Fig", ".", "2A", ".", "(", "D", ")", "PTCH1", "decreased", "SAR1B", "-", "BirA", "*", "-", "mediated", "biotinylation", "of", "SMO", ",", "but", "not", "LMAN1", ".", "The", "experiments", "were", "done", "similarly", "in", "Fig", ".", "2A", ".", "(", "C", ")", "The", "GDP", "-", "locked", "SAR1B", "(", "G37A", ")", "-", "BirA", "*", "failed", "to", "label", "SMO", ",", "while", "the", "GTP", "-", "locked", "SAR1B", "(", "H79G", ")", "-", "BirA", "*", "could", "efficiently", "biotinylate", "SMO", ".", "The", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "SMO", "and", "indicated", "SAR1B", "-", "BirA", "*", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "15", "μM", "biotin", "for", "4", "h", ".", "Then", "experiments", "were", "carried", "out", "as", "described", "in", "Fig", ".", "2A", ".", "(", "D", ")", "PTCH1", "decreased", "SAR1B", "-", "BirA", "*", "-", "mediated", "biotinylation", "of", "SMO", ",", "but", "not", "LMAN1", ".", "The", "experiments", "were", "done", "similarly", "in", "Fig", ".", "2A", ".", "(", "E", ")", "The", "Shh", "increased", "the", "binding", "of", "SAR1B", "to", "SMO", ".", "After", "transfection", "for", "24", "h", ",", "cells", "were", "incubated", "with", "the", "ShhN", "conditioned", "medium", "for", "an", "additional", "24", "h", ".", "Then", "15", "μM", "biotin", "was", "added", "into", "the", "culture", "medium", "for", "4", "h", ".", "The", "cells", "were", "harvested", "and", "analyzed", "as", "described", "in", "Fig", ".", "2A", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Biotinylation of SMO by SAR1B-BirA* (asterisk denotes the R118G mutation in BirA) in a proximity-dependent biotinylation assay. The cells were transfected with plasmids encoding SMO and SAR1B-BirA*-FLAG. After 48 h, cells were treated with different doses of biotin for 4 h. Cells were harvested and lysates were dialyzed to remove free biotin. Biotinylated proteins were pulled down by streptavidin beads and subjected to immunoblotting analysis. (B) The cells were treated with different doses of biotin for 24 h. Cells were harvested, lysed, and subjected to procedure as shown in Fig. 2A.(B) The cells were treated with different doses of biotin for 24 h. Cells were harvested, lysed, and subjected to procedure as shown in Fig. 2A.(C) The GDP-locked SAR1B(G37A)-BirA* failed to label SMO, while the GTP-locked SAR1B(H79G)-BirA* could efficiently biotinylate SMO. The cells were transfected with plasmids expressing SMO and indicated SAR1B-BirA*. After 48 h, cells were treated with 15 μM biotin for 4 h. Then experiments were carried out as described in Fig. 2A.(D) PTCH1 decreased SAR1B-BirA*-mediated biotinylation of SMO, but not LMAN1. The experiments were done similarly in Fig. 2A.(C) The GDP-locked SAR1B(G37A)-BirA* failed to label SMO, while the GTP-locked SAR1B(H79G)-BirA* could efficiently biotinylate SMO. The cells were transfected with plasmids expressing SMO and indicated SAR1B-BirA*. After 48 h, cells were treated with 15 μM biotin for 4 h. Then experiments were carried out as described in Fig. 2A. (D) PTCH1 decreased SAR1B-BirA*-mediated biotinylation of SMO, but not LMAN1. The experiments were done similarly in Fig. 2A. (E) The Shh increased the binding of SAR1B to SMO. After transfection for 24 h, cells were incubated with the ShhN conditioned medium for an additional 24 h. Then 15 μM biotin was added into the culture medium for 4 h. The cells were harvested and analyzed as described in Fig. 2A."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Treatment", "with", "glycosidase", "demonstrated", "that", "SMO", "(", "4A", ",", "in", "which", "RRTWCR", "was", "mutated", "to", "AATACA", ")", "was", "sensitive", "to", "Endo", "H", ".", "The", "experiments", "were", "done", "similarly", "in", "Fig", ".", "2A", ".", "Black", "bracket", "indicates", "mature", "glycosylated", "form", ".", "(", "C", ")", "SAR1B", "-", "BirA", "*", "-", "mediated", "biotinylation", "of", "the", "SMO", "variants", ".", "The", "experiments", "were", "done", "similarly", "in", "Fig", ".", "2A", ".", "(", "D", ")", "In", "vitro", "budding", "of", "SMO", ".", "Membranes", "were", "prepared", "and", "incubated", "in", "vitro", "in", "the", "presence", "of", "cytosol", ",", "ATP", ",", "GTP", ",", "and", "an", "ATP", "-", "regenerating", "system", "as", "described", "in", "experimental", "procedures", ".", "Then", "vesicle", "and", "membrane", "fractions", "were", "separated", "by", "centrifugation", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", ".", "(", "E", ")", "In", "vitro", "budding", "of", "the", "SMO", "variants", ".", "The", "experiments", "were", "done", "as", "same", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "(", "F", ")", "The", "ciliary", "localization", "of", "SMO", "variants", ".", "Smo", "-", "KO", "NIH3T3", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "EGFP", "fused", "SMO", "variants", ",", "incubated", "with", "serum", "starvation", "medium", "for", "24", "h", "to", "fully", "induce", "cilia", "formation", ",", "and", "treated", "with", "or", "without", "ShhN", "conditioned", "medium", "for", "4", "h", ".", "Cells", "were", "immunostained", "with", "the", "acetylated", "tubulin", "(", "red", ")", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bars", ":", "5μm", ".", "(", "G", ")", "Quantitative", "assessment", "of", "the", "intensity", "of", "ciliary", "SMO", "in", "(", "F", ")", "by", "Image", "J", ".", "More", "than", "45", "cells", "were", "randomly", "selected", "and", "counted", "for", "each", "group", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "ciliary", "SMO", ".", "80", "-", "90", "cilia", "were", "analyzed", "in", "each", "group", "in", "each", "experiment", ".", "(", "I", ")", "Gli", "-", "luciferase", "reporter", "assay", "in", "Smo", "-", "KO", "NIH3T3", "cells", ".", "The", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "SMO", "or", "SMO", "variants", ",", "GLI", "-", "promoted", "firefly", "luciferase", "and", "renilla", "luciferase", ".", "After", "24", "h", ",", "cells", "were", "incubated", "with", "a", "medium", "containing", "different", "amounts", "of", "ShhN", "for", "another", "24", "h", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Treatment with glycosidase demonstrated that SMO (4A, in which RRTWCR was mutated to AATACA) was sensitive to Endo H. The experiments were done similarly in Fig. 2A. Black bracket indicates mature glycosylated form.(C) SAR1B-BirA*-mediated biotinylation of the SMO variants. The experiments were done similarly in Fig. 2A.(D) In vitro budding of SMO. Membranes were prepared and incubated in vitro in the presence of cytosol, ATP, GTP, and an ATP-regenerating system as described in experimental procedures. Then vesicle and membrane fractions were separated by centrifugation and subjected to immunoblotting analysis.(E) In vitro budding of the SMO variants. The experiments were done as same as in (D).(F) The ciliary localization of SMO variants. Smo-KO NIH3T3 cells were transfected with the EGFP fused SMO variants, incubated with serum starvation medium for 24 h to fully induce cilia formation, and treated with or without ShhN conditioned medium for 4 h. Cells were immunostained with the acetylated tubulin (red). Results shown are representative of three independent experiments. Scale bars: 5μm.(G) Quantitative assessment of the intensity of ciliary SMO in (F) by Image J. More than 45 cells were randomly selected and counted for each group.(H) Quantification of the percentage of cells with ciliary SMO. 80-90 cilia were analyzed in each group in each experiment.(I) Gli-luciferase reporter assay in Smo-KO NIH3T3 cells. The cells were transfected with plasmids encoding SMO or SMO variants, GLI-promoted firefly luciferase and renilla luciferase. After 24 h, cells were incubated with a medium containing different amounts of ShhN for another 24 h."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Shh", "increased", "cholesterylation", "of", "SMO", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", ",", "harvested", ",", "and", "analyzed", "(", "B", ")", "The", "SMO", "cholesterylation", "of", "Ptch1", "-", "KO", "NIH3T3", "cells", "were", "increased", "comparing", "with", "WT", "cells", ".", "(", "C", ")", "The", "CP", "-", "modified", "SMO", "was", "mainly", "resistant", "to", "Endo", "H", ".", "The", "CP", "-", "modified", "SMO", "proteins", "were", "pulled", "down", "by", "streptavidin", "beads", "and", "digested", "with", "Endo", "H", "or", "PNGase", "F", "at", "37", "℃", ".", "Then", "proteins", "were", "eluted", "with", "SDS", "-", "PAGE", "sample", "buffer", "and", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Cholesterylation", "of", "SMO", "(", "4A", ")", "was", "inhibited", "by", "PTCH1", "and", "increased", "by", "ShhN", ".", "(", "E", ")", "The", "CP", "-", "modified", "SMO", "(", "4A", ")", "was", "sensitive", "to", "Endo", "H", "treatment", ".", "(", "F", ")", "The", "levels", "of", "CP", "-", "modified", "WT", "SMO", "and", "SMO", "(", "4A", ")", "were", "compared", ".", "1", ".", "39", "%", "of", "SMO", "(", "WT", ")", "pellet", "samples", "and", "11", ".", "1", "%", "of", "SMO", "(", "4A", ")", "pellet", "samples", "were", "loaded", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "CP", "-", "modified", "SMO", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "quantified", "by", "Image", "J", "and", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "total", "SMO", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "The", "stimulative", "/", "inhibitory", "effect", "of", "Shh", "/", "PTCH1", "on", "SMO", "and", "SAR1B", "interaction", "was", "compromised", "by", "D95E", "mutation", ".", "The", "experiments", "were", "done", "the", "same", "as", "Fig", ".", "2E", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Shh increased cholesterylation of SMO. HEK293T cells were transfected, harvested, and analyzed(B) The SMO cholesterylation of Ptch1-KO NIH3T3 cells were increased comparing with WT cells.(C) The CP-modified SMO was mainly resistant to Endo H. The CP-modified SMO proteins were pulled down by streptavidin beads and digested with Endo H or PNGase F at 37 ℃. Then proteins were eluted with SDS-PAGE sample buffer and were subjected to immunoblotting analysis. Results shown are representative of two independent experiments.(D) Cholesterylation of SMO(4A) was inhibited by PTCH1 and increased by ShhN.(E) The CP-modified SMO(4A) was sensitive to Endo H treatment.(F) The levels of CP-modified WT SMO and SMO(4A) were compared. 1.39% of SMO(WT) pellet samples and 11.1% of SMO(4A) pellet samples were loaded. Results shown are representative of three independent experiments.(G) Quantification of CP-modified SMO shown in (F). Three independent experiments were quantified by Image J and expressed as a percentage of the total SMO.(H, I) The stimulative /inhibitory effect of Shh/PTCH1 on SMO and SAR1B interaction was compromised by D95E mutation. The experiments were done the same as Fig. 2E."}
{"words": ["Figure", "5ALOD4", "inhibited", "the", "cholesterol", "modification", "of", "SMO", "Cells", "were", "treated", "with", "ALOD4", "for", "1", "h", ",", "and", "then", "incubated", "with", "a", "medium", "containing", "ShhN", "and", "CP", "for", "2", "and", "3", "h", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "analyzedALOD4", "inhibited", "the", "cholesterol", "modification", "of", "SMO", "(", "4A", ")", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "ALOD4", "for", "1", "h", "In", "C", ",", "ShhN", "and", "CP", "added", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "analyzed", "(", "D", ")", "Ciliary", "localization", "of", "endogenous", "SMO", "treated", "with", "or", "without", "ALOD4", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "ALOD4", "for", "1", "h", ",", "and", "then", "incubated", "with", "ShhN", "conditioned", "medium", "for", "2", "h", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Quantitative", "assessment", "of", "the", "intensity", "of", "ciliary", "SMO", "in", "(", "D", ")", ".", "More", "than", "80", "cells", "were", "randomly", "selected", "and", "counted", "for", "each", "group", ".", "Data", "are", "presented", "as", "median", "with", "interquartile", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "ciliary", "SMO", "in", "(", "D", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "90", "-", "100", "cilia", "were", "analyzed", "in", "each", "group", "in", "each", "experiment", ".", "(", "G", ")", "Effect", "of", "ALOD4", "on", "the", "expression", "of", "Gli1", "was", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "The", "cells", "were", "treated", "with", "ALOD4", "for", "1", "h", ",", "and", "then", "incubated", "with", "ShhN", "conditioned", "medium", "for", "5", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5ALOD4 inhibited the cholesterol modification of SMO Cells were treated with ALOD4 for 1 h, and then incubated with a medium containing ShhN and CP for 2 and 3 h. Cells were harvested and analyzedALOD4 inhibited the cholesterol modification of SMO(4A). Cells were treated with ALOD4 for 1 h In C, ShhN and CP added for 2 h. Cells were harvested and analyzed(D) Ciliary localization of endogenous SMO treated with or without ALOD4. Cells were treated with ALOD4 for 1 h, and then incubated with ShhN conditioned medium for 2 h. Results shown are representative of three independent experiments.(E) Quantitative assessment of the intensity of ciliary SMO in (D). More than 80 cells were randomly selected and counted for each group. Data are presented as median with interquartile.(F) Quantification of the percentage of cells with ciliary SMO in (D). Data are presented as mean ± SEM from three biological replicates (****p < 0.0001, one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test). 90-100 cilia were analyzed in each group in each experiment.(G) Effect of ALOD4 on the expression of Gli1 was measured by qRT-PCR. The cells were treated with ALOD4 for 1 h, and then incubated with ShhN conditioned medium for 5 h."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "GRAMD1B", "increased", "cholesterylation", "of", "SMO", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "SMO", "or", "SMO", "(", "4A", ")", "and", "GRAMD1B", "protein", "expression", "plasmids", "for", "24", "h", ",", "and", "then", "incubated", "with", "a", "cholesterol", "depletion", "medium", "(", "DMEM", "supplemented", "with", "5", "%", "lipoprotein", "-", "deficient", "serum", ",", "1", "μM", "lovastatin", "and", "10", "μM", "mevalonate", ")", "for", "12", "h", ",", "followed", "by", "2", "μg", "/", "mL", "of", "CP", "treatment", ".", "The", "cells", "were", "harvested", "and", "analyzed", "as", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "GRAMD1B", "promoted", "SMO", "maturation", ".", "The", "expression", "plasmids", "of", "SMO", "or", "SMO", "(", "D95E", ")", "and", "GRAMD1B", "were", "transfected", "into", "SMO", "-", "KO", "HEK293T", "cells", ".", "After", "12", "h", ",", "cells", "were", "switched", "to", "a", "cholesterol", "depletion", "medium", "for", "16", "h", "and", "then", "added", "50", "μM", "MβCD", "-", "cholesterol", "for", "8", "h", ".", "Black", "bracket", "indicates", "mature", "glycosylated", "form", ".", "(", "E", ")", "Expression", "of", "Gli1", "mRNAs", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "GRAMD1B", ".", "After", "incubating", "in", "serum", "starvation", "medium", "for", "16", "h", ",", "cells", "were", "depleted", "of", "cholesterol", "by", "treatment", "with", "1", ".", "5", "%", "HPCD", "for", "0", ".", "5", "h", "and", "then", "incubated", "in", "serum", "starvation", "medium", "containing", "1", "μM", "lovastatin", ",", "10", "μM", "mevalonate", "and", "10", "μM", "MβCD", "-", "cholesterol", ",", "ShhN", "as", "indicated", "for", "24", "h", ".", "(", "F", ")", "Confocal", "images", "of", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "mCherry", "-", "GRAMD1B", ".", "PM", "was", "labeled", "with", "wheat", "germ", "agglutinin", "(", "WGA", ")", "-", "CF", "®", "488A", "conjugate", ".", "Cells", "were", "incubated", "in", "a", "cholesterol", "depletion", "medium", "for", "16", "h", "and", "switched", "to", "the", "same", "medium", "containing", "50", "μM", "MβCD", "-", "cholesterol", "for", "1", "h", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "or", "without", "ShhN", "conditioned", "medium", "for", "another", "2", "h", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "The", "percentage", "of", "cells", "with", "GRAMD1B", "localization", "on", "PM", ".", "60", "-", "70", "cells", "were", "analyzed", "in", "each", "group", "in", "each", "experiment", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A, B) GRAMD1B increased cholesterylation of SMO. HEK293T cells were co-transfected with the SMO or SMO (4A) and GRAMD1B protein expression plasmids for 24 h, and then incubated with a cholesterol depletion medium (DMEM supplemented with 5% lipoprotein-deficient serum, 1 μM lovastatin and 10 μM mevalonate) for 12 h, followed by 2 μg/mL of CP treatment. The cells were harvested and analyzed as Results shown are representative of two independent experiments.(C, D) GRAMD1B promoted SMO maturation. The expression plasmids of SMO or SMO(D95E) and GRAMD1B were transfected into SMO-KO HEK293T cells. After 12 h, cells were switched to a cholesterol depletion medium for 16 h and then added 50 μM MβCD-cholesterol for 8 h. Black bracket indicates mature glycosylated form.(E) Expression of Gli1 mRNAs measured by qRT-PCR in NIH3T3 cells stably expressing GRAMD1B. After incubating in serum starvation medium for 16 h, cells were depleted of cholesterol by treatment with 1.5% HPCD for 0.5 h and then incubated in serum starvation medium containing 1 μM lovastatin, 10 μM mevalonate and 10 μM MβCD-cholesterol, ShhN as indicated for 24 h.(F) Confocal images of NIH3T3 cells stably expressing mCherry-GRAMD1B. PM was labeled with wheat germ agglutinin (WGA)-CF®488A conjugate. Cells were incubated in a cholesterol depletion medium for 16 h and switched to the same medium containing 50 μM MβCD-cholesterol for 1 h. Cells were then treated with or without ShhN conditioned medium for another 2 h. Results shown are representative of three independent experiments.(G) The percentage of cells with GRAMD1B localization on PM. 60-70 cells were analyzed in each group in each experiment."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "The", "cholesterol", "modification", "of", "endogenous", "SMO", "was", "decreased", "in", "NIH3T3", "cells", "lacking", "Gramd1a", ",", "1b", ",", "1c", ",", "2", ",", "and", "3", "(", "Gramd", "-", "5KO", ")", ".", "The", "cells", "were", "incubated", "in", "a", "cholesterol", "depletion", "medium", "for", "12", "h", ",", "followed", "by", "2", "μg", "/", "mL", "of", "CP", "and", "ShhN", "for", "an", "additional", "12h", ".", "(", "B", ")", "The", "glycosylation", "of", "endogenous", "SMO", "was", "decreased", "in", "Gramd", "-", "5KO", "NIH3T3", "cells", ".", "The", "ShhN", "conditioned", "medium", "was", "applied", "for", "24", "h", ".", "Black", "bracket", "indicates", "mature", "glycosylated", "form", ".", "(", "C", ")", "The", "ciliary", "localization", "of", "endogenous", "SMO", "in", "WT", "or", "Gramd", "-", "5KO", "NIH3T3", "cells", ".", "Cells", "were", "incubated", "in", "serum", "starvation", "medium", "for", "24", "h", "to", "fully", "induce", "cilia", "formation", "and", "then", "incubated", "with", "or", "without", "ShhN", "conditioned", "medium", "for", "2", "h", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Quantitative", "assessment", "of", "the", "intensity", "of", "ciliary", "SMO", "in", "(", "C", ")", ".", "More", "than", "100", "cells", "were", "randomly", "selected", "and", "counted", "for", "each", "group", ".", "Data", "are", "presented", "as", "median", "with", "interquartile", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "ciliary", "SMO", ".", "86", "-", "100", "cilia", "were", "analyzed", "in", "each", "group", "in", "each", "experiment", ".", "(", "F", ")", "The", "protein", "levels", "of", "Gli1", "was", "significantly", "reduced", "in", "Gramd", "-", "5KO", "cells", ".", "The", "cells", "were", "incubated", "in", "a", "serum", "starvation", "medium", "with", "or", "without", "ShhN", "for", "24", "h", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "GLI", "-", "luciferase", "reporter", "assay", "in", "WT", "or", "Gramd", "-", "5KO", "NIH3T3", "cells", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "technical", "replicates", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "(", "H", ")", "The", "Gli1", "mRNA", "levels", "were", "measured", "in", "WT", ",", "Gramd", "-", "5KO", ",", "Gramd", "-", "5KO", "overexpression", "GRAMD1A", ",", "1B", ",", "1C", "NIH3T3", "cells", "by", "qRT", "-", "PCR", "after", "treatment", "with", "or", "without", "ShhN", "conditioned", "medium", "for", "8", "h", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "technical", "replicates", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ")", ".", "(", "I", ")", "The", "GRAMD", "inhibitor", "AI3d", "inhibited", "cholesterol", "modification", "of", "SMO", "in", "NIH3T3", "cells", ".", "The", "cells", "were", "incubated", "in", "cholesterol", "depletion", "medium", "for", "16", "h", "and", "then", "treated", "with", "3", "μM", "AI3d", "for", "6", "h", ".", "Next", ",", "cells", "were", "incubated", "in", "the", "same", "medium", "containing", "ShhN", "and", "2", "μg", "/", "mL", "of", "CP", "for", "an", "additional", "2", "h", ".", "(", "J", ")", "The", "GRAMD", "inhibitor", "AI3d", "decreased", "the", "mRNA", "levels", "of", "Gli1", "in", "NIH3T3", "cells", ".", "Cells", "were", "incubated", "in", "serum", "starvation", "medium", "for", "16", "h", ",", "depleted", "of", "cholesterol", "by", "1", ".", "5", "%", "HPCD", "for", "0", ".", "5", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "serum", "starvation", "medium", "containing", "1", "μM", "lovastatin", ",", "10", "μM", "mevalonate", "and", "1", "μM", "AI3d", "for", "6", "h", ".", "Next", ",", "cells", "were", "incubated", "in", "the", "same", "medium", "containing", "ShhN", "and", "10", "μM", "MβCD", "-", "cholesterol", "for", "an", "additional"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) The cholesterol modification of endogenous SMO was decreased in NIH3T3 cells lacking Gramd1a, 1b, 1c, 2, and 3 (Gramd-5KO). The cells were incubated in a cholesterol depletion medium for 12 h, followed by 2 μg/mL of CP and ShhN for an additional 12h.(B) The glycosylation of endogenous SMO was decreased in Gramd-5KO NIH3T3 cells. The ShhN conditioned medium was applied for 24 h. Black bracket indicates mature glycosylated form.(C) The ciliary localization of endogenous SMO in WT or Gramd-5KO NIH3T3 cells. Cells were incubated in serum starvation medium for 24 h to fully induce cilia formation and then incubated with or without ShhN conditioned medium for 2 h. Results shown are representative of three independent experiments.(D) Quantitative assessment of the intensity of ciliary SMO in (C). More than 100 cells were randomly selected and counted for each group. Data are presented as median with interquartile.(E) Quantification of the percentage of cells with ciliary SMO. 86-100 cilia were analyzed in each group in each experiment.(F) The protein levels of Gli1 was significantly reduced in Gramd-5KO cells. The cells were incubated in a serum starvation medium with or without ShhN for 24 h. Results shown are representative of two independent experiments.(G) GLI-luciferase reporter assay in WT or Gramd-5KO NIH3T3 cells. Data are presented as mean ± SEM from three technical replicates (****p < 0.0001; ***p < 0.001; *p < 0.05, two-way ANOVA with Sidak's multiple comparison test).(H) The Gli1 mRNA levels were measured in WT, Gramd-5KO, Gramd-5KO overexpression GRAMD1A, 1B, 1C NIH3T3 cells by qRT-PCR after treatment with or without ShhN conditioned medium for 8 h. Data are expressed as mean ± SEM from three technical replicates (****p < 0.0001, two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test).(I) The GRAMD inhibitor AI3d inhibited cholesterol modification of SMO in NIH3T3 cells. The cells were incubated in cholesterol depletion medium for 16 h and then treated with 3 μM AI3d for 6 h. Next, cells were incubated in the same medium containing ShhN and 2 μg/mL of CP for an additional 2 h.(J) The GRAMD inhibitor AI3d decreased the mRNA levels of Gli1 in NIH3T3 cells. Cells were incubated in serum starvation medium for 16 h, depleted of cholesterol by 1.5% HPCD for 0.5 h, and then treated with serum starvation medium containing 1 μM lovastatin, 10 μM mevalonate and 1 μM AI3d for 6 h. Next, cells were incubated in the same medium containing ShhN and 10 μM MβCD-cholesterol for an additional 16"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "upon", "inhibition", "of", "protein", "synthesis", "with", "cycloheximide", "(", "chx", ")", ".", "A", "plasmid", "-", "borne", "3HA", "-", "Pgc1", "expressed", "from", "the", "endogenous", "promoter", "was", "used", ".", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "detected", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "Kar2", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "and", "detected", "with", "anti", "-", "Kar2", "antibodies", ".", "The", "graph", "on", "the", "right", "shows", "the", "average", "of", "four", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "B", ")", "The", "ubiquitination", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "and", "expressing", "myc", "-", "tagged", "ubiquitin", ".", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "HA", "and", "polyubiquitin", "-", "conjugated", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "detected", "using", "anti", "-", "myc", "antibody", ".", "Input", "fraction", "corresponds", "to", "2", "%", "of", "the", "total", "amount", "used", "for", "IP", ".", "(", "C", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", "in", "cells", "bearing", "the", "CDC48", "temperature", "-", "sensitive", "allele", "cdc48", "-", "6", ".", "Cells", "were", "grown", "2", ",", "5", "hours", "at", "37C", "prior", "addition", "of", "cycloheximide", ".", "Inactivation", "of", "Cdc48", "mutant", "protein", "was", "confirmed", "by", "stabilization", "of", "the", "ERAD", "substrate", "Erg1", "in", "the", "same", "cells", ".", "(", "D", ")", "Membrane", "association", "of", "ubiquitinated", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "by", "density", "gradient", "centrifugation", "followed", "by", "immunoprecipitation", ".", "Cells", "of", "the", "indicated", "genotype", "and", "expressing", "myc", "-", "tagged", "ubiquitin", "were", "grown", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "Lysates", "were", "subjected", "to", "centrifugation", "on", "an", "optiprep", "density", "gradient", ".", "Collected", "fractions", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "before", "and", "after", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "Dpm1", "and", "Pgk1", "were", "used", "as", "markers", "for", "membrane", "bound", "and", "soluble", "fractions", "respectively", ".", "Input", "fraction", "corresponds", "to", "10", "%", "of", "the", "total", "amount", "used", "for", "IP", ".", "\"", "Top", "\"", ",", "\"", "mid", "\"", ",", "\"", "bottom", "\"", "indicate", "the", "fractions", "from", "the", "gradient", ".", "Asterisk", "marks", "a", "faster", "migrating", "unspecific", "band", "in", "the", "input", "bottom", "fraction", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) The degradation of 3HA-Pgc1 was analyzed in cells with the indicated genotype upon inhibition of protein synthesis with cycloheximide (chx). A plasmid-borne 3HA-Pgc1 expressed from the endogenous promoter was used. 3HA-Pgc1 was detected with anti-HA antibodies. Kar2 was used as a loading control and detected with anti-Kar2 antibodies. The graph on the right shows the average of four independent experiments; error bars represent the standard deviation.(B) The ubiquitination of 3HA-Pgc1 was analyzed in cells with the indicated genotype and expressing myc-tagged ubiquitin. 3HA-Pgc1 was immunoprecipitated using anti-HA and polyubiquitin-conjugated 3HA-Pgc1 was detected using anti-myc antibody. Input fraction corresponds to 2% of the total amount used for IP.(C) The degradation of 3HA-Pgc1 was analyzed as in (A) in cells bearing the CDC48 temperature-sensitive allele cdc48-6. Cells were grown 2,5 hours at 37C prior addition of cycloheximide. Inactivation of Cdc48 mutant protein was confirmed by stabilization of the ERAD substrate Erg1 in the same cells.(D) Membrane association of ubiquitinated 3HA-Pgc1 was analyzed by density gradient centrifugation followed by immunoprecipitation. Cells of the indicated genotype and expressing myc-tagged ubiquitin were grown as in (C). Lysates were subjected to centrifugation on an optiprep density gradient. Collected fractions were analyzed by western blotting before and after immunoprecipitation with anti-HA antibodies. Dpm1 and Pgk1 were used as markers for membrane bound and soluble fractions respectively. Input fraction corresponds to 10% of the total amount used for IP. \"Top\", \"mid\", \"bottom\" indicate the fractions from the gradient. Asterisk marks a faster migrating unspecific band in the input bottom fraction."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Localization", "of", "chromosomally", "expressed", "GFP", "-", "Pgc1", "from", "the", "constitutive", "ADH1", "promoter", "in", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", ".", "Arrowheads", "indicate", "GFP", "-", "Pgc1", "labeling", "at", "the", "ER", ",", "which", "is", "stained", "by", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "LDs", "were", "visualized", "upon", "staining", "with", "the", "neutral", "lipid", "dye", "MDH", ".", "On", "the", "bottom", ",", "box", "plot", "with", "quantitation", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "fluorescence", "intensity", "at", "the", "nuclear", "envelope", "in", "wt", "and", "doa10Δ", ".", "GFP", "-", "Pgc1", "measurements", "were", "performed", "as", "described", "in", "the", "Materials", "and", "Methods", "section", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "Crude", "membranes", "from", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", "expressing", "3HA", "-", "Pgc1", "were", "subjected", "to", "the", "indicated", "treatments", "and", "subsequently", "fractionated", "into", "membrane", "pellet", "(", "P", ")", "and", "supernatant", "(", "S", ")", ".", "(", "D", ")", "Crude", "membranes", "from", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", "expressing", "3HA", "-", "GFP", "-", "Pgc1275", "-", "321", "were", "analyzed", "as", "in", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Localization of chromosomally expressed GFP-Pgc1 from the constitutive ADH1 promoter in wt and doa10Δ cells. Arrowheads indicate GFP-Pgc1 labeling at the ER, which is stained by Sec63-Cherry. LDs were visualized upon staining with the neutral lipid dye MDH. On the bottom, box plot with quantitation of GFP-Pgc1 fluorescence intensity at the nuclear envelope in wt and doa10Δ. GFP-Pgc1 measurements were performed as described in the Materials and Methods section. Scale bar: 5 µm.(C) Crude membranes from wt and doa10Δ cells expressing 3HA-Pgc1 were subjected to the indicated treatments and subsequently fractionated into membrane pellet (P) and supernatant (S).(D) Crude membranes from wt and doa10Δ cells expressing 3HA-GFP-Pgc1275-321 were analyzed as in (C)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Localization", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "in", "are1Δ", "are2Δ", "lro1Δ", "dga1Δ", "cells", "in", "presence", "(", "no", "LDs", ")", "or", "absence", "of", "DOA10", "(", "no", "LDs", "doa10Δ", ")", ".", "The", "ER", "was", "visualized", "by", "expression", "of", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "GFP", "-", "Pgc1", "was", "expressed", "under", "the", "ADH1", "promoter", ";", "LD", "formation", "was", "stimulated", "by", "galactose", "-", "induced", "expression", "of", "DGA1", "in", "are1Δare2Δlro1Δ", ".", "Fluorescence", "microscopy", "was", "used", "to", "follow", "GFP", "-", "Pgc1", "localization", "over", "time", ".", "LDs", "were", "visualized", "upon", "staining", "with", "the", "neutral", "lipid", "dye", "MDH", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "Photo", "-", "conversion", "of", "tdEOS", "-", "Pgc1", "expressed", "under", "the", "ADH1", "promoter", ";", "LD", "formation", "was", "stimulated", "by", "galactose", "-", "induced", "expression", "of", "DGA1", "in", "are1Δare2Δlro1Δdoa10Δ", "cells", ".", "The", "red", "square", "marks", "the", "photo", "-", "converted", "region", ".", "The", "time", "(", "in", "minutes", ")", "after", "photoconversion", "is", "indicated", ".", "Arrowheads", "point", "LDs", "containing", "photoconverted", "tdEOS", "-", "Pgc1", ".", "Scale", "bar", "5µm", ".", "(", "D", ")", "FRAP", "experiment", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "in", "wt", "and", "doa10Δcells", ".", "Representative", "examples", "are", "shown", ".", "The", "bleached", "areas", "are", "marked", "by", "red", "squares", "and", "include", "a", "LD", "adjacent", "to", "ER", ".", "The", "time", "(", "in", "seconds", ")", "after", "photobleaching", "is", "indicated", ".", "Each", "graph", "shows", "average", "fluorescence", "intensities", "for", "10", "cells", "normalized", "to", "pre", "-", "bleached", "plotted", "over", "time", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Localization of GFP-Pgc1 in are1Δ are2Δ lro1Δ dga1Δ cells in presence (no LDs) or absence of DOA10 (no LDs doa10Δ). The ER was visualized by expression of Sec63-Cherry. Scale bar: 5 µm.(B) GFP-Pgc1 was expressed under the ADH1 promoter; LD formation was stimulated by galactose-induced expression of DGA1 in are1Δare2Δlro1Δ. Fluorescence microscopy was used to follow GFP-Pgc1 localization over time. LDs were visualized upon staining with the neutral lipid dye MDH. Scale bar: 5 µm.(C) Photo-conversion of tdEOS-Pgc1 expressed under the ADH1 promoter; LD formation was stimulated by galactose-induced expression of DGA1 in are1Δare2Δlro1Δdoa10Δ cells. The red square marks the photo-converted region. The time (in minutes) after photoconversion is indicated. Arrowheads point LDs containing photoconverted tdEOS-Pgc1. Scale bar 5µm.(D) FRAP experiment of GFP-Pgc1 in wt and doa10Δcells. Representative examples are shown. The bleached areas are marked by red squares and include a LD adjacent to ER. The time (in seconds) after photobleaching is indicated. Each graph shows average fluorescence intensities for 10 cells normalized to pre-bleached plotted over time. Error bars indicate standard deviation."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "B", ")", "The", "degradation", "of", "the", "Doa10", "substrates", "3HA", "-", "Pgc1", "and", "3HA", "-", "Vma12", "-", "Ndc10C", "'", "was", "analyzed", "in", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "treated", "with", "oleic", "acid", ".", "3HA", "-", "Pgc1", "and", "3HA", "-", "Vma12", "-", "Ndc10C", "'", "were", "detected", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "Dpm1", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "and", "detected", "with", "anti", "-", "Dpm1", "antibodies", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The degradation of 3HA-Pgc1 was analyzed in cells with the indicated genotype as in Fig. 1A. The graph shows the average of three independent experiments; error bars represent the standard deviation.(B) The degradation of the Doa10 substrates 3HA-Pgc1 and 3HA-Vma12-Ndc10C' was analyzed in cells of the indicated genotypes treated with oleic acid. 3HA-Pgc1 and 3HA-Vma12-Ndc10C' were detected with anti-HA antibodies. Dpm1 was used as a loading control and detected with anti-Dpm1 antibodies. The graph shows the average of three independent experiments; error bars represent the standard deviation."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Localization", "of", "GFP", "-", "tagged", "Pgc1", "derivatives", "in", "which", "the", "hydrophobic", "hairpin", "(", "aa275", "-", "321", ")", "was", "replaced", "by", "membrane", "anchor", "of", "Scs2", "(", "Pgc1Scs2MA", ")", "or", "Bos1", "(", "Pgc1Bos1MA", ")", ".", "ER", "and", "LDs", "were", "visualized", "by", "expression", "of", "Sec63", "-", "Cherry", "and", "MDH", "staining", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "or", "the", "indicated", "chimeras", "in", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", "was", "analyzed", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "blot", "is", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "GFP", "-", "Pgc1275", "-", "321", "in", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", "was", "analyzed", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "four", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "D", ")", "Localization", "of", "3HA", "-", "GFP", "-", "Pgc1275", "-", "321", "in", "doa10Δ", "cells", ".", "The", "ER", "was", "visualized", "by", "expression", "of", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Localization of GFP-tagged Pgc1 derivatives in which the hydrophobic hairpin (aa275-321) was replaced by membrane anchor of Scs2 (Pgc1Scs2MA) or Bos1 (Pgc1Bos1MA). ER and LDs were visualized by expression of Sec63-Cherry and MDH staining, respectively. Scale bar: 5 µm.(B) The degradation of 3HA-Pgc1 or the indicated chimeras in wt and doa10Δ cells was analyzed as in Fig. 1A. The blot is representative of at least three independent experiments.(C) The degradation of 3HA-GFP-Pgc1275-321 in wt and doa10Δ cells was analyzed as in Fig. 1A. The graph shows the average of four independent experiments; error bars represent the standard deviation.(D) Localization of 3HA-GFP-Pgc1275-321 in doa10Δ cells. The ER was visualized by expression of Sec63-Cherry. Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "-", "GPAT160", "-", "216", ",", "containing", "GPAT4", "hydrophobic", "hairpin", "(", "aa160", "-", "216", ")", "replacing", "the", "one", "of", "Pgc1", "was", "analyzed", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "B", ")", "Localization", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "-", "GPAT4160", "-", "216", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", ".", "Arrowheads", "indicate", "GFP", "-", "Pgc1", "-", "GPAT4160", "-", "216", "labeling", "at", "the", "ER", ",", "marked", "with", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "LDs", "were", "visualized", "upon", "staining", "with", "MDH", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "-", "GPAT160", "-", "216", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "was", "analyzed", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "D", ")", "Localization", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "-", "GPAT160", "-", "216", "in", "are1Δ", "are2Δ", "lro1Δ", "dga1Δ", "doa10Δ", "mutant", "(", "no", "LDs", "doa10Δ", ")", ".", "The", "ER", "was", "visualized", "by", "expression", "of", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) The degradation of 3HA-Pgc1-GPAT160-216, containing GPAT4 hydrophobic hairpin (aa160-216) replacing the one of Pgc1 was analyzed in cells with the indicated genotype as in Fig. 1A. The graph shows the average of three independent experiments; error bars represent the standard deviation.(B) Localization of GFP-Pgc1-GPAT4160-216 in cells with the indicated genotype. Arrowheads indicate GFP-Pgc1-GPAT4160-216 labeling at the ER, marked with Sec63-Cherry. LDs were visualized upon staining with MDH. Scale bar: 5 µm.(C) The degradation of 3HA-Pgc1-GPAT160-216 in cells with the indicated genotype was analyzed as in Fig. 1A. The graph shows the average of three independent experiments; error bars represent the standard deviation.(D) Localization of GFP-Pgc1-GPAT160-216 in are1Δ are2Δ lro1Δ dga1Δ doa10Δ mutant (no LDs doa10Δ). The ER was visualized by expression of Sec63-Cherry. Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "1A", "Time", "course", "images", "of", "the", "hippocampal", "CA1", "region", "of", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", "after", "DT", "administration", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "an", "anti", "-", "Iba1", "antibody", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "cyan", ")", ".", "Arrow", ":", "live", "microglia", "with", "normal", "nucleus", ".", "Double", "arrow", ":", "apoptotic", "microglia", "with", "pyknotic", "nucleus", ".", "Arrowhead", ":", "microglial", "debris", "with", "no", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "50", "µm", ".", "B", "Number", "of", "apoptotic", "microglia", "with", "pyknotic", "or", "fragmented", "nucleus", "(", "n", "=", "5", "animals", "per", "group", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "post", "hoc", "Dunn", "'", "s", "test", ")", ".", "C", "Number", "of", "live", "microglia", "with", "normal", "nucleus", "(", "n", "=", "5", "animals", "per", "group", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ")", ".", "D", "Number", "of", "pieces", "of", "microglial", "debris", "(", "Iba1", "+", "spheres", "with", "a", "diameter", ">", "2", "µm", "and", "no", "nucleus", ")", "(", "n", "=", "5", "animals", "per", "group", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "post", "hoc", "Dunn", "'", "s", "test", ")", ".", "E", "A", "representative", "image", "of", "a", "survived", "microglial", "cell", "in", "the", "hippocampal", "CA1", "region", "of", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", "2", "days", "after", "DT", "administration", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "an", "anti", "-", "Iba1", "antibody", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "cyan", ")", ".", "A", "3D", "image", "(", "rightmost", "panel", ")", "was", "reconstructed", "using", "Imaris", "software", ".", "Arrow", ":", "live", "microglia", ".", "Arrowhead", ":", "microglial", "debris", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Time course images of the hippocampal CA1 region of Siglechdtr/dtr mice after DT administration. Sections were stained with an anti-Iba1 antibody (green) and DAPI (cyan). Arrow: live microglia with normal nucleus. Double arrow: apoptotic microglia with pyknotic nucleus. Arrowhead: microglial debris with no nucleus. Scale bar, 50 µm. B Number of apoptotic microglia with pyknotic or fragmented nucleus (n = 5 animals per group, Kruskal-Wallis test with post hoc Dunn's test). C Number of live microglia with normal nucleus (n = 5 animals per group, one-way ANOVA with post hoc Tukey's test). D Number of pieces of microglial debris (Iba1+ spheres with a diameter > 2 µm and no nucleus) (n = 5 animals per group, Kruskal-Wallis test with post hoc Dunn's test). E A representative image of a survived microglial cell in the hippocampal CA1 region of Siglechdtr/dtr mice 2 days after DT administration. Sections were stained with an anti-Iba1 antibody (green) and DAPI (cyan). A 3D image (rightmost panel) was reconstructed using Imaris software. Arrow: live microglia. Arrowhead: microglial debris. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", "Histological", "analysis", "of", "RFP", "+", "cells", "in", "Siglechdtr", "/", "dtr", ":", "Ccr2RFP", "/", "+", "mice", ".", "Lumber", "spinal", "cord", "after", "EAE", "induction", ",", "and", "hippocampal", "CA1", "2", "or", "4", "days", "after", "PBS", "or", "DT", "injection", "were", "analyzed", ".", "Iba1", "immunoreactivity", "(", "green", ")", "and", "RFP", "fluorescence", "(", "red", ")", "are", "shown", ".", "Images", "were", "acquired", "using", "the", "same", "laser", "power", "and", "sensitivity", ",", "and", "image", "processing", "was", "the", "same", "for", "all", "RFP", "signals", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "50", "µm", ".", "B", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "RFP", "+", "Ly6Chigh", "inflammatory", "monocytes", "in", "peripheral", "blood", "of", "Siglechdtr", "/", "dtr", ":", "Ccr2RFP", "/", "+", "mice", "2", "days", "after", "PBS", "or", "DT", "administration", ".", "Representative", "data", "and", "a", "quantification", "graph", "(", "n", "=", "5", "animals", "per", "group", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "are", "shown", ".", "C", "Immunohistochemical", "localization", "of", "CD206", "+", "perivascular", "macrophages", "(", "arrows", ")", "in", "hippocampal", "CA1", "of", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", ".", "Sections", "prepared", "2", "days", "after", "administration", "of", "PBS", "or", "DT", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Iba1", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "CD206", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "CD31", "(", "blue", ")", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "50", "µm", ".", "D", "Number", "of", "perivascular", "macrophages", "in", "hippocampal", "CA1", "of", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", "2", "days", "after", "PBS", "or", "DT", "administration", "(", "n", "=", "5", "animals", "per", "group", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Histological analysis of RFP+ cells in Siglechdtr/dtr:Ccr2RFP/+ mice. Lumber spinal cord after EAE induction, and hippocampal CA1 2 or 4 days after PBS or DT injection were analyzed. Iba1 immunoreactivity (green) and RFP fluorescence (red) are shown. Images were acquired using the same laser power and sensitivity, and image processing was the same for all RFP signals (red). Scale bar, 50 µm.B Flow cytometric analysis of RFP+Ly6Chigh inflammatory monocytes in peripheral blood of Siglechdtr/dtr:Ccr2RFP/+ mice 2 days after PBS or DT administration. Representative data and a quantification graph (n = 5 animals per group, two-tailed unpaired Student's t-test) are shown.C Immunohistochemical localization of CD206+ perivascular macrophages (arrows) in hippocampal CA1 of Siglechdtr/dtr mice. Sections prepared 2 days after administration of PBS or DT were stained with anti-Iba1 (green), anti-CD206 (red) and anti-CD31 (blue) antibodies. Scale bar, 50 µm. D Number of perivascular macrophages in hippocampal CA1 of Siglechdtr/dtr mice 2 days after PBS or DT administration (n = 5 animals per group, two-tailed unpaired Student's t-test). "}
{"words": ["Figure", "3A", "qPCR", "analysis", "of", "marker", "molecules", "for", "CNS", "cell", "types", ".", "The", "hippocampus", "of", "WT", "and", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", "2", "days", "after", "PBS", "or", "DT", "administration", "was", "analyzed", "(", "n", "=", "3", "animals", "per", "group", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ")", ".", "Results", "are", "normalized", "to", "Gapdh", ",", "and", "are", "shown", "as", "ratios", "to", "the", "value", "of", "WT", "mice", "injected", "with", "PBS", ".", "B", "Immunohistochemical", "detection", "of", "astrocytes", "in", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", ".", "Hippocampal", "CA1", "sections", "were", "prepared", "2", "days", "after", "PBS", "or", "DT", "administration", ",", "and", "stained", "with", "an", "anti", "-", "GFAP", "antibody", ".", "Images", "were", "acquired", "using", "the", "same", "laser", "power", "and", "sensitivity", ",", "and", "image", "processing", "was", "the", "same", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "30", "µm", ".", "C", "Astrocyte", "number", "in", "hippocampal", "CA1", "of", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", "2", "days", "after", "PBS", "or", "DT", "administration", "(", "n", "=", "5", "animals", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A qPCR analysis of marker molecules for CNS cell types. The hippocampus of WT and Siglechdtr/dtr mice 2 days after PBS or DT administration was analyzed (n = 3 animals per group, one-way ANOVA with post hoc Tukey's test). Results are normalized to Gapdh, and are shown as ratios to the value of WT mice injected with PBS.B Immunohistochemical detection of astrocytes in Siglechdtr/dtr mice. Hippocampal CA1 sections were prepared 2 days after PBS or DT administration, and stained with an anti-GFAP antibody. Images were acquired using the same laser power and sensitivity, and image processing was the same. Scale bar, 30 µm. C Astrocyte number in hippocampal CA1 of Siglechdtr/dtr mice 2 days after PBS or DT administration (n = 5 animals, two-tailed unpaired Student's t-test). "}
{"words": ["Figure", "4A", "Representative", "images", "of", "microglial", "debris", "surrounded", "by", "astrocyte", "processes", "in", "hippocampal", "CA1", ".", "Sections", "were", "prepared", "from", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", "2", "days", "after", "PBS", "or", "DT", "administration", ",", "and", "stained", "with", "anti", "-", "GFAP", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "CD11b", "(", "red", ")", "antibodies", ".", "3D", "images", "(", "lower", "row", ")", "were", "reconstructed", "from", "confocal", "images", "(", "upper", "row", ")", "using", "Imaris", "software", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "B", "CLEM", "analysis", "of", "a", "phagocytic", "astrocyte", "in", "hippocampal", "CA1", "of", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", "2", "days", "after", "DT", "administration", ".", "A", "phagocytic", "astrocyte", ",", "which", "engulfed", "degenerated", "microglial", "components", ",", "was", "identified", "by", "immunohistochemistry", "using", "anti", "-", "S100β", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "CD11b", "(", "red", ")", "antibodies", ",", "and", "DAPI", "(", "cyan", ")", "(", "upper", "and", "middle", "panels", ")", ".", "Then", ",", "a", "phagocytic", "cup", "of", "the", "same", "cell", "was", "analyzed", "by", "electron", "microscopy", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Degenerated", "microglial", "cytoplasm", "/", "plasma", "membrane", "(", "arrow", ")", "and", "nucleus", "(", "double", "arrow", ")", "in", "a", "phagocytic", "cup", "of", "the", "astrocyte", ",", "and", "a", "piece", "of", "microglial", "debris", "internalized", "in", "astrocytic", "cytoplasm", "(", "arrowhead", ")", "are", "indicated", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "50", "µm", "(", "upper", "panel", ")", ",", "10", "µm", "(", "upper", "panel", "[", "inset", "]", "and", "middle", "panel", ")", ",", "and", "2", "µm", "(", "lower", "panel", ")", ".", "C", "A", "representative", "image", "of", "a", "phagocytic", "astrocyte", "in", "hippocampal", "CA1", "of", "Siglechdtr", "/", "dtr", "mice", "2", "days", "after", "DT", "administration", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "anti", "-", "S100β", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "CD11b", "(", "red", ")", "antibodies", ",", "and", "confocal", "images", "were", "reconstructed", "using", "Imaris", "software", ".", "The", "lower", "two", "panels", "are", "higher", "magnification", "images", "of", "contacted", "microglial", "debris", ".", "Arrow", ":", "microglial", "debris", "contacted", "by", "astrocyte", "processes", "(", "coverage", ":", "approximately", "30", "or", "50", "%", ")", ".", "Arrowhead", ":", "microglial", "debris", "internalized", "in", "astrocyte", "cytoplasm", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "10", "µm", "(", "upper", "panel", ")", "and", "2", "µm", "(", "lower", "panels", ")", ".", "D", ",", "E", "Quantification", "of", "the", "pieces", "of", "debris", "(", "CD11b", "+", "spheres", "with", ">", "0", ".", "5", "µm", "diameter", ")", "contacted", "with", "(", "coverage", ">", "30", "%", ")", "(", "D", ")", "and", "internalized", "by", "(", "E", ")", "a", "single", "astrocyte", "within", "30", "µm", "-", "thick", "sections", "(", "n", "=", "75", "cells", "from", "five", "animals", "per", "group", ")", ".", "The", "number", "of", "debris", "pieces", "was", "counted", "in", "3D", "images", "reconstructed", "using", "Imaris", "software", ".", "All", "confocal", "images", "were", "acquired", "using", "the", "same", "laser", "power", "and", "sensitivity", ",", "and", "image", "processing", "was", "the", "same", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Representative images of microglial debris surrounded by astrocyte processes in hippocampal CA1. Sections were prepared from Siglechdtr/dtr mice 2 days after PBS or DT administration, and stained with anti-GFAP (green) and anti-CD11b (red) antibodies. 3D images (lower row) were reconstructed from confocal images (upper row) using Imaris software. Scale bar, 10 µm.B CLEM analysis of a phagocytic astrocyte in hippocampal CA1 of Siglechdtr/dtr mice 2 days after DT administration. A phagocytic astrocyte, which engulfed degenerated microglial components, was identified by immunohistochemistry using anti-S100β (green) and anti-CD11b (red) antibodies, and DAPI (cyan) (upper and middle panels). Then, a phagocytic cup of the same cell was analyzed by electron microscopy (lower panel). Degenerated microglial cytoplasm/plasma membrane (arrow) and nucleus (double arrow) in a phagocytic cup of the astrocyte, and a piece of microglial debris internalized in astrocytic cytoplasm (arrowhead) are indicated. Scale bar, 50 µm (upper panel), 10 µm (upper panel [inset] and middle panel), and 2 µm (lower panel).C A representative image of a phagocytic astrocyte in hippocampal CA1 of Siglechdtr/dtr mice 2 days after DT administration. Sections were stained with anti-S100β (green) and anti-CD11b (red) antibodies, and confocal images were reconstructed using Imaris software. The lower two panels are higher magnification images of contacted microglial debris. Arrow: microglial debris contacted by astrocyte processes (coverage: approximately 30 or 50%). Arrowhead: microglial debris internalized in astrocyte cytoplasm. Scale bar, 10 µm (upper panel) and 2 µm (lower panels). D, E Quantification of the pieces of debris (CD11b+ spheres with > 0.5 µm diameter) contacted with (coverage > 30%) (D) and internalized by (E) a single astrocyte within 30 µm-thick sections (n = 75 cells from five animals per group). The number of debris pieces was counted in 3D images reconstructed using Imaris software. All confocal images were acquired using the same laser power and sensitivity, and image processing was the same."}
{"words": ["Figure", "5B", "Expression", "level", "of", "phagocytic", "receptors", "and", "their", "extracellular", "adaptor", "molecules", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Values", "show", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "N", ".", "S", ".", ":", "no", "significance", ";", "*", "*", "*", "q", "<", "0", ".", "001", ".", "The", "probability", "values", "for", "differential", "expression", "analysis", "were", "computed", "with", "edgeR", "followed", "by", "a", "correction", "of", "multiple", "testing", "with", "q", "-", "value", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Expression level of phagocytic receptors and their extracellular adaptor molecules (n = 3 independent experiments). Values show the mean ± SEM. N.S.: no significance; ***q < 0.001. The probability values for differential expression analysis were computed with edgeR followed by a correction of multiple testing with q-value."}
{"words": ["Figure", "6Cultured", "astrocytes", "engulf", "microglial", "debris", ".", "CAG", "-", "EGFP", "mouse", "-", "derived", "primary", "astrocytes", "were", "co", "-", "cultured", "with", "or", "without", "fluorescence", "-", "labelled", "apoptotic", "microglia", ".", "(", "A", ")", "Fluorescence", "images", "of", "GFP", "(", "green", ")", ",", "microglial", "debris", "(", "red", ")", "and", "GFAP", "immunoreactivity", "(", "blue", ")", ".", "Images", "were", "acquired", "using", "the", "same", "laser", "power", "and", "sensitivity", ",", "and", "image", "processing", "was", "the", "same", "in", "the", "two", "images", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "50", "µm", ".", "(", "B", ")", "Fluorescence", "images", "of", "GFP", "(", "green", ")", ",", "microglial", "debris", "(", "red", ")", "and", "LAMP", "-", "1", "immunoreactivity", "(", "cyan", ")", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "30", "µm", "and", "5", "µm", "(", "inset", ")", ".", "C", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "uptake", "of", "microglial", "debris", "by", "cultured", "astrocytes", ".", "Fluorescence", "of", "internalized", "microglial", "debris", "was", "measured", "in", "GLAST", "+", "astrocytes", "co", "-", "cultured", "with", "or", "without", "fluorescence", "-", "labelled", "apoptotic", "microglia", ".", "D", "Expression", "of", "TAM", "family", "members", "and", "their", "knockdown", "by", "siRNA", "in", "cultured", "astrocytes", ".", "Tyro3", ",", "Axl", "and", "Metk", "in", "cultured", "astrocytes", "or", "hippocampal", "tissue", "were", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "Arrows", "indicate", "the", "corresponding", "protein", "band", "(", "s", ")", ".", "The", "secondary", "antibody", "against", "goat", "IgG", "generates", "a", "~", "115", "kDa", "non", "-", "specific", "band", ".", "The", "~", "115", "kDa", "band", "in", "the", "Axl", "image", "is", "the", "Axl", "-", "specific", "band", "overlapping", "the", "non", "-", "specific", "band", ".", "The", "~", "115", "kDa", "band", "in", "the", "Mertk", "image", "is", "the", "non", "-", "specific", "band", ".", "Axl", "and", "Mertk", "expression", "was", "knocked", "down", "by", "two", "siRNAs", ".", "GAPDH", "expression", "is", "shown", "as", "an", "internal", "control", ".", "E", "Quantification", "of", "siRNA", "knockdown", "in", "cultured", "astrocytes", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "repeated", "measures", ")", ".", "Knockdown", "of", "Tyro3", "mRNA", "was", "examined", "by", "qPCR", "because", "of", "the", "very", "low", "expression", "level", "even", "in", "control", "astrocytes", ".", "Knockdown", "efficiency", "of", "Axl", "and", "Mertk", "was", "quantified", "from", "western", "blots", ".", "Results", "are", "normalized", "to", "Gapdh", "or", "GAPDH", ",", "and", "are", "shown", "as", "ratios", "to", "the", "value", "of", "non", "-", "transfected", "astrocytes", ".", "F", ",", "G", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "microglial", "debris", "uptake", "by", "cultured", "astrocytes", ".", "After", "knockdown", "of", "TAM", "family", "members", ",", "astrocytes", "were", "co", "-", "cultured", "with", "fluorescence", "-", "labelled", "apoptotic", "microglia", ".", "Fluorescence", "of", "internalized", "microglial", "debris", "in", "GLAST", "+", "astrocytes", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "repeated", "measures", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "ratios", "to", "the", "value", "of", "non", "-", "transfected", "astrocytes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Cultured astrocytes engulf microglial debris. CAG-EGFP mouse-derived primary astrocytes were co-cultured with or without fluorescence-labelled apoptotic microglia. (A) Fluorescence images of GFP (green), microglial debris (red) and GFAP immunoreactivity (blue). Images were acquired using the same laser power and sensitivity, and image processing was the same in the two images (red). Scale bar, 50 µm.(B) Fluorescence images of GFP (green), microglial debris (red) and LAMP-1 immunoreactivity (cyan). Scale bar, 30 µm and 5 µm (inset).C Flow cytometric analysis of uptake of microglial debris by cultured astrocytes. Fluorescence of internalized microglial debris was measured in GLAST+ astrocytes co-cultured with or without fluorescence-labelled apoptotic microglia.D Expression of TAM family members and their knockdown by siRNA in cultured astrocytes. Tyro3, Axl and Metk in cultured astrocytes or hippocampal tissue were examined by western blotting. Arrows indicate the corresponding protein band(s). The secondary antibody against goat IgG generates a ~115 kDa non-specific band. The ~115 kDa band in the Axl image is the Axl-specific band overlapping the non-specific band. The ~115 kDa band in the Mertk image is the non-specific band. Axl and Mertk expression was knocked down by two siRNAs. GAPDH expression is shown as an internal control. E Quantification of siRNA knockdown in cultured astrocytes (n = 3 independent experiments, one-way ANOVA with repeated measures). Knockdown of Tyro3 mRNA was examined by qPCR because of the very low expression level even in control astrocytes. Knockdown efficiency of Axl and Mertk was quantified from western blots. Results are normalized to Gapdh or GAPDH, and are shown as ratios to the value of non-transfected astrocytes.F, G Flow cytometric analysis of microglial debris uptake by cultured astrocytes. After knockdown of TAM family members, astrocytes were co-cultured with fluorescence-labelled apoptotic microglia. Fluorescence of internalized microglial debris in GLAST+ astrocytes was quantified by flow cytometry (n = 4 independent experiments, one-way ANOVA with repeated measures). Results are shown as ratios to the value of non-transfected astrocytes."}
{"words": ["Figure", "7B", "Representative", "images", "of", "microglial", "distribution", "in", "the", "cerebral", "cortex", "of", "WT", "and", "mutant", "mice", "at", "3", "w", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Iba1", "or", "anti", "-", "CD11b", "antibodies", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "100", "µm", ".", "C", "Quantification", "of", "microglial", "number", "(", "n", "=", "5", "animals", "per", "group", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "Note", "that", "Irf8", "-", "/", "-", "mice", "were", "analyzed", "by", "CD11b", "immunostaining", ",", "while", "other", "strains", "were", "analyzed", "by", "Iba1", "staining", ".", "D", "Representative", "images", "of", "a", "spontaneous", "apoptotic", "cell", "and", "surrounding", "glial", "cells", "in", "the", "cerebral", "cortex", "of", "WT", "and", "Irf8", "-", "/", "-", "mice", "at", "3", "w", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "anti", "-", "GFAP", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "CD11b", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "cleaved", "caspase", "-", "3", "(", "blue", ")", "antibodies", ".", "3D", "images", "(", "lower", "row", ")", "were", "reconstructed", "from", "confocal", "images", "(", "upper", "row", ")", "using", "Imaris", "software", ".", "Arrows", "indicate", "cleaved", "caspase", "-", "3", "+", "apoptotic", "cells", ".", "Insets", "are", "higher", "magnification", "images", "around", "apoptotic", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", " ", "20", "µm", "and", "5", "µm", "(", "insets", ")", ".", "E", "Percentage", "of", "spontaneous", "apoptotic", "cells", "surrounded", "by", "microglia", "in", "WT", "and", "mutant", "mice", ".", "3D", "images", "reconstructed", "from", "confocal", "images", "were", "analyzed", "(", "n", "=", "36", "-", "50", "cells", "from", "five", "animals", "per", "group", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "post", "hoc", "Dunn", "'", "s", "test", ")", ".", "F", "Percentage", "of", "spontaneous", "apoptotic", "cells", "surrounded", "by", "astrocyte", "processes", "in", "WT", "and", "mutant", "mice", "(", "n", "=", "36", "-", "50", "cells", "from", "five", "animals", "per", "group", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B Representative images of microglial distribution in the cerebral cortex of WT and mutant mice at 3 w. Sections were stained with anti-Iba1 or anti-CD11b antibodies (red). Scale bar, 100 µm. C Quantification of microglial number (n = 5 animals per group, one-way ANOVA). Note that Irf8-/- mice were analyzed by CD11b immunostaining, while other strains were analyzed by Iba1 staining.  D Representative images of a spontaneous apoptotic cell and surrounding glial cells in the cerebral cortex of WT and Irf8-/- mice at 3 w. Sections were stained with anti-GFAP (green), anti-CD11b (red) and anti-cleaved caspase-3 (blue) antibodies. 3D images (lower row) were reconstructed from confocal images (upper row) using Imaris software. Arrows indicate cleaved caspase-3+ apoptotic cells. Insets are higher magnification images around apoptotic cells. Scale bar, 20 µm and 5 µm (insets). E Percentage of spontaneous apoptotic cells surrounded by microglia in WT and mutant mice. 3D images reconstructed from confocal images were analyzed (n = 36-50 cells from five animals per group, Kruskal-Wallis test with post hoc Dunn's test). F Percentage of spontaneous apoptotic cells surrounded by astrocyte processes in WT and mutant mice (n = 36-50 cells from five animals per group, one-way ANOVA with post hoc Tukey's test). "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "pS65", "-", "Ub", "(", "left", ")", "and", "total", "Ub", "(", "right", ")", "immunoblots", "of", "mitochondria", "-", "enriched", "fractions", "from", "wild", "-", "type", "flies", "treated", "3", "days", "with", "either", "paraquat", "or", "vehicle", "(", "sucrose", ")", ".", "(", "D", ")", "Immunoblots", "for", "the", "indicated", "antibodies", "following", "subcellular", "fractionation", "of", "flies", "treated", "with", "paraquat", "for", "3", "days", ".", "T", ",", "total", "lysate", ";", "N", ",", "nuclear", "-", "enriched", "fraction", ";", "M", ",", "mitochondria", "-", "enriched", "fraction", ";", "S", ",", "post", "-", "mitochondrial", "supernatant", ".", "(", "E", ")", "Immunoblots", "for", "the", "indicated", "antibodies", "of", "(", "T", ")", "total", "lysates", "or", "(", "M", ")", "mitochondria", "-", "enriched", "fractions", "from", "fly", "heads", "(", "with", "proboscises", "removed", ")", "and", "bodies", "(", "thoraces", "and", "abdomens", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) pS65-Ub (left) and total Ub (right) immunoblots of mitochondria-enriched fractions from wild-type flies treated 3 days with either paraquat or vehicle (sucrose).(D) Immunoblots for the indicated antibodies following subcellular fractionation of flies treated with paraquat for 3 days. T, total lysate; N, nuclear-enriched fraction; M, mitochondria-enriched fraction; S, post-mitochondrial supernatant.(E) Immunoblots for the indicated antibodies of (T) total lysates or (M) mitochondria-enriched fractions from fly heads (with proboscises removed) and bodies (thoraces and abdomens)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "pS65", "-", "Ub", "immunoblot", "of", "mitochondria", "-", "enriched", "fractions", "following", "the", "paraquat", "pulse", "-", "chase", "assay", "in", "wild", "-", "type", "and", "park", "-", "/", "-", "flies", ".", "UT", ",", "untreated", ";", "PQ", ",", "1", "-", "day", "paraquat", "treatment", ";", "Recovery", ",", "flies", "removed", "from", "paraquat", "and", "returned", "to", "normal", "food", ".", "Asterisk", "(", "*", ")", "denotes", "non", "-", "specific", "band", ".", "(", "D", ")", "pS65", "-", "Ub", "lane", "densitometry", "analysis", "of", "n", "=", "3", "independent", "replicates", "from", "(", "C", ")", ",", "expressed", "relative", "to", "the", "most", "intense", "lane", "signal", "in", "each", "blot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) pS65-Ub immunoblot of mitochondria-enriched fractions following the paraquat pulse-chase assay in wild-type and park-/- flies. UT, untreated; PQ, 1-day paraquat treatment; Recovery, flies removed from paraquat and returned to normal food. Asterisk (*) denotes non-specific band. (D) pS65-Ub lane densitometry analysis of n = 3 independent replicates from (C), expressed relative to the most intense lane signal in each blot."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "B", ")", "pS65", "-", "Ub", "immunoblot", "of", "whole", "-", "animal", "lysates", "from", "untreated", "flies", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "park", "RNAi", "was", "induced", "by", "da", "-", "GAL4", "(", "ubiquitous", ")", ",", "Mef2", "-", "GAL4", "(", "muscle", ")", "or", "nSyb", "-", "GAL4", "(", "neurons", ")", ".", "(", "C", ")", "pS65", "-", "Ub", "immunoblot", "of", "lysates", "from", "bodies", "or", "heads", "(", "without", "proboscises", ")", ",", "as", "indicated", ",", "from", "park", "-", "/", "-", "animals", ".", "(", "E", ")", "Higher", "magnification", "image", "of", "pS65", "-", "Ub", "positive", "structures", "in", "flight", "muscle", "counterstained", "for", "ATP5A", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "Chart", "shows", "quantification", "of", "ATP5A", "levels", "of", "pS65", "-", "Ub", "-", "positive", "(", "+", "ve", ")", "versus", "-", "negative", "(", "-", "ve", ")", "mitochondrial", "structures", "from", "3", "biological", "replicates", "(", "4", "-", "7", "images", "per", "animal", ";", "average", "per", "animal", "shown", "in", "open", "circles", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-B) pS65-Ub immunoblot of whole-animal lysates from untreated flies of the indicated genotypes. park RNAi was induced by da-GAL4 (ubiquitous), Mef2-GAL4 (muscle) or nSyb-GAL4 (neurons). (C) pS65-Ub immunoblot of lysates from bodies or heads (without proboscises), as indicated, from park-/- animals.(E) Higher magnification image of pS65-Ub positive structures in flight muscle counterstained for ATP5A. Scale bar = 5 μm. Chart shows quantification of ATP5A levels of pS65-Ub-positive (+ve) versus -negative (-ve) mitochondrial structures from 3 biological replicates (4-7 images per animal; average per animal shown in open circles)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "pS65", "-", "Ub", "immunoblot", "of", "whole", "-", "animal", "lysates", "from", "wild", "-", "type", ",", "Atg5", "-", "and", "park", "-", "/", "-", "animals", "harvested", "at", "the", "indicated", "ages", ".", "(", "B", ")", "pS65", "-", "Ub", "immunoblot", "of", "whole", "-", "animal", "lysates", "from", "young", "animals", "of", "the", "following", "genotypes", ":", "wild", "-", "type", ",", "Pink1", "-", ",", "park", "-", "/", "-", ",", "park", "RNAi", "(", "daG4", ">", "UAS", "-", "park", "RNAi", ")", ",", "Atg1", "RNAi", "(", "daG4", ">", "UAS", "-", "Atg1", "RNAi", ")", ",", "Atg8a", "-", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) pS65-Ub immunoblot of whole-animal lysates from wild-type, Atg5- and park-/- animals harvested at the indicated ages.(B) pS65-Ub immunoblot of whole-animal lysates from young animals of the following genotypes: wild-type, Pink1-, park-/-, park RNAi (daG4>UAS-park RNAi), Atg1 RNAi (daG4>UAS-Atg1 RNAi), Atg8a-."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "G", ")", "Representative", "images", "of", "pS65", "-", "Ub", "immunostaining", "false", "-", "coloured", "for", "intensity", "(", "Fire", "LUT", ")", "in", "muscle", "segments", "6", "/", "7", "from", "wandering", "L3", "larvae", "of", "the", "following", "genotypes", ":", "(", "A", ")", "wild", "type", ",", "(", "B", ")", "Pink1", "-", ",", "(", "C", ")", "park", "-", "/", "-", ",", "(", "D", ")", "Atg5", "-", ",", "(", "E", ")", "Atg8a", "-", ",", "(", "F", ")", "Atg5", "-", ";", "park", "-", "/", "-", ",", "(", "G", ")", "Atg8a", "-", ";", "park", "-", "/", "-", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "number", "of", "pS65", "-", "Ub", "puncta", "from", "A", "-", "G", "displaying", "mean", "+", "/", "-", "SEM", "from", "the", "indicated", "number", "of", "animals", "(", "n", "=", "3", "-", "5", "as", "indicated", ")", ".", "(", "I", ")", "Puncta", "volume", "from", "C", "-", "G", "expressed", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", "(", "n", "=", "4", "-", "5", "animals", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-G) Representative images of pS65-Ub immunostaining false-coloured for intensity (Fire LUT) in muscle segments 6/7 from wandering L3 larvae of the following genotypes: (A) wild type, (B) Pink1-, (C) park-/-, (D) Atg5-, (E) Atg8a-, (F) Atg5-; park-/-, (G) Atg8a-; park-/-. (H) Quantification of number of pS65-Ub puncta from A-G displaying mean +/- SEM from the indicated number of animals (n = 3-5 as indicated). (I) Puncta volume from C-G expressed as mean +/- SEM (n = 4-5 animals)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "pS65", "-", "Ub", "immunoblot", "of", "whole", "-", "animal", "lysates", "following", "paraquat", "pulse", "-", "chase", "assay", "of", "Atg5", "-", "flies", "with", "parkin", "overexpression", "(", "OE", ")", "(", "Atg55cc5", "daG4", ">", "UAS", "-", "park", ")", "compared", "with", "Atg5", "-", "flies", "overexpressing", "mitochondrially", "targeted", "GFP", "(", "Atg55cc5", "daG4", ">", "UAS", "-", "mito", "-", "HA", "-", "GFP", ")", ".", "UT", ",", "untreated", "flies", ";", "PQ", ",", "1", "-", "day", "paraquat", "treatment", ";", "Recovery", ",", "flies", "removed", "from", "paraquat", "and", "returned", "to", "normal", "food", ".", "(", "B", ")", "pS65", "-", "Ub", "lane", "densitometry", ",", "normalised", "to", "total", "protein", "(", "RevertTM", "stain", ")", ",", "of", "n", "=", "3", "independent", "replicates", "of", "(", "A", ")", ",", "expressed", "as", "pS65", "-", "Ub", "intensity", "relative", "to", "the", "most", "intense", "band", "in", "each", "blot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) pS65-Ub immunoblot of whole-animal lysates following paraquat pulse-chase assay of Atg5- flies with parkin overexpression (OE) (Atg55cc5 daG4>UAS-park) compared with Atg5- flies overexpressing mitochondrially targeted GFP (Atg55cc5 daG4>UAS-mito-HA-GFP). UT, untreated flies; PQ, 1-day paraquat treatment; Recovery, flies removed from paraquat and returned to normal food.(B) pS65-Ub lane densitometry, normalised to total protein (RevertTM stain), of n = 3 independent replicates of (A), expressed as pS65-Ub intensity relative to the most intense band in each blot."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Western", "blot", "revealed", "with", "anti", "-", "I", "-", "Abβ", "JV2", "antibody", ".", "WCL", ":", "whole", "cell", "lysate", "of", "MutuDC", "+", "pRBC", ";", "S0", ":", "supernatant", "following", "incubation", "with", "protein", "-", "G", "beads", ";", "S1", ":", "1st", "wash", "of", "protein", "-", "G", "beads", ";", "IP", "MHC", "II", ":", "eluates", "from", "Y", "-", "3P", "-", "immunoprecipitated", "MHC", "II", ",", "boiled", "or", "not", ".", "Representative", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Venn", "diagram", "of", "unique", "peptides", "from", "P", ".", "berghei", "(", "left", ")", "and", "Mus", "musculus", "(", "right", ")", "identified", "in", "the", "experiments", "performed", "with", "PbK", "pRBC", "(", "blue", ")", "and", "PbA", "pRBC", "(", "orange", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Western blot revealed with anti-I-Abβ JV2 antibody. WCL: whole cell lysate of MutuDC + pRBC ; S0: supernatant following incubation with protein-G beads ; S1: 1st wash of protein-G beads ; IP MHC II: eluates from Y-3P-immunoprecipitated MHC II, boiled or not. Representative of 2 independent experiments.(C) Venn diagram of unique peptides from P. berghei (left) and Mus musculus (right) identified in the experiments performed with PbK pRBC (blue) and PbA pRBC (orange)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Gating", "strategy", "to", "calculate", "the", "proportion", "of", "CD11a", "+", "CD49d", "+", "activated", "CD4", "T", "cells", "that", "produce", "IFN", "and", "TNF", "in", "response", "to", "MutuDC", "loaded", "with", "RBC", ",", "PbA", "pRBC", ",", "OVA", "peptide", "(", "IR17", ")", "or", "ETRAMP10", ".", "2", "peptide", "(", "NL17", ")", ".", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "IFN", "/", "TNF", "-", "double", "producing", "cells", "among", "activated", "CD4", "T", "cells", "for", "each", "peptide", ".", "Basal", "level", "with", "MutuDC", "alone", "was", "subtracted", ".", "C", ",", "D", ":", "Data", "show", "the", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ".", "Asterisks", "show", "statistical", "significance", "assessed", "by", "paired", "non", "-", "parametric", "Wilcoxon", "tests", "in", "comparison", "with", "OVA", "peptide", ".", "AMA1", ",", "P", "=", "0", ".", "0098", ";", "TIM14", ",", "P", "=", "0", ".", "078", ";", "ENO", ",", "P", "=", "0", ".", "016", ";", "GAPDH", ".", "1", ",", "P", "=", "0", ".", "002", ";", "MAHRP", ",", "P", "=", "0", ".", "0039", ";", "EF1α", ",", "P", "=", "0", ".", "0039", ";", "M1", ",", "P", "=", "0", ".", "016", ";", "MSP1", ",", "P", "=", "0", ".", "031", ";", "LDH", ",", "P", "=", "0", ".", "062", ";", "ETRAMP", ",", "P", "=", "0", ".", "001", ";", "ATPSYN", ",", "P", "=", "0", ".", "25", ";", "END70", ",", "P", "=", "0", ".", "25", ";", "PDI", ",", "P", "=", "0", ".", "16", ";", "GAPDH", ".", "2", ",", "P", "=", "0", ".", "99", ";", "pRBC", ",", "P", "=", "0", ".", "001", ".", "N", "=", "6", "mice", "for", "ATPSYN", ",", "END70", ",", "PDI", ",", "GAPDH", ".", "2", ",", "N", "=", "11", "mice", "for", "all", "other", "peptides", ",", "pooled", "from", "3", "replicates", ".", "(", "D", ")", "Hierarchy", "of", "immunodominance", ",", "depicted", "as", "the", "percentage", "of", "each", "peptide", "-", "specific", "response", "with", "respect", "to", "the", "total", "parasite", "-", "specific", "response", "obtained", "with", "PbA", "pRBC", "-", "loaded", "MutuDC", ".", "C", ",", "D", ":", "Data", "show", "the", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ".", "Asterisks", "show", "statistical", "significance", "assessed", "by", "paired", "non", "-", "parametric", "Wilcoxon", "tests", "in", "comparison", "with", "OVA", "peptide", ".", "AMA1", ",", "P", "=", "0", ".", "0098", ";", "TIM14", ",", "P", "=", "0", ".", "078", ";", "ENO", ",", "P", "=", "0", ".", "016", ";", "GAPDH", ".", "1", ",", "P", "=", "0", ".", "002", ";", "MAHRP", ",", "P", "=", "0", ".", "0039", ";", "EF1α", ",", "P", "=", "0", ".", "0039", ";", "M1", ",", "P", "=", "0", ".", "016", ";", "MSP1", ",", "P", "=", "0", ".", "031", ";", "LDH", ",", "P", "=", "0", ".", "062", ";", "ETRAMP", ",", "P", "=", "0", ".", "001", ";", "ATPSYN", ",", "P", "=", "0", ".", "25", ";", "END70", ",", "P", "=", "0", ".", "25", ";", "PDI", ",", "P", "=", "0", ".", "16", ";", "GAPDH", ".", "2", ",", "P", "=", "0", ".", "99", ";", "pRBC", ",", "P", "=", "0", ".", "001", ".", "N", "=", "6", "mice", "for", "ATPSYN", ",", "END70", ",", "PDI", ",", "GAPDH", ".", "2", ",", "N", "=", "11", "mice", "for", "all", "other", "peptides", ",", "pooled", "from", "3", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Gating strategy to calculate the proportion of CD11a+ CD49d+ activated CD4 T cells that produce IFN and TNF in response to MutuDC loaded with RBC, PbA pRBC, OVA peptide (IR17) or ETRAMP10.2 peptide (NL17).(C) Percentage of IFN/TNF-double producing cells among activated CD4 T cells for each peptide. Basal level with MutuDC alone was subtracted. C,D: Data show the mean +/- SEM. Asterisks show statistical significance assessed by paired non-parametric Wilcoxon tests in comparison with OVA peptide. AMA1, P = 0.0098 ; TIM14, P = 0.078 ; ENO, P = 0.016 ; GAPDH.1, P = 0.002 ; MAHRP, P = 0.0039 ; EF1α, P = 0.0039 ; M1, P = 0.016 ; MSP1, P = 0.031 ; LDH, P = 0.062 ; ETRAMP, P = 0.001 ; ATPSYN, P = 0.25 ; END70, P = 0.25 ; PDI, P = 0.16 ; GAPDH.2, P = 0.99 ; pRBC, P = 0.001. N = 6 mice for ATPSYN, END70, PDI, GAPDH.2, N = 11 mice for all other peptides, pooled from 3 replicates.(D) Hierarchy of immunodominance, depicted as the percentage of each peptide-specific response with respect to the total parasite-specific response obtained with PbA pRBC-loaded MutuDC. C,D: Data show the mean +/- SEM. Asterisks show statistical significance assessed by paired non-parametric Wilcoxon tests in comparison with OVA peptide. AMA1, P = 0.0098 ; TIM14, P = 0.078 ; ENO, P = 0.016 ; GAPDH.1, P = 0.002 ; MAHRP, P = 0.0039 ; EF1α, P = 0.0039 ; M1, P = 0.016 ; MSP1, P = 0.031 ; LDH, P = 0.062 ; ETRAMP, P = 0.001 ; ATPSYN, P = 0.25 ; END70, P = 0.25 ; PDI, P = 0.16 ; GAPDH.2, P = 0.99 ; pRBC, P = 0.001. N = 6 mice for ATPSYN, END70, PDI, GAPDH.2, N = 11 mice for all other peptides, pooled from 3 replicates."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "IFN", "/", "TNF", "-", "double", "producing", "cells", "among", "activated", "CD4", "T", "cells", ",", "after", "subtracting", "the", "basal", "level", "with", "MutuDC", "alone", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ")", ".", "Asterisks", "show", "statistical", "significance", "assessed", "by", "paired", "non", "-", "parametric", "Wilcoxon", "tests", "in", "comparison", "with", "OVA", "peptide", ".", "AMA1", ",", "P", "=", "0", ".", "027", ";", "TIM14", ",", "P", "=", "0", ".", "84", ";", "ENO", ",", "P", "=", "0", ".", "84", ";", "GAPDH", ".", "1", ",", "P", "=", "0", ".", "002", ";", "MAHRP", ",", "P", "=", "0", ".", "71", ";", "EF1α", ",", "P", "=", "0", ".", "001", ";", "M1", ",", "P", "=", "0", ".", "032", ";", "MSP1", ",", "P", "=", "0", ".", "23", ";", "LDH", ",", "P", "=", "0", ".", "016", ";", "ETRAMP", ",", "P", "=", "0", ".", "064", ";", "ATPSYN", ",", "P", "=", "0", ".", "77", ";", "END70", ",", "P", "=", "0", ".", "097", ";", "PDI", ",", "P", "=", "0", ".", "0052", ";", "GAPDH", ".", "2", ",", "P", "=", "0", ".", "19", ";", "pRBC", ",", "P", "=", "0", ".", "001", ".", "N", "=", "15", "mice", "pooled", "from", "3", "replicates", ".", "(", "C", ")", "Blood", "parasitemia", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ")", "monitored", "by", "flow", "cytometry", "after", "inoculation", "of", "5x104", "PbA", ".", "GFP", "spz", "in", "B6", "mice", ",", "treated", "(", "open", "squares", ")", "or", "not", "(", "black", "squares", ")", "with", "CQ", "at", "day", "6", "and", "7", "pi", ",", "in", "order", "to", "avoid", "ECM", "without", "blunting", "infection", ".", "Day", "6", ",", "P", "=", "0", ".", "29", ";", "Day", "7", ",", "P", "=", "0", ".", "0013", "by", "multiple", "unpaired", "t", "-", "tests", ".", "(", "D", ")", "IFN", "/", "TNF", "-", "double", "producing", "cells", "among", "activated", "CD4", "T", "cells", ",", "at", "day", "14", "pi", "following", "CQ", "treatment", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ")", ".", "Basal", "level", "with", "MutuDC", "alone", "was", "subtracted", ".", "GAPDH", ".", "1", ",", "P", "=", "0", ".", "99", ";", "EF1α", ",", "P", "=", "0", ".", "062", ";", "ETRAMP", ",", "P", "=", "0", ".", "031", ";", "pRBC", ",", "P", "=", "0", ".", "031", "by", "paired", "non", "-", "parametric", "Wilcoxon", "tests", "in", "comparison", "with", "OVA", "peptide", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) IFN/TNF-double producing cells among activated CD4 T cells, after subtracting the basal level with MutuDC alone (mean +/- SEM). Asterisks show statistical significance assessed by paired non-parametric Wilcoxon tests in comparison with OVA peptide. AMA1, P = 0.027 ; TIM14, P = 0.84 ; ENO, P = 0.84 ; GAPDH.1, P = 0.002 ; MAHRP, P = 0.71; EF1α, P = 0.001 ; M1, P = 0.032 ; MSP1, P = 0.23 ; LDH, P = 0.016 ; ETRAMP, P = 0.064 ; ATPSYN, P = 0.77 ; END70, P = 0.097 ; PDI, P = 0.0052 ; GAPDH.2, P = 0.19 ; pRBC, P = 0.001. N = 15 mice pooled from 3 replicates.(C) Blood parasitemia (mean +/- SEM) monitored by flow cytometry after inoculation of 5x104 PbA.GFP spz in B6 mice, treated (open squares) or not (black squares) with CQ at day 6 and 7 pi, in order to avoid ECM without blunting infection. Day 6, P = 0.29 ; Day 7, P = 0.0013 by multiple unpaired t-tests.(D) IFN/TNF-double producing cells among activated CD4 T cells, at day 14 pi following CQ treatment (mean +/- SEM). Basal level with MutuDC alone was subtracted. GAPDH.1, P = 0.99 ; EF1α, P = 0.062 ; ETRAMP, P = 0.031 ; pRBC, P = 0.031 by paired non-parametric Wilcoxon tests in comparison with OVA peptide."}
{"words": ["Figure", "4", "Figure", "4", ".", "cDC1", "are", "superior", "to", "other", "spleen", "antigen", "-", "presenting", "cells", "for", "MHC", "II", "presentation", "of", "PbA", "and", "non", "-", "PbA", "antigens", "(", "A", ")", "Gating", "strategy", "for", "FACS", "-", "sorting", "pDC", "(", "Lin", "-", "CD11clo", "B220", "+", "Ly6C", "+", ")", ",", "cDC1", "(", "Lin", "-", "CD11c", "+", "CD8α", "+", ")", ",", "cDC2", "(", "Lin", "-", "CD11c", "+", "CD8α", "-", ")", "and", "a", "mix", "of", "macrophages", "moDC", "(", "Lin", "-", "CD11c", "-", "CD11b", "+", "Ly6C", "+", ")", "from", "spleens", "of", "mice", "infected", "for", "6", "days", "with", "PbA", "pRBC", ".", "(", "B", ")", "I", "-", "Ab", "presentation", "of", "ETRAMP10", ".", "2", "peptide", "by", "the", "indicated", "APC", ",", "measured", "with", "BEZ", "hybridomas", ".", "PbA", "pRBC", "-", "loaded", "MutuDC", "were", "used", "as", "controls", ".", "Representative", "of", "2", "experiments", "with", "4", "infected", "mice", "pooled", "per", "replicate", ".", "(", "C", ")", "Fold", "-", "change", "surface", "expression", "of", "I", "-", "Ab", "in", "cDC2", "over", "cDC1", "in", "day", "6", "-", "infected", "mice", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", "of", "5", "experiments", ")", ".", "Difference", "is", "not", "significant", "based", "on", "unpaired", "t", "-", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ".", "(", "D", ",", "E", ",", "F", ")", "I", "-", "Ab", "presentation", "of", "non", "-", "PbA", "antigens", "by", "cDC", "isolated", "from", "day", "6", "PbA", "-", "infected", "mice", ".", "(", "D", ")", "I", "-", "Ab", "-", "AS15", "presentation", "after", "exogenous", "addition", "of", "AS15", "peptide", "at", "the", "indicated", "concentrations", ",", "assessed", "with", "the", "BTg01Z", "hybridomas", ".", "Dotted", "line", "in", "D", ",", "E", ",", "F", ",", "H", ",", "I", "shows", "the", "basal", "response", "of", "the", "hybridomas", "in", "the", "absence", "of", "antigen", ".", "(", "D", ",", "E", ",", "F", ")", "I", "-", "Ab", "presentation", "of", "non", "-", "PbA", "antigens", "by", "cDC", "isolated", "from", "day", "6", "PbA", "-", "infected", "mice", ".", "(", "E", ")", "I", "-", "Ab", "-", "AS15", "presentation", "by", "DC", "incubated", "with", "heat", "-", "killed", "T", ".", "gondii", "at", "the", "indicated", "ratio", ",", "assessed", "with", "the", "BTg01Z", "hybridomas", ".", "Dotted", "line", "in", "D", ",", "E", ",", "F", ",", "H", ",", "I", "shows", "the", "basal", "response", "of", "the", "hybridomas", "in", "the", "absence", "of", "antigen", ".", "(", "D", ",", "E", ",", "F", ")", "I", "-", "Ab", "presentation", "of", "non", "-", "PbA", "antigens", "by", "cDC", "isolated", "from", "day", "6", "PbA", "-", "infected", "mice", ".", "(", "F", ")", "I", "-", "Ab", "-", "IR17", "presentation", "by", "DC", "incubated", "with", "OVA", "-", "expressing", "E", ".", "coli", "at", "the", "indicated", "ratio", ",", "assessed", "with", "the", "OTIIZ", "hybridomas", ".", "PbA", "pRBC", "-", "loaded", "MutuDC", "were", "used", "as", "controls", ".", "D", ",", "E", ",", "F", ":", "representative", "of", "2", "experiments", "with", "4", "infected", "mice", "pooled", "per", "replicate", ".", "Dotted", "line", "in", "D", ",", "E", ",", "F", ",", "H", ",", "I", "shows", "the", "basal", "response", "of", "the", "hybridomas", "in", "the", "absence", "of", "antigen", ".", "(", "G", ")", "In", "vivo", "pRBC", "uptake", "by", "cDC1", "(", "XCR1", "+", "CD172a", "-", ")", "and", "cDC2", "(", "XCR1", "-", "CD172a", "+", ")", "analyzed", "at", "6", "days", "post", "-", "infection", "with", "PbA", ".", "GFP", ".", "Gates", "were", "positioned", "based", "on", "the", "auto", "-", "fluorescence", "of", "the", "cDC", "subset", "in", "day", "6", "PbA", "-", "infected", "mice", ".", "As", "GFP", "+", "events", "are", "rare", ",", "107", "events", "were", "acquired", "for", "each", "mouse", ".", "Symbols", "show", "the", "mean", "percentage", "+", "/", "-", "SEM", "(", "N", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", "of", "GFP", "+", "cells", "in", "each", "DC", "subset", ".", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "0005", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "without", "assuming", "consistent", "SD", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "I", "-", "Ab", "presentation", "by", "cDC", "isolated", "from", "naïve", "mice", ".", "(", "H", ")", "I", "-", "Ab", "-", "NL17", "presentation", "by", "DC", "incubated", "with", "PbA", "pRBC", "at", "a", "ratio", "of", "5", ":", "1", ",", "assessed", "with", "the", "BEZ", "hybridomas", ".", "H", ",", "I", ":", "representative", "of", "2", "independent", "experiments", "with", "20", "naïve", "mice", "pooled", "per", "experiment", ".", "Dotted", "line", "in", "D", ",", "E", ",", "F", ",", "H", ",", "I", "shows", "the", "basal", "response", "of", "the", "hybridomas", "in", "the", "absence", "of", "antigen", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "I", "-", "Ab", "presentation", "by", "cDC", "isolated", "from", "naïve", "mice", ".", "(", "I", ")", "I", "-", "Ab", "-", "IR17", "presentation", "by", "DC", "incubated", "with", "OVA", "-", "expressing", "E", ".", "coli", "at", "a", "ratio", "of", "20", ":", "1", ",", "assessed", "with", "the", "OTIIZ", "hybridomas", ".", "H", ",", "I", ":", "representative", "of", "2", "independent", "experiments", "with", "20", "naïve", "mice", "pooled", "per", "experiment", ".", "Dotted", "line", "in", "D", ",", "E", ",", "F", ",", "H", ",", "I", "shows", "the", "basal", "response", "of", "the", "hybridomas", "in", "the", "absence", "of", "antigen", ".", "(", "J", ")", "Fold", "-", "change", "surface", "expression", "of", "I", "-", "Ab", "in", "cDC2", "over", "cDC1", "in", "naïve", "mice", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", "of", "4", "experiments", ")", ".", "Difference", "is", "not", "significant", "based", "on", "unpaired", "t", "-", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 Figure 4. cDC1 are superior to other spleen antigen-presenting cells for MHC II presentation of PbA and non-PbA antigens (A) Gating strategy for FACS-sorting pDC (Lin- CD11clo B220+ Ly6C+), cDC1 (Lin- CD11c+ CD8α+), cDC2 (Lin- CD11c+ CD8α-) and a mix of macrophages moDC (Lin- CD11c- CD11b+ Ly6C+) from spleens of mice infected for 6 days with PbA pRBC. (B) I-Ab presentation of ETRAMP10.2 peptide by the indicated APC, measured with BEZ hybridomas. PbA pRBC-loaded MutuDC were used as controls. Representative of 2 experiments with 4 infected mice pooled per replicate.(C) Fold-change surface expression of I-Ab in cDC2 over cDC1 in day 6-infected mice (mean +/- SEM of 5 experiments). Difference is not significant based on unpaired t-test with Welch's correction.(D,E,F) I-Ab presentation of non-PbA antigens by cDC isolated from day 6 PbA-infected mice. (D) I-Ab-AS15 presentation after exogenous addition of AS15 peptide at the indicated concentrations, assessed with the BTg01Z hybridomas.Dotted line in D,E,F,H,I shows the basal response of the hybridomas in the absence of antigen.(D,E,F) I-Ab presentation of non-PbA antigens by cDC isolated from day 6 PbA-infected mice. (E) I-Ab-AS15 presentation by DC incubated with heat-killed T. gondii at the indicated ratio, assessed with the BTg01Z hybridomas. Dotted line in D,E,F,H,I shows the basal response of the hybridomas in the absence of antigen.(D,E,F) I-Ab presentation of non-PbA antigens by cDC isolated from day 6 PbA-infected mice. (F) I-Ab-IR17 presentation by DC incubated with OVA-expressing E. coli at the indicated ratio, assessed with the OTIIZ hybridomas. PbA pRBC-loaded MutuDC were used as controls. D,E,F: representative of 2 experiments with 4 infected mice pooled per replicate. Dotted line in D,E,F,H,I shows the basal response of the hybridomas in the absence of antigen.(G) In vivo pRBC uptake by cDC1 (XCR1+ CD172a-) and cDC2 (XCR1- CD172a+) analyzed at 6 days post-infection with PbA.GFP. Gates were positioned based on the auto-fluorescence of the cDC subset in day 6 PbA-infected mice. As GFP+ events are rare, 107 events were acquired for each mouse. Symbols show the mean percentage +/- SEM (N = 4 mice per group) of GFP+ cells in each DC subset. *, P = 0.0005 by unpaired t-test without assuming consistent SD.(H,I) I-Ab presentation by cDC isolated from naïve mice. (H) I-Ab-NL17 presentation by DC incubated with PbA pRBC at a ratio of 5:1, assessed with the BEZ hybridomas. H,I: representative of 2 independent experiments with 20 naïve mice pooled per experiment. Dotted line in D,E,F,H,I shows the basal response of the hybridomas in the absence of antigen.(H,I) I-Ab presentation by cDC isolated from naïve mice. (I) I-Ab-IR17 presentation by DC incubated with OVA-expressing E. coli at a ratio of 20:1, assessed with the OTIIZ hybridomas. H,I: representative of 2 independent experiments with 20 naïve mice pooled per experiment. Dotted line in D,E,F,H,I shows the basal response of the hybridomas in the absence of antigen.(J) Fold-change surface expression of I-Ab in cDC2 over cDC1 in naïve mice (mean +/- SEM of 4 experiments). Difference is not significant based on unpaired t-test with Welch's correction."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Gating", "strategy", "to", "assess", "efficiency", "of", "cDC1", "depletion", ".", "(", "C", ")", "Percentage", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ")", "of", "CD8α", "+", "out", "of", "Lin", "-", "B220", "-", "CD11c", "+", "MHC", "IIhi", "cells", ".", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "0043", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "(", "D", ")", "FACS", "plots", "showing", "the", "proportion", "of", "CD11a", "+", "CD49d", "+", "CD4", "T", "cells", "that", "produce", "IFN", "and", "TNF", "in", "response", "to", "MutuDC", "loaded", "with", "RBC", ",", "PbA", "pRBC", "or", "ETRAMP10", ".", "2", "peptide", ".", "(", "E", ")", "Proportion", "of", "CD11a", "+", "CD49d", "+", "CD4", "T", "cells", "that", "co", "-", "produce", "IFN", "and", "TNF", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ")", "in", "response", "to", "MutuDC", "loaded", "with", "the", "indicated", "antigen", ",", "isolated", "from", "Karma", "mice", "treated", "(", "open", "circles", ")", "or", "not", "(", "black", "circles", ")", "with", "DT", ".", "Asterisks", "show", "significant", "differences", "between", "no", "DT", "and", "+", "DT", "group", "by", "multiple", "unpaired", "t", "-", "tests", "without", "assuming", "consistent", "SD", ".", "RBC", ",", "P", "=", "0", ".", "18", ";", "GAPDH", ".", "1", ",", "P", "=", "0", ".", "019", ";", "EF1a", ",", "0", ".", "039", ";", "ETRAMP", ",", "P", "=", "0", ".", "00054", ";", "OVA", ",", "P", "=", "0", ".", "25", ";", "pRBC", ",", "P", "=", "0", ".", "015", ".", "(", "F", ")", "Absolute", "numbers", "of", "IFN", "+", "TNF", "+", "CD11a", "+", "CD49d", "+", "CD4", "+", "T", "cells", "responding", "to", "the", "indicated", "stimuli", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ")", ".", "GAPDH", ".", "1", ",", "P", "=", "0", ".", "0047", ";", "EF1a", ",", "0", ".", "00039", ";", "ETRAMP", ",", "P", "=", "0", ".", "00022", ";", "pRBC", ",", "P", "=", "0", ".", "00019", "by", "multiple", "unpaired", "t", "-", "tests", "without", "assuming", "consistent", "SD", ".", "(", "G", ")", "Blood", "parasitemia", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ")", "at", "day", "4", "and", "6", "pi", "in", "Karma", "mice", "treated", "(", "open", "circles", ")", "or", "not", "(", "black", "circles", ")", "with", "DT", ".", "Day", "4", ",", "P", "=", "0", ".", "022", ";", "Day", "6", ",", "P", "=", "0", ".", "77", "by", "multiple", "unpaired", "t", "-", "tests", "without", "assuming", "consistent", "SD", ".", "C", ",", "E", ",", "F", ",", "G", ":", "No", "DT", "group", ",", "N", "=", "5", "mice", ";", "+", "DT", "group", ",", "N", "=", "6", "mice", ".", "Representative", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Absolute", "numbers", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "producing", "IFN", ",", "TNF", "or", "IL", "-", "10", ",", "either", "individually", "or", "in", "combination", ",", "following", "restimulation", "with", "MutuDC", "+", "PbA", "pRBC", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ")", ".", "These", "cells", "are", "called", "cytokine", "+", "in", "the", "next", "panels", ".", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "0023", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "without", "assuming", "consistent", "SD", ".", "(", "I", ")", "Multifunctionality", "analysis", "(", "IFN", ",", "TNF", ",", "IL", "-", "10", ")", "of", "cytokine", "+", "T", "cells", "responding", "to", "MutuDC", "loaded", "with", "PbA", " ", "pRBC", ".", "(", "J", ")", "Proportion", "of", "IL", "-", "10", "+", " ", "IFN", "-", " ", "TNF", "-", "among", "cytokine", "+", "T", "cells", ",", "in", "response", "to", "MutuDC", "loaded", "with", "the", "indicated", "antigen", "(", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ")", ".", "GAPDH", ".", "1", ",", "P", "=", "0", ".", "32", ";", "EF1a", ",", "0", ".", "16", ";", "ETRAMP", ",", "P", "=", "8", ".", "5x10", "-", "5", ";", "OVA", ",", "P", "=", "0", ".", "11", ";", "pRBC", ",", "P", "=", "0", ".", "0015", "by", "multiple", "unpaired", "t", "-", "tests", "without", "assuming", "consistent", "SD", ".", "H", ",", "I", ",", "J", ":", "N", "=", "3", "mice", "per", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Gating strategy to assess efficiency of cDC1 depletion.(C) Percentage (mean +/- SEM) of CD8α+ out of Lin- B220- CD11c+ MHC IIhi cells. *, P = 0.0043 by Mann-Whitney test.(D) FACS plots showing the proportion of CD11a+ CD49d+ CD4 T cells that produce IFN and TNF in response to MutuDC loaded with RBC, PbA pRBC or ETRAMP10.2 peptide.(E) Proportion of CD11a+ CD49d+ CD4 T cells that co-produce IFN and TNF (mean +/- SEM) in response to MutuDC loaded with the indicated antigen, isolated from Karma mice treated (open circles) or not (black circles) with DT. Asterisks show significant differences between no DT and + DT group by multiple unpaired t-tests without assuming consistent SD. RBC, P = 0.18 ; GAPDH.1, P = 0.019 ; EF1a, 0.039 ; ETRAMP, P = 0.00054 ; OVA, P = 0.25 ; pRBC, P = 0.015.(F) Absolute numbers of IFN+ TNF+ CD11a+ CD49d+CD4+ T cells responding to the indicated stimuli (mean +/- SEM). GAPDH.1, P = 0.0047 ; EF1a, 0.00039 ; ETRAMP, P = 0.00022 ; pRBC, P = 0.00019 by multiple unpaired t-tests without assuming consistent SD.(G) Blood parasitemia (mean +/- SEM) at day 4 and 6 pi in Karma mice treated (open circles) or not (black circles) with DT. Day 4, P = 0.022 ; Day 6, P = 0.77 by multiple unpaired t-tests without assuming consistent SD. C,E,F,G: No DT group, N = 5 mice ; + DT group, N = 6 mice. Representative of 3 independent experiments.(H) Absolute numbers of CD4+ T cells producing IFN, TNF or IL-10, either individually or in combination, following restimulation with MutuDC+PbA pRBC (mean +/- SEM). These cells are called cytokine+ in the next panels. *, P = 0.0023 by unpaired t-test without assuming consistent SD.(I) Multifunctionality analysis (IFN, TNF, IL-10) of cytokine+ T cells responding to MutuDC loaded with PbA pRBC.(J) Proportion of IL-10+ IFN- TNF- among cytokine+ T cells, in response to MutuDC loaded with the indicated antigen (mean +/- SEM). GAPDH.1, P = 0.32 ; EF1a, 0.16 ; ETRAMP, P = 8.5x10-5 ; OVA, P = 0.11 ; pRBC, P = 0.0015 by multiple unpaired t-tests without assuming consistent SD. H,I,J: N = 3 mice per group."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ",", "b", ")", "Changes", "in", "HEK293T", "cell", "cytoplasmic", "(", "a", ")", "and", "mitochondrial", "(", "b", ")", "[", "Ca2", "+", "]", "in", "response", "to", "ionomycin", "(", "2", ".", "5", " ", "μM", ")", "were", "simultaneously", "measured", "by", "fluo", "-", "4", "and", "rhod", "-", "2", "imaging", ",", "respectively", ".", "Each", "bar", "represents", "one", "target", "gene", "silenced", "with", "pooled", "siRNA", ".", "(", "c", ")", "qrtPCR", "of", "MCU", ",", "MCUR1", "and", "MICU1", "mRNA", "from", "mouse", "tissues", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ";", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "(", "d", ")", "qrtPCR", "of", "MCUR1", "mRNA", "from", "HEK293T", "cell", "clones", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ";", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "KD", ",", "knockdown", ".", "Neg", "shRNA", ",", "negative", "shRNA", ".", "(", "e", ")", "qrtPCR", "of", "MCUR1", "mRNA", "from", "HeLa", "cell", "clones", "and", "of", "rescued", "MCUR1", "mRNA", "levels", "in", "shHe2", "clone", "cells", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ";", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "The", "same", "lentiviral", "shRNAs", "were", "used", "to", "generate", "shHK4", "and", "shHe1", "and", "shHK5", "and", "shHe2", ",", "respectively", ".", "(", "f", ")", "MCUR1", "protein", "expression", "levels", "(", "top", ")", "and", "densitometric", "analysis", "(", "bottom", "left", ")", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ";", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "Bottom", "right", ",", "Flag", "-", "tagged", "MCUR1", "protein", "expression", "in", "clone", "shHe2", "cells", "reconstituted", "with", "shRNA", "-", "resistant", "MCUR1", "cDNA", "plasmid", ".", "WB", ",", "western", "blot", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "Representative", "images", "from", "movies", "of", "HEK293T", "negative", "shRNA", "or", "shHK5", "cells", "showing", "cytosolic", "(", "green", ")", "and", "mitochondrial", "(", "red", ")", "[", "Ca2", "+", "]", "before", ",", "during", "and", "after", "ionomycin", "exposure", ".", "Scale", "bar", ",", "20", " ", "μm", ".", "(", "i", "-", "p", ")", "Cytoplasmic", "(", "green", ")", "and", "mitochondrial", "matrix", "(", "red", ")", "[", "Ca2", "+", "]", "responses", "in", "HEK293T", "(", "i", "-", "l", ")", "cells", "challenged", "with", "ionomycin", "or", "histamine", "(", "100", " ", "μM", ")", ",", "respectively", ".", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "i", ")", "Wild", "-", "type", "HEK293T", "cells", ".", "(", "j", ")", "Cells", "expressing", "negative", "shRNA", ".", "(", "k", ")", "Clone", "shHK5", "(", "n", " ", "=", " ", "4", ")", ".", "(", "l", ")", "Quantification", "of", "peak", "rhod", "-", "2", "fluorescence", ".", "*", "*", "P0", ".", "01", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "(", "i", "-", "p", ")", "Cytoplasmic", "(", "green", ")", "and", "mitochondrial", "matrix", "(", "red", ")", "[", "Ca2", "+", "]", "responses", "in", "HeLa", "(", "m", "-", "p", ")", "cells", "challenged", "with", "ionomycin", "or", "histamine", "(", "100", " ", "μM", ")", ",", "respectively", ".", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "m", ")", "HeLa", "cells", "expressing", "negative", "shRNA", ".", "(", "n", ")", "Clone", "shHe2", ".", "(", "o", ")", "Clone", "shHe2", "re", "-", "expressing", "MCUR1", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "p", ")", "Quantification", "of", "peak", "rhod", "-", "2", "fluorescence", ".", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "(", "q", ")", "[", "Ca2", "+", "]", "c", "and", "[", "Ca2", "+", "]", "m", "signals", "evoked", "by", "ATP", "(", "100", " ", "μM", ")", "and", "thapsigargin", "(", "Tg", ",", "2", " ", "μM", ")", "were", "monitored", "simultaneously", "using", "fura", "-", "2", "/", "AM", "and", "mitopericam", "(", "ipcam490", ")", ",", "respectively", "in", "control", "(", "left", ")", "and", "MCUR1", "-", "knockdown", "(", "right", ")", "HeLa", "cells", ".", "[", "Ca2", "+", "]", "c", "is", "calibrated", "in", "nanomolar", "concentrations", "(", "black", ")", ",", "whereas", "mitopericam", "fluorescence", "is", "inversely", "normalized", "to", "baseline", "(", "F0", "/", "F", ";", "red", ")", ".", "(", "r", ")", "Summary", "mean", "[", "Ca2", "+", "]", "c", "and", "[", "Ca2", "+", "]", "m", "peaks", "during", "ATP", "stimulation", "(", "negative", "shRNA", "n", " ", "=", " ", "29", ";", "MCUR1", "knockdown", "n", " ", "=", " ", "36", "cells", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "(", "s", ")", "Increase", "in", "bath", "[", "Ca2", "+", "]", "(", "Rfura2", ")", "and", "[", "Ca2", "+", "]", "m", "(", "Ripcam", ")", "signals", "in", "response", "to", "CaCl2", "(", "1", " ", "μM", ")", "and", "InsP3", "(", "IP3", ",", "7", ".", "5", " ", "μM", ")", "addition", "in", "permeabilized", "cells", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "/", "gels", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a,b) Changes in HEK293T cell cytoplasmic (a) and mitochondrial (b) [Ca2+] in response to ionomycin (2.5 μM) were simultaneously measured by fluo-4 and rhod-2 imaging, respectively. Each bar represents one target gene silenced with pooled siRNA.(c) qrtPCR of MCU, MCUR1 and MICU1 mRNA from mouse tissues (n = 3; mean ± s.e.m.).(d) qrtPCR of MCUR1 mRNA from HEK293T cell clones (n = 3; mean ± s.e.m.). KD, knockdown. Neg shRNA, negative shRNA.(e) qrtPCR of MCUR1 mRNA from HeLa cell clones and of rescued MCUR1 mRNA levels in shHe2 clone cells (n = 3; mean ± s.e.m.). The same lentiviral shRNAs were used to generate shHK4 and shHe1 and shHK5 and shHe2, respectively.(f) MCUR1 protein expression levels (top) and densitometric analysis (bottom left) (n = 3; ± s.e.m.). Bottom right, Flag-tagged MCUR1 protein expression in clone shHe2 cells reconstituted with shRNA-resistant MCUR1 cDNA plasmid. WB, western blot.(g,h) Representative images from movies of HEK293T negative shRNA or shHK5 cells showing cytosolic (green) and mitochondrial (red) [Ca2+] before, during and after ionomycin exposure. Scale bar, 20 μm.(i-p) Cytoplasmic (green) and mitochondrial matrix (red) [Ca2+] responses in HEK293T (i-l) cells challenged with ionomycin or histamine (100 μM), respectively. (n = 3). (i) Wild-type HEK293T cells. (j) Cells expressing negative shRNA. (k) Clone shHK5 (n = 4). (l) Quantification of peak rhod-2 fluorescence. **P0.01 (mean±s.e.m.).(i-p) Cytoplasmic (green) and mitochondrial matrix (red) [Ca2+] responses in HeLa (m-p) cells challenged with ionomycin or histamine (100 μM), respectively. (n = 3). (m) HeLa cells expressing negative shRNA. (n) Clone shHe2. (o) Clone shHe2 re-expressing MCUR1 (n = 3). (p) Quantification of peak rhod-2 fluorescence. *P0.05, **P0.01 (mean±s.e.m.).(q) [Ca2+]c and [Ca2+]m signals evoked by ATP (100 μM) and thapsigargin (Tg, 2 μM) were monitored simultaneously using fura-2/AM and mitopericam (ipcam490), respectively in control (left) and MCUR1-knockdown (right) HeLa cells. [Ca2+]c is calibrated in nanomolar concentrations (black), whereas mitopericam fluorescence is inversely normalized to baseline (F0/F; red).(r) Summary mean [Ca2+]c and [Ca2+]m peaks during ATP stimulation (negative shRNA n = 29; MCUR1 knockdown n = 36 cells). *P0.05 (mean±s.e.m.).(s) Increase in bath [Ca2+](Rfura2) and [Ca2+]m (Ripcam) signals in response to CaCl2 (1 μM) and InsP3 (IP3, 7.5 μM) addition in permeabilized cells. Uncropped images of blots/gels are shown in Supplementary Fig. S6."}
{"words": ["figf2Digitonin", "-", "permeabilized", "HeLa", "cells", "bathed", "in", "intracellular", "-", "like", "solution", "containing", "thapsigargin", "(", "Tg", ")", "were", "loaded", "with", "the", "ΔΨm", "indicator", "JC", "-", "1", "and", "the", "Ca2", "+", "indicator", "Fura2FF", ",", "to", "which", "pulses", "of", "10", " ", "μM", "Ca2", "+", "were", "added", "before", "the", "addition", "of", "the", "mitochondrial", "uncoupler", "CCCP", "(", "carbonyl", "cyanide", "m", "-", "chloro", "phenyl", "hydrazone", ")", ".", "(", "a", "-", "e", ")", "Representative", "traces", "from", "three", "independent", "experiments", "depict", "simultaneous", "changes", "of", "bath", "[", "Ca2", "+", "]", "and", "ΔΨm", "in", "cells", "expressing", "negative", "shRNA", "(", "Neg", "shRNA", ";", "a", ")", ",", "clone", "shHe1", "(", "b", ")", ",", "clone", "shHe2", "(", "c", ")", ",", "clone", "shHe2", "re", "-", "expressing", "MCUR1", "(", "d", ")", "and", "HeLa", "cells", "stably", "overexpressing", "MCUR1", "(", "e", ")", ".", "Under", "similar", "conditions", ",", "1", " ", "μM", "Ru360", "was", "added", "before", "10", " ", "μM", "Ca2", "+", "pulses", "until", "the", "addition", "of", "CCCP", ".", "(", "f", "-", "i", ")", "Representative", "traces", "from", "three", "independent", "experiments", "depict", "simultaneous", "changes", "of", "bath", "[", "Ca2", "+", "]", "and", "ΔΨm", "in", "negative", "shRNA", "cells", "(", "f", ")", ",", "MCUR1", "-", "knockdown", "clone", "shHe1", "(", "g", ")", "and", "shHe2", "(", "h", ")", ",", "and", "in", "control", "cells", "overexpressing", "MCUR1", "(", "i", ")", ".", "(", "j", ",", "k", ")", "Negative", "shRNA", "(", "j", ")", "and", "MCUR1", "-", "overexpressing", "(", "k", ")", "HEK293T", "cells", "were", "permeabilized", "with", "digitonin", "in", "intracellular", "-", "like", "medium", "containing", "thapsigargin", "and", "bath", "[", "Ca2", "+", "]", "indicator", "Fura2FF", ",", "and", "then", "pulsed", "with", "10", " ", "μM", "Ca2", "+", ".", "After", "mitochondrial", "clearance", "of", "bath", "Ca2", "+", ",", "Ru360", "caused", "an", "elevation", "of", "bath", "[", "Ca2", "+", "]", ",", "indicating", "that", "steady", "-", "state", "bath", "[", "Ca2", "+", "]", "after", "the", "pulse", "was", "maintained", "by", "a", "balance", "of", "MCU", "-", "mediated", "Ca2", "+", "uptake", "and", "CGP37157", "(", "10", " ", "μM", ")", "-", "sensitive", "Na", "+", "-", "Ca2", "+", "exchanger", "-", "mediated", "extrusion", ".", "CCCP", "was", "added", "as", "indicated", ".", "The", "solid", "line", "is", "the", "mean", ";", "shaded", "areas", "are", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "l", ")", "[", "Ca2", "+", "]", "m", "efflux", "rate", "derived", "from", "j", "and", "k", "during", "the", "initial", "60", "s", "following", "Ru360", "addition", "(", "NS", ";", "not", "significant", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "Digitonin", "-", "permeabilized", "HeLa", "cells", "bathed", "in", "intracellular", "-", "like", "solution", "containing", "thapsigargin", "(", "Tg", ")", "were", "loaded", "with", "the", "ΔΨm", "indicator", "JC", "-", "1", "and", "the", "Ca2", "+", "indicator", "Fura2FF", ",", "to", "which", "pulses", "of", "10", " ", "μM", "Ca2", "+", "were", "added", "before", "the", "addition", "of", "the", "mitochondrial", "uncoupler", "CCCP", "(", "carbonyl", "cyanide", "m", "-", "chloro", "phenyl", "hydrazone", ")", ".", "(", "a", "-", "e", ")", "Representative", "traces", "from", "three", "independent", "experiments", "depict", "simultaneous", "changes", "of", "bath", "[", "Ca2", "+", "]", "and", "ΔΨm", "in", "cells", "expressing", "negative", "shRNA", "(", "Neg", "shRNA", ";", "a", ")", ",", "clone", "shHe1", "(", "b", ")", ",", "clone", "shHe2", "(", "c", ")", ",", "clone", "shHe2", "re", "-", "expressing", "MCUR1", "(", "d", ")", "and", "HeLa", "cells", "stably", "overexpressing", "MCUR1", "(", "e", ")", ".", "Under", "similar", "conditions", ",", "1", " ", "μM", "Ru360", "was", "added", "before", "10", " ", "μM", "Ca2", "+", "pulses", "until", "the", "addition", "of", "CCCP", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2Digitonin-permeabilized HeLa cells bathed in intracellular-like solution containing thapsigargin (Tg) were loaded with the ΔΨm indicator JC-1 and the Ca2+ indicator Fura2FF, to which pulses of 10 μM Ca2+ were added before the addition of the mitochondrial uncoupler CCCP (carbonyl cyanide m-chloro phenyl hydrazone). (a-e) Representative traces from three independent experiments depict simultaneous changes of bath [Ca2+] and ΔΨm in cells expressing negative shRNA (Neg shRNA; a), clone shHe1 (b), clone shHe2 (c), clone shHe2 re-expressing MCUR1 (d) and HeLa cells stably overexpressing MCUR1 (e). Under similar conditions, 1 μM Ru360 was added before 10 μM Ca2+ pulses until the addition of CCCP.(f-i) Representative traces from three independent experiments depict simultaneous changes of bath [Ca2+] and ΔΨm in negative shRNA cells (f), MCUR1-knockdown clone shHe1 (g) and shHe2 (h), and in control cells overexpressing MCUR1 (i).(j,k) Negative shRNA (j) and MCUR1-overexpressing (k) HEK293T cells were permeabilized with digitonin in intracellular-like medium containing thapsigargin and bath [Ca2+] indicator Fura2FF, and then pulsed with 10 μM Ca2+. After mitochondrial clearance of bath Ca2+, Ru360 caused an elevation of bath [Ca2+], indicating that steady-state bath [Ca2+] after the pulse was maintained by a balance of MCU-mediated Ca2+ uptake and CGP37157 (10 μM)-sensitive Na+-Ca2+ exchanger-mediated extrusion. CCCP was added as indicated. The solid line is the mean; shaded areas are ±s.e.m. (n = 3).(l) [Ca2+]m efflux rate derived from j and k during the initial 60 s following Ru360 addition (NS; not significant; n = 3).Digitonin-permeabilized HeLa cells bathed in intracellular-like solution containing thapsigargin (Tg) were loaded with the ΔΨm indicator JC-1 and the Ca2+ indicator Fura2FF, to which pulses of 10 μM Ca2+ were added before the addition of the mitochondrial uncoupler CCCP (carbonyl cyanide m-chloro phenyl hydrazone). (a-e) Representative traces from three independent experiments depict simultaneous changes of bath [Ca2+] and ΔΨm in cells expressing negative shRNA (Neg shRNA; a), clone shHe1 (b), clone shHe2 (c), clone shHe2 re-expressing MCUR1 (d) and HeLa cells stably overexpressing MCUR1 (e). Under similar conditions, 1 μM Ru360 was added before 10 μM Ca2+ pulses until the addition of CCCP."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ",", "b", ")", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "transiently", "co", "-", "transfected", "for", "48", " ", "h", "with", "GFP", "-", "tagged", "MCUR1", "and", "DsRed", "-", "Mito", "plasmids", "(", "a", ")", "or", "mRFP", "-", "tagged", "MCUR1", "and", "EYFP", "-", "Mito", "(", "b", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "20", " ", "μm", ".", "(", "c", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "Flag", "-", "tagged", "MCUR1", "in", "the", "HeLa", "cell", "crude", "mitochondrial", "fraction", ",", "outer", "mitochondrial", "membrane", "(", "OMM", ")", "and", "mitoplasts", ",", "using", "antibodies", "against", "VDAC1", "(", "outer", "mitochondrial", "membrane", "protein", ")", ",", "COII", "(", "integral", "membrane", "marker", ")", "and", "Flag", ".", "(", "d", ")", "Immunoblot", "analyses", "of", "mitochondria", "-", "containing", "pellet", "and", "cytosolic", "fractions", "from", "plasma", "-", "membrane", "-", "permeabilized", "HeLa", "cells", ".", "Permeabilized", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "tBid", "(", "50", "nM", ")", "for", "outer", "mitochondrial", "membrane", "permeabilization", "and", "the", "appearance", "of", "cytosolic", "cytochrome", "c", "was", "verified", ".", "Intact", "and", "outer", "mitochondrial", "membrane", "permeabilized", "samples", "were", "exposed", "to", "proteinase", "K", "for", "10", "min", ".", "These", "samples", "were", "probed", "using", "antibodies", "against", "HSP60", ",", "OXA1", ",", "Flag", "and", "MCUR1", ".", "(", "e", ")", "Reciprocal", "co", "-", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "of", "MCU", "-", "GFP", "and", "MCUR1", "-", "Flag", "transiently", "expressed", "in", "COS7", "cells", ".", "Representative", "of", "four", "independent", "experiments", ".", "WB", ",", "western", "blot", ".", "(", "f", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "MICU1", "-", "Flag", "with", "MCU", "-", "GFP", "but", "not", "with", "MCUR1", "-", "GFP", "transiently", "expressed", "in", "COS7", "cells", ".", "Representative", "of", "four", "independent", "experiments", ".", "(", "g", ")", "Immunoprecipitation", "of", "LETM1", "-", "GFP", "with", "anti", "-", "LETM1", "failed", "to", "pull", "down", "MCUR1", "-", "Flag", "in", "transiently", "transfected", "COS7", "cells", ".", "(", "h", ")", "Immunoprecipitation", "with", "Flag", "antibody", "pulled", "down", "LETM1", "-", "Flag", "or", "MCU", "-", "Flag", "transiently", "expressed", "in", "COS7", "cells", "(", "immunoprecipitation", "lanes", "2", "and", "3", ",", "lower", "panel", ")", ",", "but", "only", "co", "-", "immunoprecipitated", "MCUR1", "-", "V5", "in", "the", "MCU", "-", "Flag", "-", "expressing", "cells", "(", "immunoprecipitation", "lanes", "4", "versus", "5", ",", "upper", "panel", ")", ",", "despite", "lower", "expression", "of", "MCU", "-", "Flag", "in", "MCUR1", "-", "co", "-", "transfected", "cells", "(", "compare", "MCU", "-", "Flag", "and", "LETM1", "-", "Flag", "expression", "in", "MCUR1", "-", "co", "-", "transfected", "cells", "in", "lysate", "lanes", "4", "and", "5", ",", "bottom", "panel", ")", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "/", "gels", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a,b) Confocal images of HeLa cells transiently co-transfected for 48 h with GFP-tagged MCUR1 and DsRed-Mito plasmids (a) or mRFP-tagged MCUR1 and EYFP-Mito (b). Scale bar, 20 μm.(c) Immunoblot analysis of Flag-tagged MCUR1 in the HeLa cell crude mitochondrial fraction, outer mitochondrial membrane (OMM) and mitoplasts, using antibodies against VDAC1 (outer mitochondrial membrane protein), COII (integral membrane marker) and Flag.(d) Immunoblot analyses of mitochondria-containing pellet and cytosolic fractions from plasma-membrane-permeabilized HeLa cells. Permeabilized cells were treated with or without tBid (50 nM) for outer mitochondrial membrane permeabilization and the appearance of cytosolic cytochrome c was verified. Intact and outer mitochondrial membrane permeabilized samples were exposed to proteinase K for 10 min. These samples were probed using antibodies against HSP60, OXA1, Flag and MCUR1.(e) Reciprocal co-immunoprecipitation (IP) of MCU-GFP and MCUR1-Flag transiently expressed in COS7 cells. Representative of four independent experiments. WB, western blot.(f) Co-immunoprecipitation of MICU1-Flag with MCU-GFP but not with MCUR1-GFP transiently expressed in COS7 cells. Representative of four independent experiments.(g) Immunoprecipitation of LETM1-GFP with anti-LETM1 failed to pull down MCUR1-Flag in transiently transfected COS7 cells.(h) Immunoprecipitation with Flag antibody pulled down LETM1-Flag or MCU-Flag transiently expressed in COS7 cells (immunoprecipitation lanes 2 and 3, lower panel), but only co-immunoprecipitated MCUR1-V5 in the MCU-Flag-expressing cells (immunoprecipitation lanes 4 versus 5, upper panel), despite lower expression of MCU-Flag in MCUR1-co-transfected cells (compare MCU-Flag and LETM1-Flag expression in MCUR1-co-transfected cells in lysate lanes 4 and 5, bottom panel). Representative of three independent experiments. Uncropped images of blots/gels are shown in Supplementary Fig. S6."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "qrtPCR", "of", "MCU", "mRNA", "from", "wild", "-", "type", "and", "stable", "MCUR1", "-", "overexpressing", "HeLa", "cells", "that", "were", "transiently", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "or", "siRNA", "against", "MCU", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "(", "b", ")", "[", "Ca2", "+", "]", "m", "responses", "to", "histamine", "(", "100", " ", "μM", ")", "in", "HeLa", "cells", "stably", "overexpressing", "MCUR1", "and", "in", "cells", "transiently", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "or", "MCU", "siRNA", ",", "and", "in", "stable", "MCUR1", "-", "overexpressing", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "MCU", "siRNA", ".", "After", "48", " ", "h", "of", "siRNA", "transfection", ",", "cells", "were", "loaded", "with", "rhod", "-", "2", "and", "[", "Ca2", "+", "]", "m", "responses", "were", "visualized", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Solid", "lines", "are", "mean", ";", "shaded", "regions", "are", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ".", "(", "c", ")", "Quantification", "of", "peak", "rhod", "-", "2", "fluorescence", "following", "histamine", "stimulation", ".", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "d", ")", "qrtPCR", "of", "MCU", "mRNA", "from", "wild", "-", "type", "and", "MCUR1", "-", "knockdown", "HeLa", "cells", "that", "were", "transiently", "transfected", "with", "MCU", "cDNA", ".", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "e", ")", "[", "Ca2", "+", "]", "m", "responses", "to", "histamine", "(", "100", " ", "μM", ")", "in", "wild", "-", "type", "and", "MCUR1", "(", "shHe2", ")", "-", "knockdown", "HeLa", "cells", "overexpressing", "MCU", ".", "Negative", "shRNA", "(", "Neg", "shRNA", ")", "and", "MCUR1", "-", "shHe2", "cells", "were", "used", "as", "controls", ".", "Solid", "lines", "are", "mean", ";", "shaded", "regions", "are", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ".", "(", "f", ")", "Quantification", "of", "peak", "rhod", "-", "2", "fluorescence", "following", "histamine", "stimulation", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) qrtPCR of MCU mRNA from wild-type and stable MCUR1-overexpressing HeLa cells that were transiently transfected with scrambled siRNA or siRNA against MCU. ***P0.001 (mean±s.e.m.).(b) [Ca2+]m responses to histamine (100 μM) in HeLa cells stably overexpressing MCUR1 and in cells transiently transfected with scrambled siRNA or MCU siRNA, and in stable MCUR1-overexpressing HeLa cells transfected with MCU siRNA. After 48 h of siRNA transfection, cells were loaded with rhod-2 and [Ca2+]m responses were visualized by confocal microscopy. Solid lines are mean; shaded regions are ±s.e.m.; n = 3. (c) Quantification of peak rhod-2 fluorescence following histamine stimulation. *P0.05, ***P0.001 (mean±s.e.m.; NS, not significant; n = 3).(d) qrtPCR of MCU mRNA from wild-type and MCUR1-knockdown HeLa cells that were transiently transfected with MCU cDNA. **P0.01, ***P0.001 (mean±s.e.m.; n = 3).(e) [Ca2+]m responses to histamine (100 μM) in wild-type and MCUR1 (shHe2)-knockdown HeLa cells overexpressing MCU. Negative shRNA (Neg shRNA) and MCUR1-shHe2 cells were used as controls. Solid lines are mean; shaded regions are ±s.e.m.; n = 3. (f) Quantification of peak rhod-2 fluorescence following histamine stimulation. ***P0.001 (mean±s.e.m.; n = 3)."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "AMP", "/", "ATP", "ratios", "in", "stable", "HeLa", "cell", "lines", "stably", "expressing", "negative", "shRNA", "(", "Neg", "shRNA", ")", ",", "MCUR1", "shRNA", "(", "clone", "shHe2", ")", "or", "shHe2", "with", "MCUR1", "re", "-", "expressed", ".", "*", "*", "P0", ".", "01", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "b", ")", "O2", "consumption", "rates", "(", "OCR", ")", "in", "stable", "HeLa", "cells", "expressing", "irrelevant", "shRNA", ",", "clone", "shHe2", ",", "and", "clone", "shHe2", "re", "-", "expressing", "MCUR1", ",", "exposed", "sequentially", "to", "oligomycin", "(", "i", ")", ",", "FCCP", "(", "ii", ")", "and", "rotenone", "plus", "myzothiazol", "(", "iii", ")", ".", "(", "c", ")", "Basal", "and", "maximal", "O2", "consumption", "rates", "in", "cells", "as", "described", "in", "b", ".", "*", "P0", ".", "05", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "d", ")", "Western", "blot", "of", "phosphorylated", "and", "total", "AMPK", "(", "top", ")", "and", "densitometric", "analysis", "(", "bottom", ")", "in", "stable", "HeLa", "lines", "expressing", "negative", "shRNA", "or", "MCUR1", "shRNA", "(", "clone", "shHe2", ")", "and", "clone", "shHe2", "re", "-", "expressing", "MCUR1", ".", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "e", ")", "Western", "blot", "of", "LC3", "or", "tubulin", "in", "stable", "HeLa", "lines", "expressing", "negative", "shRNA", "or", "MCUR1", "shRNA", "(", "clone", "shHe2", ")", "and", "clone", "shHe2", "re", "-", "expressing", "MCUR1", "(", "top", ")", "and", "quantification", "of", "LC3", "-", "II", "/", "(", "LC3", "-", "I", "+", "LC3", "-", "II", ")", "(", "bottom", ")", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "levels", "in", "cells", "expressing", "irrelevant", "shRNA", ".", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "(", "f", ",", "g", ")", ",", "The", "same", "as", "in", "d", "and", "e", ".", "Activation", "of", "AMPK", "(", "f", ")", "and", "autophagy", "(", "*", "*", "P0", ".", "001", ";", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ")", "(", "g", ")", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "InsP3R", "inhibitor", "xestospongin", "B", "(", "XeB", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "001", ",", "NS", ",", "not", "significant", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "=", " ", "3", ")", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "/", "gels", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) AMP/ATP ratios in stable HeLa cell lines stably expressing negative shRNA (Neg shRNA), MCUR1 shRNA (clone shHe2) or shHe2 with MCUR1 re-expressed. **P0.01 (mean±s.e.m.; n = 3).(b) O2 consumption rates (OCR) in stable HeLa cells expressing irrelevant shRNA, clone shHe2, and clone shHe2 re-expressing MCUR1, exposed sequentially to oligomycin (i), FCCP (ii) and rotenone plus myzothiazol (iii).(c) Basal and maximal O2 consumption rates in cells as described in b. *P0.05 (mean±s.e.m.; n = 3).(d) Western blot of phosphorylated and total AMPK (top) and densitometric analysis (bottom) in stable HeLa lines expressing negative shRNA or MCUR1 shRNA (clone shHe2) and clone shHe2 re-expressing MCUR1. *P0.05, **P0.01 (mean±s.e.m.; n = 3). (e) Western blot of LC3 or tubulin in stable HeLa lines expressing negative shRNA or MCUR1 shRNA (clone shHe2) and clone shHe2 re-expressing MCUR1 (top) and quantification of LC3-II/(LC3-I + LC3-II) (bottom) expressed as fold increase over levels in cells expressing irrelevant shRNA. *P0.05, **P0.01 (mean±s.e.m.; n = 3).(f,g), The same as in d and e. Activation of AMPK (f) and autophagy (**P0.001; mean±s.e.m.; n = 3) (g) in the absence and presence of InsP3R inhibitor xestospongin B (XeB). *P0.05, **P0.001, NS, not significant (mean±s.e.m.; n = 3). Uncropped images of blots/gels are shown in Supplementary Fig. S6."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "B", "cell", "development", "in", "Igh", "∆", "890", "/", "∆", "890", "mice", ".", "The", "relative", "frequencies", "of", "the", "indicated", "cell", "types", "were", "determined", "by", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "bone", "marrow", "cells", "from", "Igh", "∆", "890", "/", "∆", "890", "and", "Igh", "+", "/", "+", "mice", "at", "the", "age", "of", "3", "-", "4", "weeks", ",", "indicating", "a", "1", ".", "3", "-", "fold", "increase", "of", "pro", "-", "B", "cells", "and", "a", "moderate", "decrease", "at", "subsequent", "B", "cell", "developmental", "stages", "in", "Igh", "∆", "890", "/", "∆", "890", "mice", ".", "Statistical", "data", "are", "shown", "as", "mean", "value", "with", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "data", "were", "analyzed", "by", "multiple", "t", "-", "tests", "(", "unpaired", "and", "two", "-", "tailed", "with", "Holm", "-", "Sidak", "correction", ";", "A", ",", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Each", "dot", "(", "A", ",", "corresponds", "to", "one", "mouse", ".", "(", "B", ")", "Two", "-", "color", "3D", "DNA", "-", "FISH", "analysis", "of", "ex", "vivo", "sorted", "pro", "-", "B", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "with", "the", "RP23", "-", "340K14", "(", "red", ")", "and", "RP24", "-", "275L15", "(", "green", ")", "BAC", "probes", "(", "Fig", "1A", ")", ".", "Representative", "images", "are", "show", "above", ".", "Dot", "plots", "(", "below", ")", "show", "the", "distances", "measured", "between", "the", "two", "DNA", "signals", "in", "individual", "Igh", "alleles", "(", "2", ",", "123", "for", "Rag2", "-", "/", "-", ",", "1", ",", "514", "for", "Igh", "∆", "890", "/", "∆", "890", "Rag2", "-", "/", "-", "and", "502", "for", "Vav", "-", "Cre", "Pax5fl", "/", "fl", "(", "Pax5", "∆", "/", "∆", ")", "Rag2", "-", "/", "-", "pro", "-", "B", "cells", ")", "together", "with", "the", "mean", "distance", "(", "red", "bar", ")", "and", "SEM", "determined", "for", "each", "genotype", ".", "In", "total", ",", "four", "independent", "DNA", "-", "FISH", "experiments", "were", "performed", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "data", "were", "analyzed", "by", "multiple", "t", "-", "tests", "(", "unpaired", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "Tukey", "post", "-", "hoc", "test", ";", "B", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ",", "VH", "gene", "recombination", "analysis", "in", "ex", "vivo", "sorted", "Igh", "∆", "890", "/", "∆", "890", "and", "Igh", "+", "/", "+", "pro", "-", "B", "cells", ",", "as", "determined", "by", "VDJ", "-", "seq", "experiments", "(", "C", ")", "The", "percentages", "of", "uniquely", "identified", "DJH", "and", "VDJH", "sequences", "are", "shown", "as", "mean", "percentage", "with", "SEM", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "an", "independent", "VDJ", "-", "seq", "experiments", "performed", "with", "sorted", "pro", "-", "B", "cells", "from", "one", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "data", "were", "analyzed", "by", "multiple", "t", "-", "tests", "(", "unpaired", "and", "two", "-", "tailed", "with", "Holm", "-", "Sidak", "correction", ";", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Each", "dot", "C", ",", "corresponds", "to", "one", "mouse", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) B cell development in Igh∆890/∆890 mice. The relative frequencies of the indicated cell types were determined by flow cytometric analysis of bone marrow cells from Igh∆890/∆890 and Igh+/+ mice at the age of 3-4 weeks, indicating a 1.3-fold increase of pro-B cells and a moderate decrease at subsequent B cell developmental stages in Igh∆890/∆890 mice. Statistical data are shown as mean value with SEM. Data information: Statistical data were analyzed by multiple t-tests (unpaired and two-tailed with Holm-Sidak correction; A, ; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Each dot (A, corresponds to one mouse.(B) Two-color 3D DNA-FISH analysis of ex vivo sorted pro-B cells of the indicated genotypes with the RP23-340K14 (red) and RP24-275L15 (green) BAC probes (Fig 1A). Representative images are show above. Dot plots (below) show the distances measured between the two DNA signals in individual Igh alleles (2,123 for Rag2-/-, 1,514 for Igh∆890/∆890 Rag2-/- and 502 for Vav-Cre Pax5fl/fl (Pax5∆/∆) Rag2-/-pro-B cells) together with the mean distance (red bar) and SEM determined for each genotype. In total, four independent DNA-FISH experiments were performed. Data information: Statistical data were analyzed by multiple t-tests (unpaired one-way ANOVA (Tukey post-hoc test; B); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.(C, VH gene recombination analysis in ex vivo sorted Igh∆890/∆890 and Igh+/+ pro-B cells, as determined by VDJ-seq experiments (C) The percentages of uniquely identified DJH and VDJH sequences are shown as mean percentage with SEM. Each dot corresponds to an independent VDJ-seq experiments performed with sorted pro-B cells from one mouse. Data information: Statistical data were analyzed by multiple t-tests (unpaired and two-tailed with Holm-Sidak correction; ; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Each dot C, corresponds to one mouse."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Flow", "cytometric", "determination", "of", "the", "ratio", "of", "immature", "IgMb", "(", "B6", ")", "to", "IgMa", "(", "129", ")", "B", "cells", "in", "the", "bone", "marrow", "of", "Igh", "∆", "890", "(", "B6", ")", "/", "+", "(", "129", ")", ",", "IghP4V", "(", "B6", ")", "/", "+", "(", "129", ")", "and", "control", "Igh", "+", "(", "B6", ")", "/", "+", "(", "129", ")", "mice", ",", "which", "were", "generated", "by", "crossing", "Igh", "∆", "890", "/", "+", ",", "IghP4V", "/", "+", "and", "Igh", "+", "/", "+", "mice", "on", "the", "C57BL", "/", "6", "(", "B6", ")", "background", "with", "Igh", "+", "/", "+", "mice", "of", "the", "129", "/", "Sv", "(", "129", ")", "strain", ".", "The", "rearranged", "Igh", "alleles", "of", "the", "C57BL", "/", "6", "and", "129", "/", "Sv", "strains", "give", "rise", "to", "the", "expression", "of", "IgMb", "and", "IgMa", ",", "respectively", ".", "The", "IgMb", "(", "B6", ")", "to", "IgMa", "(", "129", ")", "ratio", "is", "shown", "as", "mean", "value", "with", "SEM", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "data", "were", "analyzed", "by", "multiple", "t", "-", "tests", "(", "unpaired", "and", "two", "-", "tailed", "with", "Holm", "-", "Sidak", "correction", ";", "B", ",", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Each", "dot", "(", "B", ",", "corresponds", "to", "one", "mouse", ".", "(", "C", ")", "Summary", "of", "the", "ratios", "of", "immature", "IgMb", "(", "B6", ")", "to", "IgMa", "(", "129", ")", "B", "cells", ",", "determined", "for", "the", "indicated", "six", "mouse", "strains", "analyzed", "and", "shown", "as", "mean", "values", "with", "SEM", ".", "The", "ratio", "determined", "for", "control", "Igh", "+", "(", "B6", ")", "/", "+", "(", "129", ")", "B", "cells", "was", "set", "to", "1", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "data", "were", "analyzed", "by", "multiple", "t", "-", "tests", "(", "unpaired", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "Tukey", "post", "-", "hoc", "test", ";", "C", ",", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Each", "dot", "C", ",", "corresponds", "to", "one", "mouse", ".", "(", "D", ")", "Comparison", "of", "the", "VDJ", "-", "seq", "data", "obtained", "with", "pro", "-", "B", "cells", "of", "the", "Igh", "+", "/", "+", "(", "black", ")", ",", "Igh", "∆", "890", "/", "∆", "890", "(", "white", "bars", ")", "and", "IghP4V", "/", "P4V", "(", "gray", ")", "genotypes", ".", "The", "different", "VH", "genes", "(", "horizontal", "axis", ")", "are", "aligned", "according", "to", "their", "position", "in", "the", "Igh", "locus", "The", "usage", "of", "each", "VH", "gene", "(", "vertical", "axis", ")", "is", "shown", "as", "percentage", "of", "all", "VDJH", "and", "DJH", "recombination", "events", "determined", "for", "each", "pro", "-", "B", "cell", "type", ".", "The", "relative", "frequency", "of", "each", "VH", "gene", "is", "shown", "as", "mean", "value", "with", "SEM", "and", "is", "based", "on", "three", "independent", "VDJ", "-", "seq", "experiments", "for", "pro", "-", "B", "cells", "of", "each", "genotype", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Flow cytometric determination of the ratio of immature IgMb (B6) to IgMa (129) B cells in the bone marrow of Igh∆890(B6)/+(129), IghP4V (B6)/+(129) and control Igh+(B6)/+(129) mice, which were generated by crossing Igh∆890/+, IghP4V/+ and Igh+/+ mice on the C57BL/6 (B6) background with Igh+/+ mice of the 129/Sv (129) strain. The rearranged Igh alleles of the C57BL/6 and 129/Sv strains give rise to the expression of IgMb and IgMa, respectively. The IgMb (B6) to IgMa (129) ratio is shown as mean value with SEM (right). Data information: Statistical data were analyzed by multiple t-tests (unpaired and two-tailed with Holm-Sidak correction; B, ; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Each dot (B, corresponds to one mouse.(C) Summary of the ratios of immature IgMb (B6) to IgMa (129) B cells, determined for the indicated six mouse strains analyzed and shown as mean values with SEM. The ratio determined for control Igh+(B6)/+(129) B cells was set to 1. Data information: Statistical data were analyzed by multiple t-tests (unpaired one-way ANOVA (Tukey post-hoc test; C, ; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Each dot C, corresponds to one mouse.(D) Comparison of the VDJ-seq data obtained with pro-B cells of the Igh+/+ (black), Igh∆890/∆890 (white bars) and IghP4V/P4V (gray) genotypes. The different VH genes (horizontal axis) are aligned according to their position in the Igh locus The usage of each VH gene (vertical axis) is shown as percentage of all VDJH and DJH recombination events determined for each pro-B cell type. The relative frequency of each VH gene is shown as mean value with SEM and is based on three independent VDJ-seq experiments for pro-B cells of each genotype."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Presence", "of", "open", "chromatin", "and", "the", "active", "histone", "marks", "H3K27ac", "and", "H3K4me2", "at", "the", "V8", ".", "8E", "enhancer", "in", "pro", "-", "B", "cells", ".", "The", "location", "of", "the", "VH8", "-", "8", "gene", ",", "V8", ".", "8E", "enhancer", "(", "dashed", "line", ")", "and", "PAIR5", "element", "are", "shown", "together", "with", "the", "mm9", "genomic", "coordinates", "of", "mouse", "chromosome", "12", ".", "The", "VH8", "-", "8", "gene", "with", "500", "bp", "of", "its", "upstream", "and", "downstream", "sequences", "(", "indicated", "by", "violet", "overlay", ")", "was", "inserted", "with", "the", "Floxin", "method", "at", "the", "deletion", "point", "of", "the", "Igh", "∆", "890", "allele", "to", "generate", "the", "IghV8", "-", "8"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Presence of open chromatin and the active histone marks H3K27ac and H3K4me2 at the V8.8E enhancer in pro-B cells. The location of the VH8-8 gene, V8.8E enhancer (dashed line) and PAIR5 element are shown together with the mm9 genomic coordinates of mouse chromosome 12. The VH8-8 gene with 500 bp of its upstream and downstream sequences (indicated by violet overlay) was inserted with the Floxin method at the deletion point of the Igh∆890 allele to generate the IghV8-8 allele"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ",", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "(", "B", ")", "of", "GFP", "expression", "are", "shown", "for", "pro", "-", "B", ",", "pre", "-", "B", ",", "immature", "B", "and", "recirculating", "B", "cells", "from", "the", "bone", "marrow", "of", "IghP4GV", "/", "P4GV", "(", "dark", "green", ",", "n", "=", "16", ")", ",", "IghP4GV", "/", "+", "(", "light", "green", ",", "n", "=", "12", ")", "and", "control", "Igh", "+", "/", "+", "(", "black", ",", "n", "=", "13", ")", "mice", ".", "C", ")", "geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "MFI", ",", "C", ")", "of", "GFP", "expression", "are", "shown", "for", "pro", "-", "B", ",", "pre", "-", "B", ",", "immature", "B", "and", "recirculating", "B", "cells", "from", "the", "bone", "marrow", "of", "IghP4GV", "/", "P4GV", "(", "dark", "green", ",", "n", "=", "16", ")", ",", "IghP4GV", "/", "+", "(", "light", "green", ",", "n", "=", "12", ")", "and", "control", "Igh", "+", "/", "+", "(", "black", ",", "n", "=", "13", ")", "mice", ".", "Geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "C", ")", "are", "shown", "as", "mean", "values", "with", "SEM", ".", "G", ")", "Absence", "of", "GFP", "expression", "in", "DN", "(", "CD4", "-", "CD8", "-", ")", "and", "DP", "(", "CD4", "+", "CD8", "+", ")", "T", "cells", ",", "geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "G", ")", "of", "GFP", "expression", "in", "thymocytes", "from", "the", "indicated", "mice", ".", "Geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "G", ")", "are", "shown", "as", "mean", "value", "with", "SEM", "based", "on", "12", "(", "Igh", "+", "/", "+", ")", ",", "11", "(", "IghP4GV", "/", "+", ")", "or", "12", "(", "IghP4GV", "/", "P4GV", ")", "independent", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B, Flow-cytometric analysis (B) of GFP expression are shown for pro-B, pre-B, immature B and recirculating B cells from the bone marrow of IghP4GV/P4GV (dark green, n=16), IghP4GV/+ (light green, n=12) and control Igh+/+ (black, n=13) mice.C) geometric mean fluorescence intensity measurements (MFI, C) of GFP expression are shown for pro-B, pre-B, immature B and recirculating B cells from the bone marrow of IghP4GV/P4GV (dark green, n=16), IghP4GV/+ (light green, n=12) and control Igh+/+ (black, n=13) mice. Geometric mean fluorescence intensity measurements (C) are shown as mean values with SEM.G) Absence of GFP expression in DN (CD4-CD8-) and DP (CD4+CD8+) T cells, geometric mean fluorescence intensity measurements (G) of GFP expression in thymocytes from the indicated mice. Geometric mean fluorescence intensity measurements (G) are shown as mean value with SEM based on 12 (Igh+/+), 11 (IghP4GV/+) or 12 (IghP4GV/P4GV) independent replicates."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "(", "A", ")", "and", "geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "MFI", ",", "B", ")", "of", "GFP", "expression", "are", "shown", "for", "pro", "-", "B", ",", "pre", "-", "B", ",", "immature", "B", "and", "recirculating", "B", "cells", "from", "the", "bone", "marrow", "of", "IghP4GV", "/", "+", "(", "green", ",", "n", "=", "6", ")", ",", "IghP4", "∆", "Pax5GV", "/", "+", "(", "yellow", ",", "n", "=", "5", ")", ",", "IghP4", "∆", "CtcfGV", "/", "+", "(", "brown", ",", "n", "=", "4", ")", "and", "control", "Igh", "+", "/", "+", "(", "black", ",", "n", "=", "4", ")", "mice", ".", "Geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "B", ")", "are", "shown", "as", "mean", "value", "with", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "mouse", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Activation", "of", "the", "PAIR4", "-", "V8", ".", "7E", "module", "in", "thymocytes", "upon", "loss", "of", "CTCF", "binding", "at", "PAIR4", ",", "as", "shown", "by", "flow", "-", "cytometric", "analysis", "(", "C", ")", "and", "geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "MFI", ",", "D", ")", "of", "GFP", "expression", "in", "DN", ",", "DP", ",", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "thymocytes", "of", "IghP4", "∆", "CtcfGV", "/", "+", "(", "light", "brown", ",", "n", "=", "5", ")", "and", "IghP4", "∆", "CtcfGV", "/", "P4", "∆", "CtcfGV", "(", "dark", "brown", ",", "n", "=", "6", ")", "mice", "compared", "with", "control", "Igh", "+", "/", "+", "(", "black", ",", "n", "=", "7", ")", "mice", ".", "Geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "D", ")", "are", "shown", "as", "mean", "value", "with", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "mouse", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A, B) Flow-cytometric analysis (A) and geometric mean fluorescence intensity measurements (MFI, B) of GFP expression are shown for pro-B, pre-B, immature B and recirculating B cells from the bone marrow of IghP4GV/+ (green, n=6), IghP4∆Pax5GV/+ (yellow, n=5), IghP4∆CtcfGV/+ (brown, n=4) and control Igh+/+ (black, n=4) mice. Geometric mean fluorescence intensity measurements (B) are shown as mean value with SEM. Data information: Each dot corresponds to one mouse.(C, D) Activation of the PAIR4-V8.7E module in thymocytes upon loss of CTCF binding at PAIR4, as shown by flow-cytometric analysis (C) and geometric mean fluorescence intensity measurements (MFI, D) of GFP expression in DN, DP, CD4+ and CD8+ thymocytes of IghP4∆CtcfGV/+ (light brown, n=5) and IghP4∆CtcfGV/P4∆CtcfGV (dark brown, n=6) mice compared with control Igh+/+ (black, n=7) mice. Geometric mean fluorescence intensity measurements (D) are shown as mean value with SEM. Data information: Each dot corresponds to one mouse."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ",", "C", ")", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "(", "B", ")", "and", "geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "MFI", ",", "C", ")", "of", "YFP", "expression", "are", "shown", "for", "MPPs", "(", "LSK", ")", ",", "LMPPs", ",", "ALPs", "and", "BLPs", "from", "the", "bone", "marrow", "of", "Rosa26LSL", "-", "YPF", "/", "+", "IghCμCre", "/", "+", "(", "violet", ")", "and", "control", "Rosa26LSL", "-", "YPF", "/", "+", "Igh", "+", "/", "+", "(", "black", ")", "mice", ".", "Geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "measurements", "(", "B", ")", "are", "shown", "as", "mean", "value", "with", "SEM", "and", "have", "been", "normalized", "by", "setting", "the", "mean", "value", "obtained", "with", "Igh", "+", "/", "+", "cells", "to", "1", ".", "Data", "information", ":", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "mouse", ".", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "(", "E", ")", "of", "GFP", "expression", "are", "shown", "for", "MPPs", "(", "LSK", ")", ",", "LMPPs", ",", "ALPs", ",", "BLPs", ",", "pro", "-", "B", ",", "pre", "-", "B", ",", "immature", "B", "and", "recirculating", "B", "cells", "from", "the", "bone", "marrow", "of", "IghEμG", "/", "+", "(", "light", "blue", ")", ",", "IghEμG", "/", "EμG", "(", "dark", "blue", ")", "and", "control", "Igh", "+", "/", "+", "(", "black", ")", "mice", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B, C) Flow-cytometric analysis (B) and geometric mean fluorescence intensity measurements (MFI, C) of YFP expression are shown for MPPs (LSK), LMPPs, ALPs and BLPs from the bone marrow of Rosa26LSL-YPF/+ IghCμCre/+ (violet) and control Rosa26LSL-YPF/+ Igh+/+ (black) mice. Geometric mean fluorescence intensity measurements (B) are shown as mean value with SEM and have been normalized by setting the mean value obtained with Igh+/+ cells to 1. Data information: Each dot corresponds to one mouse.Flow-cytometric analysis (E) of GFP expression are shown for MPPs (LSK), LMPPs, ALPs, BLPs, pro-B, pre-B, immature B and recirculating B cells from the bone marrow of IghEμG/+ (light blue), IghEμG/EμG (dark blue) and control Igh+/+ (black) mice."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "Same", "as", "in", "A", ",", "with", "the", "exception", "that", "cells", "expressing", "flag", "-", "praja2rm", "or", "praja2", "deletion", "mutants", "(", "praja21", "-", "530", ",", "praja21", "-", "630", "and", "praja2Δ530", "-", "630", ")", "were", "included", "in", "the", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, Same as in A, with the exception that cells expressing flag-praja2rm or praja2 deletion mutants (praja21-530, praja21-630 and praja2Δ530-630) were included in the analysis."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "MST", "signal", "(", "normalized", "fluorescence", ")", "of", "P1", "(", "red", "curve", ")", ",", "P2", "(", "green", "curve", ")", "and", "P3", "(", "cyan", "curve", ")", "plotted", "against", "TBC1D31", ",", "at", "increasing", "concentrations", "of", "peptides", ".", "The", "threading", "modelled", "structure", "of", "the", "overlapping", "binding", "segment", "of", "praja2", "(", "praja2550", "-", "570", ")", "is", "shown", ".", "F", ".", "MST", "signal", "of", "P1", "plotted", "against", "increasing", "concentrations", "of", "TBC1D31", "peptides", ":", "wild", "-", "type", "(", "red", "curve", ")", ",", "R948A", "-", "R951A", "(", "violet", "curve", ")", "and", "R957", "-", "R959D", "-", "H960A", "(", "orange", "curve", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. MST signal (normalized fluorescence) of P1 (red curve), P2 (green curve) and P3 (cyan curve) plotted against TBC1D31, at increasing concentrations of peptides. The threading modelled structure of the overlapping binding segment of praja2 (praja2550-570) is shown.F. MST signal of P1 plotted against increasing concentrations of TBC1D31 peptides: wild-type (red curve), R948A-R951A (violet curve) and R957-R959D-H960A (orange curve)."}
{"words": ["Figure", "3D", ".", "Total", "lysates", "from", "mouse", "brain", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "TBC1D31", "antibodies", "or", "with", "control", "IgG", ".", "The", "precipitates", "and", "an", "aliquot", "of", "lysates", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D. Total lysates from mouse brain were immunoprecipitated with anti-TBC1D31 antibodies or with control IgG. The precipitates and an aliquot of lysates were immunoblotted with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "4E", ".", "Same", "as", "in", "C", ",", "with", "the", "exception", "that", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "flag", "-", "OFD1", "vector", "and", "with", "control", "siRNA", "(", "siCNT", ")", "or", "siRNA", "targeting", "praja2", ".", "F", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "E", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ".", "G"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4E. Same as in C, with the exception that cells were co-transfected with flag-OFD1 vector and with control siRNA (siCNT) or siRNA targeting praja2. F. Quantitative analysis of the experiments shown in E. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. Student's t test, *p<0,05. G "}
{"words": ["Figure", "5C", ".", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "siRNAs", "were", "serum", "deprived", ",", "pre", "-", "treated", "with", "cycloheximide", "and", "stimulated", "with", "FSK", "at", "different", "time", "point", ".", "Lysates", "were", "immunoblotted", "for", "endogenous", "praja2", "and", "OFD1", ".", "Hsp90", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "D", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "C", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ";", "*", "*", "<", "0", ",", "01", "versus", "sipraja2", "(", "+", "FSK", ")", "and", "basal", "values", "(", "0", ")", ".", "E", "H", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "E97G", "mutant", "in", "HEK293", "cells", "stimulated", "with", "FSK", "as", "in", "C", ".", "I", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "H", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ",", "05", "versus", "E97G", "mutant", "(", "+", "FSK", ")", "and", "basal", "values", "(", "0", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C. HEK293 cells transfected with siRNAs were serum deprived, pre-treated with cycloheximide and stimulated with FSK at different time point. Lysates were immunoblotted for endogenous praja2 and OFD1. Hsp90 was used as loading control. D. Quantitative analysis of the experiments shown in C. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. Student's t test * p<0,05; **<0,01 versus sipraja2 (+FSK) and basal values (0). E H. Immunoblot analysis of flag-OFD1 or flag-E97G mutant in HEK293 cells stimulated with FSK as in C. I. Quantitative analysis of the experiments shown in H. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. Student's t test, *p<0,05 versus E97G mutant (+FSK) and basal values (0). "}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "siRNA", "transfected", "HEK293", "cells", "were", "serum", "deprived", "and", "stained", "for", "acetylated", "-", "tubulin", ",", "TBC1D31", "and", "DRAQ5", ".", "B", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "A", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "four", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ".", "C", "C", ".", "HEK293", "cells", "expressing", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "S735A", "were", "serum", "deprived", "and", "subjected", "to", "staining", "analysis", "for", "acetylated", "α", "-", "tubulin", ",", "flag", "and", "DRAQ5", ".", "Images", "were", "collected", "by", "super", "-", "resolution", "microscopy", "(", "upper", "panels", ")", ".", "Where", "indicated", ",", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "S735A", "was", "co", "-", "transfected", "with", "cilia", "-", "APEX", "-", "GFP", "vector", "(", "middle", "panels", ")", ".", "NIH3T3", "expressing", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "S735A", "were", "stained", "with", "anti", "-", "ARL13B", "and", "anti", "-", "flag", "antibodies", ".", "D", ",", "E", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "D", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "For", "each", "experimental", "group", ",", "a", "minimum", "of", "40", "cilia", "were", "analyzed", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "p", "*", "*", "*", "<", "0", ",", "001", ".", "F", "F", ".", "HEK293", "cells", "transiently", "transfected", "with", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "S735A", "were", "serum", "deprived", ",", "treated", "with", "FSK", "(", "6", "hours", ")", "and", "stained", "for", "flag", ",", "acetylated", "-", "tubulin", "and", "DRAQ5", ".", "G", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "F", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Cells", "analysed", "for", "each", "experiment", ":", "300", "for", "NT", ",", "80", "for", "flag", "-", "OFD1", "and", "80", "for", "flag", "-", "S735A", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "p", "*", "<", "0", ",", "05", ",", "p", "*", "*", "<", "0", ",", "01", ".", "H"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. siRNA transfected HEK293 cells were serum deprived and stained for acetylated-tubulin, TBC1D31 and DRAQ5. B. Quantitative analysis of the experiments shown in A. A mean value ± SD of four independent experiments is shown. Student's t test *p< 0,05. C C. HEK293 cells expressing flag-OFD1 or flag-S735A were serum deprived and subjected to staining analysis for acetylated α-tubulin, flag and DRAQ5. Images were collected by super-resolution microscopy (upper panels). Where indicated, flag-OFD1 or flag-S735A was co-transfected with cilia-APEX-GFP vector (middle panels). NIH3T3 expressing flag-OFD1 or flag-S735A were stained with anti-ARL13B and anti-flag antibodies. D, E. Statistical analysis of the experiments shown in D. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. For each experimental group, a minimum of 40 cilia were analyzed. Student's t test p***<0,001. F F. HEK293 cells transiently transfected with flag-OFD1 or flag-S735A were serum deprived, treated with FSK (6 hours) and stained for flag, acetylated-tubulin and DRAQ5. G. Statistical analysis of the experiments shown in F. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. Cells analysed for each experiment: 300 for NT, 80 for flag-OFD1 and 80 for flag-S735A. Student's t test, p*<0,05, p**<0,01. H "}
{"words": ["Figure", "7B", ".", "Confocal", "images", "of", "cilia", "of", "the", "neural", "tube", "cells", "in", "the", "wild", "-", "type", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "hTBC1D31", ",", "wild", "-", "type", "hOFD1", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "wild", "-", "type", "hOFD1", ",", "hOFD1S735A", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "hOFD1S735A", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "hOFD1S735D", "and", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "hOFD1S735D", "+", "hpraja2rm", "stained", "with", "anti", "-", "acetylated", "α", "-", "tubulin", "antibody", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B. Confocal images of cilia of the neural tube cells in the wild-type, Ol-TBC1D31 KD, Ol-TBC1D31 KD + hTBC1D31, wild-type hOFD1, Ol-TBC1D31 KD + wild-type hOFD1, hOFD1S735A, Ol-TBC1D31 KD + hOFD1S735A, Ol-TBC1D31 KD + hOFD1S735D and Ol-TBC1D31 KD + hOFD1S735D + hpraja2rm stained with anti-acetylated α-tubulin antibody (green) and DAPI (blue)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Characteristics", "of", "IGR39", "/", "IGR37", "and", "WM115", "/", "WM266", ".", "4", "melanoma", "cell", "lines", "(", "Upper", "Panel", ")", ".", "Pigmentation", "of", "melanoma", "cells", "pellets", "(", "lower", "panel", ")", ".", "B", ".", "Growth", "curve", "of", "primitive", "IGR39", "and", "metastatic", "IGR37", "cell", "line", "(", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "C", ".", "Phase", "-", "contrast", "images", "of", "IGR39", "and", "IGR37", "cells", ".", "Scale", "bar", "is", "100µm", ".", "D", ".", "Analysis", "of", "IGR39", "and", "IGR37", "speed", "of", "migration", "by", "time", "-", "lapse", "microscopy", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Characteristics of IGR39 /IGR37 and WM115/WM266.4 melanoma cell lines (Upper Panel). Pigmentation of melanoma cells pellets (lower panel).B. Growth curve of primitive IGR39 and metastatic IGR37 cell line (N=3 biological replicates). Data are mean ±SD.C. Phase-contrast images of IGR39 and IGR37 cells. Scale bar is 100µm.D. Analysis of IGR39 and IGR37 speed of migration by time-lapse microscopy."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "Scatter", "plot", "of", "identified", "and", "quantified", "proteins", "in", "the", "secretome", "of", "primitive", "IGR39", "and", "metastatic", "IGR37", ".", "Red", "dots", "represent", "proteins", "that", "were", "significant", "with", "FDR", "<", "0", ".", "05", ",", "blue", "dots", "represent", "proteins", "with", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "C", ".", "Scatter", "plot", "of", "identified", "and", "quantified", "proteins", "fin", "the", "secretome", "of", "primitive", "WM115", "and", "metastatic", "WM266", ".", "4", ".", "Red", "dots", "represent", "proteins", "that", "were", "significant", "with", "FDR", "<", "0", ".", "05", ",", "blue", "dots", "represent", "proteins", "with", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "D", ".", "(", "Left", ")", "Venn", "diagram", "of", "the", "significant", "proteins", "shared", "by", "both", "IGR", "and", "WM", "cell", "lines", ".", "(", "Right", ")", "Histograms", "representing", "the", "metastatic", "and", "primitive", "signatures", "H", "/", "M", "ratios", ".", "F", ".", "Confocal", "fluorescence", "images", "of", "Proteostat", "(", "1", ":", "2000", ",", "red", "spots", ")", "and", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", ",", "scale", "bar", "is", "10µm", ".", "G", ".", "Quantitation", "of", "aggregates", "/", "cell", "in", "IGRs", "cell", "lines", "by", "immunofluorescence", "analysis", ",", "left", "panel", ";", "fluorescence", "gain", "of", "soluble", "proteins", "treated", "with", "Proteostat", "reagent", ",", "right", "panel", ".", "(", "T", "-", "test", "analysis", ",", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "data", "are", "mean", "±", "SD", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. Scatter plot of identified and quantified proteins in the secretome of primitive IGR39 and metastatic IGR37. Red dots represent proteins that were significant with FDR <0.05, blue dots represent proteins with p-value<0.05. C. Scatter plot of identified and quantified proteins fin the secretome of primitive WM115 and metastatic WM266.4. Red dots represent proteins that were significant with FDR <0.05, blue dots represent proteins with p-value<0.05. D. (Left)Venn diagram of the significant proteins shared by both IGR and WM cell lines. (Right) Histograms representing the metastatic and primitive signatures H/M ratios.F. Confocal fluorescence images of Proteostat (1:2000, red spots) and DAPI staining (blue), scale bar is 10µm. G. Quantitation of aggregates/cell in IGRs cell lines by immunofluorescence analysis, left panel; fluorescence gain of soluble proteins treated with Proteostat reagent, right panel. (T-test analysis, * = p-value<0.05, N=3 biological replicates, data are mean ±SD). "}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Absolute", "quantitation", "of", "24", ",", "25", "and", "27", "-", "hydroxycholesterol", "in", "primitive", "and", "metastatic", "melanoma", "cells", "as", "indicated", ".", "(", "T", "-", "test", "analysis", ",", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ",", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "data", "are", "mean", "±", "SD", ")", ".", "B", ".", "Histogram", "representing", "R", "square", "of", "correlation", "analysis", "between", "absolute", "quantitation", "of", "24", ",", "25", "and", "27", "-", "hydroxycholesterol", "and", "label", "free", "quantitation", "of", "APOE", "in", "a", "cohort", "of", "primitive", "(", "A375", ",", "IPC298", ")", "and", "metastatic", "(", "SKMEL5", ",", "SKMEL28", ")", "melanoma", "cell", "lines", ".", "C", ".", "Confocal", "fluorescence", "images", "of", "anti", "-", "HMB45", "PMEL", "antibody", "signal", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", "in", "IGR37", "and", "IGR39", ".", "Scale", "bar", "is", "10µm", ".", "D", ".", "Western", "blot", "on", "IGR37", "and", "39", "cellular", "lysates", "probed", "with", "anti", "-", "HMB45", "PMEL", "antibody", "and", "anti", "HDAC2", "to", "check", "the", "loading", "of", "similar", "amount", "of", "total", "lysates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Absolute quantitation of 24, 25 and 27-hydroxycholesterol in primitive and metastatic melanoma cells as indicated. (T-test analysis, ***p-value<0.001, N=3 biological replicates, data are mean ±SD).B. Histogram representing R square of correlation analysis between absolute quantitation of 24, 25 and 27-hydroxycholesterol and label free quantitation of APOE in a cohort of primitive (A375, IPC298) and metastatic (SKMEL5, SKMEL28) melanoma cell lines.C. Confocal fluorescence images of anti-HMB45 PMEL antibody signal (green) and DAPI staining (blue) in IGR37 and IGR39. Scale bar is 10µm.D. Western blot on IGR37 and 39 cellular lysates probed with anti-HMB45 PMEL antibody and anti HDAC2 to check the loading of similar amount of total lysates."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "D", ".", "Immunofluorescence", "images", "with", "Proteostat", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "staining", "on", "(", "A", ")", "human", "normal", "skin", ",", "(", "B", ")", "samples", "of", "primitive", "melanomas", ",", "(", "C", ")", "melanoma", "metastases", "in", "brain", "and", "(", "D", ")", "melanoma", "metastases", "in", "lung", ".", "E", ".", "Details", "of", "brain", "metastases", ".", "Scale", "Bar", "is", "30µm", ".", "F", ".", "Quantitation", "of", "Proteostat", "positive", "dots", "in", "primitive", "vs", "metastatic", "melanoma", "tissues", ":", "6", "tissues", "from", "metastatic", "lesions", "and", "6", "from", "primitive", "melanoma", "lesions", "were", "analysed", ".", "For", "each", "tissue", "two", "sections", "were", "quantified", ".", "T", "-", "test", "analysis", "was", "applied", ".", "T", "-", "test", "analysis", ",", "*", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", "(", "N", "=", "6", ",", "data", "are", "mean", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-D. Immunofluorescence images with Proteostat (red) and DAPI (blue) staining on (A) human normal skin, (B) samples of primitive melanomas, (C) melanoma metastases in brain and (D) melanoma metastases in lung.E. Details of brain metastases. Scale Bar is 30µm. F. Quantitation of Proteostat positive dots in primitive vs metastatic melanoma tissues: 6 tissues from metastatic lesions and 6 from primitive melanoma lesions were analysed. For each tissue two sections were quantified. T-test analysis was applied. T-test analysis, ** = p-value<0.01 (N=6, data are mean ±SEM)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Unsupervised", "hierarchical", "clustering", "of", "the", "proteins", "identified", "and", "quantified", "in", "IGR37", "and", "IGR39", "upon", "treatment", "with", "DMSO", "or", "NB", "-", "360", ".", "B", ".", "Volcano", "plot", "of", "the", "proteins", "secreted", "by", "IGR37", "cells", "treated", "with", "DMSO", "or", "NB", "-", "360", ".", "D", ".", "Confocal", "fluorescence", "images", "of", "Proteostat", "signal", "(", "1", ":", "2000", ",", "red", "spots", ")", "and", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", ",", "scale", "bar", "is", "10µm", ".", "E", ".", "Quantitation", "of", "protein", "aggregates", "in", "IGRs", "by", "immunofluorescence", "analysis", "using", "Fiji", "software", ".", "(", "T", "-", "test", "analysis", ",", "*", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ",", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "data", "are", "mean", "±", "SD", ")", ".", "F", ".", "Quantitation", ",", "by", "immunofluorescence", "analysis", ",", "of", "YAP", "in", "different", "cellular", "compartments", "(", "T", "-", "test", "analysis", ",", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "data", "are", "mean", "±", "SD", ")", ".", "Images", "were", "quantified", "by", "subdividing", "cells", "into", "mostly", "cytosolic", "YAP", "(", "Cytosol", ")", ",", "mostly", "nuclear", "YAP", "(", "Nuclear", ")", ",", "or", "equal", "distribution", "(", "Total", ")", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "G", ".", "mRNA", "levels", "of", "CTGF", "measured", "by", "real", "-", "time", "PCR", "in", "IGR37", "treated", "with", "DMSO", "or", "NB", "-", "360", "(", "T", "-", "test", "analysis", ",", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "data", "are", "mean", "±", "SD", ")", ".", "H", ".", "CTGF", "mRNA", "level", "measured", "by", "real", "-", "time", "PCR", "in", "IGR39", "treated", "with", "IGR39", "conditioned", "medium", "(", "CTRL", ")", "or", "with", "IGR37", "conditioned", "medium", "(", "CM", ")", ",", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "T", "-", "test", "analysis", ",", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ",", "data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "I", ".", "CTGF", "mRNA", "level", "measured", "by", "real", "-", "time", "PCR", "in", "IGR39", "supplemented", "with", "recombinant", "PMEL", "amyloid", "fibrils", "(", "0", ".", "5µM", ")", ",", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "T", "-", "test", "analysis", ":", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ",", "data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "J", ".", "CTGF", "mRNA", "level", "measured", "by", "real", "-", "time", "PCR", "in", "IGR37", "treated", "with", "DMSO", ",", "NB", "-", "360", "or", "NB", "-", "360", "plus", "recombinant", "PMEL", "amyloid", "fibrils", "(", "0", ".", "5µM", ")", ",", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "T", "-", "test", "analysis", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Unsupervised hierarchical clustering of the proteins identified and quantified in IGR37 and IGR39 upon treatment with DMSO or NB-360.B. Volcano plot of the proteins secreted by IGR37 cells treated with DMSO or NB-360.D. Confocal fluorescence images of Proteostat signal (1:2000, red spots) and DAPI staining (blue), scale bar is 10µm. E. Quantitation of protein aggregates in IGRs by immunofluorescence analysis using Fiji software. (T-test analysis, ** = p-value<0.01, N=3 biological replicates, data are mean ±SD). F. Quantitation, by immunofluorescence analysis, of YAP in different cellular compartments (T-test analysis, * = p-value<0.05, N=3 biological replicates, data are mean ±SD). Images were quantified by subdividing cells into mostly cytosolic YAP (Cytosol), mostly nuclear YAP (Nuclear), or equal distribution (Total) from three biological replicates.G. mRNA levels of CTGF measured by real-time PCR in IGR37 treated with DMSO or NB-360 (T-test analysis, * = p-value<0.05, N=3 biological replicates, data are mean ±SD).H. CTGF mRNA level measured by real-time PCR in IGR39 treated with IGR39 conditioned medium (CTRL) or with IGR37 conditioned medium (CM), N=4 biological replicates. T-test analysis, *** p-value <0.001, data are mean ±SD.I. CTGF mRNA level measured by real-time PCR in IGR39 supplemented with recombinant PMEL amyloid fibrils (0.5µM), N=3 biological replicates. T-test analysis: *** p-value <0.001, data are mean ±SD.J. CTGF mRNA level measured by real-time PCR in IGR37 treated with DMSO, NB-360 or NB-360 plus recombinant PMEL amyloid fibrils (0.5µM), N=3 biological replicates. T-test analysis* = p-value<0.05, ** = p-value<0.01. Data are mean ±SD."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "MTT", "assay", "for", "IGRs", "treated", "with", "DMSO", "or", "NB", "-", "360", "(", "25µM", ")", ".", "Biological", "replicates", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "T", "-", "test", "analysis", "*", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "B", ".", "MTT", "assay", "for", "IGRs", "cells", "treated", "with", "DMSO", "or", "inhibitor", "3I", "(", "3µM", ")", ".", "Biological", "replicates", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "T", "-", "test", "analysis", "*", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "C", "-", "D", ".", "MTT", "assay", "of", "IGRs", "treated", "with", "NB", "-", "360", "(", "25µM", ")", "and", "different", "concentration", "of", "doxorubicin", "as", "indicated", ".", "Biological", "replicates", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "T", "-", "test", "analysis", ":", "*", "=", "0", ".", "01", "<", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "E", ".", "T", "-", "test", "analysis", "of", "IC50", "values", "for", "doxorubicin", "used", "alone", "or", "in", "combination", "with", "NB", "-", "360", "(", "combo", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "T", "-", "test", "analysis", ":", "*", "=", "0", ".", "01", "<", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "=", "0", ".", "001", "<", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. MTT assay for IGRs treated with DMSO or NB-360 (25µM). Biological replicates N=4 biological replicates. T-test analysis ** = p-value<0.01, *** p-value <0.001. Data are mean ±SD. B. MTT assay for IGRs cells treated with DMSO or inhibitor 3I (3µM). Biological replicates N=3 biological replicates. T-test analysis ** = p-value<0.01. Data are mean ±SD. C-D. MTT assay of IGRs treated with NB-360 (25µM) and different concentration of doxorubicin as indicated. Biological replicates N=4 biological replicates. T-test analysis: * = 0.01<p-value<0.05, ** = p-value<0.01. Data are mean ±SD.E. T-test analysis of IC50 values for doxorubicin used alone or in combination with NB-360 (combo). Data are mean ±SD. T-test analysis: * = 0.01<p-value<0.05; ** = 0.001<p-value<0.01."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "RGFP966", "(", "966", ")", "-", "dependent", "HDAC3", "inhibition", "resulted", "in", "significant", "and", "robust", "neurite", "outgrowth", "(", "24h", "in", "culture", ")", "compared", "to", "HDAC", "class", "II", ",", "HDAC1", "/", "2", "and", "HDAC1", "or", "3", "inhibitions", "via", "69A", ",", "963", "and", "233", "respectively", ".", "Data", "information", ":", "Data", "expressed", "as", "mean", "fold", "change", "N", "=", "3", "-", "9", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "indicate", "significant", "difference", "of", "966", "versus", "vehicle", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", ".", "B", ",", "C", ".", "Specific", "pharmacological", "inhibition", "of", "HDAC3", "facilitates", "DRG", "neurite", "outgrowth", "(", "average", "neurite", "outgrowth", "after", "24h", "in", "culture", ",", "Tuj1", "positive", "neurons", ")", "on", "PDL", "-", "laminin", "or", "Myelin", "substrates", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "expressed", "as", "average", "neurite", "length", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "-", "9", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "indicate", "significant", "difference", "of", "966", "versus", "vehicle", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "D", ",", "E", ".", "Immunoblotting", "shows", "significantly", "increased", "H3K9", "acetylation", "after", "966", "vs", "vehicle", ".", "Data", "information", ":", "Data", "expressed", "as", "mean", "fold", "change", "N", "=", "3", "-", "9", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "indicate", "significant", "difference", "of", "966", "versus", "vehicle", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "F", ",", "G", ".", "AAV", "-", "mediated", "mutant", "HDAC3", "(", "Y298H", ",", "V5", ")", "infection", "of", "DRG", "neurons", "induces", "neurite", "outgrowth", "(", "Tuj", "-", "1", "/", "V5", "double", "positive", "neurons", ")", "after", "36h", "in", "culture", ",", "which", "is", "repressed", "by", "wildtype", "HDAC3", "overexpression", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "expressed", "as", "average", "neurite", "length", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "-", "9", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "indicate", "significant", "difference", "of", "966", "versus", "V5", "vs", "AAV", "-", "GFP", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. RGFP966 (966)-dependent HDAC3 inhibition resulted in significant and robust neurite outgrowth (24h in culture) compared to HDAC class II, HDAC1/2 and HDAC1 or 3 inhibitions via 69A, 963 and 233 respectively. Data information: Data expressed as mean fold change N= 3-9 biological replicates. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005) indicate significant difference of 966 versus vehicle ANOVA followed by Bonferroni test).B, C. Specific pharmacological inhibition of HDAC3 facilitates DRG neurite outgrowth (average neurite outgrowth after 24h in culture, Tuj1 positive neurons) on PDL-laminin or Myelin substrates. Scale bars, 100 μm. Data information: Data expressed as average neurite length ± s.e.m. N= 3-9 biological replicates. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005) indicate significant difference of 966 versus vehicle Student's t-test)D, E. Immunoblotting shows significantly increased H3K9 acetylation after 966 vs vehicle. Data information: Data expressed as mean fold change N= 3-9 biological replicates. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005) indicate significant difference of 966 versus vehicle Student's t-test)F, G. AAV-mediated mutant HDAC3 (Y298H, V5) infection of DRG neurons induces neurite outgrowth (Tuj-1/V5 double positive neurons) after 36h in culture, which is repressed by wildtype HDAC3 overexpression. Scale bars, 100 μm. Data information: Data expressed as average neurite length ± s.e.m. N= 3-9 biological replicates. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005) indicate significant difference of 966 versus V5 vs AAV-GFP ANOVA followed by Bonferroni test)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "IHC", "in", "DRG", "sections", "for", "pHDAC3", "revealed", "that", "HDAC3", "phosphorylation", "is", "decreased", ",", "primarily", "in", "the", "nucleus", "24h", "after", "sciatic", "nerve", "axotomy", "(", "SNA", ")", "but", "not", "spinal", "dorsal", "column", "axotomy", "(", "DCA", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "B", "-", "C", ".", "Bar", "graphs", "show", "mean", "fold", "change", "levels", "(", "B", ")", "or", "%", "of", "pHDAC3", "+", "cells", "(", "C", ")", "(", "pHDAC3", "+", "threshold", "was", "set", "at", "the", "minimum", "intensity", "level", "of", "sham", "cells", ")", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "DAPI", "counter", "staining", "was", "used", "to", "label", "nuclei", "N", "=", "9", "-", "10", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "indicate", "significant", "difference", "versus", "sham", "or", "laminectomy", "(", "lam", ")", "(", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", ".", "D", ".", "Western", "blot", "revealed", "that", "HDAC3", "phosphorylation", "is", "decreased", "in", "DRG", "nuclear", "extracts", "but", "not", "in", "the", "cytoplasm", "24h", "after", "SNA", ".", "E", ".", "Bar", "graphs", "show", "intensity", "measurement", "of", "nuclear", "vs", "cytoplasm", "immunoblot", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "indicate", "significant", "difference", "versus", "sham", "(", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", ".", "HDAC3", "activity", "(", "HDAC3", "IP", "and", "activity", "assay", ")", "is", "strongly", "reduced", "after", "SNA", "but", "not", "DCA", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "indicate", "significant", "difference", "versus", "sham", "(", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. IHC in DRG sections for pHDAC3 revealed that HDAC3 phosphorylation is decreased, primarily in the nucleus 24h after sciatic nerve axotomy (SNA) but not spinal dorsal column axotomy (DCA). Scale bars, 100 μm.B-C. Bar graphs show mean fold change levels (B) or % of pHDAC3+ cells (C) (pHDAC3+ threshold was set at the minimum intensity level of sham cells) ± s.e.m. DAPI counter staining was used to label nuclei N= 9-10 biological replicates. (***p<0.005) indicate significant difference versus sham or laminectomy (lam) (ANOVA followed by Bonferroni test).D. Western blot revealed that HDAC3 phosphorylation is decreased in DRG nuclear extracts but not in the cytoplasm 24h after SNA. E. Bar graphs show intensity measurement of nuclear vs cytoplasm immunoblot. Data is expressed as mean ± s.e.m. N= 3 biological replicates. (***p<0.005) indicate significant difference versus sham (Student´s t-test). F. HDAC3 activity (HDAC3 IP and activity assay) is strongly reduced after SNA but not DCA. Data is expressed as mean ± s.e.m. N= 3 biological replicates. (*p<0.05) indicate significant difference versus sham (ANOVA followed by Bonferroni test)."}
{"words": ["Figure", "3PP4", "activities", "are", "induced", "after", "SNA", "but", "not", "DCA", ",", "and", "are", "blocked", "by", "the", "calcium", "chelator", "EGTA", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "-", "4", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "indicate", "significant", "difference", "versus", "sham", "or", "lam", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", ".", "PP2", "activities", "are", "induced", "after", "SNA", "but", "not", "DCA", ",", "and", "are", "blocked", "by", "the", "calcium", "chelator", "EGTA", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "-", "4", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "indicate", "significant", "difference", "versus", "sham", "or", "lam", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", ".", "C", ".", "SNA", "but", "not", "DCA", "significantly", "enhances", "calcium", "levels", "in", "DRG", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "indicate", "significant", "difference", "versus", "sham", "or", "lam", "(", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", ".", "D", "-", "F", ".", "Immunoblotting", "of", "DRG", "homogenates", "shows", "that", "nerve", "injury", "-", "dependent", "nuclear", "HDAC3", "dephosphorylation", "is", "reduced", "by", "the", "calcium", "scavenger", "EGTA", "upon", "in", "vivo", "delivery", "on", "the", "injured", "sciatic", "nerve", "(", "Axo", "=", "Axotomy", ")", ".", "Cytoplasmic", "pERK", "levels", "are", "used", "as", "control", "of", "axotomy", "-", "dependent", "signalling", ".", "(", "E", "-", "F", ")", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "fold", "change", "of", "band", "intensity", "levels", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "indicate", "a", "significant", "difference", "(", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", ".", "Significant", "Pearson", "correlations", "between", "calcium", "levels", "(", "Fluo4AM", ")", "and", "H3K9ac", ",", "r2", ":", "0", ".", "7802", "(", "G", ")", "in", "cultured", "DRG", "neurons", "after", "KCl", ".", "The", "Pearson", "correlations", "were", "disrupted", "by", "administration", "of", "Fostriecin", "(", "calcium", "and", "H3K9ac", ",", "r2", ":", "0", ".", "0007", "Data", "is", "expressed", "as", "single", "cell", "fluorescence", "levels", ".", "N", "=", "50", "cells", "per", "condition", "from", "4", "biological", "replicates", ".", "Significant", "Pearson", "correlations", "between", "calcium", "levels", "(", "Fluo4AM", ")", ";", "or", "pHDAC3", ",", "r2", ":", "0", ".", "6366", "(", "H", ")", "in", "cultured", "DRG", "neurons", "after", "KCl", ".", "The", "Pearson", "correlations", "were", "disrupted", "by", "administration", "of", "Fostriecin", "calcium", "and", "pHDAC3", ",", "r2", ":", "0", ".", "3025", ")", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "single", "cell", "fluorescence", "levels", ".", "N", "=", "50", "cells", "per", "condition", "from", "4", "biological", "replicates", ".", "J", "-", "L", ".", "Immunofluorescence", "(", "J", ")", "in", "DRG", "tissue", "sections", "24h", "after", "injury", "in", "vivo", "shows", "that", "the", "PP2a", "/", "PP4", "inhibitor", "Fostriecin", "(", "F", ")", "inhibits", "the", "injury", "-", "induced", "decrease", "in", "pHDAC3", "(", "K", ")", "and", "the", "increase", "in", "H3K9ac", "(", "L", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "K", "-", "L", ")", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "fluorescence", "intensity", "in", "arbitrary", "units", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "(", "L", ")", "or", "4", "(", "K", ")", "biological", "replicates", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "indicate", "significant", "difference", "versus", "sham", "(", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", ".", "M", "-", "N", ".", "Pharmacological", "inhibition", "of", "PP2a", "/", "PP4", "impairs", "conditioning", "-", "induced", "DRG", "neurite", "outgrowth", "ex", "vivo", "(", "12h", "in", "culture", ")", ".", "M", ".", "DRG", "neurite", "outgrowth", "(", "TUJ1", "positive", "cells", ")", "24h", "after", "sham", "or", "sciatic", "nerve", "axotomy", "(", "SNA", ")", "prior", "to", "i", ".", "t", ".", "administration", "of", "vehicle", "(", "V", ")", "or", "Fostriecin", "(", "F", ")", "(", "240µM", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100µm", ".", "(", "N", ")", "Data", "is", "expressed", "as", "average", "neurite", "length", "per", "neuron", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "condition", ",", "technical", "triplicate", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "indicate", "significant", "difference", "versus", "sham", "/", "vehicle", "(", "One", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3PP4 activities are induced after SNA but not DCA, and are blocked by the calcium chelator EGTA. Data is expressed as mean ± s.e.m. N= 3-4 biological replicates. (***p<0.001) indicate significant difference versus sham or lam (Two-way ANOVA followed by Bonferroni test).PP2 activities are induced after SNA but not DCA, and are blocked by the calcium chelator EGTA. Data is expressed as mean ± s.e.m. N= 3-4 biological replicates. (***p<0.001) indicate significant difference versus sham or lam (Two-way ANOVA followed by Bonferroni test).C. SNA but not DCA significantly enhances calcium levels in DRG. Data is expressed as mean ± s.e.m. N= 4 biological replicates. (*p<0.05) indicate significant difference versus sham or lam (ANOVA followed by Bonferroni test).D-F. Immunoblotting of DRG homogenates shows that nerve injury-dependent nuclear HDAC3 dephosphorylation is reduced by the calcium scavenger EGTA upon in vivo delivery on the injured sciatic nerve (Axo=Axotomy). Cytoplasmic pERK levels are used as control of axotomy-dependent signalling. (E-F). Data is expressed as mean fold change of band intensity levels ± s.e.m. N= 3 biological replicates. (**p<0.01, ***p<0.001) indicate a significant difference (ANOVA followed by Bonferroni test).Significant Pearson correlations between calcium levels (Fluo4AM) and H3K9ac, r2: 0.7802 (G) in cultured DRG neurons after KCl. The Pearson correlations were disrupted by administration of Fostriecin (calcium and H3K9ac, r2: 0.0007 Data is expressed as single cell fluorescence levels. N=50 cells per condition from 4 biological replicates.Significant Pearson correlations between calcium levels (Fluo4AM) ; or pHDAC3, r2: 0.6366 (H) in cultured DRG neurons after KCl. The Pearson correlations were disrupted by administration of Fostriecin calcium and pHDAC3, r2: 0.3025). Data is expressed as single cell fluorescence levels. N=50 cells per condition from 4 biological replicates.J-L. Immunofluorescence (J) in DRG tissue sections 24h after injury in vivo shows that the PP2a/PP4 inhibitor Fostriecin (F) inhibits the injury-induced decrease in pHDAC3 (K) and the increase in H3K9ac (L). Scale bar, 10 μm. (K-L). Data is expressed as mean fluorescence intensity in arbitrary units ± s.e.m. N= 3 (L) or 4 (K) biological replicates (*p<0.05; **p<0.01) indicate significant difference versus sham (ANOVA followed by Bonferroni test).M-N. Pharmacological inhibition of PP2a/PP4 impairs conditioning-induced DRG neurite outgrowth ex vivo (12h in culture). M. DRG neurite outgrowth (TUJ1 positive cells) 24h after sham or sciatic nerve axotomy (SNA) prior to i.t. administration of vehicle (V) or Fostriecin (F) (240µM). Scale bar, 100µm. (N) Data is expressed as average neurite length per neuron ± s.e.m. N= 3 biological replicates per condition, technical triplicate. *** p<0.005 indicate significant difference versus sham/vehicle (One way ANOVA followed by Bonferroni)."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "E", ".", "PP4c", "gene", "silencing", "promotes", "HDAC3", "phosphorylation", "in", "the", "presence", "of", "KCl", "(", "A", "-", "C", ",", "arrows", ")", ",", "both", "in", "the", "nucleus", "and", "the", "cytoplasm", "(", "D", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "fold", "change", "vs", "scrambled", "(", "scr", ")", "siRNA", "of", "fluorescent", "intensity", "of", "pHDAC3", "or", "PP4c", "in", "GFP", "positive", "cells", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "indicate", "significant", "difference", "versus", "scrambled", "siRNA", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "PCR", "against", "PP4c", "demonstrates", "silencing", "of", "PP4c", "mRNA", ".", "F", "-", "G", ".", "PP2a", "gene", "silencing", "inhibits", "the", "KCl", "induced", "dephosphorylation", "of", "HDAC3", "as", "shown", "by", "immunoblotting", "of", "pHDAC3", "(", "F", ")", ".", "(", "G", ")", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "fold", "change", "of", "immunoblot", "band", "intensity", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "indicate", "significant", "difference", "versus", "control", "siRNA", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "H", "-", "I", ".", "Genetic", "modification", "of", "activity", "-", "dependent", "phosphorylation", "of", "serine", "424", "of", "HDAC3", "affects", "DRG", "neurite", "outgrowth", ".", "(", "H", ")", "DRG", "neurite", "outgrowth", "after", "transfection", "of", "control", "(", "V5", "control", ")", ",", "WT", "HDAC3", "-", "V5", ",", "phospho", "-", "dead", "HDAC3", "(", "S424A", ")", "-", "V5", "or", "phospho", "-", "mimetic", "HDAC3", "(", "S424D", ")", "-", "V5", "and", "after", "24h", "in", "culture", ".", "Scale", "bar", ",", "50µm", ".", "(", "I", ")", "Data", "is", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "8", "-", "9", "biological", "replicates", ",", "approximately", "35", "V5", "positive", "cells", "each", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "indicate", "significant", "difference", "(", "One", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-E. PP4c gene silencing promotes HDAC3 phosphorylation in the presence of KCl (A-C, arrows), both in the nucleus and the cytoplasm (D). Scale bar, 20 μm. (C,D) Data is expressed as mean fold change vs scrambled (scr) siRNA of fluorescent intensity of pHDAC3 or PP4c in GFP positive cells ± s.e.m. N=3 biological replicates. (**p<0.01; ***p<0.005) indicate significant difference versus scrambled siRNA (Student's t-test). (E) PCR against PP4c demonstrates silencing of PP4c mRNA. F-G. PP2a gene silencing inhibits the KCl induced dephosphorylation of HDAC3 as shown by immunoblotting of pHDAC3 (F). (G) Data is expressed as mean fold change of immunoblot band intensity ± s.e.m. N= 3 biological replicates (*p<0.05; ****p<0.001) indicate significant difference versus control siRNA (Student's t-test). H-I. Genetic modification of activity-dependent phosphorylation of serine 424 of HDAC3 affects DRG neurite outgrowth. (H) DRG neurite outgrowth after transfection of control (V5 control), WT HDAC3-V5, phospho-dead HDAC3 (S424A)-V5 or phospho-mimetic HDAC3 (S424D)-V5 and after 24h in culture. Scale bar, 50µm. (I) Data is expressed as mean ± s.e.m. N= 8-9 biological replicates, approximately 35 V5 positive cells each. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.005 indicate significant difference (One way ANOVA followed by Bonferroni)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "The", "graph", "shows", "the", "number", "of", "differentially", "expressed", "(", "DE", ")", "genes", "24h", "following", "SNA", "or", "DCA", "compared", "to", "their", "respective", "controls", ".", "B", ".", "RNAseq", "read", "counts", "show", "differential", "occupancy", "of", "H3K9ac", "on", "specific", "gene", "regions", ",", "including", "an", "increased", "occupancy", "close", "to", "the", "transcriptional", "start", "site", "(", "TSS", ")", "after", "SNA", "only", ",", "when", "compared", "to", "corresponding", "controls", ".", "C", ".", "Bar", "graph", "shows", "the", "number", "of", "genes", "that", "are", "upregulated", "or", "downregulated", "following", "SNA", "or", "DCA", "(", "RNAseq", ")", "with", "an", "increased", "or", "decreased", "H3K9ac", "occupancy", "(", "ChIPseq", ")", ",", "respectively", ".", "D", ".", "Odds", "ratio", "analysis", "of", "the", "enrichment", "/", "depletion", "of", "genes", "with", "differential", "H3K9ac", "occupancy", "across", "each", "upregulated", "and", "downregulated", "gene", "cluster", "in", "(", "C", ")", ";", "the", "numbers", "in", "red", "represent", "the", "p", "value", "given", "by", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "(", "ns", "=", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. The graph shows the number of differentially expressed (DE) genes 24h following SNA or DCA compared to their respective controls.B. RNAseq read counts show differential occupancy of H3K9ac on specific gene regions, including an increased occupancy close to the transcriptional start site (TSS) after SNA only, when compared to corresponding controls.C. Bar graph shows the number of genes that are upregulated or downregulated following SNA or DCA (RNAseq) with an increased or decreased H3K9ac occupancy (ChIPseq), respectively. D. Odds ratio analysis of the enrichment/depletion of genes with differential H3K9ac occupancy across each upregulated and downregulated gene cluster in (C); the numbers in red represent the p value given by Fisher's exact test (ns= not significant). "}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", ".", "Co", "-", "immunofluorescence", "of", "anti", "-", "neuronal", "and", "anti", "-", "regeneration", "associated", "proteins", "in", "DRG", "following", "SCI", "and", "treatment", "with", "966", "or", "vehicle", ".", "Shown", "is", "increased", "protein", "expression", "for", "regeneration", "-", "associated", "targets", "in", "NF200", "positive", "DRG", "neurons", "(", "arrows", ")", "after", "966", "treatment", "(", "5", "weeks", "following", "SCI", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "B", ")", "Data", "is", "expressed", "as", "fold", "change", "of", "fluorescence", "intensity", "in", "NF200", "+", "cells", ",", "966", "versus", "vehicle", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "4", "-", "7", "biological", "replicates", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "indicate", "significant", "difference", "versus", "vehicle", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B. Co-immunofluorescence of anti-neuronal and anti-regeneration associated proteins in DRG following SCI and treatment with 966 or vehicle. Shown is increased protein expression for regeneration-associated targets in NF200 positive DRG neurons (arrows) after 966 treatment (5 weeks following SCI). Scale bar, 50 μm. (B) Data is expressed as fold change of fluorescence intensity in NF200+ cells, 966 versus vehicle ± s.e.m. N=4-7 biological replicates * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.005 indicate significant difference versus vehicle (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "B", ".", "AAV", "-", "HDAC3", "mutant", "(", "Y298H", ";", "dominant", "negative", "deacetylase", "inactive", ")", "promoted", "DRG", "regenerative", "growth", "after", "spinal", "cord", "injury", "vs", "AAV", "-", "V5", "control", "(", "injected", "5", "weeks", "prior", "to", "SCI", "in", "the", "sciatic", "nerve", "bilaterally", ")", "as", "shown", "by", "dextran", "-", "red", "traced", "axons", "across", "and", "beyond", "the", "lesion", "site", "(", "GFAP", ",", "green", ")", "(", "dotted", "lines", "denote", "the", "rostral", "and", "caudal", "margins", "of", "the", "scar", "around", "the", "lesion", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "(", "A", "-", "B", ")", "200", "μm", ".", "C", "-", "F", ".", "Immunofluorescence", "for", "H3K9ac", ".", "AAV", "-", "HDAC3", "mutant", "induced", "upregulation", "of", "H3K9ac", "in", "vivo", "in", "DRG", "neurons", ",", "but", "not", "in", "surrounding", "nuclei", "of", "satellite", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "(", "C", "-", "F", ")", "50", "μm", ".", "G", "-", "J", ".", "New", "synaptic", "formations", "(", "VGlut1", "+", ")", "from", "regrowing", "axons", "are", "shown", "beyond", "the", "lesion", "site", "after", "injection", "of", "AAV", "-", "HDAC3mut", ".", "(", "G", ")", "Scale", "bar", "200", "μm", ",", "(", "H", "-", "J", ")", "High", "magnification", "insets", "depict", "co", "-", "localization", "of", "Dextran", "and", "vGlut1", "staining", ".", "Scale", "bar", "50", "μm", ".", "K", "-", "L", ".", "Quantification", "of", "dextran", "positive", "axons", "shows", "that", "AAV", "-", "HDAC3mut", "promotes", "DRG", "regenerative", "growth", "across", "and", "beyond", "the", "spinal", "lesion", "site", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "percentage", "of", "dextran", "+", "axons", "at", "each", "distance", "vs", "dextran", "+", "axons", "at", "-", "700μm", "from", "the", "lesion", "margin", "(", "K", ")", "or", "distance", "from", "the", "caudal", "margin", "of", "the", "lesion", "to", "the", "most", "rostral", "dextran", "+", "axon", "tip", "for", "each", "animal", "(", "L", ")", ".", "N", "=", "10", "animals", "per", "condition", ",", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "indicate", "a", "significant", "difference", "(", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-B. AAV-HDAC3 mutant (Y298H; dominant negative deacetylase inactive) promoted DRG regenerative growth after spinal cord injury vs AAV-V5 control (injected 5 weeks prior to SCI in the sciatic nerve bilaterally) as shown by dextran-red traced axons across and beyond the lesion site (GFAP, green) (dotted lines denote the rostral and caudal margins of the scar around the lesion). Scale bar, (A-B) 200 μm.C-F. Immunofluorescence for H3K9ac. AAV-HDAC3 mutant induced upregulation of H3K9ac in vivo in DRG neurons, but not in surrounding nuclei of satellite cells. Scale bar, (C-F) 50 μm.G-J. New synaptic formations (VGlut1+) from regrowing axons are shown beyond the lesion site after injection of AAV-HDAC3mut. (G) Scale bar 200 μm, (H-J) High magnification insets depict co-localization of Dextran and vGlut1 staining. Scale bar 50 μm.K-L. Quantification of dextran positive axons shows that AAV-HDAC3mut promotes DRG regenerative growth across and beyond the spinal lesion site. Data is expressed as percentage of dextran+ axons at each distance vs dextran+ axons at -700μm from the lesion margin (K) or distance from the caudal margin of the lesion to the most rostral dextran+ axon tip for each animal (L). N= 10 animals per condition, ± s.e.m. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, ****p<0.001 indicate a significant difference (ANOVA followed by Bonferroni test)."}
{"words": ["Figure", "8A", "-", "B", ".", "Intrathecally", "administered", "RGFP966", "(", "966", ")", "through", "osmotic", "minipump", "for", "14", "days", "promoted", "DRG", "regenerative", "axonal", "growth", "after", "spinal", "cord", "injury", "as", "shown", "by", "dextran", "-", "red", "traced", "axons", "across", "and", "beyond", "the", "lesion", "site", "(", "GFAP", ",", "green", ")", "(", "dotted", "lines", "denote", "the", "rostral", "and", "caudal", "margins", "of", "the", "scar", "around", "the", "lesion", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "C", "-", "D", ".", "Quantification", "of", "axonal", "regeneration", "shows", "dextran", "axonal", "labelling", "across", "and", "beyond", "the", "spinal", "lesion", "site", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "ratio", "of", "dextran", "+", "axons", "vs", "dextran", "+", "axons", "at", "-", "700", "μm", "from", "the", "lesion", "site", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "(", "C", ")", "or", "distance", "from", "the", "caudal", "margin", "of", "the", "lesion", "to", "the", "last", "dextran", "+", "axon", "tip", "(", "D", ")", ".", "N", "=", "6", "-", "10", "animals", "per", "condition", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "indicate", "a", "significant", "difference", "(", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", ".", "E", ".", "Immunofluorescence", "for", "H3K9ac", "and", "Neurofilament", "200", "(", "NF200", ")", "shows", "upregulated", "H3K9ac", "in", "vivo", "in", "DRG", "neurons", "after", "966", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "F", "-", "G", ".", "Data", "is", "expressed", "as", "fold", "change", "of", "fluorescence", "intensity", "mean", "levels", "(", "F", ")", "or", "%", "of", "H3K9ac", "+", "cells", "(", "G", ")", "(", "H3K9ac", "+", "threshold", "was", "set", "at", "the", "mean", "intensity", "level", "of", "vehicle", "treated", "animals", ",", "DAPI", "counter", "staining", "was", "used", "to", "label", "nuclei", "from", "NF200", "+", "or", "NF200", "-", "cells", ")", "vs", "veh", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "11", "-", "12", "biological", "replicates", ".", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "indicate", "a", "significant", "difference", "vs", "respective", "Veh", "(", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A-B. Intrathecally administered RGFP966 (966) through osmotic minipump for 14 days promoted DRG regenerative axonal growth after spinal cord injury as shown by dextran-red traced axons across and beyond the lesion site (GFAP, green) (dotted lines denote the rostral and caudal margins of the scar around the lesion). Scale bar, 200 μm.C-D. Quantification of axonal regeneration shows dextran axonal labelling across and beyond the spinal lesion site. Data is expressed as ratio of dextran+ axons vs dextran+ axons at -700 μm from the lesion site ± s.e.m (C) or distance from the caudal margin of the lesion to the last dextran+ axon tip (D). N= 6-10 animals per condition. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, ****p<0.001) indicate a significant difference (ANOVA followed by Bonferroni test).E. Immunofluorescence for H3K9ac and Neurofilament 200 (NF200) shows upregulated H3K9ac in vivo in DRG neurons after 966. Scale bar, 50 µm.F-G. Data is expressed as fold change of fluorescence intensity mean levels (F) or % of H3K9ac+ cells (G) (H3K9ac+ threshold was set at the mean intensity level of vehicle treated animals, DAPI counter staining was used to label nuclei from NF200+ or NF200- cells) vs veh± s.e.m. N= 11-12 biological replicates. (***p<0.005) indicate a significant difference vs respective Veh (ANOVA followed by Bonferroni test)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "10", "nM", "control", "(", "n", "=", "84", ")", "or", "Nup50", "siRNA", "(", "n", "=", "171", ")", ",", "20", "nM", "control", "(", "n", "=", "101", ")", "or", "Nup50", "siRNA", "(", "n", "=", "157", ")", "and", "40", "nM", "control", "(", "n", "=", "86", ")", "or", "Nup50", "siRNA", "(", "n", "=", "204", ")", ".", "72", "h", "post", "transfection", ",", "cells", "were", "fixed", "with", "4", "%", "PFA", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "Nup50", "and", "mAB414", ",", "chromatin", "was", "labeled", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "Quantitation", "of", "the", "mAB414", "rim", "intensity", "at", "three", "different", "Nup50", "RNAi", "and", "control", "oligo", "concentrations", ".", "The", "means", "are", "indicated", "as", "diamonds", ",", "error", "bars", "show", "the", "standard", "deviations", ".", "P", "-", "values", "have", "been", "calculated", "from", "a", "student", "t", "-", "test", "comparing", "the", "mean", "between", "the", "experimental", "conditions", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) HeLa cells were transfected with 10 nM control (n=84) or Nup50 siRNA (n=171), 20 nM control (n=101) or Nup50 siRNA (n=157) and 40 nM control (n=86) or Nup50 siRNA (n=204). 72 h post transfection, cells were fixed with 4% PFA and stained with antibodies against Nup50 and mAB414, chromatin was labeled with DAPI. Scale bars: 50 µm. Quantitation of the mAB414 rim intensity at three different Nup50 RNAi and control oligo concentrations. The means are indicated as diamonds, error bars show the standard deviations. P-values have been calculated from a student t-test comparing the mean between the experimental conditions."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Mouse", "3T3", "-", "NIH", "cells", "were", "transfected", "with", "20", "nM", "control", ",", "Nup50A", ",", "Nup50B", "or", "a", "combination", "of", "Nup50A", "and", "Nup50B", "siRNA", ".", "After", "72h", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "mAB414", "(", "green", ")", "and", "antibodies", "against", "mouse", "Nup50", "(", "red", ")", ".", "Chromatin", "is", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "of", "the", "three", "channels", "is", "shown", "on", "the", "left", "column", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "An", "insert", "shows", "a", "zoom", "on", "a", "representative", "nucleus", "for", "each", "picture", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantitation", "of", "the", "mAB414", "rim", "intensity", "from", "n", "=", "4", "independent", "experiments", "done", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "each", "represented", "by", "a", "different", "color", ".", "The", "mean", "of", "each", "individual", "experiment", "and", "condition", "is", "represented", "by", "a", "diamond", ",", "the", "mean", "of", "all", "four", "experiments", "by", "a", "horizontal", "black", "line", ".", "P", "-", "values", "have", "been", "calculated", "from", "a", "paired", "ratio", "t", "-", "test", "comparing", "the", "mean", "between", "the", "experimental", "conditions", ".", "Error", "bars", "show", "the", "standard", "deviations", "of", "the", "means", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Mouse 3T3-NIH cells were transfected with 20 nM control, Nup50A, Nup50B or a combination of Nup50A and Nup50B siRNA. After 72h cells were fixed and stained with mAB414 (green) and antibodies against mouse Nup50 (red). Chromatin is stained with DAPI (blue). The merge of the three channels is shown on the left column. Scale bar: 50 µm. An insert shows a zoom on a representative nucleus for each picture. Scale bar: 10 µm.(B) Quantitation of the mAB414 rim intensity from n=4 independent experiments done as in (A), each represented by a different color. The mean of each individual experiment and condition is represented by a diamond, the mean of all four experiments by a horizontal black line. P-values have been calculated from a paired ratio t-test comparing the mean between the experimental conditions. Error bars show the standard deviations of the means."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ")", "Demembranated", "sperm", "chromatin", "was", "preincubated", "in", "Xenopus", "egg", "extract", ",", "depleted", "for", "MEL28", "/", "ELYS", "or", "Nup50", "(", "B", ")", "or", "control", "treated", "(", "Mock", ",", "A", ")", ".", "After", "10", "min", ",", "membranes", "were", "added", "to", "the", "reaction", ".", "Reactions", "were", "stopped", "at", "the", "indicated", "time", "points", "by", "fixation", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", "after", "immunostaining", "with", "α", "-", "MEL28", "/", "ELYS", "(", "A", ")", ",", "α", "-", "Nup50", "(", "B", ")", ",", "and", "mAb414", "(", "A", ",", "B", ")", ".", "Chromatin", "was", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", "in", "the", "overlay", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A, B) Demembranated sperm chromatin was preincubated in Xenopus egg extract, depleted for MEL28/ELYS or Nup50 (B) or control treated (Mock, A). After 10 min, membranes were added to the reaction. Reactions were stopped at the indicated time points by fixation and analyzed by confocal microscopy after immunostaining with α-MEL28/ELYS (A), α-Nup50 (B), and mAb414 (A, B). Chromatin was stained with DAPI (blue in the overlay). Scale bar: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "43", "µM", "recombinant", "EGFP", ",", "EGFP", "-", "tagged", "MEL28", "/", "ELYS", "(", "aa", "2290", "-", "2408", ")", "or", "EGFP", "-", "tagged", "Nup50", "were", "incubated", "with", "empty", "or", "DNA", "-", "coated", "magnetic", "beads", ",", "which", "were", "chromatinized", "with", "Xenopus", "egg", "extracts", "(", "right", "panel", ")", "or", "unchromatinized", "DNA", "-", "beads", "(", "left", "panel", ")", ".", "After", "3h", "the", "beads", "were", "re", "-", "isolated", ",", "washed", ",", "co", "-", "stained", "with", "DAPI", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 43 µM recombinant EGFP, EGFP-tagged MEL28/ELYS (aa 2290-2408) or EGFP-tagged Nup50 were incubated with empty or DNA-coated magnetic beads, which were chromatinized with Xenopus egg extracts (right panel) or unchromatinized DNA-beads (left panel). After 3h the beads were re-isolated, washed, co-stained with DAPI and analyzed by confocal microscopy. Scale bar: 10 µm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "EGFP", "-", "Nup50", "comprising", "different", "point", "mutations", "in", "the", "minimal", "NPC", "binding", "region", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Scale", "Bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "D", ")", "GST", "-", "fusion", "constructs", "of", "the", "Xenopus", "Nup50", "minimal", "NPC", "binding", "fragment", "(", "aa", "144", "-", "189", ")", "comprising", "no", "or", "single", "point", "mutations", "were", "incubated", "with", "Xenopus", "egg", "extracts", ".", "Starting", "material", "as", "well", "as", "bound", "proteins", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "The", "quantitation", "shows", "the", "average", "MEL28", "/", "ELYS", "and", "Nup153", "bead", "bound", "signal", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "normalized", "to", "the", "signal", "of", "their", "respective", "wild", "-", "type", "GST", "fusion", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) HeLa cells were transfected with EGFP-Nup50 comprising different point mutations in the minimal NPC binding region and analyzed as in (A). Scale Bar: 10 µm.(D) GST-fusion constructs of the Xenopus Nup50 minimal NPC binding fragment (aa 144-189) comprising no or single point mutations were incubated with Xenopus egg extracts. Starting material as well as bound proteins were analyzed by Western blotting with indicated antibodies. The quantitation shows the average MEL28/ELYS and Nup153 bead bound signal from three independent experiments, normalized to the signal of their respective wild-type GST fusion Data points from individual experiments are indicated."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "nuclei", "assembled", "for", "120", "min", "in", "mock", "depleted", ",", "Nup50", "depleted", "(", "∆", "Nup50", ")", ",", "and", "Nup50", "depleted", "Xenopus", "egg", "extracts", "supplemented", "with", "recombinant", "wild", "-", "type", "Nup50", "or", "different", "mutants", ".", "Nuclei", "were", "fixed", "in", "4", "%", "PFA", "and", "0", ".", "5", "%", "glutaraldehyde", ",", "stained", "for", "NPCs", "(", "mAB414", ")", "and", "the", "chromatin", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "Average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "points", "from", "the", "individual", "experiments", "are", "indicated", ".", "(", "C", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "nuclei", "assembled", "with", "N", "-", "terminal", "Nup50", "truncations", "and", "an", "minimal", "N", "-", "terminal", "fragment", ".", "Samples", "were", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "D", ")", "Average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "points", "from", "the", "individual", "experiments", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Confocal microscopy images of nuclei assembled for 120 min in mock depleted, Nup50 depleted (∆Nup50), and Nup50 depleted Xenopus egg extracts supplemented with recombinant wild-type Nup50 or different mutants. Nuclei were fixed in 4% PFA and 0.5 % glutaraldehyde, stained for NPCs (mAB414) and the chromatin (DAPI). Scale bar: 10 µm. (B) Average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of at least three independent experiments shown in (A). Data points from the individual experiments are indicated. (C) Confocal microscopy images of nuclei assembled with N-terminal Nup50 truncations and an minimal N-terminal fragment. Samples were analyzed as in (A). (D) Average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of at least three independent experiments shown in (C). Data points from the individual experiments are indicated. "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "fixed", "nuclei", "assembled", "for", "120", "min", "in", "mock", "depleted", "(", "mock", ")", "and", "Nup50", "depleted", "(", "∆", "Nup50", ")", "Xenopus", "egg", "extracts", "supplemented", "with", "recombinant", "mouse", "Nup50", "orthologues", ".", "Nuclei", "were", "stained", "for", "Nup50", "(", "Nup50", "antibody", "for", "Xenopus", "protein", ",", "His6", "for", "mouse", "protein", ")", "and", "NPCs", "(", "mAB414", ",", "red", ")", "on", "the", "chromatin", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "The", "average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "performed", "as", "in", "B", ")", "is", "shown", ".", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", ".", "(", "E", ")", "GST", "-", "fusion", "constructs", "of", "the", "Xenopus", "Nup53", "RRM", "domain", "(", "aa", "162", "-", "267", ",", "control", ")", "full", "-", "length", "Xenopus", "Nup50", "and", "the", "two", "mouse", "Nup50", "orthologues", "were", "incubated", "with", "Xenopus", "egg", "extracts", ".", "Starting", "material", "as", "well", "as", "bound", "proteins", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "indicated", "antibodies", "The", "right", "panel", "shows", "the", "average", "MEL28", "/", "ELYS", ",", "Nup153", ",", "importin", "β", "and", "ran", "bead", "bound", "signal", "from", "two", "independent", "experiments", "normalized", "to", "their", "respective", "Xenopus", "signal", ".", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Confocal microscopy images of fixed nuclei assembled for 120 min in mock depleted (mock) and Nup50 depleted (∆Nup50) Xenopus egg extracts supplemented with recombinant mouse Nup50 orthologues. Nuclei were stained for Nup50 (Nup50 antibody for Xenopus protein, His6 for mouse protein) and NPCs (mAB414, red) on the chromatin (DAPI). Scale bar: 10 µm. (C) The average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of three independent experiments (performed as in B) is shown. Data points from individual experiments are indicated. (E) GST-fusion constructs of the Xenopus Nup53 RRM domain (aa 162-267, control) full-length Xenopus Nup50 and the two mouse Nup50 orthologues were incubated with Xenopus egg extracts. Starting material as well as bound proteins were analyzed by Western blotting with indicated antibodies The right panel shows the average MEL28/ELYS, Nup153, importin β and ran bead bound signal from two independent experiments normalized to their respective Xenopus signal. Data points from individual experiments are indicated."}
{"words": ["Figure", "8HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "FLAG", "-", "tag", "vector", "as", "a", "control", "or", "FLAG", "-", "Nup50", "N", "-", "terminal", "fragment", "(", "aa", "1", "-", "120", "of", "the", "human", "sequence", ")", ".", "24", "h", "post", "transfection", "cells", "were", "lysed", ",", "FLAG", "-", "tagged", "proteins", "immuno", "-", "isolated", "and", "analyzed", "by", "mass", "spectrometry", "with", "the", "Volcano", "blot", "showing", "the", "identified", "interactors", "of", "Nup50", "(", "yellow", ",", "data", "from", "three", "independent", "experiments", ")", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", ".", "KPNA2", "is", "the", "gene", "name", "of", "importin", "α", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "FLAG", "-", "tag", "vector", "as", "a", "control", "or", "FLAG", "-", "Nup50", "N", "-", "terminal", "fragment", "(", "aa", "1", "-", "120", "of", "the", "human", "sequence", ")", ".", "24", "h", "post", "transfection", "cells", "were", "lysed", ",", "FLAG", "-", "tagged", "proteins", "immuno", "-", "isolated", "and", "analyzed", "by", "western", "blotting", "(", "B", ")", ",", "with", "10", "%", "of", "the", "inputs", "loaded", ".", "The", "quantification", "of", "the", "western", "blot", "(", "B", ",", "lower", "panel", ")", "shows", "the", "mean", "signal", "intensity", "normalized", "on", "the", "input", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", ".", "(", "E", ")", "2", "µM", "recombinant", "Ran", ",", "loaded", "with", "MANT", "-", "GDP", "was", "incubated", "with", "2", "mM", "GppNHp", "in", "buffer", "control", ",", "supplemented", "with", "2", "nM", "recombinant", "RCC1", ",", "20", "nM", "recombinant", "Xenopus", "Nup50", "proteins", ",", "or", "RCC1", "and", "Nup50", "together", ".", "GDP", "to", "GppNHp", "exchanged", "was", "monitored", "by", "the", "decrease", "in", "MANT", "fluorescence", "of", "the", "liberated", "GDP", "-", "MANT", ".", "The", "lower", "panel", "shows", "the", "rate", "constant", "of", "each", "experimental", "condition", "with", "n", "=", "4", "independent", "experiment", "per", "condition", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "individual", "data", "points", "are", "indicated", ".", "(", "G", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "nuclei", "assembled", "for", "120", "min", "in", "mock", "depleted", ",", "Nup50", "depleted", "(", "∆", "Nup50", ")", ",", "and", "Nup50", "depleted", "Xenopus", "egg", "extracts", "supplemented", "with", "recombinant", "Xenopus", "wild", "-", "type", "Nup50", "or", "RCC1", "binding", "mutants", ".", "Nuclei", "were", "fixed", "in", "4", "%", "PFA", "and", "0", ".", "5", "%", "glutaraldehyde", ",", "stained", "for", "NPCs", "(", "mAB414", ")", "and", "the", "chromatin", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Quantitation", "shows", "the", "average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Individual", "data", "points", "are", "indicated", "(", "H", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "nuclei", "assembled", "for", "120", "min", "in", "mock", "depleted", ",", "Nup50", "depleted", "(", "∆", "Nup50", ")", ",", "and", "Nup50", "depleted", "Xenopus", "egg", "extracts", "supplemented", "with", "RCC1", "excess", "as", "indicated", ".", "Nuclei", "were", "fixed", "in", "4", "%", "PFA", "and", "0", ".", "5", "%", "glutaraldehyde", ",", "stained", "for", "NPCs", "(", "mAB414", ")", "and", "the", "chromatin", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Quantitation", "shows", "the", "average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Individual", "data", "points", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8HEK293T cells were transfected with empty FLAG-tag vector as a control or FLAG-Nup50 N-terminal fragment (aa 1-120 of the human sequence). 24 h post transfection cells were lysed, FLAG-tagged proteins immuno-isolated and analyzed by mass spectrometry with the Volcano blot showing the identified interactors of Nup50 (yellow, data from three independent experiments) Data points from individual experiments are indicated. KPNA2 is the gene name of importin α.HEK293T cells were transfected with empty FLAG-tag vector as a control or FLAG-Nup50 N-terminal fragment (aa 1-120 of the human sequence). 24 h post transfection cells were lysed, FLAG-tagged proteins immuno-isolated and analyzed by western blotting (B), with 10% of the inputs loaded. The quantification of the western blot (B, lower panel) shows the mean signal intensity normalized on the input of at least two independent experiments. Data points from individual experiments are indicated.(E) 2 µM recombinant Ran, loaded with MANT-GDP was incubated with 2 mM GppNHp in buffer control, supplemented with 2 nM recombinant RCC1, 20 nM recombinant Xenopus Nup50 proteins, or RCC1 and Nup50 together. GDP to GppNHp exchanged was monitored by the decrease in MANT fluorescence of the liberated GDP-MANT. The lower panel shows the rate constant of each experimental condition with n=4 independent experiment per condition, bars represent the mean, individual data points are indicated.(G) Confocal microscopy images of nuclei assembled for 120 min in mock depleted, Nup50 depleted (∆Nup50), and Nup50 depleted Xenopus egg extracts supplemented with recombinant Xenopus wild-type Nup50 or RCC1 binding mutants. Nuclei were fixed in 4 % PFA and 0.5 % glutaraldehyde, stained for NPCs (mAB414) and the chromatin (DAPI). Scale bar: 10 µm. Quantitation shows the average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of three independent experiments. Individual data points are indicated (H) Confocal microscopy images of nuclei assembled for 120 min in mock depleted, Nup50 depleted (∆Nup50), and Nup50 depleted Xenopus egg extracts supplemented with RCC1 excess as indicated. Nuclei were fixed in 4 % PFA and 0.5 % glutaraldehyde, stained for NPCs (mAB414) and the chromatin (DAPI). Scale bar: 10 µm. Quantitation shows the average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of three independent experiments. Individual data points are indicated. "}
{"words": ["Figure", "1Effects", "of", "basic", "and", "bulky", "hydrophobic", "amino", "acids", "on", "LT", "-", "induced", "pyroptosis", "and", "caspase", "-", "1", "activation", "in", "RAWRA", "cells", ".", "Cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "10", "mM", "indicated", "amino", "acids", "prior", "to", "LT", "stimulation", ".", "Cell", "viability", "was", "measured", "by", "using", "the", "ATP", "assay", "and", "data", "shown", "are", "mean", "values", "±", "SD", "from", "three", "replicates", "(", "A", ")", ".", "Mock", ",", "DMEM", "medium", ".", "Cell", "supernatants", "were", "subjected", "to", "anti", "-", "caspase", "-", "1", "immunoblotting", "and", "the", "lysates", "were", "blotted", "with", "the", "anti", "-", "tubulin", "antibody", "(", "B", ")", ".", "p10", ",", "mature", "caspase", "-", "1", ";", "p45", ",", "caspase", "-", "1", "precursor", ".", "C", ",", "D", "Effects", "of", "basic", "and", "bulky", "hydrophobic", "amino", "acids", "on", "LT", "-", "induced", "RFP", "-", "ASC", "specks", "formation", "in", "RAWRA", "cells", ".", "Fluorescence", "images", "were", "taken", "on", "a", "confocal", "microscopy", "(", "C", ")", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "showing", "RFP", "-", "ASC", "specks", "(", "mean", "values", "±", "SD", "from", "three", "replicates", ")", "are", "in", "(", "D", ")", ".", "E", "Effects", "of", "basic", "and", "bulky", "hydrophobic", "amino", "acids", "on", "LT", "-", "induced", "caspase", "-", "1", "activation", "in", "Tlr4", "-", "/", "-", "iBMDMs", ".", "Cells", "were", "treated", "as", "that", "in", "(", "A", ")", ".", "Cell", "supernatants", "were", "subjected", "to", "anti", "-", "caspase", "-", "1", "immunoblotting", "and", "the", "lysates", "were", "blotted", "with", "the", "anti", "-", "tubulin", "or", "anti", "-", "MEK3", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Effects of basic and bulky hydrophobic amino acids on LT-induced pyroptosis and caspase-1 activation in RAWRA cells. Cells were pre-treated with 10 mM indicated amino acids prior to LT stimulation. Cell viability was measured by using the ATP assay and data shown are mean values ± SD from three replicates (A). Mock, DMEM medium.Cell supernatants were subjected to anti-caspase-1 immunoblotting and the lysates were blotted with the anti-tubulin antibody (B). p10, mature caspase-1; p45, caspase-1 precursor.C, D Effects of basic and bulky hydrophobic amino acids on LT-induced RFP-ASC specks formation in RAWRA cells. Fluorescence images were taken on a confocal microscopy (C). The percentages of cells showing RFP-ASC specks (mean values ± SD from three replicates) are in (D).E Effects of basic and bulky hydrophobic amino acids on LT-induced caspase-1 activation in Tlr4-/- iBMDMs. Cells were treated as that in (A). Cell supernatants were subjected to anti-caspase-1 immunoblotting and the lysates were blotted with the anti-tubulin or anti-MEK3 antibody."}
{"words": ["Figure", "2A", "RFP", "-", "ASC", "specks", "formation", "assay", "of", "the", "effect", "of", "Ubr2", "knockdown", "on", "LT", "-", "induced", "inflammasome", "activation", ".", "RAWRA", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "control", "siRNA", "or", "Ubr2", "-", "targeting", "siRNA", "mixtures", "for", "60", "h", "followed", "by", "LT", "treatment", ".", "The", "numbers", "in", "the", "merged", "panel", "are", "the", "percentages", "of", "the", "cells", "showing", "RFP", "-", "ASC", "specks", ".", "B", "Effect", "of", "Ubr2", "stable", "knockdown", "on", "caspase", "-", "1", "activation", "in", "RAWRA", "cells", ".", "Cells", "stably", "expressing", "a", "control", "or", "Ubr2", "-", "targeting", "shRNA", "were", "incubated", "with", "WT", "LT", "(", "+", ")", "or", "its", "E687C", "mutant", "(", "-", ")", "for", "3", "h", ".", "C", "Effects", "of", "Ubr2", "knockdown", "(", "siRNA", "#", "05", ")", "on", "LT", "-", "induced", "NLRP1B", "inflammasome", "activation", "reconstituted", "in", "293T", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "WT", "LT", "(", "+", ")", "or", "its", "E687C", "mutant", "(", "-", ")", ".", "D", ",", "E", "Effect", "of", "Ubr2", "knockout", "on", "NLRP1B", "or", "NAIP2", "-", "NLRC4", "inflammasome", "activation", ".", "WT", "and", "Ubr2", "-", "/", "-", "iBMDMs", "were", "treated", "with", "LT", "or", "BsaK", "for", "3", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "measured", "by", "using", "the", "ATP", "assay", "and", "data", "shown", "are", "mean", "values", "±", "SD", "from", "three", "replicates", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A RFP-ASC specks formation assay of the effect of Ubr2 knockdown on LT-induced inflammasome activation. RAWRA cells were transfected with a control siRNA or Ubr2-targeting siRNA mixtures for 60 h followed by LT treatment. The numbers in the merged panel are the percentages of the cells showing RFP-ASC specks.B Effect of Ubr2 stable knockdown on caspase-1 activation in RAWRA cells. Cells stably expressing a control or Ubr2-targeting shRNA were incubated with WT LT (+) or its E687C mutant (-) for 3 h.C Effects of Ubr2 knockdown (siRNA #05) on LT-induced NLRP1B inflammasome activation reconstituted in 293T cells. Cells were treated with WT LT (+) or its E687C mutant (-).D, E Effect of Ubr2 knockout on NLRP1B or NAIP2-NLRC4 inflammasome activation. WT and Ubr2-/- iBMDMs were treated with LT or BsaK for 3 h. Cell viability was measured by using the ATP assay and data shown are mean values ± SD from three replicates (D)."}
{"words": ["Figure", "3A", "Immunoblotting", "of", "caspase", "-", "1", "activation", "in", "Ubrs", "-", "knockdown", "BMDMs", "derived", "from", "the", "129", "/", "Sv", "mice", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", "for", "60", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "WT", "LT", "(", "+", ")", "or", "its", "E687C", "mutant", "(", "-", ")", "for", "3", "h", ".", "Immunoblotting", "of", "caspase", "-", "1", "activation", "in", "E2s", "-", "knockdown", "BMDMs", "derived", "from", "the", "129", "/", "Sv", "mice", ".", "Additional", "Ube2o", "siRNAs", "were", "used", "to", "confirm", "the", "inhibitory", "effect", "of", "Ube2o", "knockdown", "on", "LT", "-", "induced", "caspase", "-", "1", "activation", "(", "C", ")", ".", "Ube2o", "knockdown", "efficiency", "was", "measured", "by", "qPCR", "and", "are", "shown", "as", "mean", "values", "±", "SD", "from", "three", "replicates", ".", "RFP", "-", "ASC", "specks", "formation", "assay", "of", "the", "effect", "of", "Ube2o", "knockdown", "(", "siRNA", "Ube2o", "-", "01", ")", "on", "LT", "-", "induced", "inflammasome", "activation", "in", "RAWRA", "cells", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "showing", "RFP", "-", "ASC", "specks", "(", "mean", "values", "±", "SD", "from", "three", "replicates", ")", "are", "in", "(", "D", ")", ".", "F", "Co", "-", "immunoprecipitation", "interaction", "of", "UBE2O", "and", "UBR2", ".", "Myc", "-", "UBE2O", "and", "Flag", "-", "UBR2", "were", "co", "-", "expressed", "in", "293T", "cells", "and", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "anti", "-", "Flag", "immunoprecipitation", "followed", "by", "immunoblotting", "analyses", "as", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Immunoblotting of caspase-1 activation in Ubrs-knockdown BMDMs derived from the 129/Sv mice. Cells were transfected with the indicated siRNA for 60 h, and then treated with WT LT (+) or its E687C mutant (-) for 3 h.Immunoblotting of caspase-1 activation in E2s-knockdown BMDMs derived from the 129/Sv mice.Additional Ube2o siRNAs were used to confirm the inhibitory effect of Ube2o knockdown on LT-induced caspase-1 activation (C). Ube2o knockdown efficiency was measured by qPCR and are shown as mean values ± SD from three replicates.RFP-ASC specks formation assay of the effect of Ube2o knockdown (siRNA Ube2o-01) on LT-induced inflammasome activation in RAWRA cells. The percentages of cells showing RFP-ASC specks (mean values ± SD from three replicates) are in (D).F Co-immunoprecipitation interaction of UBE2O and UBR2. Myc-UBE2O and Flag-UBR2 were co-expressed in 293T cells and cell lysates were subjected to anti-Flag immunoprecipitation followed by immunoblotting analyses as shown."}
{"words": ["Figure", "4B", "Effect", "of", "LT", "treatment", "on", "NLRP1B", "protein", "level", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "NLRP1B", "expression", "plasmid", "for", "24", "h", ",", "and", "cells", "were", "then", "treated", "with", "WT", "LT", "(", "+", ")", "or", "its", "E687C", "mutant", "(", "-", ")", "for", "4", "h", ".", "Shown", "is", "the", "anti", "-", "Flag", "immunoblot", "of", "the", "total", "cell", "lysates", ".", "C", "RFP", "-", "ASC", "specks", "formation", "in", "293T", "cells", "expressing", "an", "indicated", "NLRP1B", "variant", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "LT", "for", "3", "h", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "1", "-", "983", "and", "984", "-", "C", "(", "residues", "984", "to", "the", "C", "terminus", ")", "are", "the", "FIIND", "-", "mediated", "autocleaved", "fragments", "of", "NLRP1B", ".", "Effect", "of", "MG132", "on", "LT", "-", "induced", "NLRP1B", "degradation", ".", "293T", "cells", "expressing", "NLRP1B", "(", "1", "-", "983", ")", "-", "HA", "were", "treated", "with", "LT", "and", "MG132", "for", "8", "h", ".", "Shown", "are", "the", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "tubulin", "immunoblots", "of", "the", "total", "cell", "lysates", ".", "E", "Effect", "of", "MG132", "and", "Leu", "on", "LT", "-", "induced", "NLRP1B", "degradation", ".", "293T", "cells", "expressing", "NLRP1B", "(", "1", "-", "983", ")", "-", "HA", "were", "treated", "with", "LT", "and", "MG132", "for", "8", "h", ".", "10", "mM", "Leu", "was", "added", "to", "cells", "30", "min", "prior", "to", "LT", "treatment", ".", "Shown", "are", "the", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "tubulin", "immunoblots", "of", "the", "total", "cell", "lysates", ".", "F", "LT", "-", "induced", "ubiquitination", "of", "NLRP1B", ".", "293T", "cells", "expressing", "NLRP1B", "(", "1", "-", "983", ")", "-", "HA", "were", "treated", "with", "LT", "and", "/", "or", "MG132", "for", "6", "h", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "for", "anti", "-", "HA", "immunoprecipitation", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "analyses", "using", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Effect of LT treatment on NLRP1B protein level. 293T cells were transfected with Flag-NLRP1B expression plasmid for 24 h, and cells were then treated with WT LT (+) or its E687C mutant (-) for 4 h. Shown is the anti-Flag immunoblot of the total cell lysates.C RFP-ASC specks formation in 293T cells expressing an indicated NLRP1B variant. Cells were treated with LT for 3 h. Scale bar, 20 μm. 1-983 and 984-C (residues 984 to the C terminus) are the FIIND-mediated autocleaved fragments of NLRP1B.Effect of MG132 on LT-induced NLRP1B degradation. 293T cells expressing NLRP1B (1-983)-HA were treated with LT and MG132 for 8 h. Shown are the anti-HA and anti-tubulin immunoblots of the total cell lysates.E Effect of MG132 and Leu on LT-induced NLRP1B degradation. 293T cells expressing NLRP1B (1-983)-HA were treated with LT and MG132 for 8 h. 10 mM Leu was added to cells 30 min prior to LT treatment. Shown are the anti-HA and anti-tubulin immunoblots of the total cell lysates.F LT-induced ubiquitination of NLRP1B. 293T cells expressing NLRP1B (1-983)-HA were treated with LT and/or MG132 for 6 h. Cells were then harvested for anti-HA immunoprecipitation and subjected to immunoblotting analyses using indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "2A", "Pup", "survival", "analysis", "between", "P0", "-", "P10", ",", "by", "sex", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "absolute", "percent", "of", "remaining", "animals", "per", "group", "(", "Jag1CTRL", "n", "=", "211", ",", "male", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "n", "=", "26", ",", "female", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "n", "=", "20", ",", "log", "-", "rank", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "B", "P10", "plasma", "total", "bilirubin", "levels", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0091", ")", ".", "C", "P10", "plasma", "thrombin", "antithrombin", "levels", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "2788", ")", ".", "D", "P10", "serum", "fibrinogen", "levels", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "7585", ")", ".", "E", "P10", "whole", "blood", "prothrombin", "time", "(", "INR", ")", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", ">", "0", ".", "9999", ")", ".", "F", "P10", "tail", "bleeding", "time", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "8916", ")", ".", "G", "-", "I", "µCT", "of", "P30", "skulls", ".", "(", "G", ")", "Color", "map", "depicting", "wall", "thickness", ".", "Scale", "bar", "3", ".", "5", "mm", ".", "(", "H", ")", "Skull", "full", "thickness", "volume", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Interaction", "P", "=", "0", ".", "7595", ";", "Sex", "P", "=", "0", ".", "1164", ",", "Genotype", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0012", ".", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "Male", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "P", "=", "0", ".", "0227", ";", ":", "Female", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "P", "=", "0", ".", "034", ")", ",", "(", "I", ")", "Compact", "bone", "total", "volume", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Interaction", "P", "=", "0", ".", "8631", ";", "Sex", "P", "=", "0", ".", "0901", ",", "Genotype", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0014", ".", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "Male", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "P", "=", "0", ".", "0305", ";", "Female", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "P", "=", "0", ".", "0307", ")", ".", "J", "-", "K", "(", "J", ")", "Provoked", "vascular", "accidents", "induced", "by", "portal", "vein", "resin", "injection", ",", "with", "(", "K", ")", "resin", "leakage", "quantification", "outside", "of", "blood", "vessels", "(", "red", ")", "in", "adult", "mice", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "1088", ")", ".", "L", "Adult", "brain", "Evans", "blue", "assay", "(", "Jag1CTRL", "n", "=", "7", ",", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "n", "=", "8", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "3807", ")", ".", "M", "Hemorrhagic", "P3", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "brain", "(", "n", "=", "2", "/", "83", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "mice", ",", "sex", "n", ".", "d", ".", ")", ".", "N", "Hemorrhagic", "P15", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "retina", ".", "Scale", "bar", "20", "µm", ".", "Sex", "n", ".", "d", ".", "O", "Red", "blood", "cells", "outside", "P10", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "retinal", "arteriole", ".", "Scale", "bar", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Pup survival analysis between P0-P10, by sex. Each dot represents the absolute percent of remaining animals per group (Jag1CTRL n=211, male Jag1Ndr/Ndr n=26, female Jag1Ndr/Ndr n= 20, log-rank test, ****P<0.0001).B P10 plasma total bilirubin levels (n=6 per group, unpaired t test, **P=0.0091). C P10 plasma thrombin antithrombin levels (n=6 per group, unpaired t test, ns, P=0.2788).D P10 serum fibrinogen levels (n=6 per group, unpaired t test, ns, P=0.7585).E P10 whole blood prothrombin time (INR) (n=6 per group, unpaired t test, ns, P>0.9999).F P10 tail bleeding time (n=6 per group, unpaired t test, ns, P=0.8916).G-I µCT of P30 skulls. (G) Color map depicting wall thickness. Scale bar 3.5 mm. (H) Skull full thickness volume (n=5-6 per group, two-way ANOVA. Interaction P= 0.7595; Sex P= 0.1164, Genotype **P= 0.0012. Šídák's multiple comparisons test: Male Jag1+/+ vs Jag1Ndr/Ndr *P= 0.0227; : Female Jag1+/+ vs Jag1Ndr/Ndr *P= 0.034), (I) Compact bone total volume (n=5-6 per group, two-way ANOVA. Interaction P= 0.8631; Sex P= 0.0901, Genotype **P= 0.0014. Šídák's multiple comparisons test: Male Jag1+/+ vs Jag1Ndr/Ndr *P= 0.0305; Female Jag1+/+ vs Jag1Ndr/Ndr *P= 0.0307).J-K (J) Provoked vascular accidents induced by portal vein resin injection, with (K) resin leakage quantification outside of blood vessels (red) in adult mice (n=6 per group, unpaired t test, ns, P=0.1088).L Adult brain Evans blue assay (Jag1CTRL n=7, Jag1Ndr/Ndr n=8, unpaired t test, ns, P=0.3807).M Hemorrhagic P3 Jag1Ndr/Ndr brain (n= 2/83 Jag1Ndr/Ndr mice, sex n.d.).N Hemorrhagic P15 Jag1Ndr/Ndr retina. Scale bar 20 µm. Sex n.d.O Red blood cells outside P10 Jag1Ndr/Ndr retinal arteriole. Scale bar 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Radial", "arrangement", "of", "arterioles", "(", "magenta", ")", "and", "venules", "(", "green", ")", "from", "the", "optic", "nerve", ".", "Blue", "arrows", "label", "arteriovenous", "crossings", ".", "Magnification", "of", "crossing", "shows", "compression", "/", "narrowing", "of", "the", "underlying", "vein", ".", "Scale", "bar", "left", "and", "middle", "panels", "50", "µm", ",", "and", "right", "panel", "20", "µm", ".", "(", "B", ")", "Arteriovenous", "crossings", "number", "per", "retina", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Interaction", "P", "=", "0", ".", "7074", ",", "Sex", "P", "=", ">", "0", ".", "9999", ",", "Genotype", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "<", "0", ".", "0001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "Male", ":", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", ".", "Male", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "P", "=", "0", ".", "0201", ";", "Female", ":", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", ".", "Female", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0061", ")", ".", "C", "-", "D", "(", "C", ")", "Number", "of", "major", "arterioles", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Interaction", "P", "=", "0", ".", "4353", ",", "Sex", "P", "=", "0", ".", "1995", ",", "Genotype", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "<", "0", ".", "0001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "Male", ":", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", ".", "Male", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "P", "=", "0", ".", "0146", ";", "Female", ":", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", ".", "Female", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0011", ")", "and", "(", "D", ")", "venules", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Interaction", "P", "=", "0", ".", "044", ",", "Sex", "P", "=", "0", ".", "044", ",", "Genotype", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "<", "0", ".", "0001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "Male", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "vs", ".", "Female", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "P", "=", "0", ".", "0302", ";", "Female", ":", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", ".", "Female", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", ")", ".", "E", "-", "F", "(", "E", ")", "Arterial", "tortuosity", "at", "P30", "and", "1", "year", ",", "irrespective", "of", "sex", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "not", "significant", ")", ".", "(", "F", ")", "Arterial", "tortuosity", "in", "male", "and", "female", "mice", ",", "irrespective", "of", "age", "(", "n", "=", "5", "-", "7", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "not", "significant", ")", ".", "G", "-", "H", "(", "G", ")", "Venous", "tortuosity", "at", "P30", "and", "1", "year", ",", "irrespective", "of", "sex", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Interaction", "P", "=", "0", ".", "1166", ",", "Age", "P", "=", "0", ".", "0787", ",", "Genotype", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0013", ".", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "P30", ":", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", ".", "P30", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "004", ";", "P30", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "vs", ".", "1", "year", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "P", "=", "0", ".", "0802", ";", "1", "year", ":", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", ".", "1", "year", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "P", "=", "0", ".", "5066", ")", ".", "(", "H", ")", "Venous", "tortuosity", "in", "male", "and", "female", "mice", ",", "irrespective", "of", "age", "(", "n", "=", "5", "-", "7", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Interaction", "*", "P", "=", "0", ".", "0223", ",", "Sex", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "007", ",", "Genotype", "*", "*", "*", "P", "=", "<", "0", ".", "0001", ".", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "Male", ":", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", ".", "Male", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "P", "=", "0", ".", "3247", ",", "Male", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "vs", ".", "Female", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0031", ",", "Female", ":", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", ".", "Female", ":", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "J", ")", "Tortuosity", "of", "MCA", ",", "as", "assessed", "by", "number", "of", "diversions", "per", "length", "(", "n", "=", "6", ",", "t", "-", "test", "ns", ")", ".", "(", "K", ")", "Visualization", "of", "MCA", "with", "alpha", "smooth", "muscle", "cell", "actin", "(", "αSMA", ")", "showed", "stereotype", "vasculature", "in", "6", "of", "6", "Jag1", "+", "/", "+", "animals", ",", "but", "2", "of", "6", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "animals", "showed", "highly", "divergent", "MCA", "architecture", "(", "blue", "arrows", ")", ".", "(", "L", ")", "Distances", "between", "arterial", "branches", "in", "MCA", "at", "P10", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Radial arrangement of arterioles (magenta) and venules (green) from the optic nerve. Blue arrows label arteriovenous crossings. Magnification of crossing shows compression/narrowing of the underlying vein. Scale bar left and middle panels 50 µm, and right panel 20 µm.(B) Arteriovenous crossings number per retina (n=6 per group, two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. Interaction P = 0.7074, Sex P =>0.9999, Genotype ****P= <0.0001, Tukey's multiple comparisons test: Male:Jag1+/+ vs. Male:Jag1Ndr/Ndr *P= 0.0201; Female:Jag1+/+ vs. Female:Jag1Ndr/Ndr **P= 0.0061).C-D (C) Number of major arterioles (n=6 per group, two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. Interaction P = 0.4353, Sex P =0.1995, Genotype ****P= <0.0001, Tukey's multiple comparisons test: Male:Jag1+/+ vs. Male:Jag1Ndr/Ndr *P= 0.0146; Female:Jag1+/+ vs. Female:Jag1Ndr/Ndr **P= 0.0011) and (D) venules (n=6 per group, two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. Interaction P = 0.044, Sex P =0.044, Genotype ****P= <0.0001, Tukey's multiple comparisons test: Male:Jag1Ndr/Ndr vs. Female:Jag1Ndr/Ndr *P=0.0302; Female:Jag1+/+ vs. Female:Jag1Ndr/Ndr ***P= 0.0002).E-F (E) Arterial tortuosity at P30 and 1 year, irrespective of sex (n=6 per group, two-way ANOVA, not significant). (F) Arterial tortuosity in male and female mice, irrespective of age (n=5-7, two-way ANOVA, not significant). G-H (G) Venous tortuosity at P30 and 1 year, irrespective of sex (n=6-8 per group, two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. Interaction P = 0.1166, Age P = 0.0787, Genotype **P=0.0013. Tukey's multiple comparisons test: P30:Jag1+/+ vs. P30:Jag1Ndr/Ndr **P=0.004; P30:Jag1Ndr/Ndr vs. 1 year:Jag1Ndr/Ndr P=0.0802; 1 year:Jag1+/+ vs. 1 year:Jag1Ndr/Ndr P= 0.5066). (H) Venous tortuosity in male and female mice, irrespective of age (n=5-7, two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. Interaction *P = 0.0223, Sex **P = 0.007, Genotype ***P= <0.0001. Tukey's multiple comparisons test: Male:Jag1+/+ vs. Male:Jag1Ndr/Ndr P= 0.3247, Male:Jag1Ndr/Ndr vs. Female:Jag1Ndr/Ndr **P= 0.0031, Female:Jag1+/+ vs. Female:Jag1Ndr/Ndr ****P= 0.0001).(J) Tortuosity of MCA, as assessed by number of diversions per length (n=6, t-test ns).(K) Visualization of MCA with alpha smooth muscle cell actin (αSMA) showed stereotype vasculature in 6 of 6 Jag1+/+ animals, but 2 of 6 Jag1Ndr/Ndr animals showed highly divergent MCA architecture (blue arrows).(L) Distances between arterial branches in MCA at P10 (unpaired t-test, not significant)."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "E", "αSMA", "coverage", "of", "(", "A", ")", "P10", ",", "(", "B", ")", "P15", ",", "(", "C", ")", "P30", ",", "(", "D", ")", "3", "-", "6", "month", "old", "and", "€", "1", "-", "year", "-", "old", "retinal", "arterioles", ".", "Brackets", "in", "A", ",", "B", "denote", "perpendicular", "VSMCs", "around", "arteriole", ".", "Yellow", "arrows", "in", "A", ",", "B", ",", "C", ".", "indicate", "VSMCs", "with", "an", "orientation", "parallel", "to", "the", "blood", "vessel", ".", "Green", "arrowheads", "in", "D", "denote", "stenosis", ".", "White", "arrowheads", "in", "E", "label", "αSMA", "-", "negative", "gaps", "and", "white", "arrows", "an", "aneurysm", ".", "Cropped", "images", "were", "placed", "on", "black", "background", "for", "esthetic", "purposes", ".", "(", "F", ")", "Incidence", "of", "α", "SMA", "negative", "gaps", "on", "arteries", "by", "age", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ")", ".", "(", "G", ")", "Number", "of", "α", "SMA", "negative", "gaps", "per", "retina", "and", "mouse", "by", "age", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Dots", "represent", "biological", "replicates", "/", "individual", "retinas", "/", "mice", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "not", "significant", ".", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "1", "year", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", "1", "year", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "P", "=", "0", ".", "0189", ")", ".", "H", "Transmission", "electron", "microscopy", "of", "retinal", "arterioles", ".", "VSMCs", "color", "-", "coded", "in", "magenta", ",", "EC", "in", "green", ".", "Scale", "bar", "5", "µm", ",", "boxed", "region", "1", "µm", ".", "Blue", "arrowheads", "denote", "the", "edges", "of", "VSMCs", ".", "I", "-", "J", "(", "I", ")", "One", "-", "year", "-", "old", "retinal", "arteriolar", "cCasp3", "+", "apoptotic", "cells", ".", "Scale", "bar", "10", "µm", ".", "(", "J", ")", "cCasp3", "+", "cells", "per", "field", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0109", ")", ".", "(", "K", ")", "Left", "panel", "aSMA", "coverage", "of", "MCA", "of", "P10", "mice", ".", "Scale", "bar", "20", "µm", ".", "Right", "panel", "magnification", "of", "area", "where", "number", "of", "nuclei", "was", "counted", ".", "Nuclei", "were", "color", "-", "coded", "blue", ".", "(", "L", ")", "MCA", "vascular", "smooth", "muscle", "cell", "nuclei", "quantification", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0421", ")", ".", "(", "N", ")", "Blood", "pressure", "(", "BP", ")", "before", "treatment", "in", "male", "and", "female", "Jag1CTRL", "and", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "mice", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "animal", "/", "one", "biological", "replicate", ".", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", "Interaction", "P", "=", "0", ".", "9407", ",", "Sex", "P", "=", "0", ".", "4957", ",", "Genotype", "*", "P", "=", "0", ".", "0207", ".", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "not", "significant", ")", ".", "(", "O", ")", "Blood", "pressure", "increase", "in", "Jag1CTRL", "and", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "AngII", "for", "two", "weeks", "(", "Jag1", "+", "/", "+", "ctrl", "n", "=", "4", ",", "Jag1", "+", "/", "+", "AngII", "n", "=", "4", ",", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "ctrl", "n", "=", "5", ",", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "AngII", "n", "=", "5", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", ")", ".", "(", "P", ")", "Detection", "of", "Evans", "blue", "leakage", "in", "brain", "in", "Jag1CTRL", "and", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "mice", "with", "or", "without", "AngII", "treatment", ".", "(", "Jag1", "+", "/", "+", "ctrl", "n", "=", "4", ",", "Jag1", "+", "/", "+", "AngII", "n", "=", "4", ",", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "ctrl", "n", "=", "5", ",", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "AngII", "n", "=", "5", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", ".", "Interaction", "P", "=", "0", ".", "9687", ",", "Treatment", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "007", ",", "Genotype", "P", "=", "0", ".", "5058", ")", ".", "(", "Q", ")", "One", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "mouse", "(", "male", ")", "displayed", "a", "macroscopic", "EB", "leakage", ",", "upon", "AngII", "treatment", ".", "®", "Retinal", "arteriolar", "αSMA", "coverage", "in", "vehicle", "or", "AngII", "-", "treated", "mice", ".", "Green", "arrowheads", "denote", "stenosis", ",", "blue", "arrowheads", "label", "αSMA", "-", "negative", "gap", ".", "(", "S", ")", "αSMA", "-", "negative", "gaps", "in", "arterioles", "per", "retina", "(", "Jag1", "+", "/", "+", "ctrl", "n", "=", "4", ",", "Jag1", "+", "/", "+", "AngII", "n", "=", "4", ",", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "ctrl", "n", "=", "3", "-", "5", ",", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "AngII", "n", "=", "5", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", ".", "Interaction", "P", "=", "0", ".", "1054", ",", "treatment", "P", "=", "0", ".", "0815", ";", "Genotype", "P", "=", "0", ".", "0747", ".", "Ší", "'", "ák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "AngII", "treated", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", "AngII", "treated", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "P", "=", "0", ".", "0315", ")", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-E αSMA coverage of (A) P10, (B) P15, (C) P30, (D) 3-6 month old and € 1-year-old retinal arterioles. Brackets in A, B denote perpendicular VSMCs around arteriole. Yellow arrows in A, B, C. indicate VSMCs with an orientation parallel to the blood vessel. Green arrowheads in D denote stenosis. White arrowheads in E label αSMA-negative gaps and white arrows an aneurysm. Cropped images were placed on black background for esthetic purposes.(F) Incidence of α SMA negative gaps on arteries by age (Two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test).(G) Number of α SMA negative gaps per retina and mouse by age (Two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. Dots represent biological replicates/individual retinas/mice. Two-way ANOVA not significant. Šídák's multiple comparisons test: 1 year Jag1+/+ vs 1 year Jag1Ndr/Ndr *P= 0.0189).H Transmission electron microscopy of retinal arterioles. VSMCs color-coded in magenta, EC in green. Scale bar 5 µm, boxed region 1 µm. Blue arrowheads denote the edges of VSMCs.I-J (I) One-year-old retinal arteriolar cCasp3+ apoptotic cells. Scale bar 10 µm. (J) cCasp3+ cells per field (n=6 per group, unpaired t test, *P=0.0109).(K) Left panel aSMA coverage of MCA of P10 mice. Scale bar 20 µm. Right panel magnification of area where number of nuclei was counted. Nuclei were color-coded blue.(L) MCA vascular smooth muscle cell nuclei quantification (n=6 per group, unpaired t test, *P=0.0421).(N) Blood pressure (BP) before treatment in male and female Jag1CTRL and Jag1Ndr/Ndr mice. Each dot represents one animal/one biological replicate. (Two-way ANOVA Interaction P=0.9407, Sex P=0.4957, Genotype *P= 0.0207. Šídák's multiple comparisons test not significant).(O) Blood pressure increase in Jag1CTRL and Jag1Ndr/Ndr mice treated with vehicle or AngII for two weeks (Jag1+/+ ctrl n=4, Jag1+/+ AngII n=4, Jag1Ndr/Ndr ctrl n=5, Jag1Ndr/Ndr AngII n=5, two-way ANOVA, with Sidak's multiple comparisons).(P) Detection of Evans blue leakage in brain in Jag1CTRL and Jag1Ndr/Ndr mice with or without AngII treatment. (Jag1+/+ ctrl n=4, Jag1+/+ AngII n=4, Jag1Ndr/Ndr ctrl n=5, Jag1Ndr/Ndr AngII n=5, two-way ANOVA, with Sidak's multiple comparison. Interaction P=0.9687, Treatment **P=0.007, Genotype P=0.5058).(Q) One Jag1Ndr/Ndr mouse (male) displayed a macroscopic EB leakage, upon AngII treatment.® Retinal arteriolar αSMA coverage in vehicle or AngII-treated mice. Green arrowheads denote stenosis, blue arrowheads label αSMA-negative gap. (S) αSMA-negative gaps in arterioles per retina (Jag1+/+ ctrl n=4, Jag1+/+ AngII n=4, Jag1Ndr/Ndr ctrl n=3-5, Jag1Ndr/Ndr AngII n=5, two-way ANOVA, with Sidak's multiple comparison. Interaction P = 0.1054, treatment P=0.0815; Genotype P=0.0747. Ší'ák's multiple comparisons test: AngII treated Jag1+/+ vs AngII treated Jag1Ndr/Ndr *P= 0.0315).)."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "D", "(", "A", ")", "P30", "retina", ",", "three", "CD31", "+", "capillary", "layers", "pseudo", "-", "colored", "for", "superficial", ",", "intermediate", "and", "deep", "layers", ".", "Scale", "bar", "50", "µm", ".", "(", "B", ")", "P30", "SCP", "branching", "point", "number", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "5346", ")", ".", "(", "C", ")", "P30", "ICP", "vascular", "length", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0124", ")", ".", "(", "D", ")", "P30", "ICP", "branching", "point", "number", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0057", ")", ".", "E", "-", "H", "(", "E", ")", "3", "-", "6", "months", "old", "retina", ",", "three", "pseudo", "-", "colored", "CD31", "+", "capillary", "layers", ".", "Scale", "bar", "50", "µm", ".", "(", "F", ")", "Adult", "SCP", "branching", "point", "number", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "5365", ")", ".", "(", "G", ")", "Adult", "ICP", "vascular", "length", "(", "n", "=", "6", "-", "7", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0078", ")", ".", "(", "H", ")", "Adult", "ICP", "branching", "point", "number", "(", "n", "=", "6", "-", "7", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "001I", "-", "J", "(", "I", ")", "ICP", "COLIV", "and", "CD31", "(", "arrowhead", "labels", "COLIV", "+", "CD31", "-", "capillary", ")", ".", "Scale", "bar", "50", "µm", ".", "(", "J", ")", "Empty", "COLIV", "sleeve", "length", "in", "ICP", "per", "field", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "1583", ")", ".", "(", "K", ")", "Retinal", "capillary", "plexuses", "in", "3", "-", "6", "months", "old", "(", "top", "panels", ")", "and", "one", "-", "year", "-", "old", "mice", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "White", "arrowheads", "label", "discontinuous", "ICP", ".", "Blue", "arrowhead", "labels", "SCP", ",", "green", "ICP", "and", "magenta", "DCP", ".", "(", "L", "-", "M", ")", "Vertical", "sprout", "number", "between", "SCP", "(", "S", ")", "and", "ICP", "(", "I", ")", "and", "ICP", "(", "I", ")", "and", "DCP", "(", "D", ")", "in", "(", "L", ")", "adult", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "genotype", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0004", ",", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "S", "-", "I", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "0592", ",", "I", "-", "D", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "(", "M", ")", "one", "-", "year", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "8", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "genotype", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "4507", ",", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "S", "-", "I", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "9483", ",", "I", "-", "D", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "6046", ")", ".", "N", "-", "P", "(", "N", ")", "P10", "and", "(", "O", ")", "P40", "neurofilament", "(", "NF", ")", "and", "CD31", "staining", ".", "Scale", "bar", "50", "µm", ".", "(", "P", ")", "%", "area", "positive", "for", "NF", "in", "P10", "and", "P40", "mice", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ":", "Interaction", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0001", ";", "Age", "*", "P", "=", "0", ".", "0428", ";", "Genotype", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0004", ".", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "P10", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", "P10", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "P", "=", "0", ".", "9246", ";", "P40", "Jag1", "+", "/", "+", "vs", "P40", "Jag1Ndr", "/", "Ndr", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-D (A) P30 retina, three CD31+ capillary layers pseudo-colored for superficial, intermediate and deep layers. Scale bar 50 µm. (B) P30 SCP branching point number (n=6-8 per group, unpaired t test, ns, P=0.5346). (C) P30 ICP vascular length (n=6 per group, unpaired t test, *P=0.0124). (D) P30 ICP branching point number (n=6 per group, unpaired t test, **P=0.0057). E-H (E) 3-6 months old retina, three pseudo-colored CD31+ capillary layers. Scale bar 50 µm. (F) Adult SCP branching point number (n=6 per group, unpaired t test, ns, P=0.5365). (G) Adult ICP vascular length (n=6-7 per group, unpaired t test, **P=0.0078). (H) Adult ICP branching point number (n=6-7 per group, unpaired t test, **P=0.001I-J (I) ICP COLIV and CD31 (arrowhead labels COLIV+ CD31- capillary). Scale bar 50 µm. (J) Empty COLIV sleeve length in ICP per field (n=6 per group, unpaired t test, ns, P=0.1583).(K) Retinal capillary plexuses in 3-6 months old (top panels) and one-year-old mice (bottom panels). White arrowheads label discontinuous ICP. Blue arrowhead labels SCP, green ICP and magenta DCP.(L-M) Vertical sprout number between SCP (S) and ICP (I) and ICP (I) and DCP (D) in (L) adult (n=6 per group, two-way ANOVA, genotype ***P=0.0004, Sidak's multiple comparisons test S-I ns, P=0.0592, I-D ****P<0.0001) and (M) one-year-old mice (n=8 per group, two-way ANOVA, genotype ns, P=0.4507, Sidak's multiple comparisons test S-I ns, P=0.9483, I-D ns, P=0.6046).N-P (N) P10 and (O) P40 neurofilament (NF) and CD31 staining. Scale bar 50 µm. (P) % area positive for NF in P10 and P40 mice (n=6 per group, two-way ANOVA: Interaction ***P= 0.0001; Age *P=0.0428; Genotype ***P=0.0004. Sidak's multiple comparisons test: P10 Jag1+/+ vs P10 Jag1Ndr/Ndr P= 0.9246; P40 Jag1+/+ vs P40 Jag1Ndr/Ndr ****P= <0.0001)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Representative", "retinographs", "from", "a", "healthy", "adult", ",", "patient", "with", "CADASIL", ",", "healthy", "pediatric", "individual", ",", "patient", "with", "ALGS", "and", "patient", "with", "BA", ".", "Boxed", "regions", "and", "black", "arrowheads", "magnify", "arteriovenous", "crossing", ".", "B", "-", "F", "(", "B", ")", "Arteriovenous", "crossings", "per", "retina", "(", "n", "=", "14", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "3854", ".", "(", "C", ")", "Major", "arterioles", "(", "n", "=", "14", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "2902", ")", "and", "(", "D", ")", "venules", "(", "n", "=", "14", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "1536", ")", ".", "(", "E", ")", "Arterial", "(", "n", "=", "14", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "0759", ")", "and", "(", "F", ")", "venous", "tortuosity", "(", "n", "=", "14", "per", "group", ",", "unpaired", "t", "test", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "1050", ")", ".", "G", "-", "K", "(", "G", ")", "Arteriovenous", "crossings", "per", "retina", "(", "CTRL", "n", "=", "5", ",", "ALGS", "n", "=", "3", ",", "BA", "n", "=", "4", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "0608", ",", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "ALGS", "vs", ".", "CTRL", "*", "P", "=", "0", ".", "0492", ",", "ALGS", "vs", ".", "BA", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "0999", ")", ".", "(", "H", ")", "Major", "arterioles", "(", "CTRL", "n", "=", "5", ",", "ALGS", "n", "=", "5", ",", "BA", "n", "=", "4", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0026", ",", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "ALGS", "vs", ".", "CTRL", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0039", ",", "ALGS", "vs", ".", "BA", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "9799", ")", "and", "(", "I", ")", "venules", "(", "CTRL", "n", "=", "5", ",", "ALGS", "n", "=", "5", ",", "BA", "n", "=", "4", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0008", ",", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "ALGS", "vs", ".", "CTRL", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0011", ",", "ALGS", "vs", ".", "BA", "ns", ",", "P", ">", "0", ".", "9999", ")", ".", "(", "J", ")", "Arterial", "(", "CTRL", "n", "=", "5", ",", "ALGS", "n", "=", "5", ",", "BA", "n", "=", "4", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0486", ",", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "ALGS", "vs", ".", "CTRL", "*", "P", "=", "0", ".", "0392", ",", "ALGS", "vs", ".", "BA", "ns", ",", "P", "=", "0", ".", "1204", ")", "and", "(", "K", ")", "venous", "tortuosity", "(", "CTRL", "n", "=", "5", ",", "ALGS", "n", "=", "5", ",", "BA", "n", "=", "4", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "009", ",", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "ALGS", "vs", ".", "CTRL", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0076", ",", "ALGS", "vs", ".", "BA", "*", "P", "=", "0", ".", "0327", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Representative retinographs from a healthy adult, patient with CADASIL, healthy pediatric individual, patient with ALGS and patient with BA. Boxed regions and black arrowheads magnify arteriovenous crossing.B-F (B) Arteriovenous crossings per retina (n=14 per group, unpaired t test, ns, P=0.3854. (C) Major arterioles (n=14 per group, unpaired t test, ns, P=0.2902) and (D) venules (n=14 per group, unpaired t test, ns, P=0.1536). (E) Arterial (n=14 per group, unpaired t test, ns, P=0.0759) and (F) venous tortuosity (n=14 per group, unpaired t test, ns, P=0.1050).G-K (G) Arteriovenous crossings per retina (CTRL n=5, ALGS n=3, BA n=4, one-way ANOVA, ns, P=0.0608, Sidak's multiple comparisons ALGS vs. CTRL *P=0.0492, ALGS vs. BA ns, P=0.0999). (H) Major arterioles (CTRL n=5, ALGS n=5, BA n=4, one-way ANOVA, **P=0.0026, Sidak's multiple comparisons ALGS vs. CTRL **P=0.0039, ALGS vs. BA ns, P=0.9799) and (I) venules (CTRL n=5, ALGS n=5, BA n=4, one-way ANOVA, ***P=0.0008, Sidak's multiple comparisons ALGS vs. CTRL **P=0.0011, ALGS vs. BA ns, P>0.9999). (J) Arterial (CTRL n=5, ALGS n=5, BA n=4, one-way ANOVA, *P=0.0486, Sidak's multiple comparisons ALGS vs. CTRL *P=0.0392, ALGS vs. BA ns, P=0.1204) and (K) venous tortuosity (CTRL n=5, ALGS n=5, BA n=4, one-way ANOVA, **P=0.009, Sidak's multiple comparisons ALGS vs. CTRL **P=0.0076, ALGS vs. BA *P=0.0327)."}
{"words": ["Figure", "1LPS", "-", "primed", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "treated", "with", "various", "doses", "of", "ATP", ".", "CBA", "analysis", "of", "IL", "-", "1β", "(", "A", ")", "in", "the", "culture", "supernatants", ".", "LPS", "-", "primed", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "treated", "with", "various", "doses", "of", "ATP", ".", "ELISA", "of", "IL", "-", "18", "(", "B", ")", "in", "the", "culture", "supernatants", ".", "CBA", "analysis", "of", "IL", "-", "1β", "secretion", "from", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "transduced", "with", "GFP", "-", "or", "ABRO1", "-", "GFP", "-", "expressing", "lentiviruses", "prior", "to", "stimulation", "with", "LPS", "and", "ATP", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", ".", "ELISA", "analysis", "of", "IL", "-", "1β", "secretion", "from", "HMDMs", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "shCon", "or", "shABRO1", "prior", "to", "stimulation", "with", "control", "medium", "(", "Con", ")", ",", "LPS", "or", "LPS", "plus", "ATP", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "ABRO1", "and", "anti", "-", "GAPDH", "antibodies", ".", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "left", "untreated", "(", "Con", ")", ",", "treated", "with", "LPS", "alone", "(", "LPS", ")", "or", "pretreated", "with", "LPS", "and", "then", "stimulated", "with", "nigericin", ",", "silica", ",", "MSU", ",", "MDP", ",", "Alum", ",", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", ",", "flagellin", "or", "LTx", "(", "Anthrax", "Lethal", "Factor", ")", ".", "CBA", "analysis", "of", "IL", "-", "1β", "secretion", "in", "the", "culture", "supernatants", ".", "Representative", "immunoblot", "analysis", "of", "cleaved", "caspase", "-", "1", "and", "IL", "-", "1β", "in", "culture", "supernatants", "(", "SN", ")", "of", "LPS", "-", "primed", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "treated", "with", "ATP", ",", "nigericin", ",", "MSU", ",", "flagellin", "or", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "caspase", "-", "1", "activity", "in", "LPS", "-", "primed", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "stimulated", "with", "nigericin", "for", "indicated", "times", ".", "Immunostaining", "of", "endogenous", "ASC", "specks", "in", "LPS", "-", "primed", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "nigericin", "or", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Quantification", "of", "ASC", "specks", "from", "(", "H", ")", "was", "performed", "by", "counting", "cells", "in", "five", "random", "areas", "of", "each", "image", "in", "triplicate", "experiments", "and", "described", "as", "a", "percentage", "of", "ASC", "specks", "for", "total", "cell", "nuclei", ".", "At", "least", "100", "cells", "from", "each", "treatment", "condition", "were", "quantified", ".", "UD", ",", "undetectable", ".", "LPS", "-", "primed", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "ATP", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "and", "ASC", "protein", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "ASC", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1LPS-primed Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs were treated with various doses of ATP. CBA analysis of IL-1β (A) in the culture supernatants.LPS-primed Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs were treated with various doses of ATP. ELISA of IL-18 (B) in the culture supernatants.CBA analysis of IL-1β secretion from Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs transduced with GFP- or ABRO1-GFP-expressing lentiviruses prior to stimulation with LPS and ATP. Cell lysates were immunoblotted with anti-ABRO1 antibody.ELISA analysis of IL-1β secretion from HMDMs transduced with lentiviruses expressing shCon or shABRO1 prior to stimulation with control medium (Con), LPS or LPS plus ATP. Cell lysates were immunoblotted with anti-ABRO1 and anti-GAPDH antibodies.Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs were left untreated (Con), treated with LPS alone (LPS) or pretreated with LPS and then stimulated with nigericin, silica, MSU, MDP, Alum, poly (dA: dT), flagellin or LTx (Anthrax Lethal Factor). CBA analysis of IL-1β secretion in the culture supernatants.Representative immunoblot analysis of cleaved caspase-1 and IL-1β in culture supernatants (SN) of LPS-primed Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs treated with ATP, nigericin, MSU, flagellin or poly (dA: dT).Flow cytometric analysis of caspase-1 activity in LPS-primed Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs stimulated with nigericin for indicated times.Immunostaining of endogenous ASC specks in LPS-primed Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs left untreated or treated with nigericin or poly (dA:dT). Scale bars, 10 μm. Quantification of ASC specks from (H) was performed by counting cells in five random areas of each image in triplicate experiments and described as a percentage of ASC specks for total cell nuclei. At least 100 cells from each treatment condition were quantified. UD, undetectable.LPS-primed Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs were left untreated or treated with ATP. Immunoblot analysis of NLRP3 and ASC protein in cell lysates immunoprecipitated with anti-ASC antibody."}
{"words": ["Figure", "2WT", ",", "Abro1", "−", "/", "−", "and", "Nlrp3", "−", "/", "−", "mice", "were", "intraperitoneally", "injected", "with", "MSU", "(", "1", "mg", "per", "mouse", ")", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", "for", "6", "h", ".", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "and", "TNF", "-", "α", "in", "the", "peritoneal", "lavage", "fluid", "(", "A", ")", ".", "n", "=", "6", "for", "PBS", "groups", "and", "n", "=", "12", "for", "MSU", "groups", ".", "WT", ",", "Abro1", "−", "/", "−", "and", "Nlrp3", "−", "/", "−", "mice", "were", "intraperitoneally", "injected", "with", "MSU", "(", "1", "mg", "per", "mouse", ")", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", "for", "6", "h", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "peritoneal", "cell", "exudates", "(", "B", ")", ".", "n", "=", "6", "for", "PBS", "groups", "and", "n", "=", "12", "for", "MSU", "groups", ".", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "mice", "were", "intraperitoneally", "injected", "with", "MSU", "(", "1", "mg", "per", "mouse", ")", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "caspase", "-", "1", "activity", "in", "peritoneal", "exudate", "monocytes", "and", "neutrophils", ".", "n", "=", "12", "per", "group", ".", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "mice", "were", "intraperitoneally", "injected", "with", "Alum", "(", "1", "mg", "per", "mouse", ")", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", "for", "6", "h", ".", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "in", "the", "peritoneal", "lavage", "fluid", "(", "D", ")", "n", "=", "6", "for", "PBS", "groups", "and", "n", "=", "12", "for", "Alum", "groups", ".", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "mice", "were", "intraperitoneally", "injected", "with", "Alum", "(", "1", "mg", "per", "mouse", ")", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", "for", "6", "h", ".", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "peritoneal", "cell", "exudates", "(", "E", ")", ".", "n", "=", "6", "for", "PBS", "groups", "and", "n", "=", "12", "for", "Alum", "groups", ".", "Survival", "of", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "mice", "subjected", "to", "LPS", "(", "15", "mg", "/", "kg", ")", ".", "n", "=", "20", "per", "group", ".", "ELISA", "of", "serum", "IL", "-", "1β", "from", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "mice", "3", "h", "after", "intraperitoneal", "injection", "of", "LPS", "(", "15mg", "/", "kg", ")", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", ".", "n", "=", "6", "for", "PBS", "groups", "and", "n", "=", "12", "for", "LPS", "groups", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2WT, Abro1−/− and Nlrp3−/− mice were intraperitoneally injected with MSU (1 mg per mouse) or vehicle (PBS) for 6 h. ELISA of IL-1β and TNF-α in the peritoneal lavage fluid (A). n = 6 for PBS groups and n = 12 for MSU groups.WT, Abro1−/− and Nlrp3−/− mice were intraperitoneally injected with MSU (1 mg per mouse) or vehicle (PBS) for 6 h. Flow cytometric analysis of peritoneal cell exudates (B). n = 6 for PBS groups and n = 12 for MSU groups.Abro1+/+ and Abro1−/− mice were intraperitoneally injected with MSU (1 mg per mouse). Flow cytometric analysis of caspase-1 activity in peritoneal exudate monocytes and neutrophils. n=12 per group.Abro1+/+ and Abro1−/− mice were intraperitoneally injected with Alum (1 mg per mouse) or vehicle (PBS) for 6 h. ELISA of IL-1β in the peritoneal lavage fluid (D) n = 6 for PBS groups and n = 12 for Alum groups.Abro1+/+ and Abro1−/− mice were intraperitoneally injected with Alum (1 mg per mouse) or vehicle (PBS) for 6 h. flow cytometric analysis of peritoneal cell exudates (E). n = 6 for PBS groups and n = 12 for Alum groups.Survival of Abro1+/+ and Abro1−/− mice subjected to LPS (15 mg/kg). n=20 per group.ELISA of serum IL-1β from Abro1+/+ and Abro1−/− mice 3 h after intraperitoneal injection of LPS (15mg/kg) or vehicle (PBS). n = 6 for PBS groups and n = 12 for LPS groups."}
{"words": ["Figure", "3HEK", "-", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "Flag", "-", "ABRO1", "and", "Myc", "-", "tagged", "NLRP3", ",", "ASC", "or", "pro", "-", "casapase", "-", "1", "(", "Pro", "-", "Casp", "-", "1", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Myc", "-", "and", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "c", "-", "Myc", "agarose", ".", "BMDMs", "were", "treated", "with", "indicated", "stimuli", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "ABRO1", "and", "NLRP3", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "control", "IgG", "or", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", ".", "BMDMs", "were", "treated", "with", "indicated", "stimuli", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "ABRO1", "and", "NLRP3", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "control", "IgG", "or", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", ".", "BMDMs", "were", "treated", "with", "indicated", "stimuli", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "ABRO1", "and", "NLRP3", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "control", "IgG", "or", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", ".", "BMDMs", "were", "treated", "with", "indicated", "stimuli", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "ABRO1", "and", "NLRP3", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "control", "IgG", "or", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "Flag", "-", "ABRO1", "and", "Myc", "-", "tagged", "NLRP3", "or", "NLRP3", "deletion", "mutants", "as", "indicated", "in", "(", "F", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Myc", "-", "and", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "c", "-", "Myc", "agarose", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "Myc", "-", "NLRP3", "and", "Flag", "-", "tagged", "ABRO1", "or", "ABRO1", "deletion", "mutants", "as", "indicated", "in", "(", "H", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Myc", "-", "and", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3HEK-293T cells were transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding Flag-ABRO1 and Myc-tagged NLRP3, ASC or pro-casapase-1 (Pro-Casp-1). Immunoblot analysis of Myc- and Flag-tagged proteins in cell lysates immunoprecipitated with anti-c-Myc agarose.BMDMs were treated with indicated stimuli. Immunoblot analysis of ABRO1 and NLRP3 proteins in cell lysates immunoprecipitated with control IgG or anti-ABRO1 antibody.BMDMs were treated with indicated stimuli. Immunoblot analysis of ABRO1 and NLRP3 proteins in cell lysates immunoprecipitated with control IgG or anti-ABRO1 antibody.BMDMs were treated with indicated stimuli. Immunoblot analysis of ABRO1 and NLRP3 proteins in cell lysates immunoprecipitated with control IgG or anti-ABRO1 antibody.BMDMs were treated with indicated stimuli. Immunoblot analysis of ABRO1 and NLRP3 proteins in cell lysates immunoprecipitated with control IgG or anti-ABRO1 antibody.HEK-293T cells were transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding Flag-ABRO1 and Myc-tagged NLRP3 or NLRP3 deletion mutants as indicated in (F). Immunoblot analysis of Myc- and Flag-tagged proteins in cell lysates immunoprecipitated with anti-c-Myc agarose.HEK-293T cells were transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding Myc-NLRP3 and Flag-tagged ABRO1 or ABRO1 deletion mutants as indicated in (H). Immunoblot analysis of Myc- and Flag-tagged proteins in cell lysates immunoprecipitated with anti-Flag M2 beads."}
{"words": ["Figure", "4HEK", "-", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "Myc", "-", "ABRO1", "and", "Flag", "-", "tagged", "NLRP3", "(", "WT", ")", ",", "NLRP3", "(", "S194D", ")", ",", "or", "NLRP3", "(", "S194A", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Myc", "-", "and", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "WT", "BMDMs", "were", "treated", "with", "or", "without", "5", "μM", "Anisomycin", "for", "2", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "and", "ABRO1", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "control", "IgG", "or", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", ".", "WT", "BMDMs", "were", "pretreated", "with", "or", "without", "100", "nM", "SP600125", "for", "1", "h", "and", "then", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "LPS", "for", "1", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "and", "ABRO1", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "control", "IgG", "or", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "Myc", "-", "ABRO1", "and", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "WT", ")", "or", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "S194A", ")", "were", "treated", "with", "or", "without", "5", "μM", "Anisomycin", "for", "2", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Myc", "-", "and", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "Myc", "-", "ABRO1", "and", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "WT", ")", "or", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "S194D", ")", "were", "treated", "with", "or", "without", "100", "nM", "SP600125", "for", "2", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Myc", "-", "and", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "WT", "and", "Nlrp3S194A", "/", "S194A", "BMDMs", "were", "pretreated", "with", "or", "without", "5", "μM", "Anisomycin", "for", "2", "h", "and", "then", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "LPS", "for", "1", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "and", "ABRO1", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "control", "IgG", "or", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4HEK-293T cells were transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding Myc-ABRO1 and Flag-tagged NLRP3 (WT), NLRP3 (S194D), or NLRP3 (S194A). Immunoblot analysis of Myc- and Flag-tagged proteins in cell lysates immunoprecipitated with anti-Flag M2 beads.WT BMDMs were treated with or without 5 μM Anisomycin for 2 h. Immunoblot analysis of NLRP3 and ABRO1 proteins in cell lysates immunoprecipitated with control IgG or anti-ABRO1 antibody.WT BMDMs were pretreated with or without 100 nM SP600125 for 1 h and then left untreated or treated with 100 ng/ml LPS for 1 h. Immunoblot analysis of NLRP3 and ABRO1 proteins in cell lysates immunoprecipitated with control IgG or anti-ABRO1 antibody.HEK-293T cells transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding Myc-ABRO1 and Flag-NLRP3 (WT) or Flag-NLRP3 (S194A) were treated with or without 5 μM Anisomycin for 2 h. Immunoblot analysis of Myc- and Flag-tagged proteins in cell lysates immunoprecipitated with anti-Flag M2 beads.HEK-293T cells transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding Myc-ABRO1 and Flag-NLRP3 (WT) or Flag-NLRP3 (S194D) were treated with or without 100 nM SP600125 for 2 h. Immunoblot analysis of Myc- and Flag-tagged proteins in cell lysates immunoprecipitated with anti-Flag M2 beads.WT and Nlrp3S194A/S194A BMDMs were pretreated with or without 5 μM Anisomycin for 2 h and then left untreated or treated with 100 ng/ml LPS for 1 h. Immunoblot analysis of NLRP3 and ABRO1 proteins in cell lysates immunoprecipitated with control IgG or anti-ABRO1 antibody."}
{"words": ["Figure", "5HEK", "-", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "Myc", "-", "NLRP3", ",", "Flag", "-", "ABRO1", "and", "HA", "-", "ubiquitin", "(", "HA", "-", "Ub", ")", ",", "HA", "-", "Ub", "K48", "only", "or", "K63", "only", ".", "Before", "collection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "(", "10", "μM", ")", "for", "6", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "ubiquitination", "(", "detected", "by", "anti", "-", "HA", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "c", "-", "Myc", "agarose", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "HA", "-", "Ub", ",", "Flag", "-", "ABRO1", ",", "and", "NLRP3", "truncations", "as", "indicated", ".", "Before", "collection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "(", "10", "μM", ")", "for", "6", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "ubiquitination", "of", "NLRP3", "truncations", "(", "detected", "by", "anti", "-", "HA", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "c", "-", "Myc", "agarose", ".", "LPS", "-", "primed", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "ATP", "(", "left", ")", "or", "nigericin", "(", "right", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "ubiquitination", "(", "detected", "by", "mouse", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "rabbit", "anti", "-", "NLRP3", "antibody", ".", "Nlrp3", "-", "/", "-", "BMDMs", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "WT", ")", "or", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "A350V", ")", "were", "left", "unstimulated", "or", "stimulated", "with", "LPS", "or", "LPS", "plus", "ATP", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "and", "NLRP3", "(", "A350V", ")", "ubiquitination", "(", "detected", "by", "mouse", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "Myc", "-", "ABRO1", ",", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "A350V", ")", "and", "HA", "-", "ubiquitin", "(", "HA", "-", "Ub", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "(", "A350V", ")", "ubiquitination", "(", "detected", "by", "anti", "-", "HA", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "Nlrp3", "-", "/", "-", "BMDMs", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "WT", ")", "or", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "A350V", ")", "were", "stimulated", "with", "or", "without", "100ng", "/", "ml", "LPS", "for", "1", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "ABRO1", "and", "NLRP3", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "transfected", "with", "various", "combinations", "(", "above", "lanes", ")", "of", "plasmids", "encoding", "Myc", "-", "ABRO1", ",", "Flag", "-", "NLRP3", ",", "and", "HA", "-", "ubiquitin", "(", "HA", "-", "Ub", ")", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "5", "μM", "Anisomycin", "for", "2", "h", "or", "100", "nM", "SP600125", "for", "2", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "ubiquitination", "(", "detected", "by", "anti", "-", "HA", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "LPS", "-", "primed", "WT", "and", "Nlrp3S194A", "/", "S194A", "BMDMs", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "ATP", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "ubiquitination", "(", "detected", "by", "mouse", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "rabbit", "anti", "-", "NLRP3", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5HEK-293T cells were transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding Myc-NLRP3, Flag-ABRO1 and HA-ubiquitin (HA-Ub), HA-Ub K48 only or K63 only. Before collection, cells were treated with MG132 (10 μM) for 6 h. Immunoblot analysis of NLRP3 ubiquitination (detected by anti-HA antibody) in cell lysates immunoprecipitated with anti-c-Myc agarose.HEK-293T cells were transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding HA-Ub, Flag-ABRO1, and NLRP3 truncations as indicated. Before collection, cells were treated with MG132 (10 μM) for 6 h. Immunoblot analysis of ubiquitination of NLRP3 truncations (detected by anti-HA antibody) in cell lysates immunoprecipitated with anti-c-Myc agarose.LPS-primed Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs were left untreated or treated with ATP (left) or nigericin (right). Immunoblot analysis of NLRP3 ubiquitination (detected by mouse anti-ubiquitin antibody) in cell lysates immunoprecipitated with rabbit anti-NLRP3 antibody.Nlrp3-/- BMDMs transduced with lentiviruses expressing Flag-NLRP3 (WT) or Flag-NLRP3 (A350V) were left unstimulated or stimulated with LPS or LPS plus ATP. Immunoblot analysis of NLRP3 and NLRP3 (A350V) ubiquitination (detected by mouse anti-ubiquitin antibody) in cell lysates immunoprecipitated with anti-Flag M2 beads.HEK-293T cells were transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding Myc-ABRO1, Flag-NLRP3 (A350V) and HA-ubiquitin (HA-Ub). Immunoblot analysis of NLRP3 (A350V) ubiquitination (detected by anti-HA antibody) in cell lysates immunoprecipitated with anti-Flag M2 beads.Nlrp3-/- BMDMs transduced with lentiviruses expressing Flag-NLRP3 (WT) or Flag-NLRP3 (A350V) were stimulated with or without 100ng/ml LPS for 1 h. Immunoblot analysis of ABRO1 and NLRP3 proteins in cell lysates immunoprecipitated with anti-ABRO1 antibody.HEK-293T cells transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding Myc-ABRO1, Flag-NLRP3, and HA-ubiquitin (HA-Ub) were left untreated or treated with 5 μM Anisomycin for 2 h or 100 nM SP600125 for 2 h. Immunoblot analysis of NLRP3 ubiquitination (detected by anti-HA antibody) in cell lysates immunoprecipitated with anti-Flag M2 beads.LPS-primed WT and Nlrp3S194A/S194A BMDMs were left untreated or treated with ATP. Immunoblot analysis of NLRP3 ubiquitination (detected by mouse anti-ubiquitin antibody) in cell lysates immunoprecipitated with rabbit anti-NLRP3 antibody."}
{"words": ["Figure", "6WT", "BMDMs", "were", "stimulated", "with", "LPS", "for", "1", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", ",", "ABRO1", ",", "and", "BRCC3", "from", "the", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "control", "IgG", ",", "anti", "-", "ABRO1", ",", "anti", "-", "BRCC3", "or", "anti", "-", "NLRP3", "antibody", ".", "Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "treated", "with", "or", "without", "LPS", "for", "1", "h", ".", "Before", "LPS", "treatment", ",", "Brcc3", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "pretreated", "with", "MG132", "(", "10", "μM", ")", "for", "6", "h", "to", "rescue", "the", "expression", "of", "ABRO1", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "and", "ABRO1", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "ABRO1", "antibody", ".", "Abro1", "+", "/", "+", "and", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "treated", "with", "or", "without", "LPS", "for", "1", "h", ".", "Before", "LPS", "treatment", ",", "Abro1", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "pretreated", "with", "MG132", "(", "10", "μM", ")", "for", "6", "h", "to", "rescue", "the", "expression", "of", "BRCC3", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "and", "BRCC3", "proteins", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "BRCC3", "antibody", ".", "A", "constant", "amount", "of", "Myc", "-", "NLRP3", "plasmid", "together", "with", "an", "increasing", "amount", "of", "Myc", "-", "ABRO1", "plasmid", "were", "co", "-", "transfected", "in", "HEK", "-", "293T", "cells", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "and", "BRCC3", "from", "the", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "control", "IgG", "or", "anti", "-", "BRCC3", "antibody", ".", "Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "BMDMs", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "GFP", ",", "ABRO1", "-", "GFP", "or", "BRCC3", "-", "GFP", "were", "treated", "with", "LPS", "and", "nigericin", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "ubiquitination", "(", "detected", "by", "mouse", "anti", "-", "NLRP3", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "rabbit", "anti", "-", "NLRP3", "antibodyAbro1", "+", "/", "+", ",", "Abro1", "−", "/", "−", ",", "BMDMs", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "GFP", ",", "ABRO1", "-", "GFP", "or", "BRCC3", "-", "GFP", "were", "treated", "with", "LPS", "and", "nigericin", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "ubiquitination", "(", "detected", "by", "mouse", "anti", "-", "NLRP3", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "rabbit", "anti", "-", "NLRP3", "antibodyBrcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "BMDMs", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "GFP", ",", "ABRO1", "-", "GFP", "or", "BRCC3", "-", "GFP", "CBA", "analysis", "of", "IL", "-", "1β", "in", "culture", "supernatantsAbro1", "+", "/", "+", ",", "Abro1", "−", "/", "−", ",", "BMDMs", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "GFP", ",", "ABRO1", "-", "GFP", "or", "BRCC3", "-", "GFP", "CBA", "analysis", "of", "IL", "-", "1β", "in", "culture"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6WT BMDMs were stimulated with LPS for 1 h. Immunoblot analysis of NLRP3, ABRO1, and BRCC3 from the cell lysates immunoprecipitated with control IgG, anti-ABRO1, anti-BRCC3 or anti-NLRP3 antibody.Brcc3+/+ and Brcc3−/− BMDMs were treated with or without LPS for 1 h. Before LPS treatment, Brcc3−/− BMDMs were pretreated with MG132 (10 μM) for 6 h to rescue the expression of ABRO1. Immunoblot analysis of NLRP3 and ABRO1 proteins in cell lysates immunoprecipitated with anti-ABRO1 antibody.Abro1+/+ and Abro1−/− BMDMs were treated with or without LPS for 1 h. Before LPS treatment, Abro1−/− BMDMs were pretreated with MG132 (10 μM) for 6 h to rescue the expression of BRCC3. Immunoblot analysis of NLRP3 and BRCC3 proteins in cell lysates immunoprecipitated with anti-BRCC3 antibody.A constant amount of Myc-NLRP3 plasmid together with an increasing amount of Myc-ABRO1 plasmid were co-transfected in HEK-293T cells. Immunoblot analysis of NLRP3 and BRCC3 from the cell lysates immunoprecipitated with control IgG or anti-BRCC3 antibody.Brcc3+/+ and Brcc3−/− BMDMs transduced with lentiviruses expressing GFP, ABRO1-GFP or BRCC3-GFP were treated with LPS and nigericin. Immunoblot analysis of NLRP3 ubiquitination (detected by mouse anti-NLRP3 antibody) in cell lysates immunoprecipitated with rabbit anti-NLRP3 antibodyAbro1+/+, Abro1−/−, BMDMs transduced with lentiviruses expressing GFP, ABRO1-GFP or BRCC3-GFP were treated with LPS and nigericin. Immunoblot analysis of NLRP3 ubiquitination (detected by mouse anti-NLRP3 antibody) in cell lysates immunoprecipitated with rabbit anti-NLRP3 antibodyBrcc3+/+ and Brcc3−/− BMDMs transduced with lentiviruses expressing GFP, ABRO1-GFP or BRCC3-GFP CBA analysis of IL-1β in culture supernatantsAbro1+/+, Abro1−/−, BMDMs transduced with lentiviruses expressing GFP, ABRO1-GFP or BRCC3-GFP CBA analysis of IL-1β in culture supernatants"}
{"words": ["Figure", "7Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "left", "untreated", "(", "Con", ")", ",", "treated", "with", "LPS", "alone", "(", "LPS", ")", "or", "pretreated", "with", "LPS", "and", "then", "stimulated", "with", "ATP", ",", "nigericin", ",", "MSU", ",", "Alum", ",", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", "or", "flagellin", ".", "CBA", "analysis", "of", "IL", "-", "1β", "secretion", "in", "the", "culture", "supernatants", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "cleaved", "caspase", "-", "1", "and", "IL", "-", "1β", "in", "culture", "supernatants", "(", "SN", ")", "of", "LPS", "-", "primed", "Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "BMDMs", "treated", "with", "ATP", ",", "nigericin", ",", "MSU", ",", "flagellin", ",", "and", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", ".", "Immunostaining", "of", "endogenous", "ASC", "specks", "in", "LPS", "-", "primed", "Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "-", "/", "-", "BMDMs", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "nigericin", "or", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", ".", "ASC", "speck", "positive", "cells", "were", "counted", "and", "analyzed", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1I", ".", "UD", ",", "undetectable", ".", "LPS", "-", "primed", "Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "BMDMs", "were", "left", "unstimulated", "or", "stimulated", "with", "nigericin", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "ubiquitination", "(", "detected", "by", "mouse", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", ")", "in", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "rabbit", "anti", "-", "NLRP3", "antibody", ".", "Survival", "of", "Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "mice", "subjected", "to", "LPS", "(", "15", "mg", "/", "kg", ")", ".", "n", "=", "20", "per", "group", ".", "ELISA", "of", "serum", "IL", "-", "1β", "from", "Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "mice", "3", "h", "after", "intraperitoneal", "injection", "of", "LPS", "(", "15mg", "/", "kg", ")", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", ".", "n", "=", "6", "for", "PBS", "groups", "and", "n", "=", "12", "for", "LPS", "groups", ".", "Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "mice", "were", "intraperitoneally", "injected", "with", "MSU", "(", "1", "mg", "per", "mouse", ")", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", "for", "6", "h", ".", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "and", "TNF", "-", "α", "in", "the", "peritoneal", "lavage", "fluid", "(", "G", ")", "Brcc3", "+", "/", "+", "and", "Brcc3", "−", "/", "−", "mice", "were", "intraperitoneally", "injected", "with", "MSU", "(", "1", "mg", "per", "mouse", ")", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", "for", "6", "h", ".", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "peritoneal", "cell", "exudates", "(", "H", ")", ".", "n", "=", "6", "for", "PBS", "groups", "and", "n", "=", "12", "for", "MSU", "groups", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Brcc3+/+ and Brcc3−/− BMDMs were left untreated (Con), treated with LPS alone (LPS) or pretreated with LPS and then stimulated with ATP, nigericin, MSU, Alum, poly (dA:dT) or flagellin. CBA analysis of IL-1β secretion in the culture supernatants.Immunoblot analysis of cleaved caspase-1 and IL-1β in culture supernatants (SN) of LPS-primed Brcc3+/+ and Brcc3−/− BMDMs treated with ATP, nigericin, MSU, flagellin, and poly (dA: dT).Immunostaining of endogenous ASC specks in LPS-primed Brcc3+/+ and Brcc3-/- BMDMs left untreated or treated with nigericin or poly (dA:dT). ASC speck positive cells were counted and analyzed as described in Fig. 1I. UD, undetectable.LPS-primed Brcc3+/+ and Brcc3−/− BMDMs were left unstimulated or stimulated with nigericin. Immunoblot analysis of NLRP3 ubiquitination (detected by mouse anti-ubiquitin antibody) in cell lysates immunoprecipitated with rabbit anti-NLRP3 antibody.Survival of Brcc3+/+ and Brcc3−/− mice subjected to LPS (15 mg/kg). n=20 per group.ELISA of serum IL-1β from Brcc3+/+ and Brcc3−/− mice 3 h after intraperitoneal injection of LPS (15mg/kg) or vehicle (PBS). n = 6 for PBS groups and n = 12 for LPS groups.Brcc3+/+ and Brcc3−/− mice were intraperitoneally injected with MSU (1 mg per mouse) or vehicle (PBS) for 6 h. ELISA of IL-1β and TNF-α in the peritoneal lavage fluid (G)Brcc3+/+ and Brcc3−/− mice were intraperitoneally injected with MSU (1 mg per mouse) or vehicle (PBS) for 6 h. flow cytometric analysis of peritoneal cell exudates (H). n = 6 for PBS groups and n = 12 for MSU groups."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", ",", "Immunostaining", "for", "CD31", "+", "blood", "vessels", "in", "control", "(", "ctrl", ",", "A", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "B", ")", "forebrains", ".", "Note", "the", "normal", "vasculature", "in", "the", "cortical", "hem", "(", "asterisk", ")", "of", "Gpr124KO", "mice", ".", "C", ",", "D", ",", "Immunostaining", "for", "Pax6", "in", "control", "(", "C", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "D", ")", "forebrains", "to", "reveal", "the", "lateral", "extension", "of", "the", "neocortex", "(", "dashed", "line", ")", "between", "the", "cortical", "hem", "(", "arrowhead", ")", "and", "the", "lateral", "ganglionic", "eminence", "(", "arrow", ")", ".", "E", ",", "Quantification", "of", "the", "lateral", "extension", "of", "the", "cortex", "in", "control", "and", "Gpr124KO", "brains", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "10", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "F", ",", "G", "Staining", "for", "EdU", "(", "red", ")", "and", "Ki67", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "F", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "G", ")", "cortices", "at", "E13", ".", "5", ",", "24", "hours", "after", "EdU", "injection", ".", "H", ",", "Quantification", "of", "Ki67", "+", "NPCs", "in", "the", "VZ", "(", "blue", ")", ",", "SVZ", "/", "CP", "(", "grey", ")", "and", "of", "Ki67", "-", "neurons", "(", "cyan", ")", "generated", "from", "EdU", "-", "labeled", "NPCs", "in", "control", "and", "Gpr124KO", "embryos", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", "(", "control", ")", "and", "N", "=", "3", "(", "Gpr124KO", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmI", ",", "J", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Pax6", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "I", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "J", ")", "cortices", ".", "K", ",", "Quantification", "of", "newborn", "BPs", "in", "the", "VZ", "of", "control", "and", "Gpr124KO", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmL", ",", "M", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "L", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "M", ")", "cortices", ".", "N", ",", "O", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "N", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "O", ")", "in", "control", "and", "Gpr124KO", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Note", "that", "the", "fraction", "of", "total", "BPs", "is", "significantly", "reduced", "(", "Fig", "1K", ")", "while", "the", "fraction", "of", "Ngn1", "+", "BPs", "is", "insignificantly", "reduced", "(", "Fig", "1N", ")", ",", "because", "the", "proportion", "of", "Ngn1", "+", "Tbr2", "+", "cells", "within", "all", "BPs", "is", "slightly", ",", "though", "statisically", "insignificantly", "higher", "in", "the", "Gpr124KObrains", "(", "see", "Fig", "S2M", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmP", ",", "Q", "Stainings", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "for", "Tis21", "-", "GFP", "expression", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "P", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "Q", ")", "cortices", ".", "R", ",", "S", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Tis21", "-", "GFP", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "R", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Tis21", "-", "GFP", "-", ")", "RGs", "(", "S", ")", "in", "control", "and", "Gpr124KO", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A,B, Immunostaining for CD31+ blood vessels in control (ctrl, A) and Gpr124KO (B) forebrains. Note the normal vasculature in the cortical hem (asterisk) of Gpr124KO mice.C,D, Immunostaining for Pax6 in control (C) and Gpr124KO (D) forebrains to reveal the lateral extension of the neocortex (dashed line) between the cortical hem (arrowhead) and the lateral ganglionic eminence (arrow). E, Quantification of the lateral extension of the cortex in control and Gpr124KO brains (mean±SEM; N=10; *** p<0.001).F,G Staining for EdU (red) and Ki67 (green) in control (F) and Gpr124KO (G) cortices at E13.5, 24 hours after EdU injection. H, Quantification of Ki67+ NPCs in the VZ (blue), SVZ/CP (grey) and of Ki67- neurons (cyan) generated from EdU-labeled NPCs in control and Gpr124KO embryos (mean±SEM; N=4 (control) and N=3 (Gpr124KO); * p<0.05, ** p<0.01). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmI,J, Immunostaining for Tbr2 (red) and Pax6 (green ) in control (I) and Gpr124KO (J) cortices. K, Quantification of newborn BPs in the VZ of control and Gpr124KO cortices (mean±SEM; N=4; * p<0.05). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmL,M, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in control (L) and Gpr124KO (M) cortices. N,O Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (N) or expanding (Tbr2- Ngn1-) RGs (O) in control and Gpr124KO cortices (mean±SEM; N=4; * p<0.05, *** p<0.001). Note that the fraction of total BPs is significantly reduced (Fig 1K) while the fraction of Ngn1+BPs is insignificantly reduced (Fig 1N), because the proportion of Ngn1+Tbr2+ cells within all BPs is slightly, though statisically insignificantly higher in the Gpr124KObrains (see Fig S2M). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmP,Q Stainings for Tbr2 (red) and for Tis21-GFP expression (green) in control (P) and Gpr124KO (Q) cortices. R,S Quantification of neurogenic (Tis21-GFP+) RGs and BPs (R) or expanding (Tbr2- Tis21-GFP-) RGs (S) in control and Gpr124KO cortices (mean±SEM; N=4; *** p<0.001). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µm"}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", ",", "Staining", "for", "Isolectin", "B4", "+", "blood", "vessels", "in", "control", "(", "A", ")", "and", "Gpr124ECcKO", "(", "B", ")", "forebrains", ".", "Asterisks", "mark", "the", "lateral", "ventricles", ".", "C", ",", "D", ",", "Staining", "for", "pimonidazole", "(", "PIMO", ",", "green", ")", "and", "Isolectin", "B4", "+", "blood", "vessels", "(", "red", ")", "in", "ctrl", "(", "C", ")", "and", "Gpr124ECcKO", "(", "D", ")", "cortices", ".", "E", ",", "F", ",", "Immunostaining", "for", "Pax6", "in", "control", "(", "E", ")", "and", "Gpr124ECcKO", "(", "F", ")", "forebrain", "sections", "to", "reveal", "the", "lateral", "extension", "of", "the", "neocortex", "(", "dashed", "line", ")", "between", "the", "cortical", "hem", "(", "arrowhead", ")", "and", "the", "lateral", "ganglionic", "eminence", "(", "arrow", ")", ".", "G", ",", "Quantification", "the", "lateral", "extension", "of", "the", "cortex", "in", "control", "and", "Gpr124ECcKObrains", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "6", "for", "ctrl", "and", "N", "=", "8", "for", "Gpr124ECcKO", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "H", ",", "I", ",", "Staining", "for", "EdU", "(", "red", ")", "and", "Ki67", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "H", ")", "and", "Gpr124ECcKO", "(", "I", ")", "cortices", "at", "E13", ".", "5", ",", "24", "hours", "after", "EdU", "injection", ".", "J", ",", "Quantification", "of", "Ki67", "+", "NPCs", "in", "the", "in", "VZ", "(", "blue", ")", ",", "SVZ", "/", "CP", "(", "grey", ")", "and", "of", "Ki67", "-", "neurons", "(", "cyan", ")", "generated", "from", "EdU", "-", "labeled", "NPCs", "in", "control", "and", "Gpr124ECcKO", "embryos", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmK", ",", "L", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "K", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "L", ")", "cortices", ".", "M", "-", "O", ",", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "M", ")", ",", "newborn", "BPs", "(", "N", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "O", ")", "in", "control", "and", "Gpr124ECcKO", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A,B, Staining for Isolectin B4+ blood vessels in control (A) and Gpr124ECcKO (B) forebrains. Asterisks mark the lateral ventricles.C,D, Staining for pimonidazole (PIMO, green) and Isolectin B4+ blood vessels (red) in ctrl (C) and Gpr124ECcKO (D) cortices.E,F, Immunostaining for Pax6 in control (E) and Gpr124ECcKO (F) forebrain sections to reveal the lateral extension of the neocortex (dashed line) between the cortical hem (arrowhead) and the lateral ganglionic eminence (arrow). G, Quantification the lateral extension of the cortex in control and Gpr124ECcKObrains (mean±SEM; N=6 for ctrl and N=8 for Gpr124ECcKO; * p<0.05).H,I, Staining for EdU (red) and Ki67 (green) in control (H) and Gpr124ECcKO (I) cortices at E13.5, 24 hours after EdU injection. J, Quantification of Ki67+ NPCs in the in VZ (blue), SVZ/CP (grey) and of Ki67- neurons (cyan) generated from EdU-labeled NPCs in control and Gpr124ECcKO embryos (mean±SEM; N=4; * p<0.05, ** P<0.01). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmK,L, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in control (K) and Gpr124KO (L) cortices. M-O, Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (M), newborn BPs (N) or expanding (Tbr2- Ngn1-) RGs (O) in control and Gpr124ECcKO cortices (mean±SEM; N=4; * p<0.05, ** p<0.01). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µm"}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "NSC", "-", "specific", "markers", "(", "Fabp7", ",", "Hes5", ")", "and", "neuronal", "markers", "(", "Dcx", ",", "Tubb3", ")", "in", "the", "Prom1", "+", "fraction", ",", "presented", "as", "fold", "change", "compared", "to", "the", "Prom1", "-", "fraction", ")", "from", "WT", "cortices", "at", "E14", ".", "5", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", "for", "Dcx", ";", "N", "=", "6", "for", "all", "other", "genes", ")", ".", "F", ",", "Western", "blot", "for", "HIF", "-", "1", "(", "top", ")", ",", "HIF", "-", "2", "(", "middle", ")", "and", "a", "-", "tubulin", "as", "loading", "control", "(", "bottom", ")", "using", "forebrain", "lysates", "from", "E13", ".", "5", "control", "(", "left", ")", "or", "Gpr124KOembryos", "(", "middle", ")", ".", "HIF", "-", "1", "/", "2", "-", "transfected", "HEK293", "cells", "served", "as", "positive", "control", "(", "right", ")", ".", "G", ",", "Quantification", "of", "HIF", "-", "1", "band", "intensities", "shown", "in", "panel", "F", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "H", ",", "I", ",", "Immunostaining", "for", "HIF", "-", "1α", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "control", "(", "H", ",", "H", "'", ",", "H", "'", "'", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "I", ",", "I", "'", ",", "I", "'", "'", ")", "cortices", ".", "Panels", "H", "'", ",", "H", "'", "'", ",", "I", "'", "and", "I", "'", "'", "are", "magnifications", "of", "the", "boxed", "areas", "in", "panels", "I", "and", "J", ",", "showing", "HIF", "-", "1α", "signal", "alone", "(", "H", "'", ",", "I", "'", ")", "or", "together", "with", "DAPI", "(", "H", "'", "'", ",", "I", "'", "'", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "autofluorescent", "blood", "cells", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "basal", "boundary", "of", "the", "VZ", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmJ", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "HIF", "-", "1", "target", "gene", "expression", "in", "VZ", "cells", "from", "the", "cortex", "of", "control", "and", "Gpr124KO", "E13", ".", "5", "embryos", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, qRT-PCR analysis of NSC-specific markers (Fabp7, Hes5) and neuronal markers (Dcx, Tubb3) in the Prom1+ fraction, presented as fold change compared to the Prom1- fraction) from WT cortices at E14.5 (mean±SEM; N=3 for Dcx; N=6 for all other genes).F, Western blot for HIF-1 (top), HIF-2 (middle) and a-tubulin as loading control (bottom) using forebrain lysates from E13.5 control (left) or Gpr124KOembryos (middle). HIF-1/2-transfected HEK293 cells served as positive control (right). G, Quantification of HIF-1 band intensities shown in panel F (mean±SEM; N=3; ** p<0.01).H,I, Immunostaining for HIF-1α (red) and DAPI (blue) in control (H, H', H'') and Gpr124KO (I,I',I'') cortices. Panels H',H'',I' and I'' are magnifications of the boxed areas in panels I and J, showing HIF-1α signal alone (H',I') or together with DAPI (H'',I''). Asterisks indicate autofluorescent blood cells. The dashed line indicates the basal boundary of the VZ. Scale bar = 100 µm. Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmJ, qRT-PCR analysis of HIF-1 target gene expression in VZ cells from the cortex of control and Gpr124KO E13.5 embryos (mean±SEM; N=4; *** p<0.001). SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "F", ",", "Staining", "for", "Isolectin", "B4", "(", "A", "-", "C", ")", "and", "oxidized", "thiols", "(", "D", "-", "F", ")", "in", "WT", "cortices", "at", "E10", ".", "5", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "E11", ".", "5", "(", "B", ",", "E", ")", "and", "E12", ".", "5", "(", "C", ",", "F", ")", ".", "Panels", "D", "-", "F", "are", "pseudocolor", "conversions", "of", "staining", "intensity", "(", "from", "low", "[", "purple", "]", "to", "high", "[", "red", "]", ")", ".", "Arrowheads", "denote", "the", "position", "of", "the", "vascular", "front", ".", "G", "-", "I", ",", "Immunostaining", "for", "HIF", "-", "1α", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "WT", "cortices", "at", "E10", ".", "5", "(", "G", "-", "G", "'", "'", ")", ",", "E11", ".", "5", "(", "H", "-", "H", "'", "'", ")", "and", "E12", ".", "5", "(", "I", "-", "I", "'", "'", ")", ".", "Panels", "G", "'", ",", "G", "'", "'", ",", "H", "'", ",", "H", "'", "'", ",", "I", "'", "and", "I", "'", "'", "are", "magnifications", "of", "the", "boxed", "areas", "in", "their", "respective", "original", "panels", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "border", "of", "lateral", "and", "dorsal", "cortex", ".", "J", "-", "L", ",", "Immunostaining", "for", "Glut1", "of", "WT", "cortices", "at", "E10", ".", "0", "(", "J", ")", ",", "E11", ".", "5", "(", "K", ")", "and", "E12", ".", "5", "(", "L", ")", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "the", "apical", "border", "of", "the", "cortex", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", "(", "D", ",", "F", ",", "G", ",", "H", ",", "I", ",", "J", "-", "L", ")", "or", "50", "µm", "(", "I", "'", "'", ")", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-F, Staining for Isolectin B4 (A-C) and oxidized thiols (D-F) in WT cortices at E10.5 (A,D), E11.5 (B,E) and E12.5 (C,F). Panels D-F are pseudocolor conversions of staining intensity (from low [purple] to high [red]). Arrowheads denote the position of the vascular front.G-I, Immunostaining for HIF-1α (red) and DAPI (blue) in WT cortices at E10.5 (G-G''), E11.5 (H-H'') and E12.5 (I-I''). Panels G',G'',H',H'',I' and I'' are magnifications of the boxed areas in their respective original panels. Arrows point to the border of lateral and dorsal cortex.J-L, Immunostaining for Glut1 of WT cortices at E10.0 (J), E11.5 (K) and E12.5 (L). Dashed lines indicate the apical border of the cortex. Scale bar: 100 µm (D,F,G,H,I, J-L) or 50 µm (I''), respectively."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "HIF", "-", "1", "and", "HIF", "-", "1", "target", "gene", "expression", "in", "cortices", "from", "E13", ".", "5", "WT", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "embryos", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "8", "for", "WT", "and", "N", "=", "5", "for", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "B", ",", "C", ",", "Staining", "for", "EdU", "(", "red", ")", "and", "Ki67", "(", "green", ")", "in", "WT", "(", "B", ")", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "(", "C", ")", "cortices", "at", "E13", ".", "5", ",", "24", "hours", "after", "EdU", "injection", ".", "D", ",", "Quantification", "of", "Ki67", "+", "NPCs", "in", "the", "in", "VZ", "(", "blue", ")", ",", "SVZ", "/", "CP", "(", "grey", ")", "and", "of", "Ki67", "-", "neurons", "(", "cyan", ")", "generated", "from", "EdU", "-", "labeled", "NPCs", "in", "control", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "brains", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmE", ",", "F", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "WT", "(", "E", ")", "or", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "(", "F", ")", "cortices", "at", "E13", ".", "5", ".", "G", "-", "I", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "G", ")", ",", "newborn", "BPs", "(", "H", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "I", ")", "in", "control", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "cortices", "at", "E13", ".", "5", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmJ", ",", "Whole", "mount", "image", "of", "brains", "from", "WT", "or", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "mice", "at", "P5", ".", "K", "Quantification", "of", "cortex", "area", "in", "brain", "sections", "from", "P5", "WT", "or", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "mice", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "8", "(", "WT", ")", "or", "N", "=", "6", "(", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "L", ",", "M", ",", "Staining", "with", "Hoechst", "33248", "in", "P5", "WT", "(", "L", ")", "or", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "(", "M", ")", "cortices", ".", "N", ",", "Quantification", "of", "cortical", "thickness", "of", "WT", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "cortices", ".", "The", "double", "arrow", "denotes", "the", "measured", "thickness", "of", "the", "cortex", ".", "N", ",", "Quantification", "of", "cortical", "thickness", "of", "WT", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "8", "(", "WT", ")", "or", "N", "=", "6", "(", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", ")", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "O", "-", "Q", ",", "Epifluorescent", "images", "of", "the", "E16", ".", "5", "cortex", ",", "3", "days", "after", "in", "utero", "electroporation", "(", "IUE", ")", "with", "EGFP", "alone", "(", "ctrl", ",", "O", ")", ",", "wild", "type", "HIF", "-", "1", "+", "EGFP", "(", "P", ")", "or", "mutant", "HIF", "-", "1ΔC", "+", "EGFP", "(", "Q", ")", ".", "O", "'", ",", "P", "'", "and", "Q", "'", "are", "magnifications", "of", "the", "boxed", "area", "in", "their", "respective", "original", "panel", ".", "R", ",", "Quantification", "of", "EGFP", "+", "cells", "in", "the", "cortical", "zones", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", "shown", "in", "O", "-", "Q", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmS", "-", "U", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "NSC", "marker", "(", "S", ";", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "neurogenic", "markers", "(", "T", ";", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "and", "HIF", "target", "genes", "(", "U", ";", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "in", "expanding", "NPCs", "(", "eNPCs", ")", "and", "neurogenic", "NPCs", "(", "nNPCs", ")", ".", "Gene", "expression", "was", "normalized", "to", "the", "levels", "in", "eNPCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, qRT-PCR analysis of HIF-1 and HIF-1 target gene expression in cortices from E13.5 WT and HIF-1αCC+/-embryos (mean±SEM; N=8 for WT and N=5 for HIF-1αCC+/-; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).B,C, Staining for EdU (red) and Ki67 (green) in WT (B) and HIF-1αCC+/- (C) cortices at E13.5, 24 hours after EdU injection. D, Quantification of Ki67+NPCs in the in VZ (blue), SVZ/CP (grey) and of Ki67-neurons (cyan) generated from EdU-labeled NPCs in control and HIF-1αCC+/-brains (mean±SEM; N=4; * p<0.05). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmE,F, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in WT (E) or HIF-1αCC+/- (F) cortices at E13.5. G-I Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (G), newborn BPs (H) or expanding (Tbr2-Ngn1-) RGs (I) in control and HIF-1αCC+/-cortices at E13.5 (mean±SEM; N=5; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmJ, Whole mount image of brains from WT or HIF-1αCC+/-mice at P5. K Quantification of cortex area in brain sections from P5 WT or HIF-1αCC+/-mice (mean±SEM; N=8 (WT) or N=6 (HIF-1αCC+/-); * p<0.05).L,M, Staining with Hoechst 33248 in P5 WT (L) or HIF-1αCC+/- (M) cortices. N, Quantification of cortical thickness of WT and HIF-1αCC+/-cortices. The double arrow denotes the measured thickness of the cortex. N, Quantification of cortical thickness of WT and HIF-1αCC+/-cortices (mean±SEM; N=8 (WT) or N=6 (HIF-1αCC+/-); *** p<0.001).O-Q, Epifluorescent images of the E16.5 cortex, 3 days after in utero electroporation (IUE) with EGFP alone (ctrl, O), wild type HIF-1+EGFP (P) or mutant HIF-1ΔC+EGFP (Q). O',P' and Q' are magnifications of the boxed area in their respective original panel. R, Quantification of EGFP+ cells in the cortical zones VZ/SVZ, IZ and CP shown in O-Q (mean±SEM; N=5; ** p< 0.01,* p<0.05). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmS-U, qRT-PCR analysis of NSC marker (S; mean±SEM; N=5; * P<0.05), neurogenic markers (T; mean±SEM; N=5; *** p< 0.001, * p<0.05), and HIF target genes (U; mean±SEM; N=5; ** p< 0.01,* p<0.05) in expanding NPCs (eNPCs) and neurogenic NPCs (nNPCs). Gene expression was normalized to the levels in eNPCs."}
{"words": ["Figure", "6B", "-", "E", ",", "Staining", "for", "pimonodazole", "(", "PIMO", ",", "green", ")", "and", "Isolectin", "B4", "(", "IB4", ",", "red", ")", "in", "Gpr124KO", "(", "B", ",", "C", ")", "and", "control", "(", "D", ",", "E", ")", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "(", "B", ",", "D", ")", "or", "80", "%", "O2", "(", "C", ",", "E", ")", ".", "Compared", "to", "the", "pimonidazole", "staining", "in", "panels", "B", ",", "C", ",", "the", "intensity", "of", "this", "staining", "is", "much", "weaker", "in", "panels", "D", ",", "E", ".", "For", "reasons", "of", "clarity", ",", "the", "pimonidazole", "staining", "in", "panels", "D", ",", "E", "was", "therefore", "enhanced", ",", "equally", "in", "both", "panels", ".", "F", ",", "G", ",", "Immunostaining", "for", "HIF", "-", "1", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "Gpr124KOcortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "(", "F", ")", "or", "80", "%", "O2", "(", "G", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmH", ",", "I", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "Gpr124KO", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "(", "H", ")", "or", "80", "%", "O2", "(", "I", ")", ".", "J", "-", "L", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "J", ")", ",", "newborn", "BPs", "(", "K", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "L", ")", "in", "Gpr124KO", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "or", "80", "%", "O2", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", "for", "21", "%", "O2", "and", "N", "=", "5", "for", "80", "%", "O2", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "M", ",", "N", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "control", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "(", "M", ")", "or", "80", "%", "O2", "(", "N", ")", ".", "O", "-", "Q", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "O", ")", ",", "newborn", "BPs", "(", "P", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "Q", ")", "in", "control", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "or", "80", "%", "O2", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B-E, Staining for pimonodazole (PIMO, green) and Isolectin B4 (IB4,red) in Gpr124KO (B,C) and control (D,E) cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 (B,D) or 80% O2 (C,E). Compared to the pimonidazole staining in panels B,C, the intensity of this staining is much weaker in panels D,E. For reasons of clarity, the pimonidazole staining in panels D,E was therefore enhanced, equally in both panels.F,G, Immunostaining for HIF-1 (red) and DAPI (blue) in Gpr124KOcortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 (F) or 80% O2 (G). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmH,I, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in Gpr124KO cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 (H) or 80% O2 (I). J-L Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (J), newborn BPs (K) or expanding (Tbr2- Ngn1-) RGs (L) in Gpr124KO cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 or 80% O2 (mean±SEM; N=4 for 21% O2 and N=5 for 80% O2; * p<0.05, ** p<0.01). M,N, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in control cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 (M) or 80% O2 (N). O-Q Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (O), newborn BPs (P) or expanding (Tbr2-Ngn1-) RGs (Q) in control cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 or 80% O2 (mean±SEM; N=5; ** p<0.01). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µm"}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "glycolytic", "enzymes", "in", "Prom1", "+", "VZ", "cells", "and", "their", "Prom1", "-", "differentiated", "progeny", "(", "BPs", "and", "neurons", ")", "in", "WT", "cortices", "at", "E14", ".", "5", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", "(", "Hk2", ",", "Gapdh", ")", ";", "N", "=", "6", "(", "Eno1", ";", "Ldha", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "B", ",", "Measurement", "of", "lactate", "secretion", "from", "proliferating", "NSCs", ",", "and", "of", "NSCs", "differentiating", "for", "3", "days", "(", "switch", "to", "neurogenesis", ")", "or", "for", "7", "days", "(", "fully", "differentiated", ")", ",", "normalized", "to", "cellular", "protein", "content", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "6", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "C", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Pfkfb3", "expression", "in", "proliferating", "NSCs", ",", "transduced", "with", "scr", "or", "Pfkfb3shRNA", "#", "1", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "D", ",", "Measurement", "of", "lactate", "secretion", "from", "proliferating", "NSCs", "transduced", "with", "scr", "or", "Pfkfb3shRNA", "#", "1", ",", "normalized", "to", "cellular", "protein", "content", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "E", ",", "Measurement", "of", "mitochondrial", "respiration", "rate", "(", "oxygen", "consumption", "rate", ",", "OCRMITO", ";", "see", "supplemental", "methods", ")", "in", "proliferating", "NSCs", ",", "transduced", "with", "scr", "or", "Pfkfb3shRNA", "#", "1", ",", "normalized", "to", "cellular", "protein", "content", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", ";", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ")", ".", "F", "-", "H", ",", "Epifluorescent", "images", "of", "the", "E15", ".", "5", "cortex", ",", "3", "days", "after", "in", "utero", "electroporation", "(", "IUE", ")", "with", "EGFP", "+", "scr", "shRNA", "(", "F", ")", ",", "EGFP", "+", "Pfkfb3", "shRNA", "#", "1", "(", "G", ")", "or", "EGFP", "+", "Pfkfb3", "shRNA", "#", "2", "(", "H", ")", ".", "J", ",", "Quantification", "of", "EGFP", "+", "cells", "in", "the", "cortical", "zones", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", "shown", "in", "panels", "F", "-", "H", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", "for", "scr", "and", "N", "=", "5", "for", "Pfkfb3", "shRNAs", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "K", "-", "M", ",", "Epifluorescent", "images", "of", "the", "mouse", "cortex", "after", "in", "utero", "electroporation", "(", "IUE", ")", "with", "HIF", "-", "1α", "and", "scr", "shRNA", "(", "K", ")", "or", "with", "HIF", "-", "1α", "and", "two", "different", "Pfkfb3", "shRNAs", "(", "L", ",", "M", ")", "at", "E16", ".", "5", ",", "3", "days", "after", "transfection", ".", "N", ",", "Quantification", "of", "EGFP", "+", "cells", "in", "the", "cortical", "zones", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", "shown", "in", "K", "-", "M", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, qRT-PCR analysis of glycolytic enzymes in Prom1+ VZ cells and their Prom1- differentiated progeny (BPs and neurons) in WT cortices at E14.5 (mean±SEM; N=3 (Hk2, Gapdh); N=6 (Eno1; Ldha; ** p<0.01).B, Measurement of lactate secretion from proliferating NSCs, and of NSCs differentiating for 3 days (switch to neurogenesis) or for 7 days (fully differentiated), normalized to cellular protein content (mean±SEM; N=6; *** p<0.001).C, qRT-PCR analysis of Pfkfb3 expression in proliferating NSCs, transduced with scr or Pfkfb3shRNA#1 (mean±SEM; N=4; * p<0.05).D, Measurement of lactate secretion from proliferating NSCs transduced with scr or Pfkfb3shRNA#1, normalized to cellular protein content (mean±SEM; N=3; * p<0.05).E, Measurement of mitochondrial respiration rate (oxygen consumption rate, OCRMITO; see supplemental methods) in proliferating NSCs, transduced with scr or Pfkfb3shRNA#1, normalized to cellular protein content (mean±SEM; N=3; N.S., not significant).F-H, Epifluorescent images of the E15.5 cortex, 3 days after in utero electroporation (IUE) with EGFP + scr shRNA (F), EGFP + Pfkfb3 shRNA#1 (G) or EGFP + Pfkfb3 shRNA#2 (H). J, Quantification of EGFP+ cells in the cortical zones VZ/SVZ, IZ and CP shown in panels F-H (mean±SEM; N=4 for scr and N=5 for Pfkfb3 shRNAs; * p<0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001). K-M, Epifluorescent images of the mouse cortex after in utero electroporation (IUE) with HIF-1α and scr shRNA (K) or with HIF-1α and two different Pfkfb3 shRNAs (L,M) at E16.5, 3 days after transfection. N, Quantification of EGFP+ cells in the cortical zones VZ/SVZ, IZ and CP shown in K-M (mean±SEM; N=5; * p<0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µm"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "RNF145", "and", "ADIPOR2", "respond", "to", "a", "range", "of", "FAs", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "treated", "for", "6h", "with", "saturated", "FAs", "(", "SFAs", ";", "400", "µM", "(", "C12", ":", "0", "-", "C18", ":", "0", ")", ";", "200", "µM", "(", "C20", ":", "0", ")", ")", "or", "unsaturated", "FAs", "(", "UFAs", ";", "400", "µM", "(", "C18", ":", "1", "-", "n9", ")", ";", "200", "µM", "(", "C20", ":", "4", "-", "n6", ",", "C20", ":", "5", "-", "n3", ")", ")", ".", "*", "non", "-", "specific", "bands", ".", "(", "E", ")", "Inhibition", "of", "the", "primary", "lipid", "desaturase", "SCD1", "affects", "RNF145", "and", "ADIPOR2", "levels", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "treated", "with", "the", "SCD1", "inhibitor", "MF", "-", "438", "(", "SCDi", ",", "100", "nM", ",", "18h", ")", "and", "RNF145", "/", "ADIPOR2", "expression", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "*", "non", "-", "specific", "bands", ".", "(", "F", ")", "SCD1", "overexpression", "affects", "RNF145", "/", "ADIPOR2", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "containing", "an", "empty", "control", "vector", "or", "expressing", "SCD1", "-", "HA", "were", "cultured", "in", "FCS", "-", "free", "DMEM", "for", "24h", "and", "whole", "-", "cell", "lysates", "analysed", ".", "*", "non", "-", "specific", "bands", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) RNF145 and ADIPOR2 respond to a range of FAs. HEK-293T cells were treated for 6h with saturated FAs (SFAs; 400 µM (C12:0 - C18:0); 200 µM (C20:0)) or unsaturated FAs (UFAs; 400 µM (C18:1-n9); 200 µM (C20:4-n6, C20:5-n3)). * non-specific bands.(E) Inhibition of the primary lipid desaturase SCD1 affects RNF145 and ADIPOR2 levels. HEK-293T cells were treated with the SCD1 inhibitor MF-438 (SCDi, 100 nM, 18h) and RNF145/ADIPOR2 expression analysed by immunoblotting. * non-specific bands.(F) SCD1 overexpression affects RNF145/ADIPOR2. HEK-293T cells containing an empty control vector or expressing SCD1-HA were cultured in FCS-free DMEM for 24h and whole-cell lysates analysed. * non-specific bands."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Endogenous", "ADIPOR2", "is", "stabilised", "in", "RNF145", "knockout", "cells", ".", "Representative", "35S", "pulse", "-", "chase", "analysis", "in", "HeLa", "WT", ",", "RNF145", "knockout", "(", "∆", "RNF145", ")", "or", "ADIPOR2", "knockout", "(", "∆", "AR2", ")", "cells", ".", "Quantification", "of", "35S", "-", "labelled", "ADIPOR2", "normalised", "to", "t", "=", "0", "h", "is", "shown", "below", ".", "(", "B", ")", "ADIPOR2", "regulation", "requires", "the", "E3", "ligase", "activity", "of", "RNF145", ".", "HEK", "-", "293T", "RNF145", "knockout", "cells", "(", "∆", "RNF145", ")", "were", "stably", "complemented", "with", "WT", "RNF145", "(", "RNF145", "-", "V5", ")", "or", "an", "inactive", "RNF145C552A", ",", "H554A", "RING", "domain", "mutant", "(", "mRNF145", "-", "V5", ")", ".", "*", "non", "-", "specific", "bands", ".", "(", "C", ")", "RNF145", "binds", "ADIPOR2", ".", "RNF145", "was", "immunoprecipitated", "from", "HeLa", "RNF145", "knockout", "cells", "complemented", "with", "WT", "RNF145", "(", "RNF145", "-", "V5", ")", "or", "an", "inactive", "RNF145C552A", ",", "H554A", "RING", "domain", "mutant", "(", "mRNF145", "-", "V5", ")", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "VCP", "inhibitor", "(", "NMS", "-", "873", ",", "10", "µM", ",", "90", "min", ")", "prior", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "V5", "antibody", ".", "(", "D", ")", "The", "E2", "ubiquitin", "-", "conjugating", "enzyme", "UBE2G2", "is", "involved", "in", "RNF145", "-", "mediated", "ADIPOR2", "degradation", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "HEK", "-", "293T", "cells", "depleted", "of", "RNF145", "(", "gRNF145", ")", ",", "UBE2G2", "(", "gUBE2G2", ")", "or", "B2M", "(", "control", ";", "gCTR", ")", ".", "(", "E", ")", "ADIPOR2", "degradation", "depends", "on", "UBXD8", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "depleted", "of", "B2M", "(", "gCTR", ")", "or", "UBXD8", "(", "gUBXD8", ")", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Endogenous ADIPOR2 is stabilised in RNF145 knockout cells. Representative 35S pulse-chase analysis in HeLa WT, RNF145 knockout (∆RNF145) or ADIPOR2 knockout (∆AR2) cells. Quantification of 35S-labelled ADIPOR2 normalised to t = 0 h is shown below.(B) ADIPOR2 regulation requires the E3 ligase activity of RNF145. HEK-293T RNF145 knockout cells (∆RNF145) were stably complemented with WT RNF145 (RNF145-V5) or an inactive RNF145C552A,H554A RING domain mutant (mRNF145-V5). * non-specific bands.(C) RNF145 binds ADIPOR2. RNF145 was immunoprecipitated from HeLa RNF145 knockout cells complemented with WT RNF145 (RNF145-V5) or an inactive RNF145C552A,H554A RING domain mutant (mRNF145-V5). Cells were treated with VCP inhibitor (NMS-873, 10 µM, 90 min) prior to immunoprecipitation with an anti-V5 antibody.(D) The E2 ubiquitin-conjugating enzyme UBE2G2 is involved in RNF145-mediated ADIPOR2 degradation. Immunoblot analysis of HEK-293T cells depleted of RNF145 (gRNF145), UBE2G2 (gUBE2G2) or B2M (control; gCTR).(E) ADIPOR2 degradation depends on UBXD8. HEK-293T cells were depleted of B2M (gCTR) or UBXD8 (gUBXD8) and analysed by immunoblotting."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "FA", "-", "mediated", "regulation", "of", "RNF145", "is", "proteasome", "-", "dependent", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "treated", "with", "BSA", ",", "PA", "(", "400", "µM", ",", "6h", ")", "±", "MG132", "(", "10", "µg", "/", "ml", ",", "6h", ")", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "*", "non", "-", "specific", "bands", ".", "(", "B", ")", "UBXD8", "participates", "in", "PA", "-", "modulated", "RNF145", "degradation", ".", "CRISPR", "/", "Cas9", "-", "mediated", "depletion", "of", "UBXD8", "(", "gUBXD8", ")", "or", "B2M", "(", "gB2M", ",", "control", ")", "in", "HEK", "-", "293T", "cells", ",", "followed", "by", "exposure", "to", "PA", "(", "400", "µM", ",", "6h", ")", "or", "BSA", "(", "6h", ",", "vehicle", "control", ")", ".", "(", "C", ")", "PA", "and", "OA", "treatment", "alter", "RNF145", "ubiquitination", ".", "Immunoprecipitation", "of", "RNF145", "from", "cells", "treated", "with", "BSA", "(", "control", ")", ",", "PA", "or", "OA", "(", "each", "200", "µM", ",", "3h", ")", ".", "During", "FA", "treatments", ",", "VCP", "inhibitor", "(", "NMS", "-", "873", ",", "10", "µM", ")", "was", "present", "to", "stabilise", "ubiquitinated", "proteins", ".", "RNF145", "ubiquitination", "(", "ubi", ")", "was", "detected", "using", "an", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", "(", "VU", "-", "1", ")", ".", "(", "D", ")", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "CHX", ",", "1", "µg", "/", "ml", ")", "and", "OA", "(", "400", "µM", ",", "6h", ")", "±", "MG132", "(", "10", "µg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "LE", ",", "long", "exposure", ";", "*", "non", "-", "specific", "bands", ".", "(", "E", ")", "Lysine", "-", "less", "RNF145", "is", "stabilised", "under", "PA", "treatment", ".", "RNF145", "knockout", "HEK", "-", "293T", "cells", "(", "∆", "RNF145", ")", "were", "complemented", "with", "RNF145", "-", "V5", "or", "a", "lysine", "-", "less", "variant", "of", "RNF145", "(", "RNF145", "-", "V5", "K", ">", "R", ")", "and", "treated", "BSA", "or", "PA", "(", "400", "µM", ",", "6h", ")", ".", "Dotted", "lines", "demarcate", "the", "different", "cell", "lines", ".", "(", "F", ")", "Adjustment", "of", "RNF145", "levels", "to", "PA", "requires", "its", "ubiquitin", "ligase", "activity", ".", "Immunoblot", "of", "whole", "-", "cell", "lysates", "from", "RNF145", "knockout", "HEK", "-", "293T", "(", "∆", "RNF145", ")", "cells", "stably", "complemented", "with", "RNF145", "-", "V5", "or", "RNF145C552A", ",", "H554A", "-", "V5", "(", "mRNF145", "-", "V5", ")", "and", "treated", "with", "BSA", "or", "PA", "(", "400", "µM", ",", "6h", ")", ".", "LE", ",", "long", "exposure", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) FA-mediated regulation of RNF145 is proteasome-dependent. HEK-293T cells were treated with BSA, PA (400 µM, 6h) ± MG132 (10 µg/ml, 6h) and analysed by immunoblotting. *non-specific bands.(B) UBXD8 participates in PA-modulated RNF145 degradation. CRISPR/Cas9-mediated depletion of UBXD8 (gUBXD8) or B2M (gB2M, control) in HEK-293T cells, followed by exposure to PA (400 µM, 6h) or BSA (6h, vehicle control).(C) PA and OA treatment alter RNF145 ubiquitination. Immunoprecipitation of RNF145 from cells treated with BSA (control), PA or OA (each 200 µM, 3h). During FA treatments, VCP inhibitor (NMS-873, 10 µM) was present to stabilise ubiquitinated proteins. RNF145 ubiquitination (ubi) was detected using an anti-ubiquitin antibody (VU-1).(D) HEK-293T cells were treated with cycloheximide (CHX, 1 µg/ml) and OA (400 µM, 6h) ± MG132 (10 µg/ml) for the indicated times. LE, long exposure; * non-specific bands.(E) Lysine-less RNF145 is stabilised under PA treatment. RNF145 knockout HEK-293T cells (∆RNF145) were complemented with RNF145-V5 or a lysine-less variant of RNF145 (RNF145-V5 K > R) and treated BSA or PA (400 µM, 6h). Dotted lines demarcate the different cell lines.(F) Adjustment of RNF145 levels to PA requires its ubiquitin ligase activity. Immunoblot of whole-cell lysates from RNF145 knockout HEK-293T (∆RNF145) cells stably complemented with RNF145-V5 or RNF145C552A, H554A-V5 (mRNF145-V5) and treated with BSA or PA (400 µM, 6h). LE, long exposure."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "ADIPOR2", "regulation", "by", "FAs", "is", "completely", "dependent", "on", "RNF145", ".", "WT", "or", "RNF145", "knockout", "HEK", "-", "293T", "cells", "(", "∆", "RNF145", ")", "were", "treated", "with", "BSA", ",", "PA", "or", "OA", "(", "400", "µM", ",", "6h", ")", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "Non", "-", "specific", "bands", "are", "indicated", "(", "*", ")", ".", "(", "B", ")", "RNF145", "-", "ADIPOR2", "interaction", "is", "FA", "-", "modulated", ".", "Immunoprecipitation", "of", "endogenous", "RNF145", "HEK", "-", "293T", "cells", "depleted", "of", "UBE2G2", "(", "gUBE2G2", ")", "and", "/", "or", "RNF145", "(", "gRNF145", ")", "and", "treated", "with", "400", "µM", "of", "the", "indicated", "PA", ",", "OA", "or", "BSA", "(", "control", ")", "for", "3h", ".", "LE", ",", "long", "exposure", ".", "*", "non", "-", "specific", "bands", ".", "(", "C", ")", "Immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "of", "endogenous", "ADIPOR2", "from", "WT", "or", "∆", "RNF145", "cells", "(", "see", "(", "C", ")", ")", "treated", "with", "MG132", "(", "5", "µg", "/", "ml", ",", "6h", ")", "±", "OA", "(", "200", "µM", ",", "6h", ")", ".", "Ubiquitinated", "ADIPOR2", "was", "detected", "using", "a", "specific", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", "(", "clone", "VU", "-", "1", ")", ".", "Note", "that", "ADIPOR2", "levels", "in", "RNF145", "knockout", "HEK", "-", "293T", "cells", "are", "increased", ".", "(", "D", ")", "ADIPOR2", "knockout", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "stably", "complemented", "with", "ADIPOR2", "-", "HA", ",", "an", "ADIPOR2", "mutant", "in", "which", "all", "lysines", "were", "mutated", "to", "arginines", "(", "K", "-", "less", "ADIPOR2", "-", "HA", ")", ",", "or", "an", "empty", "vector", "control", "and", "exposed", "to", "OA", "(", "200", "µM", ",", "6h", ")", "or", "BSA", "(", "control", ")", ".", "ADIPOR2", "variants", "were", "visualised", "by", "immunoblotting", "using", "a", "specific", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "LE", ",", "long", "exposure", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) ADIPOR2 regulation by FAs is completely dependent on RNF145. WT or RNF145 knockout HEK-293T cells (∆RNF145) were treated with BSA, PA or OA (400 µM, 6h) and analysed by immunoblotting. Non-specific bands are indicated (*).(B) RNF145 - ADIPOR2 interaction is FA-modulated. Immunoprecipitation of endogenous RNF145 HEK-293T cells depleted of UBE2G2 (gUBE2G2) and/or RNF145 (gRNF145) and treated with 400 µM of the indicated PA, OA or BSA (control) for 3h. LE, long exposure. * non-specific bands.(C) Immunoprecipitation (IP) of endogenous ADIPOR2 from WT or ∆RNF145 cells (see (C)) treated with MG132 (5 µg/ml, 6h) ± OA (200 µM, 6h). Ubiquitinated ADIPOR2 was detected using a specific anti-ubiquitin antibody (clone VU-1). Note that ADIPOR2 levels in RNF145 knockout HEK-293T cells are increased.(D) ADIPOR2 knockout HEK-293T cells were stably complemented with ADIPOR2-HA, an ADIPOR2 mutant in which all lysines were mutated to arginines (K-less ADIPOR2-HA), or an empty vector control and exposed to OA (200 µM, 6h) or BSA (control). ADIPOR2 variants were visualised by immunoblotting using a specific anti-HA antibody. LE, long exposure."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Loss", "of", "ADIPOR2", "sensitises", "cells", "to", "PA", "-", "induced", "cytotoxicity", ".", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "depleted", "of", "RNF145", "(", "purple", ")", ",", "ADIPOR2", "(", "blue", ")", ",", "B2M", "(", "CTR", ";", "grey", ")", ",", "or", "both", "ADIPOR2", "and", "RNF145", "(", "blue", "+", "purple", ")", ",", "exposed", "to", "PA", "(", "200", "µM", ",", "96h", ")", "and", "stained", "with", "crystal", "violet", ".", "Quantification", "of", "crystal", "-", "violet", "stained", "cells", "is", "shown", "alongside", "a", "representative", "micrograph", "(", "below", ")", ".", "The", "response", "of", "each", "cell", "line", "to", "PA", "was", "normalised", "to", "its", "BSA", "-", "treated", "condition", "(", "dotted", "line", ")", ".", "Statistically", "significant", "differences", "to", "cells", "containing", "gCTR", "cells", "are", "indicated", "(", "robust", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "multiple", "testing", "correction", ")", ".", "Mean", "±", "SD", "are", "shown", ".", "Boxplots", "represent", "the", "median", ",", "first", "and", "third", "quantiles", ".", "Upper", "and", "lower", "whiskers", "extend", "to", "values", "up", "to", "1", ".", "5", "-", "fold", "interquartile", "range", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "*", "*", "q", "≤", "0", ".", "01", ".", "Double", "knockdowns", "were", "generated", "by", "sequential", "constitutive", "CRISPR", "/", "Cas9", "-", "mediated", "depletion", "of", "RNF145", "or", "ADIPOR2", ".", "Knockdown", "efficiencies", "are", "shown", "in", "Appendix", "Fig", "S1A", ".", "(", "B", ")", "Cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "lysates", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "LE", ",", "long", "exposure", ";", "*", "non", "-", "specific", "bands", ".", "(", "C", ")", "HEK", "-", "293T", "cells", "depleted", "of", "B2M", "(", "gCTR", ")", "or", "ADIPOR2", "(", "gADIPOR2", ")", "were", "complemented", "with", "empty", "vector", "(", "blue", ")", ",", "full", "-", "length", "ADIPOR2", "-", "HA", "(", "green", ")", ",", "or", "a", "catalytically", "inactive", "variant", "of", "ADIPOR2", "-", "HA", "(", "dead", "ADIPOR2", ";", "red", ")", "and", "treated", "with", "PA", "(", "200", "µM", ",", "96h", ")", "or", "BSA", "(", "vehicle", "control", ",", "96h", ")", ".", "Measurements", "from", "PA", "-", "treated", "cells", "were", "normalised", "to", "their", "BSA", "-", "treated", "condition", "(", "dotted", "line", ")", ".", "Cell", "growth", "was", "quantified", ",", "and", "representative", "crystal", "violet", "staining", "is", "shown", ".", "Boxplots", "represent", "the", "median", ",", "first", "and", "third", "quantiles", ".", "Upper", "and", "lower", "whiskers", "extend", "to", "values", "up", "to", "1", ".", "5", "-", "fold", "interquartile", "range", ".", "*", "*", "q", "≤", "0", ".", "01", "(", "robust", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "multiple", "testing", "correction", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Loss of ADIPOR2 sensitises cells to PA-induced cytotoxicity. HEK-293T cells were depleted of RNF145 (purple), ADIPOR2 (blue), B2M (CTR; grey), or both ADIPOR2 and RNF145 (blue + purple), exposed to PA (200 µM, 96h) and stained with crystal violet. Quantification of crystal-violet stained cells is shown alongside a representative micrograph (below). The response of each cell line to PA was normalised to its BSA-treated condition (dotted line). Statistically significant differences to cells containing gCTR cells are indicated (robust one-way ANOVA with Benjamini-Hochberg multiple testing correction). Mean ± SD are shown. Boxplots represent the median, first and third quantiles. Upper and lower whiskers extend to values up to 1.5-fold interquartile range. N = 3 biological replicates, ** q ≤ 0.01. Double knockdowns were generated by sequential constitutive CRISPR/Cas9-mediated depletion of RNF145 or ADIPOR2. Knockdown efficiencies are shown in Appendix Fig S1A.(B) Cells were treated as in (A) and lysates analysed by immunoblotting. LE, long exposure; *non-specific bands.(C) HEK-293T cells depleted of B2M (gCTR) or ADIPOR2 (gADIPOR2) were complemented with empty vector (blue), full-length ADIPOR2-HA (green), or a catalytically inactive variant of ADIPOR2-HA (dead ADIPOR2; red) and treated with PA (200 µM, 96h) or BSA (vehicle control, 96h). Measurements from PA-treated cells were normalised to their BSA-treated condition (dotted line). Cell growth was quantified, and representative crystal violet staining is shown. Boxplots represent the median, first and third quantiles. Upper and lower whiskers extend to values up to 1.5-fold interquartile range. ** q ≤ 0.01 (robust one-way ANOVA with Benjamini-Hochberg multiple testing correction)."}
{"words": ["Figure", "1MITOL", "-", "KO", "MEFs", "was", "vulnerable", "to", "ER", "stress", ".", "Control", "MEFs", "(", "MITOLF", "/", "F", ")", "and", "MITOL", "-", "KO", "MEFs", "(", "MITOL", "-", "/", "-", ")", "were", "treated", "with", "DMSO", "as", "control", ",", "0", ".", "8", "µM", "thapsigargin", "(", "Tg", ")", ",", "0", ".", "7", "µg", "/", "mL", "tunicamycin", "(", "Tu", ")", "or", "1", ".", "2", "µg", "/", "mL", "brefeldin", "A", "(", "Br", ")", "for", "24", "hours", ".", "All", "experiments", "using", "Tu", "below", "were", "performed", "at", "concentration", "of", "0", ".", "7", "µg", "/", "mL", ".", "The", "relative", "cell", "viability", "shows", "a", "ratio", "between", "the", "survival", "of", "MEFs", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "ER", "stress", "inducers", ".", "Viable", "cells", "were", "detected", "by", "cell", "viability", "assay", "using", "cell", "counting", "kit", "-", "8", ".", "MITOL", "KO", "increased", "ER", "stress", "-", "induced", "apoptosis", ".", "MEFs", "were", "treated", "with", "indicated", "ER", "stress", "inducers", "at", "same", "concentration", "as", "Figure", "1A", "for", "18", "hours", "and", "stained", "with", "Annexin", "V", "-", "FITC", "for", "the", "detection", "of", "apoptosis", "using", "flow", "cytometry", ".", "MITOL", "re", "-", "expression", "in", "MITOL", "-", "KO", "MEFs", "rescued", "ER", "stress", "vulnerability", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "MITOL", "-", "coding", "vector", "(", "WT", ")", ",", "MITOL", "C65", "/", "68S", "-", "coding", "vector", "(", "CS", ")", ",", "or", "empty", "vector", "(", "Vec", ")", "24", "hours", "prior", "to", "Tu", "treatment", "for", "18", "hours", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Cleaved", "caspase", "-", "3", "(", "cC3", ")", "and", "cleaved", "PARP", "(", "cPARP", ")", "were", "used", "as", "apoptosis", "markers", ".", "MITOL", "KO", "enhanced", "ER", "stress", "-", "induced", "Bax", "translocation", "and", "cytochrome", "c", "release", ".", "Mitochondria", "or", "cytosol", "fraction", "was", "isolated", "from", "MEFs", "treated", "with", "Tu", "for", "18", "hours", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "MITOL", "KO", "induced", "excessive", "mitochondrial", "depolarization", "by", "ER", "stress", ".", "MEFs", "transfected", "with", "indicated", "vectors", "were", "treated", "with", "Tu", "for", "18", "hours", "and", "then", "stained", "with", "TMRM", ",", "followed", "by", "flow", "cytometric", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1MITOL-KO MEFs was vulnerable to ER stress. Control MEFs (MITOLF/F) and MITOL-KO MEFs (MITOL-/-) were treated with DMSO as control, 0.8 µM thapsigargin (Tg), 0.7 µg/mL tunicamycin (Tu) or 1.2 µg/mL brefeldin A (Br) for 24 hours. All experiments using Tu below were performed at concentration of 0.7 µg/mL. The relative cell viability shows a ratio between the survival of MEFs in the absence and presence of ER stress inducers. Viable cells were detected by cell viability assay using cell counting kit-8.MITOL KO increased ER stress-induced apoptosis. MEFs were treated with indicated ER stress inducers at same concentration as Figure 1A for 18 hours and stained with Annexin V-FITC for the detection of apoptosis using flow cytometry.MITOL re-expression in MITOL-KO MEFs rescued ER stress vulnerability. MEFs were transfected with MITOL-coding vector (WT), MITOL C65/68S-coding vector (CS), or empty vector (Vec) 24 hours prior to Tu treatment for 18 hours, followed by immunoblotting with indicated antibodies. Cleaved caspase-3 (cC3) and cleaved PARP (cPARP) were used as apoptosis markers.MITOL KO enhanced ER stress-induced Bax translocation and cytochrome c release. Mitochondria or cytosol fraction was isolated from MEFs treated with Tu for 18 hours, followed by immunoblotting with indicated antibodies.MITOL KO induced excessive mitochondrial depolarization by ER stress. MEFs transfected with indicated vectors were treated with Tu for 18 hours and then stained with TMRM, followed by flow cytometric analysis."}
{"words": ["Figure", "2IRE1α", "inhibition", "compensated", "MITOL", "-", "KO", "MEFs", "for", "vulnerability", "to", "ER", "stress", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "scramble", "or", "siIRE1α", "(", "#", "1", ",", "#", "2", ")", ".", "After", "24", "hours", ",", "these", "MEFs", "were", "exposed", "with", "Tu", "for", "24", "hours", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "MEFs", "were", "treated", "with", "4µ8C", "(", "25", "µM", ")", "for", "2", "hours", "prior", "to", "Tu", "treatment", "for", "24", "hours", "(", "B", ")", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "MITOL", "KO", "did", "not", "affect", "the", "autophosphorylation", "of", "IRE1α", ".", "MEFs", "were", "exposed", "with", "Tu", "for", "indicated", "periods", "and", "phosphorylated", "IRE1α", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "after", "Phos", "-", "tag", "SDS", "-", "PAGE", ".", "MITOL", "KO", "enhanced", "RIDD", "and", "xbp1", "splicing", ".", "MEFs", "were", "incubated", "with", "Tu", "for", "4", "hours", ".", "Expression", "levels", "of", "various", "UPR", "associated", "genes", "were", "determined", "by", "qRT", "-", "PCRMITOL", "KO", "enhanced", "RIDD", "and", "xbp1", "splicing", ".", "MEFs", "were", "incubated", "with", "Tu", "for", "4", "hours", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "either", "miR", "-", "17", "or", "miR", "-", "34", "luciferase", "reporter", "vector", "24", "hours", "prior", "to", "Tu", "treatment", "for", "4", "hours", ",", "followed", "by", "luciferase", "reporter", "assay", "(", "F", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "MEFs", "were", "incubated", "with", "Tu", "for", "4", "hours", ".", "Expression", "levels", "of", "various", "UPR", "associated", "genes", "were", "determined", "by", "qRT", "-", "PCRIRE1α", "-", "mediated", "JNK", "phosphorylation", "was", "prolonged", "by", "MITOL", "KO", ".", "MEFs", "were", "incubated", "with", "Tu", "for", "indicated", "periods", "and", "phosphorylated", "JNK", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "JNK", "inhibition", "reduced", "ER", "stress", "-", "induced", "apoptosis", "of", "MITOL", "-", "KO", "MEFs", ".", "MEFs", "were", "treated", "with", "20", "µM", "JNK", "inhibitor", "-", "II", "(", "JNK", "inh", ")", "2", "hours", "prior", "to", "Tu", "treatment", "for", "24", "hours", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2IRE1α inhibition compensated MITOL-KO MEFs for vulnerability to ER stress. MEFs were transfected with scramble or siIRE1α (#1, #2). After 24 hours, these MEFs were exposed with Tu for 24 hours , followed by immunoblotting with indicated antibodies. Error bars represent SD (n=3).MEFs were treated with 4µ8C (25 µM) for 2 hours prior to Tu treatment for 24 hours (B), followed by immunoblotting with indicated antibodies. Error bars represent SD (n=3).MITOL KO did not affect the autophosphorylation of IRE1α. MEFs were exposed with Tu for indicated periods and phosphorylated IRE1α was detected by immunoblotting after Phos-tag SDS-PAGE.MITOL KO enhanced RIDD and xbp1 splicing. MEFs were incubated with Tu for 4 hours. Expression levels of various UPR associated genes were determined by qRT-PCRMITOL KO enhanced RIDD and xbp1 splicing. MEFs were incubated with Tu for 4 hours. MEFs were transfected with either miR-17 or miR-34 luciferase reporter vector 24 hours prior to Tu treatment for 4 hours, followed by luciferase reporter assay (F). Error bars represent SD (n=3).MEFs were incubated with Tu for 4 hours. Expression levels of various UPR associated genes were determined by qRT-PCRIRE1α-mediated JNK phosphorylation was prolonged by MITOL KO. MEFs were incubated with Tu for indicated periods and phosphorylated JNK was detected by immunoblotting with indicated antibodies. Error bars represent SD (n=3).JNK inhibition reduced ER stress-induced apoptosis of MITOL-KO MEFs. MEFs were treated with 20 µM JNK inhibitor-II (JNK inh) 2 hours prior to Tu treatment for 24 hours, followed by immunoblotting with indicated antibodies. Error bars represent SD (n=3)."}
{"words": ["Figure", "3MITOL", "KO", "facilitated", "IRE1α", "oligomerization", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "IRE1α", "-", "GFP", "expression", "vector", "for", "24", "hours", "prior", "to", "Tu", "treatment", "for", "indicated", "periods", "(", "A", ")", ".", "The", "right", "panels", "show", "5", "-", "fold", "magnification", "images", "of", "the", "boxed", "regions", ".", "Percentages", "of", "cells", "with", "IRE1α", "-", "foci", "were", "calculated", "from", "100", "cells", "by", "visual", "inspection", "in", "each", "independent", "experiment", "(", "A", ")", ".", "To", "evaluate", "the", "oligomerization", "level", "of", "endogenous", "IRE1α", ",", "cells", "without", "any", "transfection", "were", "solubilized", "and", "separated", "by", "sucrose", "density", "-", "gradient", "centrifugation", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "IRE1α", "antibody", "(", "B", ")", ".", "IRE1α", "oligomers", "were", "stabilized", "by", "MITOL", "KO", ".", "MEFs", "transfected", "with", "IRE1α", "-", "GFP", "were", "treated", "with", "Tu", ".", "After", "4", "hours", ",", "these", "cells", "were", "washed", "with", "PBS", "and", "subsequently", "re", "-", "fed", "with", "fresh", "media", "for", "indicated", "periods", ".", "The", "right", "panels", "show", "5", "-", "fold", "magnification", "images", "of", "the", "boxed", "regions", ".", "Percentages", "of", "cells", "with", "IRE1α", "-", "foci", "were", "calculated", "from", "100", "cells", "by", "visual", "inspection", "at", "indicated", "periods", "after", "wash", "out", "of", "Tu", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "Scale", "bar", "represents", "10", "µm", ".", "Sustained", "IRE1α", "autophosphorylation", "after", "wash", "out", "of", "Tu", "in", "MITOL", "-", "KO", "MEFs", ".", "MEFs", "were", "treated", "with", "Tu", "for", "4", "hours", "and", "washed", "with", "PBS", "and", "re", "-", "fed", "with", "fresh", "media", "for", "indicated", "periods", ",", "following", "by", "immunoblotting", "anti", "-", "IRE1α", "antibody", "after", "Phos", "-", "tag", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "MITOL", "deletion", "promoted", "the", "interaction", "between", "IRE1α", "and", "BIM", "under", "ER", "stress", ".", "MITOL", "-", "depleted", "HEK293", "cells", "(", "KO", ")", "were", "generated", "using", "CRISPR", "-", "Cas9", "system", ".", "Cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "indicated", "vectors", "24", "hours", "prior", "to", "Tu", "treatment", "for", "12", "hours", ".", "Cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3MITOL KO facilitated IRE1α oligomerization. MEFs were transfected with IRE1α-GFP expression vector for 24 hours prior to Tu treatment for indicated periods (A). The right panels show 5-fold magnification images of the boxed regions. Percentages of cells with IRE1α-foci were calculated from 100 cells by visual inspection in each independent experiment (A). To evaluate the oligomerization level of endogenous IRE1α, cells without any transfection were solubilized and separated by sucrose density-gradient centrifugation, followed by immunoblotting with anti-IRE1α antibody (B).IRE1α oligomers were stabilized by MITOL KO. MEFs transfected with IRE1α-GFP were treated with Tu. After 4 hours, these cells were washed with PBS and subsequently re-fed with fresh media for indicated periods. The right panels show 5-fold magnification images of the boxed regions. Percentages of cells with IRE1α-foci were calculated from 100 cells by visual inspection at indicated periods after wash out of Tu in each independent experiment. Scale bar represents 10 µm.Sustained IRE1α autophosphorylation after wash out of Tu in MITOL-KO MEFs. MEFs were treated with Tu for 4 hours and washed with PBS and re-fed with fresh media for indicated periods, following by immunoblotting anti-IRE1α antibody after Phos-tag SDS-PAGE. Error bars represent SD (n=3).MITOL deletion promoted the interaction between IRE1α and BIM under ER stress. MITOL-depleted HEK293 cells (KO) were generated using CRISPR-Cas9 system. Cells were co-transfected with indicated vectors 24 hours prior to Tu treatment for 12 hours. Cells were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody, followed by immunoblotting with indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "4Interaction", "between", "MITOL", "and", "IRE1α", ".", "Lysates", "of", "HEK293", "cells", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "IRE1α", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", "(", "A", ")", ".", "Interaction", "between", "MITOL", "and", "IRE1α", ".", "Lysates", "of", "HEK293", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "indicated", "vectors", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", "(", "B", ")", ".", "Interaction", "between", "MITOL", "and", "IRE1α", ".", "GST", "-", "pull", "-", "down", "assay", "of", "IRE1α", "or", "MITOL", "was", "performed", "on", "lysates", "of", "MEFs", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", "(", "C", ",", "D", ")", ".", "N", "-", "ter", ":", "1", "-", "90", "aa", "of", "MITOL", ",", "Loop", ":", "158", "-", "210", "aa", "of", "MITOL", ",", "C", "-", "ter", ":", "241", "-", "278", "aa", "of", "MITOL", ",", "465", "-", "977", "aa", "of", "IRE1α", ".", "MITOL", "ubiquitylated", "IRE1α", ".", "Lysates", "of", "HEK293", "cells", "immunoprecipitated", "with", "indicated", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "MITOL", "ubiquitylated", "IRE1α", ".", "Lysates", "of", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "indicated", "vectors", ",", "were", "immunoprecipitated", "with", "indicated", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "MITOL", "ubiquitylated", "IRE1α", ".", "Lysates", "of", "MEFs", "(", "G", ")", "transfected", "with", "indicated", "vectors", ",", "were", "immunoprecipitated", "with", "indicated", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "MITOL", "adds", "lysine", "63", "-", "linked", "polyubiquitin", "chains", "to", "IRE1α", ".", "Lysates", "of", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "indicated", "vectors", "were", "immunoprecipitated", "with", "indicated", "antibody", ".", "IRE1α", "ubiquitylation", "was", "detectedMITOL", "adds", "lysine", "63", "-", "linked", "polyubiquitin", "chains", "to", "IRE1α", ".", "Lysates", "of", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "indicated", "vectors", "were", "immunoprecipitated", "with", "indicated", "antibody", ".", "IRE1α", "ubiquitylation", "was"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Interaction between MITOL and IRE1α. Lysates of HEK293 cells were subjected to immunoprecipitation with anti-IRE1α antibody, followed by immunoblotting with indicated antibodies (A).Interaction between MITOL and IRE1α. Lysates of HEK293 cells co-transfected with indicated vectors were subjected to immunoprecipitation, followed by immunoblotting with indicated antibodies (B).Interaction between MITOL and IRE1α. GST-pull-down assay of IRE1α or MITOL was performed on lysates of MEFs, followed by immunoblotting with indicated antibodies (C, D). N-ter: 1-90 aa of MITOL, Loop: 158-210 aa of MITOL, C-ter: 241-278 aa of MITOL, 465-977 aa of IRE1α.MITOL ubiquitylated IRE1α. Lysates of HEK293 cells immunoprecipitated with indicated antibody, followed by immunoblotting with indicated antibodies.MITOL ubiquitylated IRE1α. Lysates of HEK293 cells transfected with indicated vectors, were immunoprecipitated with indicated antibody, followed by immunoblotting with indicated antibodies.MITOL ubiquitylated IRE1α. Lysates of MEFs (G) transfected with indicated vectors, were immunoprecipitated with indicated antibody, followed by immunoblotting with indicated antibodies.MITOL adds lysine 63-linked polyubiquitin chains to IRE1α. Lysates of HEK293 cells transfected with indicated vectors were immunoprecipitated with indicated antibody. IRE1α ubiquitylation was detectedMITOL adds lysine 63-linked polyubiquitin chains to IRE1α. Lysates of HEK293 cells transfected with indicated vectors were immunoprecipitated with indicated antibody. IRE1α ubiquitylation was detected"}
{"words": ["Figure", "5MITOL", "added", "polyubiquitin", "chains", "to", "K481", "of", "IRE1α", ".", "Lysates", "of", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "each", "lysine", "mutant", "of", "IRE1α", "and", "indicated", "vectors", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "481", ":", "K481R", ",", "545", ":", "K545R", ",", "568", ":", "K568R", ".", "IRE1α", "K481R", "interacted", "with", "MITOL", ".", "Lysates", "of", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "indicated", "vectors", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Overexpression", "of", "IRE1α", "K481R", "induced", "apoptosis", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "indicated", "vectors", ".", "After", "24", "hours", ",", "these", "cells", "were", "stained", "with", "Annexin", "V", "-", "FITCOverexpression", "of", "IRE1α", "K481R", "induced", "apoptosis", ".", "or", "subjected", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", "(", "D", ")", ".", "Enhanced", "RIDD", "activity", "in", "IRE1α", "K481R", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "indicated", "vectors", "24", "hours", "prior", "to", "analysis", "(", "E", ",", "F", ")", ".", "The", "RIDD", "activity", "was", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Hyper", "-", "oligomerization", "of", "IRE1α", "K481R", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "IRE1α", "-", "GFP", "or", "IRE1α", "K481R", "-", "GFP", ".", "After", "24", "hours", ",", "these", "cells", "were", "exposed", "with", "Tu", "for", "indicated", "periods", "and", "GFP", "signals", "were", "observed", ".", "The", "right", "panels", "show", "5", ".", "5", "-", "fold", "magnification", "images", "of", "the", "boxed", "regions", ".", "Percentages", "of", "cells", "with", "IRE1α", "-", "foci", "were", "calculated", "from", "100", "cells", "by", "visual", "inspection", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "Increased", "interaction", "of", "IRE1α", "K481R", "with", "BIM", ".", "Cells", "transfected", "with", "indicated", "vectors", "24", "hours", "prior", "to", "immunoprecipitation", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5MITOL added polyubiquitin chains to K481 of IRE1α. Lysates of HEK293 cells transfected with each lysine mutant of IRE1α and indicated vectors were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody, followed by immunoblotting with indicated antibodies. 481: K481R, 545: K545R, 568: K568R.IRE1α K481R interacted with MITOL. Lysates of HEK293 cells transfected with indicated vectors were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody, followed by immunoblotting with indicated antibodies.Overexpression of IRE1α K481R induced apoptosis. MEFs were transfected with indicated vectors. After 24 hours, these cells were stained with Annexin V-FITCOverexpression of IRE1α K481R induced apoptosis. or subjected by immunoblotting with indicated antibodies (D).Enhanced RIDD activity in IRE1α K481R. MEFs were transfected with indicated vectors 24 hours prior to analysis (E, F). The RIDD activity was measured by qRT-PCR.Hyper-oligomerization of IRE1α K481R. MEFs were transfected with IRE1α-GFP or IRE1α K481R-GFP. After 24 hours, these cells were exposed with Tu for indicated periods and GFP signals were observed. The right panels show 5.5-fold magnification images of the boxed regions. Percentages of cells with IRE1α-foci were calculated from 100 cells by visual inspection in each independent experiment.Increased interaction of IRE1α K481R with BIM. Cells transfected with indicated vectors 24 hours prior to immunoprecipitation, followed by immunoblotting with indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "6Accumulations", "of", "MITOL", "and", "IRE1α", "in", "the", "MAM", "fraction", ".", "Each", "organelle", "fraction", "was", "isolated", "from", "MEFs", "by", "percoll", "density", "-", "gradient", "centrifugation", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "mito", ":", "pure", "mitochondria", ",", "micro", ":", "microsome", ",", "cyto", ":", "pure", "cytosol", ".", "High", "solubility", "of", "MITOL", "and", "IRE1α", "in", "the", "low", "dose", "digitonin", ".", "Raft", "-", "like", "structure", "including", "MAM", "was", "solubilized", "from", "the", "crude", "mitochondrial", "fraction", "of", "MEFs", "with", "indicated", "concentration", "of", "digitonin", ".", "S", ":", "supernatant", ",", "P", ":", "pellet", ".", "IRE1α", "regulation", "by", "MITOL", "occurred", "in", "the", "MAM", "-", "rich", "mitochondrial", "fraction", ".", "Crude", "mitochondrial", "fraction", "containing", "MAM", "(", "Mito", "plus", "MAM", ")", "and", "the", "cytosolic", "fraction", "containing", "ER", "(", "Cyto", "plus", "ER", ")", "were", "isolated", "from", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "indicated", "vector", "and", "subsequently", "immunoprecipitation", "assay", "was", "performed", "to", "detect", "the", "interaction", "between", "MITOL", "and", "IRE1αIRE1α", "regulation", "by", "MITOL", "occurred", "in", "the", "MAM", "-", "rich", "mitochondrial", "fraction", ".", "Crude", "mitochondrial", "fraction", "containing", "MAM", "(", "Mito", "plus", "MAM", ")", "and", "the", "cytosolic", "fraction", "containing", "ER", "(", "Cyto", "plus", "ER", ")", "were", "isolated", "from", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "indicated", "vector", "and", "subsequently", "immunoprecipitation", "assay", "was", "performed", "to", "detect", "the", "level", "of", "IRE1α", "ubiquitylation", "(", "D", ")", ".", "Knockdown", "of", "PACS2", "impaired", "the", "interaction", "of", "MITOL", "with", "IRE1α", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "scramble", "RNA", "or", "siPACS2", "and", "indicated", "vectors", "for", "24", "hours", "prior", "to", "immunoprecipitation", "assay", ".", "Knockdown", "of", "PACS2", "inhibited", "IRE1α", "ubiquitylation", "by", "MITOL", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "scramble", "RNA", ",", "siPACS2", "and", "indicated", "vectors", "24", "hours", "prior", "to", "immunoprecipitation", "assay", ".", "Knockdown", "of", "Mfn2", "inhibited", "IRE1α", "ubiquitylation", "by", "MITOL", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "scramble", "RNA", ",", "siMfn2", "and", "indicated", "vectors", "24", "hours", "prior", "to", "immunoprecipitation", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Accumulations of MITOL and IRE1α in the MAM fraction. Each organelle fraction was isolated from MEFs by percoll density-gradient centrifugation, followed by immunoblotting with indicated antibodies. mito: pure mitochondria, micro: microsome, cyto: pure cytosol.High solubility of MITOL and IRE1α in the low dose digitonin. Raft-like structure including MAM was solubilized from the crude mitochondrial fraction of MEFs with indicated concentration of digitonin. S: supernatant, P: pellet.IRE1α regulation by MITOL occurred in the MAM-rich mitochondrial fraction. Crude mitochondrial fraction containing MAM (Mito plus MAM) and the cytosolic fraction containing ER (Cyto plus ER) were isolated from HEK293 cells transfected with indicated vector and subsequently immunoprecipitation assay was performed to detect the interaction between MITOL and IRE1αIRE1α regulation by MITOL occurred in the MAM-rich mitochondrial fraction. Crude mitochondrial fraction containing MAM (Mito plus MAM) and the cytosolic fraction containing ER (Cyto plus ER) were isolated from HEK293 cells transfected with indicated vector and subsequently immunoprecipitation assay was performed to detect the level of IRE1α ubiquitylation (D).Knockdown of PACS2 impaired the interaction of MITOL with IRE1α. HEK293 cells were transfected with either scramble RNA or siPACS2 and indicated vectors for 24 hours prior to immunoprecipitation assay.Knockdown of PACS2 inhibited IRE1α ubiquitylation by MITOL. HEK293 cells were transfected with either scramble RNA, siPACS2 and indicated vectors 24 hours prior to immunoprecipitation assay.Knockdown of Mfn2 inhibited IRE1α ubiquitylation by MITOL. HEK293 cells were transfected with either scramble RNA, siMfn2 and indicated vectors 24 hours prior to immunoprecipitation assay."}
{"words": ["Figure", "7MITOL", "ubiquitylated", "IRE1α", "in", "the", "spinal", "cord", "of", "mice", ".", "Lysates", "of", "the", "spinal", "cord", "in", "mice", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "IRE1α", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "WT", ":", "MITOLF", "/", "F", "mice", ",", "MITOLnestin", ":", "MITOLF", "/", "F", ",", "Nestin", "-", "Cre", "mice", ".", "Loss", "of", "MITOL", "led", "to", "hyper", "-", "oligomerization", "of", "IRE1α", "in", "the", "spinal", "cord", "under", "ER", "stress", ".", "3", "month", "-", "old", "WT", "or", "MITOLnestin", "mice", "were", "treated", "with", "1", "mg", "/", "kg", "Tu", "for", "24", "hours", ".", "Spinal", "cord", "was", "solubilized", "with", "NP", "-", "40", "lysis", "buffer", "and", "separated", "by", "sucrose", "-", "density", "gradient", "centrifugation", ".", "MITOL", "deletion", "resulted", "in", "hyper", "-", "activation", "of", "IRE1α", "RNase", "in", "ER", "stress", ".", "WT", "or", "MITOLnestin", "mice", "were", "injected", "with", "Tu", "for", "24", "hours", "and", "spinal", "cord", "was", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Increased", "ER", "stress", "-", "induced", "apoptosis", "in", "the", "MITOL", "-", "KO", "spinal", "cord", ".", "3", "month", "-", "old", "WT", "or", "MITOLnestin", "mice", "were", "treated", "with", "Tu", "for", "24", "hours", "and", "each", "spinal", "cord", "was", "stained", "using", "TUNEL", "and", "hoechst", "(", "F", ")", "Arrowheads", "indicate", "the", "representative", "neurons", ".", "Increased", "ER", "stress", "-", "induced", "apoptosis", "in", "the", "MITOL", "-", "KO", "spinal", "cord", ".", "3", "month", "-", "old", "WT", "or", "MITOLnestin", "mice", "were", "treated", "with", "Tu", "for", "24", "hours", "and", "each", "spinal", "cord", "was", "stained", "using", "cresyl", "violet", "(", "G", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "representative", "neurons", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7MITOL ubiquitylated IRE1α in the spinal cord of mice. Lysates of the spinal cord in mice were immunoprecipitated with anti-IRE1α antibody, followed by immunoblotting with indicated antibodies. WT: MITOLF/F mice, MITOLnestin: MITOLF/F, Nestin-Cre mice.Loss of MITOL led to hyper-oligomerization of IRE1α in the spinal cord under ER stress. 3 month-old WT or MITOLnestin mice were treated with 1 mg/kg Tu for 24 hours. Spinal cord was solubilized with NP-40 lysis buffer and separated by sucrose-density gradient centrifugation.MITOL deletion resulted in hyper-activation of IRE1α RNase in ER stress. WT or MITOLnestin mice were injected with Tu for 24 hours and spinal cord was analyzed by qRT-PCR.Increased ER stress-induced apoptosis in the MITOL-KO spinal cord. 3 month-old WT or MITOLnestin mice were treated with Tu for 24 hours and each spinal cord was stained using TUNEL and hoechst (F) Arrowheads indicate the representative neurons.Increased ER stress-induced apoptosis in the MITOL-KO spinal cord. 3 month-old WT or MITOLnestin mice were treated with Tu for 24 hours and each spinal cord was stained using cresyl violet (G). Arrowheads indicate the representative neurons."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "Cherry", "-", "STING", ",", "the", "murine", "IFNβ", "-", "luciferase", "reporter", "(", "IFNβ", "-", "Luc", ")", ",", "a", "Renilla", "luciferase", "normalization", "control", "(", "pRL", "-", "TK", ")", "and", "the", "indicated", "expression", "plasmids", "or", "empty", "vector", "(", "ev", ")", ".", "Cells", "were", "additionally", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "cGAS", "-", "GFP", "(", "stimulated", ")", "or", "IRES", "-", "GFP", "(", "unstimulated", ")", ".", "20", "hours", "post", "transfection", ",", "cells", "were", "lysed", "and", "a", "dual", "-", "luciferase", "assay", "was", "performed", ".", "Data", "information", ":", "(", "A", "-", "G", ")", "Data", "is", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "An", "expression", "plasmid", "for", "RIG", "-", "I", "N", "(", "stimulated", ")", "or", "ev", "(", "unstimulated", ")", "was", "co", "-", "transfected", "with", "IFNβ", "-", "Luc", ",", "pRL", "-", "TK", "and", "the", "indicated", "expression", "plasmids", "in", "293T", "cells", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "(", "A", "-", "G", ")", "Data", "is", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "An", "expression", "plasmid", "for", "TBK1", "(", "stimulated", ")", "or", "ev", "(", "unstimulated", ")", "was", "co", "-", "transfected", "together", "with", "IFNβ", "-", "Luc", ",", "pRL", "-", "TK", "and", "the", "indicated", "expression", "plasmids", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "(", "A", "-", "G", ")", "Data", "is", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "a", "plasmid", "expressing", "constitutively", "active", "IRF3", "(", "IRF3", "-", "5D", ";", "stimulated", ")", "or", "IRES", "-", "GFP", "(", "unstimulated", ")", "together", "with", "IFNβ", "-", "Luc", ",", "pRL", "-", "TK", "and", "the", "indicated", "expression", "plasmids", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "(", "A", "-", "G", ")", "Data", "is", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "The", "ISG56", "-", "luciferase", "reporter", ",", "pRL", "-", "TK", "and", "the", "indicated", "expression", "plasmids", "were", "co", "-", "transfected", "in", "293T", "cells", ".", "24", "hours", "post", "transfection", ",", "cells", "were", "stimulated", "with", "0", ".", "1", "ng", "/", "µl", "human", "IFNβ", "or", "mock", "stimulated", "and", "analyzed", "16", "hours", "later", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "(", "A", "-", "G", ")", "Data", "is", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "iMEFgt", "/", "gt", "stably", "expressing", "Cherry", "-", "STING", "and", "either", "ev", "or", "V5", "-", "tagged", "m152", "were", "stimulated", "with", "5", "µg", "/", "ml", "ISD", "(", "F", ")", ",", "10", "µg", "/", "ml", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "G", ")", "or", "mock", "stimulated", "with", "Lipofectamine", ".", "4", "hours", "post", "stimulation", ",", "RNA", "was", "extracted", "to", "determine", "IFNβ", "mRNA", "transcripts", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "information", ":", "(", "A", "-", "G", ")", "Data", "is", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "H", "-", "K", ")", "iBMDM", "stably", "expressing", "ev", "or", "m152", "-", "V5", "were", "stimulated", "in", "duplicates", "with", "10", "µg", "/", "ml", "cGAMP", "(", "H", ")", ",", "6", "(", "H", ")", "or", "16", "(", "I", "-", "K", ")", "hours", "later", ",", "secreted", "IFNβ", "(", "H", "-", "J", ")", "levels", "were", "determined", "by", "ELISA", ".", "(", "H", "-", "K", ")", "Experiments", "were", "performed", "three", "(", "H", ",", "I", ",", "K", ")", "or", "two", "(", "J", ")", "times", "independently", "and", "one", "representative", "experiment", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "H", "-", "K", ")", "iBMDM", "stably", "expressing", "ev", "or", "m152", "-", "V5", "were", "stimulated", "in", "duplicates", "with", "5", "µg", "/", "ml", "ISD", "(", "I", ")", ",", "6", "(", "H", ")", "or", "16", "(", "I", "-", "K", ")", "hours", "later", ",", "secreted", "IFNβ", "(", "H", "-", "J", ")", "levels", "were", "determined", "by", "ELISA", ".", "(", "H", "-", "K", ")", "Experiments", "were", "performed", "three", "(", "H", ",", "I", ",", "K", ")", "or", "two", "(", "J", ")", "times", "independently", "and", "one", "representative", "experiment", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "H", "-", "K", ")", "iBMDM", "stably", "expressing", "ev", "or", "m152", "-", "V5", "were", "stimulated", "in", "duplicates", "with", "Newcastle", "'", "s", "Disease", "Virus", "(", "NDV", ")", "infection", "(", "J", ")", "6", "(", "H", ")", "or", "16", "(", "I", "-", "K", ")", "hours", "later", ",", "secreted", "IFNβ", "(", "H", "-", "J", ")", "levels", "were", "determined", "by", "ELISA", ".", "(", "H", "-", "K", ")", "Experiments", "were", "performed", "three", "(", "H", ",", "I", ",", "K", ")", "or", "two", "(", "J", ")", "times", "independently", "and", "one", "representative", "experiment", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "H", "-", "K", ")", "iBMDM", "stably", "expressing", "ev", "or", "m152", "-", "V5", "were", "stimulated", "in", "duplicates", "with", "µM", "CpG", "DNA", "(", "K", ")", ".", "6", "(", "H", ")", "or", "16", "(", "I", "-", "K", ")", "hours", "later", ",", "TNFα", "(", "K", ")", "levels", "were", "determined", "by", "ELISA", ".", "(", "H", "-", "K", ")", "Experiments", "were", "performed", "three", "(", "H", ",", "I", ",", "K", ")", "or", "two", "(", "J", ")", "times", "independently", "and", "one", "representative", "experiment", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) 293T cells were co-transfected with expression plasmids for Cherry-STING, the murine IFNβ-luciferase reporter (IFNβ-Luc), a Renilla luciferase normalization control (pRL-TK) and the indicated expression plasmids or empty vector (ev). Cells were additionally co-transfected with expression plasmids for cGAS-GFP (stimulated) or IRES-GFP (unstimulated). 20 hours post transfection, cells were lysed and a dual-luciferase assay was performed. Data information: (A-G) Data is combined from three independent experiments.(B) An expression plasmid for RIG-I N (stimulated) or ev (unstimulated) was co-transfected with IFNβ-Luc, pRL-TK and the indicated expression plasmids in 293T cells and analyzed as in (A). Data information: (A-G) Data is combined from three independent experiments.(C) An expression plasmid for TBK1 (stimulated) or ev (unstimulated) was co-transfected together with IFNβ-Luc, pRL-TK and the indicated expression plasmids and analyzed as in (A). Data information: (A-G) Data is combined from three independent experiments.(D) 293T cells were co-transfected with a plasmid expressing constitutively active IRF3 (IRF3-5D; stimulated) or IRES-GFP (unstimulated) together with IFNβ-Luc, pRL-TK and the indicated expression plasmids and analyzed as in (A). Data information: (A-G) Data is combined from three independent experiments.(E) The ISG56-luciferase reporter, pRL-TK and the indicated expression plasmids were co-transfected in 293T cells. 24 hours post transfection, cells were stimulated with 0.1 ng/µl human IFNβ or mock stimulated and analyzed 16 hours later as described in (A). Data information: (A-G) Data is combined from three independent experiments.(F-G) iMEFgt/gt stably expressing Cherry-STING and either ev or V5-tagged m152 were stimulated with 5 µg/ml ISD (F), 10 µg/ml poly(I:C) (G) or mock stimulated with Lipofectamine. 4 hours post stimulation, RNA was extracted to determine IFNβ mRNA transcripts by qRT-PCR. Data information: (A-G) Data is combined from three independent experiments.(H-K) iBMDM stably expressing ev or m152-V5 were stimulated in duplicates with 10 µg/ml cGAMP (H), 6 (H) or 16 (I-K) hours later, secreted IFNβ (H-J) levels were determined by ELISA. (H-K) Experiments were performed three (H, I, K) or two (J) times independently and one representative experiment is shown. Student's t-test (unpaired, two-tailed), n.s. not significant, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Data are shown as mean ± SD. (H-K) iBMDM stably expressing ev or m152-V5 were stimulated in duplicates with 5 µg/ml ISD (I), 6 (H) or 16 (I-K) hours later, secreted IFNβ (H-J) levels were determined by ELISA. (H-K) Experiments were performed three (H, I, K) or two (J) times independently and one representative experiment is shown. Student's t-test (unpaired, two-tailed), n.s. not significant, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Data are shown as mean ± SD. (H-K) iBMDM stably expressing ev or m152-V5 were stimulated in duplicates with Newcastle's Disease Virus (NDV) infection (J) 6 (H) or 16 (I-K) hours later, secreted IFNβ (H-J) levels were determined by ELISA. (H-K) Experiments were performed three (H, I, K) or two (J) times independently and one representative experiment is shown. Student's t-test (unpaired, two-tailed), n.s. not significant, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Data are shown as mean ± SD. (H-K) iBMDM stably expressing ev or m152-V5 were stimulated in duplicates with µM CpG DNA (K). 6 (H) or 16 (I-K) hours later, TNFα (K) levels were determined by ELISA. (H-K) Experiments were performed three (H, I, K) or two (J) times independently and one representative experiment is shown. Student's t-test (unpaired, two-tailed), n.s. not significant, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Data are shown as mean ± SD. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "Cherry", "-", "STING", ",", "V5", "-", "tagged", "m152", "and", "either", "ev", "(", "unstimulated", ")", "or", "cGAS", "-", "GFP", "(", "stimulated", ")", ".", "(", "B", ")", "iMEFgt", "/", "gt", "were", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "V5", "-", "tagged", "m152", "together", "with", "either", "Cherry", "-", "STING", "or", "ev", "in", "combination", "with", "cGAS", "-", "GFP", "(", "stimulated", ")", "or", "ev", "(", "unstimulated", ")", ".", "24", "hours", "post", "transfection", "cells", "were", "fixed", "for", "immunolabeling", "with", "an", "anti", "-", "V5", "antibody", ".", "White", "boxes", "indicate", "the", "region", "shown", "at", "a", "higher", "magnification", ".", "Scale", "bar", "represents", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Lysates", "of", "Cherry", "-", "STING", "and", "either", "CD4", "-", "V5", "or", "m152", "-", "V5", "expressing", "293T", "cells", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "with", "an", "anti", "-", "V5", "antibody", ".", "Input", "and", "IP", "samples", "were", "analyzed", "by", "IB", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "IB", "shown", "are", "representative", "of", "three", "(", "C", ")", "or", "two", "(", "D", ")", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "iMEF", "stably", "expressing", "ev", "or", "m152", "-", "V5", "were", "left", "unstimulated", "or", "stimulated", "with", "10", "µg", "/", "ml", "ISD", "and", "lysed", "90", "minutes", "later", ".", "m152", "was", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "V5", "antibody", "and", "samples", "were", "analyzed", "by", "IB", "with", "V5", ",", "STING", "and", "phospho", "-", "TBK1", "(", "pTBK1", ")", "specific", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "IB", "shown", "are", "representative", "of", "three", "(", "C", ")", "or", "two", "(", "D", ")", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) HeLa cells were co-transfected with expression plasmids for Cherry-STING, V5-tagged m152 and either ev (unstimulated) or cGAS-GFP (stimulated).(B) iMEFgt/gt were co-transfected with expression plasmids for V5-tagged m152 together with either Cherry-STING or ev in combination with cGAS-GFP (stimulated) or ev (unstimulated). 24 hours post transfection cells were fixed for immunolabeling with an anti-V5 antibody. White boxes indicate the region shown at a higher magnification. Scale bar represents 10 µm.(C) Lysates of Cherry-STING and either CD4-V5 or m152-V5 expressing 293T cells were subjected to immunoprecipitation (IP) with an anti-V5 antibody. Input and IP samples were analyzed by IB with the indicated antibodies. Data information: IB shown are representative of three (C) or two (D) independent experiments.(D) iMEF stably expressing ev or m152-V5 were left unstimulated or stimulated with 10 µg/ml ISD and lysed 90 minutes later. m152 was immunoprecipitated with an anti-V5 antibody and samples were analyzed by IB with V5, STING and phospho-TBK1 (pTBK1) specific antibodies. Data information: IB shown are representative of three (C) or two (D) independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Cherry", "-", "STING", ",", "IFNβ", "-", "Luc", ",", "pRL", "-", "TK", ",", "cGAS", "-", "GFP", "(", "stimulated", ")", "or", "IRES", "-", "GFP", "(", "unstimulated", ")", "and", "indicated", "expression", "plasmids", "as", "shown", "in", "(", "A", ")", "were", "transiently", "expressed", "in", "293T", "cells", "and", "a", "dual", "luciferase", "assay", "was", "performed", ".", "Data", "is", "combined", "from", "two", "out", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Data", "information", ":", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "C", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "Cherry", "-", "STING", "and", "indicated", "chimeras", "as", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "An", "anti", "-", "V5", "IP", "was", "performed", "and", "samples", "were", "analyzed", "by", "IB", "with", "indicated", "antibodies", ".", "IB", "shown", "is", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Cherry", "-", "STING", ",", "IFNβ", "-", "Luc", ",", "pRL", "-", "TK", "and", "either", "CD4", ",", "m152", ",", "m152", "-", "Δstalk", "or", "m152", "-", "GSstalk", "were", "transiently", "expressed", "in", "293T", "cells", ".", "For", "stimulation", ",", "samples", "were", "co", "-", "transfected", "with", "cGAS", "-", "GFP", ",", "and", "unstimulated", "samples", "with", "IRES", "-", "GFP", ".", "Lysates", "were", "analyzed", "as", "described", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "is", "combined", "from", "two", "out", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Data", "information", ":", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "E", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "Cherry", "-", "STING", "and", "either", "CD4", ",", "m152", ",", "m152", "-", "Δstalk", "or", "m152", "-", "GSstalk", ".", "An", "anti", "-", "V5", "IP", "was", "performed", "and", "samples", "were", "analyzed", "by", "IB", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Immunoblot", "shown", "is", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Cherry-STING, IFNβ-Luc, pRL-TK, cGAS-GFP (stimulated) or IRES-GFP (unstimulated) and indicated expression plasmids as shown in (A) were transiently expressed in 293T cells and a dual luciferase assay was performed. Data is combined from two out of three independent experiments and shown as mean ± SD. Data information: Student's t-test (unpaired, two-tailed), n.s. not significant, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001(C) 293T cells were co-transfected with expression plasmids for Cherry-STING and indicated chimeras as shown in (A). An anti-V5 IP was performed and samples were analyzed by IB with indicated antibodies. IB shown is representative of three independent experiments.(D) Cherry-STING, IFNβ-Luc, pRL-TK and either CD4, m152, m152-Δstalk or m152-GSstalk were transiently expressed in 293T cells. For stimulation, samples were co-transfected with cGAS-GFP, and unstimulated samples with IRES-GFP. Lysates were analyzed as described in (B). Data is combined from two out of three independent experiments and shown as mean ± SD. Data information: Student's t-test (unpaired, two-tailed), n.s. not significant, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001(E) 293T cells were co-transfected with expression plasmids for Cherry-STING and either CD4, m152, m152-Δstalk or m152-GSstalk. An anti-V5 IP was performed and samples were analyzed by IB with indicated antibodies. Immunoblot shown is representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "IFNβ", "-", "Luc", ",", "pRL", "-", "TK", ",", "cGAS", "-", "GFP", "(", "stimulated", ")", "or", "IRES", "-", "GFP", "(", "unstimulated", ")", "and", "indicated", "expression", "plasmids", "together", "with", "murine", "Cherry", "-", "STING", "(", "left", "panel", ")", "or", "human", "STING", "(", "right", "panel", ")", ".", "Lysates", "were", "analyzed", "by", "dual", "-", "luciferase", "assay", ".", "Data", "is", "combined", "from", "two", "out", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "C", ")", "IFNβ", "-", "Luc", ",", "pRL", "-", "TK", ",", "cGAS", "-", "GFP", "(", "stimulated", ")", "or", "IRES", "-", "GFP", "(", "unstimulated", ")", "and", "either", "LacZ", "or", "m152", "together", "with", "the", "indicated", "murine", "STING", "mutants", "described", "in", "(", "B", ")", "were", "transiently", "expressed", "in", "293T", "cells", ".", "Luciferase", "activity", "was", "measured", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "in", "(", "C", ")", "is", "normalized", "to", "LacZ", ",", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "D", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "either", "LacZ", "or", "m152", "together", "with", "the", "indicated", "murine", "STING", "mutants", "described", "in", "(", "B", ")", ".", "An", "anti", "-", "V5", "IP", "was", "performed", "and", "samples", "were", "analyzed", "by", "IB", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "IB", "shown", "in", "(", "D", ")", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Luciferase", "assay", "(", "E", ")", "were", "performed", "as", "described", "in", "(", "C", ")", "and", "(", "D", ")", ",", "respectively", ",", "using", "the", "indicated", "human", "STING", "mutants", "in", "place", "of", "the", "murine", "STING", "mutants", "described", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "in", "(", "E", ")", "is", "normalized", "to", "LacZ", ",", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "co", "-", "IP", "(", "F", ")", "were", "performed", "as", "described", "in", "(", "C", ")", "and", "(", "D", ")", ",", "respectively", ",", "using", "the", "indicated", "human", "STING", "mutants", "in", "place", "of", "the", "murine", "STING", "mutants", "described", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "IB", "shown", "in", "(", "F", ")", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) 293T cells were co-transfected with expression plasmids for IFNβ-Luc, pRL-TK, cGAS-GFP (stimulated) or IRES-GFP (unstimulated) and indicated expression plasmids together with murine Cherry-STING (left panel) or human STING (right panel). Lysates were analyzed by dual-luciferase assay. Data is combined from two out of three independent experiments and shown as mean ± SD.(C) IFNβ-Luc, pRL-TK, cGAS-GFP (stimulated) or IRES-GFP (unstimulated) and either LacZ or m152 together with the indicated murine STING mutants described in (B) were transiently expressed in 293T cells. Luciferase activity was measured as described in (A). Data information: Data in (C) is normalized to LacZ, combined from three independent experiments and shown as mean ± SD.(D) 293T cells were co-transfected with expression plasmids for either LacZ or m152 together with the indicated murine STING mutants described in (B). An anti-V5 IP was performed and samples were analyzed by IB with the indicated antibodies. IB shown in (D) representative of three independent experiments.(E-F) Luciferase assay (E) were performed as described in (C) and (D), respectively, using the indicated human STING mutants in place of the murine STING mutants described in (B). Data information: Data in (E) is normalized to LacZ, combined from three independent experiments and shown as mean ± SD.(E-F) co-IP (F) were performed as described in (C) and (D), respectively, using the indicated human STING mutants in place of the murine STING mutants described in (B). Data information: IB shown in (F) are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "IFNβ", "-", "Luc", ",", "pRL", "-", "TK", "and", "either", "ev", "or", "m152", ".", "Cells", "were", "further", "co", "-", "transfected", "with", "either", "Cherry", "-", "STING", "WT", "or", "the", "constitutively", "active", "Cherry", "-", "STING", "V154M", "(", "stimulated", ")", "or", "with", "IRES", "-", "GFP", "(", "unstimulated", ")", ".", "Data", "is", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "C", ")", "iMEF", "stably", "expressing", "ev", "or", "m152", "-", "V5", "were", "stimulated", "with", "10", "µg", "/", "ml", "ISD", "for", "the", "indicated", "times", "or", "left", "unstimulated", "(", "mock", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "non", "-", "reducing", "conditions", "and", "subjected", "to", "IB", "with", "the", "specified", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "IB", "shown", "in", "(", "C", ")", "are", "representative", "of", "three", "and", "two", "independent", "experiments", ",", "respectively", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "D", ")", "Two", "representative", "still", "images", "from", "live", "cell", "imaging", "experiments", "with", "iMEFgt", "/", "gt", "stably", "expressing", "Cherry", "-", "STING", "transfected", "with", "ISD", "(", "right", "panel", ")", "or", "left", "unstimulated", "(", "left", "panel", ")", ".", "Red", "circles", "highlight", "representative", "translocated", "STING", "in", "ISD", "stimulated", "cells", ",", "which", "is", "used", "as", "an", "indicator", "of", "activation", ".", "(", "E", ")", "iMEFgt", "/", "gt", "stably", "expressing", "Cherry", "-", "STING", "and", "either", "ev", "or", "m152", "-", "V5", "were", "stimulated", "with", "ISD", ".", "Live", "cell", "imaging", "was", "performed", "and", "STING", "translocation", "quantified", "120", "min", "and", "180", "min", "post", "stimulation", ".", "Data", "shown", "is", "one", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "F", ")", "iMEFgt", "/", "gt", "stably", "expressing", "Cherry", "-", "STING", "and", "V5", "-", "tagged", "m152", "or", "corresponding", "ev", "were", "stimulated", "with", "5", "µg", "/", "ml", "ISD", "for", "the", "indicated", "time", "or", "left", "unstimulated", "(", "mock", ")", ".", "Lysates", "were", "subjected", "to", "IB", "with", "the", "specified", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "IB", "shown", "in", "(", "C", ")", "and", "(", "F", ")", "are", "representative", "of", "three", "and", "two", "independent", "experiments", ",", "respectively", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) 293T cells were co-transfected with expression plasmids for IFNβ-Luc, pRL-TK and either ev or m152. Cells were further co-transfected with either Cherry-STING WT or the constitutively active Cherry-STING V154M (stimulated) or with IRES-GFP (unstimulated). Data is combined from three independent experiments and shown as mean ± SD.(C) iMEF stably expressing ev or m152-V5 were stimulated with 10 µg/ml ISD for the indicated times or left unstimulated (mock). Cell lysates were analyzed by SDS-PAGE under non-reducing conditions and subjected to IB with the specified antibodies. Data information: IB shown in (C) are representative of three and two independent experiments, respectively. Student's t-test (unpaired, two-tailed), n.s. not significant, *p<0.05, ****p<0.0001(D) Two representative still images from live cell imaging experiments with iMEFgt/gt stably expressing Cherry-STING transfected with ISD (right panel) or left unstimulated (left panel). Red circles highlight representative translocated STING in ISD stimulated cells, which is used as an indicator of activation.(E) iMEFgt/gt stably expressing Cherry-STING and either ev or m152-V5 were stimulated with ISD. Live cell imaging was performed and STING translocation quantified 120 min and 180 min post stimulation. Data shown is one representative of two independent experiments.(F) iMEFgt/gt stably expressing Cherry-STING and V5-tagged m152 or corresponding ev were stimulated with 5 µg/ml ISD for the indicated time or left unstimulated (mock). Lysates were subjected to IB with the specified antibodies. Data information: IB shown in (C) and (F) are representative of three and two independent experiments, respectively. Student's t-test (unpaired, two-tailed), n.s. not significant, *p<0.05, ****p<0.0001"}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "iMEF", "were", "infected", "by", "centrifugal", "enhancement", "with", "either", "parental", "MCMV", "(", "par", ".", ")", "or", "MCMV", "m152stop", "at", "an", "MOI", "of", "0", ".", "5", "or", "mock", "infected", ".", "3", "hours", "post", "infection", "(", "hpi", ")", "cells", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "with", "the", "specified", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "iMEF", "and", "iMEFgt", "/", "gt", "were", "infected", "by", "centrifugal", "enhancement", "with", "parental", "MCMV", "or", "MCMV", "m152stop", ",", "or", "parental", "MCMV", "alone", ",", "respectively", "(", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "3", "hpi", "lysates", "were", "subjected", "to", "an", "anti", "-", "m152", "IP", "and", "samples", "were", "analyzed", "by", "IB", "with", "indicated", "antibodies", ".", "IB", "shown", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Primary", "BMDM", "were", "infected", "with", "parental", "MCMV", "(", "par", ".", ")", "or", "MCMV", "m152stop", "at", "an", "MOI", "of", "0", ".", "1", "or", "mock", "infected", ".", "16", "hpi", "secreted", "levels", "of", "IFNα", "or", "IFNβ", "were", "quantified", "by", "ELISA", ".", "Data", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "iMEFgt", "/", "gt", "stably", "expressing", "Cherry", "-", "STING", "were", "infected", "with", "parental", "MCMV", "or", "MCMV", "m152stop", "(", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "Live", "cell", "imaging", "was", "performed", "and", "STING", "translocation", "quantified", "120", "min", "and", "180", "min", "post", "stimulation", ".", "Data", "shown", "is", "one", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "iMEF", "or", "iMEFgt", "/", "gt", "were", "infected", "by", "centrifugal", "enhancement", "with", "parental", "MCMV", "or", "MCMV", "m152stop", "(", "MOI", "0", ".", "01", ")", ".", "At", "6", "hpi", "total", "RNA", "was", "extracted", "to", "determine", "MCMV", "IE1", "and", "MCMV", "E1", "(", "F", ")", ",", "transcripts", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "shown", "is", "combined", "from", "two", "out", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "iMEF", "or", "iMEFgt", "/", "gt", "were", "infected", "by", "centrifugal", "enhancement", "with", "parental", "MCMV", "or", "MCMV", "m152stop", "(", "MOI", "0", ".", "01", ")", ".", "At", "6", "hpi", "total", "RNA", "was", "extracted", "to", "determine", ",", "IFNb1", "and", "IL6", "(", "G", ")", "transcripts", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "shown", "is", "combined", "from", "two", "out", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Cherry", "-", "STING", ",", "the", "pNF", "-", "κB", "luciferase", "reporter", ",", "pRL", "-", "TK", ",", "cGAS", "-", "GFP", "(", "stimulated", ")", "or", "IRES", "-", "GFP", "(", "unstimulated", ")", "and", "either", "ev", "or", "m152", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "analyzed", "as", "described", "in", "Figure", "1", ".", "Data", "is", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) iMEF were infected by centrifugal enhancement with either parental MCMV (par.) or MCMV m152stop at an MOI of 0.5 or mock infected. 3 hours post infection (hpi) cells were lysed and subjected to immunoblotting (IB) with the specified antibodies.(C) iMEF and iMEFgt/gt were infected by centrifugal enhancement with parental MCMV or MCMV m152stop, or parental MCMV alone, respectively (MOI 0.5). 3 hpi lysates were subjected to an anti-m152 IP and samples were analyzed by IB with indicated antibodies. IB shown is representative of two independent experiments.(D) Primary BMDM were infected with parental MCMV (par.) or MCMV m152stop at an MOI of 0.1 or mock infected. 16 hpi secreted levels of IFNα or IFNβ were quantified by ELISA. Data is representative of two independent experiments.(E) iMEFgt/gt stably expressing Cherry-STING were infected with parental MCMV or MCMV m152stop (MOI 0.5). Live cell imaging was performed and STING translocation quantified 120 min and 180 min post stimulation. Data shown is one representative of two independent experiments.(F-G) iMEF or iMEFgt/gt were infected by centrifugal enhancement with parental MCMV or MCMV m152stop (MOI 0.01). At 6 hpi total RNA was extracted to determine MCMV IE1 and MCMV E1 (F), transcripts by qRT-PCR. Data shown is combined from two out of three independent experiments.(F-G) iMEF or iMEFgt/gt were infected by centrifugal enhancement with parental MCMV or MCMV m152stop (MOI 0.01). At 6 hpi total RNA was extracted to determine , IFNb1 and IL6 (G) transcripts by qRT-PCR. Data shown is combined from two out of three independent experiments.(H) 293T cells were co-transfected with Cherry-STING, the pNF-κB luciferase reporter, pRL-TK, cGAS-GFP (stimulated) or IRES-GFP (unstimulated) and either ev or m152. Cells were lysed and analyzed as described in Figure 1. Data is combined from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "C", ")", "Type", "I", "IFN", "levels", "in", "spleen", "homogenates", "(", "A", ")", "and", "serum", "(", "B", ")", "of", "C57BL", "/", "6J", "(", "B6J", ")", "or", "STING", "-", "/", "-", "mice", "following", "i", ".", "v", ".", "infection", "with", "4", "x", "105", "PFU", "parental", "MCMV", "or", "MCMV", "m152stop", "were", "analyzed", "6", "hpi", "by", "ELISA", ".", "IFNβ", "levels", "of", "STING", "-", "/", "-", "mice", "were", "below", "the", "detection", "limit", "(", "n", ".", "d", ".", ")", ".", "IL6", "levels", "in", "spleen", "homogenates", "(", "C", ")", "of", "C57BL", "/", "6J", "(", "B6J", ")", "or", "STING", "-", "/", "-", "mice", "following", "i", ".", "v", ".", "infection", "with", "4", "x", "105", "PFU", "parental", "MCMV", "or", "MCMV", "m152stop", "were", "analyzed", "6", "hpi", "by", "ELISA", ".", "(", "D", ")", "B6J", "or", "STING", "-", "/", "-", "mice", "were", "i", ".", "v", ".", "infected", "with", "4", "x", "105", "PFU", "parental", "MCMV", "or", "MCMV", "m152stop", ".", "6", "hpi", ",", "RNA", "was", "extracted", "from", "spleen", "homogenates", "and", "expression", "of", "MCMV", "IE1", "and", "E1", "transcripts", "was", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "were", "normalized", "to", "107", "cellular", "β", "-", "actin", "transcripts", "(", "D", "-", "F", ")", ".", "(", "E", ")", "B6J", "or", "STING", "-", "/", "-", "mice", "were", "i", ".", "v", ".", "infected", "with", "4", "x", "105", "PFU", "parental", "MCMV", ".", "6", "hpi", ",", "RNA", "was", "extracted", "from", "spleen", "homogenates", "and", "m152", "transcript", "levels", "were", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "were", "normalized", "to", "107", "cellular", "β", "-", "actin", "transcripts", "(", "D", "-", "F", ")", ".", "(", "F", ")", "B6J", "or", "STING", "-", "/", "-", "mice", "were", "depleted", "of", "NK", "cells", "via", "treatment", "with", "anti", "-", "NK1", ".", "1", "(", "right", "panel", ")", "or", "left", "untreated", "(", "left", "panel", ")", ".", "One", "day", "after", "NK", "cell", "depletion", ",", "B6J", "or", "STING", "-", "/", "-", "mice", "were", "i", ".", "v", ".", "infected", "with", "4", "x", "105", "PFU", "parental", "MCMV", "or", "MCMV", "m152stop", ".", "16", "hpi", ",", "RNA", "was", "extracted", "from", "spleen", "homogenates", "and", "MCMV", "E1", "transcript", "levels", "were", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "were", "normalized", "to", "107", "cellular", "β", "-", "actin", "transcripts", "(", "D", "-", "F", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-C) Type I IFN levels in spleen homogenates (A) and serum (B) of C57BL/6J (B6J) or STING-/- mice following i.v. infection with 4 x 105 PFU parental MCMV or MCMV m152stop were analyzed 6 hpi by ELISA. IFNβ levels of STING-/- mice were below the detection limit (n.d.).IL6 levels in spleen homogenates (C) of C57BL/6J (B6J) or STING-/- mice following i.v. infection with 4 x 105 PFU parental MCMV or MCMV m152stop were analyzed 6 hpi by ELISA.(D) B6J or STING-/- mice were i.v. infected with 4 x 105 PFU parental MCMV or MCMV m152stop. 6 hpi, RNA was extracted from spleen homogenates and expression of MCMV IE1 and E1 transcripts was determined by qRT-PCR. Data were normalized to 107 cellular β-actin transcripts (D-F).(E) B6J or STING-/- mice were i.v. infected with 4 x 105 PFU parental MCMV. 6 hpi, RNA was extracted from spleen homogenates and m152 transcript levels were determined by qRT-PCR. Data were normalized to 107 cellular β-actin transcripts (D-F).(F) B6J or STING-/- mice were depleted of NK cells via treatment with anti-NK1.1 (right panel) or left untreated (left panel). One day after NK cell depletion, B6J or STING-/- mice were i.v. infected with 4 x 105 PFU parental MCMV or MCMV m152stop. 16 hpi, RNA was extracted from spleen homogenates and MCMV E1 transcript levels were determined by qRT-PCR. Data were normalized to 107 cellular β-actin transcripts (D-F)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Cherry", "-", "STING", ",", "pRL", "-", "TK", ",", "cGAS", "-", "GFP", "(", "stimulated", ")", "or", "IRES", "-", "GFP", "(", "unstimulated", ")", "and", "either", "the", "pNF", "-", "κB", ",", "p55", "-", "CIB", ",", "p125", "or", "p125AA", "luciferase", "reporter", ".", "Data", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "for", "cGAS", "-", "GFP", "(", "stimulated", ")", "or", "ev", "(", "unstimulated", ")", "together", "with", "either", "cherry", "-", "tagged", "WT", "STING", "or", "cherry", "-", "tagged", "K288R", "STING", ".", "Cells", "were", "fixed", "for", "imaging", "24", "hours", "post", "transfection", ".", "Scale", "bar", "represents", "10", "µm", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "iMEFgt", "/", "gt", "stably", "expressing", "cherry", "-", "tagged", "WT", "STING", "or", "K288R", "STING", "and", "either", "ev", "or", "V5", "-", "tagged", "m152", "were", "stimulated", "with", "ISD", "(", "10", "µg", "/", "ml", ")", "or", "mock", "stimulated", ".", "At", "4", "hpi", "total", "RNA", "was", "extracted", "to", "determine", "IFNb1", "(", "C", ")", "and", "IL6", "(", "D", ")", "transcripts", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "shown", "is", "combined", "from", "three", "(", "C", ")", "or", "two", "(", "D", ")", "out", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "iMEFgt", "/", "gt", "(", "-", ")", "and", "iMEFgt", "/", "gt", "stably", "expressing", "either", "cherry", "-", "tagged", "WT", "STING", "or", "K288R", "STING", "were", "infected", "by", "centrifugal", "enhancement", "with", "parental", "MCMV", "or", "MCMV", "m152stop", "(", "MOI", "0", ".", "01", ")", ".", "6", "hpi", "total", "RNA", "was", "extracted", "to", "determine", "MCMV", "E1", "transcripts", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "shown", "is", "combined", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) 293T cells were co-transfected with Cherry-STING, pRL-TK, cGAS-GFP (stimulated) or IRES-GFP (unstimulated) and either the pNF-κB, p55-CIB, p125 or p125AA luciferase reporter. Data is representative of two independent experiments.(B) 293T cells were co-transfected with expression plasmids for cGAS-GFP (stimulated) or ev (unstimulated) together with either cherry-tagged WT STING or cherry-tagged K288R STING. Cells were fixed for imaging 24 hours post transfection. Scale bar represents 10 µm.(C-D) iMEFgt/gt stably expressing cherry-tagged WT STING or K288R STING and either ev or V5-tagged m152 were stimulated with ISD (10 µg/ml) or mock stimulated. At 4 hpi total RNA was extracted to determine IFNb1 (C) and IL6 (D) transcripts by qRT-PCR. Data shown is combined from three (C) or two (D) out of three independent experiments.(E) iMEFgt/gt (-) and iMEFgt/gt stably expressing either cherry-tagged WT STING or K288R STING were infected by centrifugal enhancement with parental MCMV or MCMV m152stop (MOI 0.01). 6 hpi total RNA was extracted to determine MCMV E1 transcripts by qRT-PCR. Data shown is combined from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "RAD51", "SPR", "curves", "for", "ssDNA", "dN", "-", "50", "and", "dsDNA", "dN", "-", "50p", ".", "RAD51", "was", "injected", "at", "150", "nM", "in", "the", "presence", "of", "2", ".", "5", "mM", "ATP", "(", "pH", "7", ".", "5", ")", "and", "10", "mM", "CaCl2", ".", "The", "normalised", "mean", "number", "of", "WT", "RAD51", "bound", "to", "respective", "DNA", "oligonucleotides", "(", "N", ")", "are", "plotted", "versus", "time", ",", "as", "measured", "by", "SPR", ",", "following", "the", "equation", "N", "=", "S", "/", "(", "L", "*", "(", "MRAD51", "/", "MDNA", ")", ")", ",", "where", "S", "is", "the", "signal", "in", "RU", "units", "(", "1", "RU", "~", "50", "pg", "/", "mm2", ")", ",", "L", "is", "the", "amount", "of", "DNA", "ligand", "immobilised", "onto", "the", "experimental", "flow", "cell", "(", "RU", ")", ",", "MRAD51", "is", "the", "molecular", "weight", "(", "kDa", ")", "of", "RAD51", "(", "~", "37", "kDa", ")", "and", "MDNA", "is", "the", "molecular", "weight", "(", "kDa", ")", "of", "the", "immobilised", "DNA", "molecule", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Wild-type (WT) RAD51 SPR curves for ssDNA dN-50 and dsDNA dN-50p. RAD51 was injected at 150 nM in the presence of 2.5 mM ATP (pH 7.5) and 10 mM CaCl2. The normalised mean number of WT RAD51 bound to respective DNA oligonucleotides (N) are plotted versus time, as measured by SPR, following the equation N = S / (L * (MRAD51 / MDNA)), where S is the signal in RU units (1 RU ~ 50 pg/mm2), L is the amount of DNA ligand immobilised onto the experimental flow cell (RU), MRAD51 is the molecular weight (kDa) of RAD51 (~ 37 kDa) and MDNA is the molecular weight (kDa) of the immobilised DNA molecule."}
{"words": ["Figure", "2Biotinylated", "ssDNA", "oligonucleotides", "of", "indicated", "lengths", "were", "separately", "immobilised", "onto", "SPR", "CM5", "chips", "via", "biotin", "-", "streptavidin", "interaction", ".", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "RAD51", "was", "injected", "at", "the", "indicated", "concentrations", "to", "measure", "association", "and", "dissociation", "kinetics", ".", "The", "dotted", "and", "solid", "curves", "show", "the", "normalised", "mean", "number", "of", "RAD51", "bound", "to", "the", "ssDNA", "oligonucleotides", ",", "as", "measured", "by", "SPR", "(", "see", "Fig", ".", "1", "for", "equation", ")", "and", "the", "ODE", "model", "fits", "(", "see", "Fig", ".", "3A", "for", "model", "description", ")", ",", "respectively", ".", "As", "in", "A", ",", "except", "biotinylated", "dsDNA", "molecules", "of", "indicated", "lengths", "were", "used", "to", "measure", "association", "and", "dissociation", "kinetics", ".", "As", "in", "B", ",", "the", "dotted", "and", "solid", "curves", "show", "the", "mean", "number", "of", "RAD51", "bound", "to", "the", "dsDNA", "oligonucleotides", ",", "as", "measured", "by", "SPR", "and", "the", "ODE", "model"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Biotinylated ssDNA oligonucleotides of indicated lengths were separately immobilised onto SPR CM5 chips via biotin-streptavidin interaction. Wild-type (WT) RAD51 was injected at the indicated concentrations to measure association and dissociation kinetics.The dotted and solid curves show the normalised mean number of RAD51 bound to the ssDNA oligonucleotides, as measured by SPR (see Fig. 1 for equation) and the ODE model fits (see Fig. 3A for model description), respectively.As in A, except biotinylated dsDNA molecules of indicated lengths were used to measure association and dissociation kinetics.As in B, the dotted and solid curves show the mean number of RAD51 bound to the dsDNA oligonucleotides, as measured by SPR and the ODE model fits"}
{"words": ["Figure", "3Predicted", "concentrations", "of", "WT", "RAD51", "polymers", "in", "solution", "at", "equilibrium", "as", "a", "function", "of", "WT", "RAD51", "monomer", "concentration", "(", "150", "nM", ",", "3", "µM", ",", "30", "µM", ")", ",", "prior", "to", "RAD51", "injection", "onto", "DNA", "-", "coated", "SPR", "CM5", "chips", ".", "Predicted", "%", "WT", "RAD51", "within", "each", "polymer", "state", "in", "solution", "at", "equilibrium", "as", "a", "function", "of", "WT", "RAD51", "monomer", "concentration", "(", "150", "nM", ",", "3", "µM", ",", "30", "µM", ")", ",", "prior", "to", "RAD51", "injection", "onto", "DNA", "-", "coated", "SPR", "CM5", "chips", ".", "In", "panels", "C", "and", "D", ",", "the", "KD", "was", "fixed", "to", "the", "mean", "value", "identified", "in", "Figs", ".", "3", "A", "and", "B", "(", "i", ".", "e", ".", "KD", "=", "1", ".", "14", "nM", ")", ",", "and", "the", "concentration", "of", "WT", "RAD51", "monomer", "concentration", "was", "varied", "accordingly", ".", "In", "panel", "D", ",", "the", "%", "WT", "RAD51", "values", "were", "calculated", "by", "multiplying", "the", "polymer", "concentrations", "by", "their", "respective", "polymer", "length", ",", "and", "dividing", "each", "value", "by", "the", "total", "RAD51", "monomer", "concentration", "(", "i", ".", "e", ".", "%", "WT", "RAD51", "=", "[", "n", "-", "mer", "]", "*", "n", "/", "[", "WT", "RAD51monomer", "]", ")", ".", "[", "WT", "RAD51monomer", "]", "was", "calculated", "via", "coomassie", "staining", "image", "quantification", "using", "a", "BSA", "standard", "curve", ".", "It", "is", "important", "to", "note", "that", "the", "assumed", "maximum", "polymer", "length", "in", "solution", "(", "16", "-", "mer", ")", "leads", "to", "an", "overestimation", "of", "the", "concentration", "of", "each", "n", "-", "mer", "in", "solution", ",", "given", "that", "RAD51", "is", "likely", "to", "form", "polymers", "of", "length", "greater", "than", "16", "at", "150", "nM", ",", "3", "µM", "and", "30", "µM", "WT", "RAD51", "monomer", "concentration", ".", "However", ",", "this", "overestimation", "is", "likely", "to", "not", "alter", "the", "conclusion", "that", "WT", "RAD51", "forms", "long", "polymers", "in", "solution", "at", "150", "nM", "-", "30", "µM", "concentration", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Predicted concentrations of WT RAD51 polymers in solution at equilibrium as a function of WT RAD51 monomer concentration (150 nM, 3 µM, 30 µM), prior to RAD51 injection onto DNA-coated SPR CM5 chips. Predicted % WT RAD51 within each polymer state in solution at equilibrium as a function of WT RAD51 monomer concentration (150 nM, 3 µM, 30 µM), prior to RAD51 injection onto DNA-coated SPR CM5 chips. In panels C and D, the KD was fixed to the mean value identified in Figs. 3 A and B (i.e. KD = 1.14 nM), and the concentration of WT RAD51 monomer concentration was varied accordingly. In panel D, the % WT RAD51 values were calculated by multiplying the polymer concentrations by their respective polymer length, and dividing each value by the total RAD51 monomer concentration (i.e. % WT RAD51 = [n-mer] * n / [WT RAD51monomer]). [WT RAD51monomer] was calculated via coomassie staining image quantification using a BSA standard curve. It is important to note that the assumed maximum polymer length in solution (16-mer) leads to an overestimation of the concentration of each n-mer in solution, given that RAD51 is likely to form polymers of length greater than 16 at 150 nM, 3 µM and 30 µM WT RAD51 monomer concentration. However, this overestimation is likely to not alter the conclusion that WT RAD51 forms long polymers in solution at 150 nM - 30 µM concentration."}
{"words": ["Figure", "4Biotinylated", "DNA", "molecules", "of", "varying", "flexibility", "were", "separately", "immobilised", "onto", "SPR", "CM5", "chips", "via", "biotin", "-", "streptavidin", "interaction", ",", "and", "WT", "RAD51", "was", "injected", "at", "the", "indicated", "concentrations", "to", "measure", "association", "and", "dissociation", "kinetics", ".", "The", "flexibility", "of", "respective", "DNA", ",", "the", "expected", "entropic", "penalties", "upon", "RAD51", "binding", "to", "corresponding", "DNA", "and", "protomer", "-", "protomer", "binding", "energy", "contribution", "of", "WT", "RAD51", "are", "indicated", "in", "gray", ",", "green", "and", "blue", "boxes", ".", "H", "and", "L", "in", "each", "box", "denote", "high", "and", "low", ",", "respectively", ".", "The", "mean", "number", "of", "WT", "RAD51", "bound", "to", "respective", "DNA", "oligonucleotides", ",", "as", "measured", "by", "SPR", "(", "dotted", "lines", ")", "and", "ODE", "model", "fits", "(", "solid", "lines", ")", ".", "Bar", "plots", "of", "fitted", "kp", "values", "(", "D", ")", "and", "ks", "values", "(", "E", ")", "for", "each", "SPR", "curves", ".", "In", "panel", "D", ",", "all", "parameters", "except", "kp", "were", "fixed", "to", "the", "mean", "values", "as", "identified", "in", "Fig", ".", "3", "A", "and", "B", ",", "and", "kp", "was", "fitted", "using", "lsqcurvefit", "(", "MATLAB", ")", ".", "In", "panel", "E", ",", "all", "parameters", "except", "ks", "and", "kp", "were", "fixed", "to", "the", "mean", "values", "as", "identified", "in", "Fig", ".", "3", "A", "and", "B", ",", "and", "ks", "and", "kp", "were", "fitted", "using", "lsqcurvefit", "(", "MATLAB", ")", ".", "Only", "the", "ks", "values", "are", "reported", "here", ".", "Mean", "±", "1", "SD", "of", "3", "ODE", "model", "fits", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", ":", "un", "-", "paired", ",", "one", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "-", "Wilcoxon", "tests", ".", "E", ":", "un", "-", "paired", ",", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "-", "Wilcoxon", "tests", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "ns", "=", "non", "-", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Biotinylated DNA molecules of varying flexibility were separately immobilised onto SPR CM5 chips via biotin-streptavidin interaction, and WT RAD51 was injected at the indicated concentrations to measure association and dissociation kinetics. The flexibility of respective DNA, the expected entropic penalties upon RAD51 binding to corresponding DNA and protomer-protomer binding energy contribution of WT RAD51 are indicated in gray, green and blue boxes. H and L in each box denote high and low, respectively.The mean number of WT RAD51 bound to respective DNA oligonucleotides, as measured by SPR (dotted lines) and ODE model fits (solid lines).Bar plots of fitted kp values (D) and ks values (E) for each SPR curves. In panel D, all parameters except kp were fixed to the mean values as identified in Fig. 3 A and B, and kp was fitted using lsqcurvefit (MATLAB). In panel E, all parameters except ks and kp were fixed to the mean values as identified in Fig. 3 A and B, and ks and kp were fitted using lsqcurvefit (MATLAB). Only the ks values are reported here. Mean ± 1 SD of 3 ODE model fits (n=3). D: un-paired, one-tailed Mann-Whitney-Wilcoxon tests. E: un-paired, two-tailed Mann-Whitney-Wilcoxon tests. * p ≤ 0.05; ns = non-significant."}
{"words": ["Figure", "5As", "in", "Fig", ".", "4B", ",", "but", "F86E", "RAD51", "was", "injected", "at", "the", "indicated", "concentration", "to", "measure", "association", "and", "dissociation", "kinetics", ".", "The", "flexibility", "of", "respective", "DNA", ",", "the", "expected", "relative", "entropic", "penalties", "upon", "F86E", "RAD51", "binding", "to", "each", "DNA", "molecule", "and", "protomer", "-", "protomer", "binding", "enegy", "contribution", "of", "F86", "RAD51", "are", "indicated", "in", "gray", ",", "green", "and", "blue", "boxes", ".", "H", "and", "L", "shown", "in", "each", "box", "indicate", "high", "and", "low", ",", "respectively", ".", "The", "mean", "number", "of", "F86E", "RAD51", "bound", "to", "respective", "DNA", "oligonucleotides", ",", "as", "measured", "by", "SPR", "(", "dotted", "lines", ")", "and", "corresponding", "model", "fits", "(", "solid", "lines", ")", "using", "the", "model", "shown", "in", "panel", "D", ".", "Using", "ABC", "-", "SMC", ",", "individual", "forward", "rates", "(", "kp", ")", "and", "reverse", "rates", "(", "kpr", ")", "were", "fitted", "to", "each", "experimental", "curve", ",", "while", "a", "single", "KD", "was", "fitted", "to", "all", "experimental", "curves", ".", "Bar", "plots", "of", "fitted", "kp", "values", "for", "the", "SPR", "curves", ".", "Mean", "values", "of", "mode", "particles", "±", "1", "SD", "derived", "from", "the", "ABC", "-", "SMC", "fits", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Un", "-", "paired", ",", "one", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "-", "Wilcoxon", "tests", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "ns", "=", "non", "-", "significant", ".", "Predicted", "concentrations", "of", "F86E", "RAD51", "polymers", "in", "solution", "at", "equilibrium", "as", "a", "function", "of", "F86E", "RAD51", "monomer", "concentration", "(", "150", "nM", ",", "3", "µM", ",", "30", "µM", ")", ",", "prior", "to", "RAD51", "injection", "onto", "DNA", "-", "coated", "SPR", "CM5", "chips", ".", "Predicted", "%", "F86E", "RAD51", "within", "each", "polymer", "state", "in", "solution", "at", "equilibrium", "as", "a", "function", "of", "F86E", "RAD51", "monomer", "concentration", "(", "150", "nM", ",", "3", "µM", ",", "30", "µM", ")", ",", "prior", "to", "RAD51", "injection", "onto", "DNA", "-", "coated", "SPR", "CM5", "chips", ".", "In", "panels", "F", "and", "G", ",", "the", "KD", "was", "fixed", "to", "the", "mean", "value", "identified", "in", "Fig", ".", "5D", "(", "i", ".", "e", ".", "KD", "=", "10", ".", "2", "µM", ")", ",", "and", "the", "concentration", "of", "F86E", "RAD51", "monomer", "concentration", "was", "varied", "accordingly", ".", "In", "panel", "G", ",", "the", "%", "F86E", "RAD51", "values", "were", "calculated", "by", "multiplying", "the", "polymer", "concentrations", "by", "their", "respective", "polymer", "length", ",", "and", "dividing", "each", "value", "by", "the", "total", "RAD51", "monomer", "concentration", "(", "i", ".", "e", ".", "%", "F86E", "RAD51", "=", "[", "n", "-", "mer", "]", "*", "n", "/", "[", "F86E", "RAD51monomer", "]", ")", ".", "[", "F86E", "RAD51monomer", "]", "was", "calculated", "via", "coomassie", "staining", "image", "quantification", "using", "a", "BSA", "standard", "curve", ".", "Bar", "plots", "of", "fitted", "kpr", "values", "for", "the", "SPR", "curves", ".", "Mean", "values", "of", "mode", "particles", "±", "1", "SD", "derived", "from", "the", "ABC", "-", "SMC", "fits", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Un", "-", "paired", ",", "one", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "-", "Wilcoxon", "tests", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "ns", "=", "non", "-", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5As in Fig. 4B, but F86E RAD51 was injected at the indicated concentration to measure association and dissociation kinetics. The flexibility of respective DNA, the expected relative entropic penalties upon F86E RAD51 binding to each DNA molecule and protomer-protomer binding enegy contribution of F86 RAD51 are indicated in gray, green and blue boxes. H and L shown in each box indicate high and low, respectively.The mean number of F86E RAD51 bound to respective DNA oligonucleotides, as measured by SPR (dotted lines) and corresponding model fits (solid lines) using the model shown in panel D. Using ABC-SMC, individual forward rates (kp) and reverse rates (kpr) were fitted to each experimental curve, while a single KD was fitted to all experimental curves.Bar plots of fitted kp values for the SPR curves. Mean values of mode particles ± 1 SD derived from the ABC-SMC fits (n=3). Un-paired, one-tailed Mann-Whitney-Wilcoxon tests. * p ≤ 0.05; ns = non-significant.Predicted concentrations of F86E RAD51 polymers in solution at equilibrium as a function of F86E RAD51 monomer concentration (150 nM, 3 µM, 30 µM), prior to RAD51 injection onto DNA-coated SPR CM5 chips. Predicted % F86E RAD51 within each polymer state in solution at equilibrium as a function of F86E RAD51 monomer concentration (150 nM, 3 µM, 30 µM), prior to RAD51 injection onto DNA-coated SPR CM5 chips. In panels F and G, the KD was fixed to the mean value identified in Fig. 5D (i.e. KD = 10.2 µM), and the concentration of F86E RAD51 monomer concentration was varied accordingly. In panel G, the % F86E RAD51 values were calculated by multiplying the polymer concentrations by their respective polymer length, and dividing each value by the total RAD51 monomer concentration (i.e. % F86E RAD51 = [n-mer] * n / [F86E RAD51monomer]). [F86E RAD51monomer] was calculated via coomassie staining image quantification using a BSA standard curve. Bar plots of fitted kpr values for the SPR curves. Mean values of mode particles ± 1 SD derived from the ABC-SMC fits (n=3). Un-paired, one-tailed Mann-Whitney-Wilcoxon tests. * p ≤ 0.05; ns = non-significant."}
{"words": ["Figure", "1Partial", "embryonic", "lethality", "after", "E11", ".", "5", ".", "Chi", "-", "square", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "E11", ".", "5", "n", "=", "114", "embryos", ",", "E14", ".", "5", "n", "=", "70", "embryos", ",", "Adult", "n", "=", "314", "born", "pups", ".", "Hindbrain", "vessel", "morphology", ".", "IsolectinB4", "(", "IsoB4", ";", "white", ")", ",", "ERG", "(", "red", ")", "and", "EdU", "incorporation", "(", "green", ")", ".", "EdU", "signal", "was", "masked", "with", "ERG", "signal", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "Hindbrain", "vessel", "density", ".", "IsolectinB4", "vessel", "area", "normalized", "to", "wildtype", "(", "WT", ")", "mean", ";", "one", "dot", "is", "two", "fields", "/", "mouse", ";", "error", "bars", ":", "SD", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "18", "-", "20", ".", "Hindbrain", "EC", "proliferation", ".", "EdU", "incorporation", "in", "ERG", "-", "positive", "ECs", "(", "double", "-", "positive", "cells", ",", "yellow", "in", "B", ")", ".", "One", "dot", "is", "two", "fields", "/", "mouse", ";", "error", "bars", ":", "SD", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "7", "-", "12", ".", "Reduced", "weight", "gain", "in", "the", "adult", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0009", ";", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "n", "=", "13", "-", "20", "mice", ".", "P6", "retina", "vessel", "morphology", ".", "IsolectinB4", "(", "IsoB4", ")", "in", "black", ";", "the", "outer", "20", "%", "of", "the", "vascularized", "area", "in", "pink", ".", "Scale", "bar", ",", "250", "µm", ".", "Vessel", "parameters", "in", "the", "P6", "developing", "retina", ".", "G", ".", "Radial", "outgrowth", "(", "distance", "between", "optic", "nerve", "and", "vascular", "front", ")", ".", "Vascularized", "area", ".", "I", ".", "Vessel", "area", "in", "the", "outer", "20", "%", "of", "the", "retinal", "vasculature", ";", "pink", "in", "F", "(", "vessel", "area", "normalized", "to", "vascularized", "area", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "retina", "/", "mouse", ";", "n", "=", "3", "-", "4", ".", "EdU", "incorporation", "in", "ERG", "-", "positive", "ECs", "normalized", "to", "total", "ERG", "-", "positive", "ECs", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "retina", "/", "mouse", ";", "error", "bars", ":", "SD", ".", "n", "=", "8", "-", "9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Partial embryonic lethality after E11.5. Chi-square, **** p<0.0001. E11.5 n=114 embryos, E14.5 n=70 embryos, Adult n=314 born pups.Hindbrain vessel morphology. IsolectinB4 (IsoB4; white), ERG (red) and EdU incorporation (green). EdU signal was masked with ERG signal. Scale bar, 50 µm.Hindbrain vessel density. IsolectinB4 vessel area normalized to wildtype (WT) mean; one dot is two fields/mouse; error bars: SD; unpaired T test, * p <0.05. n=18-20.Hindbrain EC proliferation. EdU incorporation in ERG-positive ECs (double-positive cells, yellow in B). One dot is two fields/mouse; error bars: SD; unpaired T test, *p < 0.05. n=7-12.Reduced weight gain in the adult. Error bars: SD; 2-way ANOVA p=0.0009; Sidak's multiple comparison test, **p <0.01. n=13-20 mice.P6 retina vessel morphology. IsolectinB4 (IsoB4) in black; the outer 20% of the vascularized area in pink. Scale bar, 250 µm.Vessel parameters in the P6 developing retina. G. Radial outgrowth (distance between optic nerve and vascular front).Vascularized area. I. Vessel area in the outer 20% of the retinal vasculature; pink in F (vessel area normalized to vascularized area). Each dot represents one retina/mouse; n=3-4.EdU incorporation in ERG-positive ECs normalized to total ERG-positive ECs. Each dot represents one retina/mouse; error bars: SD. n=8-9."}
{"words": ["Figure", "2Body", "weight", ".", "P", ",", "postnatal", "day", ";", "w", ",", "weeks", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ".", "n", "=", "5", "-", "12", "mice", ".", "Hindbrain", "vessel", "parameters", ".", "Vessel", "density", ";", "isolectinB4", "vessel", "area", "normalized", "to", "WT", "mean", "of", "the", "litter", ".", "Hindbrain", "vessel", "parameters", ".", "EdU", "incorporation", "in", "ERG", "-", "positive", "ECs", "normalized", "to", "total", "ERG", "-", "positive", "ECs", ".", "P4", "-", "P7", "retina", "vessel", "morphology", ".", "IsolectinB4", "(", "IsoB4", ")", "in", "black", ";", "outer", "20", "%", "of", "the", "vascularized", "area", "in", "pink", ".", "Scale", "bar", ",", "250", "µm", ".", "P6", "insets", ";", "sprout", "morphology", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "Radial", "outgrowth", ".", "Distance", "between", "optic", "nerve", "and", "vascular", "front", ".", "P", ",", "postnatal", "day", ";", "error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "P4", "n", "=", "3", "-", "5", "retinas", ",", "one", "retina", "/", "mouse", ",", "P5", "n", "=", "4", "-", "7", ",", "P6", "n", "=", "9", "-", "9", ",", "P7", "n", "=", "4", "-", "5", ".", "Retina", "vascularized", "area", ".", "P", ",", "postnatal", "day", ";", "error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0013", ".", "P4", "n", "=", "7", "-", "9", "retinas", ",", "one", "retina", "/", "mouse", ",", "P5", "n", "=", "4", "-", "9", ",", "P6", "n", "=", "9", "-", "9", ",", "P7", "n", "=", "4", "-", "5", ".", "Retina", "vessel", "density", "in", "the", "retinal", "front", ".", "Quantification", "of", "the", "vessel", "area", "in", "the", "outer", "20", "%", "of", "the", "vasculature", "(", "pink", "in", "D", ")", "(", "vessel", "area", "normalized", "to", "vascularized", "area", ")", ".", "P", ",", "postnatal", "day", ";", "error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0054", ";", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "P4", "n", "=", "3", "-", "5", "retinas", ",", "one", "retina", "/", "mouse", ",", "P5", "n", "=", "4", "-", "6", ",", "P6", "n", "=", "3", "-", "5", ",", "P7", "n", "=", "4", "-", "5", ".", "Proliferation", "of", "retinal", "ECs", ".", "H", ".", "EdU", "incorporation", "in", "ERG", "-", "positive", "ECs", "normalized", "to", "total", "ERG", "-", "positive", "ECs", ",", "at", "P6", ".", "IsolectinB4", "(", "IsoB4", ";", "white", ")", ",", "ERG", "(", "red", ")", ",", "EdU", "(", "green", ")", "and", "double", "-", "positive", "cells", "(", "yellow", ")", ".", "Lower", "panel", "shows", "ERG", "/", "EdU", "merged", "staining", "alone", "with", "EdU", "signal", "masked", "by", "ERG", "signal", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ";", "error", "bars", ":", "SD", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "5", "-", "8", "retinas", ",", "one", "retina", "/", "mouse", ".", "Retina", "sprout", "length", ".", "Sprout", "length", "from", "tip", "to", "base", "in", "P6", "retinas", ";", "error", "bars", ":", "SD", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "n", "=", "3", "-", "5", "retinas", ",", "one", "retina", "/", "mouse", ".", "Vessel", "stability", ".", "IsolectinB4", "(", "IsoB4", ",", "green", ")", "and", "collagen", "IV", "(", "red", ")", "in", "P4", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "retinas", ".", "Arrows", ";", "collagen", "IV", "-", "positive", "empty", "sleeves", ".", "A", ";", "artery", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "Vessel", "stability", ".", "Collagen", "IV", "empty", "sleeves", "around", "main", "arteries", "in", "P4", "-", "P7", "retinas", ",", "three", "fields", "/", "retina", "/", "mouse", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0580", ";", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "P4", "n", "=", "7", "-", "9", ",", "P5", "n", "=", "6", "-", "12", ",", "P6", "n", "=", "3", "-", "5", ",", "P7", "n", "=", "4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Body weight. P, postnatal day; w, weeks. Error bars: SD. n=5-12 mice.Hindbrain vessel parameters. Vessel density; isolectinB4 vessel area normalized to WT mean of the litter.Hindbrain vessel parameters. EdU incorporation in ERG-positive ECs normalized to total ERG-positive ECs.P4-P7 retina vessel morphology. IsolectinB4 (IsoB4) in black; outer 20% of the vascularized area in pink. Scale bar, 250 µm. P6 insets; sprout morphology. Scale bar, 50 µm.Radial outgrowth. Distance between optic nerve and vascular front. P, postnatal day; error bars: SD; 2-way ANOVA p<0.0001; Bonferroni's multiple comparison test, *p<0.05. P4 n=3-5 retinas, one retina/mouse, P5 n=4-7, P6 n=9-9, P7 n=4-5. Retina vascularized area. P, postnatal day; error bars: SD; 2-way ANOVA p=0.0013. P4 n=7-9 retinas, one retina/mouse, P5 n=4-9, P6 n=9-9, P7 n=4-5.Retina vessel density in the retinal front. Quantification of the vessel area in the outer 20% of the vasculature (pink in D) (vessel area normalized to vascularized area). P, postnatal day; error bars: SD; 2-way ANOVA p=0.0054; Bonferroni's multiple comparison test, *p<0.05, ** p <0.01. P4 n=3-5 retinas, one retina/mouse, P5 n=4-6, P6 n=3-5, P7 n=4-5.Proliferation of retinal ECs. H. EdU incorporation in ERG-positive ECs normalized to total ERG-positive ECs, at P6.IsolectinB4 (IsoB4; white), ERG (red), EdU (green) and double-positive cells (yellow). Lower panel shows ERG/EdU merged staining alone with EdU signal masked by ERG signal. Scale bar, 50 µm; error bars: SD; unpaired T test, *p < 0.05. n=5-8 retinas, one retina/mouse.Retina sprout length. Sprout length from tip to base in P6 retinas; error bars: SD; unpaired T test, *p<0.05; n=3-5 retinas, one retina/mouse.Vessel stability. IsolectinB4 (IsoB4, green) and collagen IV (red) in P4 wildtype (WT) and Vegfr2Y1212F /Y1212F retinas. Arrows; collagen IV-positive empty sleeves. A; artery. Scale bar, 50 µm.Vessel stability. Collagen IV empty sleeves around main arteries in P4-P7 retinas, three fields/retina/mouse. Error bars: SD; 2-way ANOVA p=0.0580; Bonferroni's multiple comparison test, ** p <0.01. P4 n=7-9, P5 n=6-12, P6 n=3-5, P7 n=4."}
{"words": ["Figure", "3Immunoblot", "showing", "VEGFR2", "phosphorylation", "on", "pY1212", ",", "pY949", "and", "pY1173", ".", "A", ".", "Anti", "-", "VEGFR2", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "from", "lung", "lysates", "from", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "FVB", "mice", ",", "tail", "-", "vein", "injected", "with", "PBS", "or", "VEGF", "for", "1", "minute", ".", "Each", "lane", "(", "A", ")", "represent", "one", "individual", "mouse", ".", "Quantification", "as", "percentage", "of", "phosphoprotein", "level", "normalized", "to", "total", "VEGFR2", ".", "each", "dot", "(", "B", ")", "represent", "one", "individual", "mouse", ".", "Summary", "plot", "of", "51", "proteins", "enriched", "in", "the", "immobilized", "pY1212", "peptide", "precipitate", ".", "10", "proteins", "(", "red", "oval", ")", "were", "selected", "for", "further", "analysis", ".", "PSM", ":", "peptide", "-", "spectrum", "matches", ".", "Area", ":", "average", "area", "of", "spectra", "for", "the", "three", "most", "abundant", "peptides", "in", "arbitrary", "units", ".", "Blot", "for", "peptide", "-", "enriched", "GRB2", "and", "PI3Kp85", ".", "HDMEC", "total", "lysate", "incubated", "with", "indicated", "immobilized", "peptides", "followed", "by", "immunoblotting", "for", "GRB2", "and", "PI3Kp85", ".", "VEGFR2", "/", "GRB2", "and", "VEGFR2", "/", "PI3Kp85", "complexes", "in", "isolated", "(", "i", ")", "ECs", ".", "E", ".", "PLA", "for", "VEGFR2", "/", "GRB2", "and", "VEGFR2", "/", "PI3Kp85", "complexes", "(", "black", "puncta", ")", "in", "iECs", "from", "FVB", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "lungs", ".", "Hoechst", "33342", "show", "nuclei", "(", "grey", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "F", ",", "G", ".", "Fold", "-", "increase", "over", "PBS", "-", "treated", "sample", ";", "each", "dot", "represents", "the", "mean", "of", "6", "fields", ".", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0206", "(", "F", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0368", "(", "G", ")", ";", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "3", "experiments", ".", "phosphoERK1", "/", "2", "and", "phosphoAkt", "immunostaining", "(", "green", ")", "of", "iECs", "from", "FVB", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "lungs", ".", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ")", "shows", "nuclei", ".", "Arrows", "indicate", "nuclear", "accumulation", "of", "phosphoERK1", "/", "2", "and", "phosphoAkt", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "Nuclear", "accumulation", "expressed", "as", "phoshoERK1", "/", "2", "-", "positive", "nuclear", "area", "normalized", "to", "the", "total", "phosphoERK1", "/", "2", "area", "by", "field", ".", "Each", "dot", "represents", "1", "field", ".", "Min", ",", "minutes", "of", "stimulation", ".", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0248", ";", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "n", "=", "3", "experiments", ".", "Nuclear", "accumulation", "expressed", "as", "fold", "-", "increase", "of", "nuclear", "phosphoAkt", "area", "in", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "over", "PBS", "-", "treated", "wildtype", "(", "WT", ")", "iECs", ",", "normalized", "to", "the", "number", "of", "nuclei", ".", "Each", "dot", "represents", "1", "field", ".", "Min", ",", "minutes", "of", "stimulation", ".", "Unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "3", "experiments", ".", "Immunoblot", "for", "phosphoERK1", "/", "2", ",", "total", "ERK1", "/", "2", ",", "phosphoAkt", "and", "total", "Akt", "on", "lung", "lysates", "from", "wiltype", "(", "WT", ")", "and", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "FVB", "mice", "tail", "-", "vein", "injected", "with", "PBS", "or", "VEGFA", "followed", "by", "circulation", "for", "time", "points", "indicated", ".", "Each", "lane", "represents", "one", "individual", "mouse", ".", "Quantification", "of", "phosphoERK1", "/", "2", "/", "total", "ERK1", "/", "2", "expressed", "as", "Fold", "change", "to", "PBS", ".", "Min", ",", "minutes", "of", "stimulation", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0025", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "3", "experiments", ".", "Quantification", "of", "phosphoAkt", "/", "total", "Akt", "expressed", "as", "Fold", "change", "to", "PBS", ".", "Min", ",", "minutes", "of", "stimulation", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0003", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "3", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunoblot showing VEGFR2 phosphorylation on pY1212, pY949 and pY1173. A. Anti-VEGFR2 immunoprecipitates (IP) from lung lysates from wildtype (WT) and Vegfr2Y1212F /Y1212F FVB mice, tail-vein injected with PBS or VEGF for 1 minute. Each lane (A) represent one individual mouse.Quantification as percentage of phosphoprotein level normalized to total VEGFR2. each dot (B) represent one individual mouse.Summary plot of 51 proteins enriched in the immobilized pY1212 peptide precipitate. 10 proteins (red oval) were selected for further analysis. PSM: peptide-spectrum matches. Area: average area of spectra for the three most abundant peptides in arbitrary units.Blot for peptide-enriched GRB2 and PI3Kp85. HDMEC total lysate incubated with indicated immobilized peptides followed by immunoblotting for GRB2 and PI3Kp85.VEGFR2/GRB2 and VEGFR2/PI3Kp85 complexes in isolated (i)ECs. E. PLA for VEGFR2/GRB2 and VEGFR2/PI3Kp85 complexes (black puncta) in iECs from FVB wildtype (WT) and Vegfr2Y1212F/Y1212F lungs. Hoechst 33342 show nuclei (grey). Scale bar, 20 µm. F, G. Fold-increase over PBS-treated sample; each dot represents the mean of 6 fields. 2-way ANOVA p=0.0206 (F), p=0.0368 (G); Sidak's multiple comparison test, * p <0.05. n=3 experiments.phosphoERK1/2 and phosphoAkt immunostaining (green) of iECs from FVB wildtype (WT) and Vegfr2Y1212F/Y1212F lungs. Hoechst 33342 (blue) shows nuclei. Arrows indicate nuclear accumulation of phosphoERK1/2 and phosphoAkt, respectively. Scale bar, 20 µm.Nuclear accumulation expressed as phoshoERK1/2-positive nuclear area normalized to the total phosphoERK1/2 area by field. Each dot represents 1 field. Min, minutes of stimulation. 2-way ANOVA p=0.0248; Sidak's multiple comparison test, * p <0.05, ** p <0.01. n=3 experiments.Nuclear accumulation expressed as fold-increase of nuclear phosphoAkt area in Vegfr2Y1212F/Y1212F over PBS-treated wildtype (WT) iECs, normalized to the number of nuclei. Each dot represents 1 field. Min, minutes of stimulation. Unpaired T test, *p < 0.05. n=3 experiments.Immunoblot for phosphoERK1/2, total ERK1/2, phosphoAkt and total Akt on lung lysates from wiltype (WT) and Vegfr2Y1212F /Y1212F FVB mice tail-vein injected with PBS or VEGFA followed by circulation for time points indicated. Each lane represents one individual mouse. Quantification of phosphoERK1/2 /total ERK1/2 expressed as Fold change to PBS. Min, minutes of stimulation. Error bars: SD; 2-way ANOVA p=0.0025; unpaired T test, *p < 0.05. n=3 experiments. Quantification of phosphoAkt/total Akt expressed as Fold change to PBS. Min, minutes of stimulation. Error bars: SD; 2-way ANOVA p=0.0003; unpaired T test, *p < 0.05. n=3 experiments."}
{"words": ["Figure", "4Immunoblot", "for", "Myc", "on", "lung", "lysates", "from", "wiltype", "(", "WT", ")", "and", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "FVB", "mice", "tail", "-", "vein", "injected", "with", "PBS", "or", "VEGFA", "followed", "by", "circulation", "for", "time", "points", "indicated", ".", "Each", "lane", "represents", "one", "individual", "mouse", ".", "Quantification", "of", "Myc", "/", "Actin", "expressed", "as", "Fold", "change", "to", "PBS", ".", "Min", ",", "minutes", "of", "stimulation", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0058", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "n", "=", "3", "experiments", ".", "Myc", "protein", "expression", ".", "C", ".", "Myc", "and", "Actin", "immunoblotting", "on", "lysates", "of", "lung", "isolated", "ECs", "from", "untreated", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "mutant", "(", "VEGFR2", "Y1212F", ")", "C57Bl", "/", "6", "and", "FVB", "mice", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "Myc", "/", "Actin", "expressed", "as", "Arbitrary", "unit", ".", "Each", "lane", "(", "C", ")", "and", "each", "dot", "(", "D", ")", "represent", "one", "individual", "mouse", ".", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "n", "=", "5", "-", "7", ".", "Baseline", "transcriptional", "level", "of", "Myc", "from", "lung", "isolated", "ECs", "from", "untreated", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "mutant", "(", "VEGFR2", "Y1212F", ")", "C57Bl", "/", "6", "and", "FVB", "mice", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "individual", "mouse", ".", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0041", ";", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "4", "-", "5", ".", "Proliferation", "of", "C57Bl", "/", "6", "and", "FVB", "iECs", ".", "CD31", "(", "white", ")", ",", "ERG", "(", "red", ")", ",", "EdU", "(", "green", ")", "and", "double", "-", "positive", "cells", "(", "yellow", ")", "in", "C57Bl", "/", "6", "(", "F", ")", "and", "FVB", "(", "G", ")", "iECs", ".", "EdU", "signal", "was", "masked", "with", "ERG", "signal", ".", "Proliferation", "of", "C57Bl", "/", "6", "and", "FVB", "iECs", ".", "EdU", "incorporation", "in", "ERG", "-", "positive", "ECs", "normalized", "to", "total", "ERG", "-", "positive", "ECs", ".", "Each", "dot", "represents", "2", "fields", "/", "well", ",", "one", "well", "/", "mouse", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "p", "=", "0", ".", "0843", "(", "H", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0474", "(", "I", ")", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "C57Bl", "/", "6", "n", "=", "3", "-", "6", "mice", ",", "FVB", "n", "=", "3", "-", "5mice", ".", "Rescue", "of", "angiogenic", "sprouting", "by", "Myc", "overexpression", "in", "E11", ".", "5", "C57Bl", "/", "6", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "explant", "tissue", ".", "Representative", "images", "of", "E11", ".", "5", "explants", "from", "C57Bl", "/", "6", "embryos", "taken", "from", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "littermates", "with", "(", "MycOE", "/", "Cre", "+", ")", "and", "without", "(", "MycOE", "/", "Cre", "-", ")", "endothelial", "-", "specific", "overexpression", "of", "Myc", ".", "Endothelial", "cell", "marker", "(", "CD31", ")", "immunostaining", "highlights", "the", "vasculature", "in", "white", ".", "Embryonic", "tissue", "blacked", "out", "to", "highlight", "sprouting", "area", ".", "Rescue", "of", "angiogenic", "sprouting", "by", "Myc", "overexpression", "in", "E11", ".", "5", "C57Bl", "/", "6", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "explant", "tissue", ".", "Quantification", "as", "fold", "-", "increase", "of", "vessel", "sprouting", "area", "compared", "to", "WT", "MycOE", "/", "Cre", "-", ".", "Scale", "bar", ",", "250", "µm", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "=", "4", "-", "11", "explants", ",", "one", "explant", "/", "embryo", ".", "Rescue", "of", "Ec", "proliferation", ".", "Myc", "overexpression", "in", "E11", ".", "5", "C57Bl", "/", "6", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "explant", "tissue", ".", "ERG", "(", "red", ")", ",", "EdU", "(", "green", ")", "and", "double", "-", "positive", "cells", "(", "yellow", ";", "arrows", ")", ".", "Rescue", "of", "Ec", "proliferation", ".", "Quantification", "of", "EdU", "/", "ERG", "double", "positive", "ECs", "normalized", "to", "total", "ECs", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "=", "3", "-", "7", "explants", ",", "one", "explant", "/", "embryo", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunoblot for Myc on lung lysates from wiltype (WT) and Vegfr2Y1212F /Y1212F FVB mice tail-vein injected with PBS or VEGFA followed by circulation for time points indicated. Each lane represents one individual mouse. Quantification of Myc/Actin expressed as Fold change to PBS. Min, minutes of stimulation. Error bars: SD; 2-way ANOVA p=0.0058; unpaired T test, *p < 0.05, ** p <0.01. n=3 experiments.Myc protein expression. C. Myc and Actin immunoblotting on lysates of lung isolated ECs from untreated wildtype (WT) and mutant (VEGFR2 Y1212F) C57Bl/6 and FVB mice. D. Quantification of Myc/Actin expressed as Arbitrary unit. Each lane (C) and each dot (D) represent one individual mouse. 2-way ANOVA p <0.0001; unpaired T test, ** p <0.01. n=5-7.Baseline transcriptional level of Myc from lung isolated ECs from untreated wildtype (WT) and mutant (VEGFR2 Y1212F) C57Bl/6 and FVB mice. Each dot represents one individual mouse. 2-way ANOVA p=0.0041; Sidak's multiple comparison test, * p <0.05. n=4-5.Proliferation of C57Bl/6 and FVB iECs. CD31 (white), ERG (red), EdU (green) and double-positive cells (yellow) in C57Bl/6 (F) and FVB (G) iECs. EdU signal was masked with ERG signal.Proliferation of C57Bl/6 and FVB iECs. EdU incorporation in ERG-positive ECs normalized to total ERG-positive ECs. Each dot represents 2 fields/well, one well/mouse. Scale bar, 100 µm. Error bars: SD; 2-way ANOVA p =0.0843 (H), p=0.0474 (I); unpaired T test, *p < 0.05; **p < 0.01. C57Bl/6 n=3-6 mice, FVB n=3-5mice.Rescue of angiogenic sprouting by Myc overexpression in E11.5 C57Bl/6 Vegfr2Y1212F /Y1212F explant tissue. Representative images of E11.5 explants from C57Bl/6 embryos taken from wildtype (WT) and Vegfr2Y1212F /Y1212F littermates with (MycOE/Cre +) and without (MycOE/Cre-) endothelial-specific overexpression of Myc. Endothelial cell marker (CD31) immunostaining highlights the vasculature in white. Embryonic tissue blacked out to highlight sprouting area.Rescue of angiogenic sprouting by Myc overexpression in E11.5 C57Bl/6 Vegfr2Y1212F /Y1212F explant tissue. Quantification as fold-increase of vessel sprouting area compared to WT MycOE/Cre -. Scale bar, 250 µm. Error bars: SD; unpaired T test, ** p <0.01, **** p <0.0001. n=4-11 explants, one explant/embryo.Rescue of Ec proliferation. Myc overexpression in E11.5 C57Bl/6 Vegfr2Y1212F /Y1212F explant tissue. ERG (red), EdU (green) and double-positive cells (yellow; arrows).Rescue of Ec proliferation. Quantification of EdU/ERG double positive ECs normalized to total ECs. Scale bar, 50 µm. Error bars: SD; unpaired T test, *** p <0.001, **** p <0.0001. n=3-7 explants, one explant/embryo."}
{"words": ["Figure", "5GSEAs", "showing", "upregulation", "of", "genes", "belonging", "to", "the", "K", "-", "Ras", ",", "Angiogenesis", "and", "mTORC1", "gene", "sets", "in", "(", "WT", ")", "compared", "to", "VEGFR2", "Y1212F", "isolated", "ECs", ".", "K", "-", "Ras", "and", "Angiogenesis", "gene", "sets", "derived", "from", "C57Bl", "/", "6", "iECs", "kept", "in", "basal", "condition", ";", "mTORC1", "gene", "set", "derived", "from", "C57Bl", "/", "6", "iECs", "treated", "with", "VEGFA", "for", "3h", ".", "See", "Supplementary", "Table", "2", ".", "Enrichment", "score", "(", "ES", ")", ",", "normalized", "ES", "(", "NES", ")", "are", "shown", ".", "P", "-", "values", "<", "0", ".", "05", "were", "regarded", "as", "significant", ".", "Heat", "maps", "displaying", "gene", "regulation", "in", "gene", "sets", "shown", "in", "A", ".", "The", "color", "in", "the", "heatmap", "shows", "the", "gene", "expression", "value", ",", "expressed", "as", "a", "z", "-", "score", "across", "animals", ".", "Red", "color", "represents", "relative", "higher", "expression", "and", "blue", "color", "represents", "relative", "lower", "expression", "value", ".", "The", "z", "-", "score", "is", "calculated", "by", "(", "x", "-", "x", "'", ")", "/", "s", "where", "x", "is", "individual", "gene", "expression", ",", "x", "'", "is", "the", "mean", "of", "the", "gene", "expression", "across", "samples", "and", "s", "is", "standard", "deviation", "of", "the", "gene", "expression", "across", "samples", ".", "Myc", "-", "regulated", "gene", "expression", "downstream", "of", "VEGFR2", "pY1212", ".", "Quantitative", "PCR", "analysis", "of", "a", "set", "of", "known", "Myc", "-", "regulated", "transcripts", "in", "C57Bl", "/", "6", "(", "C", ",", "D", ")", "and", "FVB", "(", "E", ",", "F", ")", "adult", "lungs", "at", "basal", "(", "C", ",", "E", ")", "and", "at", "1", "hour", "after", "tail", "-", "vein", "administration", "of", "VEGFA", "(", "D", ",", "F", ")", ".", "FASN", ",", "fatty", "acid", "synthase", ";", "Ldha", "and", "-", "b", ",", "Lactate", "dehydrogenase", "A", "and", "B", ";", "Acod1", ",", "Aconitate", "Decarboxylase", "1", ";", "Ppat", ",", "Amidophosphoribosyltransferase", ";", "Pde4d", ",", "cAMP", "-", "specific", "3", "'", ",", "5", "'", "-", "cyclic", "phosphodiesterase", "4D", ";", "Prkaca", ",", "cAMP", "-", "dependent", "protein", "kinase", "catalytic", "subunit", "alpha", ".", "Error", "bars", ":", "SD", ";", "2", "-", "way", "ANOVA", "between", "WT", "and", "Vegfr2Y1212F", "/", "Y1212F", "p", "=", "0", ".", "0453", "(", "C", ")", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "D", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0018", "(", "E", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "09", "(", "F", ")", ";", "unpaired", "T", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "C57Bl", "/", "6", "n", "=", "8", "-", "11", "mice", ",", "FVB", "n", "=", "9", "-", "14", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5GSEAs showing upregulation of genes belonging to the K-Ras, Angiogenesis and mTORC1 gene sets in (WT) compared to VEGFR2 Y1212F isolated ECs. K-Ras and Angiogenesis gene sets derived from C57Bl/6 iECs kept in basal condition; mTORC1 gene set derived from C57Bl/6 iECs treated with VEGFA for 3h. See Supplementary Table 2. Enrichment score (ES), normalized ES (NES) are shown. P-values <0.05 were regarded as significant. Heat maps displaying gene regulation in gene sets shown in A. The color in the heatmap shows the gene expression value, expressed as a z-score across animals. Red color represents relative higher expression and blue color represents relative lower expression value. The z-score is calculated by (x-x')/s where x is individual gene expression, x' is the mean of the gene expression across samples and s is standard deviation of the gene expression across samples.Myc-regulated gene expression downstream of VEGFR2 pY1212. Quantitative PCR analysis of a set of known Myc-regulated transcripts in C57Bl/6 (C, D) and FVB (E, F) adult lungs at basal (C, E) and at 1 hour after tail-vein administration of VEGFA (D, F). FASN, fatty acid synthase; Ldha and -b, Lactate dehydrogenase A and B; Acod1, Aconitate Decarboxylase 1; Ppat, Amidophosphoribosyltransferase; Pde4d, cAMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase 4D; Prkaca, cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha. Error bars: SD; 2-way ANOVA between WT and Vegfr2Y1212F /Y1212F p=0.0453 (C), p < 0.0001 (D), p=0.0018 (E), p=0.09 (F); unpaired T test, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. C57Bl/6 n=8-11 mice, FVB n=9-14 mice."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "FGF21SS", "and", "FGF21", "improve", "insulin", "resistance", "by", "countering", "the", "inflammation", "in", "3T3", "-", "L1", "adipocytes", ".", "Cells", "were", "cultured", "in", "RAW", "-", "CM", "to", "induce", "inflammation", "and", "insulin", "resistance", ",", "while", "vehicle", ",", "FGF21", "or", "FGF21SS", "were", "added", "simultaneously", ".", "The", "insulin", "sensitivity", "was", "indicated", "by", "insulin", "-", "induced", "AKT", "phosphorylation", "using", "western", "blotting", "analysis", ".", "Error", "bars", "show", "the", "SEM", "of", "four", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "vs", "RAW", "-", "CM", "treated", "only", "group", ".", "Anti", "-", "diabetic", "effect", "evaluation", "in", "ob", "/", "ob", "mice", ".", "Mice", "were", "injected", "subcutaneously", "with", "vehicle", ",", "FGF21", "or", "FGF21SS", "at", "indicated", "doses", "every", "day", ".", "Body", "weight", "(", "B", ")", "was", "measured", "Error", "bars", "show", "the", "SEM", "of", "ten", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "vs", "vehicle", ".", "Anti", "-", "diabetic", "effect", "evaluation", "in", "ob", "/", "ob", "mice", ".", "Mice", "were", "injected", "subcutaneously", "with", "vehicle", ",", "FGF21", "or", "FGF21SS", "at", "indicated", "doses", "every", "day", ".", "plasma", "glucose", "(", "D", ")", "was", "measured", "every", "day", ".", "Plasma", "insulin", "(", "C", ")", "was", "analyzed", "at", "day", "7", "using", "insulin", "ELISA", "kit", ".", "Error", "bars", "show", "the", "SEM", "of", "ten", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "vs", "vehicle", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. FGF21SS and FGF21 improve insulin resistance by countering the inflammation in 3T3-L1 adipocytes. Cells were cultured in RAW-CM to induce inflammation and insulin resistance, while vehicle, FGF21 or FGF21SS were added simultaneously. The insulin sensitivity was indicated by insulin-induced AKT phosphorylation using western blotting analysis. Error bars show the SEM of four independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01 (Student's t-test) vs RAW-CM treated only group.Anti-diabetic effect evaluation in ob/ob mice. Mice were injected subcutaneously with vehicle, FGF21 or FGF21SS at indicated doses every day. Body weight (B) was measured Error bars show the SEM of ten independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 (Student's t-test) vs vehicle.Anti-diabetic effect evaluation in ob/ob mice. Mice were injected subcutaneously with vehicle, FGF21 or FGF21SS at indicated doses every day. plasma glucose (D) was measured every day. Plasma insulin (C) was analyzed at day 7 using insulin ELISA kit. Error bars show the SEM of ten independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 (Student's t-test) vs vehicle."}
{"words": ["Figure", "1Coomassie", "Blue", "staining", "of", "recombinant", "human", "DDX5", "purified", "in", "bacteria", ".", "M", "denotes", "the", "molecular", "mass", "markers", "in", "kDa", ".", "R", "-", "loop", "unwinding", "assay", "in", "presence", "of", "increasing", "DDX5", ".", "The", "top", "panel", "shows", "a", "typical", "image", "obtained", "after", "the", "assay", ".", "The", "bar", "graph", "(", "bottom", ")", "shows", "the", "quantification", ".", "The", "average", "is", "expressed", "as", "percentage", "unwinding", ",", "and", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", ",", "n", "=", "4", ".", "S9", ".", "6", "signal", "in", "the", "nucleoplasm", "of", "U2OS", "cells", ".", "An", "average", "from", "3", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ".", "In", "total", ",", "~", "90", "images", "for", "each", "condition", "(", "10", "images", "/", "slide", "and", "9", "slides", "for", "each", "condition", ")", "were", "taken", "and", "two", "cells", "per", "image", "were", "quantified", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "siCTL", ",", "or", "siDDX5", "were", "subjected", "to", "DRIP", "-", "qPCR", "analysis", "with", "anti", "-", "IgG", ",", "and", "anti", "-", "S9", ".", "6", "antibodies", "with", "or", "without", "RNaseH", "treatment", ".", "The", "gene", "location", "and", "genomic", "qPCR", "amplification", "region", "are", "shown", "at", "the", "top", "of", "each", "panel", ".", "B", ",", "E", ",", "H", ",", "S", "and", "X", "denote", "the", "location", "of", "the", "BsrGI", ",", "EcoRI", ",", "HindIII", ",", "SspI", ",", "and", "XbaI", ".", "The", "identified", "R", "-", "loop", "peaks", "were", "extracted", "from", "the", "R", "-", "loop", "database", "(", "R", "-", "loop", "DB", ")", "for", "each", "region", ".", "The", "bar", "graphs", "are", "the", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Coomassie Blue staining of recombinant human DDX5 purified in bacteria. M denotes the molecular mass markers in kDa.R-loop unwinding assay in presence of increasing DDX5. The top panel shows a typical image obtained after the assay. The bar graph (bottom) shows the quantification. The average is expressed as percentage unwinding, and standard error of the mean (S.E.M.), n=4.S9.6 signal in the nucleoplasm of U2OS cells. An average from 3 independent experiments performed in triplicate. In total, ~90 images for each condition (10 images/slide and 9 slides for each condition) were taken and two cells per image were quantified. Statistical significance was assessed using one-way ANOVA t-test. *: p < 0.05; ****: p < 0.0001.U2OS cells transfected with siCTL, or siDDX5 were subjected to DRIP-qPCR analysis with anti-IgG, and anti-S9.6 antibodies with or without RNaseH treatment. The gene location and genomic qPCR amplification region are shown at the top of each panel. B, E, H, S and X denote the location of the BsrGI, EcoRI, HindIII, SspI, and XbaI. The identified R-loop peaks were extracted from the R-loop database (R-loop DB) for each region. The bar graphs are the average and S.E.M. from 3 independent experiments. Statistical significance was assessed using t-test. *: p < 0.05."}
{"words": ["Figure", "2U2OS", "cells", "were", "lysed", "and", "the", "lysates", "were", "incubated", "with", "anti", "-", "PRMT5", "antibody", "or", "immunoglobulin", "G", "(", "IgG", ")", "as", "control", "followed", "by", "protein", "A", "Sepharose", "bead", "addition", ".", "The", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "proteins", "or", "whole", "cell", "extract", "(", "WCE", ")", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "Western", "blotted", "(", "WB", ")", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Same", "as", "panel", "(", "A", ")", "except", "anti", "-", "DDX5", "antibody", "was", "used", "instead", "of", "anti", "-", "PRMT5", "antibody", "for", "immunoprecipitation", ".", "The", "mass", "spectrum", "of", "R502", "monomethylation", "from", "Flag", "-", "DDX5", "expressed", "in", "U2OS", ".", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "DDX5", "were", "lysed", "and", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "antibodies", ".", "The", "bound", "proteins", "were", "along", "with", "WCE", "from", "untransfected", "(", "-", ")", "and", "Flag", "-", "DDX5", "(", "+", ")", "transfected", "cells", "were", "Western", "blotted", "with", "anti", "-", "FLAG", ",", "anti", "-", "methylarginine", "antibodies", "(", "MeR", ")", ".", "The", "knockdown", "using", "siRNAs", "of", "the", "indicated", "gene", "in", "U2OS", "cells", "was", "confirmed", "by", "Western", "blottingThe", "knockdown", "using", "siRNAs", "of", "the", "indicated", "gene", "in", "U2OS", "cells", "were", "analyzed", "by", "immunofluorescence", "with", "S9", ".", "6", "and", "anti", "-", "nucleolin", "antibodies", ".", "A", "typical", "image", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2U2OS cells were lysed and the lysates were incubated with anti-PRMT5 antibody or immunoglobulin G (IgG) as control followed by protein A Sepharose bead addition. The immunoprecipitated (IP) proteins or whole cell extract (WCE) were separated by SDS-PAGE and Western blotted (WB) with the indicated antibodies. Same as panel (A) except anti-DDX5 antibody was used instead of anti-PRMT5 antibody for immunoprecipitation.The mass spectrum of R502 monomethylation from Flag-DDX5 expressed in U2OS.HEK293 cells transfected with Flag-DDX5 were lysed and immunoprecipitated with anti-Flag antibodies. The bound proteins were along with WCE from untransfected (-) and Flag-DDX5 (+) transfected cells were Western blotted with anti-FLAG, anti-methylarginine antibodies (MeR).The knockdown using siRNAs of the indicated gene in U2OS cells was confirmed by Western blottingThe knockdown using siRNAs of the indicated gene in U2OS cells were analyzed by immunofluorescence with S9.6 and anti-nucleolin antibodies. A typical image is shown."}
{"words": ["Figure", "3Western", "blotting", "of", "PRMT5", "and", "DDX5", "knockdowns", ".", "Representative", "images", "of", "S9", ".", "6", "staining", "in", "siCTL", ",", "siDDX5", ",", "or", "siPRMT5", "knockdown", "at", "transcription", "on", "(", "TA", "-", "KR", ")", "or", "off", "(", "TetR", "-", "KR", ")", "genomic", "loci", "in", "U2OS", "TRE", "cells", ".", "The", "nuclei", "are", "visualized", "by", "DAPI", ".", "Quantification", "of", "the", "S9", ".", "6", "foci", "intensity", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "and", "50", "cells", "were", "analyzed", "in", "each", "experiment", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "of", "S9", ".", "6", "foci", "intensity", "quantification", "with", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "The", "statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", "U", "-", "test", ")", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Western blotting of PRMT5 and DDX5 knockdowns.Representative images of S9.6 staining in siCTL, siDDX5, or siPRMT5 knockdown at transcription on (TA-KR) or off (TetR-KR) genomic loci in U2OS TRE cells. The nuclei are visualized by DAPI.Quantification of the S9.6 foci intensity in the indicated conditions. Three independent experiments were performed and 50 cells were analyzed in each experiment. Error bars represent mean of S9.6 foci intensity quantification with s.e.m. The statistical analysis was performed by two-tailed Student's t-test (Mann-Whitney test U-test). ****, p < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "4U2OS", "cells", "transfected", "with", "siCTL", "or", "siPRMT5", "were", "subjected", "to", "DRIP", "-", "qPCR", "analysis", ".", "The", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "3", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Western", "blotting", "of", "whole", "cell", "extracts", "from", "siCTL", ",", "siPRMT5", ",", "siDDX5", "or", "siDDX5", "/", "siPRMT5", "transfected", "cells", ".", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "siCTL", ",", "siPRMT5", ",", "siDDX5", "or", "siDDX5", "/", "siPRMT5", "were", "subjected", "to", "DRIP", "-", "qPCR", "analysis", ".", "The", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "3", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4U2OS cells transfected with siCTL or siPRMT5 were subjected to DRIP-qPCR analysis. The average and S.E.M. from 3 independent experiments is shown. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; and **: p < 0.01.Western blotting of whole cell extracts from siCTL, siPRMT5, siDDX5 or siDDX5/ siPRMT5 transfected cells.U2OS cells transfected with siCTL, siPRMT5, siDDX5 or siDDX5/ siPRMT5 were subjected to DRIP-qPCR analysis. The average and S.E.M. from 3 independent experiments is shown. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; and **: p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "5U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "DDX5", "expression", "vector", "in", "the", "presence", "of", "siCTL", "or", "siPRMT5", ".", "Lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "IgG", "or", "anti", "-", "Flag", "antibodies", "as", "indicated", ".", "The", "WCE", "and", "the", "bound", "proteins", "were", "Western", "blotted", "with", "anti", "-", "symmetrical", "dimethylarginine", "antibody", "or", "anti", "-", "Flag", "antibodies", ".", "Coomassie", "blue", "(", "left", "panel", ")", "and", "in", "vitro", "methylation", "assay", "(", "right", "panel", ")", "of", "indicated", "GST", "-", "DDX5", "fragments", "and", "the", "GST", "-", "DDX5", "-", "RK", "mutant", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "with", "S9", ".", "6", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "tagged", "DDX5", ",", "DDX5", "-", "RK", "or", "DDX5", "-", "XD", "(", "helicase", "dead", ")", ".", "Nuclear", "S9", ".", "6", "signal", "was", "counted", "in", "both", "Flag", "-", "negative", "and", "Flag", "-", "positive", "cells", ".", "The", "Flag", "-", "negative", "cells", "were", "considered", "as", "untransfected", "cells", ".", "The", "graphs", "shown", "represent", "the", "quantification", "with", "the", "S", ".", "E", ".", "M", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "with", "S9", ".", "6", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "siCTL", "or", "siDDX5", "-", "1", "and", "Flag", "-", "tagged", "DDX5", "(", "+", "WT", ")", "or", "DDX5", "-", "RK", "(", "+", "RK", ")", "as", "indicated", ".", "The", "graphs", "show", "the", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "siCTL", ",", "or", "siDDX5", ".", "The", "next", "day", ",", "the", "cells", "that", "received", "siDDX5", "were", "subsequently", "transfected", "with", "empty", "pcDNA3", "vector", "(", "-", ")", ",", "expression", "vectors", "encoding", "Flag", "-", "DDX5", "(", "WT", ")", ",", "or", "Flag", "-", "DDX5", "-", "RK", "(", "RK", ")", ".", "Forty", "eight", "hours", "later", ",", "all", "the", "cells", "were", "subjected", "to", "DRIP", "-", "qPCR", "analysis", ".", "The", "average", "with", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "3", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "n", ".", "s", ".", ":", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5U2OS cells were transfected with a Flag-DDX5 expression vector in the presence of siCTL or siPRMT5. Lysates were immunoprecipitated with IgG or anti-Flag antibodies as indicated. The WCE and the bound proteins were Western blotted with anti-symmetrical dimethylarginine antibody or anti-Flag antibodies.Coomassie blue (left panel) and in vitro methylation assay (right panel) of indicated GST-DDX5 fragments and the GST-DDX5-RK mutant.Immunofluorescence analysis with S9.6 and anti-Flag antibodies of U2OS cells transfected with Flag-tagged DDX5, DDX5-RK or DDX5-XD (helicase dead). Nuclear S9.6 signal was counted in both Flag-negative and Flag-positive cells. The Flag-negative cells were considered as untransfected cells. The graphs shown represent the quantification with the S.E.M from 3 independent experiments. Statistical significance was assessed using one-way ANOVA t-test. ****, p < 0.0001.Immunofluorescence analysis with S9.6 and anti-Flag antibodies of U2OS cells transfected with siCTL or siDDX5-1 and Flag-tagged DDX5 (+WT) or DDX5-RK (+RK) as indicated. The graphs show the average and S.E.M. from three independent experiments. Statistical significance was assessed using one-way ANOVA t-test. ****, p < 0.0001.HEK293 cells were transfected with siCTL, or siDDX5. The next day, the cells that received siDDX5 were subsequently transfected with empty pcDNA3 vector (-), expression vectors encoding Flag-DDX5 (WT), or Flag-DDX5-RK (RK). Forty eight hours later, all the cells were subjected to DRIP-qPCR analysis. The average with the S.E.M. from 3 independent experiments is shown. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; **: p < 0.01 and n.s.: not significant."}
{"words": ["Figure", "6HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "pcDNA3", "vector", "(", "-", ")", "or", "Flag", "-", "DDX5", "(", "+", ")", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "WCE", ")", "and", "anti", "-", "Flag", "immunoprecipitations", "(", "IP", ")", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Flag", "and", "anti", "-", "XRN2", "antibodies", ".", "Untransfected", "U2OS", "cells", "were", "lyzed", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "control", "immunoglobulin", "G", "(", "IgG", ")", "or", "anti", "-", "XRN2", "antibodies", ".", "The", "bound", "proteins", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "DDX5", "or", "anti", "-", "XRN2", "antibodies", ".", "The", "migration", "of", "DDX5", "and", "XRN2", "is", "depicted", "with", "an", "arrow", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "pcDNA3", "vector", "(", "pcDNA3", ")", "or", "expression", "vectors", "encoding", "Flag", "-", "DDX5", "WT", "(", "1", "-", "614", ")", "or", "truncated", "Flag", "-", "DDX5", "proteins", "(", "60", "-", "614", ";", "1", "-", "554", ";", "1", "-", "435", ")", ".", "WCE", "of", "the", "transfected", "cells", "(", "left", "panel", ")", "were", "Western", "blotted", "with", "anti", "-", "Flag", "and", "anti", "-", "XRN2", "antibodies", "to", "confirm", "equivalent", "expression", ".", "The", "transfected", "cells", "were", "lysed", "and", "anti", "-", "Flag", "immunoprecipitations", "(", "right", "panel", ")", "performed", "for", "the", "presence", "of", "co", "-", "immunoprecipitating", "endogenous", "XRN2", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "XRN2", "antibodies", ".", "M", "denotes", "molecular", "mass", "markers", "in", "kDa", ".", "Untransfected", "and", "U2OS", "stably", "expressing", "Flag", "-", "DDX5", "WT", "or", "Flag", "-", "DDX5", "-", "RK", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "The", "WCE", "and", "the", "anti", "-", "Flag", "immunoprecipitated", "proteins", "were", "Western", "blotted", "with", "anti", "-", "monomethylarginine", "(", "MeR", ")", ",", "anti", "-", "Flag", "and", "anti", "-", "XRN2", "antibodies", ",", "respectively", ".", "M", "denotes", "molecular", "mass", "markers", "in", "kDa", ".", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "siCTL", ",", "siDDX5", ",", "or", "siXRN2", "were", "subjected", "to", "DRIP", "-", "qPCR", "analysis", "with", "anti", "-", "IgG", ",", "and", "anti", "-", "S9", ".", "6", "antibodies", "with", "or", "without", "RNaseH", "treatment", ".", "The", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "3", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6HEK293 cells were transfected with empty pcDNA3 vector (-) or Flag-DDX5 (+). Whole cell lysates (WCE) and anti-Flag immunoprecipitations (IP) were immunoblotted with anti-Flag and anti-XRN2 antibodies.Untransfected U2OS cells were lyzed and subjected to immunoprecipitation with control immunoglobulin G (IgG) or anti-XRN2 antibodies. The bound proteins were separated by SDS-PAGE followed by Western blotting with anti-DDX5 or anti-XRN2 antibodies. The migration of DDX5 and XRN2 is depicted with an arrow.U2OS cells were transfected with empty pcDNA3 vector (pcDNA3) or expression vectors encoding Flag-DDX5 WT (1-614) or truncated Flag-DDX5 proteins (60-614; 1-554; 1-435). WCE of the transfected cells (left panel) were Western blotted with anti-Flag and anti-XRN2 antibodies to confirm equivalent expression. The transfected cells were lysed and anti-Flag immunoprecipitations (right panel) performed for the presence of co-immunoprecipitating endogenous XRN2 by Western blotting with anti-XRN2 antibodies. M denotes molecular mass markers in kDa.Untransfected and U2OS stably expressing Flag-DDX5 WT or Flag-DDX5-RK were subjected to immunoprecipitation with anti-Flag antibody. The WCE and the anti-Flag immunoprecipitated proteins were Western blotted with anti-monomethylarginine (MeR), anti-Flag and anti-XRN2 antibodies, respectively. M denotes molecular mass markers in kDa.U2OS cells transfected with siCTL, siDDX5, or siXRN2 were subjected to DRIP-qPCR analysis with anti-IgG, and anti-S9.6 antibodies with or without RNaseH treatment. The average and S.E.M. from 3 independent experiments is shown. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; **: p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "7HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "siCTL", ",", "siDDX5", ",", "or", "siXRN2", ".", "The", "gene", "location", "and", "qPCR", "amplification", "region", "are", "shown", "at", "the", "top", "of", "each", "panel", ".", "The", "identified", "R", "-", "loop", "peaks", "were", "extracted", "from", "R", "-", "loop", "database", "(", "R", "-", "loop", "DB", ")", "for", "each", "gene", "region", ".", "R", "-", "loop", ":", "DRIP", "denotes", "anti", "-", "S9", ".", "6", "DRIP", "-", "qPCR", "and", "Pol", "II", "ChIP", "denotes", "RNA", "pol", "II", "ChIP", ".", "The", "bar", "graphs", "show", "the", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "B", ",", "E", ",", "H", ",", "S", "and", "X", "denote", "the", "location", "of", "the", "BsrGI", ",", "EcoRI", ",", "HindIII", ",", "SspI", ",", "and", "XbaI", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7HEK293 cells were transfected with siCTL, siDDX5, or siXRN2. The gene location and qPCR amplification region are shown at the top of each panel. The identified R-loop peaks were extracted from R-loop database (R-loop DB) for each gene region. R-loop: DRIP denotes anti-S9.6 DRIP-qPCR and Pol II ChIP denotes RNA pol II ChIP. The bar graphs show the average and S.E.M. from at least three independent experiments. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; **: p < 0.01 and ****: p < 0.0001. B, E, H, S and X denote the location of the BsrGI, EcoRI, HindIII, SspI, and XbaI."}
{"words": ["Figure", "8Schematic", "representation", "of", "the", "β", "-", "actin", "locus", "and", "the", "location", "of", "the", "genomic", "PCR", "primers", "used", "for", "ChIP", "-", "qPCR", "and", "DRIP", "-", "qPCR", ".", "Prom", "(", "promoter", ")", ",", "RB", "(", "region", "B", ")", ",", "poly", "(", "A", ")", "and", "RD", "(", "region", "D", ")", "indicate", "the", "regions", "analyzed", "by", "qPCR", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "siCTL", "or", "siDDX5", "and", "XRN2", "ChIP", "assays", "were", "performed", ".", "The", "XRN2", "ChIP", "signal", "was", "normalized", "to", "the", "Pol", "II", "ChIP", "signal", ".", "WCE", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "DDX5", "and", "α", "-", "tubulin", "antibodies", ",", "the", "latter", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "graphs", "show", "the", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "siCTL", ",", "siDDX5", "or", "siXRN2", ".", "The", "cells", "were", "subjected", "to", "Western", "blotting", ",", "RNA", "Pol", "II", "ChIP", "and", "DRIP", "analysis", "of", "β", "-", "actin", "gene", ".", "The", "graphs", "show", "the", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "siCTL", "or", "siDDX5", ".", "The", "next", "day", ",", "the", "cells", "that", "received", "siDDX5", "were", "subsequently", "transfected", "with", "empty", "pcDNA3", "vector", "(", "-", ")", ",", "expression", "vectors", "encoding", "Flag", "-", "DDX5", "(", "WT", ")", ",", "or", "Flag", "-", "DDX5", "-", "RK", "(", "RK", ")", ".", "The", "cells", "were", "subjected", "to", "Western", "blotting", "to", "visualize", "Flag", "-", "DDX", "WT", "and", "RK", "expression", ".", "Pol", "II", "ChIP", "and", "DRIP", "analysis", "of", "β", "-", "actin", "gene", "were", "performed", ".", "For", "the", "ChIP", "analysis", ",", "the", "Y", "-", "axis", "shows", "the", "signal", "-", "to", "-", "noise", "ratio", "of", "RNA", "Pol", "II", "IP", "relative", "to", "control", "IgG", "IP", ".", "The", "graphs", "show", "the", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "siCTL", "or", "siPRMT5", ".", "The", "cells", "were", "subjected", "to", "Western", "blotting", ",", "RNA", "Pol", "II", "ChIP", "and", "DRIP", "analysis", "of", "β", "-", "actin", "gene", ".", "The", "graphs", "show", "the", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "plasmid", "(", "-", ")", ",", "wild", "type", "Flag", "-", "DDX5", "(", "WT", ")", "or", "its", "RK", "mutant", "(", "RK", ")", "and", "subjected", "to", "western", "blot", "and", "Flag", "-", "DDX5", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "β", "-", "actin", "gene", ".", "The", "graphs", "show", "the", "average", "and", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Schematic representation of the β-actin locus and the location of the genomic PCR primers used for ChIP-qPCR and DRIP-qPCR. Prom (promoter), RB (region B), poly(A) and RD (region D) indicate the regions analyzed by qPCR.HEK293 cells were transfected with siCTL or siDDX5 and XRN2 ChIP assays were performed. The XRN2 ChIP signal was normalized to the Pol II ChIP signal. WCE were immunoblotted with anti-DDX5 and α-tubulin antibodies, the latter was used as a loading control. The graphs show the average and S.E.M. from at least three independent experiments. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; **: p < 0.01.HEK293 cells were transfected with siCTL, siDDX5 or siXRN2. The cells were subjected to Western blotting, RNA Pol II ChIP and DRIP analysis of β-actin gene. The graphs show the average and S.E.M. from at least three independent experiments. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; **: p < 0.01 and ****: p < 0.0001.HEK293 cells were transfected with siCTL or siDDX5. The next day, the cells that received siDDX5 were subsequently transfected with empty pcDNA3 vector (-), expression vectors encoding Flag-DDX5 (WT), or Flag-DDX5-RK (RK). The cells were subjected to Western blotting to visualize Flag-DDX WT and RK expression. Pol II ChIP and DRIP analysis of β-actin gene were performed. For the ChIP analysis, the Y-axis shows the signal-to-noise ratio of RNA Pol II IP relative to control IgG IP. The graphs show the average and S.E.M. from at least three independent experiments. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; **: p < 0.01 and ****: p < 0.0001.HEK293 cells were transfected with siCTL or siPRMT5. The cells were subjected to Western blotting, RNA Pol II ChIP and DRIP analysis of β-actin gene. The graphs show the average and S.E.M. from at least three independent experiments. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; **: p < 0.01.HEK293 cells were transfected with empty plasmid (-), wild type Flag-DDX5 (WT) or its RK mutant (RK) and subjected to western blot and Flag-DDX5 ChIP-qPCR analysis of β-actin gene. The graphs show the average and S.E.M. from at least three independent experiments. Statistical significance was assessed using Student's t-test. *: p < 0.05; **: p < 0.01 and ****: p < 0.0001; n.s. not significant."}
{"words": ["Figure", "1In", "vitro", "niche", "dependency", "of", "HGSOC", "tumor", "cells", ".", "Phase", "-", "contrast", "pictures", "illustrate", "that", "isolated", "ovarian", "cancer", "cells", "rely", "on", "EGF", "supplementation", "for", "growth", ",", "while", "they", "do", "not", "grow", "at", "all", "in", "Wnt3a", "supplemented", "medium", ".", "Also", ",", "inhibition", "of", "BMP", "signaling", "through", "Noggin", "has", "strong", "negative", "effect", "on", "the", "initial", "growth", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "µm", ".", "E", "-", "EGF", ",", "F", "-", "FGF10", ",", "N", "-", "Noggin", ",", "R", "-", "R", "-", "spondin1", ",", "B", "-", "Basic", "medium", ",", "P", "-", "PassageCancer", "organoids", "express", "HGSOC", "markers", "Pax8", "and", "EpCAM", "and", "have", "lost", "the", "cystic", "phenotype", "suggesting", "complete", "breakdown", "of", "epithelial", "polarity", "as", "seen", "on", "confocal", "images", "from", "two", "representative", "organoid", "lines", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "µm", ".", "HE", "staining", "of", "organoids", "and", "respective", "tissue", "confirm", "high", "similarity", "in", "cellular", "structure", "and", "tissue", "organization", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "HGSOC", "organoids", "show", "differential", "response", "to", "carboplatin", "treatment", ",", "confirming", "patient", "-", "specific", "sensitivity", "of", "the", "cultures", ".", "Cell", "viability", "assay", "was", "performed", "after", "5", "days", "of", "treatment", "with", "different", "concentrations", "of", "carboplatin", "on", "mature", "organoids", "from", "three", "different", "donors", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "technical", "triplicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1In vitro niche dependency of HGSOC tumor cells. Phase-contrast pictures illustrate that isolated ovarian cancer cells rely on EGF supplementation for growth, while they do not grow at all in Wnt3a supplemented medium. Also, inhibition of BMP signaling through Noggin has strong negative effect on the initial growth. Scale bar: 500 µm. E - EGF, F - FGF10, N -Noggin, R - R-spondin1, B - Basic medium, P - PassageCancer organoids express HGSOC markers Pax8 and EpCAM and have lost the cystic phenotype suggesting complete breakdown of epithelial polarity as seen on confocal images from two representative organoid lines. Scale bar: 20 µm.HE staining of organoids and respective tissue confirm high similarity in cellular structure and tissue organization. Scale bar: 100 µm.HGSOC organoids show differential response to carboplatin treatment, confirming patient-specific sensitivity of the cultures. Cell viability assay was performed after 5 days of treatment with different concentrations of carboplatin on mature organoids from three different donors. Data represent mean ±SD of technical triplicates."}
{"words": ["Figure", "2Overview", "of", "mutations", "found", "in", "organoid", "cultures", "and", "matching", "tumor", "tissue", "obtained", "by", "targeted", "sequencing", "of", "121", "HGSOC", "related", "genes", "confirms", "almost", "identical", "profile", "between", "parental", "tissue", "and", "in", "vitro", "long", "-", "term", "organoid", "culture", ".", "Color", "code", "indicates", "type", "of", "mutations", "which", "were", "detected", ".", "Representative", "western", "blot", "showing", "loss", "or", "overexpression", "of", "p53", "in", "individual", "organoid", "lines", ".", "Strong", "nuclear", "p53", "signal", "in", "immunostainings", "of", "HGSOC", "organoids", "is", "indicative", "of", "a", "gain", "-", "of", "-", "function", "TP53", "mutation", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", "(", "Tissue", ")", "and", "50", "µm", "(", "Organoid", ")", ".", "Box", "plots", "depicting", "overall", "constant", "level", "in", "normalized", "expression", "of", "major", "HGSOC", "marker", "genes", "between", "organoids", "and", "parental", "tissue", ".", "Data", "represent", "the", "median", ",", "quartiles", ",", "maximum", ",", "and", "minimum", "of", "the", "normalized", "expression", "from", "8", "different", "donors", ".", "Heat", "map", "of", "differentially", "expressed", "genes", "between", "cancer", "and", "healthy", "tissue", "/", "organoids", "reveals", "upregulation", "of", "several", "HGSOC", "biomarkers", "and", "reduction", "of", "FT", "differentiation", "markers", "in", "the", "cancer", "samples", ".", "Differential", "expression", "determined", "by", "single", "-", "color", "microarray", "for", "8", "different", "patient", "samples", "was", "significant", "for", "all", "genes", "with", "p", "<", "0", ".", "05", "except", "for", "OVGP1", "and", "TOP2A", "in", "organoids", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Overview of mutations found in organoid cultures and matching tumor tissue obtained by targeted sequencing of 121 HGSOC related genes confirms almost identical profile between parental tissue and in vitro long-term organoid culture. Color code indicates type of mutations which were detected.Representative western blot showing loss or overexpression of p53 in individual organoid lines.Strong nuclear p53 signal in immunostainings of HGSOC organoids is indicative of a gain-of-function TP53 mutation. Scale bars: 100 µm (Tissue) and 50 µm (Organoid).Box plots depicting overall constant level in normalized expression of major HGSOC marker genes between organoids and parental tissue. Data represent the median, quartiles, maximum, and minimum of the normalized expression from 8 different donors.Heat map of differentially expressed genes between cancer and healthy tissue/organoids reveals upregulation of several HGSOC biomarkers and reduction of FT differentiation markers in the cancer samples. Differential expression determined by single-color microarray for 8 different patient samples was significant for all genes with p < 0.05 except for OVGP1 and TOP2A in organoids."}
{"words": ["Figure", "3Experimental", "approach", "for", "genetic", "manipulation", "of", "FT", "epithelial", "cells", "(", "FTECs", ")", ".", "FTECs", "were", "sequentially", "transduced", "in", "2D", "culture", "with", "replication", "-", "deficient", "viruses", "containing", "specific", "shRNAs", "and", "different", "selection", "markers", ".", "After", "sorting", "cells", "were", "seeded", "in", "Matrigel", "for", "organoid", "formation", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "cm", "(", "tissue", ")", ",", "200", "µm", "(", "2D", "culture", ")", "and", "500", "µm", "(", "3D", "culture", ")", ".", "Confirmation", "of", "robust", "knockdowns", "of", "p53", ",", "PTEN", "and", "RB", "in", "FT", "organoids", "on", "RNA", "and", "protein", "level", ".", "Relative", "mRNA", "levels", "were", "normalized", "to", "the", "WT", "mRNA", "level", "and", "are", "given", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "different", "donors", ".", "A", "representative", "western", "blot", "from", "one", "donor", "is", "depicted", ".", "RNA", "as", "well", "as", "protein", "samples", "were", "taken", "at", "passage", "1", "or", "2", "of", "each", "organoid", "line", ".", "KD", "-", "Knockdown", ",", "Vec", "Ctrl", "-", "Vector", "Control", ",", "WT", "-", "Wild", "typeCyclin", "E1", "overexpression", "as", "a", "downstream", "effect", "of", "RB", "knockdown", "was", "confirmed", "by", "western", "blot", "analysis", ".", "Confocal", "images", "of", "triple", "KD", "organoids", "reveal", "increased", "DNA", "damage", "(", "yH2AX", ",", "marked", "by", "asterisks", ")", ",", "atypic", "nuclei", "(", "DRAQ5", ")", "and", "loss", "of", "apicobasal", "polarity", ".", "Scale", "bar", ":", "20µm", ".", "Confirmation", "of", "robust", "knockdowns", "of", "p53", ",", "PTEN", "and", "RB", "in", "FT", "organoids", "on", "RNA", "and", "protein", "level", ".", "Relative", "mRNA", "levels", "were", "normalized", "to", "the", "WT", "mRNA", "level", "and", "are", "given", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "different", "donors", ".", "A", "representative", "western", "blot", "from", "one", "donor", "is", "depicted", ".", "RNA", "as", "well", "as", "protein", "samples", "were", "taken", "at", "passage", "1", "or", "2", "of", "each", "organoid", "line", ".", "KD", "-", "Knockdown", ",", "Vec", "Ctrl", "-", "Vector", "Control", ",", "WT", "-", "Wild", "type", "Cyclin", "E1", "overexpression", "as", "a", "downstream", "effect", "of", "RB", "knockdown", "was", "confirmed", "by", "western", "blot", "analysis", ".", "Presence", "of", "ciliated", "cells", "(", "arrowheads", ")", ",", "as", "revealed", "by", "immunostaining", "against", "detyrosinated", "Tubulin", "(", "dtyrTub", ")", "in", "triple", "KD", "organoids", ",", "proves", "capacity", "for", "terminal", "differentiation", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Experimental approach for genetic manipulation of FT epithelial cells (FTECs). FTECs were sequentially transduced in 2D culture with replication-deficient viruses containing specific shRNAs and different selection markers. After sorting cells were seeded in Matrigel for organoid formation. Scale bars: 2 cm (tissue), 200 µm (2D culture) and 500 µm (3D culture). Confirmation of robust knockdowns of p53, PTEN and RB in FT organoids on RNA and protein level. Relative mRNA levels were normalized to the WT mRNA level and are given as the mean ±SEM from 3 different donors. A representative western blot from one donor is depicted. RNA as well as protein samples were taken at passage 1 or 2 of each organoid line. KD - Knockdown, Vec Ctrl - Vector Control, WT- Wild typeCyclin E1 overexpression as a downstream effect of RB knockdown was confirmed by western blot analysis.Confocal images of triple KD organoids reveal increased DNA damage (yH2AX, marked by asterisks), atypic nuclei (DRAQ5) and loss of apicobasal polarity. Scale bar: 20µm.Confirmation of robust knockdowns of p53, PTEN and RB in FT organoids on RNA and protein level. Relative mRNA levels were normalized to the WT mRNA level and are given as the mean ±SEM from 3 different donors. A representative western blot from one donor is depicted. RNA as well as protein samples were taken at passage 1 or 2 of each organoid line. KD - Knockdown, Vec Ctrl - Vector Control, WT- Wild type Cyclin E1 overexpression as a downstream effect of RB knockdown was confirmed by western blot analysis. Presence of ciliated cells (arrowheads), as revealed by immunostaining against detyrosinated Tubulin (dtyrTub) in triple KD organoids, proves capacity for terminal differentiation. Scale bar: 50µm."}
{"words": ["Figure", "4In", "long", "-", "term", "3D", "culture", "triple", "KD", "organoids", "show", "loss", "of", "growth", "capacity", "and", "premature", "growth", "arrest", "compared", "to", "the", "controls", "as", "indicated", "by", "the", "representative", "growth", "curves", "of", "FT234", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "µm", ".", "Growth", "curves", "and", "phase", "-", "contrast", "images", "of", "triple", "KD", "organoids", "grown", "in", "OCM", "compared", "to", "FTM", "reveal", "successful", "rescue", "of", "long", "-", "term", "growth", "capacity", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "µm", ".", "Levels", "of", "DNA", "damage", "(", "yH2AX", ")", "and", "apoptosis", "(", "cleaved", "caspase", "-", "3", ",", "PARP1", ")", "do", "not", "differ", "among", "the", "different", "media", "as", "shown", "by", "representative", "western", "blots", "comparing", "triple", "KD", "organoids", "and", "their", "controls", ".", "Triple", "KD", "(", "p53", "/", "PTEN", "/", "RB", ")", "organoids", "are", "characterized", "by", "a", "HGSOC", "gene", "expression", "signature", "as", "revealed", "by", "microarray", "analysis", "comparing", "WT", "and", "KD", "organoids", "grown", "in", "either", "OCM", "or", "FTM", ".", "Differential", "expression", "determined", "by", "dual", "-", "color", "microarray", "for", "2", "biological", "replicates", "was", "significant", "for", "all", "genes", "with", "p", "<", "0", ".", "00005", ".", "Differential", "expression", "of", "stemness", "-", "and", "differentiation", "-", "related", "genes", "of", "triple", "KD", "organoids", "grown", "in", "OCM", "vs", ".", "FTM", ".", "Fold", "-", "changes", "were", "derived", "from", "microarray", "data", "and", "indicate", "and", "an", "increase", "in", "stemness", "(", "CD133", ",", "SOX2", ",", "MYCN", ")", "and", "a", "drop", "in", "differentiation", "(", "OVGP1", ",", "PGR", ",", "FOXJ1", ")", "under", "OCM", "conditions", ".", "Differential", "expression", "determined", "by", "dual", "-", "color", "microarray", "for", "2", "biological", "replicates", "was", "significant", "for", "all", "genes", "with", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "FOXJ1", "expression", "determined", "by", "qPCR", "was", "significantly", "diminished", "in", "triple", "KD", "organoids", "grown", "in", "OCM", "compared", "to", "FTM", ",", "suggesting", "a", "decrease", "in", "differentiation", "capacity", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "technical", "triplicates", "for", "two", "independent", "knockdown", "cultures", ".", "Proportion", "of", "ciliated", "cells", "(", "detyrosinated", "Tubulin", ";", "dtyrTub", ")", "is", "significantly", "reduced", "in", "KD", "organoids", "under", "OCM", "growth", "conditions", ",", "confirming", "inhibition", "of", "differentiation", "as", "illustrated", "by", "confocal", "images", "(", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ")", ".", "The", "quantification", "plot", "depicts", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "biological", "replicates", ",", "based", "on", "quantification", "of", "the", "average", "number", "of", "ciliated", "cells", "per", "counted", "nuclei", ".", "1000", "cells", "were", "counted", "per", "individual", "experiment", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4In long-term 3D culture triple KD organoids show loss of growth capacity and premature growth arrest compared to the controls as indicated by the representative growth curves of FT234. Scale bar: 500 µm.Growth curves and phase-contrast images of triple KD organoids grown in OCM compared to FTM reveal successful rescue of long-term growth capacity. Scale bar: 500 µm.Levels of DNA damage (yH2AX) and apoptosis (cleaved caspase-3, PARP1) do not differ among the different media as shown by representative western blots comparing triple KD organoids and their controls.Triple KD (p53/PTEN/RB) organoids are characterized by a HGSOC gene expression signature as revealed by microarray analysis comparing WT and KD organoids grown in either OCM or FTM. Differential expression determined by dual-color microarray for 2 biological replicates was significant for all genes with p < 0.00005.Differential expression of stemness- and differentiation-related genes of triple KD organoids grown in OCM vs. FTM. Fold-changes were derived from microarray data and indicate and an increase in stemness (CD133, SOX2, MYCN) and a drop in differentiation (OVGP1, PGR, FOXJ1) under OCM conditions. Differential expression determined by dual-color microarray for 2 biological replicates was significant for all genes with p < 0.05.FOXJ1 expression determined by qPCR was significantly diminished in triple KD organoids grown in OCM compared to FTM, suggesting a decrease in differentiation capacity. Data represent the mean ±SEM from technical triplicates for two independent knockdown cultures.Proportion of ciliated cells (detyrosinated Tubulin; dtyrTub) is significantly reduced in KD organoids under OCM growth conditions, confirming inhibition of differentiation as illustrated by confocal images (Scale bar: 50 µm). The quantification plot depicts the mean ±SEM from 3 independent biological replicates, based on quantification of the average number of ciliated cells per counted nuclei. 1000 cells were counted per individual experiment. *p < 0.05, two-sided Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "5The", "proportion", "of", "CD133", "+", "cells", "was", "determined", "by", "FACS", "analysis", "after", "growing", "triple", "KD", "and", "control", "cells", "in", "FTM", "vs", ".", "OCM", "for", "two", "passages", ".", "The", "graph", "is", "representative", "of", "two", "biological", "replicates", ".", "Growth", "capacity", "increases", "when", "KD", "organoids", "are", "grown", "in", "OCM", "medium", "as", "shown", "by", "difference", "in", "total", "viable", "cell", "number", "(", "representative", "graph", "of", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "The", "luminescent", "cell", "viability", "assay", "was", "performed", "in", "triplicate", "and", "the", "bar", "plot", "depicts", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "sided", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ";", "KD", "-", "Knockdown", ",", "Vec", "Ctrl", "-", "Vector", "Control", ",", "WT", "-", "Wild", "typePhase", "-", "contrast", "images", "of", "cancer", "organoids", "which", "entered", "growth", "arrest", "upon", "treatment", "with", "Wnt", "agonists", "(", "Wnt3a", "/", "RSPO1", ")", "over", "2", "passages", "(", "Scale", "bar", ":", "500µm", ")", ".", "Differences", "in", "cell", "number", "were", "confirmed", "by", "the", "respective", "cell", "viability", "assays", "(", "performed", "in", "technical", "triplicates", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "for", "5", "different", "OC", "organoid", "lines", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "two", "-", "sided", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ".", "The", "number", "of", "CD133", "+", "cells", "determined", "by", "FACS", "for", "OC7", "and", "OC4", "organoids", "grown", "in", "different", "media", "with", "or", "without", "Wnt3a", "/", "RSPO1", "and", "with", "or", "without", "Noggin", "over", "2", "passages", ",", "confirms", "a", "sharp", "drop", "in", "stemness", "in", "the", "presence", "of", "Wnt", "agonists", ".", "Addition", "of", "conditioned", "medium", "collected", "from", "the", "parental", "Wnt3a", "cell", "line", "did", "not", "suppress", "growth", "of", "cancer", "organoids", ",", "proving", "that", "the", "growth", "inhibitory", "effect", "is", "due", "to", "the", "presence", "of", "Wnt", "agonists", ".", "The", "bar", "plot", "represents", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "triplicates", "performed", "with", "a", "luminescent", "cell", "viability", "assay", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "two", "-", "sided", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5The proportion of CD133+ cells was determined by FACS analysis after growing triple KD and control cells in FTM vs. OCM for two passages. The graph is representative of two biological replicates.Growth capacity increases when KD organoids are grown in OCM medium as shown by difference in total viable cell number (representative graph of 3 independent experiments). The luminescent cell viability assay was performed in triplicate and the bar plot depicts the mean ±SEM. * p < 0.05, two-sided Student`s t-test; KD - Knockdown, Vec Ctrl - Vector Control, WT - Wild typePhase-contrast images of cancer organoids which entered growth arrest upon treatment with Wnt agonists (Wnt3a/RSPO1) over 2 passages (Scale bar: 500µm). Differences in cell number were confirmed by the respective cell viability assays (performed in technical triplicates). Data represent the mean ±SEM for 5 different OC organoid lines (n=5). *** p < 0.001, two-sided Student`s t-test.The number of CD133+ cells determined by FACS for OC7 and OC4 organoids grown in different media with or without Wnt3a/RSPO1 and with or without Noggin over 2 passages, confirms a sharp drop in stemness in the presence of Wnt agonists.Addition of conditioned medium collected from the parental Wnt3a cell line did not suppress growth of cancer organoids, proving that the growth inhibitory effect is due to the presence of Wnt agonists. The bar plot represents the mean ±SEM of triplicates performed with a luminescent cell viability assay. * p < 0.05, *** p < 0.001, two-sided Student`s t-test."}
{"words": ["Figure", "6Comparative", "analysis", "of", "microarray", "data", "revealed", "consistent", "up", "-", "regulation", "of", "MYCN", ",", "the", "canonical", "Wnt", "inhibitors", "KREMEN2", "and", "DKK3", "as", "well", "as", "differentiation", "marker", "FOXJ1", ",", "AR", "and", "PGR", "in", "HGSOC", "cancer", "organoids", "as", "well", "as", "triple", "KD", "FT", "organoids", ".", "Differential", "expression", "was", "determined", "either", "by", "single", "-", "color", "microarray", "for", "the", "cancer", "samples", "(", "8", "replicates", ")", "or", "dual", "-", "color", "microarray", "for", "the", "knockdowns", "(", "2", "replicates", ")", "and", "is", "significant", "for", "all", "genes", "with", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Transcriptional", "induction", "of", "MYCN", "is", "confirmed", "by", "qPCR", "for", "three", "patients", "between", "cancer", "organoids", "and", "normal", "FT", "organoids", "as", "well", "as", "triple", "KD", "organoids", "grown", "in", "OCM", "vs", ".", "FTM", "conditions", ".", "Depicted", "is", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "the", "normalized", "MYCN", "mRNA", "expression", "level", "of", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "two", "-", "sided", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ".", "Microarray", "data", "revealed", "that", "expression", "levels", "of", "Wnt", "target", "genes", "are", "downregulated", "in", "triple", "KD", "compared", "to", "WT", "control", "FT", "organoids", ".", "Differential", "expression", "determined", "by", "dual", "-", "color", "microarray", "for", "2", "biological", "replicates", "was", "significant", "for", "all", "genes", "with", "p", "≤", "0", ".", "005", ".", "FOXJ1", "expression", "was", "upregulated", "in", "HGSOC", "organoids", "in", "FTM", "compared", "to", "OCM", "as", "shown", "by", "qPCR", "analysis", "of", "3", "different", "patient", "samples", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "technical", "triplicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Comparative analysis of microarray data revealed consistent up-regulation of MYCN, the canonical Wnt inhibitors KREMEN2 and DKK3 as well as differentiation marker FOXJ1, AR and PGR in HGSOC cancer organoids as well as triple KD FT organoids. Differential expression was determined either by single-color microarray for the cancer samples (8 replicates) or dual-color microarray for the knockdowns (2 replicates) and is significant for all genes with p < 0.05.Transcriptional induction of MYCN is confirmed by qPCR for three patients between cancer organoids and normal FT organoids as well as triple KD organoids grown in OCM vs. FTM conditions. Depicted is the mean ±SEM of the normalized MYCN mRNA expression level of three biological replicates (n=3). ** p < 0.01, *** p < 0.001, two-sided Student`s t-test.Microarray data revealed that expression levels of Wnt target genes are downregulated in triple KD compared to WT control FT organoids. Differential expression determined by dual-color microarray for 2 biological replicates was significant for all genes with p ≤ 0.005.FOXJ1 expression was upregulated in HGSOC organoids in FTM compared to OCM as shown by qPCR analysis of 3 different patient samples. Data represent the mean ±SEM of technical triplicates."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "Perturbation", "in", "the", "free", "energy", "of", "PKD2L1", "opening", "(", "∆", "G", "°", ")", "and", "difference", "in", "closure", "rates", "(", "∆", "τclose", ")", "inducted", "by", "substitutions", "within", "the", "pore", "module", ".", "Error", "bars", "=", "S", ".", "D", "as", "estimated", "by", "the", "propagation", "of", "error", "equation", ",", "as", "descried", "in", "statistics", "subsection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) Perturbation in the free energy of PKD2L1 opening (∆G°) and difference in closure rates (∆τclose) inducted by substitutions within the pore module. Error bars = S.D as estimated by the propagation of error equation, as descried in statistics subsection."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Exemplar", "tail", "currents", "from", "mutant", "channels", "where", "the", "energetics", "of", "opening", "are", "disassociated", "with", "the", "rate", "of", "channel", "closure", "-", "mutations", "which", "cause", "slower", "closure", "(", "+", "∆", "τclose", ")", "while", "also", "increasing", "the", "free", "energy", "opening", "(", "+", "∆", "G", "°", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Exemplar tail currents from mutant channels where the energetics of opening are disassociated with the rate of channel closure- mutations which cause slower closure (+∆τclose) while also increasing the free energy opening (+∆G°)."}
{"words": ["Figure", "3D", ")", "Comparing", "voltage", "-", "dependent", "opening", "based", "on", "normalized", "tail", "currents", "measured", "from", "WT", ",", "single", "and", "double", "mutant", "channels", ".", "Top", ",", "single", "and", "double", "mutant", "channels", "including", "mutations", "to", "the", "outer", "and", "inner", "gate", ".", "Middle", "and", "bottom", ",", "control", "groups", "comparing", "tail", "currents", "from", "non", "-", "gate", "S4", "-", "S5", "linker", "mutations", "(", "D476A", "and", "G479A", ")", "and", "those", "from", "the", "outer", "and", "inner", "gates", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", "for", "as", "estimated", "by", "the", "propagation", "of", "error", "equation", ",", "as", "descried", "in", "statistics", "subsection", ".", "Number", "cells", "tested", "(", "N", ")", "are", "indicated", "in", "parentheses", "for", "each", "group", ".", "E", ")", "The", "coupling", "energy", "(", "∆", "∆", "G", "°", ")", "resulting", "from", "the", "mutant", "cycle", "analysis", "resulting", "from", "the", "data", "shown", "in", "D", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", "for", "as", "estimated", "by", "the", "propagation", "of", "error", "equation", ",", "as", "descried", "in", "statistics", "subsection", ".", "Number", "cells", "tested", "(", "N", ")", "are", "indicated", "in", "parentheses", "for", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D) Comparing voltage-dependent opening based on normalized tail currents measured from WT, single and double mutant channels. Top, single and double mutant channels including mutations to the outer and inner gate. Middle and bottom, control groups comparing tail currents from non-gate S4-S5 linker mutations (D476A and G479A) and those from the outer and inner gates. Error bars indicate standard deviation for as estimated by the propagation of error equation, as descried in statistics subsection. Number cells tested (N) are indicated in parentheses for each group.E) The coupling energy (∆∆G°) resulting from the mutant cycle analysis resulting from the data shown in D. Error bars indicate standard deviation for as estimated by the propagation of error equation, as descried in statistics subsection. Number cells tested (N) are indicated in parentheses for each group."}
{"words": ["Figure", "4B", ")", "Summary", "of", "the", "change", "in", "voltage", "-", "dependent", "inactivation", "(", "∆", "V1", "/", "2", "Inact", ".", ")", "of", "pore", "mutant", "channels", ".", "∆", "V1", "/", "2", "Inact", ".", ",", "are", "plotted", "relative", "to", "the", "pore", "module", "topology", "of", "the", "channel", ".", "C", ")", "Voltage", "-", "dependent", "inactivation", "of", "test", "pulse", "tail", "currents", "recorded", "from", "WT", ",", "single", "and", "double", "mutant", "channels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B) Summary of the change in voltage-dependent inactivation (∆V1/2 Inact.) of pore mutant channels. ∆V1/2 Inact., are plotted relative to the pore module topology of the channel.C) Voltage-dependent inactivation of test pulse tail currents recorded from WT, single and double mutant channels."}
{"words": ["Figure", "5C", ")", "Exemplar", "whole", "cell", "currents", "(", "Top", ")", "at", "the", "zero", ",", "three", "and", "seven", "minute", "time", "points", ".", "Current", "records", "(", "Bottom", ")", "from", "cells", "expressing", "the", "F514C", ":", "P538C", "and", "treated", "with", "extracellular", "100", "μM", "1", ",", "2", "-", "methanediyl", "bismethanethiosulfonate", "(", "M2M", ")", ".", "D", ")", "Box", "(", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "and", "whisker", "(", "S", ".", "D", ".", ")", "plots", "comparing", "tail", "currents", "normalized", "to", "their", "initial", "amplitude", "at", "3", "minute", "(", "Left", ")", "and", "7", "-", "minute", "time", "points", "(", "Right", ")", ".", "N", "=", "6", "cells", "per", "group", ".", "Results", "from", "each", "individual", "cells", "are", "indicated", "by", "grey", "open", "circles", "and", "the", "average", "for", "the", "channel", "is", "indicated", "by", "a", "horizontal", "line", ".", "P", "-", "values", "results", "from", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "statistical", "analysis", "is", "shown", "above", "the", "plots", ".", "Dashed", "lines", "the", "level", "normalcy", ",", "no", "change", "in", "Itail", "relative", "to", "time", "point", "zero", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C) Exemplar whole cell currents (Top) at the zero, three and seven minute time points. Current records (Bottom) from cells expressing the F514C:P538C and treated with extracellular 100 μM 1,2-methanediyl bismethanethiosulfonate (M2M).D) Box (S.E.M.) and whisker (S.D.) plots comparing tail currents normalized to their initial amplitude at 3 minute (Left) and 7-minute time points (Right). N = 6 cells per group. Results from each individual cells are indicated by grey open circles and the average for the channel is indicated by a horizontal line. P-values results from a one-way ANOVA statistical analysis is shown above the plots. Dashed lines the level normalcy, no change in Itail relative to time point zero."}
{"words": ["Figure", "1Left", ":", "Fluorescence", "changes", "of", "IRDye700", "labelled", "dsDNA", "(", "at", "125", "nM", ")", "when", "incubated", "at", "increasing", "ID2", "(", "I", "+", "D2", ",", "IUb", "+", "D2Ub", ",", "I", "+", "D2Ub", ")", "or", "ubiquitinated", "FANCD2", "(", "D2Ub", ")", "concentrations", "(", "ranging", "from", "1", ".", "3", "nM", "to", "5", ".", "9", "µM", ")", ".", "Measurement", "of", "fluorescence", "enhancement", "for", "each", "ID2", "complex", "was", "conducted", "for", "two", "separately", "prepared", "complexes", "(", "two", "technical", "repeats", ")", "and", "all", "data", "points", "for", "each", "protein", "-", "combination", "were", "used", "in", "fitting", "of", "a", "one", "-", "site", "binding", "model", ".", "Right", ":", "Bar", "graph", "showing", "mean", "apparent", "Kd", "values", "calculated", "from", "model", "fitting", ".", "Error", "bars", ":", "Asymmetric", "95", "%", "confidence", "intervals", "from", "non", "-", "linear", "regression", "(", "23", "-", "24", "data", "points", "each", ")", ".", "Assessment", "of", "protein", "-", "DNA", "interactions", "using", "Electro", "-", "mobility", "shift", "assays", "(", "EMSA", ")", ".", "IRDye700", "labelled", "dsDNA", "(", "at", "2", "nM", ")", "was", "incubated", "with", "indicated", "amounts", "of", "non", "/", "single", "/", "double", "-", "ubiquitinated", "ID2", "(", "His6", "-", "TEV", "-", "V5", "-", "FANCI", "and", "FLAG", "-", "FANCD2", ")", "protein", "complexes", "(", "I", "+", "D2", ",", "IUb", "+", "D2Ub", ",", "I", "+", "D2Ub", "­", ")", "or", "ubiquitinated", "FLAG", "-", "FANCD2", "(", "D2Ub", ")", ".", "Mixes", "were", "ran", "on", "non", "-", "denaturing", "gels", ",", "and", "the", "resolved", "free", "-", "and", "protein", "-", "bound", "DNA", "bands", "were", "visualized", "using", "an", "infrared", "scanner", ".", "EMSA", "gels", "of", "ID2", "complexes", "are", "representative", "of", "3", "replicate", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Left: Fluorescence changes of IRDye700 labelled dsDNA (at 125 nM) when incubated at increasing ID2 (I+D2, IUb+D2Ub, I+D2Ub) or ubiquitinated FANCD2 (D2Ub) concentrations (ranging from 1.3 nM to 5.9 µM). Measurement of fluorescence enhancement for each ID2 complex was conducted for two separately prepared complexes (two technical repeats) and all data points for each protein-combination were used in fitting of a one-site binding model. Right: Bar graph showing mean apparent Kd values calculated from model fitting. Error bars: Asymmetric 95% confidence intervals from non-linear regression (23-24 data points each).Assessment of protein-DNA interactions using Electro-mobility shift assays (EMSA). IRDye700 labelled dsDNA (at 2 nM) was incubated with indicated amounts of non/single/double-ubiquitinated ID2 (His6-TEV-V5-FANCI and FLAG-FANCD2) protein complexes (I+D2, IUb+D2Ub, I+D2Ub­) or ubiquitinated FLAG-FANCD2 (D2Ub). Mixes were ran on non-denaturing gels, and the resolved free- and protein-bound DNA bands were visualized using an infrared scanner. EMSA gels of ID2 complexes are representative of 3 replicate experiments."}
{"words": ["Figure", "2Left", ":", "CryoEM", "2D", "classes", "of", "ID2Ub", "and", "IUbD2Ub", "-", "dsDNA", ".", "Right", ":", "3D", "reconstructions", "of", "ID2Ub", "(", "EMD", "-", "10843", ")", "and", "IUbD2Ub", "-", "DNA", "(", "EMD", "-", "10844", ")", ".", "Both", "structures", "exhibit", "a", "torus", "-", "like", "shape", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Left: CryoEM 2D classes of ID2Ub and IUbD2Ub-dsDNA. Right: 3D reconstructions of ID2Ub (EMD-10843) and IUbD2Ub-DNA (EMD-10844). Both structures exhibit a torus-like shape."}
{"words": ["Figure", "3Both", "wild", "-", "type", "(", "IWT", ")", "and", "R1285Q", "mutant", "(", "IR1285Q", ")", "FANCI", "can", "be", "efficiently", "ubiquitinated", "in", "the", "presence", "of", "DNA", ".", "Reactions", "were", "performed", "at", "2", "μM", "FANCI", "substrate", "for", "60", "min", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "4", "µM", "ssDNA", ".", "Both", "wild", "-", "type", "(", "IWT", ")", "and", "R1285Q", "mutant", "(", "IR1285Q", ")", "FANCI", "efficiently", "associate", "with", "FANCD2", ".", "Fluorescence", "changes", "occurring", "when", "RED", "-", "tris", "-", "NTA", "-", "labelled", "FANCI", "(", "IWT", "or", "IR1285Q", ";", "both", "at", "60", "nM", ")", "is", "incubated", "at", "increasing", "concentrations", "of", "FANCD2", "(", "ranging", "from", "2", ".", "48", "nM", "to", "5", ".", "08", "µM", ")", ".", "Titrations", "were", "conducted", "twice", "(", "two", "technical", "replicates", ")", "and", "all", "data", "points", "for", "each", "protein", "-", "combination", "were", "used", "in", "fitting", "of", "a", "one", "-", "site", "binding", "model", ".", "Apparent", "Kd", "values", "(", "mean", "±", "SEM", ")", "derived", "from", "fitting", "of", "a", "one", "-", "site", "binding", "model", "to", "the", "24", "data", "points", "of", "the", "two", "technical", "replicates", "are", "shown", ".", "FANCD2", "within", "an", "IR1285QD2", "complex", "is", "resistant", "to", "ubiquitination", ".", "Reactions", "were", "performed", "at", "4", "μM", "ID2", "substrate", "and", "16", "μM", "dsDNA", ".", "Progress", "of", "FANCD2", "and", "FANCI", "ubiquitination", "was", "monitored", "by", "western", "blotting", "following", "SDS", "-", "PAGE", ".", "FANCD2", "ubiquitination", "cannot", "robustly", "enhance", "ID2", "-", "DNA", "binding", "when", "complexed", "with", "IR1285Q", ",", "as", "determined", "by", "PIFE", ".", "Left", ":", "Fluorescence", "changes", "when", "IRD700", "-", "labelled", "dsDNA", "(", "at", "125", "nM", ")", "is", "incubated", "at", "increasing", "concentrations", "of", "IR1285Q", "+", "D2", "or", "IR1285Q", "+", "D2Ub", "(", "complex", "concentrations", "ranging", "from", "1", ".", "54", "nM", "to", "3", ".", "8", "µM", ")", ".", "Measurement", "of", "fluorescence", "enhancement", "for", "each", "protein", "combination", "was", "conducted", "for", "two", "separately", "prepared", "complexes", "(", "two", "technical", "repeats", ")", "and", "all", "data", "points", "for", "each", "protein", "-", "combination", "were", "used", "in", "fitting", "of", "a", "one", "-", "site", "binding", "model", ".", "Right", ":", "Bar", "graph", "showing", "mean", "apparent", "Kd", "values", "calculated", "from", "the", "one", "-", "site", "binding", "model", ".", "Error", "bars", ":", "Asymmetric", "95", "%", "confidence", "intervals", "from", "non", "-", "linear", "regression", "(", "22", "data", "points", "each", ")", ".", "IWT", "+", "D2", "and", "IWT", "+", "D2Ub", "previously", "calculated", "curves", "and", "corresponding", "Kd", "values", "(", "from", "data", "points", "shown", "in", "Figure", "1A", ")", "are", "also", "shown", "for", "comparison", ".", "FANCD2", "ubiquitination", "cannot", "robustly", "enhance", "ID2", "-", "DNA", "binding", "when", "complexed", "with", "IR1285Q", ",", "as", "determined", "by", "EMSAs", ".", "IRDye700", "-", "labelled", "dsDNA", "(", "at", "2", "nM", ")", "was", "incubated", "with", "indicated", "amounts", "of", "ID2", "(", "His6", "-", "FANCI", "or", "His6", "-", "FANCIR1285Q", "mixed", "with", "non", "-", "ubiquitinated", "or", "ubiquitinated", "FLAG", "-", "FANCD2", ".", "Mixes", "were", "ran", "on", "non", "-", "denaturing", "gels", ",", "and", "the", "resolved", "free", "-", "and", "protein", "-", "bound", "DNA", "bands", "were", "visualized", "using", "an", "infrared", "scanner", ".", "Gels", "shown", "are", "representative", "of", "two", "replicate", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Both wild-type (IWT) and R1285Q mutant (IR1285Q) FANCI can be efficiently ubiquitinated in the presence of DNA. Reactions were performed at 2 μM FANCI substrate for 60 min in the absence or presence of 4 µM ssDNA.Both wild-type (IWT) and R1285Q mutant (IR1285Q) FANCI efficiently associate with FANCD2. Fluorescence changes occurring when RED-tris-NTA-labelled FANCI (IWT or IR1285Q; both at 60 nM) is incubated at increasing concentrations of FANCD2 (ranging from 2.48 nM to 5.08 µM). Titrations were conducted twice (two technical replicates) and all data points for each protein-combination were used in fitting of a one-site binding model. Apparent Kd values (mean ± SEM) derived from fitting of a one-site binding model to the 24 data points of the two technical replicates are shown.FANCD2 within an IR1285QD2 complex is resistant to ubiquitination. Reactions were performed at 4 μM ID2 substrate and 16 μM dsDNA. Progress of FANCD2 and FANCI ubiquitination was monitored by western blotting following SDS-PAGE.FANCD2 ubiquitination cannot robustly enhance ID2-DNA binding when complexed with IR1285Q, as determined by PIFE. Left: Fluorescence changes when IRD700-labelled dsDNA (at 125 nM) is incubated at increasing concentrations of IR1285Q +D2 or IR1285Q +D2Ub (complex concentrations ranging from 1.54 nM to 3.8 µM). Measurement of fluorescence enhancement for each protein combination was conducted for two separately prepared complexes (two technical repeats) and all data points for each protein-combination were used in fitting of a one-site binding model. Right: Bar graph showing mean apparent Kd values calculated from the one-site binding model. Error bars: Asymmetric 95% confidence intervals from non-linear regression (22 data points each). IWT + D2 and IWT + D2Ub previously calculated curves and corresponding Kd values (from data points shown in Figure 1A) are also shown for comparison.FANCD2 ubiquitination cannot robustly enhance ID2-DNA binding when complexed with IR1285Q, as determined by EMSAs. IRDye700-labelled dsDNA (at 2 nM) was incubated with indicated amounts of ID2 (His6-FANCI or His6-FANCIR1285Q mixed with non-ubiquitinated or ubiquitinated FLAG-FANCD2. Mixes were ran on non-denaturing gels, and the resolved free- and protein-bound DNA bands were visualized using an infrared scanner. Gels shown are representative of two replicate experiments."}
{"words": ["Figure", "4USP1", "-", "UAF1", "can", "efficiently", "deubiquitinate", "D2Ub", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "FANCI", "(", "I", ")", ",", "but", "not", "in", "the", "presence", "of", "ubiquitinated", "FANCI", "(", "IUb", ")", ".", "Ubiquitinated", "FANCD2", "(", "D2Ub", ")", "was", "mixed", "with", "a", "50", "base", "pair", "dsDNA", "and", "either", "His6", "-", "TEV", "-", "V5", "-", "FANCI", "(", "I", ")", ",", "ubiquitinated", "His6", "-", "TEV", "-", "V5", "-", "FANCI", "(", "IUb", ")", "or", "no", "protein", ";", "protein", "-", "DNA", "mixes", "were", "subsequently", "incubated", "with", "USP1", "-", "UAF1", "(", "at", "25", "nM", "or", "100", "nM", ")", "for", "indicated", "time", "periods", ".", "Deubiquitination", "of", "D2Ub", "and", "IUb", "was", "assessed", ",", "following", "SDS", "-", "PAGE", ",", "by", "Coomassie", "staining", "of", "the", "gels", ",", "as", "well", "as", "by", "western", "blotting", "of", "transferred", "blots", "with", "a", "specific", "FANCD2", "antibody", ".", "USP7", "and", "USP2", "can", "deubiquitinate", "D2Ub", ",", "but", "their", "activity", "towards", "D2Ub", "is", "greatly", "reduced", "in", "the", "presence", "of", "FANCI", "(", "I", ")", "or", "ubiquitinated", "FANCI", "(", "IUb", ")", ".", "Reactions", "were", "set", "-", "up", "as", "in", "A", ",", "but", "with", "100", "nM", "USP7", "or", "USP2", ".", "Deubiquitination", "was", "assessed", ",", "following", "SDS", "-", "PAGE", ",", "by", "Coomassie", "staining", ".", "Time", "course", "of", "FANCI", "ubiquitination", "with", "various", "ubiquitin", "mutants", "and", "corresponding", "sensitivity", "/", "resistance", "to", "USP1", "-", "UAF1", "mediated", "deubiquitination", "of", "resulting", "products", ".", "Deubiquitination", "reactions", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "USP1", "-", "UAF1", "(", "100", "nM", ")", "incubated", "for", "30", "minutes", ".", "Time", "course", "of", "USP1", "-", "UAF1", "mediated", "deubiquitination", "of", "IUbD2Ub", "-", "DNA", "complexes", "consisting", "of", "D2Ub", "a", "50", "base", "pair", "dsDNA", "and", "IUb", "produced", "with", "various", "ubiquitin", "mutants", "or", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "ubiquitin", ".", "Progress", "of", "deubiquitination", "reaction", "was", "assessed", "following", "SDS", "-", "PAGE", ",", "by", "both", "Coomassie", "staining", "of", "the", "gels", ",", "as", "well", "as", "by", "western", "blotting", "of", "transferred", "blots", "with", "a", "specific", "FANCD2", "antibody", ".", "FANCI", "ubiquitination", "with", "indicated", "ubiquitin", "-", "mutants", "(", "or", "WT", ")", "and", "subsequent", "deubiquitination", "of", "resulting", "IUbD2Ub", "-", "DNA", "complexes", "were", "conducted", "twice", ";", "the", "residual", "FANCD2", "ubiquitination", ",", "calculated", "from", "the", "FANCD2", "blots", "for", "each", "time", "-", "point", ",", "was", "plotted", "for", "each", "type", "of", "ubiquitin", "in", "the", "protein", "complex", ",", "and", "corresponding", "deubiquitination", "progress", "curves", "were", "fitted", "using", "a", "one", "-", "phase", "decay", "model", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4USP1-UAF1 can efficiently deubiquitinate D2Ub in the presence or absence of FANCI (I), but not in the presence of ubiquitinated FANCI (IUb). Ubiquitinated FANCD2 (D2Ub) was mixed with a 50 base pair dsDNA and either His6-TEV-V5-FANCI (I), ubiquitinated His6-TEV-V5-FANCI (IUb) or no protein; protein-DNA mixes were subsequently incubated with USP1-UAF1 (at 25 nM or 100 nM) for indicated time periods. Deubiquitination of D2Ub and IUb was assessed, following SDS-PAGE, by Coomassie staining of the gels, as well as by western blotting of transferred blots with a specific FANCD2 antibody.USP7 and USP2 can deubiquitinate D2Ub, but their activity towards D2Ub is greatly reduced in the presence of FANCI (I) or ubiquitinated FANCI (IUb). Reactions were set-up as in A, but with 100 nM USP7 or USP2. Deubiquitination was assessed, following SDS-PAGE, by Coomassie staining.Time course of FANCI ubiquitination with various ubiquitin mutants and corresponding sensitivity/resistance to USP1-UAF1 mediated deubiquitination of resulting products. Deubiquitination reactions in the presence or absence of USP1-UAF1 (100 nM) incubated for 30 minutes.Time course of USP1-UAF1 mediated deubiquitination of IUbD2Ub-DNA complexes consisting of D2Ub a 50 base pair dsDNA and IUb produced with various ubiquitin mutants or wild-type (WT) ubiquitin. Progress of deubiquitination reaction was assessed following SDS-PAGE, by both Coomassie staining of the gels, as well as by western blotting of transferred blots with a specific FANCD2 antibody. FANCI ubiquitination with indicated ubiquitin-mutants (or WT) and subsequent deubiquitination of resulting IUbD2Ub-DNA complexes were conducted twice; the residual FANCD2 ubiquitination, calculated from the FANCD2 blots for each time-point, was plotted for each type of ubiquitin in the protein complex, and corresponding deubiquitination progress curves were fitted using a one-phase decay model."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Confocal", "fluorescence", "microscopy", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "0", ".", "5", "μg", "pQCXIP", "encoding", "IFITM3", "variants", "containing", "N", "-", "terminal", "FLAG", "(", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "IFITM3", ")", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "antibody", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "C", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "transfected", "cells", "in", "(", "B", ")", "immunostained", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "antibody", ".", "Corresponding", "mean", "flourescence", "intensity", "values", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "SDS", "-", "PAGE", "of", "cell", "lysates", "derived", "from", "293T", "cells", "transfected", "in", "(", "B", ")", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "SDS", "-", "PAGE", "of", "Opti", "-", "prep", "purified", "supernatants", "(", "25", "ng", "p24", "equivalent", ")", "derived", "from", "293T", "cells", "transfected", "with", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "IFITM3", "variants", ",", "HIV", "-", "1", "pNL4", "-", "3", ",", "and", "Vpr", "-", "Blam", "plasmid", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "and", "anti", "-", "p24", "Gag", "(", "183", "-", "H12", "-", "5C", ")", ".", "(", "F", ")", "Opti", "-", "prep", "purified", "supernatants", "from", "(", "E", ")", "were", "incubated", "with", "SupT1", "target", "cells", "for", "4", "hours", "and", "virus", "-", "cell", "fusion", "was", "scored", "by", "flow", "cytometry", ".", "Mean", "+", "SD", "of", "5", "-", "10", "experiments", "(", "each", "performed", "with", "virus", "produced", "from", "an", "independent", "transfection", ")", "is", "shown", ".", "(", "G", ")", "Virus", "used", "in", "(", "E", ")", "were", "used", "to", "infect", "SupT1", "cells", "and", "productive", "infection", "was", "scored", "at", "48", "-", "60", "hours", "by", "immunostaining", "with", "the", "KC57", "antibody", "and", "flow", "cytometry", ".", "Expression", "of", "pCMV", "-", "MxA", "served", "as", "a", "negative", "control", ".", "The", "mean", "+", "SD", "of", "5", "-", "10", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "H", ")", "Confocal", "fluorescence", "microscopy", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "0", ".", "5", "μg", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "IFITM3", "variants", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "antibody", "(", "I", ")", "SDS", "-", "PAGE", "of", "cell", "lysates", "derived", "from", "293T", "cells", "transfected", "in", "(", "H", ")", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "(", "J", ")", "SDS", "-", "PAGE", "of", "Opti", "-", "prep", "purified", "supernatants", "(", "25", "ng", "p24", "equivalent", ")", "derived", "from", "293T", "cells", "transfected", "with", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "IFITM3", "constructs", ",", "HIV", "-", "1", "pNL4", "-", "3", ",", "and", "Vpr", "-", "Blam", "plasmid", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "and", "anti", "-", "p24", "Gag", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "K", ")", "Opti", "-", "prep", "purified", "supernatants", "from", "(", "J", ")", "were", "incubated", "with", "SupT1", "target", "cells", "for", "4", "hours", "and", "virus", "-", "cell", "fusion", "was", "scored", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "mean", "+", "SD", "of", "3", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Confocal fluorescence microscopy of 293T cells transfected with 0.5 μg pQCXIP encoding IFITM3 variants containing N-terminal FLAG (pQCXIP-FLAG-IFITM3) and immunostained with anti-FLAG M2 antibody. Scale bar, 5 μm.(C) Flow cytometry analysis of transfected cells in (B) immunostained with anti-FLAG M2 antibody. Corresponding mean flourescence intensity values are shown.(D) SDS-PAGE of cell lysates derived from 293T cells transfected in (B) followed by immunoblotting with anti-FLAG M2 and anti-actin antibodies.(E) SDS-PAGE of Opti-prep purified supernatants (25 ng p24 equivalent) derived from 293T cells transfected with pQCXIP-FLAG-IFITM3 variants, HIV-1 pNL4-3, and Vpr-Blam plasmid followed by immunoblotting with anti-FLAG M2 and anti-p24 Gag (183-H12-5C).(F) Opti-prep purified supernatants from (E) were incubated with SupT1 target cells for 4 hours and virus-cell fusion was scored by flow cytometry. Mean + SD of 5-10 experiments (each performed with virus produced from an independent transfection) is shown. (G) Virus used in (E) were used to infect SupT1 cells and productive infection was scored at 48-60 hours by immunostaining with the KC57 antibody and flow cytometry. Expression of pCMV-MxA served as a negative control. The mean + SD of 5-10 experiments is shown.(H) Confocal fluorescence microscopy of 293T cells transfected with 0.5 μg pQCXIP-FLAG-IFITM3 variants and immunostained with anti-FLAG M2 antibody(I) SDS-PAGE of cell lysates derived from 293T cells transfected in (H) followed by immunoblotting with anti-FLAG M2 and anti-actin antibodies.(J) SDS-PAGE of Opti-prep purified supernatants (25 ng p24 equivalent) derived from 293T cells transfected with pQCXIP-FLAG-IFITM3 constructs, HIV-1 pNL4-3, and Vpr-Blam plasmid followed by immunoblotting with anti-FLAG M2 and anti-p24 Gag. Scale bar, 5 μm.(K) Opti-prep purified supernatants from (J) were incubated with SupT1 target cells for 4 hours and virus-cell fusion was scored by flow cytometry. The mean + SD of 3 experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Confocal", "fluorescent", "microscopy", "of", "SupT1", "T", "cells", "transduced", "with", "Tet", "-", "inducible", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "IFITM3", "or", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "IFITM3", "Δ1", "-", "21", "(", "Tet", "-", "ON", ")", "immunostained", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "antibody", "following", "overnight", "treatment", "with", "500", "ng", "/", "mL", "doxycycline", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Tet", "-", "ON", "SupT1", "cell", "lines", "were", "treated", "or", "not", "with", "500", "ng", "/", "mL", "doxycycline", "overnight", "and", "induction", "of", "IFITM3", "protein", "was", "assessed", "anti", "-", "FLAG", "M2", "immunostaining", "and", "flow", "cytometry", ".", "(", "C", ")", "Tet", "-", "ON", "SupT1", "cell", "lines", "were", "productively", "infected", "with", "NL4", "-", "3", "VSV", "-", "G", "and", "then", "treated", "with", "500", "ng", "/", "mL", "doxycycline", "overnight", "to", "produce", "virus", "from", "IFITM3", "-", "and", "IFITM3", "+", "cells", ".", "25", "ng", "p24", "equivalents", "of", "purified", "were", "used", "to", "infect", "fresh", "Tet", "-", "ON", "SupT1", "cells", "cell", "targets", ",", "which", "were", "previously", "treated", "with", "500", "ng", "/", "mL", "doxycycline", "or", "not", ".", "Infection", "was", "scored", "at", "72h", "post", "-", "infection", "by", "immunostaining", "with", "KC57", "and", "flow", "cytometry", ".", "Mean", "+", "SD", "of", "3", "experiments", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "25", "ng", "p24", "equivalents", "of", "virus", "used", "in", "(", "C", ")", "was", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Immunoblotting", "was", "performed", "using", "the", "anti", "-", "FLAG", "M2", ",", "anti", "-", "p24", "Gag", ",", "and", "anti", "-", "gp120", "Env", "(", "NIH", "#", "288", ")", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "amount", "of", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "IFITM3", "or", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "Δ1", "-", "21", "or", "pCMV", "-", "MxA", "and", "1", ".", "0", "μg", "of", "HIV", "-", "1", "pNL4", "-", "3", ".", "SDS", "-", "PAGE", "was", "performed", "on", "whole", "cell", "lysates", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", ",", "anti", "-", "p24", "Gag", ",", "anti", "-", "Env", "gp120", "(", "NIH", "#", "288", ")", ",", "and", "anti", "-", "tubulin", "antibodies", ".", "Western", "blot", "images", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "♯", "p", "=", "0", ".", "12", ",", "non", "statistically", "significant", ".", "Comparisons", "were", "made", "between", "the", "condition", "indicated", "and", "the", "correponding", "condition", "in", "Tet", "-", "ON", "IFITM3", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Confocal fluorescent microscopy of SupT1 T cells transduced with Tet-inducible pQCXIP-FLAG-IFITM3 or pQCXIP-FLAG-IFITM3 Δ1-21 (Tet-ON) immunostained with anti-FLAG M2 antibody following overnight treatment with 500 ng/mL doxycycline. Scale bar, 10 μm.(B) Tet-ON SupT1 cell lines were treated or not with 500 ng/mL doxycycline overnight and induction of IFITM3 protein was assessed anti-FLAG M2 immunostaining and flow cytometry.(C) Tet-ON SupT1 cell lines were productively infected with NL4-3 VSV-G and then treated with 500 ng/mL doxycycline overnight to produce virus from IFITM3- and IFITM3+ cells. 25 ng p24 equivalents of purified were used to infect fresh Tet-ON SupT1 cells cell targets, which were previously treated with 500 ng/mL doxycycline or not. Infection was scored at 72h post-infection by immunostaining with KC57 and flow cytometry. Mean + SD of 3 experiments are shown.(D) 25 ng p24 equivalents of virus used in (C) was subjected to SDS-PAGE. Immunoblotting was performed using the anti-FLAG M2, anti-p24 Gag, and anti-gp120 Env (NIH #288) antibodies.(E) 293T cells were transfected with the indicated amount of pQCXIP-FLAG-IFITM3 or pQCXIP-FLAG-Δ1-21 or pCMV-MxA and 1.0 μg of HIV-1 pNL4-3. SDS-PAGE was performed on whole cell lysates followed by immunoblotting with anti-FLAG M2, anti-p24 Gag, anti-Env gp120 (NIH #288), and anti-tubulin antibodies. Western blot images are representative of 3 independent experiments. Unpaired t-test, *p<0.05, ♯p=0.12, non statistically significant. Comparisons were made between the condition indicated and the correponding condition in Tet-ON IFITM3 cells."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Confocal", "fluorescence", "microscopy", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "0", ".", "5", "μg", "of", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "Human", "IFITM3", "mutated", "at", "indicated", "residues", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "antibody", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "The", "P17L", ",", "P18H", ",", "Δ22", "-", "24", ",", "P18L", "/", "L23P", "and", "P18H", "/", "Δ19", "-", "23", "mutations", "were", "introduced", "into", "the", "human", "IFITM3", "background", ".", "(", "B", ")", "SDS", "-", "PAGE", "of", "FLAG", "-", "immunoprecipitated", "fractions", "from", "293T", "cells", "following", "transfection", "of", "0", ".", "5", "μg", "of", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "IFITM3", "variants", "and", "0", ".", "5", "μg", "of", "pCI", "-", "HA", "-", "NEDD4", "or", "pCI", "-", "HA", "-", "NEDD4", "C867A", ".", "Immunoblotting", "was", "performed", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", ",", "anti", "-", "IFITM3", "(", "Abcam", ",", "EPR5242", ")", ",", "and", "an", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", "(", "Enzo", "Life", "Sciences", ",", "recognizing", "K29", "-", ",", "K48", "-", ",", "and", "K63", "-", "linked", "mono", "-", "and", "polyubiquitinylated", "proteins", ")", ".", "'", "L", "'", "indicates", "the", "presence", "of", "light", "chain", "antibody", "derived", "from", "the", "FLAG", "antibody", "-", "coupled", "beads", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "*", ",", "*", "*", ",", "and", "*", "*", "*", "indicate", "mono", "-", ",", "di", "-", ",", "and", "tri", "-", "ubiquitinated", "forms", "of", "IFITM3", ".", "(", "C", ")", "SDS", "-", "PAGE", "of", "whole", "cell", "lysate", "input", "fractions", "from", "293T", "cells", "used", "in", "(", "B", ")", ".", "Immunoblotting", "was", "performed", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", ",", "anti", "-", "NEDD4", ",", "and", "anti", "-", "actin", ".", "(", "D", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "1", ".", "0", "μg", "of", "pNL4", "-", "3", "and", "0", ".", "5", "μg", "of", "pQCXIP", "-", "FLAG", "-", "IFITM3", "variants", ".", "Virus", "-", "containing", "supernatants", "were", "harvested", "and", "10", "ng", "p24", "equivalents", "were", "used", "to", "reinfect", "fresh", "SupT1", "T", "cells", ".", "Productive", "infection", "was", "scored", "by", "immunostaining", "with", "the", "KC57", "antibody", "and", "flow", "cytometry", "at", "48", "hours", "post", "-", "infection", ".", "The", "means", "+", "SD", "of", "3", "experiments", "are", "shown", ".", "(", "E", ")", "2", ".", "0", "x", "10ˆ5", "cells", "were", "seeded", "and", "challenged", "with", "10", "ng", "of", "HIV", "-", "1NL4", "-", "3", "in", "the", "presence", "of", "2", "μg", "/", "mL", "DEAE", "-", "Dextran", ".", "Productive", "infection", "was", "scored", "by", "immunostaining", "with", "KC57", "and", "flow", "cytometry", "at", "48", "hours", "post", "-", "infection", ".", "The", "'", "Colobus", "native", "'", "sequence", "represents", "the", "full", "IFITM3", "sequence", "identified", "in", "the", "colobus", "monkey", ".", "(", "F", ")", "As", "in", "(", "E", ")", ",", "except", "cells", "were", "challenged", "with", "Influenza", "A", "virus", "H1N1", "PR", "/", "8", "/", "34", ",", "(", "Charles", "River", "Laboratories", ")", ",", "at", "a", "dose", "that", "resulted", "in", "˜", "50", "%", "infection", "of", "control", "(", "Empty", ")", "cells", "(", "equivalent", "to", "103", "TCID50", "/", "0", ".", "2", "mL", ")", ".", "Infection", "was", "scored", "by", "immunostaining", "with", "an", "anti", "-", "IAV", "NP", "antibody", "and", "flow", "cytometry", "at", "18", "hours", "post", "-", "infection", ".", "Results", "are", "presented", "in", "a", "logarithmic", "scale", ".", "Means", "+", "SD", "of", "3", "-", "5", "experiments", "are", "shown", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Confocal fluorescence microscopy of 293T cells transfected with 0.5 μg of pQCXIP-FLAG-Human IFITM3 mutated at indicated residues and immunostained with anti-FLAG M2 antibody. Scale bars, 5 μm. The P17L, P18H, Δ22-24, P18L/L23P and P18H/Δ19-23 mutations were introduced into the human IFITM3 background.(B) SDS-PAGE of FLAG-immunoprecipitated fractions from 293T cells following transfection of 0.5 μg of pQCXIP-FLAG-IFITM3 variants and 0.5 μg of pCI-HA-NEDD4 or pCI-HA-NEDD4 C867A. Immunoblotting was performed with anti-FLAG M2, anti-IFITM3 (Abcam, EPR5242), and an anti-ubiquitin antibody (Enzo Life Sciences, recognizing K29-, K48-, and K63-linked mono- and polyubiquitinylated proteins). 'L' indicates the presence of light chain antibody derived from the FLAG antibody-coupled beads used for immunoprecipitation. *, **, and *** indicate mono-, di-, and tri-ubiquitinated forms of IFITM3.(C) SDS-PAGE of whole cell lysate input fractions from 293T cells used in (B). Immunoblotting was performed with anti-FLAG M2, anti-NEDD4, and anti-actin.(D) 293T cells were transfected with 1.0 μg of pNL4-3 and 0.5 μg of pQCXIP-FLAG-IFITM3 variants. Virus-containing supernatants were harvested and 10 ng p24 equivalents were used to reinfect fresh SupT1 T cells. Productive infection was scored by immunostaining with the KC57 antibody and flow cytometry at 48 hours post-infection. The means + SD of 3 experiments are shown.(E) 2.0 x 10ˆ5 cells were seeded and challenged with 10 ng of HIV-1NL4-3 in the presence of 2 μg/mL DEAE-Dextran. Productive infection was scored by immunostaining with KC57 and flow cytometry at 48 hours post-infection. The 'Colobus native' sequence represents the full IFITM3 sequence identified in the colobus monkey. (F) As in (E), except cells were challenged with Influenza A virus H1N1 PR/8/34, (Charles River Laboratories), at a dose that resulted in ˜50% infection of control (Empty) cells (equivalent to 103 TCID50 / 0.2 mL). Infection was scored by immunostaining with an anti-IAV NP antibody and flow cytometry at 18 hours post-infection. Results are presented in a logarithmic scale. Means + SD of 3-5 experiments are shown. Unpaired t-test, *p<0.05, **p<0.005."}
{"words": ["Figure", "1Heatmaps", "of", "enriched", "hippocampus", "phosphotyrosine", "peptides", "in", "hippocampus", "tissue", "from", "CK", "-", "p25", "animal", "mice", ".", "Colors", "indicate", "fold", "change", "relative", "to", "control", "animals", "on", "a", "log2", "-", "scale", ".", "Row", "colors", "(", "left", ")", "indicate", "peptides", "from", "predicted", "cell", "-", "type", "specific", "proteins", ".", "Green", "=", "Astrocyte", ",", "Orange", "=", "Neuron", ",", "Blue", "=", "Microglia", ",", "Purple", "=", "Oligodendrocyte", ".", "Heatmaps", "of", "enriched", "hippocampus", "phosphotyrosine", "peptides", "in", "hippocampus", "tissue", "from", "5XFAD", "animal", "mice", ".", "Colors", "indicate", "fold", "change", "relative", "to", "control", "animals", "on", "a", "log2", "-", "scale", ".", "Row", "colors", "(", "left", ")", "indicate", "peptides", "from", "predicted", "cell", "-", "type", "specific", "proteins", ".", "Green", "=", "Astrocyte", ",", "Orange", "=", "Neuron", ",", "Blue", "=", "Microglia", ",", "Purple", "=", "Oligodendrocyte", ".", "Colors", "indicate", "fold", "change", "relative", "to", "control", "animals", "on", "a", "log2", "-", "scale", ".", "Row", "colors", "(", "left", ")", "indicate", "peptides", "from", "predicted", "cell", "-", "type", "specific", "proteins", ".", "Green", "=", "Astrocyte", ",", "Orange", "=", "Neuron", ",", "Blue", "=", "Microglia", ",", "Purple", "=", "Oligodendrocyte", ".", "(", "E", ")", "Heatmap", "showing", "enriched", "hippocampus", "phosphotyrosine", "peptides", "from", "6", "month", "old", "Tau", "P301S", "animals", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "Relative", "abundances", "across", "all", "tissues", "for", "phosphotyrosine", "peptides", ":", "(", "F", ")", "SVyTEIK", "(", "Siglec", "-", "F", "pY561", ")", ";", "(", "G", ")", "LyDFVK", "(", "Inpp5d", "pY868", ")", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "confidence", "interval", "(", "CI", ")", ";", "n", "=", "3", "-", "8", "samples", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Heatmaps of enriched hippocampus phosphotyrosine peptides in hippocampus tissue from CK-p25 animal mice. Colors indicate fold change relative to control animals on a log2-scale. Row colors (left) indicate peptides from predicted cell-type specific proteins. Green = Astrocyte, Orange = Neuron, Blue = Microglia, Purple = Oligodendrocyte. Heatmaps of enriched hippocampus phosphotyrosine peptides in hippocampus tissue from 5XFAD animal mice. Colors indicate fold change relative to control animals on a log2-scale. Row colors (left) indicate peptides from predicted cell-type specific proteins. Green = Astrocyte, Orange = Neuron, Blue = Microglia, Purple = Oligodendrocyte.  Colors indicate fold change relative to control animals on a log2-scale. Row colors (left) indicate peptides from predicted cell-type specific proteins. Green = Astrocyte, Orange = Neuron, Blue = Microglia, Purple = Oligodendrocyte. (E) Heatmap showing enriched hippocampus phosphotyrosine peptides from 6 month old Tau P301S animals. (F-G) Relative abundances across all tissues for phosphotyrosine peptides: (F) SVyTEIK (Siglec-F pY561); (G) LyDFVK (Inpp5d pY868). Bars indicate mean ± 95% confidence interval (CI); n = 3-8 samples; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "(", "IF", ")", "staining", "showing", "Siglec", "-", "F", "and", "Iba1", "localization", "in", "hippocampus", "CA3", "region", "of", "3wk", "induced", "CK", "(", "top", ")", "or", "CK", "-", "p25", "(", "bottom", ")", "mice", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "Colors", "are", ":", "Magenta", "=", "Iba1", ",", "Cyan", "=", "Siglec", "-", "F", ".", "Images", "are", "60x", "super", "-", "resolution", "max", "z", "-", "stack", "projections", "taken", "from", "coronal", "slices", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Percent", "area", "coverage", "of", "(", "B", ")", "Iba1", "and", "(", "C", ")", "Iba1", "-", "proximal", "Siglec", "-", "F", "between", "CK", "and", "CK", "-", "p25", "mice", "across", "hippocampal", "regions", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "3", "-", "4", "animals", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "IF", "staining", "of", "Siglec", "-", "F", "and", "Iba1", "in", "(", "D", ")", "5XFAD", "2", "month", "hypothalamus", "(", "HY", ")", "and", "(", "E", ")", "5XFAD", "6", "month", "dentate", "gyrus", "(", "DG", ")", ".", "Yellow", "=", "Aβ", "from", "methoxy", "X04", "(", "D", ")", "or", "D54D2", "(", "E", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "(", "F", ")", "Percent", "area", "coverage", "of", "Iba1", "-", "proximal", "Siglec", "-", "F", "relative", "to", "total", "Iba1", "across", "all", "analyzed", "thalamic", ",", "cortical", ",", "and", "hippocampal", "regions", "of", "6", "month", "WT", "(", "non", "-", "Tg", ")", "and", "5XFAD", "mice", ".", "Box", "indicates", "quartiles", "and", "whiskers", "indicate", "the", "last", "datum", "within", "1", ".", "5", "inter", "-", "quartile", "range", ";", "n", "=", "15", "-", "40", "images", "(", "3", "-", "5", "animals", ")", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "(", "G", ")", "Percent", "area", "coverage", "of", "Siglec", "-", "F", "localized", "to", "Iba1", "compared", "to", "total", "Aβ", "plaque", "volume", "in", "each", "field", "of", "view", "across", "all", "analyzed", "images", "from", "5XFAD", "and", "non", "-", "Tg", "control", "mice", ".", "Linear", "regression", "R2", "value", "is", "shown", "for", "images", "with", "≥", "10", "μm2", "total", "amyloid", "volume", ".", "(", "H", ")", "Cumulative", "distribution", "function", "(", "CDF", ")", "of", "the", "distance", "between", "Siglec", "-", "F", "+", "and", "Iba1", "+", "mask", "voxels", "and", "nearest", "Aβ", "plaques", "in", "6", "month", "5XFAD", "mice", ".", "Each", "value", "in", "the", "CDF", "represents", "the", "mean", "distance", "calculated", "from", "a", "single", "z", "-", "stack", "of", "a", "ROI", "containing", "≥", "1", "plaque", "of", "size", "≥", "10", "μm2", ".", "n", "=", "55", "images", "(", "4", "animals", ")", ".", "(", "I", "-", "J", ")", "Relative", "RNA", "abundances", "for", "Siglec", "-", "8", "in", "(", "H", ")", "hippocampus", "and", "(", "I", ")", "posterior", "cingulate", "cortex", "post", "-", "mortem", "patient", "tissue", ".", "Linear", "regression", "R2", "values", "are", "shown", "on", "plots", ".", "(", "K", ")", "IF", "staining", "showing", "Siglec", "-", "8", "and", "Iba1", ",", "and", "MHC", "-", "II", "in", "cortical", "white", "matter", "tissue", "from", "a", "patient", "with", "late", "-", "onset", "AD", "(", "20x", "wide", "-", "field", ";", "Case", "ID", ":", "01", "-", "43", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "Images", "are", "60x", "super", "-", "resolution", "max", "z", "-", "stack", "projections", ".", "(", "L", "-", "M", ")", "Percent", "area", "coverage", "of", "Siglec", "-", "8", "localized", "to", "Iba1", "or", "MHC", "in", "individuals", "with", "non", "-", "AD", "or", "AD", ".", "In", "(", "K", ")", "each", "point", "represents", "one", "WM", "or", "GM", "region", "average", "from", "each", "individual", ".", "In", "(", "L", ")", "values", "and", "statistics", "are", "shown", "for", "each", "image", "analyzed", ".", "Boolean", "mask", "operators", "indicate", ":", "°", "=", "mask", "dilation", ",", "⋂", "=", "intersection", ",", "⋃", "=", "union", ",", "NOT", "=", "inverse", "mask", ".", "Box", "indicates", "quartiles", "and", "whiskers", "indicate", "the", "last", "datum", "within", "1", ".", "5", "inter", "-", "quartile", "range", ";", "n", "=", "8", "-", "43", "images", "(", "n", "=", "1", "ND", ",", "3", "early", "-", "onset", "AD", ",", "4", "late", "-", "onset", "AD", ")", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Immunofluorescence (IF) staining showing Siglec-F and Iba1 localization in hippocampus CA3 region of 3wk induced CK (top) or CK-p25 (bottom) mice. Scale bars = 50 μm. Colors are: Magenta = Iba1, Cyan = Siglec-F. Images are 60x super-resolution max z-stack projections taken from coronal slices. (B-C) Percent area coverage of (B) Iba1 and (C) Iba1-proximal Siglec-F between CK and CK-p25 mice across hippocampal regions. Bars indicate mean ± 95% CI; n = 3-4 animals; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. (D-E) IF staining of Siglec-F and Iba1 in (D) 5XFAD 2 month hypothalamus (HY) and (E) 5XFAD 6 month dentate gyrus (DG). Yellow = Aβ from methoxy X04 (D) or D54D2 (E). Scale bars = 50 μm. (F) Percent area coverage of Iba1-proximal Siglec-F relative to total Iba1 across all analyzed thalamic, cortical, and hippocampal regions of 6 month WT (non-Tg) and 5XFAD mice. Box indicates quartiles and whiskers indicate the last datum within 1.5 inter-quartile range; n = 15-40 images (3-5 animals); *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. (G) Percent area coverage of Siglec-F localized to Iba1 compared to total Aβ plaque volume in each field of view across all analyzed images from 5XFAD and non-Tg control mice. Linear regression R2 value is shown for images with ≥10 μm2 total amyloid volume.  (H) Cumulative distribution function (CDF) of the distance between Siglec-F+ and Iba1+ mask voxels and nearest Aβ plaques in 6 month 5XFAD mice. Each value in the CDF represents the mean distance calculated from a single z-stack of a ROI containing ≥ 1 plaque of size ≥10 μm2. n = 55 images (4 animals). (I-J) Relative RNA abundances for Siglec-8 in (H) hippocampus and (I) posterior cingulate cortex post-mortem patient tissue. Linear regression R2 values are shown on plots.(K) IF staining showing Siglec-8 and Iba1, and MHC-II in cortical white matter tissue from a patient with late-onset AD (20x wide-field; Case ID: 01-43). Scale bars = 50 μm. Images are 60x super-resolution max z-stack projections.(L-M) Percent area coverage of Siglec-8 localized to Iba1 or MHC in individuals with non-AD or AD. In (K) each point represents one WM or GM region average from each individual. In (L) values and statistics are shown for each image analyzed. Boolean mask operators indicate: ° = mask dilation, ⋂ = intersection, ⋃ = union, NOT = inverse mask. Box indicates quartiles and whiskers indicate the last datum within 1.5 inter-quartile range; n = 8-43 images (n = 1 ND, 3 early-onset AD, 4 late-onset AD); *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Flow", "cytometry", "quantification", "of", "BV", "-", "2", "Siglec", "-", "F", "expression", "levels", ".", "Cells", "were", "cotreated", "with", "0", "-", "10", "ng", "/", "mL", "IFNγ", "and", "0", "-", "10", "μM", "tofacitinib", ".", "Values", "are", "geometric", "mean", "fluorescence", "intensities", "(", "gMFI", ")", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "2", "-", "4", "replicates", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "untreated", "group", ".", "(", "B", ")", "IF", "staining", "of", "iMGLs", "treated", "with", "IFNγ", ".", "Siglec", "-", "8", "fluorescence", "is", "only", "shown", "on", "non", "-", "nuclear", "(", "Hoechst", "33342", "-", ")", "regions", ".", "Images", "are", "60x", "super", "-", "resolution", "max", "z", "-", "stack", "projections", ".", "Colors", "are", ":", "Red", "=", "Iba1", ",", "Green", "=", "Siglec", "-", "8", ",", "Blue", "=", "33342", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "Siglec", "-", "8", "on", "iMGLs", "treated", "with", "PBS", "or", "25", "ng", "/", "mL", "IFNα", ",", "IFNβ", ",", "or", "IFNγ", ".", "Values", "are", "mean", "Siglec", "-", "8", "intensity", "values", "from", "Iba1", "+", ";", "33342", "-", "regions", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "8", "images", "(", "2", "replicates", ")", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "untreated", "group", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "Siglec", "-", "8", "on", "iMGLs", "treated", "±", "25", "ng", "/", "mL", "IFNγ", "and", "5", "μM", "tofacitinib", ".", "Legend", "is", "same", "as", "(", "C", ")", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "5", "-", "20", "images", "(", "2", "replicates", ")", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "untreated", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Flow cytometry quantification of BV-2 Siglec-F expression levels. Cells were cotreated with 0-10 ng/mL IFNγ and 0-10 μM tofacitinib. Values are geometric mean fluorescence intensities (gMFI). Bars indicate mean ± 95% CI; n = 2-4 replicates; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of untreated group. (B) IF staining of iMGLs treated with IFNγ. Siglec-8 fluorescence is only shown on non-nuclear (Hoechst 33342-) regions. Images are 60x super-resolution max z-stack projections. Colors are: Red = Iba1, Green = Siglec-8, Blue = 33342. Scale bars = 20 μm. (C) Quantification of Siglec-8 on iMGLs treated with PBS or 25 ng/mL IFNα, IFNβ, or IFNγ. Values are mean Siglec-8 intensity values from Iba1+;33342- regions. Bars indicate mean ± 95% CI; n = 8 images (2 replicates); *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of untreated group.(D) Quantification of Siglec-8 on iMGLs treated ± 25 ng/mL IFNγ and 5 μM tofacitinib. Legend is same as (C). Bars indicate mean ± 95% CI; n = 5-20 images (2 replicates); *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of untreated group."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Confluency", "doubling", "times", "quantified", "from", "BV", "-", "2", "cells", "with", "stable", "retroviral", "expression", "of", "Siglec", "-", "F", "and", "related", "human", "Siglec", "constructs", ".", "Plots", "indicating", "doubling", "time", "(", "normalized", "to", "2xY", "-", ">", "F", "constructs", ")", "estimated", "from", "Incucyte", "bright", "-", "field", "images", ".", "Cells", "grown", "in", "media", "alone", "or", "+", "50", "mU", "sialidase", "(", "+", "SA", ")", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "3", "-", "12", "replicates", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "2xY", "-", ">", "F", "groups", ".", "(", "B", ")", "Flow", "cytometry", "quantification", "of", "cell", "live", "/", "dead", "markers", "Annexin", "-", "V", "and", "propidium", "iodide", "on", "BV", "-", "2", "cells", "with", "stable", "retrovirus", "expression", "of", "Siglec", "-", "F", "constructs", ".", "%", "parent", "values", "are", "shown", "for", "early", "apoptotic", "(", "Annexin", "-", "V", "+", ";", "PI", "‑", ")", ",", "late", "apoptotic", "(", "Annexin", "-", "V", "+", ";", "PI", "‑", ")", ",", "and", "necrotic", "(", "Annexin", "-", "V", "-", ";", "PI", "+", ")", "populations", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "8", "replicates", ".", "(", "C", ")", "Confluency", "doubling", "times", "quantified", "from", "BV", "-", "2", "cells", "with", "dox", "-", "inducible", "expression", "of", "Siglec", "-", "F", "constructs", ".", "Plots", "indicating", "doubling", "time", "(", "normalized", "to", "2xY", "-", ">", "F", "constructs", ")", "estimated", "from", "Incucyte", "bright", "-", "field", "images", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "8", "replicates", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "2xY", "-", ">", "F", "group", ".", "(", "D", ")", "Selected", "gene", "expression", "changes", "(", "top", ")", "and", "enriched", "gene", "sets", "(", "bottom", ")", "taken", "from", "RNA", "-", "seq", "analysis", "of", "BV", "-", "2", "cells", "with", "stable", "retroviral", "expression", "of", "Siglec", "constructs", ",", "2xY", "-", ">", "F", ",", "and", "empty", "vector", "controls", ".", "Heatmaps", "share", "a", "colormap", "range", "of", "0", ".", "25", "to", "4", "for", "z", "-", "score", "values", "(", "top", ")", ",", "normalized", "enrichment", "scores", "(", "NES", ",", "bottom", ")", ".", "(", "F", ")", "Expression", "levels", "of", "C1qa", ",", "IL", "-", "1β", ",", "and", "β", "-", "actin", "by", "qPCR", "analysis", "in", "BV", "-", "2", "cells", "with", "inducible", "Siglec", "-", "F", "expression", "after", "48", "hours", "of", "treatment", "with", "500", "ng", "/", "mL", "doxycycline", ".", "Fold", "Change", "values", "are", "equal", "to", "2ΔΔCq", "normalized", "relative", "to", "GADPH", "mRNA", "levels", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "6", "replicates", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "2xY", "-", ">", "F", "group", ".", "(", "G", ")", "Western", "blot", "showing", "pro", "-", "IL", "-", "1β", "and", "β", "-", "tubulin", "in", "BV", "-", "2", "cells", "induced", "to", "express", "Siglec", "-", "F", "at", "0", "and", "48", "hours", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 (A) Confluency doubling times quantified from BV-2 cells with stable retroviral expression of Siglec-F and related human Siglec constructs. Plots indicating doubling time (normalized to 2xY->F constructs) estimated from Incucyte bright-field images. Cells grown in media alone or + 50 mU sialidase (+SA). Bars indicate mean ± 95% CI; n = 3-12 replicates; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of 2xY->F groups. (B) Flow cytometry quantification of cell live / dead markers Annexin-V and propidium iodide on BV-2 cells with stable retrovirus expression of Siglec-F constructs. % parent values are shown for early apoptotic (Annexin-V+;PI‑), late apoptotic (Annexin-V+;PI‑), and necrotic (Annexin-V-;PI+) populations. Bars indicate mean ± SD; n = 8 replicates. (C) Confluency doubling times quantified from BV-2 cells with dox-inducible expression of Siglec-F constructs. Plots indicating doubling time (normalized to 2xY->F constructs) estimated from Incucyte bright-field images. Bars indicate mean ± SD; n = 8 replicates; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of 2xY->F group. (D) Selected gene expression changes (top) and enriched gene sets (bottom) taken from RNA-seq analysis of BV-2 cells with stable retroviral expression of Siglec constructs, 2xY->F, and empty vector controls. Heatmaps share a colormap range of 0.25 to 4 for z-score values (top), normalized enrichment scores (NES, bottom).(F) Expression levels of C1qa, IL-1β, and β-actin by qPCR analysis in BV-2 cells with inducible Siglec-F expression after 48 hours of treatment with 500 ng/mL doxycycline. Fold Change values are equal to 2ΔΔCq normalized relative to GADPH mRNA levels. Bars indicate mean ± 95% CI; n = 6 replicates; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of 2xY->F group.(G) Western blot showing pro-IL-1β and β-tubulin in BV-2 cells induced to express Siglec-F at 0 and 48 hours."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", "-", "C", ")", "Volcano", "plots", "showing", "phosphotyrosine", "peptides", "that", "were", "(", "B", ")", "increased", "or", "(", "C", ")", "decreased", "after", "Siglec", "-", "F", "expression", ".", "Plots", "show", "Siglec", "-", "F", "compared", "to", "2xY", "-", ">", "F", "mutant", "data", "integrated", "across", "all", "three", "runs", ".", "Protein", "names", "are", "shown", "for", "altered", "peptides", ".", "Labels", "are", "only", "shown", "for", "peptides", "with", "maximum", "directional", "change", "from", "each", "protein", ".", "Labels", "colored", "according", "to", "GO", "terms", ":", "magenta", "=", "signal", "transduction", ",", "red", "=", "endosome", ",", "cyan", "=", "cell", "adhesion", ",", "yellow", "=", "cytoskeleton", ",", "green", "=", "metabolism", ".", "(", "D", ")", "Heatmap", "showing", "phosphosites", "in", "CK", "-", "p25", "which", "overlapped", "in", "their", "directional", "change", "with", "BV", "-", "2", "Siglec", "-", "F", "-", "associated", "sites", ".", "Colors", "indicate", "fold", "change", "relative", "to", "2xY", "-", ">", "F", "controls", ".", "Heatmap", "showing", "phosphosites", "from", "CD33", ",", "Siglec", "-", "5", ",", "and", "Siglec", "-", "8", "overexpression", "that", "were", "increased", "with", "Siglec", "expression", "and", "shared", "their", "directional", "change", "with", "Siglec", "-", "F", ".", "Siglec", "-", "F", "column", "indicates", "average", "of", "all", "untreated", "Siglec", "-", "F", "replicates", ".", "Color", "scale", "is", "same", "as", "(", "D", ")", ".", "Heatmap", "showing", "phosphosites", "from", "CD33", ",", "Siglec", "-", "5", ",", "and", "Siglec", "-", "8", "overexpression", "that", "were", "decreased", "with", "Siglec", "expression", "and", "shared", "their", "directional", "change", "with", "Siglec", "-", "F", ".", "Siglec", "-", "F", "column", "indicates", "average", "of", "all", "untreated", "Siglec", "-", "F", "replicates", ".", "Color", "scale", "is", "same", "as", "(", "D", ")", ".", "(", "G", ")", "Western", "blot", "quantification", "of", "myc", ",", "SHP", "-", "2", ",", "and", "SHP", "-", "1", "from", "myc", "co", "-", "IP", "eluates", ".", "Co", "-", "IP", "lysates", "were", "prepared", "from", "BV", "-", "2", "cells", "stably", "expressing", "Siglec", "-", "F", "and", "optionally", "treated", "with", "1", "μM", "SHP099", ".", "(", "H", ")", "Heatmap", "showing", "phosphosites", "that", "were", "perturbed", "by", "SHP099", "treatment", ".", "Color", "scale", "is", "same", "as", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B-C) Volcano plots showing phosphotyrosine peptides that were (B) increased or (C) decreased after Siglec-F expression. Plots show Siglec-F compared to 2xY->F mutant data integrated across all three runs. Protein names are shown for altered peptides. Labels are only shown for peptides with maximum directional change from each protein. Labels colored according to GO terms: magenta = signal transduction, red = endosome, cyan = cell adhesion, yellow = cytoskeleton, green = metabolism. (D) Heatmap showing phosphosites in CK-p25 which overlapped in their directional change with BV-2 Siglec-F-associated sites. Colors indicate fold change relative to 2xY->F controls.  Heatmap showing phosphosites from CD33, Siglec-5, and Siglec-8 overexpression that were increased with Siglec expression and shared their directional change with Siglec-F. Siglec-F column indicates average of all untreated Siglec-F replicates. Color scale is same as (D).  Heatmap showing phosphosites from CD33, Siglec-5, and Siglec-8 overexpression that were decreased with Siglec expression and shared their directional change with Siglec-F. Siglec-F column indicates average of all untreated Siglec-F replicates. Color scale is same as (D). (G) Western blot quantification of myc, SHP-2, and SHP-1 from myc co-IP eluates. Co-IP lysates were prepared from BV-2 cells stably expressing Siglec-F and optionally treated with 1 μM SHP099.(H) Heatmap showing phosphosites that were perturbed by SHP099 treatment. Color scale is same as (D)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", "-", "C", ")", "Flow", "cytometry", "quantification", "of", "fluorescent", "monomeric", "Aβ", "uptake", "and", "Siglec", "-", "F", "expression", "for", "(", "B", ")", "Siglec", "-", "F", "and", "(", "C", ")", "Siglec", "-", "F", "2xY", "-", ">", "F", ".", "Siglec", "-", "expressing", "cells", "were", "plated", "with", "empty", "vector", "control", "cells", "in", "the", "same", "well", "alongside", "fluorescent", "substrates", ".", "Quantification", "of", "relative", "mean", "fluorescence", "intensities", "(", "MFI", ")", "between", "empty", "vector", "and", "Siglec", "-", "expressing", "populations", ".", "Relative", "values", "are", "shown", "for", "each", "mouse", "and", "human", "Siglec", "construct", "for", "uptake", "of", "monomeric", "Aβ", ",", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "6", "replicates", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "2xY", "-", ">", "F", "group", ".", "Quantification", "of", "relative", "mean", "fluorescence", "intensities", "(", "MFI", ")", "between", "empty", "vector", "and", "Siglec", "-", "expressing", "populations", ".", "Relative", "values", "are", "shown", "for", "each", "mouse", "and", "human", "Siglec", "construct", "for", "uptake", "of", "10", ",", "000", "MW", "Dextran", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "6", "replicates", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "2xY", "-", ">", "F", "group", ".", "Quantification", "of", "relative", "mean", "fluorescence", "intensities", "(", "MFI", ")", "between", "empty", "vector", "and", "Siglec", "-", "expressing", "populations", ".", "Relative", "values", "are", "shown", "for", "each", "mouse", "and", "human", "Siglec", "construct", "for", "uptake", "of", "1", "μm", "FluoSpheres", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "6", "replicates", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "2xY", "-", ">", "F", "group", ".", "(", "G", ")", "pHrodo", "Dextran", "uptake", "in", "BV", "-", "2", "cells", "with", "stable", "expression", "of", "Siglec", "-", "F", "estimated", "by", "Incucyte", "measurements", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "6", "replicates", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "(", "H", ")", "pHrodo", "dextran", "uptake", "in", "BV", "-", "2", "cells", "stably", "expressing", "Siglec", "-", "F", "with", "0", "-", "2", ".", "5", "μM", "SHP099", "treatment", ".", "Data", "is", "from", "the", "same", "experiment", "as", "(", "G", ")", ".", "(", "I", ")", "Confluency", "doubling", "times", "for", "BV", "-", "2", "cells", "with", "stable", "expression", "of", "Siglec", "-", "F", "with", "0", "-", "2", ".", "5", "μM", "SHP099", "treatment", ".", "Data", "is", "from", "the", "same", "experiment", "as", "(", "G", ")", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "95", "%", "CI", ";", "n", "=", "4", "replicates", ";", "*", ":", "p", "<", "5e", "-", "2", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "2", ",", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "1e", "-", "4", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "sided", ".", "Dotted", "line", "indicates", "mean", "of", "untreated", "2xY", "-", ">", "F", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B-C) Flow cytometry quantification of fluorescent monomeric Aβ uptake and Siglec-F expression for (B) Siglec-F and (C) Siglec-F 2xY->F. Siglec-expressing cells were plated with empty vector control cells in the same well alongside fluorescent substrates.Quantification of relative mean fluorescence intensities (MFI) between empty vector and Siglec-expressing populations. Relative values are shown for each mouse and human Siglec construct for uptake of monomeric Aβ, Bars indicate mean ± 95% CI; n = 6 replicates; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of 2xY->F group. Quantification of relative mean fluorescence intensities (MFI) between empty vector and Siglec-expressing populations. Relative values are shown for each mouse and human Siglec construct for uptake of 10,000 MW Dextran Bars indicate mean ± 95% CI; n = 6 replicates; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of 2xY->F group.  Quantification of relative mean fluorescence intensities (MFI) between empty vector and Siglec-expressing populations. Relative values are shown for each mouse and human Siglec construct for uptake of 1 μm FluoSpheres. Bars indicate mean ± 95% CI; n = 6 replicates; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of 2xY->F group. (G) pHrodo Dextran uptake in BV-2 cells with stable expression of Siglec-F estimated by Incucyte measurements. Bars indicate mean ± 95% CI; n = 6 replicates; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. (H) pHrodo dextran uptake in BV-2 cells stably expressing Siglec-F with 0 - 2.5 μM SHP099 treatment. Data is from the same experiment as (G).  (I) Confluency doubling times for BV-2 cells with stable expression of Siglec-F with 0 - 2.5 μM SHP099 treatment. Data is from the same experiment as (G). Bars indicate mean ± 95% CI; n = 4 replicates; *: p < 5e-2, **: p < 1e-2, ***: p < 1e-3, ****: p < 1e-4; ns: not significant, using unpaired Student's t-test, two-sided. Dotted line indicates mean of untreated 2xY->F group. "}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Flow", "cytometry", "of", "cells", "infected", "with", "the", "lentiCRISPR", "v2", ".", "0", "library", "where", "the", "expression", "of", "GFP", "indicates", "latency", "reactivation", ".", "Target", "genes", "were", "enriched", "through", "two", "-", "round", "sorting", ".", "Continuously", "cultured", "C11", "latent", "cells", "infected", "with", "the", "lentiCRISPRv2", ".", "0", "served", "as", "control", ".", "Blue", "dots", "and", "the", "encircled", "area", "represent", "the", "GFP", "-", "positive", "cells", "for", "flow", "cytometry", "analysis", ".", "C", ".", "Validation", "of", "sgRNAs", "in", "unsorted", "and", "sorted", "C11", "cells", "by", "PCR", "after", "lentiCRISPR", "v2", ".", "0", "library", "infection", ".", "D", ".", "Before", "next", "generation", "sequencing", ",", "the", "GFP", "expression", "in", "two", "-", "round", "sorted", "C11", "cells", "was", "confirmed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "E", ".", "Fold", "change", "(", "Log2", ")", "of", "the", "abundance", "of", "target", "genes", "in", "sorted", "C11", "cells", ".", "Enriched", "sgRNA", "genes", "are", "highlighted", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Flow cytometry of cells infected with the lentiCRISPR v2.0 library where the expression of GFP indicates latency reactivation. Target genes were enriched through two-round sorting. Continuously cultured C11 latent cells infected with the lentiCRISPRv2.0 served as control. Blue dots and the encircled area represent the GFP-positive cells for flow cytometry analysis.C. Validation of sgRNAs in unsorted and sorted C11 cells by PCR after lentiCRISPR v2.0 library infection.D. Before next generation sequencing, the GFP expression in two-round sorted C11 cells was confirmed by fluorescence microscopy. Scale bar, 100 μm.E. Fold change (Log2) of the abundance of target genes in sorted C11 cells. Enriched sgRNA genes are highlighted."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Validation", "of", "the", "top", "candidate", "genes", "in", "the", "C11", "cell", "line", ".", "C11", "cells", "were", "infected", "by", "lentiCRISPR", "v2", ".", "0", "packaged", "lentiviruses", "with", "sgRNA", "following", "by", "screening", "for", "14", "days", "with", "2", "µg", "/", "ml", "puromycin", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", "to", "determine", "the", "level", "of", "HIV", "-", "1", "reactivation", ".", "The", "effect", "of", "candidate", "genes", "on", "HIV", "latency", "was", "further", "verified", "in", "J", "-", "Lat", "10", ".", "6", "(", "B", ")", "models", "of", "HIV", "latency", ".", "GFP", "expression", "in", "J", "-", "Lat", "10", ".", "6", "cells", "was", "analyzed", "by", "flow", "cytometryThe", "effect", "of", "candidate", "genes", "on", "HIV", "latency", "was", "further", "verified", "in", "ACH2", "(", "C", ")", "models", "of", "HIV", "latency", ".", "p24", "in", "ACH2", "cells", "was", "analyzed", "by", "ELISA", ",", "respectively", ".", "E", ".", "PEBP1", "protein", "levels", "were", "measured", "by", "Western", "blot", "after", "knock", "out", "in", "C11", "cells", "by", "LvPEBP1", "-", "sg1", ".", "Mock", "C11", "cells", "served", "as", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Validation of the top candidate genes in the C11 cell line. C11 cells were infected by lentiCRISPR v2.0 packaged lentiviruses with sgRNA following by screening for 14 days with 2 µg/ml puromycin. The percentage of GFP-positive cells was measured by flow cytometry to determine the level of HIV-1 reactivation.The effect of candidate genes on HIV latency was further verified in J-Lat 10.6 (B) models of HIV latency. GFP expression in J-Lat 10.6 cells was analyzed by flow cytometryThe effect of candidate genes on HIV latency was further verified in ACH2 (C) models of HIV latency. p24 in ACH2 cells was analyzed by ELISA, respectively.E. PEBP1 protein levels were measured by Western blot after knock out in C11 cells by LvPEBP1-sg1. Mock C11 cells served as control."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "PEBP1", "expression", "was", "measured", "by", "qPCR", "(", "left", "panel", ")", "and", "Western", "blot", "(", "right", "panel", ")", "in", "the", "latently", "infected", "C11", "cells", "and", "the", "parental", "Jurkat", "cells", ".", "B", ".", "The", "immunoprecipitation", "assay", "was", "performed", "in", "C11", "cell", "lysates", "with", "anti", "-", "PEBP1", "antibody", "followed", "by", "Western", "blot", "with", "anti", "-", "Raf1", "or", "anti", "-", "IKK", "antibodies", ".", "Effect", "of", "PEBP1", "on", "the", "Raf1", "/", "ERK", "/", "IκB", "and", "IKK", "/", "IκB", "/", "NF", "-", "κB", "signaling", "pathways", ".", "The", "levels", "of", "indicated", "proteins", "in", "total", "protein", "lysates", "(", "C", ")", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "in", "C11", "-", "PEBP1", "-", "KO", "cells", "and", "mock", "C11", "cells", ".", "Effect", "of", "PEBP1", "on", "the", "Raf1", "/", "ERK", "/", "IκB", "and", "IKK", "/", "IκB", "/", "NF", "-", "κB", "signaling", "pathways", ".", "the", "levels", "of", "NF", "-", "κB", "/", "p65", "protein", "in", "nucleus", "(", "D", ")", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "in", "C11", "-", "PEBP1", "-", "KO", "cells", "and", "mock", "C11", "cells", ".", "E", ".", "NF", "-", "κB", "/", "p65", "protein", "recruitment", "into", "HIV", "LTR", "was", "analyzed", "by", "ChIP", "-", "qPCR", "with", "specific", "primers", "targeting", "the", "HIV", "LTR", "after", "normalization", "to", "the", "input", ".", "F", ".", "The", "impact", "of", "PEBP1", "on", "the", "activation", "of", "the", "HIV", "LTR", "was", "explored", "by", "luciferase", "reporter", "assay", "in", "293T", "cells", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "PEBP1", "-", "sg1", "alone", "or", "PEBP1", "-", "sg1", "with", "HIV", "-", "1", "LTR", "-", "empty", "plasmids", ",", "HIV", "-", "1", "wild", "type", "LTR", "-", "luciferase", "plasmids", ",", "HIV", "-", "1", "LTR", "-", "Δsp1", "-", "luciferase", ",", "HIV", "-", "1", "LTR", "-", "ΔNF", "-", "κB", "-", "luciferase", ",", "HIV", "-", "1", "LTR", "-", "ΔAp1", "-", "luciferase", "or", "HIV", "-", "1", "LTR", "-", "ΔYY1", "-", "luciferase", ".", "Transcription", "of", "HIV", "-", "1", "was", "determined", "by", "luciferase", "reporter", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. PEBP1 expression was measured by qPCR (left panel) and Western blot (right panel) in the latently infected C11 cells and the parental Jurkat cells.B. The immunoprecipitation assay was performed in C11 cell lysates with anti-PEBP1 antibody followed by Western blot with anti-Raf1 or anti-IKK antibodies.Effect of PEBP1 on the Raf1/ERK/IκB and IKK/IκB/NF-κB signaling pathways. The levels of indicated proteins in total protein lysates (C) were analysed by Western blot in C11-PEBP1-KO cells and mock C11 cells.Effect of PEBP1 on the Raf1/ERK/IκB and IKK/IκB/NF-κB signaling pathways. the levels of NF-κB/p65 protein in nucleus (D) were analysed by Western blot in C11-PEBP1-KO cells and mock C11 cells.E. NF-κB/p65 protein recruitment into HIV LTR was analyzed by ChIP-qPCR with specific primers targeting the HIV LTR after normalization to the input.F. The impact of PEBP1 on the activation of the HIV LTR was explored by luciferase reporter assay in 293T cells. 293T cells were co-transfected with PEBP1-sg1 alone or PEBP1-sg1 with HIV-1 LTR-empty plasmids, HIV-1 wild type LTR-luciferase plasmids, HIV-1 LTR-Δsp1-luciferase, HIV-1 LTR-ΔNF-κB-luciferase, HIV-1 LTR-ΔAp1-luciferase or HIV-1 LTR-ΔYY1-luciferase. Transcription of HIV-1 was determined by luciferase reporter assay."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "The", "expression", "of", "PEBP1", "was", "analysed", "by", "Western", "blot", "in", "TZM", "-", "bl", "cells", "infected", "with", "mock", ",", "Lv", "-", "PCDH", "-", "empty", "or", "Lv", "-", "PCDH", "-", "PEBP1", "plasmids", ".", "Overexpression", "of", "PEBP1", "suppressed", "HIV", "-", "1", "replication", ".", "TZM", "-", "bl", "cells", "were", "transfected", "with", "Lv", "-", "PCDH", "-", "empty", "or", "Lv", "-", "PCDH", "-", "PEBP1", "followed", "by", "infection", "of", "HIV", "derived", "from", "patient", "plasma", "whose", "viral", "load", "is", "129", "copies", "/", "ml", ".", "The", "transcription", "of", "HIV", "-", "1", "was", "evaluated", "72", "h", "post", "-", "infection", "by", "luciferase", "activityOverexpression", "of", "PEBP1", "suppressed", "HIV", "-", "1", "replication", ".", "TZM", "-", "bl", "cells", "were", "transfected", "with", "Lv", "-", "PCDH", "-", "empty", "or", "Lv", "-", "PCDH", "-", "PEBP1", "followed", "by", "infection", "of", "HIV", "derived", "from", "patient", "plasma", "whose", "viral", "load", "is", "129", "copies", "/", "ml", ".", "levels", "of", "p24", "in", "the", "supernatants", "(", "C", ")", ".", "D", ".", "The", "expression", "level", "of", "PEBP1", "was", "detected", "by", "Western", "blot", "using", "the", "whole", "cell", "lysate", "of", "C11", "cells", "treated", "with", "10", "μM", "EGCG", "or", "DHA", "for", "24", "h", ".", "E", ".", "Induction", "of", "PEBP1", "by", "EGCG", "or", "DHA", "in", "HIV", "-", "1", "infected", "primary", "CD4", "+", "T", "cells", ".", "Primary", "CD4", "+", "T", "cells", "from", "healthy", "donors", "were", "treated", "with", "10", "μM", "EGCG", "or", "DHA", "during", "HIV", "-", "1", "infection", ".", "Similar", "to", "Panel", "B", ",", "HIV", "-", "1", "was", "isolated", "from", "the", "blood", "supernatants", "of", "patients", "receiving", "ART", "with", "a", "viral", "load", "of", "129", "copies", "/", "ml", ".", "Seventy", "-", "two", "hours", "post", "-", "treatment", "with", "10", "µM", "EGCG", "or", "DHA", ",", "the", "expression", "of", "PEBP1", "was", "detected", "by", "qPCR", ".", "F", ".", "The", "induction", "of", "PEBP1", "by", "EGCG", "or", "DHA", "suppressed", "HIV", "replication", "in", "the", "primary", "CD4", "+", "T", "cells", ".", "The", "primary", "CD4", "+", "T", "cells", "from", "healthy", "donors", "were", "treated", "with", "10", "μM", "EGCG", "or", "DHA", "during", "HIV", "-", "1", "infection", ".", "Similar", "to", "Panel", "B", "and", "E", ",", "HIV", "-", "1", "was", "isolated", "from", "the", "blood", "supernatants", "of", "patients", "receiving", "ART", "with", "a", "viral", "load", "of", "129", "copies", "/", "ml", ".", "The", "supernatants", "from", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "CD4", "+", "T", "cell", "were", "collected", "1", ",", "2", ",", "3", "or", "4", "days", "post", "-", "infection", ".", "Replication", "of", "HIV", "-", "1", "was", "analyzed", "by", "p24", "ELISA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. The expression of PEBP1 was analysed by Western blot in TZM-bl cells infected with mock, Lv-PCDH-empty or Lv-PCDH-PEBP1 plasmids.Overexpression of PEBP1 suppressed HIV-1 replication. TZM-bl cells were transfected with Lv-PCDH-empty or Lv-PCDH-PEBP1 followed by infection of HIV derived from patient plasma whose viral load is 129 copies/ml. The transcription of HIV-1 was evaluated 72 h post-infection by luciferase activityOverexpression of PEBP1 suppressed HIV-1 replication. TZM-bl cells were transfected with Lv-PCDH-empty or Lv-PCDH-PEBP1 followed by infection of HIV derived from patient plasma whose viral load is 129 copies/ml. levels of p24 in the supernatants (C).D. The expression level of PEBP1 was detected by Western blot using the whole cell lysate of C11 cells treated with 10 μM EGCG or DHA for 24 h.E. Induction of PEBP1 by EGCG or DHA in HIV-1 infected primary CD4+ T cells. Primary CD4+ T cells from healthy donors were treated with 10 μM EGCG or DHA during HIV-1 infection. Similar to Panel B, HIV-1 was isolated from the blood supernatants of patients receiving ART with a viral load of 129 copies/ml. Seventy-two hours post-treatment with 10 µM EGCG or DHA, the expression of PEBP1 was detected by qPCR.F. The induction of PEBP1 by EGCG or DHA suppressed HIV replication in the primary CD4+ T cells. The primary CD4+ T cells from healthy donors were treated with 10 μM EGCG or DHA during HIV-1 infection. Similar to Panel B and E, HIV-1 was isolated from the blood supernatants of patients receiving ART with a viral load of 129 copies/ml. The supernatants from HIV-1-infected CD4+ T cell were collected 1, 2, 3 or 4 days post-infection. Replication of HIV-1 was analyzed by p24 ELISA."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "EGCG", "inhibited", "α", "-", "CD3", "/", "CD28", "reactivation", "of", "latent", "HIV", "-", "1", ".", "Primary", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "isolated", "from", "HIV", "-", "1", "positive", "patients", "on", "antiretroviral", "therapy", "(", "n", "=", "5", ",", "P1", "-", "P5", ")", ".", "Primary", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "treated", "with", "α", "-", "CD3", "/", "CD28", "alone", "or", "α", "-", "CD3", "/", "CD28", "and", "10", "µM", "EGCG", ".", "Cell", "-", "associated", "RNA", "was", "extracted", "7", "days", "post", "-", "treatment", ".", "The", "transcription", "of", "HIV", "-", "1", "was", "determined", "by", "real", "-", "time", "qPCR", ".", "B", ".", "PEBP1", "mRNA", "was", "induced", "by", "EGCG", "in", "patient", "primary", "CD4", "+", "T", "cells", ".", "Primary", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μM", "EGCG", ".", "The", "expression", "of", "PEBP1", "in", "the", "cells", "was", "measured", "by", "qPCR", ".", "C", ".", "PEBP1", "protein", "was", "induced", "by", "EGCG", "in", "patient", "primary", "CD4", "+", "T", "cells", ",", "which", "was", "determined", "by", "Western", "blot", "of", "whole", "cell", "lysate", "from", "primary", "CD4", "+", "T", "cells", ".", "D", ".", "EGCG", "-", "induced", "PEBP1", "suppressed", "nuclear", "entry", "of", "NF", "-", "κB", "/", "p65", ".", "This", "was", "measured", "by", "Western", "blot", "of", "nuclear", "protein", "of", "primary", "CD4", "+", "T", "cells", "treated", "with", "α", "-", "CD3", "/", "CD28", "or", "α", "-", "CD3", "/", "CD28", "plus", "10", "μM", "EGCG", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. EGCG inhibited α-CD3/CD28 reactivation of latent HIV-1. Primary CD4+ T cells were isolated from HIV-1 positive patients on antiretroviral therapy (n=5, P1-P5). Primary CD4+ T cells were treated with α-CD3/CD28 alone or α-CD3/CD28 and 10 µM EGCG. Cell-associated RNA was extracted 7 days post-treatment. The transcription of HIV-1 was determined by real-time qPCR.B. PEBP1 mRNA was induced by EGCG in patient primary CD4+ T cells. Primary CD4+ T cells were treated with 10 μM EGCG. The expression of PEBP1 in the cells was measured by qPCR.C. PEBP1 protein was induced by EGCG in patient primary CD4+ T cells, which was determined by Western blot of whole cell lysate from primary CD4+ T cells.D. EGCG-induced PEBP1 suppressed nuclear entry of NF-κB/p65. This was measured by Western blot of nuclear protein of primary CD4+ T cells treated with α-CD3/CD28 or α-CD3/CD28 plus 10 μM EGCG."}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Transcription", "of", "HIV", "-", "1", "in", "the", "primary", "CD4", "+", "T", "cells", "was", "determined", "by", "nanoluc", "luciferase", "assays", "during", "HIV", "-", "1", "infection", ".", "C", ".", "After", "infection", "with", "VSV", "-", "G", "pseudotyped", "HIV", "-", "1", "NL4", ".", "3", "-", "nanoluc", ",", "the", "mRNA", "expression", "of", "PEBP1", "was", "measured", "by", "qPCR", ".", "Jurkat", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "α", ",", "IFN", "-", "β", "and", "IFN", "-", "γ", "for", "24", "h", ".", "The", "mRNA", "expression", "levels", "of", "PEBP1", "were", "measured", "by", "qPCRJurkat", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "α", ",", "IFN", "-", "β", "and", "IFN", "-", "γ", "for", "24", "h", ".", "The", "protein", "expression", "levels", "of", "PEBP1", "were", "measured", "by", "Western", "blot", ".", "F", ".", "PEBP1", "knockout", "enhanced", "HIV", "-", "1", "transcription", "in", "the", "primary", "CD4", "+", "T", "cell", "model", "of", "latency", ".", "The", "expression", "of", "HIV", "-", "1", "was", "measured", "by", "nanoluc", "after", "gene", "knockout", "where", "α", "-", "CD3", "/", "CD28", "stimulation", "served", "as", "a", "positive", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Transcription of HIV-1 in the primary CD4+ T cells was determined by nanoluc luciferase assays during HIV-1 infection.C. After infection with VSV-G pseudotyped HIV-1 NL4.3-nanoluc, the mRNA expression of PEBP1 was measured by qPCR.Jurkat CD4+ T cells were treated with IFN-α, IFN-β and IFN-γ for 24 h. The mRNA expression levels of PEBP1 were measured by qPCRJurkat CD4+ T cells were treated with IFN-α, IFN-β and IFN-γ for 24 h. The protein expression levels of PEBP1 were measured by Western blot.F. PEBP1 knockout enhanced HIV-1 transcription in the primary CD4+ T cell model of latency. The expression of HIV-1 was measured by nanoluc after gene knockout where α-CD3/CD28 stimulation served as a positive control."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Neural", "precursors", "derived", "from", "human", "iPS", "cells", "(", "iNPCs", ")", "were", "mock", "or", "ZIKV", "-", "infected", "and", "co", "-", "stained", "for", "Centrin", "(", "green", ")", ",", "Sox2", "(", "blue", ")", "and", "flavivirus", "envelope", "(", "red", ")", ".", "All", "cells", "were", "fixed", "16", "hours", "post", "infection", "(", "hpi", ")", ".", "(", "B", ")", "Mock", "and", "ZIKV", "-", "infected", "U87", "and", "H4", "cells", "in", "S", "phase", "co", "-", "stained", "for", "Centrin", "(", "green", ")", ",", "flavivirus", "envelope", "(", "red", ")", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "mock", "or", "ZIKV", "-", "infected", "iNPC", ",", "U87", "or", "H4", "cells", "in", "S", "phase", "with", "greater", "than", "four", "Centrin", "foci", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "normalized", "to", "the", "control", ".", "Asterisk", "denotes", "p", "<", "0", ".", "005", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Three", "biological", "replicates", "are", "represented", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "indicate", "100nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Neural precursors derived from human iPS cells (iNPCs) were mock or ZIKV-infected and co-stained for Centrin (green), Sox2 (blue) and flavivirus envelope (red). All cells were fixed 16 hours post infection (hpi). (B) Mock and ZIKV-infected U87 and H4 cells in S phase co-stained for Centrin (green), flavivirus envelope (red) and DNA (blue). (C) Quantification of the percentage of mock or ZIKV-infected iNPC, U87 or H4 cells in S phase with greater than four Centrin foci. Bars represent the mean ± SD normalized to the control. Asterisk denotes p<0.005 (Student's t test). Three biological replicates are represented. Data information: Scale bars indicate 100nm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Mock", "or", "ZIKV", "-", "infected", "U87", "cells", "in", "S", "phase", "co", "-", "stained", "for", "Centrin", "(", "red", ")", "and", "the", "centrosomal", "microcephaly", "-", "associated", "protein", ",", "CEP63", "(", "green", ")", ".", "(", "B", ")", "The", "fluorescence", "intensity", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "CEP63", "at", "the", "centrosome", "(", "0", ".", "5μm", "around", "the", "Centrin", "signal", ")", "and", "around", "the", "centrosome", "(", "1μm", "surrounding", "the", "Centrin", "signal", "minus", "the", "centrosomal", "CEP63", ")", "were", "quantified", "in", "mock", "and", "ZIKV", "infected", "U87", "cells", ".", "For", "fluorescence", "quantifications", "8", "cells", "were", "analyzed", "per", "experiment", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Asterisk", "denotes", "p", "<", "0", ".", "005", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "indicate", "5μm", "for", "all", "images", ".", "All", "cells", "were", "fixed", "16", "hours", "post", "infection", "(", "hpi", ")", ",", "(", "D", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "lysate", "from", "mock", "or", "ZIKV", "-", "infected", "U87", "cells", "probed", "for", "CEP63", "and", "ZIKV", "NS3", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Asterisk", "denotes", "specific", "band", "for", "CEP63", ".", "(", "E", ")", "S", "-", "phase", "mock", "and", "ZIKV", "infected", "control", "and", "Cep63gt", "/", "gt", "MEFs", "co", "-", "stained", "for", "Centrin", "(", "green", ")", "and", "flavivirus", "envelope", "(", "red", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "mock", "or", "ZIKV", "-", "infected", "Het", "and", "Cep63gt", "/", "gt", "MEFs", "in", "S", "phase", "with", "greater", "than", "four", "Centrin", "foci", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "normalized", "to", "the", "control", ".", "Asterisk", "denotes", "p", "<", "0", ".", "005", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Three", "biological", "replicates", "are", "represented", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "indicate", "5μm", "for", "all", "images", ".", "All", "cells", "were", "fixed", "16", "hours", "post", "infection", "(", "hpi", ")", ","], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Mock or ZIKV-infected U87 cells in S phase co-stained for Centrin (red) and the centrosomal microcephaly-associated protein, CEP63 (green). (B) The fluorescence intensity ± s.d. of CEP63 at the centrosome (0.5μm around the Centrin signal) and around the centrosome (1μm surrounding the Centrin signal minus the centrosomal CEP63) were quantified in mock and ZIKV infected U87 cells. For fluorescence quantifications 8 cells were analyzed per experiment (n=3). Asterisk denotes p<0.005 (Student's t test). Data information: Scale bars indicate 5μm for all images. All cells were fixed 16 hours post infection (hpi),(D) Immunoblot analysis of lysate from mock or ZIKV-infected U87 cells probed for CEP63 and ZIKV NS3. Actin served as a loading control. Asterisk denotes specific band for CEP63.(E) S-phase mock and ZIKV infected control and Cep63gt/gt MEFs co-stained for Centrin (green) and flavivirus envelope (red). (F) Quantification of the percentage of mock or ZIKV-infected Het and Cep63gt/gt MEFs in S phase with greater than four Centrin foci. Bars represent the mean ± SD normalized to the control. Asterisk denotes p<0.005 (Student's t test). Three biological replicates are represented. Data information: Scale bars indicate 5μm for all images. All cells were fixed 16 hours post infection (hpi),"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Mock", "or", "ZIKV", "-", "infected", "U87", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "for", "CEP63", "or", "c", "-", "Myc", ",", "which", "served", "as", "a", "negative", "control", "for", "this", "and", "other", "immunoprecipitations", "(", "Control", ")", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "immunoblotted", "for", "CEP63", "and", "NS3", ".", "Asterisk", "denotes", "specific", "band", ".", "(", "C", ")", "We", "expressed", "Myc", "-", "tagged", "Brazilian", "Zika", "NS3", "in", "293T", "/", "17", "cells", "and", "immunoprecipitated", "c", "-", "Myc", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "probed", "for", "the", "Myc", "tag", "of", "NS3", "and", "endogenous", "CEP63", ".", "The", "centriole", "distal", "end", "component", ",", "CP110", "served", "as", "a", "negative", "control", ".", "Asterisk", "denotes", "specific", "band", "for", "CEP63", ".", "(", "G", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "Control", "or", "Myc", "-", "tagged", "Brazilian", "ZIKV", "NS3", "(", "Br", "NS3", ")", "co", "-", "stained", "for", "Myc", "(", "red", ")", "and", "Centrin", "(", "green", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "indicate", "5μm", "for", "all", "images", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "control", "and", "NS3", "expressing", "HeLa", "cells", "with", "greater", "than", "four", "Centrin", "foci", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "normalized", "to", "the", "control", ".", "For", "all", "quantifications", "at", "least", "100", "cells", "were", "counted", "per", "experiment", "(", "biological", "replicates", "=", "3", ")", ".", "p", "<", "0", ".", "005", "(", "paired", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "for", "the", "comparison", "of", "NS3", "to", "mock", "transfected", "cells", "was", "denoted", "with", "asterisk", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Mock or ZIKV-infected U87 cell lysates were immunoprecipitated for CEP63 or c-Myc, which served as a negative control for this and other immunoprecipitations (Control). Precipitated proteins were immunoblotted for CEP63 and NS3. Asterisk denotes specific band.(C) We expressed Myc-tagged Brazilian Zika NS3 in 293T/17 cells and immunoprecipitated c-Myc. Precipitated proteins were probed for the Myc tag of NS3 and endogenous CEP63. The centriole distal end component, CP110 served as a negative control. Asterisk denotes specific band for CEP63.(G) HeLa cells transfected with Control or Myc-tagged Brazilian ZIKV NS3 (Br NS3) co-stained for Myc (red) and Centrin (green). Data information: Scale bars indicate 5μm for all images.(H) Quantification of the percentage of control and NS3 expressing HeLa cells with greater than four Centrin foci. Bars represent the mean ± SD normalized to the control. For all quantifications at least 100 cells were counted per experiment (biological replicates=3). p<0.005 (paired Student's t test) for the comparison of NS3 to mock transfected cells was denoted with asterisk."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "HeLa", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibodies", "to", "CEP63", "and", "TBK1", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "immunoblotted", "for", "CEP63", "and", "TBK1", ".", "(", "B", ")", "Mock", "and", "ZIKV", "-", "infected", "U87", "cells", "were", "co", "-", "stained", "for", "γ", "-", "tubulin", "(", "red", ")", "and", "p", "-", "TBK1", "(", "green", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "indicate", "5μm", "for", "all", "images", ".", "(", "C", ")", "Lysate", "from", "mock", "or", "ZIKV", "-", "infected", "U87", "cells", "at", "16", "hpi", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "to", "NS3", ",", "TBK1", ",", "and", "p", "-", "TBK1", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "D", ")", "RT", "-", "ddPCR", "of", "IFNβ", "transcript", "at", "the", "indicated", "time", "points", "in", "mock", "and", "ZIKV", "-", "infected", "H4", "cells", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "normalized", "to", "the", "control", ".", "Asterisk", "denotes", "p", "<", "0", ".", "005", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Three", "biological", "replicates", "are", "represented", ".", "(", "E", ")", "Control", "and", "Cep63gt", "/", "gt", "MEFs", "were", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "to", "γ", "-", "tubulin", "(", "red", ")", "and", "p", "-", "Tbk1", "(", "green", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "indicate", "5μm", "for", "all", "images", ".", "(", "F", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "control", "and", "Cep63gt", "/", "gt", "MEFs", "probed", "with", "antibodies", "to", "Tbk1", "and", "p", "-", "Tbk1", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "G", ")", "HeLa", "cell", "lysate", "was", "immunoprecipitated", "with", "antibodies", "to", "CEP63", ",", "DTX4", "or", "c", "-", "Myc", "(", "negative", "control", ")", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "blotted", "with", "antibodies", "to", "CEP63", "and", "DTX4", ".", "(", "H", ")", "Mock", "and", "ZIKV", "-", "infected", "U87", "cells", "co", "-", "stained", "for", "Centrin", "(", "red", ")", "and", "DTX4", "(", "green", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "indicate", "5μm", "for", "all", "images", ".", "(", "I", ")", "Total", "cell", "lysate", "from", "mock", "and", "ZIKV", "-", "transfected", "U87", "cells", "16", "hpi", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "antibodies", "to", "ZIKV", "NS3", "and", "DTX4", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "J", ")", "SC", "and", "CEP63", "siRNA", "treated", "HeLa", "cells", "were", "co", "-", "stained", "for", "Centrin", "(", "red", ")", "and", "DTX4", "(", "green", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "indicate", "5μm", "for", "all", "images", ".", "(", "K", ")", "TBK1", "or", "c", "-", "Myc", "(", "negative", "control", ")", "were", "immunoprecipitated", "from", "Control", "or", "Cep63", "mutant", "MEFs", ".", "Precipitating", "proteins", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "TBK1", "and", "K48", "-", "linked", "ubiquitin", ".", "(", "L", ")", "16hpi", "Mock", "and", "ZIKV", "-", "infected", "U87", "cell", "lysate", "was", "immunoprecipitated", "for", "TBK1", "or", "c", "-", "Myc", ".", "The", "immunoprecipitations", "were", "probed", "using", "antibodies", "to", "TBK1", "and", "K", "-", "48", "-", "linked", "ubiquitin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) HeLa cell lysates were immunoprecipitated with antibodies to CEP63 and TBK1. Precipitated proteins were immunoblotted for CEP63 and TBK1.(B) Mock and ZIKV-infected U87 cells were co-stained for γ-tubulin (red) and p-TBK1 (green). Data information: Scale bars indicate 5μm for all images.(C) Lysate from mock or ZIKV-infected U87 cells at 16 hpi were immunoblotted with antibodies to NS3, TBK1, and p-TBK1. Actin served as a loading control.(D) RT-ddPCR of IFNβ transcript at the indicated time points in mock and ZIKV-infected H4 cells. Bars represent the mean ± SD normalized to the control. Asterisk denotes p<0.005 (Student's t test). Three biological replicates are represented.(E) Control and Cep63gt/gt MEFs were co-stained with antibodies to γ-tubulin (red) and p-Tbk1 (green). Data information: Scale bars indicate 5μm for all images.(F) Immunoblot analysis of control and Cep63gt/gt MEFs probed with antibodies to Tbk1 and p-Tbk1. Actin served as a loading control.(G) HeLa cell lysate was immunoprecipitated with antibodies to CEP63, DTX4 or c-Myc (negative control). Precipitated proteins were blotted with antibodies to CEP63 and DTX4.(H) Mock and ZIKV-infected U87 cells co-stained for Centrin (red) and DTX4 (green). Data information: Scale bars indicate 5μm for all images.(I) Total cell lysate from mock and ZIKV-transfected U87 cells 16 hpi were analyzed by western blot using antibodies to ZIKV NS3 and DTX4. Actin served as a loading control.(J) SC and CEP63 siRNA treated HeLa cells were co-stained for Centrin (red) and DTX4 (green). Data information: Scale bars indicate 5μm for all images.(K) TBK1 or c-Myc (negative control) were immunoprecipitated from Control or Cep63 mutant MEFs. Precipitating proteins were probed with antibodies to TBK1 and K48-linked ubiquitin.(L) 16hpi Mock and ZIKV-infected U87 cell lysate was immunoprecipitated for TBK1 or c-Myc. The immunoprecipitations were probed using antibodies to TBK1 and K-48-linked ubiquitin."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", ".", "The", "table", "summarises", "the", "number", "and", "the", "sex", "of", "the", "embryos", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "recovered", "from", "timed", "matings", "of", "Rif1", "+", "/", "-", "x", "Rif1", "+", "/", "-", "mice", ",", "in", "a", "C57BL", "/", "6J", "genetic", "background", ".", "The", "day", "of", "gestation", "(", "E", ")", "is", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C). The table summarises the number and the sex of the embryos of the indicated genotypes, recovered from timed matings of Rif1+/- x Rif1+/- mice, in a C57BL/6J genetic background. The day of gestation (E) is indicated."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", ".", "Time", "course", "analysis", "of", "Xist", "RNA", "expression", "by", "RT", "-", "qPCR", "during", "EB", "differentiation", "of", "Rif1", "+", "/", "+", "(", "Rif1", "+", "/", "+", "+", "OHT", ")", "and", "Rif1", "-", "/", "-", "(", "Rif1F", "/", "F", "+", "OHT", ")", "cells", "at", "the", "indicated", "timepoints", ".", "Rif1", "+", "/", "+", "(", "solid", "line", ")", "and", "Rif1", "-", "/", "-", "(", "dashed", "line", ")", ",", "female", "(", "black", ")", "and", "male", "(", "grey", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "from", "three", "(", "female", "lines", ")", "or", "two", "(", "male", "lines", ")", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "comparing", "female", "Rif1", "+", "/", "+", "to", "female", "Rif1", "-", "/", "-", "cell", "lines", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ")", ".", "Xist", "RT", "-", "primers", "Xist", "ex7", "F", "and", "R", "were", "used", ".", "Values", "are", "normalised", "to", "a", "geometric", "mean", "consisting", "of", "the", "expression", "of", "Gapdh", ",", "Ubiquitin", "and", "β", "-", "Actin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C). Time course analysis of Xist RNA expression by RT-qPCR during EB differentiation of Rif1+/+ (Rif1+/+ +OHT) and Rif1-/- (Rif1F/F +OHT) cells at the indicated timepoints. Rif1+/+ (solid line) and Rif1-/- (dashed line), female (black) and male (grey). Data are presented as mean ± standard deviation from three (female lines) or two (male lines) independent experiments. Statistical significance was determined using 2-way ANOVA comparing female Rif1+/+ to female Rif1-/- cell lines (****p ≤ 0.0001). Xist RT-primers Xist ex7 F and R were used. Values are normalised to a geometric mean consisting of the expression of Gapdh, Ubiquitin and β-Actin."}
{"words": ["Figure", "3RIF1", "association", "with", "the", "Xist", "promoter", "assessed", "by", "ChIP", "-", "qPCR", "in", "two", "independent", "Rif1", "+", "/", "+", "(", "Rif1", "+", "/", "+", "+", "OHT", ",", "black", ")", "and", "two", "Rif1", "-", "/", "-", "(", "Rif1F", "/", "F", "+", "OHT", ",", "grey", ")", "female", "cell", "lines", ",", "in", "ESCs", "(", "A", ")", "P1", "and", "P2", "indicate", "the", "two", "Xist", "promoters", ",", "5", "'", "indicates", "a", "region", "2", "kb", "upstream", "of", "Xist", "TSS", ".", "Inter1", "and", "2", "are", "two", "intergenic", "regions", "that", "serve", "as", "negative", "controls", ".", "Peak", "and", "cRAD", "represent", "two", "previously", "identified", "regions", "of", "RIF1", "association", "(", "positive", "control", ")", ".", "See", "Appendix", "Fig", ".", "S2C", "for", "primer", "positions", "within", "Xist", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "A", ")", "and", "2", "independent", "experiments", "(", "B", ")", ".", "p", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", ",", "paired", "t", "test", "comparing", "RIF1", "association", "in", "Rif1", "+", "/", "+", "cells", "on", "Xist", "P2", "and", "P1", "versus", "5", "'", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", "and", "ns", "=", "not", "significant", ".", "(", "D", ")", ".", "Association", "of", "RIF1", "with", "Xist", "P2", "in", "the", "Fa2L", "cells", "(", "black", ")", "and", "a", "wild", "type", "female", "mESC", "line", "(", "grey", ")", ",", "also", "harbouring", "one", "castaneus", "and", "one", "129", "X", "chromosome", ".", "Allele", "-", "specific", "ChIP", "-", "qPCR", "primers", "were", "used", ",", "cast", "indicates", "association", "with", "the", "castaneus", "Xist", "P2", "and", "129", "indicates", "association", "with", "the", "129", "Xist", "P2", ".", "Enrichments", "are", "presented", "relative", "to", "input", "DNA", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "p", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", ",", "paired", "t", "test", "comparing", "RIF1", "association", "with", "the", "castaneus", "and", "with", "the", "129", "X", "chromosome", "Xist", "P2", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "Below", ",", "schematic", "of", "the", "Xist", "/", "Tsix", "alleles", "in", "the", "Fa2L", "undifferentiated", "cells", ".", "(", "E", ")", ".", "Association", "of", "RIF1", "with", "Xist", "P2", "in", "the", "Fa2L", "cells", "(", "black", ")", "upon", "differentiation", ".", "The", "analysis", "was", "performed", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "p", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", ",", "paired", "t", "test", "comparing", "RIF1", "association", "with", "the", "castaneus", "and", "with", "the", "129", "X", "chromosome", "Xist", "P2", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ".", "Below", ",", "schematic", "of", "the", "Xist", "/", "Tsix", "alleles", "in", "the", "Fa2L", "differentiated", "cells", ".", "(", "(", "F", ")", ".", "Quantification", "by", "ChIP", "-", "qPCR", "of", "RIF1", "association", "with", "the", "indicated", "regions", "in", "the", "Fa2L", "cell", "line", ",", "following", "treatment", "with", "DMSO", "only", "(", "black", ")", "or", "flavopiridol", "(", "grey", ")", ".", "Primers", "as", "in", "(", "E", ")", ".", "(", "G", ")", ".", "Same", "as", "in", "(", "F", ")", "but", "for", "a", "wild", "type", "female", "mESC", "line", ".", "All", "enrichments", "are", "presented", "relative", "to", "input", "DNA", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "from", "three", "(", "F", ")", "and", "two", "(", "G", ")", "independent", "experiments", "are", "presented", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", ",", "paired", "t", "test", "(", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", "and", "ns", "=", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3RIF1 association with the Xist promoter assessed by ChIP-qPCR in two independent Rif1+/+ (Rif1+/+ +OHT, black) and two Rif1-/- (Rif1F/F +OHT, grey) female cell lines, in ESCs (A) P1 and P2 indicate the two Xist promoters, 5' indicates a region 2 kb upstream of Xist TSS. Inter1 and 2 are two intergenic regions that serve as negative controls. Peak and cRAD represent two previously identified regions of RIF1 association (positive control). See Appendix Fig. S2C for primer positions within Xist. Mean ±standard deviation from 3 independent experiments (A) and 2 independent experiments (B). p calculated by Student's two-tailed, paired t test comparing RIF1 association in Rif1+/+ cells on Xist P2 and P1 versus 5'. *p ≤ 0.05, ****p ≤ 0.0001 and ns=not significant.(D). Association of RIF1 with Xist P2 in the Fa2L cells (black) and a wild type female mESC line (grey), also harbouring one castaneus and one 129 X chromosome. Allele-specific ChIP-qPCR primers were used, cast indicates association with the castaneus Xist P2 and 129 indicates association with the 129 Xist P2. Enrichments are presented relative to input DNA. Mean ±standard deviation from 3 independent experiments. p calculated by Student's two-tailed, paired t test comparing RIF1 association with the castaneus and with the 129 X chromosome Xist P2, ***p ≤ 0.001. Below, schematic of the Xist/Tsix alleles in the Fa2L undifferentiated cells. (E). Association of RIF1 with Xist P2 in the Fa2L cells (black) upon differentiation. The analysis was performed as in (D). Mean ±standard deviation from 3 independent experiments. p calculated by Student's two-tailed, paired t test comparing RIF1 association with the castaneus and with the 129 X chromosome Xist P2. *p ≤ 0.05. Below, schematic of the Xist/Tsix alleles in the Fa2L differentiated cells. ((F). Quantification by ChIP-qPCR of RIF1 association with the indicated regions in the Fa2L cell line, following treatment with DMSO only (black) or flavopiridol (grey). Primers as in (E). (G). Same as in (F) but for a wild type female mESC line. All enrichments are presented relative to input DNA. Mean ±standard deviation from three (F) and two (G) independent experiments are presented. Statistical significance was determined using Student's two-tailed, paired t test (*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01 and ns=not significant)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", ".", "Time", "course", "analysis", "of", "Xist", "expression", "by", "RT", "-", "qPCR", "during", "EB", "differentiation", "of", "female", "mESCs", "following", "knock", "down", "of", "Luciferase", "(", "Control", ",", "black", ")", "and", "Kap1", "(", "Kap1", "KD", ",", "grey", ")", ",", "at", "the", "indicated", "timepoints", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", ".", "Xist", "primers", "Xist", "ex3", "F", "and", "Xist", "ex4", "R", "were", "used", ".", "Normalisation", "was", "performed", "using", "a", "geometric", "mean", "consisting", "of", "the", "expression", "of", "Rplp0", ",", "Ubiquitin", "and", "Sdha", ".", "(", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "B", ")", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "Xist", "expression", "levels", "during", "differentiation", "of", "the", "Fa2L", "cells", ",", "following", "expression", "of", "shRNA", "against", "Luciferase", "(", "Control", ",", "black", ")", "and", "Kap1", "(", "Kap1", "KD", ",", "grey", ")", ",", "at", "the", "indicated", "timepoints", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "from", "a", "minimum", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "presented", ".", "2", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "to", "determine", "statistical", "significance", ".", "ns", "=", "not", "significant", ".", "(", "(", "C", ")", ".", "Tsix", "RNA", "levels", "in", "female", "mESCs", "infected", "with", "shRNA", "directed", "against", "Luciferase", "(", "Control", ",", "black", ")", "and", "KAP1", "(", "Kap1", "KD", ",", "grey", ")", ",", "during", "differentiation", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "from", "four", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", ".", "(", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ")", ".", "Values", "have", "first", "been", "normalised", "to", "a", "geometric", "mean", "consisting", "of", "the", "expression", "of", "Rplp0", ",", "Ubiquitin", "and", "Sdha", ".", "(", "D", ")", ".", "RNA", "FISH", "analysis", "of", "Tsix", "expression", "during", "differentiation", "of", "female", "mESCs", "expressing", "an", "shRNA", "directed", "against", "Luciferase", "(", "control", ")", "or", "against", "Kap1", "(", "Kap1", "KD", ")", ".", "Left", ":", "Cells", "with", "no", "(", "0", ",", "red", ")", ",", "one", "(", "1", ",", "grey", ")", "and", "two", "or", "more", "(", "2", ",", "black", ")", "Tsix", "foci", "were", "counted", "in", "two", "independent", "experiments", ",", "shown", "averaged", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "χ2", ".", "A", "minimum", "of", "110", "cells", "were", "counted", "per", "each", "time", "point", "for", "each", "line", "(", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ")", ".", "Right", ":", "examples", "of", "cells", "with", "one", "(", "top", ")", "or", "two", "(", "central", "and", "bottom", ")", "Tsix", "FISH", "signals", ".", "Scale", "bars", ":", "5μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A). Time course analysis of Xist expression by RT-qPCR during EB differentiation of female mESCs following knock down of Luciferase (Control, black) and Kap1 (Kap1 KD, grey), at the indicated timepoints. Data are presented as mean ±standard deviation from three independent experiments. Statistical significance was determined using 2-way ANOVA. Xist primers Xist ex3 F and Xist ex4 R were used. Normalisation was performed using a geometric mean consisting of the expression of Rplp0, Ubiquitin and Sdha. (*p ≤ 0.05). (B). RT-qPCR analysis of Xist expression levels during differentiation of the Fa2L cells, following expression of shRNA against Luciferase (Control, black) and Kap1 (Kap1 KD, grey), at the indicated timepoints. Mean ±standard deviation from a minimum of three independent experiments is presented. 2-way ANOVA was used to determine statistical significance. ns=not significant. ((C). Tsix RNA levels in female mESCs infected with shRNA directed against Luciferase (Control, black) and KAP1 (Kap1 KD, grey), during differentiation. Mean ±standard deviation from four independent experiments are shown. Statistical significance was determined using 2-way ANOVA. (**p ≤ 0.01). Values have first been normalised to a geometric mean consisting of the expression of Rplp0, Ubiquitin and Sdha.(D). RNA FISH analysis of Tsix expression during differentiation of female mESCs expressing an shRNA directed against Luciferase (control) or against Kap1 (Kap1 KD). Left: Cells with no (0, red), one (1, grey) and two or more (2, black) Tsix foci were counted in two independent experiments, shown averaged. Statistical significance was determined by χ2. A minimum of 110 cells were counted per each time point for each line (**p ≤ 0.01, ****p ≤ 0.0001). Right: examples of cells with one (top) or two (central and bottom) Tsix FISH signals. Scale bars: 5μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "KAP1", "association", "with", "the", "indicated", "sites", "in", "wild", "type", "female", "mESCs", "(", "Rif1", "+", "/", "+", ",", "same", "as", "used", "in", "Fig", ".", "3B", "but", "without", "OHT", ")", "and", "during", "early", "differentiation", ".", "ZFP629", "is", "a", "well", "-", "characterised", "KAP1", "associated", "region", "(", "positive", "control", ")", ".", "Xite", "A", "and", "C", "indicate", "two", "regions", "within", "the", "Tsix", "enhancer", "Xite", ",", "Tsix", "region", "1", "indicates", "Tsix", "major", "promoter", ",", "Tsix", "region", "2", "indicates", "the", "Dxpas34", "region", ",", "Tsix", "region", "3", "indicates", "a", "region", "slightly", "downstream", "of", "the", "Dxpas34", "region", ".", "P1", "and", "P2", "indicate", "the", "two", "Xist", "promoters", ",", "5", "'", "indicates", "a", "region", "2", "kb", "upstream", "of", "Xist", "TSS", ".", "Inter1", "is", "an", "intergenic", "region", ".", "See", "Appendix", "Fig", ".", "S2C", "for", "the", "positions", "of", "the", "primers", "within", "Xist", "and", "Tsix", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "from", "three", "(", "2d", "EB", "and", "1d", "EB", ")", "and", "two", "(", "ESCs", ")", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "test", "comparing", "RIF1", "association", "to", "Xist", "P2", "and", "P1", "in", "2d", "EB", "versus", "1d", "EB", "(", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", "and", "ns", "=", "not", "significant", ")", ".", "In", "the", "inset", ",", "Tsix", "RNA", "levels", "were", "quantified", "by", "RT", "-", "qPCR", "during", "the", "differentiation", "of", "wild", "type", "female", "ESCs", "shown", "in", "Fig", ".", "4F", ".", "The", "average", "of", "two", "experiments", "is", "shown", ".", "Tsix", "values", "are", "normalised", "to", "a", "geometric", "mean", "consisting", "of", "the", "expression", "of", "Rplp0", ",", "Ubiquitin", "and", "Sdha", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviations", ".", "(", "C", ")", ".", "KAP1", "association", "with", "Xist", "promoter", "in", "two", "independent", "Rif1", "+", "/", "+", "(", "Rif1", "+", "/", "+", "+", "OHT", ",", "black", ")", "and", "two", "Rif1", "-", "/", "-", "(", "Rif1F", "/", "F", "+", "OHT", ",", "grey", ")", "female", "mESC", "cell", "lines", ".", "Ezr", "is", "an", "additional", "region", "known", "to", "be", "associated", "with", "KAP1", "in", "mESCs", ".", "Enrichments", "are", "presented", "relative", "to", "input", "DNA", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "from", "a", "minimum", "of", "three", "independent", "experiments", "per", "cell", "line", "are", "displayed", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "t", "test", "comparing", "the", "KAP1", "association", "with", "Xist", "P2", "and", "P1", "in", "Rif1", "+", "/", "+", "versus", "Rif1", "-", "/", "-", "cells", "(", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A). ChIP-qPCR analysis of KAP1 association with the indicated sites in wild type female mESCs (Rif1+/+, same as used in Fig. 3B but without OHT) and during early differentiation. ZFP629 is a well-characterised KAP1 associated region (positive control). Xite A and C indicate two regions within the Tsix enhancer Xite, Tsix region 1 indicates Tsix major promoter, Tsix region 2 indicates the Dxpas34 region, Tsix region 3 indicates a region slightly downstream of the Dxpas34 region. P1 and P2 indicate the two Xist promoters, 5' indicates a region 2 kb upstream of Xist TSS. Inter1 is an intergenic region. See Appendix Fig. S2C for the positions of the primers within Xist and Tsix. The data are presented as mean ±standard deviation from three (2d EB and 1d EB) and two (ESCs) independent experiments. Statistical significance was calculated by Student's two-tailed unpaired t test comparing RIF1 association to Xist P2 and P1 in 2d EB versus 1d EB (*p ≤ 0.05 and ns=not significant). In the inset, Tsix RNA levels were quantified by RT-qPCR during the differentiation of wild type female ESCs shown in Fig. 4F. The average of two experiments is shown. Tsix values are normalised to a geometric mean consisting of the expression of Rplp0, Ubiquitin and Sdha. Error bars indicate standard deviations.(C). KAP1 association with Xist promoter in two independent Rif1+/+ (Rif1+/+ +OHT, black) and two Rif1-/- (Rif1F/F +OHT, grey) female mESC cell lines. Ezr is an additional region known to be associated with KAP1 in mESCs. Enrichments are presented relative to input DNA. Mean ±standard deviation from a minimum of three independent experiments per cell line are displayed. Statistical significance was determined using Student's two-tailed, unpaired t test comparing the KAP1 association with Xist P2 and P1 in Rif1+/+ versus Rif1-/- cells (**p ≤ 0.01)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", ".", "HEXIM1", "association", "with", "the", "Xist", "promoter", "(", "P1", "and", "P2", ")", "in", "two", "independent", "Rif1", "+", "/", "+", "and", "two", "Rif1", "-", "/", "-", "mESC", "lines", ",", "analysed", "by", "ChIP", "-", "qPCR", ".", "Tkbp1", "and", "Myf5", "are", "two", "control", "regions", ".", "As", "in", "the", "case", "of", "KAP1", "association", ",", "deletion", "of", "Rif1", "induces", "accumulation", "of", "HEXIM1", "on", "Xist", "P1", "and", "P2", ".", "Average", "±", "standard", "deviation", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "p", "values", "were", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", ",", "equal", "variance", "t", "-", "test", ".", "(", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "E", ")", ".", "Upon", "infection", "of", "Fa2L", "cells", "with", "shRNA", "against", "Kap1", "or", "control", ",", "against", "Luciferase", ",", "HEXIM1", "association", "with", "P2", "was", "analysed", ",", "on", "both", "alleles", ",", "by", "ChIP", "-", "qPCR", ".", "As", "in", "the", "case", "of", "KAP1", ",", "HEXIM1", "shows", "preferential", "association", "with", "Xist", "P2", "on", "the", "Cast", "allele", "(", "future", "Xa", ",", "Control", ")", ".", "The", "association", "is", "lost", "upon", "knock", "down", "of", "Kap1", "(", "Kap1", "KD", ")", ".", "Myf5", "serves", "as", "a", "negative", "and", "Neat1", "as", "a", "positive", "control", "regions", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C). HEXIM1 association with the Xist promoter (P1 and P2) in two independent Rif1+/+ and two Rif1-/- mESC lines, analysed by ChIP-qPCR. Tkbp1 and Myf5 are two control regions. As in the case of KAP1 association, deletion of Rif1 induces accumulation of HEXIM1 on Xist P1 and P2. Average ±standard deviation of two independent experiments. p values were calculated by two-tailed, unpaired, equal variance t-test. (**p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001).(E). Upon infection of Fa2L cells with shRNA against Kap1 or control, against Luciferase, HEXIM1 association with P2 was analysed, on both alleles, by ChIP-qPCR. As in the case of KAP1, HEXIM1 shows preferential association with Xist P2 on the Cast allele (future Xa, Control). The association is lost upon knock down of Kap1 (Kap1 KD). Myf5 serves as a negative and Neat1 as a positive control regions."}
{"words": ["Figure", "6Pulldowns", "of", "pointed", "end", "site", "1", "-", "4", "mutants", "using", "Strep", "-", "Hook3", "(", "D", ")", "or", "Strep", "-", "BICD2", "(", "E", ")", ".", "Binding", "is", "shown", "relative", "to", "the", "binding", "of", "the", "wildtype", "pointed", "end", "construct", "(", "dashed", "lines", ")", ".", "*", "shows", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "For", "BICD2", ",", "p", "=", "0", ".", "06", "for", "Site", "1", "mutant", ",", "and", "p", "=", "0", ".", "1", "for", "Site", "4", "mutant", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", ".", "Statistical", "significance", "calculated", "using", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Pulldowns of pointed end site 1-4 mutants using Strep-Hook3 (D) or Strep-BICD2 (E). Binding is shown relative to the binding of the wildtype pointed end construct (dashed lines). * shows p<0.05. For BICD2, p=0.06 for Site 1 mutant, and p=0.1 for Site 4 mutant. Data presented as mean ±SEM, n=3. Statistical significance calculated using ANOVA with Tukey's test for multiple comparisons."}
{"words": ["Figure", "1A", "slice", "through", "a", "filtered", "tomogram", "showing", "SR", "vesicles", "in", "contact", "with", "a", "putative", "T", "-", "tubule", ".", "Individual", "RyR1", "molecules", "are", "indicated", "by", "the", "red", "circles", ".", "The", "dense", "protein", "coat", "on", "the", "surface", "of", "the", "SR", "vesicles", "correspond", "to", "the", "SERCA", "pump", ".", "Areas", "circled", "in", "yellow", "indicate", "accumulation", "of", "density", "inside", "the", "SR", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "nm", ".", "A", "slice", "through", "the", "structure", "of", "RyR1", "in", "contact", "with", "putative", "TT", "-", "membrane", ".", "A", "middle", "slice", "through", "the", "in", "situ", "structure", "of", "RyR1", "at", "12", ".", "6", "-", "Å", "resolution", ".", "The", "observed", "additional", "transmembrane", "density", "is", "indicated", "by", "the", "red", "arrows", ".", "Scale", "bars", "in", "B", ",", "C", ":", "10", "nm", ".", "Slice", "through", "the", "structures", "of", "apoRyR1", "with", "the", "putative", "TT", "-", "membrane", "(", "left", ")", "and", "the", "standalone", "apoRyR1", "(", "right", ",", "with", "the", "flipped", "handendness", "and", "reduced", "resolution", "for", "comparison", ")", "22", "Å", "away", "from", "the", "middle", "slice", "(", "Y", "=", "92", "in", "the", "volume", "coordinates", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "nm", ".", "The", "location", "of", "the", "CaM", "/", "S100A1", "binding", "site", "is", "marked", "with", "red", "circles", "in", "slices", "through", "maps", "of", "the", "in", "situ", "structure", "(", "left", ")", "and", "the", "single", "particle", "structure", "(", "EMDB", ":", "8393", ")", "in", "the", "same", "orientation", "as", "the", "in", "situ", "structure", "and", "filtered", "to", "15", "Å", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A slice through a filtered tomogram showing SR vesicles in contact with a putative T-tubule. Individual RyR1 molecules are indicated by the red circles. The dense protein coat on the surface of the SR vesicles correspond to the SERCA pump. Areas circled in yellow indicate accumulation of density inside the SR. Scale bar: 20 nm. A slice through the structure of RyR1 in contact with putative TT-membrane. A middle slice through the in situ structure of RyR1 at 12.6-Å resolution. The observed additional transmembrane density is indicated by the red arrows. Scale bars in B, C: 10 nm.Slice through the structures of apoRyR1 with the putative TT-membrane (left) and the standalone apoRyR1 (right, with the flipped handendness and reduced resolution for comparison) 22 Å away from the middle slice (Y = 92 in the volume coordinates). Scale bar: 10 nm.The location of the CaM/S100A1 binding site is marked with red circles in slices through maps of the in situ structure (left) and the single particle structure (EMDB: 8393) in the same orientation as the in situ structure and filtered to 15 Å (right). Scale bar: 10 nm."}
{"words": ["Figure", "2A", "slice", "through", "the", "average", "structure", "of", "the", "apo", "-", "state", "at", "a", "position", "22", "Å", "away", "from", "the", "middle", "slice", "shown", "in", "Fig", ".", "1C", ".", "The", "intra", "-", "SR", "extension", "is", "boxed", "on", "the", "density", "in", "red", ".", "Representative", "SR", "vesicles", "with", "different", "distributions", "of", "inner", "-", "SR", "density", ":", "segregated", ",", "evenly", "distributed", ",", "empty", ",", "and", "empty", "with", "filaments", ".", "RyR1", "particles", "are", "circled", "in", "red", ",", "areas", "circled", "in", "yellow", "indicate", "accumulation", "of", "density", "inside", "the", "SR", ".", "The", "fractions", "of", "vesicles", "that", "fall", "into", "each", "density", "category", "for", "each", "RyR1", "sample", "(", "EDTA", ":", "n", "=", "64", ";", "1", "mM", "Ca2", "+", ":", "n", "=", "32", ";", "5", "mM", "Ca2", "+", ":", "n", "=", "21", ",", "technical", "replicates", ")", ".", "Blue", "corresponds", "to", "the", "fraction", "of", "SR", "lumen", "vesicles", "showing", "evenly", "distributed", "density", ",", "orange", "to", "segregated", "density", ",", "and", "grey", "to", "empty", "vesicles", ".", "Structures", "of", "RyR1", "determined", "in", "presence", "of", "increasing", "Ca2", "+", "concentration", "(", "1", "mM", "and", "5", "mM", ")", ",", "all", "with", "intra", "-", "SR", "extensions", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "nm", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "E", ")", ",", "20", "nm", "in", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A slice through the average structure of the apo-state at a position 22 Å away from the middle slice shown in Fig. 1C. The intra-SR extension is boxed on the density in red.Representative SR vesicles with different distributions of inner-SR density: segregated, evenly distributed, empty, and empty with filaments. RyR1 particles are circled in red, areas circled in yellow indicate accumulation of density inside the SR.The fractions of vesicles that fall into each density category for each RyR1 sample (EDTA: n=64; 1 mM Ca2+: n = 32; 5 mM Ca2+: n=21, technical replicates). Blue corresponds to the fraction of SR lumen vesicles showing evenly distributed density, orange to segregated density, and grey to empty vesicles.Structures of RyR1 determined in presence of increasing Ca2+ concentration (1 mM and 5 mM), all with intra-SR extensions. Scale bars: 10 nm in (A) and (E), 20 nm in (C)."}
{"words": ["Figure", "3B", "is", "domain", "representation", "on", "the", "grayscale", "image", ".", "Please", "note", "the", "location", "of", "two", "transmembrane", "densities", ":", "yellow", "-", "shown", "in", "Figure", "1C", ",", "magenta", "-", "shown", "in", "Figure", "3B", ".", "Slices", "through", "the", "results", "of", "classification", "of", "the", "particles", "in", "the", "global", "average", "into", "4", "classes", "at", "resolutions", "15", ".", "4", ",", "18", ",", "18", ",", "and", "27", "Å", ",", "respectively", ",", "with", "the", "percentages", "of", "the", "total", "particles", "in", "each", "class", "shown", "beneath", ".", "Red", "arrows", "show", "domain", "movements", "compared", "to", "class", "1", ".", "The", "first", "five", "modes", "of", "correlated", "movements", ".", "Direction", "of", "motion", "is", "indicated", "by", "the", "arrows", ".", "Informativity", "of", "the", "respective", "modes", "measured", "as", "variance", "of", "the", "corresponding", "mode", "divided", "by", "variance", "of", "the", "first", "mode", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B is domain representation on the grayscale image. Please note the location of two transmembrane densities: yellow - shown in Figure 1C, magenta - shown in Figure 3B.Slices through the results of classification of the particles in the global average into 4 classes at resolutions 15.4, 18, 18, and 27 Å, respectively, with the percentages of the total particles in each class shown beneath. Red arrows show domain movements compared to class 1.The first five modes of correlated movements. Direction of motion is indicated by the arrows. Informativity of the respective modes measured as variance of the corresponding mode divided by variance of the first mode. Scale bars: 10 nm."}
{"words": ["Figure", "4Structure", "of", "ryRyR1", "at", "a", "resolution", "of", "17", ".", "5", "Å", ".", "Two", "views", "are", "through", "the", "middle", "slice", "(", "top", ")", "of", "the", "reconstruction", "and", "at", "the", "level", "of", "sarcoplasmic", "extentions", "22", "Å", "below", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "The", "movement", "of", "the", "outer", "domains", "is", "associated", "with", "a", "visible", "change", "in", "membrane", "curvature", "as", "compared", "to", "the", "apo", "-", "structure", ".", "This", "movement", "is", "highlighted", "by", "red", "arrows", "in", "the", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Structure of ryRyR1 at a resolution of 17.5 Å. Two views are through the middle slice (top) of the reconstruction and at the level of sarcoplasmic extentions 22 Å below (bottom panels). The movement of the outer domains is associated with a visible change in membrane curvature as compared to the apo-structure. This movement is highlighted by red arrows in the right panels. Scale bar: 10 nm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "a", ")", "Representative", "2D", "μ", "-", "CT", "scans", "of", "RasV12", ";", "ctrl", "at", "day", "6", ",", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "larvae", "at", "day", "6", "and", "day", "10", ".", "Muscle", "(", "green", ")", ",", "fat", "body", "(", "blue", ")", "and", "eye", "-", "antennal", "discs", "/", "tumor", "(", "red", ")", "are", "outlined", ".", "Scale", "bar", ":", "1mm", ".", "Anterior", "(", "A", ")", ",", "Right", "(", "R", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(a) Representative 2D μ-CT scans of RasV12; ctrl at day 6, RasV12; scrib-/- larvae at day 6 and day 10. Muscle (green), fat body (blue) and eye-antennal discs/tumor (red) are outlined.Scale bar: 1mm. Anterior (A), Right (R)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "a", ")", "Quantification", "of", "tumor", "growth", "of", "RasV12", ";", "ctrl", "day", "6", "(", "n", "=", "15", ")", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "tumors", ",", "day", "6", "(", "n", "=", "15", ")", ",", "day", "7", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "day", "8", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "day", "9", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "day", "10", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "b", ")", "Quantifications", "of", "muscle", "volume", ",", "of", "larvae", "carrying", "tumors", "of", "RasV12", ";", "ctrl", "(", "n", "=", "15", ")", ",", "and", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "at", "day", "6", "(", "n", "=", "15", ")", ",", "day", "7", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "day", "8", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "day", "9", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "dat", "10", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "c", ")", "Quantification", "of", "width", "of", "Dorsal", "Oblique", "3", "(", "DO3", ")", "muscle", "in", "larvae", "carrying", "tumors", "of", "RasV12", ";", "ctrl", "at", "day", "6", "(", "n", "=", "29", ")", "and", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "at", "days", "6", "(", "n", "=", "29", ")", "and", "day", "10", "(", "n", "=", "31", ")", ".", "(", "d", ")", "Quantification", "of", "adipose", "tissue", "volume", "in", "larvae", "carrying", "tumors", "of", "RasV12", ";", "ctrl", "at", "day", "6", "and", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "at", "days", "6", "and", "day", "10", ".", "(", "e", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "adipose", "tissue", "in", "RasV12", ";", "ctrl", "and", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "tumors", "bearing", "animals", "at", "indicated", "ages", ".", "Lipid", "droplets", "are", "highlighted", "with", "Lipid", "Tox", "staining", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", "(", "f", ")", "Quantification", "of", "dry", "weight", "of", "RasV12", ";", "ctrl", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "day", "6", "(", "n", "=", "15", ")", "and", "day", "10", "(", "n", "=", "18", ")", "tumor", "bearing", "larvae", "excluding", "the", "tumor", "weight", ".", "(", "g", ")", "Quantification", "of", "larval", "motility", "measure", "by", "crawling", "distance", "and", "crawling", "pattern", "in", "RasV12", ";", "ctrl", "(", "n", "=", "14", ")", ",", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "day", "6", "(", "n", "=", "15", ")", ",", "day", "8", "(", "n", "=", "16", ")", "and", "day", "10", "(", "n", "=", "14", ")", ",", "each", "colored", "line", "represents", "a", "single", "larva", ".", "(", "h", ")", "Coomassie", "feeding", "assay", "to", "asses", "food", "intake", "of", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "over", "time", ",", "three", "repeated", "measurements", "of", "an", "average", "food", "intake", "of", "20", "larvae", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(a) Quantification of tumor growth of RasV12; ctrl day 6 (n=15) RasV12; scrib-/- tumors, day 6 (n=15), day 7 (n=5), day 8 (n=4), day 9 (n=5) and day 10 (n=5).(b) Quantifications of muscle volume, of larvae carrying tumors of RasV12; ctrl (n=15), and RasV12; scrib-/- at day 6(n=15), day 7 (n=5), day 8 (n=5), day 9 (n=5) and dat 10 (n=5).(c) Quantification of width of Dorsal Oblique 3 (DO3) muscle in larvae carrying tumors of RasV12; ctrl at day 6 (n=29) and RasV12; scrib-/-at days 6 (n=29) and day 10 (n=31).(d) Quantification of adipose tissue volume in larvae carrying tumors of RasV12; ctrl at day 6 and RasV12; scrib-/-at days 6 and day 10.(e) Representative confocal images of adipose tissue in RasV12; ctrl and RasV12; scrib-/- tumors bearing animals at indicated ages. Lipid droplets are highlighted with Lipid Tox staining. Scale bar: 50μm(f) Quantification of dry weight of RasV12; ctrl (n=9), RasV12; scrib-/- day 6 (n=15) and day 10 (n=18) tumor bearing larvae excluding the tumor weight.(g) Quantification of larval motility measure by crawling distance and crawling pattern in RasV12; ctrl (n=14), RasV12; scrib-/- day 6 (n=15), day 8 (n=16) and day 10 (n=14), each colored line represents a single larva.(h) Coomassie feeding assay to asses food intake of RasV12; scrib-/- over time, three repeated measurements of an average food intake of 20 larvae."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "a", "-", "e", ")", "Cartoon", "(", "top", ")", "illustrates", "the", "genotypes", "of", "the", "larvae", ",", "eye", "-", "antennal", "disc", "(", "EAD", ",", "circle", ":", "tumor", "cells", "in", "green", "and", "microenvironment", "cell", "in", "black", ")", ",", "systemic", "cells", "are", "illustrated", "as", "a", "square", "(", "wild", "type", "cells", "in", "light", "brown", "and", "atg13", "mutant", "cells", "in", "light", "orange", ")", "at", "indicated", "ages", ".", "Cartoon", "(", "left", ")", "illustrates", "the", "structure", "of", "cephalic", "complex", "attached", "to", "mouth", "hook", ".", "Representative", "images", "of", "Larva", "(", "image", "of", "larva", "using", "the", "backlight", "of", "microscope", ")", ",", "cephalic", "complex", "(", "green", "highlights", "the", "GFP", "-", "labelled", "tumor", "clones", ")", ",", "muscle", "(", "Phalloidin", "in", "green", "stains", "actin", "and", "Hoechst", "in", "blue", "stains", "nucleus", ")", "and", "adipose", "tissue", "(", "Lipid", "Tox", "in", "red", "stains", "for", "lipid", "droplets", ",", "Hoechst", "stains", "nucleus", ")", "from", "top", "to", "bottom", ".", "(", "a", ")", "RasV12", ";", "ctrl", "tumor", "bearing", "animal", "at", "day", "6", ".", "(", "b", ")", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "tumor", "bearing", "animal", "at", "day", "6", ".", "(", "c", ")", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "tumor", "bearing", "animal", "at", "day", "8", ".", "(", "d", ")", "RasV12", ",", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "at", "day", "8", ".", "(", "e", ")", "RasV12", ",", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "animal", "complemented", "with", "transgenic", "atg13", ",", "rescuing", "the", "tumor", "growth", ",", "at", "day", "8", ".", "(", "f", ")", "Quantification", "of", "area", "of", "space", "occupied", "with", "lobes", "of", "fat", "body", "within", "larval", "segments", "4", "to", "8", "(", "shown", "in", "yellow", "dashed", "line", "in", "2a", ")", ",", "of", "animals", "bearing", "tumors", "at", "day", "6", "RasV12", ";", "ctrl", "(", "n", "=", "45", ")", ",", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "30", ")", ",", "RasV12", ",", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "30", ")", "and", "ey3", ".", "5", "-", "atg13", ";", "RasV12", ",", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "29", ")", "and", "at", "day", "10", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "40", ")", ",", "RasV12", ",", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "25", ")", "and", "ey3", ".", "5", "-", "atg13", ";", "RasV12", ",", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "28", ")", ".", "(", "g", ")", "Quantification", "of", "tumor", "volumes", "day", "6", "RasV12", ";", "ctrl", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "11", ")", "and", "day", "8", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "13", ")", ",", "RasV12", ",", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "9", ")", "and", "ey3", ".", "5", "-", "atg13", ";", "RasV12", ",", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "(", "h", ")", "Quantification", "of", "Ventral", "Longitudinal", "muscle", "4", "(", "VL4", ")", "(", "shown", "in", "yellow", "dashed", "line", "in", "2a", ")", "of", "third", "segment", "of", "larvae", "carrying", "at", "day", "6", "RasV12", ";", "ctrl", "(", "n", "=", "15", ")", ",", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "14", ")", ",", "and", "at", "day8", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "11", ")", ",", "RasV12", ",", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "12", ")", "and", "ey3", ".", "5", "-", "atg13", ";", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "14", ")", ".", "(", "i", ")", "Quantification", "of", "dry", "weight", "excluding", "tumor", "of", "RasV12", ";", "scrib", "-", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "at", "day", "6", "(", "n", "=", "8", ")", "and", "day", "10", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "(", "j", ")", "Quantification", "of", "larval", "motility", "measured", "by", "crawling", "distance", "and", "crawling", "pattern", "for", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "at", "day", "6", "(", "n", "=", "15", ")", "and", "at", "day", "8", "(", "n", "=", "15", ")", ",", "each", "colored", "line", "represents", "a", "single", "larva", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(a-e) Cartoon (top) illustrates the genotypes of the larvae, eye-antennal disc (EAD, circle: tumor cells in green and microenvironment cell in black), systemic cells are illustrated as a square (wild type cells in light brown and atg13 mutant cells in light orange) at indicated ages. Cartoon (left) illustrates the structure of cephalic complex attached to mouth hook. Representative images of Larva (image of larva using the backlight of microscope), cephalic complex (green highlights the GFP-labelled tumor clones), muscle (Phalloidin in green stains actin and Hoechst in blue stains nucleus) and adipose tissue (Lipid Tox in red stains for lipid droplets, Hoechst stains nucleus) from top to bottom. (a) RasV12; ctrl tumor bearing animal at day 6. (b) RasV12; scrib-/- tumor bearing animal at day 6. (c) RasV12; scrib-/- tumor bearing animal at day 8. (d) RasV12, scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- at day 8. (e) RasV12, scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- animal complemented with transgenic atg13, rescuing the tumor growth, at day 8.(f) Quantification of area of space occupied with lobes of fat body within larval segments 4 to 8 (shown in yellow dashed line in 2a), of animals bearing tumors at day 6 RasV12; ctrl (n=45), RasV12; scrib-/- (n=30), RasV12, scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- (n=30) and ey3.5-atg13; RasV12, scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- (n=29) and at day 10 RasV12; scrib-/- (n=40), RasV12, scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- (n=25) and ey3.5-atg13; RasV12, scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- (n=28).(g) Quantification of tumor volumes day 6 RasV12; ctrl (n=7), RasV12; scrib-/- (n=11) and day 8 RasV12; scrib-/- (n=13), RasV12, scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- (n=9) and ey3.5-atg13; RasV12, scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- (n=9).(h) Quantification of Ventral Longitudinal muscle 4 (VL4) (shown in yellow dashed line in 2a) of third segment of larvae carrying at day 6 RasV12; ctrl (n=15), RasV12; scrib-/- (n=14), and at day8 RasV12; scrib-/- (n=11), RasV12, scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- (n=12) and ey3.5-atg13; RasV12; scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- (n=14).(i) Quantification of dry weight excluding tumor of RasV12; scrib- -, atg13-/-//atg13-/-at day 6 (n=8) and day 10 (n=7).(j) Quantification of larval motility measured by crawling distance and crawling pattern for RasV12; scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- at day 6 (n=15) and at day 8 (n=15), each colored line represents a single larva."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", ")", "Changes", "in", "groups", "(", "carbohydrates", ",", "amino", "acids", "and", "fatty", "acids", ")", "of", "storage", "metabolites", "measured", "in", "circulating", "haemolymph", "with", "progressing", "wasting", ",", "shown", "as", "log2", "changes", "measured", "by", "LC", "-", "MS", "and", "calculated", "per", "larvae", "relative", "to", "RasV12", ";", "ctrl", "at", "day", "6", ".", "(", "b", ")", "Volcano", "plot", "showing", "autophagy", "-", "dependent", "changes", "to", "amounts", "of", "circulating", "metabolites", "at", "day", "6", ".", "X", "-", "axis", "shows", "the", "log2", "of", "fold", "change", "of", "RasV12", ";", "atg13", "-", "/", "-", "scrib", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "vs", ".", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", ",", "y", "-", "axis", "shows", "-", "log10", "p", "-", "value", ",", "calculated", "by", "t", "-", "test", ".", "Metabolite", "names", "are", "shown", "for", "metabolites", "with", "log2", "(", "FC", ")", ">", "±", "1", "and", "/", "or", "-", "log10", "(", "P", ")", "<", "2", ".", "Green", "points", "indicate", "log2", "(", "FC", ")", ">", "±", "1", ",", "blue", "indicate", "-", "log10", "(", "P", ")", "<", "2", "and", "red", "indicates", "for", "above", "both", "thresholds", ".", "(", "c", ")", "Autophagy", "-", "driven", "wasting", "releases", "metabolites", "into", "circulation", "of", "113", "reliably", "detected", "metabolites", ",", "those", "showing", "significant", "differences", "in", "any", "of", "the", "three", "comparisons", "are", "shown", ".", "Color", "indicates", "the", "log2", "(", "fold", "change", ")", "difference", "and", "the", "numbers", "show", "the", "p", "-", "value", "of", "the", "comparison", ".", "The", "statistical", "test", "to", "define", "significance", "was", "FDR", "-", "adjusted", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "<", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a) Changes in groups (carbohydrates, amino acids and fatty acids) of storage metabolites measured in circulating haemolymph with progressing wasting, shown as log2 changes measured by LC-MS and calculated per larvae relative to RasV12; ctrl at day 6.(b) Volcano plot showing autophagy-dependent changes to amounts of circulating metabolites at day 6. X-axis shows the log2 of fold change of RasV12;atg13 -/-scrib-/- // atg13 -/- vs. RasV12; scrib-/- , y-axis shows -log10 p-value, calculated by t-test. Metabolite names are shown for metabolites with log2(FC) >± 1 and/or -log10(P) < 2. Green points indicate log2(FC) >± 1, blue indicate -log10(P) < 2 and red indicates for above both thresholds.(c) Autophagy-driven wasting releases metabolites into circulation of 113 reliably detected metabolites, those showing significant differences in any of the three comparisons are shown. Color indicates the log2(fold change) difference and the numbers show the p-value of the comparison. The statistical test to define significance was FDR-adjusted t-test p-value < 0.05"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "a", ")", "The", "amount", "of", "glycogen", "in", "the", "whole", "larvae", "measured", "by", "biochemical", "assay", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "normalized", "to", "RasV12", ";", "ctrl", "at", "day", "6", ",", "and", "per", "number", "of", "larvae", ".", "(", "b", "-", "e", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "muscle", "and", "adipose", "tissue", "of", "larvae", "carrying", "RasV12", ";", "ctrl", ",", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", "and", "RasV12", ";", "scrib", "-", "/", "-", ",", "atg13", "-", "/", "-", "/", "/", "atg13", "-", "/", "-", "showing", "glycogen", "levels", "(", "white", ")", "at", "day", "6", "and", "day", "8", ".", "(", "g", ")", "Sources", "of", "carbon", "incorporated", "into", "tumor", "biomass", "were", "differentiated", "by", "changing", "the", "isotopic", "carbon", "content", "of", "the", "food", "source", "25", "hours", "before", "measuring", "the", "total", "carbon", "content", "and", "isotopic", "ratio", "of", "the", "tumor", ".", "A", "similar", ",", "but", "independent", "experiment", "is", "reported", "in", "Holland", "P", ".", ",", "et", "al", ".", ",", "2021", "BMC", "Biol", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(a) The amount of glycogen in the whole larvae measured by biochemical assay (n=4), normalized to RasV12; ctrl at day 6, and per number of larvae.(b-e) Representative confocal images of muscle and adipose tissue of larvae carrying RasV12; ctrl, RasV12; scrib-/- and RasV12; scrib-/-, atg13-/-//atg13-/- showing glycogen levels (white) at day 6 and day 8.(g) Sources of carbon incorporated into tumor biomass were differentiated by changing the isotopic carbon content of the food source 25 hours before measuring the total carbon content and isotopic ratio of the tumor. A similar, but independent experiment is reported in Holland P., et al., 2021 BMC Biol."}
{"words": ["Figure", "1Immunohistochemistry", "of", "NSMCE2", "on", "mouse", "testis", ".", "The", "inset", "illustrates", "the", "accumulation", "of", "NSMCE2", "on", "the", "XY", "body", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Immunofluorescence", "(", "IF", ")", "of", "NSMCE2", "and", "SCP3", "on", "isolated", "mouse", "spermatocytes", ".", "Threads", "of", "NSMCE2", "can", "be", "detected", "on", "regions", "of", "weak", "SCP3", "signal", ",", "indicative", "of", "asynapsis", "(", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "2", ".", "5", "μm", ".", "Colocalization", "of", "NSMCE2", "and", "BRCA1", "at", "the", "XY", "body", "of", "mouse", "spermatocytes", ".", "Representative", "image", "of", "NSMCE2", "and", "BRCA1", "foci", "in", "control", "and", "MMS", "‐", "treated", "MEFs", ".", "Scale", "bar", ",", "2", ".", "5", "μm", ".", "Quantification", "of", "NSMCE2", "and", "BRCA1", "foci", "in", "wild", "‐", "type", "MEFs", "exposed", "to", "IR", "(", "10", "Gy", ";", "1", "‐", "h", "recovery", ")", ",", "MMS", "(", "1", "mM", "for", "1", "h", ";", "24", "‐", "h", "recovery", ")", ",", "and", "PARP", "inhibitor", "(", "1", "μM", "for", "1", "h", ";", "24", "‐", "h", "recovery", ")", ".", "Data", "indicate", "mean", "values", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "Representative", "image", "of", "IR", "‐", "(", "10", "Gy", ";", "1", "‐", "h", "recovery", ")", "and", "MMS", "‐", "(", "1", "mM", "for", "1", "‐", "h", ";", "24", "‐", "h", "recovery", ")", "induced", "NSMCE2", "and", "γH2AX", "foci", "in", "MEFs", ".", "Scale", "bar", ",", "2", ".", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunohistochemistry of NSMCE2 on mouse testis. The inset illustrates the accumulation of NSMCE2 on the XY body. Scale bar, 50 μm.Immunofluorescence (IF) of NSMCE2 and SCP3 on isolated mouse spermatocytes. Threads of NSMCE2 can be detected on regions of weak SCP3 signal, indicative of asynapsis (arrowheads). Scale bar, 2.5 μm.Colocalization of NSMCE2 and BRCA1 at the XY body of mouse spermatocytes.Representative image of NSMCE2 and BRCA1 foci in control and MMS‐treated MEFs. Scale bar, 2.5 μm.Quantification of NSMCE2 and BRCA1 foci in wild‐type MEFs exposed to IR (10 Gy; 1‐h recovery), MMS (1 mM for 1 h; 24‐h recovery), and PARP inhibitor (1 μM for 1 h; 24‐h recovery). Data indicate mean values and are representative of three independent experiments. Error bars indicate SD.Representative image of IR‐ (10 Gy; 1‐h recovery) and MMS‐ (1 mM for 1‐h; 24‐h recovery) induced NSMCE2 and γH2AX foci in MEFs. Scale bar, 2.5 μm."}
{"words": ["Figure", "2Brightfield", "microscopy", "of", "2", ".", "5", "dpc", "embryos", "obtained", "from", "crosses", "of", "Nsmce2GT", "/", "+", "mice", ".", "The", "right", "panel", "is", "of", "the", "same", "2", "embryos", "shown", "on", "the", "left", "panel", ",", "36", "h", "after", "being", "cultured", "in", "vitro", ".", "The", "arrow", "indicates", "embryos", "that", "showed", "asymmetric", "cell", "sizes", "when", "isolated", ",", "which", "degenerated", "upon", "culture", ".", "These", "embryos", "were", "identified", "as", "Nsmce2GT", "/", "GT", "through", "genotyping", ".", "Examples", "of", "the", "three", "genotypes", "found", "at", "Mendelian", "frequencies", "(", "see", "Appendix", "Table", "S1", ")", "on", "2", ".", "5", "dpc", "embryos", ".", "Examples", "of", "the", "type", "of", "nuclei", "found", "on", "Nsmce2GT", "/", "GT", "and", "Nsmce2", "+", "(", "+", "/", "+", "or", "+", "/", "GT", ")", "2", ".", "5", "dpc", "embryos", ",", "12", "h", "after", "in", "vitro", "culture", ".", "Mutant", "embryos", "were", "identified", "due", "to", "the", "absence", "of", "NSMCE2", "signal", "(", "green", ")", ".", "DAPI", "was", "used", "to", "stain", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "White", "arrows", "indicate", "examples", "of", "cells", "with", "condensed", "chromosomes", "or", "irregular", "shapes", ",", "which", "are", "hardly", "seen", "in", "wild", "type", "embryos", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Brightfield microscopy of 2.5 dpc embryos obtained from crosses of Nsmce2GT/+ mice. The right panel is of the same 2 embryos shown on the left panel, 36 h after being cultured in vitro. The arrow indicates embryos that showed asymmetric cell sizes when isolated, which degenerated upon culture. These embryos were identified as Nsmce2GT/GT through genotyping.Examples of the three genotypes found at Mendelian frequencies (see Appendix Table S1) on 2.5 dpc embryos.Examples of the type of nuclei found on Nsmce2GT/GT and Nsmce2+ (+/+ or +/GT) 2.5 dpc embryos, 12 h after in vitro culture. Mutant embryos were identified due to the absence of NSMCE2 signal (green). DAPI was used to stain DNA (blue). White arrows indicate examples of cells with condensed chromosomes or irregular shapes, which are hardly seen in wild type embryos."}
{"words": ["Figure", "3Immunoprecipitation", "of", "SMC5", "(", "and", "IgG", ",", "as", "a", "control", ")", "from", "a", "48", "‐", "h", "culture", "of", "B", "lymphocytes", "of", "wt", "and", "Nsmce2SD", "/", "SD", "animals", ".", "NSMCE2", "and", "SMC6", "levels", "on", "the", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "by", "WB", ".", "The", "image", "of", "the", "Ponceau", "staining", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "IF", "of", "NSMCE2", "foci", "in", "MMS", "‐", "treated", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2SD", "/", "SD", "MEFs", ".", "Scale", "bar", ",", "2", ".", "5", "μm", ".", "Representative", "picture", "of", "6", "‐", "month", "‐", "old", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2SD", "/", "SD", "littermates", ".", "Kaplan", "-", "Meyer", "survival", "curves", "of", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2SD", "/", "SD", "mice", ".", "The", "P", "‐", "value", "was", "calculated", "with", "the", "Mantel", "-", "Cox", "long", "‐", "rank", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunoprecipitation of SMC5 (and IgG, as a control) from a 48‐h culture of B lymphocytes of wt and Nsmce2SD/SD animals. NSMCE2 and SMC6 levels on the immunoprecipitates were analyzed by WB. The image of the Ponceau staining is shown as a loading control.IF of NSMCE2 foci in MMS‐treated Nsmce2+/+ and Nsmce2SD/SD MEFs. Scale bar, 2.5 μm.Representative picture of 6‐month‐old Nsmce2+/+ and Nsmce2SD/SD littermates.Kaplan-Meyer survival curves of Nsmce2+/+ and Nsmce2SD/SD mice. The P‐value was calculated with the Mantel-Cox long‐rank test."}
{"words": ["Figure", "4A", "Kaplan", "-", "Meyer", "survival", "curves", "of", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2", "+", "/", "GT", "mice", ".", "The", "P", "‐", "value", "was", "calculated", "with", "the", "Mantel", "-", "Cox", "long", "‐", "rank", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "B", "Tumor", "incidence", "found", "on", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2", "+", "/", "GT", "mice", "at", "the", "time", "of", "death", "(", "i", ".", "e", ".", "moribund", "mice", ")", ".", "C", "NSMCE2", "levels", "evaluated", "by", "Western", "blot", "in", "2", "independent", "pairs", "of", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2", "+", "/", "GT", "MEFs", ".", "β", "‐", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Numbers", "shown", "bellow", "indicate", "the", "relative", "amounts", "of", "NSMCE2", "in", "each", "sample", ".", "D", "Sister", "chromatid", "exchange", "(", "SCE", ")", "events", "found", "per", "metaphase", "on", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2", "+", "/", "GT", "MEFs", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "E", ",", "F", "Relative", "percentages", "of", "micronuclei", "(", "E", ")", "and", "polynucleated", "cells", "(", "F", ")", "on", "cultures", "of", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2", "+", "/", "GT", "MEFs", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Kaplan-Meyer survival curves of Nsmce2+/+ and Nsmce2+/GT mice. The P‐value was calculated with the Mantel-Cox long‐rank test. ***P 0.001.B Tumor incidence found on Nsmce2+/+ and Nsmce2+/GT mice at the time of death (i.e. moribund mice).C NSMCE2 levels evaluated by Western blot in 2 independent pairs of Nsmce2+/+ and Nsmce2+/GT MEFs. β‐actin was used as a loading control. Numbers shown bellow indicate the relative amounts of NSMCE2 in each sample.D Sister chromatid exchange (SCE) events found per metaphase on Nsmce2+/+ and Nsmce2+/GT MEFs. ***P 0.001.E, F Relative percentages of micronuclei (E) and polynucleated cells (F) on cultures of Nsmce2+/+ and Nsmce2+/GT MEFs. Data are representative of three independent experiments. Error bars indicate SD. ***P 0.001."}
{"words": ["Figure", "5NSMCE2", "levels", "assessed", "by", "WB", "in", "UQ", ".", "CreERT2", "transgenic", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2lox", "/", "lox", "littermate", "MEFs", ",", "24", "h", "after", "exposure", "to", "4", "‐", "OHT", ".", "Tubulin", "levels", "are", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "Clonogenic", "assay", "on", "immortalized", "UQ", ".", "CreERT2", "/", "Nsmce2lox", "/", "lox", "MEFs", ".", "The", "picture", "shows", "the", "colonies", "detected", "after", "10", "days", "of", "growth", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "4", "‐", "OHT", ",", "upon", "staining", "with", "crystal", "violet", ".", "NSMCE2", "and", "BRCA1", "foci", "in", "MMS", "‐", "treated", "(", "1", "mM", "for", "1", "h", ";", "24", "‐", "h", "recovery", ")", "UQ", ".", "CreERT2", "/", "Nsmce2lox", "/", "lox", "MEFs", ",", "48", "h", "after", "being", "treated", "(", "or", "not", ")", "with", "4", "‐", "OHT", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "SCE", "events", "per", "metaphase", "on", "UQ", ".", "CreERT2", "/", "Nsmce2lox", "/", "lox", "MEFs", "grown", "in", "the", "presence", "of", "4", "‐", "OHT", "for", "72", "h", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "Example", "of", "SCE", "events", "(", "arrows", ")", "found", "on", "Nsmce2", "‐", "deleted", "MEFs", ".", "SCE", "events", "at", "telomeres", "on", "UQ", ".", "CreERT2", "/", "Nsmce2lox", "/", "lox", "MEFs", "grown", "in", "the", "presence", "of", "4", "‐", "OHT", "for", "72", "h", ",", "as", "detected", "by", "CO", "‐", "FISH", "(", "see", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ".", "Telomere", "lengths", "of", "UQ", ".", "CreERT2", "Nsmce2lox", "/", "lox", "MEFs", "treated", "or", "not", "with", "4", "‐", "OHT", "for", "72", "h", ".", "Example", "of", "the", "intensity", "of", "telomere", "signals", "(", "yellow", ")", "used", "for", "(", "H", ")", ".", "Percentage", "of", "cells", "with", "micronuclei", "found", "on", "cultures", "of", "UQ", ".", "CreERT2", "/", "Nsmce2lox", "/", "lox", "MEFs", "treated", "or", "not", "with", "4", "‐", "OHT", "for", "72", "h", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5NSMCE2 levels assessed by WB in UQ.CreERT2 transgenic Nsmce2+/+ and Nsmce2lox/lox littermate MEFs, 24 h after exposure to 4‐OHT. Tubulin levels are shown as a loading control.Clonogenic assay on immortalized UQ.CreERT2/Nsmce2lox/lox MEFs. The picture shows the colonies detected after 10 days of growth in the presence or absence of 4‐OHT, upon staining with crystal violet.NSMCE2 and BRCA1 foci in MMS‐treated (1 mM for 1 h; 24‐h recovery) UQ.CreERT2/Nsmce2lox/lox MEFs, 48 h after being treated (or not) with 4‐OHT. Scale bar, 5 μm.SCE events per metaphase on UQ.CreERT2/Nsmce2lox/lox MEFs grown in the presence of 4‐OHT for 72 h. ***P 0.001.Example of SCE events (arrows) found on Nsmce2‐deleted MEFs.SCE events at telomeres on UQ.CreERT2/Nsmce2lox/lox MEFs grown in the presence of 4‐OHT for 72 h, as detected by CO‐FISH (see ). Data are representative of three independent experiments. Error bars indicate SD. *P 0.05.Telomere lengths of UQ.CreERT2 Nsmce2lox/lox MEFs treated or not with 4‐OHT for 72 h.Example of the intensity of telomere signals (yellow) used for (H).Percentage of cells with micronuclei found on cultures of UQ.CreERT2/Nsmce2lox/lox MEFs treated or not with 4‐OHT for 72 h. Data are representative of three independent experiments. Error bars indicate SD. ***P 0.001."}
{"words": ["Figure", "6Intrauterine", "dwarfism", "observed", "upon", "NSMCE2", "deletion", "on", "17", ".", "5", "dpc", "embryos", ".", "Pregnant", "females", "were", "treated", "at", "14", ".", "5", "dpc", "for", "3", "days", "with", "intraperitoneal", "injections", "of", "4", "‐", "OHT", ".", "The", "image", "represents", "the", "difference", "in", "size", "observed", "between", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2lox", "/", "lox", "embryos", "carrying", "the", "UQ", ".", "CreERT2", "transgene", "(", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2lox", "/", "lox", ",", "from", "now", "on", ")", ".", "Representative", "picture", "of", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2lox", "/", "lox", "animals", "fed", "for", "40", "weeks", "with", "a", "4", "‐", "OHT", "‐", "containing", "diet", "(", "see", "also", "Movies", "EV1", "and", "EV2", ")", ".", "Images", "illustrating", "the", "presence", "of", "altered", "pigmentation", "problems", "that", "arise", "on", "Nsmce2lox", "/", "lox", "mice", ".", "Percentage", "of", "fat", "against", "total", "body", "mass", "on", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2lox", "/", "lox", "animals", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "White", "bloodcell", "counts", "(", "WBC", ")", "from", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2lox", "/", "lox", "animals", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "Percentage", "of", "γH2AX", "‐", "positive", "micronuclei", "found", "on", "the", "intestinal", "epithelia", "of", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2lox", "/", "lox", "animals", "(", "see", "Appendix", "Fig", "S11", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "*", "P", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Intrauterine dwarfism observed upon NSMCE2 deletion on 17.5 dpc embryos. Pregnant females were treated at 14.5 dpc for 3 days with intraperitoneal injections of 4‐OHT. The image represents the difference in size observed between Nsmce2+/+ and Nsmce2lox/lox embryos carrying the UQ.CreERT2 transgene (Nsmce2+/+ and Nsmce2lox/lox, from now on).Representative picture of Nsmce2+/+ and Nsmce2lox/lox animals fed for 40 weeks with a 4‐OHT‐containing diet (see also Movies EV1 and EV2).Images illustrating the presence of altered pigmentation problems that arise on Nsmce2lox/lox mice.Percentage of fat against total body mass on Nsmce2+/+ and Nsmce2lox/lox animals. ***P 0.001.White bloodcell counts (WBC) from Nsmce2+/+ and Nsmce2lox/lox animals. ***P 0.001.Percentage of γH2AX‐positive micronuclei found on the intestinal epithelia of Nsmce2+/+ and Nsmce2lox/lox animals (see Appendix Fig S11). Data are representative of three independent experiments. Error bars indicate SD. *P 0.05."}
{"words": ["Figure", "7A", "WB", "illustrating", "the", "depletion", "of", "NSMCE2", "in", "B", "cells", "isolated", "from", "2", "‐", "month", "‐", "old", "CD19", "+", "/", "Cre", "animals", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "48", "h", "after", "being", "stimulated", "in", "vitro", "with", "lipopolysaccharide", "(", "LPS", ")", ".", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "B", "Representative", "FACS", "analysis", "from", "the", "B", "‐", "cell", "cultures", "mentioned", "in", "(", "A", ")", ".", "DNA", "content", "was", "measured", "with", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", ".", "Note", "the", "presence", "of", "cells", "with", ">", "4n", "DNA", "content", "in", "NSMCE2", "‐", "deleted", "cells", ".", "C", ",", "D", "Frequency", "of", "origin", "firing", "(", "C", ")", "and", "fork", "rate", "(", "D", ")", "were", "analyzed", "by", "DNA", "fiber", "analyses", "(", "see", ")", "from", "fibers", "prepared", "from", "B", "‐", "cell", "cultures", "explained", "in", "(", "A", ")", ".", "No", "significant", "differences", "were", "observed", "between", "Nsmce2", "+", "/", "+", "and", "Nsmce2lox", "/", "loxB", "cells", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "Between", "200", "and", "300", "tracks", "were", "measured", "to", "estimate", "fork", "rate", "and", "300", "-", "500", "for", "the", "calculation", "of", "origin", "firing", "frequencies", ".", "E", "Representative", "images", "of", "the", "DNA", "fibers", "used", "for", "the", "analysis", "explained", "in", "(", "C", ",", "D", ")", ".", "CldU", "(", "red", ")", "and", "IdU", "(", "green", ")", "channels", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A WB illustrating the depletion of NSMCE2 in B cells isolated from 2‐month‐old CD19+/Cre animals of the indicated genotypes, 48 h after being stimulated in vitro with lipopolysaccharide (LPS). Tubulin was used as a loading control.B Representative FACS analysis from the B‐cell cultures mentioned in (A). DNA content was measured with propidium iodide (PI). Note the presence of cells with > 4n DNA content in NSMCE2‐deleted cells.C, D Frequency of origin firing (C) and fork rate (D) were analyzed by DNA fiber analyses (see ) from fibers prepared from B‐cell cultures explained in (A). No significant differences were observed between Nsmce2+/+ and Nsmce2lox/loxB cells. Data are representative of two independent experiments. Error bars indicate SD. Between 200 and 300 tracks were measured to estimate fork rate and 300-500 for the calculation of origin firing frequencies.E Representative images of the DNA fibers used for the analysis explained in (C, D). CldU (red) and IdU (green) channels are shown."}
{"words": ["Figure", "8Representative", "pictures", "of", "the", "spleens", "from", "2", "‐", "month", "‐", "old", "CD19", "+", "/", "Cre", "animals", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Numbers", "of", "B", "and", "T", "cells", "from", "2", "‐", "month", "‐", "old", "CD19", "+", "/", "Cre", "animals", "of", "the", "indicated", "genotypes", "evaluated", "by", "flow", "cytometry", "(", "B220", ":", "B", "‐", "cell", "marker", ";", "CD3", ":", "T", "‐", "cell", "marker", ")", ".", "SCE", "events", "per", "metaphase", "on", "B", "cells", "obtained", "from", "CD19", "+", "/", "Cre", "animals", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "72", "h", "after", "being", "stimulated", "in", "vitro", "with", "LPS", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "Analysis", "of", "forward", "(", "FSC", ")", "and", "side", "(", "SSC", ")", "scatter", "parameters", "of", "B", "cells", "obtained", "from", "CD19", "+", "/", "Cre", "animals", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "48", "h", "after", "being", "stimulated", "in", "vitro", "with", "LPS", ".", "The", "emergence", "of", "bigger", "cells", "is", "noticeable", "on", "cells", "lacking", "both", "BLM", "and", "NSMCE2", ".", "Representative", "images", "of", "B", "‐", "cell", "cultures", "of", "the", "indicated", "genotypes", "48", "h", "after", "being", "stimulated", "in", "vitro", "with", "LPS", ".", "Insets", "provide", "a", "magnified", "view", "of", "an", "individual", "cell", "(", "arrowhead", ")", "for", "better", "comparison", "of", "the", "observed", "differences", "in", "cell", "size", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Examples", "of", "the", "types", "of", "nuclei", "found", "on", "Blm", "and", "Nsmce2", "double", "‐", "mutant", "B", "cells", "(", "compared", "with", "wild", "‐", "type", "B", "cells", ")", ",", "in", "cells", "obtained", "from", "(", "E", ")", ".", "DAPI", "was", "used", "to", "stain", "DNA", ".", "Whereas", "wt", "nuclei", "are", "regular", "in", "size", ",", "double", "‐", "mutant", "cells", "invariably", "presented", "enlarged", ",", "multilobulated", ",", "and", "irregular", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "2", ".", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Representative pictures of the spleens from 2‐month‐old CD19+/Cre animals of the indicated genotypes.Numbers of B and T cells from 2‐month‐old CD19+/Cre animals of the indicated genotypes evaluated by flow cytometry (B220: B‐cell marker; CD3: T‐cell marker).SCE events per metaphase on B cells obtained from CD19+/Cre animals of the indicated genotypes, 72 h after being stimulated in vitro with LPS. **P 0.01, ***P 0.001.Analysis of forward (FSC) and side (SSC) scatter parameters of B cells obtained from CD19+/Cre animals of the indicated genotypes, 48 h after being stimulated in vitro with LPS. The emergence of bigger cells is noticeable on cells lacking both BLM and NSMCE2.Representative images of B‐cell cultures of the indicated genotypes 48 h after being stimulated in vitro with LPS. Insets provide a magnified view of an individual cell (arrowhead) for better comparison of the observed differences in cell size. Scale bar, 100 μm.Examples of the types of nuclei found on Blm and Nsmce2 double‐mutant B cells (compared with wild‐type B cells), in cells obtained from (E). DAPI was used to stain DNA. Whereas wt nuclei are regular in size, double‐mutant cells invariably presented enlarged, multilobulated, and irregular nuclei. Scale bar, 2.5 μm."}
{"words": ["Figure", "1d", ".", "Real", "-", "time", "reverse", "transcription", "quantitative", "PCR", "(", "RT", "-", "qPCR", ")", "showing", "Fbxw7", ",", "Pten", "and", "Trp53", "expression", "in", "mouse", "uteri", "at", "4", "weeks", "and", "8", "weeks", "postnatal", "age", "(", "NB", "Trp53R172H", "uteri", "were", "not", "analysed", "at", "the", "4", "week", "timepoint", ")", ".", "Box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentiles", ",", "with", "line", "at", "median", ",", "whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "values", ",", "and", "dots", "individual", "values", "(", "n", "=", "5", "samples", "per", "group", "with", "exception", "of", "Ptendel", "and", "Ptendel", ",", "Fbxw7mut", "genotypes", "at", "8", "weeks", "which", "contain", "n", "=", "7", "samples", "each", ")", ".", "Statistical", "comparison", "between", "WT", "controls", "and", "other", "genotypes", "was", "performed", "by", "unadjusted", ",", "unpaired", "Mann", "Whitney", "test", ";", "*", "indicates", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "indicates", "P", "<", "0", ".", "01e", ".", "Western", "blot", "of", "mouse", "uteri", "at", "8", "weeks", "postnatal", "age", "(", "NB", "Trp53R172H", "uteri", "were", "not", "analysed", "by", "Western", "blotting", ")", ".", "Values", "indicate", "densitometric", "units", "(", "mean", "±", "SD", ")", "normalised", "to", "control", "group", "of", "WT", "samples", "in", "case", "of", "Fbxw7", "protein", "and", "both", "WT", "and", "Fbxw7mut", "samples", "in", "case", "of", "Pten", "and", "p53", "proteins", ".", "Image", "is", "representative", "of", "duplicate", "technical", "replicates", ".", "Statistical", "comparison", "between", "controls", "and", "other", "groups", "was", "performed", "by", "unadjusted", ",", "unpaired", "Mann", "Whitney", "test", ";", "and", "are", "shown", "next", "to", "densitometry", "results", "where", "statistically", "significant", ".", "f", ".", "Immunohistochemical", "(", "IHC", ")", "analysis", "of", "mouse", "uteri", "at", "8", "weeks", "postnatal", "age", ".", "Images", "are", "representative", "of", "minimum", "of", "3", "biological", "replicates", "for", "each", "genotype", "and", "protein", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1d. Real-time reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) showing Fbxw7, Pten and Trp53 expression in mouse uteri at 4 weeks and 8 weeks postnatal age (NB Trp53R172H uteri were not analysed at the 4 week timepoint). Box extends from 25th to 75th percentiles, with line at median, whiskers indicate minimum and maximum values, and dots individual values (n=5 samples per group with exception of Ptendel and Ptendel, Fbxw7mut genotypes at 8 weeks which contain n=7 samples each). Statistical comparison between WT controls and other genotypes was performed by unadjusted, unpaired Mann Whitney test; * indicates P<0.05, ** indicates P<0.01e. Western blot of mouse uteri at 8 weeks postnatal age (NB Trp53R172H uteri were not analysed by Western blotting). Values indicate densitometric units (mean ± SD) normalised to control group of WT samples in case of Fbxw7 protein and both WT and Fbxw7mut samples in case of Pten and p53 proteins. Image is representative of duplicate technical replicates. Statistical comparison between controls and other groups was performed by unadjusted, unpaired Mann Whitney test; and are shown next to densitometry results where statistically significant.f. Immunohistochemical (IHC) analysis of mouse uteri at 8 weeks postnatal age. Images are representative of minimum of 3 biological replicates for each genotype and protein. Scale bar indicates 100μm."}
{"words": ["Figure", "2a", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "showing", "survival", "of", "genetically", "engineered", "mouse", "models", "(", "GEMM", ")", "of", "indicated", "genotypes", "and", "group", "sizes", ".", "Statistical", "comparison", "between", "groups", "was", "performed", "by", "unadjusted", "log", "-", "rank", "test", ".", "c", ".", "Low", "and", "high", "power", "images", "of", "GEMM", "uteri", "at", "8", "weeks", "age", "and", "at", "study", "endpoint", "after", "H", "&", "E", "staining", "or", "IHC", "for", "cytokeratin", "8", "(", "CK8", ")", "(", "epithelia", ")", ".", "Scale", "bars", "in", "low", "and", "high", "magnification", "panels", "indicate", "1000μm", "and", "100μm", "respectively", ".", "Images", "are", "representative", "of", "a", "minimum", "of", "5", "mice", "per", "genotype", "per", "timepoint", ",", "with", "exception", "of", "wild", "-", "type", "and", "Fbxw7mut", "mice", "at", "8", "weeks", "age", "where", "3", "mice", "were", "analysed", ".", "e", ".", "H", "&", "E", "-", "stained", "sections", "of", "high", "grade", "external", "sarcomas", "in", "Trp53del", ",", "Trp53del", ";", "Fbxw7mut", ",", "Trp53mut", "and", "Trp53mut", ";", "Fbxw7mut", "mice", ".", "Images", "are", "representative", "of", "minimum", "of", "3", "mice", "examined", "for", "each", "genotype", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2a. Kaplan-Meier curves showing survival of genetically engineered mouse models (GEMM) of indicated genotypes and group sizes. Statistical comparison between groups was performed by unadjusted log-rank test.c. Low and high power images of GEMM uteri at 8 weeks age and at study endpoint after H&E staining or IHC for cytokeratin 8 (CK8) (epithelia). Scale bars in low and high magnification panels indicate 1000μm and 100μm respectively. Images are representative of a minimum of 5 mice per genotype per timepoint, with exception of wild-type and Fbxw7mut mice at 8 weeks age where 3 mice were analysed.e. H&E-stained sections of high grade external sarcomas in Trp53del, Trp53del; Fbxw7mut, Trp53mut and Trp53mut; Fbxw7mut mice. Images are representative of minimum of 3 mice examined for each genotype. Scale bar indicates 100μm."}
{"words": ["Figure", "3a", ".", "(", "Left", "panel", ")", "Schematic", "illustrating", "gene", "expression", "profiling", "of", "mouse", "uterine", "samples", "of", "indicated", "genotypes", "and", "group", "sizes", "at", "8", "weeks", "age", ",", "with", "groups", "compared", "by", "enrichment", "analysis", ".", "(", "Right", "panel", ")", "Dot", "plot", "indicating", "enrichment", "of", "MSigDB", "C6", "oncogenic", "gene", "sets", "in", "Ptendel", ";", "Fbxw7mut", "uteri", "vs", "Ptendel", "uteri", ".", "Arrows", "indicate", "enrichment", "of", "LEF1", "signatures", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3a. (Left panel) Schematic illustrating gene expression profiling of mouse uterine samples of indicated genotypes and group sizes at 8 weeks age, with groups compared by enrichment analysis. (Right panel) Dot plot indicating enrichment of MSigDB C6 oncogenic gene sets in Ptendel; Fbxw7mut uteri vs Ptendel uteri. Arrows indicate enrichment of LEF1 signatures."}
{"words": ["Figure", "4b", ".", "Dot", "plot", "showing", "enrichment", "analysis", "of", "1", ",", "064", "putative", "FBXW7", "substrates", "against", "GO", "biological", "processes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4b. Dot plot showing enrichment analysis of 1,064 putative FBXW7 substrates against GO biological processes."}
{"words": ["Figure", "5a", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "constructs", "encoding", "FLAG", "-", "V5", "-", "tagged", "FBXW7α", "and", "Myc", "-", "tagged", "LEF1", ".", "FLAG", "-", "V5", "-", "tagged", "FBXW7", "α", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "cell", "extracts", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "before", "immunoblotting", "for", "tagged", "proteins", "as", "indicated", "(", "upper", "panels", ")", ".", "Lower", "panels", "show", "inputs", ".", "b", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "constructs", "encoding", "FLAG", "-", "V5", "-", "tagged", "FBXW7α", "and", "Myc", "-", "tagged", "TCF7L2", ".", "IP", "was", "performed", "as", "in", "(", "a", ")", "before", "immunoblotting", "for", "tagged", "proteins", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "All", "images", "shown", "are", "representative", "of", "a", "minimum", "of", "two", "independent", "experimentsg", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Myc", "-", "tagged", "FBXW7α", "and", "either", "FLAG", "-", "V5", "-", "tagged", "full", "length", "LEF1", "(", "FL", ")", "or", "truncated", "LEF1", "in", "which", "the", "N", "terminal", "domain", "required", "for", "β", "-", "catenin", "binding", "has", "been", "deleted", ".", "Immunoblotting", "for", "indicated", "proteins", "was", "performed", "following", "IP", "by", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "All", "images", "shown", "are", "representative", "of", "a", "minimum", "of", "two", "independent"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5a. HEK293T cells were transfected with constructs encoding FLAG-V5-tagged FBXW7α and Myc-tagged LEF1. FLAG-V5-tagged FBXW7 α was immunoprecipitated (IP) from cell extracts with anti-FLAG antibody before immunoblotting for tagged proteins as indicated (upper panels). Lower panels show inputs. b. HEK293T cells were transfected with constructs encoding FLAG-V5-tagged FBXW7α and Myc-tagged TCF7L2. IP was performed as in (a) before immunoblotting for tagged proteins as indicated. Data information: All images shown are representative of a minimum of two independent experimentsg. HEK293T cells were transfected with Myc-tagged FBXW7α and either FLAG-V5-tagged full length LEF1 (FL) or truncated LEF1 in which the N terminal domain required for β-catenin binding has been deleted. Immunoblotting for indicated proteins was performed following IP by anti-FLAG antibody. Data information: All images shown are representative of a minimum of two independent experiments"}
{"words": ["Figure", "6a", ".", "Dot", "plot", "showing", "log2", "-", "transformed", "expression", "of", "FBXW7", ",", "LEF1", "and", "other", "wnt", "pathway", "genes", "in", "endometrial", "epithelial", "cell", "subsets", "defined", "by", "single", "cell", "RNAseq", "(", "scRNAseq", ")", "b", ".", "Representative", "LEF1", "immunohistochemistry", "in", "GEMM", "uteri", "from", "mice", "of", "indicated", "genotypes", "at", "8", "weeks", "age", ".", "For", "each", "of", "the", "four", "columns", "(", "i", ".", "e", "genotypes", ")", ",", "upper", "and", "lower", "images", "are", "taken", "from", "littermate", "females", "housed", "in", "the", "same", "cage", ".", "Images", "are", "representative", "of", "3", "-", "4", "mice", "as", "shown", "in", "(", "c", ")", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100μm", ".", "c", ".", "Percentage", "of", "mice", "with", "epithelial", "LEF1", "expression", "in", "endometria", "at", "8", "weeks", "age", "according", "to", "genotype", ".", "P", "value", "was", "derived", "from", "binomial", "logistic", "regression", "with", "epithelial", "LEF1", "expression", "as", "the", "dependent", "variable", ".", "d", ".", "Immunohistochemistry", "for", "LEF1", "and", "β", "-", "catenin", "from", "endometrial", "carcinomas", "in", "Ptendel", "±", "Fbxw7mut", "mice", ".", "High", "power", "images", "show", "representative", "staining", "in", "LEF1", "negative", "and", "positive", "glands", ".", "Scale", "bar", "bar", "indicates", "1000μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6a. Dot plot showing log2-transformed expression of FBXW7, LEF1 and other wnt pathway genes in endometrial epithelial cell subsets defined by single cell RNAseq (scRNAseq)b. Representative LEF1 immunohistochemistry in GEMM uteri from mice of indicated genotypes at 8 weeks age. For each of the four columns (i.e genotypes), upper and lower images are taken from littermate females housed in the same cage. Images are representative of 3-4 mice as shown in (c). Scale bar indicates 100μm.c. Percentage of mice with epithelial LEF1 expression in endometria at 8 weeks age according to genotype. P value was derived from binomial logistic regression with epithelial LEF1 expression as the dependent variable.d. Immunohistochemistry for LEF1 and β-catenin from endometrial carcinomas in Ptendel ± Fbxw7mut mice. High power images show representative staining in LEF1 negative and positive glands. Scale bar bar indicates 1000μm. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "-", "C", ")", "AFM", "and", "TEM", "analysis", "of", "unloaded", "(", "u", "-", "NPs", ")", "and", "cholesterol", "loaded", "NPs", "(", "NPs", "-", "Chol", ")", ".", "AFM", "\"", "height", "\"", "images", "(", "left", "column", ")", ",", "3D", "reconstruction", "(", "middle", "column", ")", "and", "TEM", "micrograph", "(", "right", "column", ")", "of", "u", "-", "NPs", "(", "A", ")", ",", "NPs", "-", "Chol1", "(", "B", ")", "and", "NPs", "-", "Chol3", "(", "C", ")", ".", "(", "D", ")", "Release", "profile", "in", "water", "of", "cholesterol", "(", "continuous", "line", ",", "-", ")", "and", "NBD", "-", "Chol", "(", "dotted", "line", ",", "-", "-", "-", ")", "from", "NPs", "-", "Chol1", "and", "NPs", "-", "NBD", "-", "Chol1", ",", "respectively", ".", "(", "E", ")", "In", "vitro", "release", "of", "NBD", "-", "Chol", "from", "NPs", "at", "different", "time", "-", "intervals", "in", "NS", "cells", ".", "Data", "in", "the", "graph", "represent", "mean", "(", "µg", ")", "±", "SEM", "of", "total", "NBD", "-", "Chol", "(", "embedded", "into", "and", "released", "from", "NPs", ";", "red", "columns", ")", "and", "NBD", "-", "Chol", "released", "after", "NPs", "degradation", "(", "purple", "columns", ")", "present", "in", "the", "homogenates", "of", "NS", "cells", "treated", "with", "NPs", "-", "NBD", "-"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A-C) AFM and TEM analysis of unloaded (u-NPs) and cholesterol loaded NPs (NPs-Chol). AFM \"height\" images (left column), 3D reconstruction (middle column) and TEM micrograph (right column) of u-NPs (A), NPs-Chol1 (B) and NPs-Chol3 (C).(D) Release profile in water of cholesterol (continuous line, -) and NBD-Chol (dotted line, - - -) from NPs-Chol1 and NPs-NBD-Chol1, respectively.(E) In vitro release of NBD-Chol from NPs at different time-intervals in NS cells. Data in the graph represent mean (µg) ± SEM of total NBD-Chol (embedded into and released from NPs; red columns) and NBD-Chol released after NPs degradation (purple columns) present in the homogenates of NS cells treated with NPs-NBD-Chol1"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "liver", "(", "A", ")", "and", "brain", "(", "B", ")", "slices", "from", "R6", "/", "2", "mice", "ip", "injected", "with", "C", "-", "NPs", "(", "left", ")", "or", "with", "g7", "-", "NPs", "(", "right", ")", "and", "sacrificed", "after", "4", "hrs", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "g7", "-", "NPs", "localized", "in", "the", "liver", ",", "striatum", ",", "and", "cortex", "of", "WT", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "R6", "/", "2", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "(", "µg", ")", "±", "SEM", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "g7", "-", "NPs", "in", "brain", "slices", "from", "R6", "/", "2", "mice", "administered", "with", "a", "single", "ip", "injection", "and", "sacrificed", "after", "24", "hrs", "(", "D", ",", "left", ")", "or", "2", "weeks", "(", "D", ",", "right", ")", "and", "after", "multiple", "ip", "injections", "within", "1", "week", "(", "E", ")", ".", "(", "F", "-", "I", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunostaining", "against", "IBA1", "(", "F", ")", ",", "GFAP", "(", "G", ")", ",", "calbindin", "(", "H", ")", ",", "and", "DARPP", "-", "32", "(", "I", ")", "on", "coronal", "sections", "of", "brains", "isolated", "from", "R6", "/", "2", "mice", "ip", "injected", "with", "g7", "-", "NPs", "and", "sacrificed", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "intracellular", "g7", "-", "NPs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-B) Representative confocal images of liver (A) and brain (B) slices from R6/2 mice ip injected with C-NPs (left) or with g7-NPs (right) and sacrificed after 4 hrs. (C) Quantification of g7-NPs localized in the liver, striatum, and cortex of WT (n=3) and R6/2 mice (n=3). Data represent mean (µg) ± SEM.(D-E) g7-NPs in brain slices from R6/2 mice administered with a single ip injection and sacrificed after 24 hrs (D, left) or 2 weeks (D, right) and after multiple ip injections within 1 week (E).(F-I) Representative confocal images of immunostaining against IBA1 (F), GFAP (G), calbindin (H), and DARPP-32 (I) on coronal sections of brains isolated from R6/2 mice ip injected with g7-NPs and sacrificed at the indicated time points. White arrowheads indicate intracellular g7-NPs."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "image", "(", "crop", ")", "of", "brain", "slices", "from", "R6", "/", "2", "mice", "ip", "injected", "with", "rhodamine", "labeled", "g7", "-", "NPs", "-", "NBD", "-", "Chol", "and", "sacrificed", "after", "12", "hrs", ",", "showing", "co", "-", "localization", "of", "NBD", "-", "Chol", "(", "green", ")", "and", "Rhodamine", "(", "NPs", ",", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5m", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Representative", "confocal", "image", "(", "low", "magnification", ")", "of", "brain", "slices", "from", "R6", "/", "2", "mice", "ip", "injected", "with", "g7", "-", "NPs", "-", "NBD", "-", "Chol", "and", "sacrificed", "after", "24", "hrs", "(", "B", ")", "or", "2", "weeks", "(", "C", ")", "and", "relative", "co", "-", "localization", "of", "NBD", "-", "Chol", "and", "g7", "-", "NPs", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "m", "(", "D", ")", "g7", "-", "NPs", "quantification", "in", "brain", "slices", "at", "the", "same", "time", "points", "in", "(", "B", "-", "C", ")", ".", "DAPI", "was", "used", "to", "counterstain", "nuclei", ".", "Data", "in", "(", "D", ")", "are", "expressed", "as", "number", "of", "g7", "-", "NPs", "(", "evaluated", "based", "their", "size", ")", "for", "100", "m2", "sem", ".", "Statistics", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ",", "01", "(", "48", "hrs", "vs", "7", "days", ";", "7", "days", "vs", "14", "days", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ",", "001", "(", "24", "hrs", "vs", "7", "days", ";", "7", "days", "vs", "14", "days", ")", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Newmann", "-", "Keuls", "multiple", "comparison", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative confocal image (crop) of brain slices from R6/2 mice ip injected with rhodamine labeled g7-NPs-NBD-Chol and sacrificed after 12 hrs, showing co-localization of NBD-Chol (green) and Rhodamine (NPs, red). Scale bar: 5m.(B-C) Representative confocal image (low magnification) of brain slices from R6/2 mice ip injected with g7-NPs-NBD-Chol and sacrificed after 24 hrs (B) or 2 weeks (C) and relative co-localization of NBD-Chol and g7-NPs. Scale bar: 10 m (D) g7-NPs quantification in brain slices at the same time points in (B-C). DAPI was used to counterstain nuclei. Data in (D) are expressed as number of g7-NPs (evaluated based their size) for 100 m2 sem. Statistics: **P<0,01 (48 hrs vs 7 days; 7 days vs 14 days), ***P<0,001 (24 hrs vs 7 days; 7 days vs 14 days) determined by one-way ANOVA followed by Newmann-Keuls multiple comparison test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "D", ")", "Spontaneous", "IPSCs", "(", "A", ")", "and", "spontaneous", "EPSCs", "(", "D", ")", "were", "recorded", "from", "striatal", "MSNs", "(", "WTs", "=", "52", ";", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "=", "27", ";", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "=", "29", ")", "at", "a", "holding", "potential", "of", "+", "10", "mV", "and", "-", "70mV", "respectively", ".", "As", "no", "differences", "were", "found", "between", "R6", "/", "2", "mice", "treated", "with", "saline", "(", "R6", "/", "2", ")", "or", "with", "empty", "g7", "-", "NPs", "(", "R6", "/", "2", "-", "emp", ")", ",", "data", "were", "pooled", ".", "(", "B", ",", "E", ")", "Amplitude", "-", "frequency", "histogram", "and", "average", "frequency", "(", "inset", ")", "of", "IPSCs", "(", "B", ")", "and", "EPSCs", "(", "E", ")", "from", "R6", "/", "2", "-", "Chol", ",", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "and", "WT", "MSNs", ".", "(", "C", ",", "F", ")", "Cumulative", "inter", "-", "event", "histogram", "showing", "the", "release", "probability", "of", "IPSCs", "(", "C", ")", "and", "EPSCs", "(", "F", ")", "in", "all", "groups", ".", "(", "A", ",", "D", ")", "Spontaneous", "IPSCs", "(", "A", ")", "and", "spontaneous", "EPSCs", "(", "D", ")", "were", "recorded", "from", "striatal", "MSNs", "(", "WTs", "=", "52", ";", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "=", "27", ";", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "=", "29", ")", "at", "a", "holding", "potential", "of", "+", "10", "mV", "and", "-", "70mV", "respectively", ".", "As", "no", "differences", "were", "found", "between", "R6", "/", "2", "mice", "treated", "with", "saline", "(", "R6", "/", "2", ")", "or", "with", "empty", "g7", "-", "NPs", "(", "R6", "/", "2", "-", "emp", ")", ",", "data", "were", "pooled", ".", "(", "B", ",", "E", ")", "Amplitude", "-", "frequency", "histogram", "and", "average", "frequency", "(", "inset", ")", "of", "IPSCs", "(", "B", ")", "and", "EPSCs", "(", "E", ")", "from", "R6", "/", "2", "-", "Chol", ",", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "and", "WT", "MSNs", ".", "(", "C", ",", "F", ")", "Cumulative", "inter", "-", "event", "histogram", "showing", "the", "release", "probability", "of", "IPSCs", "(", "C", ")", "and", "EPSCs", "(", "F", ")", "in", "all", "groups", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A,D) Spontaneous IPSCs (A) and spontaneous EPSCs (D) were recorded from striatal MSNs (WTs=52; R6/2-untreated=27; R6/2-Chol=29) at a holding potential of +10 mV and -70mV respectively. As no differences were found between R6/2 mice treated with saline (R6/2) or with empty g7-NPs (R6/2-emp), data were pooled. (B, E) Amplitude-frequency histogram and average frequency (inset) of IPSCs (B) and EPSCs (E) from R6/2-Chol, R6/2-untreated and WT MSNs. (C,F) Cumulative inter-event histogram showing the release probability of IPSCs (C) and EPSCs (F) in all groups.(A,D) Spontaneous IPSCs (A) and spontaneous EPSCs (D) were recorded from striatal MSNs (WTs=52; R6/2-untreated=27; R6/2-Chol=29) at a holding potential of +10 mV and -70mV respectively. As no differences were found between R6/2 mice treated with saline (R6/2) or with empty g7-NPs (R6/2-emp), data were pooled. (B, E) Amplitude-frequency histogram and average frequency (inset) of IPSCs (B) and EPSCs (E) from R6/2-Chol, R6/2-untreated and WT MSNs. (C,F) Cumulative inter-event histogram showing the release probability of IPSCs (C) and EPSCs (F) in all groups."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Fall", "latency", "from", "an", "accelerating", "rotarod", "for", "5", "-", "11", "-", "week", "-", "old", "WT", "and", "R6", "/", "2", "mice", "during", "cholesterol", "supplementation", "(", "WT", "=", "17", ";", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "=", "21", ";", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "=", "13", ")", ".", "(", "C", ")", "Rearing", "activity", "in", "open", "field", "at", "10", "weeks", "of", "age", "(", "WT", "=", "14", ";", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "=", "21", ";", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "=", "15", ")", ".", "(", "D", ")", "global", "activity", "in", "the", "open", "field", "test", "at", "10", "weeks", "of", "age", "(", "WT", "=", "14", ";", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "=", "21", ";", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "=", "15", ")", ".", "(", "E", ")", "Index", "of", "discrimination", "(", "%", ")", "in", "WT", ",", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "and", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "mice", "during", "disease", "progression", ",", "at", "8", "weeks", "of", "age", "(", "WT", "=", "24", ";", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "=", "36", ";", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "=", "21", ")", ",", "at", "10", "weeks", "of", "age", "(", "WT", "=", "25", ";", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "=", "35", ";", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "=", "20", ")", "and", "at", "12", "weeks", "of", "age", "(", "WT", "=", "24", ";", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "=", "30", ";", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "=", "19", ")", ";", "the", "index", "above", "zero", "indicates", "a", "preference", "for", "the", "novel", "object", ";", "the", "index", "below", "zero", "indicates", "a", "preference", "for", "the", "familiar", "object", ".", "As", "no", "differences", "were", "found", "between", "R6", "/", "2", "mice", "treated", "with", "saline", "(", "R6", "/", "2", ")", "or", "treated", "with", "empty", "g7", "-", "NPs", "(", "R6", "/", "2", "-", "emp", ")", ",", "data", "were", "pooled", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Fall latency from an accelerating rotarod for 5-11-week-old WT and R6/2 mice during cholesterol supplementation (WT=17; R6/2-untreated=21; R6/2-Chol=13).(C) Rearing activity in open field at 10 weeks of age (WT=14; R6/2-untreated=21; R6/2-Chol=15).(D) global activity in the open field test at 10 weeks of age (WT=14; R6/2-untreated=21; R6/2-Chol=15).(E) Index of discrimination (%) in WT, R6/2-untreated and R6/2-Chol mice during disease progression, at 8 weeks of age (WT=24; R6/2-untreated=36; R6/2-Chol=21), at 10 weeks of age (WT=25; R6/2-untreated=35; R6/2-Chol=20) and at 12 weeks of age (WT=24; R6/2-untreated=30; R6/2-Chol=19); the index above zero indicates a preference for the novel object; the index below zero indicates a preference for the familiar object. As no differences were found between R6/2 mice treated with saline (R6/2) or treated with empty g7-NPs (R6/2-emp), data were pooled."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "B", ")", "protein", "levels", "(", "A", ")", "and", "relative", "densitometry", "quantification", "(", "B", ")", "of", "several", "synaptic", "proteins", "in", "triton", "-", "insoluble", "(", "synaptic", "enriched", ")", "fractions", "purified", "from", "total", "brains", ".", "Levels", "of", "PSD95", "and", "NMDA", "receptor", "subunits", "GluN1", "and", "GluN2B", "are", "rescued", "in", "R6", "/", "2", "mice", "by", "cholesterol", "supplementation", ".", "(", "C", "-", "D", "-", "E", ")", "mRNA", "levels", "for", "Bdnf", "(", "C", ")", ",", "Snap25", "(", "D", ")", "in", "cortex", "and", "hippocampus", ";", "Complexin", "II", "(", "E", ")", "in", "cortex", ",", "hippocampus", "and", "striatum", "from", "a", "subset", "of", "WT", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "R6", "/", "2", "-", "chol", "animals", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "As", "no", "differences", "were", "found", "between", "R6", "/", "2", "mice", "treated", "with", "saline", "or", "treated", "with", "empty", "g7", "-", "NPs", ",", "data", "were", "pooled", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "Representative", "images", "of", "Nissl", "Staining", "(", "F", ")", "and", "ventricle", "volume", "revealed", "by", "Neurolucida", "Analysis", "at", "12", "weeks", "of", "age", "in", "WT", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "R6", "/", "2", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "R6", "/", "2", "-", "emp", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "(", "n", "=", "8", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-B) protein levels (A) and relative densitometry quantification (B) of several synaptic proteins in triton-insoluble (synaptic enriched) fractions purified from total brains. Levels of PSD95 and NMDA receptor subunits GluN1 and GluN2B are rescued in R6/2 mice by cholesterol supplementation.(C-D-E) mRNA levels for Bdnf (C), Snap25 (D) in cortex and hippocampus; Complexin II (E) in cortex, hippocampus and striatum from a subset of WT (n=4), R6/2-untreated (n=7) and R6/2-chol animals (n=3). As no differences were found between R6/2 mice treated with saline or treated with empty g7-NPs, data were pooled.(F-G) Representative images of Nissl Staining (F) and ventricle volume revealed by Neurolucida Analysis at 12 weeks of age in WT (n= 7), R6/2 (n=7), R6/2-emp (n=6), R6/2-Chol (n=8)"}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "B", ")", "Lathosterol", "and", "24OHC", "measured", "by", "mass", "spectrometry", "in", "the", "brain", "of", "WT", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "mRNA", "levels", "of", "hmgcr", "and", "fdft1", "in", "liver", "and", "lung", "of", "WT", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "R6", "/", "2", "-", "untreated", "(", "n", "=", "8", ")", "and", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", ".", "As", "no", "differences", "were", "found", "between", "R6", "/", "2", "mice", "treated", "with", "saline", "or", "treated", "with", "empty", "g7", "-", "NPs", ",", "data", "were", "pooled", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "mRNA", "levels", "of", "inflammatory", "genes", "in", "liver", "and", "lung", "of", "the", "of", "WT", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "R6", "/", "2", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "R6", "/", "2", "-", "emp", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "R6", "/", "2", "-", "Chol", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-B) Lathosterol and 24OHC measured by mass spectrometry in the brain of WT (n=6), R6/2-untreated (n=7) and R6/2-Chol (n=5) mice. Data represent mean ± SEM.(C-D) mRNA levels of hmgcr and fdft1 in liver and lung of WT (n=7), R6/2-untreated (n=8) and R6/2-Chol (n=4) mice. As no differences were found between R6/2 mice treated with saline or treated with empty g7-NPs, data were pooled.(E-F) mRNA levels of inflammatory genes in liver and lung of the of WT (n=7), R6/2 (n=4), R6/2-emp (n=4) and R6/2-Chol (n=5) mice."}
{"words": ["Figure", "1C", ",", "Quantification", "of", "telomeric", "allelic", "imbalances", "(", "TAI", ")", "in", "soft", "tissue", "and", "bone", "sarcoma", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C, Quantification of telomeric allelic imbalances (TAI) in soft tissue and bone sarcoma."}
{"words": ["Figure", "5E", "-", "G", ",", "Ex", "vivo", "treatment", "of", "HRDhigh", "(", "NMFH", "-", "1", ",", "OH931", ",", "PM197", ",", "USZ", "-", "21", "_", "MFS2", "and", "USZ", "-", "21", "_", "UPS1", ")", "sarcoma", "models", "compared", "with", "HRDlow", "(", "USZ", "-", "20", "_", "REA1", ",", "USZ", "-", "21", "_", "LG1", ",", "USZ", "-", "22", "_", "EMC2", ",", "USZ", "-", "20", "_", "SFT1", "and", "USZ", "-", "21", "_", "CIC1", ")", "sarcoma", "models", "for", "4", "days", "with", "six", "doses", "of", "the", "chemotherapy", "agents", "oxaliplatin", ",", "doxorubicin", "and", "trabectedin", ".", "M", "-", "O", ",", "HRDhigh", "sarcoma", "cell", "models", "and", "UWB1", ".", "289", "treated", "for", "3", "days", "with", "five", "doses", "olaparib", "alone", "and", "in", "combination", "with", "1", "nM", "trabectedin", ".", "Note", "that", "no", "sensitivity", "to", "olaparib", "in", "monotherapy", "was", "observed", "at", "3", "daysQ", "-", "S", ",", "HRDhigh", "sarcoma", "cell", "models", "and", "UWB1", ".", "289", "treated", "for", "3", "days", "with", "five", "doses", "adavosertib", "alone", "and", "in", "combination", "with", "100", "nM", "doxorubicin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5E-G, Ex vivo treatment of HRDhigh (NMFH-1, OH931, PM197, USZ-21_MFS2 and USZ-21_UPS1) sarcoma models compared with HRDlow (USZ-20_REA1, USZ-21_LG1, USZ-22_EMC2, USZ-20_SFT1 and USZ-21_CIC1) sarcoma models for 4 days with six doses of the chemotherapy agents oxaliplatin, doxorubicin and trabectedin.M-O, HRDhigh sarcoma cell models and UWB1.289 treated for 3 days with five doses olaparib alone and in combination with 1 nM trabectedin. Note that no sensitivity to olaparib in monotherapy was observed at 3 daysQ-S, HRDhigh sarcoma cell models and UWB1.289 treated for 3 days with five doses adavosertib alone and in combination with 100 nM doxorubicin."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "Immunofluorescence", "showing", "nuclear", "expression", "of", "the", "DNA", "damage", "marker", "γH2A", ".", "X", "(", "magenta", ")", "upon", "6", "h", "treatment", "with", "10", "nM", "trabectedin", "and", "100", "nM", "olaparib", "in", "combination", "in", "HRDhigh", "and", "HRDlow", "sarcoma", "cell", "models", "as", "well", "as", "ovarian", "carcinoma", "UWB1", ".", "289", "cells", ".", "B", ",", "Immunofluorescence", "showing", "RAD51", "nuclear", "foci", "(", "magenta", ")", "upon", "6", "h", "treatment", "with", "10", "nM", "trabectedin", "and", "100", "nM", "olaparib", "in", "combination", "only", "in", "the", "HRDlow", "sarcoma", "cell", "model", "(", "USZ", "-", "21", "_", "LG1", ")", ".", "C", ",", "D", ",", "Quantification", "of", "γH2A", ".", "X", "(", "C", ")", "or", "RAD51", "(", "D", ")", "nuclear", "intensity", "per", "cell", "compared", "to", "untreated", "control", "cells", ".", "E", ",", "E", ",", "Immunohistochemistry", "(", "IHC", ")", "in", "human", "tissue", "sections", "showing", "RAD51", "(", "brown", ")", "expression", "in", "HRDlow", "but", "not", "HRDhigh", "sarcoma", "patients", ".", "Small", "-", "nucleated", "lymphocytes", "and", "/", "or", "proliferating", "cells", "appeared", "RAD51", "-", "positive", "in", "HRDhigh", "models", ".", "F", ",", "Immunofluorescence", "in", "human", "tissue", "sections", "showing", "RAD51", "(", "magenta", ")", "nuclear", "foci", "in", "an", "HRDlow", "but", "not", "an", "HRDhigh", "sarcoma", "patient", ".", "H", ",", "Magnetic", "resonance", "imaging", "(", "MRI", ")", "of", "LMS", "patient", "since", "primary", "diagnosis", ".", "Open", "arrowheads", "point", "at", "metastatic", "lesions", ".", "J", ",", "RAD51", "IHC", "in", "the", "metastatic", "patient", "'", "s", "tissue", ".", "Compare", "RAD51", "nuclear", "expression", "in", "normal", "tissue", "(", "arrowhead", "points", "at", "gastric", "gland", ")", "but", "not", "in", "tumorous", "gastric", "tissue", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, Immunofluorescence showing nuclear expression of the DNA damage marker γH2A.X (magenta) upon 6 h treatment with 10 nM trabectedin and 100 nM olaparib in combination in HRDhigh and HRDlow sarcoma cell models as well as ovarian carcinoma UWB1.289 cells. B, Immunofluorescence showing RAD51 nuclear foci (magenta) upon 6 h treatment with 10 nM trabectedin and 100 nM olaparib in combination only in the HRDlow sarcoma cell model (USZ-21_LG1). C, D, Quantification of γH2A.X (C) or RAD51 (D) nuclear intensity per cell compared to untreated control cells. E,E, Immunohistochemistry (IHC) in human tissue sections showing RAD51 (brown) expression in HRDlow but not HRDhigh sarcoma patients. Small-nucleated lymphocytes and/or proliferating cells appeared RAD51-positive in HRDhigh models.F, Immunofluorescence in human tissue sections showing RAD51 (magenta) nuclear foci in an HRDlow but not an HRDhigh sarcoma patient.H, Magnetic resonance imaging (MRI) of LMS patient since primary diagnosis. Open arrowheads point at metastatic lesions.J, RAD51 IHC in the metastatic patient's tissue. Compare RAD51 nuclear expression in normal tissue (arrowhead points at gastric gland) but not in tumorous gastric tissue."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Genome", "-", "wide", "ubiquitin", "binding", "profiles", "identify", "numerous", "regions", "of", "H2B", "-", "ubiquitylation", "in", "WT", "cells", "and", "distinct", "sites", "of", "non", "-", "H2B", "ubiquitylation", "(", "'", "ubiquitin", "-", "hotspot", "'", ",", "ub", "-", "hotspot", ",", "ub", "-", "HS", ")", "which", "persist", "in", "h2b", "-", "K123R", "and", "rad6", "∆", "strains", ",", "and", "increase", "in", "cdc48", "mutants", "(", "cdc48", "-", "6", ")", ".", "A", "90", "kb", "stretch", "of", "chromosome", "XIII", "(", "ChrXIII", ")", "is", "depicted", ".", "Chromatin", "immunoprecipitation", "was", "performed", "using", "the", "FK2", "ubiquitin", "antibody", "(", "see", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S1A", ")", "and", "enriched", "DNA", "was", "analyzed", "on", "NimbleGen", "arrays", "(", "Chip", "-", "chip", ")", ".", "DNA", "from", "non", "-", "specific", "IgG", "-", "ChIP", "experiments", "served", "as", "background", "control", ".", "Significantly", "enriched", "regions", "are", "marked", "by", "bars", "above", "the", "respective", "ChIP", "-", "chip", "tracks", "and", "are", "summarized", "in", "Dataset", "EV1", ".", "Data", "represent", "means", "from", "two", "independent", "replicates", ",", "except", "for", "ubiquitin", "(", "FK2", ")", "in", "rad6", "∆", "and", "IgG", "-", "ChIP", "in", "WT", "(", "n", "=", "1", ")", ".", "All", "experiments", ",", "including", "those", "using", "cdc48", "-", "6", "and", "other", "temperature", "-", "sensitive", "(", "ts", ")", "alleles", ",", "were", "performed", "at", "30", "°", "C", "(", "semipermissive", "temperature", "for", "ts", "-", "alleles", ")", "unless", "stated", "otherwise", ".", "(", "B", ")", "Seven", "ub", "-", "HSs", "show", "strong", "correlation", "between", "ubiquitin", "binding", "and", "Slx8", "enrichment", "(", "Slx8", "-", "9myc", "ChIP", ")", ".", "16", "-", "kb", "-", "windows", "of", "the", "indicated", "regions", "centered", "around", "the", "ub", "-", "HSs", "are", "depicted", "for", "ubiquitin", "and", "Slx8", "binding", "profiles", ".", "Ubiquitin", "(", "FK2", ")", "data", "for", "WT", "and", "cdc48", "-", "6", "are", "from", "the", "same", "experiment", "as", "depicted", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "represent", "means", "from", "two", "independent", "replicates", ".", "(", "D", ")", "Slx8", "and", "Slx5", "are", "recruited", "to", "ub", "-", "HSs", ".", "DNA", "from", "Slx8", "-", "9myc", "(", "top", ")", "or", "3HA", "-", "Slx5", "(", "bottom", ")", "ChIP", "experiments", "of", "the", "indicated", "strains", "was", "analyzed", "by", "quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "(", "ChIP", "-", "qPCR", ")", "at", "selected", "ub", "-", "HSs", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ",", "n", "=", "2", ")", ".", "Consistent", "with", "a", "previous", "study", ",", "we", "did", "not", "observe", "any", "Slx8", "enrichment", "at", "centromeres", "(", "van", "de", "Pasch", "et", "al", ",", "2013", ")", ",", "however", ",", "we", "note", "that", "we", "could", "not", "confirm", "the", "reported", "centromere", "binding", "of", "Slx5", "(", "see", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S2E", ")", ".", "(", "E", ")", "K48", "-", "linked", "ubiquitin", "chains", "accumulate", "in", "a", "cdc48", "mutant", "(", "cdc48", "-", "3", ")", ".", "Ub", "-", "K48", "ChIP", "followed", "by", "qPCR", "for", "same", "loci", "as", "in", "(", "D", ")", "are", "depicted", ".", "See", "also", "Fig", ".", "EV1C", "-", "D", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "F", ")", "Slx5", "and", "Slx8", "are", "required", "for", "ub", "-", "HS", "formation", ".", "Ub", "-", "K48", "ChIP", "-", "qPCR", "in", "strains", "lacking", "one", "subunit", "of", "the", "Slx5", "/", "Slx8", "complex", "(", "slx5", "∆", ",", "slx8", "∆", ")", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "G", ")", "Ufd1", "and", "Npl4", "act", "in", "concert", "with", "Cdc48", "to", "remove", "ubiquitylated", "proteins", "from", "ub", "-", "HS", "sites", ".", "Ub", "-", "K48", "ChIP", "for", "the", "indicated", "strains", "grown", "at", "the", "semi", "-", "permissive", "temperature", "of", "30", "°", "C", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "2", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Genome-wide ubiquitin binding profiles identify numerous regions of H2B-ubiquitylation in WT cells and distinct sites of non-H2B ubiquitylation ('ubiquitin-hotspot', ub-hotspot, ub-HS) which persist in h2b-K123R and rad6∆ strains, and increase in cdc48 mutants (cdc48-6). A 90 kb stretch of chromosome XIII (ChrXIII) is depicted. Chromatin immunoprecipitation was performed using the FK2 ubiquitin antibody (see also Appendix Fig. S1A) and enriched DNA was analyzed on NimbleGen arrays (Chip-chip). DNA from non-specific IgG-ChIP experiments served as background control. Significantly enriched regions are marked by bars above the respective ChIP-chip tracks and are summarized in Dataset EV1. Data represent means from two independent replicates, except for ubiquitin (FK2) in rad6∆ and IgG-ChIP in WT (n = 1). All experiments, including those using cdc48-6 and other temperature-sensitive (ts) alleles, were performed at 30°C (semipermissive temperature for ts-alleles) unless stated otherwise.(B) Seven ub-HSs show strong correlation between ubiquitin binding and Slx8 enrichment (Slx8-9myc ChIP). 16-kb-windows of the indicated regions centered around the ub-HSs are depicted for ubiquitin and Slx8 binding profiles. Ubiquitin (FK2) data for WT and cdc48-6 are from the same experiment as depicted in (A). Data represent means from two independent replicates.(D) Slx8 and Slx5 are recruited to ub-HSs. DNA from Slx8-9myc (top) or 3HA-Slx5 (bottom) ChIP experiments of the indicated strains was analyzed by quantitative real-time PCR (ChIP-qPCR) at selected ub-HSs. Data represent mean ± standard deviation (SD, n = 2). Consistent with a previous study, we did not observe any Slx8 enrichment at centromeres (van de Pasch et al, 2013), however, we note that we could not confirm the reported centromere binding of Slx5 (see also Appendix Fig. S2E).(E) K48-linked ubiquitin chains accumulate in a cdc48 mutant (cdc48-3). Ub-K48 ChIP followed by qPCR for same loci as in (D) are depicted. See also Fig. EV1C-D. Data represent means ± SD (n = 2).(F) Slx5 and Slx8 are required for ub-HS formation. Ub-K48 ChIP-qPCR in strains lacking one subunit of the Slx5/Slx8 complex (slx5∆, slx8∆). Data represent means ± SD (n = 3).(G) Ufd1 and Npl4 act in concert with Cdc48 to remove ubiquitylated proteins from ub-HS sites. Ub-K48 ChIP for the indicated strains grown at the semi-permissive temperature of 30°C. Data represent means ± SD (n = 2)."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "A", "39", "bp", "fragment", "of", "ub", "-", "HS4", "is", "sufficient", "to", "drive", "ectopic", "ub", "-", "HS", "formation", ".", "Fragments", "of", "ub", "-", "HS4", "were", "integrated", "ectopically", "and", "ub", "-", "K48", "ChIP", "-", "qPCR", "was", "performed", "for", "the", "endogenous", "ub", "-", "HS5", "and", "the", "ectopic", "ub", "-", "HS4", "fragments", "as", "depicted", "in", "(", "A", ")", ".", "contr", ".", ":", "control", ",", "empty", "YI128", "-", "vector", "was", "integrated", "at", "LEU2", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "cdc48", "‑", "6", "background", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Experimental", "mapping", "and", "bioinformatic", "prediction", "identify", "a", "similar", "ub", "-", "HS", "-", "motif", ".", "Comparison", "between", "the", "experimentally", "mapped", "ub", "-", "HS4", "F7", "(", "B", ")", "and", "the", "consensus", "motif", "of", "all", "ub", "-", "HSs", "identified", "by", "the", "MEME", "software", ".", "E", ")", "Euc1", "binds", "to", "the", "ub", "-", "HS", "-", "motif", "in", "a", "Y1H", "assay", ".", "Gal4", "-", "AD", "-", "or", "Gal4", "-", "AD", "-", "Euc1", "-", "encoding", "plasmids", "were", "transformed", "into", "a", "Y1H", "reporter", "strain", "as", "described", "in", "(", "D", ")", ".", "Serial", "dilutions", "were", "spotted", "on", "control", "plates", "and", "plates", "lacking", "histidine", "with", "20mM", "3", "-", "amino", "-", "triazole", "(", "3AT", ")", ".", "Cells", "were", "grown", "at", "30", "°", "C", "for", "3", "days", ".", "F", ")", "Euc1", "is", "required", "for", "formation", "of", "ub", "-", "HSs", ".", "ChIP", "with", "ub", "-", "K48", "specific", "antibodies", "was", "performed", "for", "the", "indicated", "strains", "and", "enriched", "DNA", "was", "analyzed", "by", "qPCR", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Euc1", "binds", "to", "endogenous", "ub", "-", "HSs", ".", "Genome", "-", "wide", "binding", "profiles", "of", "K48", "-", "linked", "ubiquitin", "chains", "were", "obtained", "in", "ChIP", "-", "chip", "experiments", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "Euc1", "-", "ChIP", "experiments", "were", "performed", "with", "a", "polyclonal", "antibody", "raised", "against", "Euc1", "aa", "292", "-", "462", ".", "Data", "represent", "means", "from", "two", "independent", "replicates", ".", "Euc1", "binds", "to", "endogenous", "ub", "-", "HSs", ".", "Genome", "-", "wide", "binding", "profiles", "of", "Euc1", "were", "obtained", "in", "ChIP", "-", "chip", "experiments", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "Euc1", "-", "ChIP", "experiments", "were", "performed", "with", "a", "polyclonal", "antibody", "raised", "against", "Euc1", "aa", "292", "-", "462", ".", "Data", "represent", "means", "from", "two", "independent", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) A 39 bp fragment of ub-HS4 is sufficient to drive ectopic ub-HS formation. Fragments of ub-HS4 were integrated ectopically and ub-K48 ChIP-qPCR was performed for the endogenous ub-HS5 and the ectopic ub-HS4 fragments as depicted in (A). contr.: control, empty YI128-vector was integrated at LEU2. Experiments were performed in cdc48‑6 background. Data represent means ± SD (n = 2). Experimental mapping and bioinformatic prediction identify a similar ub-HS-motif. Comparison between the experimentally mapped ub-HS4 F7 (B) and the consensus motif of all ub-HSs identified by the MEME software.E) Euc1 binds to the ub-HS-motif in a Y1H assay. Gal4-AD- or Gal4-AD-Euc1-encoding plasmids were transformed into a Y1H reporter strain as described in (D). Serial dilutions were spotted on control plates and plates lacking histidine with 20mM 3-amino-triazole (3AT). Cells were grown at 30°C for 3 days.F) Euc1 is required for formation of ub-HSs. ChIP with ub-K48 specific antibodies was performed for the indicated strains and enriched DNA was analyzed by qPCR. Data represent means ± SD (n = 4).Euc1 binds to endogenous ub-HSs. Genome-wide binding profiles of K48-linked ubiquitin chains were obtained in ChIP-chip experiments as described in Fig. 1A. Euc1-ChIP experiments were performed with a polyclonal antibody raised against Euc1 aa 292-462. Data represent means from two independent replicates.Euc1 binds to endogenous ub-HSs. Genome-wide binding profiles of Euc1 were obtained in ChIP-chip experiments as described in Fig. 1A. Euc1-ChIP experiments were performed with a polyclonal antibody raised against Euc1 aa 292-462. Data represent means from two independent replicates."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "Euc1", "can", "induce", "transactivation", "via", "its", "N", "-", "terminal", "30", "amino", "acids", ".", "Euc1", "constructs", "under", "the", "endogenous", "EUC1", "promoter", "were", "transformed", "in", "a", "reporter", "strain", "as", "described", "for", "Fig", ".", "2D", "and", "serial", "dilutions", "were", "spotted", "on", "control", "or", "selective", "media", "to", "test", "HIS3", "-", "activation", ".", "Cells", "were", "grown", "at", "30", "°", "C", "for", "3", "days", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "HIS3", "mRNA", "levels", "from", "strains", "used", "in", "(", "C", ")", ".", "Cells", "were", "grown", "in", "liquid", "media", "with", "selection", "for", "the", "transformed", "plasmids", "(", "SC", "-", "Leu", ")", ",", "harvested", "in", "logarithmic", "growth", "phase", "and", "total", "mRNA", "was", "prepared", ".", "After", "reverse", "transcription", ",", "HIS3", "mRNA", "levels", "were", "quantified", "using", "qPCR", "(", "RT", "-", "qPCR", ")", ",", "normalized", "first", "to", "ACT1", "mRNA", "and", "then", "to", "the", "empty", "vector", "control", "strain", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "p", "=", "2", ".", "43", "*", "10", "-", "5", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) Euc1 can induce transactivation via its N-terminal 30 amino acids. Euc1 constructs under the endogenous EUC1 promoter were transformed in a reporter strain as described for Fig. 2D and serial dilutions were spotted on control or selective media to test HIS3-activation. Cells were grown at 30°C for 3 days.(D) Quantification of HIS3 mRNA levels from strains used in (C). Cells were grown in liquid media with selection for the transformed plasmids (SC-Leu), harvested in logarithmic growth phase and total mRNA was prepared. After reverse transcription, HIS3 mRNA levels were quantified using qPCR (RT-qPCR), normalized first to ACT1 mRNA and then to the empty vector control strain. Data represent means ± SD (n = 4). p = 2.43*10-5 (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Euc1", "interacts", "with", "SUMO", "pathway", "proteins", "in", "a", "yeast", "two", "-", "hybrid", "(", "Y2H", ")", "assay", ".", "A", "Y2H", "reporter", "strain", "(", "PJ69", "-", "7a", ")", "was", "transformed", "with", "Gal4", "DNA", "-", "binding", "domain", "(", "BD", ")", "and", "Gal4", "activation", "domain", "(", "AD", ")", "fusion", "constructs", "in", "the", "indicated", "combinations", ".", "AD", "-", "SUMO", "-", "GG", "can", "be", "conjugated", "to", "SUMOylation", "substrates", ",", "while", "AD", "-", "SUMO", "-", "AA", "is", "conjugation", "-", "deficient", ".", "Cells", "were", "spotted", "on", "control", "media", "or", "selective", "media", "(", "-", "His", ")", "and", "grown", "for", "3", "and", "6", "days", ",", "respectively", ".", "(", "B", ")", "Euc1", "is", "SUMOylated", "by", "Ubc9", ",", "Siz1", "and", "Siz2", "on", "K231", ".", "Euc1", "was", "immunoprecipitated", "from", "the", "indicated", "strains", "and", "eluates", "were", "probed", "by", "WB", "against", "SUMO", "(", "top", ")", "and", "Euc1", "(", "bottom", ")", ".", "An", "up", "-", "shifted", "band", "corresponding", "to", "Euc1SUMO", "was", "detected", "with", "both", "antibodies", ".", "Asterisks", "denote", "non", "-", "specific", "bands", ".", "(", "C", ")", "Euc1", "is", "predominantly", "monoSUMOylated", "on", "lysine", "231", ".", "Denaturing", "NiNTA", "-", "pulldowns", "(", "NiNTA", "-", "PD", ")", "with", "strains", "expressing", "His", "-", "tagged", "SUMO", "(", "HisSUMO", ")", "as", "indicated", "and", "3FLAGEuc1", "constructs", "under", "the", "control", "of", "an", "ADH", "promoter", ".", "Covalently", "SUMO", "-", "modified", "proteins", "were", "enriched", "and", "eluates", "probed", "with", "a", "FLAG", "antibody", "to", "visualize", "SUMOylated", "Euc1", ".", "Eluates", "were", "probed", "for", "SUMO", "to", "control", "for", "equal", "pull", "-", "down", ",", "Pgk1", "was", "probed", "as", "input", "control", ".", "Euc1", "-", "KR", "denotes", "the", "K231R", "mutation", "here", "and", "hereafter", ".", "(", "D", ")", "Euc1", "SUMOylation", "is", "required", "for", "ub", "-", "HS", "formation", ".", "Ub", "-", "K48", "ChIP", "quantified", "by", "qPCR", "for", "the", "indicated", "strains", ".", "The", "ubx5", "∆", "background", "was", "used", "to", "enhance", "the", "ubiquitin", "signal", ",", "similar", "results", "were", "obtained", "in", "a", "WT", "background", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "E", ")", "Euc1", "ubiquitylation", "depends", "on", "Slx8", "and", "partly", "on", "Euc1", "SUMOylation", ".", "Denaturing", "NiNTA", "-", "PDs", "as", "described", "for", "(", "C", ")", "but", "with", "strains", "expressing", "His", "-", "ubiquitin", "(", "HisUbi", ")", "and", "3FLAGEuc1", "under", "the", "control", "of", "the", "ADH", "promoter", ".", "WBs", "were", "developed", "with", "a", "FLAG", "antibody", "to", "probe", "for", "3FLAGEuc1", ",", "a", "ubiquitin", "blot", "served", "as", "PD", "-", "control", "and", "Dpm1", "as", "input", "control", ".", "The", "slx8", "-", "CD", "allele", "carries", "the", "C206S", ",", "C209S", "-", "mutations", "(", "Xie", "et", "al", ",", "2007", ")", ".", "SUMOylated", "Euc1", "is", "required", "to", "recruit", "Slx5", "and", "Slx8", "to", "ub", "-", "HSs", ".", "ChIP", "against", "Slx5", "in", "the", "indicated", "genetic", "backgrounds", "were", "quantified", "by", "qPCR", ".", "Note", "that", "Slx5", "is", "still", "recruited", "in", "the", "absence", "of", "Slx8", "(", "3HA", "-", "Slx5", "slx8", "∆", ")", ",", "but", "not", "vice", "versa", "(", "Slx8", "-", "9myc", "slx5", "∆", ")", ".", "Data", "for", "WT", "and", "3HA", "-", "Slx5", "in", "(", "F", ")", "and", "WTSUMOylated", "Euc1", "is", "required", "to", "recruit", "Slx8", "to", "ub", "-", "HSs", ".", "ChIP", "against", "Slx8", "in", "the", "indicated", "genetic", "backgrounds", "were", "quantified", "by", "qPCR", ".", "Note", "that", "Slx5", "is", "still", "recruited", "in", "the", "absence", "of", "Slx8", "(", "3HA", "-", "Slx5", "slx8", "∆", ")", ",", "but", "not", "vice", "versa", "(", "Slx8", "-", "9myc", "slx5", "∆", ")", ".", "Data", "for", "WT", "and", "Slx8", "-", "9myc", "in", "(", "G", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Euc1 interacts with SUMO pathway proteins in a yeast two-hybrid (Y2H) assay. A Y2H reporter strain (PJ69-7a) was transformed with Gal4 DNA-binding domain (BD) and Gal4 activation domain (AD) fusion constructs in the indicated combinations. AD-SUMO-GG can be conjugated to SUMOylation substrates, while AD-SUMO-AA is conjugation-deficient. Cells were spotted on control media or selective media (- His) and grown for 3 and 6 days, respectively.(B) Euc1 is SUMOylated by Ubc9, Siz1 and Siz2 on K231. Euc1 was immunoprecipitated from the indicated strains and eluates were probed by WB against SUMO (top) and Euc1 (bottom). An up-shifted band corresponding to Euc1SUMO was detected with both antibodies. Asterisks denote non-specific bands.(C) Euc1 is predominantly monoSUMOylated on lysine 231. Denaturing NiNTA-pulldowns (NiNTA-PD) with strains expressing His-tagged SUMO (HisSUMO) as indicated and 3FLAGEuc1 constructs under the control of an ADH promoter. Covalently SUMO-modified proteins were enriched and eluates probed with a FLAG antibody to visualize SUMOylated Euc1. Eluates were probed for SUMO to control for equal pull-down, Pgk1 was probed as input control. Euc1-KR denotes the K231R mutation here and hereafter.(D) Euc1 SUMOylation is required for ub-HS formation. Ub-K48 ChIP quantified by qPCR for the indicated strains. The ubx5∆ background was used to enhance the ubiquitin signal, similar results were obtained in a WT background. Data represent means ± SD (n = 3).(E) Euc1 ubiquitylation depends on Slx8 and partly on Euc1 SUMOylation. Denaturing NiNTA-PDs as described for (C) but with strains expressing His-ubiquitin (HisUbi) and 3FLAGEuc1 under the control of the ADH promoter. WBs were developed with a FLAG antibody to probe for 3FLAGEuc1, a ubiquitin blot served as PD-control and Dpm1 as input control. The slx8-CD allele carries the C206S, C209S-mutations (Xie et al, 2007).SUMOylated Euc1 is required to recruit Slx5 and Slx8 to ub-HSs. ChIP against Slx5 in the indicated genetic backgrounds were quantified by qPCR. Note that Slx5 is still recruited in the absence of Slx8 (3HA-Slx5 slx8∆), but not vice versa (Slx8-9myc slx5∆). Data for WT and 3HA-Slx5 in (F) and WTSUMOylated Euc1 is required to recruit Slx8 to ub-HSs. ChIP against Slx8 in the indicated genetic backgrounds were quantified by qPCR. Note that Slx5 is still recruited in the absence of Slx8 (3HA-Slx5 slx8∆), but not vice versa (Slx8-9myc slx5∆). Data for WT and Slx8-9myc in (G)"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Euc181", "-", "183", "binds", "to", "Slx5", "in", "Y2H", "assays", ".", "Y2H", "assay", "performed", "as", "in", "Fig", ".", "4A", ".", "Serial", "dilutions", "were", "spotted", "for", "each", "plasmid", "combination", "and", "cells", "were", "grown", "at", "30", "°", "C", "for", "2", "days", ".", "The", "Slx5", "-", "RING", "∆", "construct", "is", "deleted", "for", "the", "Slx5", "C", "-", "terminus", "from", "beginning", "of", "the", "RING", "-", "domain", "(", "∆", "aa", "488", "-", "619", ")", ".", "See", "also", "Fig", ".", "EV3B", ".", "(", "B", ")", "Euc1", "binds", "Slx5", "in", "vitro", ".", "Recombinant", "purified", "GST", "or", "GSTEuc1", "were", "used", "in", "GST", "pull", "-", "down", "assays", "to", "co", "-", "precipitate", "recombinant", "6HisSlx5", ".", "(", "C", ")", "Euc1", "binds", "to", "Slx5", "in", "vivo", ".", "Cell", "lysates", "from", "an", "euc1", "∆", "strain", "expressing", "the", "indicated", "3FLAGEuc1", "constructs", "from", "plasmids", "(", "under", "EUC1", "promoter", ")", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "using", "anti", "-", "FLAG", "beads", ".", "IP", "-", "eluates", "were", "probed", "by", "WB", "with", "Slx5", ",", "SUMO", "and", "Euc1", "antibodies", ",", "inputs", "were", "probed", "with", "Slx5", ",", "FLAG", "and", "Dpm1", "antibodies", "(", "top", "to", "bottom", ")", ".", "Note", "that", "the", "Euc1", "-", "Slx5", "interaction", "is", "independent", "of", "the", "Slx8", "ligase", "activity", "(", "slx8", "-", "CD", ",", "lanes", "5", "-", "8", ")", ".", "(", "D", ")", "Euc1", "Slx5", "-", "binding", "mutants", "(", "SBM1", ",", "SBM2", ")", "affect", "Euc1", "-", "Slx5", "interaction", "in", "Y2H", "assays", ".", "AD", "-", "Euc181", "-", "183", "constructs", "harboring", "mutations", "in", "the", "region", "required", "for", "Slx5", "binding", "were", "probed", "for", "interaction", "with", "BD", "-", "Slx5", "constructs", "as", "described", "in", "Fig", ".", "4A", ".", "Mutations", ":", "SBM1", ":", "aa", "139", "-", "143", "ENQKK", ">", "ANAAA", ",", "SBM2", ":", "aa", "162", "-", "165", "KEVF", ">", "AAAA", ".", "Serial", "dilutions", "were", "spotted", "and", "cells", "were", "grown", "at", "30", "°", "C", "for", "2", "days", ".", "See", "Appendix", "Fig", ".", "S6A", "for", "expression", "levels", ".", "(", "E", ")", "Euc1", "-", "SBM", "constructs", "show", "defective", "Slx5", "binding", "in", "vivo", ".", "Mutations", "described", "in", "(", "D", ")", "were", "introduced", "into", "full", "-", "length", "Euc1", "constructs", "(", "with", "or", "without", "the", "K231R", "mutation", ")", "and", "FLAG", "IPs", "were", "performed", "as", "described", "in", "(", "C", ")", ".", "WB", "analysis", "showed", "strong", "Slx5", "-", "binding", "defects", "for", "the", "SBM1", "/", "SBM2", "and", "SBM1", "+", "2", "constructs", "(", "top", "panel", ",", "immunoprecipitated", "Slx5", ")", ".", "WBs", "were", "probed", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "F", ")", "The", "Slx5", "middle", "domain", "(", "Slx5", "-", "Md", ")", "is", "required", "for", "interaction", "with", "Euc1", ".", "Y2H", "assays", "with", "AD", "-", "Euc181", "-", "183", "and", "BD", "-", "Slx5", "constructs", ".", "Slx5", "-", "Md", ":", "aa", "201", "-", "335", ",", "Slx5", "-", "Md", "∆", ":", "∆", "aa", "201", "-", "338", ".", "Serial", "dilutions", "were", "spotted", "and", "cells", "were", "grown", "at", "30", "°", "C", "for", "4", "days", ".", "See", "also", "Fig", ".", "EV3C", ".", "(", "G", ")", "Euc1", "-", "SBM", "constructs", "show", "defective", "binding", "to", "the", "Slx5", "-", "Md", ".", "Y2H", "assay", "with", "the", "indicated", "constructs", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "See", "Appendix", "Fig", ".", "S6A", "for", "expression", "controls", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Euc181-183 binds to Slx5 in Y2H assays. Y2H assay performed as in Fig. 4A. Serial dilutions were spotted for each plasmid combination and cells were grown at 30°C for 2 days. The Slx5-RING∆ construct is deleted for the Slx5 C-terminus from beginning of the RING-domain (∆aa 488-619). See also Fig. EV3B.(B) Euc1 binds Slx5 in vitro. Recombinant purified GST or GSTEuc1 were used in GST pull-down assays to co-precipitate recombinant 6HisSlx5.(C) Euc1 binds to Slx5 in vivo. Cell lysates from an euc1∆ strain expressing the indicated 3FLAGEuc1 constructs from plasmids (under EUC1 promoter) were subjected to immunoprecipitation using anti-FLAG beads. IP-eluates were probed by WB with Slx5, SUMO and Euc1 antibodies, inputs were probed with Slx5, FLAG and Dpm1 antibodies (top to bottom). Note that the Euc1-Slx5 interaction is independent of the Slx8 ligase activity (slx8-CD, lanes 5-8).(D) Euc1 Slx5-binding mutants (SBM1, SBM2) affect Euc1-Slx5 interaction in Y2H assays. AD-Euc181-183 constructs harboring mutations in the region required for Slx5 binding were probed for interaction with BD-Slx5 constructs as described in Fig. 4A. Mutations: SBM1: aa 139-143 ENQKK>ANAAA, SBM2: aa 162-165 KEVF>AAAA. Serial dilutions were spotted and cells were grown at 30°C for 2 days. See Appendix Fig. S6A for expression levels.(E) Euc1-SBM constructs show defective Slx5 binding in vivo. Mutations described in (D) were introduced into full-length Euc1 constructs (with or without the K231R mutation) and FLAG IPs were performed as described in (C). WB analysis showed strong Slx5-binding defects for the SBM1/SBM2 and SBM1+2 constructs (top panel, immunoprecipitated Slx5). WBs were probed as in (C).(F) The Slx5 middle domain (Slx5-Md) is required for interaction with Euc1. Y2H assays with AD-Euc181-183 and BD-Slx5 constructs. Slx5-Md: aa 201-335, Slx5-Md∆: ∆aa 201-338. Serial dilutions were spotted and cells were grown at 30°C for 4 days. See also Fig. EV3C.(G) Euc1-SBM constructs show defective binding to the Slx5-Md. Y2H assay with the indicated constructs as in (D). See Appendix Fig. S6A for expression controls."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Euc1", "Slx5", "-", "binding", "mutations", "impair", "Euc1", "ubiquitylation", ".", "His", "-", "ubiquitin", "-", "modified", "proteins", "were", "enriched", "by", "denaturing", "NiNTA", "-", "PDs", "as", "described", "in", "Fig", ".", "4E", ".", "3FLAG", "-", "tagged", "Euc1", "constructs", "were", "expressed", "from", "plasmids", "under", "the", "control", "of", "the", "ADH", "promoter", ".", "NiNTA", "-", "PD", "eluates", "were", "probed", "with", "FLAG", "and", "ubiquitin", "(", "P4D1", ")", "antibodies", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "input", ")", "were", "probed", "with", "FLAG", "and", "Dpm1", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "The", "Slx5", "-", "SIMs", "and", "Slx5", "-", "Md", "are", "required", "for", "Euc1", "ubiquitylation", ".", "NiNTA", "-", "PDs", "for", "His", "-", "ubiquitin", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "All", "strains", "expressed", "wild", "-", "type", "3FLAGEuc1", "from", "plasmids", "under", "the", "ADH", "promoter", "and", "His", "-", "ubiquitin", ".", "Slx5", "constructs", "were", "expressed", "from", "plasmids", "under", "control", "of", "the", "endogenous", "promoter", ".", "WBs", "were", "probed", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ",", "Slx5", "-", "levels", "were", "probed", "using", "an", "HA", "antibody", ".", "Asterisk", "denotes", "a", "non", "-", "specific", "band", ".", "Slx5", "-", "SIM", "*", ":", "SIMs", "1", "-", "4", "were", "mutated", "as", "described", "(", "Xie", "et", "al", ",", "2010", ")", ",", "for", "SIM5", ",", "aa", "477", "-", "479", "(", "IIV", ")", "were", "mutated", "to", "alanines", ".", "To", "avoid", "possible", "mislocalization", "by", "deletion", "of", "the", "Slx5", "-", "Md", ",", "which", "overlaps", "with", "a", "putative", "NLS", "(", "Westerbeck", "et", "al", ",", "2014", ")", ",", "an", "N", "-", "terminal", "NLS", "was", "fused", "to", "all", "constructs", ".", "See", "Appendix", "Fig", ".", "S7C", "for", "HU", "complementation", ".", "(", "C", ")", "Euc1", "Slx5", "-", "binding", "mutations", "(", "SBM1", "/", "SBM2", ")", "reduce", "/", "abolish", "ub", "-", "HSs", "and", "recruitment", "of", "Slx5", "to", "ub", "-", "HSs", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "for", "ub", "-", "K48", "(", "top", ")", "or", "Slx5", "(", "using", "Slx5", "antibody", ",", "bottom", ")", "in", "euc1", "∆", "ubx5", "∆", "cells", "expressing", "the", "indicated", "constructs", "from", "plasmids", "under", "the", "control", "of", "the", "EUC1", "promoter", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "See", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S7E", "-", "G", ".", "(", "D", ")", "Slx5", "-", "SIMs", "and", "the", "Slx5", "-", "Md", "are", "required", "for", "the", "formation", "of", "ub", "-", "HSs", "and", "recruitment", "of", "Slx5", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "for", "ub", "-", "K48", "(", "left", ")", "or", "Slx5", "(", "anti", "-", "HA", "ChIP", ",", "right", ")", "in", "ubx5", "∆", "cells", "or", "slx5", "∆", "ubx5", "∆", "cells", "complemented", "with", "plasmids", "expressing", "the", "indicated", "Slx5", "-", "constructs", "under", "control", "of", "the", "SLX5", "promoter", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "See", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S7H", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Euc1 Slx5-binding mutations impair Euc1 ubiquitylation. His-ubiquitin-modified proteins were enriched by denaturing NiNTA-PDs as described in Fig. 4E. 3FLAG-tagged Euc1 constructs were expressed from plasmids under the control of the ADH promoter. NiNTA-PD eluates were probed with FLAG and ubiquitin (P4D1) antibodies. Whole cell lysates (input) were probed with FLAG and Dpm1 antibodies.(B) The Slx5-SIMs and Slx5-Md are required for Euc1 ubiquitylation. NiNTA-PDs for His-ubiquitin as in (A). All strains expressed wild-type 3FLAGEuc1 from plasmids under the ADH promoter and His-ubiquitin. Slx5 constructs were expressed from plasmids under control of the endogenous promoter. WBs were probed as described in (A), Slx5-levels were probed using an HA antibody. Asterisk denotes a non-specific band. Slx5-SIM*: SIMs 1-4 were mutated as described (Xie et al, 2010), for SIM5, aa 477-479 (IIV) were mutated to alanines. To avoid possible mislocalization by deletion of the Slx5-Md, which overlaps with a putative NLS (Westerbeck et al, 2014), an N-terminal NLS was fused to all constructs. See Appendix Fig. S7C for HU complementation.(C) Euc1 Slx5-binding mutations (SBM1/SBM2) reduce/abolish ub-HSs and recruitment of Slx5 to ub-HSs. ChIP-qPCR for ub-K48 (top) or Slx5 (using Slx5 antibody, bottom) in euc1∆ ubx5∆ cells expressing the indicated constructs from plasmids under the control of the EUC1 promoter. Data represent means ± SD (n = 3). See also Appendix Fig. S7E-G.(D) Slx5-SIMs and the Slx5-Md are required for the formation of ub-HSs and recruitment of Slx5. ChIP-qPCR for ub-K48 (left) or Slx5 (anti-HA ChIP, right) in ubx5∆ cells or slx5∆ ubx5∆ cells complemented with plasmids expressing the indicated Slx5-constructs under control of the SLX5 promoter. Data represent means ± SD (n = 2). See also Appendix Fig. S7H."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Deletion", "of", "EUC1", "does", "not", "lead", "to", "ub", "-", "HS", "adjacent", "gene", "deregulation", ",", "but", "rather", "widespread", "transcriptome", "changes", ".", "Total", "RNA", "isolated", "from", "WT", "and", "euc1", "∆", "cells", "was", "polyA", "-", "enriched", "and", "sequenced", "(", "RNAseq", ",", "triplicates", ")", ".", "Significance", "testing", "was", "based", "on", "the", "Wald", "test", ",", "see", "Materials", "and", "Methods", "for", "details", ".", "See", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S8A", "for", "quantification", "of", "selected", "transcripts", "by", "qPCR", ".", "(", "B", ")", "RNAseq", "transcriptome", "analysis", "of", "EUC1", "overexpression", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "∆", "euc1", "cells", "with", "pGAL", "-", "EUC1", "or", "pEUC1", "-", "EUC1", "(", "control", ")", "integrated", "at", "the", "URA3", "-", "locus", "(", "YIplac211", ")", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "and", "2", "%", "galactose", "was", "added", "for", "3h", ".", "See", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S8E", ".", "(", "C", ")", "EUC1", "overexpression", "is", "toxic", "at", "elevated", "temperatures", "and", "upon", "exposure", "to", "the", "membrane", "fluidizing", "drug", "benzylalcohol", ".", "For", "(", "C", ",", "D", ",", "F", ")", ",", "serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "strains", "were", "spotted", "and", "grown", "on", "YPD", "control", "(", "or", "selective", "media", ")", "plates", "or", "under", "conditions", "as", "indicated", ".", "See", "also", "Fig", ".", "EV4A", "-", "B", ".", "(", "D", ")", "EUC1", "overexpression", "toxicity", "depends", "on", "DNA", "binding", "and", "transactivation", ".", "The", "indicated", "EUC1", "alleles", "with", "endogenous", "or", "galactose", "-", "inducible", "promoters", "were", "integrated", "at", "the", "URA3", "locus", "(", "YIplac211", ",", "euc1", "∆", "background", ")", "and", "spotted", "on", "glucose", "control", "or", "galactose", "plates", "to", "induce", "EUC1", "overexpression", ".", "See", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S9A", "-", "C", ".", "(", "E", ")", "Aberrant", "binding", "of", "overexpressed", "EUC1", "partially", "depends", "on", "Euc1", "DNA", "binding", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "of", "Euc1", "after", "3", "hours", "galactose", "induction", ".", "Note", "that", "IP", "/", "input", "ratios", "of", "Euc1", "signals", "are", "shown", ",", "also", "for", "the", "control", "locus", "(", "contr", ".", ",", "TOS1", "promoter", ")", "to", "highlight", "Euc1", "binding", "at", "non", "-", "ub", "-", "HS", "sites", ".", "STI1", "-", "CIN5", ":", "intergenic", "region", ".", "TEC1", "-", "us", ":", "upstream", "(", "promoter", ")", "region", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "See", "also", "Fig", ".", "EV4C", "-", "D", ".", "(", "F", ")", "Simultaneous", "overexpression", "of", "SLX5", "and", "SLX8", "rescue", "EUC1", "toxicity", ".", "Experiment", "as", "in", "(", "D", ")", ",", "but", "with", "concomitant", "plasmid", "-", "borne", "overexpression", "(", "ADH", "promoter", ")", "of", "SLX5", "and", "SLX8", "(", "bottom", "panels", ")", "and", "on", "media", "selecting", "for", "SLX5", "/", "SLX8", "plasmids", ".", "See", "also", "Fig", ".", "EV4E", "and", "Appendix", "Fig", ".", "S9D", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Deletion of EUC1 does not lead to ub-HS adjacent gene deregulation, but rather widespread transcriptome changes. Total RNA isolated from WT and euc1∆ cells was polyA-enriched and sequenced (RNAseq, triplicates). Significance testing was based on the Wald test, see Materials and Methods for details. See also Appendix Fig. S8A for quantification of selected transcripts by qPCR.(B) RNAseq transcriptome analysis of EUC1 overexpression as in (A). ∆euc1 cells with pGAL-EUC1 or pEUC1-EUC1 (control) integrated at the URA3-locus (YIplac211) were grown to mid-log phase and 2% galactose was added for 3h. See also Appendix Fig. S8E.(C) EUC1 overexpression is toxic at elevated temperatures and upon exposure to the membrane fluidizing drug benzylalcohol. For (C, D, F), serial dilutions of the indicated strains were spotted and grown on YPD control (or selective media) plates or under conditions as indicated. See also Fig. EV4A-B.(D) EUC1 overexpression toxicity depends on DNA binding and transactivation. The indicated EUC1 alleles with endogenous or galactose-inducible promoters were integrated at the URA3 locus (YIplac211, euc1∆ background) and spotted on glucose control or galactose plates to induce EUC1 overexpression. See also Appendix Fig. S9A-C.(E) Aberrant binding of overexpressed EUC1 partially depends on Euc1 DNA binding. ChIP-qPCR of Euc1 after 3 hours galactose induction. Note that IP/input ratios of Euc1 signals are shown, also for the control locus (contr., TOS1 promoter) to highlight Euc1 binding at non-ub-HS sites. STI1-CIN5: intergenic region. TEC1-us: upstream (promoter) region. Data represent means ± SD (n = 3). See also Fig. EV4C-D.(F) Simultaneous overexpression of SLX5 and SLX8 rescue EUC1 toxicity. Experiment as in (D), but with concomitant plasmid-borne overexpression (ADH promoter) of SLX5 and SLX8 (bottom panels) and on media selecting for SLX5/SLX8 plasmids. See also Fig. EV4E and Appendix Fig. S9D."}
{"words": ["Figure", "8EUC1", "displays", "negative", "genetic", "interactions", "with", "genes", "involved", "in", "general", "and", "specific", "transcriptional", "regulation", "(", "A", ")", "and", "in", "particular", "with", "members", "of", "the", "Rpd3L", "histone", "deacetylase", "complex", "(", "B", ")", ".", "For", "(", "A", "-", "D", ")", ",", "serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "strains", "were", "spotted", "and", "grown", "on", "YPD", "control", "or", "selective", "media", "plates", ",", "or", "under", "conditions", "as", "indicated", ".", "Note", "that", "all", "strains", "used", "in", "(", "A", "-", "D", ")", "contained", "an", "extra", "copy", "of", "MED11", ",", "EUC1", "displays", "negative", "genetic", "interactions", "with", "genes", "involved", "in", "particular", "with", "members", "of", "the", "Rpd3L", "histone", "deacetylase", "complex", "For", ",", "serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "strains", "were", "spotted", "and", "grown", "on", "YPD", "control", "or", "selective", "media", "plates", ",", "or", "under", "conditions", "as", "indicated", ".", "Note", "that", "all", "strains", "used", "in", "(", "A", "-", "D", ")", "contained", "an", "extra", "copy", "of", "MED11", ",", "For", "serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "strains", "were", "spotted", "and", "grown", "on", "YPD", "control", "or", "selective", "media", "plates", ",", "or", "under", "conditions", "as", "indicated", ".", "Note", "that", "all", "strains", "used", "contained", "an", "extra", "copy", "of", "MED11", "(", "C", ")", "Plasmid", "-", "borne", "EUC1", "complements", "genetic", "interactions", "with", "Rpd3L", "subunits", ".", "Empty", "vector", "(", "-", ")", "or", "a", "plasmid", "encoding", "EUC1", "with", "its", "endogenous", "promoter", "were", "transformed", "in", "the", "indicated", "strains", "and", "spotted", "on", "selective", "media", ".", "For", "serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "strains", "were", "spotted", "and", "grown", "on", "YPD", "control", "or", "selective", "media", "plates", ",", "or", "under", "conditions", "as", "indicated", ".", "Note", "that", "all", "strains", "used", "contained", "an", "extra", "copy", "of", "MED11", "(", "D", ")", "EUC1", "and", "Rpd3S", "act", "in", "a", "common", "pathway", "which", "is", "redundant", "with", "Rpd3L", ".", "rco1", "∆", "and", "eaf3", "∆", "(", "Rpd3S", ")", "show", "similar", "phenotypes", "when", "paired", "with", "sds3", "∆", "(", "Rpd3L", ")", "as", "euc1", "∆", "and", "are", "epistatic", "with", "euc1", "∆", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8EUC1 displays negative genetic interactions with genes involved in general and specific transcriptional regulation (A) and in particular with members of the Rpd3L histone deacetylase complex (B). For (A-D), serial dilutions of the indicated strains were spotted and grown on YPD control or selective media plates, or under conditions as indicated. Note that all strains used in (A-D) contained an extra copy of MED11,EUC1 displays negative genetic interactions with genes involved in particular with members of the Rpd3L histone deacetylase complex For , serial dilutions of the indicated strains were spotted and grown on YPD control or selective media plates, or under conditions as indicated. Note that all strains used in (A-D) contained an extra copy of MED11,For serial dilutions of the indicated strains were spotted and grown on YPD control or selective media plates, or under conditions as indicated. Note that all strains used contained an extra copy of MED11 (C) Plasmid-borne EUC1 complements genetic interactions with Rpd3L subunits. Empty vector (-) or a plasmid encoding EUC1 with its endogenous promoter were transformed in the indicated strains and spotted on selective media.For serial dilutions of the indicated strains were spotted and grown on YPD control or selective media plates, or under conditions as indicated. Note that all strains used contained an extra copy of MED11 (D) EUC1 and Rpd3S act in a common pathway which is redundant with Rpd3L. rco1∆ and eaf3∆ (Rpd3S) show similar phenotypes when paired with sds3∆ (Rpd3L) as euc1∆ and are epistatic with euc1∆."}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", ")", "Euc1", "is", "recruited", "to", "ub", "-", "HSs", "upon", "mild", "heat", "stress", "(", "37", "°", "C", ",", "90", "min", ")", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "experiments", "with", "strains", "and", "conditions", "as", "indicated", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "see", "Appendix", "Fig", ".", "S11B", "for", "statistical", "analysis", ".", "The", "ability", "to", "form", "ub", "-", "hotspots", "is", "crucial", "for", "endogenous", "EUC1", "function", ".", "The", "genetic", "interaction", "of", "EUC1", "with", "SDS3", "(", "Rpd3L", "complex", ")", "was", "rescued", "with", "plasmid", "-", "borne", "EUC1", "-", "alleles", "and", "serial", "dilutions", "were", "spotted", "on", "selective", "media", ".", "(", "-", ")", "denotes", "empty", "vector", ".", "SLX5", "also", "shows", "negative", "genetic", "interactions", "with", "SDS3", "upon", "heat", "stress", ".", "Serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "strains", "were", "spotted", "on", "YPD", "and", "incubated", "as", "indicated", ".", "See", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S12C", "-", "D", ".", "Note", "that", "all", "strains", "used", "in", "(", "A", "-", "C", ")", "contained", "an", "extra", "copy", "of", "MED11", ","], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A) Euc1 is recruited to ub-HSs upon mild heat stress (37°C, 90 min). ChIP-qPCR experiments with strains and conditions as indicated. Data represent means ± SD (n = 4), see Appendix Fig. S11B for statistical analysis.The ability to form ub-hotspots is crucial for endogenous EUC1 function. The genetic interaction of EUC1 with SDS3 (Rpd3L complex) was rescued with plasmid-borne EUC1-alleles and serial dilutions were spotted on selective media. (-) denotes empty vector.SLX5 also shows negative genetic interactions with SDS3 upon heat stress. Serial dilutions of the indicated strains were spotted on YPD and incubated as indicated. See also Appendix Fig. S12C-D. Note that all strains used in (A-C) contained an extra copy of MED11,"}
{"words": ["Figure", "1All", "ORFs", "for", "the", "sense", "non", "-", "AUG", "-", "dependent", "translation", "of", "the", "(", "G4C2", ")", "n", "~", "188", ",", "DPR", "coding", "for", "(", "GA", ")", ",", "(", "GP", ")", ",", "(", "GR", ")", "can", "be", "detected", "and", "quantified", "using", "a", "filter", "-", "trap", "binding", "assay", "probing", "for", "the", "c", "-", "terminal", "HA", "tag", "of", "the", "C9", "DPR", "reporter", "construct", ".", "The", "(", "GA", ")", "ORF", "is", "the", "most", "abundantly", "detected", "DPR", "and", "GR", "the", "lowest", "in", "HEK293T", "cell", "24", "h", "post", "transient", "transfection", "of", "the", "C9", "DPR", "reporter", "construct", ".", "n", "=", "5", ".", "The", "C9orf72", "NRE", "non", "-", "AUG", "-", "dependent", "reporter", "constructs", "recapitulate", "localization", "patterns", "and", "pathological", "features", "identified", "in", "C9orf72", "NRE", "models", ".", "The", "Dendra2", "(", "green", ")", "c", "-", "terminal", "fusion", "was", "used", "to", "monitor", "cellular", "localization", "and", "fluorescence", "intensity", "for", "each", "DPR", "translated", "from", "the", "G4C2", "strand", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "cotransfected", "with", "an", "NES", "-", "mIFP", "-", "mIFP", "-", "NES", "(", "NES", "-", "mIFP", ")", "fusion", "protein", "cytoplasmic", "marker", ".", "C9", "DPR", "reporter", "constructs", "show", "cell", "-", "type", "variability", "in", "the", "number", "of", "cells", "that", "are", "DPR", "positive", "and", "the", "overall", "DPR", "levels", ".", "Transient", "cotransfections", "of", "HEK293T", "cells", "robustly", "undergo", "G4C2", "-", "Dendra2", "non", "-", "AUG", "-", "dependent", "translation", "compared", "to", "NSC34", "or", "rat", "primary", "cortical", "neurons", ".", "DPR", "positive", "cells", "and", "DPR", "fluorescent", "intensity", "were", "analyzed", "and", "calculated", "24", "h", "post", "-", "transfection", "only", "in", "cells", "expressing", "the", "co", "-", "transfected", "NES", "-", "mIFP", "construct", ".", "DPR", "fluorescent", "intensity", "was", "normalized", "to", "NES", "-", "mIFP", "fluorescent", "intensity", "to", "adjust", "for", "cell", "specific", "AUG", "-", "dependent", "translation", "levels", ";", "represented", "as", "fold", "-", "change", "relative", "to", "HEK293T", ".", "HEK293T", ":", "n", "=", "5", "with", "m", ">", "500", "cells", "analyzed", "per", "n", ".", "NSC34", ":", "n", "=", "5", "with", "m", ">", "500", "cells", "per", "n", ".", "Rat", "primary", "cortical", "neuron", ":", "n", "=", "5", "with", "m", ">", "40", "cells", "per", "n", ".", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "See", "also", "Figure", "EV1", "-", "2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1All ORFs for the sense non-AUG-dependent translation of the (G4C2)n~188, DPR coding for (GA), (GP), (GR) can be detected and quantified using a filter-trap binding assay probing for the c-terminal HA tag of the C9 DPR reporter construct. The (GA) ORF is the most abundantly detected DPR and GR the lowest in HEK293T cell 24 h post transient transfection of the C9 DPR reporter construct. n = 5.The C9orf72 NRE non-AUG-dependent reporter constructs recapitulate localization patterns and pathological features identified in C9orf72 NRE models. The Dendra2 (green) c-terminal fusion was used to monitor cellular localization and fluorescence intensity for each DPR translated from the G4C2 strand in HEK293T cells transiently cotransfected with an NES-mIFP-mIFP-NES (NES-mIFP) fusion protein cytoplasmic marker.C9 DPR reporter constructs show cell-type variability in the number of cells that are DPR positive and the overall DPR levels. Transient cotransfections of HEK293T cells robustly undergo G4C2 -Dendra2 non-AUG-dependent translation compared to NSC34 or rat primary cortical neurons. DPR positive cells and DPR fluorescent intensity were analyzed and calculated 24 h post-transfection only in cells expressing the co-transfected NES-mIFP construct. DPR fluorescent intensity was normalized to NES-mIFP fluorescent intensity to adjust for cell specific AUG-dependent translation levels; represented as fold-change relative to HEK293T. HEK293T: n = 5 with m > 500 cells analyzed per n. NSC34: n = 5 with m > 500 cells per n. Rat primary cortical neuron: n = 5 with m > 40 cells per n. (***P < 0.001, **P < 0.01, *P <0.05) See also Figure EV1-2."}
{"words": ["Figure", "2Quantitative", "fluorescent", "microscopy", "imaging", "shows", "a", "dose", "-", "dependent", "increase", "in", "the", "number", "of", "C9", "DPR", "reporter", "positive", "cells", "with", "increasing", "concentrations", "of", "an", "apoptotic", "stimulator", ",", "staurosporine", "(", "SSP", ")", ".", "The", "C9", "DPR", "reporter", "in", "the", "GP", "frame", "was", "utilized", "for", "these", "experiments", ".", "n", "=", "4", ".", "Filter", "trap", "binding", "assays", "using", "DPR", "-", "specific", "antibodies", "show", "all", "DPR", "levels", "are", "increased", "for", "the", "sense", "-", "coding", "C9", "DPR", "reporter", "when", "NSC34", "cells", "are", "challenged", "with", "stress", "-", "inducing", "compounds", ".", "These", "stress", "-", "inducing", "compounds", "broadly", "cover", "distinct", "or", "overlapping", "cellular", "pathways", "(", "see", "Table", "EV2", ")", "Antibodies", "specific", "for", "the", "C9orf72", "NRE", "DPRs", ",", "poly", "-", "GA", ",", "-", "GP", ",", "or", "-", "GR", ",", "were", "used", "to", "quantify", "DPR", "levels", "normalized", "to", "GAPDH", "24", "h", "post", "transient", "transfection", "of", "the", "C9", "DPR", "reporter", "constructs", ".", "n", "=", "4", ".", "Quantitative", "fluorescent", "microscopy", "imaging", "shows", "that", "NSC34", ",", "rat", "primary", "cortical", "neurons", "have", "increased", "relative", "DPR", "fluorescent", "intensity", "levels", "following", "compound", "induced", "cellular", "stress", ".", "In", "NES", "-", "mIFP", "cotransfection", "positive", "NSC34", "and", "rat", "primary", "cortical", "neurons", "there", "is", "a", "significant", "increase", "in", "C9", "DPR", "reporter", "fluorescent", "intensity", "levels", "24", "post", "treatment", "with", "most", "stress", "-", "inducing", "compounds", ".", "Fluorescent", "intensity", "was", "not", "normalized", "to", "NES", "-", "mIFP", "fluorescent", "levels", ".", "NSC34", ":", "n", "=", "10", "with", "m", ">", "500", "cells", "analyzed", "per", "n", ".", "Cortical", "neuron", ":", "n", "=", "6", "with", "m", ">", "40", "cells", "per", "n", ".", "Endogenously", "expression", "of", "DPRs", "in", "iPS", "spinal", "motor", "neurons", "(", "iPS", "sMN", ")", "derived", "from", "C9orf72", "NRE", "patients", "increases", "following", "induction", "of", "cellular", "stress", ".", "DPR", "fluorescent", "intensity", "in", "iPS", "sMN", "was", "measured", "using", "the", "DPR", "-", "specific", "antibodies", "described", "above", ".", "IPS", "sMN", ":", "n", "=", "4", "with", "m", ">", "20", "cells", "per", "n", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Quantitative fluorescent microscopy imaging shows a dose-dependent increase in the number of C9 DPR reporter positive cells with increasing concentrations of an apoptotic stimulator, staurosporine (SSP). The C9 DPR reporter in the GP frame was utilized for these experiments. n = 4.Filter trap binding assays using DPR-specific antibodies show all DPR levels are increased for the sense-coding C9 DPR reporter when NSC34 cells are challenged with stress-inducing compounds. These stress-inducing compounds broadly cover distinct or overlapping cellular pathways (see Table EV2) Antibodies specific for the C9orf72 NRE DPRs, poly-GA, -GP, or -GR, were used to quantify DPR levels normalized to GAPDH 24 h post transient transfection of the C9 DPR reporter constructs. n = 4.Quantitative fluorescent microscopy imaging shows that NSC34, rat primary cortical neurons have increased relative DPR fluorescent intensity levels following compound induced cellular stress. In NES-mIFP cotransfection positive NSC34 and rat primary cortical neurons there is a significant increase in C9 DPR reporter fluorescent intensity levels 24 post treatment with most stress-inducing compounds. Fluorescent intensity was not normalized to NES-mIFP fluorescent levels. NSC34: n = 10 with m > 500 cells analyzed per n. Cortical neuron: n = 6 with m > 40 cells per n. Endogenously expression of DPRs in iPS spinal motor neurons (iPS sMN) derived from C9orf72 NRE patients increases following induction of cellular stress. DPR fluorescent intensity in iPS sMN was measured using the DPR-specific antibodies described above. IPS sMN: n = 4 with m > 20 cells per n."}
{"words": ["Figure", "3Fluorescent", "microscopy", "images", "shows", "Glutamate", "-", "induced", "(", "Glut", ")", "excitotoxic", "stress", "increases", "DPR", "levels", "in", "rat", "cortical", "neurons", "expressing", "the", "C9", "DPR", "reporter", "and", "in", "iPS", "sMN", "derived", "from", "C9orf72", "NRE", "patients", ".", "Glutamate", "-", "induced", "DPR", "levels", "are", "reduced", "by", "pretreating", "cells", "with", "the", "AMPA", "and", "NMDA", "specific", "antagonists", "NBQX", "and", "MK801", ",", "respectively", ".", "Relative", "fluorescent", "intensity", "quantification", "demonstrates", "there", "is", "a", "significant", "increase", "in", "DPR", "levels", "when", "primary", "cortical", "neurons", "and", "sMNs", "are", "challenged", "with", "the", "excitotoxic", "stressors", ":", "glutamate", ",", "AMPA", ",", "NMDA", ",", "and", "HC", ".", "Blocking", "either", "the", "AMPA", "or", "NMDA", "receptors", "reduces", "DPR", "levels", "in", "the", "presence", "of", "excitotoxic", "stressors", ".", "NES", "-", "mIFP", "or", "MAP2", "were", "used", "to", "mark", "transfection", "positive", "rat", "cortical", "neurons", "or", "iPS", "sMNs", ",", "respectively", ",", "for", "quantification", ".", "DPR", "fluorescent", "intensity", "in", "iPS", "sMN", "was", "measured", "using", "DPR", "-", "specific", "antibodies", ".", "Changes", "in", "DPR", "levels", "are", "relative", "to", "non", "-", "stressed", "cells", "(", "CTRL", ")", "Cortical", "neuron", ":", "n", "=", "6", "with", "m", ">", "40", "cells", "per", "n", ".", "IPSC", "sMN", ":", "n", "=", "4", "with", "m", ">", "25", "cells", "per", "n", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Fluorescent microscopy images shows Glutamate-induced (Glut) excitotoxic stress increases DPR levels in rat cortical neurons expressing the C9 DPR reporter and in iPS sMN derived from C9orf72 NRE patients. Glutamate-induced DPR levels are reduced by pretreating cells with the AMPA and NMDA specific antagonists NBQX and MK801, respectively. Relative fluorescent intensity quantification demonstrates there is a significant increase in DPR levels when primary cortical neurons and sMNs are challenged with the excitotoxic stressors: glutamate, AMPA, NMDA, and HC. Blocking either the AMPA or NMDA receptors reduces DPR levels in the presence of excitotoxic stressors. NES-mIFP or MAP2 were used to mark transfection positive rat cortical neurons or iPS sMNs, respectively, for quantification. DPR fluorescent intensity in iPS sMN was measured using DPR-specific antibodies. Changes in DPR levels are relative to non-stressed cells (CTRL) Cortical neuron: n = 6 with m > 40 cells per n. IPSC sMN: n = 4 with m > 25 cells per n."}
{"words": ["Figure", "4Microscopy", "images", "show", "increased", "DPR", "fluorescent", "intensity", "levels", "from", "medium", "and", "high", "frequency", "stimulation", "of", "ChR2", "in", "primary", "cortical", "neurons", "transfected", "with", "the", "C9", "DPR", "reporter", ".", "Relative", "fluorescent", "intensity", "quantification", "shows", "a", "significant", "increase", "in", "DPR", "levels", "with", "increases", "in", "neuronal", "activity", "through", "medium", "and", "high", "stimulation", "in", "primary", "cortical", "neurons", ".", "No", "stimulation", "and", "low", "stimulation", "frequencies", "did", "not", "increase", "levels", "of", "DPR", ".", "The", "C9", "DPR", "reporter", ",", "monitoring", "the", "GP", "DPR", "(", "ORF2", ")", ",", "was", "cotransfected", "with", "ChR2", ".", "Cortical", "neuron", ":", "n", "=", "4", "with", "m", ">", "10", "cells", "per", "n", ".", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Microscopy images show increased DPR fluorescent intensity levels from medium and high frequency stimulation of ChR2 in primary cortical neurons transfected with the C9 DPR reporter.Relative fluorescent intensity quantification shows a significant increase in DPR levels with increases in neuronal activity through medium and high stimulation in primary cortical neurons. No stimulation and low stimulation frequencies did not increase levels of DPR. The C9 DPR reporter, monitoring the GP DPR (ORF2), was cotransfected with ChR2. Cortical neuron: n = 4 with m > 10 cells per n. (****P < 0.0001)."}
{"words": ["Figure", "5Filter", "trap", "binding", "assays", "show", "that", "ISR", "proteins", "are", "enhanced", "by", "all", "stressors", ".", "Significant", "increases", "following", "cellular", "stress", "treatments", "are", "seen", "in", "the", "ratio", "of", "phospho", "-", "eif2α", "to", "total", "eif2α", "as", "well", "as", "phospho", "-", "PERK", "and", "ATF4", "levels", "compared", "to", "untreated", "controls", ".", "Changes", "in", "ISR", "proteins", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "and", "shown", "relative", "to", "non", "-", "stressed", "or", "DMSO", "-", "only", "treated", "cells", "(", "CTRL", ")", "depending", "on", "the", "vehicle", "compounds", "were", "dissolved", "in", ".", "n", "=", "4", ".", "Fluorescent", "intensity", "measurements", "show", "the", "levels", "of", "two", "ISR", "-", "related", "proteins", ",", "PERK", "and", "relative", "phospho", "-", "eif2α", "(", "phospho", "-", "eif2α", "/", "total", "eif2α", ")", ",", "are", "increased", "following", "different", "excitotoxic", "stress", "treatments", "in", "cortical", "neurons", ".", "Representative", "images", "indicate", "fluorescent", "intensity", "differences", "for", "phospho", "-", "eif2α", "and", "phospho", "-", "PERK", "levels", "24", "h", "post", "treatment", "with", "different", "excitotoxic", "stressor", "paradigms", ".", "Blocking", "of", "AMPA", "and", "NMDA", "receptors", "using", "known", "antagonists", "significantly", "reduces", "ISR", "-", "related", "protein", "levels", ",", "which", "parallels", "reduced", "DPR", "levels", "(", "Figure", "3B", ")", ".", "Changes", "in", "ISR", "proteins", "are", "relative", "to", "non", "-", "stressed", "cells", "(", "CTRL", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Filter trap binding assays show that ISR proteins are enhanced by all stressors. Significant increases following cellular stress treatments are seen in the ratio of phospho-eif2α to total eif2α as well as phospho-PERK and ATF4 levels compared to untreated controls. Changes in ISR proteins are normalized to GAPDH and shown relative to non-stressed or DMSO-only treated cells (CTRL) depending on the vehicle compounds were dissolved in. n = 4.Fluorescent intensity measurements show the levels of two ISR-related proteins, PERK and relative phospho-eif2α (phospho-eif2α / total eif2α), are increased following different excitotoxic stress treatments in cortical neurons. Representative images indicate fluorescent intensity differences for phospho-eif2α and phospho-PERK levels 24 h post treatment with different excitotoxic stressor paradigms. Blocking of AMPA and NMDA receptors using known antagonists significantly reduces ISR-related protein levels, which parallels reduced DPR levels (Figure 3B). Changes in ISR proteins are relative to non-stressed cells (CTRL)."}
{"words": ["Figure", "6Relative", "fluorescent", "intensity", "quantification", "shows", "a", "significant", "decrease", "in", "C9", "DPR", "reporter", "levels", "when", "stressor", "challenged", "NSC34", "cells", "were", "treated", "with", "compounds", "inhibiting", "ISR", "-", "related", "or", "translation", "-", "targeting", "pathways", ".", "Dibenzoylmethane", "(", "1", ",", "3DBM", ";", "20", "µM", ")", ",", "which", "inhibits", "eif2α", "-", "P", "activity", ",", "had", "the", "most", "significant", "decreases", "in", "DPR", "production", ".", "Trazodone", "(", "Traz", ";", "20", "µM", ")", "showed", "similar", "significant", "reduction", "in", "DPR", "levels", "as", "the", "PERK", "inhibitor", ",", "GSK2606414", "(", "500", "nM", ")", ".", "Relative", "fluorescent", "intensity", "quantification", "shows", "a", "significant", "decrease", "in", "C9", "DPR", "reporter", "levels", "when", "glutamate", "stressed", "primary", "cortical", "neurons", "were", "treated", "with", "the", "compounds", "Trazodone", "(", "Traz", ";", "20", "µM", ")", "or", "Dibenzoylmethane", "(", "1", ",", "3DBM", ";", "20", "µM", ")", ".", "Similar", "to", "the", "treatments", "in", "NSC34", ",", "1", ",", "3DBM", "shows", "the", "most", "significant", "decrease", "in", "DPR", "production", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Relative fluorescent intensity quantification shows a significant decrease in C9 DPR reporter levels when stressor challenged NSC34 cells were treated with compounds inhibiting ISR-related or translation-targeting pathways. Dibenzoylmethane (1,3DBM; 20 µM), which inhibits eif2α-P activity, had the most significant decreases in DPR production. Trazodone (Traz; 20 µM) showed similar significant reduction in DPR levels as the PERK inhibitor, GSK2606414 (500 nM).Relative fluorescent intensity quantification shows a significant decrease in C9 DPR reporter levels when glutamate stressed primary cortical neurons were treated with the compounds Trazodone (Traz; 20 µM) or Dibenzoylmethane (1,3DBM; 20 µM). Similar to the treatments in NSC34, 1,3DBM shows the most significant decrease in DPR production."}
{"words": ["Figure", "1Analysis", "of", "ER", "architecture", "and", "dynamics", "as", "a", "function", "of", "RNF26", "in", "U2OS", "cells", "ectopically", "expressing", "mCherry", "-", "KDEL", "and", "transfected", "with", "either", "control", "siRNA", "(", "siC", ")", "or", "siRNAs", "targeting", "RNF26", "(", "siRNF26", "-", "1", "or", "siRNF26", "-", "2", ")", ".", "B", ".", "Time", "-", "lapse", "imaging", ".", "Top", "panels", ":", "representative", "confocal", "fluorescence", "images", "of", "Cherry", "-", "KDEL", "(", "white", ")", "at", "the", "start", "of", "time", "-", "lapse", "t", "=", "0", "(", "top", ")", ".", "Middle", "panels", ":", "time", "color", "coded", "overlays", "of", "60x1s", "frames", ",", "each", "assigned", "a", "different", "color", "LUT", "(", "white", "-", "same", "ER", "location", "across", "all", "frames", ";", "color", "-", "ER", "movement", "between", "frames", ")", ".", "Bottom", "panels", ":", "overlays", "of", "twice", "eroded", "ER", "sheet", "masks", "(", "magenta", ")", "with", "mCherry", "-", "KDEL", "signal", "(", "green", ")", ".", "Masks", "were", "generated", "using", "ImageJ", "software", ".", "Zoom", "-", "ins", "show", "select", "PN", "and", "PP", "regions", ".", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "I", ".", "CLIMP63", "abundance", "as", "a", "function", "of", "RNF26", ".", "Top", ":", "representative", "immunoblot", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "stained", "against", "endogenous", "CLIMP63", "and", "Vinculin", "(", "loading", "control", ")", ".", "Bottom", ":", "quantification", "of", "CLIMP63", "abundance", ",", "normalized", "to", "Vinculin", "and", "expressed", "relative", "to", "control", "(", "siC", "=", "1", ".", "0", ")", ",", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "report", "mean", "or", "median", "(", "red", "line", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "error", "bars", "reflecting", "+", "/", "-", "SD", ")", "J", ",", "K", ".", "Effect", "of", "RNF26", "depletion", "on", "basal", "ER", "stress", "using", "IRE1", "-", "mediated", "XBP1", "splicing", "as", "a", "readout", ".", "J", ".", "Relative", "abundance", "of", "RNF26", "transcript", "normalized", "to", "GAPDH", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "All", "transcripts", "were", "detected", "by", "qPCR", ".", "Plots", "report", "values", "relative", "to", "control", "(", "siC", "=", "1", ".", "0", ")", ".", "K", ".", "Quantification", "of", "IRE1", "-", "dependent", "XBP1", "splicing", ".", "XBP", "-", "s", "and", "XBP1", "transcripts", "isolated", "from", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "were", "detected", "by", "qPCR", ",", "normalized", "to", "GAPDH", ",", "and", "expressed", "as", "ratio", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "report", "mean", "or", "median", "(", "red", "line", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "J", "and", "K", "with", "error", "bars", "reflecting", "+", "/", "-", "SD", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Analysis of ER architecture and dynamics as a function of RNF26 in U2OS cells ectopically expressing mCherry-KDEL and transfected with either control siRNA (siC) or siRNAs targeting RNF26 (siRNF26-1 or siRNF26-2). B. Time-lapse imaging. Top panels: representative confocal fluorescence images of Cherry-KDEL (white) at the start of time-lapse t=0 (top). Middle panels: time color coded overlays of 60x1s frames, each assigned a different color LUT (white - same ER location across all frames; color - ER movement between frames). Bottom panels: overlays of twice eroded ER sheet masks (magenta) with mCherry-KDEL signal (green). Masks were generated using ImageJ software. Zoom-ins show select PN and PP regions. Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively.I. CLIMP63 abundance as a function of RNF26. Top: representative immunoblot of U2OS cells transfected with the indicated siRNAs stained against endogenous CLIMP63 and Vinculin (loading control). Bottom: quantification of CLIMP63 abundance, normalized to Vinculin and expressed relative to control (siC=1.0), n=4 independent experiments. Data information: Graphs report mean or median (red line) of sample values (open circles). Significance was assessed using Student's t-test with error bars reflecting +/- SD)J, K. Effect of RNF26 depletion on basal ER stress using IRE1-mediated XBP1 splicing as a readout. J. Relative abundance of RNF26 transcript normalized to GAPDH; n=3 independent experiments. All transcripts were detected by qPCR. Plots report values relative to control (siC=1.0). K. Quantification of IRE1-dependent XBP1 splicing. XBP-s and XBP1 transcripts isolated from U2OS cells transfected with the indicated siRNAs were detected by qPCR, normalized to GAPDH, and expressed as ratio, n=3 independent experiments. Data information: Graphs report mean or median (red line) of sample values (open circles). Significance was assessed using Student's t-test J and K with error bars reflecting +/- SD) p<0.05; *** p<0.001, ns: not significant."}
{"words": ["Figure", "2C", ",", "D", ".", "Proximity", "biotinylation", "of", "endogenous", "vimentin", "by", "2HA", "-", "TurboID", "-", "RNF26", ",", "catalytically", "inactive", "point", "mutant", "(", "I382R", ")", ",", "or", "RING", "domain", "truncation", "mutant", "(", "∆", "RING", ")", "in", "HeLa", "cells", "following", "30", "min", "incubation", "with", "biotin", "prior", "to", "lysis", ".", "C", ".", "Representative", "immunoblots", "of", "neutravidin", "precipitates", "and", "lysate", "inputs", "stained", "against", "HA", "and", "vimentin", ".", "D", ".", "Quantifications", "of", "vimentin", "biotinylation", "by", "2HA", "-", "TurboID", "-", "RNF26", "and", "mutants", "normalized", "to", "auto", "biotinylated", "HA", "-", "tagged", "RNF26", "species", "and", "expressed", "relative", "to", "RNF26", "WT", ",", "n", "=", "6", "independent", "experiments", "performed", "in", "U2OS", "and", "HeLa", "cells", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "cell", "lysate", ".", "Graphs", "in", "D", "report", "mean", "(", "red", "line", ")", "and", "SEM", "(", "error", "bars", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "E", ".", "In", "vitro", "co", "-", "precipitation", "of", "purified", "recombinant", "Rhodamine", "-", "labeled", "RING", "-", "I382R", "(", "304", "-", "433", ")", "with", "purified", "recombinant", "His", "-", "tagged", "vimentin", "on", "Ni", "-", "NTA", "beads", ".", "Rhodamine", "in", "-", "gel", "fluorescent", "scan", "and", "immunoblot", "against", "vimentin", "are", "shown", ",", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "G", ".", "Proximity", "-", "based", "biotinylation", "of", "endogenous", "vimentin", "by", "2HA", "-", "TurboID", "-", "I382R", ",", "-", "∆", "RING", ",", "and", "-", "I382R", "-", "∆", "C", "lacking", "amino", "acids", "423", "-", "433", ".", "Immunoblots", "of", "neutravidin", "precipitates", "and", "lysate", "inputs", "against", "HA", "and", "vimentin", "are", "shown", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "cell", "lysate", ".", "H", ".", "In", "vitro", "peptide", "binding", "assay", ".", "Rhodamine", "-", "linked", "C", "-", "terminal", "peptide", "of", "RNF26", "(", "Rho", "-", "RGILQTLNVYL", ")", "or", "free", "Rhodamine", "were", "incubated", "at", "10nM", "with", "increasing", "concentrations", "of", "His", "-", "vimentin", "and", "binding", "was", "measured", "using", "fluorescence", "polarization", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", "H", "report", "mean", "(", "red", "line", ")", "and", "SEM", "(", "error", "bars", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C, D. Proximity biotinylation of endogenous vimentin by 2HA-TurboID-RNF26, catalytically inactive point mutant (I382R), or RING domain truncation mutant (∆RING) in HeLa cells following 30 min incubation with biotin prior to lysis. C. Representative immunoblots of neutravidin precipitates and lysate inputs stained against HA and vimentin. D. Quantifications of vimentin biotinylation by 2HA-TurboID-RNF26 and mutants normalized to auto biotinylated HA-tagged RNF26 species and expressed relative to RNF26 WT, n=6 independent experiments performed in U2OS and HeLa cells. Data information: WCL: whole cell lysate. Graphs in D report mean (red line) and SEM (error bars) of sample values (open circles). Significance was assessed using Student's t-test; * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.E. In vitro co-precipitation of purified recombinant Rhodamine-labeled RING-I382R (304-433) with purified recombinant His-tagged vimentin on Ni-NTA beads. Rhodamine in-gel fluorescent scan and immunoblot against vimentin are shown, representative of three independent experiments.G. Proximity-based biotinylation of endogenous vimentin by 2HA-TurboID-I382R, -∆RING, and -I382R-∆C lacking amino acids 423-433. Immunoblots of neutravidin precipitates and lysate inputs against HA and vimentin are shown and are representative of three independent experiments. Data information: WCL: whole cell lysate.H. In vitro peptide binding assay. Rhodamine-linked C-terminal peptide of RNF26 (Rho-RGILQTLNVYL) or free Rhodamine were incubated at 10nM with increasing concentrations of His-vimentin and binding was measured using fluorescence polarization; n=3 independent experiments. Data information H report mean (red line) and SEM (error bars) of sample values (open circles). Significance was assessed using Student's t-test; * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "E", ".", "Analysis", "of", "RNF26", "sequence", "determinants", "with", "respect", "to", "the", "intracellular", "distribution", "of", "RNF26", "and", "its", "colocalization", "with", "vimentin", "filaments", ".", "A", ".", "Representative", "confocal", "fluorescence", "images", "of", "U2OS", "cells", "ectopically", "expressing", "RFP", "-", "RNF26", "(", "green", ")", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutants", "(", "I382R", ",", "∆", "RING", ",", "∆", "C", ")", ",", "fixed", "and", "immunostained", "against", "endogenous", "vimentin", "(", "magenta", ")", "and", "VAP", "-", "A", "(", "magenta", ")", ".", "Indicated", "single", "channels", "and", "their", "corresponding", "color", "overlays", "are", "shown", ".", "Zoom", "-", "ins", "highlight", "PN", "regions", ".", "B", ".", "Colocalization", "(", "Manders", "'", ")", "analysis", "of", "RFP", "-", "RNF26", "and", "mutants", "overlap", "with", "vimentin", ".", "Plot", "reports", "n", "WT", "=", "38", ",", "n", "I382R", "=", "31", ",", "n", "ΔRING", "=", "34", ",", "n", "ΔC", "=", "22", "cells", "analysed", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Colocalization", "(", "Manders", "'", ")", "analysis", "of", "RFP", "-", "RNF26", "and", "mutants", "with", "VAP", "-", "A", ".", "Plot", "reports", "n", "WT", "=", "29", ",", "n", "I382R", "=", "21", ",", "n", "ΔRING", "=", "17", ",", "n", "ΔC", "=", "16", "cells", "analysed", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "Perinuclearity", "of", "RFP", "-", "RNF26", "as", "a", "function", "of", "its", "RING", "domain", "determinants", ".", "Plot", "reports", "n", "WT", "=", "72", ",", "n", "I382R", "=", "48", ",", "n", "ΔRING", "=", "37", ",", "n", "ΔC", "=", "28", "cells", "analysed", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "E", ".", "Intracellular", "distribution", "of", "vimentin", "as", "a", "function", "of", "RNF26", "(", "mutant", ")", "overexpression", ".", "Plot", "reports", "n", "WT59", ",", "n", "I382R", "=", "58", ",", "n", "ΔRING", "=", "36", ",", "n", "ΔC", "=", "32", "technical", "replicates", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Values", "capped", "at", "10", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Students", "'", "T", "-", "test", "(", "B", ",", "D", "error", "bars", "indicate", "mean", "-", "/", "+", "SD", ")", "or", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "C", ",", "E", "error", "bars", "indicate", "median", "and", "95", "%", "confidence", "interval", ")", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "not", "significant", ".", "F", ",", "G", ".", "Analysis", "of", "vimentin", "cytoskeleton", "distribution", "as", "a", "function", "of", "RNF26", ".", "F", ".", "Representative", "confocal", "fluorescence", "images", "of", "control", "cells", ",", "cells", "silenced", "for", "RNF26", "(", "si", "#", "1", ")", ",", "or", "RNF26", "KO", "cells", ".", "Zoom", "-", "ins", "highlight", "PN", "regions", ".", "G", ".", "Perinuclearity", "of", "vimentin", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "RNF26", ".", "Plot", "reports", "n", "control", "=", "98", ",", "n", "siRNF26", "=", "132", ",", "n", "RNF26", "KO", "=", "41", "technical", "replicates", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Students", "'", "T", "-", "test", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "error", "bars", "indicate", "median", "and", "95", "%", "confidence", "interval", ")", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "not", "significant", ".", "H", ".", "Vimentin", "abundance", "as", "a", "function", "of", "RNF26", ".", "Top", ":", "representative", "immunoblot", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "siRNF26", "#", "1", "stained", "against", "endogenous", "vimentin", "and", "Vinculin", "(", "loading", "control", ")", ".", "Bottom", ":", "quantification", "of", "vimentin", "abundance", ",", "normalized", "to", "Vinculin", "and", "expressed", "relative", "to", "control", "(", "siC", "=", "1", ".", "0", ")", ",", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Students", "'", "T", "-", "test", "error", "bars", "indicate", "mean", "-", "/", "+", "SD", ")", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-E. Analysis of RNF26 sequence determinants with respect to the intracellular distribution of RNF26 and its colocalization with vimentin filaments. A. Representative confocal fluorescence images of U2OS cells ectopically expressing RFP-RNF26 (green) wild-type (WT) or mutants (I382R, ∆RING, ∆C), fixed and immunostained against endogenous vimentin (magenta) and VAP-A (magenta). Indicated single channels and their corresponding color overlays are shown. Zoom-ins highlight PN regions. B. Colocalization (Manders') analysis of RFP-RNF26 and mutants overlap with vimentin. Plot reports n WT=38, n I382R=31, n ΔRING=34, n ΔC=22 cells analysed from three independent experiments. C. Colocalization (Manders') analysis of RFP-RNF26 and mutants with VAP-A. Plot reports n WT=29, n I382R=21, n ΔRING=17, n ΔC=16 cells analysed from three independent experiments. D. Perinuclearity of RFP-RNF26 as a function of its RING domain determinants. Plot reports n WT=72, n I382R=48, n ΔRING=37, n ΔC=28 cells analysed from three independent experiments. E. Intracellular distribution of vimentin as a function of RNF26 (mutant) overexpression. Plot reports n WT59, n I382R=58, n ΔRING=36, n ΔC=32 technical replicates from three independent experiments. Values capped at 10. Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively. Scale bar = 10µm. Statistical analyses were performed using Students' T-test (B, D error bars indicate mean -/+ SD) or Mann-Whitney U test (C, E error bars indicate median and 95% confidence interval); *** p<0.001, ns: not significant.F, G. Analysis of vimentin cytoskeleton distribution as a function of RNF26. F. Representative confocal fluorescence images of control cells, cells silenced for RNF26 (si#1), or RNF26 KO cells. Zoom-ins highlight PN regions. G. Perinuclearity of vimentin in the presence or absence of RNF26. Plot reports n control=98, n siRNF26=132, n RNF26 KO=41 technical replicates from three independent experiments. Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively. Scale bar = 10µm. Statistical analyses were performed using Students' T-test Mann-Whitney U test error bars indicate median and 95% confidence interval); *** p<0.001, ns: not significant.H. Vimentin abundance as a function of RNF26. Top: representative immunoblot of U2OS cells transfected with siRNF26#1 stained against endogenous vimentin and Vinculin (loading control). Bottom: quantification of vimentin abundance, normalized to Vinculin and expressed relative to control (siC=1.0), n=4 independent experiments. Statistical analyses were performed using Students' T-test error bars indicate mean -/+ SD) ; *** p<0.001, ns: not significant."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "D", ".", "Effect", "of", "vimentin", "ablation", "on", "intracellular", "distribution", "of", "RNF26", ".", "A", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "parental", "and", "vimentin", "knockout", "(", "Vim", "KO", ")", "U2OS", "cells", "ectopically", "expressing", "GFP", "-", "RNF26", "(", "green", ")", ",", "fixed", "and", "immunostained", "against", "endogenous", "VAP", "-", "A", "(", "magenta", ")", ".", "B", ".", "Validation", "of", "vimentin", "knockout", ".", "Immunoblots", "against", "endogenous", "vimentin", "and", "Vinculin", "(", "loading", "control", ")", "of", "a", "Vim", "KO", "clonal", "cell", "line", "and", "their", "parental", "U2OS", "cells", "are", "shown", ",", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Molecular", "weight", "markers", "are", "as", "indicated", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "GFP", "-", "RNF26", "signal", "distribution", "expressed", "as", "perinuclearity", "ratio", ".", "Graph", "reports", "n", "Parental", "=", "73", ",", "n", "Vim", "KO", "=", "43", "technical", "replicates", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "Colocalization", "(", "Manders", "'", ")", "analysis", "of", "VAP", "-", "A", "overlapping", "with", "GFP", "-", "RNF26", "(", "left", "plot", ")", "and", "vice", "versa", "(", "right", "plot", ")", ".", "Plots", "report", "on", "subset", "of", "cells", "from", "data", "set", "in", "(", "B", ")", ",", "same", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "Zoom", "-", "ins", "designate", "regions", "encompassing", "perinuclear", "and", "peripheral", "areas", ".", "All", "scale", "bars", "=", "10µm", ".", "Graphs", "report", "mean", "(", "red", "line", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Students", "'", "T", "-", "test", "(", "D", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "C", "error", "bars", "indicate", "median", "and", "95", "%", "confidence", "interval", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "E", ",", "F", ".", "Effect", "of", "vimentin", "or", "RNF26", "ablation", "on", "the", "intracellular", "distribution", "of", "endolysosomes", ".", "E", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "parental", ",", "RNF26", "KO", ",", "vimentin", "KO", "#", "1", "U2OS", "cells", ",", "vimentin", "KO", "#", "1", "cells", "ectopically", "complemented", "with", "untagged", "wild", "type", "vimentin", "(", "Vim", "KO", "+", "Rescue", ")", ",", "fixed", "and", "immunostained", "against", "endogenous", "LAMP1", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "LAMP1", "signal", "distribution", "expressed", "as", "perinuclearity", "ratio", ".", "Graph", "reports", "on", "n", "Parental", "=", "145", ",", "n", "R26", "KO", "=", "64", ",", "n", "Vim", "KO", "#", "1", "=", "119", ",", "n", "Vim", "KO", "#", "1", "/", "Rescue", "=", "32", "technical", "replicates", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Values", "capped", "at", "6", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "Zoom", "-", "ins", "designate", "regions", "encompassing", "perinuclear", "and", "peripheral", "areas", ".", "All", "scale", "bars", "=", "10µm", ".", "Graphs", "report", "mean", "(", "red", "line", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "F", "error", "bars", "indicate", "median", "and", "95", "%", "confidence", "interval", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "G", ",", "H", ".", "Effects", "of", "vimentin", "ablation", "on", "trafficking", "of", "extracellular", "materials", "to", "lysosomes", ".", "G", ".", "Time", "-", "lapse", "imaging", ".", "Representative", "confocal", "overlays", "of", "parental", "and", "vimentin", "KO", "#", "2", "U2OS", "cells", ",", "stained", "with", "SiR", "-", "Lysosome", "(", "magenta", ")", "to", "mark", "late", "endocytic", "compartments", "and", "incubated", "with", "the", "cell", "impermeable", "dye", "SR101", "(", "green", ")", ",", "taken", "soon", "after", "the", "start", "(", "t", "=", "5", "min", ")", "and", "at", "the", "end", "(", "t", "=", "120", "min", ")", "of", "time", "-", "lapse", "are", "shown", ".", "Zoom", "-", "ins", "highlight", "select", "PN", "regions", "in", "overlay", "and", "single", "channels", ".", "H", ".", "Colocalization", "(", "Manders", "'", ")", "of", "SiR", "-", "Lysosome", "overlapping", "SR101", "at", "t", "=", "120", "minutes", "following", "SR101", "addition", ".", "Graph", "reports", "on", "n", "Parental", "=", "71", ",", "n", "Vim", "KO", "=", "69", "technical", "replicates", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "Zoom", "-", "ins", "designate", "regions", "encompassing", "perinuclear", "and", "peripheral", "areas", ".", "All", "scale", "bars", "=", "10µm", ".", "Graphs", "report", "mean", "(", "red", "line", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Students", "'", "T", "-", "test", "H", "error", "bars", "indicate", "mean", "-", "/", "+", "SD", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-D. Effect of vimentin ablation on intracellular distribution of RNF26. A. Representative confocal images of parental and vimentin knockout (Vim KO) U2OS cells ectopically expressing GFP-RNF26 (green), fixed and immunostained against endogenous VAP-A (magenta). B. Validation of vimentin knockout. Immunoblots against endogenous vimentin and Vinculin (loading control) of a Vim KO clonal cell line and their parental U2OS cells are shown, representative of three independent experiments. Molecular weight markers are as indicated. C. Quantification of GFP-RNF26 signal distribution expressed as perinuclearity ratio. Graph reports n Parental = 73, n Vim KO = 43 technical replicates from three independent experiments. D. Colocalization (Manders') analysis of VAP-A overlapping with GFP-RNF26 (left plot) and vice versa (right plot). Plots report on subset of cells from data set in (B), same as in (C). Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively. Zoom-ins designate regions encompassing perinuclear and peripheral areas. All scale bars = 10µm. Graphs report mean (red line) of sample values (open circles). Statistical analyses were performed using Students' T-test (D Mann-Whitney U test (C error bars indicate median and 95% confidence interval); * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.E, F. Effect of vimentin or RNF26 ablation on the intracellular distribution of endolysosomes. E. Representative confocal images of parental, RNF26 KO, vimentin KO #1 U2OS cells, vimentin KO#1 cells ectopically complemented with untagged wild type vimentin (Vim KO + Rescue), fixed and immunostained against endogenous LAMP1. F. Quantification of LAMP1 signal distribution expressed as perinuclearity ratio. Graph reports on n Parental = 145, n R26 KO = 64, n Vim KO#1 = 119, n Vim KO#1/Rescue= 32 technical replicates from three independent experiments.Values capped at 6. Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively. Zoom-ins designate regions encompassing perinuclear and peripheral areas. All scale bars = 10µm. Graphs report mean (red line) of sample values (open circles). Mann-Whitney U test F error bars indicate median and 95% confidence interval); * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.G, H. Effects of vimentin ablation on trafficking of extracellular materials to lysosomes. G. Time-lapse imaging. Representative confocal overlays of parental and vimentin KO#2 U2OS cells, stained with SiR-Lysosome (magenta) to mark late endocytic compartments and incubated with the cell impermeable dye SR101 (green), taken soon after the start (t=5 min) and at the end (t=120 min) of time-lapse are shown. Zoom-ins highlight select PN regions in overlay and single channels. H. Colocalization (Manders') of SiR-Lysosome overlapping SR101 at t=120 minutes following SR101 addition. Graph reports on n Parental = 71, n Vim KO = 69 technical replicates from 3 independent experiments. Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively. Zoom-ins designate regions encompassing perinuclear and peripheral areas. All scale bars = 10µm. Graphs report mean (red line) of sample values (open circles). Statistical analyses were performed using Students' T-test H error bars indicate mean -/+ SD) ; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001."}
{"words": ["Figure", "5Effect", "of", "vimentin", "ablation", "on", "ER", "organization", "and", "dynamics", ".", "Analysis", "of", "parental", "versus", "vimentin", "KO", "#", "1", "U2OS", "cells", "ectopically", "expressing", "mCherry", "-", "KDEL", ".", "D", ".", "Time", "-", "lapse", "imaging", ".", "Left", "panels", ":", "representative", "confocal", "fluorescence", "images", "of", "Cherry", "-", "KDEL", "(", "white", ")", "at", "the", "start", "of", "time", "-", "lapse", "t", "=", "0", "(", "top", ")", ".", "Middle", "panels", ":", "time", "color", "coded", "(", "TCC", ")", "overlays", "of", "60x1s", "frames", ".", "Right", "panels", ":", "overlays", "of", "twice", "eroded", "ER", "sheet", "masks", "(", "magenta", ")", "with", "mCherry", "-", "KDEL", "signal", "(", "green", ")", ".", "Masks", "were", "generated", "using", "ImageJ", "software", ".", "Zoom", "-", "ins", "show", "select", "PN", "and", "PP", "regions", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Effect of vimentin ablation on ER organization and dynamics. Analysis of parental versus vimentin KO#1 U2OS cells ectopically expressing mCherry-KDEL. D. Time-lapse imaging. Left panels: representative confocal fluorescence images of Cherry-KDEL (white) at the start of time-lapse t=0 (top). Middle panels: time color coded (TCC) overlays of 60x1s frames. Right panels: overlays of twice eroded ER sheet masks (magenta) with mCherry-KDEL signal (green). Masks were generated using ImageJ software. Zoom-ins show select PN and PP regions. Scale bar = 10µm."}
{"words": ["Figure", "6D", ",", "Consequences", "of", "RNF26", ",", "UBE2J1", ",", "and", "vimentin", "loss", "on", "ERQC", "formation", ".", "D", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "fixed", "U2OS", "cells", "transfected", "or", "genetically", "modified", "as", "indicated", ",", "treated", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "presence", "(", "+", ")", "of", "tunicamycin", "(", "5ug", "/", "mL", ",", "O", "/", "N", ")", ",", "fixed", "and", "immunostained", "against", "endogenous", "calnexin", "(", "white", ")", ".", "F", ",", "G", ".", "Consequences", "of", "RNF26", ",", "UBE2J1", ",", "and", "vimentin", "loss", "on", "induction", "of", "PERK", "-", "mediated", "UPR", "signaling", "by", "tunicamycin", ".", "F", ".", "U2OS", "cells", ",", "transfected", "or", "genetically", "modified", "as", "indicated", ",", "were", "treated", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "presence", "(", "+", ")", "of", "tunicamycin", "(", "2", ".", "5µg", "/", "mL", ",", "5hrs", ")", ".", "Immunoblots", "of", "whole", "cell", "lysates", "against", "endogenous", "PERK", ",", "phospho", "-", "eIF2a", ",", "ATF4", ",", "HERP1", ",", "and", "Vinculin", "(", "loading", "control", ")", "are", "shown", ",", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "G", ".", "CHOP", "transcripts", "isolated", "from", "U2OS", "cells", "transfected", "or", "genetically", "modified", "as", "indicated", "and", "treated", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "presence", "(", "+", ")", "of", "tunicamycin", "(", "2", ".", "5ug", "/", "mL", ",", "O", "/", "N", ")", "were", "detected", "by", "qPCR", "and", "normalized", "to", "GAPDH", ";", "n", "siC", "(", "-", ")", "=", "4", ",", "n", "siC", "(", "+", ")", "=", "4", ",", "n", "siRNF26", "#", "1", "(", "+", ")", "=", "3", ",", "n", "siRNF26", "#", "2", "(", "+", ")", "=", "4", ",", "n", "PARENTAL", "(", "+", ")", "=", "4", ",", "n", "Vim", "KO", "(", "+", ")", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "report", "mean", "or", "median", "(", "red", "line", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Students", "'", "T", "-", "test", "G", "error", "bars", "indicate", "mean", "-", "/", "+", "SEM", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D, Consequences of RNF26, UBE2J1, and vimentin loss on ERQC formation. D. Representative confocal images of fixed U2OS cells transfected or genetically modified as indicated, treated in the absence (-) or presence (+) of tunicamycin (5ug/mL, O/N), fixed and immunostained against endogenous calnexin (white).F, G. Consequences of RNF26, UBE2J1, and vimentin loss on induction of PERK-mediated UPR signaling by tunicamycin. F. U2OS cells, transfected or genetically modified as indicated, were treated in the absence (-) or presence (+) of tunicamycin (2.5µg/mL, 5hrs). Immunoblots of whole cell lysates against endogenous PERK, phospho-eIF2a, ATF4, HERP1, and Vinculin (loading control) are shown, representative of three independent experiments. G. CHOP transcripts isolated from U2OS cells transfected or genetically modified as indicated and treated in the absence (-) or presence (+) of tunicamycin (2.5ug/mL, O/N) were detected by qPCR and normalized to GAPDH; n siC (-)=4, n siC (+)=4, n siRNF26#1 (+)=3, n siRNF26#2 (+)=4, n PARENTAL (+)=4, n Vim KO (+)=4 independent experiments. Data information: Graphs report mean or median (red line) of sample values (open circles). Statistical analyses were performed using Students' T-test G error bars indicate mean -/+ SEM) p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "Analysis", "of", "localization", "of", "RNF26", "sequence", "variants", "and", "HERP1", "or", "HERP2", "in", "the", "ER", ".", "A", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "RNF26", "WT", ",", "RFP", "-", "RNF26", "I382R", ",", "GFP", "-", "RNF26", "ΔRING", "and", "HERP1", "or", "GFP", "-", "RNF26", "WT", "with", "HA", "-", "HERP2", "that", "were", "stained", "for", "HA", "and", "endogenous", "VAP", "-", "A", ".", "Indicated", "single", "channels", "and", "their", "corresponding", "color", "overlays", "are", "shown", ".", "Zoom", "-", "ins", "highlight", "PN", "regions", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ".", "C", ".", "Analysis", "of", "determinants", "for", "RNF26", "complex", "formation", "with", "ERQC", "proteins", "HERP1", "and", "HRD1", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "RFP", "-", "RNF26", "variants", "(", "WT", ",", "I382R", ",", "ΔRING", ")", "or", "EV", "with", "either", "HA", "-", "HERP1", "or", "HA", "-", "HRD1", "before", "lysis", "in", "1", "%", "DMNG", "detergent", ",", "pulldown", "with", "RFP", "-", "TRAP", "beads", "and", "analysis", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "WB", ".", "Representative", "images", "of", "three", "independent", "replicates", ".", "D", ",", "E", ".", "Analysis", "of", "localization", "of", "ERQC", "domains", "with", "vimentin", ".", "D", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "HERP1", "that", "were", "stained", "for", "endogenous", "vimentin", ".", "Indicated", "single", "channels", "and", "their", "corresponding", "color", "overlays", "are", "shown", ".", "Zoom", "-", "ins", "highlight", "PN", "regions", "where", "vimentin", "surrounds", "HERP1", "-", "labeled", "ERQC", "domains", ".", "E", ".", "Line", "graph", "analysis", "of", "HA", "-", "HERP1", "(", "magenta", ")", "and", "vimentin", "(", "green", ")", "signals", "from", "E", "(", "bottom", "zoom", "image", ")", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ".", "F", ",", "G", ".", "Analysis", "of", "HERP1", "-", "induced", "ERQC", "domain", "localization", "as", "a", "function", "of", "vimentin", "and", "RNF26", ".", "F", ".", "Representative", "confocal", "fluorescence", "images", "of", "control", "cells", ",", "RNF26", "KO", "cells", ",", "or", "vimentin", "KO", "#", "2", "cells", ",", "transfected", "with", "HA", "-", "HERP1", "and", "immunostained", "for", "HA", ".", "Zoom", "-", "ins", "highlight", "PN", "regions", ".", "G", ".", "Perinuclearity", "analysis", "of", "HA", "-", "HERP1", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "RNF26", "or", "vimentin", ".", "Plot", "reports", "median", "(", "red", "line", ")", "and", "95", "%", "confidence", "interval", "(", "error", "bar", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circle", ")", ",", "n", "Parental", "=", "79", ",", "n", "R26", "KO", "=", "51", ",", "n", "Vim", "KO", "=", "45", "technical", "replicates", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Graphs", "report", "median", "(", "red", "line", ")", "and", "95", "%", "confidence", "interval", "(", "error", "bars", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, Analysis of localization of RNF26 sequence variants and HERP1 or HERP2 in the ER. A. Representative confocal images of U2OS cells transfected with GFP-RNF26 WT, RFP-RNF26 I382R, GFP-RNF26 ΔRING and HERP1 or GFP-RNF26 WT with HA-HERP2 that were stained for HA and endogenous VAP-A. Indicated single channels and their corresponding color overlays are shown. Zoom-ins highlight PN regions. Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively. Scale bar = 10µm.C. Analysis of determinants for RNF26 complex formation with ERQC proteins HERP1 and HRD1. U2OS cells were transfected with RFP-RNF26 variants (WT, I382R, ΔRING) or EV with either HA-HERP1 or HA-HRD1 before lysis in 1% DMNG detergent, pulldown with RFP-TRAP beads and analysis by SDS-PAGE and WB. Representative images of three independent replicates.D, E. Analysis of localization of ERQC domains with vimentin. D. Representative confocal images of U2OS cells transfected with HA-HERP1 that were stained for endogenous vimentin. Indicated single channels and their corresponding color overlays are shown. Zoom-ins highlight PN regions where vimentin surrounds HERP1-labeled ERQC domains. E. Line graph analysis of HA-HERP1 (magenta) and vimentin (green) signals from E (bottom zoom image). Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively. Scale bar = 10µm.F, G. Analysis of HERP1-induced ERQC domain localization as a function of vimentin and RNF26. F. Representative confocal fluorescence images of control cells, RNF26 KO cells, or vimentin KO#2 cells, transfected with HA-HERP1 and immunostained for HA. Zoom-ins highlight PN regions. G. Perinuclearity analysis of HA-HERP1 in the presence or absence of RNF26 or vimentin. Plot reports median (red line) and 95% confidence interval (error bar) of sample values (open circle), n Parental=79, n R26 KO=51, n Vim KO=45 technical replicates from three independent experiments (Mann-Whitney U test; ** p<0.01, *** p<0.001). Graphs report median (red line) and 95% confidence interval (error bars) of sample values (open circles). Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively. Scale bar = 10µm."}
{"words": ["Figure", "8C", ",", "D", ".", "Lysosomal", "processing", "of", "Sec62", "-", "HALO", "-", "GFP", "over", "time", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "RNF26", "or", "vimentin", ".", "C", ".", "Parental", ",", "Vim", "KO", "#", "2", "or", "RNF26", "KO", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "Sec62", "-", "HALO", "-", "GFP", "overnight", ",", "incubated", "with", "6", "-", "chlorohexanol", "for", "15", "minutes", ",", "washed", "3", "times", "with", "PBS", ",", "pulsed", "with", "TAMRA", "HALOtag", "ligand", "(", "200nM", ")", "for", "1hr", ",", "and", "incubated", "with", "6", "-", "chlorohexanol", "with", "or", "without", "Bafilomycin", "A1", "(", "100nM", ")", "for", "the", "indicated", "times", "before", "cell", "lysis", "and", "analysis", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Shown", "is", "a", "representative", "in", "-", "gel", "fluorescence", "scan", "with", "indication", "of", "full", "-", "length", "Sec62", ",", "protease", "-", "resistant", "HALO", "fragment", "and", "molecular", "weight", "markers", "(", "MW", ")", ",", "as", "well", "as", "a", "Vinculin", "blot", "(", "loading", "control", ")", "D", ".", "Quantification", "of", "Sec62", "accumulation", "in", "LEs", "from", "(", "B", ")", ".", "Unprocessed", "and", "protease", "-", "resistant", "(", "lysosomal", ")", "band", "intensities", "in", "(", "B", ")", "were", "calculated", "with", "ImageJ", "and", "ratios", "of", "lysosomal", "Sec62", "versus", "unprocessed", "Sec62", "were", "normalized", "to", "transfer", "in", "parental", "cells", "after", "10", "hours", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "n", "Parental", "=", "6", ",", "n", "R26", "KO", "=", "4", ",", "n", "Vim", "KO", "=", "6", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ".", "Graphs", "report", "mean", "(", "in", "D", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Students", "'", "T", "-", "test", "(", "D", "(", "paired", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "E", ",", "F", ".", "Sec62", "-", "mediated", "transfer", "of", "ER", "to", "lysosomes", "as", "a", "function", "of", "RNF26", "or", "vimentin", ".", "E", ".", "Representative", "Airyscan", "images", "of", "Parental", ",", "RNF26", "KO", "or", "Vim", "KO", "#", "2", "U2OS", "cells", "that", "were", "transfected", "with", "Sec62", "-", "HALO", "-", "GFP", ",", "incubated", "with", "6", "-", "chlorohexanol", "for", "15", "minutes", ",", "washed", "3", "times", "with", "PBS", ",", "pulsed", "with", "JF646", "HALOtag", "ligand", "for", "1hr", ",", "and", "incubated", "with", "6", "-", "chlorohexanol", "and", "Bafilomycin", "A1", "for", "8hrs", "before", "fixation", "and", "immunostaining", "for", "CD63", "to", "visualize", "LEs", ".", "F", ".", "Colocalization", "(", "Manders", "'", ")", "analysis", "of", "CD63", "over", "HALO", "signals", "from", "(", "D", ")", ".", "Plot", "reports", "n", "Parental", "=", "106", ",", "n", "R26", "KO", "=", "69", ",", "n", "Vim", "KO", "=", "68", "technical", "replicates", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ".", "Graphs", "report", "mean", "(", "in", "F", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Students", "'", "T", "-", "test", "F", "(", "unpaired", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "G", ",", "H", ".", "Sec62", "-", "mediated", "transfer", "of", "ER", "to", "lysosomes", "as", "a", "function", "of", "RNF26", "overexpression", "and", "activity", ".", "G", ".", "Representative", "spinning", "disc", "live", "cell", "images", "of", "RNF26", "WT", "and", "I382R", "inactive", "mutant", "with", "Sec62", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "overnight", "with", "Sec62", "-", "HALO", "-", "GFP", "and", "RFP", "-", "RNF26", "WT", "or", "I382R", ",", "incubated", "for", "5hrs", "with", "JF646", "and", "imaged", "by", "spinning", "disc", "microscopy", ".", "Images", "show", "overlay", "of", "GFP", "(", "green", ")", ",", "JF646", "(", "magenta", ")", "and", "RFP", "signals", ",", "zoom", "-", "ins", "of", "overlay", "and", "single", "channels", "that", "show", "transfer", "of", "RNF26", "into", "LEs", "(", "WT", "RNF26", ")", ".", "H", ".", "Analysis", "of", "Sec62", "transfer", "to", "proteolytic", "compartments", "as", "a", "function", "of", "RNF26", "WT", "or", "I382R", "overexpression", ".", "Number", "of", "GFP", "-", "negative", "/", "HALO", "-", "positive", "signals", "was", "manually", "counted", "from", "cells", "in", "(", "B", ")", "and", "(", "G", ")", ".", "Plot", "reports", "n", "EV", "=", "86", ",", "n", "R26", "WT", "=", "35", ",", "n", "R26", "IR", "=", "40", "technical", "replicates", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Cell", "and", "nuclear", "boundaries", "are", "demarcated", "using", "dashed", "and", "continuous", "lines", ",", "median", "(", "in", "H", ")", "of", "sample", "values", "(", "open", "circles", ")", ".", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "H", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8C, D. Lysosomal processing of Sec62-HALO-GFP over time in the presence or absence of RNF26 or vimentin. C. Parental, Vim KO#2 or RNF26 KO U2OS cells were transfected with Sec62-HALO-GFP overnight, incubated with 6-chlorohexanol for 15 minutes, washed 3 times with PBS, pulsed with TAMRA HALOtag ligand (200nM) for 1hr, and incubated with 6-chlorohexanol with or without Bafilomycin A1 (100nM) for the indicated times before cell lysis and analysis by SDS-PAGE. Shown is a representative in-gel fluorescence scan with indication of full-length Sec62, protease-resistant HALO fragment and molecular weight markers (MW), as well as a Vinculin blot (loading control) D. Quantification of Sec62 accumulation in LEs from (B). Unprocessed and protease-resistant (lysosomal) band intensities in (B) were calculated with ImageJ and ratios of lysosomal Sec62 versus unprocessed Sec62 were normalized to transfer in parental cells after 10 hours. Error bars show mean +/- SD of n Parental=6, n R26 KO=4, n Vim KO =6 independent experiments. Scale bar = 10µm. Graphs report mean (in D of sample values (open circles). Statistical analyses were performed using Students' T-test (D (paired) ; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).E, F. Sec62-mediated transfer of ER to lysosomes as a function of RNF26 or vimentin. E. Representative Airyscan images of Parental, RNF26 KO or Vim KO#2 U2OS cells that were transfected with Sec62-HALO-GFP, incubated with 6-chlorohexanol for 15 minutes, washed 3 times with PBS, pulsed with JF646 HALOtag ligand for 1hr, and incubated with 6-chlorohexanol and Bafilomycin A1 for 8hrs before fixation and immunostaining for CD63 to visualize LEs. F. Colocalization (Manders') analysis of CD63 over HALO signals from (D). Plot reports n Parental=106, n R26 KO=69, n Vim KO =68 technical replicates from three independent experiments. Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, respectively. Scale bar = 10µm. Graphs report mean (in F) of sample values (open circles). Statistical analyses were performed using Students' T-test F (unpaired) ; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).G, H. Sec62-mediated transfer of ER to lysosomes as a function of RNF26 overexpression and activity. G. Representative spinning disc live cell images of RNF26 WT and I382R inactive mutant with Sec62. U2OS cells were transfected overnight with Sec62-HALO-GFP and RFP-RNF26 WT or I382R, incubated for 5hrs with JF646 and imaged by spinning disc microscopy. Images show overlay of GFP (green), JF646 (magenta) and RFP signals, zoom-ins of overlay and single channels that show transfer of RNF26 into LEs (WT RNF26). H. Analysis of Sec62 transfer to proteolytic compartments as a function of RNF26 WT or I382R overexpression. Number of GFP-negative/HALO-positive signals was manually counted from cells in (B) and (G). Plot reports n EV=86, n R26 WT=35, n R26 IR =40 technical replicates from three independent experiments. Data information: Cell and nuclear boundaries are demarcated using dashed and continuous lines, median (in H) of sample values (open circles). Mann-Whitney U test (H); * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Coomassie", "stained", "SDS", "-", "PAGE", "showing", "purified", "T", ".", "thermophila", "tubulin", ".", "(", "B", ")", "A", "representative", "cryo", "-", "electron", "micrograph", "of", "paclitaxel", "-", "stabilized", "T", ".", "thermophila", "MTs", ".", "(", "C", ")", "Kymographs", "obtained", "by", "TIRF", "microscopy", "showing", "the", "dynamics", "of", "T", ".", "thermophila", "MTs", "at", "the", "indicated", "concentrations", "in", "µM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Coomassie stained SDS-PAGE showing purified T. thermophila tubulin.(B) A representative cryo-electron micrograph of paclitaxel-stabilized T. thermophila MTs.(C) Kymographs obtained by TIRF microscopy showing the dynamics of T. thermophila MTs at the indicated concentrations in µM."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "Plot", "showing", "the", "time", "course", "of", "T", ".", "thermophila", "cell", "growth", "in", "the", "presence", "of", "CA4", "(", "20µM", ")", "or", "parabulin", "(", "50µM", ";", "error", "bars", "corresponding", "to", "the", "standard", "deviation", "of", "triplicate", "biological", "measurements", ")", ".", "Control", "experiments", "are", "done", "with", "DMSO", "alone", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) Plot showing the time course of T. thermophila cell growth in the presence of CA4 (20µM) or parabulin (50µM; error bars corresponding to the standard deviation of triplicate biological measurements). Control experiments are done with DMSO alone."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Plot", "showing", "quantification", "of", "the", "T", ".", "thermophila", "MT", "growth", "events", "in", "TIRF", "microscopy", "MT", "dynamics", "reconstitution", "assays", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "drugs", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "+", "/", "-", "95", "%", "CI", ".", "For", "each", "concentration", ",", "data", "is", "obtained", "from", "at", "least", "2", "independent", "experiments", ".", "For", "growth", "rates", "and", "growth", "lengths", ",", "n", "=", "41", "(", "DMSO", ")", ",", "n", "=", "4", "(", "0", ".", "04uM", "parabulin", ")", ",", "n", "=", "34", "(", "0", ".", "04", "uM", "colchicine", ")", ".", "Rates", "were", "compared", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ";", "DMSO", "vs", "parabulin", "P", "<", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ";", "DMSO", "vs", "colchicine", "p", "=", "0", ".", "40", "(", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ")", ".", "(", "B", ")", "T", ".", "thermophila", "MT", "growth", "rates", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "drugs", "(", "40", "μM", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "+", "/", "-", "95", "%", "CI", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Rates", "were", "compared", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ";", "DMSO", "vs", "parabulin", "P", "=", "0", ".", "25", ";", "DMSO", "vs", "colchicine", "P", "=", "0", ".", "20", "(", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "kymographs", "obtained", "by", "TIRF", "microscopy", "showing", "the", "effect", "of", "parabulin", "and", "colchicine", "on", "dynamic", "Tt", "-", "MTs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Plot showing quantification of the T. thermophila MT growth events in TIRF microscopy MT dynamics reconstitution assays in the presence of the indicated drugs. Error bars represent the mean +/- 95% CI. For each concentration, data is obtained from at least 2 independent experiments. For growth rates and growth lengths, n=41(DMSO), n= 4 (0.04uM parabulin), n= 34 (0.04 uM colchicine). Rates were compared using one-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test; DMSO vs parabulin P<0001 (****); DMSO vs colchicine p = 0.40 (n.s., not significant). (B) T. thermophila MT growth rates in the presence of the indicated drugs (40 μM). Error bars represent the mean +/- 95% CI (n=4). Rates were compared using one-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test; DMSO vs parabulin P = 0.25; DMSO vs colchicine P = 0.20 (n.s., not significant).(D) Representative kymographs obtained by TIRF microscopy showing the effect of parabulin and colchicine on dynamic Tt-MTs."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Evaluation", "of", "vertebrate", "cell", "toxicity", "using", "the", "MTT", "assay", "which", "detects", "metabolic", "activity", "proportionate", "to", "the", "number", "of", "viable", "cells", "in", "a", "sample", ".", "The", "absorbance", "measurements", "for", "all", "treatment", "conditions", "were", "normalized", "to", "the", "null", "control", "value", "which", "is", "set", "to", "100", "%", "growth", ".", "Sub", "-", "confluent", "human", "fibroblasts", "were", "used", "to", "visualize", "potential", "compound", "effects", "during", "proliferation", ".", "The", "results", "represent", "the", "average", "of", "9", "readings", "(", "3", "biological", "replicates", "with", "3", "technical", "replicates", "of", "each", "treatment", ")", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", ".", "(", "B", ")", "Replication", "of", "GFP", "-", "expressing", "T", ".", "gondii", "tachyzoites", "in", "individual", "intracellular", "vacuoles", "can", "be", "followed", "by", "live", "cell", "imaging", ".", "Since", "vacuoles", "containing", "more", "than", "eight", "tachyzoites", "are", "not", "always", "easy", "to", "score", ",", "we", "tallied", "vacuoles", "above", "eight", "as", "being", "8", "+", "in", "size", ".", "At", "36", "hours", ",", "both", "null", "and", "vehicle", "control", "samples", "show", "most", "vacuoles", "harbor", "eight", "or", "more", "tachyzoites", "(", "three", "or", "more", "doublings", ")", ".", "Vacuoles", "in", "parabulin", "-", "treated", "cultures", "contain", "significantly", "fewer", "parasites", ",", "indicating", "that", "replication", "is", "slowed", ".", "The", "graph", "shows", "three", "biological", "replicates", "with", "values", "normalized", "to", "100", "%", "for", "each", "condition", "and", "each", "replicate", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", "between", "experiments", ".", "(", "C", ")", "The", "parabulin", "EC50", "value", "for", "T", ".", "gondii", "growth", "was", "determined", "using", "a", "plaque", "assay", "to", "measure", "a", "reduction", "in", "plaque", "area", "relative", "to", "control", "conditions", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", ".", "The", "results", "represent", "the", "average", "of", "18", "readings", "(", "6", "biological", "replicates", "with", "3", "technical", "replicates", "of", "each", "treatment", ")", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", ".", "(", "D", ")", "Phase", "contrast", "of", "extracellular", "parasite", "cultures", ".", "Serial", "passage", "of", "T", ".", "gondii", "in", "40", "-", "80", "μM", "parabulin", "induces", "accumulation", "of", "aberrant", "tachyzoite", "forms", ".", "These", "arise", "with", "MT", "defects", "that", "disconnect", "coordinated", "nuclear", "division", "and", "daughter", "cell", "budding", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Evaluation of vertebrate cell toxicity using the MTT assay which detects metabolic activity proportionate to the number of viable cells in a sample. The absorbance measurements for all treatment conditions were normalized to the null control value which is set to 100% growth. Sub-confluent human fibroblasts were used to visualize potential compound effects during proliferation. The results represent the average of 9 readings (3 biological replicates with 3 technical replicates of each treatment) ± standard error of the mean.(B) Replication of GFP-expressing T. gondii tachyzoites in individual intracellular vacuoles can be followed by live cell imaging. Since vacuoles containing more than eight tachyzoites are not always easy to score, we tallied vacuoles above eight as being 8+ in size. At 36 hours, both null and vehicle control samples show most vacuoles harbor eight or more tachyzoites (three or more doublings). Vacuoles in parabulin-treated cultures contain significantly fewer parasites, indicating that replication is slowed. The graph shows three biological replicates with values normalized to 100% for each condition and each replicate, error bars represent standard error of the mean between experiments.(C) The parabulin EC50 value for T. gondii growth was determined using a plaque assay to measure a reduction in plaque area relative to control conditions. Error bars represent standard error of the mean. The results represent the average of 18 readings (6 biological replicates with 3 technical replicates of each treatment) ± standard error of the mean.(D) Phase contrast of extracellular parasite cultures. Serial passage of T. gondii in 40-80 μM parabulin induces accumulation of aberrant tachyzoite forms. These arise with MT defects that disconnect coordinated nuclear division and daughter cell budding."}
{"words": ["Figure", "1A", "Cell", "viability", "as", "assessed", "by", "GFP", "expression", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "pRetroX", "TETOne3G", "-", "eGFP", "plasmid", "only", "(", "vector", ")", "or", "pRetroX", "TETOne3G", "-", "eGFP", "harbouring", "the", "N", "-", "terminal", "fragment", "of", "GSDMD", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "doxycycline", "24", "h", "post", "transfection", "and", "the", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "was", "determined", "16", "h", "later", "by", "flow", "cytometry", ".", "B", "LDH", "release", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "pRetroX", "TETOne3G", "-", "eGFP", "plasmid", "only", "(", "vector", ")", "or", "pRetroX", "TETOne3G", "-", "eGFP", "harbouring", "the", "N", "-", "terminal", "fragment", "of", "GSDMD", ".", "At", "24", "h", "post", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "doxycycline", "for", "8", "h", "and", "the", "percentage", "of", "LDH", "release", "was", "determined", ".", "Graphs", "show", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "quadruplicate", "wells", ".", "C", "-", "D", ".", "PI", "staining", "of", "and", "LDH", "release", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "pRetroX", "TETOne3G", "-", "eGFP", "harbouring", "the", "N", "-", "terminal", "fragment", "of", "GSDMD", "in", "the", "presence", "of", "osmoprotectants", ".", "At", "24", "h", "post", "transfection", ",", "PEGs", "of", "the", "indicated", "molecular", "weights", "were", "added", "to", "a", "final", "concentration", "of", "30", "mM", ",", "cells", "were", "treated", "with", "250", "ng", "/", "ml", "doxycycline", "for", "8", "h", "and", "the", "level", "of", "PI", "staining", "(", "C", ")", "or", "LDH", "release", "(", "D", ")", "was", "determined", ".", "E", "-", "F", ".", "PI", "staining", "of", "and", "LDH", "release", "from", "LPS", "-", "primed", "primary", "BMDMs", "infected", "with", "log", "-", "phase", "S", ".", "typhimurium", "for", "the", "indicated", "timepoints", "in", "the", "presence", "of", "PEGs", "of", "the", "indicated", "molecular", "weight", "(", "numbers", "on", "the", "X", "-", "axis", ",", "30", "mM", "final", "concentration", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "as", "determined", "by", "student", "'", "s", "t", "test", ".", "Graphs", "show", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "quadruplicate", "wells", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "expeirments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Cell viability as assessed by GFP expression in HEK293T cells transfected with the pRetroX TETOne3G-eGFP plasmid only (vector) or pRetroX TETOne3G-eGFP harbouring the N-terminal fragment of GSDMD. Cells were treated with the indicated concentrations of doxycycline 24 h post transfection and the percentage of GFP-positive cells was determined 16 h later by flow cytometry.B LDH release from HEK293T cells transfected with the pRetroX TETOne3G-eGFP plasmid only (vector) or pRetroX TETOne3G-eGFP harbouring the N-terminal fragment of GSDMD. At 24 h post transfection, cells were treated with the indicated concentrations of doxycycline for 8 h and the percentage of LDH release was determined. Graphs show mean and s.d. of quadruplicate wells.C-D. PI staining of and LDH release from HEK293T cells transfected pRetroX TETOne3G-eGFP harbouring the N-terminal fragment of GSDMD in the presence of osmoprotectants. At 24 h post transfection, PEGs of the indicated molecular weights were added to a final concentration of 30 mM, cells were treated with 250 ng/ml doxycycline for 8 h and the level of PI staining (C) or LDH release (D) was determined.E-F. PI staining of and LDH release from LPS-primed primary BMDMs infected with log-phase S. typhimurium for the indicated timepoints in the presence of PEGs of the indicated molecular weight (numbers on the X-axis, 30 mM final concentration).* p<0.05 as determined by student's t test. Graphs show mean and s.d. of quadruplicate wells. Data are representative of at least three independent expeirments."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "cleaved", "GSDMD", "in", "culture", "supernatants", "and", "full", "length", "GSDMD", ",", "cleaved", "GSDMD", "and", "α", "-", "tubulin", "in", "the", "cell", "lysates", "of", "immortalized", "LPS", "-", "primed", "WT", "macrophages", "left", "uninfected", "(", "NS", ")", "or", "infected", "for", "10", "-", "40", "minutes", "with", "log", "phase", "S", ".", "typhimurium", "(", "MOI", "=", "50", ")", ".", "C", ".", "Fractionation", "and", "immunoblot", "analysis", "for", "GSDMD", ",", "Na", "+", "K", "+", "ATPase", ",", "VDAC", "(", "Voltage", "-", "dependent", "anion", "channel", ")", ",", "HDAC1", "(", "Histone", "deacetylase", "1", ")", "and", "GAPDH", "(", "Glycerinaldehyd", "-", "3", "-", "phosphat", "-", "Dehydrogenase", ")", "of", "WT", "macrophages", "infected", "for", "10", "and", "20", "minutes", "with", "log", "phase", "S", ".", "typhimurium", "(", "MOI", "=", "50", ")", ".", "Fractionation", "was", "carried", "out", "as", "described", "in", "the", "Material", "and", "Methods", "section", "and", "equivalent", "amount", "of", "protein", "was", "loaded", "per", "lane", ".", "D", ".", "Extraction", "of", "cleaved", "GSDMD", "from", "isolated", "membranes", "of", "WT", "macrophages", "infected", "for", "10", "minutes", "with", "log", "phase", "S", ".", "typhimurium", "(", "MOI", "=", "50", ")", ".", "Extraction", "was", "carried", "in", "variable", "conditions", "as", "described", "in", "the", "Material", "and", "Methods", "section", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblot analysis of cleaved GSDMD in culture supernatants and full length GSDMD, cleaved GSDMD and α-tubulin in the cell lysates of immortalized LPS-primed WT macrophages left uninfected (NS) or infected for 10-40 minutes with log phase S. typhimurium (MOI=50).C. Fractionation and immunoblot analysis for GSDMD, Na+K+ ATPase, VDAC (Voltage-dependent anion channel), HDAC1 (Histone deacetylase 1) and GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase) of WT macrophages infected for 10 and 20 minutes with log phase S. typhimurium (MOI=50). Fractionation was carried out as described in the Material and Methods section and equivalent amount of protein was loaded per lane.D. Extraction of cleaved GSDMD from isolated membranes of WT macrophages infected for 10 minutes with log phase S. typhimurium (MOI=50). Extraction was carried in variable conditions as described in the Material and Methods section."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Human", "GSDMD", "at", "a", "concentration", "of", "2", "μM", "was", "incubated", "at", "room", "temperature", "with", "5", "nM", "caspase", "-", "1", ".", "The", "protein", "was", "cleaved", "in", "a", "time", "-", "dependent", "manner", "into", "two", "bands", "of", "31", "kDa", "(", "GSDMDNterm", ")", "and", "22", "kDa", "(", "GSDMDCterm", ")", ".", "B", ".", "Cross", "-", "linking", "experiment", "of", "full", "-", "length", "and", "cleaved", "GSDMD", ".", "GSDMD", "at", "a", "concentration", "of", "2", "μM", "was", "incubated", "at", "room", "temperature", "with", "5", "nM", "caspase", "-", "1", ".", "After", "enzymatic", "cleavage", ",", "GSDMDNterm", "is", "highly", "cross", "-", "linked", "by", "DSS", ",", "resulting", "in", "the", "gel", "-", "impenetrating", "species", "highlighted", "by", "the", "arrow", ".", "GSDMDCterm", "is", "not", "cross", "-", "linked", ".", "C", ".", "GSDMD", "at", "a", "concentration", "of", "1", "μM", "was", "incubated", "at", "room", "temperature", "with", "5", "nM", "caspase", "-", "1", "and", "liposomes", "composed", "of", "4", "mM", "DMPC", "or", "polar", "lipid", "extract", "derived", "from", "E", ".", "coli", ".", "After", "2", "h", ",", "the", "lipid", "fraction", "(", "L", ")", "was", "separated", "from", "the", "supernatant", "(", "S", ")", "by", "ultracentrifugation", "at", "4C", "for", "1", "h", "at", "120", ",", "000g", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Human GSDMD at a concentration of 2 μM was incubated at room temperature with 5 nM caspase-1. The protein was cleaved in a time-dependent manner into two bands of 31 kDa (GSDMDNterm) and 22 kDa (GSDMDCterm).B. Cross-linking experiment of full-length and cleaved GSDMD. GSDMD at a concentration of 2 μM was incubated at room temperature with 5 nM caspase-1. After enzymatic cleavage, GSDMDNterm is highly cross-linked by DSS, resulting in the gel-impenetrating species highlighted by the arrow. GSDMDCterm is not cross-linked.C. GSDMD at a concentration of 1 μM was incubated at room temperature with 5 nM caspase-1 and liposomes composed of 4 mM DMPC or polar lipid extract derived from E. coli. After 2 h, the lipid fraction (L) was separated from the supernatant (S) by ultracentrifugation at 4C for 1 h at 120,000g."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "I", ".", "Dye", "release", "time", "courses", "from", "liposomes", "as", "a", "percentage", "of", "maximal", "release", ".", "A", ".", "Five", "different", "reactions", ",", "where", "5", "nM", "caspase", "-", "1", "and", "400", "μM", "6", "-", "carboxifluorescein", "-", "loaded", "liposomes", "prepared", "with", "E", ".", "Coli", "polar", "lipid", "extract", "were", "incubated", "with", "GSDMD", "concentrations", "of", "(", "nM", ")", ":", "520", ",", "260", ",", "130", ",", "100", ",", "65", "(", "colored", "dark", "to", "light", "orange", ")", ".", "The", "time", "point", "of", "20", "min", "is", "highlighted", "by", "a", "vertical", "dashed", "line", ".", "A", "-", "I", ".", "Dye", "release", "time", "courses", "from", "liposomes", "as", "a", "percentage", "of", "maximal", "release", ".", "B", ".", "Five", "different", "reactions", ",", "where", "130", "nM", "of", "GSDMD", "and", "400μM", "6", "-", "carboxifluorescein", "-", "loaded", "liposomes", "prepared", "with", "E", ".", "Coli", "extract", "polar", "lipid", "were", "incubated", "with", "caspase", "-", "1", "concentration", "of", "(", "nM", ")", ":", "15", ",", "8", ",", "5", ",", "2", ".", "5", ",", "1", ".", "2", "(", "colored", "dark", "to", "light", "blue", ")", ".", "The", "time", "point", "of", "20", "min", "is", "highlighted", "by", "a", "vertical", "dashed", "line", ".", "A", "-", "I", ".", "Dye", "release", "time", "courses", "from", "liposomes", "as", "a", "percentage", "of", "maximal", "release", ".", "C", ".", "Three", "different", "reactions", ",", "where", "5", "nM", "caspase", "-", "1", "and", "400", "μM", "6", "-", "carboxifluorescein", "-", "loaded", "liposomes", "prepared", "with", "porcine", "brain", "total", "lipid", "extract", "were", "incubated", "with", "GSDMD", "concentrations", "of", "(", "nM", ")", ":", "520", ",", "260", ",", "100", "(", "colored", "dark", "to", "light", "green", ")", ".", "A", "-", "I", ".", "Dye", "release", "time", "courses", "from", "liposomes", "as", "a", "percentage", "of", "maximal", "release", ".", "D", ".", "Dye", "release", "at", "20", "minutes", "reaction", "as", "a", "function", "of", "GSDMD", "(", "dark", "orange", ")", "and", "caspase", "-", "1", "(", "dark", "blue", ")", "concentrations", ".", "Errors", "bars", "for", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "A", "-", "I", ".", "Dye", "release", "time", "courses", "from", "liposomes", "as", "a", "percentage", "of", "maximal", "release", ".", "E", ".", "Two", "different", "sets", "of", "reactions", ",", "where", "wild", "type", "GSDMD", "(", "dark", "to", "light", "orange", ")", "and", "the", "mutant", "GSDMDI104N", "(", "dark", "to", "light", "blue", ")", "were", "independently", "incubated", "at", "the", "concentrations", "of", "260", ",", "130", "and", "65", "nM", "with", "5", "nM", "caspase", "-", "1", "and", "400", "μM", "6", "-", "carboxifluorescein", "-", "loaded", "liposomes", ".", "The", "time", "point", "of", "60", "minutes", "is", "highlighted", "by", "a", "vertical", "dashed", "line", ".", "A", "-", "I", ".", "Dye", "release", "time", "courses", "from", "liposomes", "as", "a", "percentage", "of", "maximal", "release", ".", "F", ".", "Dye", "release", "at", "60", "minutes", "of", "reaction", "as", "a", "function", "of", "GSDMD", "wild", "type", "(", "dark", "orange", ")", "and", "GSDMDI104N", "(", "dark", "blue", ")", "concentration", ".", "Error", "bars", "for", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "A", "-", "I", ".", "Dye", "release", "time", "courses", "from", "liposomes", "as", "a", "percentage", "of", "maximal", "release", ".", "G", "-", "I", ".", "Dye", "release", "from", "400", "μM", "liposomes", "loaded", "with", "the", "6", "-", "carboxifluorescein", "-", "derivates", "FD", "-", "20", ",", "FD", "-", "40", "and", "FD", "-", "150", ",", "with", "variable", "Stokes", "diameters", ",", "as", "indicated", ".", "130", "nM", "of", "GSDMD", "and", "5", "nM", "caspase", "-", "1", "were", "incubated", "with", "the", "liposomes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-I. Dye release time courses from liposomes as a percentage of maximal release. A. Five different reactions, where 5 nM caspase-1 and 400 μM 6-carboxifluorescein-loaded liposomes prepared with E. Coli polar lipid extract were incubated with GSDMD concentrations of (nM): 520, 260, 130, 100, 65 (colored dark to light orange). The time point of 20 min is highlighted by a vertical dashed line.A-I. Dye release time courses from liposomes as a percentage of maximal release. B. Five different reactions, where 130 nM of GSDMD and 400μM 6-carboxifluorescein-loaded liposomes prepared with E. Coli extract polar lipid were incubated with caspase-1 concentration of (nM): 15, 8, 5, 2.5, 1.2 (colored dark to light blue). The time point of 20 min is highlighted by a vertical dashed line.A-I. Dye release time courses from liposomes as a percentage of maximal release. C. Three different reactions, where 5 nM caspase-1 and 400 μM 6-carboxifluorescein-loaded liposomes prepared with porcine brain total lipid extract were incubated with GSDMD concentrations of (nM): 520, 260,100 (colored dark to light green).A-I. Dye release time courses from liposomes as a percentage of maximal release. D. Dye release at 20 minutes reaction as a function of GSDMD (dark orange) and caspase-1 (dark blue) concentrations. Errors bars for three independent experiments are shown.A-I. Dye release time courses from liposomes as a percentage of maximal release. E. Two different sets of reactions, where wild type GSDMD (dark to light orange) and the mutant GSDMDI104N (dark to light blue) were independently incubated at the concentrations of 260, 130 and 65 nM with 5 nM caspase-1 and 400 μM 6-carboxifluorescein-loaded liposomes. The time point of 60 minutes is highlighted by a vertical dashed line.A-I. Dye release time courses from liposomes as a percentage of maximal release. F. Dye release at 60 minutes of reaction as a function of GSDMD wild type (dark orange) and GSDMDI104N (dark blue) concentration. Error bars for three independent experiments are shown.A-I. Dye release time courses from liposomes as a percentage of maximal release. G-I. Dye release from 400 μM liposomes loaded with the 6-carboxifluorescein-derivates FD-20, FD-40 and FD-150, with variable Stokes diameters, as indicated. 130 nM of GSDMD and 5 nM caspase-1 were incubated with the liposomes."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", ".", "Cryo", "-", "EM", "micrographs", "of", "GSDMDNterm", "pores", "in", "E", ".", "coli", "extract", "polar", "lipids", "liposomes", ".", "The", "micrographs", "were", "acquired", "at", "protein", "/", "lipid", "molar", "ratios", "of", "1", "/", "1000", ",", "1", "/", "500", "and", "1", "/", "100", ",", "respectively", ".", "Black", "arrows", "indicate", "ring", "-", "shaped", "structures", "corresponding", "to", "oligomeric", "GSDMDNterm", "pore", "forms", ".", "Scale", "bars", "=", "80", "nm", ".", "D", ".", "Proteoliposome", "with", "protein", "/", "lipid", "molar", "ratio", "of", "1", "/", "100", "at", "higher", "magnification", ".", "Scale", "bar", "=", "80", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C. Cryo-EM micrographs of GSDMDNterm pores in E. coli extract polar lipids liposomes. The micrographs were acquired at protein/lipid molar ratios of 1/1000, 1/500 and 1/100, respectively. Black arrows indicate ring-shaped structures corresponding to oligomeric GSDMDNterm pore forms. Scale bars = 80 nm.D. Proteoliposome with protein/lipid molar ratio of 1/100 at higher magnification. Scale bar = 80 nm."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "AFM", "topograph", "of", "GSDMDNterm", "bound", "to", "lipid", "membranes", "of", "E", ".", "coli", "extract", "polar", "lipids", ".", "Overview", "topograph", "showing", "arc", "-", ",", "slit", "-", "and", "ring", "-", "like", "GSDMD", "oligomers", ".", "B", "-", "E", ".", "High", "-", "resolution", "AFM", "topographs", "and", "height", "profiles", "of", "GSDMDNterm", "oligomers", "(", "red", "curves", ")", ".", "Height", "profiles", "were", "measured", "along", "the", "red", "lines", "in", "the", "topographs", ".", "Dashed", "zero", "lines", "(", "0", "nm", ")", "indicate", "the", "surface", "of", "the", "lipid", "membrane", ";", "heights", "of", "<", "−", "4", "nm", "indicate", "that", "the", "oligomers", "formed", "transmembrane", "pores", ".", "Topographs", "were", "taken", "in", "buffer", "solution", "(", "150", "NaCl", ",", "20", "mM", "Hepes", ",", "pH", "7", ".", "8", ")", "at", "room", "temperature", ".", "The", "experiment", "was", "reproduced", "at", "least", "three", "times", "using", "independent", "liposome", "and", "GSDMD", "preparations", ".", "F", "-", "H", ".", "Analysis", "of", "GSDMDNterm", "oligomers", "bound", "to", "lipid", "membranes", "of", "E", ".", "coli", "extract", "polar", "lipids", ".", "F", ".", "GSDMDNterm", "oligomers", "assembled", "into", "arcs", ",", "slits", "and", "rings", "leading", "to", "transmembrane", "(", "TM", ")", "pores", "or", "not", "transmembrane", "aggregate", "(", "n", "=", "218", ")", ".", "G", ".", "Height", "of", "GSDMDNterm", "oligomers", "protruding", "from", "the", "lipid", "membrane", ".", "Bars", "represent", "mean", "and", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "218", ")", ".", "H", ".", "Distribution", "of", "the", "diameters", "of", "rings", "formed", "by", "GSDMDNterm", "oligomers", ".", "The", "average", "distribution", "was", "21", ".", "2", "±", "5", ".", "6", "nm", "(", "n", "=", "164", ";", "average", "±", "s", ".", "d", ".", ")", "and", "the", "bin", "size", "was", "3", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. AFM topograph of GSDMDNterm bound to lipid membranes of E. coli extract polar lipids. Overview topograph showing arc-, slit- and ring-like GSDMD oligomers.B-E. High-resolution AFM topographs and height profiles of GSDMDNterm oligomers (red curves). Height profiles were measured along the red lines in the topographs. Dashed zero lines (0 nm) indicate the surface of the lipid membrane; heights of <−4 nm indicate that the oligomers formed transmembrane pores. Topographs were taken in buffer solution (150 NaCl, 20 mM Hepes, pH 7.8) at room temperature. The experiment was reproduced at least three times using independent liposome and GSDMD preparations.F-H. Analysis of GSDMDNterm oligomers bound to lipid membranes of E. coli extract polar lipids. F. GSDMDNterm oligomers assembled into arcs, slits and rings leading to transmembrane (TM) pores or not transmembrane aggregate (n = 218). G. Height of GSDMDNterm oligomers protruding from the lipid membrane. Bars represent mean and error bars represent s.e.m. (n = 218). H. Distribution of the diameters of rings formed by GSDMDNterm oligomers. The average distribution was 21.2 ± 5.6 nm (n = 164; average ± s.d.) and the bin size was 3 nm."}
{"words": ["Figure", "1Co", "-", "immunoprecipitation", "assays", "in", "HEK293T", "cells", "after", "co", "-", "transfection", "with", "Flag", "-", "TRIM27", "and", "the", "indicated", "combinations", "of", "empty", "HA", "-", "vector", ",", "HA", "-", "tagged", "FIP200", ",", "ULK1", ",", "or", "ATG13", "before", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "Immunoprecipitates", "(", "top", "panel", ")", "and", "input", "samples", "(", "bottom", "panel", ")", "were", "then", "subjected", "to", "Western", "blotting", "against", "anti", "-", "HA", "or", "Flag", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "C", "-", "F", ".", "WT", "(", "C", ")", ",", "FIP200", "knockout", "(", "KO", ")", "(", "D", ")", ",", "ULK1", "/", "2", "knockout", "(", "E", ")", "MEF", "cells", "or", "ATG13", "knockout", "4T1", "cells", "(", "F", ")", "were", "subjected", "to", "starvation", "conditions", "before", "immunoprecipitation", "against", "control", "Immunoglobulin", "G", "(", "IgG", ")", "or", "anti", "-", "TRIM27", "before", "blotting", "against", "the", "indicated", "endogenous", "forms", "of", "TRIM27", ",", "FIP200", ",", "ULK1", ",", "ATG13", ",", "and", "USP7", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "G", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "assays", "in", "HEK293T", "cells", "after", "co", "-", "transfection", "with", "Flag", "-", "TRIM27", "and", "either", "full", "length", "ULK", "(", "HA", "-", "ULK1", "1", "-", "1051", ")", "or", "the", "indicated", "various", "truncated", "forms", "of", "ULK1", "designated", "HA", "-", "ULK1", "1", "-", "828", ",", "HA", "-", "ULK1", "1", "-", "600", ",", "and", "HA", "-", "ULK1", "1", "-", "500", ";", "AA", ",", "amino", "acids", ".", "Data", "information", ":", ",", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "H", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "assays", "in", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "ULK1", "and", "immunoprecipitation", "against", "IgG", "or", "HA", "followed", "by", "Western", "blotting", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "Flag", "-", "TRIM27", "were", "starved", "as", "indicated", "or", "starved", "for", "2h", "before", "replenishing", "with", "complete", "medium", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "(", "top", "panel", ")", "and", "input", "samples", "(", "bottom", "panel", ")", "were", "then", "subjected", "to", "blotting", "against", "Flag", "and", "ULK1", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "Purified", "recombinant", "GST", "or", "GST", "-", "TRIM27", "was", "incubated", "with", "recombinant", "HA", "-", "ULK1", "and", "bound", "ULK1", "analyzed", "by", "Western", "blotting", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Co-immunoprecipitation assays in HEK293T cells after co-transfection with Flag-TRIM27 and the indicated combinations of empty HA-vector, HA-tagged FIP200, ULK1, or ATG13 before immunoprecipitation with anti-HA antibodies. Immunoprecipitates (top panel) and input samples (bottom panel) were then subjected to Western blotting against anti-HA or Flag. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.C-F. WT (C), FIP200 knockout (KO) (D), ULK1/2 knockout (E) MEF cells or ATG13 knockout 4T1 cells (F) were subjected to starvation conditions before immunoprecipitation against control Immunoglobulin G (IgG) or anti-TRIM27 before blotting against the indicated endogenous forms of TRIM27, FIP200, ULK1, ATG13, and USP7. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.G. Co-immunoprecipitation assays in HEK293T cells after co-transfection with Flag-TRIM27 and either full length ULK (HA-ULK1 1-1051) or the indicated various truncated forms of ULK1 designated HA-ULK1 1-828, HA-ULK1 1-600, and HA-ULK1 1-500; AA, amino acids. Data information: , the experiments were performed at least three times independently with similar results.H. Co-immunoprecipitation assays in HeLa cells stably expressing HA-ULK1 and immunoprecipitation against IgG or HA followed by Western blotting as indicated. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.HeLa cells stably expressing Flag-TRIM27 were starved as indicated or starved for 2h before replenishing with complete medium. Anti-Flag immunoprecipitates (top panel) and input samples (bottom panel) were then subjected to blotting against Flag and ULK1. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.Purified recombinant GST or GST-TRIM27 was incubated with recombinant HA-ULK1 and bound ULK1 analyzed by Western blotting. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results."}
{"words": ["Figure", "2Ubiquitination", "assays", "in", "HEK293T", "cells", "after", "co", "-", "transfection", "with", "HA", "-", "ULK1", "and", "His", "-", "Ub", "along", "with", "Flag", "-", "TRIM27", "(", "A", ")", "Samples", "recovered", "with", "Ni", "-", "NTA", "(", "top", "panel", ")", "and", "input", "samples", "(", "bottom", "panel", ")", "were", "then", "subjected", "to", "blotting", "against", "anti", "-", "HA", ",", "Flag", "or", "His", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", ",", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "Ubiquitination", "assays", "in", "HEK293T", "cells", "after", "knockdown", "of", "TRIM27", "using", "independent", "shRNAs", "(", "shTRIM27", "-", "1", "and", "-", "2", ")", "(", "B", ")", ".", "Samples", "recovered", "with", "Ni", "-", "NTA", "(", "top", "panel", ")", "and", "input", "samples", "(", "bottom", "panel", ")", "were", "then", "subjected", "to", "blotting", "against", "anti", "-", "HA", "or", "His", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", ",", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "C", ".", "In", "vitro", "ubiquitination", "assays", "performed", "with", "the", "indicated", "combinations", "of", "recombinant", "GST", ",", "GST", "-", "TRIM27", ",", "affinity", "-", "purified", "HA", "-", "ULK1", "and", "His", "-", "Ub", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "E1", ",", "E2", ",", "and", "ATP", ".", "The", "reactions", "were", "analyzed", "with", "anti", "-", "Ub", ",", "anti", "-", "HA", ",", "or", "anti", "-", "GST", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "ULK1", "levels", "in", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "control", "or", "TRIM27", "shRNAs", "(", "D", ")", "Data", "information", ":", ",", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "empty", "Flag", "vector", "(", "-", ")", "or", "Flag", "-", "TRIM27", "after", "treatment", "with", "or", "without", "10", "μM", "MG132", "for", "4", "hours", "(", "E", ")", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "F", ".", "Fluorescence", "microscopy", "image", "of", "MEFs", "with", "stable", "expression", "of", "mCherry", "-", "ULK1", "and", "GFP", "-", "TRIM27", "after", "treating", "cells", "with", "DMSO", "(", "MOCK", ")", "or", "10", "μM", "MG132", "for", "4", "hours", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "HA", "-", "ULK1", "levels", "in", "50", "μg", "/", "mL", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "-", "treated", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "co", "-", "expression", "of", "Flag", "-", "TRIM27", "(", "G", ",", "H", ")", "Western", "blots", "against", "HA", "-", "ULK1", "and", "actin", "control", "(", "G", ",", "were", "subjected", "to", "densitometric", "quantitation", "(", "H", ",", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "All", "the", "statistical", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "(", "H", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "endogenous", "ULK1", "levels", "(", "I", ",", "J", ")", "in", "50", "μg", "/", "mL", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "-", "treated", "HEK293T", "cells", "or", "without", "TRIM27", "RNAi", "(", "I", ",", "J", ")", ".", "and", "actin", "control", "I", ")", "were", "subjected", "to", "densitometric", "quantitation", "J", ")", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "All", "the", "statistical", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "J", ")", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Ubiquitination", "assays", "were", "performed", "in", "HEK293T", "cells", "after", "co", "-", "transfection", "with", "full", "length", "HA", "-", "ULK1", "or", "the", "indicated", "truncated", "constructs", "(", "K", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Flag", "-", "TRIM27", ".", "Data", "information", ":", ",", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "Ubiquitination", "assays", "were", "performed", "in", "HEK293T", "cells", "after", "co", "-", "transfection", "with", "double", "(", "K568", "/", "K571R", ")", "or", "single", "(", "K568R", ",", "K571R", ")", "lysine", "substitution", "mutants", "(", "L", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Flag", "-", "TRIM27", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "M", ".", "Ubiquitination", "of", "HA", "-", "ULK1", "in", "cells", "co", "-", "expressing", "Flag", "-", "TRIM27", "with", "either", "His", "-", "Ub", "WT", ",", "His", "-", "Ub", "K48", ",", "or", "His", "-", "Ub", "K63", ",", "respectively", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "N", ".", "In", "vitro", "ubiquitination", "assays", "against", "affinity", "-", "purified", "HA", "-", "ULK1", "WT", "or", "the", "HA", "-", "ULK1", "K568", "/", "K571R", "mutant", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "GST", "-", "TRIM27", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", ".", "O", ".", "ULK1", "/", "2", "knockout", "MEFs", "stably", "expressing", "the", "indicated", "HA", "-", "ULK1", "constructs", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "against", "HA", "or", "actin", "before", "(", "0h", ")", "and", "after", "treatment", "with", "CHX", "for", "12", "hours", ".", "Data", "information", ":", "the", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", "independently", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Ubiquitination assays in HEK293T cells after co-transfection with HA-ULK1 and His-Ub along with Flag-TRIM27 (A) Samples recovered with Ni-NTA (top panel) and input samples (bottom panel) were then subjected to blotting against anti-HA, Flag or His as indicated. Data information: , the experiments were performed at least three times independently with similar results.Ubiquitination assays in HEK293T cells after knockdown of TRIM27 using independent shRNAs (shTRIM27-1 and -2) (B). Samples recovered with Ni-NTA (top panel) and input samples (bottom panel) were then subjected to blotting against anti-HA or His as indicated. Data information: , the experiments were performed at least three times independently with similar results.C. In vitro ubiquitination assays performed with the indicated combinations of recombinant GST, GST-TRIM27, affinity-purified HA-ULK1 and His-Ub in the presence or absence of E1, E2, and ATP. The reactions were analyzed with anti-Ub, anti-HA, or anti-GST. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.Western blot analysis of ULK1 levels in HeLa cells stably expressing control or TRIM27 shRNAs (D) Data information: , the experiments were performed at least three times independently with similar results.Western blot analysis of HEK293T cells transfected with empty Flag vector (-) or Flag-TRIM27 after treatment with or without 10 μM MG132 for 4 hours (E). Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.F. Fluorescence microscopy image of MEFs with stable expression of mCherry-ULK1 and GFP-TRIM27 after treating cells with DMSO (MOCK) or 10 μM MG132 for 4 hours. Scale bar, 10 μm. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.HA-ULK1 levels in 50 μg/mL cycloheximide (CHX)-treated HEK293T cells with or without co-expression of Flag-TRIM27 (G, H) Western blots against HA-ULK1 and actin control (G, were subjected to densitometric quantitation (H, Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results. All the statistical data are presented as mean ± s.d. of three independent experiments. Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired Student's t-tests (H , **P < 0.01.endogenous ULK1 levels (I, J) in 50 μg/mL cycloheximide (CHX)-treated HEK293T cells or without TRIM27 RNAi (I, J). and actin control I) were subjected to densitometric quantitation J). Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results. All the statistical data are presented as mean ± s.d. of three independent experiments. Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired Student's t-tests J), **P < 0.01.Ubiquitination assays were performed in HEK293T cells after co-transfection with full length HA-ULK1 or the indicated truncated constructs (K) in the presence or absence of Flag-TRIM27. Data information: , the experiments were performed at least three times independently with similar results.Ubiquitination assays were performed in HEK293T cells after co-transfection with double (K568/K571R) or single (K568R, K571R) lysine substitution mutants (L) in the presence or absence of Flag-TRIM27. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.M. Ubiquitination of HA-ULK1 in cells co-expressing Flag-TRIM27 with either His-Ub WT, His-Ub K48, or His-Ub K63, respectively. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.N. In vitro ubiquitination assays against affinity-purified HA-ULK1 WT or the HA-ULK1 K568/K571R mutant in the presence or absence of GST-TRIM27. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results.O. ULK1/2 knockout MEFs stably expressing the indicated HA-ULK1 constructs were subjected to Western blot analysis against HA or actin before (0h) and after treatment with CHX for 12 hours. Data information: the experiments were performed at least three times independently with similar results."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "autophagy", "marker", "proteins", "(", "p62", "and", "Ser318", "phosphorylated", "ATG13", ")", "in", "WT", "HeLa", "cells", "and", "two", "independent", "TRIM27", "KO", "clones", ".", "ULK1", "and", "TRIM27", "levels", "were", "measured", ",", "along", "with", "actin", "as", "a", "loading", "control", ".", "B", ".", "TRIM27", "KO", "HeLa", "cells", "were", "reconstituted", "with", "Flag", "-", "TRIM27", "and", "Western", "blotting", "was", "performed", "as", "per", "(", "A", ")", ".", "C", ".", "LC3", "conversion", "was", "measured", "by", "Western", "blot", "in", "WT", "or", "TRIM27", "KO", "HeLa", "cells", "with", "or", "without", "pretreatment", "with", "200", "nM", "bafilomycin", "A1", "(", "BAF", "A1", ")", ".", "D", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "indicated", "proteins", "in", "MEFs", "generated", "from", "Trim27", "+", "/", "+", "or", "Trim27", "-", "/", "-", "mice", ".", "E", "-", "H", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "endogenous", "LC3", "in", "MEFs", "generated", "from", "Trim27", "+", "/", "+", "or", "Trim27", "-", "/", "-", "mice", "cultured", "in", "fed", "(", "E", ")", "or", "starved", "conditions", "(", "G", ")", ".", "Quantification", "of", "LC3B", "puncta", "Fed", "conditions", "(", "F", ")", ",", "starved", "conditions", "(", "H", ")", "(", "n", "=", "50", "cells", "per", "condition", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "in", "F", "and", "H", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "Data", "information", ":", "(", "F", ",", "H", ",", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "I", "-", "J", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "autophagy", "markers", "in", "the", "kidneys", "of", "three", "-", "month", "-", "old", "Trim27", "+", "/", "+", "and", "Trim27", "-", "/", "-", "mice", ".", "Each", "lane", "represents", "a", "different", "mouse", "(", "I", ")", ".", "Quantification", "of", "p62", ",", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "ratio", ",", "and", "LC3", "-", "II", "/", "actin", "ratio", "in", "I", "(", "J", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "three", "mice", "per", "genotype", ".", "Data", "information", ":", "J", ",", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "K", ".", "Microscopy", "analysis", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "in", "MEFs", "generated", "from", "indicated", "genotype", "mice", "in", "normal", "or", "starvation", "conditions", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "L", "-", "M", ".", "Quantitation", "of", "data", "presented", "in", "(", "K", ")", "shows", "mean", "number", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "per", "cell", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "50", "cells", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "L", "and", "M", ")", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Western blot analysis of autophagy marker proteins (p62 and Ser318 phosphorylated ATG13) in WT HeLa cells and two independent TRIM27 KO clones. ULK1 and TRIM27 levels were measured, along with actin as a loading control.B. TRIM27 KO HeLa cells were reconstituted with Flag-TRIM27 and Western blotting was performed as per (A).C. LC3 conversion was measured by Western blot in WT or TRIM27 KO HeLa cells with or without pretreatment with 200 nM bafilomycin A1 (BAF A1).D. Western blot analysis of indicated proteins in MEFs generated from Trim27 +/+ or Trim27 -/- mice.E-H. Immunofluorescence analysis of endogenous LC3 in MEFs generated from Trim27+/+ or Trim27-/- mice cultured in fed (E) or starved conditions (G). Quantification of LC3B puncta Fed conditions (F), starved conditions (H) (n = 50 cells per condition). Data are mean ± s.d. in F and H. Scale bar, 10 μm. Data information: (F, H, Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired Student's t-tests, *P< 0.05,***P<0.001.I-J. Western blot analysis of autophagy markers in the kidneys of three-month-old Trim27 +/+ and Trim27-/- mice. Each lane represents a different mouse (I). Quantification of p62, LC3-II/LC3-I ratio, and LC3-II/actin ratio in I (J). Data are mean ± s.e.m. for three mice per genotype. Data information: J, Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired Student's t-tests, *P< 0.05,***P<0.001.K. Microscopy analysis of GFP-LC3 puncta in MEFs generated from indicated genotype mice in normal or starvation conditions. Scale bar, 10 μm. L-M. Quantitation of data presented in (K) shows mean number of GFP-LC3 puncta per cell ± s.d. (n = 50 cells per condition). Data information: L and M) Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired Student's t-tests, *P< 0.05,***P<0.001."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "HA", "-", "ULK1", "in", "HeLa", "derivatives", "co", "-", "expressing", "His", "-", "Ub", "with", "or", "without", "TRIM27", "knockout", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "starvation", "for", "the", "indicated", "time", ".", "B", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "ULK1", "levels", "in", "HeLa", "cells", "with", "or", "without", "TRIM27", "knockout", ".", "The", "cells", "were", "treated", "with", "starvation", "for", "the", "indicated", "time", ".", "The", "lysates", "were", "analyzed", "using", "anti", "-", "ULK1", ",", "anti", "-", "TRIM27", ",", "or", "anti", "-", "Actin", ".", "C", ".", "HA", "-", "ULK1", ",", "HA", "-", "ULK1", "K568", "/", "K571R", "were", "stably", "expressed", "in", "ULK1", "knockout", "HeLa", "cells", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "starvation", ",", "the", "lysates", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "anti", "-", "HA", ",", "or", "anti", "-", "Actin", ".", "E", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "Flag", "-", "TRIM27", "with", "HA", "-", "ULK1", "in", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "STK38L", "knockdown", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "starvation", ".", "Flag", "-", "TRIM27", "was", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "Flag", ",", "the", "bound", "HA", "-", "ULK1", "was", "detected", "using", "anti", "-", "HA", ".", "F", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "endogenous", "TRIM27", "with", "endogenous", "STK38L", "in", "HeLa", "cells", ".", "G", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "Flag", "-", "STK38L", "with", "ULK1", ",", "or", "TRIM27", "in", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "starvation", "treatment", ".", "Flag", "-", "STK38L", "was", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "Flag", ",", "the", "immunoprecipitates", "and", "lysates", "were", "analyzed", "with", "anti", "-", "ULK1", ",", "anti", "-", "TRIM27", ".", "H", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "endogenous", "TRIM27", "with", "endogenous", "ULK1", "in", "HeLa", "cells", "with", "or", "without", "STK38L", "knockout", ".", "The", "cells", "were", "treated", "with", "starvation", "before", "lysis", ".", "I", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "ULK1", "levels", "in", "starved", "HeLa", "cells", "expressing", "either", "Myc", "-", "STK38L", ",", "or", "Flag", "-", "TRIM27", ",", "or", "both", ".", "The", "lysates", "were", "analyzed", "using", "anti", "-", "ULK1", ",", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "Myc", ",", "or", "anti", "-", "actin", ".", "J", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "HA", "-", "ULK1", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "Flag", "-", "TRIM27", "and", "His", "-", "Ub", ",", "or", "together", "with", "Myc", "-", "STK38L", ".", "K", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "ULK1", "levels", "in", "HeLa", "cells", "with", "or", "without", "STK38L", "knockout", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "starvation", "for", "the", "indicated", "time", ".", "L", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "p62", "or", "LC3", "levels", "in", "HeLa", "cells", "with", "or", "without", "STK38L", "knockout", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "starvation", "for", "the", "indicated", "time", ".", "Bafilomycin", "A1", "(", "BAF", "A1", ")", "was", "used", "to", "inhibit", "the", "fusion", "between", "autophagosomes", "and", "lysosomes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Ubiquitination analysis of HA-ULK1 in HeLa derivatives co-expressing His-Ub with or without TRIM27 knockout, the cells were treated with starvation for the indicated time.B. Western blot analysis of ULK1 levels in HeLa cells with or without TRIM27 knockout. The cells were treated with starvation for the indicated time. The lysates were analyzed using anti-ULK1, anti-TRIM27, or anti-Actin.C. HA-ULK1, HA-ULK1 K568/K571R were stably expressed in ULK1 knockout HeLa cells, the cells were treated with starvation, the lysates were analyzed by western blot using anti-HA, or anti-Actin.E. Co-immunoprecipitation of Flag-TRIM27 with HA-ULK1 in HEK293T cells with or without STK38L knockdown, the cells were treated with starvation. Flag-TRIM27 was immunoprecipitated using anti-Flag, the bound HA-ULK1 was detected using anti-HA.F. Co-immunoprecipitation of endogenous TRIM27 with endogenous STK38L in HeLa cells.G. Co-immunoprecipitation of Flag-STK38L with ULK1, or TRIM27 in HEK293T cells with or without starvation treatment. Flag-STK38L was immunoprecipitated using anti-Flag, the immunoprecipitates and lysates were analyzed with anti-ULK1, anti-TRIM27.H. Co-immunoprecipitation of endogenous TRIM27 with endogenous ULK1 in HeLa cells with or without STK38L knockout. The cells were treated with starvation before lysis.I. Western blot analysis of ULK1 levels in starved HeLa cells expressing either Myc-STK38L, or Flag-TRIM27, or both. The lysates were analyzed using anti-ULK1, anti-Flag, anti-Myc, or anti-actin.J. Ubiquitination analysis of HA-ULK1 in HEK293T cells co-expressing Flag-TRIM27 and His-Ub, or together with Myc-STK38L.K. Western blot analysis of ULK1 levels in HeLa cells with or without STK38L knockout, the cells were treated with starvation for the indicated time.L. Western blot analysis of p62 or LC3 levels in HeLa cells with or without STK38L knockout, the cells were treated with starvation for the indicated time. Bafilomycin A1 (BAF A1) was used to inhibit the fusion between autophagosomes and lysosomes."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "ULK1", "levels", "in", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "Flag", "-", "TRIM27", ",", "the", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "Myc", "-", "vector", ",", "Myc", "-", "STK38L", ",", "or", "Myc", "-", "STK38L", "-", "K119A", ".", "Then", "the", "cells", "were", "treated", "with", "starvation", "before", "lysis", ".", "B", ".", "Phosphorylation", "of", "HA", "-", "ULK1", "in", "HeLa", "STK38L", "knockout", "cells", "with", "or", "without", "expression", "of", "Flag", "-", "STK38L", ".", "HA", "-", "ULK1", "was", "immunoprecipitated", "and", "then", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "anti", "-", "phosphoserine", "or", "anti", "-", "phosphothreonine", ",", "and", "the", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "using", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "Myc", ".", "C", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "Flag", "-", "TRIM27", "with", "HA", "-", "ULK1", "or", "HA", "-", "ULK1", "-", "S495A", "in", "HEK293T", "cells", ".", "HA", "-", "ULK1", "or", "HA", "-", "ULK1", "S495A", "was", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "HA", ",", "the", "immunoprecipitates", "and", "lysates", "were", "analyzed", "with", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Flag", ".", "D", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "HA", "-", "ULK1", "WT", "or", "HA", "-", "ULK1", "S495A", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "Flag", "-", "TRIM27", "and", "His", "-", "Ub", ".", "E", ".", "Phosphorylation", "of", "HA", "-", "ULK1", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "Myc", "-", "STK38L", "with", "or", "without", "CIP", "treatment", ".", "HA", "-", "ULK1", "was", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HA", "and", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "a", "specific", "antibody", "against", "p", "-", "ULK1", "-", "S495", "(", "Ser495", ")", ".", "F", ".", "Phosphorylation", "of", "HA", "-", "ULK1", "or", "HA", "-", "ULK1", "S495A", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "Myc", "-", "STK38L", ".", "HA", "-", "ULK1", "or", "HA", "-", "ULK1", "S495A", "was", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HA", "and", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "a", "specific", "antibody", "against", "p", "-", "ULK1", "-", "S495", "(", "Ser495", ")", ".", "G", ".", "In", "vitro", "kinase", "assay", "using", "GST", "-", "STK38L", ",", "or", "GST", "-", "STK38L", "K119A", "(", "a", "kinase", "-", "inactive", "mutant", ")", "and", "HA", "-", "ULK1", "as", "substrate", ".", "GST", "-", "STK38L", "or", "GST", "-", "STK38L", "K119A", "was", "pulled", "down", "using", "glutathione", "Sepharose", "beads", ".", "HA", "-", "ULK1", "was", "immunoprecipitated", "from", "HEK293T", "using", "anti", "-", "HA", "and", "treated", "with", "lambda", "phosphatase", ",", "the", "reaction", "product", "was", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "p", "-", "ULK1", "-", "S495", "(", "Ser495", ")", ".", "H", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "Myc", "-", "STK38L", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "Flag", "-", "TRIM27", "and", "His", "-", "Ub", ".", "I", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "Flag", "-", "STK38L", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "His", "-", "Ub", "with", "or", "without", "TRIM27", "knockdown", ",", "cells", "were", "cultured", "in", "fed", "or", "starved", "conditions", "as", "indicated", ".", "J", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "Flag", "-", "STK38L", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "Myc", "-", "TRIM27", "with", "either", "His", "-", "Ub", "(", "wild", "-", "type", ")", "or", "His", "-", "Ub", "K6R", ".", "K", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "Myc", "-", "STK38L", "WT", ",", "Myc", "-", "STK38L", "-", "K432R", "+", "K434R", "or", "Myc", "-", "STK38L", "-", "K181R", "+", "K215R", "+", "K224R", "+", "K432R", "+", "K434R", "(", "Myc", "-", "STK38L", "-", "5KR", ")", "mutant", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "TRIM27", "and", "His", "-", "Ub", ".", "L", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "Myc", "-", "STK38L", "K1", "-", "38R", "mutant", "(", "All", "lysines", "were", "mutated", "to", "arginines", ")", ",", "or", "Myc", "-", "STK38L", "-", "R181", "/", "215", "/", "224", "/", "432", "/", "434K", "(", "All", "lysines", "were", "mutated", "to", "arginines", "except", "the", "indicated", "five", "lysine", "residues", ")", "mutant", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "TRIM27", "and", "His", "-", "Ub", ".", "M", ".", "Phosphorylation", "of", "HA", "-", "ULK1", "S495", "(", "Ser495", ")", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "Myc", "-", "STK38L", "WT", ",", "or", "Myc", "-", "STK38L", "-", "5KR", "mutant", "in", "K", ".", "The", "cells", "were", "cultured", "in", "fed", "or", "starved", "conditions", "as", "indicated", "and", "HA", "-", "ULK1", "was", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "HA", ",", "the", "immunoprecipitates", "and", "lysates", "were", "analyzed", "with", "a", "specific", "antibody", "against", "p", "-", "ULK1", "-", "S495", "(", "Ser495", ")", ",", "anti", "-", "Myc", ",", "anti", "-", "HA", ",", "or", "anti", "-", "actin", ".", "N", ".", "Phosphorylation", "of", "HA", "-", "ULK1", "in", "HeLa", "cells", "with", "or", "without", "TRIM27", "-", "knockout", ",", "cells", "were", "cultured", "in", "fed", "or", "starved", "conditions", "as", "indicated", ",", "HA", "-", "ULK1", "was", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "HA", ",", "the", "immunoprecipitates", "and", "lysates", "were", "analyzed", "with", "a", "specific", "antibody", "against", "p", "-", "ULK1", "-", "S495", "(", "Ser495", ")", ",", "anti", "-", "HA", ",", "or", "anti", "-", "actin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Western blot analysis of ULK1 levels in HeLa cells stably expressing Flag-TRIM27, the cells were transfected with either Myc-vector, Myc-STK38L, or Myc-STK38L-K119A. Then the cells were treated with starvation before lysis.B. Phosphorylation of HA-ULK1 in HeLa STK38L knockout cells with or without expression of Flag-STK38L. HA-ULK1 was immunoprecipitated and then analyzed by western blot using anti-phosphoserine or anti-phosphothreonine, and the cell lysates were analyzed using anti-HA and anti-Myc.C. Co-immunoprecipitation of Flag-TRIM27 with HA-ULK1 or HA-ULK1-S495A in HEK293T cells. HA-ULK1 or HA-ULK1 S495A was immunoprecipitated using anti-HA, the immunoprecipitates and lysates were analyzed with anti-HA or anti-Flag.D. Ubiquitination analysis of HA-ULK1 WT or HA-ULK1 S495A in HEK293T cells co-expressing Flag-TRIM27 and His-Ub.E. Phosphorylation of HA-ULK1 in HEK293T cells co-expressing Myc-STK38L with or without CIP treatment. HA-ULK1 was immunoprecipitated with anti-HA and analyzed by western blot using a specific antibody against p-ULK1-S495 (Ser495).F. Phosphorylation of HA-ULK1 or HA-ULK1 S495A in HEK293T cells co-expressing Myc-STK38L. HA-ULK1 or HA-ULK1 S495A was immunoprecipitated with anti-HA and analyzed by western blot using a specific antibody against p-ULK1-S495 (Ser495).G. In vitro kinase assay using GST-STK38L, or GST-STK38L K119A (a kinase-inactive mutant) and HA-ULK1 as substrate. GST-STK38L or GST-STK38L K119A was pulled down using glutathione Sepharose beads. HA-ULK1 was immunoprecipitated from HEK293T using anti-HA and treated with lambda phosphatase, the reaction product was analyzed by western blot using p-ULK1-S495 (Ser495).H. Ubiquitination analysis of Myc-STK38L in HEK293T cells co-expressing Flag-TRIM27 and His-Ub.I. Ubiquitination analysis of Flag-STK38L in HEK293T cells co-expressing His-Ub with or without TRIM27 knockdown, cells were cultured in fed or starved conditions as indicated.J. Ubiquitination analysis of Flag-STK38L in HEK293T cells co-expressing Myc-TRIM27 with either His-Ub (wild-type) or His-Ub K6R.K. Ubiquitination analysis of Myc-STK38L WT, Myc-STK38L-K432R+K434R or Myc-STK38L-K181R+K215R+K224R+K432R+K434R (Myc-STK38L-5KR) mutant in HEK293T cells co-expressing HA-TRIM27 and His-Ub.L. Ubiquitination analysis of Myc-STK38L K1-38R mutant (All lysines were mutated to arginines), or Myc-STK38L-R181/215/224/432/434K (All lysines were mutated to arginines except the indicated five lysine residues) mutant in HEK293T cells co-expressing HA-TRIM27 and His-Ub.M. Phosphorylation of HA-ULK1 S495(Ser495) in HEK293T cells co-expressing Myc-STK38L WT, or Myc-STK38L-5KR mutant in K. The cells were cultured in fed or starved conditions as indicated and HA-ULK1 was immunoprecipitated using anti-HA, the immunoprecipitates and lysates were analyzed with a specific antibody against p-ULK1-S495 (Ser495), anti-Myc, anti-HA, or anti-actin.N. Phosphorylation of HA-ULK1 in HeLa cells with or without TRIM27-knockout, cells were cultured in fed or starved conditions as indicated, HA-ULK1 was immunoprecipitated using anti-HA, the immunoprecipitates and lysates were analyzed with a specific antibody against p-ULK1-S495 (Ser495), anti-HA, or anti-actin."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Comparison", "of", "the", "relative", "mRNA", "levels", "of", "TRIM27", "in", "normal", "breast", "tissues", "(", "Normal", ",", "n", "=", "113", ")", "and", "indicated", "breast", "tumors", "(", "Basal", "，", "n", "=", "143", "；", "Her2", "，", "n", "=", "67", "；", "LumA", "，", "n", "=", "427", "；", "LumB", "，", "n", "=", "190", ")", "in", "the", "TCGA", "database", ".", "The", "number", "of", "biological", "replicates", "are", "shown", "as", "indicated", ".", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "B", ".", "Analysis", "of", "the", "correlation", "between", "ULK1", "and", "TRIM27", "expression", "in", "the", "CPTAC", "proteomics", "database", ".", "P", "=", "0", ".", "0027", "(", "Pearson", "'", "s", "correlation", "method", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "ULK1", "and", "TRIM27", "levels", "from", "tumor", "tissues", "(", "T", ")", ",", "Pericarcinomatous", "tissues", "(", "P", ")", ",", "and", "their", "matched", "surrounding", "normal", "tissues", "(", "N", ")", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "(", "C", ")", ".", "F", ".", "Representative", "tumors", "in", "MMTV", "-", "PyMT", "mice", "of", "the", "indicated", "Trim27", "genotypes", ".", "Scale", "bar", ",", "5mm", ".", "G", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "indicated", "proteins", "in", "Trim27", "-", "/", "-", "PyMT", "or", "Trim27", "+", "/", "-", "PyMT", "mice", "in", "primary", "breast", "tumors", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "H", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "tumor", "-", "free", "survival", "curves", "of", "Trim27", "+", "/", "-", "PyMT", "(", "median", "=", "75", "d", ",", "number", "=", "20", ")", ",", "or", "Trim27", "-", "/", "-", "PyMT", "mice", "(", "median", "=", "95", "d", ",", "number", "=", "16", ")", ".", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Mantel", "-", "Cox", "test", ")", ".", "Pulmonary", "surface", "nodules", "in", "Trim27", "+", "/", "-", "PyMT", "mice", "and", "Trim27", "-", "/", "-", "PyMT", "mice", "(", "I", "Scale", "bar", ",", "1mm", ".", "Pulmonary", "surface", "nodules", "and", "hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "staining", "in", "Trim27", "+", "/", "-", "PyMT", "mice", "and", "Trim27", "-", "/", "-", "PyMT", "mice", "J", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "1mm", ".", "(", "K", ")", ".", "Bar", "chart", "showing", "quantification", "for", "the", "number", "of", "metastatic", "nodules", "per", "lung", "lope", "(", "Trim27", "+", "/", "-", ",", "n", "=", "6", "mice", ";", "Trim27", "-", "/", "-", "n", "=", "6", "mice", ")", ",", "when", "compared", "at", "the", "same", "final", "timepoint", ".", "Each", "symbol", "represents", "a", "mouse", ";", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "from", "three", "independent", "experiments", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Comparison of the relative mRNA levels of TRIM27 in normal breast tissues (Normal, n=113) and indicated breast tumors (Basal，n=143；Her2，n=67；LumA，n=427；LumB，n=190) in the TCGA database. The number of biological replicates are shown as indicated. P < 0.0001 (one-way ANOVA).B. Analysis of the correlation between ULK1 and TRIM27 expression in the CPTAC proteomics database. P = 0.0027 (Pearson's correlation method).Western blot analysis of ULK1 and TRIM27 levels from tumor tissues (T), Pericarcinomatous tissues (P), and their matched surrounding normal tissues (N). GAPDH was used as a loading control (C).F. Representative tumors in MMTV-PyMT mice of the indicated Trim27 genotypes. Scale bar, 5mm.G. Western blot analysis of indicated proteins in Trim27-/- PyMT or Trim27+/- PyMT mice in primary breast tumors. Actin was used as a loading control.H. Kaplan-Meier tumor-free survival curves of Trim27+/- PyMT (median = 75 d, number = 20), or Trim27 -/- PyMT mice (median = 95 d, number = 16). P < 0.0001 (Mantel-Cox test).Pulmonary surface nodules in Trim27+/- PyMT mice and Trim27-/- PyMT mice (I Scale bar, 1mm.Pulmonary surface nodules and hematoxylin and eosin (H&E) staining in Trim27+/- PyMT mice and Trim27-/- PyMT mice J). Scale bar, 1mm. (K). Bar chart showing quantification for the number of metastatic nodules per lung lope (Trim27+/-, n=6 mice; Trim27-/- n=6 mice), when compared at the same final timepoint. Each symbol represents a mouse; Data are presented as mean ± s.d. from three independent experiments; ***P<0.001 (unpaired student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "BrdU", "incorporation", "assay", "for", "H460", "and", "A549", "cells", ".", "The", "mean", "±", "SD", "represents", "6", "biological", "replicates", "in", "one", "experiment", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "D", ",", "Immunoblot", "showing", "the", "expression", "of", "Cleaved", "-", "PARP", ",", "Cleaved", "-", "CASP3", ",", "CASP3", "and", "Actin", "in", "H460", "and", "A549", "cells", ".", "E", ",", "H460", "and", "A549", "cells", "were", "cultured", "in", "5", "%", "Matrigel", "for", "10", "days", ".", "Representative", "images", "of", "the", "3D", "Matrigel", "culture", "are", "shown", "in", "the", "top", "panel", ",", "and", "immunofluorescence", "staining", "with", "anti", "-", "laminin5", "and", "DAPI", "is", "shown", "in", "the", "bottom", "panel", "(", "laminin5", ",", "red", ";", "DAPI", ",", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", ".", "The", "right", "panel", "shows", "the", "percentages", "of", "colonies", "with", "a", "diameter", "≥", "50", "μm", "and", "colonies", "with", "a", "diameter", "<", "50", "μm", ".", "The", "mean", "±", "SD", "represents", "5", "visual", "fields", "from", "one", "experiment", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "F", ",", "The", "relative", "cytoplasmic", "nucleosomes", "index", "was", "measured", "by", "detection", "with", "the", "cell", "death", "detection", "ELISA", "kit", "for", "H460", "and", "A549", "cells", "after", "24", "h", "under", "attached", "or", "suspended", "conditions", ".", "Immunoblot", "showing", "the", "expression", "of", "Cleaved", "-", "PARP", ",", "Cleaved", "-", "CASP3", ",", "CASP3", "and", "Actin", "in", "H460", "and", "A549", "cells", "after", "24", "h", "under", "attached", "or", "suspended", "conditions", ".", "The", "mean", "±", "SD", "represents", "4", "biological", "replicates", "in", "one", "experiment", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "ns", ",", "nonsignificant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "G", ",", "The", "indicated", "cells", "were", "allowed", "to", "grow", "in", "soft", "agar", "for", "2", "weeks", ",", "and", "colonies", "were", "counted", ".", "The", "mean", "±", "SD", "represents", "3", "biological", "replicates", "in", "one", "experiment", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "J", ",", "The", "volcano", "plot", "maps", "based", "on", "RNA", "-", "seq", "data", "show", "changes", "in", "the", "gene", "expression", "profile", "in", "H460", "(", "C", "/", "C", ")", "cells", "versus", "H460", "(", "T", "/", "T", ")", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, BrdU incorporation assay for H460 and A549 cells. The mean ± SD represents 6 biological replicates in one experiment. Three independent experiments were performed. **p < 0.01, ****p < 0.0001, unpaired two-tailed Student's t test.D, Immunoblot showing the expression of Cleaved-PARP, Cleaved-CASP3, CASP3 and Actin in H460 and A549 cells.E, H460 and A549 cells were cultured in 5% Matrigel for 10 days. Representative images of the 3D Matrigel culture are shown in the top panel, and immunofluorescence staining with anti-laminin5 and DAPI is shown in the bottom panel (laminin5, red; DAPI, blue). Scale bars, 200 μm. The right panel shows the percentages of colonies with a diameter ≥ 50 μm and colonies with a diameter < 50 μm. The mean ± SD represents 5 visual fields from one experiment. Three independent experiments were performed. ****p < 0.0001, unpaired two-tailed Student's t test.F, The relative cytoplasmic nucleosomes index was measured by detection with the cell death detection ELISA kit for H460 and A549 cells after 24 h under attached or suspended conditions. Immunoblot showing the expression of Cleaved-PARP, Cleaved-CASP3, CASP3 and Actin in H460 and A549 cells after 24 h under attached or suspended conditions. The mean ± SD represents 4 biological replicates in one experiment. Three independent experiments were performed. ns, nonsignificant, **p < 0.01, unpaired two-tailed Student's t test.G, The indicated cells were allowed to grow in soft agar for 2 weeks, and colonies were counted. The mean ± SD represents 3 biological replicates in one experiment. Three independent experiments were performed. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, unpaired two-tailed Student's t test.J, The volcano plot maps based on RNA-seq data show changes in the gene expression profile in H460 (C/C) cells versus H460 (T/T) cells."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "C", ",", "H460", "(", "T", "/", "T", ")", ",", "H460", "(", "C", "/", "C", ")", ",", "A549", "(", "T", "/", "T", ")", "and", "A549", "(", "C", "/", "C", ")", "cells", "were", "subcutaneously", "inoculated", "into", "BALB", "/", "c", "nude", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Primary", "tumors", "were", "resected", "after", "5", "weeks", "(", "A", ")", ".", "The", "graphs", "show", "the", "mean", "tumor", "volumes", "(", "B", ")", "and", "weight", "(", "C", ")", ".", "Values", "shown", "are", "means", "±", "SD", "obtained", "from", "animal", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "(", "B", ")", "and", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "C", ")", ".", "D", ",", "IHC", "staining", "for", "Ki67", "in", "primary", "tumors", "from", "animals", ".", "The", "panels", "show", "representative", "images", "(", "left", ")", ",", "and", "the", "graph", "shows", "the", "quantification", "of", "Ki67", "-", "positive", "cells", "in", "the", "tumor", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "The", "mean", "±", "SD", "represents", "5", "visual", "fields", "from", "each", "tumor", "tissue", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "F", ",", "The", "scatter", "plot", "and", "the", "percentage", "of", "HLA", "-", "I", "-", "positive", "circulating", "tumor", "cells", "(", "CTCs", ")", "in", "the", "peripheral", "blood", "was", "analyzed", "by", "Flow", "Cytometry", ",", "and", "numerical", "statistics", "of", "the", "two", "groups", "were", "calculated", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Tumor", "-", "free", "mice", "were", "used", "as", "a", "negative", "control", "to", "determine", "the", "gating", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "I", ",", "The", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "of", "overall", "survival", "of", "239", "Chinese", "lung", "cancer", "patients", "based", "on", "rs1663689", "genotype", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-C, H460 (T/T), H460 (C/C), A549 (T/T) and A549 (C/C) cells were subcutaneously inoculated into BALB/c nude mice (n = 5). Primary tumors were resected after 5 weeks (A). The graphs show the mean tumor volumes (B) and weight (C). Values shown are means ± SD obtained from animal experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, two-way ANOVA (B) and unpaired two-tailed Student's t test (C).D, IHC staining for Ki67 in primary tumors from animals. The panels show representative images (left), and the graph shows the quantification of Ki67-positive cells in the tumor (right). Scale bars, 100 μm. The mean ± SD represents 5 visual fields from each tumor tissue. ***p < 0.001, ****p < 0.0001, unpaired two-tailed Student's t test.F, The scatter plot and the percentage of HLA-I-positive circulating tumor cells (CTCs) in the peripheral blood was analyzed by Flow Cytometry, and numerical statistics of the two groups were calculated (n = 5). Tumor-free mice were used as a negative control to determine the gating. *p < 0.05, **p < 0.01, unpaired two-tailed Student's t test.I, The log-rank (Mantel-Cox) test of overall survival of 239 Chinese lung cancer patients based on rs1663689 genotype."}
{"words": ["Figure", "3F", ",", "The", "location", "diagram", "shows", "4C", "enrichment", "around", "the", "negative", "control", "and", "ADGRG6", "probe", ".", "Representative", "images", "of", "nuclei", "stained", "with", "DNA", "FISH", "probes", "for", "SNP", "rs1666389", "(", "green", ")", "and", "negative", "control", "(", "red", ")", "or", "ADGRG6", "(", "red", ")", "in", "H460", "and", "A549", "cells", ".", "The", "numerical", "points", "in", "the", "figure", "show", "the", "percentage", "of", "colocation", "in", "seven", "slides", "(", "with", "a", "total", "of", "80", "nuclei", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "colocation", "signals", ".", "Nuclei", "with", "green", "or", "red", "positive", "signal", "are", "listed", "in", "the", "counting", "range", ".", "Values", "shown", "are", "means", "±", "SD", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "ns", ",", "nonsignificant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "G", ",", "Expression", "of", "ADGRG6", "at", "the", "protein", "levels", "in", "H460", "and", "A549", "cells", ".", "H", ",", "eQTL", "analysis", "demonstrating", "the", "correlation", "between", "the", "rs1663689", "genotype", "and", "the", "expression", "of", "ADGRG6", "in", "the", "clinical", "patient", "cohorts", ".", "The", "p", "value", "of", "the", "linear", "model", "was", "assessed", "by", "the", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ".", "Values", "shown", "are", "means", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3F, The location diagram shows 4C enrichment around the negative control and ADGRG6 probe. Representative images of nuclei stained with DNA FISH probes for SNP rs1666389 (green) and negative control (red) or ADGRG6 (red) in H460 and A549 cells. The numerical points in the figure show the percentage of colocation in seven slides (with a total of 80 nuclei). Arrows point to the colocation signals. Nuclei with green or red positive signal are listed in the counting range. Values shown are means ± SD. Scale bars, 5 μm. ns, nonsignificant, *p < 0.05, **p < 0.01, unpaired two-tailed Student's t test.G, Expression of ADGRG6 at the protein levels in H460 and A549 cells.H, eQTL analysis demonstrating the correlation between the rs1663689 genotype and the expression of ADGRG6 in the clinical patient cohorts. The p value of the linear model was assessed by the Kruskal-Wallis test. Values shown are means ± SD."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "Protein", "expression", "of", "ADGRG6", "or", "Actin", "after", "ADGRG6", "knockdown", "in", "T", "/", "T", "cells", "and", "overexpression", "in", "C", "/", "C", "cells", ".", "Boyden", "chamber", "assay", "(", "C", ")", "of", "ADGRG6", "-", "knockdown", "T", "/", "T", "cells", "and", "ADGRG6", "-", "overexpressing", "C", "/", "C", "cells", ".", "Values", "shown", "are", "means", "±", "SD", "obtained", "from", "one", "experiment", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, Protein expression of ADGRG6 or Actin after ADGRG6 knockdown in T/T cells and overexpression in C/C cells.Boyden chamber assay (C) of ADGRG6-knockdown T/T cells and ADGRG6-overexpressing C/C cells. Values shown are means ± SD obtained from one experiment. Scale bars, 200 μm. Three independent experiments were performed. **p < 0.01, ****p < 0.0001, unpaired two-tailed Student's t test."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "Immunoblot", "showing", "the", "expression", "of", "PKA", "substrate", "phosphorylation", ",", "PKA", "and", "Actin", "in", "the", "indicated", "cells", "and", "genotypes", "and", "the", "indicated", "cells", "treated", "with", "H89", ".", "BrdU", "incorporation", "assay", "(", "B", ")", "of", "the", "indicated", "cells", "after", "treatment", "with", "H89", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", ".", "Values", "shown", "are", "means", "±", "SD", "obtained", "from", "one", "experiment", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "ns", ",", "nonsignificant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "D", ",", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "patient", "-", "derived", "organoids", "treated", "with", "20", "μM", "H89", "and", "controls", ".", "The", "mean", "±", "SD", "represents", "5", "visual", "fields", "from", "one", "experiment", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "ns", ",", "nonsignificant", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, Immunoblot showing the expression of PKA substrate phosphorylation, PKA and Actin in the indicated cells and genotypes and the indicated cells treated with H89.BrdU incorporation assay (B) of the indicated cells after treatment with H89. Scale bars, 200 μm. Values shown are means ± SD obtained from one experiment. Three independent experiments were performed. ns, nonsignificant, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, unpaired two-tailed Student's t test.D, Representative images and quantification of patient-derived organoids treated with 20 μM H89 and controls. The mean ± SD represents 5 visual fields from one experiment. Scale bars, 20 μm. ns, nonsignificant, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, unpaired two-tailed Student's t test."}
{"words": ["Figure", "2A", "Cell", "cycle", "analysis", "by", "flow", "cytometry", "(", "EdU", "vs", ".", "TO", "-", "PRO", "-", "3", ")", "in", "complete", "medium", "(", "ENRAD", ")", "or", "in", "the", "absence", "of", "A83", "-", "01", "(", "24", "hours", ")", ".", "B", "Detection", "of", "proteins", "secreted", "by", "mouse", "prostate", "organoids", "in", "culture", "based", "on", "click", "-", "chemistry", "enrichment", "and", "mass", "spectrometry", "analysis", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ";", "data", "points", "are", "shown", "with", "crossing", "line", "representing", "mean", "value", ")", ".", "C", "IF", "analysis", "for", "selected", "markers", "in", "mouse", "prostate", "tissue", "and", "organoid", "sections", "(", "scale", "bar", "=", "50", "μm", ")", ".", "D", "Representative", "stereoscopic", "images", "of", "mouse", "prostate", "organoids", "cultured", "in", "the", "absence", "of", "A83", "-", "01", ",", "with", "or", "without", "Follistatin", "(", "Fst", ",", "500", "ng", "/", "mL", ",", "6", "days", ")", ",", "or", "with", "or", "without", "the", "Activin", "A", "neutralizing", "antibody", "MAB3381", "(", "1", "μg", "/", "mL", ",", "6", "days", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "mmE", "Western", "blot", "(", "WB", ")", "analysis", "in", "mouse", "prostate", "organoids", "for", "selected", "canonical", "and", "non", "-", "canonical", "Tgf", "-", "β", "signalling", "mediators", ",", "and", "the", "cell", "cycle", "inhibitor", "p21", "(", "Activin", "A", ",", "50", "ng", "/", "mL", ";", "Tgfb1", ",", "500", "ng", "/", "mL", ";", "24", "hours", ")", ".", "G", "Representative", "stereoscopic", "images", "of", "mouse", "prostate", "organoids", "following", "treatment", "with", "Takinib", "(", "Tak1", "inhibitor", ";", "5", "μM", ",", "6", "days", ")", ",", "SB203580", "(", "p38α", "/", "β", "inhibitor", ";", "10", "μM", ",", "6", "days", ")", "or", "the", "structurally", "unrelated", "Ralimetinib", "(", "p38α", "/", "β", "inhibitor", ";", "1", "μM", ",", "7", "days", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "mmH", "Nuclear", "/", "Cytoplasmic", "fractionation", "and", "western", "blot", "analysis", "in", "mouse", "prostate", "organoids", "for", "selected", "signalling", "mediators", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "SB203580", "(", "p38α", "/", "β", "inhibitor", ";", "10", "μM", ",", "24", "hours", ")", ".", "I", "Gene", "set", "enrichment", "analysis", "(", "GSEA", ")", "plots", "displaying", "significant", "enrichment", "for", "inflammatory", "response", "and", "Tumor", "Necrosis", "Factor", "(", "TNF", ")", "signalling", "in", "mouse", "prostate", "organoids", "cultured", "without", "A83", "-", "01", "(", "24", "hours", ")", "versus", "complete", "medium", "(", "ENRAD", ")", ".", "J", "Nuclear", "/", "Cytoplasmic", "fractionation", "and", "western", "blot", "analysis", "in", "mouse", "prostate", "organoids", "for", "selected", "cell", "cycle", "regulators", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "SB203580", "(", "p38α", "/", "β", "inhibitor", ";", "10", "μM", ",", "24", "or", "48", "hours", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Cell cycle analysis by flow cytometry (EdU vs. TO-PRO-3) in complete medium (ENRAD) or in the absence of A83-01 (24 hours).B Detection of proteins secreted by mouse prostate organoids in culture based on click-chemistry enrichment and mass spectrometry analysis (n=4 biological replicates; data points are shown with crossing line representing mean value).C IF analysis for selected markers in mouse prostate tissue and organoid sections (scale bar = 50 μm).D Representative stereoscopic images of mouse prostate organoids cultured in the absence of A83-01, with or without Follistatin (Fst, 500 ng/mL, 6 days), or with or without the Activin A neutralizing antibody MAB3381 (1 μg/mL, 6 days). Scale bar = 1 mmE Western blot (WB) analysis in mouse prostate organoids for selected canonical and non-canonical Tgf-β signalling mediators, and the cell cycle inhibitor p21 (Activin A, 50 ng/mL; Tgfb1, 500 ng/mL; 24 hours).G Representative stereoscopic images of mouse prostate organoids following treatment with Takinib (Tak1 inhibitor; 5 μM, 6 days), SB203580 (p38α/β inhibitor; 10 μM, 6 days) or the structurally unrelated Ralimetinib (p38α/β inhibitor; 1 μM, 7 days). Scale bar = 1 mmH Nuclear/Cytoplasmic fractionation and western blot analysis in mouse prostate organoids for selected signalling mediators in the presence or absence of SB203580 (p38α/β inhibitor; 10 μM, 24 hours).I Gene set enrichment analysis (GSEA) plots displaying significant enrichment for inflammatory response and Tumor Necrosis Factor (TNF) signalling in mouse prostate organoids cultured without A83-01 (24 hours) versus complete medium (ENRAD).J Nuclear/Cytoplasmic fractionation and western blot analysis in mouse prostate organoids for selected cell cycle regulators, in the presence or absence of SB203580 (p38α/β inhibitor; 10 μM, 24 or 48 hours)."}
{"words": ["Figure", "3A", "Diagram", "depicting", "the", "expansion", "of", "mouse", "prostate", "organoid", "cultures", "in", "the", "absence", "of", "the", "Tgf", "-", "β", "ligand", "inhibitor", "A83", "-", "01", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "lobe", "-", "specific", "organoid", "culture", ";", "arrow", "=", "continuous", "expansion", ";", "dot", "=", "passage", ";", "cross", "=", "culture", "loss", ")", ".", "B", "Representative", "stereoscopic", "images", "of", "C57BL", "/", "6J", "DLP", "#", "1", "and", "#", "3", "mouse", "prostate", "organoid", "lines", "during", "adaptation", "in", "the", "absence", "of", "A83", "-", "01", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "mmD", "Gene", "set", "enrichment", "analysis", "(", "GSEA", ")", "plot", "displaying", "significant", "enrichment", "for", "activation", "of", "ATR", "signalling", "in", "mouse", "prostate", "organoid", "lines", "(", "C57", "#", "1", "DLP", ",", "top", ";", "C57", "#", "3", "DLP", ",", "bottom", ")", "adapted", "to", "grow", "in", "the", "absence", "of", "A83", "-", "01", "vs", ".", "normal", "control", "organoids", "cultured", "in", "complete", "medium", "(", "ENRAD", ")", ".", "E", "Western", "blot", "analysis", "in", "C57", "#", "1", "and", "C57", "#", "3", "DLP", "mouse", "prostate", "organoid", "lines", "adapted", "to", "grow", "in", "the", "absence", "of", "A83", "-", "01", "vs", ".", "normal", "control", "organoids", "cultured", "in", "complete", "medium", "(", "ENRAD", ")", ".", "Immunoblots", "are", "displayed", "for", "Chek1", "(", "ATR", "signalling", "mediator", ")", ",", "Trp53", "and", "p21", ".", "F", "Representative", "spectral", "karyotype", "(", "SKY", ")", "images", "of", "metaphase", "spreads", "obtained", "from", "C57", "#", "1", "DLP", "mouse", "prostate", "organoids", "cultured", "in", "normal", "conditions", "(", "ENRAD", ")", "or", "upon", "adaptation", "without", "A83", "-", "01", ".", "Widespread", "genomic", "instability", "is", "observed", "following", "adaptation", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "µm", ".", "G", "-", "H", "Representative", "telomere", "FISH", "images", "-", "and", "quantification", "(", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ",", "20", "metaphases", "per", "condition", ")", "-", "in", "C57", "#", "1", "DLP", "mouse", "prostate", "organoids", "cultured", "in", "normal", "conditions", "(", "ENRAD", ")", "or", "upon", "adaptation", "without", "A83", "-", "01", ".", "Widespread", "telomeric", "instability", "is", "observed", "following", "adaptation", "(", "arrows", "indicate", "telomere", "doublets", ",", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Diagram depicting the expansion of mouse prostate organoid cultures in the absence of the Tgf-β ligand inhibitor A83-01 (n = 3 biological replicates per lobe-specific organoid culture; arrow = continuous expansion; dot = passage; cross = culture loss).B Representative stereoscopic images of C57BL/6J DLP #1 and #3 mouse prostate organoid lines during adaptation in the absence of A83-01. Scale bar = 1 mmD Gene set enrichment analysis (GSEA) plot displaying significant enrichment for activation of ATR signalling in mouse prostate organoid lines (C57#1 DLP, top; C57#3 DLP, bottom) adapted to grow in the absence of A83-01 vs. normal control organoids cultured in complete medium (ENRAD).E Western blot analysis in C57#1 and C57#3 DLP mouse prostate organoid lines adapted to grow in the absence of A83-01 vs. normal control organoids cultured in complete medium (ENRAD). Immunoblots are displayed for Chek1 (ATR signalling mediator), Trp53 and p21.F Representative spectral karyotype (SKY) images of metaphase spreads obtained from C57#1 DLP mouse prostate organoids cultured in normal conditions (ENRAD) or upon adaptation without A83-01. Widespread genomic instability is observed following adaptation. Scale bars = 5 µm. G-H Representative telomere FISH images - and quantification (n = 2 biological replicates, 20 metaphases per condition) - in C57#1 DLP mouse prostate organoids cultured in normal conditions (ENRAD) or upon adaptation without A83-01. Widespread telomeric instability is observed following adaptation (arrows indicate telomere doublets, One-way ANOVA, scale bars = 10 µm)."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "Whole", "cell", "lysates", "were", "prepared", "with", "HeLa", "cells", "infected", "or", "not", "for", "48", "h", "with", "C", ".", "trachomatis", "L2", "(", "multiplicity", "of", "infection", "MOI", "=", "1", ")", "in", "the", "presence", "or", "not", "of", "BP", ".", "In", "the", "indicated", "samples", "CP4d", "was", "added", "2", "h", "before", "infection", ".", "Cell", "lysates", "were", "run", "on", "SDS", "-", "PAGE", ",", "proteins", "were", "transferred", "to", "a", "membrane", "and", "BP", "incorporation", "was", "revealed", "with", "HRP", "-", "conjugated", "streptavidin", ".", "BP", "incorporation", "is", "enhanced", "in", "infected", "samples", ",", "and", "is", "inhibited", "by", "CP4d", ".", "The", "two", "main", "bands", "present", "in", "all", "samples", "correspond", "to", "naturally", "biotinylated", "host", "proteins", "(", "Haneji", "&", "Koide", ",", "1989", ")", ".", "After", "blotting", "the", "membrane", "was", "stained", "with", "Coomassie", "blue", "to", "control", "for", "equal", "loading", ".", "B", "-", "Same", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "except", "that", "where", "indicated", "250", "μM", "doxycycline", "(", "doxy", ",", "left", ")", "or", "7", "μM", "cycloheximide", "(", "CHX", ",", "right", ")", "were", "added", "24", "h", "or", "2", "hpi", ",", "respectively", ".", "C", "-", "Whole", "cell", "lysates", "were", "prepared", "with", "TG2", "+", "/", "+", "and", "TG2", "-", "/", "-", "MEFs", "infected", "or", "not", "for", "48", "h", "with", "C", ".", "trachomatis", "L2", "in", "the", "presence", "or", "not", "of", "BP", ",", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "D", "-", "Western", "blot", "with", "anti", "-", "TG2", "antibodies", "on", "total", "cell", "lysates", "infected", "or", "not", "with", "C", ".", "trachomatis", "L2", "for", "the", "indicated", "time", ".", "The", "histogram", "displays", "the", "mean", "±", "SD", "of", "TG2", "expression", "relative", "to", "actin", "from", "four", "independent", "experiments", ",", "with", "the", "results", "of", "the", "Student", "'", "s", "ratio", "-", "paired", "t", "-", "test", ".", "NI", ":", "not", "infected", ".", "E", "-", "Cells", "were", "infected", "with", "C", ".", "trachomatis", "L2", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "24", "or", "46", "h", ".", "Where", "indicated", ",", "40", "μM", "CP4d", "was", "added", "2", "hpi", ".", "tgm2", "transcripts", "were", "measured", "by", "real", "-", "time", "RT", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "actin", "transcripts", "following", "the", "∆", "∆", "Ct", "method", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "relative", "mRNA", "levels", "compared", "to", "uninfected", "cells", "and", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Each", "experiment", "was", "performed", "in", "duplicate", "and", "repeated", "at", "least", "four", "times", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "ratio", "-", "paired", "t", "-", "test", "<", "0", ".", "05", "are", "shown", ".", "F", "-", "Cells", "were", "treated", "for", "18", "h", "with", "the", "indicated", "concentration", "of", "human", "recombinant", "IL", "-", "6", "before", "measuring", "TG2", "transcription", "relative", "to", "actin", "like", "in", "(", "E", ")", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "relative", "mRNA", "levels", "compared", "to", "untreated", "cells", "and", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Each", "experiment", "was", "performed", "in", "duplicate", "and", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "ratio", "-", "paired", "t", "-", "test", "<", "0", ".", "05", "are", "shown", ".", "Cells", "were", "left", "uninfected", "or", "infected", "with", "C", ".", "trachomatis", "L2", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "concentration", "of", "anti", "-", "IL", "-", "6", "receptor", "antibodies", ".", "Forty", "-", "eight", "h", "later", "TG2", "transcription", "relative", "to", "actin", "was", "measured", "like", "in", "(", "E", ")", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "relative", "mRNA", "levels", "compared", "to", "uninfected", "/", "untreated", "cells", "and", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Each", "experiment", "was", "performed", "in", "duplicate", "and", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "ratio", "-", "paired", "t", "-", "test", "<", "0", ".", "05", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A - Whole cell lysates were prepared with HeLa cells infected or not for 48 h with C. trachomatis L2 (multiplicity of infection MOI=1) in the presence or not of BP. In the indicated samples CP4d was added 2 h before infection. Cell lysates were run on SDS-PAGE, proteins were transferred to a membrane and BP incorporation was revealed with HRP-conjugated streptavidin. BP incorporation is enhanced in infected samples, and is inhibited by CP4d. The two main bands present in all samples correspond to naturally biotinylated host proteins (Haneji & Koide, 1989). After blotting the membrane was stained with Coomassie blue to control for equal loading. B - Same as in (A), except that where indicated 250 μM doxycycline (doxy, left) or 7 μM cycloheximide (CHX, right) were added 24 h or 2 hpi, respectively.C - Whole cell lysates were prepared with TG2+/+ and TG2-/- MEFs infected or not for 48 h with C. trachomatis L2 in the presence or not of BP, and analyzed as in (A).D -Western blot with anti-TG2 antibodies on total cell lysates infected or not with C. trachomatis L2 for the indicated time. The histogram displays the mean ± SD of TG2 expression relative to actin from four independent experiments, with the results of the Student's ratio-paired t-test. NI: not infected.E - Cells were infected with C. trachomatis L2 (MOI=1) for 24 or 46 h. Where indicated, 40 μM CP4d was added 2 hpi. tgm2 transcripts were measured by real-time RT-PCR and normalized to actin transcripts following the ∆∆Ct method. The data are presented as relative mRNA levels compared to uninfected cells and shown as the mean ± SD. Each experiment was performed in duplicate and repeated at least four times. P-values of Student's ratio-paired t-test <0.05 are shown.F - Cells were treated for 18 h with the indicated concentration of human recombinant IL-6 before measuring TG2 transcription relative to actin like in (E). The data are presented as relative mRNA levels compared to untreated cells and shown as the mean ± SD. Each experiment was performed in duplicate and repeated at least three times. P-values of Student's ratio-paired t-test <0.05 are shown.Cells were left uninfected or infected with C. trachomatis L2 in the presence of the indicated concentration of anti-IL-6 receptor antibodies. Forty-eight h later TG2 transcription relative to actin was measured like in (E). The data are presented as relative mRNA levels compared to uninfected/untreated cells and shown as the mean ± SD. Each experiment was performed in duplicate and repeated at least three times. P-values of Student's ratio-paired t-test <0.05 are shown."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "HeLa", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "CP4d", "(", "or", "DMSO", "alone", ")", "for", "2", "h", "before", "being", "infected", "with", "L2incDGFP", "at", "MOI", "=", "0", ".", "15", ".", "Thirty", "hours", "later", "the", "cells", "were", "disrupted", "and", "bacterial", "titers", "(", "IFU", "=", "inclusion", "forming", "unit", ")", "were", "determined", "by", "re", "-", "infecting", "fresh", "HeLa", "cells", "as", "described", "in", "the", "methods", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "paired", "t", "-", "test", "are", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", ".", "B", "-", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "two", "siRNAs", "against", "TG2", ".", "Two", "days", "later", ",", "the", "efficiency", "of", "the", "silencing", "was", "assessed", "by", "western", "blot", "using", "anti", "-", "TG2", "antibodies", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", "as", "loading", "control", "(", "bottom", ")", ".", "Duplicate", "wells", "were", "infected", "with", "L2incDGFP", "and", "progeny", "was", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", "(", "top", ")", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "four", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "paired", "t", "-", "test", "are", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", ".", "C", "-", "Same", "as", "in", "(", "A", ")", "except", "that", "C", ".", "trachomatis", "serovar", "L2", "(", "left", ")", "or", "D", "(", "right", ")", "were", "grown", "in", "primary", "cells", "isolated", "from", "fallopian", "tubes", ".", "For", "serovar", "D", ",", "IFU", "were", "determined", "48", "hpi", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "four", "to", "five", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "paired", "t", "-", "test", "are", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", ".", "D", "-", "HeLa", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "CP4d", "(", "or", "DMSO", "alone", ")", "for", "2", "h", "before", "being", "infected", "with", "L2incDGFP", "at", "MOI", "=", "0", ".", "15", ".", "Thirty", "hours", "later", "the", "cells", "were", "fixed", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "percentage", "of", "infected", "cells", "(", "left", ")", "and", "the", "mean", "fluorescence", "of", "the", "infected", "population", "(", "right", ")", "±", "SD", "are", "shown", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "paired", "t", "-", "test", "are", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", ".", "A", "representative", "field", "for", "each", "condition", "is", "shown", ",", "scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "E", "-", "Primary", "epithelial", "cells", "isolated", "from", "fallopian", "tubes", "were", "pre", "-", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "CP4d", "(", "or", "DMSO", "alone", ")", "for", "2", "h", "before", "being", "infected", "with", "C", ".", "trachomatis", "serovar", "L2", "(", "left", ")", "or", "D", "(", "right", ")", ".", "Twenty", "-", "four", "hours", "later", "the", "cells", "were", "fixed", ",", "bacteria", "were", "stained", "using", "FITC", "-", "labeled", "anti", "-", "Chlamydia", "-", "LPS", "antibodies", ",", "and", "the", "mean", "size", "of", "the", "inclusions", "manually", "determined", "using", "ImageJ", ",", "on", "twenty", "inclusions", "per", "experiment", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "paired", "t", "-", "test", "are", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", ".", "F", "-", "Mice", "were", "infected", "intravaginally", "with", "105", "IFU", "of", "C", ".", "muridarum", ".", "Twenty", "-", "five", "days", "later", "the", "mice", "were", "sacrificed", "and", "the", "upper", "genital", "tract", ",", "from", "the", "uterine", "horn", "to", "the", "oviduct", ",", "was", "collected", ".", "The", "right", "part", "was", "used", "for", "bacterial", "burden", "assessment", "(", "top", "left", ")", ".", "The", "left", "part", "was", "rinsed", "with", "PBS", "and", "observed", "with", "a", "binocular", "magnifier", "(", "right", ")", "to", "determine", "the", "hydrosalpinx", "score", "(", "bottom", "left", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "mouse", ",", "the", "mean", "±", "SD", "is", "shown", ".", "P", "-", "values", "of", "Mann", "-", "Whitney", "test", "are", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A - HeLa cells were pre-treated with the indicated concentrations of CP4d (or DMSO alone) for 2 h before being infected with L2incDGFP at MOI=0.15. Thirty hours later the cells were disrupted and bacterial titers (IFU=inclusion forming unit) were determined by re-infecting fresh HeLa cells as described in the methods. The mean ± SD of three independent experiments are shown. P-values of Student's paired t-test are indicated when <0.05.B - HeLa cells were transfected with control siRNA or two siRNAs against TG2. Two days later, the efficiency of the silencing was assessed by western blot using anti-TG2 antibodies and anti-actin antibodies as loading control (bottom). Duplicate wells were infected with L2incDGFP and progeny was analyzed as in (A) (top). The mean ± SD of four independent experiments are shown. P-values of Student's paired t-test are indicated when <0.05.C - Same as in (A) except that C. trachomatis serovar L2 (left) or D (right) were grown in primary cells isolated from fallopian tubes. For serovar D, IFU were determined 48 hpi. The mean ± SD of four to five independent experiments are shown. P-values of Student's paired t-test are indicated when <0.05.D - HeLa cells were pre-treated with the indicated concentrations of CP4d (or DMSO alone) for 2 h before being infected with L2incDGFP at MOI=0.15. Thirty hours later the cells were fixed and analyzed by flow cytometry. The percentage of infected cells (left) and the mean fluorescence of the infected population (right) ± SD are shown for three independent experiments. P-values of Student's paired t-test are indicated when <0.05. A representative field for each condition is shown, scale bar = 10 μm.E - Primary epithelial cells isolated from fallopian tubes were pre-treated with the indicated concentrations of CP4d (or DMSO alone) for 2 h before being infected with C. trachomatis serovar L2 (left) or D (right). Twenty-four hours later the cells were fixed, bacteria were stained using FITC-labeled anti-Chlamydia-LPS antibodies, and the mean size of the inclusions manually determined using ImageJ, on twenty inclusions per experiment. The mean ± SD of three independent experiments are shown. P-values of Student's paired t-test are indicated when <0.05.F - Mice were infected intravaginally with 105 IFU of C. muridarum. Twenty-five days later the mice were sacrificed and the upper genital tract, from the uterine horn to the oviduct, was collected. The right part was used for bacterial burden assessment (top left). The left part was rinsed with PBS and observed with a binocular magnifier (right) to determine the hydrosalpinx score (bottom left). Each dot represents one mouse, the mean ± SD is shown. P-values of Mann-Whitney test are indicated when <0.05."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "MEFs", "were", "grown", "for", "24", "h", "culture", "medium", "complemented", "with", "the", "indicated", "concentration", "of", "glucose", "before", "being", "infected", "with", "L2", "IncDGFP", "bacteria", "(", "MOI", "=", "0", ".", "2", ")", ".", "Cells", "were", "disrupted", "30", "h", "later", "and", "the", "bacterial", "titer", "determined", "by", "re", "-", "infecting", "fresh", "wild", "type", "cells", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "B", "-", "Cells", "were", "infected", "with", "C", ".", "trachomatis", "L2", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "24", "or", "48", "h", ".", "Where", "indicated", "40", "μM", "CP4d", "was", "added", "2", "hpi", ".", "GLUT", "-", "1", "and", "GLUT", "-", "3", "transcripts", "were", "measured", "by", "real", "-", "time", "RT", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "actin", "transcripts", "following", "the", "∆", "∆", "Ct", "method", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "relative", "mRNA", "levels", "compared", "to", "uninfected", "cells", "and", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Each", "experiment", "was", "performed", "in", "duplicate", "and", "repeated", "four", "times", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "ratio", "-", "paired", "t", "-", "test", "are", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", ".", "C", "-", "Relationship", "between", "TGM2", "and", "GLUT", "-", "1", "(", "top", ")", "and", "GLUT", "-", "3", "(", "bottom", ")", "expression", "across", "265", "HGSOCs", ".", "Expression", "comparisons", "were", "performed", "using", "Spearman", "'", "s", "rank", "correlation", "test", ".", "D", "-", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "C", ".", "trachomatis", "L2", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "24", "or", "46", "h", ".", "HIF", "-", "1α", "transcripts", "were", "measured", "by", "real", "-", "time", "RT", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "actin", "transcripts", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "relative", "E", "-", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "two", "siRNAs", "against", "HIF", "-", "1α", ".", "Two", "days", "later", ",", "cells", "were", "infected", "with", "C", ".", "trachomatis", "L2", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "48", "h", ".", "The", "indicated", "transcripts", "were", "measured", "by", "real", "-", "time", "RT", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "actin", "transcripts", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "relative", "mRNA", "levels", "compared", "to", "uninfected", "cells", "and", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Each", "experiment", "was", "performed", "in", "duplicate", "and", "repeated", "three", "times", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "ratio", "-", "paired", "t", "-", "test", "are", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", ".", "F", "-", "TG2", "-", "/", "-", "MEFs", "stably", "transformed", "or", "not", "with", "the", "indicated", "TG2", "construct", "were", "infected", "for", "two", "days", "with", "C", ".", "trachomatis", "L2", "(", "MOI", "=", "1", ")", ".", "Mouse", "GLUT", "-", "1", "transcripts", "were", "measured", "by", "real", "-", "time", "RT", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "mouse", "actin", "transcripts", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "relative", "mRNA", "levels", "compared", "to", "uninfected", "cells", "and", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Each", "experiment", "was", "performed", "in", "duplicate", "and", "repeated", "three", "times", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "ratio", "-", "paired", "t", "-", "test", "are", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A - MEFs were grown for 24 h culture medium complemented with the indicated concentration of glucose before being infected with L2 IncDGFP bacteria (MOI = 0.2). Cells were disrupted 30 h later and the bacterial titer determined by re-infecting fresh wild type cells. The mean ± SD of three independent experiments are shown.B - Cells were infected with C. trachomatis L2 (MOI=1) for 24 or 48 h. Where indicated 40 μM CP4d was added 2 hpi. GLUT-1 and GLUT-3 transcripts were measured by real-time RT-PCR and normalized to actin transcripts following the ∆∆Ct method. The data are presented as relative mRNA levels compared to uninfected cells and shown as the mean ± SD. Each experiment was performed in duplicate and repeated four times. P-values of Student's ratio-paired t-test are indicated when <0.05.C -Relationship between TGM2 and GLUT-1 (top) and GLUT-3 (bottom) expression across 265 HGSOCs. Expression comparisons were performed using Spearman's rank correlation test.D -HeLa cells were infected with C. trachomatis L2 (MOI=1) for 24 or 46 h. HIF-1α transcripts were measured by real-time RT-PCR and normalized to actin transcripts. The data are presented as relative E - HeLa cells were transfected with control siRNA or two siRNAs against HIF-1α. Two days later, cells were infected with C. trachomatis L2 (MOI=1) for 48 h. The indicated transcripts were measured by real-time RT-PCR and normalized to actin transcripts. The data are presented as relative mRNA levels compared to uninfected cells and shown as the mean ± SD. Each experiment was performed in duplicate and repeated three times. P-values of Student's ratio-paired t-test are indicated when <0.05.F - TG2-/- MEFs stably transformed or not with the indicated TG2 construct were infected for two days with C. trachomatis L2 (MOI=1). Mouse GLUT-1 transcripts were measured by real-time RT-PCR and normalized to mouse actin transcripts. The data are presented as relative mRNA levels compared to uninfected cells and shown as the mean ± SD. Each experiment was performed in duplicate and repeated three times. P-values of Student's ratio-paired t-test are indicated when <0.05."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "C", ".", "trachomatis", "(", "MOI", "=", "1", ")", "and", "40", "µM", "CP4d", "was", "added", "or", "not", "2", "hpi", ".", "After", "24", "h", "0", ".", "5", "mM", "BP", "was", "added", "and", "cells", "were", "lysed", "at", "48", "hpi", ".", "Lysates", "were", "precipitated", "with", "streptavidin", "-", "coated", "beads", ".", "After", "separation", "with", "SDS", "-", "PAGE", ",", "proteins", "were", "transferred", "to", "a", "membrane", "and", "blotted", "with", "anti", "-", "GFPT", "antibody", "followed", "with", "HRP", "-", "conjugated", "secondary", "antibody", ".", "B", "-", "In", "vitro", "assay", "testing", "the", "ability", "of", "purified", "TG2", "to", "crosslink", "purified", "rhGFPT1", "with", "BP", ".", "Samples", "were", "incubated", "for", "3", "h", "at", "37", "°", "C", "before", "separation", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Proteins", "were", "transferred", "to", "a", "membrane", "and", "BP", "was", "revealed", "using", "HRP", "-", "conjugated", "streptavidin", ".", "rhGFPT1", "is", "77", ".", "5", "kDa", ".", "D", "-", "In", "vitro", "assay", "was", "performed", "as", "described", "in", "B", "using", "wild", "type", "rhGFPT1", "(", "WT", ")", ",", "rhGFPT1", "Q58N", ",", "rhGFPT1", "Q328N", "or", "rhGFPT1", "Q555N", "as", "substrates", ".", "The", "reaction", "was", "performed", "at", "37", "°", "C", "for", "30", "min", ".", "After", "probing", "with", "HRP", "-", "Streptavidin", "the", "membrane", "was", "washed", "and", "probed", "with", "anti", "-", "GFPT", "antibodies", "followed", "with", "HRP", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "The", "ratio", "of", "modified", "protein", "(", "streptavidin", "signal", ")", "to", "the", "total", "GFPT", "is", "shown", ",", "normalized", "to", "its", "value", "with", "WT", "rhGFPT1", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "five", "independent", "experiments", "is", "shown", ",", "the", "p", "-", "value", "of", "the", "Student", "'", "s", "ratio", "-", "paired", "t", "-", "test", "is", "indicated", "when", "<", "0", ".", "05", ".", "E", "-", "Lysates", "of", "cells", "treated", "or", "not", "for", "6", "h", "with", "ionomycin", "were", "incubated", "at", "37", "°", "C", "for", "45", "min", "with", "fructose", "-", "6", "-", "P", "and", "glutamine", ".", "The", "production", "of", "glucosamine", "-", "6", "-", "P", "was", "measured", "using", "HPAEC", "-", "PAD", ".", "Results", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ",", "with", "mean", "±", "SD", ",", "and", "p", "-", "value", "of", "the", "Student", "'", "s", "paired", "t", "-", "test", "is", "indicated", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A - HeLa cells were infected with C. trachomatis (MOI = 1) and 40 µM CP4d was added or not 2 hpi. After 24 h 0.5 mM BP was added and cells were lysed at 48 hpi. Lysates were precipitated with streptavidin-coated beads. After separation with SDS-PAGE, proteins were transferred to a membrane and blotted with anti-GFPT antibody followed with HRP-conjugated secondary antibody.B - In vitro assay testing the ability of purified TG2 to crosslink purified rhGFPT1 with BP. Samples were incubated for 3 h at 37°C before separation by SDS-PAGE. Proteins were transferred to a membrane and BP was revealed using HRP-conjugated streptavidin. rhGFPT1 is 77.5 kDa.D - In vitro assay was performed as described in B using wild type rhGFPT1 (WT), rhGFPT1 Q58N, rhGFPT1 Q328N or rhGFPT1 Q555N as substrates. The reaction was performed at 37 °C for 30 min. After probing with HRP-Streptavidin the membrane was washed and probed with anti-GFPT antibodies followed with HRP-conjugated secondary antibodies. The ratio of modified protein (streptavidin signal) to the total GFPT is shown, normalized to its value with WT rhGFPT1. The mean ± SD of five independent experiments is shown, the p-value of the Student's ratio-paired t-test is indicated when <0.05.E - Lysates of cells treated or not for 6 h with ionomycin were incubated at 37 °C for 45 min with fructose-6-P and glutamine. The production of glucosamine-6-P was measured using HPAEC-PAD. Results of three independent experiments are shown, with mean ± SD, and p-value of the Student's paired t-test is indicated (*P < 0.05)."}
{"words": ["Figure", "5B", "-", "Endocervical", "epithelial", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "or", "not", "with", "40", "μM", "CP4d", "for", "2", "h", "before", "addition", "of", "the", "indicated", "concentration", "of", "ionomycin", "(", "or", "an", "equivalent", "volume", "of", "DMSO", ")", "and", "0", ".", "5", "µM", "BP", ".", "Six", "hours", "later", "whole", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", ".", "The", "membrane", "was", "first", "blotted", "with", "HRP", "-", "conjugated", "streptavidin", "to", "detect", "TG2", "activity", ",", "then", "extensively", "washed", "and", "probed", "with", "anti", "-", "O", "-", "GlcNAcylation", "antibody", "followed", "with", "HRP", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "Last", "the", "membrane", "was", "probed", "with", "anti", "-", "actin", "as", "a", "loading", "control", ".", "C", "-", "The", "same", "experimental", "procedure", "as", "described", "in", "(", "B", ")", "was", "applied", "to", "HeLa", "cells", "treated", "for", "48", "h", "prior", "to", "ionomycin", "treatment", "(", "8", "µM", ")", "with", "siRNA", "control", "or", "directed", "against", "TG2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B - Endocervical epithelial cells were pre-treated or not with 40 μM CP4d for 2 h before addition of the indicated concentration of ionomycin (or an equivalent volume of DMSO) and 0.5 µM BP. Six hours later whole cell lysates were analyzed by western blot. The membrane was first blotted with HRP-conjugated streptavidin to detect TG2 activity, then extensively washed and probed with anti-O-GlcNAcylation antibody followed with HRP-conjugated secondary antibodies. Last the membrane was probed with anti-actin as a loading control.C - The same experimental procedure as described in (B) was applied to HeLa cells treated for 48 h prior to ionomycin treatment (8 µM) with siRNA control or directed against TG2."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "HeLa", "cells", "were", "infected", "or", "not", "(", "NI", ")", "with", "C", ".", "trachomatis", "(", "MOI", "=", "1", ")", ",", "then", "lysed", "24", "or", "48", "hpi", ".", "After", "separation", "with", "SDS", "-", "PAGE", ",", "proteins", "were", "transferred", "to", "a", "membrane", ",", "probed", "with", "anti", "-", "O", "-", "GlcNAcylation", "antibody", "followed", "with", "HRP", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "After", "extensive", "washes", "the", "membrane", "was", "blotted", "again", "with", "anti", "-", "GFPT", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", "before", "revelation", "with", "HRP", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "B", "-", "HeLa", "cells", "were", "infected", "or", "not", "with", "C", ".", "trachomatis", "(", "MOI", "=", "1", ")", ".", "Twenty", "-", "four", "hours", "later", ",", "8", "µM", "ionomycin", "(", "or", "DMSO", "alone", ")", "and", "0", ".", "5", "mM", "BP", "were", "added", ".", "After", "6", "h", "of", "treatment", ",", "cells", "were", "lysed", "and", "proteins", "revealed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "C", "-", "HeLa", "cells", "treated", "for", "72", "h", "with", "siRNA", "targeting", "GFPT1", "or", "GFPT2", "were", "lysed", ".", "After", "separation", "with", "SDS", "-", "PAGE", ",", "proteins", "were", "transferred", "to", "a", "membrane", ",", "probed", "with", "anti", "-", "GFPT", "and", "anti", "-", "actin", "antibody", "before", "revelation", "with", "HRP", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "D", "-", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "siRNAs", "against", "GFPT", "or", "TG2", ".", "Two", "days", "later", "the", "cells", "were", "infected", "for", "the", "indicated", "times", "(", "MOI", "=", "0", ".", "3", ")", "before", "fixation", ",", "rupture", "of", "the", "cells", "and", "measurement", "of", "bacterial", "diameter", ".", "The", "mean", "diameter", "±", "SD", "and", "p", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "paired", "t", "-", "test", "on", "4", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "E", "-", "HeLa", "cells", "treated", "for", "48", "h", "with", "siRNA", "targeting", "GFPT1", "or", "not", "(", "siCTRL", ")", "were", "infected", "with", "C", ".", "trachomatis", "(", "MOI", "=", "0", ".", "15", ")", ".", "Thirty", "hours", "later", "cells", "were", "fixed", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "percentage", "of", "infected", "cells", "(", "top", ")", "and", "the", "mean", "fluorescence", "of", "the", "infected", "population", "(", "middle", ")", ")", "±", "SD", "are", "shown", "for", "at", "least", "four", "independent", "experiments", ".", "Duplicate", "wells", "were", "lysed", "and", "used", "to", "re", "-", "infect", "fresh", "HeLa", "cells", "to", "determine", "the", "bacterial", "titer", "(", "bottom", ")", ".", "P", "-", "values", "of", "Student", "'", "s", "ratio", "-", "paired", "t", "-", "test", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A - HeLa cells were infected or not (NI) with C. trachomatis (MOI = 1), then lysed 24 or 48 hpi. After separation with SDS-PAGE, proteins were transferred to a membrane, probed with anti-O-GlcNAcylation antibody followed with HRP-conjugated secondary antibodies. After extensive washes the membrane was blotted again with anti-GFPT and anti-actin antibodies before revelation with HRP-conjugated secondary antibodies.B - HeLa cells were infected or not with C. trachomatis (MOI = 1). Twenty-four hours later, 8 µM ionomycin (or DMSO alone) and 0.5 mM BP were added. After 6 h of treatment, cells were lysed and proteins revealed as in (A).C - HeLa cells treated for 72 h with siRNA targeting GFPT1 or GFPT2 were lysed. After separation with SDS-PAGE, proteins were transferred to a membrane, probed with anti-GFPT and anti-actin antibody before revelation with HRP-conjugated secondary antibodies.D - HeLa cells were transfected with control siRNA or siRNAs against GFPT or TG2. Two days later the cells were infected for the indicated times (MOI=0.3) before fixation, rupture of the cells and measurement of bacterial diameter. The mean diameter ± SD and p-values of Student's paired t-test on 4 independent experiments are shown.E - HeLa cells treated for 48 h with siRNA targeting GFPT1 or not (siCTRL) were infected with C. trachomatis (MOI = 0.15). Thirty hours later cells were fixed and analyzed by flow cytometry. The percentage of infected cells (top) and the mean fluorescence of the infected population (middle) ) ± SD are shown for at least four independent experiments. Duplicate wells were lysed and used to re-infect fresh HeLa cells to determine the bacterial titer (bottom). P-values of Student's ratio-paired t-test are indicated."}
{"words": ["Figure", "1IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "A", ")", "in", "Myc", "empty", "vector", "(", "200", "ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "B", ")", "in", "Myc", "empty", "vector", "(", "200", "ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "C", ")", "in", "Myc", "empty", "vector", "(", "200", "ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "H1299", "cells", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "D", ")", "in", "Myc", "empty", "vector", "(", "200", "ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "H1299", "cells", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "E", ")", "in", "the", "indicated", "siRNA", "-", "transfected", "H1299", "cells", "(", "si", "-", "NC", ",", "si", "-", "SIRT5", "#", "1", "and", "si", "-", "SIRT5", "#", "2", ")", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "NC", ",", "negative", "control", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "F", ")", "in", "the", "indicated", "siRNA", "-", "transfected", "H1299", "cells", "(", "si", "-", "NC", ",", "si", "-", "SIRT5", "#", "1", "and", "si", "-", "SIRT5", "#", "2", ")", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "NC", ",", "negative", "control", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "G", ")", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", ")", "or", "the", "wildtype", "(", "WT", ")", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "H", ")", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", ")", "or", "the", "wildtype", "(", "WT", ")", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "I", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "transfection", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "J", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "Myc", "-", "RIG", "-", "I", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200ng", ")", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "K", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "Myc", "-", "MDA5", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "L", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "HA", "-", "MAVS", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "M", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "Myc", "-", "TBK1", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "N", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "HA", "-", "IRF3", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "O", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "HA", "-", "MAVS", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", "(", "200ng", ")", "respectively", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1IFN-β promoter activity (A) in Myc empty vector (200 ng) or Myc-SIRT5 (200 ng)-transfected HEK293T cells with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).ISRE reporter activity (B) in Myc empty vector (200 ng) or Myc-SIRT5 (200 ng)-transfected HEK293T cells with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).IFN-β promoter activity (C) in Myc empty vector (200 ng) or Myc-SIRT5 (200 ng)-transfected H1299 cells with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).ISRE reporter activity (D) in Myc empty vector (200 ng) or Myc-SIRT5 (200 ng)-transfected H1299 cells with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).IFN-β promoter activity (E) in the indicated siRNA-transfected H1299 cells (si-NC, si-SIRT5#1 and si-SIRT5#2) with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. NC, negative control. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).ISRE reporter activity (F) in the indicated siRNA-transfected H1299 cells (si-NC, si-SIRT5#1 and si-SIRT5#2) with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. NC, negative control. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).IFN-β promoter activity (G) in SIRT5-deficient H1299 cells (SIRT5 -/-) or the wildtype (WT) H1299 cells (SIRT5 +/+) with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).ISRE reporter activity (H) in SIRT5-deficient H1299 cells (SIRT5 -/-) or the wildtype (WT) H1299 cells (SIRT5 +/+) with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).I ISRE reporter activity in Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng)-transfected HEK293T cells with or without poly(I:C) transfection for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).J ISRE reporter activity in co-transfection of Myc-RIG-I (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200ng)-transfected HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).K ISRE reporter activity in co-transfection of Myc-MDA5 (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng) in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).L ISRE reporter activity in co-transfection of HA-MAVS (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng) in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).M ISRE reporter activity in co-transfection of Myc-TBK1 (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng) in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).N ISRE reporter activity in co-transfection of HA-IRF3 (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng) in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).O ISRE reporter activity in co-transfection of HA-MAVS (200 ng) together with Myc-SIRT5 (200ng) or Myc-SIRT5-H158Y(200ng) respectively in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "2A", "Confocal", "microscopy", "image", "of", "endogenous", "SIRT5", "co", "-", "localized", "with", "endogenous", "MAVS", "in", "H1299", "cells", "detected", "by", "immunofluorescence", "staining", "using", "anti", "-", "SIRT5", "and", "anti", "-", "MAVS", "antibodies", ".", "Mito", ",", "Mitotracker", ";", "Scale", "bar", "=", "8", "µm", ".", "B", "-", "C", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "Myc", "-", "SIRT5", "with", "HA", "-", "MAVS", "and", "vice", "versa", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "indicated", "plasmids", "for", "24", "h", ".", "Anti", "-", "Myc", "(", "B", ")", "or", "anti", "-", "HA", "antibody", "conjugated", "agarose", "beads", "(", "C", ")", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "and", "the", "interaction", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "D", "Endogenous", "interaction", "between", "MAVS", "and", "SIRT5", ".", "Anti", "-", "MAVS", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ",", "and", "normal", "mouse", "IgG", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "E", "Endogenous", "interaction", "between", "MAVS", "and", "SIRT5", "in", "the", "wildtype", "(", "WT", ")", "(", "MAVS", "+", "/", "+", ")", "or", "SIRT5", "-", "deficient", "(", "MAVS", "-", "/", "-", ")", "H1299", "cells", ".", "Anti", "-", "MAVS", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ",", "and", "the", "interaction", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "SIRT5", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "F", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "for", "GST", "-", "tagged", "MAVS", "and", "His", "-", "tagged", "SIRT5", ".", "GST", "-", "tagged", "MAVS", "and", "His", "-", "tagged", "SIRT5", "were", "expressed", "in", "Escherichia", "coli", "(", "BL21", ")", ",", "respectively", ".", "The", "association", "of", "GST", "-", "MAVS", "with", "His", "-", "SIRT5", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "SIRT5", "antibody", ".", "GST", "and", "GST", "-", "MAVS", "proteins", "were", "stained", "with", "Coomassie", "blue", ".", "H", "-", "I", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "HA", "-", "SIRT5", "with", "Flag", "-", "MAVS", "-", "truncated", "mutants", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "Anti", "-", "Flag", "antibody", "conjugated", "agarose", "beads", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "and", "the", "interaction", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Flag", "-", "MAVS", "fragments", "(", "WT", ":", "full", "length", ";", "ΔC1", ",", "1", "-", "173", "aa", ";", "ΔC2", ",", "1", "-", "513", "aa", ";", "ΔN1", ",", "91", "-", "540", "aa", ";", "ΔN2", ",", "173", "-", "540", "aa", ";", "ΔCARD", ",", "Δ10", "-", "77", "aa", ";", "ΔPR", ",", "Δ103", "-", "173", "aa", ";", "ΔTM", ",", "Δ514", "-", "535", "aa", ")", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Confocal microscopy image of endogenous SIRT5 co-localized with endogenous MAVS in H1299 cells detected by immunofluorescence staining using anti-SIRT5 and anti-MAVS antibodies. Mito, Mitotracker; Scale bar = 8 µm.B-C Co-immunoprecipitation of Myc-SIRT5 with HA-MAVS and vice versa. HEK293T cells were co-transfected with indicated plasmids for 24 h. Anti-Myc (B) or anti-HA antibody conjugated agarose beads (C) were used for immunoprecipitation and the interaction was detected by immunoblotting with the indicated antibodies. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.D Endogenous interaction between MAVS and SIRT5. Anti-MAVS antibody was used for immunoprecipitation, and normal mouse IgG was used as a control. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.E Endogenous interaction between MAVS and SIRT5 in the wildtype (WT) (MAVS +/+) or SIRT5-deficient (MAVS -/-) H1299 cells. Anti-MAVS antibody was used for immunoprecipitation, and the interaction was detected by immunoblotting with anti-SIRT5 antibody. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.F GST pull-down assay for GST-tagged MAVS and His-tagged SIRT5. GST-tagged MAVS and His-tagged SIRT5 were expressed in Escherichia coli (BL21), respectively. The association of GST-MAVS with His-SIRT5 was detected by immunoblotting with anti-SIRT5 antibody. GST and GST-MAVS proteins were stained with Coomassie blue.H-I Co-immunoprecipitation analysis of HA-SIRT5 with Flag-MAVS-truncated mutants. HEK293T cells were co-transfected with the indicated plasmids. Anti-Flag antibody conjugated agarose beads were used for immunoprecipitation and the interaction was analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies. Flag-MAVS fragments (WT: full length; ΔC1, 1-173 aa; ΔC2, 1-513 aa; ΔN1, 91-540 aa; ΔN2, 173-540 aa; ΔCARD, Δ10-77 aa; ΔPR, Δ103-173 aa; ΔTM, Δ514-535 aa). Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "B", "MAVS", "could", "be", "succinylated", "in", "vitro", ".", "GST", "-", "MAVS", "(", "A", ")", "extracted", "from", "E", ".", "coli", "or", "Flag", "-", "tagged", "MAVS", "(", "B", ")", "protein", "purified", "from", "HEK293T", "cells", "was", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "succinyl", "-", "CoA", ".", "Protein", "succinylation", "was", "detected", "with", "anti", "-", "pan", "-", "succinyl", "-", "lysine", "antibody", ";", "GST", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "MAVS", "was", "stained", "by", "Coomassie", "blue", ".", "C", "The", "succinylated", "residue", "in", "MAVS", "was", "identified", "by", "mass", "spectrometry", "analysis", ".", "E", "Dot", "-", "blot", "assay", "for", "the", "specificity", "of", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Equal", "amounts", "of", "succinyl", "-", "peptides", "or", "the", "control", "peptides", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "dilutions", "of", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "GST", "-", "MAVS", "(", "F", ")", "extracted", "from", "E", ".", "coli", "cells", "was", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "succinyl", "-", "CoA", ".", "The", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "lysine", "7", "was", "detected", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Flag", "-", "MAVS", "(", "G", ")", "purified", "from", "HEK293T", "cells", "was", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "succinyl", "-", "CoA", ".", "The", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "lysine", "7", "was", "detected", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "H", "Disruption", "of", "SIRT5", "in", "H1299", "cells", "enhanced", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "Lys", "7", "compared", "to", "that", "in", "the", "SIRT5", "-", "intact", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "(", "3", ".", "2", "vs", ".", "1", ".", "0", ")", ".", "The", "cell", "lysates", "from", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "or", "the", "SIRT5", "-", "intact", "H1299", "cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "MAVS", "antibody", "or", "mouse", "IgG", "control", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "I", "Reconstitution", "of", "WT", "SIRT5", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", ")", "caused", "a", "significant", "reduction", "in", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "Lys", "7", "(", "1", ".", "0", "vs", ".", "0", ".", "2", ")", ";", "but", "overexpression", "of", "SIRT5", "-", "H158Y", "in", "SIRT5", "-", "/", "-", "H1299", "cells", "has", "no", "effect", "on", "the", "reduction", "in", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "Lys", "7", "(", "1", ".", "0", "vs", ".", "1", ".", "2", ")", ".", "The", "SIRT5", "-", "/", "-", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "SIRT5", "or", "Flag", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", ",", "followed", "by", "immunoprecipitating", "with", "anti", "-", "MAVS", "antibody", "or", "mouse", "IgG", "control", ",", "and", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "J", "-", "K", "Knockout", "of", "Sirt5", "increased", "Mavs", "succinylation", "in", "mouse", "livers", "(", "J", ")", "and", "lungs", "(", "K", ")", ".", "Proteins", "extracted", "from", "livers", "(", "J", ")", "and", "lungs", "(", "K", ")", "of", "Sirt5", "KO", "and", "the", "wildtype", "littermates", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "were", "detected", "by", "the", "indicated", "antibodies", ".", "MAVS", "succinylation", "was", "determined", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ",", "and", "anti", "-", "pan", "-", "succinyl", "-", "lysine", "antibody", "was", "used", "as", "positive", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-B MAVS could be succinylated in vitro. GST-MAVS (A) extracted from E.coli or Flag-tagged MAVS (B) protein purified from HEK293T cells was incubated with the indicated concentrations of succinyl-CoA. Protein succinylation was detected with anti-pan-succinyl-lysine antibody; GST-MAVS or Flag-MAVS was stained by Coomassie blue.C The succinylated residue in MAVS was identified by mass spectrometry analysis.E Dot-blot assay for the specificity of anti-succ-K7-MAVS antibody. Equal amounts of succinyl-peptides or the control peptides were immunoblotted with the indicated dilutions of anti-succ-K7-MAVS antibody.GST-MAVS (F) extracted from E.coli cells was incubated with the indicated concentrations of succinyl-CoA. The succinylation of MAVS at lysine 7 was detected by anti-succ-K7-MAVS antibody.Flag-MAVS (G) purified from HEK293T cells was incubated with the indicated concentrations of succinyl-CoA. The succinylation of MAVS at lysine 7 was detected by anti-succ-K7-MAVS antibody.H Disruption of SIRT5 in H1299 cells enhanced succinylation of MAVS at Lys 7 compared to that in the SIRT5-intact H1299 cells (SIRT5 +/+) (3.2 vs. 1.0). The cell lysates from SIRT5-deficient H1299 cells or the SIRT5-intact H1299 cells were immunoprecipitated with anti-MAVS antibody or mouse IgG control, followed by immunoblotting with anti-succ-K7-MAVS antibody. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.I Reconstitution of WT SIRT5 in SIRT5-deficient H1299 cells (SIRT5 -/-) caused a significant reduction in succinylation of MAVS at Lys 7 (1.0 vs. 0.2); but overexpression of SIRT5-H158Y in SIRT5 -/- H1299 cells has no effect on the reduction in succinylation of MAVS at Lys 7 (1.0 vs. 1.2). The SIRT5 -/- H1299 cells were transfected with Flag-SIRT5 or Flag-SIRT5-H158Y, followed by immunoprecipitating with anti-MAVS antibody or mouse IgG control, and immunoblotting with anti-succ-K7-MAVS antibody. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.J-K Knockout of Sirt5 increased Mavs succinylation in mouse livers (J) and lungs (K). Proteins extracted from livers (J) and lungs (K) of Sirt5 KO and the wildtype littermates (n = 3 per group) were detected by the indicated antibodies. MAVS succinylation was determined by anti-succ-K7-MAVS antibody, and anti-pan-succinyl-lysine antibody was used as positive controls."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "C", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "analysis", "(", "qPCR", ")", "of", "IFNβ", "(", "A", ")", ",", "CXCL10", "(", "B", ")", "and", "IFIT1", "(", "C", ")", "mRNA", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "control", "plasmid", "(", "Myc", "empty", ")", "or", "the", "plasmid", "expressing", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "Myc", "-", "SIRT5", ")", "for", "24", "h", ",", "followed", "by", "infection", "with", "or", "without", "SeV", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "8h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "D", "-", "F", "qPCR", "analysis", "of", "IFNβ", "(", "D", ")", ",", "CXCL10", "(", "E", ")", ",", "and", "IFIT1", "(", "F", ")", "mRNA", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "G", "-", "I", "qPCR", "analysis", "of", "IFNβ", "(", "G", ")", ",", "CXCL10", "(", "H", ")", "and", "IFIT1", "(", "I", ")", "mRNA", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "J", "qPCR", "analysis", "of", "IFNβ", "mRNA", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "control", "plasmid", "(", "Myc", "empty", ")", ",", "or", "the", "plasmid", "expressing", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "Myc", "-", "SIRT5", ")", ",", "or", "its", "enzyme", "-", "deficient", "mutant", "H158Y", "(", "Myc", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", ")", "for", "24", "h", ",", "followed", "by", "stimulation", "with", "or", "without", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "K", "qPCR", "analysis", "of", "IFNβ", "mRNA", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", ")", "transfected", "with", "the", "control", "plasmid", "(", "Myc", "empty", ")", "or", "the", "plasmid", "expressing", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "Myc", "-", "SIRT5", ")", "or", "its", "enzyme", "-", "deficient", "mutant", "H158Y", "(", "Myc", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", ")", "for", "24", "h", ",", "followed", "by", "infection", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "SeV", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "L", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "MAVS", "aggregates", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "HA", "-", "MAVS", "together", "with", "WT", "Myc", "-", "SIRT5", "or", "its", "enzyme", "-", "deficient", "mutant", "(", "Myc", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", ")", "after", "infected", "with", "SeV", "for", "12h", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "M", "-", "N", "IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "M", ")", "and", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "N", ")", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "Myc", "-", "SIRT5", "together", "with", "HA", "-", "MAVS", "or", "HA", "-", "MAVS", "-", "K7R", ".", "Data", "information", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "(", "MOI", "=", "0", ".", "1", ")", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "O", ")", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "(", "MOI", "=", "0", ".", "1", ")", "for", "12", "h", "and", "viral", "infectivity", "western", "blot", "analysis", "(", "P", ")", "Data", "information", ":", "ll", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "(", "MOI", "=", "0", ".", "1", ")", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "flow", "cytometry", "analysis", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "Q", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-C Quantitative real time PCR analysis (qPCR) of IFNβ (A), CXCL10 (B) and IFIT1 (C) mRNA in HEK293T cells transfected with the control plasmid (Myc empty) or the plasmid expressing Myc-SIRT5 (Myc-SIRT5) for 24 h, followed by infection with or without SeV (SeV or UI) for 8h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).D-F qPCR analysis of IFNβ (D), CXCL10 (E), and IFIT1 (F) mRNA in SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) infected with or without SeV (SeV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).G-I qPCR analysis of IFNβ (G), CXCL10 (H) and IFIT1 (I) mRNA in SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) infected with or without VSV (VSV or UI) for 8h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).J qPCR analysis of IFNβ mRNA in HEK293T cells transfected with the control plasmid (Myc empty), or the plasmid expressing Myc-SIRT5 (Myc-SIRT5), or its enzyme-deficient mutant H158Y (Myc-SIRT5-H158Y) for 24 h, followed by stimulation with or without poly(I:C) for 8 h. Data information: All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).K qPCR analysis of IFNβ mRNA in SIRT5-deficient H1299 cells (SIRT5-/-) transfected with the control plasmid (Myc empty) or the plasmid expressing Myc-SIRT5 (Myc-SIRT5) or its enzyme-deficient mutant H158Y (Myc-SIRT5-H158Y) for 24 h, followed by infection with (+) or without (-) SeV for 8 h. Data information: All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).L SDD-AGE analysis of MAVS aggregates in HEK293T cells transfected HA-MAVS together with WT Myc-SIRT5 or its enzyme-deficient mutant (Myc-SIRT5-H158Y) after infected with SeV for 12h. SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control.M-N IFN-β promoter activity (M) and ISRE reporter activity (N) in HEK293T cells co-transfected Myc-SIRT5 together with HA-MAVS or HA-MAVS-K7R. Data information All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) were infected with VSV-GFP viruses (MOI = 0.1) for 12 h, and viral infectivity was detected by fluorescence microscopy (O)SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) were infected with VSV-GFP viruses (MOI = 0.1) for 12 h and viral infectivity western blot analysis (P) Data information: ll data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) were infected with VSV-GFP viruses (MOI = 0.1) for 12 h, and viral infectivity was detected by flow cytometry analysis (n = 3) (Q)."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "F", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "A", ")", ",", "Ifnα1", "(", "B", ")", ",", "Ifnα4", "(", "C", ")", ",", "Ifit1", "(", "D", ")", ",", "Cxcl10", "(", "E", ")", ",", "and", "Cxcl11", "(", "F", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "8h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "G", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "for", "the", "indicated", "times", ",", "and", "the", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "for", "monomeric", "(", "Monomer", ")", "and", "dimeric", "(", "Dimer", ")", "Irf3", "(", "top", ";", "native", "-", "PAGE", ")", ",", "phosphorylated", "Irf3", "(", "p", "-", "Irf3", ")", ",", "total", "Irf3", ",", "Sirt5", ",", "and", "GAPDH", "(", "bottom", ")", ".", "H", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "for", "8", "h", ",", "the", "interaction", "between", "endogenous", "Mavs", "and", "Rig", "-", "I", "was", "revealed", "by", "immunoprecipitation", "using", "anti", "-", "Mavs", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Rig", "-", "I", "antibody", ".", "I", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "Mavs", "aggregates", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "SeV", "for", "12", "h", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "J", "-", "O", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "J", ")", ",", "Ifnα1", "(", "K", ")", ",", "Ifnα4", "(", "L", ")", ",", "Ifit1", "(", "M", ")", ",", "Cxcl10", "(", "N", ")", ",", "and", "Cxcl11", "(", "O", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "P", ")", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "western", "blot", "analysis", "(", "Q", ")", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "flow", "cytometry", "analysis", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "R", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-F qPCR analysis of Ifnβ (A), Ifnα1 (B), Ifnα4 (C), Ifit1 (D), Cxcl10 (E), and Cxcl11 (F) mRNA in WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without SeV (SeV or UI) for 8h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).G WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without SeV for the indicated times, and the cell lysates were analyzed by immunoblotting for monomeric (Monomer) and dimeric (Dimer) Irf3 (top; native-PAGE), phosphorylated Irf3 (p-Irf3), total Irf3, Sirt5, and GAPDH (bottom).H WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without SeV for 8 h, the interaction between endogenous Mavs and Rig-I was revealed by immunoprecipitation using anti-Mavs antibody, followed by immunoblotting with anti-Rig-I antibody.I SDD-AGE analysis of Mavs aggregates in WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with SeV for 12 h. SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control.J-O qPCR analysis of Ifnβ (J), Ifnα1 (K), Ifnα4 (L), Ifit1 (M), Cxcl10 (N), and Cxcl11 (O) mRNA in WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without VSV (VSV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without VSV-GFP viruses for 12 h, and viral infectivity was detected by fluorescence microscopy (P)WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without VSV-GFP viruses for 12 h, and viral infectivity was detected by western blot analysis (Q)WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without VSV-GFP viruses for 12 h, and viral infectivity was detected by flow cytometry analysis (n = 3) (R). Data information: All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "6qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "A", ")", ",", "Ifnα1", "(", "B", ")", ",", "Ifnα4", "(", "C", ")", ",", "Ifit1", "(", "D", ")", ",", "Rig", "-", "I", "(", "E", ")", ",", "Cxcl10", "(", "F", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "(", "Sev", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Cxcl11", "(", "G", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "(", "Sev", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "H", ")", ",", "Ifnα1", "(", "I", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "viruses", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnα4", "(", "J", ")", ",", "Ifit1", "(", "K", ")", ",", "Rig", "-", "I", "(", "L", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "viruses", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Cxcl10", "(", "M", ")", "and", "Cxcl11", "(", "N", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "viruses", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "O", "Confocal", "fluorescence", "microscopy", "image", "of", "replication", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "after", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "for", "12", "h", "(", "MOI", "=", "1", ")", "(", "fluorescence", ",", "upper", ";", "bright", "-", "field", ",", "bottom", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "75", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6qPCR analysis of Ifnβ (A), Ifnα1 (B), Ifnα4 (C), Ifit1 (D), Rig-I (E), Cxcl10 (F) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without SeV (Sev or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).qPCR analysis of Cxcl11 (G) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without SeV (Sev or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).qPCR analysis of Ifnβ (H), Ifnα1 (I) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without VSV viruses (VSV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).qPCR analysis of Ifnα4 (J), Ifit1 (K), Rig-I (L) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without VSV viruses (VSV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).qPCR analysis of Cxcl10 (M) and Cxcl11 (N) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without VSV viruses (VSV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).O Confocal fluorescence microscopy image of replication in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) after infected with VSV-GFP viruses for 12 h (MOI = 1) (fluorescence, upper; bright-field, bottom). Scale bar = 75 µm."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "B", "VSV", "infection", "increased", "Mavs", "succinylation", "in", "mouse", "livers", "(", "A", ")", "and", "lungs", "(", "B", ")", ".", "Proteins", "in", "the", "livers", "(", "A", ")", "and", "lungs", "(", "B", ")", "of", "WT", "littermates", "injected", "intraperitoneally", "with", "(", "+", ")", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", "or", "PBS", "control", "(", "-", ")", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "were", "detected", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Mavs", "succinylation", "was", "determined", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Relative", "succinylation", "level", "was", "quantified", "(", "right", "panel", ")", ".", "C", "-", "D", "Knockout", "of", "Sirt5", "increased", "Mavs", "succinylation", "in", "mouse", "livers", "(", "C", ")", "and", "lungs", "(", "D", ")", "upon", "VSV", "infection", ".", "Proteins", "in", "the", "livers", "(", "C", ")", "and", "lungs", "(", "D", ")", "of", "Sirt5", "-", "deficient", "or", "WT", "littermates", "(", "Sirt5", "-", "/", "-", "or", "Sirt5", "+", "/", "+", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", ")", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "for", "24", "h", "were", "detected", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Mavs", "succinylation", "was", "determined", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Relative", "succinylation", "level", "was", "quantified", "(", "right", "panel", ")", ".", "E", "Survival", "(", "Kaplan", "-", "Meier", "curve", ")", "of", "WT", "mice", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "n", "=", "7", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "a", "high", "dose", "of", "VSV", "(", "5", "×", "107", "PFU", "per", "mouse", ")", "and", "monitored", "for", "10", "d", ".", "F", "ELISA", "assay", "of", "Ifnβ", "in", "serum", "from", "the", "WT", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", ")", "or", "PBS", "control", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "WT", "mice", ".", "PBS", ",", "phosphate", "buffer", "saline", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ")", ".", "G", "Hematoxylin", "-", "and", "-", "eosin", "-", "stained", "images", "of", "lung", "sections", "from", "mice", "in", "F", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "H", ")", ",", "Ifnα1", "(", "I", ")", ",", "Ifit1", "(", "J", ")", ",", "Isg15", "(", "K", ")", ",", "Cxcl10", "(", "L", ")", ",", "Cxcl11", "(", "M", ")", "mRNA", "in", "the", "lungs", "of", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", "or", "PBS", "control", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "WT", "mice", ".", "PBS", ",", "phosphate", "buffer", "saline", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Rig", "-", "I", "(", "N", ")", ",", "and", "Irf7", "(", "O", ")", "mRNA", "in", "the", "lungs", "of", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", "or", "PBS", "control", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "WT", "mice", ".", "PBS", ",", "phosphate", "buffer", "saline", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ")", ".", "P", "qPCR", "analysis", "of", "VSV", "mRNA", "in", "the", "lungs", "of", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", "or", "PBS", "control", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "WT", "mice", ".", "PBS", ",", "phosphate", "buffer", "saline", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-B VSV infection increased Mavs succinylation in mouse livers (A) and lungs (B). Proteins in the livers (A) and lungs (B) of WT littermates injected intraperitoneally with (+) VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse) or PBS control (-) (n = 3 per group) were detected with the indicated antibodies. Mavs succinylation was determined by anti-succ-K7-MAVS antibody. Relative succinylation level was quantified (right panel).C-D Knockout of Sirt5 increased Mavs succinylation in mouse livers (C) and lungs (D) upon VSV infection. Proteins in the livers (C) and lungs (D) of Sirt5-deficient or WT littermates (Sirt5 -/- or Sirt5 +/+) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse)) (n = 3 per group) for 24 h were detected with the indicated antibodies. Mavs succinylation was determined by anti-succ-K7-MAVS antibody. Relative succinylation level was quantified (right panel).E Survival (Kaplan-Meier curve) of WT mice (n = 7) and Sirt5-deficient mice (n = 7) injected intraperitoneally with a high dose of VSV (5 × 107 PFU per mouse) and monitored for 10 d.F ELISA assay of Ifnβ in serum from the WT mice (n = 4) and Sirt5-deficient mice (n = 4) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse)) or PBS control for 24 h. Data information: The graphs represent fold-induction relative to the untreated WT mice. PBS, phosphate buffer saline. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test or two-way ANOVA analysis).G Hematoxylin-and-eosin-stained images of lung sections from mice in F. Scale bar = 50 µm.qPCR analysis of Ifnβ (H), Ifnα1 (I), Ifit1 (J), Isg15 (K), Cxcl10 (L), Cxcl11 (M) mRNA in the lungs of WT or Sirt5-deficient mice (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse) or PBS control for 24 h. Data information: The graphs represent fold-induction relative to the untreated WT mice. PBS, phosphate buffer saline. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test or two-way ANOVA analysis).qPCR analysis of Rig-I (N), and Irf7 (O) mRNA in the lungs of WT or Sirt5-deficient mice (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse) or PBS control for 24 h. Data information: The graphs represent fold-induction relative to the untreated WT mice. PBS, phosphate buffer saline. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test or two-way ANOVA analysis).P qPCR analysis of VSV mRNA in the lungs of WT or Sirt5-deficient mice (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse) or PBS control for 24 h. Data information: The graphs represent fold-induction relative to the untreated WT mice. PBS, phosphate buffer saline. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test or two-way ANOVA analysis)."}
{"words": ["Figure", "1IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "stimulated", "with", "BCR", "-", "ligand", "-", "(", "IgM", ")", "or", "BCR", "-", "ligand", "+", "(", "IgG", ")", "beads", "for", "60", "min", ",", "fixed", "and", "stained", "for", "F", "-", "actin", "(", "top", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "bottom", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "Histograms", "show", "the", "quantifications", "of", "the", "polymerized", "tubulin", "and", "filamentous", "F", "-", "actin", "at", "the", "centrosome", "(", "dashed", "outline", "on", "the", "image", ",", "values", "correspond", "to", "the", "fraction", "of", "fluorescence", "in", "a", "2", "-", "micron", "-", "wide", "area", "around", "the", "centrosome", "relative", "to", "the", "total", "fluorescence", "in", "the", "cell", ")", "and", "the", "total", "amount", "of", "polymerized", "fluorescent", "tubulin", "(", "bottom", "right", ",", "values", "were", "normalized", "with", "respect", "to", "the", "mean", "of", "control", "condition", ")", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "IgM", "(", "BCR", "-", "ligand", "-", ")", ":", "n", "=", "88", ";", "IgG", "(", "BCR", "-", "ligand", "+", ")", ":", "n", "=", "93", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "Percentage", "differences", "of", "centrosomal", "F", "-", "actin", "and", "centrosomal", "microtubule", "fluorescence", "intensities", "in", "cells", "stimulated", "with", "BCR", "-", "ligand", "+", "beads", "with", "respect", "to", "cells", "stimulated", "with", "BCR", "-", "ligand", "-", "beads", ".", "The", "data", "set", "is", "identical", "to", "panel", "(", "B", ")", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "IgM", "(", "BCR", "-", "ligand", "-", ")", ":", "n", "=", "88", ";", "IgG", "(", "BCR", "-", "ligand", "+", ")", ":", "n", "=", "93", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "one", "-", "sample", "t", "-", "test", "(", "i", ".", "e", ".", "comparison", "to", "a", "theoretical", "mean", "of", "\"", "0", "\"", ")", ".", "The", "graph", "shows", "the", "variations", "of", "the", "total", "amount", "of", "tubulin", "per", "cell", "with", "respect", "to", "the", "content", "of", "actin", "at", "the", "centrosome", "in", "an", "XY", "representation", "of", "individual", "measurements", ".", "The", "two", "lines", "correspond", "to", "linear", "regressions", "of", "the", "two", "sets", "of", "data", "relative", "to", "cells", "stimulated", "with", "BCR", "-", "ligand", "+", "(", "activated", "cells", ")", "or", "BCR", "-", "ligand", "-", "(", "resting", "cells", ")", "beads", ".", "IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "fixed", "and", "immuno", "-", "stained", "for", "F", "-", "actin", "(", "red", ")", "and", "microtubules", "(", "green", ")", ".", "Images", "show", "the", "projection", "of", "maximal", "intensity", "of", "three", "confocal", "slices", "spaced", "by", "0", ".", "5", "µm", "apart", "from", "the", "centrosome", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "µm", "(", "0", ".", "5", "µm", "in", "the", "zoomed", "insets", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1IIA1.6 B lymphoma cells were stimulated with BCR-ligand- (IgM) or BCR-ligand+ (IgG) beads for 60 min, fixed and stained for F-actin (top) and α-tubulin (bottom). Scale bar: 3 µm.Histograms show the quantifications of the polymerized tubulin and filamentous F-actin at the centrosome (dashed outline on the image, values correspond to the fraction of fluorescence in a 2-micron-wide area around the centrosome relative to the total fluorescence in the cell) and the total amount of polymerized fluorescent tubulin (bottom right, values were normalized with respect to the mean of control condition). Measurements were pooled from 3 independent experiments; IgM (BCR-ligand-): n= 88; IgG (BCR-ligand+): n= 93. Error bars correspond to standard deviations. P values were calculated with Mann-Whitney test. Scale bar: 2 µm.Percentage differences of centrosomal F-actin and centrosomal microtubule fluorescence intensities in cells stimulated with BCR-ligand+ beads with respect to cells stimulated with BCR-ligand- beads. The data set is identical to panel (B). Measurements were pooled from 3 independent experiments; IgM (BCR-ligand-): n= 88; IgG (BCR-ligand+): n= 93. Error bars correspond to standard deviations. P values were calculated with one-sample t-test (i.e. comparison to a theoretical mean of \"0\").The graph shows the variations of the total amount of tubulin per cell with respect to the content of actin at the centrosome in an XY representation of individual measurements. The two lines correspond to linear regressions of the two sets of data relative to cells stimulated with BCR-ligand+ (activated cells) or BCR-ligand- (resting cells) beads.IIA1.6 B lymphoma cells were fixed and immuno-stained for F-actin (red) and microtubules (green). Images show the projection of maximal intensity of three confocal slices spaced by 0.5 µm apart from the centrosome. Scale bars: 2 µm (0.5 µm in the zoomed insets)."}
{"words": ["Figure", "2IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "treated", "45", "min", "with", "indicated", "inhibitors", "(", "CK666", "at", "25", "µM", ",", "SMIFH2", "at", "25µM", ")", "or", "DMSO", "as", "control", "prior", "to", "being", "fixed", "and", "stained", "for", "α", "-", "tubulin", "(", "left", "column", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "right", "column", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "Histograms", "show", "the", "quantifications", "of", "the", "amount", "of", "polymerized", "fluorescent", "tubulin", "(", "right", ",", "values", "were", "normalized", "with", "respect", "to", "the", "mean", "of", "control", "condition", ")", "and", "filamentous", "actin", "at", "the", "centrosome", "(", "left", ",", "values", "correspond", "to", "the", "fraction", "of", "fluorescence", "in", "a", "2", "-", "micron", "-", "wide", "area", "around", "the", "centrosome", "relative", "to", "the", "total", "fluorescence", "in", "the", "cell", ")", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "DMSO", ":", "n", "=", "91", ",", "CK666", ":", "n", "=", "82", ",", "SMIFH2", ":", "n", "=", "74", ",", "latrunculinA", ":", "n", "=", "96", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Percentage", "differences", "of", "centrosomal", "F", "-", "actin", "and", "microtubule", "fluorescence", "intensities", "in", "cells", "treated", "with", "cytoskeleton", "inhibitors", "in", "comparison", "with", "the", "respective", "densities", "in", "cells", "treated", "with", "DMSO", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "one", "-", "sample", "t", "-", "test", "(", "i", ".", "e", ".", "comparison", "to", "a", "theoretical", "mean", "of", "\"", "0", "\"", ")", ".", "The", "graph", "shows", "the", "same", "measurements", "as", "in", "panel", "(", "B", ")", "in", "an", "XY", "representation", "of", "individual", "measurements", ".", "The", "three", "lines", "correspond", "to", "linear", "regressions", "of", "the", "three", "sets", "of", "data", "relative", "to", "cells", "stimulated", "with", "each", "actin", "drug", ".", "IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "transfected", "to", "transiently", "express", "centrin1", "-", "GFP", "(", "red", ")", "and", "EB3", "-", "mCherry", "(", "green", ")", "and", "video", "-", "recorded", "at", "the", "contact", "site", "with", "the", "glass", "coverslip", "(", "left", ")", "and", "at", "the", "centrosome", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "The", "duration", "of", "EB3", "-", "positive", "comets", "presence", "in", "the", "bottom", "plane", "was", "measured", "in", "DMSO", "and", "CK666", "treated", "cells", "(", "left", ")", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "deviations", ".", "The", "number", "of", "EB3", "-", "positive", "comets", "exiting", "the", "a", "2", "-", "µm", "wide", "centrosomal", "area", "was", "also", "compared", "between", "the", "two", "conditions", "(", "right", ")", ".", "In", "both", "cases", "P", "values", "were", "calculated", "with", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "transfected", "to", "transiently", "express", "centrin1", "-", "VCA", "-", "GFP", "(", "bottom", ")", "or", "centrin1", "-", "GFP", "(", "top", ")", "as", "control", "prior", "to", "be", "fixed", "and", "stained", "for", "α", "-", "tubulin", "(", "left", "column", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "middle", "column", ")", ".", "The", "GFP", "signal", "of", "centrin1", "or", "centrin1", "-", "VCA", "is", "shown", "in", "the", "right", "column", "to", "illustrate", "the", "proper", "centrosome", "targeting", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "Histograms", "show", "the", "quantifications", "of", "the", "amount", "of", "polymerized", "fluorescent", "tubulin", "(", "right", ")", "and", "filamentous", "actin", "at", "the", "centrosome", "(", "left", ")", ".", "Values", "correspond", "to", "the", "fraction", "of", "fluorescence", "in", "a", "2", "-", "micron", "-", "wide", "area", "around", "the", "centrosome", "relative", "to", "the", "total", "fluorescence", "in", "the", "cell", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "centrin1", "-", "GFP", ":", "n", "=", "88", ",", "centrin1", "-", "VCA", "-", "GFP", ":", "n", "=", "87", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Percentage", "differences", "of", "F", "-", "actin", "and", "microtubule", "fluorescence", "intensities", "at", "the", "centrosome", "were", "compared", "in", "cells", "transfected", "either", "with", "centrin1", "-", "VCA", "-", "GFP", "or", "with", "centrin1", "-", "GFP", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "one", "-", "sample", "t", "-", "test", "(", "i", ".", "e", ".", "comparison", "to", "a", "theoretical", "mean", "of", "\"", "0", "\"", ")", ".", "The", "graph", "shows", "the", "variations", "of", "the", "total", "amount", "of", "tubulin", "per", "cell", "with", "respect", "to", "the", "content", "of", "actin", "at", "the", "centrosome", ".", "The", "two", "lines", "correspond", "to", "linear", "regressions", "of", "the", "two", "sets", "of", "data", "relative", "to", "cells", "transfected", "with", "centrin1", "-", "VCA", "-", "GFP", "or", "centrin1", "-", "GFP", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2IIA1.6 B lymphoma cells were treated 45 min with indicated inhibitors (CK666 at 25 µM, SMIFH2 at 25µM) or DMSO as control prior to being fixed and stained for α-tubulin (left column) and F-actin (right column). Scale bar: 3 µm.Histograms show the quantifications of the amount of polymerized fluorescent tubulin (right, values were normalized with respect to the mean of control condition) and filamentous actin at the centrosome (left, values correspond to the fraction of fluorescence in a 2-micron-wide area around the centrosome relative to the total fluorescence in the cell). Measurements were pooled from 3 independent experiments; DMSO: n= 91, CK666: n= 82, SMIFH2: n= 74, latrunculinA: n= 96. Error bars correspond to standard deviations. P values were calculated with Mann-Whitney test.Percentage differences of centrosomal F-actin and microtubule fluorescence intensities in cells treated with cytoskeleton inhibitors in comparison with the respective densities in cells treated with DMSO. Errors bars represent standard deviations. P values were calculated with one-sample t-test (i.e. comparison to a theoretical mean of \"0\").The graph shows the same measurements as in panel (B) in an XY representation of individual measurements. The three lines correspond to linear regressions of the three sets of data relative to cells stimulated with each actin drug.IIA1.6 B lymphoma cells were transfected to transiently express centrin1-GFP (red) and EB3-mCherry (green) and video-recorded at the contact site with the glass coverslip (left) and at the centrosome (right). Scale bar: 3 µm.The duration of EB3-positive comets presence in the bottom plane was measured in DMSO and CK666 treated cells (left). Error bars correspond to standard deviations. The number of EB3-positive comets exiting the a 2-µm wide centrosomal area was also compared between the two conditions (right). In both cases P values were calculated with Mann-Whitney test.IIA1.6 B lymphoma cells were transfected to transiently express centrin1-VCA-GFP (bottom) or centrin1-GFP (top) as control prior to be fixed and stained for α-tubulin (left column) and F-actin (middle column). The GFP signal of centrin1 or centrin1-VCA is shown in the right column to illustrate the proper centrosome targeting. Scale bar: 3 µm.Histograms show the quantifications of the amount of polymerized fluorescent tubulin (right) and filamentous actin at the centrosome (left). Values correspond to the fraction of fluorescence in a 2-micron-wide area around the centrosome relative to the total fluorescence in the cell. Measurements were pooled from 3 independent experiments; centrin1-GFP: n= 88, centrin1-VCA-GFP: n= 87. Errors bars represent standard deviations. P values were calculated with Mann-Whitney test.Percentage differences of F-actin and microtubule fluorescence intensities at the centrosome were compared in cells transfected either with centrin1-VCA-GFP or with centrin1-GFP. Errors bars represent standard deviations. P values were calculated with one-sample t-test (i.e. comparison to a theoretical mean of \"0\").The graph shows the variations of the total amount of tubulin per cell with respect to the content of actin at the centrosome. The two lines correspond to linear regressions of the two sets of data relative to cells transfected with centrin1-VCA-GFP or centrin1-GFP."}
{"words": ["Figure", "3Two", "sets", "of", "representative", "images", "showing", "fluorescent", "microtubules", "and", "actin", "filaments", "assembled", "from", "isolated", "centrosomes", ".", "Centrosomes", "were", "isolated", "from", "Jurkat", "cells", "expressing", "centrin1", "-", "GFP", ".", "Upper", "and", "lower", "lines", "show", "actin", "filaments", "and", "microtubules", "radiating", "from", "two", "distinct", "centrosomes", "with", "low", "(", "top", ")", "and", "high", "(", "bottom", ")", "densities", "of", "actin", "filaments", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "centrosome", "relative", "to", "the", "density", "of", "actin", "filaments", ".", "Inset", "shows", "actin", "filaments", "at", "the", "centrosome", "with", "a", "FIRE", "look", "-", "up", "table", "and", "a", "20", "µm", "-", "wide", "circle", "in", "which", "actin", "fluorescence", "intensity", "is", "measured", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "5", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "50", ".", "Microtubules", "(", "top", "line", ")", "and", "actin", "filaments", "(", "bottom", "line", ")", "assembly", "from", "isolated", "centrosomes", "in", "the", "presence", "of", "increasing", "concentration", "of", "monomeric", "actin", "(", "from", "left", "to", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "centrosome", "in", "response", "to", "increasing", "concentrations", "of", "monomeric", "actin", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "2", "independent", "experiments", ";", "0", "µM", ":", "n", "=", "21", ";", "0", ".", "3", "µM", ":", "n", "=", "17", ";", "0", ".", "5", "µM", ":", "n", "=", "17", ";", "1", ".", "0", "µM", ":", "n", "=", "17", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "001", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "The", "image", "shows", "the", "density", "of", "actin", "filaments", "(", "in", "the", "presence", "of", "1µM", "of", "actin", "monomers", ")", "at", "the", "centrosome", "color", "-", "coded", "with", "the", "FIRE", "look", "-", "up", "table", "and", "the", "definition", "of", "central", ",", "peripheral", "and", "distal", "regions", "corresponding", "to", "decreasing", "concentrations", "of", "actin", "filaments", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "the", "measurements", "of", "microtubule", "growth", "rate", "in", "each", "region", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ":", "central", "zone", ":", "n", "=", "58", ",", "peripheral", ":", "n", "=", "104", ",", "outside", ":", "n", "=", "61", ";", "n", ".", "s", ".", "means", "no", "statistical", "difference", "between", "the", "data", "set", "according", "to", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "The", "graphs", "show", "the", "various", "intensities", "of", "centrosome", "immuno", "-", "staining", "with", "antibodies", "against", "gamma", "-", "tubulin", "on", "the", "same", "coverslip", "depending", "on", "the", "presence", "/", "absence", "of", "actin", "filaments", "(", "left", ")", "or", "on", "the", "amount", "of", "actin", "filaments", "(", "right", ")", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Left", "graph", ":", "without", "actin", "n", "=", "69", ",", "with", "actin", "n", "=", "26", ",", "right", "graph", "n", "=", "26", ".", "N", ".", "s", ".", "means", "no", "statistical", "difference", "between", "the", "data", "set", "according", "to", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Two sets of representative images showing fluorescent microtubules and actin filaments assembled from isolated centrosomes. Centrosomes were isolated from Jurkat cells expressing centrin1-GFP. Upper and lower lines show actin filaments and microtubules radiating from two distinct centrosomes with low (top) and high (bottom) densities of actin filaments. Scale bars: 10 μm.The graph shows the number of microtubules per centrosome relative to the density of actin filaments. Inset shows actin filaments at the centrosome with a FIRE look-up table and a 20 µm-wide circle in which actin fluorescence intensity is measured. Measurements were pooled from 5 independent experiments; n= 50.Microtubules (top line) and actin filaments (bottom line) assembly from isolated centrosomes in the presence of increasing concentration of monomeric actin (from left to right). Scale bar: 20 μm.The graph shows the number of microtubules per centrosome in response to increasing concentrations of monomeric actin. Data were pooled from 2 independent experiments; 0 µM: n=21; 0.3 µM: n=17; 0.5 µM: n=17; 1.0 µM: n=17. ****:P<0.001 Mann-Whitney test.The image shows the density of actin filaments (in the presence of 1µM of actin monomers) at the centrosome color-coded with the FIRE look-up table and the definition of central, peripheral and distal regions corresponding to decreasing concentrations of actin filaments. Scale bar: 20 μm. The graph shows the measurements of microtubule growth rate in each region. Data were pooled from 3 independent experiments: central zone: n=58, peripheral: n=104, outside: n=61; n. s. means no statistical difference between the data set according to Mann-Whitney test.The graphs show the various intensities of centrosome immuno-staining with antibodies against gamma-tubulin on the same coverslip depending on the presence/absence of actin filaments (left) or on the amount of actin filaments (right). Data were pooled from 3 independent experiments. Left graph: without actin n=69, with actin n=26, right graph n=26. N.s. means no statistical difference between the data set according to Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "4Schematic", "illustration", "of", "the", "first", "dynamic", "assay", ":", "sequential", "addition", "of", "tubulin", "followed", "by", "tubulin", "and", "actin", "on", "isolated", "centrosomes", ".", "Representative", "images", "showing", "microtubules", "(", "top", "line", ")", "and", "the", "merged", "images", "of", "actin", "and", "microtubules", "(", "bottom", "line", ")", "for", "the", "two", "steps", "of", "the", "assay", ";", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "only", "(", "left", "column", ")", "and", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "and", "actin", "(", "right", "column", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "differences", "in", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "centrosome", "between", "the", "two", "stages", "of", "the", "experiment", "described", "above", "on", "centrosomes", "capable", "(", "first", "condition", ")", ",", "or", "not", "(", "second", "condition", ")", ",", "to", "grow", "actin", "filaments", ".", "Data", "were", "collected", "from", "a", "single", "experiment", ";", "asters", "without", "actin", "filaments", ":", "n", "=", "29", ";", "asters", "with", "actin", "filaments", ":", "n", "=", "13", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Schematic", "illustration", "of", "the", "second", "dynamic", "assay", ":", "tubulin", "is", "added", "to", "measure", "centrosome", "nucleation", "capacity", "and", "washed", "out", ".", "Then", "actin", "is", "added", "followed", "by", "actin", "and", "tubulin", ".", "Representative", "images", "showing", "microtubules", "(", "top", "line", ")", "and", "the", "merged", "images", "of", "actin", "and", "microtubule", "(", "bottom", "line", ")", "during", "the", "three", "steps", "of", "the", "assay", ";", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "only", "(", "left", "column", ")", ",", "in", "the", "absence", "of", "tubulin", "and", "presence", "of", "actin", "(", "middle", "column", ")", "and", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "and", "actin", "(", "right", "column", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Arrowheads", "indicate", "microtubules", "unable", "to", "re", "-", "grow", "after", "assembly", "of", "actin", "filaments", ".", "Quantification", "of", "the", "differences", "in", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "centrosome", "between", "the", "first", "and", "last", "steps", "of", "the", "experiment", "described", "above", "(", "panels", "D", "and", "E", ")", "on", "centrosomes", "capable", "(", "first", "condition", ")", ",", "or", "not", "(", "second", "condition", ")", ",", "to", "grow", "actin", "filaments", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "2", "independent", "experiments", ";", "asters", "without", "actin", "filaments", ":", "n", "=", "24", ";", "asters", "with", "actin", "filaments", ":", "n", "=", "13", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "001", "Student", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Schematic illustration of the first dynamic assay: sequential addition of tubulin followed by tubulin and actin on isolated centrosomes. Representative images showing microtubules (top line) and the merged images of actin and microtubules (bottom line) for the two steps of the assay; in the presence of tubulin only (left column) and in the presence of tubulin and actin (right column). Scale bar: 10 µm. Quantification of the differences in the number of microtubules per centrosome between the two stages of the experiment described above on centrosomes capable (first condition), or not (second condition), to grow actin filaments. Data were collected from a single experiment; asters without actin filaments: n= 29; asters with actin filaments: n= 13. Data were analyzed using Mann-Whitney test.Schematic illustration of the second dynamic assay: tubulin is added to measure centrosome nucleation capacity and washed out. Then actin is added followed by actin and tubulin. Representative images showing microtubules (top line) and the merged images of actin and microtubule (bottom line) during the three steps of the assay; in the presence of tubulin only (left column), in the absence of tubulin and presence of actin (middle column) and in the presence of tubulin and actin (right column). Scale bar:10 µm. Arrowheads indicate microtubules unable to re-grow after assembly of actin filaments. Quantification of the differences in the number of microtubules per centrosome between the first and last steps of the experiment described above (panels D and E) on centrosomes capable (first condition), or not (second condition), to grow actin filaments. Data were pooled from 2 independent experiments; asters without actin filaments: n= 24; asters with actin filaments: n= 13. ****:P<0.001 Student t-test."}
{"words": ["Figure", "5Representative", "images", "of", "microtubules", "(", "top", ")", "and", "actin", "filaments", "(", "bottom", ")", "growth", "from", "micropatterns", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "Schematic", "illustration", "of", "the", "assay", "on", "micropatterned", "substrate", ".", "Tubulin", "was", "first", "added", "alone", "to", "measure", "the", "nucleation", "capacity", "of", "each", "micropattern", ",", "and", "then", "washed", "out", ".", "Later", "on", ",", "actin", "was", "added", "followed", "by", "actin", "and", "tubulin", ".", "Finally", ",", "actin", "was", "rinsed", "out", "and", "gelsolin", "was", "added", "to", "fully", "disassemble", "actin", "filaments", ".", "Representative", "images", "showing", "microtubules", "(", "top", "line", ")", "and", "the", "merged", "images", "of", "actin", "and", "microtubules", "(", "bottom", "line", ")", "during", "the", "four", "steps", "of", "the", "assay", ";", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "only", ",", "in", "the", "absence", "of", "tubulin", "and", "presence", "of", "actin", ",", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "and", "actin", ",", "and", "finally", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "and", "gelsolin", "but", "in", "the", "absence", "of", "actin", "filaments", "(", "from", "left", "to", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "micropattern", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "only", "(", "left", ")", ",", "actin", "and", "tubulin", "(", "middle", ")", "and", "tubulin", "only", "after", "actin", "filaments", "disassembly", "(", "right", ")", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "2", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "133", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "001", "Student", "t", "-", "test", ".", "The", "graph", "shows", "the", "same", "measurements", "as", "in", "panel", "(", "E", ")", "in", "an", "XY", "representation", "of", "individual", "measurements", ".", "It", "illustrates", "the", "differences", "in", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "micropattern", "between", "the", "first", "to", "the", "second", "step", "(", "tubulin", "only", "versus", "actin", "and", "tubulin", "together", ")", "with", "respect", "to", "the", "density", "of", "actin", "filaments", "per", "micropattern", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative images of microtubules (top) and actin filaments (bottom) growth from micropatterns. Scale bars: 20 μm.Schematic illustration of the assay on micropatterned substrate. Tubulin was first added alone to measure the nucleation capacity of each micropattern, and then washed out. Later on, actin was added followed by actin and tubulin. Finally, actin was rinsed out and gelsolin was added to fully disassemble actin filaments. Representative images showing microtubules (top line) and the merged images of actin and microtubules (bottom line) during the four steps of the assay; in the presence of tubulin only, in the absence of tubulin and presence of actin, in the presence of tubulin and actin, and finally in the presence of tubulin and gelsolin but in the absence of actin filaments (from left to right). Scale bar: 10 μm.Quantification of the number of microtubules per micropattern in the presence of tubulin only (left), actin and tubulin (middle) and tubulin only after actin filaments disassembly (right). Data were pooled from 2 independent experiments; n= 133. ****:P<0.001 Student t-test. The graph shows the same measurements as in panel (E) in an XY representation of individual measurements. It illustrates the differences in the number of microtubules per micropattern between the first to the second step (tubulin only versus actin and tubulin together) with respect to the density of actin filaments per micropattern."}
{"words": ["Figure", "6RPE1", "cells", "stably", "expressing", "centrin1", "-", "GFP", "were", "plated", "for", "3", "h", "on", "coverslips", "coated", "with", "different", "ratios", "(", "100", ":", "0", ";", "50", ":", "50", "or", "1", ":", "99", ")", "of", "fibronectin", "and", "PLL", "-", "PEG", "prior", "to", "fixation", "and", "staining", "for", "F", "-", "actin", "(", "top", "line", "and", "magnified", "views", "around", "centrosome", "below", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", "and", "2", "µm", ",", "respectively", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "bottom", "line", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ")", ".", "IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "plated", "for", "60", "min", "on", "poly", "-", "L", "-", "lysine", ",", "fibronectin", "or", "ICAM", "-", "1", "coated", "cover", "slides", "prior", "to", "be", "fixed", "and", "stained", "for", "F", "-", "actin", "(", "top", "line", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "bottom", "line", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "area", "occupied", "by", "RPE1", "cells", "on", "the", "substrate", "(", "top", "left", ")", ",", "F", "-", "actin", "content", "at", "the", "centrosome", "(", "top", "right", ")", "polymerized", "tubulin", "at", "the", "centrosome", "(", "bottom", "left", ")", "and", "in", "the", "entire", "cell", "(", "bottom", "right", ")", "for", "the", "three", "conditions", "of", "cell", "adhesion", "described", "in", "(", "B", ")", ".", "Measurements", "came", "from", "3", "independent", "experiments", "with", "more", "than", "60", "analyzed", "cells", "in", "each", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "F", "-", "actin", "and", "microtubule", "contents", "were", "compared", "using", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "and", "variations", "of", "the", "cell", "area", "were", "compared", "using", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Quantification", "of", "the", "area", "occupied", "by", "B", "lymphoma", "cells", "on", "the", "substrate", "(", "top", "left", ")", ",", "F", "-", "actin", "content", "at", "the", "centrosome", "(", "top", "right", ")", "polymerized", "tubulin", "at", "the", "centrosome", "(", "bottom", "left", ")", "and", "in", "the", "entire", "cell", "(", "bottom", "right", ")", "for", "the", "three", "conditions", "of", "cell", "adhesion", "described", "in", "(", "D", ")", ".", "Measurements", "came", "from", "3", "independent", "experiments", "with", "more", "than", "80", "analyzed", "cells", "in", "each", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "F", "-", "actin", "and", "microtubule", "contents", "were", "compared", "using", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "and", "variations", "of", "the", "cell", "area", "were", "compared", "using", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6RPE1 cells stably expressing centrin1-GFP were plated for 3 h on coverslips coated with different ratios (100:0; 50:50 or 1:99) of fibronectin and PLL-PEG prior to fixation and staining for F-actin (top line and magnified views around centrosome below. Scale bars: 10 µm and 2 µm, respectively) and α-tubulin (bottom line. Scale bar: 10 µm).IIA1.6 B lymphoma cells were plated for 60 min on poly-L-lysine, fibronectin or ICAM-1 coated cover slides prior to be fixed and stained for F-actin (top line) and α-tubulin (bottom line). Scale bar: 3 µm.Quantification of the area occupied by RPE1 cells on the substrate (top left), F-actin content at the centrosome (top right) polymerized tubulin at the centrosome (bottom left) and in the entire cell (bottom right) for the three conditions of cell adhesion described in (B). Measurements came from 3 independent experiments with more than 60 analyzed cells in each. Errors bars represent standard deviations. F-actin and microtubule contents were compared using Mann-Whitney test, and variations of the cell area were compared using unpaired t-test.Quantification of the area occupied by B lymphoma cells on the substrate (top left), F-actin content at the centrosome (top right) polymerized tubulin at the centrosome (bottom left) and in the entire cell (bottom right) for the three conditions of cell adhesion described in (D). Measurements came from 3 independent experiments with more than 80 analyzed cells in each. Errors bars represent standard deviations. F-actin and microtubule contents were compared using Mann-Whitney test, and variations of the cell area were compared using unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "1B", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "parkin", "(", "green", ")", ",", "OCT", "-", "DsRed2", "(", "red", ")", "and", "CFP", "-", "Drp1K38E", "were", "left", "untreated", "(", "untreated", ")", "or", "treated", "for", "2", "h", "with", "10", "µM", "CCCP", "(", "CCCP", ")", ",", "then", "fixed", "and", "stained", "for", "TOM20", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "30", "µm", ".", "C", "Cells", "prepared", "as", "in", "(", "B", ")", "were", "treated", "with", "50", "µM", "antimycin", "A", "for", "2", "h", ".", "Arrows", "indicate", "OCT", "-", "DsRed2", "-", "positive", "/", "TOM20", "-", "negative", "MDVs", "that", "colocalize", "with", "GFP", "-", "parkin", ",", "while", "circles", "indicate", "MDVs", "that", "are", "parkin", "-", "negative", ".", "Arrowheads", "indicate", "“", "nascent", "”", "vesicles", ",", "adjacent", "to", "mitochondria", ",", "exhibiting", "cargo", "selectivity", "and", "parkin", "recruitment", ".", "Open", "arrowheads", "indicate", "parkin", "-", "negative", "MDVs", "containing", "the", "reciprocal", "cargo", "(", "TOM20", "-", "positive", "/", "OCT", "-", "DsRed2", "-", "negative", ")", ".", "Cell", "boundaries", "are", "delineated", "in", "the", "GFP", "-", "parkin", "single", "-", "channel", "image", ".", "Scale", "bars", ",", "30", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B HeLa cells expressing GFP-parkin (green), OCT-DsRed2 (red) and CFP-Drp1K38E were left untreated (untreated) or treated for 2 h with 10 µM CCCP (CCCP), then fixed and stained for TOM20 (blue). Scale bars, 30 µm.C Cells prepared as in (B) were treated with 50 µM antimycin A for 2 h. Arrows indicate OCT-DsRed2-positive/TOM20-negative MDVs that colocalize with GFP-parkin, while circles indicate MDVs that are parkin-negative. Arrowheads indicate “nascent” vesicles, adjacent to mitochondria, exhibiting cargo selectivity and parkin recruitment. Open arrowheads indicate parkin-negative MDVs containing the reciprocal cargo (TOM20-positive/OCT-DsRed2-negative). Cell boundaries are delineated in the GFP-parkin single-channel image. Scale bars, 30 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "OCTμDsRed2μpositive", "/", "TOM20μnegative", "vesicles", "in", "cells", "expressing", "GFP", ",", "GFPμparkinWT", ",", "GFPμparkinR42P", ",", "GFPμparkinK211N", ",", "or", "GFPμparkinC431F", ",", "treated", "with", "or", "without", "antimycin", "A", "(", "anti", "A", ")", "as", "in", "(", "C", ")", ";", "both", "the", "total", "number", "(", "white", "bars", ")", "and", "the", "number", "colocalizing", "with", "GFPμparkin", "(", "gray", "bars", ")", "are", "indicated", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Pμvalues", "are", "given", "first", "for", "GFPμ", "/", "GFPμparkinμpositive", "vesicles", ",", "then", "for", "total", "vesicle", "number", "(", "n", "=", "49", "-", "68", "cells", "in", "2", "-", "3", "experiments", ")", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "C", "HeLa", "cells", "expressing", "various", "GFP", "-", "parkin", "mutant", "contructs", "(", "green", ")", ",", "pOCT", "-", "DsRed2", "(", "red", ")", "and", "CFP", "-", "Drp1K38E", "were", "treated", "with", "50", "µM", "antimycin", "A", "for", "2", "h", ",", "then", "fixed", "and", "immunostained", "against", "TOM20", ".", "Arrows", "indicate", "matrix", "-", "positive", "/", "TOM20", "-", "negative", "structures", "colocalizing", "with", "GFP", "-", "parkin", ".", "Scale", "bars", ",", "30", "µm", ".", "D", "Immunoblot", "of", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "various", "GFP", "-", "parkin", "constructs", ",", "treated", "with", "50", "µM", "antimycin", "A", "(", "anti", "A", ",", "+", ")", "or", "DMSO", "(", "-", ")", "for", "2", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Quantification of the number of OCTμDsRed2μpositive/TOM20μnegative vesicles in cells expressing GFP, GFPμparkinWT, GFPμparkinR42P, GFPμparkinK211N, or GFPμparkinC431F, treated with or without antimycin A (anti A) as in (C); both the total number (white bars) and the number colocalizing with GFPμparkin (gray bars) are indicated. Bars represent the mean ± s.e.m. Pμvalues are given first for GFPμ/GFPμparkinμpositive vesicles, then for total vesicle number (n = 49-68 cells in 2-3 experiments); ns, not significant; **P < 0.01; ***P < 0.001).C HeLa cells expressing various GFP-parkin mutant contructs (green), pOCT-DsRed2 (red) and CFP-Drp1K38E were treated with 50 µM antimycin A for 2 h, then fixed and immunostained against TOM20. Arrows indicate matrix-positive/TOM20-negative structures colocalizing with GFP-parkin. Scale bars, 30 µm.D Immunoblot of whole-cell lysates of HeLa cells expressing various GFP-parkin constructs, treated with 50 µM antimycin A (anti A, +) or DMSO (-) for 2 h."}
{"words": ["Figure", "3A", "Representative", "immunoblot", "of", "whole", "‐", "cell", "lysates", "from", "U2OS", ":", "GFP", "and", "U2OS", ":", "GFP", "‐", "parkin", "cells", "transfected", "with", "non", "‐", "targeting", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "Drp1", "(", "siDrp1", ")", ".", "B", "U2OS", ":", "GFP", "−", "parkin", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "Drp1", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "upper", "panels", ")", "or", "25", "μM", "antimycin", "A", "(", "anti", "A", ",", "lower", "panels", ")", "for", "90", "min", ",", "then", "fixed", "and", "immunostained", "against", "PDH", "(", "red", ")", "and", "TOM20", "(", "blue", ")", ".", "PDHE2", "/", "E3", "bp", "−", "positive", "/", "TOM20", "−", "negative", "MDVs", "colocalizing", "with", "GFP", "−", "parkin", "(", "arrows", ")", "or", "not", "(", "circles", ")", "are", "indicated", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", "(", "first", "panels", "on", "left", ")", "and", "2", "μm", ".", "C", "Quantification", "of", "PDH", "−", "positive", "/", "TOM20", "−", "negative", "vesicles", "in", "U2OS", ":", "GFP", "and", "U2OS", ":", "GFP", "−", "parkin", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", ",", "treated", "with", "DMSO", "or", "antimycin", "A", "(", "anti", "A", ")", "as", "in", "(", "B", ")", ";", "both", "the", "total", "number", "(", "white", "bars", ")", "and", "the", "number", "colocalizing", "with", "GFP", "−", "parkin", "(", "gray", "bars", ")", "are", "indicated", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "−", "values", "are", "given", "first", "for", "GFP", "−", "/", "GFP", "−", "parkin", "−", "positive", "vesicles", ",", "then", "for", "total", "vesicle", "number", "(", "n", "=", "48", "-", "85", "cells", "in", "2", "-", "3", "experiments", ")", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "D", "5", "μm", "‐", "long", "profile", "of", "the", "parkin", "‐", "positive", "vesicle", "and", "adjacent", "mitochondrial", "tubule", "depicted", "in", "the", "antimycin", "A", "‐", "treated", "cell", "from", "(", "B", ")", "(", "left", ")", ".", "Increasing", "position", "values", "on", "the", "x", "‐", "axis", "of", "the", "fluorescence", "intensity", "plot", "(", "right", ")", "correspond", "to", "moving", "from", "the", "top", "to", "the", "bottom", "of", "the", "profile", ".", "*", "MDV", "indicated", "by", "an", "arrow", "in", "(", "B", ")", ".", "E", "Quantification", "of", "the", "distance", "between", "the", "centres", "of", "GFP", "−", "parkin", "−", "negative", "(", "black", "bar", ")", "or", "−", "positive", "(", "gray", "bar", ")", "vesicles", "and", "the", "edge", "of", "the", "nearest", "mitochondrial", "tubule", "for", "the", "vesicles", "quantified", "in", "antimycin", "A", "−", "treated", "U2OS", ":", "GFP", "−", "parkin", "cells", "transfected", "with", "siDrp1", "in", "(", "C", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "−", "test", ")", ".", "F", "U2OS", ":", "GFP", "‐", "parkin", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "Drp1", "(", "siDrp1", ")", "were", "treated", "with", "25", "μM", "antimycin", "A", "for", "90", "min", "prior", "to", "fixation", ".", "Samples", "were", "immunostained", "against", "TOM20", "(", "blue", ")", "and", "the", "indicated", "mitochondrial", "marker", "(", "red", ")", ".", "TOM20", "‐", "negative", "MDVs", "containing", "the", "specified", "cargo", "and", "colocalizing", "with", "GFP", "‐", "parkin", "(", "arrows", ")", "or", "not", "(", "circles", ")", "are", "indicated", ".", "Arrowheads", "show", "lack", "of", "colocalization", "between", "GFP", "‐", "parkin", "and", "the", "indicated", "mitochondrial", "marker", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", "(", "first", "two", "columns", "of", "panels", ")", "and", "2", "μm", "(", "remaining", "columns", "of", "panels", ")", ".", "G", "Quantification", "of", "TOM20", "−", "negative", "structures", "that", "stained", "positively", "for", "the", "indicated", "cargo", "in", "U2OS", ":", "GFP", "(", "GFP", ")", "and", "U2OS", ":", "GFP", "−", "parkin", "(", "GFP", "−", "parkin", ")", "cells", ",", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "Drp1", ",", "treated", "with", "antimycin", "A", "(", "anti", "A", ")", ";", "both", "the", "total", "number", "(", "white", "bars", ")", "and", "the", "number", "colocalizing", "with", "GFP", "−", "parkin", "(", "gray", "bars", ")", "are", "indicated", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "−", "values", "are", "given", "first", "for", "GFP", "−", "/", "GFP", "−", "parkin", "−", "positive", "vesicles", ",", "then", "for", "total", "vesicle", "number", "(", "n", "=", "24", "-", "59", "cells", "in", "two", "experiments", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Representative immunoblot of whole‐cell lysates from U2OS:GFP and U2OS:GFP‐parkin cells transfected with non‐targeting siRNA or siRNA targeting Drp1 (siDrp1).B U2OS:GFP−parkin cells transfected with siRNA targeting Drp1 were treated with DMSO (upper panels) or 25 μM antimycin A (anti A, lower panels) for 90 min, then fixed and immunostained against PDH (red) and TOM20 (blue). PDHE2/E3 bp−positive/TOM20−negative MDVs colocalizing with GFP−parkin (arrows) or not (circles) are indicated. Scale bars, 20 μm (first panels on left) and 2 μm.C Quantification of PDH−positive/TOM20−negative vesicles in U2OS:GFP and U2OS:GFP−parkin cells transfected with the indicated siRNA, treated with DMSO or antimycin A (anti A) as in (B); both the total number (white bars) and the number colocalizing with GFP−parkin (gray bars) are indicated. Bars represent the mean ± s.e.m. P−values are given first for GFP−/GFP−parkin−positive vesicles, then for total vesicle number (n = 48-85 cells in 2-3 experiments); ns, not significant; ***P < 0.001).D 5 μm‐long profile of the parkin‐positive vesicle and adjacent mitochondrial tubule depicted in the antimycin A‐treated cell from (B) (left). Increasing position values on the x‐axis of the fluorescence intensity plot (right) correspond to moving from the top to the bottom of the profile. *MDV indicated by an arrow in (B).E Quantification of the distance between the centres of GFP−parkin−negative (black bar) or −positive (gray bar) vesicles and the edge of the nearest mitochondrial tubule for the vesicles quantified in antimycin A−treated U2OS:GFP−parkin cells transfected with siDrp1 in (C). Error bars represent the mean ± s.e.m.; *P < 0.05 (obtained by Student's t−test).F U2OS:GFP‐parkin cells transfected with siRNA targeting Drp1 (siDrp1) were treated with 25 μM antimycin A for 90 min prior to fixation. Samples were immunostained against TOM20 (blue) and the indicated mitochondrial marker (red). TOM20‐negative MDVs containing the specified cargo and colocalizing with GFP‐parkin (arrows) or not (circles) are indicated. Arrowheads show lack of colocalization between GFP‐parkin and the indicated mitochondrial marker. Scale bars, 20 μm (first two columns of panels) and 2 μm (remaining columns of panels).G Quantification of TOM20−negative structures that stained positively for the indicated cargo in U2OS:GFP (GFP) and U2OS:GFP−parkin (GFP−parkin) cells, transfected with siRNA targeting Drp1, treated with antimycin A (anti A); both the total number (white bars) and the number colocalizing with GFP−parkin (gray bars) are indicated. Error bars represent the mean ± s.e.m. P−values are given first for GFP−/GFP−parkin−positive vesicles, then for total vesicle number (n = 24-59 cells in two experiments; ns, not significant; ***P < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "4AHeLa", "cells", ",", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "Drp1", "and", "GFP", "‐", "parkin", "(", "green", ")", ",", "were", "treated", "with", "25", "μM", "antimycin", "A", "for", "90", "min", "following", "a", "30", "‐", "min", "pretreatment", "with", "50", "nM", "bafilomycin", "A1", ",", "then", "fixed", "and", "immunostained", "against", "PDH", "E2", "/", "E3", "bp", "(", "red", ")", "and", "TOM20", "(", "blue", ")", ".", "PDH", "E2", "/", "E3", "bp", "‐", "positive", "/", "TOM20", "‐", "negative", "MDVs", "colocalizing", "with", "GFP", "‐", "parkin", "(", "arrows", ")", "or", "not", "(", "circles", ")", "are", "indicated", ".", "Scale", "bar", ",", "30", "μm", ".", "B", "Quantification", "of", "PDH", "E2", "/", "E3bp", "‐", "positive", "/", "TOM20", "‐", "negative", "vesicles", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "antimycin", "A", "in", "the", "presence", "of", "the", "lysosomal", "inhibitors", "bafilomycin", "A1", "or", "pepstatin", "A", "and", "E", "‐", "64d", ";", "both", "total", "number", "(", "white", "bars", ")", "and", "the", "number", "colocalizing", "with", "GFP", "‐", "parkin", "(", "gray", "bars", ")", "are", "indicated", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "‐", "values", "are", "given", "for", "total", "vesicle", "number", "(", "n", "=", "19", "to", "120", "cells", "in", "2", "-", "3", "experiments", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "CHeLa", "cells", ",", "transfected", "with", "GFP", "‐", "parkin", "(", "green", ")", "and", "siRNA", "targeting", "Drp1", "and", "Atg5", ",", "were", "treated", "with", "25", "μM", "antimycin", "A", "for", "90", "min", ",", "then", "fixed", ",", "immunostained", "for", "PDH", "(", "red", ")", "and", "TOM20", "(", "blue", ")", ",", "and", "counterstained", "for", "Hoescht", "(", "gray", ")", ".", "PDH", "E2", "/", "E3bp", "bp", "‐", "positive", "/", "TOM20", "‐", "negative", "MDVs", "colocalizing", "with", "GFP", "‐", "parkin", "(", "arrows", ")", "or", "not", "(", "circles", ")", "are", "indicated", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "D", "Quantification", "of", "PDH", "E2", "/", "E3", "bp", "‐", "positive", "/", "TOM20", "‐", "negative", "vesicles", "from", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", ";", "both", "the", "total", "number", "(", "white", "bars", ")", "and", "the", "number", "colocalizing", "with", "GFP", "‐", "parkin", "(", "gray", "bars", ")", "are", "indicated", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "‐", "values", "are", "given", "for", "the", "total", "vesicle", "number", "(", "n", "=", "42", "-", "64", "cells", "in", "2", "-", "3", "experiments", ")", ";", "ns", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4AHeLa cells, transfected with siRNA targeting Drp1 and GFP‐parkin (green), were treated with 25 μM antimycin A for 90 min following a 30‐min pretreatment with 50 nM bafilomycin A1, then fixed and immunostained against PDH E2/E3 bp (red) and TOM20 (blue). PDH E2/E3 bp‐positive/TOM20‐negative MDVs colocalizing with GFP‐parkin (arrows) or not (circles) are indicated. Scale bar, 30 μm.B Quantification of PDH E2/E3bp‐positive/TOM20‐negative vesicles in HeLa cells treated with antimycin A in the presence of the lysosomal inhibitors bafilomycin A1 or pepstatin A and E‐64d; both total number (white bars) and the number colocalizing with GFP‐parkin (gray bars) are indicated. Bars represent the mean ± s.e.m. P‐values are given for total vesicle number (n = 19 to 120 cells in 2-3 experiments; **P < 0.01; ***P < 0.001).CHeLa cells, transfected with GFP‐parkin (green) and siRNA targeting Drp1 and Atg5, were treated with 25 μM antimycin A for 90 min, then fixed, immunostained for PDH (red) and TOM20 (blue), and counterstained for Hoescht (gray). PDH E2/E3bp bp‐positive/TOM20‐negative MDVs colocalizing with GFP‐parkin (arrows) or not (circles) are indicated. Scale bars, 20 μm.D Quantification of PDH E2/E3 bp‐positive/TOM20‐negative vesicles from HeLa cells transfected with the indicated siRNA; both the total number (white bars) and the number colocalizing with GFP‐parkin (gray bars) are indicated. Error bars represent the mean ± s.e.m. P‐values are given for the total vesicle number (n = 42-64 cells in 2-3 experiments); ns, not significant."}
{"words": ["Figure", "5A", "Representative", "immunoblot", "of", "whole", "‐", "cell", "lysates", "from", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "non", "‐", "targeting", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "PINK1", "(", "siPINK1", ")", ",", "treated", "with", "10", "μM", "CCCP", "for", "6", "h", "in", "order", "to", "stabilize", "the", "PINK1", "full", "‐", "length", "band", ".", "B", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "GFP", "−", "parkin", "(", "green", ")", "and", "siRNA", "targeting", "PINK1", "(", "siPINK1", ")", "or", "non", "−", "targeting", "control", "(", "ctrl", "siRNA", ")", ",", "were", "treated", "with", "25", "μM", "antimycin", "A", "for", "90", "min", ",", "then", "fixed", "and", "immunostained", "for", "PDH", "E2", "/", "E3", "bp", "(", "red", ")", "and", "TOM20", "(", "blue", ")", ".", "PDH", "E2", "/", "E3", "bp", "−", "positive", "/", "TOM20", "−", "negative", "MDVs", "colocalizing", "with", "GFP", "−", "parkin", "(", "arrows", ")", "or", "not", "(", "circles", ")", "are", "indicated", ".", "Arrowheads", "indicate", "parkin", "−", "positive", "MDVs", "adjacent", "to", "mitochondria", ",", "possibly", "budding", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "C", "Quantification", "of", "PDHE2", "/", "E3", "bp", "−", "positive", "/", "TOM20", "−", "negative", "structures", "from", "(", "B", ")", ";", "both", "the", "total", "number", "(", "white", "bars", ")", "and", "the", "number", "colocalizing", "with", "GFP", "−", "parkin", "(", "gray", "bars", ")", "are", "indicated", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "−", "values", "are", "given", "first", "for", "GFP", "−", "/", "GFP", "−", "parkin", "−", "positive", "vesicles", ",", "then", "for", "total", "vesicle", "number", "(", "n", "=", "42", "-", "60", "cells", "in", "three", "experiments", ")", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Representative immunoblot of whole‐cell lysates from HeLa cells transfected with non‐targeting siRNA or siRNA targeting PINK1 (siPINK1), treated with 10 μM CCCP for 6 h in order to stabilize the PINK1 full‐length band.B HeLa cells transfected with GFP−parkin (green) and siRNA targeting PINK1 (siPINK1) or non−targeting control (ctrl siRNA), were treated with 25 μM antimycin A for 90 min, then fixed and immunostained for PDH E2/E3 bp (red) and TOM20 (blue). PDH E2/E3 bp−positive/TOM20−negative MDVs colocalizing with GFP−parkin (arrows) or not (circles) are indicated. Arrowheads indicate parkin−positive MDVs adjacent to mitochondria, possibly budding. Scale bar, 20 μm.C Quantification of PDHE2/E3 bp−positive/TOM20−negative structures from (B); both the total number (white bars) and the number colocalizing with GFP−parkin (gray bars) are indicated. Error bars represent the mean ± s.e.m. P−values are given first for GFP−/GFP−parkin−positive vesicles, then for total vesicle number (n = 42-60 cells in three experiments); ns, not significant; ***P < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Quantification", "of", "TMRM", "fluorescence", "by", "flow", "cytometry", "in", "U2OS", ":", "GFP", "‐", "parkin", "cells", "treated", "with", "25", "μM", "antimycin", "A", "(", "anti", "A", ")", ",", "25", "μM", "antimycin", "A", "and", "10", "μM", "oligomycin", "(", "anti", "A", "+", "oligo", ")", ",", "and", "20", "μM", "CCCP", "(", "CCCP", ")", "for", "the", "indicated", "time", ",", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "fluorescence", "intensity", "compared", "to", "DMSO", "‐", "treated", "cells", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "experiments", ")", ".", "B", "U2OS", ":", "GFP", "‐", "parkin", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "DMSO", ")", ",", "25", "μM", "antimycin", "A", "(", "anti", "A", ")", ",", "25", "μM", "antimycin", "A", "and", "10", "μM", "oligomycin", "(", "anti", "A", "+", "oligo", ")", ",", "or", "20", "μM", "CCCP", "(", "CCCP", ")", "for", "two", "hours", ",", "then", "fixed", "and", "immunostained", "for", "TOM20", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "C", "Quantification", "ofPDHE2", "/", "E3", "bp", "−", "positive", "/", "TOM20", "−", "negative", "structures", "from", "(", "B", ")", ";", "both", "the", "total", "number", "(", "white", "bars", ")", "and", "the", "number", "colocalizing", "with", "GFP", "−", "parkin", "(", "gray", "bars", ")", "are", "indicated", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "−", "values", "are", "given", "first", "for", "GFP", "−", "/", "GFP", "−", "parkin", "−", "positive", "vesicles", ",", "then", "for", "total", "vesicle", "number", "(", "n", "=", "42", "-", "60", "cells", "in", "three", "experiments", ")", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "D", "U2OS", ":", "GFP", "−", "parkin", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "DMSO", ")", ",", "25", "μM", "antimycin", "A", "(", "anti", "A", ")", ",", "25", "μM", "antimycin", "A", "and", "10", "μM", "oligomycin", "(", "anti", "A", "+", "oligo", ")", ",", "or", "20", "μM", "CCCP", "(", "CCCP", ")", "for", "two", "hours", ",", "then", "fixed", "and", "immunostained", "for", "PDH", "E2", "/", "E3", "bp", "(", "red", ")", "and", "TOM20", "(", "blue", ")", ".", "A", "merged", "image", "of", "both", "mitochondrial", "markers", "(", "mito", ")", "is", "shown", "at", "the", "far", "right", ".", "Arrows", "indicate", "PDH", "E2", "/", "E3", "bp", "−", "positive", "/", "TOM20", "−", "negative", "structures", "colocalizing", "with", "GFP", "−", "parkin", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Quantification of TMRM fluorescence by flow cytometry in U2OS:GFP‐parkin cells treated with 25 μM antimycin A (anti A), 25 μM antimycin A and 10 μM oligomycin (anti A + oligo), and 20 μM CCCP (CCCP) for the indicated time, represented as a fraction of fluorescence intensity compared to DMSO‐treated cells. Error bars represent the mean ± s.e.m. (n = 3 experiments).B U2OS:GFP‐parkin cells were treated with DMSO (DMSO), 25 μM antimycin A (anti A), 25 μM antimycin A and 10 μM oligomycin (anti A + oligo), or 20 μM CCCP (CCCP) for two hours, then fixed and immunostained for TOM20 (red). Scale bars, 50 μm.C Quantification ofPDHE2/E3 bp−positive/TOM20−negative structures from (B); both the total number (white bars) and the number colocalizing with GFP−parkin (gray bars) are indicated. Error bars represent the mean ± s.e.m. P−values are given first for GFP−/GFP−parkin−positive vesicles, then for total vesicle number (n = 42-60 cells in three experiments); ns, not significant; ***P < 0.001).D U2OS:GFP−parkin cells were treated with DMSO (DMSO), 25 μM antimycin A (anti A), 25 μM antimycin A and 10 μM oligomycin (anti A + oligo), or 20 μM CCCP (CCCP) for two hours, then fixed and immunostained for PDH E2/E3 bp (red) and TOM20 (blue). A merged image of both mitochondrial markers (mito) is shown at the far right. Arrows indicate PDH E2/E3 bp−positive/TOM20−negative structures colocalizing with GFP−parkin (green). Scale bars, 20 μm."}
{"words": ["Figure", "7A", "Representative", "immunoblot", "of", "whole", "‐", "cell", "lysates", "from", "U2OS", ":", "GFP", "and", "GFP", "‐", "parkin", "cells", "treated", "with", "DMSO", ",", "25", "μM", "antimycin", "A", "(", "anti", "A", ")", ",", "25", "μM", "antimycin", "A", "with", "10", "μM", "oligomycin", "(", "anti", "A", "+", "oligo", ")", ",", "or", "20", "μM", "CCCP", "for", "the", "indicated", "time", "period", ".", "B", "Quantification", "of", "PDH", "E1a", "signal", "intensity", "relative", "to", "that", "of", "actin", "in", "immunoblots", "from", "(", "A", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "experiments", ")", ".", "C", "Quantification", "of", "mitochondrial", "clearance", "in", "U2OS", ":", "GFP", "−", "parkin", "cells", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "fixed", "and", "immunostained", "for", "TOM20", ".", "Data", "are", "shown", "as", "percentage", "of", "cells", "containing", "mitochondria", ",", "by", "TOM20", "staining", ",", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "experiments", ",", "with", "at", "least", "85", "cells", "quantified", "per", "condition", ",", "per", "experiment", ")", ".", "D", "U2OS", ":", "GFP", "‐", "parkin", "cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "for", "the", "indicated", "time", "period", ",", "then", "fixed", "and", "immunostained", "for", "TOM20", "(", "red", ")", ".", "Cell", "boundaries", "are", "delineated", "in", "single", "‐", "channel", "images", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Representative immunoblot of whole‐cell lysates from U2OS:GFP and GFP‐parkin cells treated with DMSO, 25 μM antimycin A (anti A), 25 μM antimycin A with 10 μM oligomycin (anti A + oligo), or 20 μM CCCP for the indicated time period.B Quantification of PDH E1a signal intensity relative to that of actin in immunoblots from (A). Error bars represent the mean ± s.e.m. (n = 3 experiments).C Quantification of mitochondrial clearance in U2OS:GFP−parkin cells treated as in (A), fixed and immunostained for TOM20. Data are shown as percentage of cells containing mitochondria, by TOM20 staining, visualized by fluorescence microscopy. Error bars represent the mean ± s.e.m. (n = 3 experiments, with at least 85 cells quantified per condition, per experiment).D U2OS:GFP‐parkin cells were treated as in (A) for the indicated time period, then fixed and immunostained for TOM20 (red). Cell boundaries are delineated in single‐channel images. Scale bars, 20 μm."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Colony", "formation", "assay", "(", "CFA", ")", "with", "imatinib", "with", "representative", "images", "of", "colonies", "formed", "by", "each", "cell", "line", "within", "the", "panel", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ",", "n", "=", "9", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "H1915", "P", "=", "0", ".", "0004", ",", "H2110", "P", "=", "0", ".", "0001", ")", ".", "B", ".", "Western", "blot", "analysis", "after", "1", "hour", "treatment", "with", "imatinib", ".", "C", ".", "MTT", "assay", "for", "NSCLC", "cell", "lines", "and", "Beas", "-", "2B", "cells", "with", "dasatinib", "or", "DMSO", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ",", "n", "=", "9", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "H1915", "P", "=", "1", ".", "09", "×", "10", "-", "5", ",", "H2110", "P", "=", "0", ".", "009", "and", "A549", "P", "=", "6", "×", "10", "-", "6", ")", ".", "D", ".", "Western", "blot", "analysis", "after", "1", "h", "treatment", "with", "dasatinib", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Colony formation assay (CFA) with imatinib with representative images of colonies formed by each cell line within the panel. Error bars represent mean ±S.E.M., n=9, *P < 0.001 by two-tailed unpaired Student's t-test (H1915 P= 0.0004, H2110 P=0.0001).B. Western blot analysis after 1 hour treatment with imatinib.C. MTT assay for NSCLC cell lines and Beas-2B cells with dasatinib or DMSO. Error bars represent mean ±S.E.M., n=9, *P<0.001 by two-tailed unpaired Student's t-test (H1915 P=1.09×10-5, H2110 P=0.009 and A549 P=6×10-6).D. Western blot analysis after 1 h treatment with dasatinib."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "C", ".", "Drug", "-", "resistant", "ABL1", "-", "T315I", "rescues", "dasatinib", "-", "and", "imatinib", "-", "induced", "cytotoxicity", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "(", "A", ")", "transient", "and", "(", "B", ")", "tetracycline", "-", "inducible", "overexpression", "of", "ABL1", "-", "T315I", "in", "H1915", "cells", "treated", "with", "dasatinib", "or", "imatinib", ".", "C", ".", "CFA", "with", "dasatinib", "or", "imatinib", "for", "H1915", "cells", "with", "or", "without", "tetracycline", "-", "inducible", "expression", "of", "ABL1", "-", "T315I", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ",", "n", "=", "9", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "control", ",", "DMSO", "vs", "dasatinib", "P", "=", "4", ".", "3", "×", "10", "-", "12", "vs", "imatinib", "P", "=", "6", "×", "10", "-", "6", ";", "dasatinib", ",", "control", "vs", "tetracycline", ",", "P", "=", "9", "×", "10", "-", "7", ";", "imatinib", ",", "control", "vs", "tetracycline", "P", "=", "9", ".", "7", "×", "10", "-", "5", ")", ".", "D", "-", "F", ".", "Knockdown", "of", "mutated", "ABL1", "reduces", "viability", "of", "lung", "cancer", "cells", ".", "Top", ",", "western", "blot", "analysis", "of", "ABL1", "knockdown", "in", "(", "D", ")", "Beas", "-", "2B", ",", "(", "E", ")", "H1915", "and", "(", "F", ")", "H2110", "cells", "upon", "transfection", "with", "three", "ABL1", "siRNAs", ",", "negative", "control", "(", "scrambled", ")", "and", "CyclophilinB", "positive", "control", ".", "Bottom", ",", "MTT", "assay", "showing", "viability", "of", "(", "D", ")", "Beas", "-", "2B", ",", "(", "E", ")", "H1915", "and", "(", "F", ")", "H2110", "cells", "in", "response", "to", "ABL1", "knockdown", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ",", "n", "=", "9", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "Beas", "-", "2B", ",", "scrambled", "vs", "siABL1", "-", "3", "P", "=", "0", ".", "002", ";", "H1915", ",", "scrambled", "vs", "siABL1", "-", "1", "P", "=", "0", ".", "004", ",", "vs", "siABL1", "-", "2", "P", "=", "0", ".", "001", ",", "vs", "siABL1", "-", "3", "P", "=", "0", ".", "002", ";", "H2110", "scrambled", "vs", "siABL1", "-", "1", "P", "=", "5", "×", "10", "-", "6", ",", "vs", "siABL1", "-", "2", "P", "=", "2", "×", "10", "-", "5", ",", "vs", "siABL1", "-", "3", "P", "=", "4", ".", "2", "×", "10", "-", "6", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A -C. Drug-resistant ABL1-T315I rescues dasatinib- and imatinib-induced cytotoxicity. Western blot analysis of (A) transient and (B) tetracycline-inducible overexpression of ABL1-T315I in H1915 cells treated with dasatinib or imatinib.C. CFA with dasatinib or imatinib for H1915 cells with or without tetracycline-inducible expression of ABL1-T315I. Error bars represent mean ±S.E.M., n=9, *P<0.001 by two-tailed unpaired Student's t-test (control, DMSO vs dasatinib P=4.3×10-12 vs imatinib P=6×10-6; dasatinib, control vs tetracycline, P=9×10-7; imatinib, control vs tetracycline P=9.7×10-5).D-F. Knockdown of mutated ABL1 reduces viability of lung cancer cells. Top, western blot analysis of ABL1 knockdown in (D) Beas-2B, (E) H1915 and (F) H2110 cells upon transfection with three ABL1 siRNAs, negative control (scrambled) and CyclophilinB positive control. Bottom, MTT assay showing viability of (D) Beas-2B, (E) H1915 and (F) H2110 cells in response to ABL1 knockdown. Error bars represent mean ±S.E.M, n=9, *P<0.005, **P<0.001 by two-tailed unpaired Student's t-test (Beas-2B, scrambled vs siABL1-3 P=0.002; H1915, scrambled vs siABL1-1 P=0.004, vs siABL1-2 P=0.001, vs siABL1-3 P=0.002; H2110 scrambled vs siABL1-1 P=5×10-6, vs siABL1-2 P=2×10-5, vs siABL1-3 P=4.2×10-6)."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "C", ".", "Average", "tumor", "volumes", "of", "xenografts", "derived", "from", "H1915", "(", "A", ")", ",", "H650", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", "H1915", "cell", "line", "with", "doxycycline", "inducible", "ABL1", "gate", "-", "keeper", "mutation", "(", "H1915", "-", "ABL1T315I", ")", "in", "mice", "treated", "with", "either", "vehicle", "or", "imatinib", "(", "100mg", "/", "kg", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "S", ".", "D", ".", ",", "n", "=", "6", "-", "10", "mice", "per", "group", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0016", "by", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-C. Average tumor volumes of xenografts derived from H1915 (A), H650 (B) and (C) H1915 cell line with doxycycline inducible ABL1 gate-keeper mutation (H1915-ABL1T315I) in mice treated with either vehicle or imatinib (100mg/kg). Error bars represent ±S.D., n=6-10 mice per group, *P=0.0016 by Mann-Whitney U test."}
{"words": ["Figure", "4A", "and", "C", ".", "Root", "mean", "square", "deviation", "(", "RMSD", ")", "analysis", "of", "the", "movement", "of", "(", "A", ")", "αC", "-", "helix", "and", "(", "C", ")", "DFG", "motif", "in", "the", "active", "and", "inactive", "conformation", "of", "ABL1", "kinase", "with", "R351W", "mutation", "(", "orange", ")", "compared", "to", "the", "wild", "type", "(", "WT", ")", "kinase", "(", "black", ")", ".", "B", "and", "D", ".", "Time", "-", "lapse", "images", "show", "movement", "within", "the", "αC", "-", "helix", "(", "B", ")", "and", "DFG", "motif", "(", "D", ")", "of", "the", "inactive", "structure", "of", "the", "WT", "(", "black", "outline", ")", "and", "R351W", "(", "orange", "outline", ")", "constructs", ".", "E", ".", "left", ",", "western", "blot", "analysis", "of", "transient", "overexpression", "of", "wild", "type", "ABL1", "(", "WT", ")", "and", "ABL1", "-", "R351W", ",", "compared", "to", "empty", "vector", "control", "(", "EV", ")", "in", "HEK293T", "cells", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "p", "-", "CRKL", "signal", "based", "on", "densitometry", "analysis", "of", "blots", "from", "6", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "S", ".", "D", ".", ",", "n", "=", "6", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0004", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "F", ".", "Overexpression", "of", "mutant", "ABL1", "constructs", "with", "mutations", "identified", "in", "selected", "primary", "lung", "tumors", "(", "Ding", "et", "al", ",", "2008", ")", "in", "H157", "cells", ".", "Values", "indicate", "quantified", "band", "intensity", "for", "p", "-", "CRKL", ",", "relative", "to", "α", "-", "tubulin", "and", "HA", "-", "tagged", "ABL1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A and C. Root mean square deviation (RMSD) analysis of the movement of (A) αC-helix and (C) DFG motif in the active and inactive conformation of ABL1 kinase with R351W mutation (orange) compared to the wild type (WT) kinase (black). B and D. Time-lapse images show movement within the αC-helix (B) and DFG motif (D) of the inactive structure of the WT (black outline) and R351W (orange outline) constructs.E. left, western blot analysis of transient overexpression of wild type ABL1 (WT) and ABL1-R351W, compared to empty vector control (EV) in HEK293T cells. Right, quantification of p-CRKL signal based on densitometry analysis of blots from 6 independent experiments. Error bars represent ±S.D., n=6, *P=0.0004 by two-tailed unpaired Student's t-test.F. Overexpression of mutant ABL1 constructs with mutations identified in selected primary lung tumors (Ding et al, 2008) in H157 cells. Values indicate quantified band intensity for p-CRKL, relative to α-tubulin and HA-tagged ABL1."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Immunofluorescence", "imaging", "of", "endogenous", "ABL1", "in", "the", "panel", "of", "NSCLC", "cell", "lines", ";", "scale", "bars", "=", "20", "μm", ".", "B", "and", "C", "Quantification", "of", "nuclear", "versus", "cytoplasmic", "localization", "of", "(", "B", ")", "endogenous", "ABL1", "in", "NSCLC", "cell", "lines", "and", "(", "C", ")", "tetracycline", "-", "inducible", "expression", "of", "ABL1", "-", "WT", ",", "ABL1", "-", "R351W", "and", "ABL1", "-", "G340L", "in", "Beas", "-", "2B", "cells", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "S", ".", "D", ".", ",", "n", "=", "6", "-", "10", "images", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "Beas", "-", "2B", "vs", "H1915", "P", "=", "6", ".", "6", "×", "10", "-", "5", ",", "vs", "H2110", "P", "=", "0", ".", "0001", ";", "WT", "vs", "R351W", "P", "=", "0", ".", "003", ",", "vs", "G340L", "P", "=", "0", ".", "002", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Immunofluorescence imaging of endogenous ABL1 in the panel of NSCLC cell lines; scale bars=20 μm. B and C Quantification of nuclear versus cytoplasmic localization of (B) endogenous ABL1 in NSCLC cell lines and (C) tetracycline-inducible expression of ABL1-WT, ABL1-R351W and ABL1-G340L in Beas-2B cells. Error bars represent ±S.D., n=6-10 images, *P<0.005 by two-tailed unpaired Student's t-test (Beas-2B vs H1915 P=6.6×10-5, vs H2110 P=0.0001; WT vs R351W P=0.003, vs G340L P=0.002)."}
{"words": ["Figure", "1IL", "-", "1β", "concentrations", "in", "supernatants", "of", "macrophages", ",", "unstimulated", "(", "control", ")", "(", "B", ")", "or", "stimulated", "with", "SP", "/", "N", "(", "C", ")", "or", "LPS", "/", "N", "(", "D", ")", ".", "E", ".", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "spike", "ELISA", "of", "the", "corresponding", "plasma", ":", "(", "EC50", "titer", ")", "of", "samples", "collected", "at", "T0", "(", "n", "=", "35", "individuals", ")", ",", "T1", "(", "n", "=", "28", "individuals", ")", "or", "T2", "(", "n", "=", "44", "individuals", ")", ".", "F", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "ASC", "specks", "(", "green", ")", "in", "T2", "macrophages", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "indicates", "20", "µm", ".", "Arrow", "indicates", "ASC", "speck", "formation", "with", "magnified", "illustration", "in", "the", "right", "corner", "of", "the", "image", ".", "G", ",", "H", ".", "ASC", "specks", "were", "quantified", "microscopically", "at", "T0", "(", "G", ")", "(", "n", "=", "7", "individuals", ")", "and", "T2", "(", "H", ")", "(", "n", "=", "8", "individuals", ")", "upon", "indicated", "stimuli", ".", "I", ".", "Cleaved", "gasdermin", "D", "(", "lysate", ")", "and", "cleaved", "IL", "-", "1β", "(", "supernatant", ")", "detected", "by", "Western", "Blot", "in", "macrophages", "stimulated", "with", "LPS", "/", "N", "or", "SP", "/", "N", "at", "T0", "and", "T2", ".", "J", ",", "K", ".", "Cell", "death", "quantification", "of", "macrophages", "by", "flow", "cytometry", "in", "unstimulated", "or", "SP", "/", "N", "stimulated", "cells", "at", "T0", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", "(", "J", ")", "and", "T2", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", "(", "K", ")", "using", "the", "viability", "dye", "Zombie", "UV", ".", "LPS", "/", "N", "was", "used", "as", "positive", "control", ".", "L", ".", "LDH", "release", "of", "macrophages", "(", "n", "=", "6", "individuals", ")", "stimulated", "with", "SP", "/", "N", "at", "T2", "compared", "to", "unstimulated", "cells", ".", "M", ".", "IL", "-", "1β", "concentrations", "of", "MCC950", "treated", "T2", "macrophage", "(", "n", "=", "44", "individuals", ")", "stimulation", "with", "SP", "/", "N", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1IL-1β concentrations in supernatants of macrophages, unstimulated (control) (B) or stimulated with SP/N (C) or LPS/N (D).E. SARS-CoV-2 spike ELISA of the corresponding plasma: (EC50 titer) of samples collected at T0 (n = 35 individuals), T1 (n = 28 individuals) or T2 (n = 44 individuals).F. Immunofluorescence microscopy images of ASC specks (green) in T2 macrophages. Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar indicates 20 µm. Arrow indicates ASC speck formation with magnified illustration in the right corner of the image.G, H. ASC specks were quantified microscopically at T0 (G) (n = 7 individuals) and T2 (H) (n = 8 individuals) upon indicated stimuli.I. Cleaved gasdermin D (lysate) and cleaved IL-1β (supernatant) detected by Western Blot in macrophages stimulated with LPS/N or SP/N at T0 and T2.J, K. Cell death quantification of macrophages by flow cytometry in unstimulated or SP/N stimulated cells at T0 (n = 5 individuals) (J) and T2 (n = 5 individuals) (K) using the viability dye Zombie UV. LPS/N was used as positive control.L. LDH release of macrophages (n = 6 individuals) stimulated with SP/N at T2 compared to unstimulated cells. M. IL-1β concentrations of MCC950 treated T2 macrophage (n = 44 individuals) stimulation with SP/N."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "Volcano", "plot", "showing", "DEGs", "in", "the", "same", "samples", ".", "Negative", "log10", "padj", "-", "values", "are", "plotted", "against", "the", "log2", "fold", "-", "change", ".", "Selected", "genes", "are", "labeled", ".", "C", ",", "D", ".", "CLEC4D", "(", "C", ")", "and", "CLEC4E", "(", "D", ")", "surface", "expression", "on", "patient", "-", "derived", "macrophages", "prior", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", "or", "post", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", "vaccination", "were", "quantified", "by", "flow", "cytometry", ".", "Graphs", "indicate", "the", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", ".", "E", ",", "F", ".", "SP", "or", "LPS", "as", "a", "control", "PAMP", "were", "incubated", "with", "affinity", "purified", "CLRs", "(", "ratio", ":", "10", "vs", ".", "1", "for", "SP", ")", "for", "1h", "and", "then", "added", "to", "primary", "T2", "macrophages", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", ".", "Subsequently", ",", "IL", "-", "1β", "was", "quantified", "in", "the", "supernatants", ".", "(", "E", ")", "shows", "absolute", "values", "for", "SP", ";", "(", "F", ")", "shows", "the", "fold", "change", "calculated", "with", "the", "corresponding", "unstimulated", "control", "for", "SP", "and", "LPS", ".", "G", ".", "Monocytes", "were", "isolated", "prior", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", "or", "after", "vaccination", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", "and", "differentiated", "to", "macrophages", ".", "IL", "-", "1β", "concentrations", "in", "supernatants", "of", "macrophages", "were", "measured", "after", "stimulation", "with", "the", "SP", "S1", "subunit", "SP", "and", "nigericin", ".", "H", ".", "Monocytes", "were", "isolated", "prior", "(", "T0", ";", "n", "=", "35", "individuals", ")", "or", "after", "vaccination", "[", "2", "weeks", "after", "1st", "(", "T1", ";", "n", "=", "28", "individuals", ")", ",", "2", "weeks", "(", "T2", ";", "n", "=", "38", "individuals", ")", "and", "10", "weeks", "(", "T3", ";", "n", "=", "33", "individuals", ")", "after", "2nd", "vaccination", "]", "and", "differentiated", "to", "macrophages", ".", "IL", "-", "1β", "concentrations", "in", "supernatants", "of", "macrophages", ",", "stimulated", "with", "the", "SP", "S2", "subunit", "SP", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. Volcano plot showing DEGs in the same samples. Negative log10 padj-values are plotted against the log2 fold-change. Selected genes are labeled.C, D. CLEC4D (C) and CLEC4E (D) surface expression on patient-derived macrophages prior (n = 5 individuals) or post (n = 5 individuals) vaccination were quantified by flow cytometry. Graphs indicate the mean fluorescence intensity (MFI).E, F. SP or LPS as a control PAMP were incubated with affinity purified CLRs (ratio: 10 vs. 1 for SP) for 1h and then added to primary T2 macrophages (n = 5 individuals). Subsequently, IL-1β was quantified in the supernatants. (E) shows absolute values for SP; (F) shows the fold change calculated with the corresponding unstimulated control for SP and LPS.G. Monocytes were isolated prior (n = 5 individuals) or after vaccination (n = 5 individuals) and differentiated to macrophages. IL-1β concentrations in supernatants of macrophages were measured after stimulation with the SP S1 subunit SP and nigericin. H. Monocytes were isolated prior (T0; n = 35 individuals) or after vaccination [2 weeks after 1st (T1; n = 28 individuals), 2 weeks (T2; n = 38 individuals) and 10 weeks (T3; n =33 individuals) after 2nd vaccination] and differentiated to macrophages. IL-1β concentrations in supernatants of macrophages, stimulated with the SP S2 subunit SP are shown."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "Phospho", "-", "SYK", "Immunofluorescence", "-", "microscopy", "in", "macrophages", "before", "and", "after", "vaccination", ".", "Nuclei", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", "indicate", "20", "µm", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "pSYK", "positive", "macrophages", "by", "flow", "cytometry", "before", "(", "n", "=", "3", "individuals", ")", "and", "14", "d", "after", "vaccination", "(", "n", "=", "3", "individuals", ")", ".", "Total", "SYK", "was", "measured", "as", "control", ".", "D", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "phospho", "-", "NF", "-", "κB", "and", "NLRP3", "in", "cell", "lysates", "of", "macrophages", "(", "T0", ";", "T2", ")", "stimulated", "with", "LPS", "/", "N", "or", "SP", "/", "N", ".", "E", ".", "Macrophages", "were", "incubated", "with", "IKK", "-", "β", "-", "inhibitor", "KINK", "-", "1", "(", "n", "=", "10", "individuals", ")", "and", "SYK", "-", "inhibitors", "entospletinib", "(", "n", "=", "20", "individuals", ")", ",", "R406", "(", "n", "=", "13", "individuals", ")", "prior", "to", "SP", "/", "nigericin", "stimulation", ".", "IL", "-", "1β", "concentrations", "measured", "with", "ELISA", ".", "DMSO", "-", "treated", ",", "SP", "/", "N", "-", "stimulated", "and", "untreated", "unstimulated", "macrophages", "were", "used", "as", "control", "(", "both", "n", "=", "44", "individuals", ")", ".", "F", ".", "IL", "-", "1β", "quantification", "in", "THP", "-", "1", "wild", "-", "type", "cells", "incubated", "with", "SYK", "inhibitors", "entospletinib", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ")", "and", "R406", "(", "n", "=", "2", "independent", "experiments", ")", "or", "in", "THP", "-", "1", "SYKKO", "cells", "stimulated", "with", "SP", "/", "N", "(", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ")", ".", "G", ".", "ASC", "formation", "quantified", "by", "immunofluorescence", "-", "microscopy", "in", "SP", "/", "N", "stimulated", "primary", "macrophages", "after", "vaccination", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", ".", "H", ".", "Quantification", "of", "cell", "death", "in", "T2", "macrophages", "(", "n", "=", "4", "individuals", ")", "treated", "with", "R406", "prior", "to", "SP", "/", "N", "-", "stimulation", ".", "I", "-", "K", ".", "mROS", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "using", "MitoSOX", "red", "staining", "at", "T0", "and", "T2", "in", "SP", "/", "N", "-", "stimulated", "macrophages", "without", "inhibitor", "(", "I", "[", "exemplary", "results", "]", ",", "J", "[", "T0", ":", "n", "=", "5", "individuals", ";", "T2", ":", "n", "=", "5", "individuals", "]", ")", "mROS", "quantified", "MitoSOX", "red", "staining", "at", "T0", "and", "T2", "in", "SP", "/", "N", "-", "stimulated", "macrophages", "with", "R406", "treatment", "(", "n", "=", "4", "individuals", ")", "(", "K", ")", ".", "L", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "SOD2", "in", "macrophages", "at", "T0", "and", "T2", "treated", "with", "SP", "/", "N", "or", "LPS", "/", "N", ".", "M", ".", "Mitochondrial", "membrane", "potential", "determined", "with", "flow", "cytometry", "of", "tetramethylrhodamine", "methyl", "ester", "(", "TMRM", ")", "stained", "macrophages", "at", "T0", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", "and", "T2", "(", "n", "=", "5", "individuals", ")", "stimulated", "with", "SP", "/", "N", ".", "N", ".", "T2", "-", "macrophages", "(", "n", "=", "4", "individuals", ")", "were", "treated", "with", "the", "SYK", "-", "inhibitor", "R406", ".", "Data", "information", ":", "For", "statistical", "analysis", ",", "one", "-", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "tukey", "post", "hoc", "test", "was", "used", ".", "Box", "plots", "indicate", "the", "median", "and", "the", "upper", "and", "lower", "quartile", ".", "Outliers", "are", "plotted", "as", "individual", "dots", "(", "outside", "the", "10", "-", "90", "percentile", ")", ".", "Scatter", "dot", "plots", "show", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "S", "-", "protein", ":", "SP", ",", "lipopolysaccharide", ":", "LPS", ",", "nigericin", ":", "N", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. Phospho-SYK Immunofluorescence-microscopy in macrophages before and after vaccination. Nuclei stained with DAPI. Scale bars indicate 20 µm.C. Quantification of pSYK positive macrophages by flow cytometry before (n = 3 individuals) and 14 d after vaccination (n = 3 individuals). Total SYK was measured as control.D. Western blot analysis of phospho-NF-κB and NLRP3 in cell lysates of macrophages (T0; T2) stimulated with LPS/N or SP/N.E. Macrophages were incubated with IKK-β-inhibitor KINK-1 (n = 10 individuals) and SYK-inhibitors entospletinib (n = 20 individuals), R406 (n = 13 individuals) prior to SP/nigericin stimulation. IL-1β concentrations measured with ELISA. DMSO-treated, SP/N-stimulated and untreated unstimulated macrophages were used as control (both n = 44 individuals).F. IL-1β quantification in THP-1 wild-type cells incubated with SYK inhibitors entospletinib (n = 4 independent experiments) and R406 (n = 2 independent experiments) or in THP-1 SYKKO cells stimulated with SP/N (n = 5 independent experiments).G. ASC formation quantified by immunofluorescence-microscopy in SP/N stimulated primary macrophages after vaccination (n = 5 individuals).H. Quantification of cell death in T2 macrophages (n = 4 individuals) treated with R406 prior to SP/N-stimulation.I-K. mROS quantified by flow cytometry using MitoSOX red staining at T0 and T2 in SP/N-stimulated macrophages without inhibitor (I [exemplary results], J [T0: n = 5 individuals; T2: n = 5 individuals])mROS quantified MitoSOX red staining at T0 and T2 in SP/N-stimulated macrophages with R406 treatment (n = 4 individuals) (K).L. Western blot analysis of SOD2 in macrophages at T0 and T2 treated with SP/N or LPS/N.M. Mitochondrial membrane potential determined with flow cytometry of tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) stained macrophages at T0 (n = 5 individuals) and T2 (n = 5 individuals) stimulated with SP/N. N. T2-macrophages (n = 4 individuals) were treated with the SYK-inhibitor R406. Data information: For statistical analysis, one- or two-way ANOVA with tukey post hoc test was used. Box plots indicate the median and the upper and lower quartile. Outliers are plotted as individual dots (outside the 10-90 percentile). Scatter dot plots show mean ± SD. *p<0.05; **p<0.01, ***p<0.001. (S-protein: SP, lipopolysaccharide: LPS, nigericin: N)"}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "H", ".", "(", "A", ")", "T", "cells", "at", "T0", "(", "n", "=", "6", "individuals", ")", "and", "T2", "(", "n", "=", "10", "individuals", ")", "were", "incubated", "with", "SP", "/", "N", "-", "stimulated", "macrophages", ".", "Co", "-", "cultures", "of", "unstimulated", "macrophages", "were", "used", "as", "control", "(", "con", ")", ".", "CD4", "+", "subpopulation", "analyses", "performed", "with", "flow", "cytometry", "(", "Experimental", "setup", ":", "Fig", "EV3", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "fold", "change", "of", "the", "CD4", "+", "T", "cell", "subpopulation", "upon", "SP", "/", "N", "stimulation", "(", "T0", ";", "T2", ")", ".", "Dotted", "line", "indicates", "the", "baseline", "(", "fold", "change", "=", "1", ".", "0", ")", ".", "(", "C", ")", "Fold", "change", "of", "CD4", "+", "naïve", "T", "cell", "and", "CD4", "+", "effector", "memory", "T", "cell", "populations", "(", "D", ")", "upon", "co", "-", "culture", "of", "macrophages", "stimulated", "with", "SP", "/", "N", "in", "presence", "of", "MCC950", "or", "R406", ".", "Identical", "analyses", "performed", "with", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "E", ",", "F", ",", "G", ",", "H", ")", ".", "I", ",", "J", ".", "PD", "-", "1", "expression", "was", "analyzed", "in", "CD4", "+", "(", "I", ")", "and", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "J", ")", "by", "flow", "cytometry", "upon", "co", "-", "culture", "with", "SP", "/", "N", "-", "stimulated", "T0", "(", "n", "=", "6", "individuals", ")", "or", "T2", "(", "n", "=", "11", "individuals", ")", "macrophages", ".", "Co", "-", "cultures", "of", "unstimulated", "macrophages", "were", "used", "as", "control", ".", "K", ",", "L", ".", "Interferon", "-", "γ", "quantified", "in", "supernatants", "of", "corresponding", "co", "-", "cultures", ",", "untreated", "(", "T0", "[", "n", "=", "6", "individuals", "]", "and", "T2", "[", "n", "=", "11", "individuals", "]", ")", "(", "K", ")", "and", "treated", "with", "MCC950", "or", "R406", "(", "L", ")", "at", "T2", "(", "n", "=", "11", "individuals", ")", ".", "M", ".", "IL", "-", "1β", "concentrations", "determined", "in", "SP", "/", "N", "-", "stimulated", "monocyte", "-", "derived", "macrophages", "at", "34", "weeks", "after", "2nd", "vaccination", "(", "first", "booster", ")", "(", "T4", "=", "7", "individuals", ")", "and", "2", "weeks", "after", "the", "3rd", "vaccination", "(", "second", "booster", ")", "(", "T5", "=", "11", "individuals", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-H. (A) T cells at T0 (n = 6 individuals) and T2 (n = 10 individuals) were incubated with SP/N-stimulated macrophages. Co-cultures of unstimulated macrophages were used as control (con). CD4+ subpopulation analyses performed with flow cytometry (Experimental setup: Fig EV3). (B) Quantification of fold change of the CD4+ T cell subpopulation upon SP/N stimulation (T0; T2). Dotted line indicates the baseline (fold change = 1.0). (C) Fold change of CD4+ naïve T cell and CD4+ effector memory T cell populations (D) upon co-culture of macrophages stimulated with SP/N in presence of MCC950 or R406. Identical analyses performed with CD8+ T cells (E, F, G, H).I, J. PD-1 expression was analyzed in CD4+ (I) and CD8+ T cells (J) by flow cytometry upon co-culture with SP/N-stimulated T0 (n = 6 individuals) or T2 (n = 11 individuals) macrophages. Co-cultures of unstimulated macrophages were used as control.K, L. Interferon-γ quantified in supernatants of corresponding co-cultures, untreated (T0 [n = 6 individuals] and T2 [n = 11 individuals]) (K) and treated with MCC950 or R406 (L) at T2 (n = 11 individuals).M. IL-1β concentrations determined in SP/N-stimulated monocyte-derived macrophages at 34 weeks after 2nd vaccination (first booster) (T4 = 7 individuals) and 2 weeks after the 3rd vaccination (second booster) (T5 = 11 individuals)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "The", "Armi", "complex", "immunoisolated", "from", "OSCs", "using", "anti", "-", "Armi", "antibodies", "contains", "Yb", ",", "SoYb", ",", "and", "Vret", ".", "B", ".", "The", "Vret", "complex", "immunoisolated", "from", "OSCs", "using", "anti", "-", "Vret", "antibodies", "contains", "Yb", ",", "Armi", ",", "and", "SoYb", ".", "C", ".", "Silver", "staining", "of", "protein", "components", "in", "the", "Vret", "complex", "The", "lane", "α", "-", "Vret", "(", "left", ")", "contained", "only", "the", "anti", "-", "Vret", "antibodies", "used", "in", "these", "experiments", ".", "D", ".", "Immunoprecipitation", "and", "western", "blotting", "were", "performed", "in", "OSCs", "upon", "RNAi", "treatment", "(", "kd", ")", ".", "Even", "without", "the", "association", "of", "Yb", ",", "Armi", ",", "SoYb", ",", "and", "Vret", "associated", ".", "Yb", "and", "Armi", "remained", "bound", "to", "each", "other", "upon", "SoYb", "or", "Vret", "depletion", ".", "The", "level", "of", "SoYb", "(", "input", ")", "decreased", "upon", "Vret", "depletion", ".", "Likewise", ",", "the", "level", "of", "Vret", "(", "input", ")", "decreased", "upon", "SoYb", "depletion", ".", "E", ".", "Upon", "Armi", "depletion", ",", "SoYb", "and", "Vret", "were", "still", "bound", "to", "each", "other", "but", "this", "heterodimer", "no", "longer", "associated", "with", "Yb", ".", "F", ".", "Immunofluorescence", "analyses", "in", "OSCs", ".", "Yb", "bodies", "disappeared", "upon", "Yb", "depletion", ",", "which", "led", "Armi", ",", "SoYb", "and", "Vret", "to", "be", "localized", "in", "the", "cytosol", ".", "Yb", "bodies", "were", "detected", "in", "OSCs", "upon", "Armi", "depletion", ",", "but", "SoYb", "and", "Vret", "localized", "in", "the", "cytosol", ".", "Armi", "was", "detected", "at", "Yb", "bodies", "upon", "SoYb", "or", "Vret", "depletion", ".", "Yb", "bodies", "are", "indicated", "by", "white", "arrows", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. The Armi complex immunoisolated from OSCs using anti-Armi antibodies contains Yb, SoYb, and Vret.B. The Vret complex immunoisolated from OSCs using anti-Vret antibodies contains Yb, Armi, and SoYb.C. Silver staining of protein components in the Vret complex The lane α-Vret (left) contained only the anti-Vret antibodies used in these experiments.D. Immunoprecipitation and western blotting were performed in OSCs upon RNAi treatment (kd). Even without the association of Yb, Armi, SoYb, and Vret associated. Yb and Armi remained bound to each other upon SoYb or Vret depletion. The level of SoYb (input) decreased upon Vret depletion. Likewise, the level of Vret (input) decreased upon SoYb depletion.E. Upon Armi depletion, SoYb and Vret were still bound to each other but this heterodimer no longer associated with Yb.F. Immunofluorescence analyses in OSCs. Yb bodies disappeared upon Yb depletion, which led Armi, SoYb and Vret to be localized in the cytosol. Yb bodies were detected in OSCs upon Armi depletion, but SoYb and Vret localized in the cytosol. Armi was detected at Yb bodies upon SoYb or Vret depletion. Yb bodies are indicated by white arrows. Nuclei are shown in blue. Scale bar: 2 μm."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "In", "Yb", "-", "lacking", "OSCs", "(", "Yb", "kd", ")", ",", "WT", "Yb", "and", "∆", "eTud", "bound", "to", "Armi", "but", "∆", "eTud", "did", "not", ".", "Note", "that", "WT", "Yb", "and", "both", "mutants", "were", "engineered", "to", "be", "RNAi", "-", "resistant", "by", "mutations", ".", "β", "-", "gal", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "C", ".", "In", "normal", "OSCs", ",", "WT", "Yb", "and", "∆", "eTud", "bound", "with", "Yb", "but", "∆", "Hel", "-", "C", "did", "not", ".", "D", ".", "Flag", "-", "Hel", "-", "C", "copurified", "with", "Myc", "-", "Hel", "-", "C", "but", "not", "with", "BSD", "(", "negative", "control", ")", ".", "E", ".", "Subcellular", "localization", "of", "WT", "Yb", "and", "deletion", "mutants", "∆", "Hel", "-", "C", "and", "∆", "eTud", ".", "Myc", "-", "Yb", "is", "shown", "in", "green", ".", "Endogenous", "Armi", "is", "shown", "in", "red", ".", "DAPI", "shows", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "Western", "blotting", "(", "right", ")", "showing", "WT", "Yb", "and", "deletion", "mutants", "∆", "Hel", "-", "C", "and", "∆", "eTud", "expressed", "in", "Yb", "-", "lacking", "OSCs", ".", "F", ".", "CLIP", "shows", "that", "WT", "Yb", "and", "∆", "Hel", "-", "C", "bind", "RNA", "in", "vivo", "but", "∆", "eTud", "does", "not", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. In Yb-lacking OSCs (Yb kd), WT Yb and ∆eTud bound to Armi but ∆eTud did not. Note that WT Yb and both mutants were engineered to be RNAi-resistant by mutations. β-gal was used as a negative control.C. In normal OSCs, WT Yb and ∆eTud bound with Yb but ∆Hel-C did not.D. Flag-Hel-C copurified with Myc-Hel-C but not with BSD (negative control).E. Subcellular localization of WT Yb and deletion mutants ∆Hel-C and ∆eTud. Myc-Yb is shown in green. Endogenous Armi is shown in red. DAPI shows nuclei (blue). Scale bar: 5 μm. Western blotting (right) showing WT Yb and deletion mutants ∆Hel-C and ∆eTud expressed in Yb-lacking OSCs.F. CLIP shows that WT Yb and ∆Hel-C bind RNA in vivo but ∆eTud does not."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Rescue", "experiments", "showing", "that", "∆", "Hel", "-", "C", "but", "not", "∆", "eTud", "restored", "piRNA", "biogenesis", "attenuated", "by", "endogenous", "Yb", "depletion", ".", "Flag", "-", "Piwi", "was", "expressed", "upon", "endogenous", "Yb", "depletion", ".", "B", ".", "The", "levels", "of", "transposon", "mdg1", "Bars", "and", "error", "bars", "represent", "means", "±", "SEM", "values", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "p", "values", "were", "calculated", "by", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "C", ".", "Mapping", "of", "flam", "-", "piRNAs", "produced", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "the", "Hel", "-", "C", "domain", "in", "OSCs", ".", "D", ".", "Mapping", "of", "tj", "-", "piRNAs", "produced", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "the", "Hel", "-", "C", "domain", "in", "OSCs", ".", "E", ".", "Scatterplot", "showing", "changes", "in", "the", "abundances", "of", "transposon", "-", "repressing", "piRNAs", "and", "non", "-", "transposon", "-", "repressing", "piRNAs", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "the", "Hel", "-", "C", "domain", ".", "Orange", "and", "blue", "dots", "indicate", "the", "number", "of", "normalized", "piRNA", "reads", "mapped", "uniquely", "to", "transposons", "in", "the", "reverse", "orientation", "and", "coding", "genes", "in", "the", "sense", "orientation", ",", "respectively", ".", "F", ".", "The", "relative", "enrichments", "of", "RNAs", "coimmunopurified", "with", "WT", "Yb", "and", "∆", "Hel", "-", "C", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "represent", "means", "±", "SEM", "values", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "In", "addition", "to", "tj", ",", "three", "genic", "piRNA", "sources", "that", "were", "characterized", "in", "previous", "studies", "(", "dm", "/", "Myc", "[", "59", "]", ",", "c", "-", "Fos", "/", "kay", "[", "60", "]", ",", "and", "CG9257", "[", "34", "]", ")", "are", "also", "shown", ".", "rp49", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "p", "value", "was", "calculated", "by", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Rescue experiments showing that ∆Hel-C but not ∆eTud restored piRNA biogenesis attenuated by endogenous Yb depletion. Flag-Piwi was expressed upon endogenous Yb depletion.B. The levels of transposon mdg1 Bars and error bars represent means ± SEM values of three independent experiments. p values were calculated by t-test. *: p < 0.05.C. Mapping of flam-piRNAs produced in the presence and absence of the Hel-C domain in OSCs. D. Mapping of tj-piRNAs produced in the presence and absence of the Hel-C domain in OSCs. E. Scatterplot showing changes in the abundances of transposon-repressing piRNAs and non-transposon-repressing piRNAs in the presence and absence of the Hel-C domain. Orange and blue dots indicate the number of normalized piRNA reads mapped uniquely to transposons in the reverse orientation and coding genes in the sense orientation, respectively.F. The relative enrichments of RNAs coimmunopurified with WT Yb and ∆Hel-C. Bars and error bars represent means ± SEM values of three independent experiments. In addition to tj, three genic piRNA sources that were characterized in previous studies (dm/Myc [59], c-Fos/kay [60], and CG9257 [34]) are also shown. rp49 was used as a negative control. p value was calculated by t-test. ***: p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Yb", "bodies", "(", "Yb", "in", "green", ")", "disappeared", "after", "1", ",", "6", "-", "hexanediol", "treatment", "of", "OSCs", ",", "as", "did", "P", "bodies", "(", "Dcp1", "in", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "B", ".", "Snapshots", "of", "live", "imaging", "of", "GFP", "-", "Yb", "expressed", "in", "OSCs", "Fusion", "-", "and", "fission", "-", "like", "dynamics", "of", "Yb", "bodies", "were", "observed", ".", "Saturated", "pixels", "are", "shown", "in", "red", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "5", "μm", ".", "C", ".", "Yb", "Y23A", "and", "F129A", "mutants", "(", "green", ")", "impaired", "Yb", "body", "formation", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "D", ".", "Yb", "Y23A", "and", "F129A", "mutants", "failed", "to", "produce", "flam", "-", "piRNAs", ".", "miR", "-", "310", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "E", ".", "Mapping", "of", "flam", "-", "and", "tj", "-", "piRNAs", "produced", "in", "the", "flamKG", "mutant", "and", "heterozygote", "ovaries", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Yb bodies (Yb in green) disappeared after 1,6-hexanediol treatment of OSCs, as did P bodies (Dcp1 in red). Nuclei are shown in blue. Scale bar: 5 μm.B. Snapshots of live imaging of GFP-Yb expressed in OSCs Fusion- and fission-like dynamics of Yb bodies were observed. Saturated pixels are shown in red. Scale bar: 0.5 μm.C. Yb Y23A and F129A mutants (green) impaired Yb body formation. Nuclei are shown in blue. Scale bar: 5 μm.D. Yb Y23A and F129A mutants failed to produce flam-piRNAs. miR-310 was used as a loading control.E. Mapping of flam- and tj-piRNAs produced in the flamKG mutant and heterozygote ovaries."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "Total", "pup", "retrieval", "time", "in", "biological", "mothers", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "foster", "mothers", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "and", "virgin", "females", "(", "n", "=", "10", ")", "on", "3", "consecutive", "days", ".", "C", ",", "D", "Fraction", "of", "parental", "(", "C", ")", "and", "ignoring", "(", "D", ")", "behaviors", "of", "virgin", "females", ",", "of", "the", "total", "session", "duration", "in", "each", "of", "the", "three", "pup", "exposure", "days", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "repeated", "measures", "and", "are", "displayed", "as", "individual", "measurements", "with", "the", "line", "connecting", "the", "mean", "value", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "F", ",", "A", "representative", "image", "of", "a", "coronal", "brain", "section", "immunostained", "for", "c", "-", "Fos", "after", "pup", "retrieval", "on", "day", "1", "and", "day", "3", ".", "The", "mPFC", "region", "is", "indicated", "by", "dashed", "lines", ",", "which", "is", "also", "shown", "in", "the", "insets", "in", "higher", "magnification", ".", "Scale", "bar", "indicates", "500", "µm", ",", "10", "×", "magnification", ".", "G", ",", "Heat", "-", "map", "of", "the", "Z", "-", "score", "for", "the", "difference", "in", "the", "fraction", "of", "c", "-", "Fos", "expressing", "cells", ",", "between", "day", "1", "and", "day", "3", "of", "behavioral", "testing", ".", "Foster", "mothers", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "virgins", "with", "pups", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "virgins", "with", "object", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "H", ",", "Representative", "coronal", "sections", "of", "the", "mPFC", "immunostained", "for", "c", "-", "Fos", "with", "the", "anatomical", "borders", "of", "the", "ACC", "indicated", "by", "dashed", "lines", ",", "in", "foster", "mothers", "(", "FM", ")", "and", "virgin", "females", "exposed", "to", "pups", "(", "V", "pups", ")", "or", "objects", "(", "V", "object", ")", "on", "day", "1", "and", "day", "3", "of", "behavioral", "testing", ".", "Scale", "bar", "100", "µm", ",", "20", "×", "magnification", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, Total pup retrieval time in biological mothers (n=6), foster mothers (n=7), and virgin females (n=10) on 3 consecutive days.C,D Fraction of parental (C) and ignoring (D) behaviors of virgin females, of the total session duration in each of the three pup exposure days (n=7). Data were analyzed using 2-way ANOVA with repeated measures and are displayed as individual measurements with the line connecting the mean value; *p < 0.05.F, A representative image of a coronal brain section immunostained for c-Fos after pup retrieval on day 1 and day 3. The mPFC region is indicated by dashed lines, which is also shown in the insets in higher magnification. Scale bar indicates 500 µm, 10× magnification.G, Heat-map of the Z-score for the difference in the fraction of c-Fos expressing cells, between day 1 and day 3 of behavioral testing. Foster mothers (n=5), virgins with pups (n=6), virgins with object (n=7).H, Representative coronal sections of the mPFC immunostained for c-Fos with the anatomical borders of the ACC indicated by dashed lines, in foster mothers (FM) and virgin females exposed to pups (V pups) or objects (V object) on day 1 and day 3 of behavioral testing. Scale bar 100 µm, 20× magnification."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "Reconstruction", "of", "the", "mouse", "brain", "following", "anterograde", "labeling", "with", "AAV", "-", "GFP", "in", "the", "ACC", "(", "I", ")", ";", "representative", "coronal", "images", "showing", "site", "of", "injection", "and", "axonal", "distribution", "pattern", "in", "the", "dorsal", "striatum", "(", "II", ")", "and", "central", "lateral", "nucleus", "of", "the", "thalamus", "(", "III", ",", "IV", ")", ".", "Images", "in", "aI", "-", "aIV", "were", "taken", "from", "the", "Allen", "Mouse", "Brain", "Connectivity", "AtlasC", ",", "A", "representative", "coronal", "section", "showing", "labeling", "pattern", "at", "the", "site", "of", "injection", ".", "White", "arrows", "in", "the", "magnified", "image", "(", "C", ",", "right", ")", "point", "to", "double", "-", "labeled", "putative", "starter", "cells", "for", "transsynaptic", "retrograde", "labeling", ".", "D", ",", "Representative", "coronal", "sections", "showing", "bidirectional", "connectivity", "patterns", "with", "the", "thalamus", "(", "I", ")", "and", "monosynaptic", "input", "to", "the", "ACC", "from", "the", "claustrum", "(", "II", ")", "and", "ventral", "CA1", "(", "III", ")", ".", "Scale", "bars", "500", "µm", ",", "10", "×", "magnification", "(", "left", "images", ")", "and", "100", "µm", ",", "20", "×", "magnification", "(", "right", "images", ")", ".", "G", ",", "Representative", "coronal", "sections", "of", "the", "dorsal", "thalamus", ",", "following", "c", "-", "Fos", "immunolabeling", "on", "day", "1", "(", "left", ")", "and", "day", "3", "(", "right", ")", ",", "with", "the", "ILM", "subnuclei", "indicated", ";", "CM", "central", "medial", "nucleus", ",", "CL", "central", "lateral", "nucleus", ",", "PCN", "paracentral", "nucleus", ",", "RH", "rhomboid", "nucleus", ".", "Scale", "bar", "200", "µm", ",", "10", "×", "magnification", ".", "Foster", "mothers", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "virgins", "with", "pups", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "virgins", "with", "object", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "H", ",", "Fraction", "of", "c", "-", "Fos", "+", "cells", "in", "different", "ILM", "subnuclei", ",", "virgin", "exposed", "to", "pups", "(", "left", ")", ",", "in", "foster", "mothers", "(", "middle", ")", ",", "and", "virgin", "exposed", "to", "object", "(", "right", ")", ",", "on", "day", "1", "and", "day", "3", "of", "behavioral", "testing", ".", "Foster", "mothers", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "virgins", "with", "pups", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "virgins", "with", "object", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "repeated", "measures", "and", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, Reconstruction of the mouse brain following anterograde labeling with AAV-GFP in the ACC (I); representative coronal images showing site of injection and axonal distribution pattern in the dorsal striatum (II) and central lateral nucleus of the thalamus (III, IV). Images in aI-aIV were taken from the Allen Mouse Brain Connectivity AtlasC, A representative coronal section showing labeling pattern at the site of injection. White arrows in the magnified image (C, right) point to double-labeled putative starter cells for transsynaptic retrograde labeling.D, Representative coronal sections showing bidirectional connectivity patterns with the thalamus (I) and monosynaptic input to the ACC from the claustrum (II) and ventral CA1 (III). Scale bars 500 µm, 10× magnification (left images) and 100 µm, 20× magnification (right images).G, Representative coronal sections of the dorsal thalamus, following c-Fos immunolabeling on day 1 (left) and day 3 (right), with the ILM subnuclei indicated; CM central medial nucleus, CL central lateral nucleus, PCN paracentral nucleus, RH rhomboid nucleus. Scale bar 200 µm, 10× magnification. Foster mothers (n=5), virgins with pups (n=6), virgins with object (n=7).H, Fraction of c-Fos+ cells in different ILM subnuclei, virgin exposed to pups (left), in foster mothers (middle), and virgin exposed to object (right), on day 1 and day 3 of behavioral testing. Foster mothers (n=5), virgins with pups (n=6), virgins with object (n=7). Data were analyzed using 2-way ANOVA with repeated measures and are expressed as mean ± s.e.m; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "3B", ",", "Representative", "coronal", "sections", "of", "the", "PFC", ",", "following", "the", "labeling", "schemes", "described", "in", "(", "A", ")", ",", "for", "mapping", "inputs", "onto", "ACC", "excitatory", "(", "B", ",", "top", ")", "and", "inhibitory", "(", "B", ",", "bottom", ")", "neurons", ".", "High", "magnification", "images", "(", "B", ",", "right", "top", "and", "bottom", ")", "show", "the", "double", "-", "labeled", ",", "putative", "starter", "cells", "for", "transsynaptic", "retrograde", "labeling", ".", "Scale", "bars", "represent", "200", "µm", ",", "10", "×", "magnification", "(", "left", "top", "and", "bottom", ")", ",", "and", "50", "µm", "(", "right", "top", "and", "bottom", ")", ",", "20", "×", "magnification", ".", "C", ",", "Representative", "coronal", "images", "of", "the", "thalamus", ",", "immunolabeled", "for", "c", "-", "Fos", ",", "following", "retrograde", "labeling", "from", "excitatory", "(", "C", ",", "top", ")", "or", "inhibitory", "(", "C", ",", "bottom", ")", "neurons", "in", "the", "ACC", ".", "White", "arrows", "in", "high", "magnification", "images", "indicate", "colocalization", "of", "c", "-", "Fos", "and", "td", "-", "Tomato", "(", "C", ",", "right", "top", "and", "bottom", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "200", "µm", ",", "10", "×", "magnification", "(", "left", "top", "and", "bottom", ")", ",", "and", "25", "µm", "(", "right", "top", "and", "bottom", ")", ",", "20", "×", "magnification", ".", "D", ",", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "neurons", "in", "CL", "region", "projecting", "to", "excitatory", "or", "inhibitory", "ACC", "neurons", ",", "as", "a", "fraction", "of", "the", "total", "thalamic", "contribution", "(", "top", ")", "and", "fraction", "of", "neurons", "co", "-", "expressing", "tdTomato", "and", "c", "-", "Fos", "of", "the", "total", "tdTomato", "+", "population", "in", "CL", "(", "bottom", ")", ".", "Foster", "mothers", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "virgins", "with", "pups", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "virgins", "with", "object", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "and", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ";", ",", "Representative", "in", "-", "situ", "hybridization", "images", "of", "Gal", "in", "the", "ILM", "taken", "from", "the", "Allen", "Mouse", "Brain", "Atlas", "representative", "coronal", "images", "showing", "the", "expression", "of", "Gal", "neurons", "in", "Gal", "-", "Cre", ":", ":", "FLEX", "-", "YFP", "female", "mice", "(", "bottom", "right", "and", "left", ")", ".", ",", "Representative", "image", "of", "the", "ILM", "immunolabeled", "for", "GFP", "and", "c", "-", "Fos", ",", "following", "pup", "retrieval", "test", ".", "Yellow", "and", "white", "arrows", "indicate", "c", "-", "Fos", "expressing", "Gal", "-", "positive", "and", "Gal", "-", "negative", "neurons", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "µm", ",", "20", "×", "magnification", ".", "G", ",", "Graph", "plots", "showing", "the", "fraction", "of", "c", "-", "Fos", "expressing", "Gal", "-", "positive", "(", "Galc", "-", "Fos", "+", ")", "and", "Gal", "-", "negative", "neurons", "(", "DAPIc", "-", "Fos", "+", ")", "in", "the", "CL", ",", "PCN", ",", "and", "CM", "after", "pup", "retrieval", "test", "(", "G", ",", "top", ")", "or", "object", "exposure", "(", "G", ",", "bottom", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "and", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", "=", "3", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B, Representative coronal sections of the PFC, following the labeling schemes described in (A), for mapping inputs onto ACC excitatory (B, top) and inhibitory (B, bottom) neurons. High magnification images (B, right top and bottom) show the double-labeled, putative starter cells for transsynaptic retrograde labeling. Scale bars represent 200 µm, 10× magnification (left top and bottom), and 50 µm (right top and bottom), 20× magnification.C, Representative coronal images of the thalamus, immunolabeled for c-Fos, following retrograde labeling from excitatory (C, top) or inhibitory (C, bottom) neurons in the ACC. White arrows in high magnification images indicate colocalization of c-Fos and td-Tomato (C, right top and bottom). Scale bars represent 200 µm, 10× magnification (left top and bottom), and 25 µm (right top and bottom), 20× magnification.D, Quantification of the number of neurons in CL region projecting to excitatory or inhibitory ACC neurons, as a fraction of the total thalamic contribution (top) and fraction of neurons co-expressing tdTomato and c-Fos of the total tdTomato+ population in CL (bottom). Foster mothers (n=3), virgins with pups (n=4), virgins with object (n=4). Data were analyzed using student's t-test and are displayed as mean ± s.e.m;, Representative in-situ hybridization images of Gal in the ILM taken from the Allen Mouse Brain Atlas representative coronal images showing the expression of Gal neurons in Gal-Cre::FLEX-YFP female mice (bottom right and left)., Representative image of the ILM immunolabeled for GFP and c-Fos, following pup retrieval test. Yellow and white arrows indicate c-Fos expressing Gal-positive and Gal-negative neurons, respectively. Scale bars represent 100 µm, 20× magnification.G, Graph plots showing the fraction of c-Fos expressing Gal-positive (Galc-Fos+) and Gal-negative neurons (DAPIc-Fos+) in the CL, PCN, and CM after pup retrieval test (G, top) or object exposure (G, bottom). Data were analyzed using 2-way ANOVA and expressed as mean ± s.e.m.; n=3; *p < 0.05."}
{"words": ["Figure", "5B", ",", "C", ",", "Quantification", "of", "pup", "retrieval", "latencies", "following", "ACC", "chemogenetic", "activation", "with", "hM3D", "(", "n", "=", "6", ")", "(", "B", ")", "or", "chemogenetic", "inhibition", "using", "hM4D", "(", "n", "=", "7", ")", "(", "C", ")", "compared", "to", "control", "groups", "in", "virgin", "females", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "repeated", "measures", "and", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "D", ",", "Same", "as", "(", "C", ")", "but", "for", "mothers", "(", "n", "=", "7", ")", "E", ",", "Representative", "images", "showing", "AAV", "-", "DIO", "-", "CAG", "-", "hM3D", "-", "2A", "-", "tdTomato", "and", "c", "-", "Fos", "expression", "in", "the", "PFC", "of", "virgin", "females", ",", "2", "hours", "following", "CNO", "/", "vehicle", "administration", ".", "Masks", "demonstrating", "distribution", "of", "DAPI", "+", "c", "-", "Fos", "(", "green", ")", ",", "DAPI", "+", "dTomato", "(", "magenta", ")", "and", "their", "colocalization", "(", "white", ")", ".", "Scale", "bars", "100", "µm", ",", "20", "×", "magnification", ".", "F", ",", "Fraction", "c", "-", "Fos", "+", "cells", "of", "the", "total", "DAPI", "(", "top", ")", "or", "hM3D", "-", "2A", "-", "dTomato", "(", "bottom", ")", "population", "in", "the", "ACC", ",", "following", "CNO", "/", "vehicle", "administration", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "and", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "G", ",", "Representative", "images", "of", "the", "CL", ",", "immunolabeled", "for", "c", "-", "Fos", ",", "following", "hM3D", "-", "mediated", "neuronal", "activation", "of", "the", "ACC", ".", "Scale", "bars", "200", "µm", ",", "20", "×", "magnification", ".", "H", ",", "Spearman", "correlation", "between", "the", "hM3D", "-", "mediated", "activation", "of", "the", "ACC", "(", "as", "measured", "in", "(", "F", ",", "top", ")", ")", "and", "the", "CL", "region", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B,C, Quantification of pup retrieval latencies following ACC chemogenetic activation with hM3D (n=6) (B) or chemogenetic inhibition using hM4D (n=7) (C) compared to control groups in virgin females (n=8). Data were analyzed using 2-way ANOVA with repeated measures and are displayed as mean ± s.e.m* p< 0.05, ** p< 0.01. D, Same as (C) but for mothers (n=7)E, Representative images showing AAV-DIO-CAG-hM3D-2A-tdTomato and c-Fos expression in the PFC of virgin females, 2 hours following CNO/vehicle administration. Masks demonstrating distribution of DAPI + c-Fos (green), DAPI + dTomato (magenta) and their colocalization (white). Scale bars 100 µm, 20× magnification.F, Fraction c-Fos+ cells of the total DAPI (top) or hM3D-2A-dTomato (bottom) population in the ACC, following CNO/vehicle administration. (n=3). Data were analyzed using student's t-test and are displayed as mean ± s.e.m; * p< 0.05, ** p< 0.01.G, Representative images of the CL, immunolabeled for c-Fos, following hM3D-mediated neuronal activation of the ACC. Scale bars 200 µm, 20× magnification.H, Spearman correlation between the hM3D-mediated activation of the ACC (as measured in (F, top)) and the CL region."}
{"words": ["Figure", "6B", ",", "Representative", "images", "showing", "AAV", "-", "DIO", "-", "CAG", "-", "hM3D", "-", "2A", "-", "tdTomato", "and", "c", "-", "Fos", "expression", "in", "the", "CL", ",", "2", "h", "after", "CNO", "administration", ".", "Scale", "bars", "200", "µm", ",", "10", "×", "magnification", "(", "left", ")", "and", "50", "µm", ",", "20", "×", "magnification", "(", "right", ")", ".", "C", ",", "Quantification", "of", "pup", "retrieval", "latencies", "in", "virgin", "females", "following", "CLGal", "+", "chemogenetic", "activation", "with", "hM3D", "compared", "to", "GFP", "-", "expressing", "control", "group", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "repeated", "measures", "and", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B, Representative images showing AAV-DIO-CAG-hM3D-2A-tdTomato and c-Fos expression in the CL, 2 h after CNO administration. Scale bars 200 µm, 10× magnification (left) and 50 µm, 20× magnification (right).C, Quantification of pup retrieval latencies in virgin females following CLGal+ chemogenetic activation with hM3D compared to GFP-expressing control group (n=7). Data were analyzed using 2-way ANOVA with repeated measures and are presented as mean ± s.e.m; * p < 0.05."}
{"words": ["Figure", "1E", ".", "Immunoblot", "(", "IB", ")", "analysis", "of", "stable", "Ub", "replacement", "cell", "lines", "treated", "or", "not", "with", "DOX", "for", "72", "h", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "three", "(", "E", "independent", "experiments", "with", "similar", "outcome", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1E. Immunoblot (IB) analysis of stable Ub replacement cell lines treated or not with DOX for 72 h. Data information: Data are representative of three (E independent experiments with similar outcome."}
{"words": ["Figure", "3F", ",", "G", ".", "HA", "-", "Ub", "conjugates", "isolated", "as", "in", "(", "D", ")", "were", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "similar", "outcome", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3F,G. HA-Ub conjugates isolated as in (D) were immunoblotted with indicated antibodies. Data information: Data are representative of three independent experiments with similar outcome."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Representative", "images", "(", "upper", ")", "and", "QIBC", "analysis", "(", "lower", ")", "(", "solid", "lines", ",", "median", ";", "dashed", "lines", ",", "quartiles", ";", ">", "10000", "cells", "analyzed", "per", "condition", ")", "of", "Ub", "(", "G76V", ")", "-", "GFP", "expression", "in", "stable", "U2OS", "/", "Ub", "(", "G76V", ")", "-", "GFP", "cells", "treated", "or", "not", "with", "p97i", "for", "4", "h", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "similar", "outcome", ".", "D", ".", "DOX", "-", "treated", "U2OS", "/", "shUb", "/", "HA", "-", "Ub", "(", "WT", ")", "and", "U2OS", "/", "shUb", "/", "HA", "-", "Ub", "(", "K27R", ")", "cell", "lines", "were", "transfected", "with", "shUb", "-", "resistant", "Ub", "(", "G76V", ")", "-", "GFP", "construct", "and", "treated", "or", "not", "with", "p97i", "for", "4", "h", ".", "Cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "GFP", "IP", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "similar", "outcome", ".", "E", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "DOX", "-", "treated", "U2OS", "/", "shUb", "/", "HA", "-", "Ub", "cell", "lines", "treated", "or", "not", "with", "MG132", "for", "4", "h", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "similar", "outcome", ".", "G", ".", "DOX", "-", "treated", "U2OS", "/", "shUb", "/", "HA", "-", "Ub", "(", "WT", ")", "and", "U2OS", "/", "shUb", "/", "HA", "-", "Ub", "(", "K27R", ")", "cell", "lines", "transfected", "with", "indicated", "Ub", "(", "G76V", ")", "-", "GFP", "expression", "constructs", "were", "subjected", "to", "GFP", "IP", "under", "denaturing", "conditions", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "four", "(", "G", ")", "independent", "experiments", "with", "similar", "outcome", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Representative images (upper) and QIBC analysis (lower) (solid lines, median; dashed lines, quartiles; >10000 cells analyzed per condition) of Ub(G76V)-GFP expression in stable U2OS/Ub(G76V)-GFP cells treated or not with p97i for 4 h. Data information: Data are representative of three independent experiments with similar outcome.D. DOX-treated U2OS/shUb/HA-Ub(WT) and U2OS/shUb/HA-Ub(K27R) cell lines were transfected with shUb-resistant Ub(G76V)-GFP construct and treated or not with p97i for 4 h. Cell extracts were subjected to GFP IP followed by immunoblotting with indicated antibodies. Data information: Data are representative of three independent experiments with similar outcome.E. Immunoblot analysis of DOX-treated U2OS/shUb/HA-Ub cell lines treated or not with MG132 for 4 h. Data information: Data are representative of three independent experiments with similar outcome.G. DOX-treated U2OS/shUb/HA-Ub(WT) and U2OS/shUb/HA-Ub(K27R) cell lines transfected with indicated Ub(G76V)-GFP expression constructs were subjected to GFP IP under denaturing conditions followed by immunoblotting with indicated antibodies. Data information: Data are representative of four (G) independent experiments with similar outcome."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "FLAG", "IPs", "from", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "indicated", "FLAG", "-", "tagged", "expression", "constructs", "were", "incubated", "with", "purified", "K27", "di", "-", "Ub", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "three", "(", "A", "independent", "experiments", "with", "similar", "outcome", ".", "C", ".", "Cells", "transfected", "as", "in", "(", "B", ")", "and", "treated", "or", "not", "with", "p97i", "for", "4", "h", "were", "subjected", "to", "GFP", "IP", "followed", "by", "immunoblotting", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "similar", "outcome", ".", "I", ".", "U2OS", "/", "Ub", "(", "G76V", ")", "-", "GFP", "and", "U2OS", "/", "Ub", "(", "G76V", ")", "-", "20AA", "-", "GFP", "cell", "lines", "were", "transfected", "or", "not", "with", "FLAG", "-", "UCHL3", "C95S", "expression", "construct", ",", "treated", "with", "MG132", "for", "2", "h", "and", "subjected", "to", "GFP", "IP", "followed", "by", "immunoblotting", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "similar", "outcome", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. FLAG IPs from U2OS cells transfected with indicated FLAG- tagged expression constructs were incubated with purified K27 di-Ub and analyzed by immunoblotting. Data information: Data are representative of three (A independent experiments with similar outcome.C. Cells transfected as in (B) and treated or not with p97i for 4 h were subjected to GFP IP followed by immunoblotting. Data information: Data are representative of three independent experiments with similar outcome.I. U2OS/Ub(G76V)-GFP and U2OS/Ub(G76V)-20AA-GFP cell lines were transfected or not with FLAG-UCHL3 C95S expression construct, treated with MG132 for 2 h and subjected to GFP IP followed by immunoblotting. Data information: Data are representative of three independent experiments with similar outcome."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "SHOXprotein", "representation", "and", "luciferase", "assay", ".", "The", "variants", "found", "in", "SHOX", "are", "indicated", "in", "red", ".", "Luciferase", "assays", "to", "test", "the", "impact", "of", "SHOX", "mutations", "on", "its", "transcriptional", "activity", "were", "performed", "on", "FGFR3", "promoter", "in", "U2OS", "cells", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "triplicates", ".", "pcDNA4", "-", "TO", "empty", "vector", "was", "used", "as", "control", ".", "R153L", "represents", "a", "mutation", "known", "to", "affect", "SHOXprotein", "activity", "and", "was", "used", "as", "positive", "control", "(", "Schneider", "et", "al", ".", ",", "2005", ")", ".", "Homeodomain", ",", "DNA", "binding", "domain", ";", "Src", "Homology", "3", "domain", ";", "OAR", ",", "OtpAristalessRax", "domain", ".", "RLU", ",", "Relative", "Light", "Units", ".", "B", ".", "CYP26C1protein", "representation", "and", "luciferase", "assay", ".", "Variants", "found", "in", "CYP26C1", "are", "indicated", "in", "green", ".", "Cignal", "-", "RARE", "system", "luciferase", "assays", "to", "test", "the", "impact", "of", "CYP26C1", "variants", "on", "its", "RA", "degradation", "activity", "were", "performed", "in", "U2OS", "cells", "treated", "with", "250", "nM", "all", "-", "trans", "retinoic", "acid", "(", "ATRA", ")", "for", "24", "hours", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "triplicates", ".", "pIRES2", "-", "EGFP", "empty", "vector", "was", "used", "as", "control", ".", "The", "residue", "C459", "represents", "the", "Iron", "binding", "residue", "(", "Q6VOL0", ",", "UniProtKB", ")", "and", "was", "mutated", "to", "Ala", "and", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "TM", ",", "Transmembrane", "helix", ";", "P450", ",", "cytochrome", "p450", "domain", ".", "RLU", ",", "Relative", "Light", "Units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. SHOXprotein representation and luciferase assay. The variants found in SHOX are indicated in red. Luciferase assays to test the impact of SHOX mutations on its transcriptional activity were performed on FGFR3 promoter in U2OS cells (n = 4). Experiments were performed in triplicates. pcDNA4-TO empty vector was used as control. R153L represents a mutation known to affect SHOXprotein activity and was used as positive control (Schneider et al., 2005). Homeodomain, DNA binding domain; Src Homology 3 domain; OAR, OtpAristalessRax domain. RLU, Relative Light Units.B. CYP26C1protein representation and luciferase assay. Variants found in CYP26C1 are indicated in green. Cignal-RARE system luciferase assays to test the impact of CYP26C1 variants on its RA degradation activity were performed in U2OS cells treated with 250 nM all-trans retinoic acid (ATRA) for 24 hours (n = 4). Experiments were performed in triplicates.pIRES2-EGFP empty vector was used as control. The residue C459 represents the Iron binding residue (Q6VOL0, UniProtKB) and was mutated to Ala and used as a positive control. TM, Transmembrane helix; P450, cytochrome p450 domain. RLU, Relative Light Units."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Right", "panel", ",", "western", "blot", "showing", "the", "expression", "of", "CYP26C1", "in", "human", "primary", "chondrocytes", "on", "protein", "level", ".", "Overexpression", "of", "CYP26C1", "in", "U2OS", "cells", "was", "carried", "out", "to", "compare", "protein", "sizes", ".", "+", ",", "cDNA", ";", "-", ",", "water", ";", "M", ",", "marker", ";", "HPC", ",", "human", "primary", "chondrocytes", ".", "A", ".", "Left", "panel", ",", "RT", "-", "PCR", "showing", "the", "expression", "of", "CYP26C1", "mRNA", "in", "human", "primary", "chondrocytes", ".", "SOX9", "was", "used", "as", "chondrocyte", "marker", ".", "B", ".", "Relative", "expression", "of", "SHOX", "mRNA", "normalized", "to", "the", "reference", "genes", "SDHA", "and", "HPRT", "in", "human", "primary", "chondrocytes", "treated", "with", "ATRA", "100", "nM", "for", "6h", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "One", "outlier", "with", "high", "relative", "expression", "(", "2", ".", "3", "fold", ")", "was", "excluded", "from", "ATRA", "100", "nM", "treatment", "(", "two", "-", "sided", "Grubb", "'", "s", "test", ",", "Z", "value", "2", ".", "34", ",", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "C", ".", "SHOX", "promoter", "was", "cloned", "in", "pGL3basic", "for", "luciferase", "reporter", "experiments", "as", "previously", "described", "(", "Verdin", "et", "al", ",", "2015", ")", ".", "In", "silico", "analysis", "of", "SHOX", "promoter", "identified", "three", "putative", "RXRa", "binding", "sites", "which", "were", "mutated", "to", "test", "their", "direct", "effect", "on", "SHOX", "expression", "upon", "treatment", "with", "ATRA", "250", "nM", "in", "U2OS", "cells", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "triplicates", ".", "RLU", ",", "Relative", "Light", "Units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Right panel, western blot showing the expression of CYP26C1 in human primary chondrocytes on protein level. Overexpression of CYP26C1 in U2OS cells was carried out to compare protein sizes. +, cDNA; -, water; M, marker; HPC, human primary chondrocytes.A. Left panel, RT-PCR showing the expression of CYP26C1 mRNA in human primary chondrocytes. SOX9 was used as chondrocyte marker.B. Relative expression of SHOX mRNA normalized to the reference genes SDHA and HPRT in human primary chondrocytes treated with ATRA 100 nM for 6h (n = 5). One outlier with high relative expression (2.3 fold) was excluded from ATRA 100 nM treatment (two-sided Grubb's test, Z value 2.34, p-value < 0.05).C. SHOX promoter was cloned in pGL3basic for luciferase reporter experiments as previously described (Verdin et al, 2015). In silico analysis of SHOX promoter identified three putative RXRa binding sites which were mutated to test their direct effect on SHOX expression upon treatment with ATRA 250 nM in U2OS cells (n = 4). Experiments were performed in triplicates. RLU, Relative Light Units."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "C", ".", "Wild", "type", "embryos", "injected", "with", "control", "MO", "or", "with", "shox", "MO", ".", "(", "A", ")", "Lateral", "views", "of", "the", "embryos", "at", "55", "hours", "post", "fertilization", "(", "hpf", ")", ".", "(", "B", ")", "Dorsal", "view", "and", "magnification", "on", "the", "lateral", "view", "of", "the", "embryos", ".", "Dotted", "line", ",", "pectoral", "fins", ".", "shox", "morphants", "show", "smaller", "fins", "compared", "to", "controls", "(", "n", "=", "30", "embryos", ")", ".", "A", "-", "C", ".", "Wild", "type", "embryos", "injected", "with", "control", "MO", "or", "with", "shox", "MO", ".", "C", ".", "Expression", "of", "col2a1", "at", "55", "hpf", "was", "examined", "by", "in", "situ", "hybridization", "in", "wild", "type", "embryos", "injected", "with", "control", "MO", "and", "with", "shox", "MO", ".", "Arrow", "and", "dotted", "line", "indicate", "the", "pectoral", "fin", ".", "A", "-", "C", ".", "Wild", "type", "embryos", "injected", "with", "control", "MO", "or", "with", "shox", "MO", ".", "D", ".", "Pectoral", "fin", "area", "was", "measured", "by", "imageJ", "(", "n", "=", "30", "embryos", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-C. Wild type embryos injected with control MO or with shox MO. (A) Lateral views of the embryos at 55 hours post fertilization (hpf). (B) Dorsal view and magnification on the lateral view of the embryos. Dotted line, pectoral fins. shox morphants show smaller fins compared to controls (n = 30 embryos).A-C. Wild type embryos injected with control MO or with shox MO. C. Expression of col2a1 at 55 hpf was examined by in situ hybridization in wild type embryos injected with control MO and with shox MO. Arrow and dotted line indicate the pectoral fin.A-C. Wild type embryos injected with control MO or with shox MO. D. Pectoral fin area was measured by imageJ (n = 30 embryos)."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "D", ".", "Wild", "type", "embryos", "injected", "with", "control", "MO", "or", "with", "cyp26c1", "MO", ".", "(", "A", ")", "Lateral", "views", "of", "the", "embryos", "at", "55", "hours", "post", "fertilization", "(", "hpf", ")", ".", "(", "B", ")", "Dorsal", "view", "and", "magnification", "on", "the", "lateral", "view", "of", "the", "embryos", ".", "Dotted", "line", ",", "pectoral", "fins", ";", "*", ",", "otic", "vesicle", ".", "cyp26c1", "morphants", "show", "smaller", "fins", "compared", "to", "controls", "(", "n", "=", "30", "embryos", ")", ".", "A", "-", "D", ".", "Wild", "type", "embryos", "injected", "with", "control", "MO", "or", "with", "cyp26c1", "MO", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Expression", "of", "col2a1", "(", "C", ")", "and", "shox", "(", "D", ")", "at", "55", "hpf", "was", "examined", "by", "in", "situ", "hybridization", "in", "embryos", "injected", "with", "control", "MO", "or", "with", "cyp26c1", "MO", ".", "(", "C", ")", "Dorsal", "view", "and", "magnification", "on", "the", "pectoral", "fins", "of", "col2a1expression", ".", "Arrow", "and", "dotted", "line", "indicate", "the", "pectoral", "fin", ".", "(", "D", ")", "Dorsal", "view", "and", "magnification", "on", "the", "pectoral", "fins", "of", "shox", "expression", ".", "Arrow", "and", "dotted", "line", "indicate", "the", "pectoral", "fin", ".", "E", ".", "Pectoral", "fin", "area", "was", "measured", "by", "imageJ", "(", "n", "=", "30", "embryos", ")", ".", "F", ".", "Cignal", "-", "RARE", "system", "luciferase", "assay", "testing", "cyp26c1", "MO", "on", "RA", "acid", "levels", "in", "zebrafishembryos", "(", "n", "=", "5", "replicates", ")", ".", "Embryos", "were", "separated", "in", "groups", "of", "20", "-", "30", "and", "luciferase", "assayed", ".", "RLU", ",", "Relative", "Light", "Units", ".", "G", ".", "Relative", "shox", "mRNA", "expression", "normalized", "to", "reference", "genes", "eef1a", "and", "b", "-", "actin", "in", "zebrafishembryos", "injected", "with", "control", "MO", "or", "cyp26c1", "MO", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "RNA", "was", "extracted", "from", "10", "-", "15", "injected", "embryos", "at", "55", "hours", "post", "fertilization", ".", "H", ".", "Relative", "shox", "mRNA", "expression", "normalized", "to", "reference", "genes", "eef1a", "and", "b", "-", "actin", "in", "zebrafishembryos", "treated", "with", "100", "nM", "ATRA", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Embryos", "were", "collected", "at", "24", "hpf", "and", "treated", "with", "mock", "control", "or", "ATRA", ".", "RNA", "was", "extracted", "from", "10", "-", "15", "embryos", "after", "6", "hours", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-D. Wild type embryos injected with control MO or with cyp26c1 MO. (A) Lateral views of the embryos at 55 hours post fertilization (hpf). (B) Dorsal view and magnification on the lateral view of the embryos. Dotted line, pectoral fins; *, otic vesicle. cyp26c1 morphants show smaller fins compared to controls (n = 30 embryos).A-D. Wild type embryos injected with control MO or with cyp26c1 MO. (C, D) Expression of col2a1(C) and shox (D) at 55 hpf was examined by in situ hybridization in embryos injected with control MO or with cyp26c1 MO. (C) Dorsal view and magnification on the pectoral fins of col2a1expression. Arrow and dotted line indicate the pectoral fin. (D) Dorsal view and magnification on the pectoral fins of shox expression. Arrow and dotted line indicate the pectoral fin.E. Pectoral fin area was measured by imageJ (n = 30 embryos).F. Cignal-RARE system luciferase assay testing cyp26c1 MO on RA acid levels in zebrafishembryos (n = 5 replicates). Embryos were separated in groups of 20-30 and luciferase assayed. RLU, Relative Light Units.G. Relative shox mRNA expression normalized to reference genes eef1a and b-actin in zebrafishembryos injected with control MO or cyp26c1 MO (n = 4). RNA was extracted from 10-15 injected embryos at 55 hours post fertilization.H. Relative shox mRNA expression normalized to reference genes eef1a and b-actin in zebrafishembryos treated with 100 nM ATRA (n = 4). Embryos were collected at 24 hpf and treated with mock control or ATRA. RNA was extracted from 10-15 embryos after 6 hours treatment."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "C", ".", "Wild", "type", "embryos", "injected", "with", "control", "MO", ",", "subphenotypic", "doses", "of", "shox", "MO", ",", "cyp26c1", "MO", "or", "a", "combination", "of", "shox", "+", "cyp26c1", "MOs", ".", "(", "A", ")", "Dorsal", "views", "of", "the", "embryos", "at", "55", "hours", "post", "fertilization", "(", "hpf", ")", ".", "Dotted", "line", ",", "pectoral", "fins", ".", "shox", "+", "cyp26c1", "double", "morphants", "show", "smaller", "fins", "compared", "to", "control", "and", "single", "MOs", "(", "n", "=", "30", "embryos", ")", ".", "A", "-", "C", ".", "Wild", "type", "embryos", "injected", "with", "control", "MO", ",", "subphenotypic", "doses", "of", "shox", "MO", ",", "cyp26c1", "MO", "or", "a", "combination", "of", "shox", "+", "cyp26c1", "MOs", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Dorsal", "view", "and", "magnification", "on", "the", "pectoral", "fins", "of", "col2a1expression", "at", "55", "hpf", ".", "Arrow", "and", "dotted", "line", "indicate", "the", "pectoral", "fin", ".", "D", ".", "Pectoral", "fins", "area", "was", "measured", "by", "imageJ", "(", "n", "=", "30", "embryos", ")", ".", "E", ".", "Relative", "expression", "of", "shox", "mRNA", "normalized", "to", "reference", "genes", "eef1a", "and", "b", "-", "actin", "in", "zebrafishembryos", "injected", "with", "control", "MO", ",", "shox", "MO", ",", "cyp26c1", "MO", ",", "or", "shox", "+", "cyp26c1", "MOs", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "RNA", "was", "extracted", "from", "10", "-", "15", "injected", "embryos", "at", "55", "hours", "post", "fertilization", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-C. Wild type embryos injected with control MO, subphenotypic doses of shox MO, cyp26c1 MO or a combination of shox + cyp26c1 MOs. (A) Dorsal views of the embryos at 55 hours post fertilization (hpf). Dotted line, pectoral fins. shox + cyp26c1 double morphants show smaller fins compared to control and single MOs (n = 30 embryos).A-C. Wild type embryos injected with control MO, subphenotypic doses of shox MO, cyp26c1 MO or a combination of shox + cyp26c1 MOs. (B, C) Dorsal view and magnification on the pectoral fins of col2a1expression at 55 hpf. Arrow and dotted line indicate the pectoral fin.D. Pectoral fins area was measured by imageJ (n = 30 embryos).E. Relative expression of shox mRNA normalized to reference genes eef1a and b-actin in zebrafishembryos injected with control MO, shox MO, cyp26c1 MO, or shox + cyp26c1 MOs (n = 4). RNA was extracted from 10-15 injected embryos at 55 hours post fertilization."}
{"words": ["Figure", "1B", "Western", "blots", "of", "whole", "-", "cell", "extracts", "showing", "efficient", "degradation", "of", "PDS5A", "or", "PDS5B", "(", "left", ",", "right", ")", "with", "dTAG", "treatment", "(", "at", "different", "time", "points", ")", ".", "D", "ChIP", "-", "seq", "signal", "for", "FLAG", "-", "PDS5A", "and", "FLAG", "-", "PDSB", "(", "ChIP", "assays", "were", "performed", "with", "antibodies", "against", "Flag", "and", "PDS5A", "/", "B", ")", "centered", "at", "TSS", "of", "promoters", "(", "±", "3", "kb", ")", "across", "all", "peaks", "called", "for", "each", "of", "the", "proteins", "in", "DMSO", "treated", "PDS5A", "-", "dTAG", "or", "PDS5B", "-", "dTAG", "cells", ",", "showing", "the", "drastic", "reduction", "in", "PDS5A", "/", "B", "enrichment", "on", "chromatin", "after", "degradation", ".", "Top", ":", "normalized", "signal", "intensities", "for", "each", "protein", ".", "F", "ChIP", "-", "qPCR", "using", "Flag", "antibody", "demonstrating", "complete", "depletion", "of", "PDS5A", "or", "PDS5B", "(", "left", ",", "right", ")", "in", "H19", "/", "IGF2", "imprinting", "locus", "and", "the", "promoter", "region", "of", "PCDH10", ",", "NC", "represents", "a", "negative", "binding", "site", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "from", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Western blots of whole-cell extracts showing efficient degradation of PDS5A or PDS5B (left, right) with dTAG treatment (at different time points).D ChIP-seq signal for FLAG-PDS5A and FLAG-PDSB (ChIP assays were performed with antibodies against Flag and PDS5A/B) centered at TSS of promoters (± 3 kb) across all peaks called for each of the proteins in DMSO treated PDS5A-dTAG or PDS5B-dTAG cells, showing the drastic reduction in PDS5A/B enrichment on chromatin after degradation. Top: normalized signal intensities for each protein.F ChIP-qPCR using Flag antibody demonstrating complete depletion of PDS5A or PDS5B (left, right) in H19/IGF2 imprinting locus and the promoter region of PCDH10, NC represents a negative binding site. Data are represented as mean±SD from three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2B", "Heatmaps", "of", "signal", "intensities", "for", "FLAG", "-", "PDS5A", ",", "FLAG", "-", "PDS5B", ",", "CTCF", ",", "and", "RAD21", "ChIP", "-", "seq", "data", "across", "all", "defined", "FLAG", "-", "PDS5A", "peaks", ".", "C", "Averaged", "ChIP", "-", "seq", "signal", "densities", "of", "FLAG", "-", "PDS5A", ",", "FLAG", "-", "PDS5B", ",", "RAD21", ",", "and", "CTCF", "on", "PDS5A", "&", "PDS5B", "common", "sites", "and", "PDS5A", "/", "PDS5B", "unique", "sites", ".", "F", "Reciprocal", "Re", "-", "ChIP", "for", "PDS5A", "and", "PDS5B", ".", "The", "co", "-", "binding", "of", "PDS5A", "and", "PDS5B", "at", "PDS5A", "&", "PDS5B", "common", "sites", "were", "assayed", "by", "Re", "-", "ChIP", "-", "qPCR", ".", "The", "second", "ChIP", "for", "Re", "-", "ChIP", "was", "performed", "using", "antibodies", "against", "PDS5A", ",", "FLAG", "(", "PDS5B", ")", ",", "RAD21", ",", "control", "IgG", ".", "RAD21", "served", "as", "a", "positive", "control", ".", "Data", "are", "shown", "as", "fold", "enrichment", "versus", "IgG", "(", "mean", "±", "SD", "from", "three", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Heatmaps of signal intensities for FLAG-PDS5A, FLAG-PDS5B, CTCF, and RAD21 ChIP-seq data across all defined FLAG-PDS5A peaks.C Averaged ChIP-seq signal densities of FLAG-PDS5A, FLAG-PDS5B, RAD21, and CTCF on PDS5A & PDS5B common sites and PDS5A/PDS5B unique sites.F Reciprocal Re-ChIP for PDS5A and PDS5B. The co-binding of PDS5A and PDS5B at PDS5A&PDS5B common sites were assayed by Re-ChIP-qPCR. The second ChIP for Re-ChIP was performed using antibodies against PDS5A, FLAG(PDS5B), RAD21, control IgG. RAD21 served as a positive control. Data are shown as fold enrichment versus IgG (mean±SD from three biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "5A", "Validation", "of", "PDS5A", ";", "PDS5B", "-", "dTAG", "cells", "for", "simultaneous", "depletion", "of", "PDS5A", "and", "PDS5B", ".", "B", "Chromatin", "fractionation", "assay", "showing", "the", "change", "of", "chromatin", "-", "bound", "level", "of", "RAD21", "or", "CTCF", "after", "co", "-", "depletion", "of", "PDS5A", "and", "PDS5B", ".", "C", "Heatmaps", "displaying", "the", "ChIP", "-", "seq", "binding", "intensities", "for", "significantly", "changed", "RAD21", "peaks", "after", "joint", "PDS5", "proteins", "depletion", "(", "left", ")", ".", "Veen", "diagram", "showing", "RAD21", "peaks", "identified", "in", "cells", "before", "and", "after", "co", "-", "depletion", "of", "PDS5A", "and", "PDS5B", ".", "D", "Changes", "of", "RAD21", "signals", "at", "all", "loop", "anchors", "defined", "in", "PDS5A", "-", "dTAG", "cells", "or", "PDS5B", "-", "dTAG", "cells", "with", "DMSO", "treatment", "after", "PDS5A", "and", "PDS5B", "co", "-", "depletion", ",", "or", "either", "depletion", ".", "For", "PDS5A", ";", "PDS5B", "-", "dTAG", "cells", ",", "we", "used", "the", "genomic", "positions", "of", "loop", "anchors", "identified", "in", "DMSO", "treated", "PDS5A", "-", "dTAG", "cells", ".", "E", "Differential", "RAD21", "ChIP", "-", "seq", "signals", "of", "representative", "regions", "showing", "significantly", "down", "-", "regulated", "peaks", "after", "co", "-", "depletion", "of", "PDS5A", "and", "PDS5B", ".", "F", "Differential", "RAD21", "ChIP", "-", "seq", "signals", "of", "representative", "regions", "showing", "significantly", "up", "-", "regulated", "peaks", "after", "co", "-", "depletion", "of", "PDS5A", "and", "PDS5B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Validation of PDS5A;PDS5B-dTAG cells for simultaneous depletion of PDS5A and PDS5B.B Chromatin fractionation assay showing the change of chromatin-bound level of RAD21 or CTCF after co-depletion of PDS5A and PDS5B.C Heatmaps displaying the ChIP-seq binding intensities for significantly changed RAD21 peaks after joint PDS5 proteins depletion (left). Veen diagram showing RAD21 peaks identified in cells before and after co-depletion of PDS5A and PDS5B.D Changes of RAD21 signals at all loop anchors defined in PDS5A-dTAG cells or PDS5B-dTAG cells with DMSO treatment after PDS5A and PDS5B co-depletion, or either depletion. For PDS5A;PDS5B-dTAG cells, we used the genomic positions of loop anchors identified in DMSO treated PDS5A-dTAG cells. E Differential RAD21 ChIP-seq signals of representative regions showing significantly down-regulated peaks after co-depletion of PDS5A and PDS5B. F Differential RAD21 ChIP-seq signals of representative regions showing significantly up-regulated peaks after co-depletion of PDS5A and PDS5B."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "Volcano", "plots", "showing", "gene", "expression", "changes", "after", "PDS5A", "(", "A", ")", "and", "PDS5B", "(", "B", ")", "degradation", ".", "Genes", "with", "significant", "changes", "(", "padj", "<", "0", ".", "05", ")", "are", "colored", "blue", "(", "upregulated", ")", "or", "red", "(", "downregulated", ")", ".", "C", "The", "overlap", "and", "discrepancy", "of", "PDS5A", "and", "PDS5B", "misregulated", "genes", "(", "left", ")", ".", "Heatmap", "displaying", "Benjamini", "-", "Hochberg", "adjusted", "p", "-", "value", "of", "shared", "genes", "down", "-", "regulated", "and", "up", "-", "regulated", "after", "PDS5A", "or", "PDS5B", "depletion", "(", "right", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B Volcano plots showing gene expression changes after PDS5A (A) and PDS5B (B) degradation. Genes with significant changes (padj < 0.05) are colored blue (upregulated) or red (downregulated).C The overlap and discrepancy of PDS5A and PDS5B misregulated genes (left). Heatmap displaying Benjamini-Hochberg adjusted p-value of shared genes down-regulated and up-regulated after PDS5A or PDS5B depletion (right)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Evaluation", "of", "siRNA", "-", "mediated", "depletion", ".", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "control", ",", "Plk4", "or", "hSAS", "-", "6", "siRNA", "and", "immunoblotting", "was", "performed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Asterisk", "indicates", "non", "-", "specific", "bands", ".", "The", "positions", "of", "molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "B", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "Cell", "peripheries", "are", "marked", "with", "dotted", "lines", ".", "Enlarged", "single", "cell", "images", "(", "marked", "with", "arrowheads", "in", "the", "top", "row", ")", "are", "shown", "at", "the", "bottom", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", "(", "bottom", ")", ",", "10", "μm", "(", "top", ")", ".", "C", ",", "D", ",", "E", ".", "Quantification", "of", "the", "dispersion", "of", "satellite", "components", "upon", "depletion", "of", "Plk4", "but", "not", "hSAS", "-", "6", "knockdown", ".", "The", "results", "of", "PCM1", "(", "C", ")", ",", "hMsd1", "/", "SSX2IP", "(", "D", ")", "or", "BBS4", "(", "E", ")", "are", "shown", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "+", "SD", "(", ">", "200", "cells", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", ".", "s", ".", "(", "not", "significant", ")", ".", "F", ",", "G", ".", "U2OS", "cells", "were", "arrested", "in", "G1", "and", "treated", "with", "control", "or", "Plk4", "siRNA", ",", "followed", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "by", "using", "indicated", "antibodies", ".", "Enlarged", "images", "(", "marked", "by", "arrowheads", ")", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "Quantification", "of", "PCM1", "distribution", "is", "shown", "in", "G", ".", ">", "200", "cells", "were", "counted", "and", "classified", "into", "two", "categories", ":", "normal", "(", "around", "and", "away", "from", "the", "centrosome", ")", "or", "dispersed", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "+", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "μm", "(", "F", ",", "right", ")", ",", "10", "μm", "(", "F", ")", ".", "H", ",", "I", ".", "siRNA", "-", "treated", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "vectors", "(", "EV", ")", "or", "plasmids", "containing", "Plk4", "or", "siRNA", "-", "resistant", "Plk4", "-", "myc", "WT", "*", "or", "KD", "*", "and", "immunostained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Cell", "peripheries", "are", "marked", "with", "solid", "lines", ",", "in", "which", "cells", "with", "yellow", "lines", "are", "successfully", "transfected", "(", "positive", "in", "myc", "signals", ")", ",", "while", "those", "with", "white", "lines", "represent", "non", "-", "transfected", "cells", ".", "Quantification", "of", "PCM1", "distribution", "is", "shown", "in", "I", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "+", "SD", "(", ">", "200", "cells", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", ".", "s", ".", "(", "not", "significant", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", "(", "H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Evaluation of siRNA-mediated depletion. U2OS cells were treated with control, Plk4 or hSAS-6 siRNA and immunoblotting was performed with the indicated antibodies. Asterisk indicates non-specific bands. The positions of molecular weight markers (kDa) are shown on the right.B. U2OS cells were transfected with the indicated siRNAs. Cell peripheries are marked with dotted lines. Enlarged single cell images (marked with arrowheads in the top row) are shown at the bottom. Scale bars, 5 μm (bottom),10 μm (top).C, D, E. Quantification of the dispersion of satellite components upon depletion of Plk4 but not hSAS-6 knockdown. The results of PCM1 (C), hMsd1/SSX2IP (D) or BBS4 (E) are shown. Data represent the mean + SD (>200 cells, n=3). Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired student's t-tests. **p<0.01, n.s. (not significant).F, G. U2OS cells were arrested in G1 and treated with control or Plk4 siRNA, followed by immunofluorescence microscopy by using indicated antibodies. Enlarged images (marked by arrowheads) are shown on the right. Quantification of PCM1 distribution is shown in G. >200 cells were counted and classified into two categories: normal (around and away from the centrosome) or dispersed. Data represent the mean + SD (n=3). Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired student's t-tests. **p<0.01. Scale bar, 1 μm (F, right), 10 μm (F).H, I. siRNA-treated U2OS cells were transfected with empty vectors (EV) or plasmids containing Plk4 or siRNA-resistant Plk4-myc WT* or KD* and immunostained with the indicated antibodies. Cell peripheries are marked with solid lines, in which cells with yellow lines are successfully transfected (positive in myc signals), while those with white lines represent non-transfected cells. Quantification of PCM1 distribution is shown in I. Data represent the mean + SD (>200 cells, n=3). Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired student's t-tests. ****p<0.0001, **p<0.01, n.s. (not significant). Scale bar, 5 μm (H)."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", ".", "Either", "empty", "vector", "plasmids", "(", "EV", ")", "or", "those", "producing", "EGFP", "-", "PCM1", "(", "A", ")", "or", "myc", "-", "Plk4", "(", "B", ")", "were", "transfected", "into", "U2OS", "cells", ".", "Immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "was", "performed", "with", "anti", "-", "GFP", "(", "A", ")", "or", "anti", "-", "myc", "antibodies", "(", "B", ")", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "DIC", ",", "the", "dynein", "intermediate", "chain", ".", "C", ".", "Bacterially", "expressed", "and", "purified", "His", "-", "PCM1", "(", "a", ".", "a", ".", "1", "-", "1128", ")", "was", "incubated", "with", "MBP", "alone", "or", "MBP", "-", "Plk4", "(", "WT", "or", "KD", ")", "in", "vitro", ",", "and", "pulled", "down", "by", "magnetic", "beads", "coupled", "with", "an", "anti", "-", "MBP", "antibody", ",", "followed", "by", "staining", "with", "Coomassie", "Blue", "(", "left", ")", "or", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "His", "antibody", "(", "right", ")", ".", "Asterisks", "show", "non", "-", "specific", "bands", ".", "The", "mobility", "difference", "between", "Plk4", "-", "WT", "and", "Plk4", "-", "KD", "was", "reported", "previously", "[", "43", ",", "48", "]", ".", "We", "reproducibly", "observed", "the", "upward", "mobility", "shift", "of", "His", "-", "PCM1", "upon", "binding", "to", "MBP", "-", "Plk4", "-", "WT", ",", "but", "not", "Plk4", "-", "KD", ".", "E", ".", "Total", "cell", "extracts", "were", "prepared", "from", "U2OS", "cells", "treated", "with", "PCM1", "siRNA", "and", "transfected", "with", "RNAi", "-", "resistant", "EGFP", "-", "PCM1", "-", "WT", "*", ".", "Cells", "were", "cultured", "asynchronously", "(", "As", ")", "or", "arrested", "in", "G1", ",", "G2", "or", "M", "phase", ",", "followed", "by", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "Pulled", "down", "samples", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B. Either empty vector plasmids (EV) or those producing EGFP-PCM1 (A) or myc-Plk4 (B) were transfected into U2OS cells. Immunoprecipitation (IP) was performed with anti-GFP (A) or anti-myc antibodies (B), followed by immunoblotting with the indicated antibodies. DIC, the dynein intermediate chain.C. Bacterially expressed and purified His-PCM1 (a.a. 1-1128) was incubated with MBP alone or MBP-Plk4 (WT or KD) in vitro, and pulled down by magnetic beads coupled with an anti-MBP antibody, followed by staining with Coomassie Blue (left) or immunoblotting with an anti-His antibody (right). Asterisks show non-specific bands. The mobility difference between Plk4-WT and Plk4-KD was reported previously [43, 48]. We reproducibly observed the upward mobility shift of His-PCM1 upon binding to MBP-Plk4-WT, but not Plk4-KD.E. Total cell extracts were prepared from U2OS cells treated with PCM1 siRNA and transfected with RNAi-resistant EGFP-PCM1-WT*. Cells were cultured asynchronously (As) or arrested in G1, G2 or M phase, followed by immunoprecipitation with an anti-GFP antibodies. Pulled down samples were immunoblotted with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ",", "C", ",", "D", ".", "siRNA", "-", "treated", "U2OS", "cells", "(", "PCM1", "for", "A", "and", "B", ";", "Plk4", "for", "C", "and", "D", ")", "were", "transfected", "with", "plasmids", "producing", "various", "EGFP", "-", "PCM1", "constructs", "(", "WT", "*", ",", "S372A", "*", ",", "S372D", "*", "or", "S372E", "*", ")", ",", "fixed", "and", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "arrowheads", "point", "to", "the", "centrosome", ")", "(", "A", "and", "C", ")", ".", "Quantification", "data", "are", "shown", "in", "B", "and", "D", ".", ">", "200", "cells", "were", "counted", "and", "classified", "into", "three", "categories", ":", "normal", "(", "around", "and", "away", "from", "the", "centrosome", ")", ",", "aggregated", "or", "dispersed", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "+", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "(", "not", "significant", ")", ".", "Note", "that", "the", "percentage", "of", "cells", "displaying", "\"", "dispersed", "\"", "is", "analysed", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", "(", "A", "and", "C", ")", ".", "E", ".", "PCM1", "siRNA", "-", "treated", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "two", "types", "of", "plasmids", "(", "EGFP", "-", "and", "mCherry", "-", "tagged", ")", "that", "produce", "PCM1", "-", "WT", "*", "and", "PCM1", "-", "S372A", "*", ".", "Immunoprecipitation", "and", "subsequent", "immunoblotting", "were", "performed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Quantification", "data", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "F", ".", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "PCM1", "siRNA", "and", "transfected", "with", "empty", "vectors", "(", "EV", ")", "or", "EGFP", "plasmids", "that", "produce", "PCM1", "-", "WT", "*", "or", "PCM1", "-", "S372A", "*", ".", "Immunoprecipitation", "was", "performed", "with", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B, C, D. siRNA-treated U2OS cells (PCM1 for A and B; Plk4 for C and D) were transfected with plasmids producing various EGFP-PCM1 constructs (WT*, S372A*, S372D* or S372E*), fixed and stained with the indicated antibodies (arrowheads point to the centrosome) (A and C). Quantification data are shown in B and D. >200 cells were counted and classified into three categories: normal (around and away from the centrosome), aggregated or dispersed. Data represent the mean + SD (n=3). Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired student's t-tests. ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, n.s. (not significant). Note that the percentage of cells displaying \"dispersed\" is analysed. Scale bars, 5 μm (A and C).E. PCM1 siRNA-treated U2OS cells were transfected with two types of plasmids (EGFP- and mCherry-tagged) that produce PCM1-WT* and PCM1-S372A*. Immunoprecipitation and subsequent immunoblotting were performed with the indicated antibodies. Quantification data is shown on the right. Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired student's t-tests. *p<0.05, **p<0.01, n.s. not significant.F. U2OS cells were treated with PCM1 siRNA and transfected with empty vectors (EV) or EGFP plasmids that produce PCM1-WT* or PCM1-S372A*. Immunoprecipitation was performed with an anti-GFP antibody, followed by immunoblotting with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "was", "performed", "using", "the", "indicated", "antibodies", "in", "hTERT", "-", "RPE", "-", "1", "cells", "treated", "with", "control", ",", "PCM1", "or", "Plk4", "siRNA", ".", "Regions", "around", "the", "basal", "body", "(", "insets", ")", "are", "enlarged", "on", "the", "right", "hand", "side", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", "(", "left", ")", "and", "1", "μm", "(", "right", ")", ".", "B", ".", "Quantification", ".", "At", "least", "150", "cells", "were", "counted", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "C", ".", "hTERT", "-", "RPE", "-", "1", "cells", "treated", "with", "PCM1", "siRNA", "were", "transfected", "by", "an", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "or", "plasmids", "producing", "PCM1", "-", "WT", "*", ",", "-", "S327A", "*", "or", "-", "S372E", "*", ",", "and", "immunofluorescence", "microscopy", "performed", ".", "Enlarged", "images", "of", "the", "regions", "around", "the", "basal", "body", "are", "shown", "in", "insets", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", "and", "1", "μm", "(", "inset", ")", ".", "D", ".", "Quantification", ".", "At", "least", "200", "cells", "were", "counted", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Immunofluorescence microscopy was performed using the indicated antibodies in hTERT-RPE-1 cells treated with control, PCM1 or Plk4 siRNA. Regions around the basal body (insets) are enlarged on the right hand side. Scale bars, 5 μm (left) and 1 μm (right).B. Quantification. At least 150 cells were counted (n=3). Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired student's t-tests. ***p<0.001, ****p<0.0001.C. hTERT-RPE-1 cells treated with PCM1 siRNA were transfected by an empty vector (EV) or plasmids producing PCM1-WT*, -S327A* or -S372E*, and immunofluorescence microscopy performed. Enlarged images of the regions around the basal body are shown in insets. Scale bars, 5 μm and 1 μm (inset).D. Quantification. At least 200 cells were counted (n=3). Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired student's t-tests. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, n.s. not significant."}
{"words": ["Figure", "1Graphs", "show", "changes", "in", "cytotoxicity", "between", "WT", "and", "GR", "T24", "and", "UMUC3", "cells", "exposed", "to", "increasing", "concentrations", "of", "GEM", ",", "and", "WST", "assays", "were", "performed", "48", "hr", "after", "treatment", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Major", "metabolites", "altered", "in", "the", "glycolytic", "pathway", "in", "CR", "cells", "and", "GR", "cells", "compared", "to", "WT", "cells", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "GLUT1", ",", "PKM2", ",", "LDHA", ",", "and", "β", "-", "actin", "compared", "among", "WT", ",", "CR", ",", "and", "GR", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Graphs show changes in cytotoxicity between WT and GR T24 and UMUC3 cells exposed to increasing concentrations of GEM, and WST assays were performed 48 hr after treatment (n=3, biological replicates).Major metabolites altered in the glycolytic pathway in CR cells and GR cells compared to WT cells. The data are shown as the means ± SDs (n=4) and were analyzed by Student's t test.Western blot analysis of GLUT1, PKM2, LDHA, and β-actin compared among WT, CR, and GR cells."}
{"words": ["Figure", "2Levels", "of", "endpoint", "metabolites", "of", "the", "purine", "synthesis", "pathway", "in", "GR", "cells", "relative", "to", "those", "in", "WT", "cells", "as", "determined", "by", "CE", "-", "MS", "metabolomics", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "n", ".", "s", ".", "=", "non", "-", "significant", "Levels", "of", "endpoint", "metabolites", "of", "the", "pyrimidine", "synthesis", "pathway", "in", "GR", "cells", "relative", "to", "those", "in", "WT", "cells", "as", "determined", "by", "CE", "-", "MS", "metabolomics", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Hif", "-", "1α", ",", "G6PD", ",", "TIGAR", ",", "TKT", ",", "CTPS1", ",", "and", "β", "-", "actin", "in", "WT", "and", "GR", "cells", "under", "normoxia", "and", "hypoxia", "(", "left", ":", "T24", "cells", ",", "right", ":", "UMUC3", "cells", ")", ".", "CE", "-", "MS", "-", "based", "metabolite", "detection", "for", "diphosphate", "nucleosides", "in", "WT", "and", "GR", "cells", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "The", "levels", "in", "GR", "cells", "are", "presented", "relative", "to", "those", "in", "WT", "control", "cells", "and", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "N", ".", "D", ".", "=", "non", "-", "detectable", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Levels of endpoint metabolites of the purine synthesis pathway in GR cells relative to those in WT cells as determined by CE-MS metabolomics. The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates) and were analyzed by Student's t test. n.s.= non-significant   Levels of endpoint metabolites of the pyrimidine synthesis pathway in GR cells relative to those in WT cells as determined by CE-MS metabolomics. The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates) and were analyzed by Student's t test. *p<0.05, **p<0.01.  Western blot analysis of Hif-1α, G6PD, TIGAR, TKT, CTPS1, and β-actin in WT and GR cells under normoxia and hypoxia (left: T24 cells, right: UMUC3 cells).CE-MS-based metabolite detection for diphosphate nucleosides in WT and GR cells. The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates). The levels in GR cells are presented relative to those in WT control cells and analyzed by Student's t test. ***p<0.001. N.D.= non-detectable."}
{"words": ["Figure", "3Levels", "of", "intermediate", "metabolites", "of", "the", "tricarboxylic", "acid", "cycle", "(", "TCA", ")", "cycle", "in", "GR", "cells", "relative", "to", "those", "in", "WT", "cells", "based", "on", "targeted", "CE", "-", "MS", "metabolomics", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Relative", "2", "-", "hydroxyglutarate", "(", "2", "-", "HG", ")", "production", "level", "based", "on", "targeted", "CE", "-", "MS", "metabolomics", "comparing", "among", "WT", "and", "GR", "cells", "(", "left", "panel", ":", "T24", ",", "right", "panel", ":", "UMUC3", ")", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Relative", "mRNA", "expression", "levels", "of", "IDH2", "and", "EGLN1", "genes", "compared", "between", "WT", "and", "GR", "cells", "(", "left", "panel", ":", "T24", ",", "right", "panel", ":", "UMUC3", ")", ".", "The", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "and", "plotted", "relative", "to", "expression", "levels", "in", "WT", "cells", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SEs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "IDH2", ",", "PHD2", ",", "and", "β", "-", "actin", "in", "WT", "and", "GR", "cells", "(", "left", "panel", ":", "T24", ",", "right", "panel", ":", "UMUC3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Levels of intermediate metabolites of the tricarboxylic acid cycle (TCA) cycle in GR cells relative to those in WT cells based on targeted CE-MS metabolomics. The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates) and were analyzed by Student's t test. *p<0.05, **p<0.01.Relative 2-hydroxyglutarate (2-HG) production level based on targeted CE-MS metabolomics comparing among WT and GR cells (left panel: T24, right panel: UMUC3). The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates) and were analyzed by Student's t test. *p<0.05, **p<0.01. Relative mRNA expression levels of IDH2 and EGLN1 genes compared between WT and GR cells (left panel: T24, right panel: UMUC3). The expression levels were analyzed by Student's t test and plotted relative to expression levels in WT cells. The data are shown as the means ± SEs (n=3, biological replicates. *p<0.05, ***p<0.001.Western blot analysis of IDH2, PHD2, and β-actin in WT and GR cells (left panel: T24, right panel: UMUC3)."}
{"words": ["Figure", "4Western", "blot", "analysis", "of", "Hif", "-", "1α", ",", "GLUT1", ",", "G6PD", ",", "TIGAR", ",", "TKT", ",", "CTPS1", ",", "PKM2", ",", "LDHA", ",", "and", "β", "-", "actin", "after", "transfection", "with", "NTC", "and", "IDH2", "-", "targeting", "(", "siHIF1A", "#", "1", "and", "#", "2", ")", "siRNAs", "(", "left", ":", "T24GR", ",", "right", ":", "UMUC3GR", ")", ".", "Relative", "mRNA", "expression", "levels", "of", "IDH2", ",", "GLUT1", ",", "G6PD", ",", "TIGAR", ",", "TKT", ",", "CTPS1", ",", "PKM2", ",", "and", "LDHA", "in", "cells", "transfected", "with", "siIDH2", "#", "1", "and", "#", "2", "compared", "with", "cells", "transfected", "with", "siNTC", "(", "upper", ":", "T24GR", ",", "lower", ":", "UMUC3GR", ")", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SEs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "and", "plotted", "relative", "to", "expression", "levels", "in", "GR", "cells", "transfected", "with", "siNTC", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "IDH2", ",", "PHD2", ",", "HIF", "-", "1α", ",", "G6PD", ",", "GLUT1", ",", "TIGAR", ",", "TKT", ",", "CTPS1", ",", "PKM2", ",", "LDHA", ",", "and", "β", "-", "actin", "after", "transfection", "with", "NTC", "and", "IDH2", "-", "targeting", "(", "siIDH2", "#", "1", "and", "#", "2", ")", "siRNA", "(", "left", ":", "T24GR", ",", "right", ":", "UMUC3GR", ")", ".", "Graph", "showing", "the", "viability", "of", "GR", "cells", "exposed", "to", "various", "concentrations", "of", "GEM", "for", "48", "hr", "after", "transfection", "with", "NTC", "and", "IDH2", "-", "targeting", "(", "siIDH2", "#", "1", "and", "#", "2", ")", "siRNA", "(", "left", ":", "T24GR", ",", "right", ":", "UMUC3GR", ")", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Western blot analysis of Hif-1α, GLUT1, G6PD, TIGAR, TKT, CTPS1, PKM2, LDHA, and β-actin after transfection with NTC and IDH2-targeting (siHIF1A#1 and #2) siRNAs (left: T24GR, right: UMUC3GR).Relative mRNA expression levels of IDH2, GLUT1, G6PD, TIGAR, TKT, CTPS1, PKM2, and LDHA in cells transfected with siIDH2#1 and #2 compared with cells transfected with siNTC (upper: T24GR, lower: UMUC3GR). The data are shown as the means ± SEs (n=3, biological replicates) and were analyzed by Student's t test, and plotted relative to expression levels in GR cells transfected with siNTC. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.   Western blot analysis of IDH2, PHD2, HIF-1α, G6PD, GLUT1, TIGAR, TKT, CTPS1, PKM2, LDHA, and β-actin after transfection with NTC and IDH2-targeting (siIDH2#1 and #2) siRNA (left: T24GR, right: UMUC3GR).  Graph showing the viability of GR cells exposed to various concentrations of GEM for 48 hr after transfection with NTC and IDH2-targeting (siIDH2#1 and #2) siRNA (left: T24GR, right: UMUC3GR) The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "5Relative", "mRNA", "expression", "levels", "of", "IDH2", ",", "EGLN1", ",", "Hif", "-", "1α", ",", "G6PD", ",", "TIGAR", ",", "TKT", ",", "and", "CTPS1", "between", "J82", "wild", "-", "type", "cells", "(", "J82WT", ")", "and", "J82", "cells", "with", "IDH2", "overexpression", "(", "J82", "-", "IDH2ox", "cells", ")", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SEs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "The", "expression", "levels", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "and", "are", "plotted", "relative", "to", "the", "expression", "levels", "in", "WT", "cells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "IDH2", ",", "PHD2", ",", "Hif", "-", "1α", ",", "G6PD", ",", "TIGAR", ",", "TKT", ",", "CTPS1", ",", "and", "β", "-", "actin", "in", "J82WT", "and", "J82", "-", "IDH2ox", "cells", ".", "Graph", "showing", "the", "viability", "of", "J82WT", "and", "J82", "-", "IDH2ox", "cells", "exposed", "to", "various", "concentrations", "of", "GEM", "for", "48", "hr", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Relative mRNA expression levels of IDH2, EGLN1, Hif-1α, G6PD, TIGAR, TKT, and CTPS1 between J82 wild-type cells (J82WT) and J82 cells with IDH2 overexpression (J82-IDH2ox cells). The data are shown as the means ± SEs (n=3, biological replicates). The expression levels were analyzed by Student's t test and are plotted relative to the expression levels in WT cells. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.Western blot analysis of IDH2, PHD2, Hif-1α, G6PD, TIGAR, TKT, CTPS1, and β-actin in J82WT and J82-IDH2ox cells.Graph showing the viability of J82WT and J82-IDH2ox cells exposed to various concentrations of GEM for 48 hr. The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates) and were analyzed by Student's t test. ***p<0.001."}
{"words": ["Figure", "6Changes", "in", "cytotoxicity", "between", "WT", "and", "GR", "T24", "and", "UMUC3", "cells", "exposed", "to", "increasing", "concentrations", "of", "CDDP", "for", "48", "hr", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Immunohistochemistry", "(", "IHC", ")", "staining", "of", "Ki", "-", "67", "in", "UMUC3WT", "and", "GR", "cells", "exposed", "to", "CDDP", "/", "GEM", ".", "Ki", "-", "67", "staining", "quantitation", "of", "UMUC3WT", "and", "UMUC3GR", "cells", "exposed", "to", "CDDP", "/", "GEM", "are", "shown", "as", "bar", "graph", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "the", "Bonferroni", "test", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", ".", "s", ".", "=", "non", "-", "significantNADPH", "/", "NADP", "ratios", "of", "GR", "cells", "transfected", "with", "NTC", ",", "IDH2", "siRNA", "#", "1", ",", "and", "siRNA", "#", "2", "(", "left", ":", "T24GR", ",", "right", ":", "UMUC3GR", ")", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", "and", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Changes in cytotoxicity between WT and GR T24 and UMUC3 cells exposed to increasing concentrations of CDDP for 48 hr. The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates).Immunohistochemistry (IHC) staining of Ki-67 in UMUC3WT and GR cells exposed to CDDP/GEM. Ki-67 staining quantitation of UMUC3WT and UMUC3GR cells exposed to CDDP/GEM are shown as bar graph The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates) and were analyzed by one-way ANOVA with the Bonferroni test. ** p<0.05, ***p<0.001. n.s.= non-significantNADPH/NADP ratios of GR cells transfected with NTC, IDH2 siRNA#1, and siRNA#2 (left: T24GR, right: UMUC3GR). The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates) and were analyzed by Student's t test. ** p<0.01."}
{"words": ["Figure", "7Graph", "showing", "the", "viability", "of", "GR", "cells", "exposed", "to", "various", "concentrations", "of", "GEM", "for", "48", "hr", "in", "combination", "with", "DMSO", "or", "10", "µM", "AGI6780", "(", "upper", ":", "T24GR", ",", "lower", ":", "UMUC3GR", ")", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "means", "±", "SDs", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "IHC", "staining", "for", "IDH2", ",", "Ki", "-", "67", ",", "CAIX", ",", "TIGAR", ",", "TKT", ",", "and", "CTPS1", "in", "groups", "with", "GEM", "alone", ",", "AGI6780", "alone", ",", "and", "the", "combination", "of", "GEM", "and", "AGI6780", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Graph showing the viability of GR cells exposed to various concentrations of GEM for 48 hr in combination with DMSO or 10 µM AGI6780 (upper: T24GR, lower: UMUC3GR). The data are shown as the means ± SDs (n=3, biological replicates).IHC staining for IDH2, Ki-67, CAIX, TIGAR, TKT, and CTPS1 in groups with GEM alone, AGI6780 alone, and the combination of GEM and AGI6780."}
{"words": ["Figure", "8Representative", "immunostaining", "of", "IDH2", ",", "CAIX", "(", "surrogate", "marker", "of", "Hif", "-", "1α", ")", ",", "TIGAR", ",", "TKT", ",", "and", "CTPS1", "in", "surgical", "specimens", "from", "upper", "tract", "urothelial", "carcinoma", "(", "UTUC", ")", "patients", ".", "The", "upper", "panel", "represents", "the", "immunostaining", "of", "metabolic", "enzymes", "of", "early", "-", "stage", "UTUC", "tumors", ",", "whereas", "the", "lower", "panel", "represents", "the", "images", "of", "invasive", "UTUC", "tumors", ".", "The", "power", "fieldKaplan", "-", "Meier", "curves", "showing", "the", "cancer", "-", "specific", "survival", "(", "CSS", ")", "of", "74", "UTUC", "patients", "treated", "with", "GC", "adjuvant", "chemotherapy", ".", "Metabolic", "enzymes", "were", "classified", "according", "to", "the", "results", "of", "receiver", "operating", "curve", "(", "ROC", ")", "analysis", ".", "Data", "were", "compared", "with", "the", "log", "-", "rank", "test", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "showing", "the", "CSS", "of", "32", "MIBC", "patients", "treated", "with", "GC", "chemotherapy", ".", "The", "cutoffs", "for", "metabolic", "enzyme", "levels", "were", "determined", "according", "to", "the", "results", "of", "ROC", "analysis", ".", "Data", "were", "compared", "with", "the", "log", "-", "rank", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Representative immunostaining of IDH2, CAIX (surrogate marker of Hif-1α), TIGAR, TKT, and CTPS1 in surgical specimens from upper tract urothelial carcinoma (UTUC) patients. The upper panel represents the immunostaining of metabolic enzymes of early-stage UTUC tumors, whereas the lower panel represents the images of invasive UTUC tumors. The power fieldKaplan-Meier curves showing the cancer-specific survival (CSS) of 74 UTUC patients treated with GC adjuvant chemotherapy. Metabolic enzymes were classified according to the results of receiver operating curve (ROC) analysis. Data were compared with the log-rank test.Kaplan-Meier method showing the CSS of 32 MIBC patients treated with GC chemotherapy. The cutoffs for metabolic enzyme levels were determined according to the results of ROC analysis. Data were compared with the log-rank test."}
{"words": ["Figure", "1Coomassie", "-", "stained", "proteins", "from", "bovine", "retina", "that", "were", "co", "-", "immunoprecipitated", "by", "the", "anti", "-", "RIBEYE", "antibody", "2D9", "(", "lane", "3", ")", ".", "Lane", "2", ",", "control", "precipitation", "by", "irrelevant", "mouse", "IgGs", ";", "lane", "1", ",", "input", "(", "10", "%", "of", "the", "total", "loaded", "in", "each", "lane", ")", "Western", "blot", "of", "the", "immunoprecipitated", "proteins", "(", "as", "in", "A", ",", "1", "%", "of", "the", "total", "protein", "was", "loaded", "per", "lane", ")", "probed", "with", "anti", "-", "RIBEYE", "(", "Ba", ")", ",", "anti", "-", "CASPR1", "(", "Bb", ")", "and", "anti", "-", "CNTN1", "(", "Bc", ")", ".", "The", "2D9", "antibody", "immunoprecipitated", "RIBEYE", "(", "Ba", ",", "lane", "3", ")", ",", "CASPR1", "(", "Bb", ",", "lane", "3", ")", "and", "CNTN1", "(", "Bc", ",", "lane", "3", ")", ";", "these", "proteins", "were", "not", "detectable", "in", "the", "control", "immunoprecipitations", ".", "Bd", ")", "As", "a", "loading", "control", ",", "heavy", "chains", "of", "the", "precipitating", "antibody", "(", "IgG", "hc", ")", "were", "visualized", "by", "the", "goat", "anti", "-", "mouse", "IgG", "antibody", "conjugated", "to"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Coomassie- stained proteins from bovine retina that were co-immunoprecipitated by the anti-RIBEYE antibody 2D9 (lane 3). Lane 2, control precipitation by irrelevant mouse IgGs; lane 1, input (10% of the total loaded in each lane) Western blot of the immunoprecipitated proteins (as in A, 1% of the total protein was loaded per lane) probed with anti-RIBEYE (Ba), anti-CASPR1 (Bb) and anti-CNTN1 (Bc). The 2D9 antibody immunoprecipitated RIBEYE (Ba, lane 3), CASPR1 (Bb, lane 3) and CNTN1 (Bc, lane 3); these proteins were not detectable in the control immunoprecipitations. Bd) As a loading control, heavy chains of the precipitating antibody (IgG hc) were visualized by the goat anti-mouse IgG antibody conjugated to peroxidase"}
{"words": ["Figure", "2Localization", "of", "CASPR", "in", "semi", "-", "thin", "sections", "of", "retinas", "from", "either", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", "mice", "(", "EAE", "mice", ")", "or", "CFA", "-", "injected", "control", "mice", "(", "9", "days", "after", "injection", ")", ".", "Semi", "-", "thin", "sections", "were", "double", "-", "immunolabelled", "with", "antibodies", "against", "CASPR1", "and", "RIBEYE", "(", "A", "-", "B", "OPL", ",", "outer", "plexiform", "layer", ";", "INL", ",", "nuclear", "layer", ";", "IPL", ",", "inner", "plexiform", "layer", ".", "Scale", "bars", ":", "20μmLocalization", "o", "visual", "-", "arrestin", "(", "v", "-", "arrestin", ")", "in", "semi", "-", "thin", "sections", "of", "retinas", "from", "either", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", "mice", "(", "EAE", "mice", ")", "or", "CFA", "-", "injected", "control", "mice", "(", "9", "days", "after", "injection", ")", ".", "Semi", "-", "thin", "sections", "were", "double", "-", "immunolabelle", "with", "antibodies", "against", "v", "-", "arrestin", "and", "RIBEYE", "(", "C", "-", "D", ")", "V", "-", "arrestin", ",", "visual", "arrestin", ";", "OPL", ",", "outer", "plexiform", "layer", ";", "INL", ",", "nuclear", "layer", ";", "IPL", ",", "inner", "plexiform", "layer", ".", "Scale", "bars", ":"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Localization of CASPR in semi-thin sections of retinas from either MOG/CFA-injected mice (EAE mice) or CFA-injected control mice (9 days after injection). Semi-thin sections were double-immunolabelled with antibodies against CASPR1 and RIBEYE (A-B OPL, outer plexiform layer; INL, nuclear layer; IPL, inner plexiform layer. Scale bars: 20μmLocalization o visual-arrestin (v-arrestin) in semi-thin sections of retinas from either MOG/CFA-injected mice (EAE mice) or CFA-injected control mice (9 days after injection). Semi-thin sections were double-immunolabelle with antibodies against v-arrestin and RIBEYE (C-D) V-arrestin, visual arrestin; OPL, outer plexiform layer; INL, nuclear layer; IPL, inner plexiform layer. Scale bars: 20μm"}
{"words": ["Figure", "3Localization", "of", "CNTN1", "in", "semi", "-", "thin", "(", "0", ".", "5μm", "-", "thin", ")", "sections", "of", "retinas", "from", "either", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", "mice", "(", "EAE", "mice", ")", "or", "CFA", "-", "injected", "control", "mice", "(", "9", "days", "after", "injection", ")", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Sections", "were", "double", "-", "immunolabelled", "with", "antibodies", "against", "CNTN1", "and", "RIBEYE", "proteins", "in", "the", "OPL", "and", "IPL", ".", "ONL", ",", "outer", "nuclear", "layer", ";", "OPL", ",", "outer", "plexiform", "layer", ";", "INL", ",", "nuclear", "layer", ";", "IPL", ",", "inner", "plexiform", "layerQuantification", "of", "the", "immunosignals", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "the", "OPL", "and", "IPL", ".", "ONL", ",", "outer", "nuclear", "layer", ";", "OPL", ",", "outer", "plexiform", "layer", ";", "INL", ",", "nuclear", "layer", ";", "IPL", ",", "inner", "plexiform", "layer", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "non", "-", "significant", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ",", "actual", "p", "-", "values", "are", "given", "in", "C", ")", "(", "N", "=", "6", "independent", "set", "of", "experiments", ";", "n", "=", "295", "images", "(", "CFA", ")", ";", "n", "=", "274", "images", "(", "MOG", "/", "CFA", ")", "for", "quantification", "of", "RIBEYE", "immunosignals", ";", "n", "=", "95", "(", "CFA", ")", ";", "n", "=", "92", "(", "MOG", "/", "CFA", ")", "for", "quantification", "of", "CASPR1", "immunosignals", ";", "n", "=", "91", "(", "CFA", ")", ",", "n", "=", "82", "(", "MOG", "/", "CFA", ")", "for", "CNTN1", "quantification", ";", "n", "=", "109", "(", "CFA", ")", ";", "n", "=", "100", "(", "MOG", "/", "CFA", ")", "for", "quantification", "of", "v", "-", "arrestin", ".", "Scale", "bars", ":"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Localization of CNTN1 in semi-thin (0.5μm-thin) sections of retinas from either MOG/CFA-injected mice (EAE mice) or CFA-injected control mice (9 days after injection). (A,B) Sections were double-immunolabelled with antibodies against CNTN1 and RIBEYE proteins in the OPL and IPL. ONL, outer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; INL, nuclear layer; IPL, inner plexiform layerQuantification of the immunosignals of the indicated proteins in the OPL and IPL. ONL, outer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; INL, nuclear layer; IPL, inner plexiform layer; n.s., non-significant; ***, p<0.001 (Mann-Whitney U test, actual p-values are given in C) (N=6 independent set of experiments; n=295 images (CFA); n=274 images (MOG/CFA) for quantification of RIBEYE immunosignals; n=95 (CFA); n=92 (MOG/CFA) for quantification of CASPR1 immunosignals; n=91 (CFA), n=82 (MOG/CFA) for CNTN1 quantification; n=109 (CFA); n=100 (MOG/CFA) for quantification of v-arrestin. Scale bars: 20μm"}
{"words": ["Figure", "4MOG", "/", "CFA", "-", "but", "not", "CFA", "-", "injected", "mice", "contain", "reactive", "antibodies", "for", "retinal", "proteins", "in", "blood", "and", "show", "altered", "spatial", "visual", "behavior", ".", "(", "A", ")", "7", "-", "9", "days", "after", "injection", ",", "blood", "from", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", "(", "red", ")", "but", "not", "from", "CFA", "-", "injected", "mice", "(", "black", ")", ",", "elicited", "strong", "antibody", "responses", "in", "ELISA", ".", "Antibodies", "for", "RIBEYE", "and", "SV2", "were", "used", "as", "positive", "controls", "(", "green", ")", ",", "secondary", "antibody", "only", "as", "a", "negative", "control", "(", "white", ")", ".", "Normalized", "data", "are", "given", "as", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "N", "=", "4", "(", "CFA", ")", ";", "N", "=", "5", "(", "MOG", "/", "CFA", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "significance", "was", "assessed", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "precise", "p", "-", "values", "given", "in", "the", "figure", ")", "Control", "Western", "blot", "of", "HEK293", "protein", "lysates", "obtained", "from", "cells", "transfected", "with", "mCherry", "(", "lane", "1", ")", "or", "CASPR1", "-", "mCherry", "cDNA", "(", "lane", "2", ")", "and", "probed", "with", "anti", "-", "mCherry", "antibody", "(", "C", ",", "D", ")", "Western", "blot", "of", "protein", "lysates", "as", "in", "B", ")", "probed", "by", "blood", "samples", "from", "mice", "before", "and", "7", "to", "9", "days", "after", "MOG", "/", "CFA", "injection", ".", "Only", "blood", "samples", "obtained", "from", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", "mice", "revealed", "immunoreactivity", "against", "CASPR1", "(", "lanes", "15", ",", "16", ";", "top", "panels", ")", "whereas", "samples", "obtained", "before", "immunization", "(", "lanes", "7", ",", "8", ";", "top", "panels", ")", "did", "not", ".", "The", "same", "filters", "were", "re", "-", "probed", "with", "anti", "-", "actin", "antibodies", "as", "loading", "control", "(", "C", ",", "D", ")", "Western", "blot", "of", "protein", "lysates", "as", "in", "B", ")", "probed", "by", "blood", "samples", "from", "mice", "before", "and", "7", "to", "9", "days", "after", "MOG", "/", "CFA", "injection", ".", "Only", "blood", "samples", "obtained", "from", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", "mice", "revealed", "immunoreactivity", "against", "CASPR1", "(", "lanes", "15", ",", "16", ";", "top", "panels", ")", "whereas", "samples", "obtained", "before", "immunization", "(", "lanes", "7", ",", "8", ";", "top", "panels", ")", "did", "not", ".", "The", "same", "filters", "were", "re", "-", "probed", "with", "anti", "-", "actin", "antibodies", "as", "loading", "control", ".", "(", "E", ")", "Summary", "of", "data", "from", "(", "C", ",", "D", ")", "shown", "as", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "N", "=", "4", ",", "before", "injection", ";", "N", "=", "5", ",", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", ")", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "non", "-", "significant", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "precise", "p", "-", "values", "given", "in", "the", "figure", ")", "Spatially", "guided", "visual", "behavior", ",", "measured", "as", "frequency", "threshold", "with", "a", "virtual", "optokinetic", "system", "9", "days", "after", "immunization", ",", "is", "significantly", "decreased", "in", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", "mice", "compared", "to", "CFA", "-", "injected", "control", "litters", ".", "Data", "are", "shown", "as", "median", ";", "boxes", "and", "whiskers", "illustrate", "25", "-", "75", "and", "5", "-", "95", "percentiles", "of", "values", ",", "respectively", ".", "Points", "below", "and", "above", "whiskers", "are", "drawn", "as", "individual", "points", ".", "At", "each", "trial", ",", "mice", "were", "measured", "three", "times", ".", "Home", "-", "made", "and", "commercial", "MOG", "/", "CFA", "suspensions", "were", "compared", "as", "well", "as", "PLP", "-", "injected", "mice", "with", "control", "-", "injected", "mice", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "ANOVA", "(", "0", ",", "05", "significance", "level", ")", ",", "mean", "comparison", "probabilities", "were", "Bonferroni", "corrected", ".", "N", "=", "32", ",", "n", "=", "96", "(", "MOG", "/", "CFA", ")", ";", "N", "=", "24", ",", "n", "=", "72", "(", "CFA", ")", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Results", "from", "mice", "injected", "with", "home", "-", "made", "and", "commercial", "MOG", "/", "CFA", "suspensions", "as", "well", "as", "results", "obtained", "from", "PLP", "/", "CFA", "-", "injected", "mice", "(", "and", "respective", "control", "-", "injected", "mice", ")", "are"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4MOG/CFA- but not CFA-injected mice contain reactive antibodies for retinal proteins in blood and show altered spatial visual behavior. (A) 7-9 days after injection, blood from MOG/CFA-injected (red) but not from CFA-injected mice (black), elicited strong antibody responses in ELISA. Antibodies for RIBEYE and SV2 were used as positive controls (green), secondary antibody only as a negative control (white). Normalized data are given as mean ± S.E.M. (N=4 (CFA); N=5 (MOG/CFA). ** p<0.01 (significance was assessed by Mann-Whitney test, precise p-values given in the figure)Control Western blot of HEK293 protein lysates obtained from cells transfected with mCherry (lane 1) or CASPR1-mCherry cDNA (lane 2) and probed with anti-mCherry antibody(C,D) Western blot of protein lysates as in B) probed by blood samples from mice before and 7 to 9 days after MOG/CFA injection. Only blood samples obtained from MOG/CFA-injected mice revealed immunoreactivity against CASPR1 (lanes 15,16; top panels) whereas samples obtained before immunization (lanes 7,8; top panels) did not. The same filters were re-probed with anti-actin antibodies as loading control(C,D) Western blot of protein lysates as in B) probed by blood samples from mice before and 7 to 9 days after MOG/CFA injection. Only blood samples obtained from MOG/CFA-injected mice revealed immunoreactivity against CASPR1 (lanes 15,16; top panels) whereas samples obtained before immunization (lanes 7,8; top panels) did not. The same filters were re-probed with anti-actin antibodies as loading control. (E) Summary of data from (C,D) shown as mean ± S.E.M. (N=4, before injection; N=5, MOG/CFA-injected). ***, p<0.001; n.s., non-significant (unpaired two-tailed Student's t-test, precise p-values given in the figure)Spatially guided visual behavior, measured as frequency threshold with a virtual optokinetic system 9 days after immunization, is significantly decreased in MOG/CFA-injected mice compared to CFA-injected control litters. Data are shown as median; boxes and whiskers illustrate 25-75 and 5-95 percentiles of values, respectively. Points below and above whiskers are drawn as individual points. At each trial, mice were measured three times. Home-made and commercial MOG/CFA suspensions were compared as well as PLP-injected mice with control-injected mice. Statistical analysis was done by ANOVA (0,05 significance level), mean comparison probabilities were Bonferroni corrected. N=32, n=96 (MOG/CFA); N=24, n=72 (CFA). ***, p<0.001 (Mann-Whitney test). Results from mice injected with home-made and commercial MOG/CFA suspensions as well as results obtained from PLP/CFA-injected mice (and respective control-injected mice) are displayed"}
{"words": ["Figure", "5Optic", "nerve", "parameters", "are", "unaltered", "in", "early", "EAE", "(", "9", "days", "after", "injection", ")", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Cryostat", "sections", "of", "the", "optic", "nerve", "from", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", "mice", "(", "own", "lab", "-", "made", "suspension", ";", "for", "comparison", "with", "commercial", "MOG", "/", "CFA", "suspensions", ",", "see", "Appendix", "Fig", ".", "S12", ")", "and", "CFA", "-", "injected", "control", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Nav", "antibody", "(", "1", ":", "50", "dilution", ")", "to", "label", "the", "node", "of", "Ranvier", "and", "with", "anti", "-", "CASPR1", "antibody", "(", "1", ":", "500", "dilution", ")", "to", "stain", "the", "paranodal", "region", ".", "Length", "of", "the", "node", "of", "Ranvier", "and", "length", "of", "the", "paranodal", "region", "were", "quantified", "in", "C", ")", "D", ")", "(", "E1", ",", "E2", ")", "Richardson", "-", "Blue", "stained", "semi", "-", "thin", "sections", "from", "the", "indicated", "optic", "nerve", "samples", ".", "(", "E2", ",", "E3", ",", "F2", ",", "F3", ")", "Transmission", "electron", "micrographs", "of", "the", "optic", "nerves", "from", "MOG", "/", "CFA", "-", "and", "CFA", "-", "injected", "animals", ".", "Abbreviations", ":", "ax", ",", "axon", ";", "my", ",", "myelin", "sheath", ".", "Axon", "number", "and", "myelin", "thickness", "were", "quantified", "in", "G", ")", "and", "H", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "1μm", "(", "A", ",", "B", ",", "E", ",", "F", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Optic nerve parameters are unaltered in early EAE (9 days after injection). (A,B) Cryostat sections of the optic nerve from MOG/CFA-injected mice (own lab-made suspension; for comparison with commercial MOG/CFA suspensions, see Appendix Fig. S12) and CFA-injected control mice were stained with anti-Nav antibody (1:50 dilution) to label the node of Ranvier and with anti-CASPR1 antibody (1:500 dilution) to stain the paranodal region. Length of the node of Ranvier and length of the paranodal region were quantified in C) D)(E1, E2) Richardson-Blue stained semi-thin sections from the indicated optic nerve samples. (E2, E3, F2, F3) Transmission electron micrographs of the optic nerves from MOG/CFA- and CFA-injected animals. Abbreviations: ax, axon; my, myelin sheath. Axon number and myelin thickness were quantified in G) and H). Scale bars: 1μm (A,B,E,F)"}
{"words": ["Figure", "6Retinal", "slices", "from", "MOG", "/", "CFA", "-", "injected", "and", "CFA", "-", "injected", "SypHy", "mice", "were", "stimulated", "by", "applying", "a", "25mM", "K", "+", "-", "containing", "depolarization", "solution", "for", "1min", "(", "Fig", ".", "6A", ")", ".", "In", "response", "to", "depolarization", ",", "we", "observed", "a", "strong", "increase", "in", "fluorescence", "(", "Fig", ".", "6A", ")", "that", "can", "be", "best", "fitted", "by", "a", "double", "-", "exponential", "curve", "(", "B", ")", ".", "Amplitudes", "of", "fast", "and", "slow", "release", "(", "together", "with", "the", "respective", "time", "constants", ")", "of", "the", "first", "depolarization", "response", "are", "plotted", "in", "C", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Retinal slices from MOG/CFA-injected and CFA-injected SypHy mice were stimulated by applying a 25mM K+-containing depolarization solution for 1min (Fig. 6A). In response to depolarization, we observed a strong increase in fluorescence (Fig. 6A) that can be best fitted by a double-exponential curve (B). Amplitudes of fast and slow release (together with the respective time constants) of the first depolarization response are plotted in C)"}
{"words": ["Figure", "7The", "amount", "of", "CASPR1", "protein", "in", "the", "synapse", "is", "also", "altered", "in", "the", "PLP", "mouse", "model", "of", "multiple", "sclerosis", ".", "Semi", "-", "thin", "sections", "of", "PLP", "/", "CFA", "and", "CFA", "-", "injected", "mice", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "A", ",", "B", ";", "see", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S13", ")", "The", "synaptic", "amount", "of", "CASPR1", "is", "strongly", "reduced", "both", "in", "the", "OPL", "and", "IPL", ".", "RIBEYE", "is", "only", "reduced", "in", "the", "OPL", "but", "not", "significantly", "in", "the", "IPL", ".", "CNTN1", "is", "strongly", "reduced", "in", "both", "OPL", "and", "IPL", "(", "C", ",", "see", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S13", ")", ".", "N", "=", "4", "PLP", "/", "CFA", "-", "injected", "mice", ";", "N", "=", "4", "CFA", "-", "injected", "mice", ";", "n", "=", "140", "slices", "(", "CFA", ",", "RIBEYE", ")", ";", "n", "=", "143", "slices", "(", "PLP", "/", "CFA", ",", "RIBEYE", ")", ";", "n", "=", "47", "slices", "(", "CFA", ",", "CASPR1", ")", ";", "n", "=", "53", "slices", "(", "PLP", "/", "CFA", ",", "CASPR1", ")", ";", "n", "=", "49", "slices", "(", "CFA", ",", "CNTN1", ")", ";", "n", "=", "46", "slices", "(", "PLP", "/", "CFA", ",", "CNTN1", ")", ";", "n", "=", "44", "slices", "(", "CFA", ",", "v", "-", "arrestin", ")", ";", "n", "=", "44", "slices", "(", "PLP", "/", "CFA", ",", "v", "-", "arrestin", ")", "(", "D", ",", "E", ")", "Cryostat", "sections", "of", "the", "optic", "nerve", "from", "PLP", "and", "control", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Nav", "-", "channel", "antibody", "to", "label", "the", "node", "of", "Ranvier", "and", "with", "anti", "-", "CASPR1", "antibody", "to", "stain", "the", "paranodal", "region", ".", "Length", "of", "the", "node", "of", "Ranvier", "and", "length", "of", "the", "paranodal", "region", "were", "quantified", "in", "G", ")", "H", ")", ".", "(", "F", ")", "transmission", "electron", "micrographs", "of", "the", "optic", "nerves", "from", "PLP", "/", "CFA", "-", "and", "CFA", "-", "injected", "animals", "(", "F1", "-", "F4", ")", ".", "Axon", "numbers", "and", "myelin", "thickness", "were", "quantified", "in", "I", ")", "J", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7The amount of CASPR1 protein in the synapse is also altered in the PLP mouse model of multiple sclerosis. Semi-thin sections of PLP/CFA and CFA-injected mice were probed with the indicated antibodies (A, B; see also Appendix Fig. S13)The synaptic amount of CASPR1 is strongly reduced both in the OPL and IPL. RIBEYE is only reduced in the OPL but not significantly in the IPL. CNTN1 is strongly reduced in both OPL and IPL (C, see also Appendix Fig. S13). N=4 PLP/CFA-injected mice; N=4 CFA-injected mice; n=140 slices (CFA, RIBEYE); n=143 slices (PLP/CFA, RIBEYE); n=47 slices (CFA, CASPR1); n=53 slices (PLP/CFA, CASPR1); n=49 slices (CFA, CNTN1); n=46 slices (PLP/CFA, CNTN1); n=44 slices (CFA, v-arrestin); n=44 slices (PLP/CFA, v-arrestin)(D,E) Cryostat sections of the optic nerve from PLP and control mice were stained with anti-Nav-channel antibody to label the node of Ranvier and with anti-CASPR1 antibody to stain the paranodal region. Length of the node of Ranvier and length of the paranodal region were quantified in G) H). (F) transmission electron micrographs of the optic nerves from PLP/CFA- and CFA-injected animals (F1-F4). Axon numbers and myelin thickness were quantified in I) J)"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "using", "primers", "overlapping", "exons", "15", "and", "16", "permitted", "to", "quantify", "the", "non", "‐", "skipped", "α1S", "form", ":", "18", "±", "6", "%", "(", "*", "*", "P", "⩽", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "19", ")", "and", "10", "±", "7", "%", "(", "*", "*", "P", "⩽", "0", ".", "001", "n", "=", "19", ")", "(", "black", "bars", ")", "of", "the", "total", "α1S", "mRNA", "(", "grey", "bars", ")", "at", "2", "and", "6", "months", "post", "injection", "in", "TA", "of", "AAV1", "‐", "(", "U7", "‐", "ESE", ")", "and", "AAV1", "‐", "(", "U7", "‐", "SA", ")", ":", "ΔDHPR", "or", "AAV1", "‐", "(", "U7", "‐", "Ctrl", ")", ":", "c", "as", "a", "control", ",", "respectively", ".", "(", "C", ")", "Six", "months", "post", "injection", ",", "lysates", "from", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", "and", "TACtrl", "(", "c", ")", "were", "immuno", "‐", "blotted", "for", "α1S", "or", "α", "-", "actin", "for", "four", "mice", ".", "Graph", "depicts", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "relative", "expression", "of", "α1S", "subunit", "determined", "by", "densitrometry", "and", "nomalized", "to", "the", "α", "-", "actin", "expression", "for", "each", "muscle", ".", "Results", "were", "expressed", "in", "protein", "levels", "of", "α1S", "subunit", "in", "TAΔDHPR", "normalized", "to", "TACtrl", "for", "each", "mice", ",", "*", "*", "P", "⩽", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "4", ".", "(", "D", ")", "Longitudinal", "cryo", "‐", "sections", "from", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", "and", "TACtrl", "(", "c", ")", "were", "stained", "with", "anti", "‐", "α1S", "subunit", "(", "red", ")", "and", "anti", "‐", "laminin", "(", "green", ")", "antibodies", ",", "nuclei", "were", "visualized", "by", "Dapi", "(", "blue", ")", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Bars", "represent", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) qRT-PCR analysis using primers overlapping exons 15 and 16 permitted to quantify the non‐skipped α1S form: 18±6% (**P⩽0.001, n=19) and 10±7% (**P⩽0.001 n=19) (black bars) of the total α1S mRNA (grey bars) at 2 and 6 months post injection in TA of AAV1‐(U7‐ESE) and AAV1‐(U7‐SA):ΔDHPR or AAV1‐(U7‐Ctrl): c as a control, respectively.(C) Six months post injection, lysates from TAΔDHPR (ΔDHPR) and TACtrl (c) were immuno‐blotted for α1S or α-actin for four mice. Graph depicts mean±s.e.m. of relative expression of α1S subunit determined by densitrometry and nomalized to the α-actin expression for each muscle. Results were expressed in protein levels of α1S subunit in TAΔDHPR normalized to TACtrl for each mice, **P⩽0.001, n=4.(D) Longitudinal cryo‐sections from TAΔDHPR (ΔDHPR) and TACtrl (c) were stained with anti‐α1S subunit (red) and anti‐laminin (green) antibodies, nuclei were visualized by Dapi (blue) and imaged by confocal microscopy. Bars represent 20 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Six", "months", "post", "injection", ",", "TAs", "from", "eight", "mice", "were", "dissected", "and", "weighed", ".", "(", "B", ")", "The", "internal", "diameters", "(", "shortest", "diameter", ")", "from", "all", "fibres", "throughout", "the", "total", "muscle", "section", "were", "recorded", "and", "analysed", ".", "Muscles", "from", "five", "different", "animals", "were", "examined", ".", "The", "bar", "graph", "presents", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "the", "number", "of", "myofibres", "by", "fibre", "diameter", "class", "for", "TAΔDHPR", "(", "black", ")", "and", "TACtrl", "(", "grey", ")", ".", "(", "C", ")", "Transversal", "sections", "of", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", "and", "TACtrl", "(", "c", ")", "were", "stained", "with", "haematoxylin", "and", "eosin", ",", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "(", "D", ")", "To", "quantify", "fibrosis", ",", "transversal", "sections", "of", "total", "muscle", "were", "stained", "with", "Red", "Sirius", "and", "quantified", "using", "Histolab", "Software", "(", "marked", "in", "blue", ")", ",", "data", "were", "normalized", "with", "total", "surface", "of", "each", "muscle", "(", "orange", "line", "surrounding", "the", "sections", ")", ",", "bars", "represent", "500", "μm", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "is", "presented", "in", "bar", "graph", "and", "showed", "4", ".", "1", "±", "0", ".", "1", "fold", "increase", "of", "fibrosis", "in", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", "compared", "to", "TACtrl", "(", "c", ")", "(", "*", "*", "P0", ".", "001", ",", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Six months post injection, TAs from eight mice were dissected and weighed.(B) The internal diameters (shortest diameter) from all fibres throughout the total muscle section were recorded and analysed. Muscles from five different animals were examined. The bar graph presents mean±s.e.m. of the number of myofibres by fibre diameter class for TAΔDHPR (black) and TACtrl(grey).(C) Transversal sections of TAΔDHPR (ΔDHPR) and TACtrl (c) were stained with haematoxylin and eosin, bars represent 100 μm.(D) To quantify fibrosis, transversal sections of total muscle were stained with Red Sirius and quantified using Histolab Software (marked in blue), data were normalized with total surface of each muscle (orange line surrounding the sections), bars represent 500 μm. (E) Quantification is presented in bar graph and showed 4.1±0.1 fold increase of fibrosis in TAΔDHPR (ΔDHPR) compared to TACtrl (c) (**P0.001, n=4)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "mRNA", "from", "TAΔDHPR", "and", "TACtrl", "tissues", "were", "extracted", "and", "nNOS", "expression", "was", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "*", "*", "P0", ".", "001", ",", "n", "=", "4", ".", "(", "B", ")", "Transversal", "cryo", "‐", "sections", "of", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", "and", "TACtrl", "(", "c", ")", "were", "stained", "with", "anti", "‐", "nNOS", "(", "red", ")", ",", "anti", "‐", "laminin", "(", "green", ")", "antibodies", ",", "nuclei", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Bars", "represent", "20", "μm", ".", "(", "C", ")", "The", "tissues", "from", "extracts", "were", "analysed", "by", "western", "blot", "with", "FoxO3a", "‐", "P", "antibody", "and", "normalized", "with", "α", "‐", "actin", "antibody", ".", "Graph", "depicts", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "relative", "expression", "of", "FoxO3a", "‐", "P", "determined", "by", "densitometry", "and", "nomalized", "to", "the", "α", "‐", "actin", "expression", "for", "each", "muscle", ",", "*", "P", "⩽", "0", ".", "005", ",", "n", "=", "3", ".", "(", "D", ")", "Longitudinal", "cryo", "‐", "sections", "of", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", "and", "TACtrl", "(", "c", ")", "were", "stained", "with", "anti", "‐", "FoxO3a", "(", "red", ")", ",", "anti", "‐", "laminin", "(", "green", ")", "antibodies", ",", "nuclei", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Bars", "represent", "20", "μm", ".", "(", "E", ")", "mRNA", "from", "TAΔDHPR", "and", "TACtrl", "tissues", "were", "extracted", "and", "regulation", "of", "autophagy", "genes", "expression", "was", "followed", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Bnip3", ",", "CathepsinL", ",", "LC3", "and", "PI3KIII", "expression", "(", "noted", "in", "red", ")", "were", "significantly", "increased", "in", "TAΔDHPR", "compared", "with", "the", "controlateral", "TACtrl", ",", "*", "*", "P0", ".", "001", ",", "n", "=", "4", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) mRNA from TAΔDHPR and TACtrl tissues were extracted and nNOS expression was quantified by qRT-PCR. Results are expressed as mean±s.e.m., **P0.001, n=4.(B) Transversal cryo‐sections of TAΔDHPR (ΔDHPR) and TACtrl (c) were stained with anti‐nNOS (red), anti‐laminin (green) antibodies, nuclei with Dapi (blue) and imaged by confocal microscopy. Bars represent 20 μm.(C) The tissues from extracts were analysed by western blot with FoxO3a‐P antibody and normalized with α‐actin antibody. Graph depicts mean±s.e.m. of relative expression of FoxO3a‐P determined by densitometry and nomalized to the α‐actin expression for each muscle, *P⩽0.005, n=3.(D) Longitudinal cryo‐sections of TAΔDHPR (ΔDHPR) and TACtrl (c) were stained with anti‐FoxO3a (red), anti‐laminin (green) antibodies, nuclei with Dapi (blue) and imaged by confocal microscopy. Bars represent 20 μm.(E) mRNA from TAΔDHPR and TACtrl tissues were extracted and regulation of autophagy genes expression was followed by qRT-PCR. Bnip3, CathepsinL, LC3 and PI3KIII expression (noted in red) were significantly increased in TAΔDHPR compared with the controlateral TACtrl, **P0.001, n=4."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Ultrathin", "sections", "were", "imaged", "by", "electron", "microscopy", ",", "M", ",", "mitochondria", ";", "C", ",", "collagen", "fibres", ";", "T", ",", "T", "‐", "tubule", ".", "Arrows", "show", "double", "‐", "membrane", "vesicules", "called", "auphagosomes", ".", "(", "B", ")", "Transversal", "cryo", "‐", "sections", "were", "stained", "with", "anti", "‐", "LC3b", "(", "red", ")", ",", "anti", "‐", "dystrophin", "(", "green", ")", "antibodies", ",", "nuclei", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Upper", "panel", ":", "TACtrl", "(", "Ctrl", ")", "and", "lower", "panel", ":", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", ".", "Bars", "represent", "20", "μm", ".", "(", "C", ")", "Myofibres", "isolated", "from", "control", "(", "Ctrl", ")", "or", "6", "months", "post", "‐", "injected", "FDB", "(", "ΔDHPR", ")", "muscles", "were", "processed", "for", "immuno", "‐", "fluorescent", "labelling", "for", "P62", "(", "green", ")", "and", "LC3b", "(", "red", ")", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Ultrathin sections were imaged by electron microscopy, M, mitochondria; C, collagen fibres; T, T‐tubule. Arrows show double‐membrane vesicules called auphagosomes.(B) Transversal cryo‐sections were stained with anti‐LC3b (red), anti‐dystrophin (green) antibodies, nuclei with Dapi (blue) and imaged by confocal microscopy. Upper panel: TACtrl (Ctrl) and lower panel: TAΔDHPR (ΔDHPR). Bars represent 20 μm.(C) Myofibres isolated from control (Ctrl) or 6 months post‐injected FDB (ΔDHPR) muscles were processed for immuno‐fluorescent labelling for P62 (green) and LC3b (red) and imaged by confocal microscopy. Scale bars, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Ultrathin", "sections", "of", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", "and", "TACtrl", "(", "c", ")", "were", "imaged", "by", "electron", "microscopy", ".", "Cis", ",", "terminal", "cisternae", ";", "T", ",", "tubule", ";", "SR", ",", "sarcoplasmic", "reticulum", ".", "Bars", ":", "500", "nm", ".", "(", "B", ")", "Myofibres", "isolated", "from", "Ctrl", "or", "ΔDHPR", "FDB", "muscles", "6", "months", "post", "injection", "were", "processed", "for", "immuno", "‐", "fluorescent", "labelling", "for", "RyR1", "(", "green", ")", ",", "SERCA", "(", "red", ")", ",", "Dapi", "(", "blue", ")", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Ultrathin sections of TAΔDHPR (ΔDHPR) and TACtrl (c) were imaged by electron microscopy. Cis, terminal cisternae; T, tubule; SR, sarcoplasmic reticulum. Bars: 500 nm.(B) Myofibres isolated from Ctrl or ΔDHPR FDB muscles 6 months post injection were processed for immuno‐fluorescent labelling for RyR1 (green), SERCA (red), Dapi (blue) and imaged by confocal microscopy. Scale bars, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Lysates", "from", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", "and", "TACtrl", "(", "c", ")", "were", "immuno", "‐", "blotted", "for", "RyR1", "or", "α", "‐", "actin", ".", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Graph", "depicts", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "relative", "expression", "of", "RyR1", "determined", "by", "densitometry", "and", "nomalized", "to", "the", "α", "‐", "actin", "expression", "for", "each", "muscle", ".", "Results", "were", "expressed", "in", "protein", "levels", "of", "ΔDHPR", "in", "TAΔDHPR", "normalized", "to", "TACtrl", "for", "each", "mice", ",", "*", "P", "⩽", "0", ".", "005", ",", "n", "=", "4", ".", "(", "B", ")", "Longitudinal", "cryo", "‐", "sections", "of", "TAΔDHPR", "(", "ΔDHPR", ")", "and", "TACtrl", "(", "c", ")", "were", "stained", "with", "anti", "‐", "α1S", "subunit", "(", "red", ")", ",", "anti", "‐", "RyR1", "(", "green", ")", "antibodies", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Bars", "=", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Lysates from TAΔDHPR (ΔDHPR) and TACtrl (c) were immuno‐blotted for RyR1 or α‐actin. (n=4). Graph depicts mean±s.e.m. of relative expression of RyR1 determined by densitometry and nomalized to the α‐actin expression for each muscle. Results were expressed in protein levels of ΔDHPR in TAΔDHPR normalized to TACtrl for each mice, *P⩽0.005, n=4.(B) Longitudinal cryo‐sections of TAΔDHPR (ΔDHPR) and TACtrl (c) were stained with anti‐α1S subunit (red), anti‐RyR1 (green) antibodies and imaged by confocal microscopy. Bars=20 μm."}
{"words": ["Figure", "7Localization", "of", "α", "1S", "subunit", ".", "Whole", "skeletal", "muscle", "fibres", "enzymatically", "isolated", "from", "Ctrl", "(", "A", "-", "D", ")", "or", "ΔDHPR", "(", "E", "-", "H", ")", "FDB", "muscles", "6", "months", "post", "injection", "were", "processed", "for", "immuno", "‐", "fluorescent", "labelling", "for", "α1", "S", "subunit", "(", "red", ")", "and", "laminin", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "Arrows", "indicate", "α1", "S", "subunit", "expression", "on", "sarcolemma", ";", "antibody", "labelling", "was", "visualized", "by", "serial", "confocal", "microscopy", "and", "represented", "as", "movies", "of", "the", "optical", "sections", "(", "Supplementary", "Movies", "S5A", "and", "S5B", ")", ".", "(", "D", ",", "H", ")", "Present", "projections", "of", "confocal", "Z", "‐", "series", "(", "step", "between", "each", "frame", "is", "1", "μm", ")", "along", "XZ", "and", "YZ", "planes", "as", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Localization of α 1S subunit. Whole skeletal muscle fibres enzymatically isolated from Ctrl (A-D) or ΔDHPR (E-H) FDB muscles 6 months post injection were processed for immuno‐fluorescent labelling for α1 S subunit (red) and laminin (green). Scale bars, 10 μm; Arrows indicate α1 S subunit expression on sarcolemma; antibody labelling was visualized by serial confocal microscopy and represented as movies of the optical sections (Supplementary Movies S5A and S5B). (D, H) Present projections of confocal Z‐series (step between each frame is 1 μm) along XZ and YZ planes as indicated."}
{"words": ["Figure", "1Immunostaining", "for", "CCN1", "(", "green", ")", "in", "the", "adult", "brain", "coronal", "section", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "The", "insert", "refers", "to", "the", "same", "image", "with", "DAPI", "staining", "to", "show", "cell", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "LV", ",", "lateral", "ventricle", ".", "Adult", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "stained", "for", "CCN1", "(", "white", ")", "and", "S100β", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Adult", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "stained", "for", "CCN1", "(", "white", ")", ",", "GFAP", "(", "green", ")", "and", "VCAM1", "(", "magenta", ")", ".", "Arrowhead", "points", "to", "a", "VCAM1", "+", "B1", "cell", "surrounded", "by", "CCN1", "-", "expressing", "ependymal", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Confocal", "images", "tracing", "a", "VCAM1", "+", "GFAP", "+", "cell", "reveal", "CCN1", "expression", "is", "absent", "in", "B1", "cells", ".", "Yellow", "arrowheads", "point", "to", "the", "apical", "side", "of", "a", "B1", "cell", "in", "the", "center", "of", "a", "NSC", "unit", ".", "White", "arrowheads", "point", "to", "the", "process", "of", "the", "B1", "cell", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunostaining for CCN1 (green) in the adult brain coronal section. Scale bar: 50 μm. The insert refers to the same image with DAPI staining to show cell nuclei (blue). LV, lateral ventricle.Adult V-SVZ whole-mounts stained for CCN1 (white) and S100β (green). Scale bar: 10 μm.Adult V-SVZ whole-mounts stained for CCN1 (white), GFAP (green) and VCAM1 (magenta). Arrowhead points to a VCAM1+ B1 cell surrounded by CCN1-expressing ependymal cells. Scale bar: 10 μm.Confocal images tracing a VCAM1+GFAP+ cell reveal CCN1 expression is absent in B1 cells. Yellow arrowheads point to the apical side of a B1 cell in the center of a NSC unit. White arrowheads point to the process of the B1 cell. Scale bar: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "2V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mount", "staining", "showing", "reduced", "CCN1", "expression", "in", "Ccn1cKO", "mice", "1", "week", "after", "TAM", "treatment", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "stained", "for", "γ", "-", "tubulin", "(", "cyan", ")", "and", "GFAP", "(", "red", ")", ".", "Arrowheads", "point", "to", "B1", "cells", "in", "the", "pinwheel", "center", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "μm", "(", "left", ")", ",", "50", "μm", "(", "middle", ")", ",", "10", "μm", "(", "right", ")", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "B1", "cells", "in", "the", "adult", "V", "-", "SVZ", ".", "n", "=", "4", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0005", ".", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "stained", "for", "γ", "-", "tubulin", "(", "cyan", ")", ",", "GFAP", "(", "red", ")", "and", "VCAM1", "(", "white", ")", ".", "Arrowheads", "point", "to", "VCAM1", "+", "B1", "cells", "in", "NSC", "units", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", "(", "left", ")", ",", "10", "μm", "(", "right", ")", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "VCAM1", "+", "B1", "cells", "in", "the", "adult", "V", "-", "SVZ", ".", "n", "=", "4", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "002", ".", "Densities", "(", "units", "/", "mm2", ")", "of", "NSC", "units", "in", "the", "adult", "V", "-", "SVZ", ".", "n", "=", "4", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0022", ".", "Distribution", "of", "NSC", "units", "with", "different", "numbers", "of", "B1", "cells", ".", "n", "=", "4", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "1", "B1", "cell", "/", "unit", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0025", "(", "2", "B1", "cells", "/", "unit", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0063", "(", "3", "B1", "cells", "/", "unit", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0385", "(", "4", "B1", "cells", "/", "unit", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2V-SVZ whole-mount staining showing reduced CCN1 expression in Ccn1cKO mice 1 week after TAM treatment. Scale bar: 10 μm.V-SVZ whole-mounts stained for γ-tubulin (cyan) and GFAP (red). Arrowheads point to B1 cells in the pinwheel center. Scale bars: 500 μm (left), 50 μm (middle), 10 μm (right).Densities (cells/mm2) of B1 cells in the adult V-SVZ. n=4, ***p=0.0005.V-SVZ whole-mounts stained for γ-tubulin (cyan), GFAP (red) and VCAM1 (white). Arrowheads point to VCAM1+ B1 cells in NSC units. Scale bars: 50 μm (left), 10 μm (right).Densities (cells/mm2) of VCAM1+ B1 cells in the adult V-SVZ. n=4, **p=0.002. Densities (units/mm2) of NSC units in the adult V-SVZ. n=4, **p=0.0022. Distribution of NSC units with different numbers of B1 cells. n=4, ****p<0.0001 (1 B1 cell/unit), **p=0.0025 (2 B1 cells/unit), **p=0.0063 (3 B1 cells/unit), *p=0.0385 (4 B1 cells/unit)."}
{"words": ["Figure", "3Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "B1", "cells", "in", "the", "aged", "V", "-", "SVZ", ".", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0099", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "VCAM1", "+", "B1", "cells", "in", "the", "aged", "V", "-", "SVZ", ".", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0041", ".", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "stained", "for", "γ", "-", "tubulin", "(", "cyan", ")", ",", "GFAP", "(", "red", ")", "and", "VCAM1", "(", "white", ")", "in", "aged", "mice", ".", "Arrowheads", "point", "to", "VCAM1", "+", "B1", "cells", "in", "NSC", "units", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", "(", "left", ")", ",", "10", "μm", "(", "right", ")", ".", "Densities", "(", "units", "/", "mm2", ")", "of", "NSC", "units", "in", "the", "aged", "V", "-", "SVZ", ".", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0093", ".", "Average", "numbers", "of", "B1", "cells", "in", "a", "NSC", "unit", ".", "n", "=", "3", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Densities (cells/mm2) of B1 cells in the aged V-SVZ. n=3, **p=0.0099.Densities (cells/mm2) of VCAM1+ B1 cells in the aged V-SVZ. n=3, **p=0.0041.V-SVZ whole-mounts stained for γ-tubulin (cyan), GFAP (red) and VCAM1 (white) in aged mice. Arrowheads point to VCAM1+ B1 cells in NSC units. Scale bars: 50 μm (left), 10 μm (right).Densities (units/mm2) of NSC units in the aged V-SVZ. n=3, **p=0.0093. Average numbers of B1 cells in a NSC unit. n=3, n.s. not significant."}
{"words": ["Figure", "4Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "GFAP", "+", "Ki67", "+", "cells", "in", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "2", "days", "after", "TAM", "treatment", ".", "n", "=", "4", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0141", ".", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "stained", "for", "GFAP", "(", "red", ")", "and", "Ki67", "(", "cyan", ")", ".", "Arrowheads", "point", "to", "dividing", "GFAP", "+", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Numbers", "of", "ASCL1", "+", "cells", "in", "V", "-", "SVZ", "coronal", "sections", "2", "days", "after", "TAM", "treatment", ".", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0087", ".", "V", "-", "SVZ", "coronal", "sections", "stained", "for", "ASCL1", "(", "red", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "BrdU", "+", "cells", "in", "the", "OB", "granule", "cell", "layer", "(", "GCL", ")", "2", "days", "after", "TAM", "treatment", ".", "n", "=", "4", "(", "Ctrl", ")", "and", "3", "(", "Ccn1cKO", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0086", ".", "OB", "sections", "stained", "for", "BrdU", "(", "yellow", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "GFAP", "+", "Ki67", "+", "cells", "in", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "4", "weeks", "after", "TAM", "treatment", ".", "Arrowheads", "point", "to", "dividing", "GFAP", "+", "cells", ".", "n", "=", "4", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Numbers", "of", "ASCL1", "+", "cells", "in", "V", "-", "SVZ", "coronal", "sections", "4", "weeks", "after", "TAM", "treatment", ".", "n", "=", "3", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "BrdU", "+", "cells", "in", "the", "OB", "GCL", "4", "weeks", "after", "TAM", "treatment", ".", "n", "=", "4", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "GFAP", "+", "Ki67", "+", "cells", "in", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "16", "months", "after", "TAM", "treatment", ".", "Arrowheads", "point", "to", "dividing", "GFAP", "+", "cells", ".", "n", "=", "4", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "BrdU", "+", "cells", "in", "the", "OB", "GCL", "16", "months", "after", "TAM", "treatment", ".", "n", "=", "4", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Densities (cells/mm2) of GFAP+Ki67+ cells in V-SVZ whole-mounts 2 days after TAM treatment. n=4, *p=0.0141. V-SVZ whole-mounts stained for GFAP (red) and Ki67 (cyan). Arrowheads point to dividing GFAP+ cells. Scale bar: 10 μm.Numbers of ASCL1+ cells in V-SVZ coronal sections 2 days after TAM treatment. n=3, **p= 0.0087. V-SVZ coronal sections stained for ASCL1 (red) and nuclei (blue). Scale bar: 50 μm.Densities (cells/mm2) of BrdU+ cells in the OB granule cell layer (GCL) 2 days after TAM treatment. n=4 (Ctrl) and 3 (Ccn1cKO), **p=0.0086. OB sections stained for BrdU (yellow) and nuclei (blue). Scale bar: 50 μm.Densities (cells/mm2) of GFAP+Ki67+ cells in V-SVZ whole-mounts 4 weeks after TAM treatment. Arrowheads point to dividing GFAP+ cells. n=4, n.s. not significant. Scale bar: 10 μm.Numbers of ASCL1+ cells in V-SVZ coronal sections 4 weeks after TAM treatment. n=3, n.s. not significant. Scale bar: 20 μm.Densities (cells/mm2) of BrdU+ cells in the OB GCL 4 weeks after TAM treatment. n=4, n.s. not significant. Scale bar: 50 μm.Densities (cells/mm2) of GFAP+Ki67+ cells in V-SVZ whole-mounts 16 months after TAM treatment. Arrowheads point to dividing GFAP+ cells. n=4, n.s. not significant. Scale bar: 10 μm.Densities (cells/mm2) of BrdU+ cells in the OB GCL 16 months after TAM treatment. n=4, n.s. not significant. Scale bar: 50 μm."}
{"words": ["Figure", "5Numbers", "of", "GFAP", "+", "BrdU", "+", "label", "-", "retaining", "NSCs", "in", "the", "V", "-", "SVZ", ".", "Arrowheads", "point", "to", "label", "-", "retaining", "NSCs", ".", "n", "=", "4", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "039", ".", "V", "-", "SVZ", "coronal", "sections", "stained", "for", "GFAP", "(", "cyan", ")", "and", "BrdU", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "GFAP", "+", "Ki67", "+", "cells", "in", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "24h", "after", "TMZ", "treatment", ".", "Arrowheads", "point", "to", "dividing", "NSCs", "under", "regenerative", "condition", ".", "n", "=", "6", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0173", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "DCX", "+", "neuroblasts", "in", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "3", "days", "after", "TMZ", "treatment", ".", "n", "=", "3", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0179", ".", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "stained", "for", "DCX", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "BrdU", "+", "cells", "in", "the", "OB", "GCL", "labeled", "24h", "after", "TMZ", "treatment", ".", "n", "=", "5", "(", "Ctrl", ")", "and", "6", "(", "Ccn1cKO", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0484", ".", "OB", "sections", "stained", "for", "BrdU", "(", "yellow", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "GFAP", "+", "Ki67", "+", "cells", "in", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "of", "aged", "mice", "24h", "after", "TMZ", "treatment", ".", "Arrowheads", "point", "to", "dividing", "NSCs", "under", "regenerative", "condition", ".", "n", "=", "3", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0321", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "DCX", "+", "neuroblasts", "in", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "of", "aged", "mice", "3", "days", "after", "TMZ", "treatment", ".", "n", "=", "3", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "μm", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "BrdU", "+", "cells", "in", "the", "OB", "GCL", "of", "aged", "mice", "labeled", "3", "days", "after", "TMZ", "treatment", ".", "n", "=", "4", "(", "Ctrl", ")", "and", "3", "(", "Ccn1cKO", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Numbers of GFAP+BrdU+ label-retaining NSCs in the V-SVZ. Arrowheads point to label-retaining NSCs. n=4, *p= 0.039. V-SVZ coronal sections stained for GFAP (cyan) and BrdU (red). Scale bar: 10 μm.Densities (cells/mm2) of GFAP+Ki67+ cells in V-SVZ whole-mounts 24h after TMZ treatment. Arrowheads point to dividing NSCs under regenerative condition. n=6, *p= 0.0173. Scale bar: 10 μm.Densities (cells/mm2) of DCX+ neuroblasts in V-SVZ whole-mounts 3 days after TMZ treatment. n=3, *p= 0.0179. V-SVZ whole-mounts stained for DCX. Scale bar: 500 μm.Densities (cells/mm2) of BrdU+ cells in the OB GCL labeled 24h after TMZ treatment. n=5 (Ctrl) and 6 (Ccn1cKO), *p= 0.0484. OB sections stained for BrdU (yellow) and nuclei (blue). Scale bar: 50 μm.Densities (cells/mm2) of GFAP+Ki67+ cells in V-SVZ whole-mounts of aged mice 24h after TMZ treatment. Arrowheads point to dividing NSCs under regenerative condition. n=3, *p= 0.0321. Scale bar: 10 μm.Densities (cells/mm2) of DCX+ neuroblasts in V-SVZ whole-mounts of aged mice 3 days after TMZ treatment. n=3, n.s. not significant. Scale bar: 500 μm.Densities (cells/mm2) of BrdU+ cells in the OB GCL of aged mice labeled 3 days after TMZ treatment. n=4 (Ctrl) and 3 (Ccn1cKO), n.s. not significant. Scale bar: 50 μm."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "FACS", "plots", "showing", "gating", "strategy", "for", "the", "analysis", "of", "cell", "types", "in", "the", "adult", "V", "-", "SVZ", ".", "Total", "number", "of", "V", "-", "SVZ", "cells", "isolated", "from", "one", "mouse", ".", "n", "=", "3", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Representative", "FACS", "plots", "showing", "aNSCs", "(", "GFP", "+", "EGFR", "+", ")", ",", "qNSCs", "(", "GFP", "+", "EGFR", "-", ")", "and", "C", "cells", "(", "GFP", "-", "EGFR", "+", ")", "in", "the", "adult", "V", "-", "SVZ", ".", "Percentage", "of", "each", "cell", "population", "in", "the", "adult", "V", "-", "SVZ", ".", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0014", "(", "GFP", "+", "EGFR", "-", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", "(", "GFP", "+", "EGFR", "+", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0111", "(", "GFP", "-", "EGFR", "+", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0006", "(", "GFP", "+", ")", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Densities", "(", "cells", "/", "mm2", ")", "of", "VCAM1", "+", "B1", "cells", "in", "the", "adult", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", ".", "n", "=", "4", "(", "Ctrl", "+", "vehicle", "and", "Ccn1cKO", "+", "vehicle", ")", "and", "3", "(", "Ccn1cKO", "+", "erlotinib", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0021", "(", "Ccn1cKO", "+", "vehicle", "vs", "Ccn1cKO", "+", "erlotinib", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0014", "(", "Ccn1cKO", "+", "erlotinib", "vs", "Ctrl", "+", "vehicle", ")", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Densities", "(", "units", "/", "mm2", ")", "of", "NSC", "units", "in", "the", "adult", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", ".", "n", "=", "4", "(", "Ctrl", "+", "vehicle", "and", "Ccn1cKO", "+", "vehicle", ")", "and", "3", "(", "Ccn1cKO", "+", "erlotinib", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "017", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0061", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", ".", "V", "-", "SVZ", "whole", "-", "mounts", "stained", "for", "γ", "-", "tubulin", "(", "cyan", ")", ",", "GFAP", "(", "red", ")", "and", "VCAM1", "(", "white", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative FACS plots showing gating strategy for the analysis of cell types in the adult V-SVZ.Total number of V-SVZ cells isolated from one mouse. n=3, n.s. not significant.Representative FACS plots showing aNSCs (GFP+EGFR+), qNSCs (GFP+EGFR-) and C cells (GFP-EGFR+) in the adult V-SVZ.Percentage of each cell population in the adult V-SVZ. n=3, **p=0.0014 (GFP+EGFR-), ***p=0.0002 (GFP+EGFR+), *p=0.0111 (GFP-EGFR+), ***p=0.0006 (GFP+), n.s. not significant.Densities (cells/mm2) of VCAM1+ B1 cells in the adult V-SVZ whole-mounts. n=4 (Ctrl + vehicle and Ccn1cKO + vehicle) and 3 (Ccn1cKO + erlotinib), **p=0.0021 (Ccn1cKO + vehicle vs Ccn1cKO + erlotinib), **p=0.0014 (Ccn1cKO + erlotinib vs Ctrl + vehicle), ****p<0.0001.Densities (units/mm2) of NSC units in the adult V-SVZ whole-mounts. n=4 (Ctrl + vehicle and Ccn1cKO + vehicle) and 3 (Ccn1cKO + erlotinib), *p=0.017, **p=0.0061, ***p=0.0002.V-SVZ whole-mounts stained for γ-tubulin (cyan), GFAP (red) and VCAM1 (white). Scale bar: 50 μm."}
{"words": ["Figure", "1A", "Kinetics", "of", "intracellular", "Ca2", "+", "after", "EDN", "stimulation", ".", "UACC257", "and", "A2058", "(", "WT", "and", "ENDRB", "-", "KO", ")", "were", "seeded", "on", "96", "well", "plates", ",", "loaded", "with", "Fluo", "-", "4", "dye", "and", "stimulated", "with", "100", "nM", "EDN", "or", "PBS", ".", "Fluo", "-", "4", "fluorescence", "was", "monitored", "over", "ten", "minutes", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Representative", "example", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "Time", "course", "of", "AKT", "and", "CREB", "phosphorylation", ".", "Melanoma", "cell", "lines", "were", "stimulated", "with", "100", "nM", "EDN", "for", "2", "-", "90", "min", ".", "AKT", "and", "CREB", "phosphorylation", "and", "expression", "was", "evaluated", "by", "Western", "blot", ".", "Representative", "example", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "D", "High", "reproducibility", "in", "the", "UACC257", "and", "A2058", "datasets", ".", "All", "CV", "values", "were", "grouped", "according", "to", "cell", "line", "to", "represent", "dataset", "specific", "CV", "distributions", ".", "Numbers", "and", "lines", "indicate", "the", "median", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Kinetics of intracellular Ca2+ after EDN stimulation. UACC257 and A2058 (WT and ENDRB-KO) were seeded on 96 well plates, loaded with Fluo-4 dye and stimulated with 100 nM EDN or PBS. Fluo-4 fluorescence was monitored over ten minutes (n = 6). Representative example of three independent experiments.B Time course of AKT and CREB phosphorylation. Melanoma cell lines were stimulated with 100 nM EDN for 2-90 min. AKT and CREB phosphorylation and expression was evaluated by Western blot. Representative example of three independent experiments.D High reproducibility in the UACC257 and A2058 datasets. All CV values were grouped according to cell line to represent dataset specific CV distributions. Numbers and lines indicate the median."}
{"words": ["Figure", "2A", "Phosphopeptide", "MS1", "intensities", "in", "UACC257", "samples", "were", "analysed", "by", "PCA", ".", "Colours", "indicate", "experimental", "groups", "and", "shading", "is", "mapped", "to", "time", ".", "C", "Comparison", "of", "the", "kinetics", "of", "the", "242", "shared", "target", "phosphopeptides", ".", "Log2", "FC", "of", "EDN", "/", "Ctr", "is", "plotted", "from", "top", "to", "bottom", "for", "each", "phosphopeptide", "for", "both", "cell", "lines", "with", "increases", "shown", "in", "green", "and", "decreases", "shown", "in", "red", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Phosphopeptide MS1 intensities in UACC257 samples were analysed by PCA. Colours indicate experimental groups and shading is mapped to time.C Comparison of the kinetics of the 242 shared target phosphopeptides. Log2 FC of EDN/Ctr is plotted from top to bottom for each phosphopeptide for both cell lines with increases shown in green and decreases shown in red."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "EDN", "target", "phosphopeptides", "for", "(", "A", ")", "UACC257", "and", "(", "B", ")", "A2058", "were", "segregated", "into", "six", "clusters", "each", ",", "using", "c", "-", "means", "clustering", "(", "MFuzz", ")", ".", "Each", "line", "represents", "one", "phosphopeptide", "and", "cluster", "membership", "is", "indicated", "by", "colour", ".", "Most", "likely", "kinases", "for", "each", "phosphosite", "were", "predicted", "using", "NetworKIN", "and", "enrichment", "of", "kinase", "substrates", "was", "calculated", "for", "each", "cluster", ".", "Enriched", "kinases", "are", "indicated", "above", "each", "cluster", ".", "Note", "that", "substrates", "of", "these", "kinases", "only", "account", "for", "a", "fraction", "of", "all", "phosphosites", "in", "a", "cluster", ".", "C", "Average", "MS1", "intensity", "z", "-", "score", "kinetics", "for", "217", "predicted", "CaMKII", "-", "α", "sites", "that", "are", "shared", "between", "both", "cell", "lines", ".", "For", "comparison", ",", "average", "(", "n", "=", "6", ")", "calcium", "abundance", "kinetics", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A,B EDN target phosphopeptides for (A) UACC257 and (B) A2058 were segregated into six clusters each, using c-means clustering (MFuzz). Each line represents one phosphopeptide and cluster membership is indicated by colour. Most likely kinases for each phosphosite were predicted using NetworKIN and enrichment of kinase substrates was calculated for each cluster. Enriched kinases are indicated above each cluster. Note that substrates of these kinases only account for a fraction of all phosphosites in a cluster.C Average MS1 intensity z-score kinetics for 217 predicted CaMKII-α sites that are shared between both cell lines. For comparison, average (n = 6) calcium abundance kinetics are shown."}
{"words": ["Figure", "6Predicted", "kinases", "are", "indicated", "on", "top", "of", "each", "panel", "for", "which", "one", "of", "their", "marker", "substrate", "phosphorylations", "was", "assayed", ".", "UACC257", "cells", "were", "serum", "starved", "and", "stimulated", "with", "PBS", "or", "EDN", "at", "100", "nM", "for", "60", "min", "(", "5", "min", "for", "CaMKII", ")", ".", "Ten", "μg", "protein", "from", "RIPA", "lysates", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", ".", "Kinase", "marker", "substrate", "phosphorylations", "and", "corresponding", "loading", "controls", "are", "shown", ".", "For", "each", "kinase", ",", "two", "independent", "replicates", "were", "performed", "and", "are", "shown", ".", "Each", "gel", "also", "had", "control", "lanes", "with", "increasing", "concentration", "of", "kinase", "inhibitors", "to", "support", "phospho", "band"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Predicted kinases are indicated on top of each panel for which one of their marker substrate phosphorylations was assayed. UACC257 cells were serum starved and stimulated with PBS or EDN at 100 nM for 60 min (5 min for CaMKII). Ten μg protein from RIPA lysates were analysed by Western blot. Kinase marker substrate phosphorylations and corresponding loading controls are shown. For each kinase, two independent replicates were performed and are shown. Each gel also had control lanes with increasing concentration of kinase inhibitors to support phospho band identity"}
{"words": ["Figure", "7", "The", "effect", "of", "kinase", "inhibitors", "on", "EDN", "induced", "cell", "migration", "of", "UACC257", "cells", "was", "analysed", "using", "a", "scratch", "assay", ".", "Scratches", "were", "made", "in", "UACC257", "monolayers", ".", "Serum", "was", "removed", "and", "cells", "were", "treated", "with", "PBS", "or", "100", "nM", "EDN", "in", "combination", "with", "DMSO", "or", "kinase", "inhibitors", "at", "0", ".", "1", "μM", "or", "1", "μM", "in", "triplicates", ".", "A", "Example", "pictures", "showing", "the", "effect", "of", "EDN", "on", "migration", ".", "Cell", "free", "areas", "are", "delimited", "by", "blue", "lines", ".", "Migration", "was", "quantified", "as", "the", "change", "in", "cell", "free", "area", "between", "0", "h", "and", "48", "h", ".", "B", "The", "four", "inhibitors", "that", "were", "effective", "at", "1", "µM", "are", "shown", "in", "detail", ",", "i", ".", "e", ".", "every", "point", "corresponds", "to", "one", "well", ".", "C", "Abundance", "of", "E", "-", "Cadherin", "(", "normalized", "to", "GAPDH", "and", "Actin", ")", "was", "assessed", "by", "LC", "-", "SRM", "after", "48", "h", "treatment", "with", "EDN", "or", "kinase", "inhibitors", "at", "1", "µM", ".", "Only", "the", "single", "inhibitor", "which", "could", "reverse", "EDN", "induced", "E", "-", "Cadherin", "repression", "is", "shown", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "two", "-", "sided", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 The effect of kinase inhibitors on EDN induced cell migration of UACC257 cells was analysed using a scratch assay. Scratches were made in UACC257 monolayers. Serum was removed and cells were treated with PBS or 100 nM EDN in combination with DMSO or kinase inhibitors at 0.1 μM or 1 μM in triplicates. A Example pictures showing the effect of EDN on migration. Cell free areas are delimited by blue lines. Migration was quantified as the change in cell free area between 0 h and 48 h. B The four inhibitors that were effective at 1 µM are shown in detail, i.e. every point corresponds to one well. C Abundance of E-Cadherin (normalized to GAPDH and Actin) was assessed by LC-SRM after 48 h treatment with EDN or kinase inhibitors at 1 µM. Only the single inhibitor which could reverse EDN induced E-Cadherin repression is shown. * p < 0.05 two-sided unpaired t-test.  "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "-", "B", ")", "Coronal", "brain", "section", ",", "bregma", ":", "-", "2", ".", "88", "from", "The", "Mouse", "Brain", "Atlas", "shows", "the", "site", "of", "injection", "in", "the", "CA1", "cell", "body", "layer", "of", "the", "right", "hippocampus", "(", "A", ")", ".", "8", "h", "post", "-", "injection", ",", "majority", "of", "the", "injected", "Fib", "-", "Tau", "-", "1N3R", "-", "ATTO550", "(", "red", ")", "is", "taken", "up", "by", "the", "corpus", "callosum", "of", "the", "injected", "side", "(", "B", ")", ".", "Images", "are", "shown", "at", "low", "(", "left", ",", "10X", ")", "and", "high", "(", "right", ",", "63X", ")", "magnification", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bar", ",", "100µm", "in", "the", "left", "panel", "in", "(", "B", ")", ",", "10µm", "everywhere", "else", ".", "Representative", "images", "of", "the", "distribution", "of", "Fib", "-", "Tau", "(", "red", ")", "8", "h", "and", "24", "h", "after", "injection", ".", "Dendrites", "are", "immunolabeled", "using", "MAP2", "antibody", "(", "green", ")", ".", "8", "h", "after", "injection", ",", "both", "diffused", "and", "clustered", "distribution", "of", "exogenous", "Fib", "-", "Tau", "is", "observed", "in", "stratum", "oriens", "and", "CA1", "cell", "body", "region", "No", "exogenous", "Fib", "-", "Tau", "is", "detected", "in", "the", "adjoining", "cortex", ",", "stratum", "radiatum", "and", "entrorhinal", "cortex", "24", "h", "after", "injection", ",", "clustered", "distribution", "is", "primarily", "restricted", "to", "the", "pyramidal", "(", "CA", ")", "cell", "body", "layer", "(", "D", ")", ".", "Uptake", "of", "Fib", "-", "Tau", "is", "seen", "in", "some", "cells", "in", "both", "stratum", "oriens", "and", "pyramidal", "cell", "body", "layer", "(", "D", ")", ".", "Paired", "-", "t", "-", "test", "performed", "between", "'", "8", "/", "24h", "-", "right", "'", "and", "'", "8", "/", "24h", "-", "left", "'", ";", "Unpaired", "t", "-", "test", "performed", "between", "'", "8h", "-", "left", "'", "and", "'", "24h", "-", "left", "'", "columns", "(", "n", "is", "number", "of", "animals", ":", "6", "for", "8h", "and", "5", "for", "24h", ")", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Note", ":", "The", "images", "presented", "in", "panels", "C", "and", "D", "were", "independently", "acquired", "images", "under", "non", "-", "identical", "exposure", "setting", "at", "low", "magnification", "for", "display", "purpose", "Data", "information", ":", "Scale", "bar", ",", "10µmRepresentative", "images", "of", "the", "distribution", "of", "Fib", "-", "Tau", "(", "red", ")", "8", "h", "and", "24", "h", "after", "injection", ".", "Dendrites", "are", "immunolabeled", "using", "MAP2", "antibody", "(", "green", ")", ".", "8", "h", "after", "injection", ",", "both", "diffused", "and", "clustered", "distribution", "of", "exogenous", "Fib", "-", "Tau", "is", "observed", "in", "stratum", "oriens", "The", "number", "of", "Fib", "-", "Tau", "clusters", "per", "µm2", "within", "stratum", "oriens", "decreases", "between", "8", "h", "and", "24", "h", "post", "-", "injection", "(", "G", ")", ".", "A", "similar", "decrease", "in", "the", "total", "fluorescence", "(", "clusters", "+", "diffused", ")", "is", "observed", "indicating", "the", "diffusion", "and", "/", "or", "clearance", "of", "exogenous", "Fib", "-", "Tau", "(", "H", ")", ".", "Paired", "-", "t", "-", "test", "performed", "between", "'", "8", "/", "24h", "-", "right", "'", "and", "'", "8", "/", "24h", "-", "left", "'", ";", "Unpaired", "t", "-", "test", "performed", "between", "'", "8h", "-", "left", "'", "and", "'", "24h", "-", "left", "'", "columns", "(", "n", "is", "number", "of", "animals", ":", "6", "for", "8h", "and", "5", "for", "24h", ")", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Panels", "(", "E", "and", "F", ")", "are", "shown", "for", "same", "exposure", "and", "are", "used", "for", "quantification", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bar"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A-B) Coronal brain section, bregma: - 2.88 from The Mouse Brain Atlas shows the site of injection in the CA1 cell body layer of the right hippocampus (A). 8 h post-injection, majority of the injected Fib-Tau-1N3R-ATTO550 (red) is taken up by the corpus callosum of the injected side (B). Images are shown at low (left, 10X) and high (right, 63X) magnification. Data information: Scale bar, 100µm in the left panel in (B), 10µm everywhere else.Representative images of the distribution of Fib-Tau (red) 8 h and 24 h after injection. Dendrites are immunolabeled using MAP2 antibody (green). 8 h after injection, both diffused and clustered distribution of exogenous Fib-Tau is observed in stratum oriens and CA1 cell body region No exogenous Fib-Tau is detected in the adjoining cortex, stratum radiatum and entrorhinal cortex 24 h after injection, clustered distribution is primarily restricted to the pyramidal (CA) cell body layer (D). Uptake of Fib-Tau is seen in some cells in both stratum oriens and pyramidal cell body layer (D). Paired-t-test performed between '8/24h-right' and '8/24h-left'; Unpaired t-test performed between '8h-left' and '24h-left' columns (n is number of animals: 6 for 8h and 5 for 24h); ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, ns= not significant. Note: The images presented in panels C and D were independently acquired images under non-identical exposure setting at low magnification for display purpose Data information: Scale bar, 10µmRepresentative images of the distribution of Fib-Tau (red) 8 h and 24 h after injection. Dendrites are immunolabeled using MAP2 antibody (green). 8 h after injection, both diffused and clustered distribution of exogenous Fib-Tau is observed in stratum oriens The number of Fib-Tau clusters per µm2 within stratum oriens decreases between 8 h and 24 h post-injection (G). A similar decrease in the total fluorescence (clusters + diffused) is observed indicating the diffusion and/or clearance of exogenous Fib-Tau (H). Paired-t-test performed between '8/24h-right' and '8/24h-left'; Unpaired t-test performed between '8h-left' and '24h-left' columns (n is number of animals: 6 for 8h and 5 for 24h); ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, ns= not significant. Panels (E and F) are shown for same exposure and are used for quantification. Data information: Scale bar 10µm"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "C", ")", "Time", "and", "concentration", "dependent", "clustering", "of", "Fib", "-", "Tau", "in", "primary", "neurons", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "for", "certain", "conditions", "to", "illustrate", "Fib", "-", "Tau", "clustering", "time", "dependence", "(", "A", ",", "top", "-", "row", ")", "and", "concentration", "dependence", "(", "A", ",", "bottom", "-", "row", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "Fib", "-", "Tau", "clusters", "per", "µm2", "(", "B", ")", "or", "fluorescence", "intensity", "of", "clusters", "At", "low", "concentrations", "(", "up", "to", "0", ".", "72nM", ")", "the", "density", "of", "clusters", "increased", "with", "time", "(", "between", "10", "and", "60", "min", ")", "but", "the", "increase", "in", "intensity", "was", "small", ".", "At", "high", "concentrations", "of", "Fib", "-", "Tau", "(", "≥", "1", ".", "8nM", ")", ",", "both", "density", "and", "size", "increased", "with", "increasing", "time", ".", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "post", "-", "hoc", "test", ",", "number", "of", "images", "analysed", "from", "3", "cultures", "(", "from", "left", "to", "right", ":", "25", ",", "25", ",", "25", ",", "25", ",", "70", ",", "45", ",", "45", ",", "45", ",", "45", ",", "45", ",", "30", ",", "40", ",", "40", ",", "40", ",", "40", "and", "40", "images", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", "2µm", "(", "D", "-", "F", ")", "Single", "Particle", "Tracking", "using", "Quantum", "Dots", "(", "SPT", "-", "QD", ")", "of", "biotin", "tagged", "Fib", "-", "Tau", ".", "Representative", "single", "molecule", "trajectories", "of", "Fib", "-", "Tau", "following", "10", "or", "60", "min", "exposure", "are", "shown", "(", "D", ")", ".", "Note", "after", "60min", "exposure", "(", "0", ".", "36nM", ")", ",", "single", "molecules", "are", "more", "confined", "suggesting", "they", "are", "trapped", "and", "clustered", ".", "Quantification", "of", "diffusion", "coefficient", "(", "E", ")", "and", "explored", "area", "(", "F", ",", "extracted", "from", "mean", "squared", "displacement", "(", "MSD", ")", ",", "see", "methods", ")", "shows", "that", "both", "these", "parameters", "decrease", "after", "60min", "exposure", "to", "Fib", "-", "Tau", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "is", "averaged", "value", "per", "cells", "imaged", "in", "3", "experiments", "(", "10", "min", ":", "22", ",", "60", "min", ":", "23", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ",", "2µm", "(", "G", ")", "Neurons", "were", "exposed", "for", "60", "min", "to", "Fib", "-", "Tau", "(", "0", ".", "36nM", ")", "labeled", "both", "with", "biotin", "and", "ATTO488", "(", "red", ")", ".", "Cell", "surface", "exposed", "biotin", "was", "labelled", "using", "streptavidin", "-", "550", "(", "green", ")", "followed", "by", "live", "imaging", ".", "Note", "that", "most", "of", "the", "clusters", "of", "ATTO488", "(", "red", ")", "are", "co", "-", "labelled", "with", "Streptavidin", "550", "(", "green", ")", "indicating", "that", "the", "clusters", "are", "at", "the", "cell", "surface", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ",", "5µm", "(", "H", "-", "J", ")", "Clearance", "of", "Tau", "clusters", "from", "neurons", ".", "Neurons", "were", "exposed", "(", "0", ".", "36nM", ")", "to", "ATTO", "550", "labeled", "Fib", "-", "Tau", "for", "10", "min", "and", "the", "unbound", "fibrils", "were", "washed", ".", "Cells", "were", "fixed", "immediately", "(", "10min", ")", "or", "allowed", "to", "recover", "in", "culture", "medium", "for", "60", "min", ".", "Two", "representative", "images", "(", "H", ")", "and", "quantifications", "(", "I", ",", "J", ")", "show", "that", "following", "60", "min", "recovery", "most", "of", "the", "Tau", "clusters", "disappear", "/", "dissociate", "as", "indicated", "by", "a", "decrease", "in", "their", "density", ".", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ",", "Unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "is", "number", "of", "images", "analyzed", "from", "3", "cultures", "(", "49", "images", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Scale", "bar"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-C) Time and concentration dependent clustering of Fib-Tau in primary neurons. Representative images are shown for certain conditions to illustrate Fib-Tau clustering time dependence (A, top-row) and concentration dependence (A, bottom-row). Quantification of the number of Fib-Tau clusters per µm2 (B) or fluorescence intensity of clusters At low concentrations (up to 0.72nM) the density of clusters increased with time (between 10 and 60 min) but the increase in intensity was small. At high concentrations of Fib-Tau (≥1.8nM), both density and size increased with increasing time. Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution; One-way ANOVA with Dunnett post-hoc test, number of images analysed from 3 cultures (from left to right: 25, 25, 25, 25, 70, 45, 45, 45, 45, 45, 30, 40, 40, 40, 40 and 40 images). Data information: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ns= not significant. Scale bar 2µm(D-F) Single Particle Tracking using Quantum Dots (SPT-QD) of biotin tagged Fib-Tau. Representative single molecule trajectories of Fib-Tau following 10 or 60 min exposure are shown (D). Note after 60min exposure (0.36nM), single molecules are more confined suggesting they are trapped and clustered. Quantification of diffusion coefficient (E) and explored area (F, extracted from mean squared displacement (MSD), see methods) shows that both these parameters decrease after 60min exposure to Fib-Tau. Unpaired t-test, n is averaged value per cells imaged in 3 experiments (10 min: 22, 60 min: 23). Data information: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ns= not significant. Scale bar, 2µm(G) Neurons were exposed for 60 min to Fib-Tau (0.36nM) labeled both with biotin and ATTO488 (red). Cell surface exposed biotin was labelled using streptavidin-550 (green) followed by live imaging. Note that most of the clusters of ATTO488 (red) are co-labelled with Streptavidin 550 (green) indicating that the clusters are at the cell surface. Data information: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ns= not significant. Scale bar, 5µm(H-J) Clearance of Tau clusters from neurons. Neurons were exposed (0.36nM) to ATTO 550 labeled Fib-Tau for 10 min and the unbound fibrils were washed. Cells were fixed immediately (10min) or allowed to recover in culture medium for 60 min. Two representative images (H) and quantifications (I, J) show that following 60 min recovery most of the Tau clusters disappear/dissociate as indicated by a decrease in their density. Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution, Unpaired t-test, n is number of images analyzed from 3 cultures (49 images). Data information: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ns= not significant. Scale bar 2µm"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Super", "-", "resolution", "STORM", "images", "of", "neuronal", "membrane", "after", "exposure", "to", "ATTO647N", "labeled", "Fib", "-", "Tau", "(", "0", ".", "36nM", ")", ".", "Primary", "neurons", "were", "fixed", "10", ",", "60", ",", "120", "and", "240", "min", "after", "exposure", "to", "ATTO647N", "labeled", "Fib", "-", "Tau", ".", "Images", "rendered", "with", "a", "pixel", "size", "of", "5nm", "show", "both", "clustered", "and", "diffused", "(", "non", "-", "clustered", ")", "distribution", "of", "exogenous", "Fib", "-", "Tau", "molecules", ".", "Scale", "bar", ",", "1µm", ".", "(", "B", "-", "F", ")", "Quantification", "of", "various", "parameters", "from", "the", "super", "-", "resolution", "images", ".", "Averaged", "values", "per", "image", "is", "plotted", ".", "Increased", "\"", "total", "detections", "per", "µm2", "\"", "(", "B", ")", "and", "\"", "cluster", "-", "density", "\"", "(", "C", ")", "of", "Fib", "-", "Tau", "bound", "to", "neurons", "with", "increasing", "exposure", "time", "is", "observed", ".", "No", "change", "in", "the", "\"", "size", "of", "cluster", "\"", "(", "D", ")", "or", "\"", "number", "of", "molecules", "within", "a", "cluster", "\"", "(", "E", ")", "is", "seen", "with", "increased", "exposure", "time", ".", "The", "proportion", "of", "single", "molecule", "events", "detected", "within", "clusters", "remained", "nearly", "constant", "(", "~", "50", "%", ")", "in", "all", "conditions", "(", "F", ")", "indicating", "an", "equilibrium", "between", "clustered", "and", "non", "-", "clustered", "Fib", "-", "Tau", "single", "molecules", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "to", "compare", "difference", "with", "10", "min", ",", "n", "is", "number", "of", "images", "(", "8", "images", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Super-resolution STORM images of neuronal membrane after exposure to ATTO647N labeled Fib-Tau (0.36nM). Primary neurons were fixed 10, 60, 120 and 240 min after exposure to ATTO647N labeled Fib-Tau. Images rendered with a pixel size of 5nm show both clustered and diffused (non-clustered) distribution of exogenous Fib-Tau molecules. Scale bar, 1µm. (B-F) Quantification of various parameters from the super-resolution images. Averaged values per image is plotted. Increased \"total detections per µm2\" (B) and \"cluster-density\" (C) of Fib-Tau bound to neurons with increasing exposure time is observed. No change in the \"size of cluster\" (D) or \"number of molecules within a cluster\" (E) is seen with increased exposure time. The proportion of single molecule events detected within clusters remained nearly constant (~ 50%) in all conditions (F) indicating an equilibrium between clustered and non-clustered Fib-Tau single molecules. Unpaired t-test to compare difference with 10 min, n is number of images (8 images). *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ns= not significant. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "D", ")", "List", "of", "synaptic", "and", "plasma", "membrane", "proteins", "with", "extracellular", "domains", "significantly", "enriched", "in", "pull", "-", "downs", "from", "neurons", "exposed", "to", "Fib", "-", "Tau", ".", "For", "each", "identified", "protein", ",", "the", "name", "of", "the", "protein", ",", "the", "gene", "name", ",", "the", "p", "-", "value", "(", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "correction", ")", ",", "and", "the", "fold", "change", "corresponding", "to", "the", "ratio", "of", "spectral", "counts", "between", "exposed", "neuron", "and", "control", "samples", "are", "given", ".", "In", "an", "independent", "analysis", ",", "after", "10", "min", "exposure", "of", "neurons", "to", "biotinylated", "Fib", "-", "Tau", ",", "a", "cross", "-", "linking", "step", "was", "performed", "during", "20", "min", "using", "1mM", "of", "DTSSP", "added", "in", "the", "culture", "medium", ",", "in", "order", "to", "cross", "-", "link", "the", "protein", "complexes", "formed", "at", "the", "cell", "surface", "using", "a", "membrane", "impermeable", "cross", "-", "linker", ".", "After", "cross", "-", "linking", ",", "proteins", "were", "analyzed", "and", "identified", "exactly", "as", "non", "-", "cross", "-", "linked", "samples", ".", "Proteins", "identified", "with", "at", "least", "2", "peptides", "are", "labeled", "\"", "+", "\"", ",", "the", "other", "are", "labeled", "\"", "-", "\"", ".", "(", "E", ")", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "exogenous", "biotin", "-", "labelled", "Fib", "-", "Tau", "with", "α3", "-", "NKA", ",", "GluA2", "and", "GluN1", ".", "α3", "-", "NKA", ",", "GluA2", "and", "GluN1", "were", "immunoprecipitated", "using", "specific", "antibodies", "as", "described", "in", "the", "methods", "section", ".", "The", "presence", "of", "Fib", "-", "Tau", "in", "the", "immunoprecipitate", "was", "assessed", "using", "a", "slot", "blot", "apparatus", "and", "nitrocellulose", "membranes", "probed", "with", "streptavidin", "-", "HRP", ".", "A", "2", ".", "4", "-", ",", "2", ".", "3", "-", ",", "and", "1", ".", "8", "-", "fold", "enrichment", "in", "Tau", "band", "-", "intensity", "is", "observed", "in", "α3", "-", "NKA", ",", "GluA2", "and", "GluN1", "immunoprecipitates", ",", "respectively", ",", "compared", "to", "controls", "performed", "with", "pre", "-", "immune", "goat", "or", "rabbit", "IgGs", ".", "Co", "-", "immunoprecipitates", "of", "exogenous", "biotin", "-", "labelled", "Fib", "-", "Tau", "with", "anti", "α3", "-", "NKA", ",", "GluA2", "and", "GluN1", "specific", "antibodies", "were", "also", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "Western", "blot", "analysis", ".", "The", "presence", "of", "Fib", "-", "Tau", "in", "the", "immunoprecipitates", "was", "assessed", "by", "probing", "the", "nitrocellulose", "membranes", "with", "streptavidin", "-", "HRP", ".", "Fib", "-", "Tau", "co", "-", "immunoprecipitates", "with", "α3", "-", "NKA", "and", "GluA2", "-", "AMPA", "receptor", "but", "not", "with", "GluN1", "-", "NMDA", "receptor", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(D) List of synaptic and plasma membrane proteins with extracellular domains significantly enriched in pull-downs from neurons exposed to Fib-Tau. For each identified protein, the name of the protein, the gene name, the p-value (t-test with Benjamini-Hochberg correction), and the fold change corresponding to the ratio of spectral counts between exposed neuron and control samples are given. In an independent analysis, after 10 min exposure of neurons to biotinylated Fib-Tau, a cross-linking step was performed during 20 min using 1mM of DTSSP added in the culture medium, in order to cross-link the protein complexes formed at the cell surface using a membrane impermeable cross-linker. After cross-linking, proteins were analyzed and identified exactly as non-cross-linked samples. Proteins identified with at least 2 peptides are labeled \"+\", the other are labeled \"-\".(E). Co-immunoprecipitation of exogenous biotin-labelled Fib-Tau with α3-NKA, GluA2 and GluN1. α3-NKA, GluA2 and GluN1 were immunoprecipitated using specific antibodies as described in the methods section. The presence of Fib-Tau in the immunoprecipitate was assessed using a slot blot apparatus and nitrocellulose membranes probed with streptavidin-HRP. A 2.4-, 2.3-, and 1.8- fold enrichment in Tau band-intensity is observed in α3-NKA, GluA2 and GluN1 immunoprecipitates, respectively, compared to controls performed with pre-immune goat or rabbit IgGs. Co-immunoprecipitates of exogenous biotin-labelled Fib-Tau with anti α3-NKA, GluA2 and GluN1 specific antibodies were also subjected to SDS-PAGE and Western blot analysis. The presence of Fib-Tau in the immunoprecipitates was assessed by probing the nitrocellulose membranes with streptavidin-HRP. Fib-Tau co-immunoprecipitates with α3-NKA and GluA2-AMPA receptor but not with GluN1-NMDA receptor."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ",", "B", ")", "Primary", "neurons", "were", "exposed", "to", "Fib", "-", "Tau", "-", "ATTO550", "(", "0", ".", "36nM", ",", "red", ")", "for", "10", "(", "top", "row", ")", "or", "60", "min", "(", "bottom", "row", ")", "and", "excitatory", "(", "Homer", ",", "green", ")", "and", "inhibitory", "synapses", "(", "Gephyrin", ",", "blue", ")", "were", "immuno", "-", "labelled", ".", "Fib", "-", "Tau", "clusters", "co", "-", "localized", "and", "/", "or", "apposed", "to", "Homer", "(", "arrowheads", ")", "but", "not", "Gephyrin", "(", "A", ")", ".", "Quantitative", "analysis", "shows", "that", "10", "to", "20", "%", "of", "Fib", "-", "Tau", "clusters", "are", "localized", "at", "Homer", "containing", "synapses", "(", "B", ")", ".", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ",", "Unpaired", "t", "-", "test", "to", "compare", "difference", "between", "10", "and", "60", "min", ",", "n", "is", "number", "of", "images", "analyzed", "from", "3", "-", "experiments", "(", "10", "min", ":", "49", ";", "60", "min", ":", "50", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5µm", ".", "Exposure", "of", "neurons", "to", "Fib", "-", "Tau", "-", "ATTO550", "(", "0", ".", "36nM", ",", "60", "min", ",", "red", ")", "and", "immuno", "-", "labelling", "of", "excitatory", "synapse", "(", "Anti", "-", "Rabbit", "-", "Homer", "or", "Anti", "-", "Mouse", "-", "PSD", ",", "blue", ")", "and", "α3", "-", "NKA", "or", "GluA1", "-", "AMPA", "or", "GluA2", "-", "AMPA", "or", "GluN1", "-", "NMDA", "or", "GluN2B", "-", "NMDA", "subunits", "(", "green", ",", "post", "-", "permeabilization", ")", ".", "Arrows", "indicate", "excitatory", "synapses", "where", "Fib", "-", "Tau", "and", "α3", "-", "NKA", "/", "AMPA", "/", "NMDA", "are", "co", "-", "localized", "(", "C", ")", ".", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", ",", "n", "is", "number", "of", "images", "analyzed", "from", "3", "-", "4", "experiments", "(", "α3", "-", "NKA", ":", "75", ";", "GluA1", ":", "95", ";", "GluA2", ":", "50", ";", "GluN1", "/", "N2B", ":", "45", ")", ".", "Exposure", "of", "neurons", "to", "Fib", "-", "Tau", "-", "ATTO550", "(", "0", ".", "36nM", ",", "60", "min", ",", "red", ")", "and", "immuno", "-", "labelling", "of", "excitatory", "synapse", "(", "Anti", "-", "Rabbit", "-", "Homer", "or", "Anti", "-", "Mouse", "-", "PSD", ",", "blue", ")", "and", "α3", "-", "NKA", "or", "GluA1", "-", "AMPA", "or", "GluA2", "-", "AMPA", "or", "GluN1", "-", "NMDA", "or", "GluN2B", "-", "NMDA", "subunits", "(", "green", ",", "post", "-", "permeabilization", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "fluorescence", "intensity", "(", "indicating", "size", "of", "clusters", "of", "synaptic", "α3", "-", "NKA", "/", "AMPA", "/", "NMDA", "spots", "(", "obtained", "after", "thresholding", ")", "following", "exposure", "to", "Fib", "-", "Tau", "showed", "a", "reduction", "in", "the", "size", "of", "α3", "-", "NKA", "and", "increase", "in", "the", "size", "of", "GluA2", "-", "subunit", "containing", "AMPA", "receptors", "(", "D", ")", ".", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", ",", "5µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A, B) Primary neurons were exposed to Fib-Tau-ATTO550 (0.36nM, red) for 10 (top row) or 60 min (bottom row) and excitatory (Homer, green) and inhibitory synapses (Gephyrin, blue) were immuno-labelled. Fib-Tau clusters co-localized and/or apposed to Homer (arrowheads) but not Gephyrin (A). Quantitative analysis shows that 10 to 20% of Fib-Tau clusters are localized at Homer containing synapses (B). Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution, Unpaired t-test to compare difference between 10 and 60 min, n is number of images analyzed from 3-experiments (10 min: 49; 60 min: 50). Scale bar, 5µm.Exposure of neurons to Fib-Tau-ATTO550 (0.36nM, 60 min, red) and immuno-labelling of excitatory synapse (Anti-Rabbit-Homer or Anti-Mouse-PSD, blue) and α3-NKA or GluA1-AMPA or GluA2-AMPA or GluN1-NMDA or GluN2B-NMDA subunits (green, post-permeabilization). Arrows indicate excitatory synapses where Fib-Tau and α3-NKA/AMPA/NMDA are co-localized (C). Mann-Whitney-test, n is number of images analyzed from 3-4 experiments (α3-NKA: 75; GluA1: 95; GluA2: 50; GluN1/N2B: 45).Exposure of neurons to Fib-Tau-ATTO550 (0.36nM, 60 min, red) and immuno-labelling of excitatory synapse (Anti-Rabbit-Homer or Anti-Mouse-PSD, blue) and α3-NKA or GluA1-AMPA or GluA2-AMPA or GluN1-NMDA or GluN2B-NMDA subunits (green, post-permeabilization). Quantification of the fluorescence intensity (indicating size of clusters of synaptic α3-NKA/AMPA/NMDA spots (obtained after thresholding) following exposure to Fib-Tau showed a reduction in the size of α3-NKA and increase in the size of GluA2-subunit containing AMPA receptors (D). Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution, **p<0.01; ns= not significant. Scale bar, 5µm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "C", ")", "SPT", "-", "QD", "of", "pHluorin", "tagged", "AMPA", "(", "GluA1", "and", "GluA2", ")", "and", "NMDA", "(", "GluN1", "and", "GluN2B", ")", "receptor", "subunits", "using", "GFP", "-", "antibody", "pre", "-", "coupled", "to", "QD655", ".", "Primary", "neurons", "were", "exposed", "or", "not", "to", "Fib", "-", "Tau", "(", "0", ".", "36nM", ",", "60", "min", ")", ".", "Cumulative", "frequency", "of", "diffusion", "coefficient", "of", "all", "trajectories", "(", "extracted", "from", "MSD", "plot", ",", "inset", ",", "A", ")", "show", "a", "slow", "-", "down", "in", "diffusion", "of", "GluA2", "-", "subunit", "but", "not", "GluA1", ",", "GluN1", "and", "GluN2B", "subunits", "(", "A", ")", ".", "To", "compute", "statistical", "differences", ",", "the", "diffusion", "coefficient", "of", "all", "trajectories", "per", "movie", "(", "from", "3", "independent", "experiments", ")", "were", "averaged", "(", "B", ")", ".", "To", "measure", "statistical", "differences", "in", "MSD", ",", "the", "explored", "area", "(", "area", "under", "curve", "during", "600", "-", "900ms", "of", "MSD", "plot", ")", "per", "movie", "(", "from", "3", "independent", "experiments", ")", "were", "averaged", "(", "C", ")", ".", "Decreased", "diffusion", "coefficient", "and", "area", "explored", "for", "GluA2", "-", "AMPA", "was", "observed", "indicating", "increased", "confinement", "concomitant", "with", "increased", "clustering", "(", "Fig", "5C", ")", "following", "exposure", "to", "Fib", "-", "Tau", ".", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", ",", "n", "is", "number", "of", "movies", "(", "left", "to", "right", ")", ":", "14", ",", "15", ",", "14", ",", "13", ",", "15", ",", "15", ",", "15", ",", "and", "15", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "ns", "=", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-C) SPT-QD of pHluorin tagged AMPA (GluA1 and GluA2) and NMDA (GluN1 and GluN2B) receptor subunits using GFP-antibody pre-coupled to QD655. Primary neurons were exposed or not to Fib-Tau (0.36nM, 60 min). Cumulative frequency of diffusion coefficient of all trajectories (extracted from MSD plot, inset, A) show a slow-down in diffusion of GluA2-subunit but not GluA1, GluN1 and GluN2B subunits (A). To compute statistical differences, the diffusion coefficient of all trajectories per movie (from 3 independent experiments) were averaged (B). To measure statistical differences in MSD, the explored area (area under curve during 600-900ms of MSD plot) per movie (from 3 independent experiments) were averaged (C). Decreased diffusion coefficient and area explored for GluA2-AMPA was observed indicating increased confinement concomitant with increased clustering (Fig 5C) following exposure to Fib-Tau. Mann-Whitney-test, n is number of movies (left to right): 14, 15, 14, 13, 15, 15, 15, and 15. **p<0.01; ns= not significant."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Single", "Particle", "Tracking", "using", "PALM", "(", "SPT", "-", "PALM", ")", "was", "performed", "on", "α3", "-", "NKA", "-", "Dendra", "expressing", "primary", "neurons", ".", "A", "representative", "image", "shows", "an", "epifluorescence", "image", "and", "trajectories", "(", "strands", "of", "different", "colors", ")", "of", "minimum", "5", "points", "in", "length", ".", "Scale", "bars", ":", "1", "µm", "in", "panel", "(", "A", ")", "(", "B", ",", "C", ")", "Extraction", "of", "diffusion", "coefficient", "using", "mean", "squared", "displacement", "(", "MSD", ")", "approach", "using", "minimum", "5", "-", "point", "trajectory", "length", ".", "Spine", "and", "shaft", "were", "visually", "identified", ".", "An", "upward", "shift", "of", "MSD", "curve", ",", "indicating", "reduced", "confinement", "was", "observed", "following", "exposure", "to", "Fib", "-", "Tau", "(", "0", ".", "36nM", ",", "60", "min", ")", "(", "B", ")", ".", "As", "expected", ",", "an", "increased", "diffusion", "coefficient", "(", "i", ".", "e", ".", "increased", "mobility", ")", "(", "C", ")", "of", "α3", "-", "NKA", "is", "observed", "in", "dendritic", "shaft", "following", "exposure", "to", "Fib", "-", "Tau", ".", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", ",", "n", "=", "21", "cells", ",", "obtained", "from", "4", "independent", "experiments", ";", "Each", "dot", "represents", "average", "diffusion", "coefficient", "of", "all", "trajectories", "value", "per", "cell", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Extraction", "of", "the", "number", "of", "diffusive", "states", "of", "α3", "-", "NKA", "and", "the", "transition", "rates", "between", "these", "diffusive", "states", "using", "thousands", "of", "short", "(", "minimum", "2", "-", "point", ")", "trajectories", "using", "Hidden", "Markov", "Model", "The", "occupancy", "time", "of", "α3", "-", "NKA", "in", "bound", "-", "state", "also", "decreased", "whereas", "that", "in", "free", "-", "state", "increased", "upon", "neuron", "exposure", "to", "Fib", "-", "Tau", "(", "E", ")", ".", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "entire", "distribution", ",", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", "on", "averaged", "value", "per", "movie", "from", "4", "experiments", "(", "n", "=", "21", "cells", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Extraction", "of", "the", "number", "of", "diffusive", "states", "of", "α3", "-", "NKA", "and", "the", "transition", "rates", "between", "these", "diffusive", "states", "using", "thousands", "of", "short", "(", "minimum", "2", "-", "point", ")", "trajectories", "using", "Hidden", "Markov", "Model", "Dwell", "-", "time", "of", "α3", "-", "NKA", "is", "also", "reduced", "in", "bound", "state", "indicating", "destabilization", "of", "native", "α3", "-", "NKA", "-", "complexes", "following", "interaction", "with", "Fib", "-", "Tau", "(", "F", ")", ".", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "entire", "distribution", ",", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", "on", "averaged", "value", "per", "movie", "from", "4", "experiments", "(", "n", "=", "21", "cells", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "Cell", "-", "surface", "biotinylation", "on", "primary", "neurons", "exposed", "or", "not", "to", "Fib", "-", "Tau", "(", "1", ".", "8nM", ",", "60", "min", ")", ".", "The", "amount", "of", "α", "-", "NKA", "at", "cell", "surface", "decreased", "upon", "exposure", "of", "neurons", "to", "Fib", "-", "Tau", "(", "G", ")", ".", "Quantification", "was", "performed", "by", "normalizing", "the", "western", "blot", "band", "intensity", "with", "input", ".", "Paired", "-", "t", "-", "test", ",", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "(", "I", ")", "Paraformaldehyde", "fixation", "α3", "-", "NKA", "-", "pHluorin", "(", "green", ",", "top", "row", ")", "reveals", "endocytic", "spots", "otherwise", "not", "visible", "in", "live", "neurons", "(", "green", ",", "bottom", "row", ")", ".", "Many", "Fib", "-", "Tau", "-", "ATTO647", "(", "red", ")", "clusters", "overlapped", "(", "arrow", ")", "with", "α3", "-", "NKA", "-", "pHluorin", "spots", "(", "exposure", ",", "0", ".", "36nM", ",", "60", "min", ")", ".", "Scale", "bars", "2µm", "(", "J", ")", "The", "majority", "of", "the", "overlapping", "Fib", "-", "Tau", "-", "ATTO647", "clusters", "(", "red", ")", "and", "α3", "-", "NKA", "-", "pHluorin", "spots", "(", "green", ")", "localized", "on", "top", "of", "Clathrin", "-", "mRFP", "(", "blue", ")", "puncta", ".", "Scale", "bars", ":"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Single Particle Tracking using PALM (SPT-PALM) was performed on α3-NKA-Dendra expressing primary neurons. A representative image shows an epifluorescence image and trajectories (strands of different colors) of minimum 5 points in length. Scale bars: 1 µm in panel (A)(B, C) Extraction of diffusion coefficient using mean squared displacement (MSD) approach using minimum 5-point trajectory length. Spine and shaft were visually identified. An upward shift of MSD curve, indicating reduced confinement was observed following exposure to Fib-Tau (0.36nM, 60 min) (B). As expected, an increased diffusion coefficient (i.e. increased mobility) (C) of α3-NKA is observed in dendritic shaft following exposure to Fib-Tau. Mann-Whitney-test, n=21 cells, obtained from 4 independent experiments; Each dot represents average diffusion coefficient of all trajectories value per cell. Data information: *p<0.05; ns= not significant.Extraction of the number of diffusive states of α3-NKA and the transition rates between these diffusive states using thousands of short (minimum 2-point) trajectories using Hidden Markov Model The occupancy time of α3-NKA in bound-state also decreased whereas that in free-state increased upon neuron exposure to Fib-Tau (E). Box-plot represents: median, interquartile range and entire distribution, Mann-Whitney-test on averaged value per movie from 4 experiments (n=21 cells). Data information: *p<0.05; ns= not significant.Extraction of the number of diffusive states of α3-NKA and the transition rates between these diffusive states using thousands of short (minimum 2-point) trajectories using Hidden Markov Model Dwell-time of α3-NKA is also reduced in bound state indicating destabilization of native α3-NKA-complexes following interaction with Fib-Tau (F). Box-plot represents: median, interquartile range and entire distribution, Mann-Whitney-test on averaged value per movie from 4 experiments (n=21 cells). Data information: *p<0.05; ns= not significant.(G-H) Cell-surface biotinylation on primary neurons exposed or not to Fib-Tau (1.8nM, 60 min). The amount of α-NKA at cell surface decreased upon exposure of neurons to Fib-Tau (G). Quantification was performed by normalizing the western blot band intensity with input. Paired-t-test, 3 independent experiments. Data information: *p<0.05; ns= not significant.(I) Paraformaldehyde fixation α3-NKA-pHluorin (green, top row) reveals endocytic spots otherwise not visible in live neurons (green, bottom row). Many Fib-Tau-ATTO647 (red) clusters overlapped (arrow) with α3-NKA-pHluorin spots (exposure, 0.36nM, 60 min). Scale bars 2µm(J) The majority of the overlapping Fib-Tau-ATTO647 clusters (red) and α3-NKA-pHluorin spots (green) localized on top of Clathrin-mRFP (blue) puncta. Scale bars: 2µm"}
{"words": ["Figure", "8DIV21", "neurons", "were", "co", "-", "exposed", "to", "fixed", "concentration", "of", "Fib", "-", "Tau", "(", "0", ".", "36nM", ",", "60min", ",", "ATTO550", "labelled", ",", "red", ")", "and", "increasing", "concentrations", "(", "given", "in", "monomer", "-", "equivalent", ")", "of", "α", "-", "Syn", "fibrils", "[", "in", "total", "5", "-", "experiments", "were", "performed", "with", "either", "ATTO647", "labeled", "α", "-", "Syn", "(", "shown", "here", "in", "green", ")", "or", "unlabeled", "α", "-", "Syn", "A", "concentration", "-", "dependent", "increase", "in", "the", "binding", "and", "clustering", "of", "α", "-", "Syn", "fibrils", "is", "seen", ".", "Notably", ",", "Fib", "-", "Tau", "clustering", "dramatically", "increased", "with", "increasing", "concentrations", "of", "α", "-", "SynDIV21", "neurons", "were", "co", "-", "exposed", "to", "fixed", "concentration", "of", "Fib", "-", "Tau", "(", "0", ".", "36nM", ",", "60min", ",", "ATTO550", "labelled", ",", "red", ")", "and", "increasing", "Aβ", "(", "given", "in", "monomer", "-", "equivalent", ")", "of", "Aβ", "(", "B", ")", "fibrils", "[", "in", "total", "5", "-", "experiments", "were", "performed", "with", "either", "ATTO647", "labeled", "Aβ", "(", "shown", "here", "in", "green", ")", "or", "unlabeled", "Aβ", "fibrils", "]", ".", "concentration", "-", "dependent", "increase", "in", "the", "binding", "and", "clustering", "of", "Aβ", "fibrils", "is", "seen", ".", "Notably", ",", "Fib", "-", "Tau", "clustering", "dramatically", "increased", "with", "increasing", "concentrations", "of", "α", "-", "Syn", ",", "but", "not", "Aβ", "fibrilsDIV21", "neurons", "were", "co", "-", "exposed", "to", "fixed", "concentration", "of", "Fib", "-", "Tau", "(", "0", ".", "36nM", ",", "60min", ",", "ATTO550", "labelled", ",", "red", ")", "and", "increasing", "concentrations", "(", "given", "in", "monomer", "-", "equivalent", ")", "of", "α", "-", "Syn", "fibrils", "[", "in", "total", "5", "-", "experiments", "were", "performed", "with", "either", "ATTO647", "labeled", "α", "-", "Syn", "or", "unlabeled", "α", "-", "Syn", "A", "concentration", "-", "dependent", "increase", "in", "the", "binding", "and", "clustering", "of", "both", "α", "-", "Syn", "fibrils", "is", "seen", ".", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", "was", "performed", "to", "compare", "the", "different", "condition", "to", "the", "reference", "condition", "(", "100nM", ")", ".", "The", "number", "of", "images", "analyzed", "is", "27", ",", "25", ",", "25", ",", "26", "and", "28", "in", "(", "C", ")", ",", "from", "left", "to", "right", ".", "The", "data", "originate", "from", "3", "to", "4", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ",", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", "is", "performed", ",", "n", "=", "40", "images", "from", "4", "-", "experiments", ",", "Scale", "bars", ",", "5µm", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "DIV21", "neurons", "were", "co", "-", "exposed", "to", "fixed", "concentration", "of", "Fib", "-", "Tau", "(", "0", ".", "36nM", ",", "60min", ",", "ATTO550", "labelled", ",", "red", ")", "and", "increasing", "concentrations", "(", "given", "in", "monomer", "-", "equivalent", ")", "of", "Aβ", "fibrils", "[", "in", "total", "5", "-", "experiments", "were", "performed", "with", "either", "ATTO647", "labeled", "Aβ", "or", "unlabeled", "Aβ", "fibrils", "A", "concentration", "-", "dependent", "increase", "in", "the", "binding", "and", "clustering", "of", "Aβ", "fibrils", "is", "seen", ".", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", "was", "performed", "to", "compare", "the", "different", "condition", "to", "the", "reference", "condition", "(", "100nM", ")", ".", "The", "number", "of", "images", "analyzed", "is", "18", ",", "50", ",", "50", ",", "50", ",", "25", "in", "(", "D", ")", ",", "from", "left", "to", "right", ".", "The", "data", "originate", "from", "3", "to", "4", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ",", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", "is", "performed", ",", "n", "=", "40", "images", "from", "4", "-", "experiments", ",", "Scale", "bars", ",", "5µm", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Notably", ",", "Fib", "-", "Tau", "clustering", "dramatically", "increased", "with", "increasing", "concentrations", "of", "α", "-", "Syn", ",", "but", "not", "Aβ", "fibrils", "The", "quantification", "in", "(", "E", ")", "includes", "all", "5", "-", "experiments", "(", "n", "=", "number", "of", "images", "analyzed", ",", "left", "to", "right", ":", "58", ",", "54", ",", "50", ",", "62", ",", "63", ",", "65", ",", "43", ",", "35", ",", "60", ",", "60", ",", "60", ",", "35", ";", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Dunnette", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", "was", "performed", "to", "compare", "the", "size", "of", "Fib", "-", "Tau", "clusters", ")", ".", "Data", "information", ":", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ",", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", "is", "performed", ",", "n", "=", "40", "images", "from", "4", "-", "experiments", ",", "Scale", "bars", ",", "5µm", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "A", "perfect", "co", "-", "localization", "between", "Fib", "-", "Tau", "and", "α", "-", "Syn", "clusters", "is", "also", "observed", ".", "The", "proportion", "of", "Fib", "-", "Tau", "clusters", "co", "-", "localizing", "with", "α", "-", "Syn", "fibrils", "increased", "with", "an", "increasing", "concentration", "of", "α", "-", "Syn", "fibrils", "reaching", "60", "-", "70", "%", "overlap", "A", "weaker", ",", "concentration", "independent", ",", "overlap", "(", "10", "-", "20", "%", ")", "was", "observed", "with", "Aβ", "fibrils", "The", "quantification", "in", "(", "F", ")", "is", "derived", "from", "3", "to", "4", "independent", "experiments", ".", "The", "number", "of", "images", "analyzed", "is", "27", ",", "25", ",", "25", ",", "26", ",", "28", "for", "α", "-", "Syn", "and", "18", ",", "50", ",", "50", ",", "50", ",", "25", "for", "Aβ", "from", "left", "to", "right", ".", "One", "-", "Way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", "was", "performed", "to", "compare", "the", "co", "-", "localization", "differences", "from", "100nM", "concentration", ".", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ".", "Data", "information", ":", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ",", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", "is", "performed", ",", "n", "=", "40", "images", "from", "4", "-", "experiments", ",", "Scale", "bars", ",", "5µm", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "Primary", "neurons", "were", "co", "-", "exposed", "to", "Fib", "-", "Tau", "(", "0", ".", "36nM", ",", "ATTO550", "labelled", ")", "and", "Fib", "-", "α", "-", "Syn", "(", "50nM", ",", "monomer", "-", "equivalent", ",", "unlabeled", ")", "for", "60min", "and", "immunolabelled", "for", "homer", "(", "G", ")", "or", "α3", "-", "NKA", "(", "H", ")", ".", "Quantification", "of", "Fib", "-", "Tau", "clusters", "co", "-", "localized", "with", "homer", "or", "α3", "-", "NKA", "(", "I", ")", ".", "Note", "an", "increased", "co", "-", "localization", "of", "Fib", "-", "Tau", "with", "homer", "in", "presence", "of", "Fib", "-", "α", "-", "Syn", ".", "Data", "information", ":", "Box", "-", "plot", "represents", ":", "median", ",", "interquartile", "range", "and", "10", "-", "90", "%", "distribution", ",", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", "is", "performed", ",", "n", "=", "40", "images", "from", "4", "-", "experiments", ",", "Scale", "bars", ",", "5µm", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", "=", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8DIV21 neurons were co-exposed to fixed concentration of Fib-Tau (0.36nM, 60min, ATTO550 labelled, red) and increasing concentrations (given in monomer-equivalent) of α-Syn fibrils [in total 5-experiments were performed with either ATTO647 labeled α-Syn (shown here in green) or unlabeled α-Syn A concentration-dependent increase in the binding and clustering of α-Syn fibrils is seen. Notably, Fib-Tau clustering dramatically increased with increasing concentrations of α-SynDIV21 neurons were co-exposed to fixed concentration of Fib-Tau (0.36nM, 60min, ATTO550 labelled, red) and increasing Aβ (given in monomer-equivalent) of Aβ (B) fibrils [in total 5-experiments were performed with either ATTO647 labeled Aβ (shown here in green) or unlabeled Aβ fibrils]. concentration-dependent increase in the binding and clustering of Aβ fibrils is seen. Notably, Fib-Tau clustering dramatically increased with increasing concentrations of α-Syn, but not Aβ fibrilsDIV21 neurons were co-exposed to fixed concentration of Fib-Tau (0.36nM, 60min, ATTO550 labelled, red) and increasing concentrations (given in monomer-equivalent) of α-Syn fibrils [in total 5-experiments were performed with either ATTO647 labeled α-Syn or unlabeled α-Syn A concentration-dependent increase in the binding and clustering of both α-Syn fibrils is seen. One-Way ANOVA with Dunnett's post-hoc test was performed to compare the different condition to the reference condition (100nM).The number of images analyzed is 27, 25, 25, 26 and 28 in (C) , from left to right. The data originate from 3 to 4 independent experiments. Data information: Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution, Mann-Whitney-test is performed, n=40 images from 4-experiments, Scale bars, 5µm. *p<0.05, ***p<0.001; ns= not significant.DIV21 neurons were co-exposed to fixed concentration of Fib-Tau (0.36nM, 60min, ATTO550 labelled, red) and increasing concentrations (given in monomer-equivalent) of Aβ fibrils [in total 5-experiments were performed with either ATTO647 labeled Aβ or unlabeled Aβ fibrils A concentration-dependent increase in the binding and clustering of Aβ fibrils is seen. One-Way ANOVA with Dunnett's post-hoc test was performed to compare the different condition to the reference condition (100nM).The number of images analyzed is 18, 50, 50, 50, 25 in (D), from left to right. The data originate from 3 to 4 independent experiments. Data information: Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution, Mann-Whitney-test is performed, n=40 images from 4-experiments, Scale bars, 5µm. *p<0.05, ***p<0.001; ns= not significant.Notably, Fib-Tau clustering dramatically increased with increasing concentrations of α-Syn, but not Aβ fibrils The quantification in (E) includes all 5-experiments (n = number of images analyzed, left to right: 58, 54, 50, 62, 63, 65, 43, 35, 60, 60, 60, 35; One-Way ANOVA with Dunnette's post-hoc test was performed to compare the size of Fib-Tau clusters). Data information: Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution, Mann-Whitney-test is performed, n=40 images from 4-experiments, Scale bars, 5µm. *p<0.05, ***p<0.001; ns= not significant.A perfect co-localization between Fib-Tau and α-Syn clusters is also observed. The proportion of Fib-Tau clusters co-localizing with α-Syn fibrils increased with an increasing concentration of α-Syn fibrils reaching 60-70% overlap A weaker, concentration independent, overlap (10-20%) was observed with Aβ fibrils The quantification in (F) is derived from 3 to 4 independent experiments. The number of images analyzed is 27, 25, 25, 26, 28 for α-Syn and 18, 50, 50, 50, 25 for Aβ from left to right. One-Way ANOVA with Dunnett's post-hoc test was performed to compare the co-localization differences from 100nM concentration. Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution. Data information: Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution, Mann-Whitney-test is performed, n=40 images from 4-experiments, Scale bars, 5µm. *p<0.05, ***p<0.001; ns= not significant.(G-I) Primary neurons were co-exposed to Fib-Tau (0.36nM, ATTO550 labelled) and Fib-α-Syn (50nM, monomer-equivalent, unlabeled) for 60min and immunolabelled for homer (G) or α3-NKA (H). Quantification of Fib-Tau clusters co-localized with homer or α3-NKA (I). Note an increased co-localization of Fib-Tau with homer in presence of Fib-α-Syn. Data information: Box-plot represents: median, interquartile range and 10-90% distribution, Mann-Whitney-test is performed, n=40 images from 4-experiments, Scale bars, 5µm. *p<0.05, ***p<0.001; ns= not significant."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "The", "39", "-", "kDa", "catalytic", "domain", "(", "8", "-", "kDa", "subdomain", "not", "shown", "for", "clarity", ")", "is", "colored", "by", "subdomain", ":", "fingers", "(", "salmon", ")", ",", "palm", "(", "yellow", ")", "and", "thumb", "(", "purple", ")", ".", "The", "polymerase", "is", "in", "complex", "with", "a", "1", "-", "nt", "gapped", "16", "-", "mer", "oligo", "(", "grey", ")", "containing", "a", "templating", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "green", ")", ".", "Key", "residues", "involved", "in", "stabilizing", "the", "templating", "base", "(", "Y505", "and", "R517", ")", "are", "shown", "in", "black", ".", "(", "C", ")", "(", "Left", "panel", ")", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "green", ")", "preferentially", "adopts", "the", "pro", "-", "mutagenic", "syn", "-", "conformation", ".", "A", "simulated", "annealing", "Fo", "-", "Fc", "omit", "density", "map", "is", "shown", "for", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "contoured", "at", "3σ", ")", ".", "(", "Right", "panel", ")", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "anti", ")", "(", "black", ",", "modeled", "using", "2PFO", ")", "was", "overlayed", "with", "the", "Fo", "-", "Fc", "omit", "density", "map", ".", "In", "the", "anti", "-", "conformation", ",", "the", "C8", "-", "carbonyl", "would", "directly", "clash", "with", "the", "5", "′", "-", "phosphate", "(", "red", "-", "dotted", "line", ")", ".", "(", "D", ")", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "syn", ")", "(", "green", ")", "is", "stabilized", "by", "multiple", "interactions", ",", "including", "Tyr505", "and", "Arg517", "(", "grey", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) The 39-kDa catalytic domain (8-kDa subdomain not shown for clarity) is colored by subdomain: fingers (salmon), palm (yellow) and thumb (purple). The polymerase is in complex with a 1-nt gapped 16-mer oligo (grey) containing a templating 8-oxo-dG (green). Key residues involved in stabilizing the templating base (Y505 and R517) are shown in black.(C) (Left panel) 8-oxo-dG (green) preferentially adopts the pro-mutagenic syn-conformation. A simulated annealing Fo-Fc omit density map is shown for 8-oxo-dG (contoured at 3σ). (Right panel) 8-oxo-dG(anti) (black, modeled using 2PFO)was overlayed with the Fo-Fc omit density map. In the anti-conformation, the C8-carbonyl would directly clash with the 5′-phosphate (red-dotted line).(D) 8-oxo-dG(syn) (green) is stabilized by multiple interactions, including Tyr505 and Arg517 (grey)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Overview", "of", "the", "8", "-", "oxo", "-", "dG", ":", "dATP", "insertion", "complex", ".", "The", "39", "-", "kDa", "catalytic", "domain", "(", "8", "-", "kDa", "subdomain", "not", "shown", "for", "clarity", ")", "is", "colored", "by", "subdomain", ":", "fingers", "(", "salmon", ")", ",", "palm", "(", "yellow", ")", "and", "thumb", "(", "purple", ")", ".", "The", "polymerase", "is", "in", "complex", "with", "a", "1", "-", "nt", "gapped", "16", "-", "mer", "oligo", "(", "grey", ")", "containing", "a", "templating", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "green", ")", ".", "The", "primer", "terminal", "ddC", "and", "the", "incoming", "ddCTP", "are", "shown", "in", "cyan", "and", "magenta", ",", "respectively", ".", "Key", "residues", "that", "form", "the", "nascent", "base", "pair", "binding", "pocket", "(", "N513", "and", "R517", ")", "and", "are", "involved", "in", "catalysis", "(", "D427", ",", "D429", "and", "D490", ")", "are", "shown", "in", "black", ".", "The", "catalytic", "metal", "A", "and", "the", "nucleotide", "binding", "metal", "B", "are", "shown", "in", "red", "and", "neon", ",", "respectively", ".", "(", "C", ")", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "green", ")", "establishes", "a", "Watson", "-", "Crick", "pair", "with", "ddCTP", "(", "magenta", ")", ".", "Binding", "of", "the", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "in", "the", "anti", "-", "conformation", "is", "only", "possible", "because", "the", "C8", "-", "carbonyl", "is", "far", "enough", "away", "not", "to", "clash", "with", "the", "5", "′", "-", "phosphate", ".", "Asn513", "and", "Arg517", "(", "purple", ")", "interact", "with", "the", "minor", "groove", "of", "the", "nascent", "base", "pair", ".", "The", "base", "pair", "geometry", "(", "C1", "′", "distance", "and", "λ", "angles", ")", "is", "indicated", "at", "the", "bottom", "of", "the", "figure", ".", "A", "simulated", "annealing", "Fo", "-", "Fc", "omit", "density", "map", "for", "the", "pair", "is", "also", "shown", "(", "contoured", "at", "3σ", ")", ".", "(", "D", ")", "Overlay", "of", "the", "primer", "terminus", "and", "active", "site", "with", "an", "undamaged", "reference", "structure", "(", "2PFO", ",", "black", ")", ".", "The", "catalytic", "aspartic", "acids", "are", "shown", "in", "yellow", ",", "the", "primer", "terminus", "in", "cyan", "and", "the", "incoming", "dATP", "in", "magenta", ".", "A", "water", "molecule", "(", "red", ")", "and", "Mg2", "+", "(", "neon", ")", "are", "occupying", "the", "metal", "A", "and", "metal", "B", "sites", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Overview of the 8-oxo-dG:dATP insertion complex. The 39-kDa catalytic domain (8-kDa subdomain not shown for clarity) is colored by subdomain: fingers (salmon), palm (yellow) and thumb (purple). The polymerase is in complex with a 1-nt gapped 16-mer oligo (grey) containing a templating 8-oxo-dG (green). The primer terminal ddC and the incoming ddCTP are shown in cyan and magenta, respectively. Key residues that form the nascent base pair binding pocket (N513 and R517) and are involved in catalysis (D427, D429 and D490) are shown in black. The catalytic metal A and the nucleotide binding metal B are shown in red and neon, respectively.(C) 8-oxo-dG (green) establishes a Watson-Crick pair with ddCTP (magenta). Binding of the 8-oxo-dG in the anti-conformation is only possible because the C8-carbonyl is far enough away not to clash with the 5′-phosphate. Asn513 and Arg517 (purple) interact with the minor groove of the nascent base pair. The base pair geometry (C1′ distance and λ angles) is indicated at the bottom of the figure. A simulated annealing Fo-Fc omit density map for the pair is also shown (contoured at 3σ).(D) Overlay of the primer terminus and active site with an undamaged reference structure (2PFO, black). The catalytic aspartic acids are shown in yellow, the primer terminus in cyan and the incoming dATP in magenta. A water molecule (red) and Mg2+ (neon) are occupying the metal A and metal B sites, respectively."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Overview", "of", "the", "8", "-", "oxo", "-", "dG", ":", "dATP", "insertion", "complex", ".", "The", "39", "-", "kDa", "catalytic", "domain", "(", "8", "-", "kDa", "subdomain", "not", "shown", "for", "clarity", ")", "is", "colored", "by", "subdomain", ":", "fingers", "(", "salmon", ")", ",", "palm", "(", "yellow", ")", "and", "thumb", "(", "purple", ")", ".", "The", "polymerase", "is", "in", "complex", "with", "a", "1", "-", "nt", "gapped", "16", "-", "mer", "oligo", "(", "grey", ")", "containing", "a", "templating", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "green", ")", ".", "The", "primer", "terminal", "ddC", "and", "the", "incoming", "dATP", "are", "shown", "in", "cyan", "and", "magenta", ",", "respectively", ".", "Key", "residues", "that", "form", "the", "nascent", "base", "pair", "binding", "pocket", "(", "N513", "and", "R517", ")", "and", "are", "involved", "in", "catalysis", "(", "D427", ",", "D429", "and", "D490", ")", "are", "shown", "in", "black", ".", "The", "catalytic", "metal", "A", "and", "the", "nucleotide", "binding", "metal", "B", "are", "shown", "in", "red", "and", "neon", ",", "respectively", ".", "(", "C", ")", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "green", ")", "establishes", "a", "Hoogsteen", "base", "pair", "with", "dATP", "(", "magenta", ")", ".", "Asn513", "and", "Arg517", "(", "purple", ")", "interact", "with", "the", "minor", "groove", "of", "the", "nascent", "base", "pair", ".", "The", "base", "pair", "geometry", "(", "C1", "′", "distance", "and", "λ", "angles", ")", "is", "indicated", "at", "the", "bottom", "of", "the", "figure", ".", "A", "simulated", "annealing", "Fo", "-", "Fc", "omit", "density", "map", "for", "the", "pair", "is", "also", "shown", "(", "contoured", "at", "3σ", ")", ".", "(", "D", ")", "Overlay", "of", "the", "primer", "terminus", "and", "active", "site", "with", "an", "undamaged", "reference", "structure", "(", "2PFO", ",", "black", ")", ".", "The", "catalytic", "aspartic", "acids", "are", "shown", "in", "yellow", ",", "the", "primer", "terminus", "in", "cyan", "and", "the", "incoming", "dATP", "in", "magenta", ".", "A", "water", "molecule", "(", "red", ")", "and", "Mg2", "+", "(", "neon", ")", "are", "occupying", "the", "metal", "A", "and", "B", "sites", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Overview of the 8-oxo-dG:dATP insertion complex. The 39-kDa catalytic domain (8-kDa subdomain not shown for clarity) is colored by subdomain: fingers (salmon), palm (yellow) and thumb (purple). The polymerase is in complex with a 1-nt gapped 16-mer oligo (grey) containing a templating 8-oxo-dG (green). The primer terminal ddC and the incoming dATP are shown in cyan and magenta, respectively. Key residues that form the nascent base pair binding pocket (N513 and R517) and are involved in catalysis (D427, D429 and D490) are shown in black. The catalytic metal A and the nucleotide binding metal B are shown in red and neon, respectively.(C) 8-oxo-dG (green) establishes a Hoogsteen base pair with dATP (magenta). Asn513 and Arg517 (purple) interact with the minor groove of the nascent base pair. The base pair geometry (C1′ distance and λ angles) is indicated at the bottom of the figure. A simulated annealing Fo-Fc omit density map for the pair is also shown (contoured at 3σ).(D) Overlay of the primer terminus and active site with an undamaged reference structure (2PFO, black). The catalytic aspartic acids are shown in yellow, the primer terminus in cyan and the incoming dATP in magenta. A water molecule (red) and Mg2+ (neon) are occupying the metal A and B sites, respectively."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "and", "B", ")", "Overlay", "of", "the", "nascent", "base", "pair", "in", "the", "insertion", "structures", "with", "an", "undamaged", "reference", "structure", "(", "2PFO", ",", "black", ")", ".", "Binding", "of", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "green", ")", "in", "both", "the", "anti", "-", "(", "A", ")", "or", "syn", "-", "(", "B", ")", "conformation", "involves", "a", "repositioning", "of", "the", "5", "′", "-", "phosphate", "(", "red", "arrow", ")", ".", "Furthermore", ",", "the", "Arg514", "side", "chain", "(", "purple", ")", "that", "normally", "stacks", "with", "the", "templating", "base", "and", "interacts", "with", "the", "5", "′", "-", "phosphate", "(", "blue", "-", "dotted", "line", ")", ",", "also", "repositions", "(", "black", "arrow", ")", ".", "In", "both", "structures", ",", "Arg514", "interacts", "with", "the", "C6", "-", "carbonyl", "of", "the", "templating", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "anti", ")", "(", "A", ")", "or", "the", "C6", "-", "amino", "group", "of", "the", "incoming", "dATP", "(", "B", ")", ".", "The", "incoming", "nucleotide", "is", "shown", "in", "magenta", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A and B) Overlay of the nascent base pair in the insertion structures with an undamaged reference structure (2PFO, black). Binding of 8-oxo-dG (green) in both the anti- (A) or syn-(B) conformation involves a repositioning of the 5′-phosphate (red arrow). Furthermore, the Arg514 side chain (purple) that normally stacks with the templating base and interacts with the 5′-phosphate (blue-dotted line), also repositions (black arrow). In both structures, Arg514 interacts with the C6-carbonyl of the templating 8-oxo-dG(anti) (A) or the C6-amino group of the incoming dATP (B). The incoming nucleotide is shown in magenta."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Overview", "of", "the", "8", "-", "oxo", "-", "dG", ":", "dC", "extension", "complex", ".", "The", "39", "-", "kDa", "catalytic", "domain", "(", "8", "-", "kDa", "subdomain", "not", "shown", "for", "clarity", ")", "is", "colored", "by", "subdomain", ":", "fingers", "(", "salmon", ")", ",", "palm", "(", "yellow", ")", "and", "thumb", "(", "purple", ")", ".", "The", "polymerase", "is", "in", "complex", "with", "a", "1", "-", "nt", "gapped", "16", "-", "mer", "oligo", "(", "grey", ")", "and", "an", "incoming", "dUMPNPP", "(", "magenta", ")", ".", "The", "primer", "terminal", "dC", "and", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "are", "shown", "in", "cyan", "and", "magenta", ",", "respectively", ".", "Key", "residues", "that", "form", "the", "primer", "terminal", "base", "pair", "binding", "pocket", "(", "N513", ",", "R517", "and", "Glu529", ")", "and", "are", "involved", "in", "catalysis", "(", "D427", ",", "D429", "and", "D490", ")", "are", "shown", "in", "black", ".", "The", "nucleotide", "binding", "metal", "(", "B", ")", "is", "shown", "in", "neon", ".", "(", "C", ")", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "orange", ")", "establishes", "a", "Watson", "-", "Crick", "base", "pair", "with", "dC", "(", "cyan", ")", "at", "the", "primer", "terminus", ".", "Tyr505", ",", "Arg517", ",", "and", "Glu529", "(", "purple", ")", "interact", "with", "the", "minor", "groove", "of", "the", "base", "pair", ".", "The", "base", "pair", "geometry", "(", "C1", "′", "distance", "and", "λ", "angles", ")", "is", "indicated", "at", "the", "bottom", "of", "the", "figure", ".", "A", "simulated", "annealing", "Fo", "-", "Fc", "omit", "density", "map", "for", "the", "pair", "is", "also", "shown", "(", "contoured", "at", "3σ", ")", ".", "(", "D", ")", "Overlay", "of", "the", "primer", "terminus", "and", "active", "site", "with", "an", "undamaged", "reference", "structure", "(", "2PFO", ",", "black", ")", ".", "The", "catalytic", "aspartic", "acids", "are", "shown", "in", "yellow", ",", "incoming", "dUMPNPP", "in", "magenta", ",", "and", "primer", "terminal", "dC", "in", "cyan", ".", "Expectedly", ",", "Mg2", "+", "(", "neon", ")", "is", "occupying", "the", "metal", "B", "site", ".", "However", ",", "the", "metal", "A", "is", "absent", "in", "the", "structure", ",", "resulting", "in", "a", "non", "-", "catalytic", "position", "of", "the", "3", "′", "-", "OH", ".", "This", "is", "consistent", "with", "other", "structures", "containing", "an", "incoming", "non", "-", "hydrolyzable", "analog", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Overview of the 8-oxo-dG:dC extension complex. The 39-kDa catalytic domain (8-kDa subdomain not shown for clarity) is colored by subdomain: fingers (salmon), palm (yellow) and thumb (purple). The polymerase is in complex with a 1-nt gapped 16-mer oligo (grey) and an incoming dUMPNPP (magenta). The primer terminal dC and 8-oxo-dG are shown in cyan and magenta, respectively. Key residues that form the primer terminal base pair binding pocket (N513, R517 and Glu529) and are involved in catalysis (D427, D429 and D490) are shown in black. The nucleotide binding metal (B) is shown in neon.(C) 8-oxo-dG (orange) establishes a Watson-Crick base pair with dC (cyan) at the primer terminus. Tyr505, Arg517, and Glu529 (purple) interact with the minor groove of the base pair. The base pair geometry (C1′ distance and λ angles) is indicated at the bottom of the figure. A simulated annealing Fo-Fc omit density map for the pair is also shown (contoured at 3σ).(D) Overlay of the primer terminus and active site with an undamaged reference structure (2PFO, black). The catalytic aspartic acids are shown in yellow, incoming dUMPNPP in magenta, and primer terminal dC in cyan. Expectedly, Mg2+ (neon) is occupying the metal B site. However, the metal A is absent in the structure, resulting in a non-catalytic position of the 3′-OH. This is consistent with other structures containing an incoming non-hydrolyzable analog."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Overview", "of", "the", "8", "-", "oxo", "-", "dG", ":", "dC", "extension", "complex", ".", "The", "39", "-", "kDa", "catalytic", "domain", "(", "8", "-", "kDa", "subdomain", "not", "shown", "for", "clarity", ")", "is", "colored", "by", "subdomain", ":", "fingers", "(", "salmon", ")", ",", "palm", "(", "yellow", ")", "and", "thumb", "(", "purple", ")", ".", "The", "polymerase", "is", "in", "complex", "with", "a", "1", "-", "nt", "gapped", "16", "-", "mer", "oligo", "(", "grey", ")", "and", "an", "incoming", "dUMPNPP", "(", "magenta", ")", ".", "The", "primer", "terminal", "dA", "and", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "are", "shown", "in", "cyan", "and", "magenta", ",", "respectively", ".", "Key", "residues", "that", "form", "the", "primer", "terminal", "base", "pair", "binding", "pocket", "(", "N513", "and", "R517", ")", "and", "are", "involved", "in", "catalysis", "(", "D427", ",", "D429", "and", "D490", ")", "are", "shown", "in", "black", ".", "The", "nucleotide", "binding", "metal", "(", "B", ")", "is", "shown", "in", "neon", ".", "(", "C", ")", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "orange", ")", "establishes", "a", "Hoogsteen", "base", "pair", "with", "dA", "(", "cyan", ")", "at", "the", "primer", "terminus", ".", "Tyr505", "and", "Arg517", "(", "purple", ")", "interact", "with", "the", "minor", "groove", "of", "the", "base", "pair", ".", "The", "base", "pair", "geometry", "(", "C1", "′", "distance", "and", "λ", "angles", ")", "is", "indicated", "at", "the", "bottom", "of", "the", "figure", ".", "A", "simulated", "annealing", "Fo", "-", "Fc", "omit", "density", "map", "for", "the", "pair", "is", "also", "shown", "(", "contoured", "at", "3σ", ")", ".", "(", "D", ")", "Overlay", "of", "the", "primer", "terminus", "and", "active", "site", "with", "an", "undamaged", "reference", "structure", "(", "2PFO", ",", "black", ")", ".", "The", "catalytic", "aspartic", "acids", "are", "shown", "in", "yellow", ",", "incoming", "dUMPNPP", "in", "magenta", ",", "and", "primer", "terminal", "dA", "in", "cyan", ".", "Expectedly", ",", "Mg2", "+", "(", "neon", ")", "is", "occupying", "the", "metal", "B", "site", ".", "However", ",", "the", "metal", "A", "is", "absent", "in", "the", "structure", ",", "resulting", "in", "a", "non", "-", "catalytic", "position", "of", "the", "3", "′", "-", "OH", ".", "This", "is", "consistent", "with", "other", "structures", "containing", "an", "incoming", "non", "-", "hydrolyzable", "analog", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Overview of the 8-oxo-dG:dC extension complex. The 39-kDa catalytic domain (8-kDa subdomain not shown for clarity) is colored by subdomain: fingers (salmon), palm (yellow) and thumb (purple). The polymerase is in complex with a 1-nt gapped 16-mer oligo (grey) and an incoming dUMPNPP (magenta). The primer terminal dA and 8-oxo-dG are shown in cyan and magenta, respectively. Key residues that form the primer terminal base pair binding pocket (N513 and R517) and are involved in catalysis (D427, D429 and D490) are shown in black. The nucleotide binding metal (B) is shown in neon.(C) 8-oxo-dG (orange) establishes a Hoogsteen base pair with dA (cyan) at the primer terminus. Tyr505 and Arg517 (purple) interact with the minor groove of the base pair. The base pair geometry (C1′ distance and λ angles) is indicated at the bottom of the figure. A simulated annealing Fo-Fc omit density map for the pair is also shown (contoured at 3σ).(D) Overlay of the primer terminus and active site with an undamaged reference structure (2PFO, black). The catalytic aspartic acids are shown in yellow, incoming dUMPNPP in magenta, and primer terminal dA in cyan. Expectedly, Mg2+ (neon) is occupying the metal B site. However, the metal A is absent in the structure, resulting in a non-catalytic position of the 3′-OH. This is consistent with other structures containing an incoming non-hydrolyzable analog."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Glu529", "(", "purple", ")", "forms", "a", "hydrogen", "bond", "with", "the", "C2", "-", "amino", "group", "of", "the", "primer", "terminal", "templating", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "orange", ")", "in", "the", "anti", "-", "conformation", ".", "(", "B", ")", "This", "interaction", "is", "abolished", "when", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "orange", ")", "adopts", "the", "syn", "-", "conformation", ".", "An", "overlay", "with", "the", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "anti", ")", "-", "containing", "structure", "reveals", "that", "Glu529", "(", "black", ")", "would", "likely", "clash", "(", "red", "-", "dotted", "line", ")", "with", "the", "C8", "-", "carbonyl", "of", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "syn", ")", ".", "Repositioning", "of", "Glu529", "(", "purple", ")", "places", "the", "side", "chain", "4", ".", "5", "Å", "away", "from", "the", "C8", "-", "carbonyl", ".", "(", "C", ")", "Comparison", "of", "catalytic", "efficiencies", "for", "extension", "past", "an", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "anti", ")", ":", "dC", ",", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "(", "syn", ")", ":", "dA", "and", "dG", ":", "dC", "base", "pairs", "at", "the", "primer", "terminus", "using", "WT", "and", "E529A", "Pol", "λ", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Glu529 (purple) forms a hydrogen bond with the C2-amino group of the primer terminal templating 8-oxo-dG (orange) in the anti-conformation. (B) This interaction is abolished when 8-oxo-dG (orange) adopts the syn-conformation. An overlay with the 8-oxo-dG(anti)-containing structure reveals that Glu529 (black) would likely clash (red-dotted line) with the C8-carbonyl of 8-oxo-dG(syn). Repositioning of Glu529 (purple) places the side chain 4.5 Å away from the C8-carbonyl. (C) Comparison of catalytic efficiencies for extension past an 8-oxo-dG(anti):dC, 8-oxo-dG(syn):dA and dG:dC base pairs at the primer terminus using WT and E529A Pol λ."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Undamaged", "structure", "containing", "a", "templating", "dG", "at", "the", "primer", "terminus", "(", "2PFO", ")", "was", "overlayed", "with", "a", "structure", "containing", "an", "8", "-", "oxo", "-", "dG", ":", "dC", "base", "pair", "(", "black", ")", "or", "an", "8", "-", "oxo", "-", "dG", ":", "dA", "mispair", "(", "red", ")", "at", "the", "primer", "terminus", ".", "(", "B", ")", "Undamaged", "structure", "containing", "a", "templating", "dA", "at", "the", "primer", "terminus", "(", "1XSN", ")", "was", "overlayed", "with", "a", "structure", "containing", "an", "8", "-", "oxo", "-", "dG", ":", "dC", "base", "pair", "(", "black", ")", "or", "an", "8", "-", "oxo", "-", "dG", ":", "dA", "mispair", "(", "red", ")", "at", "the", "primer", "terminus", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Undamaged structure containing a templating dG at the primer terminus (2PFO) was overlayed with a structure containing an 8-oxo-dG:dC base pair (black) or an 8-oxo-dG:dA mispair (red) at the primer terminus. (B) Undamaged structure containing a templating dA at the primer terminus (1XSN) was overlayed with a structure containing an 8-oxo-dG:dC base pair (black) or an 8-oxo-dG:dA mispair (red) at the primer terminus."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Gross", "morphology", "of", "control", "(", "Ctrl", ")", ",", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", ",", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "53bp1", "−", "/", "−", ",", "and", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "Usp28", "−", "/", "−", "embryos", "at", "E9", ".", "5", ".", "At", "least", "five", "embryos", "were", "considered", "per", "genotype", "and", "all", "the", "double", "mutant", "embryos", "exhibited", "the", "rescue", "criteria", "mentioned", "in", "the", "text", ".", "Scale", "bar", "=", "500", "μm", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Immunostaining", "for", "p53", "(", "B", ")", "and", "Cleaved", "-", "Caspase3", "(", "Cl", "-", "CASP3", ",", "C", ")", "on", "transverse", "sections", "of", "Ctrl", ",", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", ",", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "53bp1", "−", "/", "−", ",", "and", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "Usp28", "−", "/", "−", "embryos", "at", "E9", ".", "5", ".", "The", "area", "shown", "encompasses", "the", "ventral", "neural", "tube", "and", "surrounding", "mesenchyme", ".", "Asterisks", "in", "(", "B", ")", "denote", "non", "-", "specific", "staining", "of", "blood", "cells", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Quantifications", "of", "the", "p53", "(", "D", ")", "and", "Cl", "-", "CASP3", "(", "E", ")", "fluorescence", "signals", "shown", "in", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", ",", "respectively", ".", "Three", "embryos", "per", "genotype", "were", "used", "for", "the", "quantifications", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "T", "-", "test", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", "gave", "similar", "results", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "D", ")", "Ctrl", ":", "1", ".", "00", "±", "0", ".", "06", "(", "n", "=", "1770", "cells", ")", ";", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", ":", "6", ".", "84", "±", "0", ".", "34", "(", "n", "=", "275", ")", ",", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "53bp1", "−", "/", "−", ":", "1", ".", "85", "±", "0", ".", "75", "(", "n", "=", "690", ")", ",", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "Usp28", "−", "/", "−", ":", "1", ".", "50", "±", "0", ".", "48", "(", "n", "=", "975", ")", ".", "(", "E", ")", "Ctrl", ":", "1", ".", "00", "±", "0", ".", "70", "(", "n", "=", "1690", ")", ";", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", ":", "7", ".", "88", "±", "2", ".", "62", "(", "n", "=", "175", ")", ";", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "53bp1", "−", "/", "−", ":", "1", ".", "43", "±", "0", ".", "71", "(", "n", "=", "1030", ")", ";", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "Usp28", "−", "/", "−", ":", "1", ".", "57", "±", "0", ".", "44", "(", "n", "=", "950", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Gross morphology of control (Ctrl), Sas-4−/−, Sas-4−/− 53bp1−/−, and Sas-4−/− Usp28−/− embryos at E9.5. At least five embryos were considered per genotype and all the double mutant embryos exhibited the rescue criteria mentioned in the text. Scale bar = 500 μm.(B, C) Immunostaining for p53 (B) and Cleaved-Caspase3 (Cl-CASP3, C) on transverse sections of Ctrl, Sas-4−/−, Sas-4−/− 53bp1−/−, and Sas-4−/− Usp28−/− embryos at E9.5. The area shown encompasses the ventral neural tube and surrounding mesenchyme. Asterisks in (B) denote non-specific staining of blood cells. Scale bar = 50 μm. (D, E) Quantifications of the p53 (D) and Cl-CASP3 (E) fluorescence signals shown in (B) and (C), respectively. Three embryos per genotype were used for the quantifications. *** p < 0.001, *p<0.05 (two-tailed student's T-test, one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons tests gave similar results). Bars represent mean ± s.d. (D) Ctrl: 1.00 ± 0.06 (n=1770 cells); Sas-4−/−: 6.84 ± 0.34 (n=275), Sas-4−/− 53bp1−/−: 1.85 ± 0.75 (n=690), Sas-4−/− Usp28−/−: 1.50 ± 0.48 (n=975). (E) Ctrl: 1.00 ± 0.70 (n=1690); Sas-4−/−: 7.88 ± 2.62 (n=175); Sas-4−/− 53bp1−/−: 1.43 ± 0.71 (n=1030); Sas-4−/− Usp28−/−: 1.57 ± 0.44 (n=950). "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "Whole", "-", "mount", "immunostaining", "and", "quantification", "for", "p53", "on", "Ctrl", "and", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "embryos", "at", "E7", ".", "5", "(", "A", ")", "and", "E6", ".", "5", "(", "B", ")", ".", "Representative", "sagittal", "planes", "are", "shown", "and", "the", "dotted", "lines", "demarcate", "the", "epiblast", ".", "Quantification", "of", "nuclear", "p53", "fluorescence", "intensity", "in", "the", "epiblast", "is", "shown", "below", ",", "normalized", "to", "control", "embryos", "in", "the", "same", "batch", "at", "E7", ".", "5", "(", "4", "embryos", ")", "and", "at", "E6", ".", "5", "(", "9", "embryos", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "T", "-", "test", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "μm", ".", "(", "A", ")", "Ctrl", ":", "1", ".", "04", "±", "0", ".", "00", "(", "n", "=", "495", "cells", ")", ";", "Sas", "-", "4", "-", "/", "-", ":", "1", ".", "65", "±", "0", ".", "19", "(", "n", "=", "850", ")", ".", "(", "B", ")", "Ctrl", ":", "1", ".", "00", "±", "0", ".", "18", "(", "n", "=", "1665", ")", ";", "Sas", "-", "4", "-", "/", "-", ":", "1", ".", "16", "±", "0", ".", "44", "(", "n", "=", "1330", ")", "(", "C", ",", "D", ")", "Immunostaining", "for", "53BP1", "and", "USP28", "on", "sagittal", "sections", "of", "WT", "embryos", "at", "E6", ".", "5", "(", "C", ")", "or", "sagittal", "planes", "of", "whole", "-", "mount", "immunostaining", "at", "E5", ".", "5", "(", "D", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "fluorescent", "signals", "in", "the", "epiblast", "(", "Ep", ")", "versus", "visceral", "endoderm", "(", "VE", ")", "are", "shown", "below", ".", "Four", "embryos", "per", "genotype", "were", "used", "for", "the", "quantifications", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "T", "-", "test", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "C", ")", "53BP1", "in", "Ep", ":", "1", ".", "00", "±", "0", ".", "10", "(", "n", "=", "225", "cells", ")", ";", "53BP1", "in", "VE", ":", "0", ".", "37", "±", "0", ".", "06", "(", "n", "=", "105", ")", ";", "USP28", "in", "Ep", ":", "1", ".", "00", "±", "0", ".", "08", "(", "n", "=", "235", ")", ";", "USP28", "in", "VE", ":", "0", ".", "17", "±", "0", ".", "05", "(", "n", "=", "90", ")", ".", "(", "D", ")", "53BP1", "in", "Ep", ":", "1", ".", "00", "±", "0", ".", "24", "(", "n", "=", "225", ")", ";", "53BP1", "in", "VE", ":", "0", ".", "68", "±", "0", ".", "14", "(", "n", "=", "115", ")", ";", "USP28", "in", "Ep", ":", "1", ".", "00", "±", "0", ".", "23", "(", "n", "=", "280", ")", ";", "USP28", "in", "VE", ":", "0", ".", "28", "±", "0", ".", "00", "(", "n", "=", "110", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B) Whole-mount immunostaining and quantification for p53 on Ctrl and Sas-4−/− embryos at E7.5 (A) and E6.5 (B). Representative sagittal planes are shown and the dotted lines demarcate the epiblast. Quantification of nuclear p53 fluorescence intensity in the epiblast is shown below, normalized to control embryos in the same batch at E7.5 (4 embryos) and at E6.5 (9 embryos). *** p < 0.001 (two-tailed student's T-test). Bars represent mean ± s.d. Scale bars = 100 μm. (A) Ctrl: 1.04 ± 0.00 (n=495 cells); Sas-4-/-: 1.65 ± 0.19 (n=850). (B) Ctrl: 1.00 ± 0.18 (n=1665); Sas-4-/-: 1.16 ± 0.44 (n=1330)(C, D) Immunostaining for 53BP1 and USP28 on sagittal sections of WT embryos at E6.5 (C) or sagittal planes of whole-mount immunostaining at E5.5 (D). Quantification of the fluorescent signals in the epiblast (Ep) versus visceral endoderm (VE) are shown below. Four embryos per genotype were used for the quantifications. **** p < 0.0001, ***p<0.001 (two-tailed student's T-test). Bars represent mean ± s.d. Scale bar = 50 μm. (C) 53BP1 in Ep: 1.00 ± 0.10 (n=225 cells); 53BP1 in VE: 0.37 ± 0.06 (n=105); USP28 in Ep: 1.00 ± 0.08 (n=235); USP28 in VE: 0.17 ± 0.05 (n=90). (D) 53BP1 in Ep: 1.00 ± 0.24 (n=225); 53BP1 in VE: 0.68 ± 0.14 (n=115); USP28 in Ep: 1.00 ± 0.23 (n=280); USP28 in VE: 0.28 ± 0.00 (n=110)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunostaining", "for", "the", "centrosome", "marker", "γ", "-", "tubulin", "(", "TUBG", ")", "on", "Ctrl", "and", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "primary", "mESCs", ".", "The", "bottom", "panels", "are", "magnifications", "of", "the", "areas", "marked", "in", "the", "top", "panels", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", "(", "top", ")", "and", "10", "μm", "(", "bottom", ")", ".", "(", "B", ")", "Immunostaining", "and", "quantification", "for", "p53", "on", "Ctrl", "and", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "primary", "mESCs", "in", "pluripotent", "and", "partially", "differentiated", "(", "diff", ".", ")", "conditions", ".", "The", "quantification", "of", "p53", "fluorescence", "intensities", "was", "normalized", "to", "Ctrl", "(", "Four", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "T", "-", "test", ",", "the", "comparison", "of", "the", "genotypes", "in", "the", "\"", "Pluripotent", "\"", "condition", "was", "not", "significant", "using", "the", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "Pluripotent", "Ctrl", ":", "1", ".", "00", "±", "0", ".", "02", "(", "n", "=", "2030", "cells", ")", ";", "pluripotent", "Sas", "-", "4", "-", "/", "-", ":", "1", ".", "17", "±", "0", ".", "10", "(", "n", "=", "2170", ")", ";", "partially", "diff", ".", "Ctrl", ":", "0", ".", "62", "±", "0", ".", "13", "(", "n", "=", "2745", ")", ";", "partially", "diff", ".", "Sas", "-", "4", "-", "/", "-", ":", "1", ".", "12", "±", "0", ".", "24", "(", "n", "=", "2000", ")", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Three", "-", "day", "growth", "curves", "of", "WT", "and", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "(", "C", ")", "or", "p53", "−", "/", "−", "and", "Sas", "-", "4", "−", "/", "−", "p53", "−", "/", "−", "(", "D", ")", "primary", "mESCs", "in", "the", "indicated", "conditions", "starting", "with", "105", "cells", "on", "Day", "0", "(", "Four", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "T", "-", "test", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "For", "details", "of", "the", "measurements", ",", "see", "Materials", "and", "Methods", "(", "Tables", "3", "and", "4", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunostaining for the centrosome marker γ-tubulin (TUBG) on Ctrl and Sas-4−/− primary mESCs. The bottom panels are magnifications of the areas marked in the top panels. Scale bars = 20 μm (top) and 10 μm (bottom).(B) Immunostaining and quantification for p53 on Ctrl and Sas-4−/− primary mESCs in pluripotent and partially differentiated (diff.) conditions. The quantification of p53 fluorescence intensities was normalized to Ctrl (Four independent experiments). ** p < 0.01, * p < 0.05 (two-tailed student's T-test, the comparison of the genotypes in the \"Pluripotent\" condition was not significant using the one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons tests). Bars represent mean ± s.d. Scale bar = 50 μm. Pluripotent Ctrl: 1.00 ± 0.02 (n=2030 cells); pluripotent Sas-4-/-: 1.17 ± 0.10 (n=2170); partially diff. Ctrl: 0.62 ± 0.13 (n=2745); partially diff. Sas-4-/-: 1.12 ± 0.24 (n=2000).(C, D) Three-day growth curves of WT and Sas-4−/− (C) or p53−/− and Sas-4−/− p53−/− (D) primary mESCs in the indicated conditions starting with 105 cells on Day 0 (Four independent experiments). ** p < 0.01, * p < 0.05 (two-tailed student's T-test). Bars represent mean ± s.d. For details of the measurements, see Materials and Methods (Tables 3 and 4)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Sagittal", "planes", "of", "whole", "-", "mount", "immunostaining", "and", "quantification", "for", "TUBG", "on", "WT", "mouse", "embryos", "from", "E3", ".", "5", "to", "E6", ".", "5", ".", "The", "insets", "are", "magnifications", "of", "selected", "centrosomes", "from", "the", "dotted", "areas", "denoting", "the", "inner", "cell", "mass", "(", "E3", ".", "5", ")", "or", "epiblast", "(", "E5", ".", "5", "and", "E6", ".", "5", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "T", "-", "test", "or", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "E3", ".", "5", "and", "E5", ".", "5", "=", "15", "μm", ";", "E6", ".", "5", "=", "30", "μm", "and", "3", "μm", "(", "insets", ")", ".", "E3", ".", "5", ":", "88", "±", "26", "%", "(", "n", "=", "73", "cells", "from", "5", "embryos", ")", ";", "E5", ".", "5", ":", "92", "±", "10", "%", "(", "n", "=", "270", "from", "3", "embryos", ")", ";", "E6", ".", "5", ":", "79", "±", "12", "%", "(", "n", "=", "12", ",", "082", "from", "3", "embryos", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Representative", "gSTED", "super", "-", "resolution", "images", "of", "immunostaining", "for", "TUBG", "and", "either", "CEP164", "(", "B", ")", "or", "ODF2", "(", "C", ")", ".", "Whole", "-", "mount", "staining", "was", "used", "for", "the", "CEP164", "data", "as", "well", "as", "for", "the", "E3", ".", "5", "blastocysts", "for", "ODF2", ",", "whereas", "staining", "on", "sections", "was", "used", "for", "ODF2", "at", "E5", ".", "5", "and", "E6", ".", "5", ".", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "centrosomes", "(", "TUBG", ")", "with", "CEP164", "or", "ODF2", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "T", "-", "test", "or", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", ";", "the", "ODF2", "data", "between", "E5", ".", "5", "and", "E6", ".", "5", "was", "not", "significant", "using", "the", "latter", "test", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "Scale", "bar", "=", "0", ".", "5", "μm", ".", "CEP164", "at", "E3", ".", "5", ":", "2", "±", "2", "%", ",", "(", "n", "=", "92", "centrosomes", "from", "4", "embryos", ")", ";", "E5", ".", "5", ":", "50", "±", "2", "%", "(", "n", "=", "249", "from", "3", "embryos", ")", ";", "E6", ".", "5", ":", "62", "±", "0", "%", "(", "n", "=", "856", "from", "3", "embryos", ")", ".", "ODF2", "at", "E3", ".", "5", ":", "20", "±", "9", "%", "(", "n", "=", "108", "from", "5", "embryos", ")", ";", "E5", ".", "5", ":", "51", "±", "4", "%", "(", "n", "=", "294", "from", "5", "embryos", ")", ";", "E6", ".", "5", ":", "60", "±", "2", "%", "(", "n", "=", "1", ",", "183", "from", "4", "embryos", ")", ".", "(", "D", ")", "Immunostaining", "and", "quantification", "of", "the", "area", "of", "TUBG", "and", "PCNT", "signals", "from", "E5", ".", "5", "and", "E6", ".", "5", "centrosomes", "in", "epiblast", "cells", ".", "The", "separate", "channels", "for", "the", "marked", "centriole", "are", "shown", "in", "the", "insets", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "T", "-", "test", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "μm", ".", "Quantification", "of", "PCNT", "at", "E5", ".", "5", ":", "0", ".", "22", "±", "0", ".", "01", "μm", "(", "n", "=", "103", "centrosomes", "from", "3", "embryos", ")", ";", "E6", ".", "5", ":", "0", ".", "31", "±", "0", ".", "02", "μm", "(", "n", "=", "342", "from", "3", "embryos", ")", ".", "Quantification", "of", "TUBG", "at", "E5", ".", "5", ":", "0", ".", "15", "±", "0", ".", "02", "μm", "(", "n", "=", "108", "from", "4", "embryos", ")", ";", "E6", ".", "5", ":", "0", ".", "25", "±", "0", ".", "01", "μm", "(", "n", "=", "311", "from", "3", "embryos", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Sagittal planes of whole-mount immunostaining and quantification for TUBG on WT mouse embryos from E3.5 to E6.5. The insets are magnifications of selected centrosomes from the dotted areas denoting the inner cell mass (E3.5) or epiblast (E5.5 and E6.5). Bars represent mean ± s.d (two-tailed student's T-test or one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons tests). Scale bars: E3.5 and E5.5 = 15 μm; E6.5 = 30 μm and 3 μm (insets). E3.5: 88 ± 26% (n=73 cells from 5 embryos); E5.5: 92 ± 10% (n=270 from 3 embryos); E6.5: 79 ± 12% (n=12,082 from 3 embryos).(B, C) Representative gSTED super-resolution images of immunostaining for TUBG and either CEP164 (B) or ODF2 (C). Whole-mount staining was used for the CEP164 data as well as for the E3.5 blastocysts for ODF2, whereas staining on sections was used for ODF2 at E5.5 and E6.5. Quantification of the percentage of centrosomes (TUBG) with CEP164 or ODF2 are shown on the right. **** p < 0.0001, *** p < 0.001, * p < 0.05 (two-tailed student's T-test or one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons tests; the ODF2 data between E5.5 and E6.5 was not significant using the latter test). Bars represent mean ± s.d. Scale bar = 0.5 μm. CEP164 at E3.5: 2 ± 2%, (n=92 centrosomes from 4 embryos); E5.5: 50 ± 2% (n=249 from 3 embryos); E6.5: 62 ± 0% (n=856 from 3 embryos). ODF2 at E3.5: 20 ± 9% (n=108 from 5 embryos); E5.5: 51 ± 4% (n=294 from 5 embryos); E6.5: 60 ± 2% (n=1,183 from 4 embryos).(D) Immunostaining and quantification of the area of TUBG and PCNT signals from E5.5 and E6.5 centrosomes in epiblast cells. The separate channels for the marked centriole are shown in the insets. *** p < 0.001, ** p < 0.01 (two-tailed student's T-test). Bars represent mean ± s.d. Scale bar = 2 μm. Quantification of PCNT at E5.5: 0.22 ± 0.01 μm (n=103 centrosomes from 3 embryos); E6.5: 0.31 ± 0.02 μm (n=342 from 3 embryos). Quantification of TUBG at E5.5: 0.15 ± 0.02 μm (n=108 from 4 embryos); E6.5: 0.25 ± 0.01 μm (n=311 from 3 embryos)."}
{"words": ["Figure", "1MEFs", "expressing", "vector", ",", "TRPML", "-", "1", ",", "or", "GRP1", "-", "DD", "were", "treated", "with", "BSA", "or", "palmitate", "(", "250", "μM", ")", "for", "3", "h", "and", "stained", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "aspect", "ratio", "(", "O", ")", ",", "branch", "length", "(", "P", ")", ",", "and", "roundness", "(", "Q", ")", "of", "mitochondria", "in", "the", "cells", "in", "(", "N", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1MEFs expressing vector, TRPML-1, or GRP1-DD were treated with BSA or palmitate (250 μM) for 3 h and stained as in (A). aspect ratio (O), branch length (P), and roundness (Q) of mitochondria in the cells in (N)."}
{"words": ["Figure", "2TMRE", "(", "100", "nM", ")", "and", "MitoTracker", "green", "(", "200", "nM", ")", "staining", "in", "MEFs", "treated", "with", "BSA", "or", "palmitate", "(", "250", "μM", ")", "for", "12", "h", "after", "a", "3", "h", "pre", "-", "treatment", "with", "vehicle", "or", "SH", "-", "BC", "-", "893", "(", "893", ",", "5", "μM", ")", ".", "TMRE", "intensity", "in", "(", "A", ")", "on", "a", "per", "cell", "basis", ".", "MitoSOX", "(", "5", "μM", ")", "and", "MitoTracker", "Green", "(", "200", "nM", ")", "staining", "in", "MEFs", "treated", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "or", "C2", "-", "ceramide", "(", "50", "μM", ")", "for", "12", "h", "after", "a", "3", "h", "pre", "-", "treatment", "with", "vehicle", "or", "SH", "-", "BC", "-", "893", "(", "893", ",", "5", "μM", ")", ".", "MitoSOX", "intensity", "for", "(", "C", ")", "on", "a", "per", "cell", "basis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2TMRE (100 nM) and MitoTracker green (200 nM) staining in MEFs treated with BSA or palmitate (250 μM) for 12 h after a 3 h pre-treatment with vehicle or SH-BC-893 (893, 5 μM). TMRE intensity in (A) on a per cell basis. MitoSOX (5 μM) and MitoTracker Green (200 nM) staining in MEFs treated with vehicle (DMSO) or C2-ceramide (50 μM) for 12 h after a 3 h pre-treatment with vehicle or SH-BC-893 (893, 5 μM). MitoSOX intensity for (C) on a per cell basis."}
{"words": ["Figure", "3NAD", "(", "P", ")", "H", "autofluorescence", "evaluated", "by", "confocal", "microscopy", "in", "freshly", "resected", "livers", "from", "mice", "in", "(", "A", ")", "4", "-", "8", "h", "after", "treatment", "with", "vehicle", "(", "n", "=", "5", ")", "or", "120", "mg", "/", "kg", "SH", "-", "BC", "-", "893", "(", "n", "=", "4", ")", "by", "gavage", "at", "ZT8", ".", "5", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "and", "imaged", "in", "pairs", "(", "SD", "and", "HFD", ")", ".", "Citrate", "synthase", "staining", "in", "the", "arcuate", "nucleus", "of", "mice", "in", "(", "E", ")", "4", "h", "after", "treatment", "with", "vehicle", "or", "120", "mg", "/", "kg", "SH", "-", "BC", "-", "893", "by", "gavage", "at", "ZT8", ".", "5", ";", "n", "=", "3", ".", "imaging", "was", "performed", "in", "the", "areas", "of", "the"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3NAD(P)H autofluorescence evaluated by confocal microscopy in freshly resected livers from mice in (A) 4-8 h after treatment with vehicle (n=5) or 120 mg/kg SH-BC-893 (n=4) by gavage at ZT8.5. Mice were sacrificed and imaged in pairs (SD and HFD).Citrate synthase staining in the arcuate nucleus of mice in (E) 4 h after treatment with vehicle or 120 mg/kg SH-BC-893 by gavage at ZT8.5; n=3.imaging was performed in the areas of the cortex"}
{"words": ["Figure", "4NAD", "(", "P", ")", "H", "autofluorescence", "was", "evaluated", "in", "epididymal", "fat", "(", "eWAT", ")", "freshly", "resected", "from", "the", "mice", "in", "(", "A", ")", "4", "h", "after", "treatment", "with", "vehicle", "or", "120", "mg", "/", "kg", "SH", "-", "BC", "-", "893", "by", "gavage", "at", "ZT8", ".", "5", ";", "n", "=", "5", ".", "NAD", "(", "P", ")", "H", "intensity", "from", "(", "B", ")", "calculated", "on", "a", "per", "cell", "basis", ";", "16", "-", "25", "cells", "from", "each", "of", "the", "5", "mice", "per", "group", "were", "quantified", "(", "87", "-", "109", "total", "cells", "per", "treatment", "group", ")", ".", "TMRE", "(", "100", "nM", ")", "and", "MitoTracker", "Green", "staining", "(", "200", "nM", ")", "in", "eWAT", "resected", "from", "mice", "in", "(", "D", ")", "treated", "as", "in", "(", "B", ",", "C", ")", ";", "n", "=", "5", ".", "TMRE", "(", "F", ")", "or", "MitoTracker", "(", "G", ")", "intensity", "for", "(", "E", ")", "calculated", "on", "a", "per", "cell", "basis", ";", "15", "-", "24", "cells", "from", "each", "of", "the", "5", "mice", "in", "each", "group", "were", "quantified", "(", "99", "-", "104", "total", "cells", "per", "treatment", "group", ")", ".", "MitoSOX", "(", "5", "μM", ")", "and", "MitoTracker", "Green", "staining", "in", "eWAT", "resected", "from", "the", "mice", "in", "(", "D", ")", "treated", "as", "in", "(", "B", "and", "E", ")", ";", "n", "=", "5", ".", "MitoSOX", "(", "I", ")", "or", "MitoTracker", "(", "J", ")", "intensity", "calculated", "as", "in", "(", "F", "and", "G", ")", ";", "10", "-", "13", "cells", "from", "each", "of", "the", "5", "mice", "in", "each", "group", "were", "quantified", "(", "57", "-", "58", "total", "cells", "per", "treatment", "group", ")", ".", "Chop", ",", "Xbp1s", ",", "Atf6", ",", "and", "Grp78", "mRNA", "measured", "in", "eWAT", "resected", "from", "mice", "maintained", "on", "a", "HFD", "for", "13", "weeks", "and", "gavaged", "with", "vehicle", "or", "120", "mg", "/", "kg", "SH", "-", "BC", "-", "893", "on", "Monday", ",", "Wednesday", ",", "and", "Friday", "for", "the", "final", "3", "weeks", ";", "n", "=", "7", "-", "9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4NAD(P)H autofluorescence was evaluated in epididymal fat (eWAT) freshly resected from the mice in (A) 4 h after treatment with vehicle or 120 mg/kg SH-BC-893 by gavage at ZT8.5; n=5. NAD(P)H intensity from (B) calculated on a per cell basis; 16 - 25 cells from each of the 5 mice per group were quantified (87 - 109 total cells per treatment group).TMRE (100 nM) and MitoTracker Green staining (200 nM) in eWAT resected from mice in (D) treated as in (B,C); n=5. TMRE (F) or MitoTracker (G) intensity for (E) calculated on a per cell basis; 15 - 24 cells from each of the 5 mice in each group were quantified (99 - 104 total cells per treatment group).MitoSOX (5 μM) and MitoTracker Green staining in eWAT resected from the mice in (D) treated as in (B and E); n=5. MitoSOX (I) or MitoTracker (J) intensity calculated as in (F and G); 10 - 13 cells from each of the 5 mice in each group were quantified (57 - 58 total cells per treatment group).Chop, Xbp1s, Atf6, and Grp78 mRNA measured in eWAT resected from mice maintained on a HFD for 13 weeks and gavaged with vehicle or 120 mg/kg SH-BC-893 on Monday, Wednesday, and Friday for the final 3 weeks; n=7-9."}
{"words": ["Figure", "5Plasma", "adiponectin", "(", "A", ")", "or", "leptin", "(", "B", ")", "in", "mice", "maintained", "on", "a", "SD", "or", "HFD", "for", "8", "-", "9", "weeks", "then", "gavaged", "with", "vehicle", "or", "120", "mg", "/", "kg", "SH", "-", "BC", "-", "893", "4", "h", "prior", "to", "blood", "collection", ".", "Pair", "-", "fed", "mice", "were", "provided", "with", "the", "amount", "of", "food", "consumed", "by", "SH", "-", "BC", "-", "893", "-", "treated", "mice", "in", "4", "h", "but", "left", "untreated", ";", "n", "=", "8", "-", "10", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Plasma adiponectin (A) or leptin (B) in mice maintained on a SD or HFD for 8-9 weeks then gavaged with vehicle or 120 mg/kg SH-BC-893 4 h prior to blood collection. Pair-fed mice were provided with the amount of food consumed by SH-BC-893-treated mice in 4 h but left untreated; n=8-10."}
{"words": ["Figure", "6Average", "daily", "distance", "run", "by", "HFD", "-", "fed", "mice", "treated", "with", "vehicle", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "SH", "-", "BC", "-", "893", "(", "120", "mg", "/", "kg", ",", "n", "=", "6", ")", "on", "Mondays", ",", "Wednesdays", ",", "and", "Fridays", "over", "4", "weeks", "when", "housed", "with", "a", "running", "wheel", ".", "Body", "weight", "change", "in", "the", "mice", "in", "(", "O", ",", "P", ")", "over", "the", "24", "h", "after", "the", "first", "treatment", "(", "Q", ")", "or", "after", "the", "3", "week", "course", "of", "treatment", "(", "R", ")", ";", "n", "=", "9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Average daily distance run by HFD-fed mice treated with vehicle (n=8) or SH-BC-893 (120 mg/kg, n=6) on Mondays, Wednesdays, and Fridays over 4 weeks when housed with a running wheel.Body weight change in the mice in (O,P) over the 24 h after the first treatment (Q) or after the 3 week course of treatment (R); n=9."}
{"words": ["Figure", "7Representative", "H", "&", "E", "stained", "liver", "sections", "from", "the", "mice", "shown", "in", "Fig", ".", "6F", "after", "4", "weeks", "of", "treatment", "with", "vehicle", "or", "120", "mg", "/", "kg", "SH", "-", "BC", "-", "893", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Blood", "glucose", "levels", "(", "F", ")", "or", "area", "under", "the", "curve", "(", "AUC", ",", "(", "G", ")", ")", "during", "an", "oral", "glucose", "tolerance", "test", "performed", "in", "the", "same", "mice", "as", "in", "(", "E", ")", ".", "Insulin", "levels", "in", "plasma", "collected", "4", "h", "after", "the", "indicated", "treatment", "with", "vehicle", "or", "SH", "-", "BC", "-", "893", "from", "the", "mice", "in", "Fig", ".", "5D", ",", "E", "or", "in", "9", "week", "old", "SD", "-", "fed", "mice", "treated", "with", "vehicle", "(", "same", "mice", "as", "in", "Fig", ".", "5J", ",", "K", ",", "0", "weeks", "on", "HFD", ")", ";", "n", "=", "8", ".", "Insulin", "levels", "in", "the", "plasma", "collected", "4", "h", "after", "treatment", "with", "vehicle", "or", "SH", "-", "BC", "-", "893", "from", "the", "same", "mice", "as", "in", "Fig", ".", "5A", ",", "B", ";", "n", "=", "8", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative H&E stained liver sections from the mice shown in Fig. 6F after 4 weeks of treatment with vehicle or 120 mg/kg SH-BC-893. Scale bar, 10 μm.Blood glucose levels (F) or area under the curve (AUC, (G)) during an oral glucose tolerance test performed in the same mice as in (E).Insulin levels in plasma collected 4 h after the indicated treatment with vehicle or SH-BC-893 from the mice in Fig. 5D,E or in 9 week old SD-fed mice treated with vehicle (same mice as in Fig. 5J,K, 0 weeks on HFD); n=8. Insulin levels in the plasma collected 4 h after treatment with vehicle or SH-BC-893 from the same mice as in Fig. 5A,B; n=8."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "WT", "to", "Il21r", "-", "/", "-", "splenic", "SWHEL", "B", "cells", "over", "time", ".", "(", "C", ")", "WT", "to", "Il21r", "-", "/", "-", "SWHEL", "B", "cell", "ratio", "within", "CTV", "division", "peaks", ".", "Data", "information", ":", "Data", "in", "(", "B", ")", "is", "representative", "of", "8", "-", "9", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "8", "-", "9", ")", "pooled", "from", "two", "independent", "experiments", "with", "statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ".", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Data", "show", "concatenated", "data", "from", "4", "-", "5", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", "and", "are", "representative", "for", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Rate", "of", "apoptosis", "measured", "by", "detecting", "active", "caspase", "3", "by", "flow", "cytometry", "across", "CTV", "division", "peaks", ".", "Data", "information", ":", "Data", "show", "concatenated", "data", "from", "4", "-", "5", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", "and", "are", "representative", "for", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Flow cytometry analysis of WT to Il21r-/- splenic SWHEL B cells over time. (C) WT to Il21r-/- SWHEL B cell ratio within CTV division peaks. Data information: Data in (B) is representative of 8-9 biological replicates (n = 8-9) pooled from two independent experiments with statistical analysis by one-way ANOVA with Tukey's post-test. ** p ≤ 0.01; **** p ≤ 0.0001. Data show concatenated data from 4-5 biological replicates (n = 4-5) and are representative for two independent experiments.(E) Rate of apoptosis measured by detecting active caspase 3 by flow cytometry across CTV division peaks. Data information: Data show concatenated data from 4-5 biological replicates (n = 4-5) and are representative for two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "showing", "WT", "to", "Il21r", "-", "/", "-", "SWHEL", "B", "cell", "ratio", "of", "cells", "that", "have", "been", "in", "S", "phase", "and", "thus", "incorporated", "BrdU", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "5", "-", "7", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "5", "-", "7", ")", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "sample", "t", "test", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "D", ")", "Ratio", "of", "the", "proportion", "of", "BrdU", "positive", "WT", "and", "Il21r", "-", "/", "-", "SWHEL", "B", "cells", "with", "2N", "DNA", "content", "4", ",", "10", "and", "12", "hours", "post", "BrdU", "pulse", "on", "day", "3", ".", "5", "post", "immunization", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "5", "-", "7", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "5", "-", "7", ")", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "sample", "t", "test", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Flow cytometry analysis showing WT to Il21r-/- SWHEL B cell ratio of cells that have been in S phase and thus incorporated BrdU. Data information: Data are representative of 5-7 biological replicates (n = 5-7) from two independent experiments. Statistical analysis by one-sample t test. *p ≤ 0.05.(D) Ratio of the proportion of BrdU positive WT and Il21r-/- SWHEL B cells with 2N DNA content 4, 10 and 12 hours post BrdU pulse on day 3.5 post immunization. Data information: Data are representative of 5-7 biological replicates (n = 5-7) from two independent experiments. Statistical analysis by one-sample t test. *p ≤ 0.05."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "Rate", "of", "de", "novo", "cell", "cycle", "entry", "10", "hours", "post", "in", "vivo", "IL", "-", "21", "(", "2", "µg", ")", "or", "saline", "pulse", ".", "The", "ratio", "of", "WT", "to", "Il21r", "-", "/", "-", "cells", "not", "in", "S", "/", "G2", "at", "the", "time", "of", "pulse", "(", "BrdU", "-", "cells", ")", "and", "containing", ">", "2N", "DNA", "content", "10", "hours", "after", "pulse", "is", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "10", "-", "12", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "10", "-", "12", ")", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "sample", "t", "test", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) Rate of de novo cell cycle entry 10 hours post in vivo IL-21 (2 µg) or saline pulse. The ratio of WT to Il21r-/- cells not in S/G2 at the time of pulse (BrdU- cells) and containing >2N DNA content 10 hours after pulse is shown. Data information: Data are representative of 10-12 biological replicates (n = 10-12) from two independent experiments. Statistical analysis by one-sample t test. * p ≤ 0.05."}
{"words": ["Figure", "4Phosphoflow", "analysis", "of", "naïve", "WT", "or", "Il21r", "-", "/", "-", "B", "cells", "following", "in", "vitro", "culture", "for", "3", "hours", "with", "or", "without", "IL", "-", "21", "(", "20", "ng", "/", "mL", ")", "and", "/", "or", "in", "the", "presence", "of", "BCR", "cross", "-", "linking", "(", "biotinylated", "anti", "-", "Igκ", "+", "anti", "-", "Igλ", "and", "avidin", "-", "mediated", "cross", "-", "linking", ")", "or", "agonistic", "anti", "-", "CD40", ".", "(", "A", ")", "Exemplary", "p", "-", "AKT", "(", "S473", ")", "staining", "and", "(", "B", ")", "quantification", "of", "p", "-", "AKT", "median", "fluorescence", "intensity", "(", "MedFI", ")", ".", "(", "C", ")", "Exemplary", "p", "-", "S6", "(", "Ser235", "/", "236", ")", "staining", "and", "(", "D", ")", "quantification", "of", "frequency", "of", "p", "-", "S6", "positive", "cells", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "4", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", "(", "D", ")", ",", "t", "test", "(", "B", ",", "E", ")", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "(", "F", ",", "In", "vitro", "cell", "culture", "of", "CTV", "labeled", "SWHEL", "B", "cells", "with", "or", "without", "IL", "-", "21", "(", "20", "ng", "/", "mL", ")", "and", "anti", "-", "CD40", "for", "three", "days", "and", "analysis", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "F", ")", "Exemplary", "CTV", "division", "peaks", ".", "G", ")", "In", "vitro", "cell", "culture", "of", "CTV", "labeled", "SWHEL", "B", "cells", "with", "or", "without", "IL", "-", "21", "(", "20", "ng", "/", "mL", ")", "and", "anti", "-", "CD40", "for", "three", "days", "and", "analysis", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "proportion", "SWHEL", "B", "that", "had", "divided", "and", "thus", "diluted", "CTV", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "4", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "correction", "for", "multiple", "comparison", "using", "Šidák", "method", "(", "G", ")", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Phosphoflow analysis of naïve WT or Il21r-/- B cells following in vitro culture for 3 hours with or without IL-21 (20 ng/mL) and/or in the presence of BCR cross-linking (biotinylated anti-Igκ + anti-Igλ and avidin-mediated cross-linking) or agonistic anti-CD40. (A) Exemplary p-AKT (S473) staining and (B) quantification of p-AKT median fluorescence intensity (MedFI). (C) Exemplary p-S6 (Ser235/236) staining and (D) quantification of frequency of p-S6 positive cells Data information: Data are representative of 4 biological replicates (n = 4). Statistical analysis by one-way ANOVA with Tukey's post-test (D), t test (B, E) * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001; **** p ≤ 0.0001.(F, In vitro cell culture of CTV labeled SWHEL B cells with or without IL-21 (20 ng/mL) and anti-CD40 for three days and analysis by flow cytometry. (F) Exemplary CTV division peaks.G) In vitro cell culture of CTV labeled SWHEL B cells with or without IL-21 (20 ng/mL) and anti-CD40 for three days and analysis by flow cytometry. (G) Quantification of the proportion SWHEL B that had divided and thus diluted CTV. Data information: Data are representative of 4 biological replicates (n = 4). Statistical analysis by two-way ANOVA with correction for multiple comparison using Šidák method (G). * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001; **** p ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ",", "C", ")", "Analysis", "of", "splenic", "OTII", "Tfh", "cells", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "B", ")", "Tfh", "cell", "count", "and", "(", "C", ")", "Proportion", "of", "Il21Gfp", "/", "+", "OTII", "Tfh", "cells", "transcribing", "the", "Il21", "locus", "and", "thus", "expressing", "GFP", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "5", "-", "6", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", "form", "two", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", "(", "B", ",", "C", ")", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ".", "Analysis", "of", "splenic", "WT", "and", "Il21r", "-", "/", "-", "SWHEL", "B", "cells", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "D", ")", "CTV", "profile", "of", "and", "(", "E", ")", "absolute", "cell", "count", "in", "pooled", "CTV", "division", "peaks", "(", "0", "-", "4", ",", "5", "-", "8", ",", "9", "-", "11", "+", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "5", "-", "6", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", "form", "two", "independent", "experiments", ".", "D", ",", "show", "concatenated", "data", "representative", "of", "3", "-", "5", "biological", "replicates", ".", "Data", "in", "E", "were", "analyzed", "after", "log", "transformation", "using", "Multiple", "paired", "t", "tests", "and", "p", "values", "corrected", "for", "multiple", "comparisons", "using", "Holm", "-", "Šídák", "method", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ".", "(", "F", ")", "Cell", "surface", "expression", "(", "median", "fluorescence", "intensity", ",", "MedFI", ")", "of", "CD38", ",", "IgD", "and", "FAS", "across", "individual", "CTV", "division", "peaks", ".", "(", "G", ")", "Representative", "flow", "cytometry", "plot", "of", "plasma", "cell", "differentiation", "indicated", "by", "CD138", "expression", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "5", "-", "6", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", "form", "two", "independent", "experiments", ".", "F", "and", "G", "show", "concatenated", "data", "representative", "of", "3", "-", "5", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B, C) Analysis of splenic OTII Tfh cells by flow cytometry. (B) Tfh cell count and (C) Proportion of Il21Gfp/+ OTII Tfh cells transcribing the Il21 locus and thus expressing GFP. Data information: Data are representative of 5-6 biological replicates (n = 5-6) form two independent experiments. Statistical analysis by one-way ANOVA with Tukey's post-test (B, C). * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01.Analysis of splenic WT and Il21r-/- SWHEL B cells by flow cytometry. (D) CTV profile of and (E) absolute cell count in pooled CTV division peaks (0-4, 5-8, 9-11+). Data information: Data are representative of 5-6 biological replicates (n = 5-6) form two independent experiments. D, show concatenated data representative of 3-5 biological replicates. Data in E were analyzed after log transformation using Multiple paired t tests and p values corrected for multiple comparisons using Holm-Šídák method. * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01.(F) Cell surface expression (median fluorescence intensity, MedFI) of CD38, IgD and FAS across individual CTV division peaks. (G) Representative flow cytometry plot of plasma cell differentiation indicated by CD138 expression. Data information: Data are representative of 5-6 biological replicates (n = 5-6) form two independent experiments. F and G show concatenated data representative of 3-5 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "E", ")", "Analysis", "of", "splenic", "SWHEL", "B", "cells", "and", "PC", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "A", ")", "Proportion", "of", "SWHEL", "B", "cells", "with", "a", "FAS", "+", "GL7", "+", "GC", "phenotype", ",", "(", "B", ")", "SWHEL", "GC", "B", "cell", "count", "and", "(", "C", ")", "representation", "of", "IL", "-", "21R", "deficient", "cells", "among", "total", "SWHEL", "GC", "B", "cells", ".", "(", "D", ")", "CD98", "+", "CD138", "+", "_", "SWHEL", "PC", "count", "and", "(", "E", ")", "representation", "of", "IL", "-", "21R", "deficient", "cells", "among", "total", "SWHEL", "PC", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "6", "-", "10", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "6", "-", "10", ")", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Data", "in", "B", ",", "D", "were", "analyzed", "after", "log", "transformation", "with", "with", "statistical", "analysis", "by", "Multiple", "paired", "t", "tests", "(", "A", ",", "B", ",", "D", ")", "and", "p", "-", "values", "corrected", "for", "multiple", "comparisons", "using", "Holm", "-", "Šídák", "method", "or", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", "(", "C", ")", "or", "t", "test", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-E) Analysis of splenic SWHEL B cells and PC by flow cytometry. (A) Proportion of SWHEL B cells with a FAS+GL7+ GC phenotype, (B) SWHEL GC B cell count and (C) representation of IL-21R deficient cells among total SWHEL GC B cells. (D) CD98+ CD138+_SWHEL PC count and (E) representation of IL-21R deficient cells among total SWHEL PC. Data information: Data are representative of 6-10 biological replicates (n = 6-10) from two independent experiments. Data in B, D were analyzed after log transformation with with statistical analysis by Multiple paired t tests (A, B, D) and p-values corrected for multiple comparisons using Holm-Šídák method or One-way ANOVA with Tukey's post-test (C) or t test (E)."}
{"words": ["Figure", "1Western", "blotting", "in", "the", "WT", ",", "Trim71", "knockout", "(", "Trim71", "_", "KO", ")", ",", "and", "the", "Trim71", "mutant", "(", "R783H", ")", "mESCs", ".", "The", "signals", "from", "the", "pluripotency", "factors", "Nanog", "and", "Oct4", "were", "obtained", "through", "short", "(", "~", "10", "seconds", ")", "exposure", ".", "Colony", "formation", "assay", "for", "mESCs", ".", "The", "mESCs", "were", "cultured", "in", "15", "%", "FBS", "+", "Lif", "for", "7", "days", ",", "and", "the", "resultant", "colonies", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "AP", ".", "Exit", "pluripotency", "assay", "for", "mESCs", ".", "The", "mESCs", "were", "induced", "to", "exit", "pluripotency", "in", "medium", "without", "Lif", "for", "2", "days", "and", "then", "switched", "to", "2i", "+", "Lif", "medium", "for", "5", "days", ".", "The", "resultant", "colonies", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "AP", ".", "Western", "blotting", "of", "pluripotency", "factors", "during", "EB", "formation", ".", "The", "signals", "from", "the", "pluripotency", "factors", "Nanog", "and", "Oct4", "were", "obtained", "through", "long", "(", "5", "-", "10min", ")", "exposure", ".", "Immunofluorescence", "(", "IF", ")", "staining", "showing", "the", "expression", "level", "of", "Rex1", "in", "mESCs", "cultured", "in", "the", "stemness", "(", "2i", "+", "Lif", ")", "and", "differentiating", "(", "15", "%", "FBS", "-", "Lif", ")", "conditions", ".", "Relative", "intensity", "of", "IF", "signals", "from", "individual", "cells", "in", "experiment", "associated", "with", "E", ".", "The", "results", "represent", "the", "means", "(", "±", "SD", ")", "of", "three", "independent", "IF", "stainings", ".", "Expression", "of", "neural", "lineage", "markers", "during", "mESCs", "neural", "differentiation", ".", "Expression", "of", "neural", "lineage", "markers", "during", "mESCs", "neural", "differentiation", ".", "IF", "staining", "of", "Nestin", ".", "The", "quantifications", "represent", "the", "means", "(", "±", "SD", ")", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Western blotting in the WT, Trim71 knockout (Trim71_KO), and the Trim71 mutant (R783H) mESCs. The signals from the pluripotency factors Nanog and Oct4 were obtained through short (~10 seconds) exposure.Colony formation assay for mESCs. The mESCs were cultured in 15%FBS + Lif for 7 days, and the resultant colonies were fixed and stained for AP.Exit pluripotency assay for mESCs. The mESCs were induced to exit pluripotency in medium without Lif for 2 days and then switched to 2i+Lif medium for 5 days. The resultant colonies were fixed and stained for AP.Western blotting of pluripotency factors during EB formation. The signals from the pluripotency factors Nanog and Oct4 were obtained through long (5-10min) exposure.Immunofluorescence (IF) staining showing the expression level of Rex1 in mESCs cultured in the stemness (2i + Lif) and differentiating (15% FBS - Lif) conditions.Relative intensity of IF signals from individual cells in experiment associated with E. The results represent the means (± SD) of three independent IF stainings.Expression of neural lineage markers during mESCs neural differentiation.Expression of neural lineage markers during mESCs neural differentiation.IF staining of Nestin. The quantifications represent the means (± SD) of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2Distribution", "of", "the", "WT", "Trim71", "and", "the", "R783H", "Trim71", "mutant", "binding", "regions", "in", "the", "mouse", "genome", ".", "In", "each", "CLIP", "-", "seq", ",", "there", "are", "two", "biological", "replicates", ".", "The", "binding", "regions", "present", "in", "both", "of", "the", "biological", "replicates", "are", "used", "for", "the", "analysis", ".", "CLIP", "-", "qRT", "-", "PCR", "for", "the", "identified", "target", "mRNAs", "of", "the", "Trim71", "mutant", "R783H", ".", "The", "results", "represent", "the", "means", "(", "±", "SD", ")", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "UCSC", "genome", "browser", "snapshot", "for", "the", "CLIP", "-", "seq", "data", "from", "Trim71", "and", "the", "Trim71", "mutant", "R783H", "in", "the", "Lsd1", "locus", ".", "The", "red", "box", "indicates", "the", "binding", "region", "of", "the", "Trim71", "mutant", "R783H", ".", "The", "inputs", "are", "from", "the", "size", "-", "matched", "input", "samples", "in", "the", "CLIP", "-", "seq", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Distribution of the WT Trim71 and the R783H Trim71 mutant binding regions in the mouse genome. In each CLIP-seq, there are two biological replicates. The binding regions present in both of the biological replicates are used for the analysis.CLIP-qRT-PCR for the identified target mRNAs of the Trim71 mutant R783H. The results represent the means (±SD) of three independent experiments.UCSC genome browser snapshot for the CLIP-seq data from Trim71 and the Trim71 mutant R783H in the Lsd1 locus. The red box indicates the binding region of the Trim71 mutant R783H. The inputs are from the size-matched input samples in the CLIP-seq analysis."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "A", "representative", "set", "of", "Western", "blots", "in", "the", "WT", "and", "the", "R783H", "Trim71", "mESCs", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "the", "target", "proteins", "in", "the", "WT", "and", "the", "R783H", "Trim71", "mESCs", ".", "Data", "information", ":", "The", "results", "represent", "the", "means", "(", "±", "SD", ")", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "Way", "ANOVA", "was", "used", "to", "determine", "the", "significance", "of", "the", "difference", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "The", "Western", "blots", "listed", "in", "B", "is", "the", "Biological", "Replicate"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. A representative set of Western blots in the WT and the R783H Trim71 mESCs. C. Quantification of the target proteins in the WT and the R783H Trim71 mESCs. Data information: The results represent the means (± SD) of three independent experiments. One-Way ANOVA was used to determine the significance of the difference, *p<0.05. The Western blots listed in B is the Biological Replicate 1"}
{"words": ["Figure", "4Western", "blotting", "in", "the", "WT", "and", "the", "Trim71", "(", "R783H", ")", "mESCs", ".", "Quantification", "of", "Lsd1", "protein", "and", "mRNA", "levels", ".", "Gapdh", "and", "18S", "rRNA", "were", "used", "for", "normalization", "in", "protein", "and", "mRNA", "quantifications", ",", "respectively", ".", "Polysome", "analysis", "in", "the", "WT", "and", "the", "Trim71", "(", "R783H", ")", "mESCs", ".", "Quantification", "of", "the", "indicated", "mRNA", "distribution", "in", "the", "RNP", ",", "80S", ",", "and", "polysome", "fractions", "from", "the", "WT", "and", "the", "Trim71", "(", "R783H", ")", "mESCs", ".", "Western", "blotting", "in", "the", "WT", "mESCs", "expressing", "an", "empty", "vector", ",", "Flag", "-", "Trim71", ",", "Flag", "-", "Trim71", "(", "R783H", ")", ".", "Quantification", "of", "Lsd1", "protein", "and", "mRNA", "in", "the", "WT", "mESCs", "expressing", "an", "empty", "vector", ",", "Flag", "-", "Trim71", ",", "Flag", "-", "Trim71", "(", "R783H", ")", ".", "Polysome", "analysis", "in", "the", "WT", "mESCs", "expressing", "an", "empty", "vector", ",", "Flag", "-", "Trim71", ",", "Flag", "-", "Trim71", "(", "R783H", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "indicated", "mRNA", "distribution", "in", "the", "RNP", ",", "80S", ",", "and", "polysome", "fractions", "from", "the", "WT", "mESCs", "expressing", "an", "empty", "vector", ",", "Flag", "-", "Trim71", ",", "Flag", "-", "Trim71", "(", "R783H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Western blotting in the WT and the Trim71 (R783H) mESCs.Quantification of Lsd1 protein and mRNA levels. Gapdh and 18S rRNA were used for normalization in protein and mRNA quantifications, respectively.Polysome analysis in the WT and the Trim71 (R783H) mESCs.Quantification of the indicated mRNA distribution in the RNP, 80S, and polysome fractions from the WT and the Trim71 (R783H) mESCs.Western blotting in the WT mESCs expressing an empty vector, Flag-Trim71, Flag-Trim71(R783H).Quantification of Lsd1 protein and mRNA in the WT mESCs expressing an empty vector, Flag-Trim71, Flag-Trim71(R783H).Polysome analysis in the WT mESCs expressing an empty vector, Flag-Trim71, Flag-Trim71(R783H). Quantification of the indicated mRNA distribution in the RNP, 80S, and polysome fractions from the WT mESCs expressing an empty vector, Flag-Trim71, Flag-Trim71(R783H)."}
{"words": ["Figure", "5Deletion", "of", "the", "Trim71", "mutant", "R783H", "binding", "site", "in", "Lsd1", "mRNA", "'", "s", "3", "'", "UTR", ".", "CLIP", "-", "RIP", "followed", "by", "qRT", "-", "PCR", "to", "examine", "mRNAs", "associated", "with", "the", "Trim71", "and", "the", "Trim71", "mutant", "R783H", "in", "the", "WT", ",", "Trim71", "(", "R783H", ")", ",", "CLIP", "∆", ",", "and", "Trim71", "(", "R783H", ")", "/", "CLIP", "∆", "mESCs", ".", "The", "mRNA", "signals", "from", "the", "E14", "mESCs", "were", "set", "as", "1", "for", "relative", "comparison", ".", "Western", "blotting", "in", "the", "WT", ",", "Trim71", "(", "R783H", ")", ",", "CLIP", "∆", ",", "and", "Trim71", "(", "R783H", ")", "/", "CLIP", "∆", "mESCs", ".", "Quantification", "of", "Lsd1", "protein", "and", "mRNA", "in", "the", "WT", ",", "Trim71", "(", "R783H", ")", ",", "CLIP", "∆", ",", "and", "Trim71", "(", "R783H", ")", "/", "CLIP", "∆", "mESCs", ".", "Beta", "-", "Tubulin", "and", "18S", "rRNA", "were", "used", "for", "normalization", "in", "the", "protein", "and", "mRNA", "quantification", ",", "respectively", ".", "Exit", "pluripotency", "assay", "for", "mESCs", ".", "Representative", "Western", "blotting", "and", "quantification", "of", "pluripotency", "factors", "during", "EB", "formation", ".", "Representative", "Western", "blotting", "and", "quantification", "of", "neural", "lineage", "markers", "during", "mESCs", "neural", "differentiation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Deletion of the Trim71 mutant R783H binding site in Lsd1 mRNA's 3'UTR.CLIP-RIP followed by qRT-PCR to examine mRNAs associated with the Trim71 and the Trim71 mutant R783H in the WT, Trim71(R783H), CLIP∆, and Trim71(R783H)/CLIP∆ mESCs. The mRNA signals from the E14 mESCs were set as 1 for relative comparison.Western blotting in the WT, Trim71(R783H), CLIP∆, and Trim71(R783H)/CLIP∆ mESCs.Quantification of Lsd1 protein and mRNA in the WT, Trim71(R783H), CLIP∆, and Trim71(R783H)/CLIP∆ mESCs. Beta-Tubulin and 18S rRNA were used for normalization in the protein and mRNA quantification, respectively.Exit pluripotency assay for mESCs.Representative Western blotting and quantification of pluripotency factors during EB formation.Representative Western blotting and quantification of neural lineage markers during mESCs neural differentiation."}
{"words": ["Figure", "6Western", "blotting", "in", "the", "WT", "and", "the", "Trim71", "(", "R783H", ")", "mESCs", "with", "dox", "-", "inducible", "expression", "of", "Lsd1", "-", "GFP", ".", "Exit", "pluripotency", "assay", "for", "mESCs", ".", "Representative", "Western", "blotting", "and", "quantification", "of", "pluripotency", "factors", "during", "the", "monolayer", "differentiation", "of", "mESCs", ".", "Representative", "Western", "blotting", "and", "quantification", "of", "neural", "lineage", "markers", "during", "mESCs", "neural", "differentiation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Western blotting in the WT and the Trim71(R783H) mESCs with dox-inducible expression of Lsd1-GFP.Exit pluripotency assay for mESCs.Representative Western blotting and quantification of pluripotency factors during the monolayer differentiation of mESCs.Representative Western blotting and quantification of neural lineage markers during mESCs neural differentiation."}
{"words": ["Figure", "7Representative", "Western", "blotting", "and", "quantification", "in", "the", "WT", "and", "the", "R783H", "/", "+", "mESCs", ".", "Exit", "pluripotency", "assay", "for", "the", "WT", "and", "the", "R783H", "/", "+", "mESCs", ".", "Representative", "Western", "blotting", "and", "quantification", "of", "pluripotency", "factors", "in", "differentiating", "mESCs", ".", "Representative", "Western", "blotting", "and", "quantification", "of", "neural", "lineage", "markers", "during", "mESCs", "neural", "differentiation", ".", "Western", "blotting", "in", "the", "WT", "and", "the", "R783H", "/", "+", "mESCs", "with", "dox", "-", "inducible", "expression", "of", "Lsd1", "-", "GFP", ".", "Exit", "pluripotency", "assay", "for", "the", "WT", "and", "the", "R783H", "/", "+", "mESCs", "with", "dox", "-", "inducible", "expression", "of", "Lsd1", "-", "GFP", ".", "Representative", "Western", "blotting", "and", "quantification", "of", "pluripotency", "factors", "during", "the", "differentiation", "of", "the", "WT", "and", "the", "R783H", "/", "+", "mESCs", "with", "dox", "-", "inducible", "expression", "of", "Lsd1", "-", "GFP", ".", "Representative", "Western", "blotting", "and", "quantification", "of", "neural", "lineage", "markers", "during", "the", "neural", "differentiation", "of", "the", "WT", "and", "the", "R783H", "/", "+", "mESCs", "with", "dox", "-", "inducible", "expression", "of", "Lsd1", "-", "GFP", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative Western blotting and quantification in the WT and the R783H/+ mESCs.Exit pluripotency assay for the WT and the R783H/+ mESCs.Representative Western blotting and quantification of pluripotency factors in differentiating mESCs.Representative Western blotting and quantification of neural lineage markers during mESCs neural differentiation.Western blotting in the WT and the R783H/+ mESCs with dox-inducible expression of Lsd1-GFP.Exit pluripotency assay for the WT and the R783H/+ mESCs with dox-inducible expression of Lsd1-GFP.Representative Western blotting and quantification of pluripotency factors during the differentiation of the WT and the R783H/+ mESCs with dox-inducible expression of Lsd1-GFP.Representative Western blotting and quantification of neural lineage markers during the neural differentiation of the WT and the R783H/+ mESCs with dox-inducible expression of Lsd1-GFP."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Electrophoretic", "mobility", "-", "shift", "assay", "(", "EMSA", ")", "with", "biotin", "-", "labeled", "RORA", "consensus", ",", "rs2978980T", "or", "rs2978980G", "probes", "and", "HGC", "-", "27", "or", "MGC80", "-", "3", "nuclear", "extracts", ".", "HGC", "-", "27", "or", "MGC80", "-", "3", "left", "panel", ":", "EMSA", "with", "RORA", "consensus", "or", "rs2978980T", "probes", ".", "Lane", "1", "-", "8", ":", "from", "the", "first", "lane", "at", "the", "left", "side", "to", "the", "right", "side", ".", "Lanes", "4", "and", "8", ",", "probe", "only", ";", "lanes", "2", "and", "6", ",", "probe", "and", "nuclear", "extracts", ";", "lanes", "1", ",", "3", ",", "5", "and", "7", ",", "probe", "and", "nuclear", "extracts", "plus", "100", "×", "unlabeled", "rs2978980T", "(", "lanes", "1", "and", "5", ")", "or", "RORA", "consensus", "probes", "(", "lanes", "3", "and", "7", ")", ".", "HGC", "-", "27", "or", "MGC80", "-", "3", "right", "panel", ":", "EMSA", "with", "rs2978980T", "or", "rs2978980G", "probes", ".", "Lanes", "1", "and", "6", ",", "probe", "only", ";", "lanes", "2", "and", "7", ",", "probe", "and", "nuclear", "extracts", ";", "lanes", "3", "-", "5", "and", "8", "-", "10", ",", "probe", "and", "nuclear", "extracts", "plus", "100", "×", "unlabeled", "rs2978980T", "(", "lanes", "5", "and", "8", ")", ",", "rs2978980G", "(", "lanes", "3", "and", "10", ")", "or", "RORA", "consensus", "probes", "(", "lanes", "4", "and", "9", ")", ".", "(", "F", ")", "Suppression", "of", "RORA", "using", "siRNAs", "(", "siRORA", "-", "1", "and", "siRORA", "-", "2", ")", "could", "markedly", "down", "-", "regulate", "lncPSCA", "expression", "in", "MGC80", "-", "3", "cells", "but", "not", "in", "HGC", "-", "27", "cells", ".", "In", "detail", ",", "MGC80", "-", "3", "and", "HGC", "-", "27", "cells", "were", "transfected", "with", "siRORA", "-", "1", "and", "siRORA", "-", "2", ",", "lncPSCA", "and", "RORA", "expression", "levels", "were", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", "and", "Western", "Blot", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1  (C) Electrophoretic mobility-shift assay (EMSA) with biotin-labeled RORA consensus, rs2978980T or rs2978980G probes and HGC-27 or MGC80-3 nuclear extracts. HGC-27 or MGC80-3 left panel: EMSA with RORA consensus or rs2978980T probes. Lane 1-8: from the first lane at the left side to the right side. Lanes 4 and 8, probe only; lanes 2 and 6, probe and nuclear extracts; lanes 1, 3, 5 and 7, probe and nuclear extracts plus 100× unlabeled rs2978980T (lanes 1 and 5) or RORA consensus probes (lanes 3 and 7). HGC-27 or MGC80-3 right panel: EMSA with rs2978980T or rs2978980G probes. Lanes 1 and 6, probe only; lanes 2 and 7, probe and nuclear extracts; lanes 3-5 and 8-10, probe and nuclear extracts plus 100× unlabeled rs2978980T (lanes 5 and 8), rs2978980G (lanes 3 and 10) or RORA consensus probes (lanes 4 and 9).   (F) Suppression of RORA using siRNAs (siRORA-1 and siRORA-2) could markedly down-regulate lncPSCA expression in MGC80-3 cells but not in HGC-27 cells. In detail, MGC80-3 and HGC-27 cells were transfected with siRORA-1 and siRORA-2, lncPSCA and RORA expression levels were measured by RT-qPCR and Western Blot. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "E", ")", "lncPSCA", "-", "knockout", "significantly", "promoted", "growth", "of", "MGC80", "-", "3", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "HGC", "-", "27", "(", "n", "=", "7", ")", "xenografts", "compared", "with", "control", "xenografts", "after", "27", "or", "18", "days", ".", "(", "F", ")", "HE", "and", "Ki67", "staining", "of", "MGC80", "-", "3", "or", "HGC", "-", "27", "xenografts", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 (E) lncPSCA-knockout significantly promoted growth of MGC80-3 (n = 8) or HGC-27 (n = 7) xenografts compared with control xenografts after 27 or 18 days.  (F) HE and Ki67 staining of MGC80-3 or HGC-27 xenografts. Scale bar = 100 μm. "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "lncPSCA", "inhibits", "invasion", "abilities", "of", "MGC80", "-", "3", "and", "HGC", "-", "27", "cells", ".", "Cells", "on", "the", "lower", "surface", "of", "the", "chamber", "were", "stained", "by", "crystal", "violet", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "(", "C", ")", "In", "MGC80", "-", "3", "and", "HGC", "-", "27", "cells", ",", "expression", "changes", "of", "different", "markers", "(", "β", "-", "catenin", ",", "ZO", "-", "1", ",", "SNAIL", "and", "VIMENTIN", ")", "of", "epithelial", "-", "to", "-", "mesenchymal", "transition", "were", "examined", "after", "overexpression", "or", "knockout", "of", "lncPSCA", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 (B) lncPSCA inhibits invasion abilities of MGC80-3 and HGC-27 cells. Cells on the lower surface of the chamber were stained by crystal violet. Scale bar = 100 μm.  (C) In MGC80-3 and HGC-27 cells, expression changes of different markers (β-catenin, ZO-1, SNAIL and VIMENTIN) of epithelial-to-mesenchymal transition were examined after overexpression or knockout of lncPSCA. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "F", ")", "Gastric", "cancer", "cells", "after", "lncPSCA", "-", "knockout", "or", "stably", "overexpressing", "lncPSCA", "and", "control", "cells", "were", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "or", "vehicle", "for", "the", "indicated", "periods", "of", "time", ".", "DDX5", "levels", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "(", "I", ")", "Knockdown", "of", "DDX5", "with", "siRNA", "(", "siD", "-", "1", "and", "siD", "-", "2", ")", "substantially", "reduced", "the", "proliferation", "of", "gastric", "cancer", "cells", ".", "Data", "show", "one", "representative", "example", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "(", "J", ")", "Silencing", "of", "DDX5", "with", "shRNA", "(", "shD", ")", "significantly", "reduced", "the", "proliferation", "of", "gastric", "cancer", "cells", ".", "Data", "show", "one", "representative", "example", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "("], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 (F) Gastric cancer cells after lncPSCA-knockout or stably overexpressing lncPSCA and control cells were treated with cycloheximide (CHX) or vehicle for the indicated periods of time. DDX5 levels were analyzed by Western blot.  (I) Knockdown of DDX5 with siRNA (siD-1 and siD-2) substantially reduced the proliferation of gastric cancer cells. Data show one representative example of three biological replicates. (J) Silencing of DDX5 with shRNA (shD) significantly reduced the proliferation of gastric cancer cells. Data show one representative example of three biological replicates. ( "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "E", ")", "RNA", "Pol", "II", "ChIPseq", "and", "RNAseq", "signals", "of", "PMAIP1", ",", "CDKN1A", ",", "SESN2", "and", "SESN3", "in", "HGC", "-", "27", "cells", ".", "Red", "bars", "represent", "the", "RNA", "Pol", "II", "ChIPseq", "signal", ".", "Orange", "or", "blue", "bars", "represent", "the", "RNAseq", "signals", "of", "HGC", "-", "27", "cells", "overexpressing", "lncPSCA", "(", "lncP", ")", "or", "with", "silenced", "DDX5", "(", "shD", ")", ",", "respectively", ".", "(", "F", ")", "Validation", "of", "candidate", "downstream", "genes", "of", "the", "lncPSCA", "-", "DDX5", "axis", "identified", "through", "the", "integrated", "analyses", ".", "qRT", "-", "PCR", "was", "performed", "for", "PMAIP1", ",", "CDKN1A", "and", "SESN2", "genes", "upon", "overexpression", "of", "lncPSCA", "(", "lncP", ")", ",", "silencing", "of", "DDX5", "(", "shD", ")", "or", "lncPSCA", "konckout", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "SEM", ".", "Data", "show", "one", "representative", "example", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 (E) RNA Pol II ChIPseq and RNAseq signals of PMAIP1, CDKN1A, SESN2 and SESN3 in HGC-27 cells. Red bars represent the RNA Pol II ChIPseq signal. Orange or blue bars represent the RNAseq signals of HGC-27 cells overexpressing lncPSCA (lncP) or with silenced DDX5 (shD), respectively.  (F) Validation of candidate downstream genes of the lncPSCA-DDX5 axis identified through the integrated analyses. qRT-PCR was performed for PMAIP1, CDKN1A and SESN2 genes upon overexpression of lncPSCA (lncP), silencing of DDX5 (shD) or lncPSCA konckout. Error bars indicate the SEM. Data show one representative example of three biological replicates. "}
{"words": ["Fig", "1", "(", "A", ")", "Swelling", "of", "neurons", "in", "the", "vestibular", "nucleus", "due", "to", "fine", "vesiculation", "(", "arrows", ")", "and", "clear", "vacuolization", "(", "arrowhead", ")", "of", "the", "cytoplasm", ".", "HE", ",", "scale", "bar", "100", "μm", ".", "(", "B", ")", "Clear", "cytoplasmic", "vacuolization", "(", "arrows", ")", "in", "cerebellar", "corticalPurkinje", "cells", ".", "HE", ",", "scale", "bar", "100", "μm", ".", "(", "C", ")", "Normal", "cerebellar", "cortex", "of", "an", "unaffected", "dog", "shows", "viable", "Purkinje", "cells", "(", "arrows", ")", "and", "a", "dense", "granular", "cell", "layer", ".", "HE", ",", "scale", "bar", "100", "μm", ".", "(", "D", ")", "Marked", "neuronal", "loss", "is", "present", "the", "cerebellar", "cortex", "of", "an", "affected", "dog", ".", "The", "number", "of", "neurons", "in", "the", "granular", "cell", "layer", "is", "reduced", "and", "only", "scattered", "Purkinje", "cells", "remain", "(", "arrow", ")", ".", "HE", ",", "scale", "bar", "100", "μm", ".", "(", "E", ")", "Axonal", "spheroids", "of", "varying", "quality", "were", "seen", "in", "the", "white", "matter", "(", "arrows", ")", "of", "cerebellum", "and", "brainstem", ".", "HE", ",", "scale", "bar", "100", "μm", ".", "(", "F", ")", "Diffuse", "cytoplasmic", "vacuolization", "of", "the", "exocrine", "pancreatic", "acinar", "cells", ".", "HE", ",", "scale", "bar", "100", "μm", ".", "(", "G", ")", "Purkinje", "cell", "with", "numerous", "single", "-", "membrane", "bound", ",", "cytoplasmic", "vacuoles", "tethering", "to", "each", "other", "(", "arrows", ",", "inset", ")", ".", "Electronmicrograph", ",", "scale", "bar", "2", "μm", ".", "Inset", ":", "scale", "bar", "1", "μm", ".", "(", "H", ")", "Axonal", "spheroid", "containing", "aggregated", "degenerated", "mitochondria", ",", "occasional", "double", "-", "membrane", "-", "bound", "autophagosomes", "(", "arrows", ")", "and", "free", "electron", "dense", "material", ",", "compressed", "by", "a", "peripheral", "clear", "vacuolar", "space", ".", "Electronmicrograph", ",", "scale", "bar", "0", ".", "5", "μm", ".", "Abbreviations", ":", "n", ",", "nucleus", ";", "ml", ",", "molecular", "layer", ";", "pl", ",", "Purkinje", "cell", "layer", ";", "gl", ",", "granular", "cell", "layer", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 1(A) Swelling of neurons in the vestibular nucleus due to fine vesiculation (arrows) and clear vacuolization (arrowhead) of the cytoplasm. HE, scale bar 100 μm.(B) Clear cytoplasmic vacuolization (arrows) in cerebellar corticalPurkinje cells. HE, scale bar 100 μm.(C) Normal cerebellar cortex of an unaffected dog shows viable Purkinje cells (arrows) and a dense granular cell layer. HE, scale bar 100 μm. (D) Marked neuronal loss is present the cerebellar cortex of an affected dog. The number of neurons in the granular cell layer is reduced and only scattered Purkinje cells remain (arrow). HE, scale bar 100 μm.(E) Axonal spheroids of varying quality were seen in the white matter (arrows) of cerebellum and brainstem. HE, scale bar 100 μm.(F) Diffuse cytoplasmic vacuolization of the exocrine pancreatic acinar cells. HE, scale bar 100 μm.(G) Purkinje cell with numerous single-membrane bound, cytoplasmic vacuoles tethering to each other (arrows, inset). Electronmicrograph, scale bar 2 μm. Inset: scale bar 1 μm.(H) Axonal spheroid containing aggregated degenerated mitochondria, occasional double-membrane-bound autophagosomes (arrows) and free electron dense material, compressed by a peripheral clear vacuolar space. Electronmicrograph, scale bar 0.5 μm. Abbreviations: n, nucleus; ml, molecular layer; pl, Purkinje cell layer; gl, granular cell layer."}
{"words": ["Fig", "4", "(", "A", ")", "Axonal", "spheroids", "stain", "diffusely", "positive", "for", "LC3B", ".", "IHCLC3B", ",", "scale", "bar", "100", "μm", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "The", "granular", "cores", "of", "the", "spheroids", "are", "positive", "for", "(", "B", ")", "ubiquitin", "(", "arrow", ")", "and", "(", "C", ")", "p62", ".", "IHCubiquitin", "and", "p62", ",", "scale", "bars", "20", "and", "100", "μm", ",", "respectively", ".", "(", "D", ")", "Smooth", "axonal", "swellings", "in", "the", "cerebellar", "cortex", "contain", "ATG4D", ".", "Inset", ":", "control", ".", "IHCATG4D", ",", "scale", "bar", "100", "μm", ".", "(", "E", ")", "Affected", "neurons", "show", "increased", "perinuclear", "granular", "LC3B", "positivity", ".", "Inset", ":", "control", ".", "IHCLC3B", ",", "scale", "bar", "100", "μm", ".", "(", "F", ")", "Neuronalvacuoles", "are", "partially", "LAMP2", "positive", "(", "arrow", ")", "and", "partially", "negative", "(", "arrow", "head", ")", ".", "Inset", ":", "control", ".", "IHCLAMP2", ",", "scale", "bar", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 4(A) Axonal spheroids stain diffusely positive for LC3B. IHCLC3B, scale bar 100 μm. (B,C) The granular cores of the spheroids are positive for (B) ubiquitin (arrow) and (C) p62. IHCubiquitin and p62, scale bars 20 and 100 μm, respectively. (D) Smooth axonal swellings in the cerebellar cortex contain ATG4D. Inset: control. IHCATG4D, scale bar 100 μm. (E) Affected neurons show increased perinuclear granular LC3B positivity. Inset: control. IHCLC3B, scale bar 100 μm. (F) Neuronalvacuoles are partially LAMP2 positive (arrow) and partially negative (arrow head). Inset: control. IHCLAMP2, scale bar 20 μm."}
{"words": ["Fig", "5", "(", "A", "-", "F", ")", "Lateral", "views", "of", "control", "and", "morphant", "zebrafishembryos", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Control", "embryos", "appear", "normal", "at", "1", "dpf", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Morphant", "embryos", "show", "severe", "abnormalities", "in", "different", "regions", "of", "the", "brain", "at", "1", "dpf", ".", "Black", "arrowheads", "denote", "the", "developing", "cerebellum", ".", "Purple", "arrows", "indicate", "the", "hindbrain", "irregularities", ".", "(", "E", ")", "Control", "embryo", "at", "2", "dpf", ".", "(", "F", ")", "A", "morphant", "embryo", "at", "2", "dpf", "displaying", "hydrocephalus", "(", "yellow", "arrow", ")", "and", "small", "head", "and", "eye", ".", "(", "G", ")", "RT", "-", "PCR", "assay", "showing", "the", "efficiency", "of", "the", "atg4daSMO", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 5(A-F) Lateral views of control and morphant zebrafishembryos. (A,B) Control embryos appear normal at 1 dpf. (C,D) Morphant embryos show severe abnormalities in different regions of the brain at 1 dpf. Black arrowheads denote the developing cerebellum. Purple arrows indicate the hindbrain irregularities. (E) Control embryo at 2 dpf. (F) A morphant embryo at 2 dpf displaying hydrocephalus (yellow arrow) and small head and eye.(G) RT-PCR assay showing the efficiency of the atg4daSMO."}
{"words": ["Fig", "6Immunostaining", "with", "(", "A", "-", "C", ")", "anti", "-", "Pvalb7", "and", "(", "D", "-", "F", ")", "anti", "-", "zebrinII", "antibody", "show", "loss", "of", "cerebellarPurkinje", "cells", "in", "atg4da", "morphants", ".", "(", "A", ",", "D", ")", "Control", "embryos", "at", "4", ".", "5", "dpf", ".", "(", "B", ",", "E", ")", "Morphants", "with", "mild", "phenotype", "show", "partial", "loss", "of", "cerebellarPurkinje", "cells", ".", "(", "C", ",", "F", ")", "Morphants", "with", "strong", "phenotype", "show", "either", "total", "loss", "of", "Purkinje", "cells", "or", "presence", "of", "few", "differentiated", "neurons", ",", "which", "are", "laterally", "located", "in", "the", "cerebellum", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "Labeling", "of", "cerebellar", "granule", "cells", "with", "anti", "-", "Vglut1", "antibody", "in", "control", "and", "morphant", "embryos", ".", "(", "H", ")", "Mildly", "affected", "morphants", "show", "reduced", "expression", "of", "Vglut1", "in", "the", "cerebellum", ".", "(", "I", ")", "Vglut1", "expression", "is", "strongly", "reduced", "in", "embryos", "showing", "severe", "phenotype", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "the", "region", "of", "cerebellum", ".", "Abbreviations", ":", "hb", ",", "hindbrain", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 6Immunostaining with (A-C) anti-Pvalb7 and (D-F) anti-zebrinII antibody show loss of cerebellarPurkinje cells in atg4da morphants. (A,D) Control embryos at 4.5 dpf. (B,E) Morphants with mild phenotype show partial loss of cerebellarPurkinje cells. (C,F) Morphants with strong phenotype show either total loss of Purkinje cells or presence of few differentiated neurons, which are laterally located in the cerebellum. (G-I) Labeling of cerebellar granule cells with anti-Vglut1 antibody in control and morphant embryos. (H) Mildly affected morphants show reduced expression of Vglut1 in the cerebellum. (I) Vglut1 expression is strongly reduced in embryos showing severe phenotype. White arrowheads indicate the region of cerebellum. Abbreviations: hb, hindbrain."}
{"words": ["Fig", "1A", ")", "Transmission", "electron", "microscopy", "(", "TEM", ")", "of", "MoDCs", "infected", "with", "P", ".", "gingivalis", "for", "2", ",", "12", "and", "24", "hours", "(", "left", ",", "middle", "and", "right", "panels", ")", ".", "The", "sections", "show", "the", "intra", "-", "and", "extra", "-", "cellular", "contents", "of", "Cont", ".", "(", "un", "-", "infected", ")", ",", "Pg381", ",", "Mfa1", "+", "Pg", "and", "FimA", "+", "Pg", "infected", "MoDCs", "for", "the", "different", "time", "pointsB", ")", "The", "figure", "shows", "the", "intracellular", "content", "of", "P", ".", "gingivalis", "strains", "after", "24", "hours", "of", "infection", ".", "MoDCs", "infected", "with", "Pg381", "or", "isogenic", "mutants", "strains", "were", "lysed", "and", "the", "survived", "intracellular", "bacteria", "were", "re", "-", "suspended", "and", "maintained", "in", "anaerobic", "broth", "for", "5", "days", ".", "The", "data", "represents", "CFU", "within", "MoDCs", "harvested", "from", "three", "healthy", "individuals", ".", "The", "means", "±", "standard", "deviation", "(", "in", "triplicates", ")", "were", "analyzed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "of", "different", "groups", "and", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "group", "comparisons", "within", "3", "different", "experiments", "(", "*", "statistical", "significance", "at", "the", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "B", ")", "The", "figure", "shows", "the", "intracellular", "content", "of", "P", ".", "gingivalis", "strains", "after", "24", "hours", "of", "infection", ".", "MoDCs", "infected", "with", "Pg381", "or", "isogenic", "mutants", "strains", "were", "lysed", "and", "the", "survived", "intracellular", "bacteria", "were", "re", "-", "suspended", "and", "maintained", "in", "anaerobic", "broth", "for", "5", "days", ".", "The", "data", "represents", "CFU", "within", "MoDCs", "harvested", "from", "three", "healthy", "individuals", ".", "The", "means", "±", "standard", "deviation", "(", "in", "triplicates", ")", "were", "analyzed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "of", "different", "groups", "and", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "group", "comparisons", "within", "3", "different", "experiments", "(", "*", "statistical", "significance", "at", "the", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 1A) Transmission electron microscopy (TEM) of MoDCs infected with P. gingivalis for 2, 12 and 24 hours (left, middle and right panels). The sections show the intra-and extra-cellular contents of Cont. (un-infected), Pg381, Mfa1+Pg and FimA+Pg infected MoDCs for the different time pointsB) The figure shows the intracellular content of P. gingivalis strains after 24 hours of infection. MoDCs infected with Pg381 or isogenic mutants strains were lysed and the survived intracellular bacteria were re-suspended and maintained in anaerobic broth for 5 days. The data represents CFU within MoDCs harvested from three healthy individuals. The means ±standard deviation (in triplicates) were analyzed by One-way ANOVA of different groups and Tukey's test for multiple group comparisons within 3 different experiments (* statistical significance at the p<0.001).B) The figure shows the intracellular content of P. gingivalis strains after 24 hours of infection. MoDCs infected with Pg381 or isogenic mutants strains were lysed and the survived intracellular bacteria were re-suspended and maintained in anaerobic broth for 5 days. The data represents CFU within MoDCs harvested from three healthy individuals. The means ±standard deviation (in triplicates) were analyzed by One-way ANOVA of different groups and Tukey's test for multiple group comparisons within 3 different experiments (* statistical significance at the p<0.001)."}
{"words": ["Fig", "2A", ")", "DC", "-", "SIGN", "mRNA", "expression", "in", "P", ".", "gingivalis", "-", "infected", "MoDCs", "at", "0", ".", "1", ",", "1", "and", "10", "MOIs", ".", "The", "figure", "shows", "the", "gene", "expression", "after", "12", "hours", "of", "Pg381", "and", "mutant", "strains", "infections", ".", "The", "target", "gene", "(", "DC", "-", "SIGN", ")", "was", "normalized", "using", "the", "endogenous", "control", "GAPDH", "(", "ΔCt", ")", "and", "fold", "regulations", "were", "calculated", "using", "2", "-", "(", "ΔΔCt", ")", "method", ".", "The", "statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "the", "t", "-", "test", ",", "which", "accounts", "for", "the", "clustering", "of", "infected", "and", "un", "-", "infected", "controls", "within", "3", "different", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "B", ")", "Immuno", "-", "electron", "microscopy", "of", "un", "-", "infected", "MoDCs", "(", "Cont", ".", ")", "(", "upper", "panel", ")", ",", "MoDCs", "infected", "with", "Pg381", "(", "middle", "panel", ")", "and", "Mfa1", "+", "Pg", "mutants", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Gold", "particles", "(", "marked", "with", "red", "rings", ")", "for", "positive", "DC", "-", "SIGN", "were", "detected", "in", "the", "cell", "membrane", "and", "cytoplasm", "of", "cells", "infected", "with", "Mfa1", "+", "Pg", "strains", ".", "Minimal", "positive", "staining", "for", "DC", "-", "SIGN", "was", "detected", "in", "the", "membranes", "of", "MoDCs", "infected", "with", "Pg381", ",", "while", "no", "cytoplasmic", "gold", "labeling", "was", "detected", "in", "these", "cells", ".", "C", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "surface", "DC", "-", "SIGN", "in", "human", "MoDCs", "after", "infection", "with", "Pg381", ",", "Mfa1", "+", "Pg", "and", "FimA", "+", "Pg", ".", "The", "analysis", "of", "the", "intensity", "used", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "analysis", "of", "different", "groups", "and", "Dunn", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", "3", "different", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 2A) DC-SIGN mRNA expression in P. gingivalis-infected MoDCs at 0.1, 1 and 10 MOIs. The figure shows the gene expression after 12 hours of Pg381 and mutant strains infections. The target gene (DC-SIGN) was normalized using the endogenous control GAPDH (ΔCt) and fold regulations were calculated using 2-(ΔΔCt) method. The statistical analysis was performed using the t-test, which accounts for the clustering of infected and un-infected controls within 3 different experiments (* p<0.001).B) Immuno-electron microscopy of un-infected MoDCs (Cont.) (upper panel), MoDCs infected with Pg381 (middle panel) and Mfa1+Pg mutants (lower panel). Gold particles (marked with red rings) for positive DC-SIGN were detected in the cell membrane and cytoplasm of cells infected with Mfa1+Pg strains. Minimal positive staining for DC-SIGN was detected in the membranes of MoDCs infected with Pg381, while no cytoplasmic gold labeling was detected in these cells.C) Flow cytometry analysis of surface DC-SIGN in human MoDCs after infection with Pg381, Mfa1+Pg and FimA+Pg. The analysis of the intensity used Kruskal-Wallis test analysis of different groups and Dunn's test for multiple comparisons 3 different experiments (* p<0.01)."}
{"words": ["Fig", "3A", ")", "Pg381", "and", "mutant", "strains", "count", "after", "24", "hr", "incubation", "with", "human", "MoDCs", "with", "/", "without", "Rapamycin", "treatment", ".", "The", "survived", "bacteria", "were", "measured", "after", "maintaining", "the", "lysed", "MoDCs", "suspension", "in", "anaerobic", "broth", "for", "5", "days", ".", "The", "plot", "represents", "the", "means", "±", "standard", "deviation", "of", "CFU", "within", "MoDCs", "harvested", "from", "three", "healthy", "individuals", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "The", "analysis", "of", "readings", "used", "One", "-", "way", "AVOVA", "analysis", "of", "different", "groups", "and", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "B", ")", "Epifluorescence", "microscopy", "images", "of", "MoDCs", "treated", "with", "Rapamycin", "1", "hour", "after", "P", ".", "gingivalis", "infections", ".", "LC3", "-", "II", "(", "red", "-", "fluorescent", "dye", ")", "and", "the", "bacterial", "strains", "(", "green", "CFSE", ")", "were", "studied", "in", "MoDCs", "11", "hours", "after", "Rapamycin", "treatment", "(", "12", "hours", "after", "infections", ")", ".", "C", ")", "Quantifications", "of", "the", "fluorescent", "intensity", "of", "CFSE", "-", "labeled", "P", ".", "gingivalis", "and", "LC3", "-", "II", "signals", "within", "infected", "MoDCs", "using", "NIS", "-", "Elements", "BR", "software", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "was", "used", "to", "compare", "the", "means", "of", "intensity", "of", "different", "groups", "and", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 3A) Pg381 and mutant strains count after 24 hr incubation with human MoDCs with/without Rapamycin treatment. The survived bacteria were measured after maintaining the lysed MoDCs suspension in anaerobic broth for 5 days. The plot represents the means ±standard deviation of CFU within MoDCs harvested from three healthy individuals (* P<0.001). The analysis of readings used One-way AVOVA analysis of different groups and Tukey's test for multiple comparisons.B) Epifluorescence microscopy images of MoDCs treated with Rapamycin 1 hour after P. gingivalis infections. LC3-II (red-fluorescent dye) and the bacterial strains (green CFSE) were studied in MoDCs 11 hours after Rapamycin treatment (12 hours after infections).C) Quantifications of the fluorescent intensity of CFSE-labeled P. gingivalis and LC3-II signals within infected MoDCs using NIS-Elements BR software. One-way ANOVA analysis was used to compare the means of intensity of different groups and Tukey's test for multiple comparisons (* P<0.001)."}
{"words": ["Fig", "4A", ")", "Survival", "of", "P", ".", "gingivalis", "strains", "within", "MoDCs", "after", "6", ",", "12", ",", "24", "and", "48", "hours", ".", "Blue", "lines", "show", "P", ".", "gingivalis", "strains", "survival", "within", "MoDCs", "and", "their", "survival", "in", "anaerobic", "condition", "in", "the", "absence", "of", "DCs", "are", "showed", "in", "black", "lines", ".", "The", "effect", "of", "rapamycin", "on", "Mfa1", "+", "Pg", ",", "Pg381", "and", "FimA", "+", "Pg", "survival", "within", "MoDCs", "are", "shown", "in", "figures", "B", ",", "C", "and", "D", "respectively", ".", "A", "three", "-", "factor", "repeated", "measures", "ANOVA", "using", "mixed", "models", "was", "used", "to", "test", "the", "effect", "of", "strain", "and", "rapamycin", "treatment", "over", "time", "on", "OD", "reading", ".", "The", "survival", "curves", "for", "the", "strains", "are", "showed", "in", "blue", ",", "while", "the", "effect", "of", "rapamycin", "treatments", "are", "in", "red", ".", "Bacterial", "survivals", "in", "the", "absence", "of", "MoDCs", "with", "and", "without", "rapamycin", "are", "plotted", "in", "grey", "and", "black", ",", "respectively", ".", "Statistical", "analysis", "showed", "that", "the", "strain", "by", "rapamycin", "treatment", "overtime", "interaction", "indicates", "the", "pattern", "of", "means", "in", "each", "strain", "(", "Mfa1", "+", "Pg", ",", "Pg381", "and", "FimA", "+", "Pg", ")", "between", "treated", "(", "rapamycin", ")", "and", "untreated", "were", "significantly", "different", "overtime", "(", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "=", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 4A) Survival of P. gingivalis strains within MoDCs after 6, 12, 24 and 48 hours. Blue lines show P. gingivalis strains survival within MoDCs and their survival in anaerobic condition in the absence of DCs are showed in black lines.The effect of rapamycin on Mfa1+Pg, Pg381 and FimA+Pg survival within MoDCs are shown in figures B, C and D respectively. A three-factor repeated measures ANOVA using mixed models was used to test the effect of strain and rapamycin treatment over time on OD reading. The survival curves for the strains are showed in blue, while the effect of rapamycin treatments are in red. Bacterial survivals in the absence of MoDCs with and without rapamycin are plotted in grey and black, respectively. Statistical analysis showed that the strain by rapamycin treatment overtime interaction indicates the pattern of means in each strain (Mfa1+Pg, Pg381 and FimA+Pg) between treated (rapamycin) and untreated were significantly different overtime (p-value <0.=001)."}
{"words": ["Fig", "5A", ")", "Epifluorescence", "microscopy", "images", "of", "MoDCs", "infected", "with", "Pg381", ",", "Mfa1", "+", "Pg", ",", "FimA", "+", "Pg", "and", "MFB", "strains", "after", "12", "hours", ".", "LC3", "-", "II", "was", "detected", "in", "red", "-", "fluorescent", "(", "Texas", "red", ")", "dye", "and", "the", "bacterial", "strains", "were", "pre", "-", "labeled", "with", "CFSE", "(", "green", ")", ".", "Co", "-", "localization", "of", "P", ".", "gingivalis", "and", "LC3", "-", "II", "showed", "in", "the", "right", "panels", ".", "B", ")", "Quantifications", "of", "the", "fluorescent", "intensity", "of", "LC3", "-", "II", "within", "infected", "MoDCs", "using", "NIS", "-", "Elements", "BR", "software", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "was", "used", "to", "compare", "the", "means", "of", "intensity", "of", "different", "groups", "and", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", "of", "three", "different", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "C", ")", "Bacterial", "uptake", "by", "MoDCs", "was", "determined", "by", "CFSE", "fluorescent", "intensity", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 5A) Epifluorescence microscopy images of MoDCs infected with Pg381, Mfa1+Pg, FimA+Pg and MFB strains after 12 hours. LC3-II was detected in red-fluorescent (Texas red) dye and the bacterial strains were pre-labeled with CFSE (green). Co-localization of P. gingivalis and LC3-II showed in the right panels.B) Quantifications of the fluorescent intensity of LC3-II within infected MoDCs using NIS-Elements BR software. One-way ANOVA analysis was used to compare the means of intensity of different groups and Tukey's test for multiple comparisons of three different experiments (* p<0.001, # p<0.01).C) Bacterial uptake by MoDCs was determined by CFSE fluorescent intensity (* p<0.001, # p<0.01)."}
{"words": ["Fig", "6A", ")", "Immuno", "-", "fluorescence", "images", "of", "LC3", "-", "II", "and", "P", ".", "gingivalis", "within", "MoDCs", "pre", "-", "treated", "with", "GP120", "(", "DC", "-", "SIGN", "blocker", ")", "after", "12", "hours", "of", "infection", ".", "LC3", "-", "II", "was", "detected", "in", "red", "-", "fluorescent", "dye", "and", "the", "bacterial", "strains", "were", "pre", "-", "labeled", "with", "green", "CFSE", ".", "B", ")", "Fluorescent", "intensity", "of", "LC3", "-", "II", "and", "P", ".", "gingivalis", "strains", "signal", "(", "in", "triplicates", ")", "were", "statistically", "analyzed", "(", "*", "and", "#", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "C", ")", "Flow", "cytometry", "of", "MoDCs", "treated", "with", "siRNA", "for", "DC", "-", "SIGN", "(", "si", "-", "DC", "-", "SIGN", ")", "after", "12", "hours", ".", "Left", "panels", "show", "the", "decrease", "of", "DC", "-", "SIGN", "in", "Cont", ".", "(", "un", "-", "infected", ")", ",", "Pg381", "and", "Mfa1", "+", "Pg", "-", "infected", "MoDCs", ".", "D", ")", "Epifluorescence", "microscopy", "images", "of", "MoDCs", "(", "si", "-", "DC", "-", "SIGN", ")", "infected", "with", "Pg381", "and", "Mfa1", "+", "Pg", ".", "LC3", "-", "II", "was", "detected", "in", "red", "-", "fluorescent", "dye", "and", "the", "bacterial", "strains", "were", "pre", "-", "labeled", "with", "green", "CFSE", ".", "E", ")", "The", "figure", "shows", "the", "CFU", "counts", "of", "the", "P", ".", "gingivalis", "strains", "with", "MoDCs", "that", "lack", "DC", "-", "SIGN", "(", "si", "-", "DC", "-", "SIGN", ")", ".", "The", "analysis", "of", "readings", "used", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "different", "groups", "and", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 6A) Immuno-fluorescence images of LC3-II and P. gingivalis within MoDCs pre-treated with GP120 (DC-SIGN blocker) after 12 hours of infection. LC3-II was detected in red-fluorescent dye and the bacterial strains were pre-labeled with green CFSE.B) Fluorescent intensity of LC3-II and P. gingivalis strains signal (in triplicates) were statistically analyzed (* and # p<0.001).C) Flow cytometry of MoDCs treated with siRNA for DC-SIGN (si-DC-SIGN) after 12 hours. Left panels show the decrease of DC-SIGN in Cont. (un-infected), Pg381 and Mfa1+Pg-infected MoDCs.D) Epifluorescence microscopy images of MoDCs (si-DC-SIGN) infected with Pg381 and Mfa1+Pg. LC3-II was detected in red-fluorescent dye and the bacterial strains were pre-labeled with green CFSE.E) The figure shows the CFU counts of the P. gingivalis strains with MoDCs that lack DC-SIGN (si-DC-SIGN). The analysis of readings used One-way ANOVA analysis of different groups and Tukey's test for multiple comparisons (* p<0.001)."}
{"words": ["Fig", "7A", ")", "Western", "blot", "detection", "of", "LC3", "in", "MoDCs", "infected", "with", "Pg381", "and", "mutant", "strains", "for", "12", "hours", ".", "B", ")", "The", "mean", "±", "standard", "deviation", "of", "LC3", "-", "II", "intensity", "represents", "three", "different", "experiments", "and", "the", "values", "were", "analyzed", "using", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "analysis", "of", "different", "groups", "and", "Dunn", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "C", ")", "Blot", "shows", "the", "autophagy", "flux", "test", "after", "blocking", "the", "lysosomal", "fusion", "with", "Bafilomycin", "in", "MoDCs", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "Bafilomycin", "for", "4", "hours", "at", "4nM", ".", "D", ")", "LC3", "-", "II", "intensity", "in", "MoDCs", "infected", "with", "Pg381", "strains", "with", "and", "without", "Bafilomycin", ".", "The", "analysis", "of", "the", "intensity", "of", "three", "different", "experiments", "used", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "analysis", "of", "different", "groups", "and", "Dunn", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 7A) Western blot detection of LC3 in MoDCs infected with Pg381 and mutant strains for 12 hours. B) The mean ±standard deviation of LC3-II intensity represents three different experiments and the values were analyzed using Kruskal-Wallis test analysis of different groups and Dunn's test for multiple comparisons.C) Blot shows the autophagy flux test after blocking the lysosomal fusion with Bafilomycin in MoDCs. Cells were treated with Bafilomycin for 4 hours at 4nM. D) LC3-II intensity in MoDCs infected with Pg381 strains with and without Bafilomycin. The analysis of the intensity of three different experiments used Kruskal-Wallis test analysis of different groups and Dunn's test for multiple comparisons."}
{"words": ["Fig", "8A", ")", "Flow", "cytometry", "of", "CD83", "on", "MoDCs", "after", "incubation", "of", "TLR4", "ligand", "(", "E", ".", "coli", "LPS", ")", "and", "TLR1", "and", "2", "ligand", "(", "Pam3csk4", ")", "for", "4", "hour", ".", "B", ")", "Immuno", "-", "fluorescence", "images", "of", "LC3", "-", "II", "(", "red", ")", "within", "MoDCs", "after", "incubation", "with", "TLR4", "and", "TLR1", "&", "amp", ";", "amp", ";", "2", "ligands", "(", "E", ".", "coli", "LPS", "and", "Pam3csk4", ")", "C", ")", "The", "plot", "represents", "the", "means", "±", "standard", "deviation", "of", "CFU", "within", "MoDCs", "harvested", "from", "three", "healthy", "individuals", "after", "24", "hours", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 8A) Flow cytometry of CD83 on MoDCs after incubation of TLR4 ligand (E. coli LPS) and TLR1 and 2 ligand (Pam3csk4) for 4 hour.B) Immuno-fluorescence images of LC3-II (red) within MoDCs after incubation with TLR4 and TLR1&amp;amp;2 ligands (E. coli LPS and Pam3csk4)C) The plot represents the means ±standard deviation of CFU within MoDCs harvested from three healthy individuals after 24 hours (** p<0.001)."}
{"words": ["Fig", "9A", ")", "Scanning", "electron", "microscopy", "(", "SEM", ")", "of", "MoDCs", "of", "the", "early", "interaction", "of", "MoDCs", "with", "Pg381", "and", "Mfa1", "+", "Pg", "(", "upper", "panel", "10000x", "and", "lower", "panel", "25000x", ")", ".", "B", ")", "SEM", "for", "MoDCs", "interacting", "with", "Pg381", "(", "green", "stains", "for", "bacteria", "are", "computer", "generated", ")", ".", "C", ")", "Transmission", "electron", "microscopy", "(", "TEM", ")", "of", "autophagosome", "like", "structures", "within", "MoDCs", "infected", "with", "Pg381", ",", "Mfa1", "+", "Pg", "and", "FimA", "+", "Pg", "for", "12", "hours", "(", "upper", ",", "middle", "and", "lower", "panels", ",", "respectively", ")", ".", "The", "right", "and", "left", "sections", "show", "the", "different", "magnifications", "of", "randomly", "selected", "sections", ".", "Pg381", "and", "FimA", "+", "Pg", "strains", "are", "mostly", "enclosed", "in", "the", "characteristics", "double", "-", "membrane", "intracellular", "vesicles", "(", "Orange", "arrows", ")", ".", "Contrary", ",", "Mfa1", "+", "Pg", "escaped", "these", "autophagic", "(", "double", "-", "membrane", ")", "vesicles", "and", "enclosed", "within", "single", "membrane", "structures", "or", "freely", "occupy", "the", "cytoplasm", "(", "Green", "arrows", ")", ".", "D", ")", "The", "ratio", "of", "bacteria", "included", "in", "the", "double", "membrane", "were", "compared", "to", "total", "number", "of", "bacteria", "within", "MoDCs", "and", "plotted", "as", "percentage", ".", "Counting", "of", "the", "bacteria", "included", "in", "single", "or", "doubled", "membrane", "vesicles", "after", "12", "hours", "of", "infection", ".", "Each", "strain", "was", "counted", "in", "three", "randomly", "selected", "grids", "for", "each", "sample", ".", "The", "analysis", "of", "the", "bacterial", "counts", "used", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "of", "different", "groups", "and", "Dunn", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 9A) Scanning electron microscopy (SEM) of MoDCs of the early interaction of MoDCs with Pg381 and Mfa1+Pg (upper panel 10000x and lower panel 25000x). B) SEM for MoDCs interacting with Pg381 (green stains for bacteria are computer generated).C) Transmission electron microscopy (TEM) of autophagosome like structures within MoDCs infected with Pg381, Mfa1+Pg and FimA+Pg for 12 hours (upper, middle and lower panels, respectively). The right and left sections show the different magnifications of randomly selected sections. Pg381 and FimA+Pg strains are mostly enclosed in the characteristics double-membrane intracellular vesicles (Orange arrows). Contrary, Mfa1+Pg escaped these autophagic (double-membrane) vesicles and enclosed within single membrane structures or freely occupy the cytoplasm (Green arrows).D) The ratio of bacteria included in the double membrane were compared to total number of bacteria within MoDCs and plotted as percentage. Counting of the bacteria included in single or doubled membrane vesicles after 12 hours of infection. Each strain was counted in three randomly selected grids for each sample. The analysis of the bacterial counts used Kruskal-Wallis test of different groups and Dunn's test for multiple comparisons (*p<0.01)."}
{"words": ["Fig", "10A", ")", "Epifluorescence", "microscopy", "images", "of", "MoDCs", "infected", "with", "pre", "-", "labeled", "bacteria", "(", "green", "-", "CFSE", ")", ".", "LAMP1", "detected", "by", "transduction", "of", "red", "fluorescent", "protein", "(", "RFP", ")", "chimera", "using", "baculovirus", "transgenes", "to", "MoDCs", ".", "B", ")", "The", "mean", "of", "fluorescent", "intensities", "±", "standard", "deviation", "of", "LAMP1", "were", "quantified", "in", "three", "different", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "C", ")", "The", "upper", "scattered", "plot", "shows", "the", "co", "-", "localization", "of", "red", "and", "green", "signals", "in", "sections", "of", "MoDCs", "infected", "with", "Pg381", "and", "mutants", "strains", ".", "The", "lower", "plot", "shows", "the", "average", "of", "Pearson", "'", "s", "correlation", "measures", "of", "three", "randomly", "selected", "region", "of", "interest", "(", "ROI", ")", "within", "each", "field", "within", "3", "different", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "(", "Table", "4", "and", "5", ")", ".", "All", "analysis", "of", "fluorescence", "intensity", "used", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "different", "groups", "and", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparisons", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 10A) Epifluorescence microscopy images of MoDCs infected with pre-labeled bacteria (green-CFSE). LAMP1 detected by transduction of red fluorescent protein (RFP) chimera using baculovirus transgenes to MoDCs.B) The mean of fluorescent intensities ±standard deviation of LAMP1 were quantified in three different experiments (* p<0.001).C) The upper scattered plot shows the co-localization of red and green signals in sections of MoDCs infected with Pg381 and mutants strains. The lower plot shows the average of Pearson's correlation measures of three randomly selected region of interest (ROI) within each field within 3 different experiments (* p<0.0001) (Table 4 and 5). All analysis of fluorescence intensity used One-way ANOVA analysis of different groups and Tukey's test for multiple comparisons."}
{"words": ["Figure", "1C", ",", "D", ".", "Immunolabeling", "of", "HH25", "chick", "embryo", "sections", "50", "hours", "post", "-", "engraftment", "of", "A375P", ":", ":", "GFP", "cells", ",", "using", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", "(", "in", "green", "in", "C", ",", "in", "brown", "in", "D", ",", "A375P", ":", "GFP", "cells", ")", ",", "an", "anti", "-", "HNK1", "antibody", "(", "in", "white", ",", "migrating", "and", "early", "post", "-", "migrating", "NCCs", ")", ",", "an", "anti", "-", "Ki67", "antibody", "(", "in", "red", "in", "C", ",", "cycling", "cells", ")", ",", "an", "anti", "-", "SOX10", "antibody", "(", "in", "red", "in", "D", ",", "also", "stains", "chick", "endogenous", "NCCs", ")", "and", "an", "anti", "-", "MITF", "antibody", "(", "in", "yellow", "in", "D", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "(", "in", "blue", ")", ".", "In", "C", ",", "the", "upper", "left", "photo", "shows", "a", "grafted", "embryo", "prior", "to", "cryosection", ".", "In", "D", ",", "right", "panels", "are", "enlargements", "of", "the", "lower", "left", "panel", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "µm", ".", "F", ".", "3D", "views", "(", "light", "-", "sheet", "imaging", ")", "of", "HH25", "chick", "embryos", "engrafted", "with", "different", "melanoma", "patient", "samples", ",", "showing", "different", "patterns", "of", "tumor", "cell", "localization", "50", "hours", "post", "-", "engraftment", ".", "G", ".", "Immunofluorescent", "labeling", "of", "HH25", "chick", "embryo", "sections", "50", "hours", "post", "-", "engraftment", "of", "OF", "-", "MEL", "-", "020", "patient", "sample", ",", "labeled", "with", "CFSE", "(", "in", "green", ")", "prior", "to", "the", "graft", ".", "An", "anti", "-", "SOX10", "antibody", "(", "in", "red", ")", "and", "an", "anti", "-", "MITF", "antibody", "(", "in", "yellow", ")", "were", "used", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "(", "in", "blue", ")", ".", "Right", "panels", "are", "enlargements", "of", "the", "dotted", "area", "in", "the", "left", "panel", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C,D. Immunolabeling of HH25 chick embryo sections 50 hours post-engraftment of A375P::GFP cells, using an anti-GFP antibody (in green in C, in brown in D, A375P:GFP cells), an anti-HNK1 antibody (in white, migrating and early post-migrating NCCs), an anti-Ki67 antibody (in red in C, cycling cells), an anti-SOX10 antibody (in red in D, also stains chick endogenous NCCs) and an anti-MITF antibody (in yellow in D). Nuclei were stained with Hoechst (in blue). In C, the upper left photo shows a grafted embryo prior to cryosection. In D, right panels are enlargements of the lower left panel. Scale bar: 200 µm.F. 3D views (light-sheet imaging) of HH25 chick embryos engrafted with different melanoma patient samples, showing different patterns of tumor cell localization 50 hours post-engraftment.G. Immunofluorescent labeling of HH25 chick embryo sections 50 hours post-engraftment of OF-MEL-020 patient sample, labeled with CFSE (in green) prior to the graft. An anti-SOX10 antibody (in red) and an anti-MITF antibody (in yellow) were used. Nuclei were stained with Hoechst (in blue). Right panels are enlargements of the dotted area in the left panel."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", ".", "Immunofluorescent", "labeling", "(", "A", ")", "of", "HH25", "chick", "embryo", "sections", "50", "hours", "post", "-", "engraftment", "of", "A375P", ":", ":", "GFP", "cells", ",", "using", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", ",", "an", "anti", "-", "MITF", "antibody", "(", "pink", ")", "and", "an", "anti", "-", "SOX10", "(", "white", ")", "antibody", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", ".", "Right", "panels", "are", "enlargements", "of", "the", "dotted", "area", "in", "left", "panel", ".", "In", "B", ",", "the", "mean", "fraction", "of", "MITF", "-", "negative", "(", "MITFneg", ")", ",", "-", "low", "(", "MITFlow", ")", "and", "-", "positive", "(", "MITFpos", ")", "A375P", ":", ":", "GFP", "cells", "in", "the", "tumor", "mass", "and", "in", "migrating", "cells", "was", "quantified", "(", "n", "=", "16", "slices", "from", "3", "embryos", ")", ".", "Error", "bars", "show", "SEM", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", "comparing", "tumors", "vs", "migrating", "cells", "for", "each", "class", "of", "MITF", "expression", "was", "performed", ",", "p", "-", "values", "are", "indicated", "on", "the", "graph", ".", "C", ",", "D", ".", "Immunofluorescent", "labeling", "(", "C", ")", "of", "HH25", "chick", "embryo", "sections", "50", "hours", "post", "-", "engraftment", "of", "A375P", ":", ":", "GFP", "cells", ",", "using", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", "and", "an", "anti", "-", "Ki67", "antibody", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", ".", "Right", "panels", "are", "enlargements", "of", "the", "dotted", "area", "in", "the", "left", "panel", ".", "In", "D", ",", "the", "mean", "fraction", "of", "Ki67", "-", "positive", "(", "Ki67pos", ")", "A375P", ":", ":", "GFP", "cells", "in", "the", "tumor", "mass", "and", "in", "migrating", "cells", "was", "quantified", "(", "n", "=", "25", "slices", "from", "3", "embryos", ")", ".", "Arrows", "point", "at", "cells", "having", "a", "mesenchymal", "morphology", ".", "Error", "bars", "show", "SEM", ".", "Student", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0070", ".", "H", "-", "K", ".", "3D", "views", "(", "H", ",", "J", ")", "and", "quantification", "of", "tumor", "volumes", "(", "I", ",", "K", ")", "of", "HH25", "chick", "embryos", "engrafted", "with", "GLO", "(", "H", ",", "I", ")", "or", "GLO", "-", "R", "(", "J", ",", "K", ")", "cells", "and", "treated", "with", "a", "combination", "of", "Vemurafenib", "and", "Cobimetinib", ",", "or", "Vorinostat", "alone", ",", "or", "a", "combination", "of", "the", "three", "molecules", ".", "The", "number", "of", "embryos", "analyzed", "for", "each", "experimental", "condition", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "+", "SEM", ".", "Student", "t", "-", "tests", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ":", "not", "significant", ".", "Exact", "p", "-", "values", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A,B. Immunofluorescent labeling (A) of HH25 chick embryo sections 50 hours post-engraftment of A375P::GFP cells, using an anti-GFP antibody, an anti-MITF antibody (pink) and an anti-SOX10 (white) antibody. Nuclei were stained with Hoechst. Right panels are enlargements of the dotted area in left panel. In B, the mean fraction of MITF-negative (MITFneg), -low (MITFlow) and -positive (MITFpos) A375P::GFP cells in the tumor mass and in migrating cells was quantified (n = 16 slices from 3 embryos). Error bars show SEM. Mann-Whitney test comparing tumors vs migrating cells for each class of MITF expression was performed, p-values are indicated on the graph.C,D. Immunofluorescent labeling (C) of HH25 chick embryo sections 50 hours post-engraftment of A375P::GFP cells, using an anti-GFP antibody and an anti-Ki67 antibody. Nuclei were stained with Hoechst. Right panels are enlargements of the dotted area in the left panel. In D, the mean fraction of Ki67-positive (Ki67pos) A375P::GFP cells in the tumor mass and in migrating cells was quantified (n = 25 slices from 3 embryos). Arrows point at cells having a mesenchymal morphology. Error bars show SEM. Student t-test, **p = 0.0070.H-K. 3D views (H, J) and quantification of tumor volumes (I, K) of HH25 chick embryos engrafted with GLO (H, I) or GLO-R (J, K) cells and treated with a combination of Vemurafenib and Cobimetinib, or Vorinostat alone, or a combination of the three molecules. The number of embryos analyzed for each experimental condition are indicated on the graphs. Bars and error bars indicate mean + SEM. Student t-tests, **: p < 0.01, ns: not significant. Exact p-values are indicated on the graphs."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ".", "3D", "views", "(", "A", ")", "and", "quantification", "of", "variations", "in", "the", "mean", "tumor", "volume", "(", "B", ")", "of", "HH25", "chick", "embryos", "engrafted", "with", "BRAFwt", "(", "OF", "-", "MEL", "-", "028", ")", "or", "BRAFV600E", "(", "OF", "-", "MEL", "-", "020", ",", "OF", "-", "MEL", "-", "027", ")", "patient", "samples", "and", "treated", "with", "excipient", "or", "a", "combination", "of", "Vemurafenib", "and", "Cobimetinib", ".", "The", "number", "of", "embryos", "analyzed", "for", "each", "patient", "sample", "is", "indicated", "on", "the", "graphs", ".", "Student", "t", "-", "test", "for", "OF", "-", "MEL", "-", "020", ";", "Mann", "-", "Whintey", "test", "for", "OF", "-", "MEL", "-", "028", ",", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", ":", "not", "significant", ".", "Exact", "p", "-", "values", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", ".", "C", ",", "D", ".", "Survival", "rate", "(", "left", "axis", ")", "and", "mean", "body", "surface", "area", "(", "BSA", ",", "right", "axis", ")", "of", "chick", "embryos", "injected", "with", "increasing", "doses", "of", "Dabrafenib", "(", "C", ")", "and", "Trametinib", "(", "D", ")", ".", "The", "maximum", "tolerated", "dose", "(", "MTD", ",", "in", "red", "on", "the", "X", "-", "axis", ")", "was", "defined", "as", "the", "higher", "dose", "of", "drug", "associated", "with", "a", "survival", "rate", "higher", "than", "75", "%", "and", "a", "mean", "BSA", "similar", "(", "i", ".", "e", ".", ",", "non", "-", "statistically", "different", ")", "from", "embryos", "treated", "with", "excipient", "(", "17", ".", "1", "and", "0", ".", "0228", "mg", "/", "kg", "respectively", ")", ".", "N", "=", "10", "replicates", "per", "experimental", "group", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "ns", ",", "non", "-", "significant", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "compared", "with", "excipient", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "of", "HH25", "chick", "embryos", "engrafted", "with", "3", "different", "patient", "samples", "(", "OF", "-", "MEL", "-", "033", "(", "F", ")", ",", "OF", "-", "MEL", "-", "034", "(", "G", ")", ",", "OF", "-", "MEL", "-", "035", "(", "H", ")", ")", "and", "treated", "with", "excipient", "or", "a", "combination", "of", "Dabrafenib", "and", "Trametinib", ".", "The", "clinical", "response", "of", "each", "patient", "after", "a", "3", "months", "treatment", "with", "Dabrafenib", "/", "Trametinib", "is", "indicated", "above", "the", "graphs", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ",", "exact", "p", "-", "values", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A,B. 3D views (A) and quantification of variations in the mean tumor volume (B) of HH25 chick embryos engrafted with BRAFwt (OF-MEL-028) or BRAFV600E (OF-MEL-020, OF-MEL-027) patient samples and treated with excipient or a combination of Vemurafenib and Cobimetinib. The number of embryos analyzed for each patient sample is indicated on the graphs. Student t-test for OF-MEL-020; Mann-Whintey test for OF-MEL-028, *: p < 0.05, ns: not significant. Exact p-values are indicated on the graphs.C,D. Survival rate (left axis) and mean body surface area (BSA, right axis) of chick embryos injected with increasing doses of Dabrafenib (C) and Trametinib (D). The maximum tolerated dose (MTD, in red on the X-axis) was defined as the higher dose of drug associated with a survival rate higher than 75% and a mean BSA similar (i.e., non-statistically different) from embryos treated with excipient (17.1 and 0.0228 mg/kg respectively). N=10 replicates per experimental group. Error bars indicate SEM. ns, non-significant using Student's t-test compared with excipient.(F-H) of HH25 chick embryos engrafted with 3 different patient samples (OF-MEL-033 (F), OF-MEL-034 (G), OF-MEL-035 (H)) and treated with excipient or a combination of Dabrafenib and Trametinib. The clinical response of each patient after a 3 months treatment with Dabrafenib/Trametinib is indicated above the graphs. Error bars indicate SEM. Mann-Whitney tests, exact p-values are indicated on the graphs."}
{"words": ["f1a", ",", "Fluorescence", "microscopyHeLa", "cells", "infected", "with", "Shigella", "and", "Listeria", "visualized", "with", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", "(", "DAPI", ")", "(", "pseudo", "-", "coloured", "red", ")", ",", "and", "Salmonella", "carrying", "mCherry", "-", "expressing", "vector", "(", "red", ")", ".", "The", "cis", "-", "Golgi", "(", "green", ")", "was", "detected", "by", "α", "-", "GM130", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "µm", ".", "b", ",", "Fluorescence", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "either", "IpaJ", "or", "VirA", ".", "The", "cis", "-", "Golgi", "(", "GM130", ",", "green", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "red", ")", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "c", ",", "Fluorescence", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "infected", "with", "indicated", "Shigella", "mutant", "strains", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "µm", ".", "d", ",", "Percentage", "of", "HeLa", "cells", "with", "disrupted", "Golgi", "morphology", "in", "100", "cells", "infected", "with", "either", "wild", "-", "type", "Shigella", "(", "M90T", ")", "or", "the", "indicated", "mutants", ".", "Error", "bars", ",", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "calculated", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "e", ",", "Number", "of", "recoverable", "c", ".", "f", ".", "u", ".", "per", "mouselung24", "h", "after", "intranasal", "inoculation", "with", "1", "×", "106", "of", "wild", "-", "type", "M90T", "or", "each", "mutant", "Shigella", "strain", "as", "indicated", ".", "Limit", "of", "detection", "(", "LOD", ")", "for", "this", "assay", "is", "indicated", "by", "the", "dotted", "line", ".", "Error", "bars", ",", "geometrical", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1a, Fluorescence microscopyHeLa cells infected with Shigella and Listeria visualized with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (pseudo-coloured red), and Salmonella carrying mCherry-expressing vector (red). The cis-Golgi (green) was detected by α-GM130 antibodies. Scale bar, 10 µm.b, Fluorescence microscopy of HeLa cells transfected with either IpaJ or VirA. The cis-Golgi (GM130, green) and F-actin (red) are shown. Scale bar, 10 µm.c, Fluorescence microscopy of HeLa cells infected with indicated Shigella mutant strains. Scale bar, 10 µm.d, Percentage of HeLa cells with disrupted Golgi morphology in 100 cells infected with either wild-type Shigella (M90T) or the indicated mutants. Error bars, means ± s.e.m. calculated from three independent experiments.e, Number of recoverable c.f.u. per mouselung24 h after intranasal inoculation with 1 × 106 of wild-type M90T or each mutant Shigella strain as indicated. Limit of detection (LOD) for this assay is indicated by the dotted line. Error bars, geometrical means ± s.e.m. **P<0.001."}
{"words": ["f2b", ",", "Fluorescence", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "IpaJ", "mutants", ".", "The", "cis", "-", "Golgi", "(", "GM130", ",", "green", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "red", ")", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "c", ",", "IpaJ", "or", "its", "catalytic", "mutants", "were", "expressed", "from", "a", "galactose", "-", "inducible", "promoter", "(", "pGal413", "vector", ")", "and", "assayed", "for", "a", "growth", "arrest", "phenotype", "on", "galactose", "or", "glucose", "(", "control", ")", "carbon", "source", ".", "e", ",", "Yeast", "strain", "harbouring", "a", "galactose", "-", "inducible", "IpaJ", "gene", "were", "transformed", "with", "a", "multi", "-", "copy", "vector", "containing", "the", "indicated", "genes", ".", "Yeast", "were", "assayed", "for", "a", "growth", "arrest", "phenotype", "on", "galactose", "or", "glucose", "(", "control", ")", "carbon", "source", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2b, Fluorescence microscopy of HeLa cells transfected with the indicated IpaJ mutants. The cis-Golgi (GM130, green) and F-actin (red) are shown. Scale bar, 10 µm.c, IpaJ or its catalytic mutants were expressed from a galactose-inducible promoter (pGal413 vector) and assayed for a growth arrest phenotype on galactose or glucose (control) carbon source.e, Yeast strain harbouring a galactose-inducible IpaJ gene were transformed with a multi-copy vector containing the indicated genes. Yeast were assayed for a growth arrest phenotype on galactose or glucose (control) carbon source."}
{"words": ["f3a", "-", "c", ",", "Mass", "spectra", "of", "purified", "ARF1", "-", "strep", "in", "untreated", "(", "a", ")", ",", "IpaJ", "-", "treated", "(", "b", ")", "or", "IpaJ", "C64A", "-", "treated", "(", "c", ")", "cells", ",", "with", "the", "observed", "monoisotopic", "mass", "reported", "in", "daltons", ".", "*", "Observed", "1", "Da", "shift", "in", "molecular", "mass", "is", "accounted", "for", "in", "MS", "/", "MS", "data", "(", "Supplementary", "Fig", ".", "7", ")", ".", "f", ",", "In", "-", "gel", "fluorescence", "assay", "(", "top", "panel", ")", "visualizing", "Alexa", "Fluor", "647", "-", "labelled", "myristoylated", "ARF1", "-", "His", "isolated", "from", "bacteria", "either", "not", "expressing", "(", "lane", "1", ")", "or", "expressing", "(", "lane", "2", ")", "NMTp", ".", "Bacterial", "cell", "lysates", "treated", "with", "recombinant", "IpaJ", "or", "IpaJ", "C64A", "as", "indicated", ".", "The", "expression", "levels", "of", "ARF1", "-", "His", "were", "determined", "by", "Coomassie", "blue", "stain", ".", "g", ",", "In", "-", "gel", "fluorescence", "assay", "(", "top", "panel", ")", "visualizing", "Alexa", "Fluor", "647", "-", "labelled", "myristoylated", "ARF1", "-", "strep", "purified", "from", "HeLa", "cell", "lysates", "left", "untreated", "or", "incubated", "with", "IpaJ", "or", "its", "catalytic", "mutant", "as", "indicated", ".", "The", "expressed", "amounts", "of", "ARF1", "-", "strep", "are", "shown", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "h", ",", "In", "-", "gel", "fluorescence", "assay", "visualizing", "protein", "extracts", "isolated", "from", "HeLa", "cells", "incubated", "with", "azide", "myristic", "acid", ",", "azide", "palmitic", "acid", "or", "geranylgeranyl", "alcohol", "azide", "and", "subsequently", "labelled", "with", "Alexa", "Fluor", "647", "alkyne", "by", "click", "chemistry", ".", "Arrows", "indicate", "proteins", "that", "are", "proteolytically", "demyristoylated", "by", "IpaJ", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3a-c, Mass spectra of purified ARF1-strep in untreated (a), IpaJ-treated (b) or IpaJ C64A-treated (c) cells, with the observed monoisotopic mass reported in daltons. *Observed 1 Da shift in molecular mass is accounted for in MS/MS data (Supplementary Fig. 7).f, In-gel fluorescence assay (top panel) visualizing Alexa Fluor 647-labelled myristoylated ARF1-His isolated from bacteria either not expressing (lane 1) or expressing (lane 2) NMTp. Bacterial cell lysates treated with recombinant IpaJ or IpaJ C64A as indicated. The expression levels of ARF1-His were determined by Coomassie blue stain.g, In-gel fluorescence assay (top panel) visualizing Alexa Fluor 647-labelled myristoylated ARF1-strep purified from HeLa cell lysates left untreated or incubated with IpaJ or its catalytic mutant as indicated. The expressed amounts of ARF1-strep are shown (bottom panel).h, In-gel fluorescence assay visualizing protein extracts isolated from HeLa cells incubated with azide myristic acid, azide palmitic acid or geranylgeranyl alcohol azide and subsequently labelled with Alexa Fluor 647 alkyne by click chemistry. Arrows indicate proteins that are proteolytically demyristoylated by IpaJ."}
{"words": ["f4b", ",", "In", "-", "gel", "fluorescence", "assay", "showing", "myristoylated", "peptides", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "cells", "expressing", "IpaJ", "or", "catalytic", "mutant", ".", "The", "peptide", "-", "eGFP", "and", "IpaJ", "inputs", "are", "indicated", ".", "*", "Demyristoylation", "of", "GRASP65", "and", "hVPS15", "resulted", "in", "slower", "mobility", "of", "the", "resulting", "peptide", ",", "potentially", "owing", "to", "reduced", "mobility", "in", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "caused", "by", "proteolytic", "reaction", ".", "c", ",", "In", "-", "gel", "fluorescence", "assay", "showing", "myristoylated", "ARF1", "T31N", "mutant", "(", "a", "GDP", "-", "locked", "mutant", ")", "or", "ARF1", "Q71L", "(", "a", "GTP", "-", "locked", "mutant", ")", "after", "in", "cells", "co", "-", "expressing", "IpaJ", "or", "catalytic", "mutants", "as", "indicated", ".", "Equal", "loading", "of", "ARF1", "(", "middle", "panel", ")", "and", "IpaJ", "(", "lower", "panel", ")", "was", "determined", "by", "western", "blot", "analysis", ".", "d", ",", "Fluorescence", "microscopy", "showing", "ARF1", "-", "mCherry", "and", "the", "Golgi", "apparatus", "(", "GM130", ")", "after", "cellular", "microinjection", "of", "recombinant", "IpaJ", "or", "IpaJ", "C64A", ",", "over", "the", "indicated", "period", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "µm", ".", "e", ",", "Fluorescence", "microscopy", "showing", "ARF1", "-", "eGFP", "(", "green", ")", "and", "Golgi", "membranes", "(", "blue", ",", "GM130", ")", "after", "infection", "with", "Shigella", "M90T", "and", "the", "indicated", "mutants", "(", "red", ";", "mCherry", "-", "expressing", "bacteria", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4b, In-gel fluorescence assay showing myristoylated peptides of the indicated proteins in cells expressing IpaJ or catalytic mutant. The peptide-eGFP and IpaJ inputs are indicated. *Demyristoylation of GRASP65 and hVPS15 resulted in slower mobility of the resulting peptide, potentially owing to reduced mobility in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis caused by proteolytic reaction.c, In-gel fluorescence assay showing myristoylated ARF1 T31N mutant (a GDP-locked mutant) or ARF1 Q71L (a GTP-locked mutant) after in cells co-expressing IpaJ or catalytic mutants as indicated. Equal loading of ARF1 (middle panel) and IpaJ (lower panel) was determined by western blot analysis.d, Fluorescence microscopy showing ARF1-mCherry and the Golgi apparatus (GM130) after cellular microinjection of recombinant IpaJ or IpaJ C64A, over the indicated period. Scale bar, 10 µm.e, Fluorescence microscopy showing ARF1-eGFP (green) and Golgi membranes (blue, GM130) after infection with Shigella M90T and the indicated mutants (red; mCherry-expressing bacteria). Scale bar, 10µm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Mice", "bearing", "established", "A375", "were", "treated", "with", "vehicle", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "PLX4720", "(", "n", "=", "5", ")", "bevacizumab", "(", "n", "=", "7", ")", "or", "COMBO", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Tumor", "growth", "is", "expressed", "as", "%", "change", "of", "the", "initial", "tumor", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "PLX4720", "P", "=", "0", ".", "0049", ";", "bevacizumab", "P", "=", "0", ".", "0003", ";", "P", "=", "4", ".", "86E", "-", "10", ")", "ŦP", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "PLX4720", "(", "P", "=", "0", ".", "015", ")", ".", "(", "B", ")", "Mice", "bearing", "established", "COLO205", "were", "treated", "with", "vehicle", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "PLX4720", "(", "n", "=", "8", ")", "bevacizumab", "(", "n", "=", "7", ")", "or", "COMBO", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Tumor", "growth", "is", "expressed", "as", "%", "change", "of", "the", "initial", "tumor", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "PLX4720", "P", "=", "2", ".", "75E", "-", "05", ";", "bevacizumab", "P", "=", "2", ".", "96E", "-", "05", ";", "COMBO", "P", "=", "2", ".", "13E", "-", "07", ")", "Ŧp", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "PLX4720", "(", "P", "=", "0", ".", "039", ")", ".", "(", "C", ")", "Melanoma", "MC", "-", "1", "cells", "(", "5", "x", "105", ")", "were", "injected", "into", "the", "tail", "vein", "of", "CD1", "mice", ".", "Lung", "colonization", "was", "assayed", "by", "HE", "staining", "and", "calculating", "the", "number", "of", "nodules", "and", "their", "total", "area", "normalized", "per", "the", "total", "area", "of", "the", "lungs", ".", "The", "mice", "analyzed", "were", ":", "start", "point", ",", "n", "=", "6", ";", "vehicle", ",", "n", "=", "7", ";", "PLX4720", ",", "n", "=", "6", ";", "bevacizumab", ",", "n", "=", "6", ";", "COMBO", ",", "n", "=", "7", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "0", ".", "031", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "tumor", "cell", "proliferation", "determined", "by", "immunofluorescence", "Ki67", "staining", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "Ki67", "+", "area", "/", "tumor", "area", "(", "n", "=", "4", "tumors", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "PLX4720", "P", "=", "2", ".", "83E", "-", "08", ";", "bevacizumab", "P", "=", "4", ".", "25E", "-", "13", ";", "COMBO", "P", "=", "6", ".", "16E", "-", "08", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "tumor", "cell", "apoptosis", "determined", "by", "immunofluorescence", "staining", "with", "TUNEL", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "TUNEL", "+", "area", "/", "tumor", "area", "(", "n", "=", "3", "tumors", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "6", ".", "2", ".", "7E", "-", "10", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Mice bearing established A375 were treated with vehicle (n=7), PLX4720 (n=5) bevacizumab (n=7) or COMBO (n=5). Tumor growth is expressed as % change of the initial tumor, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus vehicle (PLX4720 P = 0.0049; bevacizumab P = 0.0003; P = 4.86E-10) ŦP < 0.05 compared to PLX4720 (P = 0.015).(B) Mice bearing established COLO205 were treated with vehicle (n=7), PLX4720 (n=8) bevacizumab (n=7) or COMBO (n=8). Tumor growth is expressed as % change of the initial tumor, ***P < 0.001 versus vehicle (PLX4720 P = 2.75E-05; bevacizumab P = 2.96E-05; COMBO P = 2.13E-07) Ŧp < 0.05 compared to PLX4720 (P = 0.039).(C) Melanoma MC-1 cells (5 x 105) were injected into the tail vein of CD1 mice. Lung colonization was assayed by HE staining and calculating the number of nodules and their total area normalized per the total area of the lungs. The mice analyzed were: start point, n=6; vehicle, n=7; PLX4720, n=6; bevacizumab, n=6; COMBO, n=7, *P < 0.001 versus vehicle (P = 0.031).(D) Representative images of tumor cell proliferation determined by immunofluorescence Ki67 staining in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the Ki67+ area/tumor area (n=4 tumors), ***P < 0.001 versus vehicle (PLX4720 P = 2.83E-08; bevacizumab P = 4.25E-13; COMBO P = 6.16E-08).(E) Representative images of tumor cell apoptosis determined by immunofluorescence staining with TUNEL in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the TUNEL+ area/tumor area (n=3 tumors). ***P < 0.001 versus vehicle (P = 6.2.7E-10)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "vasculature", "stained", "by", "an", "antibody", "anti", "-", "CD31", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "quantitative", "micro", "vessel", "density", "(", "MVD", ")", "and", "micro", "vessel", "area", "(", "MVA", ")", "analysis", "(", "n", "=", "5", "tumors", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "MVD", ":", "bevacizumab", "P", "=", "5", ".", "94E", "-", "25", ";", "COMBO", "P", "=", "1", ".", "84E", "-", "04", ")", "(", "MVA", ":", "PLX4720", "P", "=", "4", ".", "98E", "-", "09", ";", "bevacizumab", "P", "=", "1", ".", "16E", "-", "19", ";", "COMBO", "P", "=", "3", ".", "00E", "-", "08", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "vessel", "lumen", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "quantitative", "analysis", "of", "lumen", "diameters", "in", "A375", "and", "COLO205", "xenografts", "(", "n", "=", "3", "tumors", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "A375", ":", "PLX4720", "P", "=", "0", ".", "0078", ";", "COMBO", "P", "=", "0", ".", "0012", ")", "(", "COLO205", ":", "PLX4720", "P", "=", "2", ".", "01E", "-", "06", ";", "COMBO", "P", "=", "1", ".", "33E", "-", "07", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "perfusing", "fluorescent", "beads", "and", "their", "relationship", "with", "microvessels", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "%", "of", "CD31", "+", "vessels", "co", "-", "stained", "with", "fluorescent", "beads", "(", "n", "=", "4", "tumors", ")", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "versus", "vehicle", "(", "PLX4720", "P", "=", "0", ".", "0031", ";", "COMBO", "P", "=", "0", ".", "0033", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "hypoxia", "marker", "pimonidazole", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "show", "the", "%", "of", "tumor", "hypoxic", "area", "in", "A375", "and", "COLO205", "xenografts", "(", "n", "=", "5", "tumors", ")", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "A375", ":", "PLX4720", "P", "=", "6", ".", "94E", "-", "12", ";", "COMBO", "P", "=", "3", ".", "34E", "-", "12", ")", "(", "COLO205", ":", "PLX4720", "P", "=", "0", ".", "0015", ";", "bevacizumab", "P", "=", "0", ".", "0004", ";", "COMBO", "P", "=", "0", ".", "0003", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative images of vasculature stained by an antibody anti-CD31 in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate quantitative micro vessel density (MVD) and micro vessel area (MVA) analysis (n=5 tumors), ***P < 0.001 versus vehicle (MVD: bevacizumab P = 5.94E-25; COMBO P = 1.84E-04) (MVA: PLX4720 P = 4.98E-09; bevacizumab P = 1.16E-19; COMBO P = 3.00E-08).(B) Representative images of vessel lumen in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the quantitative analysis of lumen diameters in A375 and COLO205 xenografts (n=3 tumors), *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus vehicle (A375: PLX4720 P = 0.0078; COMBO P = 0.0012) (COLO205: PLX4720 P = 2.01E-06; COMBO P = 1.33E-07).(C) Representative images of perfusing fluorescent beads and their relationship with microvessels in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the % of CD31+ vessels co-stained with fluorescent beads (n=4 tumors), **P < 0.01 versus vehicle (PLX4720 P = 0.0031; COMBO P = 0.0033).(D) Representative images of hypoxia marker pimonidazole in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs show the % of tumor hypoxic area in A375 and COLO205 xenografts (n=5 tumors), **P < 0.01, ***P < 0.001 versus vehicle (A375: PLX4720 P = 6.94E-12; COMBO P = 3.34E-12) (COLO205: PLX4720 P = 0.0015; bevacizumab P = 0.0004; COMBO P = 0.0003)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "D", ")", "GSEA", "enrichment", "plots", "for", "\"", "Reactome", "Cytokine", "Signaling", "in", "Immune", "System", "\"", "and", "\"", "Reactome", "Innate", "Immune", "System", "\"", "(", "upper", "panels", ")", "and", "\"", "Reactome", "Extracellular", "Matrix", "Organization", "\"", "and", "\"", "Reactome", "Collagen", "Formation", "\"", "(", "lower", "panels", ")", "highlight", "significant", "enrichment", "of", "the", "pathways", "relative", "to", "the", "immune", "response", "and", "a", "decreased", "expression", "of", "the", "pathways", "relative", "to", "extracellular", "matrix", "remodeling", "in", "COMBO", "treated", "tumors", "as", "compared", "to", "the", "other", "treatments", "(", "vehicle", ",", "PLX4720", ",", "bevacizumab", ")", ".", "(", "E", ")", "Heatmap", "representation", "of", "gene", "expression", "changes", "within", "the", "\"", "Reactome", "Innate", "Immune", "System", "\"", "(", "left", "panel", ")", "and", "\"", "Reactome", "Extracellular", "matrix", "Organization", "\"", "(", "right", "panel", ")", "gene", "set", ".", "Genes", "in", "heatmaps", "are", "shown", "in", "rows", "and", "samples", "are", "shown", "in", "columns", ".", "Expression", "level", "is", "represented", "as", "a", "gradient", "from", "high", "(", "red", ")", "to", "low", "(", "blue", ")", ".", "V", ",", "P", ",", "B", "and", "C", "respectively", "indicate", "vehicle", ",", "PLX4720", ",", "bevacizumab", "and", "COMBO", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(D) GSEA enrichment plots for \"Reactome Cytokine Signaling in Immune System\" and \"Reactome Innate Immune System\" (upper panels) and \"Reactome Extracellular Matrix Organization\" and \"Reactome Collagen Formation\" (lower panels) highlight significant enrichment of the pathways relative to the immune response and a decreased expression of the pathways relative to extracellular matrix remodeling in COMBO treated tumors as compared to the other treatments (vehicle, PLX4720, bevacizumab).(E) Heatmap representation of gene expression changes within the \"Reactome Innate Immune System\" (left panel) and \"Reactome Extracellular matrix Organization\" (right panel) gene set. Genes in heatmaps are shown in rows and samples are shown in columns. Expression level is represented as a gradient from high (red) to low (blue). V, P, B and C respectively indicate vehicle, PLX4720, bevacizumab and COMBO."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "leukocytes", "infiltration", "determined", "by", "immunofluorescence", "CD45", "staining", "in", "of", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "CD45", "+", "area", "/", "tumor", "area", "in", "A375", "and", "COLO205", "xenografts", "(", "n", "=", "5", "tumors", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "A375", ":", "P", "=", "2", ".", "19E", "-", "20", ")", "(", "COLO205", ":", "P", "=", "1", ".", "81E", "-", "06", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "macrophage", "infiltration", "determined", "by", "F4", "/", "80", "immunofluorescence", "staining", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "F4", "/", "80", "+", "area", "/", "tumor", "area", "in", "A375", "and", "COLO205", "xenografts", "(", "n", "=", "5", "tumors", ")", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "A375", ":", "COMBO", "P", "=", "3", ".", "42E", "-", "13", ")", "(", "COLO205", ":", "COMBO", "P", "=", "1", ".", "94E", "-", "06", ")", ".", "(", "C", ")", "A375", "xenograft", "tumors", "after", "14", "days", "of", "treatment", "were", "subjected", "to", "FACS", "and", "tumor", "infiltrate", "was", "analyzed", ".", "Gating", "strategy", "for", "CD45", "+", "cells", "and", "graph", "showing", "the", "quantification", "of", "FACS", "analysis", "of", "infiltrating", "CD45", "+", "leukocytes", "in", "vehicle", "(", "n", "=", "4", "tumors", ")", "compared", "to", "COMBO", "(", "n", "=", "6", "tumors", ")", "treated", "tumors", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "0", ".", "0064", ")", ".", "(", "D", ")", "Graph", "showing", "the", "quantification", "of", "FACS", "analysis", "of", "infiltrating", "F4", "/", "80", "+", "macrophages", "and", "CD11c", "+", "MHCII", "+", "dendritic", "cells", "in", "vehicle", "(", "n", "=", "4", "tumors", ")", "compared", "to", "COMBO", "(", "n", "=", "6", "tumors", ")", "treated", "tumors", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "versus", "vehicle", "(", "TAM", "P", "=", "0", ".", "0061", ";", "DC", "P", "=", "0", ".", "0091", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative images of leukocytes infiltration determined by immunofluorescence CD45 staining in of A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the CD45+ area/tumor area in A375 and COLO205 xenografts (n=5 tumors), ***P < 0.001 versus vehicle (A375: P = 2.19E-20) (COLO205: P = 1.81E-06).(B) Representative images of macrophage infiltration determined by F4/80 immunofluorescence staining in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the F4/80+ area/tumor area in A375 and COLO205 xenografts (n=5 tumors) ***P < 0.001 versus vehicle (A375: COMBO P = 3.42E-13) (COLO205: COMBO P = 1.94E-06).(C) A375 xenograft tumors after 14 days of treatment were subjected to FACS and tumor infiltrate was analyzed. Gating strategy for CD45+ cells and graph showing the quantification of FACS analysis of infiltrating CD45+ leukocytes in vehicle (n=4 tumors) compared to COMBO (n=6 tumors) treated tumors, **P < 0.01 versus vehicle (P = 0.0064).(D) Graph showing the quantification of FACS analysis of infiltrating F4/80+ macrophages and CD11c+MHCII+ dendritic cells in vehicle (n=4 tumors) compared to COMBO (n=6 tumors) treated tumors, **P < 0.01 versus vehicle (TAM P = 0.0061; DC P = 0.0091)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Real", "-", "time", "quantitative", "PCR", "of", "the", "indicated", "genes", "(", "M1", "-", "like", "and", "M2", "-", "like", "macrophages", "markers", ")", "of", "A375", "xenograft", "treated", "with", "PLX4720", ",", "bevacizumab", "or", "COMBO", ".", "Data", "are", "presented", "as", "expression", "fold", "change", "(", "log2", ")", "compared", "with", "vehicle", "after", "normalization", "for", "housekeeping", "gene", "TBP", "(", "n", "=", "3", "tumors", ")", ",", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "PLX4720", ":", "m", "-", "Arg1", "P", "=", "5", ".", "65E", "-", "06", ")", "(", "bevacizumab", ":", "m", "-", "Ccl5", "P", "=", "0", ".", "025", ")", "(", "COMBO", ":", "m", "-", "Ccl5", "P", "=", "0", ".", "0070", ";", "m", "-", "Cd40", "P", "=", "0", ".", "00099", ";", "m", "-", "Cxcl10", "P", "=", "0", ".", "043", ";", "m", "-", "Cxcl9", "P", "=", "0", ".", "046", ";", "m", "-", "Il1b", "P", "=", "0", ".", "0367", ";", "m", "-", "Stat1", "P", "=", "0", ".", "049", ";", "m", "-", "Tlr2", "=", "0", ".", "00182", ";", "m", "-", "Arg", "-", "1", "P", "=", "0", ".", "0013", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "COMBO", "-", "treated", "tumor", "sections", "co", "-", "stained", "with", "an", "antibody", "against", "CD68", "and", "an", "antibody", "anti", "-", "CCR7", "(", "M1", "-", "like", "polarization", ")", "or", "anti", "-", "CD206", "(", "M2", "-", "like", "polarization", ")", ".", "(", "C", ")", "Graphs", "showing", "the", "quantification", "of", "FACS", "analysis", "of", "infiltrating", "F4", "/", "80", "+", "tumor", "macrophages", "and", "average", "percentage", "of", "median", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "TNFα", "+", "or", "INOS", "+", "on", "F4", "/", "80", "+", "cells", "after", "ex", "vivo", "stimulation", "with", "PMA", "and", "ionomycin", "in", "vehicle", "(", "n", "=", "4", "tumors", ")", "and", "COMBO", "(", "n", "=", "6", "tumors", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "versus", "vehicle", "(", "TNFα", "P", "=", "0", ".", "037", ";", "INOS", "=", "0", ".", "038", ")", ".", "(", "D", ")", "Graphs", "showing", "the", "quantification", "of", "FACS", "analysis", "of", "infiltrating", "CD11b", "+", "Ly6C", "+", "tumor", "monocytes", "and", "average", "percentage", "of", "MFI", "of", "TNFα", "+", "or", "INOS", "+", "on", "CD11b", "+", "Ly6C", "+", "cells", "after", "ex", "vivo", "stimulation", "with", "PMA", "and", "ionomycin", "in", "vehicle", "(", "n", "=", "4", "tumors", ")", "and", "COMBO", "(", "n", "=", "6", "tumors", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "versus", "vehicle", "(", "TNFα", "P", "=", "0", ".", "048", ";", "INOS", "=", "0", ".", "038", ")", ".", "(", "E", ")", "Graph", "showing", "the", "quantification", "of", "circulating", "CD11b", "+", "Ly6C", "+", "monocytes", "in", "peripheral", "blood", "analyzed", "by", "FACS", "in", "vehicle", "-", "(", "n", "=", "4", "tumors", ")", "and", "COMBO", "-", "(", "n", "=", "6", "tumors", ")", "treated", "tumors", ".", "(", "F", ")", "Cell", "viability", "measured", "as", "fluorescence", "intensity", "of", "ZsGreen", "-", "A375", "cells", "co", "-", "cultured", "with", "cells", "isolated", "from", "xenograft", "treated", "with", "vehicle", "or", "COMBO", "with", "after", "48h", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "experiment", "out", "of", "two", "done", "in", "triplicate", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "0", ".", "046", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Real-time quantitative PCR of the indicated genes (M1-like and M2-like macrophages markers) of A375 xenograft treated with PLX4720, bevacizumab or COMBO. Data are presented as expression fold change (log2) compared with vehicle after normalization for housekeeping gene TBP (n=3 tumors), (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus vehicle (PLX4720: m-Arg1 P = 5.65E-06) (bevacizumab: m-Ccl5 P = 0.025) (COMBO: m-Ccl5 P = 0.0070; m-Cd40 P = 0.00099; m-Cxcl10 P = 0.043; m-Cxcl9 P = 0.046; m-Il1b P = 0.0367; m-Stat1 P = 0.049; m-Tlr2 = 0.00182; m-Arg-1 P = 0.0013).(B) Representative images of COMBO-treated tumor sections co-stained with an antibody against CD68 and an antibody anti-CCR7 (M1-like polarization) or anti-CD206 (M2-like polarization).(C) Graphs showing the quantification of FACS analysis of infiltrating F4/80+ tumor macrophages and average percentage of median fluorescence intensity (MFI) of TNFα+ or INOS+ on F4/80+ cells after ex vivo stimulation with PMA and ionomycin in vehicle (n=4 tumors) and COMBO (n=6 tumors), *P < 0.05 versus vehicle (TNFα P = 0.037; INOS = 0.038).(D) Graphs showing the quantification of FACS analysis of infiltrating CD11b+Ly6C+ tumor monocytes and average percentage of MFI of TNFα+ or INOS+ on CD11b+Ly6C+ cells after ex vivo stimulation with PMA and ionomycin in vehicle (n=4 tumors) and COMBO (n=6 tumors), *P < 0.05 versus vehicle (TNFα P = 0.048; INOS = 0.038).(E) Graph showing the quantification of circulating CD11b+Ly6C+ monocytes in peripheral blood analyzed by FACS in vehicle- (n=4 tumors) and COMBO- (n=6 tumors) treated tumors.(F) Cell viability measured as fluorescence intensity of ZsGreen-A375 cells co-cultured with cells isolated from xenograft treated with vehicle or COMBO with after 48h. Data are representative of one experiment out of two done in triplicate *P < 0.05 versus vehicle (P = 0.046)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "collagen", "deposition", "determined", "by", "collagen", "I", "immunofluorescent", "staining", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "collagen", "I", "+", "area", "/", "tumor", "area", "(", "n", "=", "5", "tumors", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "2", ".", "93E", "-", "06", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "CAF", "density", "determined", "by", "α", "-", "SMA", "immunofluorescence", "staining", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "α", "-", "SMA", "+", "area", "/", "tumor", "area", "(", "n", "=", "5", "tumors", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "0", ".", "0006", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "Lysyl", "Oxidase", "enzyme", "determined", "by", "LOX", "immunofluorescence", "staining", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "LOX", "+", "area", "/", "tumor", "area", "(", "n", "=", "3", "tumors", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "versus", "vehicle", "(", "bevacizumab", "P", "=", "0", ".", "033", ";", "COMBO", "P", "=", "0", ".", "040", ")", ".", "(", "E", ")", "Quantitative", "Real", "-", "time", "PCR", "of", "h", "-", "TGFB1", "and", "m", "-", "Tgfb1", "of", "A375", "xenograft", "treated", "with", "PLX4720", ",", "bevacizumab", "or", "COMBO", ".", "Data", "are", "presented", "as", "expression", "fold", "change", "(", "log2", ")", "compared", "with", "vehicle", "after", "normalization", "for", "the", "housekeeping", "gene", "TBP", "(", "n", "=", "3", "tumors", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "0", ".", "043", ")", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "for", "human", "TGFβ", "in", "total", "protein", "extract", "from", "A375", "tumors", "treated", "as", "indicate", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Representative images of collagen deposition determined by collagen I immunofluorescent staining in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the collagen I+ area/tumor area (n=5 tumors), ***P < 0.001 versus vehicle (P = 2.93E-06).(B) Representative images of CAF density determined by α-SMA immunofluorescence staining in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate α-SMA+ area/tumor area (n=5 tumors), ***P < 0.001 versus vehicle (P = 0.0006).(C) Representative images of Lysyl Oxidase enzyme determined by LOX immunofluorescence staining in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the LOX+ area/tumor area (n=3 tumors), *P < 0.05 versus vehicle (bevacizumab P = 0.033; COMBO P = 0.040).(E) Quantitative Real-time PCR of h-TGFB1 and m-Tgfb1 of A375 xenograft treated with PLX4720, bevacizumab or COMBO. Data are presented as expression fold change (log2) compared with vehicle after normalization for the housekeeping gene TBP (n=3 tumors), *P < 0.05 versus vehicle (P = 0.043).(F) Western blot for human TGFβ in total protein extract from A375 tumors treated as indicate. Vinculin was used as an internal control."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Effect", "of", "clodronate", "liposomes", "on", "tumor", "growth", "inhibition", "induced", "by", "COMBO", "treatment", "in", "in", "mice", "bearing", "A375", "tumors", ".", "Tumor", "growth", "is", "expressed", "as", "%", "change", "of", "the", "initial", "tumor", ".", "Macrophage", "depletion", "by", "clodronate", "liposome", "enhanced", "the", "tumor", "growth", "of", "tumors", "treated", "with", "the", "combination", "of", "PLX4720", "and", "bevacizumab", "(", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "vehicle", "Clodronate", "P", "=", "0", ".", "049", ",", "COMBO", "P", "=", "5", ".", "72E", "-", "06", ")", "ŦP", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "COMBO", "(", "P", "=", "0", ".", "033", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "macrophage", "infiltration", "determined", "by", "F4", "/", "80", "immunofluorescence", "staining", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "F4", "/", "80", "+", "area", "/", "tumor", "(", "n", "=", "3", "tumors", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "1", ".", "53E", "-", "25", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "collagen", "deposition", "determined", "by", "collagen", "I", "immunofluorescence", "staining", "in", "A375", "xenografts", "treated", "as", "indicated", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "collagen", "I", "+", "area", "/", "tumor", "(", "n", "=", "3", "tumors", ")", ".", "(", "D", ")", "Waterfall", "plots", "showing", "the", "percent", "change", "in", "volume", "(", "relative", "to", "the", "initial", "tumor", "volume", ")", "for", "the", "individual", "A375", "xenografts", "in", "each", "treatment", "group", "(", "vehicle", ",", "PLX4720", ",", "bevacizumab", "and", "COMBO", ")", "from", "week", "1", "to", "week", "6", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "macrophage", "infiltration", "determined", "by", "F4", "/", "80", "immunofluorescence", "staining", "in", "a", "responder", "and", "a", "relapsing", "A375", "xenografts", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "F4", "/", "80", "+", "area", "/", "tumor", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "1", ".", "25E", "-", "06", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "collagen", "deposition", "determined", "by", "collagen", "I", "immunofluorescence", "staining", "in", "a", "responder", "and", "a", "relapsing", "A375", "xenografts", ".", "Bar", "graphs", "indicate", "the", "collagen", "I", "+", "area", "/", "tumor", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "4", ".", "03E", "-", "05", ")", ".", "(", "G", ")", "Real", "-", "time", "quantitative", "PCR", "of", "h", "-", "TGFB1", "of", "A375", "xenograft", "treated", "with", "PLX4720", ",", "bevacizumab", "or", "COMBO", ".", "Data", "are", "presented", "as", "expression", "fold", "change", "(", "log2", ")", "of", "relapsing", "tumors", "compared", "to", "responder", "tumors", "after", "normalization", "for", "housekeeping", "gene", "TBP", "(", "n", "=", "3", "tumors", ")", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "(", "P", "=", "0", ".", "0006", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Effect of clodronate liposomes on tumor growth inhibition induced by COMBO treatment in in mice bearing A375 tumors. Tumor growth is expressed as % change of the initial tumor. Macrophage depletion by clodronate liposome enhanced the tumor growth of tumors treated with the combination of PLX4720 and bevacizumab (n=5 mice/group), *P < 0.05, ***P < 0.001 versus vehicle (vehicle Clodronate P = 0.049, COMBO P = 5.72E-06) ŦP < 0.05 compared to COMBO (P = 0.033).(B) Representative images of macrophage infiltration determined by F4/80 immunofluorescence staining in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the F4/80+ area/tumor (n=3 tumors), ***P < 0.001 versus vehicle (P = 1.53E-25).(C) Representative images of collagen deposition determined by collagen I immunofluorescence staining in A375 xenografts treated as indicated. Bar graphs indicate the collagen I+ area/tumor (n=3 tumors).(D) Waterfall plots showing the percent change in volume (relative to the initial tumor volume) for the individual A375 xenografts in each treatment group (vehicle, PLX4720, bevacizumab and COMBO) from week 1 to week 6.(E) Representative images of macrophage infiltration determined by F4/80 immunofluorescence staining in a responder and a relapsing A375 xenografts. Bar graphs indicate the F4/80+ area/tumor (n=3 mice), ***P < 0.001 versus vehicle (P = 1.25E-06).(F) Representative images of collagen deposition determined by collagen I immunofluorescence staining in a responder and a relapsing A375 xenografts. Bar graphs indicate the collagen I+ area/tumor (n=3 mice), ***P < 0.001 versus vehicle (P = 4.03E-05).(G) Real-time quantitative PCR of h-TGFB1 of A375 xenograft treated with PLX4720, bevacizumab or COMBO. Data are presented as expression fold change (log2) of relapsing tumors compared to responder tumors after normalization for housekeeping gene TBP (n=3 tumors) ***P < 0.001 versus vehicle (P = 0.0006)."}
{"words": ["Figure", "2A", "Isothermal", "calorimetry", "(", "ITC", ")", "assays", "using", "ADP", "-", "ribose", "ligand", "and", "purified", "macrodomains", "of", "human", "macroH2A1", ".", "1", "and", "macroH2A2", ".", "B", "In", "vitro", "PARP1", "activity", "assay", "in", "the", "presence", "of", "increasing", "concentrations", "(", "10", ",", "25", "and", "50", "μM", ")", "of", "purified", "macrodomains", "of", "human", "macroH2A1", ".", "1", ",", "macroH2A1", ".", "1", "G224E", "mutant", "and", "macroH2A2", ".", "PARP1", "activity", "is", "assessed", "by", "its", "auto", "-", "PARylation", "detected", "by", "an", "anti", "-", "PAR", "immunoblot", ".", "The", "naphtol", "blue", "staining", "shows", "the", "increasing", "amounts", "of", "purified", "macrodomain", "added", "to", "each", "reaction", ".", "A", "representative", "blot", "of", "one", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Isothermal calorimetry (ITC) assays using ADP-ribose ligand and purified macrodomains of human macroH2A1.1 and macroH2A2.B In vitro PARP1 activity assay in the presence of increasing concentrations (10, 25 and 50 μM) of purified macrodomains of human macroH2A1.1, macroH2A1.1 G224E mutant and macroH2A2. PARP1 activity is assessed by its auto-PARylation detected by an anti-PAR immunoblot. The naphtol blue staining shows the increasing amounts of purified macrodomain added to each reaction. A representative blot of one of three independent experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "3A", "The", "diameter", "(", "d", ")", "of", "the", "fluorescence", "signaling", "of", "H2B", "tagged", "with", "photo", "-", "activatable", "GFP", "(", "PAGFP", "-", "H2B", ")", "is", "used", "to", "quantify", "chromatin", "expansion", "across", "120", "seconds", "after", "induction", "of", "DNA", "damage", "using", "intercalating", "DNA", "dye", "and", "local", "irradiation", "with", "a", "laser", ".", "B", "Chromatin", "expansion", "in", "absence", "and", "presence", "of", "intercalating", "DNA", "dye", "(", "-", "and", "+", "DNA", "damage", ")", "and", "pretreatment", "of", "1h", "with", "1μM", "of", "Olaparib", "PARP", "inhibitor", ".", "Boxplots", "represent", "single", "cell", "measurement", "of", "chromatin", "expansion", "at", "120", "sec", ".", "post", "DNA", "damage", "from", "3", "biological", "replicates", "with", "n", ">", "30", "cells", "each", ".", "The", "box", "limits", "correspond", "to", "25th", "and", "75th", "percentiles", ",", "the", "bold", "line", "indicates", "median", "and", "cross", "indicates", "the", "average", "values", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", ")", ".", "C", "Quantified", "chromatin", "expansion", "in", "cells", "not", "transfected", "(", "control", ")", "and", "cells", "transfected", "with", "each", "mCherry", "-", "tagged", "histone", "(", "as", "indicated", ")", ".", "Data", "is", "represented", "as", "in", "B", "(", "n", ">", "30", "cells", ",", "3", "bio", ".", "repl", ".", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "mCherry", "-", "H2A", "-", "expressing", "cells", "using", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", ")", ".", "D", "Chromatin", "expansion", "in", "Hela", "cells", "containing", "a", "doxocyclin", "(", "doxo", ".", ")", "-", "inducible", "macroH2A1", ".", "1", "transgene", ".", "Chromatin", "expansion", "assay", "was", "performed", "48", "hours", "after", "induction", "and", "expression", "was", "controlled", "by", "anti", "-", "macroH2A1", ".", "1", "-", "immunoblotting", ".", "Data", "is", "represented", "as", "in", "B", "(", "n", ">", "30", "cells", ",", "3", "bio", ".", "repl", ".", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A The diameter (d) of the fluorescence signaling of H2B tagged with photo-activatable GFP (PAGFP-H2B) is used to quantify chromatin expansion across 120 seconds after induction of DNA damage using intercalating DNA dye and local irradiation with a laser.B Chromatin expansion in absence and presence of intercalating DNA dye (- and + DNA damage) and pretreatment of 1h with 1μM of Olaparib PARP inhibitor. Boxplots represent single cell measurement of chromatin expansion at 120 sec. post DNA damage from 3 biological replicates with n > 30 cells each. The box limits correspond to 25th and 75th percentiles, the bold line indicates median and cross indicates the average values (*, p < 0.05 using unpaired, two-tailed Student's T-test).C Quantified chromatin expansion in cells not transfected (control) and cells transfected with each mCherry-tagged histone (as indicated). Data is represented as in B (n > 30 cells, 3 bio. repl.; *, p < 0.05 compared to mCherry-H2A-expressing cells using unpaired, two-tailed Student's T-test).D Chromatin expansion in Hela cells containing a doxocyclin (doxo.)-inducible macroH2A1.1 transgene. Chromatin expansion assay was performed 48 hours after induction and expression was controlled by anti-macroH2A1.1-immunoblotting. Data is represented as in B (n > 30 cells, 3 bio. repl.; *, p < 0.05 using unpaired, two-tailed Student's T-test)."}
{"words": ["Figure", "4Quantified", "chromatin", "expansion", "in", "cells", "transfected", "with", "indicated", "histone", "constructs", ".", "Boxplots", "represent", "single", "cell", "measurement", "of", "chromatin", "expansion", "at", "120", "sec", ".", "post", "DNA", "damage", "(", "n", ">", "30", "cells", ",", "3", "bio", ".", "repl", ".", ")", ".", "The", "box", "limits", "correspond", "to", "25th", "and", "75th", "percentiles", ",", "the", "bold", "line", "indicates", "median", "and", "cross", "indicates", "the", "average", "values", ".", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", "comparing", "to", "H2A", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ")", ".", "Quantified", "chromatin", "expansion", "in", "cells", "transfected", "with", "indicated", "histone", "constructs", ".", "Boxplots", "represent", "single", "cell", "measurement", "of", "chromatin", "expansion", "at", "120", "sec", ".", "post", "DNA", "damage", "(", "n", ">", "30", "cells", ",", "3", "bio", ".", "repl", ".", ")", ".", "The", "box", "limits", "correspond", "to", "25th", "and", "75th", "percentiles", ",", "the", "bold", "line", "indicates", "median", "and", "cross", "indicates", "the", "average", "values", ".", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", "comparing", "to", "H2A", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Quantified chromatin expansion in cells transfected with indicated histone constructs. Boxplots represent single cell measurement of chromatin expansion at 120 sec. post DNA damage (n > 30 cells, 3 bio. repl.). The box limits correspond to 25th and 75th percentiles, the bold line indicates median and cross indicates the average values. (*, p<0.05 using unpaired two-tailed Student's T-test comparing to H2A; n.s., not significant).Quantified chromatin expansion in cells transfected with indicated histone constructs. Boxplots represent single cell measurement of chromatin expansion at 120 sec. post DNA damage (n > 30 cells, 3 bio. repl.). The box limits correspond to 25th and 75th percentiles, the bold line indicates median and cross indicates the average values. (*, p<0.05 using unpaired two-tailed Student's T-test comparing to H2A; n.s., not significant)."}
{"words": ["Figure", "5A", "Western", "blot", "showing", "the", "expression", "of", "macroH2A", "proteins", "in", "control", "HepG2", "cells", ",", "knock", "-", "down", "for", "macroH2A1", "and", "macroH2A2", "(", "DKD", ")", "and", "DKD", "with", "ectopic", "expression", "of", "the", "indicated", "YFP", "-", "tagged", "constructs", ".", "H3", "is", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "B", "H3K9me3", "immunostaining", "in", "the", "indicated", "HepG2", "cell", "lines", "with", "nuclear", "counterstaining", "in", "DAPI", ".", "The", "indicated", "areas", "are", "zoomed", "-", "in", "for", "a", "better", "observation", "of", "the", "H3K9me3", "signal", "profile", ".", "All", "images", "are", "maximum", "intensity", "Z", "-", "projections", "of", "confocal", "stacks", ".", "Quantification", "of", "the", "nuclear", "area", "The", "box", "limits", "correspond", "to", "25th", "and", "75th", "percentiles", ",", "the", "bold", "line", "indicates", "median", "and", "cross", "indicates", "the", "average", "values", ".", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ")", ".", "Quantification", "of", "H3K9me3", "foci", "per", "nucleus", ",", "The", "box", "limits", "correspond", "to", "25th", "and", "75th", "percentiles", ",", "the", "bold", "line", "indicates", "median", "and", "cross", "indicates", "the", "average", "values", ".", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Western blot showing the expression of macroH2A proteins in control HepG2 cells, knock-down for macroH2A1 and macroH2A2 (DKD) and DKD with ectopic expression of the indicated YFP-tagged constructs. H3 is used as a loading control.B H3K9me3 immunostaining in the indicated HepG2 cell lines with nuclear counterstaining in DAPI. The indicated areas are zoomed-in for a better observation of the H3K9me3 signal profile. All images are maximum intensity Z-projections of confocal stacks.Quantification of the nuclear area The box limits correspond to 25th and 75th percentiles, the bold line indicates median and cross indicates the average values. (*, p<0.05 using unpaired two-tailed Student's T-test; n.s., not significant).Quantification of H3K9me3 foci per nucleus, The box limits correspond to 25th and 75th percentiles, the bold line indicates median and cross indicates the average values. (*, p<0.05 using unpaired two-tailed Student's T-test; n.s., not significant)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "c", "-", "f", ")", "The", "indicated", "marker", "genes", "were", "used", "to", "select", "clusters", "for", "subsetting", "into", "stromal", "cells", "(", "c", ")", ",", "epithelial", "cells", "(", "d", ")", ",", "endothelial", "cells", "(", "e", ")", ",", "and", "leukocytes", "(", "f", ")", ".", "(", "g", "-", "j", ")", "The", "heatmaps", "show", "the", "relative", "gene", "expression", "levels", "for", "the", "indicated", "marker", "genes", "for", "the", "indicated", "stromal", "(", "g", ")", ",", "epithelial", "(", "h", ")", ",", "endothelial", "(", "i", ")", ",", "and", "leukocyte", "(", "j", ")", "cell", "types", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(c-f) The indicated marker genes were used to select clusters for subsetting into stromal cells (c), epithelial cells (d), endothelial cells (e), and leukocytes (f).(g-j) The heatmaps show the relative gene expression levels for the indicated marker genes for the indicated stromal (g), epithelial (h), endothelial (i), and leukocyte (j) cell types."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "d", ")", "Differential", "gene", "expression", "between", "end", "stage", "lung", "disease", "patients", "and", "controls", "across", "cohorts", "was", "compared", "for", "the", "indicated", "cell", "type", "identities", ".", "The", "color", "code", "demonstrates", "similarities", "of", "gene", "expression", "changes", "calculated", "by", "Pearson", "correlation", "of", "the", "t", "-", "value", "coefficient", ",", "which", "represents", "differences", "in", "the", "likelihood", "of", "detection", "for", "any", "gene", "between", "health", "and", "disease", ".", "(", "e", ")", "The", "heatmap", "shows", "the", "top", "79", "genes", "differentially", "expressed", "in", "the", "indicated", "cell", "type", "identities", ".", "(", "f", "-", "h", ")", "The", "box", "plots", "illustrate", "differences", "in", "mRNA", "detection", "for", "the", "indicated", "genes", "between", "tissues", "from", "end", "stage", "lung", "fibrosis", "patients", "in", "(", "f", ")", "alveolar", "epithelial", "cells", ",", "(", "g", ")", "fibroblasts", ",", "and", "(", "h", ")", "macrophages", "when", "compared", "to", "control", "tissue", ".", "The", "boxes", "represent", "the", "interquartile", "range", ",", "the", "horizontal", "line", "in", "the", "box", "is", "the", "median", ",", "and", "the", "whiskers", "represent", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "(", "Chicago", "cohort", ":", "ILD", "n", "=", "9", ",", "controls", "n", "=", "8", ";", "Nashville", "cohort", ":", "ILD", "n", "=", "20", ",", "controls", "n", "=", "10", ";", "Munich", "cohort", ":", "ILD", "n", "=", "3", ",", "controls", "n", "=", "11", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(d) Differential gene expression between end stage lung disease patients and controls across cohorts was compared for the indicated cell type identities. The color code demonstrates similarities of gene expression changes calculated by Pearson correlation of the t-value coefficient, which represents differences in the likelihood of detection for any gene between health and disease.(e) The heatmap shows the top 79 genes differentially expressed in the indicated cell type identities.(f-h) The box plots illustrate differences in mRNA detection for the indicated genes between tissues from end stage lung fibrosis patients in (f) alveolar epithelial cells, (g) fibroblasts, and (h) macrophages when compared to control tissue. The boxes represent the interquartile range, the horizontal line in the box is the median, and the whiskers represent 1.5 times the interquartile range (Chicago cohort: ILD n = 9, controls n = 8; Nashville cohort: ILD n = 20, controls n = 10; Munich cohort: ILD n = 3, controls n = 11)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "e", ")", "The", "heatmap", "shows", "changes", "of", "the", "indicated", "cell", "type", "signatures", "in", "published", "bulk", "RNA", "-", "seq", "data", "(", "GEO", "GSE124685", ")", "across", "different", "histopathological", "stages", "that", "represent", "increasing", "extent", "of", "fibrosis", "from", "stage", "1", "-", "3", ",", "as", "determined", "by", "quantitative", "micro", "-", "CT", "imaging", "and", "tissue", "histology", "Samples", "used", "in", "this", "study", "were", "10", "IPF", "and", "6", "control", "patients", ".", "(", "f", ")", "The", "heatmaps", "show", "z", "-", "scores", "for", "the", "individual", "marker", "genes", "of", "the", "indicated", "cell", "types", "across", "IPF", "stages", "and", "controls", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(e) The heatmap shows changes of the indicated cell type signatures in published bulk RNA-seq data (GEO GSE124685) across different histopathological stages that represent increasing extent of fibrosis from stage 1-3, as determined by quantitative micro-CT imaging and tissue histology Samples used in this study were 10 IPF and 6 control patients.(f) The heatmaps show z-scores for the individual marker genes of the indicated cell types across IPF stages and controls."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "b", ")", "The", "boxplots", "show", "the", "number", "of", "proteins", "quantified", "(", "y", "-", "axis", ")", "across", "various", "diagnoses", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "The", "mean", "and", "10", "-", "90", "percentiles", "are", "shown", ";", "the", "dotted", "line", "marks", "1000", "proteins", "(", "IPF", "n", "=", "16", ",", "HP", "/", "EAA", "n", "=", "8", ",", "COP", "n", "=", "11", ",", "NSIP", "n", "=", "10", ",", "RB", "-", "IL", ",", "n", "=", "3", ",", "Sarcoidosis", "n", "=", "22", ",", "other", "ILDs", "n", "=", "25", ",", "non", "-", "IL", ",", "n", "=", "29", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(b) The boxplots show the number of proteins quantified (y-axis) across various diagnoses (x-axis). The mean and 10-90 percentiles are shown; the dotted line marks 1000 proteins (IPF n=16, HP/EAA n=8, COP n=11, NSIP n=10, RB-IL, n=3, Sarcoidosis n=22, other ILDs n=25, non-IL, n=29)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "c", "Empirical", "cumulative", "density", "plots", "depict", "the", "distribution", "of", "correlation", "coefficients", "for", "(", "c", ")", "Myofibroblast", "markers", "(", "red", "points", ")", "with", "DLCO", "in", "comparison", "to", "all", "background", "proteins", "(", "black", "line", ")", ".", "d", ")", "Empirical", "cumulative", "density", "plots", "depict", "the", "distribution", "of", "correlation", "coefficients", "for", "(", "d", ")", "Plasma", "cell", "markers", "(", "red", "points", ")", "with", "%", "alveolar", "macrophages", "in", "BAL", "in", "comparison", "to", "all", "background", "proteins", "(", "black", "line", ")", ".", "(", "e", ")", "Barplot", "displays", "coefficients", "derived", "from", "correlating", "lung", "function", "associations", "at", "the", "protein", "level", "with", "cell", "type", "specific", "ILD", "associations", "at", "the", "RNA", "level", ".", "(", "f", ")", "The", "heatmap", "illustrates", "gene", "expression", "changes", "associated", "with", "lung", "fibrosis", "across", "indicated", "cell", "types", "(", "columns", ")", "for", "selected", "BALF", "protein", "biomarkers", "(", "rows", ")", ".", "The", "dotplot", "visualizes", "the", "frequency", "changes", "of", "the", "indicated", "cell", "types", "inferred", "from", "the", "deconvolution", "of", "bulk", "mRNA", "data", "of", "ILD", "samples", "compared", "to", "controls", "(", "GSE47460", ")", ".", "Samples", "used", "in", "this", "study", "from", "the", "LTRC", "n", "=", "254", "ILD", "patients", "and", "n", "=", "108", "controls", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(c Empirical cumulative density plots depict the distribution of correlation coefficients for (c) Myofibroblast markers (red points) with DLCO in comparison to all background proteins (black line).d) Empirical cumulative density plots depict the distribution of correlation coefficients for (d) Plasma cell markers (red points) with % alveolar macrophages in BAL in comparison to all background proteins (black line).(e) Barplot displays coefficients derived from correlating lung function associations at the protein level with cell type specific ILD associations at the RNA level.(f) The heatmap illustrates gene expression changes associated with lung fibrosis across indicated cell types (columns) for selected BALF protein biomarkers (rows). The dotplot visualizes the frequency changes of the indicated cell types inferred from the deconvolution of bulk mRNA data of ILD samples compared to controls (GSE47460). Samples used in this study from the LTRC n = 254 ILD patients and n = 108 controls."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "a", ",", "b", ")", "Scatter", "plots", "stratify", "genes", "based", "on", "the", "protein", "lung", "function", "associations", "(", "y", "-", "axis", ")", "and", "cell", "type", "specific", "ILD", "associations", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "The", "size", "of", "the", "dots", "represents", "the", "detection", "level", "of", "each", "gene", "in", "the", "corresponding", "cell", "type", ".", "Colors", "highlight", "genes", "with", "marginal", "associations", "at", "the", "protein", "and", "RNA", "levels", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "The", "box", "plots", "illustrate", "differences", "in", "mRNA", "detection", "for", "the", "indicated", "genes", "between", "tissues", "from", "end", "stage", "lung", "fibrosis", "patients", "in", "(", "c", ")", "basal", "cells", ",", "and", "(", "d", ")", "alveolar", "epithelial", "cells", "when", "compared", "to", "controls", ".", "The", "boxes", "represent", "the", "interquartile", "range", ",", "the", "horizontal", "line", "in", "the", "box", "is", "the", "median", ",", "and", "the", "whiskers", "represent", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "(", "Chicago", "cohort", ":", "ILD", "n", "=", "9", ",", "controls", "n", "=", "8", ";", "Nashville", "cohort", ":", "ILD", "n", "=", "20", ",", "controls", "n", "=", "10", ";", "Munich", "cohort", ":", "ILD", "n", "=", "3", ",", "controls", "n", "=", "11", ")", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "The", "scatter", "plots", "show", "the", "positive", "correlation", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "BALF", "(", "MS", "-", "intensity", ",", "x", "-", "axis", ")", "with", "meta", "lung", "function", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "(", "g", "-", "j", ")", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "the", "indicated", "proteins", "and", "cell", "type", "markers", "in", "IPF", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "control", "samples", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(a, b) Scatter plots stratify genes based on the protein lung function associations (y-axis) and cell type specific ILD associations (x-axis). The size of the dots represents the detection level of each gene in the corresponding cell type. Colors highlight genes with marginal associations at the protein and RNA levels.(c, d) The box plots illustrate differences in mRNA detection for the indicated genes between tissues from end stage lung fibrosis patients in (c) basal cells, and (d) alveolar epithelial cells when compared to controls. The boxes represent the interquartile range, the horizontal line in the box is the median, and the whiskers represent 1.5 times the interquartile range (Chicago cohort: ILD n = 9, controls n = 8; Nashville cohort: ILD n = 20, controls n = 10; Munich cohort: ILD n = 3, controls n = 11).(e, f) The scatter plots show the positive correlation of the indicated proteins in BALF (MS-intensity, x-axis) with meta lung function (y-axis).(g-j) Immunofluorescence analysis of the indicated proteins and cell type markers in IPF (n=3) and control samples (n=3)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "a", ")", "The", "scatter", "plots", "show", "the", "positive", "correlation", "of", "CFHR1", "in", "BALF", "(", "MS", "-", "intensity", ",", "x", "-", "axis", ")", "with", "meta", "lung", "function", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "(", "c", ")", "The", "volcano", "plot", "depicts", "the", "fold", "changes", "(", "x", "-", "axis", ")", "and", "the", "-", "log10", "p", "-", "values", "(", "y", "-", "axis", ")", "derived", "from", "the", "differential", "gene", "expression", "analysis", "using", "diffxpy", "between", "ILD", "and", "controls", "within", "the", "subset", "of", "PDGFRB", "+", "pericytes", "(", "outlier", "values", "truncated", ")", ".", "(", "e", ")", "The", "heatmap", "shows", "the", "expression", "of", "genes", "most", "strongly", "associated", "with", "SSTR2", "expression", "within", "the", "pericytes", "(", "left", "color", "bar", "indicates", "significant", "correlation", "or", "anti", "-", "correlation", ")", ".", "(", "f", ")", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "SSTR2", ",", "the", "pericyte", "cell", "type", "marker", "PDGFRB", "and", "a", "marker", "for", "smooth", "muscle", "cells", "DESMIN", "in", "IPF", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "control", "samples", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "g", ")", "Representative", "images", "of", "immunohistochemistry", "analysis", "of", "SSTR2", "protein", "expression", "in", "tissue", "regions", "(", "n", "=", "474", ")", "from", "ILD", "patients", "(", "n", "=", "53", ")", "and", "control", "patients", "(", "n", "=", "26", ")", ".", "(", "h", ")", "Correlation", "of", "immunohistochemistry", "signal", "of", "SSTR2", "with", "Ashcroft", "scores", ".", "(", "i", ")", "The", "bar", "graph", "shows", "the", "genes", "most", "strongly", "correlated", "with", "SSTR2", "belonging", "to", "the", "GO", "category", "\"", "transcription", "regulators", "\"", ".", "The", "dotted", "line", "marks", "a", "correlation", "coefficient", "of", "zero", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(a) The scatter plots show the positive correlation of CFHR1 in BALF (MS-intensity, x-axis) with meta lung function (y-axis).(c) The volcano plot depicts the fold changes (x-axis) and the -log10 p-values (y-axis) derived from the differential gene expression analysis using diffxpy between ILD and controls within the subset of PDGFRB+ pericytes (outlier values truncated).(e) The heatmap shows the expression of genes most strongly associated with SSTR2 expression within the pericytes (left color bar indicates significant correlation or anti-correlation).(f) Immunofluorescence analysis of SSTR2, the pericyte cell type marker PDGFRB and a marker for smooth muscle cells DESMIN in IPF (n=3) and control samples (n=3).(g) Representative images of immunohistochemistry analysis of SSTR2 protein expression in tissue regions (n = 474) from ILD patients (n = 53) and control patients (n = 26).(h) Correlation of immunohistochemistry signal of SSTR2 with Ashcroft scores.(i) The bar graph shows the genes most strongly correlated with SSTR2 belonging to the GO category \"transcription regulators\". The dotted line marks a correlation coefficient of zero."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "a", ")", "The", "scatter", "plots", "show", "the", "positive", "correlation", "of", "CFHR1", "in", "BALF", "(", "MS", "-", "intensity", ",", "x", "-", "axis", ")", "with", "meta", "lung", "function", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "(", "c", ")", "Relative", "expression", "level", "of", "CRTAC1", "across", "human", "organs", ".", "(", "d", ")", "The", "box", "plots", "illustrate", "differences", "in", "mRNA", "detection", "for", "CRTAC1", "in", "alveolar", "epithelial", "cells", "from", "fibrosis", "patients", "compared", "to", "control", "samples", "across", "the", "three", "indicated", "patient", "cohorts", "(", "Chicago", "cohort", ":", "ILD", "n", "=", "9", ",", "controls", "n", "=", "8", ";", "Nashville", "cohort", ":", "ILD", "n", "=", "20", ",", "controls", "n", "=", "10", ";", "Munich", "cohort", ":", "ILD", "n", "=", "3", ",", "controls", "n", "=", "11", ")", ".", "(", "e", ")", "Relative", "gene", "expression", "levels", "of", "CRTAC1", "in", "GSE47460", ".", "Dots", "represent", "average", "expression", "in", "the", "tissue", "of", "individual", "patients", ".", "The", "line", "represents", "the", "mean", ",", "error", "bars", "show", "SD", ".", "CRTAC1", "is", "significantly", "downregulated", "in", "ILD", "but", "not", "COPD", "patients", "(", "f", ")", "For", "each", "single", "cell", "cohort", ",", "the", "gene", "-", "gene", "correlations", "with", "CRTAC1", "within", "the", "SFTPC", "+", "AT", "-", "2", "cells", "were", "calculated", ".", "The", "indicated", "genes", "were", "selected", "based", "on", "their", "common", "direction", "of", "correlation", "across", "cohorts", ".", "(", "h", ")", "The", "bar", "graph", "shows", "the", "gene", "categories", "most", "strongly", "correlated", "with", "CRTAC1", "belonging", "to", "the", "GO", "category", "of", "\"", "transcription", "regulators", "\"", ".", "The", "dotted", "line", "marks", "a", "correlation", "coefficient", "of", "zero", ".", "(", "n", ")", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "SPRR1A", ",", "KRT8", "as", "well", "as", "SFTPC", "in", "IPF", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "control", "samples", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "o", ")", "A", "high", "throughput", "experimental", "workflow", "for", "plasma", "proteomics", "(", "Niu", "allowed", "for", "profiling", "of", "two", "independent", "cohorts", "of", "ILD", "patients", "(", "Munich", ",", "n", "=", "30", "and", "Hannover", ",", "n", "=", "81", ";", "healthy", "age", "matched", "controls", ",", "n", "=", "30", ")", ".", "All", "proteins", "quantified", "in", "plasma", "are", "shown", ",", "ranked", "by", "their", "abundance", "measured", "by", "mass", "spectrometry", "(", "MS", "-", "intensity", ")", ".", "(", "p", ")", "The", "indicated", "proteins", "from", "the", "plasma", "analysis", "were", "selected", "based", "on", "their", "common", "direction", "of", "correlation", "with", "patient", "lung", "function", "in", "two", "independent", "patient", "cohorts", "with", "distinct", "clinical", "characteristics", ".", "(", "q", ")", "The", "heatmap", "shows", "the", "predicted", "relative", "contribution", "of", "lung", "cell", "types", "to", "the", "association", "of", "protein", "biomarker", "signatures", "in", "plasma", "with", "lung", "function", "(", "forced", "vital", "capacity", "-", "FVC", ")", ".", "Patients", "were", "split", "in", "two", "groups", ",", "one", "with", "a", "mild", "decline", "in", "lung", "function", "[", "FVC", "60", "-", "100", "%", "]", "and", "one", "with", "severe", "loss", "of", "lung", "function", "[", "FVC", "20", "-", "60", "%", "]", "and", "compared", "to", "healthy", "age", "matched", "controls", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(a) The scatter plots show the positive correlation of CFHR1 in BALF (MS-intensity, x-axis) with meta lung function (y-axis).(c) Relative expression level of CRTAC1 across human organs.(d) The box plots illustrate differences in mRNA detection for CRTAC1 in alveolar epithelial cells from fibrosis patients compared to control samples across the three indicated patient cohorts (Chicago cohort: ILD n = 9, controls n = 8; Nashville cohort: ILD n = 20, controls n = 10; Munich cohort: ILD n = 3, controls n = 11).(e) Relative gene expression levels of CRTAC1 in GSE47460. Dots represent average expression in the tissue of individual patients. The line represents the mean, error bars show SD. CRTAC1 is significantly downregulated in ILD but not COPD patients(f) For each single cell cohort, the gene-gene correlations with CRTAC1 within the SFTPC+ AT-2 cells were calculated. The indicated genes were selected based on their common direction of correlation across cohorts.(h) The bar graph shows the gene categories most strongly correlated with CRTAC1 belonging to the GO category of \"transcription regulators\". The dotted line marks a correlation coefficient of zero.(n) Immunofluorescence analysis of SPRR1A, KRT8 as well as SFTPC in IPF (n=3) and control samples (n=2).(o) A high throughput experimental workflow for plasma proteomics(Niu allowed for profiling of two independent cohorts of ILD patients (Munich, n=30 and Hannover, n=81; healthy age matched controls, n=30). All proteins quantified in plasma are shown, ranked by their abundance measured by mass spectrometry (MS-intensity).(p) The indicated proteins from the plasma analysis were selected based on their common direction of correlation with patient lung function in two independent patient cohorts with distinct clinical characteristics.(q) The heatmap shows the predicted relative contribution of lung cell types to the association of protein biomarker signatures in plasma with lung function (forced vital capacity - FVC). Patients were split in two groups, one with a mild decline in lung function [FVC 60-100%] and one with severe loss of lung function [FVC 20-60%] and compared to healthy age matched controls."}
{"words": ["Figure", "1CSTB", "gene", "expression", "analysis", "in", "hCOs", ",", "starting", "from", "day", "(", "d", ")", "16", "until", "d140", ".", "For", "every", "time", "point", ",", "at", "least", "3", "different", "samples", "were", "analyzed", ";", "each", "sample", "was", "made", "by", "a", "pool", "of", "3", "to", "4", "hCOs", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Micrographs", "of", "sections", "of", "control", "hCOs", "immunostained", "with", "CSTB", "antibody", "at", "different", "time", "points", "in", "culture", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "cavities", "/", "ventricles", "(", "V", "-", "like", ")", ".", "The", "cortical", "plate", "like", "side", "is", "indicated", "(", "CP", "-", "like", ")", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", ".", "Real", "time", "qPCR", "results", "of", "PAX6", ",", "NEUN", ",", "NESTIN", ",", "CSTB", "gene", "expression", "levels", "in", "PAX6", "-", "and", "NEUN", "-", "FACS", "sorted", "nuclei", "from", "f", "-", "CTRL", "d135", "hCOs", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "based", "on", "T", "-", "student", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "For", "PAX6", ",", "10", "samples", "were", "analyzed", "as", "biological", "replicates", ":", "5", "for", "Pax6", "+", "sorted", "Nuclei", "and", "5", "for", "Neun", "+", "sorted", "Nuclei", ";", "for", "NEUN", ",", "NESTIN", "and", "CSTB", ",", "9", "samples", "were", "analyzed", "as", "biological", "replicates", ":", "5", "for", "Pax6", "+", "sorted", "Nuclei", "and", "4", "for", "Neun", "+", "sorted", "Nuclei", ".", "Western", "blot", "analysis", "and", "relative", "quantifications", "(", "arbitrary", "units", ",", "a", ".", "u", ".", ")", "on", "protein", "extracts", "from", "cortical", "(", "Cx", ")", "and", "ganglionic", "eminence", "(", "GE", ")", "tissues", "for", "Cstb", "using", "Actb", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cx", "and", "GE", "tissues", "from", "mouse", "embryos", "at", "different", "time", "of", "development", "as", "indicated", "in", "figure", ".", "Micrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E16", "mouse", "cerebral", "cortices", "immunostained", "for", "Cstb", "and", "acetylated", "tubulin", "(", "acTub", ")", "as", "marker", "for", "stabilized", "microtubules", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "and", "cortical", "plate", "(", "CP", ")", "are", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1CSTB gene expression analysis in hCOs, starting from day (d) 16 until d140. For every time point, at least 3 different samples were analyzed; each sample was made by a pool of 3 to 4 hCOs. Data are represented as mean ± SEM. Unpaired t-test (*P < 0.05, **P < 0.01).Micrographs of sections of control hCOs immunostained with CSTB antibody at different time points in culture. The dashed lines represent the apical surface of the cavities/ventricles (V-like). The cortical plate like side is indicated (CP-like). Nuclei (blue) are stained with DAPI.Real time qPCR results of PAX6, NEUN, NESTIN, CSTB gene expression levels in PAX6- and NEUN- FACS sorted nuclei from f-CTRL d135 hCOs. Data are represented as mean ± SEM. Statistical significance was based on T-student test (*P < 0.05, **P < 0.01). For PAX6, 10 samples were analyzed as biological replicates: 5 for Pax6+sorted Nuclei and 5 for Neun+sorted Nuclei; for NEUN, NESTIN and CSTB, 9 samples were analyzed as biological replicates: 5 for Pax6+sorted Nuclei and 4 for Neun+sorted Nuclei.Western blot analysis and relative quantifications (arbitrary units, a.u.) on protein extracts from cortical (Cx) and ganglionic eminence (GE) tissues for Cstb using Actb as a loading control. Cx and GE tissues from mouse embryos at different time of development as indicated in figure.Micrograph of coronal sections of E16 mouse cerebral cortices immunostained for Cstb and acetylated tubulin (acTub) as marker for stabilized microtubules. Ventricle (V) and cortical plate (CP) are indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles. Nuclei (blue) are stained with DAPI."}
{"words": ["Figure", "2Micrograph", "sections", "of", "d40", "hCOs", "electroporated", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "control", "or", "GFP", "-", "CSTB", "and", "analyzed", "5", "dpe", ".", "Sections", "were", "then", "immunostained", "for", "GFP", "and", "KI67", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "cavities", "/", "ventricles", "(", "V", "-", "like", ")", ".", "The", "cortical", "plate", "like", "side", "is", "indicated", "(", "CP", "-", "like", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "proliferating", "KI67", "+", "cells", "/", "area", "(", "µm2", ")", "of", "V", "-", "like", "structures", "transfected", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "control", "or", "GFP", "-", "CSTB", "in", "(", "A", ")", ".", "Micrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E16", "mouse", "cerebral", "cortices", "electroporated", "at", "E14", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "or", "GFP", "-", "Cstb", "and", "analyzed", "2", "dpe", "and", "immunostained", "with", "GFP", ",", "Ki67", "and", "BrdU", "30", "minutes", "after", "BrdU", "injection", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "and", "cortical", "plate", "(", "CP", ")", "are", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "proliferating", "Ki67", "+", "cells", "/", "area", "(", "µm2", ")", "(", "D", ")", "and", "Ki67", "+", "Brdu", "+", "cells", "/", "area", "(", "µm2", ")", "(", "E", ")", "of", "ventricles", "transfected", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "or", "GFP", "-", "Cstb", "in", "(", "C", ")", ".", "Micrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E16", "mouse", "cerebral", "cortices", "electroporated", "at", "E14", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "or", "GFP", "-", "Cstb", ",", "analyzed", "2", "dpe", "and", "immunostained", "with", "GFP", "and", "Phospho", "-", "Histone", "H3", "(", "PH3", ")", "(", "F", ")", "and", "with", "GFP", ",", "Pax6", "and", "Tbr2", "(", "G", ")", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "and", "cortical", "plate", "(", "CP", ")", "are", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Distribution", "of", "proliferating", "Ki67", "+", "/", "BrdU", "+", "cells", "(", "H", ")", "and", "mitotic", "progenitor", "PH3", "+", "cells", "(", "I", ")", "in", "the", "mouse", "cortex", ".", "The", "cortex", "was", "subdivided", "in", "5", "equal", "Bins", "-", "Bin1", "corresponded", "to", "apical", "side", "and", "Bin5", "to", "pial", "side", "of", "the", "cortex", "and", "PH3", "+", "cells", "or", "Ki67", "+", "/", "BrdU", "+", "cells", "calculated", "in", "each", "Bin", ".", "Distribution", "of", "Tbr2", "+", "intermediate", "progenitors", "(", "J", ")", "and", "Pax6", "+", "Tbr2", "+", "cells", "(", "K", ")", "in", "the", "mouse", "cortex", ".", "The", "cortex", "was", "subdivided", "in", "5", "equal", "Bins", "-", "Bin1", "corresponded", "to", "apical", "side", "and", "Bin5", "to", "pial", "side", "of", "the", "cortex", "and", "Tbr2", "+", "cells", "or", "Pax6", "+", "Tbr2", "+", "cells", "calculated", "in", "each", "Bin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Micrograph sections of d40 hCOs electroporated with GFP-empty vector control or GFP-CSTB and analyzed 5 dpe. Sections were then immunostained for GFP and KI67. The dashed lines represent the apical surface of the cavities/ventricles (V-like). The cortical plate like side is indicated (CP-like). Quantification of the total number of proliferating KI67+ cells/area (µm2) of V-like structures transfected with GFP-empty vector control or GFP-CSTB in (A).Micrograph of coronal sections of E16 mouse cerebral cortices electroporated at E14 with GFP-empty vector or GFP-Cstb and analyzed 2 dpe and immunostained with GFP,Ki67 and BrdU 30 minutes after BrdU injection. Ventricle (V) and cortical plate (CP) are indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles. Quantification of the total number of proliferating Ki67+ cells/area(µm2)(D) and Ki67+Brdu+ cells/area(µm2)(E) of ventricles transfected with GFP-empty vector or GFP-Cstb in (C).Micrograph of coronal sections of E16 mouse cerebral cortices electroporated at E14 with GFP-empty vector or GFP-Cstb, analyzed 2 dpe and immunostained with GFP and Phospho-Histone H3 (PH3)(F) and with GFP, Pax6 and Tbr2 (G). Ventricle (V) and cortical plate (CP) are indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles.Distribution of proliferating Ki67+/BrdU+cells (H) and mitotic progenitor PH3+ cells (I) in the mouse cortex. The cortex was subdivided in 5 equal Bins -Bin1 corresponded to apical side and Bin5 to pial side of the cortex and PH3+ cells or Ki67+/BrdU+ cells calculated in each Bin.Distribution of Tbr2+ intermediate progenitors (J) and Pax6+Tbr2+ cells (K) in the mouse cortex. The cortex was subdivided in 5 equal Bins -Bin1 corresponded to apical side and Bin5 to pial side of the cortex and Tbr2+ cells or Pax6+Tbr2+ cells calculated in each Bin."}
{"words": ["Figure", "3Western", "blot", "analysis", "for", "CSTB", "in", "the", "CSF", "from", "2", "different", "E14", "mouse", "embryos", "(", "A", ")", ",", "in", "the", "CM", "from", "E14", "cortical", "cells", "in", "culture", "for", "4", "daysWestern", "blot", "analysis", "for", "CSTB", "in", "the", "CM", "from", "hCOs", "after", "4", "days", "in", "culture", "(", "C", ")", ".", "The", "CM", "was", "collected", "from", "hCOs", "at", "different", "time", "points", "in", "culture", "(", "d19", ",", "d38", ",", "d60", ",", "d80", ")", ".", "Protein", "extract", "(", "PE", ")", "from", "60", "days", "hCOs", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "GAPDH", "immunostaining", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", "on", "hCOs", "CM", ".", "Ponceau", "red", "staining", "is", "shown", "to", "indicate", "the", "presence", "of", "proteins", "at", "comparable", "levels", "in", "the", "CM", "samplesMicrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E17", "mouse", "cerebral", "cortices", "electroporated", "at", "E14", "co", "-", "electroporated", "with", "mCherry", "expressing", "vector", "and", "HA", "-", "empty", "vector", "or", "-", "Cstb", ",", "and", "analyzed", "3", "dpe", ".", "Immunostaining", "with", "RFP", "to", "identify", "electroporated", "cells", "and", "GFP", "to", "identify", "migrating", "interneurons", "in", "the", "GAD65", "-", "GFP", "transgenic", "mouse", "line", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "and", "cortical", "plate", "(", "CP", ")", "are", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Distribution", "of", "GFP", "+", "interneurons", "in", "the", "5", "equal", "Bins", "of", "the", "mouse", "developing", "cortex", "-", "Bin1", "corresponded", "to", "apical", "side", "and", "Bin5", "to", "pial", "side", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "is", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Micrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E17", "mouse", "cerebral", "cortices", "electroporated", "at", "E14", "co", "-", "electroporated", "with", "mCherry", "and", "HA", "-", "Cstb", "expressing", "vector", ",", "analyzed", "3", "dpe", ".", "Immunostaining", "with", "RFP", "to", "identify", "electroporated", "cells", "and", "GFP", "to", "identify", "migrating", "interneurons", "in", "the", "GAD67", "-", "GFP", "transgenic", "mouse", "line", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "and", "cortical", "plate", "(", "CP", ")", "are", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Distribution", "of", "GFP", "+", "interneurons", "in", "the", "5", "equal", "Bins", "of", "the", "mouse", "developing", "cortex", "comparing", "electroporated", "sides", "with", "the", "contralateral", "ones", "in", "the", "same", "section", "to", "avoid", "different", "distribution", "of", "interneurons", "rostro", "-", "caudally", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Western blot analysis for CSTB in the CSF from 2 different E14 mouse embryos (A), in the CM from E14 cortical cells in culture for 4 daysWestern blot analysis for CSTB in the CM from hCOs after 4 days in culture (C). The CM was collected from hCOs at different time points in culture (d19, d38, d60, d80). Protein extract (PE) from 60 days hCOs was used as a positive control. GAPDH immunostaining was used as a negative control on hCOs CM. Ponceau red staining is shown to indicate the presence of proteins at comparable levels in the CM samplesMicrograph of coronal sections of E17 mouse cerebral cortices electroporated at E14 co-electroporated with mCherry expressing vector and HA-empty vector or -Cstb, and analyzed 3 dpe. Immunostaining with RFP to identify electroporated cells and GFP to identify migrating interneurons in the GAD65-GFP transgenic mouse line. Ventricle (V) and cortical plate (CP) are indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles. Distribution of GFP+ interneurons in the 5 equal Bins of the mouse developing cortex-Bin1 corresponded to apical side and Bin5 to pial side. Ventricle (V) is indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles.Micrograph of coronal sections of E17 mouse cerebral cortices electroporated at E14 co-electroporated with mCherry and HA-Cstb expressing vector, analyzed 3 dpe. Immunostaining with RFP to identify electroporated cells and GFP to identify migrating interneurons in the GAD67-GFP transgenic mouse line. Ventricle (V) and cortical plate (CP) are indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles. Distribution of GFP+ interneurons in the 5 equal Bins of the mouse developing cortex comparing electroporated sides with the contralateral ones in the same section to avoid different distribution of interneurons rostro-caudally."}
{"words": ["Figure", "4Micrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E17", "mouse", "cerebral", "cortices", "electroporated", "at", "E14", "with", "GFP", "-", "miR", "-", "neg", "vector", "(", "CTRL", ")", "and", "GFP", "-", "miRNA", "-", "Cstb", "(", "KD", ")", ",", "analyzed", "3", "dpe", "and", "immunostained", "with", "GFP", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "and", "cortical", "plate", "(", "CP", ")", "are", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Distribution", "of", "electroporated", "GFP", "+", "cells", "in", "the", "mouse", "cortex", ".", "The", "cortex", "was", "subdivided", "in", "5", "equal", "Bins", "-", "Bin1", "corresponded", "to", "apical", "side", "and", "Bin5", "to", "pial", "side", "of", "the", "cortex", "and", "GFP", "+", "cells", "calculated", "in", "each", "Bin", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", ".", "Micrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E17", "mouse", "cerebral", "cortices", "electroporated", "at", "E14", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "control", "and", "GFP", "-", "miRNA", "-", "Cstb", ",", "analyzed", "3", "dpe", "and", "immunostained", "with", "GFP", "and", "Ki67", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "is", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "proliferating", "Ki67", "+", "cells", "/", "area", "(", "µm2", ")", "of", "ventricular", "structures", "transfected", "with", "GFP", "-", "miR", "-", "neg", "vector", "or", "GFP", "-", "miRNA", "-", "Cstb", "in", "(", "C", ")", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", ".", "Micrograph", "sections", "of", "d40", "hCOs", "electroporated", "with", "GFP", "-", "CSTB", "expressing", "vector", "or", "GFP", "-", "R68X", "mutant", "and", "analyzed", "5", "dpe", ".", "Sections", "were", "immunostained", "for", "GFP", "and", "Ki67", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "cavities", "/", "ventricles", "(", "V", "-", "like", ")", ".", "The", "cortical", "plate", "like", "side", "is", "indicated", "(", "CP", "-", "like", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "proliferating", "KI67", "+", "cells", "/", "area", "(", "µm2", ")", "(", "F", ")", "and", "Ki67", "+", "GFP", "+", "cells", "/", "area", "(", "µm2", ")", "(", "G", ")", "of", "ventricles", "like", "structures", "transfected", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "control", ",", "GFP", "-", "CSTB", "or", "GFP", "-", "R68X", "mutant", "in", "(", "E", ")", ".", "Micrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E16", "mouse", "cerebral", "cortices", "electroporated", "at", "E14", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "control", ",", "GFP", "-", "Cstb", "or", "GFP", "-", "R68X", ",", "analyzed", "2", "dpe", "and", "immunostained", "with", "GFP", "and", "Phospho", "-", "Histone", "H3", "(", "PH3", ")", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "and", "cortical", "plate", "(", "CP", ")", "are", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Distribution", "of", "electroporated", "GFP", "+", "cells", "in", "the", "mouse", "cortex", ".", "The", "cortex", "was", "subdivided", "in", "5", "equal", "Bins", "-", "Bin1", "corresponded", "to", "apical", "side", "and", "Bin5", "to", "pial", "side", "of", "the", "cortex", "and", "GFP", "+", "cells", "calculated", "in", "each", "Bin", ".", "Distribution", "of", "mitotic", "progenitor", "PH3", "+", "cells", "in", "the", "mouse", "cortex", ".", "The", "cortex", "was", "subdivided", "in", "5", "equal", "Bins", "-", "Bin1", "corresponded", "to", "apical", "side", "and", "Bin5", "to", "pial", "side", "of", "the", "cortex", "and", "PH3", "+", "cells", "calculated", "in", "each", "Bin", ".", "K", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "proliferating", "PH3", "+", "cells", "/", "area", "(", "µm2", ")", "of", "ventricular", "structures", "transfected", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "control", ",", "GFP", "-", "Cstb", "or", "GFP", "-", "R68X", "mutant", "in", "(", "H", ")", ".", "Micrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E16", "mouse", "cerebral", "cortices", "electroporated", "at", "E14", "with", "GFP", "-", "empty", "vector", "control", ",", "GFP", "-", "Cstb", "or", "GFP", "-", "R68X", "mutant", ",", "analyzed", "2", "dpe", "and", "immunostained", "with", "GFP", "and", "Tbr2", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "is", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "Tbr2", "+", "cells", "/", "cortical", "area", "(", "µm2", ")", "in", "(", "L", ")", ".", "Data", "shown", "as", "Z", "-", "scores", "relative", "to", "the", "mean", "of", "GFP", "control", "vector", ".", "Micrograph", "of", "coronal", "sections", "of", "E17", "mouse", "cerebral", "cortices", "electroporated", "at", "E14", "co", "-", "electroporated", "with", "mCherry", "expressing", "vector", "and", "HA", "-", "Cstb", "or", "R68X", ",", "and", "analyzed", "3", "dpe", ".", "Immunostaining", "with", "RFP", "to", "identify", "electroporated", "cells", "and", "GFP", "to", "identify", "migrating", "interneurons", "in", "the", "GAD65", "-", "GFP", "transgenic", "mouse", "line", ".", "Ventricle", "(", "V", ")", "is", "indicated", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "ventricles", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "GAD65", "-", "GFP", "interneurons", "/", "cortical", "area", "(", "µm2", ")", "in", "(", "N", ")", ".", "Data", "shown", "as", "Z", "-", "scores", "relative", "to", "the", "mean", "of", "GFP", "control", "vector", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Micrograph of coronal sections of E17 mouse cerebral cortices electroporated at E14 with GFP-miR-neg vector (CTRL) and GFP-miRNA-Cstb (KD), analyzed 3 dpe and immunostained with GFP. Ventricle (V) and cortical plate (CP) are indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles. Distribution of electroporated GFP+ cells in the mouse cortex. The cortex was subdivided in 5 equal Bins -Bin1 corresponded to apical side and Bin5 to pial side of the cortex and GFP+ cells calculated in each Bin. Nuclei (blue) are stained with DAPI.Micrograph of coronal sections of E17 mouse cerebral cortices electroporated at E14 with GFP-empty vector control and GFP-miRNA-Cstb, analyzed 3 dpe and immunostained with GFP and Ki67. Ventricle (V) is indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles. Quantification of the total number of proliferating Ki67+ cells/area (µm2) of ventricular structures transfected with GFP-miR-neg vector or GFP-miRNA- Cstb in (C). Nuclei (blue) are stained with DAPI.Micrograph sections of d40 hCOs electroporated with GFP-CSTB expressing vector or GFP-R68X mutant and analyzed 5 dpe. Sections were immunostained for GFP and Ki67. The dashed lines represent the apical surface of the cavities/ventricles (V-like). The cortical plate like side is indicated (CP-like). Quantification of the total number of proliferating KI67+ cells/area(µm2)(F)and Ki67+GFP+ cells/area(µm2)(G) of ventricles like structures transfected with GFP-empty vector control, GFP-CSTB or GFP-R68X mutant in (E).Micrograph of coronal sections of E16 mouse cerebral cortices electroporated at E14 with GFP-empty vector control, GFP-Cstb or GFP-R68X, analyzed 2 dpe and immunostained with GFP and Phospho-Histone H3 (PH3). Ventricle (V) and cortical plate (CP) are indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles. Distribution of electroporated GFP+ cells in the mouse cortex. The cortex was subdivided in 5 equal Bins -Bin1 corresponded to apical side and Bin5 to pial side of the cortex and GFP+ cells calculated in each Bin.Distribution of mitotic progenitor PH3+ cells in the mouse cortex. The cortex was subdivided in 5 equal Bins -Bin1 corresponded to apical side and Bin5 to pial side of the cortex and PH3+ cells calculated in each Bin.K.Quantification of the total number of proliferating PH3+ cells/area(µm2)of ventricular structures transfected with GFP-empty vector control, GFP-Cstb or GFP-R68X mutant in (H).Micrograph of coronal sections of E16 mouse cerebral cortices electroporated at E14 with GFP-empty vector control, GFP-Cstb or GFP-R68X mutant, analyzed 2 dpe and immunostained with GFP and Tbr2. Ventricle (V) is indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles. Quantification of the total number of Tbr2+ cells/ cortical area (µm2) in (L). Data shown as Z-scores relative to the mean of GFP control vector.Micrograph of coronal sections of E17 mouse cerebral cortices electroporated at E14 co-electroporated with mCherry expressing vector and HA-Cstb or R68X, and analyzed 3 dpe. Immunostaining with RFP to identify electroporated cells and GFP to identify migrating interneurons in the GAD65-GFP transgenic mouse line. Ventricle (V) is indicated. The dashed lines represent the apical surface of the ventricles. Quantification of the total number of GAD65-GFP interneurons/ cortical area (µm2) in (N). Data shown as Z-scores relative to the mean of GFP control vector. Nuclei (blue) are stained with DAPI."}
{"words": ["Figure", "5Left", "panel", "shows", "representative", "images", "of", "hCOs", "from", "the", "different", "iPSC", "lines", "at", "the", "analyzed", "time", "points", ".", "Right", "panel", "shows", "the", "difference", "of", "the", "areas", "of", "f", "-", "CTRL", ",", "b", "-", "CTRL", ",", "UL1", "and", "UL4", "hCOs", "at", "different", "time", "in", "culture", ".", "Data", "shown", "as", "Z", "-", "scores", "relative", "to", "the", "mean", "of", "b", "-", "CTRL", ".", "Micrograph", "sections", "of", "d30", "b", "-", "CTRL", ",", "UL1", "and", "UL4", "hCOs", "immunostained", "for", "proliferation", "markers", "KI67", "and", "PH3", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "cavities", "/", "ventricles", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "proliferating", "Ki67", "+", "cells", "/", "area", "(", "µm2", ")", "of", "ventricles", "like", "structures", "and", "of", "the", "number", "of", "PH3", "+", "cells", "facing", "the", "ventricle", "/", "apical", "surface", "length", "(", "µm", ")", ".", "Data", "shown", "as", "Z", "-", "scores", "relative", "to", "the", "mean", "of", "b", "-", "CTRL", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", ".", "Micrograph", "sections", "of", "d60", "b", "-", "CTRL", ",", "UL1", "and", "UL4", "hCOs", "immunostained", "for", "proliferation", "markers", "KI67", "and", "PH3", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "cavities", "/", "ventricles", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "proliferating", "KI67", "+", "cells", "/", "area", "of", "ventricles", "like", "structures", "and", "of", "the", "number", "of", "PH3", "+", "cells", "facing", "the", "ventricle", "/", "the", "apical", "surface", "length", "(", "µm", ")", ".", "Data", "shown", "as", "Z", "-", "scores", "relative", "to", "the", "mean", "of", "CTRL", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scheme", "of", "the", "experiment", "with", "conditioned", "medium", "exchange", "between", "b", "-", "CTRL", "and", "UL4", "hCOs", "and", "quantification", "of", "the", "Ki67", "+", "cells", "by", "FACS", "analysis", "on", "36", "days", "old", "dissociated", "hCOs", ".", "Four", "samples", "were", "analyzed", "as", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Left panel shows representative images of hCOs from the different iPSC lines at the analyzed time points. Right panel shows the difference of the areas of f-CTRL, b-CTRL, UL1 and UL4 hCOs at different time in culture. Data shown as Z-scores relative to the mean of b-CTRL.Micrograph sections of d30 b-CTRL, UL1 and UL4 hCOs immunostained for proliferation markers KI67 and PH3. The dashed lines represent the apical surface of the cavities/ventricles. Quantification of the total number of proliferating Ki67+ cells/area (µm2) of ventricles like structures and of the number of PH3+ cells facing the ventricle/apical surface length (µm). Data shown as Z-scores relative to the mean of b-CTRL. Nuclei (blue) are stained with DAPI.Micrograph sections of d60 b-CTRL, UL1 and UL4 hCOs immunostained for proliferation markers KI67 and PH3. The dashed lines represent the apical surface of the cavities/ventricles. Quantification of the total number of proliferating KI67+ cells/ area of ventricles like structures and of the number of PH3+ cells facing the ventricle/the apical surface length (µm). Data shown as Z-scores relative to the mean of CTRL. Nuclei (blue) are stained with DAPI.Scheme of the experiment with conditioned medium exchange between b-CTRL and UL4 hCOs and quantification of the Ki67+ cells by FACS analysis on 36 days old dissociated hCOs. Four samples were analyzed as biological replicates."}
{"words": ["Figure", "6Micrograph", "sections", "of", "d30", "b", "-", "CTRL", ",", "UL1", "and", "UL4", "hCOs", "immunostained", "for", "the", "neuronal", "marker", "DCX", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "cavities", "/", "ventricles", ".", "Quantification", "of", "the", "DCX", "+", "area", ".", "The", "area", "of", "DCX", "+", "cells", "was", "calculated", "and", "related", "to", "the", "total", "area", "(", "µm2", ")", "of", "the", "ventricular", "structure", ".", "Data", "shown", "as", "Z", "-", "scores", "relative", "to", "the", "mean", "of", "b", "-", "CTRL", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", ".", "Micrograph", "sections", "of", "d60", "b", "-", "CTRL", ",", "UL1", "and", "UL4", "hCOs", "immunostained", "for", "neuronal", "marker", "DCX", ".", "The", "dashed", "lines", "represent", "the", "apical", "surface", "of", "the", "cavities", "/", "ventricles", ".", "Quantification", "of", "the", "DCX", "+", "area", ".", "The", "area", "(", "µm2", ")", "of", "DCX", "+", "cells", "was", "calculated", "and", "related", "to", "the", "total", "area", "of", "the", "ventricular", "structure", ".", "Data", "shown", "as", "Z", "-", "scores", "relative", "to", "the", "mean", "of", "b", "-", "CTRL", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "neuronal", "DCX", "+", "cells", "by", "FACS", "sorting", "on", "60", "days", "old", "dissociated", "hCOs", ".", "Data", "shown", "as", "Z", "-", "scores", "relative", "to", "the", "mean", "of", "b", "-", "CTRL", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", ".", "Micrograph", "sections", "of", "d30", "fused", "-", "organoid", ";", "ventral", "GFP", "-", "f", "-", "CTRL", "and", "dorsal", "UL1", ".", "Micrographs", "of", "sections", "from", "d30", "fused", "organoids", ",", "showing", "ventral", "GFP", "+", "cells", "in", "the", "dorsal", "area", ".", "The", "migrating", "GFP", "+", "cells", "were", "counted", "starting", "from", "100", "µm", "far", "from", "the", "ventral", "/", "dorsal", "border", ".", "Quantification", "of", "ventrally", "-", "derived", "GFP", "+", "cells", "in", "dorsal", "/", "thickness", "of", "the", "counted", "area", "(", "µm3", ")", ".", "The", "counted", "area", "was", "always", "100", "µm", "far", "from", "the", "border", "between", "ventral", "and", "dorsal", "area", "as", "indicated", "in", "Fig", ".", "EV5D", ".", "Every", "dot", "represents", "a", "different", "hCOs", "and", "different", "areas", "were", "counted", "for", "each", "hCO", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "are", "stained", "with", "DAPI", ".", "Volcano", "plot", "representing", "proteins", "identified", "by", "high", "-", "resolution", "nanoLC", "MS", "/", "MS", "analysis", ".", "Up", "-", "and", "down", "-", "regulated", "proteins", "(", "-", "0", ".", "3", "≥", "log2FC", "≥", "0", ".", "3", ")", "in", "human", "cerebral", "organoids", "(", "UL1", "vs", "b", "-", "CTRL", ")", "are", "shown", "in", "red", "and", "green", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Micrograph sections of d30 b-CTRL, UL1 and UL4 hCOs immunostained for the neuronal marker DCX. The dashed lines represent the apical surface of the cavities/ventricles. Quantification of the DCX+ area. The area of DCX+ cells was calculated and related to the total area (µm2) of the ventricular structure. Data shown as Z-scores relative to the mean of b-CTRL. Nuclei (blue) are stained with DAPI.Micrograph sections of d60 b-CTRL, UL1 and UL4 hCOs immunostained for neuronal marker DCX. The dashed lines represent the apical surface of the cavities/ventricles. Quantification of the DCX+ area. The area (µm2) of DCX+ cells was calculated and related to the total area of the ventricular structure. Data shown as Z-scores relative to the mean of b-CTRL. Quantification of the number of neuronal DCX+ cells by FACS sorting on 60 days old dissociated hCOs. Data shown as Z-scores relative to the mean of b-CTRL. Nuclei (blue) are stained with DAPI.Micrograph sections of d30 fused-organoid; ventral GFP-f-CTRL and dorsal UL1.Micrographs of sections from d30 fused organoids, showing ventral GFP+ cells in the dorsal area. The migrating GFP+ cells were counted starting from 100 µm far from the ventral/dorsal border. Quantification of ventrally-derived GFP+ cells in dorsal/thickness of the counted area (µm3). The counted area was always 100 µm far from the border between ventral and dorsal area as indicated in Fig.EV5D. Every dot represents a different hCOs and different areas were counted for each hCO. Nuclei (blue) are stained with DAPI.Volcano plot representing proteins identified by high-resolution nanoLC MS/MS analysis. Up- and down-regulated proteins (-0.3≥log2FC≥0.3) in human cerebral organoids (UL1 vs b-CTRL) are shown in red and green, respectively."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "C", "Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "splenic", "B", "cells", "isolated", "from", "B1", "-", "8", "transgenic", "mice", "after", "stimulation", "with", "(", "A", ")", "NIP15", "-", "BSA", "(", "30", "pM", ")", "or", "1NIP", "-", "pep", "(", "see", "Figure", "EV1", ",", "80", "nM", ")", ";", "(", "B", ")", "Ac146", "antibody", "(", "12", ".", "5", "nM", ")", "or", "Ac146Fab", "(", "25", "nM", ")", ";", "(", "C", ")", "Ac38", "antibody", "(", "12", ".", "5", "nM", ")", "or", "Ac38Fab", "(", "25", "nM", ")", ".", "The", "addition", "of", "the", "stimuli", "to", "the", "cells", "is", "indicated", "by", "arrows", ".", "D", "Representative", "microscopy", "images", "showing", "Fab", "-", "PLA", "results", "measuring", "the", "BCR", "proximity", "for", "the", "IgM", "-", "BCR", "(", "upper", ")", "and", "the", "IgD", "-", "BCR", "(", "lower", ")", "on", "untreated", "or", "treated", "B1", "-", "8", "splenic", "B", "cells", ".", "PLA", "signals", "are", "shown", "as", "red", "dots", "and", "the", "nuclei", "are", "visualized", "by", "DAPI", "staining", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "E", "The", "Fab", "-", "PLA", "results", "are", "quantified", "by", "Blobfinder", "software", "and", "presented", "as", "box", "plots", ".", "The", "median", "values", "are", "highlighted", "as", "thick", "lines", "and", "the", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "PLA", "signals", "(", "dots", "/", "cells", ")", "were", "counted", "from", "at", "least", "100", "cells", "for", "each", "sample", ".", "Data", "from", "treated", "samples", "were", "compared", "to", "data", "from", "resting", "cells", ",", "p", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-C Calcium flux measured by FACScan for splenic B cells isolated from B1-8 transgenic mice after stimulation with (A) NIP15-BSA (30 pM) or 1NIP-pep (see Figure EV1, 80 nM); (B) Ac146 antibody (12.5 nM) or Ac146Fab (25 nM); (C) Ac38 antibody (12.5 nM) or Ac38Fab (25 nM). The addition of the stimuli to the cells is indicated by arrows.D Representative microscopy images showing Fab-PLA results measuring the BCR proximity for the IgM-BCR (upper) and the IgD-BCR (lower) on untreated or treated B1-8 splenic B cells. PLA signals are shown as red dots and the nuclei are visualized by DAPI staining. Scale bar: 5 μm.E The Fab-PLA results are quantified by Blobfinder software and presented as box plots. The median values are highlighted as thick lines and the whiskers represent the minimum and maximum value. PLA signals (dots/cells) were counted from at least 100 cells for each sample. Data from treated samples were compared to data from resting cells, p-values were calculated by Kruskal-Wallis one-way analysis of variance (ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "C", "Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "splenic", "B", "cells", "isolated", "from", "Lyn", "-", "deficient", "B1", "-", "8", "transgenic", "mice", "after", "stimulation", "with", "(", "A", ")", "NIP15", "-", "BSA", "(", "30", "pM", ")", "or", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ";", "(", "B", ")", "Ac146", "antibody", "(", "12", ".", "5", "nM", ")", "or", "Ac146Fab", "(", "25", "nM", ")", ";", "(", "C", ")", "Ac38", "antibody", "(", "12", ".", "5", "nM", ")", "or", "Ac38Fab", "(", "25", "nM", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "addition", "of", "the", "stimuli", "to", "the", "cells", ".", "D", "Representative", "microscopy", "images", "showing", "Fab", "-", "PLA", "results", "monitoring", "the", "BCR", "proximity", "for", "the", "IgM", "-", "BCR", "(", "upper", ")", "and", "the", "IgD", "-", "BCR", "(", "lower", ")", "on", "untreated", "or", "treated", "B1", "-", "8", "splenic", "B", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "E", "Quantified", "Fab", "-", "PLA", "results", "are", "presented", "as", "box", "plots", ",", "where", "the", "median", "values", "are", "highlighted", "as", "thick", "lines", "and", "the", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "PLA", "signals", "(", "dots", "/", "cells", ")", "were", "counted", "from", "at", "least", "100", "cells", "for", "each", "sample", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-C Calcium flux measured by FACScan for splenic B cells isolated from Lyn-deficient B1-8 transgenic mice after stimulation with (A) NIP15-BSA (30 pM) or 1NIP-pep (80 nM); (B) Ac146 antibody (12.5 nM) or Ac146Fab (25 nM); (C) Ac38 antibody (12.5 nM) or Ac38Fab (25 nM). Arrows indicate the addition of the stimuli to the cells.D Representative microscopy images showing Fab-PLA results monitoring the BCR proximity for the IgM-BCR (upper) and the IgD-BCR (lower) on untreated or treated B1-8 splenic B cells. Scale bar: 5 μm.E Quantified Fab-PLA results are presented as box plots, where the median values are highlighted as thick lines and the whiskers represent the minimum and maximum value. PLA signals (dots/cells) were counted from at least 100 cells for each sample. p-values were calculated by Kruskal-Wallis one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "D", "Proximity", "between", "IgM", "-", "BCR", "on", "the", "surface", "of", "3046SM", "(", "A", ",", "C", ")", "or", "3046M", "(", "B", ",", "D", ")", "cells", "before", "and", "after", "a", "1", "-", "min", "stimulation", "with", "the", "indicated", "reagents", ",", "assayed", "by", "Fab", "-", "PLA", ".", "Results", "are", "presented", "as", "representative", "microscopy", "images", "(", "A", ",", "B", ")", "and", "box", "plots", "after", "quantification", "(", "C", ",", "D", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "In", "the", "box", "plots", ",", "the", "median", "values", "are", "highlighted", "as", "thick", "lines", "and", "the", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "PLA", "signals", "(", "dots", "/", "cells", ")", "were", "counted", "from", "at", "least", "100", "cells", "for", "each", "sample", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "E", "-", "H", "Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "3046SM", "(", "E", ",", "F", ")", "and", "3046M", "(", "G", ",", "H", ")", "cells", "after", "stimulation", "with", "NIP15", "-", "BSA", "(", "30", "pM", ")", ",", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ",", "Ac146Fab", "(", "25", "nM", ")", "or", "Ac38Fab", "(", "25", "nM", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "addition", "of", "the", "stimuli", "to", "the", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-D Proximity between IgM-BCR on the surface of 3046SM (A, C) or 3046M (B, D) cells before and after a 1-min stimulation with the indicated reagents, assayed by Fab-PLA. Results are presented as representative microscopy images (A, B) and box plots after quantification (C, D). Scale bar: 5 μm. In the box plots, the median values are highlighted as thick lines and the whiskers represent the minimum and maximum value. PLA signals (dots/cells) were counted from at least 100 cells for each sample and p-values were calculated by Kruskal-Wallis one-way ANOVA.E-H Calcium flux measured by FACScan for 3046SM (E, F) and 3046M (G, H) cells after stimulation with NIP15-BSA (30 pM), 1NIP-pep (80 nM), Ac146Fab (25 nM) or Ac38Fab (25 nM). Arrows indicate the addition of the stimuli to the cells."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "D", "Proximity", "between", "IgD", "-", "BCRs", "on", "the", "surface", "of", "3046SD", "(", "A", ",", "C", ")", "or", "3046D", "(", "B", ",", "D", ")", "cells", "before", "and", "after", "a", "1", "-", "min", "stimulation", ",", "assayed", "by", "Fab", "-", "PLA", ".", "Results", "are", "presented", "as", "representative", "microscopy", "images", "(", "A", ",", "B", ")", "and", "box", "plots", "after", "quantification", "(", "C", ",", "D", ")", ".", "PLA", "signals", "are", "shown", "as", "red", "dots", "and", "nuclei", "were", "visualized", "by", "DAPI", "staining", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "In", "the", "box", "plots", ",", "the", "median", "values", "were", "highlighted", "as", "thick", "lines", "and", "the", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "PLA", "signals", "(", "dots", "/", "cells", ")", "were", "counted", "from", "at", "least", "100", "cells", "for", "each", "sample", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "E", "-", "H", "Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "3046SD", "(", "E", ",", "F", ")", "and", "3046D", "(", "G", ",", "H", ")", "cells", "after", "stimulation", "with", "NIP15", "-", "BSA", "(", "30", "pM", ")", ",", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ",", "Ac146Fab", "(", "25", "nM", ")", "or", "Ac38Fab", "(", "25", "nM", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "addition", "of", "the", "stimuli", "to", "the", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-D Proximity between IgD-BCRs on the surface of 3046SD (A, C) or 3046D (B, D) cells before and after a 1-min stimulation, assayed by Fab-PLA. Results are presented as representative microscopy images (A, B) and box plots after quantification (C, D). PLA signals are shown as red dots and nuclei were visualized by DAPI staining. Scale bar: 5 μm. In the box plots, the median values were highlighted as thick lines and the whiskers represent the minimum and maximum value. PLA signals (dots/cells) were counted from at least 100 cells for each sample and p-values were calculated by Kruskal-Wallis one-way ANOVA.E-H Calcium flux measured by FACScan for 3046SD (E, F) and 3046D (G, H) cells after stimulation with NIP15-BSA (30 pM), 1NIP-pep (80 nM), Ac146Fab (25 nM) or Ac38Fab (25 nM). Arrows indicate the addition of the stimuli to the cells."}
{"words": ["Figure", "5Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "3046M", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "3046SD", "(", "B", ",", "E", ")", "and", "3046D", "(", "C", ",", "F", ")", "cells", "stimulated", "with", "anti", "-", "HC", "(", "2", "μl", "/", "ml", ")", "(", "A", ",", "B", ",", "C", ")", ",", "or", "anti", "-", "λ", "(", "2", "μl", "/", "ml", ")", "(", "D", ",", "E", ",", "F", ")", "antibodies", "with", "or", "without", "1", "min", "prestimulation", "with", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ".", "The", "addition", "of", "antibodies", "is", "indicated", "by", "black", "arrows", ".", "The", "1NIP", "-", "pep", "was", "added", "immediately", "before", "recording", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Calcium flux measured by FACScan for 3046M (A, D), 3046SD (B, E) and 3046D (C, F) cells stimulated with anti-HC (2 μl/ml) (A, B, C), or anti-λ (2 μl/ml) (D, E, F) antibodies with or without 1 min prestimulation with 1NIP-pep (80 nM). The addition of antibodies is indicated by black arrows. The 1NIP-pep was added immediately before recording. Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "E", "B1", "-", "8", "B", "cells", ",", "3046SM", "cells", ",", "3046M", "cells", ",", "3046SD", "cells", ",", "or", "3046D", "cells", "were", "stimulated", "with", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ",", "or", "anti", "-", "CD19", "antibody", "(", "62", "nM", ")", ",", "or", "costimulated", "with", "1NIP", "-", "pep", "and", "anti", "-", "CD19", "antibody", ".", "The", "calcium", "fluxes", "were", "measured", "by", "FACScan", ".", "F", "-", "J", "B1", "-", "8", "B", "cells", ",", "3046SM", "cells", ",", "3046M", "cells", ",", "3046SD", "cells", ",", "or", "3046D", "cells", "were", "stimulated", "with", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ",", "or", "anti", "-", "CD20", "antibody", "(", "62", "nM", ")", ",", "or", "costimulated", "with", "1NIP", "-", "pep", "and", "anti", "-", "CD20", "antibody", ".", "The", "calcium", "fluxes", "were", "measured", "by", "FACScan", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-E B1-8 B cells, 3046SM cells, 3046M cells, 3046SD cells, or 3046D cells were stimulated with 1NIP-pep (80 nM), or anti-CD19 antibody (62 nM), or costimulated with 1NIP-pep and anti-CD19 antibody. The calcium fluxes were measured by FACScan.F-J B1-8 B cells, 3046SM cells, 3046M cells, 3046SD cells, or 3046D cells were stimulated with 1NIP-pep (80 nM), or anti-CD20 antibody (62 nM), or costimulated with 1NIP-pep and anti-CD20 antibody. The calcium fluxes were measured by FACScan."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "D", ")", "Validation", "by", "western", "blot", "of", "changes", "in", "specific", "phosphorylation", "events", "on", "kinases", ".", "Left", ",", "Immunoblots", "of", "cortical", "lysates", "of", "CTL", "and", "micTNFα", "-", "KO", "at", "ZT6", "for", ":", "(", "top", ")", "phosphorylated", "GSK3α", "/", "β", "(", "pGSK3α", "at", "Ser21", "and", "pGSK3β", "at", "Ser9", ")", "and", "total", "GSK3α", ";", "and", "(", "bottom", ")", "phosphorylated", "MAPK", "(", "pMAPK", ",", "MAPK3", "at", "Thr203", "/", "Tyr205", "and", "MAPK1", "at", "Thr183", "/", "Tyr185", ")", "and", "total", "MAPK", ".", "Right", ",", "Ratio", "between", "phosphorylated", "and", "total", "kinase", "normalized", "to", "CTL", "at", "ZT18", "and", "ZT6", ".", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ".", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "000009", "(", "GSK3α", ")", ",", "multiple", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "correction", ".", "(", "E", ")", "Kinases", "with", "altered", "activity", "between", "CTL", "and", "micTNF", "-", "KOs", "predicted", "by", "robust", "kinase", "activity", "inference", "(", "RoKAI", ")", "at", "ZT18", "and", "ZT6", ".", "Graph", "shows", "the", "z", "-", "score", "value", "of", "each", "kinase", "assigned", "by", "RoKAI", ".", "Kinases", "above", "and", "below", "the", "dotted", "line", "represent", "prediction", "of", "up", "-", "and", "downregulated", "activity", "in", "micTNFα", "-", "KO", ",", "respectively", ".", "Kinases", "are", "color", "-", "coded", "according", "to", "kinase", "group", "as", "described", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "F", "Validation", "by", "western", "blot", "of", "altered", "activity", "of", "predicted", "kinases", "between", "CTL", "and", "micTNF", "-", "KOs", ".", "(", "F", ")", "Left", ",", "Immunoblots", "of", "cortical", "lysates", "of", "CTL", "and", "micTNFα", "-", "KO", "at", "ZT6", "using", "antibodies", "specific", "to", "target", "phosphorylation", "motifs", "of", "MAPK", "/", "CDK", "(", "PXS", "*", "P", ",", "S", "*", "PX", "(", "K", "/", "R", ")", ")", "and", "PKC", "(", "(", "K", "/", "R", ")", "XS", "*", "X", "(", "K", "/", "R", ")", ")", ".", "Dashed", "boxes", "indicate", "quantified", "signal", ".", "Right", ",", "Ratio", "between", "phosphorylated", "substrates", "and", "loading", "control", "normalized", "to", "CTL", "at", "ZT18", "and", "ZT6", ".", "(", "F", ",", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "022", "(", "MAPK", "/", "CDK", "phospho", "sub", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "014", "(", "PKC", "phospho", "sub", ")", "multiple", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "correction", ".", "G", ")", "Validation", "by", "western", "blot", "of", "altered", "activity", "of", "predicted", "kinases", "between", "CTL", "and", "micTNF", "-", "KOs", ".", "(", "G", ")", "Left", ",", "Immunoblots", "show", "signal", "of", "phosphorylated", "threonine", "in", "MARKs", "activation", "loop", ".", "Right", ",", "Ratio", "between", "phosphorylated", "MARK", "activation", "loop", "and", "loading", "control", "normalized", "to", "CTL", "at", "ZT18", "and", "ZT6", ".", "G", ")", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0091", "(", "MARK", ")", ",", "multiple", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "correction", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(D) Validation by western blot of changes in specific phosphorylation events on kinases. Left, Immunoblots of cortical lysates of CTL and micTNFα-KO at ZT6 for: (top) phosphorylated GSK3α/β (pGSK3α at Ser21 and pGSK3β at Ser9) and total GSK3α; and (bottom) phosphorylated MAPK (pMAPK, MAPK3 at Thr203/Tyr205 and MAPK1 at Thr183/Tyr185) and total MAPK. Right, Ratio between phosphorylated and total kinase normalized to CTL at ZT18 and ZT6. n=5 mice per group. ***p=0.000009 (GSK3α), multiple t-test with Benjamini-Hochberg correction.(E) Kinases with altered activity between CTL and micTNF-KOs predicted by robust kinase activity inference (RoKAI) at ZT18 and ZT6. Graph shows the z-score value of each kinase assigned by RoKAI. Kinases above and below the dotted line represent prediction of up- and downregulated activity in micTNFα-KO, respectively. Kinases are color-coded according to kinase group as described in (C).(F Validation by western blot of altered activity of predicted kinases between CTL and micTNF-KOs. (F) Left, Immunoblots of cortical lysates of CTL and micTNFα-KO at ZT6 using antibodies specific to target phosphorylation motifs of MAPK/CDK (PXS*P, S*PX(K/R)) and PKC ((K/R)XS*X(K/R)). Dashed boxes indicate quantified signal. Right, Ratio between phosphorylated substrates and loading control normalized to CTL at ZT18 and ZT6. (F, n=5 mice per group. *p=0.022 (MAPK/CDK phospho sub), *p=0.014 (PKC phospho sub) multiple t-test with Benjamini-Hochberg correction.G) Validation by western blot of altered activity of predicted kinases between CTL and micTNF-KOs. (G) Left, Immunoblots show signal of phosphorylated threonine in MARKs activation loop. Right, Ratio between phosphorylated MARK activation loop and loading control normalized to CTL at ZT18 and ZT6. G) n=5 mice per group. **p=0.0091 (MARK), multiple t-test with Benjamini-Hochberg correction."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "3D", "time", "‐", "lapse", "microscopy", "of", "mitochondria", "undergoing", "fission", "in", "a", "dendritic", "arbor", "of", "a", "neuron", ".", "Neurons", "were", "transfected", "with", "Mito", "‐", "DsRed2", ",", "pretreated", "with", "the", "pan", "‐", "caspase", "inhibitor", "zVAD", "‐", "fmk", "methyl", "ester", "(", "100", "μM", ")", ",", "and", "exposed", "to", "SNOC", "(", "200", "μM", ")", ".", "Images", "were", "3D", "iso", "‐", "surface", "rendered", ".", "Frames", "depict", "representative", "time", "points", "of", "the", "movie", "demonstrating", "mitochondrial", "fragmentation", "within", "3", "h", "of", "NO", "exposure", "(", "upper", "panels", ";", "scale", "bar", ",", "15", "μm", ")", "and", "closeup", "views", "(", "lower", "panels", ";", "scale", "bar", ",", "3", "μm", ")", ".", "See", "Supplementary", "Video", "1", ".", "(", "B", ")", "Mitochondrial", "fragmentation", "within", "the", "field", "of", "view", "shown", "in", "(", "A", ")", "results", "in", "increased", "mitochondrial", "numbers", ".", "(", "C", ")", "NO", "induces", "dose", "‐", "dependent", "mitochondrial", "fission", ".", "Neurons", "expressing", "Mito", "‐", "DsRed2", "were", "exposed", "to", "SNOC", "and", "fixed", "at", "60", "min", ".", "The", "fraction", "of", "neurons", "displaying", "fragmented", "mitochondria", "is", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "D", ")", "Mito", "‐", "DsRed2", "‐", "expressing", "corticalneurons", "were", "pretreated", "with", "1", "mM", "nitro", "‐", "L", "‐", "arginine", "(", "20", "min", ")", "and", "exposed", "to", "25", "μM", "NMDA", ".", "The", "fraction", "of", "neurons", "exhibiting", "fragmented", "mitochondria", "at", "60", "min", "after", "NMDA", "treatment", "is", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "quintuplicate", "samples", "from", "a", "representative", "experiment", "(", "†", "†", "†", "significance", "at", "P0", ".", "001", "or", "n", ".", "s", ".", "†", ",", "not", "significant", "compared", "to", "control", ";", "*", "*", "*", "significance", "at", "P0", ".", "001", "as", "compared", "to", "NMDA", "treatment", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) 3D time‐lapse microscopy of mitochondria undergoing fission in a dendritic arbor of a neuron. Neurons were transfected with Mito‐DsRed2, pretreated with the pan‐caspase inhibitor zVAD‐fmk methyl ester (100 μM), and exposed to SNOC (200 μM). Images were 3D iso‐surface rendered. Frames depict representative time points of the movie demonstrating mitochondrial fragmentation within 3 h of NO exposure (upper panels; scale bar, 15 μm) and closeup views (lower panels; scale bar, 3 μm). See Supplementary Video 1.(B) Mitochondrial fragmentation within the field of view shown in (A) results in increased mitochondrial numbers.(C) NO induces dose‐dependent mitochondrial fission. Neurons expressing Mito‐DsRed2 were exposed to SNOC and fixed at 60 min. The fraction of neurons displaying fragmented mitochondria is shown as the mean±s.e.m.(D) Mito‐DsRed2‐expressing corticalneurons were pretreated with 1 mM nitro‐L‐arginine (20 min) and exposed to 25 μM NMDA. The fraction of neurons exhibiting fragmented mitochondria at 60 min after NMDA treatment is shown as the mean±s.e.m. of quintuplicate samples from a representative experiment (†††significance at P0.001 or n.s.†, not significant compared to control; ***significance at P0.001 as compared to NMDA treatment)."}
{"words": ["Figure", "2Mitochondrial", "fission", "occurs", "before", "dendritic", "injury", "and", "without", "AIF", "or", "cytochrome", "c", "release", "from", "mitochondria", ".", "Neurons", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "vectors", "encoding", "(", "A", ")", "Mito", "‐", "DsRed2", "and", "(", "B", ")", "MyrPalm", "‐", "mCFP", "plus", "(", "C", ")", "AIF", "‐", "GFP", "and", "the", "effects", "of", "SNOC", "were", "recorded", "using", "3D", "time", "‐", "lapse", "imaging", ".", "Projection", "images", "zoomed", "in", "onto", "the", "dendritic", "arbor", "of", "one", "neuron", "(", "representative", "of", "n", "=", "42", ")", ".", "Arrows", "indicate", "dendritic", "spines", ".", "The", "inset", "shows", "the", "soma", "at", "appropriate", "grayscale", "levels", ".", "The", "apparent", "brightening", "of", "AIF", "‐", "GFP", "fluorescence", "in", "the", "nucleus", "at", "5", "h", "was", "due", "to", "nuclear", "and", "cell", "body", "shrinkage", "rather", "than", "nuclear", "translocation", "of", "AIF", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "See", "also", "Supplementary", "Video", "2", ".", "(", "D", ")", "3D", "time", "‐", "lapse", "image", "reconstructions", "of", "mitochondria", "and", "cytochrome", "c", "in", "a", "dendritic", "arbor", "at", "indicated", "time", "points", "following", "SNOC", "addition", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Five", "mitochondria", "were", "selected", "and", "motion", "tracked", "throughout", "the", "imaging", "series", ".", "(", "E", ")", "Traces", "show", "the", "ratio", "of", "mean", "GFP", "to", "DsRed2", "emission", "intensity", "from", "each", "mitochondrion", ".", "Each", "trace", "color", "corresponds", "to", "the", "same", "colored", "mitochondrion", ".", "(", "representative", "of", "n", "=", "9", ")", "(", "F", "-", "G", ")", "Immunocytochemistry", "for", "staining", "anti", "‐", "AIF", "antibodies", "(", "red", ")", "anti", "‐", "NeuN", "antibodies", "(", "green", ")", "and", "nuclei", "labeled", "with", "Hoechst", "33342", "dye", "(", "blue", ")", "after", "(", "F", ")", "aged", "SNOC", "or", "(", "G", ")", "SNOC", "(", "150", "μM", ";", "4", "h", ")", "treatment", ".", "Volume", "rendered", "3D", "reconstruction", "of", "confocal", "image", "stacks", "are", "shown", "above", ",", "and", "a", "single", "confocal", "plane", "in", "grayscale", "below", ".", "Grid", ",", "3", ".", "3", "μm", "for", "(", "F", ")", "and", "1", ".", "9", "μm", "for", "(", "G", ")", ",", "scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "(", "H", ")", "Ratio", "of", "nuclear", "to", "somal", "AIF", "signal", "was", "measured", "as", "mean", "fluorescence", "intensity", "in", "the", "center", "of", "nuclei", "divided", "by", "the", "mean", "fluorescence", "intensity", "in", "the", "cell", "body", ",", "outlined", "by", "the", "NeuN", "staining", "(", "excluding", "the", "nucleus", ")", ".", "The", "bar", "diagram", "summarizes", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "282", "and", "262", "neurons", "measured", "in", "n", "=", "19", "and", "20", "image", "stacks", "in", "three", "independent", "experiments", "for", "aged", "SNOC", "and", "SNOC", ",", "respectively", "(", "P", "∼", "0", ".", "99", "not", "significant", "by", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", ".", "(", "I", ")", "DEVDase", "activity", ".", "Purified", "cortical", "neurons", "were", "exposed", "to", "either", "200", "μM", "SNOC", "or", "1", "μM", "staurosporine", ",", "as", "positive", "control", ".", "The", "rate", "of", "zDEVD", "‐", "AMC", "caspase", "substrate", "cleavage", "per", "minute", "was", "monitored", "and", "expressed", "in", "arbitrary", "fluorescence", "units", ".", "Data", "show", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "four", "independent", "experiments", "(", "*", "significance", "at", "P0", ".", "01", "by", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Mitochondrial fission occurs before dendritic injury and without AIF or cytochrome c release from mitochondria. Neurons were co‐transfected with vectors encoding (A) Mito‐DsRed2 and (B) MyrPalm‐mCFP plus (C) AIF‐GFP and the effects of SNOC were recorded using 3D time‐lapse imaging. Projection images zoomed in onto the dendritic arbor of one neuron (representative of n=42). Arrows indicate dendritic spines. The inset shows the soma at appropriate grayscale levels. The apparent brightening of AIF‐GFP fluorescence in the nucleus at 5 h was due to nuclear and cell body shrinkage rather than nuclear translocation of AIF. Scale bars, 10 μm. See also Supplementary Video 2.(D) 3D time‐lapse image reconstructions of mitochondria and cytochrome c in a dendritic arbor at indicated time points following SNOC addition. Scale bar, 10 μm. Five mitochondria were selected and motion tracked throughout the imaging series.(E) Traces show the ratio of mean GFP to DsRed2 emission intensity from each mitochondrion. Each trace color corresponds to the same colored mitochondrion. (representative of n=9)(F-G) Immunocytochemistry for staining anti‐AIF antibodies (red) anti‐NeuN antibodies (green) and nuclei labeled with Hoechst 33342 dye (blue) after (F) aged SNOC or (G) SNOC (150 μM; 4 h) treatment. Volume rendered 3D reconstruction of confocal image stacks are shown above, and a single confocal plane in grayscale below. Grid, 3.3 μm for (F) and 1.9 μm for (G), scale bars, 5 μm.(H) Ratio of nuclear to somal AIF signal was measured as mean fluorescence intensity in the center of nuclei divided by the mean fluorescence intensity in the cell body, outlined by the NeuN staining (excluding the nucleus). The bar diagram summarizes the mean±s.e.m. of 282 and 262 neurons measured in n=19 and 20 image stacks in three independent experiments for aged SNOC and SNOC, respectively (P∼0.99 not significant by Student's t‐test).(I) DEVDase activity. Purified cortical neurons were exposed to either 200 μM SNOC or 1 μM staurosporine, as positive control. The rate of zDEVD‐AMC caspase substrate cleavage per minute was monitored and expressed in arbitrary fluorescence units. Data show mean±s.e.m. for four independent experiments (*significance at P0.01 by ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Elongated", "mitochondrion", "(", "arrow", ")", "in", "neuronal", "process", "of", "the", "unaffected", "hemisphere", "(", "top", ")", ".", "Small", "mitochondrial", "segments", "(", "arrows", ")", "are", "in", "close", "proximity", "to", "each", "other", "in", "a", "neuronal", "process", "of", "the", "ischemic", "brain", "region", "(", "bottom", ")", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "analyzed", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "nm", ".", "(", "B", ")", "Histogram", "comparing", "mitochondrial", "cross", "‐", "section", "length", "of", "contralateral", ",", "control", "(", "red", ")", "and", "ischemic", "(", "black", ")", "hemispheres", ".", "The", "lower", "bins", "of", "the", "histogram", "(", "2000", "nm", ")", "were", "compared", "with", "χ2", "‐", "test", "and", "were", "not", "different", ".", "The", "table", "shows", "the", "presence", "of", "long", "mitochondrial", "cross", "‐", "sections", "(", ">", "2000", "nm", ")", "in", "the", "control", "hemisphere", "and", "their", "absence", "in", "the", "ischemic", "hemisphere", "(", "P0", ".", "01", ";", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Proximities", "of", "mitochondria", "comparing", "the", "contralateral", "(", "red", ")", "and", "ischemic", "(", "black", ")", "hemispheres", ".", "Bar", "diagram", "shows", "percents", "of", "mitochondrial", "proximities", "found", "to", "be", "smaller", "or", "larger", "than", "400", "nm", ".", "The", "same", "data", "set", "is", "summarized", "as", "a", "contingency", "table", "on", "the", "right", ",", "(", "P0", ".", "001", ";", "two", "‐", "way", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Elongated mitochondrion (arrow) in neuronal process of the unaffected hemisphere (top). Small mitochondrial segments (arrows) are in close proximity to each other in a neuronal process of the ischemic brain region (bottom). Images are representative of three analyzed mice. Scale bars, 500 nm.(B) Histogram comparing mitochondrial cross‐section length of contralateral, control (red) and ischemic (black) hemispheres. The lower bins of the histogram (2000 nm) were compared with χ2‐test and were not different. The table shows the presence of long mitochondrial cross‐sections (>2000 nm) in the control hemisphere and their absence in the ischemic hemisphere (P0.01; Fisher's exact test).(C) Proximities of mitochondria comparing the contralateral (red) and ischemic (black) hemispheres. Bar diagram shows percents of mitochondrial proximities found to be smaller or larger than 400 nm. The same data set is summarized as a contingency table on the right, (P0.001; two‐way Fisher's exact test)."}
{"words": ["Figure", "4Fission", "is", "associated", "with", "ultrastructural", "changes", "in", "mitochondria", ".", "EM", "tomography", "of", "mitochondria", "in", "cultured", "corticalneurons", "demonstrates", "injury", "associated", "with", "mitochondrial", "fission", ".", "Cortical", "cultures", "were", "exposed", "to", "aged", "SNOC", "control", "(", "A", "-", "D", ")", "or", "200", "μM", "SNOC", "(", "E", "-", "L", ")", "for", "6", "h", "in", "the", "presence", "of", "80", "μM", "zVAD", "‐", "fmk", "methyl", "ester", ".", "A", "slice", "from", "each", "tilt", "series", "is", "shown", "(", "A", ",", "E", "and", "I", ")", ",", "followed", "by", "orthogonal", "views", "of", "3D", "reconstructions", "after", "segmentation", "of", "the", "OMM", "(", "blue", ")", "and", "IMM", "(", "gray", ")", ",", "with", "cristae", "(", "various", "arbitrary", "colors", ")", "(", "B", "-", "D", ",", "F", "-", "H", "and", "J", "-", "L", ")", ".", "For", "clarity", ",", "10", "representative", "cristae", "are", "shown", "in", "(", "B", ",", "D", ",", "F", ",", "G", ",", "J", "and", "K", ")", ",", "while", "all", "cristae", "are", "displayed", "in", "(", "C", ",", "H", "and", "L", ")", ".", "The", "control", "mitochondrion", "(", "A", "-", "D", ")", "is", "elongated", "with", "a", "dark", "matrix", ",", "indicating", "no", "swelling", ",", "and", "34", "cristae", ".", "The", "NO", "‐", "exposed", "mitochondrion", "in", "(", "E", "-", "H", ")", "is", "dividing", ",", "and", "the", "lower", "mitochondrion", "of", "the", "couplet", "shows", "severe", "damage", ",", "recognized", "by", "an", "outer", "membrane", "rupture", ",", "a", "regionally", "confined", "inner", "membrane", "blowout", ",", "slight", "matrix", "swelling", "and", "cristae", "fragmentation", ".", "Each", "of", "the", "daughter", "mitochondria", "is", "shorter", "and", "rounder", "than", "controls", ".", "Unlike", "the", "upper", "daughter", ",", "few", "of", "the", "cristae", "extend", "throughout", "the", "lower", "mitochondrion", ".", "Additionally", ",", "cristae", "are", "considerably", "smaller", "and", "regionally", "confined", ".", "The", "lower", "mitochondrion", "of", "the", "couplet", "contains", "82", "cristae", ",", "while", "the", "upper", "contains", "only", "39", ",", "indicating", "cristae", "fragmentation", "in", "the", "former", ".", "The", "NO", "‐", "exposed", "mitochondrial", "triplet", "in", "(", "I", "-", "L", ")", "displays", "further", "damage", ",", "including", "membrane", "degradation", ",", "accumulation", "of", "an", "electron", "dense", "mass", ",", "greater", "cristae", "fragmentation", ",", "and", "apparent", "mitochondrial", "fragmentation", ".", "All", "cristae", "are", "smaller", "than", "controls", ",", "with", "73", "in", "the", "top", "mitochondrion", ",", "112", "in", "the", "middle", ",", "and", "47", "in", "the", "bottom", ".", "Scale", "bars", ",", "400", "nm", ".", "See", "Supplementary", "Video", "3", ",", "4", "and", "5", "of", "tomographic", "reconstruction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Fission is associated with ultrastructural changes in mitochondria. EM tomography of mitochondria in cultured corticalneurons demonstrates injury associated with mitochondrial fission. Cortical cultures were exposed to aged SNOC control (A-D) or 200 μM SNOC (E-L) for 6 h in the presence of 80 μM zVAD‐fmk methyl ester. A slice from each tilt series is shown (A, E and I), followed by orthogonal views of 3D reconstructions after segmentation of the OMM (blue) and IMM (gray), with cristae (various arbitrary colors) (B-D, F-H and J-L). For clarity, 10 representative cristae are shown in (B, D, F, G, J and K), while all cristae are displayed in (C, H and L). The control mitochondrion (A-D) is elongated with a dark matrix, indicating no swelling, and 34 cristae. The NO‐exposed mitochondrion in (E-H) is dividing, and the lower mitochondrion of the couplet shows severe damage, recognized by an outer membrane rupture, a regionally confined inner membrane blowout, slight matrix swelling and cristae fragmentation. Each of the daughter mitochondria is shorter and rounder than controls. Unlike the upper daughter, few of the cristae extend throughout the lower mitochondrion. Additionally, cristae are considerably smaller and regionally confined. The lower mitochondrion of the couplet contains 82 cristae, while the upper contains only 39, indicating cristae fragmentation in the former. The NO‐exposed mitochondrial triplet in (I-L) displays further damage, including membrane degradation, accumulation of an electron dense mass, greater cristae fragmentation, and apparent mitochondrial fragmentation. All cristae are smaller than controls, with 73 in the top mitochondrion, 112 in the middle, and 47 in the bottom. Scale bars, 400 nm. See Supplementary Video 3, 4 and 5 of tomographic reconstruction."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Projection", "image", "of", "two", "neurons", "expressing", "Mito", "‐", "DsRed2", "(", "red", ")", "and", "MyrPalm", "‐", "CFP", "(", "blue", ")", ".", "Images", "were", "high", "‐", "pass", "filtered", "and", "z", "‐", "stacks", "were", "projected", "over", "maximum", "intensity", ".", "(", "B", ")", "Changes", "in", "mitochondrial", "dynamics", "were", "evaluated", "as", "mean", "skeletal", "length", "of", "mitochondria", "or", "(", "C", ")", "as", "mitochondrial", "numbers", ".", "(", "D", ")", "Magnified", "representative", "frames", "of", "the", "time", "‐", "lapse", "recording", "of", "the", "area", "within", "the", "white", "rectangle", "of", "(", "A", ")", "indicate", "mitochondrial", "morphology", "at", "time", "0", ",", "20", "min", "and", "1", "h", ".", "These", "time", "points", "are", "depicted", "in", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", "by", "red", "arrows", ".", "Data", "are", "representative", "of", "26", "neurons", ",", "which", "exhibited", "reversible", "mitochondrial", "fission", "from", "a", "total", "of", "55", "analyzed", "neurons", "(", "six", "experiments", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "See", "Supplementary", "Video", "6", ".", "(", "E", ")", "Autophagy", "in", "neurites", "at", "6", "h", "after", "SNOC", "exposure", ".", "Arrows", "indicate", "autophagosomes", "engulfing", "injured", "mitochondria", "next", "to", "an", "intact", "mitochondrion", "in", "the", "left", "image", ".", "The", "arrowhead", "in", "the", "right", "panel", "indicates", "membrane", "wrappers", "characteristic", "of", "autophagosomes", ".", "White", "arrowheads", "in", "the", "insets", "show", "the", "double", "membranes", "of", "the", "autophagosome", "and", "those", "of", "mitochondria", "within", "the", "autophagosome", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Projection image of two neurons expressing Mito‐DsRed2 (red) and MyrPalm‐CFP (blue). Images were high‐pass filtered and z‐stacks were projected over maximum intensity.(B) Changes in mitochondrial dynamics were evaluated as mean skeletal length of mitochondria or (C) as mitochondrial numbers.(D) Magnified representative frames of the time‐lapse recording of the area within the white rectangle of (A) indicate mitochondrial morphology at time 0, 20 min and 1 h. These time points are depicted in (B) and (C) by red arrows. Data are representative of 26 neurons, which exhibited reversible mitochondrial fission from a total of 55 analyzed neurons (six experiments). Scale bar, 10 μm. See Supplementary Video 6.(E) Autophagy in neurites at 6 h after SNOC exposure. Arrows indicate autophagosomes engulfing injured mitochondria next to an intact mitochondrion in the left image. The arrowhead in the right panel indicates membrane wrappers characteristic of autophagosomes. White arrowheads in the insets show the double membranes of the autophagosome and those of mitochondria within the autophagosome. Scale bars, 500 nm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Mitochondrial", "fission", "is", "linked", "to", "a", "drop", "in", "ATP", ".", "Purified", "corticalneurons", "were", "exposed", "to", "increasing", "SNOC", "concentrations", "or", "mitochondrial", "inhibitors", "(", "2", "μM", "rotenone", "plus", "2", "μg", "/", "ml", "oligomycin", ";", "Rot", "/", "Olig", ")", ".", "ATP", "concentrations", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "normalized", "to", "the", "plating", "density", "of", "neurons", "(", "n", "=", "6", ")", "(", "B", ")", "[", "ATP", "]", "/", "[", "ADP", "]", "ratios", "in", "purified", "corticalneurons", "exposed", "to", "increasing", "SNOC", "concentrations", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "C", ")", "The", "bar", "graph", "depicts", "ethidine", "fluorescence", "density", "in", "arbitrary", "units", "of", "aged", "and", "fresh", "SNOC", "treated", "neurons", "at", "2", ".", "5", "h", ".", "(", "D", ")", "Cortical", "neurons", "expressing", "Mito", "‐", "GFP", "(", "green", ")", "were", "exposed", "to", "aged", "or", "fresh", "200", "μM", "SNOC", "solution", ".", "After", "2", ".", "5", "h", "cultures", "were", "loaded", "with", "hydroethidine", ".", "Images", "are", "representative", "of", "more", "that", "20", "neurons", "analyzed", "(", "in", "D", ")", "for", "each", "condition", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "E", ")", "Reduced", "glutathione", "(", "GSH", ")", "partially", "blocks", "mitochondrial", "fission", ".", "Neurons", "were", "transfected", "with", "Mito", "pretreated", "for", "2", "h", "with", "2", "mM", "GSH", "monoethyl", "ester", ",", "washed", "once", "and", "then", "exposed", "to", "35", "μM", "SNOC", ".", "Mitochondrial", "fission", "was", "scored", "after", "1", "h", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "quintuplicate", "samples", "from", "one", "representative", "experiment", "of", "a", "total", "of", "three", "(", "†", "†", "†", "significance", "at", "P0", ".", "001", "or", "n", ".", "s", ".", ",", "†", "not", "significant", "compared", "to", "control", ";", "*", "significance", "at", "P0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Mitochondrial fission is linked to a drop in ATP. Purified corticalneurons were exposed to increasing SNOC concentrations or mitochondrial inhibitors (2 μM rotenone plus 2 μg/ml oligomycin; Rot/Olig). ATP concentrations are shown as the mean±s.e.m. normalized to the plating density of neurons (n=6)(B) [ATP]/[ADP] ratios in purified corticalneurons exposed to increasing SNOC concentrations (n=4).(C) The bar graph depicts ethidine fluorescence density in arbitrary units of aged and fresh SNOC treated neurons at 2.5 h.(D) Cortical neurons expressing Mito‐GFP (green) were exposed to aged or fresh 200 μM SNOC solution. After 2.5 h cultures were loaded with hydroethidine. Images are representative of more that 20 neurons analyzed (in D) for each condition from at least three independent experiments. Scale bar, 10 μm.(E) Reduced glutathione (GSH) partially blocks mitochondrial fission. Neurons were transfected with Mito pretreated for 2 h with 2 mM GSH monoethyl ester, washed once and then exposed to 35 μM SNOC. Mitochondrial fission was scored after 1 h. Data are means±s.e.m. of quintuplicate samples from one representative experiment of a total of three (†††significance at P0.001 or n.s., †not significant compared to control; *significance at P0.05)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Representative", "fluorescence", "micrographs", "of", "mitochondrial", "morphology", "before", "and", "after", "SNOC", "(", "175", "μM", ";", "7", "h", ")", "or", "rotenone", "(", "30", "nM", ";", "2", "h", ")", "treatments", "and", "a", "comparison", "of", "the", "effects", "of", "Aβ25", "-", "35", "versus", "Aβ35", "-", "25", "(", "10", "μM", ",", "6", "h", ")", ",", "as", "indicated", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "B", ")", "Percentage", "of", "mitochondrial", "fission", "and", "cell", "death", "at", "18", "h", "(", "†", "and", "†", "†", "†", "significance", "at", "P0", ".", "05", "and", "0", ".", "001", "as", "compared", "to", "control", "pcDNA3", "transfection", ";", "*", ",", "*", "*", "and", "*", "*", "*", "significance", "at", "P0", ".", "05", ",", "0", ".", "01", "and", "0", ".", "001", ",", "respectively", ",", "compared", "to", "SNOC", "treated", ",", "pcDNA3", "transfected", "neurons", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Dying", "neurons", "were", "recognized", "by", "their", "shrunken", "and", "condensed", "nuclei", "after", "Hoechst", "33342", "staining", ".", "(", "C", ")", "Enforced", "Drp1", "or", "Fis1", "expression", "(", "60", "h", ")", "evokes", "fission", "and", "neuronal", "cell", "death", "(", "*", ",", "*", "*", "and", "*", "*", "*", "significance", "at", "P0", ".", "05", ",", "0", ".", "01", "and", "0", ".", "001", ",", "respectively", ",", "compared", "to", "pcDNA3", "transfected", "neurons", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "D", ")", "Rotenone", "induces", "dose", "‐", "dependent", "mitochondrial", "fission", ".", "The", "fraction", "of", "neurons", "displaying", "fissioned", "mitochondria", "is", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "*", "significance", "at", "P0", ".", "05", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "E", ")", "Mfn1", "or", "Drp1K38A", "inhibits", "100", "nM", "rotenone", "‐", "induced", "mitochondrial", "fission", "(", "4", "h", ")", "and", "cell", "death", "(", "48", "h", ")", ".", "Data", "indicate", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "measurements", "(", "†", "†", "and", "†", "†", "†", "significance", "at", "P0", ".", "01", "and", "0", ".", "001", "as", "compared", "to", "untreated", "control", ";", "*", "*", "*", "significance", "at", "P0", ".", "001", "as", "compared", "to", "rotenone", "treatment", "with", "pcDNA3", "transfection", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "F", ")", "Mitochondrial", "fission", "by", "Aβ35", "-", "25", "or", "Aβ25", "-", "35", "exposure", ".", "The", "fraction", "of", "neurons", "exhibiting", "fragmented", "mitochondria", "is", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "†", "†", "significance", "at", "P0", ".", "01", "compared", "to", "pcDNA3", "transfected", ",", "Aβ35", "−", "25", "treated", "control", ";", "*", "and", "*", "*", "significance", "at", "P0", ".", "05", "and", "0", ".", "001", ",", "respectively", ",", "compared", "to", "pcDNA3", "transfected", ",", "Aβ25", "-", "35", "treated", "neurons", ";", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Representative fluorescence micrographs of mitochondrial morphology before and after SNOC (175 μM; 7 h) or rotenone (30 nM; 2 h) treatments and a comparison of the effects of Aβ25-35 versus Aβ35-25(10 μM, 6 h), as indicated. Scale bar, 20 μm.(B) Percentage of mitochondrial fission and cell death at 18 h († and ††† significance at P0.05 and 0.001 as compared to control pcDNA3 transfection; *,** and *** significance at P0.05 , 0.01 and 0.001, respectively, compared to SNOC treated, pcDNA3 transfected neurons; n=3 independent experiments). Dying neurons were recognized by their shrunken and condensed nuclei after Hoechst 33342 staining.(C) Enforced Drp1 or Fis1 expression (60 h) evokes fission and neuronal cell death (*,** and *** significance at P0.05, 0.01 and 0.001, respectively, compared to pcDNA3 transfected neurons; n=3 independent experiments).(D) Rotenone induces dose‐dependent mitochondrial fission. The fraction of neurons displaying fissioned mitochondria is shown as the mean ±s.e.m. (*significance at P0.05, n=4).(E) Mfn1 or Drp1K38A inhibits 100 nM rotenone‐induced mitochondrial fission (4 h) and cell death (48 h). Data indicate means±s.e.m. of triplicate measurements (†† and ††† significance at P0.01 and 0.001 as compared to untreated control; ***significance at P0.001 as compared to rotenone treatment with pcDNA3 transfection; n=3).(F) Mitochondrial fission by Aβ35-25 or Aβ25-35 exposure. The fraction of neurons exhibiting fragmented mitochondria is shown as the mean±s.e.m. (††significance at P0.01 compared to pcDNA3 transfected, Aβ35−25 treated control; * and ** significance at P0.05 and 0.001, respectively, compared to pcDNA3 transfected, Aβ25-35 treated neurons; n=3)."}
{"words": ["Figure", "3", "Therapeutic", "leads", "generated", "using", "PDN", "were", "directly", "tested", "for", "survival", "benefit", "using", "a", "murine", "model", "of", "endotoxemia", ".", "Select", "compounds", "were", "injected", "24", "hours", "before", "and", "on", "the", "day", "of", "LPS", "administration", ",", "using", "routes", "and", "doses", "specified", "in", "the", "methods", ".", "C57bl", "/", "6", "female", "mice", "were", "injected", "with", "a", "high", "-", "lethality", "dose", "of", "E", ".", "coli", "LPS", "(", "38", "-", "40", "μg", "/", "g", ")", "followed", "by", "a", "subcutaneous", "injection", "of", "sterile", "saline", ".", "Significant", "differences", "in", "concentration", "between", "drug", "and", "vehicle", "-", "treated", "pre", "-", "and", "post", "-", "pubertal", "mice", "are", "labeled", "with", "*", "*", "*", "*", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ",", "*", "*", "*", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "(", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "or", "*", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Percent", "survival", "was", "compared", "using", "a", "log", "rank", "Mantel", "Cox", "test"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 Therapeutic leads generated using PDN were directly tested for survival benefit using a murine model of endotoxemia. Select compounds were injected 24 hours before and on the day of LPS administration, using routes and doses specified in the methods. C57bl/6 female mice were injected with a high-lethality dose of E. coli LPS (38-40 μg/g) followed by a subcutaneous injection of sterile saline. Significant differences in concentration between drug and vehicle-treated pre- and post-pubertal mice are labeled with **** (p<0.0001), *** (p<0.001, ** (p<0.01), or * (p<0.05). Percent survival was compared using a log rank Mantel Cox test "}
{"words": ["Figure", "1A", "Representative", "images", "of", "alkaline", "phosphatase", "(", "ALP", ")", ",", "Alizarin", "Red", "S", "(", "ARS", ")", "and", "Van", "Gieson", "'", "s", "staining", "of", "human", " ", "MSCs", "B", ",", "C", "Quantitative", "analyses", "of", "the", "ALP", "activity", "and", "calcium", "mineralization", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "6", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "t", "test", "D", ",", "E", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "and", "western", "blot", "analyses", "of", "the", "expression", "of", "osteogenic", "markers", ".", "Cells", "were", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "t", "test", "F", "H", "&", "E", "staining", "of", "the", "MSCs", "-", "mediated", "ectopic", "bone", "formation", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "G", "Quantitative", "analysis", "of", "bone", " ", "volume", "versus", "total", "tissue", "volume", "(", "BV", "/", "TV", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "6", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "t"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Representative images of alkaline phosphatase (ALP), Alizarin Red S (ARS) and Van Gieson's staining of human MSCs B, C Quantitative analyses of the ALP activity and calcium mineralization. Results are shown as mean ± SEM; n=6; **: p<0.01 and ***: p<0.001 by t test D, E Quantitative RT-PCR and western blot analyses of the expression of osteogenic markers. Cells were cultured in osteogenic medium for 5 days. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by t test F H&E staining of the MSCs-mediated ectopic bone formation. Scale bar, 50 μm G Quantitative analysis of bone volume versus total tissue volume (BV/TV). Results are shown as mean ± SEM; n=6. *: p<0.05 by t test"}
{"words": ["Figure", "4", "A", "Scatter", "plot", "of", "RNA", "-", "seq", "expression", "analysis", ".", "508", "genes", "were", "upregulated", "and", "391", "genes", "were", "downregulated", ".", "Human", "MSCs", "were", "transfected", "with", "USP34", "or", "control", "siRNAs", "and", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "2", "days", ".", "Two", "biological", "replicates", "per", "group", "C", "Heatmap", "of", "representative", "genes", "associated", "with", "BMP2", "signaling", "pathway", "D", "Relative", "activity", "of", "BRE", "luciferase", "assay", ".", "293T", "cells", "were", "depleted", "with", "serum", "overnight", "followed", "by", "a", "treatment", "with", "BMP2", "for", "6", "hours", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "t", "testE", "Immunoblot", "analysis", "of", "BMP2", "-", "induce", "Sp7", "expression", ".", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", "and", "Usp34f", "/", "f", "control", "MSCs", "were", "starved", "overnight", "and", "then", "stimulated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "24", "hoursF", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "BMP2", "-", "induce", "Sp7", " ", "transcription", ".", "Cells", "were", "depleted", "from", "serum", "overnight", "before", "BMP2", "stimulation", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "t", "testG", "Representative", "images", "of", "ALP", "and", "ARS", " ", "staining", ".", "MSCs", "were", "cultured", "with", "normal", "medium", "supplemented", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "10", "and", "21", "days", ",", "respectivelyH", ",", "I", "Quantitative", "analyses", "of", "the", "ALP", "activity", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "calcium", "mineralization", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "t", "test", "J", ",", "K", "Representative", "microCT", "images", "and", "quantification", "of", "newly", "formed", "bone", "in", "response", "to", "BMP2", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "t", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "2500", "μm", "L", "H", "&", "E", "staining", "of", "BMP2", "-", "induced", "newly", "formed", "bone", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μmM", "Quantitative", "analysis", "of", "bone", " ", "volume", "versus", "total", "tissue", " ", "volume", "(", "BV", "/", "TV", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "t", " ", "test", "N", "H", "&", "E", "staining", "of", "calvarial", "organ", "cultures", "stimulated", "with", "or", "without", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", ".", "Red", "dotted", "lines", "indicate", "the", "interface", "between", "original", "and", "newly", "formed", "bone", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μmO", "Quantitative", "analysis", "of", "newly", "formed", "bone", " ", "volume", "versus", "original", "bone", " ", "volume", "(", "%", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "t", " "], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A Scatter plot of RNA-seq expression analysis. 508 genes were upregulated and 391 genes were downregulated. Human MSCs were transfected with USP34 or control siRNAs and cultured in osteogenic medium for 2 days. Two biological replicates per group  C Heatmap of representative genes associated with BMP2 signaling pathway D Relative activity of BRE luciferase assay. 293T cells were depleted with serum overnight followed by a treatment with BMP2 for 6 hours. Results are shown as mean ± SEM; n=3. ***: p<0.001 by t testE Immunoblot analysis of BMP2-induce Sp7 expression. Prx1-Cre;Usp34f/f and Usp34f/f control MSCs were starved overnight and then stimulated with 100 ng/ml BMP2 for 24 hoursF Quantitative RT-PCR analysis of BMP2-induce Sp7 transcription. Cells were depleted from serum overnight before BMP2 stimulation. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05 and **: p<0.01 by t testG Representative images of ALP and ARS staining. MSCs were cultured with normal medium supplemented with 100 ng/ml BMP2 for 10 and 21 days, respectivelyH, I Quantitative analyses of the ALP activity (n=4) and calcium mineralization (n=5). Results are shown as mean ± SEM; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by t test J, K Representative microCT images and quantification of newly formed bone in response to BMP2. Results are shown as mean ± SEM; n=8. *: p<0.05 by t test. Scale bar, 2500 μm L H&E staining of BMP2-induced newly formed bone. Scale bar, 50 μmM Quantitative analysis of bone volume versus total tissue volume (BV/TV). Results are shown as mean ± SEM; n=8; **: p<0.01 by t test N H&E staining of calvarial organ cultures stimulated with or without 100 ng/ml BMP2. Red dotted lines indicate the interface between original and newly formed bone. Scale bar, 50 μmO Quantitative analysis of newly formed bone volume versus original bone volume (%). Results are shown as mean ± SEM; n=8; **: p<0.01 by t test"}
{"words": ["Figure", "6A", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "USP34", "with", "ectopically", "expressed", "FLAG", "-", "tagged", "Smad1", "in", "293T", "cells", "B", "Immunoblot", "analysis", "showing", "decreased", "FLAG", "-", "Smad1", "after", "USP34", "knockdown", "C", "Immunoblot", "of", "Smad1", "-", "linked", "polyUb", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "FLAG", "-", "Smad1", "overexpression", "plasmid", "and", "USP34", "siRNA", ",", "and", "treated", "with", "10", "µM", "MG132", "for", "4", "hours", "before", "collection", "D", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "degradation", "of", "FLAG", "-", "Smad1", "protein", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "FLAG", "-", "Smad1", "overexpression", "plasmid", "and", "USP34", "siRNA", ",", "and", "treated", "with", "50", "µg", "/", "ml", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "before", "collection", "at", "designated", "time", "points", ".", "Right", ":", "relative", "quantification", "of", "FLAG", "-", "Smad1", "protein", "levels", "at", "different", "time", "pointsE", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "USP34", "with", "ectopically", "expressed", "FLAG", "-", "tagged", "RUNX2", "in", "293T", "cellsF", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "USP34", "with", "endogenous", "RUNX2", "in", "mouse", "MSCsG", "Immunoblot", "of", "RUNX2", "-", "linked", "polyUb", ".", "Differentiated", "mouse", "MSCs", "were", "treated", "with", "10", "µM", "MG132", "for", "4", "hours", "before", "collection", ".", "Prx1", "-", "Cre", "(", "+", ")", "indicates", "MSCs", "isolated", "from", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", "mice", ",", "and", "Prx1", "-", "Cre", "(", "-", ")", "indicates", "those", "from", "Usp34f", "/", "f", "control", "miceH", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "degradation", "of", "endogenous", "RUNX2", "protein", "in", "MSCs", ".", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", "and", "Usp34f", "/", "f", "control", "MSCs", "were", "stimulated", "with", "BMP2", ",", "treated", "with", "50", "µg", "/", "ml", "CHX", ",", "and", "collected", "at", "designated", "time", "points", ".", "Right", ":", "relative", "quantification", "of", "RUNX2", "protein", "levels", "at", "different", "time", "pointsI", "Representative", "images", "of", "ALP", "and", "ARS", "staining", ".", "Usp34f", "/", "f", "and", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", " ", "MSCs", "were", "transduced", "with", "GFP", ",", "Smad1", ",", "Runx2", "or", "Smad1", "+", "Runx2", "adenoviruses", ",", "and", "then", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "and", "10", "days", ",", "respectivelyJ", ",", "K", "Quantitative", "analyses", "of", "the", "ALP", "activity", "and", "calcium", "mineralization", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "testL", ",", "M", "H", "&", "E", " ", "staining", "and", "quantitative", "analysis", "of", "MSCs", "-", "mediated", "ectopic", "bone", "formation", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Co-immunoprecipitation of USP34 with ectopically expressed FLAG-tagged Smad1 in 293T cells B Immunoblot analysis showing decreased FLAG-Smad1 after USP34 knockdown  C Immunoblot of Smad1-linked polyUb. 293T cells were co-transfected with FLAG-Smad1 overexpression plasmid and USP34 siRNA, and treated with 10 µM MG132 for 4 hours before collection  D Immunoblot analysis of the degradation of FLAG-Smad1 protein. 293T cells were co-transfected with FLAG-Smad1 overexpression plasmid and USP34 siRNA, and treated with 50 µg/ml cycloheximide (CHX) before collection at designated time points. Right: relative quantification of FLAG-Smad1 protein levels at different time pointsE Co-immunoprecipitation of USP34 with ectopically expressed FLAG-tagged RUNX2 in 293T cellsF Co-immunoprecipitation of USP34 with endogenous RUNX2 in mouse MSCsG Immunoblot of RUNX2-linked polyUb. Differentiated mouse MSCs were treated with 10 µM MG132 for 4 hours before collection. Prx1-Cre(+) indicates MSCs isolated from Prx1-Cre;Usp34f/f mice, and Prx1-Cre(-) indicates those from Usp34f/f control miceH Immunoblot analysis of the degradation of endogenous RUNX2 protein in MSCs. Prx1-Cre;Usp34f/f and Usp34f/f control MSCs were stimulated with BMP2, treated with 50 µg/ml CHX, and collected at designated time points. Right: relative quantification of RUNX2 protein levels at different time pointsI Representative images of ALP and ARS staining. Usp34f/f and Prx1-Cre;Usp34f/f MSCs were transduced with GFP, Smad1, Runx2 or Smad1+Runx2 adenoviruses, and then cultured in osteogenic medium for 5 and 10 days, respectivelyJ, K Quantitative analyses of the ALP activity and calcium mineralization. Results are shown as mean ± SEM; n=8; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by ANOVA with Tukey's post hoc testL, M H&E staining and quantitative analysis of MSCs-mediated ectopic bone formation. Scale bar, 50 μm. Results are shown as mean ± SEM; n=8; *: p<0.05 and **: p<0.01 by ANOVA with Tukey's post hoc test"}
{"words": ["Figure", "7A", "Relative", "activity", "of", "BRE", "luciferase", "assay", ".", "293T", "cells", "were", "depleted", "with", "serum", "overnight", "followed", "by", "a", "treatment", "with", "BMP2", "for", "6", "hours", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "testB", "Immunoblot", "analysis", "of", "BMP2", "-", "induce", "Sp7", "expression", ".", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", " ", "MSCs", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "starved", "overnight", "and", "then", "stimulated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "24", "hoursC", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "BMP2", "-", "induce", "Sp7", " ", "transcription", ".", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", " ", "MSCs", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "and", "depleted", "from", "serum", "overnight", "before", "BMP2", "stimulation", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "testD", "ALP", " ", "staining", "and", "quantitative", "measurement", "of", "ALP", "activity", ".", "MSCs", "were", "cultured", "with", "normal", "medium", "supplemented", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "5", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "E", "Representative", "images", "of", "ARS", "staining", "and", "quantification", ".", "Cells", "were", "cultured", "with", "normal", "medium", "supplemented", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "14", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "F", "Representative", "images", "of", "ALP", "and", "ARS", "staining", ".", "Mouse", "MSCs", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "and", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "and", "10", "days", ",", "respectivelyG", ",", "H", "Quantitative", "analyses", "of", "the", "ALP", "activity", "and", "calcium", "mineralization", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", " ", "I", ",", "J", "Quantitative", "RT", "-", "PC", "analyses", "of", "the", "expression", "of", "osteogenic", "markers", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "and", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "testwestern", "blot", "analyses", "of", "the", "expression", "of", "osteogenic", "markers", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "and", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Relative activity of BRE luciferase assay. 293T cells were depleted with serum overnight followed by a treatment with BMP2 for 6 hours. Results are shown as mean ± SEM; n=3. *: p<0.05 by ANOVA with Tukey's post hoc testB Immunoblot analysis of BMP2-induce Sp7 expression. Prx1-Cre;Usp34f/f MSCs were treated with Smurf1 or control siRNAs, starved overnight and then stimulated with 100 ng/ml BMP2 for 24 hoursC Quantitative RT-PCR analysis of BMP2-induce Sp7 transcription. Prx1-Cre;Usp34f/f MSCs were treated with Smurf1 or control siRNAs, and depleted from serum overnight before BMP2 stimulation. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05 and **: p<0.01 by ANOVA with Tukey's post hoc testD ALP staining and quantitative measurement of ALP activity. MSCs were cultured with normal medium supplemented with 100 ng/ml BMP2 for 5 days. Results are shown as mean ± SEM; n=8; **: p<0.01 by ANOVA with Tukey's post hoc test E Representative images of ARS staining and quantification. Cells were cultured with normal medium supplemented with 100 ng/ml BMP2 for 14 days. Results are shown as mean ± SEM; n=8; *: p<0.05, and **: p<0.01 by ANOVA with Tukey's post hoc test  F Representative images of ALP and ARS staining. Mouse MSCs were treated with Smurf1 or control siRNAs, and cultured in osteogenic medium for 5 and 10 days, respectivelyG, H Quantitative analyses of the ALP activity and calcium mineralization. Results are shown as mean ± SEM; n=8; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by ANOVA with Tukey's post hoc test I, J Quantitative RT-PC analyses of the expression of osteogenic markers. Cells were treated with Smurf1 or control siRNAs, and cultured in osteogenic medium for 5 days. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by ANOVA with Tukey's post hoc testwestern blot analyses of the expression of osteogenic markers. Cells were treated with Smurf1 or control siRNAs, and cultured in osteogenic medium for 5 days. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by ANOVA with Tukey's post hoc test"}
{"words": ["Figure", "1B", "Phospholipid", "transport", "/", "synthesis", ",", "as", "measured", "by", "3H", "-", "serine", "incorporation", ",", "in", "human", "fibroblasts", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "9", ",", "with", "5", "replicates", "/", "experiment", ")", "and", "in", "primary", "mouse", "hippocampal", "neurons", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "4", "or", "5", "replicates", "/", "experiment", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "E3", ".", "C", "Comparison", "of", "3H", "-", "serine", "incorporation", "in", "ApoE", "ACM", "-", "treated", "WT", "-", "and", "Mfn2", "-", "KO", "MEFs", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "3", "replicates", "/", "experiment", ")", ".", "D", "Duramycin", "sensitivity", "in", "ApoE", "ACM", "-", "treated", "fibroblasts", ".", "Note", "increased", "sensitivity", "after", "20", "min", "to", "5", "μM", "duramycin", "in", "ApoE4", "-", "treated", "cells", ",", "which", "was", "blocked", "upon", "the", "addition", "of", "15", "μM", "exogenous", "PtdEtn", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "3", "replicates", "/", "experiment", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Phospholipid transport/synthesis, as measured by 3H-serine incorporation, in human fibroblasts (mean±SE; n=9, with 5 replicates/experiment) and in primary mouse hippocampal neurons (mean±SE; n=3, with 4 or 5 replicates/experiment). *, p<0.05 vs E3.C Comparison of 3H-serine incorporation in ApoE ACM-treated WT- and Mfn2-KO MEFs (mean±SE; n=3, with 3 replicates/experiment).D Duramycin sensitivity in ApoE ACM-treated fibroblasts. Note increased sensitivity after 20 min to 5 μM duramycin in ApoE4-treated cells, which was blocked upon the addition of 15 μM exogenous PtdEtn (mean±SD; n=3, with 3 replicates/experiment)."}
{"words": ["Figure", "2B", "Fractions", "from", "the", "discontinuous", "gradient", "were", "blotted", "with", "anti", "-", "ApoE", "(", "WUE", "-", "4", ")", "antibody", ";", "the", "doublet", "is", "a", "characteristic", "feature", "on", "ApoE", "western", "blots", "due", "to", "ApoE", "sialylation", "[", "16", "]", ".", "C", "An", "ApoE", "-", "containing", "fraction", "(", "fraction", "5", "[", "+", "]", ")", ",", "an", "ApoE", "-", "negative", "fraction", "(", "fraction", "3", "[", "-", "]", ")", ",", "and", "recombinant", "lipid", "-", "free", "ApoE", "protein", "were", "applied", "to", "human", "fibroblasts", ".", "Note", "increase", "in", "phospholipid", "synthesis", "using", "an", "ApoE4", "-", "containing", "lipoprotein", "fraction", ",", "but", "not", "with", "either", "an", "ApoE4", "-", "negative", "fraction", "or", "with", "lipoprotein", "-", "free", "recombinant", "ApoE3", "or", "ApoE4", "protein", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "3", "replicates", "/", "experiment", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Fractions from the discontinuous gradient were blotted with anti-ApoE (WUE-4) antibody; the doublet is a characteristic feature on ApoE western blots due to ApoE sialylation [16].C An ApoE-containing fraction (fraction 5 [+]), an ApoE-negative fraction (fraction 3 [-]), and recombinant lipid-free ApoE protein were applied to human fibroblasts. Note increase in phospholipid synthesis using an ApoE4-containing lipoprotein fraction, but not with either an ApoE4-negative fraction or with lipoprotein-free recombinant ApoE3 or ApoE4 protein (mean ± SE; n=3, with 3 replicates/experiment)."}
{"words": ["Figure", "3A", "Cholesteryl", "ester", "synthesis", ",", "as", "measured", "by", "3H", "-", "oleate", "incorporation", ".", "Note", "increased", "CE", "in", "ApoE4", "-", "treated", "cells", ",", "whereas", "there", "was", "essentially", "no", "difference", "in", "triglyceride", "(", "TAG", ")", "production", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ".", "with", "3", "replicates", "/", "experiment", ")", ".", "†", ",", "p", "=", "0", ".", "06", "vs", "E3", ".", "B", "Comparison", "of", "3H", "-", "oleate", "incorporation", "in", "ApoE", "ACM", "-", "treated", "WT", "-", "and", "Mfn2", "-", "KO", "MEFs", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "5", "replicates", "/", "experiment", ")", ".", "C", "ApoE", "ACM", "-", "treated", "fibroblasts", "were", "stained", "with", "LipidTox", "green", "neutral", "lipid", "stain", ",", "and", "lipid", "droplets", "were", "visualized", "(", "example", "at", "left", ")", "and", "counted", "(", "right", ")", ".", "Note", "significantly", "more", "lipid", "droplets", "in", "ApoE4", "-", "treated", "cells", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Cholesteryl ester synthesis, as measured by 3H-oleate incorporation. Note increased CE in ApoE4-treated cells, whereas there was essentially no difference in triglyceride (TAG) production (mean±SE; n=3. with 3 replicates/experiment). †, p=0.06 vs E3.B Comparison of 3H-oleate incorporation in ApoE ACM-treated WT- and Mfn2-KO MEFs (mean±SE; n=3, with 5 replicates/experiment).C ApoE ACM-treated fibroblasts were stained with LipidTox green neutral lipid stain, and lipid droplets were visualized (example at left) and counted (right). Note significantly more lipid droplets in ApoE4-treated cells (mean ± SD, n=3)."}
{"words": ["Figure", "4HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "to", "visualize", "ER", "(", "in", "green", ")", "and", "mitochondria", "(", "in", "red", ")", ",", "and", "then", "were", "treated", "with", "ApoE3", "-", "and", "ApoE4", "-", "ACM", "for", "24", "hours", ".", "Shown", "is", "a", "box", "-", "and", "-", "whisker", "plot", "comparing", "co", "-", "localization", "in", "ApoE3", "ACM", "(", "n", "=", "15", "images", "analyzed", "[", "gray", "circles", ",", "average", "of", "co", "-", "localization", "in", "~", "5", "cells", "in", "each", "image", "field", "]", ")", "compared", "to", "that", "in", "ApoE4", "ACM", "(", "n", "=", "18", "images", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4HeLa cells were transfected with plasmids to visualize ER (in green) and mitochondria (in red), and then were treated with ApoE3- and ApoE4-ACM for 24 hours. Shown is a box-and-whisker plot comparing co-localization in ApoE3 ACM (n = 15 images analyzed [gray circles, average of co-localization in ~5 cells in each image field]) compared to that in ApoE4 ACM (n = 18 images)."}
{"words": ["Figure", "1A", "Expression", "of", "transcripts", "coding", "for", "PI3K", "subunit", "genes", "in", "pDCs", "(", "n", "=", "12", "biological", "replicates", ")", ".", "In", "the", "boxplot", ",", "the", "middle", ",", "the", "bottom", ",", "and", "the", "top", "of", "the", "box", "represent", "the", "median", ",", "the", "1st", "quantile", "and", "the", "3rd", "quantile", ",", "respectively", ";", "the", "height", "of", "the", "box", "is", "given", "by", "the", "difference", "between", "the", "3rd", "and", "the", "1st", "quantiles", "(", "IQR", ",", "interquartile", "range", ")", ";", "the", "whiskers", "length", "is", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", ".", "Data", "points", "beyond", "the", "whiskers", "represent", "values", "more", "extreme", "than", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "above", "or", "below", "the", "3rd", "or", "the", "1st", "quantile", ",", "respectively", ".", "C", "Kyn", "levels", "in", "culture", "supernatants", "of", "pDCs", "incubated", "for", "24", "h", "with", "medium", "alone", "(", "Ctrl", ")", "or", "IFN", "-", "γ", "after", "1", "−", "h", "pretreatment", "with", "PI3K", "inhibitors", ".", "D", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "Ido1", "and", "Tgfb1", "transcripts", "in", "pDCs", "stimulated", "for", "18", "h", "with", "TGF", "-", "β", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "(", "Ctrl", ",", "control", ")", "of", "catalytic", "PI3K", "inhibitors", ",", "normalized", "to", "the", "expression", "of", "Gapdh", "and", "presented", "relative", "to", "results", "in", "untreated", "cells", "(", "dotted", "line", ",", "1", "-", "fold", ")", ".", "E", "In", "vivo", "suppression", "of", "the", "activity", "of", "HY", "-", "pulsed", "CD8", "−", "DCs", "in", "combination", "with", "a", "minority", "fraction", "(", "5", "%", ")", "of", "pDCs", "conditioned", "in", "vitro", "with", "TGF", "-", "β", "(", "or", "medium", ")", "for", "24", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "(", "Ctrl", ")", "of", "catalytic", "inhibitors", "as", "in", "C", ".", "Analysis", "of", "skin", "reactivity", "of", "recipient", "mice", "to", "the", "eliciting", "peptide", "at", "15", "days", "is", "presented", "as", "change", "in", "footpad", "weight", "(", "experimental", "versus", "control", "footpads", ")", ".", "F", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "Ido1", "and", "Tgfb1", "transcripts", "in", "pDCs", "transfected", "with", "p110α", "-", ",", "β", "-", ",", "δ", "-", "specific", ",", "or", "negative", "control", "(", "nc", ")", "siRNA", "and", "stimulated", "for", "18", "h", "with", "TGF", "-", "β", ",", "normalized", "to", "the", "expression", "of", "Gapdh", "and", "presented", "relative", "to", "results", "in", "unstimulated", "cells", "(", "dotted", "line", ",", "1", "-", "fold", ")", ".", "G", "In", "vivo", "suppression", "of", "the", "activity", "of", "HY", "-", "pulsed", "CD8", "−", "DCs", "in", "combination", "with", "a", "minority", "fraction", "(", "5", "%", ")", "of", "pDCs", "transfected", "with", "siRNA", "as", "in", "(", "F", ")", "and", "conditioned", "in", "vitro", "with", "TGF", "-", "β", "(", "or", "medium", ")", "for", "24", "h", ".", "Analysis", "of", "skin", "reactivity", "of", "recipient", "mice", "to", "the", "eliciting", "peptide", "at", "15", "days", "is", "presented", "as", "change", "in", "footpad", "weight", "(", "experimental", "versus", "control", "footpads", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Expression of transcripts coding for PI3K subunit genes in pDCs (n =12 biological replicates). In the boxplot, the middle, the bottom, and the top of the box represent the median, the 1st quantile and the 3rd quantile, respectively; the height of the box is given by the difference between the 3rd and the 1st quantiles (IQR, interquartile range); the whiskers length is 1.5 times the interquartile range. Data points beyond the whiskers represent values more extreme than 1.5 times the interquartile range above or below the 3rd or the 1st quantile, respectively.C Kyn levels in culture supernatants of pDCs incubated for 24 h with medium alone (Ctrl) or IFN-γ after 1−h pretreatment with PI3K inhibitors. D Real-time PCR analysis of Ido1 and Tgfb1 transcripts in pDCs stimulated for 18 h with TGF-β, in the presence or absence (Ctrl, control) of catalytic PI3K inhibitors, normalized to the expression of Gapdh and presented relative to results in untreated cells (dotted line, 1-fold). E In vivo suppression of the activity of HY-pulsed CD8− DCs in combination with a minority fraction (5%) of pDCs conditioned in vitro with TGF-β (or medium) for 24 h in the presence or absence (Ctrl) of catalytic inhibitors as in C. Analysis of skin reactivity of recipient mice to the eliciting peptide at 15 days is presented as change in footpad weight (experimental versus control footpads).F Real-time PCR analysis of Ido1 and Tgfb1 transcripts in pDCs transfected with p110α-, β-, δ-specific, or negative control (nc) siRNA and stimulated for 18 h with TGF-β, normalized to the expression of Gapdh and presented relative to results in unstimulated cells (dotted line, 1-fold). G In vivo suppression of the activity of HY-pulsed CD8− DCs in combination with a minority fraction (5%) of pDCs transfected with siRNA as in (F) and conditioned in vitro with TGF-β (or medium) for 24 h. Analysis of skin reactivity of recipient mice to the eliciting peptide at 15 days is presented as change in footpad weight (experimental versus control footpads). "}
{"words": ["Figure", "2C", "Pull", "-", "down", "(", "PD", ")", "assay", "of", "lysates", "from", "P1", ".", "HTR", "cells", "with", "unphosphorylated", "(", "YENM", ")", "and", "tyrosine", "-", "phosphorylated", "IDO1", "peptides", "(", "pYENM", ",", "pITIM1", ",", "and", "pITIM2", ")", ",", "analyzed", "by", "sequential", "immunoblotting", "with", "anti", "−", "p85", ",", "−", "SHP", "-", "1", ",", "and", "-", "SHP", "-", "2", "antibodies", ".", "D", "Immunoblotting", "with", "anti", "-", "IDO1", "and", "-", "p85", "antibodies", "of", "IDO1", "immunoprecipitates", "obtained", "from", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "or", "IDO1", ".", "Y149F", ".", "Mock", "-", "transfected", "P1", ".", "HTR", "cells", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "E", "Tyrosine", "phosphatase", "activity", "in", "anti", "-", "IDO1", "immunoprecipitates", "from", "lysates", "of", "P1", ".", "HTR", "transfectants", "as", "in", "D", ".", "F", "Kyn", "release", "over", "24", "h", "by", "P1", ".", "HTR", "transfectants", "as", "in", "D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C Pull-down (PD) assay of lysates from P1.HTR cells with unphosphorylated (YENM) and tyrosine-phosphorylated IDO1 peptides (pYENM, pITIM1, and pITIM2), analyzed by sequential immunoblotting with anti−p85, −SHP-1, and -SHP-2 antibodies.D Immunoblotting with anti-IDO1 and -p85 antibodies of IDO1 immunoprecipitates obtained from P1.HTR cells transfected with IDO1.WT or IDO1.Y149F. Mock-transfected P1.HTR cells were used as a control.E Tyrosine phosphatase activity in anti-IDO1 immunoprecipitates from lysates of P1.HTR transfectants as in D.F Kyn release over 24 h by P1.HTR transfectants as in D."}
{"words": ["Figure", "3A", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "either", "untransfected", "(", "Untr", ")", "or", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "(", "WT", ")", "or", "vector", "alone", "(", "Mock", ")", "and", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "B", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", ",", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "markers", "of", "intracellular", "organelles", "and", "structures", "(", "as", "indicated", ";", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "imagine", "is", "shown", "for", "all", "stainings", "or", "without", "DAPI", "(", "no", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "C", "Immunoblotting", "analysis", "of", "EE", "purified", "from", "P1", ".", "IDO1", ".", "WT", "cells", ".", "Mock", "-", "transfected", "cells", "as", "in", "A", "were", "used", "as", "control", ".", "D", "Distribution", "of", "the", "IDO1", ".", "WT", "protein", "expressed", "by", "P1", ".", "HTR", "transfected", "cells", "in", "isopycnic", "sucrose", "gradients", ".", "Fractions", "were", "immunoblotted", "using", "antibodies", "specific", "for", "IDO1", "and", "intracellular", "organelles", "or", "structures", "as", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Confocal immunofluorescence microscopy images of P1.HTR cells either untransfected (Untr) or transfected with IDO1.WT (WT) or vector alone (Mock) and stained with antibodies recognizing IDO1 (green). Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar, 20 µm.B Confocal immunofluorescence microscopy images of P1.HTR cells transfected with IDO1.WT, co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and markers of intracellular organelles and structures (as indicated; red). Nuclei were stained with DAPI (blue). The merge imagine is shown for all stainings or without DAPI (no DAPI). Scale bar, 10 µm.C Immunoblotting analysis of EE purified from P1.IDO1.WT cells. Mock-transfected cells as in A were used as control.D Distribution of the IDO1.WT protein expressed by P1.HTR transfected cells in isopycnic sucrose gradients. Fractions were immunoblotted using antibodies specific for IDO1 and intracellular organelles or structures as indicated."}
{"words": ["Figure", "4A", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "or", "IDO1", ".", "Y149F", "and", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "EEA1", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "imagine", "is", "shown", "for", "all", "stainings", "or", "without", "DAPI", "(", "no", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "B", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "of", "IDO1", "colocalization", "with", "EEA1", "in", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "as", "in", "A", ",", "with", "each", "point", "representing", "colocalization", "within", "an", "image", "stack", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "24", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "C", "Distribution", "of", "IDO1", ".", "WT", "and", "the", "IDO1", ".", "Y149F", "mutants", "in", "homogenates", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "along", "the", "isopycnic", "sucrose", "gradient", "as", "in", "Fig", "3D", ".", "Fractions", "were", "immunoblotted", "using", "antibodies", "specific", "for", "IDO1", ".", "D", "The", "distribution", "of", "IDO1", ".", "WT", "and", "IDO1", ".", "Y149F", "proteins", "along", "the", "isopycnic", "sucrose", "gradient", "is", "shown", "in", "term", "of", "densitometric", "analysis", "in", "each", "fraction", "(", "mean", "±", "SD", "of", "three", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Confocal immunofluorescence microscopy images of P1.HTR cells transfected with IDO1.WT or IDO1.Y149F and co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and EEA1 (red). Nuclei were stained with DAPI (blue). The merge imagine is shown for all stainings or without DAPI (no DAPI). Scale bar, 10 µm.B Pearson's coefficient of IDO1 colocalization with EEA1 in P1.HTR cells transfected as in A, with each point representing colocalization within an image stack. Data represent mean ± SD (n > 24 cells from three independent experiments). Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired Student's t-test. ***P < 0.001.C Distribution of IDO1.WT and the IDO1.Y149F mutants in homogenates of P1.HTR cells along the isopycnic sucrose gradient as in Fig 3D. Fractions were immunoblotted using antibodies specific for IDO1.D The distribution of IDO1.WT and IDO1.Y149F proteins along the isopycnic sucrose gradient is shown in term of densitometric analysis in each fraction (mean ± SD of three experiments)."}
{"words": ["Figure", "5", "A", "Pull", "-", "down", "assay", "of", "lysates", "from", "untransfected", "P1", ".", "HTR", "cells", "with", "unphosphorylated", "(", "YENM", ")", "and", "tyrosine", "-", "phosphorylated", "(", "pYENM", ")", "IDO1", "peptides", ",", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "p85", ",", "-", "p110α", ",", "-", "p110β", ",", "-", "p110γ", ",", "and", "-", "p110δ", "antibodies", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "were", "used", "as", "control", "of", "lysate", "amount", ".", "B", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "incubated", "with", "class", "IA", "PI3K", "p110", "isoform", "inhibitors", "(", "indicated", ")", "or", "medium", "alone", "(", "Ctrl", ")", "for", "24", "h", "and", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "EEA1", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "imagine", "is", "shown", "for", "all", "stainings", "or", "without", "DAPI", "(", "no", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "C", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "of", "IDO1", "colocalization", "with", "EEA1", "in", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "and", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ",", "with", "each", "point", "representing", "colocalization", "within", "an", "image", "stack", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "20", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "D", "Tyrosine", "phosphatase", "activity", "in", "anti", "-", "IDO1", "immunoprecipitates", "from", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "cells", "and", "treated", "with", "PI3K", "catalytic", "inhibitors", "(", "indicated", ")", "or", "medium", "alone", "(", "ctrl", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A Pull-down assay of lysates from untransfected P1.HTR cells with unphosphorylated (YENM) and tyrosine-phosphorylated (pYENM) IDO1 peptides, analyzed by immunoblotting with anti-p85, -p110α, -p110β, -p110γ, and -p110δ antibodies. Whole cell lysates (WCL) were used as control of lysate amount. B Confocal immunofluorescence microscopy images of P1.HTR cells transfected with IDO1.WT incubated with class IA PI3K p110 isoform inhibitors (indicated) or medium alone (Ctrl) for 24 h and co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and EEA1 (red). Nuclei were stained with DAPI (blue). The merge imagine is shown for all stainings or without DAPI (no DAPI). Scale bar, 10 µm.C Pearson's coefficient of IDO1 colocalization with EEA1 in P1.HTR cells transfected and treated as in (B), with each point representing colocalization within an image stack. Data represent mean ± SD (n > 20 cells from two independent experiments).D Tyrosine phosphatase activity in anti-IDO1 immunoprecipitates from P1.HTR cells transfected with IDO1.WT cells and treated with PI3K catalytic inhibitors (indicated) or medium alone (ctrl). Data represent the mean ± SD (n = 3 technical replicates)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "freshly", "purified", "pDCs", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "markers", "of", "intracellular", "organelles", "and", "structures", "(", "indicated", ";", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "imagine", "is", "shown", "for", "all", "stainings", "or", "without", "DAPI", "(", "no", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "B", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "pDCs", "incubated", "for", "24", "h", "with", "TGF", "-", "β", "or", "IFN", "-", "γ", "and", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "EEA1", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "C", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "of", "IDO1", "colocalization", "with", "EEA1", "in", "pDCs", "either", "untreated", "or", "stimulated", "with", "TGF", "-", "β", "or", "IFN", "-", "γ", "(", "as", "in", "B", ")", ",", "with", "each", "point", "representing", "colocalization", "within", "an", "image", "stack", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "20", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Confocal immunofluorescence microscopy images of freshly purified pDCs co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and markers of intracellular organelles and structures (indicated; red). Nuclei were stained with DAPI (blue). The merge imagine is shown for all stainings or without DAPI (no DAPI). Scale bar, 5 µm.B Confocal immunofluorescence microscopy images of pDCs incubated for 24 h with TGF-β or IFN-γ and co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and EEA1 (red). Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar, 5 µm. C Pearson's coefficient of IDO1 colocalization with EEA1 in pDCs either untreated or stimulated with TGF-β or IFN-γ (as in B), with each point representing colocalization within an image stack. Data represent mean ± SD (n > 20 cells from three independent experiments). "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "The", "Hippo", "WW", "domain", "-", "containing", "proteins", "show", "binding", "specificity", "to", "the", "known", "Hippo", "PY", "motif", "-", "containing", "proteins", ".", "TAP", "-", "MS", "analysis", "of", "a", "series", "of", "WW", "domain", "-", "containing", "proteins", "were", "performed", "and", "their", "binding", "with", "the", "indicated", "Hippo", "PY", "motif", "-", "containing", "proteins", "was", "summarized", "in", "a", "heatmap", ".", "(", "E", ")", "Validation", "of", "the", "binding", "specificity", "for", "the", "Hippo", "WW", "domain", "-", "containing", "proteins", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "SFB", "-", "tagged", "constructs", "and", "subjected", "to", "the", "pulldown", "assay", ".", "(", "F", ")", "Validation", "of", "the", "binding", "specificity", "for", "the", "derived", "WW", "domains", "from", "the", "Hippo", "WW", "domain", "-", "containing", "proteins", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "SFB", "-", "tagged", "constructs", "and", "subjected", "to", "the", "pulldown", "assay", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) The Hippo WW domain-containing proteins show binding specificity to the known Hippo PY motif-containing proteins. TAP-MS analysis of a series of WW domain-containing proteins were performed and their binding with the indicated Hippo PY motif-containing proteins was summarized in a heatmap.(E) Validation of the binding specificity for the Hippo WW domain-containing proteins. HEK293T cells were transfected with the indicated SFB-tagged constructs and subjected to the pulldown assay.(F) Validation of the binding specificity for the derived WW domains from the Hippo WW domain-containing proteins. HEK293T cells were transfected with the indicated SFB-tagged constructs and subjected to the pulldown assay."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", "-", "G", ")", "Validation", "of", "the", "identified", "9", "-", "amino", "acid", "sequence", "in", "determining", "the", "Hippo", "WW", "domain", "binding", "specificity", ".", "The", "requirement", "of", "the", "identified", "9", "-", "amino", "acid", "sequence", "for", "AMOT", "association", "was", "respectively", "examined", "for", "TAZ", "(", "C", ")", ",", "TAZ", "-", "WW", "domain", "(", "D", ")", ",", "KIBRA", "(", "E", ")", ",", "YAP", "(", "F", ")", "and", "SAV1", "(", "G", ")", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "SFB", "-", "tagged", "constructs", "and", "subjected", "to", "the", "pulldown", "assay", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C-G) Validation of the identified 9-amino acid sequence in determining the Hippo WW domain binding specificity. The requirement of the identified 9-amino acid sequence for AMOT association was respectively examined for TAZ (C), TAZ-WW domain (D), KIBRA (E), YAP (F) and SAV1 (G). HEK293T cells were transfected with the indicated SFB-tagged constructs and subjected to the pulldown assay."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "STXBP4", "forms", "a", "complex", "with", "several", "Hippo", "PY", "motif", "-", "containing", "proteins", ".", "Immunoprecipitation", "was", "performed", "with", "STXBP4", "antibody", ".", "(", "C", ")", "The", "identified", "9", "-", "amino", "acid", "sequence", "is", "required", "for", "the", "association", "between", "STXBP4", "and", "AMOT", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "STXBP4", "mutants", "and", "subjected", "to", "the", "pulldown", "assay", ".", "(", "E", ")", "The", "YAP", "-", "WW1", "/", "SMAD7", "-", "PY", "and", "STXBP4", "-", "WW", "/", "SMAD7", "-", "PY", "complexes", "show", "similar", "cumulative", "average", "trend", "and", "average", "binding", "free", "energy", "(", "∆", "G", ")", "within", "standard", "deviation", "(", "the", "shaded", "region", ")", "of", "one", "another", ".", "(", "F", ")", "Loss", "of", "STXBP4", "inhibits", "YAP", "phosphorylation", "and", "LATS", "activation", ".", "Western", "blotting", "was", "performed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Loss", "of", "STXBP4", "activates", "YAP", ".", "STXBP4", "deficiency", "promotes", "YAP", "nuclear", "translocation", "(", "G", ")", "Loss", "of", "STXBP4", "activates", "YAP", ".", "STXBP4", "deficiency", "promotes", "YAP", "downstream", "gene", "transcription", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "(", "H", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "I", ")", "WW", "domain", "is", "required", "for", "the", "STXBP4", "-", "mediated", "YAP", "cytoplasmic", "translocation", ".", "STXBP4", "KO", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "STXBP4", "constructs", "and", "immunofluorescent", "staining", "was", "performed", ".", "HA", "-", "positive", "cells", "(", "arrows", ")", "from", "~", "30", "different", "views", "(", "~", "200", "cells", "in", "total", ")", "were", "randomly", "selected", "and", "quantified", "for", "YAP", "localization", ".", "Percentage", "of", "HA", "-", "positive", "cells", "with", "nuclear", "YAP", "enrichment", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "J", ")", "Loss", "of", "STXBP4", "attenuates", "YAP", "phosphorylation", "as", "induced", "by", "actin", "cytoskeleton", "inhibition", ".", "The", "indicated", "cells", "were", "subjected", "to", "serum", "starvation", "(", "treatment", "with", "no", "-", "serum", "medium", "for", "12", "hours", ")", ",", "glucose", "starvation", "(", "treatment", "with", "no", "-", "glucose", "medium", "for", "6", "hours", ")", "or", "actin", "inhibition", "(", "treatment", "with", "0", ".", "5", "μg", "/", "mL", "latrunculin", "B", "or", "5", "μM", "blebbistatin", "for", "30", "min", ")", ".", "YAP", "phosphorylation", "was", "detected", "using", "phospho", "-", "tag", "gel", ",", "where", "the", "YAP", "phosphorylation", "level", "was", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) STXBP4 forms a complex with several Hippo PY motif-containing proteins. Immunoprecipitation was performed with STXBP4 antibody.(C) The identified 9-amino acid sequence is required for the association between STXBP4 and AMOT. HEK293T cells were transfected with the indicated STXBP4 mutants and subjected to the pulldown assay.(E) The YAP-WW1/SMAD7-PY and STXBP4-WW/SMAD7-PY complexes show similar cumulative average trend and average binding free energy (∆G) within standard deviation (the shaded region) of one another.(F) Loss of STXBP4 inhibits YAP phosphorylation and LATS activation. Western blotting was performed with the indicated antibodies.Loss of STXBP4 activates YAP. STXBP4 deficiency promotes YAP nuclear translocation (G)Loss of STXBP4 activates YAP. STXBP4 deficiency promotes YAP downstream gene transcription (mean ± s.d., n=3 biological replicates) (H). Scale bar, 20 μm.*** p < 0.001 (Student's t-test).(I) WW domain is required for the STXBP4-mediated YAP cytoplasmic translocation. STXBP4 KO cells were transfected with the indicated STXBP4 constructs and immunofluorescent staining was performed. HA-positive cells (arrows) from ~30 different views (~200 cells in total) were randomly selected and quantified for YAP localization. Percentage of HA-positive cells with nuclear YAP enrichment is shown. Scale bar, 20 μm.(J) Loss of STXBP4 attenuates YAP phosphorylation as induced by actin cytoskeleton inhibition. The indicated cells were subjected to serum starvation (treatment with no-serum medium for 12 hours), glucose starvation (treatment with no-glucose medium for 6 hours) or actin inhibition (treatment with 0.5 μg/mL latrunculin B or 5 μM blebbistatin for 30 min). YAP phosphorylation was detected using phospho-tag gel, where the YAP phosphorylation level was indicated."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "STXBP4", "forms", "a", "protein", "complex", "with", "α", "-", "catenin", "and", "a", "group", "of", "Hippo", "pathway", "proteins", ".", "(", "C", ")", "STXBP4", "promotes", "the", "association", "of", "α", "-", "catenin", "with", "AMOT", "and", "LATS1", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "SFB", "-", "tagged", "constructs", "and", "subjected", "to", "the", "pulldown", "assay", ".", "(", "D", ")", "Loss", "of", "STXBP4", "diminishes", "the", "association", "of", "α", "-", "catenin", "with", "AMOT", ",", "LATS1", "and", "YAP", ".", "HEK293A", "and", "STXBP4", "KO", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "SFB", "-", "tagged", "α", "-", "catenin", "construct", "and", "subjected", "to", "the", "pulldown", "assay", ".", "(", "E", ")", "STXBP4", "induces", "the", "co", "-", "localization", "between", "α", "-", "catenin", "and", "AMOT", "as", "well", "as", "LATS1", "and", "YAP", ".", "HEK293A", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", "and", "immunofluorescence", "was", "performed", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Identification", "of", "several", "STXBP4", "missense", "mutations", "that", "disrupt", "its", "interaction", "with", "α", "-", "catenin", "and", "AMOT", ".", "The", "identified", "missense", "mutations", "respectively", "disrupted", "the", "STXBP4", "-", "α", "-", "catenin", "(", "G", ")", "and", "STXBP4", "-", "AMOT", "(", "H", ")", "complex", "formation", ".", "(", "I", ")", "Inhibition", "of", "actin", "cytoskeleton", "promotes", "the", "STXBP4", "-", "associated", "protein", "complex", "formation", ".", "HEK293A", "and", "the", "STXBP4", "KO", "cells", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "using", "pre", "-", "immune", "serum", "and", "anti", "-", "STXBP4", "serum", "under", "the", "indicated", "treatments", ".", "(", "J", ")", "The", "missense", "mutations", "of", "STXBP4", "(", "F", ")", "diminished", "the", "ability", "of", "STXBP4", "to", "rescue", "YAP", "phosphorylation", "in", "the", "STXBP4", "KO", "cells", "with", "low", "actin", "cytoskeleton", "tension", ".", "YAP", "phosphorylation", "was", "detected", "using", "phospho", "-", "tag", "gel", ",", "where", "the", "YAP", "phosphorylation", "level", "was", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) STXBP4 forms a protein complex with α-catenin and a group of Hippo pathway proteins.(C) STXBP4 promotes the association of α-catenin with AMOT and LATS1. HEK293T cells were transfected with the indicated SFB-tagged constructs and subjected to the pulldown assay.(D) Loss of STXBP4 diminishes the association of α-catenin with AMOT, LATS1 and YAP. HEK293A and STXBP4 KO cells were transfected with the SFB-tagged α-catenin construct and subjected to the pulldown assay.(E) STXBP4 induces the co-localization between α-catenin and AMOT as well as LATS1 and YAP. HEK293A cells were transfected with the indicated constructs and immunofluorescence was performed. Scale bar, 20 μm.Identification of several STXBP4 missense mutations that disrupt its interaction with α-catenin and AMOT. The identified missense mutations respectively disrupted the STXBP4- α-catenin (G) and STXBP4-AMOT (H) complex formation.(I) Inhibition of actin cytoskeleton promotes the STXBP4-associated protein complex formation. HEK293A and the STXBP4 KO cells were subjected to immunoprecipitation using pre-immune serum and anti-STXBP4 serum under the indicated treatments.(J) The missense mutations of STXBP4 (F) diminished the ability of STXBP4 to rescue YAP phosphorylation in the STXBP4 KO cells with low actin cytoskeleton tension. YAP phosphorylation was detected using phospho-tag gel, where the YAP phosphorylation level was indicated."}
{"words": ["Figure", "5STXBP4", "is", "downregulated", "in", "human", "kidney", "cancer", ".", "The", "mRNA", "level", "of", "STXBP4", "is", "analyzed", "in", "the", "Firebrowse", "web", "database", "(", "A", ")", ",", "where", "14", ",", "729", "tumor", "sample", "data", "generated", "by", "TCGA", "were", "included", ".", "The", "first", "quartile", ",", "median", "and", "third", "quartile", "values", "were", "indicated", "as", "the", "boxplots", ".", "Outliers", "were", "plotted", "as", "individual", "points", ".", "Error", "bars", "indicated", "the", "standard", "deviation", "above", "and", "below", "the", "mean", "of", "the", "data", ".", "STXBP4", "is", "downregulated", "in", "human", "kidney", "cancer", ".", "The", "expression", "of", "STXBP4", "was", "also", "examined", "using", "kidney", "tissue", "microarray", ",", "where", "percentage", "of", "the", "indicated", "tissue", "samples", "with", "downregulated", "STXBP4", "was", "shown", "(", "B", ")", ".", "The", "p", "value", "was", "calculated", "by", "using", "the", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "of", "overall", "survival", "of", "patients", "with", "ccRCC", "is", "stratified", "by", "STXBP4", "expression", "level", ".", "Clinical", "data", "of", "STXBP4", "were", "analyzed", "in", "TCGA", "-", "KIRC", "project", "containing", "total", "611", "patient", "samples", ".", "The", "p", "value", "was", "calculated", "by", "using", "the", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ".", "(", "D", ")", "Immunohistochemical", "staining", "of", "STXBP4", "and", "YAP", "were", "performed", "in", "a", "kidney", "cancer", "tissue", "microarray", ",", "where", "the", "indicated", "regions", "in", "the", "box", "were", "shown", "three", "times", "enlarged", ".", "Brown", "staining", "indicates", "positive", "immunoreactivity", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "E", ")", "Correlation", "analyses", "between", "STXBP4", "and", "YAP", "in", "human", "normal", "kidney", "and", "clear", "cell", "carcinoma", "samples", "are", "shown", "as", "tables", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "chi", "-", "square", "test", ".", "R", ",", "correlation", "coefficient", ".", "N", ",", "nuclear", "localization", ".", "C", ",", "cytoplasmic", "localization", ".", "(", "F", ")", "STXBP4", "expression", "is", "examined", "in", "a", "panel", "of", "ccRCC", "cell", "lines", "by", "Western", "Blotting", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "Both", "the", "association", "with", "α", "-", "catenin", "and", "the", "functional", "WW", "domain", "are", "required", "for", "the", "STXBP4", "'", "s", "tumor", "suppressive", "function", "in", "786", "-", "O", "cells", ".", "Overexpression", "of", "STXBP4", ",", "but", "not", "the", "indicated", "STXBP4", "missense", "mutants", ",", "significantly", "suppressed", "the", "786", "-", "O", "cell", "xenograft", "tumor", "formation", ".", "Xenograft", "tumors", "are", "shown", "in", "(", "G", ")", ",", "and", "the", "tumor", "weight", "is", "quantified", "in", "(", "H", ")", "(", "n", "=", "5", "mice", ",", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "cm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5STXBP4 is downregulated in human kidney cancer. The mRNA level of STXBP4 is analyzed in the Firebrowse web database (A), where 14,729 tumor sample data generated by TCGA were included. The first quartile, median and third quartile values were indicated as the boxplots. Outliers were plotted as individual points. Error bars indicated the standard deviation above and below the mean of the data.STXBP4 is downregulated in human kidney cancer. The expression of STXBP4 was also examined using kidney tissue microarray, where percentage of the indicated tissue samples with downregulated STXBP4 was shown (B). The p value was calculated by using the paired Student's t-test.(C) Kaplan-Meier curves of overall survival of patients with ccRCC is stratified by STXBP4 expression level. Clinical data of STXBP4 were analyzed in TCGA-KIRC project containing total 611 patient samples. The p value was calculated by using the Log-rank (Mantel-Cox) test.(D) Immunohistochemical staining of STXBP4 and YAP were performed in a kidney cancer tissue microarray, where the indicated regions in the box were shown three times enlarged. Brown staining indicates positive immunoreactivity. Scale bar, 100 μm.(E) Correlation analyses between STXBP4 and YAP in human normal kidney and clear cell carcinoma samples are shown as tables. Statistical significance was determined by chi-square test. R, correlation coefficient. N, nuclear localization. C, cytoplasmic localization.(F) STXBP4 expression is examined in a panel of ccRCC cell lines by Western Blotting.(G and H) Both the association with α-catenin and the functional WW domain are required for the STXBP4's tumor suppressive function in 786-O cells. Overexpression of STXBP4, but not the indicated STXBP4 missense mutants, significantly suppressed the 786-O cell xenograft tumor formation. Xenograft tumors are shown in (G), and the tumor weight is quantified in (H) (n = 5 mice, mean ± s.d.). ** p < 0.01 (Student's t-test). Scale bar, 1 cm."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "RT", "-", "qPCR", "(", "n", "=", "3", "-", "12", "biological", "replicates", ")", "analyses", "of", "CGN", "expression", "in", "different", "mouse", "organs", "at", "P21", ".", "B", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "CGN", "expression", "in", "different", "mouse", "organs", "at", "P21", ".", "G", ".", "Whole", "mount", "immunofluorescence", "of", "CGN", "expression", "in", "P3", ",", "P14", "and", "P21", "mouse", "cochlea", "coimmunostained", "with", "cuticular", "plate", "marker", "LMO7", "(", "G", ")", ".", "CGN", "expression", "levels", "at", "the", "cuticular", "plates", "were", "normalized", "to", "LMO7", "immunofluorescent", "signals", "(", "n", "=", "130", "-", "193", "hair", "cells", "from", "3", "-", "4", "cochleae", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, RT-qPCR (n = 3-12 biological replicates) analyses of CGN expression in different mouse organs at P21.B. Western blot analyses of CGN expression in different mouse organs at P21.G. Whole mount immunofluorescence of CGN expression in P3, P14 and P21 mouse cochlea coimmunostained with cuticular plate marker LMO7 (G). CGN expression levels at the cuticular plates were normalized to LMO7 immunofluorescent signals (n = 130-193 hair cells from 3-4 cochleae). Data information: Data are presented as mean ± SEM; one-way ANOVA was used * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 and **** P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "MDCK", "cells", "expressing", "WT", "or", "mutant", "CGN", "were", "immunolabeled", "with", "CGN", "or", "Flag", "antibodies", ".", "D", ".", "RT", "-", "qPCR", "of", "CGN", "expression", "in", "transfected", "MDCK", "cells", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "in", "(", "D", ")", ".", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. MDCK cells expressing WT or mutant CGN were immunolabeled with CGN or Flag antibodies.D. RT-qPCR of CGN expression in transfected MDCK cells (n = 3 biological replicates). Data information: Data are presented as mean ± SEM; unpaired Student's t-test was used in (D). ns, not significant, P > 0.05."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "C", ".", "DPOAE", "thresholds", "(", "A", ")", ",", "ABR", "thresholds", "(", "B", ")", "and", "ABR", "P1", "amplitudes", "(", "C", ")", "of", "the", "2", "-", "month", "old", "control", "(", "Cgnfl", "/", "fl", ")", "and", "Cgn", "-", "cKO", "(", "Cgnfl", "/", "fl", ";", "Pou4f3creER", "/", "+", ")", "mice", ".", "Control", "mice", "(", "circle", ")", ",", "n", "=", "16", "mice", "(", "female", "=", "8", ",", "male", "=", "8", ")", ";", "Cgn", "-", "cKO", "mice", "(", "square", ")", ",", "n", "=", "19", "mice", "(", "female", "=", "11", ",", "male", "=", "8", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "D", "-", "I", ".", "Growth", "curves", "of", "ABR", "P1", "amplitudes", "at", "different", "cochlear", "frequencies", "(", "5", ".", "6", "-", "32", "kHz", ")", "of", "the", "2", "-", "month", "old", "control", "and", "Cgn", "-", "cKO", "mice", ".", "Control", "mice", "(", "circle", ")", ",", "n", "=", "16", "mice", "(", "female", "=", "8", ",", "male", "=", "8", ")", ";", "Cgn", "-", "cKO", "mice", "(", "square", ")", ",", "n", "=", "19", "mice", "(", "female", "=", "11", ",", "male", "=", "8", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "J", ".", "Whole", "mount", "immunofluorescence", "of", "the", "organ", "of", "Corti", "from", "2", "-", "month", "old", "control", "and", "Cgn", "-", "cKO", "mice", ".", "Phalloidin", "(", "F", "-", "actin", ",", "magenta", ")", ";", "Myosin7a", "(", "hair", "cells", ",", "green", ")", ".", "White", "arrows", "label", "the", "lost", "OHCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-C. DPOAE thresholds (A), ABR thresholds (B) and ABR P1 amplitudes (C) of the 2-month old control (Cgnfl/fl) and Cgn-cKO (Cgnfl/fl;Pou4f3creER/+) mice. Control mice (circle), n = 16 mice (female = 8, male = 8); Cgn-cKO mice (square), n = 19 mice (female = 11, male = 8). Data information: Data are presented as mean ± SEM; two-way ANOVA was used * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 and **** P < 0.0001.D-I. Growth curves of ABR P1 amplitudes at different cochlear frequencies (5.6 - 32 kHz) of the 2-month old control and Cgn-cKO mice. Control mice (circle), n = 16 mice (female = 8, male = 8); Cgn-cKO mice (square), n = 19 mice (female = 11, male = 8). Data information: Data are presented as mean ± SEM; two-way ANOVA was used * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 and **** P < 0.0001.J. Whole mount immunofluorescence of the organ of Corti from 2-month old control and Cgn-cKO mice. Phalloidin (F-actin, magenta); Myosin7a (hair cells, green). White arrows label the lost OHCs."}
{"words": ["Figure", "5C", ".", "Whole", "mount", "immunofluorescence", "of", "CGN", "expression", "in", "organ", "of", "Corti", "from", "P21", "CgndelG", "mouse", ".", "D", "-", "I", ".", "DPOAE", "thresholds", "(", "D", ",", "E", ")", ",", "ABR", "thresholds", "(", "F", ",", "G", ")", ",", "and", "ABR", "P1", "amplitudes", "at", "32", "kHz", "(", "H", ",", "I", ")", "of", "2", "-", "month", "old", "(", "D", ",", "F", ",", "H", ")", "or", "6", "-", "month", "old", "(", "E", ",", "G", ",", "I", ")", "CgndelG", "mice", ".", "Control", "Cgn", "+", "/", "+", "mice", "(", "circle", ")", ",", "n", "=", "3", "mice", "(", "2", "-", "month", ",", "female", "=", "1", ",", "male", "=", "2", ")", "or", "15", "mice", "(", "6", "-", "month", ",", "female", "=", "4", ",", "male", "=", "11", ")", ";", "CgndelG", "/", "+", "mice", "(", "triangle", ")", ",", "n", "=", "8", "mice", "(", "2", "-", "month", ",", "female", "=", "4", ",", "male", "=", "4", ")", "or", "20", "mice", "(", "6", "-", "month", ",", "female", "=", "9", ",", "male", "=", "11", ")", ";", "CgndelG", "/", "delG", "mice", "(", "square", ")", ",", "n", "=", "7", "mice", "(", "2", "-", "month", ",", "female", "=", "4", ",", "male", "=", "3", ")", "or", "16", "mice", "(", "6", "-", "month", ",", "female", "=", "6", ",", "male", "=", "10", ")", ".", "Cgn", "+", "/", "+", "vs", "CgndelG", "/", "delG", ",", "*", "(", "red", ")", ";", "Cgn", "+", "/", "+", "vs", "CgndelG", "/", "+", ",", "*", "(", "green", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "J", ".", "Whole", "mount", "immunofluorescence", "of", "the", "organ", "of", "Corti", "from", "7", "-", "month", "old", "CgndelG", "mice", ".", "White", "arrows", "indicate", "lost", "OHCs", "by", "F", "-", "actin", "labeling", "(", "Phalloidin", ")", ".", "K", ".", "Percentage", "of", "OHC", "loss", "in", "7", "-", "month", "old", "CgndelG", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "8", "biological", "replicates", "from", "3", "cochleae", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C. Whole mount immunofluorescence of CGN expression in organ of Corti from P21 CgndelG mouse.D-I. DPOAE thresholds (D, E), ABR thresholds (F, G), and ABR P1 amplitudes at 32 kHz (H, I) of 2-month old (D, F, H) or 6-month old (E, G, I) CgndelG mice. Control Cgn+/+ mice (circle), n = 3 mice (2-month, female = 1, male = 2) or 15 mice (6-month, female = 4, male = 11); CgndelG/+ mice (triangle), n = 8 mice (2-month, female = 4, male = 4) or 20 mice (6-month, female = 9, male = 11); CgndelG/delG mice (square), n = 7 mice (2-month, female = 4, male = 3) or 16 mice (6-month, female = 6, male = 10). Cgn+/+ vs CgndelG/delG, * (red); Cgn+/+ vs CgndelG/+, * (green). Data information: Data are presented as mean ± SEM; two-way ANOVA was used * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 and **** P < 0.0001.J. Whole mount immunofluorescence of the organ of Corti from 7-month old CgndelG mice. White arrows indicate lost OHCs by F-actin labeling (Phalloidin).K. Percentage of OHC loss in 7-month old CgndelG mice (n = 3-8 biological replicates from 3 cochleae). Data information: Data are presented as mean ± SEM; two-way ANOVA was used * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 and **** P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "6F", ".", "Percentage", "of", "OHC", "loss", "in", "noise", "exposed", "CgndelG", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "9", "cochleae", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "in", "(", "F", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6F. Percentage of OHC loss in noise exposed CgndelG mice (n = 5-9 cochleae). Data information: Data are presented as mean ± SEM; one-way ANOVA was used in (F). ** P < 0.01, *** P < 0.001 and **** P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "7Whole", "mount", "immunofluorescence", "with", "LMO7", "antibody", "on", "2", "-", "month", "old", "CgndelG", "mice", "at", "32", "kHz", "cochlear", "regionWhole", "mount", "immunofluorescence", "with", "Spectrin", "β", "II", "antibody", "on", "2", "-", "month", "old", "CgndelG", "mice", "at", "32", "kHz", "cochlear"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Whole mount immunofluorescence with LMO7 antibody on 2-month old CgndelG mice at 32 kHz cochlear regionWhole mount immunofluorescence with Spectrin β II antibody on 2-month old CgndelG mice at 32 kHz cochlear region"}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "Low", "-", "magnification", "SEM", "images", "of", "hair", "bundles", "from", "2", "-", "month", "old", "Cgn", "+", "/", "+", "and", "CgndelG", "/", "delG", "mice", ".", "B", ".", "High", "-", "magnification", "SEM", "images", "of", "IHC", "hair", "bundles", "from", "2", "-", "month", "old", "Cgn", "+", "/", "+", "and", "CgndelG", "/", "delG", "mice", ".", "C", ".", "High", "-", "magnification", "SEM", "images", "of", "OHC", "hair", "bundles", "from", "2", "-", "month", "old", "Cgn", "+", "/", "+", "and", "CgndelG", "/", "delG", "mice", ".", "Shown", "are", "hair", "bundles", "of", "the", "second", "-", "row", "OHCs", "(", "OHC2", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. Low-magnification SEM images of hair bundles from 2-month old Cgn+/+ and CgndelG/delG mice. B. High-magnification SEM images of IHC hair bundles from 2-month old Cgn+/+ and CgndelG/delG mice. C. High-magnification SEM images of OHC hair bundles from 2-month old Cgn+/+ and CgndelG/delG mice. Shown are hair bundles of the second-row OHCs (OHC2)."}
{"words": ["Figure", "1A", "WT", "MDFs", "were", "treated", "±", "TSI", "individually", "or", "in", "combination", "for", "3", "hrs", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "and", "UBA", "-", "pull", "down", "(", "UBA", "-", "PD", ")", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Samples", "of", "UBA", "-", "pull", "down", "in", "following", "figures", "were", "analysed", "in", "the", "same", "way", "unless", "otherwise", "indicated", ".", "B", "WT", ",", "Ripk3", "-", "/", "-", ",", "Mlkl", "-", "/", "-", ",", "Tnfr1", "-", "/", "-", "and", "Traf2", "-", "/", "-", "MDFs", "were", "untreated", "(", "UT", ")", "or", "treated", "with", "TSI", "for", "3", "hrs", ".", "Nec", "-", "1", "and", "GSK872", "were", "added", "to", "inhibit", "RIPK1", "and", "RIPK3", "kinase", "activities", "respectively", ".", "E", "RIPK3", "-", "gyrase", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Ripk3", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", "(", "dox", ")", "for", "5", "hrs", ",", "and", "cells", "were", "then", "treated", "±", "combination", "of", "TSI", ",", "or", "coumermycin", "(", "coum", ")", "for", "3", "hrs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A WT MDFs were treated ± TSI individually or in combination for 3 hrs. Whole cell lysates (WCL) and UBA-pull down (UBA-PD) fractions were analysed by Western blot and probed with antibodies as indicated. Representative of three independent experiments. Samples of UBA-pull down in following figures were analysed in the same way unless otherwise indicated.B WT, Ripk3-/-, Mlkl-/-, Tnfr1-/- and Traf2-/- MDFs were untreated (UT) or treated with TSI for 3 hrs. Nec-1 and GSK872 were added to inhibit RIPK1 and RIPK3 kinase activities respectively.E RIPK3-gyrase were inducibly expressed in Ripk3-/- MDFs by doxycycline (dox) for 5 hrs, and cells were then treated ± combination of TSI, or coumermycin (coum) for 3 hrs."}
{"words": ["Figure", "2B", "UBA", "-", "pull", "down", "from", "WT", "MDFs", "treated", "with", "TSI", "for", "3", "hrs", "were", "subjected", "to", "the", "DUBs", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Beads", "eluates", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "1", ".", "4", "mL", "cleared", "cell", "lysate", "from", "4", "x", "106", "TSI", "-", "treated", "WT", "MDFs", "was", "split", "into", "three", "parts", "of", "the", "indicated", "volume", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", "and", "DUB", "incubation", ".", "Bead", "eluates", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B UBA-pull down from WT MDFs treated with TSI for 3 hrs were subjected to the DUBs shown in (A). Beads eluates were analysed by Western blot and probed with antibodies as indicated. Representative of three independent experiments.C 1.4 mL cleared cell lysate from 4 x 106 TSI-treated WT MDFs was split into three parts of the indicated volume, followed by UBA-pull down and DUB incubation. Bead eluates were analysed by Western blot and probed with the indicated antibodies. Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3A", "WT", "MDFs", "were", "treated", "with", "TSI", "for", "indicated", "time", ".", "Cells", "were", "fractionated", "into", "cytosol", "and", "crude", "membrane", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", ".", "All", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "WT", "USP21", "-", "CaaX", "and", "USP21C221R", "-", "CaaX", "(", "CR", ")", "were", "inducibly", "expressed", "in", "WT", "MDFs", "by", "doxycycline", "for", "5", "hrs", ".", "Ubiquitylated", "proteins", "were", "enriched", "followed", "by", "TSI", "stimulation", "and", "cellular", "fractionation", ".", "All", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A WT MDFs were treated with TSI for indicated time. Cells were fractionated into cytosol and crude membrane, followed by UBA-pull down. All fractions were analysed by Western blot and probed with antibodies as indicated. Representative of three independent experiments.B WT USP21-CaaX and USP21C221R-CaaX (CR) were inducibly expressed in WT MDFs by doxycycline for 5 hrs. Ubiquitylated proteins were enriched followed by TSI stimulation and cellular fractionation. All fractions were analysed by Western blot and probed with antibodies as indicated. Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4A", "WT", "and", "R105AD106A", "mutant", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", ",", "at", "the", "same", "time", "cells", "were", "untreated", "(", "UT", ")", "or", "treated", "with", "TSQ", "for", "6", "hrs", ".", "Cells", "were", "fractionated", "into", "cytosol", "(", "C", ")", "and", "crude", "membrane", "(", "M", ")", ".", "Fractions", "were", "analysed", "by", "BN", "-", "or", "SDS", "-", "PAGE", ",", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "Cell", "lysates", "from", "(", "A", ")", "were", "subjected", "to", "UBA", "-", "pull", "down", "and", "analysed", "as", "described", "above", ".", "E", "HT29", "cells", "were", "stimulated", "with", "TSI", ",", "±", "NSA", "(", "500", "nM", ")", ",", "or", "left", "untreated", "(", "UT", ")", "for", "16", "hrs", ",", "followed", "by", "cellular", "fractionation", ".", "Fractions", "were", "analysed", "by", "BN", "-", "or", "SDS", "-", "PAGE", ",", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "F", "Cell", "lysates", "from", "(", "E", ")", "were", "subjected", "to", "UBA", "-", "pulldown", "and", "analysed", "as", "described", "above", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A WT and R105AD106A mutant MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline, at the same time cells were untreated (UT) or treated with TSQ for 6 hrs. Cells were fractionated into cytosol (C) and crude membrane (M). Fractions were analysed by BN- or SDS-PAGE, Western blot and probed with the indicated antibodies. Representative of three independent experiments. B Cell lysates from (A) were subjected to UBA-pull down and analysed as described above.E HT29 cells were stimulated with TSI, ± NSA (500 nM), or left untreated (UT) for 16 hrs, followed by cellular fractionation. Fractions were analysed by BN- or SDS-PAGE, Western blot and probed with the indicated antibodies. Representative of three independent experiments. F Cell lysates from (E) were subjected to UBA-pulldown and analysed as described above."}
{"words": ["Figure", "5A", "WT", "and", "E109AE110A", "mutant", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", ",", "cells", "were", "untreated", "or", "treated", "with", "TSQ", "for", "6", "hrs", "(", "please", "note", "that", "the", "same", "WT", "control", "was", "used", "in", "Fig", ".", "EV3A", ")", ".", "Cell", "death", "was", "measured", "by", "PI", "staining", "based", "on", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "Cellular", "fractions", "from", "(", "A", ")", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "from", "BN", "-", "PAGE", "or", "SDS", "-", "PAGE", "using", "antibodies", "as", "indicated", ".", "The", "same", "WT", "control", "was", "used", "in", "Fig", ".", "4A", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "Cell", "lysates", "from", "(", "A", ")", "were", "subjected", "to", "UBA", "-", "pull", "down", "and", "analysed", "as", "described", "above", ".", "D", "N", "-", "FLAG", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", "overnight", ",", "and", "cells", "were", "treated", "with", "TSI", "for", "indicated", "time", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", "N", "-", "FLAG", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", "for", "16", "hrs", ".", "Cells", "were", "stimulated", "±", "TSI", "for", "3", "hrs", "after", "withdrawal", "of", "doxycycline", ".", "Then", "TSI", "medium", "was", "removed", "and", "replaced", "to", "medium", "containing", "inhibitors", "Bafilomycin", "A1", "(", "BAF", ")", ",", "PS341", "(", "PS", ")", "or", "left", "untreated", "(", "UT", ")", ".", "IDN", "-", "6556", "was", "added", "to", "all", "conditions", "to", "block", "apoptosis", ".", "Cells", "were", "collected", "0", ",", "2", ",", "4", ",", "6", "hrs", "after", "medium", "replacement", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A WT and E109AE110A mutant MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline, cells were untreated or treated with TSQ for 6 hrs (please note that the same WT control was used in Fig. EV3A). Cell death was measured by PI staining based on flow cytometry. Data are plotted as mean ± SEM of three independent experiments. B Cellular fractions from (A) were analysed by Western blot from BN-PAGE or SDS-PAGE using antibodies as indicated. The same WT control was used in Fig. 4A. Representative of three independent experiments. C Cell lysates from (A) were subjected to UBA-pull down and analysed as described above.D N-FLAG MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline overnight, and cells were treated with TSI for indicated time, followed by UBA-pull down. Representative of three independent experiments. E N-FLAG MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline for 16 hrs. Cells were stimulated ± TSI for 3 hrs after withdrawal of doxycycline. Then TSI medium was removed and replaced to medium containing inhibitors Bafilomycin A1 (BAF), PS341 (PS) or left untreated (UT). IDN-6556 was added to all conditions to block apoptosis. Cells were collected 0, 2, 4, 6 hrs after medium replacement, followed by UBA-pull down. Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6B", "WT", "and", "4KR", "mutant", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", "for", "6", "hrs", "and", "cells", "were", "untreated", "(", "UT", ")", "or", "treated", "with", "TSI", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B WT and 4KR mutant MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline for 6 hrs and cells were untreated (UT) or treated with TSI, followed by UBA-pull down. Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7D", "MLKL", "-", "/", "-", "HT29", "cells", "stably", "transfected", "with", "constructs", "encoding", "human", "MLKL", "-", "USP21", "and", "MLKL", "-", "USP21C221R", ",", "were", "treated", "with", "doxycycline", ",", "NSA", "(", "1", "μM", ")", ",", "TSI", "or", "combinations", "thereof", "(", "added", "simultaneously", ")", ".", "Sytox", "Green", "positive", "cells", "were", "quantified", "in", "real", "time", "by", "live", "cell", "imaging", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "six", "independent", "experiments", ".", "(", "A", "red", "dashed", "line", "is", "shown", "to", "highlight", "the", "delay", "in", "death", "kinetics", "upon", "treatment", "with", "NSA", ")", ".", "E", "Human", "MLKL", "-", "USP21", "and", "MLKL", "-", "USP21C221R", "were", "inducibly", "expressed", "in", "MLKL", "-", "/", "-", "HT29", "cells", "by", "doxycycline", "(", "10", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hrs", ",", "TSI", "was", "added", "for", "the", "indicated", "times", "but", "all", "samples", "were", "collected", "25", "hrs", "post", "-", "induction", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pulldown", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7D MLKL-/- HT29 cells stably transfected with constructs encoding human MLKL-USP21 and MLKL-USP21C221R, were treated with doxycycline, NSA (1 μM), TSI or combinations thereof (added simultaneously). Sytox Green positive cells were quantified in real time by live cell imaging. Data are plotted as mean ± SEM of six independent experiments. (A red dashed line is shown to highlight the delay in death kinetics upon treatment with NSA). E Human MLKL-USP21 and MLKL-USP21C221R were inducibly expressed in MLKL-/- HT29 cells by doxycycline (10 ng/mL) for 16 hrs, TSI was added for the indicated times but all samples were collected 25 hrs post-induction, followed by UBA-pulldown . Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3B", "Inhibition", "zone", "-", "based", "assay", "for", "synergy", "between", "AMSIN", "and", "HNP1", "&", "2", "or", "lysozyme", "C", "(", "abbreviated", "as", "hLZc", ")", "to", "the", "two", "oral", "Streptococcus", "(", "SSAN", "and", "SSAL", ")", ".", "Inset", "(", "upper", "panel", ",", "boxed", ")", ",", "a", "representative", "example", "of", "the", "inhibition", "-", "zone", "test", "showing", "the", "synergy", ".", "Peptide", "doses", "used", "here", "were", "0", ".", "05", "nmol", "/", "well", "for", "HNP1", "&", "2", "and", "hLZc", "at", "which", "no", "visible", "inhibition", "zones", "were", "observed", "for", "both", "of", "them", ".", "At", "the", "same", "dose", ",", "AMSIN", "produced", "a", "small", "inhibition", "zone", ".", "For", "synergetic", "observation", ",", "two", "peptides", "were", "applied", "to", "the", "same", "well", "according", "to", "the", "doses", "indicated", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "is", "displayed", ".", "P", "values", "were", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Note", ":", "the", "nanomolar", "concentration", "of", "HNP1", "&", "2", "was", "calculated", "from", "the", "average", "molecular", "weight", "of", "HNP1", "and", "HNP2", ".", "C", "The", "FIC", "index", "assay", "for", "synergy", "between", "AMSIN", "and", "HNP1", "&", "2", "or", "hLZc", "to", "SSAL", "and", "SSAN", ".", "The", "dashed", "line", "represents", "the", "cutoff", "of", "the", "FIC", "index", "(", "0", ".", "5", ")", "for", "synergy", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Inhibition zone-based assay for synergy between AMSIN and HNP1&2 or lysozyme C (abbreviated as hLZc) to the two oral Streptococcus (SSAN and SSAL). Inset (upper panel, boxed), a representative example of the inhibition-zone test showing the synergy. Peptide doses used here were 0.05 nmol/well for HNP1&2 and hLZc at which no visible inhibition zones were observed for both of them. At the same dose, AMSIN produced a small inhibition zone. For synergetic observation, two peptides were applied to the same well according to the doses indicated. Mean ± SD of three biological replicates is displayed. P values were obtained by Student's t-test (***P<0.001 Note: the nanomolar concentration of HNP1&2 was calculated from the average molecular weight of HNP1 and HNP2.C The FIC index assay for synergy between AMSIN and HNP1&2 or hLZc to SSAL and SSAN. The dashed line represents the cutoff of the FIC index (0.5) for synergy."}
{"words": ["Figure", "4A", "Growth", "kinetic", "measurements", "of", "SM", "exposed", "to", "AMSIN", "or", "various", "antibiotics", "with", "known", "cellular", "targets", ".", "The", "peptide", "or", "the", "compounds", "used", "were", "4", "×", "CL", ".", "VAN", ",", "vancomycin", ";", "RIF", ",", "rifampicin", ";", "KAN", ",", "kanamycin", ".", "OD600", "were", "calculated", "as", "measured", "values", "subtracting", "the", "background", "value", "from", "broth", "medium", "(", "OD600", "=", "0", ".", "356", ")", ".", "D", "Scanning", "electron", "microscopic", "observation", "of", "AMSIN", "-", "induced", "BM", "deformation", ".", "The", "doses", "used", "were", "10", "×", "CL", "for", "AMSIN", "and", "vancomycin", ".", "E", "Cytoplasmic", "accumulation", "of", "the", "soluble", "cell", "-", "wall", "precursor", "UMP", "in", "vancomycin", "-", "treated", "(", "blue", "line", ")", ",", "AMSIN", "-", "treated", "(", "red", "dashed", "line", ")", "or", "not", "treated", "(", "green", "line", ")", "culture", "of", "MRSA", "P1374", ".", "Inset", ":", "UMP", "identified", "by", "UPLC", "-", "HRMS", "with", "singlely", "and", "doubly", "protonated", "m", "/", "z", "observed", ".", "H", "ESI", "-", "MS", "detecting", "the", "non", "-", "covalent", "complex", "between", "AMSIN", "and", "UMP", ".", "The", "quadruply", "protonated", "complex", "(", "m", "/", "z", "1304", ".", "8", ")", "is", "observed", ".", "Inset", ":", "comparison", "of", "intensities", "of", "the", "complex", "between", "two", "ratios", "of", "UMP", ":", "AMSIN", "Here", ",", "AMSIN", "is", "abbreviated", "as", "AMS", "due", "to", "space", "limitation", ".", "J", "The", "dose", "-", "response", "unit", "curve", "of", "UMP", "binding", "to", "AMSIN", ",", "which", "is", "fitted", "by", "the", "BIAevaluation", "v2", ".", "0", ".", "1", ".", "software", "using", "1", ":", "1", "Langmuir", "binding", "model", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Growth kinetic measurements of SM exposed to AMSIN or various antibiotics with known cellular targets. The peptide or the compounds used were 4×CL. VAN, vancomycin; RIF, rifampicin; KAN, kanamycin. OD600 were calculated as measured values subtracting the background value from broth medium (OD600 = 0.356).D Scanning electron microscopic observation of AMSIN-induced BM deformation. The doses used were 10×CL for AMSIN and vancomycin.E Cytoplasmic accumulation of the soluble cell-wall precursor UMP in vancomycin-treated (blue line), AMSIN-treated (red dashed line) or not treated (green line) culture of MRSA P1374. Inset: UMP identified by UPLC-HRMS with singlely and doubly protonated m/z observed.H ESI-MS detecting the non-covalent complex between AMSIN and UMP. The quadruply protonated complex (m/z 1304.8) is observed. Inset: comparison of intensities of the complex between two ratios of UMP:AMSIN Here, AMSIN is abbreviated as AMS due to space limitation.J The dose-response unit curve of UMP binding to AMSIN, which is fitted by the BIAevaluation v2.0.1. software using 1:1 Langmuir binding model."}
{"words": ["Figure", "5B", "Hemolysis", "by", "AMSIN", ".", "Meucin", "-", "18", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "three", "technical", "replicates", "is", "displayed", ".", "C", "Comparison", "of", "cytotoxic", "effects", "of", "AMSIN", "and", "LL", "-", "37", "on", "HL", "-", "60", "cells", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "is", "displayed", ".", "P", "values", "were", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "or", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "the", "latter", "indicated", "by", "a", "red", "asterisk", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "no", "significanceD", "An", "inhibition", "-", "zone", "assay", "showing", "the", "inability", "of", "AMSIN", "to", "bind", "DNA", ".", "The", "bacterium", "used", "was", "MRSA", "P1374", "and", "the", "peptide", "dose", "was", "1", ".", "0", "nmol", "/", "well", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "is", "displayed", ".", "P", "values", "were", "obtained", "by", "Mann", "-", "Whitney", "U", "(", "ns", ":", "no", "significanceE", "The", "effect", "of", "AMSIN", "on", "human", "ion", "channels", "expressed", "in", "the", "CNS", "and", "heart", ".", "The", "asterisks", "mark", "steady", "state", "current", "traces", "after", "administering", "100", "μM", "AMSIN", ".", "F", "Peptide", "-", "induced", "IL", "-", "8", "release", ".", "A549", "cells", "were", "treated", "with", "AMSIN", "or", "LL", "-", "37", "for", "24", "h", ".", "IL", "-", "8", "levels", "in", "culture", "supernatants", "from", "the", "FBS", "-", "containing", "medium", "(", "left", ")", "or", "the", "serum", "-", "free", "medium", "(", "right", ")", "were", "measured", "with", "an", "ELISA", ",", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "is", "displayed", ".", "P", "values", "were", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "or", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "the", "latter", "indicated", "by", "a", "red", "asterisk", "or", "ns", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "no", "significance", "G", "Peptide", "-", "induced", "MCP", "-", "1", "release", ".", "HL", "-", "60", "cells", "were", "treated", "with", "AMSIN", "or", "LL", "-", "37", "for", "24", "h", ".", "MCP", "-", "1", "levels", "in", "culture", "supernatants", "from", "the", "FBS", "-", "containing", "medium", "(", "left", ")", "or", "the", "serum", "-", "free", "medium", "(", "right", ")", "were", "measured", "with", "an", "ELISA", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "is", "displayed", ".", "P", "values", "were", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "or", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "the", "latter", "indicated", "by", "a", "red", "asterisk", "or", "ns", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ":", "no", "significanceJ", "Survival", "after", "peritoneal", "infection", "with", "MRSA", "P1374", ".", "The", "survival", "fraction", "of", "the", "vehicle", "-", "treated", "control", "group", "was", "zero", "out", "of", "11", "mice", "and", "the", "treatment", "group", "contained", "six", "mice", "and", "all", "survived", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Hemolysis by AMSIN. Meucin-18 was used as a positive control. Mean ± SD of three technical replicates is displayed.C Comparison of cytotoxic effects of AMSIN and LL-37 on HL-60 cells. Mean ± SD of three biological replicates is displayed. P values were obtained by Student's t-test or Mann-Whitney U test (the latter indicated by a red asterisk; *P<0.05, ***P<0.001, ns: no significanceD An inhibition-zone assay showing the inability of AMSIN to bind DNA. The bacterium used was MRSA P1374 and the peptide dose was 1.0 nmol/well. Mean ± SD of three biological replicates is displayed. P values were obtained by Mann-Whitney U (ns: no significanceE The effect of AMSIN on human ion channels expressed in the CNS and heart. The asterisks mark steady state current traces after administering 100 μM AMSIN.F Peptide-induced IL-8 release. A549 cells were treated with AMSIN or LL-37 for 24 h. IL-8 levels in culture supernatants from the FBS-containing medium (left) or the serum-free medium (right) were measured with an ELISA, as described in Materials and Methods. Mean ± SD of three biological replicates is displayed. P values were obtained by Student's t-test or Mann-Whitney U test (the latter indicated by a red asterisk or ns; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ns: no significance G Peptide-induced MCP-1 release. HL-60 cells were treated with AMSIN or LL-37 for 24 h. MCP-1 levels in culture supernatants from the FBS-containing medium (left) or the serum-free medium (right) were measured with an ELISA. Mean ± SD of three biological replicates is displayed. P values were obtained by Student's t-test or Mann-Whitney U test (the latter indicated by a red asterisk or ns; *P<0.05, **P<0.01, ns: no significanceJ Survival after peritoneal infection with MRSA P1374. The survival fraction of the vehicle-treated control group was zero out of 11 mice and the treatment group contained six mice and all survived."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "The", "indicated", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "p5HRE", "-", "Luc", "and", "either", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", "or", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "empty", "vector", ":", "EV", ")", "were", "cultured", "under", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "for", "the", "luciferase", "assay", ".", "B", ",", "U2OS", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "p5HRE", "-", "Luc", "and", "the", "indicated", "siRNA", "were", "cultured", "under", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "for", "the", "luciferase", "assay", ".", "C", ",", "HCT116", "p53", "-", "/", "-", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "p5HRE", "-", "Luc", ",", "either", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", "or", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", ",", "and", "either", "pcDNA3", "/", "p53", "(", "at", "two", "concentrations", ":", "+", "and", "+", "+", ")", "or", "pcDNA3", "(", "EV", ")", "were", "cultured", "under", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "for", "the", "luciferase", "assay", "and", "Western", "blotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "D", ",", "HCT116", "p53", "+", "/", "+", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "p5HRE", "-", "Luc", ",", "either", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", "or", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", ",", "and", "either", "pcDNA3", "/", "p53", "R175H", ",", "R248W", ",", "R273H", ",", "or", "pcDNA3", "(", "EV", ")", "were", "cultured", "under", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "for", "the", "luciferase", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, The indicated cells co-transfected with p5HRE-Luc and either pEF6/ZBTB2 (ZBTB2) or pEF6/myc-His B (empty vector: EV) were cultured under the indicated oxygen conditions for 24 hours for the luciferase assay. B, U2OS cells co-transfected with p5HRE-Luc and the indicated siRNA were cultured under the indicated oxygen conditions for 24 hours for the luciferase assay.C, HCT116 p53-/- cells co-transfected with p5HRE-Luc, either pEF6/ZBTB2 (ZBTB2) or pEF6/myc-His B (EV), and either pcDNA3/p53 (at two concentrations: + and ++) or pcDNA3 (EV) were cultured under the indicated oxygen conditions for 24 hours for the luciferase assay and Western blotting using the indicated antibodies.D, HCT116 p53+/+ cells co-transfected with p5HRE-Luc, either pEF6/ZBTB2 (ZBTB2) or pEF6/myc-His B (EV), and either pcDNA3/p53 R175H, R248W, R273H, or pcDNA3 (EV) were cultured under the indicated oxygen conditions for 24 hours for the luciferase assay."}
{"words": ["Figure", "2The", "indicated", "cells", "transiently", "transfected", "with", "either", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", "or", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", "either", "pcDNA3", "/", "p53", "(", "p53", ")", "or", "pcDNA3", "(", "EV", ")", "(", "C", ")", "with", "the", "indicated", "siRNA", "were", "cultured", "under", "<", "0", ".", "1", "%", "O2", "conditions", "for", "24", "hours", "and", "subjected", "to", "qRT", "-", "PCR", "for", "the", "indicated", "mRNAThe", "indicated", "cells", "transiently", "transfected", "with", "either", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", "or", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", "to", "the", "transwell", "invasion", "assayThe", "indicated", "cells", "transiently", "transfected", "with", "either", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", "or", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", "with", "the", "indicated", "siRNA", "or", "to", "the", "transwell", "invasion", "assayG", ",", "The", "number", "of", "metastatic", "colonies", "in", "lungs", "in", "the", "pulmonary", "metastasis", "model", "using", "the", "indicated", "cells", "stably", "transfected", "with", "ZBTB2", "expression", "vector", "(", "ZBTB2", ")", "or", "its", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "(", "left", ")", "and", "the", "representative", "images", "of", "lungs", "(", "right", ")", ".", "The", "indicated", "cells", "stably", "transfected", "with", "the", "ZBTB2", "expression", "vector", "(", "ZBTB2", ")", "or", "its", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "(", "H", ")", "were", "cultured", "under", "<", "0", ".", "1", "%", "O2", "(", "H", ")", "for", "the", "indicated", "periods", "and", "subjected", "to", "the", "in", "vitro", "cell", "proliferation", "assay", ".", "The", "indicated", "cells", "stably", "transfected", "with", "the", "ZBTB2", "expression", "vector", "(", "ZBTB2", ")", "transiently", "transfected", "with", "siScr", "or", "siZBTB2", "(", "I", ")", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "(", "I", ")", "for", "the", "indicated", "periods", "and", "subjected", "to", "the", "in", "vitro", "cell", "proliferation", "assay", ".", "J", ",", "K", ",", "Growth", "of", "the", "indicated", "tumor", "xenografts", "with", "or", "without", "ZBTB2", "overexpression", "was", "analyzed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The indicated cells transiently transfected with either pEF6/ZBTB2 (ZBTB2) or pEF6/myc-His B (EV) either pcDNA3/p53 (p53) or pcDNA3 (EV) (C) with the indicated siRNA were cultured under < 0.1% O2 conditions for 24 hours and subjected to qRT-PCR for the indicated mRNAThe indicated cells transiently transfected with either pEF6/ZBTB2 (ZBTB2) or pEF6/myc-His B (EV) to the transwell invasion assayThe indicated cells transiently transfected with either pEF6/ZBTB2 (ZBTB2) or pEF6/myc-His B (EV) with the indicated siRNA or to the transwell invasion assayG, The number of metastatic colonies in lungs in the pulmonary metastasis model using the indicated cells stably transfected with ZBTB2 expression vector (ZBTB2) or its empty vector (EV) (left) and the representative images of lungs (right).The indicated cells stably transfected with the ZBTB2 expression vector (ZBTB2) or its empty vector (EV) (H) were cultured under < 0.1% O2 (H) for the indicated periods and subjected to the in vitro cell proliferation assay.The indicated cells stably transfected with the ZBTB2 expression vector (ZBTB2) transiently transfected with siScr or siZBTB2 (I) the indicated oxygen conditions (I) for the indicated periods and subjected to the in vitro cell proliferation assay.J,K, Growth of the indicated tumor xenografts with or without ZBTB2 overexpression was analyzed."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "Tissue", "microarrays", "of", "human", "lung", "adenocarcinoma", "(", "243", "samples", ")", "stained", "with", "anti", "-", "ZBTB2", "antibodies", ".", "High", "magnification", "images", "are", "shown", "in", "the", "left", "lower", "side", "of", "each", "image", ".", "Scale", "bar", ",", "500", "and", "100", "μm", "in", "the", "low", "and", "high", "magnification", "images", ",", "respectively", ".", "B", ",", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "for", "percentage", "of", "CA9", "-", "positive", "tumors", "in", "the", "four", "indicated", "groups", ".", "Percentages", "and", "absolute", "numbers", "of", "each", "group", "are", "indicated", "in", "the", "graph", ".", "C", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "the", "disease", "-", "free", "survival", "of", "the", "lung", "cancer", "patients", "stratified", "by", "the", "expression", "levels", "of", "ZBTB2", "and", "p53", "status", ".", "D", "-", "F", ",", "TCGA", "-", "based", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "overall", "survival", "of", "lung", "adenocarcinoma", "patients", "stratified", "by", "the", "expression", "levels", "of", "ZBTB2", "and", "those", "of", "BAX", "(", "D", ")", ",", "ZMAT3", "(", "E", ")", ",", "and", "CEACAM1", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, Tissue microarrays of human lung adenocarcinoma (243 samples) stained with anti-ZBTB2 antibodies. High magnification images are shown in the left lower side of each image. Scale bar, 500 and 100 μm in the low and high magnification images, respectively.B, Fisher's exact test for percentage of CA9-positive tumors in the four indicated groups. Percentages and absolute numbers of each group are indicated in the graph.C, Kaplan-Meier analysis of the disease-free survival of the lung cancer patients stratified by the expression levels of ZBTB2 and p53 status.D-F, TCGA-based Kaplan-Meier analysis of overall survival of lung adenocarcinoma patients stratified by the expression levels of ZBTB2 and those of BAX (D), ZMAT3 (E), and CEACAM1 (F)."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "The", "indicated", "cells", "transiently", "transfected", "with", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", "or", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", "were", "cultured", "under", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "and", "subjected", "to", "Western", "blotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "indicated", "cells", "transiently", "transfected", "with", "both", "pG5H1bLuc", "and", "either", "pcDNA6", "/", "Gal4", "DBD", "-", "HIF", "-", "1α", "TAD", "P564A", "pcDNA6", "/", "Gal4", "DBD", "-", "HIF", "-", "1α", "TAD", "P564A", "and", "N803A", "(", "E", ")", "were", "additionally", "co", "-", "transfected", "with", "either", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "1", "-", "23", "]", "(", "del", "[", "1", "-", "23", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "BTB", "/", "POZ", "]", "(", "del", "[", "BTB", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF1", "]", "(", "del", "[", "ZF1", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF2", "]", "(", "del", "[", "ZF2", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF3", "]", "(", "del", "[", "ZF3", "]", ")", ",", "or", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF4", "]", "-", "(", "del", "[", "ZF4", "]", ")", ",", "as", "indicated", "with", "the", "indicated", "siRNA", "The", "cells", "were", "then", "cultured", "under", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "and", "subjected", "to", "the", "luciferase", "assay", ".", "The", "indicated", "cells", "transiently", "transfected", "with", "both", "pG5H1bLuc", "and", "either", "pcDNA6", "/", "Gal4", "DBD", "-", "HIF", "-", "1α", "TAD", "P564A", "were", "additionally", "co", "-", "transfected", "with", "either", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "1", "-", "23", "]", "(", "del", "[", "1", "-", "23", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "BTB", "/", "POZ", "]", "(", "del", "[", "BTB", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF1", "]", "(", "del", "[", "ZF1", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF2", "]", "(", "del", "[", "ZF2", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF3", "]", "(", "del", "[", "ZF3", "]", ")", ",", "or", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF4", "]", "-", "(", "del", "[", "ZF4", "]", ")", ",", "as", "indicated", "with", "the", "indicated", "siRNA", "The", "cells", "were", "then", "cultured", "under", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "and", "subjected", "to", "the", "luciferase", "assay", ".", "The", "indicated", "cells", "transiently", "transfected", "with", "pcDNA6", "/", "Gal4", "DBD", "-", "HIF", "-", "1α", "TAD", "P564A", "and", "N803A", "(", "E", ")", "were", "additionally", "co", "-", "transfected", "with", "either", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "1", "-", "23", "]", "(", "del", "[", "1", "-", "23", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "BTB", "/", "POZ", "]", "(", "del", "[", "BTB", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF1", "]", "(", "del", "[", "ZF1", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF2", "]", "(", "del", "[", "ZF2", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF3", "]", "(", "del", "[", "ZF3", "]", ")", ",", "or", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF4", "]", "-", "(", "del", "[", "ZF4", "]", ")", ",", "as", "indicated", "(", "B", ",", "D", ",", "E", ",", "F", ")", "The", "cells", "were", "then", "cultured", "under", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "and", "subjected", "to", "the", "luciferase", "assay", ".", "The", "indicated", "cells", "transiently", "transfected", "with", "both", "pG5H1bLuc", "and", "either", "pcDNA6", "/", "Gal4", "DBD", "-", "HIF", "-", "1α", "TAD", "P564A", "were", "additionally", "co", "-", "transfected", "with", "either", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "1", "-", "23", "]", "(", "del", "[", "1", "-", "23", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "BTB", "/", "POZ", "]", "(", "del", "[", "BTB", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF1", "]", "(", "del", "[", "ZF1", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF2", "]", "(", "del", "[", "ZF2", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF3", "]", "(", "del", "[", "ZF3", "]", ")", ",", "or", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "ZF4", "]", "-", "(", "del", "[", "ZF4", "]", ")", ",", "as", "indicated", "The", "cells", "were", "then", "cultured", "under", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "and", "subjected", "to", "the", "luciferase", "assay", ".", "H", ",", "After", "transient", "transfection", "with", "the", "expression", "vectors", "for", "ZBTB2", "-", "V5", ",", "ZBTB2", "-", "myc", ",", "or", "their", "empty", "vector", "(", "-", ")", ",", "ZBTB2", "-", "myc", "protein", "was", "immunoprecipitated", "using", "the", "anti", "-", "myc", "antibody", "and", "co", "-", "precipitated", "ZBTB2", "-", "V5", "was", "detected", "using", "the", "anti", "-", "V5", "antibody", "(", "upper", ")", ".", "One", "-", "tenth", "of", "the", "whole", "cell", "lysate", "(", "WCL", ")", "was", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "lower", ")", ".", "I", ",", "J", ",", "The", "indicated", "cells", "transiently", "transfected", "with", "or", "without", "either", "pcDNA4", "/", "ZBTB2", "-", "LgBiT", "or", "pcDNA4", "/", "LgBiT", "and", "either", "pcDNA4", "/", "ZBTB2", "-", "SmBiT", "or", "pcDNA4", "/", "SmBiT", ",", "as", "indicated", ",", "were", "cultured", "under", "<", "0", ".", "1", "%", "oxygen", "(", "I", ")", "or", "the", "indicated", "oxygen", "conditions", "(", "J", ")", "and", "subjected", "to", "the", "split", "luciferase", "complementation", "assay", ".", "K", ",", "HeLa", "cells", "overexpressing", "wildtype", "or", "the", "indicated", "mutant", "of", "ZBTB2", "(", "ZF2", "or", "ZF3", "-", "deletion", ")", "were", "cultured", "under", "<", "0", ".", "1", "%", "oxygen", "conditions", ",", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "myc", "antibody", ".", "Coprecipitated", "DNA", "was", "subjected", "to", "the", "qRT", "-", "PCR", "experiment", "using", "primers", "against", "HRE", "regions", "of", "the", "STC1", "promoter", ".", "L", ",", "The", "same", "experiment", "as", "I", "was", "conducted", "using", "the", "indicated", "combination", "of", "pcDNA4", "/", "ZBTB2", "-", "LgBiT", "(", "WT", ")", ",", "pcDNA4", "/", "ZBTB2ΔZF2", "-", "LgBiT", "(", "ΔZF2", ")", ",", "or", "pcDNA4", "/", "ZBTB2ΔZF3", "-", "LgBiT", "(", "ΔZF3", ")", ",", "and", "pcDNA4", "/", "ZBTB2", "-", "SmBiT", "(", "WT", ")", ",", "pcDNA4", "/", "ZBTB2ΔZF2", "-", "SmBiT", "(", "ΔZF2", ")", ",", "or", "pcDNA4", "/", "ZBTB2ΔZF3", "-", "SmBiT", "(", "ΔZF3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, The indicated cells transiently transfected with pEF6/ZBTB2 (ZBTB2) or pEF6/myc-His B (EV) were cultured under the indicated oxygen conditions for 24 hours and subjected to Western blotting using the indicated antibodies.The indicated cells transiently transfected with both pG5H1bLuc and either pcDNA6/Gal4 DBD-HIF-1α TAD P564A pcDNA6/Gal4 DBD-HIF-1α TAD P564A and N803A (E) were additionally co-transfected with either pEF6/myc-His B (EV), pEF6/ZBTB2 (ZBTB2), pEF6/ZBTB2 del[1-23] (del[1-23]), pEF6/ZBTB2 del[BTB/POZ] (del[BTB]), pEF6/ZBTB2 del[ZF1] (del[ZF1]), pEF6/ZBTB2 del[ZF2] (del[ZF2]), pEF6/ZBTB2 del[ZF3] (del[ZF3]), or pEF6/ZBTB2 del[ZF4]- (del[ZF4]), as indicated with the indicated siRNA The cells were then cultured under the indicated oxygen conditions for 24 hours and subjected to the luciferase assay.The indicated cells transiently transfected with both pG5H1bLuc and either pcDNA6/Gal4 DBD-HIF-1α TAD P564A were additionally co-transfected with either pEF6/myc-His B (EV), pEF6/ZBTB2 (ZBTB2), pEF6/ZBTB2 del[1-23] (del[1-23]), pEF6/ZBTB2 del[BTB/POZ] (del[BTB]), pEF6/ZBTB2 del[ZF1] (del[ZF1]), pEF6/ZBTB2 del[ZF2] (del[ZF2]), pEF6/ZBTB2 del[ZF3] (del[ZF3]), or pEF6/ZBTB2 del[ZF4]- (del[ZF4]), as indicated with the indicated siRNA The cells were then cultured under the indicated oxygen conditions for 24 hours and subjected to the luciferase assay.The indicated cells transiently transfected with pcDNA6/Gal4 DBD-HIF-1α TAD P564A and N803A (E) were additionally co-transfected with either pEF6/myc-His B (EV), pEF6/ZBTB2 (ZBTB2), pEF6/ZBTB2 del[1-23] (del[1-23]), pEF6/ZBTB2 del[BTB/POZ] (del[BTB]), pEF6/ZBTB2 del[ZF1] (del[ZF1]), pEF6/ZBTB2 del[ZF2] (del[ZF2]), pEF6/ZBTB2 del[ZF3] (del[ZF3]), or pEF6/ZBTB2 del[ZF4]- (del[ZF4]), as indicated (B,D,E,F) The cells were then cultured under the indicated oxygen conditions for 24 hours and subjected to the luciferase assay.The indicated cells transiently transfected with both pG5H1bLuc and either pcDNA6/Gal4 DBD-HIF-1α TAD P564A were additionally co-transfected with either pEF6/myc-His B (EV), pEF6/ZBTB2 (ZBTB2), pEF6/ZBTB2 del[1-23] (del[1-23]), pEF6/ZBTB2 del[BTB/POZ] (del[BTB]), pEF6/ZBTB2 del[ZF1] (del[ZF1]), pEF6/ZBTB2 del[ZF2] (del[ZF2]), pEF6/ZBTB2 del[ZF3] (del[ZF3]), or pEF6/ZBTB2 del[ZF4]- (del[ZF4]), as indicated The cells were then cultured under the indicated oxygen conditions for 24 hours and subjected to the luciferase assay.H, After transient transfection with the expression vectors for ZBTB2-V5, ZBTB2-myc, or their empty vector (-), ZBTB2-myc protein was immunoprecipitated using the anti-myc antibody and co-precipitated ZBTB2-V5 was detected using the anti-V5 antibody (upper). One-tenth of the whole cell lysate (WCL) was subjected to immunoblotting with the indicated antibodies (lower).I,J, The indicated cells transiently transfected with or without either pcDNA4/ZBTB2-LgBiT or pcDNA4/LgBiT and either pcDNA4/ZBTB2-SmBiT or pcDNA4/SmBiT, as indicated, were cultured under < 0.1% oxygen (I) or the indicated oxygen conditions (J) and subjected to the split luciferase complementation assay.K, HeLa cells overexpressing wildtype or the indicated mutant of ZBTB2 (ZF2 or ZF3-deletion) were cultured under < 0.1% oxygen conditions, and subjected to immunoprecipitation with anti-myc antibody. Coprecipitated DNA was subjected to the qRT-PCR experiment using primers against HRE regions of the STC1 promoter.L, The same experiment as I was conducted using the indicated combination of pcDNA4/ZBTB2-LgBiT (WT), pcDNA4/ZBTB2ΔZF2-LgBiT (ΔZF2), or pcDNA4/ZBTB2ΔZF3-LgBiT (ΔZF3), and pcDNA4/ZBTB2-SmBiT (WT), pcDNA4/ZBTB2ΔZF2-SmBiT (ΔZF2), or pcDNA4/ZBTB2ΔZF3-SmBiT (ΔZF3)."}
{"words": ["Figure", "5B", ",", "HCT116", "p53", "-", "/", "-", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "pG5H1bLuc", ",", "pcDNA6", "/", "Gal4", "DBD", "-", "HIF", "-", "1α", "TAD", "P564A", ",", "and", "either", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "8", "-", "11", "]", "(", "ZBTB2", "del", "[", "8", "-", "11", "]", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "del", "[", "51", "-", "54", "]", "(", "ZBTB2", "del", "[", "51", "-", "54", "]", ")", ",", "or", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", ",", "as", "indicated", ",", "were", "cultured", "under", "<", "0", ".", "1", "%", "oxygen", "conditions", "for", "24", "hours", "and", "subjected", "to", "the", "luciferase", "assay", ".", "C", ",", "After", "transient", "transfection", "with", "or", "without", "the", "expression", "vectors", "for", "ZBTB2", "-", "V5", ",", "ZBTB2", "4A", "-", "V5", ",", "ZBTB2", "-", "myc", ",", "ZBTB2", "4A", "-", "myc", ",", "or", "their", "empty", "vector", ",", "as", "indicated", ",", "the", "myc", "-", "fused", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "using", "an", "anti", "-", "myc", "antibody", "and", "co", "-", "precipitated", "ZBTB2", "-", "V5", "or", "ZBTB2", "4A", "-", "V5", "was", "detected", "(", "upper", ")", ".", "One", "-", "tenth", "of", "the", "whole", "cell", "lysate", "(", "WCL", ")", "was", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "lower", ")", ".", "D", ",", "HCT116", "p53", "-", "/", "-", "(", "left", ")", "cells", "transiently", "transfected", "with", "or", "without", "either", "pcDNA4", "/", "ZBTB2", "-", "LgBiT", "(", "ZBTB2", ")", ",", "pcDNA4", "/", "ZBTB2", "4A", "-", "LgBiT", "4A", "(", "4A", ")", ",", "or", "pcDNA4", "/", "LgBiT", "(", "-", ")", "and", "either", "pcDNA4", "/", "ZBTB2", "-", "SmBiT", "(", "ZBTB2", ")", ",", "pcDNA4", "/", "ZBTB2", "4A", "-", "SmBiT", "(", "4A", ")", ",", "or", "pcDNA4", "/", "SmBiT", "(", "-", ")", ",", "as", "indicated", ",", "were", "cultured", "under", "<", "0", ".", "1", "%", "oxygen", "and", "subjected", "to", "the", "split", "luciferase", "complementation", "assay", ".", "G", ",", "The", "same", "kind", "of", "luciferase", "assay", "to", "quantify", "the", "transactivation", "activity", "as", "B", "was", "carried", "out", "using", "either", "pEF6", "/", "ZBTB2", "(", "ZBTB2", ")", ",", "pEF6", "/", "ZBTB2", "4A", "(", "4A", ")", ",", "or", "pEF6", "/", "myc", "-", "His", "B", "(", "EV", ")", ".", "H", ",", "Growth", "of", "the", "indicated", "tumor", "xenografts", "was", "analyzed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B, HCT116 p53-/- cells co-transfected with pG5H1bLuc, pcDNA6/Gal4 DBD-HIF-1α TAD P564A, and either pEF6/ZBTB2 (ZBTB2), pEF6/ZBTB2 del[8-11] (ZBTB2 del[8-11]), pEF6/ZBTB2 del[51-54] (ZBTB2 del[51-54]), or pEF6/myc-His B (EV), as indicated, were cultured under < 0.1% oxygen conditions for 24 hours and subjected to the luciferase assay.C, After transient transfection with or without the expression vectors for ZBTB2-V5, ZBTB2 4A-V5, ZBTB2-myc, ZBTB2 4A-myc, or their empty vector, as indicated, the myc-fused proteins were immunoprecipitated using an anti-myc antibody and co-precipitated ZBTB2-V5 or ZBTB2 4A-V5 was detected (upper). One-tenth of the whole cell lysate (WCL) was subjected to immunoblotting with the indicated antibodies (lower).D, HCT116 p53-/- (left) cells transiently transfected with or without either pcDNA4/ZBTB2-LgBiT (ZBTB2), pcDNA4/ZBTB2 4A-LgBiT 4A (4A), or pcDNA4/LgBiT (-) and either pcDNA4/ZBTB2-SmBiT (ZBTB2), pcDNA4/ZBTB2 4A-SmBiT (4A), or pcDNA4/SmBiT (-), as indicated, were cultured under < 0.1% oxygen and subjected to the split luciferase complementation assay.G, The same kind of luciferase assay to quantify the transactivation activity as B was carried out using either pEF6/ZBTB2 (ZBTB2), pEF6/ZBTB2 4A (4A), or pEF6/myc-His B (EV).H, Growth of the indicated tumor xenografts was analyzed."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "a", "strain", "expressing", "TurboID", "-", "HA", "-", "Emc6", ",", "Bpl1", "-", "AID", "*", "-", "9myc", "and", "OsTIR1", "which", "was", "grown", "overnight", "in", "SD", "media", "with", "or", "without", "auxin", ".", "The", "cells", "were", "then", "diluted", "into", "fresh", "SD", "media", "and", "grown", "to", "mid", "logarithmic", "phase", "(", "~", "4hours", ")", "with", "or", "without", "auxin", "(", "respectively", ")", ".", "When", "required", ",", "biotin", "was", "added", "either", "30min", "before", "harvesting", ",", "or", "for", "the", "entire", "4hours", ".", "H3", "(", "histone", "H3", ")", "is", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) Western blot analysis of a strain expressing TurboID-HA-Emc6, Bpl1-AID*-9myc and OsTIR1 which was grown overnight in SD media with or without auxin. The cells were then diluted into fresh SD media and grown to mid logarithmic phase (~4hours) with or without auxin (respectively). When required, biotin was added either 30min before harvesting, or for the entire 4hours. H3 (histone H3) is used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Volcano", "plots", "for", "each", "of", "the", "four", "distinct", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "experiments", "highlighted", "in", "Figure", "2A", "showing", "-", "log", "(", "p", "-", "value", ")", "against", "log2", "(", "fold", "-", "change", ")", "for", "all", "proteins", "identified", "in", "the", "appropriate", "Emc6", "/", "Sbh1", "samples", ".", "Proteins", "enriched", "in", "the", "Emc6", "samples", "are", "colour", "/", "pattern", "-", "coded", "as", "follows", ":", "dotted", "outline", "for", "HA", "-", "IP", "of", "BioID2", "-", "HA", "-", "Emc6", ";", "blue", "fill", "for", "streptavidin", "-", "AP", "of", "BioID2", "-", "HA", "-", "Emc6", ";", "black", ",", "solid", "outline", "for", "streptavidin", "-", "AP", "of", "TurboID", "-", "HA", "-", "Emc6", ";", "and", "yellow", "fill", "for", "streptavidin", "-", "AP", "of", "TurboID", "-", "HA", "-", "Emc6", "/", "ABOLISH", ".", "Grey", "dots", "represent", "proteins", "that", "passed", "the", "p", "-", "value", "and", "fold", "-", "change", "criteria", ",", "but", "were", "only", "identified", "by", "one", "peptide", ".", "Only", "EMC", "complex", "components", "or", "proteins", "with", "EMC", "client", "features", "are", "named", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Volcano plots for each of the four distinct LC-MS/MS experiments highlighted in Figure 2A showing -log(p-value) against log2(fold-change) for all proteins identified in the appropriate Emc6/Sbh1 samples. Proteins enriched in the Emc6 samples are colour/pattern-coded as follows: dotted outline for HA-IP of BioID2-HA-Emc6; blue fill for streptavidin-AP of BioID2-HA-Emc6; black, solid outline for streptavidin-AP of TurboID-HA-Emc6; and yellow fill for streptavidin-AP of TurboID-HA-Emc6/ABOLISH. Grey dots represent proteins that passed the p-value and fold-change criteria, but were only identified by one peptide. Only EMC complex components or proteins with EMC client features are named."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Fluorescence", "microscopy", "images", "of", "control", "or", "Δemc3", "strains", "containing", "either", "Alg1", "N", "'", "tagged", "with", "GFP", ",", "Gnp1", "C", "'", "tagged", "with", "GFP", ",", "Pdr12", "N", "'", "tagged", "with", "GFP", "or", "Pho84", "C", "'", "tagged", "with", "GFP", ".", "For", "the", "Gnp1", "-", "GFP", "strain", ",", "the", "quantified", "signal", "depletion", "was", "~", "10", "%", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Topological", "schematics", "feature", "beneath", "each", "respective", "image", ",", "with", "predicted", "TMDs", "highlighted", "in", "blue", "(", "Weill", "et", "al", ",", "2019", ")", ".", "All", "images", "are", "from", "two", "independent", "biological", "repeats", "and", "are", "digitally", "coloured", "using", "the", "'", "fire", "'", "lookup", "table", "(", "LUT", ")", "on", "Fiji", ".", "The", "same", "contrast", "settings", "were", "used", "for", "each", "image", "pair", ".", "(", "C", ")", "Streptavidin", "blots", "of", "diploid", "strains", "expressing", "either", "AviTag", "-", "Fks1", ",", "-", "Gnp1", ",", "-", "Pdr5", ",", "-", "Pdr12", "or", "-", "Stv1", "(", "as", "negative", "control", ")", "together", "with", "BirA", "-", "Emc6", ",", "grown", "in", "the", "conditions", "described", "in", "Figure", "1E", ".", "For", "each", "strain", ",", "blots", "showing", "both", "the", "'", "lower", "'", "(", "L", ")", "and", "'", "higher", "'", "(", "H", ")", "contrast", "settings", "are", "shown", "side", "-", "by", "-", "side", ".", "The", "expected", "molecular", "weight", "in", "kDa", "for", "each", "tested", "protein", "including", "AviTag", "is", "written", "in", "parentheses", "after", "the", "protein", "name", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Fluorescence microscopy images of control or Δemc3 strains containing either Alg1 N' tagged with GFP, Gnp1 C' tagged with GFP, Pdr12 N' tagged with GFP or Pho84 C' tagged with GFP. For the Gnp1-GFP strain, the quantified signal depletion was ~10% (p < 0.0001). Topological schematics feature beneath each respective image, with predicted TMDs highlighted in blue (Weill et al, 2019). All images are from two independent biological repeats and are digitally coloured using the 'fire' lookup table (LUT) on Fiji. The same contrast settings were used for each image pair.(C) Streptavidin blots of diploid strains expressing either AviTag-Fks1, -Gnp1, -Pdr5, -Pdr12 or -Stv1 (as negative control) together with BirA-Emc6, grown in the conditions described in Figure 1E. For each strain, blots showing both the 'lower' (L) and 'higher' (H) contrast settings are shown side-by-side. The expected molecular weight in kDa for each tested protein including AviTag is written in parentheses after the protein name."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "U2OS", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "TIP60", "or", "empty", "vector", "(", "vec", ")", "were", "subjected", "to", "FLAG", "-", "immunoprecipitation", "from", "nuclear", "lysates", "and", "analysed", "by", "Western", "blotting", "(", "C", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "pcDNA3", ".", "1", "encoding", "FLAG", "-", "TIP60WT", ",", "FLAG", "-", "TIP60S90A", "or", "empty", "vector", "(", "vec", ")", ".", "The", "samples", "were", "subjected", "to", "FLAG", "affinity", "-", "purification", ",", "dephosphorylated", "with", "shrimp", "alkaline", "phosphatase", "(", "rSAP", ")", "and", "incubated", "as", "indicated", "with", "CDK9", "/", "cyclinT1", "in", "presence", "of", "ATP", ".", "Phosphorylation", "of", "TIP60", "was", "analysed", "by", "a", "phosphoS90", "-", "specific", "TIP60", "antibody", ",", "and", "the", "blot", "was", "further", "probed", "with", "antibodies", "specific", "for", "FLAG", "and", "CDK9", "(", "D", ")", "p53", "-", "/", "-", "hRasG12V", "MEF", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "1µM", "SNS", "-", "032", "(", "SNS", ")", "for", "1h", ".", "Nuclear", "lysates", "were", "analysed", "by", "Western", "blotting", "(", "E", ")", "p53", "-", "/", "-", "hRasG12V", "MEF", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "1µM", "SNS", "-", "032", "(", "SNS", ")", "or", "50µM", "DRB", "followed", "by", "addition", "of", "100nM", "Calyculin", "A", "as", "indicated", ".", "Nuclear", "lysates", "were", "analysed", "by", "Western", "blotting", "(", "F", ")", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "TIP60WT", "were", "transfected", "with", "a", "pool", "of", "four", "different", "CDK9", "-", "targeting", "siRNAs", "or", "a", "control", "siRNA", "targeting", "Luciferase", ".", "Nuclear", "lysates", "were", "analysed", "by", "Western", "blotting"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 (B) U2OS stably expressing FLAG-TIP60 or empty vector (vec) were subjected to FLAG- immunoprecipitation from nuclear lysates and analysed by Western blotting  (C) HEK293T cells were transfected with pcDNA3.1 encoding FLAG-TIP60WT, FLAG- TIP60S90A or empty vector (vec). The samples were subjected to FLAG affinity-purification, dephosphorylated with shrimp alkaline phosphatase (rSAP) and incubated as indicated with CDK9/cyclinT1 in presence of ATP. Phosphorylation of TIP60 was analysed by a phosphoS90-specific TIP60 antibody, and the blot was further probed with antibodies specific for FLAG and CDK9  (D) p53-/- hRasG12V MEF were treated with DMSO or 1µM SNS-032 (SNS) for 1h. Nuclear lysates were analysed by Western blotting  (E) p53-/- hRasG12V MEF were treated with DMSO, 1µM SNS-032 (SNS) or 50µM DRB followed by addition of 100nM Calyculin A as indicated. Nuclear lysates were analysed by Western blotting  (F) U2OS cells stably expressing FLAG-TIP60WT were transfected with a pool of four different CDK9-targeting siRNAs or a control siRNA targeting Luciferase. Nuclear lysates were analysed by Western blotting "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Localization", "of", "TIP60", "was", "analysed", "employing", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "TIP60WT", ",", "FLAG", "-", "TIP60S90A", "or", "FLAG", "-", "TIP60S86A", ".", "Nucleoplasm", "(", "nuc", ".", ")", "and", "chromatin", "(", "chr", ".", ")", "fractions", "were", "generated", "and", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "(", "B", ")", "The", "experiment", "as", "described", "in", "(", "A", ")", "was", "repeated", "twice", "with", "U2OS", "cells", "and", "twice", "with", "Ba", "/", "F3", "cells", "and", "the", "blots", "were", "quantified", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "ration", "of", "FLAG", "-", "TiIP60", "to", "H4", "in", "the", "chromatin", "fraction", "of", "altogether", "four", "individual", "experiments", "as", "shown", "in", "(", "A", ")", "(", "C", ")", "Nuclear", "extracts", "of", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "TIP60WT", "or", "TIP60S90A", ",", "or", "FLAG", "-", "tagged", "chromodomain", "mutants", "TIP60F50A", ",", "TIP60Y47A", ",", "TIP60Y44F", "or", "the", "empty", "vector", "(", "vec", ")", "were", "subjected", "to", "fractionation", "into", "nucleoplasm", "(", "nuc", ".", ")", "and", "chromatin", "(", "chr", ".", ")", "fraction", ".", "Both", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blotting", "(", "D", ")", "Nuclear", "extracts", "of", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "TIP60WT", ",", "TIP60S90A", ",", "TIP60S90E", ",", "TIP60S90D", "or", "the", "empty", "vector", "(", "vec", ")", "were", "subjected", "to", "fractionation", "into", "nucleoplasm", "(", "nuc", ".", ")", "and", "chromatin", "(", "chr", ".", ")", "fraction", ".", "Both", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blotting", "(", "E", ")", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "TIP60WT", ",", "TIP60S90A", "or", "empty", "vector", "(", "vec", ")", "were", "treated", "with", "2", "µM", "SNS", "-", "032", "(", "SNS", ")", "for", "3", "hours", "as", "indicated", ".", "The", "nucleus", "was", "fractionated", "into", "nucleoplasm", "and", "chromatin", ".", "Both", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 (A) Localization of TIP60 was analysed employing U2OS cells stably expressing FLAG- TIP60WT, FLAG-TIP60S90A or FLAG-TIP60S86A. Nucleoplasm (nuc.) and chromatin (chr.) fractions were generated and were subjected to Western blot analysis  (B) The experiment as described in (A) was repeated twice with U2OS cells and twice with Ba/F3 cells and the blots were quantified. Each dot represents the ration of FLAG-TiIP60 to H4 in the chromatin fraction of altogether four individual experiments as shown in (A)  (C) Nuclear extracts of U2OS cells stably expressing FLAG-tagged TIP60WT or TIP60S90A, or FLAG-tagged chromodomain mutants TIP60F50A, TIP60Y47A, TIP60Y44F or the empty vector (vec) were subjected to fractionation into nucleoplasm (nuc.) and chromatin (chr.) fraction. Both fractions were analysed by Western blotting  (D) Nuclear extracts of U2OS cells stably expressing FLAG-tagged TIP60WT, TIP60S90A, TIP60S90E, TIP60S90D or the empty vector (vec) were subjected to fractionation into nucleoplasm (nuc.) and chromatin (chr.) fraction. Both fractions were analysed by Western blotting (E) U2OS cells stably expressing FLAG-tagged TIP60WT, TIP60S90A or empty vector (vec) were treated with 2 µM SNS-032 (SNS) for 3 hours as indicated. The nucleus was fractionated into nucleoplasm and chromatin. Both fractions were analysed by Western blotting"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "FLAG", "-", "immunoprecipitations", "were", "performed", "from", "nuclear", "extracts", "of", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "TIP60WT", ",", "TIP60S90A", ",", "TIP60S86A", "or", "empty", "vector", "(", "vec", ")", ".", "Immunoprecipitated", "material", "and", "input", "lysate", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "(", "B", ")", "The", "experiment", "as", "shown", "in", "(", "A", ")", "was", "repeated", "three", "times", ".", "The", "graphs", "and", "error", "bars", "represent", "mean", "and", "standard", "deviation", "of", "these", "three", "individual", "experiments", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "Fisher", "\"", "s", "LSD", "test", ",", "WT", "vs", ".", "S86A", "p", "=", "0", ",", "5992", ",", "WT", "vs", ".", "S90A", "p", "=", "0", ",", "0429", ",", "S90A", "vs", ".", "S86A", "p", "=", "0", ",", "0176", "(", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ";", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "p", ">", "0", ",", "05", ")", ")", "(", "C", ")", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "pcDNA3", ".", "1", "encoding", "FLAG", "-", "TIP60WT", ",", "FLAG", "-", "TIP60S90A", "or", "empty", "vector", ".", "FLAG", "-", "immunoprecipitations", "were", "performed", "from", "nuclear", "extracts", ".", "Immunoprecipitated", "material", "and", "input", "lysate", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "(", "D", ")", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "TIP60WT", "or", "empty", "vector", "were", "treated", "with", "2µM", "SNS", "-", "032", "(", "SNS", ")", "for", "2", "hours", "as", "indicated", ".", "FLAG", "-", "immunoprecipitations", "were", "performed", "from", "nuclear", "extracts", ".", "This", "material", "and", "input", "lysate", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "(", "E", ")", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "TIP60WT", ",", "FLAG", "-", "TIP60S90A", "or", "empty", "vector", "(", "vec", ")", "were", "subjected", "to", "ChIP", "using", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "Immunoprecipitated", "DNA", "and", "input", "were", "subjected", "to", "quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "using", "primers", "annealing", "in", "the", "myc", "locus", "about", "50bp", "upstream", "(", "myc", "+", "50", ")", "or", "about", "500", "bp", "downstream", "(", "myc", "-", "500", ")", "of", "the", "transcription", "start", "site", ".", "Promoter", "occupancy", "of", "FLAG", "-", "TIP60WT", "or", "FLAG", "-", "TIP60S90A", "was", "determined", "as", "percent", "input", "in", "relation", "to", "FLAG", "-", "TIP60WT", ".", "The", "graphs", "and", "error", "bars", "represent", "mean", "and", "standard", "deviation", "of", "three", "individual", "experiments", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "Bonferroni", "\"", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "myc", "+", "50", "WT", "vs", ".", "S90A", "p", "=", "0", ",", "0289", ",", "myc", "-", "500", "WT", "vs", ".", "S90A", "p", "=", "0", ",", "0155", "(", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ")", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 (A) FLAG- immunoprecipitations were performed from nuclear extracts of U2OS cells stably expressing FLAG-tagged TIP60WT, TIP60S90A, TIP60S86A or empty vector (vec). Immunoprecipitated material and input lysate were subjected to Western blot analysis (B) The experiment as shown in (A) was repeated three times. The graphs and error bars represent mean and standard deviation of these three individual experiments (one-way ANOVA, Fisher\"s LSD test, WT vs. S86A p=0,5992, WT vs. S90A p=0,0429, S90A vs. S86A p=0,0176 (*p < 0,05; n.s. not significant, p > 0,05))  (C) HEK293 cells were transfected with pcDNA3.1 encoding FLAG-TIP60WT, FLAG-TIP60S90A or empty vector. FLAG-immunoprecipitations were performed from nuclear extracts. Immunoprecipitated material and input lysate were subjected to Western blot analysis  (D) U2OS cells stably expressing FLAG-TIP60WT or empty vector were treated with 2µM SNS-032 (SNS) for 2 hours as indicated. FLAG-immunoprecipitations were performed from nuclear extracts. This material and input lysate were subjected to Western blot analysis  (E) U2OS cells stably expressing FLAG-TIP60WT, FLAG-TIP60S90A or empty vector (vec) were subjected to ChIP using anti-FLAG antibody. Immunoprecipitated DNA and input were subjected to quantitative real-time PCR using primers annealing in the myc locus about 50bp upstream (myc+50) or about 500 bp downstream (myc-500) of the transcription start site. Promoter occupancy of FLAG-TIP60WT or FLAG-TIP60S90A was determined as percent input in relation to FLAG -TIP60WT. The graphs and error bars represent mean and standard deviation of three individual experiments (one-way ANOVA, Bonferroni\"s multiple comparison test, myc+50 WT vs. S90A p=0,0289, myc-500 WT vs. S90A p=0,0155 (*p < 0,05))"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "TIP60WT", ",", "FLAG", "-", "TIP60S90A", "or", "empty", "vector", "(", "vec", ")", "were", "treated", "with", "2µM", "SNS", "-", "032", "(", "SNS", ")", ",", "2µM", "JQ1", "(", "JQ1", ")", "or", "the", "solvent", "DMSO", "(", "d", ".", ")", "for", "2h", "as", "indicated", ".", "FLAG", "-", "immunoprecipitations", "were", "performed", "from", "nuclear", "extracts", ".", "Immunoprecipitated", "material", "and", "input", "lysate", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "(", "B", ")", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "TIP60WT", "were", "treated", "with", "2µM", "JQ1", "(", "JQ1", ")", "for", "2h", ".", "The", "nucleus", "was", "fractionated", "into", "nucleoplasm", "and", "chromatin", ".", "Both", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blotting", "(", "C", ")", "HEK293", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "pcDNA4", "encoding", "Brd4", "or", "GFP", ".", "The", "nucleus", "was", "fractionated", "into", "nucleoplasm", "and", "chromatin", ".", "Both", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blotting"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 (A) U2OS cells stably expressing FLAG-TIP60WT, FLAG-TIP60S90A or empty vector (vec) were treated with 2µM SNS-032 (SNS), 2µM JQ1 (JQ1) or the solvent DMSO (d.) for 2h as indicated. FLAG-immunoprecipitations were performed from nuclear extracts. Immunoprecipitated material and input lysate were subjected to Western blot analysis (B) U2OS cells stably expressing FLAG-TIP60WT were treated with 2µM JQ1 (JQ1) for 2h. The nucleus was fractionated into nucleoplasm and chromatin. Both fractions were analysed by Western blotting  (C) HEK293 cells were transiently transfected with pcDNA4 encoding Brd4 or GFP. The nucleus was fractionated into nucleoplasm and chromatin. Both fractions were analysed by Western blotting "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "siRNA", "pool", "targeting", "human", "TIP60", "(", "Dharmacon", ")", "or", "luciferase", "(", "Dharmacon", ")", ".", "The", "nuclear", "lysates", "were", "analysed", "by", "Western", "blotting", "24h", "after", "transfection", "(", "B", ")", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "TIP60WT", ",", "FLAG", "-", "TIP60S90A", ",", "FLAG", "-", "TIP60S86A", "or", "empty", "vector", "(", "vec", ")", "were", "analysed", "by", "Western", "blotting", "60", "hours", "after", "viral", "transduction"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 (A) U2OS cells were transfected with a siRNA pool targeting human TIP60 (Dharmacon) or luciferase (Dharmacon). The nuclear lysates were analysed by Western blotting 24h after transfection  (B) U2OS cells stably expressing FLAG-TIP60WT, FLAG-TIP60S90A, FLAG-TIP60S86A or empty vector (vec) were analysed by Western blotting 60 hours after viral transduction "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ",", "B", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "(", "A", ",", "n", "=", "4", ")", "or", "isolated", "vaginal", "LCs", "(", "B", ",", "n", "=", "5", ")", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "a", "variety", "of", "vaginal", "microbiota", "and", "subsequently", "exposed", "to", "HIV", "-", "1", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "Epidermal", "LC", "were", "stimulated", "with", "L", ".", "crispatus", "(", "LC", ")", ",", "M", ".", "elsdenii", "(", "ME", ")", ",", "and", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "whereas", "vaginal", "LCs", "were", "additionally", "stimulated", "with", "L", ".", "iners", "(", "LI", ")", ",", "G", ".", "vaginalis", "(", "GV", ")", ",", "and", "A", ".", "vaginae", "(", "AV", ")", ".", "After", "five", "days", ",", "HIV", "-", "1", "p24", "in", "LCs", "was", "determined", "by", "an", "intracellular", "staining", "for", "CD1a", "and", "p24", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "(", "n", "=", "3", ")", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "B", ".", "fragilis", "(", "BF", ")", ",", "B", ".", "thetaiotaomicron", "(", "BT", ")", ",", "P", ".", "amnii", "(", "PA", ")", ",", "P", ".", "bivia", "(", "PB", ")", ",", "P", ".", "copri", "(", "PC", ")", ",", "and", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", ",", "followed", "by", "HIV", "-", "1", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", "infection", "for", "5", "days", "and", "HIV", "-", "1", "p24", "determination", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "D", ")", "Vaginal", "epithelium", "explants", "(", "n", "=", "8", ")", "were", "exposed", "to", "vaginal", "microbiota", "as", "described", "for", "isolated", "vaginal", "LCs", ".", "HIV", "-", "1", "p24", "in", "emigrated", "LCs", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A, B) Isolated epidermal LCs (A, n = 4) or isolated vaginal LCs (B, n = 5) were stimulated O/N with a variety of vaginal microbiota and subsequently exposed to HIV-1 (SF162; MOI 0.5). Epidermal LC were stimulated with L. crispatus (LC), M. elsdenii (ME), and P. timonensis (PT) whereas vaginal LCs were additionally stimulated with L. iners (LI), G. vaginalis (GV), and A. vaginae (AV). After five days, HIV-1 p24 in LCs was determined by an intracellular staining for CD1a and p24 by flow cytometry. Data information: symbols represent independent donors. Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001.(C) Isolated epidermal LCs (n = 3) were stimulated O/N with B. fragilis (BF), B. thetaiotaomicron (BT), P. amnii (PA), P. bivia (PB), P. copri (PC), and P. timonensis (PT), followed by HIV-1 (SF162; MOI 0.5) infection for 5 days and HIV-1 p24 determination by flow cytometry. Data information: symbols represent independent donors. Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001.(D) Vaginal epithelium explants (n = 8) were exposed to vaginal microbiota as described for isolated vaginal LCs. HIV-1 p24 in emigrated LCs was determined by flow cytometry. Data information: symbols represent independent donors. Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "D", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "(", "A", ",", "n", "=", "2", ")", ",", "isolated", "vaginal", "LCs", "(", "B", "-", "C", ",", "both", "n", "=", "3", ")", ",", "or", "vaginal", "explants", "(", "D", ",", "n", "=", "5", ")", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "and", "exposed", "to", "HIV", "-", "1", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", "for", "five", "days", "in", "presence", "or", "absence", "of", "HIV", "-", "1", "replication", "inhibitors", "(", "Inh", ")", "zidovudine", "(", "AZT", ")", ",", "tenofovir", "(", "TFV", ")", ",", "iamivudine", "(", "3TC", ")", "or", "indinavir", "(", "IDV", ")", ".", "HIV", "-", "1", "levels", "were", "determined", "by", "intracellular", "staining", "for", "HIV", "-", "1", "p24", "using", "flow", "cytometry", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "G", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "(", "n", "=", "3", ")", "were", "treated", "with", "T20", ",", "Maraviroc", "(", "MAR", ")", ",", "neutralizing", "antibodies", "against", "CD4", "(", "αCD4", ")", "and", "isotype", "control", "(", "Iso", ")", ",", "followed", "by", "O", "/", "N", "stimulation", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", ".", "Next", ",", "LCs", "were", "exposed", "to", "HIV", "-", "1", "for", "five", "days", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "Intracellular", "HIV", "-", "1", "p24", "levels", "were", "determined", "using", "flow", "cytometry", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-D) Isolated epidermal LCs (A, n = 2), isolated vaginal LCs (B-C, both n = 3), or vaginal explants (D, n = 5) were stimulated O/N with P. timonensis (PT) and exposed to HIV-1 (SF162; MOI 0.5) for five days in presence or absence of HIV-1 replication inhibitors (Inh) zidovudine (AZT), tenofovir (TFV), iamivudine (3TC) or indinavir (IDV). HIV-1 levels were determined by intracellular staining for HIV-1 p24 using flow cytometry. Data information: symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, and ***p <0.001.(G) Isolated epidermal LCs (n = 3) were treated with T20, Maraviroc (MAR), neutralizing antibodies against CD4 (αCD4) and isotype control (Iso), followed by O/N stimulation with P. timonensis (PT). Next, LCs were exposed to HIV-1 for five days (SF162; MOI 0.5). Intracellular HIV-1 p24 levels were determined using flow cytometry. Data information: symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, and ***p <0.001."}
{"words": ["Figure", "3Immature", "vaginal", "(", "vLC", ")", "and", "epidermal", "LCs", "(", "eLC", ")", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "L", ".", "crispatus", "(", "LC", ")", ",", "M", ".", "elsdenii", "(", "ME", ")", ",", "or", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "and", "activation", "phenotype", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Same", "donor", "emigrated", "epidermal", "LCs", "(", "mLC", ")", "served", "as", "a", "matured", "and", "activated", "control", ".", "Same", "donor", "data", "of", "emigrated", "vaginal", "LCs", "could", "not", "be", "obtained", "due", "to", "limited", "amount", "of", "tissue", "(", "N", ".", "D", ".", ")", ".", "Representative", "plots", "of", "vaginal", "(", "A", ")", "or", "epidermal", "(", "B", ")", "donors", "and", "combined", "experiments", "(", "MFI", "expression", "relative", "to", "untreated", "condition", ")", "of", "CD80", ",", "CD86", "and", "CCR7", "surface", "expression", "are", "shown", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Immature", "vaginal", "(", "vLC", ")", "and", "epidermal", "LCs", "(", "eLC", ")", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "L", ".", "crispatus", "(", "LC", ")", ",", "M", ".", "elsdenii", "(", "ME", ")", ",", "or", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "and", "activation", "phenotype", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Same", "donor", "emigrated", "epidermal", "LCs", "(", "mLC", ")", "served", "as", "a", "matured", "and", "activated", "control", ".", "Same", "donor", "data", "of", "emigrated", "vaginal", "LCs", "could", "not", "be", "obtained", "due", "to", "limited", "amount", "of", "tissue", "(", "N", ".", "D", ".", ")", ".", "CD80", "(", "C", ",", "n", "=", "3", ")", ",", "CD86", "(", "D", "n", "=", "3", ")", ",", "and", "CCR7", "(", "E", ",", "n", "=", "3", ")", "surface", "expression", "are", "shown", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Ex", "vivo", "skin", "explants", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "L", ".", "crispatus", "(", "LC", ")", ",", "M", ".", "elsdenii", "(", "ME", ")", ",", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "or", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "and", "at", "day", "3", "post", "-", "inoculation", ",", "emigrated", "LCs", "were", "collected", ",", "washed", "and", "activation", "phenotype", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Cells", "were", "analysed", "for", "CD1a", "expression", "and", "the", "absolute", "number", "of", "CD1a", "-", "positive", "cells", ",", "i", ".", "e", ".", "LCs", ",", "migrated", "from", "the", "epidermis", "was", "determined", "using", "counting", "beads", ",", "the", "graph", "shows", "the", "migration", "relative", "to", "the", "untreated", "condition", "(", "F", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "CD1a", "-", "positive", "cells", ",", "i", ".", "e", ".", "LCs", ",", "were", "analysed", "using", "flow", "cytometry", "and", "the", "graphs", "show", "combined", "experiments", "(", "MFI", "expression", "relative", "to", "untreated", "condition", ")", "of", "CD80", "(", "G", ",", "n", "=", "5", ")", "and", "CD86", "(", "H", "n", "=", "5", ")", "surface", "expression", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immature vaginal (vLC) and epidermal LCs (eLC) were stimulated O/N with L. crispatus (LC), M. elsdenii (ME), or P. timonensis (PT) and activation phenotype was determined by flow cytometry. Same donor emigrated epidermal LCs (mLC) served as a matured and activated control. Same donor data of emigrated vaginal LCs could not be obtained due to limited amount of tissue (N.D.). Representative plots of vaginal (A) or epidermal (B) donors and combined experiments (MFI expression relative to untreated condition) of CD80 , CD86 and CCR7 surface expression are shown. Data information: symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001.Immature vaginal (vLC) and epidermal LCs (eLC) were stimulated O/N with L. crispatus (LC), M. elsdenii (ME), or P. timonensis (PT) and activation phenotype was determined by flow cytometry. Same donor emigrated epidermal LCs (mLC) served as a matured and activated control. Same donor data of emigrated vaginal LCs could not be obtained due to limited amount of tissue (N.D.). CD80 (C, n = 3), CD86 (D n = 3), and CCR7 (E, n = 3) surface expression are shown. Data information: symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001.Ex vivo skin explants were stimulated O/N with L. crispatus (LC), M. elsdenii (ME), P. timonensis (PT) or poly(I:C) and at day 3 post-inoculation, emigrated LCs were collected, washed and activation phenotype was determined by flow cytometry. Cells were analysed for CD1a expression and the absolute number of CD1a-positive cells, i.e. LCs, migrated from the epidermis was determined using counting beads, the graph shows the migration relative to the untreated condition (F, n = 5). CD1a-positive cells, i.e. LCs, were analysed using flow cytometry and the graphs show combined experiments (MFI expression relative to untreated condition) of CD80 (G, n = 5) and CD86 (H n = 5) surface expression. Data information: symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "4Isolated", "vaginal", "LCs", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "followed", "by", "HIV", "-", "1", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", "exposure", ".", "(", "A", ")", "Intracellular", "HIV", "-", "1", "detection", "was", "determined", "by", "confocal", "microscopy", "(", "Hoechst", "in", "blue", ",", "HIV", "-", "1", "p24", "in", "green", ")", ",", "scale", "bar", "represents", "5", "µm", "(", "representative", "donor", ")", ".", "(", "B", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "followed", "by", "a", "4", "-", "hour", "exposure", "to", "HIV", "-", "1", ".", "HIV", "-", "1", "p24", "was", "determined", "by", "ELISA", "after", "trypsin", "treatment", "and", "lysis", "of", "LCs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "followed", "by", "HIV", "-", "1", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", "exposure", "for", "3", "days", ".", "After", "3", "days", ",", "LCs", "were", "treated", "with", "PBS", "or", "trypsin", "and", "HIV", "-", "1", "p24", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Isolated", "vaginal", "LCs", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "followed", "by", "infection", "with", "VSV", "-", "g", "-", "BlaM", "-", "Vpr", "fusion", "(", "positive", "control", ")", "and", "NL4", ".", "3Bal", "-", "BlaM", "-", "Vpr", "fusion", ".", "Figure", "shows", "representative", "plots", "(", "D", ")", "and", "pooled", "data", "(", "E", ",", "n", "=", "3", ")", "of", "viral", "fusion", "as", "determined", "by", "β", "-", "lactamase", "-", "Vpr", "(", "BlaM", "-", "Vpr", ")", "activity", ".", "Data", "information", ":", "Symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "F", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "followed", "by", "HIV", "-", "1", "exposure", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", "in", "presence", "or", "absence", "of", "anti", "-", "langerin", "(", "10E2", ")", "or", "mannan", "(", "MAN", ")", ".", "HIV", "-", "1", "p24", "content", "was", "determined", "by", "ELISA", "after", "trypsin", "-", "treatment", "and", "subsequent", "lysis", "of", "LCs", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Data", "information", ":", "Symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "G", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "followed", "by", "treatment", "with", "Rapamycin", "(", "µM", ")", "and", "exposure", "to", "HIV", "-", "1", "(", "SF162", ")", ".", "After", "3", "days", "HIV", "-", "1", "p24", "was", "measured", "by", "ELISA", "after", "trypsin", "treatment", "and", "lysis", "of", "LCs", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Data", "information", ":", "Symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Isolated vaginal LCs were stimulated O/N with P. timonensis (PT) followed by HIV-1 (SF162; MOI 0.5) exposure. (A) Intracellular HIV-1 detection was determined by confocal microscopy (Hoechst in blue, HIV-1 p24 in green), scale bar represents 5 µm (representative donor).(B) Isolated epidermal LCs were stimulated O/N with P. timonensis (PT) followed by a 4-hour exposure to HIV-1. HIV-1 p24 was determined by ELISA after trypsin treatment and lysis of LCs (n = 3). Data information: Symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001.(C) Isolated epidermal LCs were stimulated O/N with P. timonensis (PT) followed by HIV-1 (SF162; MOI 0.5) exposure for 3 days. After 3 days, LCs were treated with PBS or trypsin and HIV-1 p24 was determined by flow cytometry (n = 3). Data information: Symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001.(D, E) Isolated vaginal LCs were stimulated O/N with P. timonensis (PT) followed by infection with VSV-g-BlaM-Vpr fusion (positive control) and NL4.3Bal-BlaM-Vpr fusion. Figure shows representative plots (D) and pooled data (E, n = 3) of viral fusion as determined by β-lactamase-Vpr (BlaM-Vpr) activity. Data information: Symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001.(F) Isolated epidermal LCs were stimulated O/N with P. timonensis (PT) followed by HIV-1 exposure (SF162; MOI 0.5) in presence or absence of anti-langerin (10E2) or mannan (MAN). HIV-1 p24 content was determined by ELISA after trypsin-treatment and subsequent lysis of LCs (n = 2). Data information: Symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001.(G) Isolated epidermal LCs were stimulated O/N with P. timonensis (PT) followed by treatment with Rapamycin (µM) and exposure to HIV-1 (SF162). After 3 days HIV-1 p24 was measured by ELISA after trypsin treatment and lysis of LCs (n = 2). Data information: Symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, **p  < 0.01, ***p <0.001, and ****p < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "followed", "by", "HIV", "-", "1", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", "exposure", ".", "LCs", "were", "subjected", "to", "repetitive", "freeze", "-", "thaw", "cycles", "and", "cell", "lysates", "were", "added", "to", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "cell", "line", ".", "HIV", "-", "1", "infection", "of", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "was", "determined", "by", "an", "intracellular", "staining", "for", "p24", "by", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ",", "Ex", "vivo", "skin", "explants", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "At", "day", "2", "post", "-", "inoculation", ",", "emigrated", "LCs", "were", "collected", ",", "washed", "and", "co", "-", "cultured", "with", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "cells", "for", "3", "days", ".", "Cells", "were", "analysed", "for", "CD1a", "expression", "and", "p24", "content", "by", "flow", "cytometry", "and", "here", "presented", "as", "representative", "plots", "(", "B", ")", "C", ")", "Ex", "vivo", "skin", "explants", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "L", ".", "crispatus", "(", "LC", ")", ",", "M", ".", "elsdenii", "(", "ME", ")", ",", "or", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "and", "inoculated", "with", "HIV", "-", "1", "(", "JRCSF", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", "in", "presence", "or", "absence", "of", "tenofovir", ".", "At", "day", "2", "post", "-", "inoculation", ",", "emigrated", "LCs", "were", "collected", ",", "washed", "and", "co", "-", "cultured", "with", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "cells", "for", "3", "days", ".", "pooled", "data", "of", "HIV", "-", "1", "positive", "cells", "(", "%", ")", "of", "the", "CD1a", "negative", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "cells", "(", "C", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "Symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "D", ")", "Ex", "vivo", "skin", "explants", "were", "stimulated", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", ",", "pre", "-", "treated", "with", "T20", "or", "maraviroc", "(", "MAR", ")", "and", "exposed", "to", "HIV", "-", "1", "(", "JRCSF", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", "for", "2", "days", ",", "after", "which", "the", "migratory", "fraction", "was", "co", "-", "cultured", "with", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "cells", ".", "HIV", "-", "1", "positive", "cells", "(", "%", ")", "of", "the", "CD1a", "-", "negative", "fraction", ",", "i", ".", "e", ".", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "cells", ",", "were", "determined", "using", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Data", "information", ":", "Symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Isolated", "vaginal", "LCs", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "and", "infected", "with", "HIV", "-", "1", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "After", "3", "days", "LCs", "were", "washed", "and", "co", "-", "cultured", "with", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", ".", "Infection", "was", "analysed", "by", "flow", "cytometry", "and", "here", "shown", "as", "representative", "plots", "(", "E", ")", "and", "pooled", "data", "of", "HIV", "-", "1", "positive", "cells", "(", "%", ")", "of", "the", "CD1a", "-", "negative", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "cells", "(", "F", ",", "n", "=", "2", ")", ".", "Data", "information", ":", "Symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Isolated epidermal LCs were stimulated O/N with P. timonensis (PT) followed by HIV-1 (SF162; MOI 0.5) exposure. LCs were subjected to repetitive freeze-thaw cycles and cell lysates were added to U87.CD4.CCR5 cell line. HIV-1 infection of U87.CD4.CCR5 was determined by an intracellular staining for p24 by flow cytometry (n = 3). Data information: Symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, and ***p <0.001.(B, Ex vivo skin explants were stimulated O/N with P. timonensis (PT) At day 2 post-inoculation, emigrated LCs were collected, washed and co-cultured with U87.CD4.CCR5 cells for 3 days. Cells were analysed for CD1a expression and p24 content by flow cytometry and here presented as representative plots (B)C) Ex vivo skin explants were stimulated O/N with L. crispatus (LC), M. elsdenii (ME), or P. timonensis (PT) and inoculated with HIV-1 (JRCSF; MOI 0.5) in presence or absence of tenofovir. At day 2 post-inoculation, emigrated LCs were collected, washed and co-cultured with U87.CD4.CCR5 cells for 3 days. pooled data of HIV-1 positive cells (%) of the CD1a negative U87.CD4.CCR5 cells (C, n = 4). Data information: Symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, and ***p <0.001.(D) Ex vivo skin explants were stimulated with P. timonensis (PT), pre-treated with T20 or maraviroc (MAR) and exposed to HIV-1 (JRCSF; MOI 0.5) for 2 days, after which the migratory fraction was co-cultured with U87.CD4.CCR5 cells. HIV-1 positive cells (%) of the CD1a-negative fraction, i.e. U87.CD4.CCR5 cells, were determined using flow cytometry (n = 5). Data information: Symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, and ***p <0.001.(E, F) Isolated vaginal LCs were stimulated O/N with P. timonensis (PT) and infected with HIV-1 (SF162; MOI 0.5). After 3 days LCs were washed and co-cultured with U87.CD4.CCR5. Infection was analysed by flow cytometry and here shown as representative plots (E) and pooled data of HIV-1 positive cells (%) of the CD1a-negative U87.CD4.CCR5 cells (F, n = 2). Data information: Symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05, **p  < 0.01, and ***p <0.001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "Isolated", "epidermal", "LCs", "were", "stimulated", "by", "different", "Prevotella", "spp", ".", "and", "Bacteriodus", "spp", ".", "followed", "by", "T", "/", "F", "variant", "(", "CH058", ";", "MOI", "0", ".", "25", ")", "exposure", "in", "presence", "or", "absence", "of", "AZT", "(", "A", ",", "n", "=", "3", ")", "or", "tenofovir", "(", "B", ",", "n", "=", "2", ")", ".", "A", "lower", "MOI", "was", "used", "due", "to", "higher", "susceptibility", "of", "LCs", "for", "CH058", "than", "for", "laboratory", "strains", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ".", "(", "C", ")", "HIV", "-", "1", "uptake", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Ex", "vivo", "skin", "explants", "(", "n", "=", "3", ")", "were", "stimulated", "O", "/", "N", "with", "P", ".", "timonensis", "(", "PT", ")", "followed", "by", "pre", "-", "treatment", "with", "tenofovir", "(", "TFV", ")", ".", "After", "pre", "-", "treatment", ",", "skin", "explants", "were", "inoculated", "with", "lab", "-", "adapted", "strain", "(", "SF162", ";", "MOI", "0", ".", "25", ")", "or", "HIV", "-", "1", "T", "/", "F", "strain", "(", "CHO58", ";", "MOI", "0", ".", "25", ")", ".", "After", "2", "days", "the", "migratory", "fraction", "was", "collected", "and", "co", "-", "cultured", "with", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "cells", ".", "Cells", "were", "analysed", "for", "CD1a", "expression", "and", "p24", "content", "in", "U87", ".", "CD4", ".", "CCR5", "cells", "by", "flow", "cytometry", ".", "A", "lower", "MOI", "was", "used", "due", "to", "higher", "susceptibility", "of", "LCs", "for", "CH058", "than", "for", "laboratory", "strain", "SF162", ".", "Data", "information", ":", "symbols", "represent", "independent", "donors", "(", "mean", "of", "duplicates", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A, B) Isolated epidermal LCs were stimulated by different Prevotella spp. and Bacteriodus spp. followed by T/F variant (CH058; MOI 0.25) exposure in presence or absence of AZT (A, n = 3) or tenofovir (B, n = 2). A lower MOI was used due to higher susceptibility of LCs for CH058 than for laboratory strains. Data information: symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05.(C) HIV-1 uptake was determined by flow cytometry. Ex vivo skin explants (n = 3) were stimulated O/N with P. timonensis (PT) followed by pre-treatment with tenofovir (TFV). After pre-treatment, skin explants were inoculated with lab-adapted strain (SF162; MOI 0.25) or HIV-1 T/F strain (CHO58; MOI 0.25). After 2 days the migratory fraction was collected and co-cultured with U87.CD4.CCR5 cells. Cells were analysed for CD1a expression and p24 content in U87.CD4.CCR5 cells by flow cytometry. A lower MOI was used due to higher susceptibility of LCs for CH058 than for laboratory strain SF162. Data information: symbols represent independent donors (mean of duplicates). Data are mean ± SD. Two-tailed t-test, *p  < 0.05."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ",", "Sequential", "dissociation", "of", "EI24", "and", "BiP", "from", "IRE1", "elicits", "a", "two", "-", "phase", "activation", "of", "IRE1", "in", "response", "to", "ER", "stress", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "4", "μM", "tunicamycin", "(", "TM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "The", "interactions", "of", "EI24", "and", "BiP", "with", "IRE1", "were", "analyzed", "by", "immunoprecipitation", "(", "D", ")", "EI24", "knockout", "promotes", "the", "activation", "of", "IRE1", ",", "but", "not", "PERK", "or", "ATF6", ".", "Control", "(", "sgGFP", ")", "and", "EI24", "knockout", "(", "sgEI24", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "4", "μM", "TM", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Protein", "expression", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "(", "G", ")", "Expression", "of", "Flag", "-", "EI24", "in", "EI24", "knockout", "cells", "inhibits", "IRE1", "activity", ".", "Flag", "-", "Metap2", "served", "as", "the", "control", ".", "Cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "cDNAs", "were", "treated", "with", "or", "without", "4", "μM", "TM", "for", "2", "hr", ".", "Protein", "expression", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B, Sequential dissociation of EI24 and BiP from IRE1 elicits a two-phase activation of IRE1 in response to ER stress. Cells were treated with 4 μM tunicamycin (TM) for the indicated times. The interactions of EI24 and BiP with IRE1 were analyzed by immunoprecipitation(D) EI24 knockout promotes the activation of IRE1, but not PERK or ATF6. Control (sgGFP) and EI24 knockout (sgEI24) HeLa cells were treated with 4 μM TM for the indicated times. Protein expression was analyzed by immunoblotting.(G) Expression of Flag-EI24 in EI24 knockout cells inhibits IRE1 activity. Flag-Metap2 served as the control. Cells transfected with the indicated cDNAs were treated with or without 4 μM TM for 2 hr. Protein expression was analyzed by immunoblotting."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "EI24", "persistently", "localizes", "on", "the", "ER", "regardless", "of", "the", "presence", "or", "absence", "of", "ER", "stress", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "Flag", "-", "EI24", "were", "treated", "with", "or", "without", "4", "μM", "tunicamycin", "(", "TM", ")", "for", "2", "hr", ".", "Colocalization", "of", "EI24", "with", "ER", "was", "analyzed", ".", "KDEL", "-", "mCherry", ",", "ER", "marker", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "The", "C", "-", "terminus", "of", "EI24", "is", "required", "for", "IRE1", "binding", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "EI24", "mutants", "were", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ",", "after", "which", "protein", "-", "protein", "interactions", "were", "analyzed", "by", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ".", "The", "star", "represents", "IgG", "light", "chains", ".", "(", "E", ")", "The", "C", "-", "terminus", "of", "EI24", "binds", "to", "IRE1", "in", "a", "persistent", "fashion", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "EI24", "domains", "were", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Protein", "-", "protein", "interactions", "were", "analyzed", "by", "IP", ".", "The", "star", "represents", "IgG", "light", "chains", ".", "(", "(", "I", ")", "EI24", "overexpression", "cannot", "prevent", "the", "activation", "of", "the", "phospho", "-", "mimicking", "(", "3SE", ")", "IRE1", "mutant", ".", "Wild", "-", "type", "and", "IRE1", "3SE", "knock", "-", "in", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "vector", "or", "Flag", "-", "EI24", ".", "Transfected", "cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Protein", "expressions", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "(", "L", ")", "Expression", "of", "full", "-", "length", "EI24", "or", "the", "△", "TM34", "or", "△", "C", "mutant", "in", "EI24", "knockout", "HeLa", "cells", "for", "comparison", "of", "their", "functions", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "EI24", "mutants", "were", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Protein", "expressions", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) EI24 persistently localizes on the ER regardless of the presence or absence of ER stress. HeLa cells stably expressing Flag-EI24 were treated with or without 4 μM tunicamycin (TM) for 2 hr. Colocalization of EI24 with ER was analyzed. KDEL-mCherry, ER marker. Scale bar, 10 μm.(D) The C-terminus of EI24 is required for IRE1 binding. HeLa cells transfected with the indicated EI24 mutants were treated as in (B), after which protein-protein interactions were analyzed by immunoprecipitation (IP). The star represents IgG light chains. (E) The C-terminus of EI24 binds to IRE1 in a persistent fashion. HeLa cells transfected with the indicated EI24 domains were treated as in (B). Protein-protein interactions were analyzed by IP. The star represents IgG light chains. ((I) EI24 overexpression cannot prevent the activation of the phospho-mimicking (3SE) IRE1 mutant. Wild-type and IRE1 3SE knock-in HeLa cells were transfected with empty vector or Flag-EI24. Transfected cells were treated as in (B). Protein expressions were analyzed by immunoblotting.(L) Expression of full-length EI24 or the △TM34 or △C mutant in EI24 knockout HeLa cells for comparison of their functions. HeLa cells transfected with the indicated EI24 mutants were treated as in (B). Protein expressions were analyzed by immunoblotting."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ",", "C", ")", "EI24", "knockout", "causes", "resting", "-", "state", "ER", "calcium", "reduction", "(", "B", ")", "and", "cytosolic", "calcium", "elevation", "(", "C", ")", "under", "ER", "stress", ".", "Control", "(", "sgGFP", ")", "and", "EI24", "knockout", "(", "sgEI24", ")", "HeLa", "cells", "were", "first", "perfused", "in", "TM", "-", "free", "buffer", ",", "and", "switched", "to", "the", "buffer", "containing", "4", "μM", "TM", "to", "induce", "ER", "stress", "where", "indicated", ".", "Resting", "state", "calcium", "levels", "in", "the", "ER", "(", "B", ")", "and", "cytosol", "(", "C", ")", "with", "or", "without", "TM", "are", "displayed", "in", "columns", ".", "Data", "information", ":", "N", "=", "20", "cells", "for", "one", "replicate", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "ns", ",", "no", "significant", "difference", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "Knockdown", "of", "IP3R1", "prevents", "calcium", "mobilization", "from", "the", "ER", "to", "the", "cytosol", ".", "The", "measurements", "were", "similarly", "performed", "as", "in", "(", "E", ")", ",", "and", "were", "from", "the", "same", "batch", "of", "cells", ".", "Data", "information", ":", "N", "=", "20", "cells", "for", "one", "replicate", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "ns", ",", "no", "significant", "difference", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "I", ")", "Wild", "-", "type", "EI24", ",", "but", "not", "the", "TM34", "-", "or", "C", "-", "terminus", "-", "deleted", "mutant", ",", "preserves", "ER", "calcium", "stores", "in", "EI24", "knockout", "cells", ".", "The", "measurements", "were", "similarly", "performed", "as", "in", "(", "E", ")", ",", "and", "were", "from", "the", "same", "batch", "of", "cells", ".", "Data", "information", ":", "N", "=", "20", "cells", "for", "one", "replicate", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "ns", ",", "no", "significant", "difference", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B, C) EI24 knockout causes resting-state ER calcium reduction (B) and cytosolic calcium elevation (C) under ER stress. Control (sgGFP) and EI24 knockout (sgEI24) HeLa cells were first perfused in TM-free buffer, and switched to the buffer containing 4 μM TM to induce ER stress where indicated. Resting state calcium levels in the ER (B) and cytosol (C) with or without TM are displayed in columns. Data information: N = 20 cells for one replicate. Data are mean ± SEM (n = 3 technical replicates). ns, no significant difference; ***P < 0.001; two-tailed Student's t-test.(G) Knockdown of IP3R1 prevents calcium mobilization from the ER to the cytosol. The measurements were similarly performed as in (E), and were from the same batch of cells. Data information: N = 20 cells for one replicate. Data are mean ± SEM (n = 3 technical replicates). ns, no significant difference; ***P < 0.001; two-tailed Student's t-test.(I) Wild-type EI24, but not the TM34- or C-terminus-deleted mutant, preserves ER calcium stores in EI24 knockout cells. The measurements were similarly performed as in (E), and were from the same batch of cells. Data information: N = 20 cells for one replicate. Data are mean ± SEM (n = 3 technical replicates). ns, no significant difference; ***P < 0.001; two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Knockdown", "of", "IP3R1", "prevents", "ER", "stress", "-", "induced", "apoptosis", "in", "EI24", "knockout", "cells", ".", "Cells", "were", "cultured", "with", "or", "without", "4", "μM", "TM", "for", "8", "hr", ".", "Percentages", "of", "early", "apoptotic", "cells", "were", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "information", ":", "N", "≈", "10000", "cells", "for", "one", "biological", "replicate", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "or", "4", "biologically", "independent", "replicates", ")", ".", "ns", ",", "no", "significant", "difference", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "D", ")", "Knockdown", "of", "IP3R1", "prevents", "ER", "stress", "-", "induced", "apoptosis", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "4", "μM", "TM", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Protein", "expressions", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "Reintroduction", "of", "full", "-", "length", "EI24", ",", "but", "not", "the", "TM34", "-", "or", "C", "-", "terminus", "-", "deleted", "mutant", "(", "F", ",", "G", ")", "or", "the", "C", "-", "terminus", "alone", "(", "H", ")", ",", "inhibited", "ER", "stress", "-", "induced", "apoptosis", "in", "EI24", "knockout", "cells", ".", "Cells", "treated", "with", "or", "without", "TM", "were", "analyzed", "for", "apoptosis", "by", "flow", "cytometry", "(", "F", ",", "H", ")", "or", "by", "immunoblotting", "(", "G", ")", ".", "Arrows", "in", "(", "H", ")", "denote", "decreased", "or", "increased", "apoptotic", "levels", ".", "Data", "information", ":", "N", "≈", "10000", "cells", "for", "one", "biological", "replicate", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "or", "4", "biologically", "independent", "replicates", ")", ".", "ns", ",", "no", "significant", "difference", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "for", "F", ")", ",", "one", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "for", "(", "H", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Knockdown of IP3R1 prevents ER stress-induced apoptosis in EI24 knockout cells. Cells were cultured with or without 4 μM TM for 8 hr. Percentages of early apoptotic cells were measured by flow cytometry. Data information: N ≈ 10000 cells for one biological replicate. Data are mean ± SEM (n = 3 or 4 biologically independent replicates). ns, no significant difference; ***P < 0.001; two-tailed Student's t-test(D) Knockdown of IP3R1 prevents ER stress-induced apoptosis. Cells were treated with 4 μM TM for the indicated times. Protein expressions were analyzed by immunoblotting.(F-H) Reintroduction of full-length EI24, but not the TM34- or C-terminus-deleted mutant (F, G) or the C-terminus alone (H), inhibited ER stress-induced apoptosis in EI24 knockout cells. Cells treated with or without TM were analyzed for apoptosis by flow cytometry (F, H) or by immunoblotting (G). Arrows in (H) denote decreased or increased apoptotic levels. Data information: N ≈ 10000 cells for one biological replicate. Data are mean ± SEM (n = 3 or 4 biologically independent replicates). ns, no significant difference; ***P < 0.001; two-tailed Student's t-test for F), one-tailed Student's t-test for (H)."}
{"words": ["Figure", "1B", "t", "-", "SNE", "plots", "showing", "integrated", "analysis", "of", "Prrx1", "-", "Cre", "-", "(", "8", "-", "week", "-", "old", "mice", ",", "n", "=", "3", "males", ")", "and", "Lepr", "-", "Cre", "-", "traced", "(", "8", "-", "week", "-", "old", "mice", ",", "n", "=", "4", "males", ")", "cells", ".", "Cells", "were", "colored", "by", "clusters", "(", "left", ")", "or", "samples", "(", "right", ")", ".", "Top", "20", "PCs", "were", "chosen", "for", "the", "clustering", ".", "D", "Violin", "plots", "showing", "the", "expression", "of", "feature", "genes", "for", "each", "cluster", ".", "E", "In", "situ", "hybridization", "of", "Col3a1", "on", "femur", "sections", ".", "Col3a1", "was", "expressed", "in", "the", "perichondral", "(", "a", ")", "and", "periosteal", "(", "b", ")", "regions", ",", "but", "not", "in", "the", "bone", "marrow", ".", "B", ":", "Bone", ";", "BM", ":", "Bone", "marrow", ";", "Peri", ":", "Periosteum", ";", "Endo", ":", "Endosteum", ".", "Scale", "bars", "were", "100", "µm", ".", "Arrowheads", "indicated", "the", "periosteum", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B t-SNE plots showing integrated analysis of Prrx1-Cre- (8-week-old mice, n=3 males) and Lepr-Cre-traced (8-week-old mice, n=4 males) cells. Cells were colored by clusters (left) or samples (right). Top 20 PCs were chosen for the clustering.D Violin plots showing the expression of feature genes for each cluster.E In situ hybridization of Col3a1 on femur sections. Col3a1 was expressed in the perichondral (a) and periosteal (b) regions, but not in the bone marrow. B: Bone; BM: Bone marrow; Peri: Periosteum; Endo: Endosteum. Scale bars were 100 µm. Arrowheads indicated the periosteum."}
{"words": ["Figure", "2E", "Violin", "plots", "showing", "the", "expression", "of", "feature", "genes", "for", "each", "cluster", ".", "F", "Immunofluorescent", "images", "of", "the", "distal", "femur", "in", "8", "-", "week", "-", "old", "Lepr", "-", "Cre", ";", "tdTomato", "mice", ".", "Arrowheads", "indicated", "tdTomato", "+", "periosteal", "cells", ".", "Two", "representative", "periosteal", "regions", "were", "magnified", "(", "a", "and", "b", ")", ".", "GP", ":", "Growth", "plate", ".", "B", ":", "Bone", ".", "BM", ":", "Bone", "marrow", ".", "Peri", ":", "Periosteum", ".", "Scale", "bars", "were", "100", "µm", ".", "G", "Immunofluorescent", "images", "of", "the", "distal", "femur", "in", "8", "-", "week", "-", "old", "Lepr", "-", "Cre", ";", "tdTomato", "mice", "7", "days", "after", "fracture", ".", "Aggrecan", "(", "green", ")", ",", "tdTomato", "(", "red", ")", ",", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Arrowheads", "indicated", "tdTomato", "+", "periosteal", "cells", ".", "Two", "representative", "regions", "were", "magnified", "(", "a", "and", "b", ")", ".", "Scale", "bars", "were", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2E Violin plots showing the expression of feature genes for each cluster.F Immunofluorescent images of the distal femur in 8-week-old Lepr-Cre; tdTomato mice. Arrowheads indicated tdTomato+ periosteal cells. Two representative periosteal regions were magnified (a and b). GP: Growth plate. B: Bone. BM: Bone marrow. Peri: Periosteum. Scale bars were 100 µm. G Immunofluorescent images of the distal femur in 8-week-old Lepr-Cre; tdTomato mice 7 days after fracture. Aggrecan (green), tdTomato (red), DAPI (blue). Arrowheads indicated tdTomato+ periosteal cells. Two representative regions were magnified (a and b). Scale bars were 100 µm."}
{"words": ["Figure", "3B", "Dot", "plots", "showing", "the", "gene", "expression", "patterns", "of", "selected", "genes", "in", "each", "cluster", ".", "D", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "BrdU", "incorporation", "in", "uncultured", "Lepr", "-", "Cre", "+", "Notch3", "+", "/", "-", "BMSCs", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "Lepr", "-", "Cre", ";", "tdTomato", "mice", "were", "given", "a", "single", "intraperitoneal", "injection", "of", "BrdU", "(", "100", "mg", "/", "kg", "body", "mass", ")", "and", "maintained", "on", "0", ".", "5", "mg", "/", "ml", "of", "BrdU", "in", "the", "drinking", "water", "for", "14", "days", ".", "E", "Immunofluorescent", "images", "of", "the", "distal", "femur", "in", "8", "-", "week", "-", "old", "Lepr", "-", "Cre", ";", "tdTomato", "mice", ".", "Notch3", "(", "green", ")", ",", "tdTomato", "(", "red", ")", ",", "CD31", "(", "gray", ")", ",", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Sinusoid", "(", "a", ")", ",", "arteriole", "(", "b", ")", ",", "artery", "(", "c", ")", "and", "avascular", "bone", "marrow", "(", "BM", ",", "d", ")", "regions", "were", "shown", ".", "Arrowheads", "indicated", "Notch3", "+", "tdTomato", "+", "adventitial", "cells", "closely", "associated", "with", "ECs", ".", "Arrows", "indicated", "Notch3", "-", "tdTomato", "+", "reticular", "cells", "in", "the", "bone", "marrow", "that", "were", "not", "associated", "with", "ECs", ".", "Scale", "bars", "were", "10", "µm", ".", "F", "Localization", "quantification", "of", "Lepr", "-", "Cre", "+", "Notch3", "+", "cells", "relative", "to", "bone", "marrow", "ECs", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Cells", "within", "5", "µm", "diameter", "of", "ECs", "were", "considered", "adjacent", ".", "GH", "Volcano", "plot", "showing", "DEGs", "in", "the", "bulk", "RNA", "-", "seq", "analysis", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Green", "dots", "represent", "down", "-", "regulated", "genes", ".", "Red", "dots", "represent", "up", "-", "regulated", "genes", ".", "O", "Heatmap", "showing", "the", "average", "expression", "levels", "(", "column", "-", "wide", "Z", "score", ")", "of", "secreted", "factors", "with", "clustering", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Dot plots showing the gene expression patterns of selected genes in each cluster.D Flow cytometry analysis of BrdU incorporation in uncultured Lepr-Cre+Notch3+/- BMSCs (n=4 independent experiments). Eight-week-old Lepr-Cre; tdTomato mice were given a single intraperitoneal injection of BrdU (100 mg/kg body mass) and maintained on 0.5 mg/ml of BrdU in the drinking water for 14 days.E Immunofluorescent images of the distal femur in 8-week-old Lepr-Cre; tdTomato mice. Notch3 (green), tdTomato (red), CD31 (gray), DAPI (blue). Sinusoid (a), arteriole (b), artery (c) and avascular bone marrow (BM, d) regions were shown. Arrowheads indicated Notch3+ tdTomato+ adventitial cells closely associated with ECs. Arrows indicated Notch3- tdTomato+ reticular cells in the bone marrow that were not associated with ECs. Scale bars were 10 µm. F Localization quantification of Lepr-Cre+Notch3+ cells relative to bone marrow ECs (n=5 biological replicates from three independent experiments). Cells within 5 µm diameter of ECs were considered adjacent. GH Volcano plot showing DEGs in the bulk RNA-seq analysis (n=3 biological replicates). Green dots represent down-regulated genes. Red dots represent up-regulated genes.O Heatmap showing the average expression levels (column-wide Z score) of secreted factors with clustering."}
{"words": ["Figure", "4C", "Heatmap", "showing", "pseudotime", "-", "dependent", "gene", "expression", ".", "Bars", "on", "the", "top", "were", "colored", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Representative", "genes", "were", "highlighted", "on", "both", "sides", ".", "F", "Representative", "images", "of", "adipogenic", ",", "osteogenic", "and", "chondrogenic", "differentiation", "following", "shRNA", "knockdown", "in", "Lepr", "-", "Cre", "+", "BMSCs", ".", "Scale", "bars", "were", "100", "µm", ".", "G", "qPCR", "analysis", "of", "the", "expression", "levels", "of", "Pparg", ",", "Bglap", "and", "Acan", "in", "control", "or", "knockdown", "group", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "The", "statistical", "significance", "of", "differences", "was", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVAs", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ".", "Data", "represented", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C Heatmap showing pseudotime-dependent gene expression. Bars on the top were colored as in (A). Representative genes were highlighted on both sides.F Representative images of adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation following shRNA knockdown in Lepr-Cre+ BMSCs. Scale bars were 100 µm.G qPCR analysis of the expression levels of Pparg, Bglap and Acan in control or knockdown group (n=3 independent experiments). The statistical significance of differences was analyzed by one-way ANOVAs with Tukey's multiple comparison tests. Data represented Mean ± SD. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001."}
{"words": ["Figure", "5B", "Violin", "plots", "showing", "the", "expression", "of", "feature", "genes", "for", "each", "cluster", ".", "F", "Immunostaining", "of", "Sca", "-", "1", "on", "femur", "sections", "of", "8", "-", "week", "-", "old", "Lepr", "-", "Cre", ";", "tdTomato", "mice", ".", "Arrows", "indicated", "Sca", "-", "1", "+", "tdTomato", "+", "cells", "inside", "cortical", "bones", "of", "the", "femur", "diaphysis", ".", "Arrowheads", "indicated", "Sca", "-", "1", "+", "tdTomato", "+", "cells", "in", "the", "femur", "periosteum", ".", "B", ":", "Bone", ".", "BM", ":", "Bone", "marrow", ".", "Peri", ":", "Periosteum", ".", "Scale", "bars", "were", "100", "µm", ".", "G", "Representative", "flow", "cytometry", "plots", "of", "long", "bone", "periosteum", "in", "8", "-", "week", "-", "old", "Lepr", "-", "Cre", ";", "tdTomato", "mice", ".", "The", "percentage", "of", "DAPI", "-", "CD45", "-", "Ter119", "-", "Tie2", "-", "tdTomato", "+", "Sca", "-", "1", "+", "/", "-", "cells", "were", "shown", ".", "I", ",", "J", "The", "average", "number", "of", "CFU", "-", "F", "colonies", "formed", "(", "I", ")", "and", "the", "average", "cell", "number", "per", "colony", "(", "J", ")", "were", "shown", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "The", "statistical", "significance", "of", "differences", "was", "assessed", "using", "one", "-", "way", "ANOVAs", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ".", "All", "data", "represented", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Violin plots showing the expression of feature genes for each cluster.F Immunostaining of Sca-1 on femur sections of 8-week-old Lepr-Cre; tdTomato mice. Arrows indicated Sca-1+ tdTomato+ cells inside cortical bones of the femur diaphysis. Arrowheads indicated Sca-1+ tdTomato+ cells in the femur periosteum. B: Bone. BM: Bone marrow. Peri: Periosteum. Scale bars were 100 µm.G Representative flow cytometry plots of long bone periosteum in 8-week-old Lepr-Cre; tdTomato mice. The percentage of DAPI- CD45- Ter119- Tie2- tdTomato+ Sca-1+/- cells were shown.I, J The average number of CFU-F colonies formed (I) and the average cell number per colony (J) were shown (n=4 independent experiments). The statistical significance of differences was assessed using one-way ANOVAs with Tukey's multiple comparison tests. All data represented Mean ± SD. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "Representative", "oil", "red", "staining", "after", "7", "days", "of", "adipogenic", "differentiation", "in", "Lepr", "-", "Cre", "+", "subsets", "(", "A", ")", "and", "qPCR", "analysis", "of", "Adipoq", "and", "Pparg", "expression", "(", "B", ")", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Scale", "bars", "were", "100", "µm", ".", "C", ",", "D", "In", "vitro", "chondrogenic", "differentiation", "of", "sorted", "periosteal", "cells", ".", "Representative", "alcian", "blue", "staining", "after", "chondrogenic", "differentiation", "for", "21", "days", "and", "cryosection", "(", "C", ")", ".", "Scale", "bars", "were", "100", "µm", ".", "Chondrogenic", "efficiencies", "were", "quantified", "by", "qPCR", "analysis", "of", "Acan", "and", "Col2a1", "expression", "(", "D", ")", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "E", ",", "F", "In", "vitro", "osteogenic", "differentiation", "of", "sorted", "periosteal", "cells", ".", "Representative", "alizarin", "red", "staining", "after", "osteogenic", "differentiation", "for", "14", "days", ".", "Scale", "bars", "were", "200", "µm", ".", "Osteogenic", "efficiencies", "were", "quantified", "by", "qPCR", "analysis", "of", "Sp7", "and", "Bglap", "expression", "(", "F", ")", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B Representative oil red staining after 7 days of adipogenic differentiation in Lepr-Cre+ subsets (A) and qPCR analysis of Adipoq and Pparg expression (B) (n=3 independent experiments). Scale bars were 100 µm.C, D In vitro chondrogenic differentiation of sorted periosteal cells. Representative alcian blue staining after chondrogenic differentiation for 21 days and cryosection (C). Scale bars were 100 µm. Chondrogenic efficiencies were quantified by qPCR analysis of Acan and Col2a1 expression (D) (n=3 independent experiments).E, F In vitro osteogenic differentiation of sorted periosteal cells. Representative alizarin red staining after osteogenic differentiation for 14 days. Scale bars were 200 µm. Osteogenic efficiencies were quantified by qPCR analysis of Sp7 and Bglap expression (F) (n=3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "1D", ")", "SDS", "-", "PAGE", "analysis", "of", "purified", "tubulin", "from", "brains", "of", "all", "mouse", "models", "used", "in", "the", "current", "study", ",", "stained", "with", "Coomassie", "Brilliant", "-", "Blue", ".", "Alpha", "-", "and", "β", "-", "tubulin", "are", "separated", "using", "a", "specific", "SDS", "-", "PAGE", "protocolE", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "all", "purified", "tubulin", "variants", ".", "The", "molecular", "weight", "in", "(", "D", ")", "and", "(", "E", ")", "is", "indicated", "in", "kDa", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D) SDS-PAGE analysis of purified tubulin from brains of all mouse models used in the current study, stained with Coomassie Brilliant-Blue. Alpha- and β-tubulin are separated using a specific SDS-PAGE protocolE) Immunoblot analysis of all purified tubulin variants. The molecular weight in (D) and (E) is indicated in kDa."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Representative", "IRM", "and", "TIRF", "microscopy", "images", "showing", "microtubule", "positions", "and", "Tau", "-", "meGFP", "intensities", "for", "different", "PTM", "variants", "(", "grey", ":", "wild", "type", ";", "blue", ":", "Ttll1", "-", "/", "-", ";", "yellow", ":", "Ttll7", "-", "/", "-", ";", "green", ":", "Ttll1", "-", "/", "-", "Ttll7", "-", "/", "-", ";", "pink", ":", "Atat1", "‑", "/", "‑", ")", ".", "In", "the", "last", "column", ",", "false", "-", "coloured", "TIRF", "images", "highlight", "differences", "of", "Tau", "-", "meGFP", "intensities", "on", "different", "types", "of", "microtubules", "(", "Movie", "EV1", ")", ".", "C", ")", "Quantification", "of", "integrated", "intensity", "of", "Tau", "-", "meGFP", "on", "GMPCPP", "microtubules", "in", "three", "independent", "sets", "of", "experiments", "performed", "with", "independently", "purified", "tubulin", "samples", ".", "Single", "assays", "(", "Fig", "EV2A", ")", "of", "one", "experiment", "were", "combined", "after", "normalisation", "to", "the", "wild", "-", "type", "microtubule", "values", "(", "A", ".", "U", ".", "=", "arbitrary", "units", ")", ".", "Each", "data", "point", "represents", "the", "normalised", "fluorescence", "intensity", "value", "of", "one", "microtubule", ".", "D", ")", "Summary", "quantification", "the", "three", "independent", "experiments", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Each", "point", "is", "a", "normalised", "mean", "of", "the", "triplicates", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "E", ")", "Saturation", "curve", "of", "increasing", "concentration", "Tau", "-", "mCherry", "binding", "to", "GMPCPP", "wild", "-", "type", "and", "Ttll1", "-", "/", "-", "Ttll7", "-", "/", "-", "microtubules", ".", "Each", "data", "point", "is", "shown", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "of", "the", "raw", "integrated", "intensity", "values", "(", "A", ".", "U", ".", "×", "104", ")", "of", "three", "experiments", "with", "independently", "purified", "tubulin", "samples", "(", "Fig", "EV2D", ")", ".", "Dissociation", "constants", "Kd", "and", "R2", "coefficient", "from", "non", "-", "linear", "fits", "of", "each", "microtubule", "type", "are", "indicated", "below", "the", "plot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Representative IRM and TIRF microscopy images showing microtubule positions and Tau-meGFP intensities for different PTM variants (grey: wild type; blue: Ttll1-/-; yellow: Ttll7-/-; green: Ttll1-/-Ttll7-/-; pink: Atat1‑/‑). In the last column, false-coloured TIRF images highlight differences of Tau-meGFP intensities on different types of microtubules (Movie EV1). C) Quantification of integrated intensity of Tau-meGFP on GMPCPP microtubules in three independent sets of experiments performed with independently purified tubulin samples. Single assays (Fig EV2A) of one experiment were combined after normalisation to the wild-type microtubule values (A.U. = arbitrary units). Each data point represents the normalised fluorescence intensity value of one microtubule. D) Summary quantification the three independent experiments shown in (C). Each point is a normalised mean of the triplicates, error bars represent standard deviation.E) Saturation curve of increasing concentration Tau-mCherry binding to GMPCPP wild-type and Ttll1-/-Ttll7-/- microtubules. Each data point is shown as mean ± standard deviation of the raw integrated intensity values (A.U. ×104) of three experiments with independently purified tubulin samples (Fig EV2D). Dissociation constants Kd and R2 coefficient from non-linear fits of each microtubule type are indicated below the plot."}
{"words": ["Figure", "3C", ")", "Decay", "curves", "of", "normalised", "microtubule", "length", "plotted", "against", "time", "upon", "incubation", "with", "katanin", "(", "A", ".", "U", ".", "=", "arbitrary", "units", ")", "for", "single", "microtubules", "highlighted", "by", "arrow", "heads", "with", "yellow", "borders", "in", "(", "B", ")", ".", "D", ")", "Half", "-", "life", "times", "(", "seconds", ")", "of", "all", "microtubules", "from", "the", "assays", "of", "which", "representative", "images", "are", "displayed", "in", "(", "B", ")", "and", "representative", "decay", "curves", "are", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Each", "data", "point", "represents", "half", "-", "life", "of", "a", "single", "microtubule", ".", "Medians", "with", "interquartile", "ranges", "shown", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "p", "-", "values", "displayed", ".", "E", ")", "Analysis", "of", "normalised", "microtubule", "half", "-", "lifetimes", "from", "14", "independent", "experiments", "(", "Fig", "EV3", ")", ".", "Each", "data", "point", "represents", "half", "-", "life", "of", "a", "single", "microtubule", ".", "Medians", "with", "interquartile", "ranges", "shown", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "p", "-", "values", "displayed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C) Decay curves of normalised microtubule length plotted against time upon incubation with katanin (A.U. = arbitrary units) for single microtubules highlighted by arrow heads with yellow borders in (B). D) Half-life times (seconds) of all microtubules from the assays of which representative images are displayed in (B) and representative decay curves are shown in (C). Each data point represents half-life of a single microtubule. Medians with interquartile ranges shown. Mann-Whitney test, p-values displayed.E) Analysis of normalised microtubule half-lifetimes from 14 independent experiments (Fig EV3). Each data point represents half-life of a single microtubule. Medians with interquartile ranges shown, Mann-Whitney test, p-values displayed."}
{"words": ["Figure", "4B", ")", "Kymographs", "showing", "single", "Kif5B", "-", "EGFP", "motor", "molecules", "moving", "on", "one", "single", "microtubule", "of", "known", "PTM", "state", "(", "Movie", "EV4", ")", ".", "Horizontal", "scale", "bars", "2", "µm", ";", "vertical", "scale", "bars", "5", "C", ")", "Scatter", "plots", "showing", "the", "average", "velocities", "(", "µm", "/", "s", ")", "exhibited", "by", "single", "Kif5b", "-", "EGFP", "molecules", "on", "the", "different", "microtubule", "types", "(", "each", "data", "point", "represents", "one", "Kif5b", "-", "EGFP", "molecule", ")", ".", "Data", "pooled", "from", "29", "independent", "experiments", "(", "Appendix", "Fig", "S2", ")", ".", "Medians", "with", "interquartile", "ranges", "shown", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "p", "-", "values", "displayed", ".", "D", ",", "E", ")", "Survival", "probability", "(", "Kaplan", "-", "Meier", "plots", ",", "taking", "varying", "microtubule", "lengths", "into", "account", ";", "see", "Methods", ")", "of", "the", "interaction", "time", "(", "D", ")", "and", "run", "length", "(", "E", ")", "of", "Kif5b", "-", "EGFP", "molecules", "on", "different", "microtubule", "types", ".", "Data", "in", "(", "C", ",", "D", ",", "E", ")", "were", "pooled", "from", "individual", "experiments", "(", "Appendix", "Fig", "S2", ")", "without", "normalisation", ".", "The", "50", "%", "probability", "values", "are", "show", "in", "the", "plots", ".", "Statistical", "analysis", "displayed", "in", "the", "tables", "below", ":", "hazard", "ratios", "with", "95", "%", "confidence", "intervals", "pairing", "all", "data", "from", "different", "microtubule", "types", "(", "*", "pairs", "differing", "with", "significance", "level", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B) Kymographs showing single Kif5B-EGFP motor molecules moving on one single microtubule of known PTM state (Movie EV4). Horizontal scale bars 2 µm; vertical scale bars 5 C) Scatter plots showing the average velocities (µm/s) exhibited by single Kif5b-EGFP molecules on the different microtubule types (each data point represents one Kif5b-EGFP molecule). Data pooled from 29 independent experiments (Appendix Fig S2). Medians with interquartile ranges shown, Mann-Whitney test, p-values displayed.D,E) Survival probability (Kaplan-Meier plots, taking varying microtubule lengths into account; see Methods) of the interaction time (D) and run length (E) of Kif5b-EGFP molecules on different microtubule types. Data in (C,D,E) were pooled from individual experiments (Appendix Fig S2) without normalisation. The 50% probability values are show in the plots. Statistical analysis displayed in the tables below: hazard ratios with 95% confidence intervals pairing all data from different microtubule types (*pairs differing with significance level p<0.05)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Phenotyping", "of", "the", "same", "mice", ",", "presented", "in", "the", "same", "order", ",", "inoculated", "i", ".", "n", ".", "with", "0", ".", "3", "×", "105", "TCID50", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "at", "the", "age", "of", "5", "-", "7", "wks", "and", "viral", "RNA", "content", "was", "determination", "in", "the", "indicated", "organs", "at", "3", "dpi", "by", "conventional", "E", "-", "specific", "qRT", "-", "PCR", ".", "Red", "lines", "indicate", "the", "qRT", "-", "PCR", "limits", "of", "detection", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Quantification", "(", "C", ")", "and", "images", "(", "D", ")", "of", "hACE2", "protein", "expression", "level", "by", "Western", "blot", "from", "the", "lungs", "of", "the", "same", "mice", "as", "in", "panels", "A", "and", "B", ",", "presented", "in", "the", "same", "order", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Phenotyping of the same mice, presented in the same order, inoculated i.n. with 0.3 × 105 TCID50 of SARS-CoV-2 at the age of 5-7 wks and viral RNA content was determination in the indicated organs at 3 dpi by conventional E-specific qRT-PCR. Red lines indicate the qRT-PCR limits of detection.(C, D) Quantification (C) and images (D) of hACE2 protein expression level by Western blot from the lungs of the same mice as in panels A and B, presented in the same order."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", "-", "E", ")", "Examples", "of", "lesions", "observed", "in", "the", "lungs", "of", "infected", "mice", "at", "higher", "magnification", ".", "The", "two", "top", "panels", "depict", "mild", "(", "B", ")", "(", "scale", "bar", ":", "100", "μm", ")", "and", "mild", "to", "moderate", "(", "C", ")", "interstitium", "thickening", "accompanied", "by", "dense", "inflammatory", "infiltrates", "predominantly", "localized", "in", "the", "vicinity", "of", "bronchioles", "(", "yellow", "stars", ")", "and", "also", "present", "around", "blood", "vessels", "(", "green", "stars", ")", "(", "scale", "bar", ":", "200", "μm", ")", ".", "(", "D", ")", "Alveoli", "filled", "with", "a", "proteinaceous", "exudate", "containing", "a", "few", "cells", "(", "green", "arrows", ")", "(", "scale", "bar", ":", "50", "μm", ")", ".", "(", "E", ")", "Discrete", "degenerative", "lesions", "of", "the", "bronchiolar", "epithelium", ",", "such", "as", "perinuclear", "clear", "spaces", "(", "blue", "arrows", ")", ",", "hyper", "-", "eosinophilic", "cells", "with", "condensed", "nuclei", "(", "orange", "arrow", ")", "and", "some", "intraluminal", "fibrinous", "and", "cell", "debris", "(", "black", "arrow", ")", "in", "an", "overall", "well", "-", "preserved", "epithelium", "(", "scale", "bar", ":", "20", "μm", ")", ".", "(", "G", ")", "Representative", "NCoV", "-", "2", "-", "specific", "IHC", "image", "of", "the", "brain", "in", "NI", "control", "or", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "infected", "mice", "at", "3", "dpi", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "μm", ".", "(", "H", ")", "Closer", "view", "of", "a", "NCoV", "-", "2", "positive", "area", "from", "an", "infected", "mouse", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B-E) Examples of lesions observed in the lungs of infected mice at higher magnification. The two top panels depict mild (B) (scale bar: 100 μm) and mild to moderate (C) interstitium thickening accompanied by dense inflammatory infiltrates predominantly localized in the vicinity of bronchioles (yellow stars) and also present around blood vessels (green stars) (scale bar: 200 μm). (D) Alveoli filled with a proteinaceous exudate containing a few cells (green arrows) (scale bar: 50 μm). (E) Discrete degenerative lesions of the bronchiolar epithelium, such as perinuclear clear spaces (blue arrows), hyper-eosinophilic cells with condensed nuclei (orange arrow) and some intraluminal fibrinous and cell debris (black arrow) in an overall well-preserved epithelium (scale bar: 20 μm).(G) Representative NCoV-2-specific IHC image of the brain in NI control or SARS-CoV-2-infected mice at 3 dpi. Scale bar: 500 μm. (H) Closer view of a NCoV-2 positive area from an infected mouse. Scale bar: 500 μm. "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Comparative", "permissiveness", "of", "various", "organs", "from", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "and", "B6", ".", "K18", "-", "ACE22prlmn", "/", "Jax", "transgenic", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "/", "group", ")", "to", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "replication", ",", "as", "determined", "at", "3", "dpi", "by", "conventional", "E", "-", "specific", "or", "sub", "-", "genomic", "Esg", "-", "specific", "qRT", "-", "PCR", ".", "Red", "lines", "indicate", "the", "qRT", "-", "PCR", "limits", "of", "detection", ".", "(", "B", ")", "Comparative", "quantitation", "of", "hACE", "-", "2", "mRNA", "in", "the", "lungs", "and", "brain", "of", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "and", "B6", ".", "K18", "-", "ACE22prlmn", "/", "Jax", "transgenic", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "/", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "significance", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "=", "not", "significant", ")", ".", "(", "C", ")", "Heatmaps", "represent", "log2", "fold", "change", "in", "cytokine", "and", "chemokine", "mRNA", "expression", "in", "the", "lungs", "or", "brain", "of", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "and", "B6", ".", "K18", "-", "ACE22prlmn", "/", "Jax", "mice", "at", "3", "dpi", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "/", "group", ")", ".", "Data", "were", "normalized", "versus", "untreated", "controls", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Comparative permissiveness of various organs from B6.K18-hACE2IP-THV and B6.K18-ACE22prlmn/Jax transgenic mice (n = 5-6/group) to SARS-CoV-2 replication, as determined at 3 dpi by conventional E-specific or sub-genomic Esg-specific qRT-PCR. Red lines indicate the qRT-PCR limits of detection. (B) Comparative quantitation of hACE-2 mRNA in the lungs and brain of B6.K18-hACE2IP-THV and B6.K18-ACE22prlmn/Jax transgenic mice (n = 5-6/group). Data information: Statistical significance was evaluated by Mann-Whitney test (*= p < 0.05, **= p <0.01, ns = not significant).(C) Heatmaps represent log2 fold change in cytokine and chemokine mRNA expression in the lungs or brain of B6.K18-hACE2IP-THV and B6.K18-ACE22prlmn/Jax mice at 3 dpi (n = 5-6/group). Data were normalized versus untreated controls."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Viral", "RNA", "content", "as", "determined", "in", "various", "organs", "at", "3", "dpi", "(", "n", "=", "6", "/", "group", ")", "by", "use", "of", "conventional", "E", "-", "specific", "or", "sub", "-", "genomic", "Esg", "-", "specific", "qRT", "-", "PCR", ".", "Red", "lines", "indicate", "the", "qRT", "-", "PCR", "detection", "limits", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "significance", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "D", ")", "Percentages", "of", "NK", "cells", "or", "neutrophils", "in", "the", "lungs", "of", "LV", ":", ":", "S", "-", "or", "sham", "-", "vaccinated", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "challenged", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "transgenic", "mice", "at", "3", "dpi", "(", "n", "=", "6", "/", "group", ")", ".", "Percentages", "were", "calculated", "versus", "total", "lung", "live", "CD45", "+", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "significance", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "E", ")", "Relative", "log2", "fold", "change", "in", "cytokine", "and", "chemokine", "mRNA", "expression", "in", "the", "brain", "of", "LV", ":", ":", "S", "-", "or", "sham", "-", "immunized", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "challenged", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "transgenic", "mice", "at", "3", "dpi", "(", "n", "=", "6", "/", "group", ")", ".", "Means", "±", "SD", "are", "shown", ".", "Data", "were", "normalized", "versus", "untreated", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "significance", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Viral RNA content as determined in various organs at 3 dpi (n = 6/group) by use of conventional E-specific or sub-genomic Esg-specific qRT-PCR. Red lines indicate the qRT-PCR detection limits. Data information: Statistical significance was evaluated by Mann-Whitney test (* = p<0.05, ** = p<0.01).(D) Percentages of NK cells or neutrophils in the lungs of LV::S- or sham-vaccinated and SARS-CoV-2-challenged B6.K18-hACE2IP-THV transgenic mice at 3 dpi (n = 6/group). Percentages were calculated versus total lung live CD45+ cells. Data information: Statistical significance was evaluated by Mann-Whitney test (* = p<0.05, ** = p<0.01).(E) Relative log2 fold change in cytokine and chemokine mRNA expression in the brain of LV::S- or sham-immunized and SARS-CoV-2-challenged B6.K18-hACE2IP-THV transgenic mice at 3 dpi (n = 6/group). Means ± SD are shown. Data were normalized versus untreated controls. Data information: Statistical significance was evaluated by Mann-Whitney test (* = p<0.05, ** = p<0.01). "}
{"words": ["Figure", "5B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "mice", "were", "primed", "(", "i", ".", "m", ".", ")", "at", "wk", "0", "and", "boosted", "(", "i", ".", "n", ".", ")", "at", "wk", "5", "(", "n", "=", "5", ")", "with", "non", "-", "integrative", "LV", ":", ":", "S", ".", "Control", "mice", "were", "injected", "with", "an", "empty", "LV", "(", "sham", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Cytometric", "strategy", "to", "detect", "lung", "CD8", "+", "T", "central", "memory", "(", "Tcm", ",", "CD44", "+", "CD62L", "+", "CD69", "-", ")", ",", "T", "effector", "memory", "(", "Tem", ",", "CD44", "+", "CD62L", "-", "CD69", "-", ")", "and", "T", "resident", "memory", "(", "Trm", ",", "CD44", "+", "CD62L", "-", "CD69", "+", "CD103", "+", ")", "and", "(", "C", ")", "percentages", "of", "these", "subsets", "among", "CD8", "+", "T", "-", "cells", "in", "LV", ":", ":", "S", "-", "vaccinated", "(", "n", "=", "9", ")", "or", "sham", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "significance", "of", "the", "difference", "between", "the", "two", "groups", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "mice", "were", "primed", "(", "i", ".", "m", ".", ")", "at", "wk", "0", "and", "boosted", "(", "i", ".", "n", ".", ")", "at", "wk", "5", "(", "n", "=", "5", ")", "with", "non", "-", "integrative", "LV", ":", ":", "S", ".", "Control", "mice", "were", "injected", "with", "an", "empty", "LV", "(", "sham", ")", ".", "(", "D", ")", "Cytometric", "strategy", "to", "detect", "SCoV", "-", "2", "-", "specific", "CD8", "+", "T", "cells", "by", "use", "of", "the", "H", "-", "2Db", "-", "SCoV", "-", "2", ":", "538", "-", "546", "dextramer", "in", "the", "lungs", "of", "LV", ":", ":", "S", "or", "sham", "-", "vaccinated", "mice", ".", "Inside", "CD8", "+", "dextramer", "+", "T", "-", "cell", "subset", ",", "Tcm", ",", "Tem", "and", "Trm", "have", "been", "distinguished", ".", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "mice", "were", "primed", "(", "i", ".", "m", ".", ")", "at", "wk", "0", "and", "boosted", "(", "i", ".", "n", ".", ")", "at", "wk", "5", "(", "n", "=", "5", ")", "with", "non", "-", "integrative", "LV", ":", ":", "S", ".", "Control", "mice", "were", "injected", "with", "an", "empty", "LV", "(", "sham", ")", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Anti", "-", "SCoV", "-", "2", "IgG", "or", "IgA", "titers", "(", "F", ")", "and", "neutralizing", "activity", "(", "EC50", ")", "(", "G", ")", "in", "the", "sera", "or", "lung", "homogenates", "at", "3", "dpi", ".", "Samples", "from", "individual", "mice", "(", "n", "=", "4", "/", "group", ")", "were", "studied", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "significance", "of", "the", "difference", "between", "the", "two", "groups", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B6.K18-hACE2IP-THV mice were primed (i.m.) at wk 0 and boosted (i.n.) at wk 5 (n = 5) with non-integrative LV::S. Control mice were injected with an empty LV (sham). (B, C) Cytometric strategy to detect lung CD8+ T central memory (Tcm, CD44+CD62L+CD69-), T effector memory (Tem, CD44+CD62L-CD69-) and T resident memory (Trm, CD44+CD62L-CD69+CD103+) and (C) percentages of these subsets among CD8+ T-cells in LV::S-vaccinated (n = 9) or sham (n = 5) mice. Data information: Statistical significance of the difference between the two groups was evaluated by Mann-Whitney test (*= p < 0.05, **= p <0.01).B6.K18-hACE2IP-THV mice were primed (i.m.) at wk 0 and boosted (i.n.) at wk 5 (n = 5) with non-integrative LV::S. Control mice were injected with an empty LV (sham). (D) Cytometric strategy to detect SCoV-2-specific CD8+ T cells by use of the H-2Db-SCoV-2:538-546 dextramer in the lungs of LV::S or sham-vaccinated mice. Inside CD8+ dextramer+ T-cell subset, Tcm, Tem and Trm have been distinguished.B6.K18-hACE2IP-THV mice were primed (i.m.) at wk 0 and boosted (i.n.) at wk 5 (n = 5) with non-integrative LV::S. Control mice were injected with an empty LV (sham). (F, G) Anti-SCoV-2 IgG or IgA titers (F) and neutralizing activity (EC50) (G) in the sera or lung homogenates at 3 dpi. Samples from individual mice (n = 4/group) were studied. Data information: Statistical significance of the difference between the two groups was evaluated by Mann-Whitney test (*= p < 0.05, **= p <0.01). "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "mice", "were", "immunized", "with", "LV", ":", ":", "S", "via", "i", ".", "m", ".", "or", "i", ".", "n", ".", "at", "wk", "0", "and", "boosted", "via", "i", ".", "m", ".", "or", "i", ".", "n", ".", "at", "wk", "5", "(", "n", "=", "5", "/", "group", ")", "with", "non", "-", "integrative", "LV", ":", ":", "S", ".", "Control", "mice", "were", "injected", "i", ".", "m", ".", "i", ".", "n", ".", "with", "an", "empty", "LV", "(", "sham", ")", ".", "Viral", "RNA", "contents", "were", "determined", "by", "conventional", "E", "-", "specific", "RT", "-", "PCR", "at", "3", "dpi", ",", "in", "the", "brain", ",", "lung", "and", "nasal", "washes", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "significance", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", "=", "not", "significant", ")", ".", "(", "B", ")", "Lung", "histology", "in", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "mice", ",", "vaccinated", "with", "LV", ":", ":", "S", "after", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "inoculation", ".", "H", "&", "E", "(", "rows", "1", "and", "3", ")", "(", "scale", "bar", ":", "500", "μm", ")", "and", "NCoV", "-", "2", "-", "specific", "IHC", "(", "rows", "2", "and", "4", ")", "(", "scale", "bar", ":", "50", "μm", ")", "staining", "of", "whole", "lung", "sections", "(", "scale", "bar", ":", "50", "μm", ")", "from", "the", "primed", "(", "i", ".", "m", ".", ")", ",", "boosted", "(", "i", ".", "n", ".", ")", "and", "challenged", "B6", ".", "K18", "-", "hACE2IP", "-", "THV", "mice", "compared", "with", "their", "sham", "controls", ".", "H", "&", "E", "and", "NCoV", "-", "2", "-", "specific", "IHC", "were", "performed", "on", "contiguous", "sections", ".", "The", "IHC", "fields", "correspond", "to", "the", "rectangles", "in", "the", "corresponding", "H", "&", "E", "images", "above", "them", ".", "A", "representative", "NCoV", "-", "2", "-", "specific", "IHC", "on", "a", "lung", "section", "from", "a", "non", "-", "infected", "(", "NI", ")", "mouse", "is", "also", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) B6.K18-hACE2IP-THV mice were immunized with LV::S via i.m. or i.n. at wk 0 and boosted via i.m. or i.n. at wk 5 (n = 5/group) with non-integrative LV::S. Control mice were injected i.m. i.n. with an empty LV (sham). Viral RNA contents were determined by conventional E-specific RT-PCR at 3 dpi, in the brain, lung and nasal washes. Data information: Statistical significance was evaluated by Mann-Whitney test (*= p < 0.05, **= p <0.01, ****= p < 0.0001, ns = not significant).(B) Lung histology in B6.K18-hACE2IP-THV mice, vaccinated with LV::S after SARS-CoV-2 inoculation. H&E (rows 1 and 3) (scale bar: 500 μm) and NCoV-2-specific IHC (rows 2 and 4) (scale bar: 50 μm) staining of whole lung sections (scale bar: 50 μm) from the primed (i.m.), boosted (i.n.) and challenged B6.K18-hACE2IP-THV mice compared with their sham controls. H&E and NCoV-2-specific IHC were performed on contiguous sections. The IHC fields correspond to the rectangles in the corresponding H&E images above them. A representative NCoV-2-specific IHC on a lung section from a non-infected (NI) mouse is also shown."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Example", "of", "CD3", "-", "positive", "cells", "in", "an", "olfactory", "bulb", "from", "an", "LV", ":", ":", "S", "i", ".", "m", ".", "-", "i", ".", "n", ".", "vaccinated", "and", "protected", "mice", "and", "representative", "results", "from", "this", "group", "versus", "sham", "-", "vaccinated", "and", "unprotected", "mice", "at", "3", "dpi", "(", "n", "=", "7", "-", "9", "/", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Statistical", "significance", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Cytometric", "analysis", "of", "cells", "extracted", "from", "pooled", "olfactory", "bulbs", "from", "the", "same", "groups", ".", "Cytometric", "analysis", "of", "cells", "extracted", "from", "pooled", "olfactory", "bulbs", "from", "the", "same", "groups", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Innate", "immune", "cells", "in", "the", "olfactory", "bulbs", "(", "C", ")", "or", "brain", "(", "D", ")", ".", "The", "CD11b", "+", "Ly6C", "+", "Ly6G", "+", "population", "in", "the", "olfactory", "bulbs", "are", "neutrophils", "and", "the", "CD11b", "+", "Ly6C", "+", "Ly6G", "-", "cells", "of", "the", "brain", "are", "inflammatory", "monocytes", ".", "(", "E", ")", "Brain", "H", "&", "E", "histology", "at", "3", "dpi", ".", "The", "top", "right", "and", "both", "bottom", "panels", "show", "examples", ",", "in", "two", "different", "mice", ",", "of", "leukocyte", "clusters", "(", "arrows", ")", "alongside", "the", "ventricular", "wall", ".", "No", "such", "clusters", "were", "detected", "in", "the", "LV", ":", ":", "S", "i", ".", "m", ".", "-", "i", ".", "n", ".", "vaccinated", "mice", "(", "top", "left", "panel", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "The", "close", "up", "view", "(", "bottom", "right", "panel", ")", "highlights", "the", "thickened", ",", "disorganized", "ependymal", "lining", ",", "compared", "to", "the", "normal", "ependymal", "cells", "and", "cilia", "of", "an", "LV", ":", ":", "S", "i", ".", "m", ".", "-", "i", ".", "n", ".", "vaccinated", "mouse", "(", "top", "left", "panel", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Example of CD3-positive cells in an olfactory bulb from an LV::S i.m.-i.n. vaccinated and protected mice and representative results from this group versus sham-vaccinated and unprotected mice at 3 dpi (n = 7-9/group). Scale bar: 50 μm. Statistical significance was evaluated by Mann-Whitney test (**= p <0.01).Cytometric analysis of cells extracted from pooled olfactory bulbs from the same groups.Cytometric analysis of cells extracted from pooled olfactory bulbs from the same groups. (C, D) Innate immune cells in the olfactory bulbs (C) or brain (D). The CD11b+ Ly6C+ Ly6G+ population in the olfactory bulbs are neutrophils and the CD11b+ Ly6C+ Ly6G- cells of the brain are inflammatory monocytes.(E) Brain H&E histology at 3 dpi. The top right and both bottom panels show examples, in two different mice, of leukocyte clusters (arrows) alongside the ventricular wall. No such clusters were detected in the LV::S i.m.-i.n. vaccinated mice (top left panel). Scale bar: 200 μm. The close up view (bottom right panel) highlights the thickened, disorganized ependymal lining, compared to the normal ependymal cells and cilia of an LV::S i.m.-i.n. vaccinated mouse (top left panel). Scale bar: 50 μm."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "B", ")", "Brain", "or", "lung", "viral", "RNA", "contents", ",", "determined", "by", "conventional", "E", "-", "specific", "or", "sub", "-", "genomic", "Esg", "-", "specific", "qRT", "-", "PCR", "at", "3", "dpi", ".", "Two", "mice", "out", "of", "the", "5", "sham", "-", "vaccinated", "mice", "did", "not", "have", "detectable", "viral", "RNA", "in", "the", "lungs", "despite", "high", "viral", "RNA", "content", "in", "the", "brain", "and", "hACE2", "mRNA", "expression", "levels", "comparable", "to", "that", "of", "the", "other", "mice", "in", "the", "same", "group", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "significance", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "E", ")", "Wild", "type", "or", "µMT", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "9", "/", "group", ")", "were", "injected", "by", "LV", ":", ":", "S", "or", "sham", "following", "the", "time", "line", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "then", "pretreated", "with", "Ad5", ":", ":", "hACE2", "4", "days", "before", "challenge", "with", "the", "ancestral", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "strain", ".", "Lung", "viral", "RNA", "contents", "were", "determined", "at", "3", "dpi", ".", "Data", "information", ":", "Statistical", "significance", "was", "evaluated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(B) Brain or lung viral RNA contents, determined by conventional E-specific or sub-genomic Esg-specific qRT-PCR at 3 dpi. Two mice out of the 5 sham-vaccinated mice did not have detectable viral RNA in the lungs despite high viral RNA content in the brain and hACE2 mRNA expression levels comparable to that of the other mice in the same group. Data information: Statistical significance was evaluated by Mann-Whitney test (*= p < 0.05, **= p < 0.01, ****= p < 0.0001).(E) Wild type or µMT KO mice (n = 5-9/group) were injected by LV::S or sham following the time line shown in (A), then pretreated with Ad5::hACE2 4 days before challenge with the ancestral SARS-CoV-2 strain. Lung viral RNA contents were determined at 3 dpi. Data information: Statistical significance was evaluated by Mann-Whitney test (*= p < 0.05, **= p < 0.01, ****= p < 0.0001)."}
{"words": ["Figure", "1D", "Changes", "(", "Δ", "g", ")", "in", "inguinal", "WAT", "(", "iWAT", ")", "mass", "of", "mice", "in", "(", "C", ")", ".", "n", "=", "5", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ".", "E", "Changes", "(", "Δ", "g", ")", "in", "epididymal", "WAT", "(", "eWAT", ")", "mass", "of", "mice", "in", "(", "C", ")", ".", "n", "=", "5", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ".", "F", "Expression", "of", "Pltp", "mRNA", "in", "indicated", "tissues", ".", "Data", "are", "shown", "by", "relative", "Pltp", "mRNA", "levels", "normalized", "by", "18s", "expression", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "tissues", "(", "except", "BAT", "and", "WAT", "n", "=", "5", ",", "Testis", "n", "=", "2", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "Pltp", "expression", "in", "BAT", "vs", "other", "tissues", "(", "except", "testis", "and", "lung", ")", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "G", "Plasma", "PLTP", "activity", "from", "control", "(", "Ppargflox", "/", "flox", ")", "and", "BAT", "-", "less", "mice", "(", "Pparg", "UCP1", "-", "KO", ",", "Ucp1", "-", "Cre", "x", "Ppargflox", "/", "flox", ")", ".", "Following", "6", "-", "h", "fasting", "plasma", "was", "obtained", "from", "PpargUCP1", "-", "KO", "mice", "and", "littermate", "control", ".", "n", "=", "3", "for", "both", "groups", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "relative", "to", "control", "mice", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "H", "PLTP", "protein", "levels", "in", "the", "culture", "conditioned", "medium", "from", "primary", "differentiated", "inguinal", "adipocytes", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", "and", "aP2", "-", "PRDM16", "mice", "[", "24", "]", ".", "Peptide", "levels", "was", "determined", "by", "quantitative", "proteomics", ".", "n", "=", "2", "for", "both", "groups", ".", "I", "Transcriptional", "regulation", "of", "the", "Pltp", "gene", "by", "PRDM16", "and", "PPARγ", ".", "ChIP", "-", "seq", "data", "for", "PRDM16", "and", "PPARγ", "were", "obtained", "from", "[", "31", ",", "32", "]", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D Changes (Δ g) in inguinal WAT (iWAT) mass of mice in (C). n=5. *P<0.05, **P<0.01 relative to GFP by Student's t-test. N.S., not significant. E Changes (Δ g) in epididymal WAT (eWAT) mass of mice in (C). n=5. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 relative to GFP by Student's t-test. N.S., not significant. F Expression of Pltp mRNA in indicated tissues. Data are shown by relative Pltp mRNA levels normalized by 18s expression. n=3 for all tissues (except BAT and WAT n=5, Testis n=2). *P<0.05 Pltp expression in BAT vs other tissues (except testis and lung) by Student's t-test.G Plasma PLTP activity from control (Ppargflox/flox) and BAT-less mice (Pparg UCP1-KO, Ucp1-Cre x Ppargflox/flox). Following 6-h fasting plasma was obtained from PpargUCP1-KO mice and littermate control. n=3 for both groups. *P < 0.05 relative to control mice by Student's t-test.H PLTP protein levels in the culture conditioned medium from primary differentiated inguinal adipocytes of wild type (WT) and aP2-PRDM16 mice [24]. Peptide levels was determined by quantitative proteomics. n=2 for both groups.I Transcriptional regulation of the Pltp gene by PRDM16 and PPARγ. ChIP-seq data for PRDM16 and PPARγ were obtained from [31,32], respectively."}
{"words": ["Figure", "2B", "Changes", "in", "body", "weight", "of", "mice", "in", "(", "A", ")", "during", "10", "weeks", "of", "HFD", ".", "n", "=", "9", "for", "GFP", "and", "n", "=", "8", "for", "PLTP", "(", "cohort", "1", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "GFP", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "repeated", "measures", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "test", ".", "C", "Changes", "in", "food", "intake", "of", "mice", "in", "(", "A", ")", "during", "10", "weeks", "of", "HFD", "(", "cohort", "1", ")", ".", "n", "=", "9", "for", "GFP", "(", "cage", "1", "=", "5", "mice", ";", "cage", "2", "=", "4", "mice", ")", "and", "n", "=", "8", "for", "PLTP", "(", "cage", "1", "=", "4", "mice", ";", "cage", "2", "=", "4", "mice", ")", "D", "Body", "composition", "of", "mice", "in", "(", "A", ")", "at", "10", "weeks", "of", "HFD", "determined", "by", "EchoMRI", ".", "n", "=", "9", "for", "GFP", "and", "n", "=", "8", "for", "PLTP", "(", "cohort", "1", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "relative", "to", "GFP", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ".", "E", "Whole", "-", "body", "energy", "expenditure", "of", "mice", "at", "3", "weeks", "of", "HFD", ".", "Area", "under", "the", "curve", "(", "AUC", ")", "of", "VO2", "is", "shown", "in", "the", "right", "graph", ".", "n", "=", "7", "for", "GFP", "and", "n", "=", "8", "for", "PLTP", "(", "cohort", "2", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "F", "Physical", "movement", "of", "mice", "at", "3", "weeks", "of", "HFD", "as", "determined", "by", "metabolic", "cage", "analysis", ".", "n", "=", "7", "for", "GFP", "and", "n", "=", "8", "for", "PLTP", "(", "cohort", "2", ")", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "testG", "OCR", "in", "the", "interscapular", "BAT", "and", "iWAT", "of", "control", "and", "PLTP", "-", "treated", "mice", ".", "One", "week", "after", "the", "treatment", ",", "BAT", "and", "iWAT", "were", "isolated", "from", "mice", "(", "7", "weeks", "old", ")", "that", "received", "adenovirus", "for", "GFP", "or", "PLTP", ".", "n", "=", "5", "for", "both", "groups", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ".", "H", "Gene", "expression", "of", "indicated", "thermogenic", "genes", "in", "(", "A", ")", "from", "interscapular", "BAT", "for", "GFP", "(", "n", "=", "8", ")", "and", "PLTP", "(", "n", "=", "8", ")", "groups", "(", "cohort", "1", ")", "except", "n", "=", "7", "for", "Ucp1", "of", "the", "PLTP", "group", ".", "Tbp", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ".", "I", "H", "&", "E", "staining", "of", "interscapular", "BAT", "from", "mice", "in", "(", "A", ")", "at", "10", "weeks", "of", "HFD", "(", "cohort", "1", ")", ".", "Representative", "images", "from", "n", "=", "3", "mice", "for", "both", "groups", ".", "Scale", "Bar", ",", "50µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Changes in body weight of mice in (A) during 10 weeks of HFD. n=9 for GFP and n=8 for PLTP (cohort 1). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.01 relative to GFP by two-way ANOVA repeated measures followed by Bonferroni's test.C Changes in food intake of mice in (A) during 10 weeks of HFD (cohort 1). n=9 for GFP (cage 1 = 5 mice; cage 2 = 4 mice) and n=8 for PLTP (cage 1 = 4 mice; cage 2 = 4 mice)D Body composition of mice in (A) at 10 weeks of HFD determined by EchoMRI. n=9 for GFP and n=8 for PLTP (cohort 1). *P<0.05 relative to GFP by two-way ANOVA followed by Tukey's test. N.S., not significant.E Whole-body energy expenditure of mice at 3 weeks of HFD. Area under the curve (AUC) of VO2 is shown in the right graph. n=7 for GFP and n=8 for PLTP (cohort 2). *P<0.05 relative to GFP by Student's t-test.F Physical movement of mice at 3 weeks of HFD as determined by metabolic cage analysis. n=7 for GFP and n=8 for PLTP (cohort 2). N.S., not significant by Student's t-testG OCR in the interscapular BAT and iWAT of control and PLTP-treated mice. One week after the treatment, BAT and iWAT were isolated from mice (7 weeks old) that received adenovirus for GFP or PLTP. n=5 for both groups. *P<0.05 relative to GFP by Student's t-test. N.S., not significant.H Gene expression of indicated thermogenic genes in (A) from interscapular BAT for GFP (n=8) and PLTP (n=8) groups (cohort 1) except n=7 for Ucp1 of the PLTP group. Tbp was used as an internal control. *P<0.05, **P<0.01 relative to GFP by Student's t-test. N.S., not significant.I H&E staining of interscapular BAT from mice in (A) at 10 weeks of HFD (cohort 1). Representative images from n=3 mice for both groups. Scale Bar, 50µm."}
{"words": ["Figure", "3A", "Glucose", "tolerance", "test", "of", "mice", "that", "received", "AAV", "control", "(", "GFP", ")", "or", "PLTP", "at", "10", "weeks", "of", "HFD", ".", "After", "eight", "hours", "of", "fasting", ",", "2", "g", "/", "kg", "body", "weight", "of", "glucose", "was", "administered", ".", "n", "=", "9", "for", "GFP", "and", "n", "=", "7", "for", "PLTP", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "GFP", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "repeated", "measures", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "test", ".", "B", "Insulin", "tolerance", "test", "of", "mice", "in", "(", "A", ")", "at", "10", "weeks", "of", "HFD", ".", "Mice", "were", "fasted", "for", "four", "hours", "and", "administered", "insulin", "(", "0", ".", "75", "U", "/", "kg", "body", "weight", ")", ".", "n", "=", "9", "for", "GFP", "control", "and", "n", "=", "7", "for", "PLTP", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "GFP", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "repeated", "measures", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "test", ".", "C", "Fasting", "insulin", "levels", "of", "mice", "in", "(", "A", ")", "at", "10", "weeks", "of", "HFD", ".", "Blood", "samples", "were", "harvested", "after", "eight", "hours", "of", "fasting", ".", "n", "=", "5", "for", "GFP", "and", "n", "=", "4", "for", "PLTP", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "D", "Glucose", "tolerance", "test", "of", "mice", "that", "received", "AAV", "control", "(", "GFP", ")", "or", "PLTP", "at", "6", "weeks", "of", "HFD", ".", "Note", "that", "no", "difference", "was", "found", "in", "body", "weight", "between", "the", "groups", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "repeated", "measures", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "test", ".", ".", "After", "eight", "hours", "of", "fasting", ",", "2", "g", "/", "kg", "body", "weight", "of", "glucose", "was", "administered", ".", "n", "=", "7", "for", "GFP", "control", "and", "n", "=", "10", "for", "PLTP", ".", "AUC", "of", "glucose", "is", "shown", "in", "the", "right", "graph", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", "18F", "-", "FDG", "PET", "/", "CT", "scan", "images", "of", "mice", "that", "received", "adenovirus", "GFP", "(", "control", ")", "or", "PLTP", "at", "14", "weeks", "of", "HFD", ".", "Mice", "received", "CL316", ",", "243", "at", "dose", "of", "1", "mg", "/", "kg", "of", "body", "weight", "30", "min", "before", "the", "PET", "/", "CT", "images", ".", "Representative", "images", "of", "n", "=", "5", "for", "both", "groups", ".", "Yellow", "arrows", "indicate", "anatomical", "references", "as", "bladder", ",", "heart", "and", "interscapular", "BAT", ".", "F", "Quantification", "of", "18F", "-", "FDG", "uptake", "in", "indicated", "tissues", "from", "mice", "in", "(", "E", ")", ".", "After", "the", "18F", "-", "FDG", "PET", "/", "CT", "imaging", ",", "indicated", "tissues", "were", "harvested", "and", "the", "radioactivity", "was", "measured", "by", "scintillation", "counter", ".", "n", "=", "5", "for", "both", "groups", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Glucose tolerance test of mice that received AAV control (GFP) or PLTP at 10 weeks of HFD. After eight hours of fasting, 2 g/kg body weight of glucose was administered. n=9 for GFP and n=7 for PLTP. *P<0.05, **P<0.01 relative to GFP by two-way ANOVA repeated measures followed by Bonferroni's test.B Insulin tolerance test of mice in (A) at 10 weeks of HFD. Mice were fasted for four hours and administered insulin (0.75 U/kg body weight). n=9 for GFP control and n=7 for PLTP. *P<0.05, **P<0.01 relative to GFP by two-way ANOVA repeated measures followed by Bonferroni's test.C Fasting insulin levels of mice in (A) at 10 weeks of HFD. Blood samples were harvested after eight hours of fasting. n=5 for GFP and n=4 for PLTP. *P<0.05 relative to GFP by Student's t-test.D Glucose tolerance test of mice that received AAV control (GFP) or PLTP at 6 weeks of HFD. Note that no difference was found in body weight between the groups by two-way ANOVA repeated measures followed by Bonferroni's test.. After eight hours of fasting, 2 g/kg body weight of glucose was administered. n=7 for GFP control and n=10 for PLTP. AUC of glucose is shown in the right graph. *P<0.05 by Student's t-test.E 18F-FDG PET/CT scan images of mice that received adenovirus GFP (control) or PLTP at 14 weeks of HFD. Mice received CL316,243 at dose of 1 mg/kg of body weight 30 min before the PET/CT images. Representative images of n=5 for both groups. Yellow arrows indicate anatomical references as bladder, heart and interscapular BAT.F Quantification of 18F-FDG uptake in indicated tissues from mice in (E). After the 18F-FDG PET/CT imaging, indicated tissues were harvested and the radioactivity was measured by scintillation counter. n=5 for both groups. *P<0.05 relative to GFP by Student's t-test. N.S., not significant."}
{"words": ["Figure", "4A", "Lipidomics", "-", "based", "quantification", "of", "indicated", "lipid", "species", "in", "mice", "that", "received", "tail", "-", "vein", "injection", "of", "adenovirus", "expressing", "PLTP", "or", "GFP", "(", "control", ")", ".", "Blood", "and", "tissues", "were", "harvested", "after", "10", "weeks", "of", "HFD", ".", "n", "=", "4", "for", "GFP", "and", "n", "=", "5", "for", "PLTP", "in", "mice", "on", "HFD", ".", "LPC", "=", "(", "lyso", ")", "phosphatidylcholine", ",", "LPE", "=", "(", "lyso", ")", "phosphatidylethalonamine", ",", "PA", "=", "phosphatidic", "acid", ",", "SM", "=", "sphingomyelin", ",", "TAG", "=", "triglycerides", ",", "FFA", "=", "free", "fatty", "acid", ".", "Statistical", "analysis", "is", "demonstrated", "(", "P", "value", ")", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "B", "Plasma", "total", "cholesterol", "levels", "in", "mice", "that", "received", "adenovirus", "GFP", "(", "control", ")", "or", "PLTP", ".", "Blood", "and", "tissues", "were", "harvested", "seven", "days", "after", "adenovirus", "infection", ".", "n", "=", "8", "in", "mice", "on", "RD", "and", "n", "=", "7", "in", "mice", "on", "HFD", "for", "14", "weeks", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "C", "Relative", "mRNA", "levels", "of", "indicated", "genes", "in", "the", "liver", "of", "mice", "on", "HFD", ".", "Tbp", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "n", "=", "4", "for", "GFP", "and", "n", "=", "6", "for", "PLTP", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "D", "Bile", "acid", "levels", "in", "the", "liver", "of", "mice", "in", "(", "B", ")", ".", "n", "=", "8", "in", "mice", "on", "RD", "and", "n", "=", "6", "in", "mice", "on", "HFD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", "Bile", "acid", "levels", "in", "the", "plasma", "of", "mice", "in", "(", "B", ")", ".", "n", "=", "8", "in", "mice", "on", "RD", "and", "n", "=", "7", "in", "mice", "on", "HFD", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "F", "Bile", "acid", "levels", "in", "the", "feces", "of", "mice", "in", "(", "B", ")", ".", "Feces", "were", "collected", "from", "mice", "on", "RD", "and", "HFD", "after", "seven", "days", "of", "treatment", ".", "n", "=", "7", "in", "mice", "on", "RD", "and", "HFD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "relative", "to", "GFP", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "H", "Relative", "expression", "of", "Ucp1", "in", "differentiated", "brown", "adipocytes", "treated", "with", "cholic", "acid", "(", "CA", ")", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "CA", "at", "indicated", "concentrations", "for", "24", "h", ".", "0", ".", "1", "%", "ETOH", "was", "used", "as", "vehicle", "control", "(", "Ctr", ")", ".", "n", "=", "3", ".", "Ucp1", "mRNA", "expression", "was", "normalized", "by", "Tbp", "as", "an", "internal", "control", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "Ctr", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Lipidomics-based quantification of indicated lipid species in mice that received tail-vein injection of adenovirus expressing PLTP or GFP (control). Blood and tissues were harvested after 10 weeks of HFD. n=4 for GFP and n=5 for PLTP in mice on HFD. LPC = (lyso)phosphatidylcholine, LPE = (lyso)phosphatidylethalonamine, PA = phosphatidic acid, SM = sphingomyelin, TAG = triglycerides, FFA = free fatty acid. Statistical analysis is demonstrated (P value) relative to GFP by Student's t-test.B Plasma total cholesterol levels in mice that received adenovirus GFP (control) or PLTP. Blood and tissues were harvested seven days after adenovirus infection. n=8 in mice on RD and n=7 in mice on HFD for 14 weeks. ***P<0.001 relative to GFP by Student's t-test.C Relative mRNA levels of indicated genes in the liver of mice on HFD. Tbp was used as an internal control. n=4 for GFP and n=6 for PLTP. *P<0.05, **P<0.01 relative to GFP by Student's t-test.D Bile acid levels in the liver of mice in (B). n=8 in mice on RD and n=6 in mice on HFD. *P<0.05, **P<0.01 relative to GFP by Student's t-test.E Bile acid levels in the plasma of mice in (B). n=8 in mice on RD and n=7 in mice on HFD. ***P<0.001 relative to GFP by Student's t-test. F Bile acid levels in the feces of mice in (B). Feces were collected from mice on RD and HFD after seven days of treatment. n=7 in mice on RD and HFD. **P<0.01, ***P<0.001 relative to GFP by Student's t-test. H Relative expression of Ucp1 in differentiated brown adipocytes treated with cholic acid (CA). Cells were treated with CA at indicated concentrations for 24 h. 0.1% ETOH was used as vehicle control (Ctr). n=3. Ucp1 mRNA expression was normalized by Tbp as an internal control. **P<0.01 relative to Ctr by one-way ANOVA followed by Tukey's test. N.S., not significant."}
{"words": ["Figure", "5B", "Relative", "expression", "of", "Pltp", "in", "liver", "of", "mice", "that", "received", "adenovirus", "GFP", "(", "control", ")", "or", "PLTP", ".", "n", "=", "4", "for", "GFP", ",", "n", "=", "6", "for", "PLTP", "and", "n", "=", "6", "for", "PLTPM159E", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "GFP", "by", "ANOVA", "one", "-", "way", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ".", "C", "Plasma", "PLTP", "concentration", "in", "mice", "that", "received", "adenovirus", "GFP", "or", "PLTP", "as", "determined", "by", "quantitative", "mass", "spectrometry", ".", "n", "=", "4", "for", "GFP", ",", "n", "=", "6", "for", "PLTP", "and", "n", "=", "6", "for", "PLTPM159E", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "relative", "to", "GFP", "by", "ANOVA", "one", "-", "way", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ".", "D", "Plasma", "PLTP", "activity", "in", "mice", "that", "received", "adenovirus", "GFP", "or", "PLTP", ".", "n", "=", "4", "for", "GFP", ",", "n", "=", "6", "for", "PLTP", "and", "n", "=", "6", "for", "PLTPM159E", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "PLTP", "relative", "to", "GFP", "and", "PLTPM159E", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "PLTPM159E", "relative", "to", "GFP", "by", "ANOVA", "one", "-", "way", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "E", "Changes", "in", "body", "weight", "of", "mice", "that", "received", "AAV", "control", "or", "PLTP", "during", "10", "weeks", "of", "HFD", ".", "n", "=", "8", "for", "GFP", ",", "n", "=", "10", "for", "PLTP", "and", "n", "=", "10", "for", "PLTPM159E", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "relative", "to", "PLTPM159E", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "repeated", "measures", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "test", ".", "F", "Relative", "Ucp1", "expression", "in", "BAT", "of", "mice", "that", "received", "AAV", "GFP", "(", "control", ")", "or", "PLTP", "at", "10", "weeks", "of", "HFD", ".", "n", "=", "4", "for", "GFP", ",", "n", "=", "5", "for", "PLTP", "and", "n", "=", "4", "for", "PLTPM159E", ".", "Tbp", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "one", "-", "way", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "G", "Glucose", "tolerance", "test", "of", "mice", "that", "received", "AAV", "GFP", "or", "PLTP", "at", "10", "weeks", "of", "HFD", ".", "n", "=", "5", "for", "GFP", "and", "n", "=", "6", "for", "both", "PLTP", "and", "PLTPM159E", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "PLTP", "relative", "to", "GFP", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "repeated", "measures", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "test", ".", "AUC", "of", "glucose", ",", "shown", "in", "the", "right", "graph", ",", "was", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ".", "H", "Plasma", "total", "cholesterol", "of", "mice", "that", "received", "AAV", "control", "or", "PLTP", "at", "10", "weeks", "of", "HFD", ".", "n", "=", "7", "for", "all", "groups", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "05", "by", "ANOVA", "one", "-", "way", "followed", "by", "Fisher", "'", "s", "LSD", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ".", "I", "Plasma", "bile", "acids", "in", "(", "H", ")", ".", "n", "=", "7", "for", "all", "groups", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "PLTP", "relative", "to", "GFP", "and", "PLTPM159E", "by", "ANOVA", "one", "-", "way", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "J", "Plasma", "phospholipid", "in", "(", "H", ")", ".", "n", "=", "7", "for", "all", "groups", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "PLTP", "and", "PLTPM159E", "relative", "to", "GFP", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "PLTP", "relative", "to", "PLTPM159E", "by", "ANOVA", "one", "-", "way", "followed", "by", "Fisher", "'", "s", "LSD", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Relative expression of Pltp in liver of mice that received adenovirus GFP (control) or PLTP. n=4 for GFP, n=6 for PLTP and n=6 for PLTPM159E. **P<0.01 relative to GFP by ANOVA one-way followed by Tukey's test. N.S., not significant.C Plasma PLTP concentration in mice that received adenovirus GFP or PLTP as determined by quantitative mass spectrometry. n=4 for GFP, n=6 for PLTP and n=6 for PLTPM159E. ***P<0.001 relative to GFP by ANOVA one-way followed by Tukey's test. N.S., not significant.D Plasma PLTP activity in mice that received adenovirus GFP or PLTP. n=4 for GFP, n=6 for PLTP and n=6 for PLTPM159E. ***P<0.001 PLTP relative to GFP and PLTPM159E; *P<0.05 PLTPM159E relative to GFP by ANOVA one-way followed by Tukey's test.E Changes in body weight of mice that received AAV control or PLTP during 10 weeks of HFD. n=8 for GFP, n=10 for PLTP and n=10 for PLTPM159E. *P<0.05, **P<0.01 relative to PLTPM159E by two-way ANOVA repeated measures followed by Bonferroni's test.F Relative Ucp1 expression in BAT of mice that received AAV GFP (control) or PLTP at 10 weeks of HFD. n=4 for GFP, n=5 for PLTP and n=4 for PLTPM159E. Tbp was used as an internal control. *P<0.05, **P<0.01 by ANOVA one-way followed by Tukey's test.G Glucose tolerance test of mice that received AAV GFP or PLTP at 10 weeks of HFD. n=5 for GFP and n=6 for both PLTP and PLTPM159E. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 PLTP relative to GFP by two-way ANOVA repeated measures followed by Bonferroni's test. AUC of glucose, shown in the right graph, was analyzed by one-way ANOVA followed by Tukey's test. N.S., not significant.H Plasma total cholesterol of mice that received AAV control or PLTP at 10 weeks of HFD. n=7 for all groups. *P=0.05 by ANOVA one-way followed by Fisher's LSD test. N.S., not significant.I Plasma bile acids in (H). n=7 for all groups. ***P<0.001 PLTP relative to GFP and PLTPM159E by ANOVA one-way followed by Tukey's test.J Plasma phospholipid in (H). n=7 for all groups. ***P<0.001 PLTP and PLTPM159E relative to GFP; *P<0.05 PLTP relative to PLTPM159E by ANOVA one-way followed by Fisher's LSD test."}
{"words": ["Figure", "1Testicular", "maturation", "arrest", "in", "the", "patient", "(", "WHT3759", ")", ".", "Testicular", "tissue", "obtained", "by", "biopsy", "was", "sectioned", "and", "stained", "with", "hematoxylin", "/", "eosin", ".", "Seminiferous", "tubules", "contained", "meiotic", "germ", "cells", "such", "as", "zygotene", "(", "ZS", ",", "arrowheads", ")", "and", "pachytene", "spermatocytes", "(", "PS", ",", "arrows", ")", ",", "but", "no", "post", "-", "meiotic", "germ", "cells", "such", "as", "round", "spermatids", "were", "detectable", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Testicular maturation arrest in the patient (WHT3759). Testicular tissue obtained by biopsy was sectioned and stained with hematoxylin/eosin. Seminiferous tubules contained meiotic germ cells such as zygotene (ZS, arrowheads) and pachytene spermatocytes (PS, arrows), but no post-meiotic germ cells such as round spermatids were detectable. Scale bar, 25 μm."}
{"words": ["Figure", "2Western", "blot", "analysis", "of", "TEX11", "in", "the", "testes", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "mice", "with", "different", "Tex11", "gene", "dosages", ".", "ACTB", "serves", "as", "a", "loading", "control", ".", "Testis", "weight", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "males", ".", "Sperm", "count", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "males", ".", "Histological", "analysis", "of", "testes", "from", "adult", "wild", "-", "type", ",", "Tex11", "KI", "/", "KO", ",", "and", "Tex11", "−", "/", "Y", "males", ".", "RS", ",", "round", "spermatids", ";", "ES", ",", "elongating", "spermatids", ";", "Pa", ",", "pachytene", "spermatocytes", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "The", "Tex11", "knockin", "allele", "rescues", "chromosomal", "synapsis", "defects", "in", "Tex11", "−", "/", "Y", "spermatocytes", "in", "3", "-", "month", "-", "old", "males", ".", "Chromosomal", "synapsis", "defects", "were", "assessed", "by", "SYCP1", "and", "SYCP2", "immunostaining", "of", "spread", "nuclei", "from", "100", "pachytene", "spermatocytes", "per", "male", ";", "for", "each", "genotype", ",", "three", "males", "were", "analyzed", ".", "Abbreviations", "for", "Tex11", "genotypes", ":", "−", "/", "Y", ",", "Tex11", "knockout", "(", "Yang", "et", "al", ",", "2008", ")", ";", "KI", ";", "−", "/", "Y", ",", "Tex11", "knockin", "and", "knockout", ";", "+", "/", "Y", ",", "wild", "type", ";", "KI", ";", "+", "/", "Y", ",", "Tex11", "knockin", "plus", "wild", "-", "type", "Tex11", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Western blot analysis of TEX11 in the testes of 3-month-old mice with different Tex11 gene dosages. ACTB serves as a loading control.Testis weight of 3-month-old males.Sperm count of 3-month-old males.Histological analysis of testes from adult wild-type, Tex11 KI/KO, and Tex11−/Y males. RS, round spermatids; ES, elongating spermatids; Pa, pachytene spermatocytes. Scale bar, 50 μm.The Tex11 knockin allele rescues chromosomal synapsis defects in Tex11−/Y spermatocytes in 3-month-old males. Chromosomal synapsis defects were assessed by SYCP1 and SYCP2 immunostaining of spread nuclei from 100 pachytene spermatocytes per male; for each genotype, three males were analyzed. Abbreviations for Tex11 genotypes: −/Y, Tex11 knockout (Yang et al, 2008); KI;−/Y, Tex11 knockin and knockout; +/Y, wild type; KI;+/Y, Tex11 knockin plus wild-type Tex11."}
{"words": ["Figure", "3Reduced", "testis", "weight", "in", "juvenile", "but", "not", "adult", "Tex11", "KI", ";", "−", "/", "Y", "males", ".", "The", "time", "frames", "of", "the", "first", "wave", "and", "adult", "waves", "of", "spermatogenesis", "are", "indicated", ".", "Increased", "chromosomal", "asynapsis", "in", "spermatocytes", "and", "reduced", "levels", "of", "TEX11", "protein", "in", "the", "testes", "of", "25", "-", "day", "-", "old", "Tex11", "KI", "/", "KO", "males", ".", "Chromosomal", "synapsis", "defects", "were", "assessed", "by", "SYCP1", "and", "SYCP2", "immunostaining", "of", "spread", "nuclei", "from", "100", "pachytene", "spermatocytes", "per", "male", ";", "for", "each", "genotype", ",", "three", "males", "were", "analyzed", ".", "Pachytene", "spermatocytes", "from", "25", "-", "day", "-", "old", "Tex11", "KI", "/", "KO", "males", "contain", "significantly", "fewer", "MLH1", "foci", "compared", "to", "wild", "-", "type", "spermatocytes", ".", "Values", "are", "shown", "as", "average", "±", "standard", "deviation", ".", "Error", "bar", "is", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Reduced testis weight in juvenile but not adult Tex11 KI; −/Y males. The time frames of the first wave and adult waves of spermatogenesis are indicated.Increased chromosomal asynapsis in spermatocytes and reduced levels of TEX11 protein in the testes of 25-day-old Tex11 KI/KO males. Chromosomal synapsis defects were assessed by SYCP1 and SYCP2 immunostaining of spread nuclei from 100 pachytene spermatocytes per male; for each genotype, three males were analyzed.Pachytene spermatocytes from 25-day-old Tex11 KI/KO males contain significantly fewer MLH1 foci compared to wild-type spermatocytes. Values are shown as average ± standard deviation. Error bar is standard deviation."}
{"words": ["Figure", "4The", "number", "of", "MLH1", "foci", "in", "pachytene", "spermatocytes", "from", "3", "-", "month", "-", "old", "males", "positively", "correlates", "with", "increasing", "Tex11", "gene", "dosage", ".", "Quantification", "of", "MLH1", "foci", "in", "pachytene", "oocytes", "from", "the", "ovaries", "of", "Tex11", "−", "/", "−", ",", "Tex11", "+", "/", "−", ",", "and", "wild", "-", "type", "embryonic", "day", "-", "17", ".", "5", "(", "E17", ".", "5", ")", "fetuses", "reveals", "a", "positive", "correlation", "of", "Tex11", "gene", "dosage", "and", "the", "number", "of", "MLH1", "foci", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4The number of MLH1 foci in pachytene spermatocytes from 3-month-old males positively correlates with increasing Tex11 gene dosage.Quantification of MLH1 foci in pachytene oocytes from the ovaries of Tex11−/−, Tex11+/−, and wild-type embryonic day-17.5 (E17.5) fetuses reveals a positive correlation of Tex11 gene dosage and the number of MLH1 foci."}
{"words": ["Figure", "6A", "Western", "blot", "analysis", "reveals", "comparable", "levels", "of", "TEX11", "protein", "in", "the", "testes", "of", "wild", "-", "type", "and", "point", "mutant", "KI", "/", "KO", "males", ".", "ACTB", "serves", "as", "a", "control", ".", "B", "-", "D", "Body", "weight", "(", "B", ")", ",", "testisweight", "(", "C", ")", "in", "Tex11", "KI", "(", "V749A", ")", "/", "KO", "males", ".", "B", "-", "D", "Significantly", "reduced", "sperm", "count", "(", "per", "pair", "of", "epididymides", ")", "in", "Tex11", "KI", "(", "V749A", ")", "/", "KO", "males", "(", "D", ")", ".", "E", "Mating", "test", "of", "3", "-", "to", "5", "-", "month", "-", "old", "males", ".", "F", "Dramatically", "increased", "chromosomal", "asynapsis", "in", "spermatocytes", "from", "Tex11", "KI", "(", "V749A", ")", "/", "KO", "males", ".", "100", "pachytene", "spermatocytes", "per", "mouse", "were", "examined", "by", "surface", "spread", "analysis", ".", "G", "Number", "of", "MLH1", "foci", "in", "pachytene", "spermatocytes", ".", "Note", "a", "significantly", "higher", "number", "of", "MLH1", "foci", "in", "spermatocytes", "from", "KI", "(", "Q173R", ")", "/", "KO", "males", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Western blot analysis reveals comparable levels of TEX11 protein in the testes of wild-type and point mutant KI/KO males. ACTB serves as a control.B-D Body weight (B), testisweight (C) in Tex11 KI(V749A)/KO males.B-D Significantly reduced sperm count (per pair of epididymides) in Tex11 KI(V749A)/KO males (D).E Mating test of 3- to 5-month-old males.F Dramatically increased chromosomal asynapsis in spermatocytes from Tex11 KI(V749A)/KO males. 100 pachytene spermatocytes per mouse were examined by surface spread analysis.G Number of MLH1 foci in pachytene spermatocytes. Note a significantly higher number of MLH1 foci in spermatocytes from KI(Q173R)/KO males."}
{"words": ["Figure", "1Reverse", "Transcriptase", "PCR", "showing", "that", "bd1971", ",", "and", "control", "gene", "dnaK", ",", "are", "expressed", "throughout", "the", "predatory", "cycle", "of", "Bdellovibrio", "bacteriovorus", ".", "RNA", "was", "isolated", "at", "the", "time", "points", "indicated", "across", "the", "top", "of", "the", "gel", "during", "one", "round", "of", "synchronous", "Bdellovibrio", "infection", "of", "E", ".", "coli", "cells", ".", "Primers", "were", "designed", "to", "anneal", "specifically", "to", "the", "gene", "of", "interest", ".", "L", "=", "100bp", "DNA", "ladder", ",", "AP", "=", "Attack", "Phase", "cells", ",", "15", "-", "45", "=", "15", "-", "45", "minutes", "respectively", "since", "infection", ",", "1h", "-", "4h", "=", "hours", "respectively", "since", "infection", ".", "Ec", "=", "E", ".", "coli", "strain", "S17", "-", "1", "RNA", "(", "negative", "control", ":", "no", "Bdellovibrio", "RNA", ")", ";", "NT", "=", "control", "with", "no", "template", "RNA", ";", "gen", "=", "B", ".", "bacteriovorus", "HD100", "genomic", "DNA", "(", "positive", "control", ")", ".", "The", "cartoon", "above", "represents", "each", "stage", "in", "the", "predatory", "cycle", ".", "Epifluorescent", "images", "of", "E", ".", "coli", "invaded", "by", "B", ".", "bacteriovorus", "HD100", "with", "mCherry", "tagged", "Bd1971", "at", "the", "times", "indicated", "throughout", "the", "invasive", "process", "during", "one", "round", "of", "synchronous", "infection", ".", "Fluorescence", "was", "acquired", "with", "a", "two", "second", "exposure", "and", "maximum", "sensitivity", "gain", "but", "different", "balance", "and", "contrast", "levels", "in", "the", "fluorescence", "channel", "were", "used", "to", "produce", "these", "images", "(", "see", "methods", ")", "as", "the", "fluorescence", "was", "fainter", "at", "later", "timepoints", "but", "we", "wished", "to", "show", "whether", "or", "not", "the", "cellular", "localization", "within", "the", "Bdellovibrio", "altered", "during", "predation", ".", "Fluorescence", "images", "and", "merges", "with", "phase", "contrast", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "are", "2", "µm", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Reverse Transcriptase PCR showing that bd1971, and control gene dnaK, are expressed throughout the predatory cycle of Bdellovibrio bacteriovorus. RNA was isolated at the time points indicated across the top of the gel during one round of synchronous Bdellovibrio infection of E. coli cells. Primers were designed to anneal specifically to the gene of interest. L = 100bp DNA ladder, AP = Attack Phase cells, 15-45 = 15-45 minutes respectively since infection, 1h-4h = hours respectively since infection. Ec = E. coli strain S17-1 RNA (negative control: no Bdellovibrio RNA); NT = control with no template RNA; gen = B. bacteriovorus HD100 genomic DNA (positive control). The cartoon above represents each stage in the predatory cycle.Epifluorescent images of E. coli invaded by B. bacteriovorus HD100 with mCherry tagged Bd1971 at the times indicated throughout the invasive process during one round of synchronous infection. Fluorescence was acquired with a two second exposure and maximum sensitivity gain but different balance and contrast levels in the fluorescence channel were used to produce these images (see methods) as the fluorescence was fainter at later timepoints but we wished to show whether or not the cellular localization within the Bdellovibrio altered during predation. Fluorescence images and merges with phase contrast images are shown. Scale bars are 2 µm. Images are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2Relative", "levels", "of", "c", "-", "di", "-", "GMP", "in", "matched", "cell", "biomass", "host", "-", "independent", "(", "HI", ")", "cultures", "of", "bd1971", ":", ":", "kan", "compared", "with", "fliC1", "merodiploid", "KnR", "HI", "control", "strain", "(", "Wild", "-", "Type", "for", "bd1971", ")", ".", "The", "bd1971", "mutant", "strain", "contains", "significantly", "more", "c", "-", "di", "-", "GMP", "than", "the", "control", ".", "Data", "are", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Relative", "levels", "of", "c", "-", "di", "-", "GMP", "in", "matched", "cell", "biomass", "wild", "-", "type", "predatory", "cultures", "of", "HD100", "strain", ",", "silent", "Bd1971", "deletion", "strain", "(", "Δ1971", ")", ",", "Bd1971D306307A", "strain", "(", "bd1971DD", ")", "and", "Bd1971R67D", "strain", "(", "bd1971R", ")", ".", "All", "mutant", "strains", "had", "higher", "levels", "of", "c", "-", "di", "-", "GMP", "compared", "to", "the", "wild", "type", "strain", ".", "Error", "bars", "show", "SEM", ".", "Data", "are", "from", "six", "independent", "experiments", "for", "HD100", "and", "ΔBd1971", "and", "from", "four", "independent", "experiments", "for", "Bd1971DD", "and", "Bd1971R", "mutants", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Relative levels of c-di-GMP in matched cell biomass host-independent (HI) cultures of bd1971::kan compared with fliC1 merodiploid KnR HI control strain (Wild-Type for bd1971). The bd1971 mutant strain contains significantly more c-di-GMP than the control. Data are from 3 independent experiments.Relative levels of c-di-GMP in matched cell biomass wild-type predatory cultures of HD100 strain, silent Bd1971 deletion strain (Δ1971), Bd1971D306307A strain (bd1971DD) and Bd1971R67D strain (bd1971R). All mutant strains had higher levels of c-di-GMP compared to the wild type strain. Error bars show SEM. Data are from six independent experiments for HD100 and ΔBd1971 and from four independent experiments for Bd1971DD and Bd1971R mutants."}
{"words": ["Figure", "5Apo", "-", "Bd1971", "was", "supplemented", "with", "10", "mM", "MgCl2", "or", "CaCl2", "in", "conjunction", "with", "saturating", "concentrations", "(", "2", ".", "5", "mM", ")", "of", "cAMP", ",", "cGMP", "or", "no", "nucleotide", "and", "phosphodiesterase", "activity", "with", "respect", "to", "the", "generic", "substrate", "PNPP", "(", "5", "mM", ")", "was", "measured", "spectrophotometrically", ".", "Values", "are", "the", "average", "of", "three", "repeats", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "HPLC", "traces", "of", "reaction", "products", "generated", "from", "100", "µM", "c", "-", "di", "-", "GMP", "incubated", "with", "apo", "-", "Bd1971", "(", "Control", ")", ",", "or", "protein", "supplemented", "with", "either", "100", "µM", "cAMP", "or", "cGMP", ".", "Peaks", "were", "identified", "by", "reference", "to", "standards", "also", "resolved", "by", "HPLC", "and", "are", "labeled", "in", "the", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Apo-Bd1971 was supplemented with 10 mM MgCl2 or CaCl2 in conjunction with saturating concentrations (2.5 mM) of cAMP, cGMP or no nucleotide and phosphodiesterase activity with respect to the generic substrate PNPP (5 mM) was measured spectrophotometrically. Values are the average of three repeats, error bars represent standard deviation.HPLC traces of reaction products generated from 100 µM c-di-GMP incubated with apo-Bd1971 (Control), or protein supplemented with either 100 µM cAMP or cGMP. Peaks were identified by reference to standards also resolved by HPLC and are labeled in the figure."}
{"words": ["Figure", "8ITC", "titration", "curves", "and", "relative", "heats", "of", "binding", "for", "(", "A", ")", "cAMP", "binding", "to", "Bd1971ΔEAL", ".", "Successive", "injections", "of", "6", "µl", "of", "cNMP", "(", "0", ".", "5", "-", "1", ".", "6", "mM", ")", "were", "made", "into", "1", ".", "4", "ml", "of", "apo", "-", "Bd1971ΔEAL", "(", "50", "-", "150", "µM", ")", "and", "heat", "changes", "measured", ".", "The", "top", "panels", "show", "the", "ITC", "titrations", "and", "the", "bottom", "panels", "show", "the", "binding", "isotherm", "associated", "with", "each", "ITC", "experiment", ".", "ITC", "titration", "curves", "and", "relative", "heats", "of", "binding", "for", "cGMP", "binding", "to", "Bd1971ΔEAL", ".", "Successive", "injections", "of", "6", "µl", "of", "cNMP", "(", "0", ".", "5", "-", "1", ".", "6", "mM", ")", "were", "made", "into", "1", ".", "4", "ml", "of", "apo", "-", "Bd1971ΔEAL", "(", "50", "-", "150", "µM", ")", "and", "heat", "changes", "measured", ".", "The", "top", "panels", "show", "the", "ITC", "titrations", "and", "the", "bottom", "panels", "show", "the", "binding", "isotherm", "associated", "with", "each", "ITC", "experiment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8ITC titration curves and relative heats of binding for (A) cAMP binding to Bd1971ΔEAL. Successive injections of 6 µl of cNMP (0.5 - 1.6 mM) were made into 1.4 ml of apo-Bd1971ΔEAL (50 - 150 µM) and heat changes measured. The top panels show the ITC titrations and the bottom panels show the binding isotherm associated with each ITC experiment.ITC titration curves and relative heats of binding for cGMP binding to Bd1971ΔEAL. Successive injections of 6 µl of cNMP (0.5 - 1.6 mM) were made into 1.4 ml of apo-Bd1971ΔEAL (50 - 150 µM) and heat changes measured. The top panels show the ITC titrations and the bottom panels show the binding isotherm associated with each ITC experiment."}
{"words": ["Figure", "9Data", "were", "fitted", "with", "an", "allosteric", "sigmoidal", "model", "in", "GraphPad", "Prism", "software", "and", "used", "to", "determine", "the", "kinetic", "parameters", "associated", "with", "cNMP", "dependent", "phosphodiesterase", "activity", ".", "Data", "points", "for", "both", "sets", "of", "results", "are", "the", "average", "of", "three", "experimental", "replicates", "with", "the", "standard", "deviation", "shown", "by", "intersecting", "bars", ".", "Results", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9Data were fitted with an allosteric sigmoidal model in GraphPad Prism software and used to determine the kinetic parameters associated with cNMP dependent phosphodiesterase activity.Data points for both sets of results are the average of three experimental replicates with the standard deviation shown by intersecting bars. Results are representative of at least three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "11Spot", "tests", "of", "co", "-", "transformants", "of", "either", "Bd0367", "(", "DgcA", ";", "GGDEF", "protein", ")", "response", "regulator", "domain", "or", "Bd3125", "(", "CdgA", ";", "a", "degenerate", "GGDEF", "protein", "likely", "involved", "in", "c", "-", "di", "-", "GMP", "binding", "and", "signalling", ")", "with", "full", "length", "Bd1971", ",", "or", "the", "N", "-", "terminal", "(", "1", "-", "145", ")", ",", "or", "C", "-", "terminal", "(", "145", "-", "400", ")", "portions", "of", "Bd1971", "in", "either", "pUT18c", "or", "pKT25", "as", "indicated", ".", "Positive", "control", "was", "co", "-", "transformants", "with", "pUT18c", "-", "zip", "and", "pKT25", "-", "zip", ",", "negative", "control", "was", "the", "empty", "vectors", ".", "The", "co", "-", "transformants", "were", "plated", "on", "LB", "-", "X", "-", "Gal", "medium", "with", "positive", "interaction", "resulting", "in", "blue", "colouration", ",", "which", "can", "be", "seen", "for", "all", "of", "the", "interactions", "in", "both", "plasmid", "combinations", ",", "but", "not", "for", "the", "negative", "control", ".", "Images", "are", "representative", "of", "at", "least", "4", "independent", "experiments", ".", "Confirmation", "of", "BTH", "interactions", "by", "β", "-", "Galactosidase", "activity", "assays", ".", "The", "interaction", "is", "significantly", "stronger", "between", "Bd3125", "and", "the", "N", "-", "terminal", "domain", "of", "Bd1971", "than", "the", "interaction", "with", "the", "C", "-", "terminus", "of", "Bd1971", ".", "The", "response", "regulator", "domain", "of", "Bd0367", "showed", "significant", "interaction", "with", "Bd1971", ",", "but", "the", "full", "length", "Bd0367", "did", "not", ".", "*", "p", ">", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "N", "/", "S", "-", "not", "significant", ".", "Data", "are", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ",", "error", "bars", "are", "the", "standard", "error", "of", "the"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 11Spot tests of co-transformants of either Bd0367 (DgcA; GGDEF protein) response regulator domain or Bd3125 (CdgA; a degenerate GGDEF protein likely involved in c-di-GMP binding and signalling) with full length Bd1971, or the N-terminal (1-145), or C-terminal (145-400) portions of Bd1971 in either pUT18c or pKT25 as indicated. Positive control was co-transformants with pUT18c-zip and pKT25-zip, negative control was the empty vectors. The co-transformants were plated on LB-X-Gal medium with positive interaction resulting in blue colouration, which can be seen for all of the interactions in both plasmid combinations, but not for the negative control. Images are representative of at least 4 independent experiments.Confirmation of BTH interactions by β-Galactosidase activity assays. The interaction is significantly stronger between Bd3125 and the N-terminal domain of Bd1971 than the interaction with the C-terminus of Bd1971. The response regulator domain of Bd0367 showed significant interaction with Bd1971, but the full length Bd0367 did not. *p>0.05 by Student's t-test N/S- not significant. Data are from at least three independent experiments, error bars are the standard error of the mean"}
{"words": ["Figure", "1A", "RNA", "-", "seq", ".", "of", "freshly", "isolated", ",", "proliferating", "and", "differentiating", "satellite", "cells", "reveals", "an", "increased", "expression", "of", "linc", "-", "MYH", "in", "proliferating", "and", "differentiating", "MuSCs", ",", "but", "no", "expression", "is", "found", "in", "in", "freshly", "isolated", "MuSCs", ".", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "is", "confined", "to", "skeletal", "muscle", "in", "mouse", "(", "B", ")", "tissues", ".", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "is", "confined", "to", "skeletal", "muscle", "in", "human", "(", "C", ")", "tissues", ".", "D", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "is", "not", "detected", "in", "limb", "buds", "at", "E10", ".", "5", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "E13", ".", "5", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "E15", ".", "5", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "in", "hindlimb", "muscle", "of", "E18", ".", "5", ",", "newborn", "and", "7", "day", "old", "animals", "(", "n", "=", "3", "/", "3", "/", "3", ")", ".", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "in", "m", ".", "soleus", "(", "soleus", ")", ",", "m", ".", "tibialis", "anterior", "(", "TA", ")", "and", "and", "m", ".", "extensor", "digitorum", "longus", "(", "EDL", ")", "muscle", "at", "3", "weeks", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "8", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Biological", "replicates", "were", "used", "for", "all", "PCR", "experiments", ",", "data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "E", "Murine", "linc", "-", "Myh", "is", "localized", "in", "nuclear", "extracts", "of", "C2C12", "cells", ".", "Xist", "(", "nuclear", ")", "and", "Gapdh", "(", "mainly", "cytoplasmic", ")", "were", "used", "as", "controls", "(", "n", "=", "2", "nuclear", "/", "3", "cytoplasmic", "biological", "replicates", ".", ")", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "F", "-", "H", "RNA", "-", "FISH", "identifies", "linc", "-", "Myh", "in", "nuclei", "(", "DAPI", ",", "blue", ")", "of", "C2C12", "myoblasts", ".", "(", "G", ")", "Adipor", "(", "cytoplasmic", ")", "and", "(", "H", ")", "Xist", "(", "nuclear", ")", "were", "used", "as", "controls", ".", "(", "J", ")", "Heat", "map", "of", "proteins", "pulled", "down", "in", "the", "same", "experiments", "as", "in", "I", ",", "demonstrating", "that", "INO80", "chromatin", "remodeler", "complex", "exclusively", "interacts", "with", "linc", "-", "MYH", ".", "Blue", "color", "indicates", "pull", "-", "down", "of", "the", "respective", "protein", ",", "white", "color", "indicates", "that", "the", "protein", "was", "not", "detected", "in", "the", "respective", "sample", ".", "RNA", "-", "IP", "experiments", "using", "an", "anti", "-", "INO80", "antibody", "to", "isolate", "the", "INO80", "complex", "from", "murine", "C2C12", "cells", "(", "K", ")", "INO80", "in", "L", "refer", "to", "replicate", "INO80", "precipitation", "experiments", ".", "Precipitated", "RNAs", "were", "detected", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "RNA", "-", "IP", "experiments", "using", "an", "anti", "-", "INO80", "antibody", "to", "isolate", "the", "INO80", "complex", "from", "human", "HSMM", "cells", "(", "L", ")", ".", "INO80", "II", "in", "L", "refer", "to", "replicate", "INO80", "precipitation", "experiments", ".", "Precipitated", "RNAs", "were", "detected", "by", "RT", "-", "PCR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A RNA-seq. of freshly isolated, proliferating and differentiating satellite cells reveals an increased expression of linc-MYH in proliferating and differentiating MuSCs, but no expression is found in in freshly isolated MuSCs.Expression of linc-MYH is confined to skeletal muscle in mouse (B) tissues.Expression of linc-MYH is confined to skeletal muscle in human (C) tissues.D Expression of linc-MYH is not detected in limb buds at E10.5 (n = 3), E13.5 (n = 3) and E15.5 (n = 3). Expression of linc-MYH in hindlimb muscle of E18.5, newborn and 7 day old animals (n = 3/3/3). Expression of linc-MYH in m. soleus (soleus), m. tibialis anterior (TA) and and m. extensor digitorum longus (EDL) muscle at 3 weeks (n = 3) and 8 weeks of age (n = 5). Biological replicates were used for all PCR experiments, data are mean ± S.E.M.E Murine linc-Myh is localized in nuclear extracts of C2C12 cells. Xist (nuclear) and Gapdh (mainly cytoplasmic) were used as controls (n = 2 nuclear / 3 cytoplasmic biological replicates.) Data are mean ± S.E.M.F-H RNA-FISH identifies linc-Myh in nuclei (DAPI, blue) of C2C12 myoblasts. (G) Adipor (cytoplasmic) and (H) Xist (nuclear) were used as controls.(J) Heat map of proteins pulled down in the same experiments as in I, demonstrating that INO80 chromatin remodeler complex exclusively interacts with linc-MYH. Blue color indicates pull-down of the respective protein, white color indicates that the protein was not detected in the respective sample.RNA-IP experiments using an anti-INO80 antibody to isolate the INO80 complex from murine C2C12 cells (K) INO80 in L refer to replicate INO80 precipitation experiments. Precipitated RNAs were detected by RT-PCR.RNA-IP experiments using an anti-INO80 antibody to isolate the INO80 complex from human HSMM cells (L). INO80 II in L refer to replicate INO80 precipitation experiments. Precipitated RNAs were detected by RT-PCR."}
{"words": ["Figure", "2Body", "weight", "(", "A", ")", "of", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "and", "ctrl", "mice", "at", "10", "weeks", "(", "n", "=", "24", "KO", "/", "17", "WT", ";", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "tibia", "length", "(", "B", ")", "of", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "and", "ctrl", "mice", "of", "10", "weeks", "(", "n", "=", "9", "KO", "/", "13", "WT", ";", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "not", "significant", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "C", ",", "D", "Weight", "of", "m", ".", "tibialis", "anterior", "(", "TA", ")", "and", "m", ".", "digitorum", "longus", "(", "EDL", ")", "of", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "and", "ctrl", "mice", "at", "10", "weeks", "(", "n", "=", "9", "KO", "/", "10", "WT", "for", "TA", ",", "n", "=", "10", "KO", "/", "11", "WT", "for", "EDL", ";", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Size", "distribution", "of", "fibers", "in", "cross", "sections", "of", "TA", "(", "E", ",", "F", ")", "and", "EDL", "(", "G", ",", "H", ")", "muscle", "in", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "(", "blue", ")", "and", "ctrl", "(", "grey", ")", "animals", "at", "10", "weeks", ".", "A", "significant", "increase", "of", "fiber", "size", "was", "observed", "for", "TA", "and", "EDL", "muscles", "of", "linc", "-", "MYH", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", "KO", "/", "4", "WT", "for", "TA", ",", "n", "=", "3", "KO", "/", "3", "WT", "for", "EDL", "muscle", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Fisher", "'", "s", "multiple", "comparisons", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", ">", "250", "fibers", "per", "animal", "were", "counted", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Size", "distribution", "of", "fibers", "in", "cross", "sections", "of", "TA", "and", "EDL", "muscle", "in", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "(", "blue", ")", "and", "ctrl", "(", "grey", ")", "animals", "at", "10", "weeks", ".", "A", "significant", "increase", "of", "fiber", "size", "was", "observed", "for", "TA", "and", "EDL", "muscles", "of", "linc", "-", "MYH", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", "KO", "/", "4", "WT", "for", "TA", ",", "n", "=", "3", "KO", "/", "3", "WT", "for", "EDL", "muscle", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Fisher", "'", "s", "multiple", "comparisons", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", ">", "250", "fibers", "per", "animal", "were", "counted", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "K", "Numbers", "of", "myonuclei", "in", "cross", "sections", "of", "TA", "and", "EDL", "muscle", "(", "TA", ":", "n", "=", "6", "KO", "/", "6", "WT", ",", "EDL", "n", "=", "3", "KO", "/", "3", "WT", "animals", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "one", "-", "tailed", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "05", ")", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "L", "-", "O", "Number", "of", "myonuclei", "/", "fiber", "and", "of", "Pax7pos", "(", "red", ")", "MuSCs", "(", "red", "arrows", ")", "on", "myofibers", "isolated", "from", "flexor", "digitorum", "brevis", "muscle", ".", "Nuclei", "were", "stained", "using", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "in", "L", "indicates", "50", "µm", "for", "L", "and", "M", ".", "(", "N", ")", "The", "number", "of", "myonuclei", "/", "isolated", "fiber", "is", "increased", "in", "linc", "-", "MYH", "KO", "compared", "to", "WT", "myofibers", "(", "n", "=", "4", "KO", "/", "4", "WT", ",", ">", "26", "fibers", "/", "animal", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", "two", "-", "tailed", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "O", ")", "Number", "of", "MuSCs", "on", "isolated", "fibers", "from", "linc", "-", "MYH", "KO", "and", "WT", "mice", "(", "n", "=", "4", "KO", "/", "4", "WT", "animals", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "two", "-", "tailed", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "P", "-", "S", "Number", "of", "Pax7", "(", "red", ")", "positive", "MuSCs", "in", "cross", "sections", "of", "tibialis", "anterior", "muscle", "(", "P", "-", "R", ")", ";", "the", "relative", "amount", "of", "quiescent", "MuSCs", "identified", "by", "double", "staining", "(", "yellow", "arrows", ")", "for", "Pax7", "and", "CalcR", "(", "green", ")", "does", "not", "significantly", "differ", "between", "WT", "and", "linc", "-", "MYH", "KO", "animals", "(", "S", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "in", "P", "indicates", "25", "µm", "for", "P", "and", "Q", ".", "(", "n", "=", "3", "KO", "/", "3", "WT", "animals", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "one", "-", "tailed", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "05", ",", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "All", "data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "T", "The", "number", "of", "MuSC", "-", "related", "events", "in", "FACS", "experiments", "is", "significantly", "increased", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "KO", "animals", "(", "n", "=", "7", "KO", "/", "7", "WT", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0126", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "U", "-", "V", "Structure", "of", "MuSCs", "and", "the", "heterochromatin", "content", "of", "MuSC", "nuclei", "is", "not", "changed", "in", "linc", "-", "MYH", "KO", "(", "V", ")", "compared", "to", "WT", "mice", "(", "U", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Body weight (A) of male linc-MYH KO and ctrl mice at 10 weeks (n = 24 KO/17 WT; Student's t test, two-tailed, **p < 0.01)tibia length (B) of male linc-MYH KO and ctrl mice of 10 weeks (n = 9 KO/13 WT; Student's t test, two-tailed, not significant). Data are mean ± S.E.M.C, D Weight of m. tibialis anterior (TA) and m. digitorum longus (EDL) of male linc-MYH KO and ctrl mice at 10 weeks (n = 9 KO/10 WT for TA, n = 10 KO/11 WT for EDL; Student's t test, two-tailed, **p < 0.01, ***p<0.001). Data are mean ± S.E.M.Size distribution of fibers in cross sections of TA (E, F) and EDL (G, H) muscle in male linc-MYH KO (blue) and ctrl (grey) animals at 10 weeks. A significant increase of fiber size was observed for TA and EDL muscles of linc-MYH KO mice (n = 5 KO/4 WT for TA, n = 3 KO/3 WT for EDL muscle, two-way ANOVA with Fisher's multiple comparisons; *p < 0.05, **p < 0.01; > 250 fibers per animal were counted). Data are mean ± S.E.M.Size distribution of fibers in cross sections of TA and EDL muscle in male linc-MYH KO (blue) and ctrl (grey) animals at 10 weeks. A significant increase of fiber size was observed for TA and EDL muscles of linc-MYH KO mice (n = 5 KO/4 WT for TA, n = 3 KO/3 WT for EDL muscle, two-way ANOVA with Fisher's multiple comparisons; *p < 0.05, **p < 0.01; > 250 fibers per animal were counted). Data are mean ± S.E.M.K Numbers of myonuclei in cross sections of TA and EDL muscle (TA: n = 6 KO/6 WT, EDL n = 3 KO/3 WT animals, Mann-Whitney test one-tailed, **p<0.01, *p = 0.05) Data are mean ± S.E.M.L-O Number of myonuclei / fiber and of Pax7pos (red) MuSCs (red arrows) on myofibers isolated from flexor digitorum brevis muscle. Nuclei were stained using DAPI (blue). Scale bar in L indicates 50 µm for L and M. (N) The number of myonuclei / isolated fiber is increased in linc-MYH KO compared to WT myofibers (n = 4 KO/4 WT, > 26 fibers/animal; Mann-Whitney test two-tailed, * p < 0.05). (O) Number of MuSCs on isolated fibers from linc-MYH KO and WT mice (n = 4 KO/4 WT animals, Mann-Whitney test two-tailed; ****p < 0.0001). Data are mean ± S.E.M.P-S Number of Pax7 (red) positive MuSCs in cross sections of tibialis anterior muscle (P-R); the relative amount of quiescent MuSCs identified by double staining (yellow arrows) for Pax7 and CalcR (green) does not significantly differ between WT and linc-MYH KO animals (S). Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar in P indicates 25 µm for P and Q. (n = 3 KO/3 WT animals, Mann-Whitney test one-tailed; *p = 0.05, ns: not significant). All data are mean ± S.E.M.T The number of MuSC-related events in FACS experiments is significantly increased in linc-MYH-KO animals (n = 7 KO/7 WT, Student's t test, two-tailed, *p = 0.0126). Data are mean ± S.E.M.U-V Structure of MuSCs and the heterochromatin content of MuSC nuclei is not changed in linc-MYH KO (V) compared to WT mice (U)."}
{"words": ["Figure", "3RNA", "in", "situ", "hybridization", "proximity", "ligation", "assay", "(", "rISH", "-", "PLA", ")", "detects", "the", "close", "proximity", "of", "a", "specific", "RNA", "with", "proteins", "in", "situ", "modified", "from", "Roussis", "et", "al", ".", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "rISH", "-", "PLA", "confirms", "the", "proximity", "of", "linc", "-", "MYH", "to", "endogenous", "INO80", "-", "V5", "in", "the", "nucleus", "of", "proliferating", "WT", "MuSCs", "(", "B", ")", ".", "The", "specific", "signal", "is", "lost", "in", "linc", "-", "MYH", "deficient", "MuSCs", "(", "C", ")", ".", "(", "n", "=", "3", "WT", "/", "3", "KO", "biological", "replicates", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "05", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "E", "-", "I", "Representative", "images", "of", "TA", "muscle", "sections", "of", "10", "weeks", "old", "mice", "stained", "for", "PAX7", "(", "green", ")", "and", "EdU", "incorporation", "(", "red", ")", ".", "MuSCs", "without", "(", "green", "arrows", ")", "and", "with", "EdU", "-", "labeling", "(", "red", "arrows", ")", "are", "indicated", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Deletion", "of", "linc", "-", "MYH", "results", "in", "increased", "numbers", "of", "muscle", "stem", "cells", "and", "pronounced", "increase", "of", "the", "ratio", "of", "EdU", "-", "positive", "MuSCs", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "The", "increase", "in", "both", "the", "number", "of", "MuSCs", "and", "EdU", "positive", "MuSCs", "in", "linc", "-", "MYH", "mutant", "muscle", "is", "abolished", "by", "constitutive", "(", "G", ":", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", ",", "Ino80", "KO", ";", "H", ":", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", ",", "dKO", ")", "and", "induced", "(", "I", ":", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "CreERT2pos", "/", "INO80", "-", "/", "-", ",", "dKO", "CreERT", ")", "deletion", "of", "INO80", "in", "Pax7", "expressing", "cells", ".", "Statistical", "evaluation", "of", "the", "number", "of", "muscle", "stem", "cells", "observed", "in", "TA", "muscles", "(", "J", ")", ".", ";", "(", "n", "=", "5", "WT", "/", "5", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "4", "Ino80", "KO", "/", "5", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "J", "/", "K", ",", "n", "=", "6", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "5", "Ino80", "KO", "/", "6", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "L", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", ">", "31", "MSCs", "/", "animal", "in", "K", ";", "ANOVA", "test", "with", "multiple", "comparisons", "against", "WT", ".", "Sidak", "-", "Holm", "correction", "was", "used", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", ".", "Statistical", "evaluation", "of", "the", "ratio", "of", "EdU", "-", "incorporating", "MuSCs", "relative", "to", "all", "Pax7", "-", "positive", "MuSCs", "(", "K", ")", ".", ";", "(", "n", "=", "5", "WT", "/", "5", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "4", "Ino80", "KO", "/", "5", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "J", "/", "K", ",", "n", "=", "6", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "5", "Ino80", "KO", "/", "6", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "L", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", ">", "31", "MSCs", "/", "animal", "in", "K", ";", "ANOVA", "test", "with", "multiple", "comparisons", "against", "WT", ".", "Sidak", "-", "Holm", "correction", "was", "used", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", ".", "Statistical", "evaluation", "of", "the", "number", "of", "myonuclei", "in", "myofibers", "of", "TA", "muscles", "from", "different", "genotypes", "(", "L", ")", "(", "n", "=", "5", "WT", "/", "5", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "4", "Ino80", "KO", "/", "5", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "J", "/", "K", ",", "n", "=", "6", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "5", "Ino80", "KO", "/", "6", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "L", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", ">", "31", "MSCs", "/", "animal", "in", "K", ";", "ANOVA", "test", "with", "multiple", "comparisons", "against", "WT", ".", "Sidak", "-", "Holm", "correction", "was", "used", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3RNA in situ hybridization proximity ligation assay (rISH-PLA) detects the close proximity of a specific RNA with proteins in situ modified from Roussis et al.. (B-C) rISH-PLA confirms the proximity of linc-MYH to endogenous INO80-V5 in the nucleus of proliferating WT MuSCs (B). The specific signal is lost in linc-MYH deficient MuSCs (C). (n = 3 WT/3 KO biological replicates; Mann-Whitney test, *p = 0.05). Data are mean ± S.E.M.E-I Representative images of TA muscle sections of 10 weeks old mice stained for PAX7 (green) and EdU incorporation (red). MuSCs without (green arrows) and with EdU-labeling (red arrows) are indicated. (E, F) Deletion of linc-MYH results in increased numbers of muscle stem cells and pronounced increase of the ratio of EdU-positive MuSCs. (G-I) The increase in both the number of MuSCs and EdU positive MuSCs in linc-MYH mutant muscle is abolished by constitutive (G: Pax7-Crepos / INO80-/-, Ino80 KO; H: linc-MYH-/- / Pax7-Crepos / INO80-/-, dKO) and induced (I: linc-MYH-/- / Pax7-CreERT2pos / INO80-/-, dKO CreERT) deletion of INO80 in Pax7 expressing cells.Statistical evaluation of the number of muscle stem cells observed in TA muscles (J). ; (n = 5 WT/5 linc-MYH KO/4 Ino80 KO/5 dKO/3 CreERT dKO animals in J/K, n = 6 WT/6 linc-MYH KO/5 Ino80 KO/6 dKO/3 CreERT dKO animals in L **p < 0.01, ****p <0.0001, > 31 MSCs /animal in K; ANOVA test with multiple comparisons against WT. Sidak-Holm correction was used. Data are mean ± S.E.M.).Statistical evaluation of the ratio of EdU-incorporating MuSCs relative to all Pax7-positive MuSCs (K). ; (n = 5 WT/5 linc-MYH KO/4 Ino80 KO/5 dKO/3 CreERT dKO animals in J/K, n = 6 WT/6 linc-MYH KO/5 Ino80 KO/6 dKO/3 CreERT dKO animals in L **p < 0.01, ****p <0.0001, > 31 MSCs /animal in K; ANOVA test with multiple comparisons against WT. Sidak-Holm correction was used. Data are mean ± S.E.M.).Statistical evaluation of the number of myonuclei in myofibers of TA muscles from different genotypes (L) (n = 5 WT/5 linc-MYH KO/4 Ino80 KO/5 dKO/3 CreERT dKO animals in J/K, n = 6 WT/6 linc-MYH KO/5 Ino80 KO/6 dKO/3 CreERT dKO animals in L **p < 0.01, ****p <0.0001, > 31 MSCs /animal in K; ANOVA test with multiple comparisons against WT. Sidak-Holm correction was used. Data are mean ± S.E.M.)."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "D", "Isolated", "linc", "-", "MYH", "KO", "MuSCs", "reach", "confluence", "much", "faster", "than", "WT", "MuSCs", "indicating", "higher", "proliferation", "rates", ".", "Deletion", "of", "INO80", "eliminates", "the", "difference", "between", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "(", "Ino80", "KO", ")", "and", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "(", "dKO", ")", ".", "Images", "are", "representative", "images", "for", "cultures", "after", "13", "days", "in", "culture", ".", "E", "Differences", "in", "proliferation", "rates", "are", "abolished", "by", "additional", "deletion", "of", "INO80", "in", "MuSCs", ".", "Cell", "confluence", "was", "monitored", "by", "a", "live", "cell", "imaging", "analysis", "system", "for", "13", "days", "(", "n", "=", "7", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "3", "Ino80", "KO", "/", "3", "dKO", "independent", "preparations", "of", "MuSCs", ")", ".", "F", "Statistical", "analysis", "of", "cell", "confluence", "after", "13", "days", "of", "muscle", "stem", "cell", "proliferation", "(", "n", "=", "7", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "3", "Ino80", "KO", "/", "3", "dKO", "independent", "preparations", "of", "MuSCs", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "=", "not", "significant", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "G", "-", "I", "Gene", "set", "enrichment", "analysis", "(", "GSEA", ",", "broadinstitute", ".", "org", ")", "of", "microarray", "data", "from", "proliferating", "MuSCs", ".", "Comparison", "of", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "vs", ".", "WT", "proliferating", "MuSC", "transcriptomes", "shows", "enrichment", "of", "genes", "related", "to", "cell", "proliferation", "(", "G", ")", ",", "enrichment", "of", "genes", "containing", "cis", "regulatory", "elements", "for", "YY1", "(", "H", ")", "and", "p53", "(", "I", ")", ".", "Enrichments", "are", "highly", "significant", "using", "the", "most", "conservative", "familywise", "-", "error", "rate", "method", "(", "FWER", ")", ".", "Enrichments", "were", "lost", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "MuSCs", "after", "additional", "deletion", "of", "INO80", "(", "dKOs", ")", "compared", "to", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Heat", "maps", "of", "the", "10", "most", "upregulated", "genes", "of", "the", "respective", "gene", "sets", "depicted", "in", "G", "-", "I", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "vs", ".", "WT", "MuSCs", "and", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "dKO", "vs", ".", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Expression", "of", "up", "-", "regulated", "genes", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "was", "normalized", "after", "additional", "deletion", "of", "INO80", "(", "dKOs", ")", ",", "indicating", "that", "effects", "of", "linc", "-", "MYH", "completely", "depend", "on", "INO80", "(", "WT", "n", "=", "4", ",", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Cre", "dKO", "n", "=", "3", "animals", "used", "for", "independent", "isolations", "of", "MuSCs", ")", ".", "Heat", "maps", "of", "the", "10", "most", "upregulated", "genes", "of", "the", "respective", "gene", "sets", "depicted", "in", "G", "-", "I", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "vs", ".", "WT", "MuSCs", "and", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "dKO", "vs", ".", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Expression", "of", "up", "-", "regulated", "genes", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "was", "normalized", "after", "additional", "deletion", "of", "INO80", "(", "dKOs", ")", ",", "indicating", "that", "effects", "of", "linc", "-", "MYH", "completely", "depend", "on", "INO80", "(", "WT", "n", "=", "4", ",", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Cre", "dKO", "n", "=", "3", "animals", "used", "for", "independent", "isolations", "of", "MuSCs", ")", ".", "Heat", "maps", "of", "the", "10", "most", "upregulated", "genes", "of", "the", "respective", "gene", "sets", "depicted", "in", "G", "-", "I", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "vs", ".", "WT", "MuSCs", "and", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "dKO", "vs", ".", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Expression", "of", "up", "-", "regulated", "genes", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "was", "normalized", "after", "additional", "deletion", "of", "INO80", "(", "dKOs", ")", ",", "indicating", "that", "effects", "of", "linc", "-", "MYH", "completely", "depend", "on", "INO80", "(", "WT", "n", "=", "4", ",", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Cre", "dKO", "n", "=", "3", "animals", "used", "for", "independent", "isolations", "of", "MuSCs", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-D Isolated linc-MYH KO MuSCs reach confluence much faster than WT MuSCs indicating higher proliferation rates. Deletion of INO80 eliminates the difference between Pax7-Crepos / INO80-/- (Ino80 KO) and linc-MYH-/- / linc-MYH-/-/ Pax7-Crepos / INO80-/- (dKO). Images are representative images for cultures after 13 days in culture.E Differences in proliferation rates are abolished by additional deletion of INO80 in MuSCs. Cell confluence was monitored by a live cell imaging analysis system for 13 days (n = 7 WT / 6 linc-MYH KO / 3 Ino80 KO / 3 dKO independent preparations of MuSCs).F Statistical analysis of cell confluence after 13 days of muscle stem cell proliferation (n = 7 WT / 6 linc-MYH KO / 3 Ino80 KO / 3 dKO independent preparations of MuSCs, Student's t test, two-tailed; *p < 0.05, ns = not significant). Data are mean ± S.E.M.G-I Gene set enrichment analysis (GSEA, broadinstitute.org) of microarray data from proliferating MuSCs. Comparison of linc-MYH-/- vs. WT proliferating MuSC transcriptomes shows enrichment of genes related to cell proliferation (G), enrichment of genes containing cis regulatory elements for YY1 (H) and p53 (I). Enrichments are highly significant using the most conservative familywise-error rate method (FWER). Enrichments were lost in linc-MYH-/- MuSCs after additional deletion of INO80 (dKOs) compared to Pax7-Crepos / INO80-/- MuSCs.Heat maps of the 10 most upregulated genes of the respective gene sets depicted in G-I in linc-MYH-/- vs. WT MuSCs and in linc-MYH-/-/ Pax7-Crepos / INO80-/- dKO vs. Pax7-Crepos / INO80-/- MuSCs. Expression of up-regulated genes in linc-MYH-/- was normalized after additional deletion of INO80 (dKOs), indicating that effects of linc-MYH completely depend on INO80 (WT n = 4, linc-MYH-/- n = 4, Pax7-Crepos / INO80-/- n = 4, Pax7-Cre dKO n = 3 animals used for independent isolations of MuSCs).Heat maps of the 10 most upregulated genes of the respective gene sets depicted in G-I in linc-MYH-/- vs. WT MuSCs and in linc-MYH-/-/ Pax7-Crepos / INO80-/- dKO vs. Pax7-Crepos / INO80-/- MuSCs. Expression of up-regulated genes in linc-MYH-/- was normalized after additional deletion of INO80 (dKOs), indicating that effects of linc-MYH completely depend on INO80 (WT n = 4, linc-MYH-/- n = 4, Pax7-Crepos / INO80-/- n = 4, Pax7-Cre dKO n = 3 animals used for independent isolations of MuSCs).Heat maps of the 10 most upregulated genes of the respective gene sets depicted in G-I in linc-MYH-/- vs. WT MuSCs and in linc-MYH-/-/ Pax7-Crepos / INO80-/- dKO vs. Pax7-Crepos / INO80-/- MuSCs. Expression of up-regulated genes in linc-MYH-/- was normalized after additional deletion of INO80 (dKOs), indicating that effects of linc-MYH completely depend on INO80 (WT n = 4, linc-MYH-/- n = 4, Pax7-Crepos / INO80-/- n = 4, Pax7-Cre dKO n = 3 animals used for independent isolations of MuSCs)."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "D", "γ", "-", "H2AX", "staining", "of", "proliferating", "MuSCs", "from", "WT", "(", "A", ")", ",", "linc", "-", "MYH", "deficient", "(", "B", ")", ",", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "KO", "(", "C", ")", ",", "and", "linc", "-", "MYH", "/", "INO80", "dKO", "(", "D", ")", "mice", ".", "Deletion", "of", "INO80", "results", "in", "increased", "γ", "-", "H2AX", "signals", "while", "deletion", "of", "linc", "-", "MYH", "has", "no", "effects", "(", "asterisk", ":", "low", "γ", "-", "H2AX", "signals", ",", "arrow", ":", "γ", "-", "H2AX", "-", "foci", "detected", "in", "nuclei", ",", "arrowhead", ":", "pan", "-", "nuclear", "γ", "-", "H2AX", "signal", ".", "E", "-", "G", "Statistical", "evaluation", "of", "the", "presence", "of", "γ", "-", "H2AX", "signals", "in", "MuSCs", "of", "different", "genotypes", "(", "n", "=", "3", "/", "3", "/", "3", "/", "3", "animals", "used", "for", "independent", "isolations", "of", "MuSCs", ",", "two", "technical", "replicates", "for", "each", "animal", "and", "at", "least", "164", "cells", "were", "counted", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "H", "-", "I", "Gene", "set", "enrichment", "analysis", "of", "microarray", "data", "obtained", "for", "proliferating", "MuSCs", "shows", "enrichment", "of", "genes", "related", "to", "activity", "of", "ATR", "in", "response", "to", "replication", "stress", "recovery", "(", "H", ")", "and", "enrichment", "of", "genes", "involved", "in", "chromosome", "maintenance", "(", "I", ")", "in", "WT", "compared", "to", "Pax7", "-", "Crepos", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Enrichment", "of", "these", "or", "similar", "gene", "sets", "was", "not", "observed", "when", "comparing", "WT", "to", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "MuSCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-D γ-H2AX staining of proliferating MuSCs from WT (A), linc-MYH deficient (B), Pax7-Crepos / INO80 KO (C), and linc-MYH/INO80 dKO (D) mice. Deletion of INO80 results in increased γ-H2AX signals while deletion of linc-MYH has no effects (asterisk: low γ-H2AX signals, arrow: γ-H2AX-foci detected in nuclei, arrowhead: pan-nuclear γ-H2AX signal.E-G Statistical evaluation of the presence of γ-H2AX signals in MuSCs of different genotypes (n = 3/3/3/3 animals used for independent isolations of MuSCs, two technical replicates for each animal and at least 164 cells were counted, Mann-Whitney test, **p<0.01. Data are mean ± s.e.m.).H-I Gene set enrichment analysis of microarray data obtained for proliferating MuSCs shows enrichment of genes related to activity of ATR in response to replication stress recovery (H) and enrichment of genes involved in chromosome maintenance (I) in WT compared to Pax7-Crepos INO80-/- MuSCs. Enrichment of these or similar gene sets was not observed when comparing WT to linc-MYH-/- MuSCs."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "Co", "-", "Immunoprecipitation", "of", "INO80", "complex", "subunits", "from", "TA", "muscles", "of", "WT", "and", "linc", "-", "MYH", "KO", "mice", "followed", "by", "Western", "Blot", "analysis", ".", "(", "B", ")", "Statistical", "analysis", "of", "Co", "-", "IP", "/", "Western", "Blot", "data", ".", "The", "amount", "of", "RUVBL1", "and", "RUVBL2", "in", "the", "INO80", "complex", "is", "not", "changed", "after", "deletion", "of", "linc", "-", "MYH", ",", "while", "the", "amounts", "of", "YY1", ",", "WDR5", "and", "TFPT", "pulled", "down", "by", "INO80", "increase", "(", "n", "=", "3", "WT", "/", "3", "linc", "-", "MYH", "KO", "animals", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "multiple", "comparisons", "by", "Fishers", "LSD", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "C", "-", "K", "Proximity", "ligation", "assays", "between", "INO80", "and", "YY1", "(", "C", ",", "D", ")", ",", "INO80", "and", "WDR5", "(", "F", ",", "G", ")", ",", "and", "INO80", "and", "RuvBl2", "(", "I", ",", "J", ")", "in", "proliferating", "MuSCs", ".", "Red", "signals", "indicate", "close", "proximity", "of", "INO80", "-", "V5", "and", "the", "respective", "interacting", "protein", ".", "Nuclei", "were", "stained", "using", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Statistical", "evaluation", "of", "proximity", "ligation", "assays", "indicating", "increased", "interactions", "of", "INO80", "-", "V5", "and", "YY1", "(", "E", ",", "n", "=", "3", "/", "3", "animals", ",", "3", "independent", "wells", "per", "animal", ",", "two", "-", "tailed", "students", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "of", "INO80", "-", "V5", "to", "WDR5", "(", "H", ",", "n", "=", "2", "(", "WT", ")", "/", "2", "(", "KO", ")", "animals", ",", "3", "independent", "wells", "per", "animal", ",", "two", "-", "tailed", "students", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "No", "increase", "in", "proximity", "was", "detected", "between", "Ino80", "-", "V5", "and", "Ruvbl2", "(", "K", ",", "n", "=", "2", "(", "WT", ")", "/", "2", "(", "KO", ")", "animals", ",", "3", "independent", "wells", "per", "animal", ",", "two", "-", "tailed", "students", "t", "-", "test", ",", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "Specificity", "of", "all", "analyzed", "signals", "was", "analyzed", "using", "single", "primary", "or", "single", "secondary", "antibodies", "in", "PLA", "assays", ".", "No", "signals", "were", "detected", "for", "these", "controls", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B Co-Immunoprecipitation of INO80 complex subunits from TA muscles of WT and linc-MYH KO mice followed by Western Blot analysis. (B) Statistical analysis of Co-IP/Western Blot data. The amount of RUVBL1 and RUVBL2 in the INO80 complex is not changed after deletion of linc-MYH, while the amounts of YY1, WDR5 and TFPT pulled down by INO80 increase (n = 3 WT / 3 linc-MYH KO animals; one-way ANOVA, multiple comparisons by Fishers LSD test, *p<0.05). Data are mean ± S.E.M.C-K Proximity ligation assays between INO80 and YY1 (C, D), INO80 and WDR5 (F, G), and INO80 and RuvBl2 (I, J) in proliferating MuSCs. Red signals indicate close proximity of INO80-V5 and the respective interacting protein. Nuclei were stained using DAPI (blue). Statistical evaluation of proximity ligation assays indicating increased interactions of INO80-V5 and YY1 (E, n = 3/3 animals, 3 independent wells per animal, two-tailed students t-test, *p<0.05) and of INO80-V5 to WDR5 (H, n = 2 (WT)/2 (KO) animals, 3 independent wells per animal, two-tailed students t-test, **p<0.01). No increase in proximity was detected between Ino80-V5 and Ruvbl2 (K, n = 2 (WT)/2 (KO) animals, 3 independent wells per animal, two-tailed students t-test, ns: not significant). Specificity of all analyzed signals was analyzed using single primary or single secondary antibodies in PLA assays. No signals were detected for these controls. Data are mean ± S.E.M."}
{"words": ["Figure", "1Assessment", "of", "mtDNA", "damage", "by", "quantitative", "PCR", ".", "HEK293", "cells", "infected", "with", "control", "(", "empty", "vector", ")", "or", "shATG5", "for", "5", "days", ".", "Cells", "were", "then", "incubated", "with", "DMSO", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", "and", "either", "immediately", "harvested", "or", "washed", "with", "fresh", "medium", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "with", "or", "without", "washout", "were", "used", "for", "the", "extraction", "of", "total", "DNA", ".", "All", "DNA", "samples", "were", "used", "for", "amplification", "of", "8", ".", "9", "kb", "mtDNA", "fragment", "using", "quantitative", "PCR", "and", "were", "normalized", "to", "amplification", "of", "a", "221", "bp", "mtDNA", "fragment", ".", "PCR", "products", "were", "quantitated", "by", "PicoGreen", "staining", "using", "Micro", "Plate", "Reader", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "The", "data", "in", "(", "A", ")", "were", "further", "calculated", "for", "the", "frequency", "of", "mtDNA", "damage", ".", "The", "equation", "was", "seen", "in", "\"", "Materials", "and", "Methods", "\"", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Representative", "images", "show", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "staining", ".", "Control", "or", "shATG5", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ",", "and", "then", "either", "fixed", "immediately", "or", "washed", "with", "fresh", "medium", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "were", "immunostained", "with", "DAPI", "and", "anti", "-", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "antibody", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "fluorescence", "intensity", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Control", "or", "shATG5", "HEK293", "cells", "stably", "expressing", "mito", "-", "Keima", ".", "Control", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ",", "and", "shATG5", "cells", "were", "treated", "with", "200", "µM", "H2O2", "as", "a", "negative", "control", ".", "Cells", "were", "then", "imaged", "with", "458", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "a", "neutral", "pH", ")", "and", "561", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "an", "acidic", "pH", ")", "laser", "excitation", "for", "mito", "-", "Keima", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Right", "panels", "show", "the", "pixel", "intensity", "of", "red", "(", "mitochondria", "within", "lysosomes", ")", "and", "green", "(", "mitochondria", "in", "the", "cytoplasm", ")", "from", "a", "line", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "red", "to", "green", "fluorescence", "intensity", "(", "561", "nm", "/", "458", "nm", ")", "of", "the", "cells", "described", "in", "(", "E", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Tom20", "and", "anti", "-", "DNA", "antibodies", ",", "then", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "The", "white", "arrows", "were", "indicated", "the", "LC3", "punta", "colocalizing", "or", "contacting", "with", "mtDNA", "/", "Tom20", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "LC3", "punta", "colocalizing", "or", "contacting", "with", "mtDNA", "/", "Tom20", "in", "a", "cell", ".", "n", "=", "30", "cells", "from", "3", "coverslips", ",", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "30", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Assessment of mtDNA damage by quantitative PCR. HEK293 cells infected with control (empty vector) or shATG5 for 5 days. Cells were then incubated with DMSO or 4 mM 3-NPA for 2 h and either immediately harvested or washed with fresh medium and incubated for another 1 h. Cells with or without washout were used for the extraction of total DNA. All DNA samples were used for amplification of 8.9 kb mtDNA fragment using quantitative PCR and were normalized to amplification of a 221 bp mtDNA fragment. PCR products were quantitated by PicoGreen staining using Micro Plate Reader. Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test, N.S., not significant, *p < 0.05, **p < 0.01. The data in (A) were further calculated for the frequency of mtDNA damage. The equation was seen in \"Materials and Methods\". Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments), statistical significance was assessed by a two-tailed student's t-test, N.S., not significant, **p < 0.01.Representative images show 8-oxo-dG staining. Control or shATG5 HeLa cells were treated with DMSO, 200 µM H2O2, or 4 mM 3-NPA for 2 h, and then either fixed immediately or washed with fresh medium and incubated for another 1 h. Cells were immunostained with DAPI and anti-8-oxo-dG antibody and analyzed by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative 8-oxo-dG fluorescence intensity in (C). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by a two-tailed student's t-test, N.S., not significant, *p < 0.05, **p < 0.01.Control or shATG5 HEK293 cells stably expressing mito-Keima. Control cells were treated with DMSO, 200 µM H2O2, or 4 mM 3-NPA for 2 h, and shATG5 cells were treated with 200 µM H2O2 as a negative control. Cells were then imaged with 458 nm (measuring mitochondria with a neutral pH) and 561 nm (measuring mitochondria with an acidic pH) laser excitation for mito-Keima by confocal microscopy. Right panels show the pixel intensity of red (mitochondria within lysosomes) and green (mitochondria in the cytoplasm) from a line. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative ratio of red to green fluorescence intensity (561 nm/458 nm) of the cells described in (E). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by a two-way ANOVA, N.S., not significant, **p < 0.01.HeLa cells expressing GFP-LC3 were treated with DMSO, 200 µM H2O2, or 4 mM 3-NPA for 2 h. Cells were stained with anti-Tom20 and anti-DNA antibodies, then analyzed by confocal microscopy. The white arrows were indicated the LC3 punta colocalizing or contacting with mtDNA/Tom20. Scale bar, 10 µm. Quantification of the LC3 punta colocalizing or contacting with mtDNA/Tom20 in a cell. n = 30 cells from 3 coverslips, Data are presented as mean ± SD (n = 30), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "2Screening", "of", "mitophagy", "regulators", "for", "removing", "damaged", "mtDNA", ".", "HeLa", "cells", "were", "infected", "by", "lentiviral", "particles", "containing", "the", "indicated", "knockdown", "vectors", ".", "Five", "days", "later", ",", "cells", "were", "treated", "with", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "then", "imaged", "with", "458", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "a", "neutral", "pH", ")", "and", "561", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "an", "acidic", "pH", ")", "laser", "excitation", "for", "mito", "-", "Keima", ".", "ShATG5", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Right", "panels", "for", "each", "image", "show", "the", "FACS", "-", "based", "mito", "-", "Keima", "dot", "plots", ".", "The", "y", "-", "axis", "represents", "the", "fluorescence", "emission", "of", "mito", "-", "Keima", "at", "pH", "4", ".", "0", "(", "lysosome", ")", ",", "while", "the", "x", "-", "axis", "indicates", "mito", "-", "Keima", "at", "pH", "7", ".", "0", "(", "mitochondria", ")", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "within", "the", "different", "regions", "are", "indicated", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Control", "or", "ATAD3B", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "mito", "-", "Keima", "were", "treated", "with", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", "and", "imaged", "with", "458", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "a", "neutral", "pH", ")", "and", "561", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "an", "acidic", "pH", ")", "laser", "excitation", "for", "mito", "-", "Keima", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "red", "to", "green", "fluorescence", "intensity", "(", "561", "nm", "/", "458", "nm", ")", "of", "the", "cells", "described", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Control", "or", "KO", "ATAD3B", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "washed", "with", "fresh", "medium", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", "and", "immunostained", "with", "DAPI", "and", "anti", "-", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "antibodies", "and", "were", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "fluorescence", "intensity", "in", "cells", "described", "in", "(", "D", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Screening of mitophagy regulators for removing damaged mtDNA. HeLa cells were infected by lentiviral particles containing the indicated knockdown vectors. Five days later, cells were treated with 200 µM H2O2 for 2 h. Cells were then imaged with 458 nm (measuring mitochondria with a neutral pH) and 561 nm (measuring mitochondria with an acidic pH) laser excitation for mito-Keima. ShATG5 was used as a negative control. Right panels for each image show the FACS-based mito-Keima dot plots. The y-axis represents the fluorescence emission of mito-Keima at pH 4.0 (lysosome), while the x-axis indicates mito-Keima at pH 7.0 (mitochondria). The percentages of cells within the different regions are indicated. Scale bar, 10 µm.Control or ATAD3B KO HeLa cells stably expressing mito-Keima were treated with 4 mM 3-NPA for 2 h and imaged with 458 nm (measuring mitochondria with a neutral pH) and 561 nm (measuring mitochondria with an acidic pH) laser excitation for mito-Keima by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative ratio of red to green fluorescence intensity (561 nm/458 nm) of the cells described in (B). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test, N.S., not significant, **p < 0.01.Control or KO ATAD3B HeLa cells were treated with 4 mM 3-NPA for 2 h. Cells were washed with fresh medium and incubated for another 1 h. Cells were then fixed and immunostained with DAPI and anti-8-oxo-dG antibodies and were analyzed by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative 8-oxo-dG fluorescence intensity in cells described in (D). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test , N.S., not significant, **p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "3PINK1", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "mito", "-", "Keima", "were", "infected", "with", "control", "or", "shATAD3B", ".", "Five", "days", "later", ",", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "then", "analyzed", "and", "imaged", "with", "458", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "a", "neutral", "pH", ")", "and", "561", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "an", "acidic", "pH", ")", "laser", "excitation", "for", "mito", "-", "Keima", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "red", "to", "green", "fluorescence", "intensity", "(", "561nm", "/", "458nm", ")", "of", "the", "cells", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "4", "mM", "3", "-", "NPA", ",", "8", "mM", "3", "-", "NPA", ",", "or", "10", "µM", "CCCP", "for", "2", "h", ",", "and", "cell", "lysates", "were", "then", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "PINK1", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "ATAD3A", "-", "Flag", "(", "3A", "-", "Flag", ")", "or", "ATAD3B", "-", "Flag", "(", "3B", "-", "Flag", ")", "were", "mixed", "with", "control", "PINK1", "KO", "cells", "respectively", ",", "and", "incubated", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "(", "D", ")", "or", "200", "µM", "H2O2", "(", "F", ")", "for", "2", "h", ",", "and", "then", "washed", "with", "fresh", "medium", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "fluorescence", "intensity", "of", "cells", "treated", "with", "3", "-", "NPA", "(", "E", ")", "or", "H2O2", "(", "G", ")", "was", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "individual", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Control", "(", "GFP", "+", ")", "and", "shATAD3B", "(", "GFP", "-", ")", "PINK1", "KO", "HeLa", "cells", "were", "mixed", "and", "incubated", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "(", "H", ")", "or", "200", "µM", "H2O2", "(", "J", ")", "for", "2", "h", ",", "and", "washed", "with", "fresh", "medium", ",", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "and", "DAPI", ",", "then", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Control", "or", "shATAD3B", "cells", "are", "circled", "by", "white", "dashed", "lines", ".", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "fluorescence", "intensity", "of", "cells", "treated", "with", "3", "-", "NPA", "(", "I", ")", "or", "H2O2", "(", "K", ")", "was", "quantified", "using", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3PINK1 KO HeLa cells stably expressing mito-Keima were infected with control or shATAD3B. Five days later, cells were treated with DMSO, 200 µM H2O2, or 4 mM 3-NPA for 2 h. Cells were then analyzed and imaged with 458 nm (measuring mitochondria with a neutral pH) and 561 nm (measuring mitochondria with an acidic pH) laser excitation for mito-Keima by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative ratio of red to green fluorescence intensity (561nm/458nm) of the cells described in (A). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test, N.S., not significant, **p < 0.01.HeLa cells were treated with DMSO, 4 mM 3-NPA, 8 mM 3-NPA, or 10 µM CCCP for 2 h, and cell lysates were then analyzed by Western blotting using the indicated antibodies.PINK1 KO HeLa cells stably expressing ATAD3A-Flag (3A-Flag) or ATAD3B-Flag (3B-Flag) were mixed with control PINK1 KO cells respectively, and incubated for 24 h. Cells were treated with 4 mM 3-NPA (D) or 200 µM H2O2 (F) for 2 h, and then washed with fresh medium and incubated for another 1 h. Cells were fixed and immunostained with anti-8-oxo-dG and anti-Flag antibodies and analyzed by confocal microscopy. 8-oxo-dG fluorescence intensity of cells treated with 3-NPA (E) or H2O2 (G) was quantified by ImageJ software. Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by individual two-tailed student's t-test, N.S., not significant, *p < 0.05, **p < 0.01. Scale bar, 10 µm.Control (GFP+) and shATAD3B (GFP-) PINK1 KO HeLa cells were mixed and incubated for 24 h. Cells were then treated with 4 mM 3-NPA (H) or 200 µM H2O2 (J) for 2 h, and washed with fresh medium, and incubated for another 1 h. Cells were fixed and immunostained with anti-8-oxo-dG and DAPI, then analyzed by confocal microscopy. Control or shATAD3B cells are circled by white dashed lines. 8-oxo-dG fluorescence intensity of cells treated with 3-NPA (I) or H2O2 (K) was quantified using ImageJ software. Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test, **p < 0.01. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "4293T", "cells", "were", "treated", "with", "H2O2", "for", "2", "h", ",", "and", "cell", "lysates", "were", "then", "immunoprecipitated", "with", "Dynabeads", "Protein", "G", "pre", "-", "coupled", "with", "rabbit", "IgG", "(", "control", ")", "or", "anti", "-", "ATAD3", "antibody", ",", "followed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "LC3B", "or", "anti", "-", "ATAD3", "antibodies", ".", "ATAD3", "DKO", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3B", "were", "transiently", "transfected", "with", "control", ",", "ATAD3A", "-", "Flag", "or", "ATAD3B", "-", "Flag", ".", "48", "h", "after", "transfection", ",", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "affinity", "gel", ",", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Flag", "or", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ",", "and", "cell", "lysates", "were", "incubated", "with", "the", "indicated", "GST", "-", "ATAD3A", "or", "GST", "-", "ATAD3B", "protein", "fragments", "(", "expressed", "in", "E", ".", "coli", ")", "coupled", "to", "glutathione", "agarose", "beads", "(", "Pierce", ")", "for", "GST", "pull", "-", "down", "assay", ".", "Eluted", "protein", "samples", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "antibodies", "against", "GST", "or", "LC3B", ".", "The", "indicated", "GST", "-", "ATAD3A", "or", "GST", "-", "ATAD3B", "protein", "fragments", "and", "His", "-", "LC3B", "were", "expressed", "in", "E", ".", "coli", "and", "purified", ".", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "was", "performed", "using", "glutathione", "agarose", "beads", ".", "Eluted", "protein", "samples", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "GST", "or", "anti", "-", "His", "antibodies", ".", "The", "indicated", "GST", "-", "ATAD3B", "(", "WT", ")", "or", "GST", "-", "ATAD3B", "(", "LIR", "mutations", ")", "and", "His", "-", "LC3", "were", "expressed", "in", "E", ".", "coli", "and", "purified", ".", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "was", "performed", "using", "the", "glutathione", "agarose", "beads", ".", "Eluted", "protein", "samples", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "antibodies", "against", "GST", "or", "LC3B", ".", "HeLa", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "monoclonal", "cell", "line", "was", "infected", "with", "lentivirus", "particles", "containing", "control", "or", "shATAD3B", ".", "Five", "days", "later", ",", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "or", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "Tom20", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "the", "LC3", "puncta", "colocalizing", "or", "contacting", "with", "Tom20", "(", "mitochondria", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "colocalized", "or", "contacted", "with", "Tom20", "(", "mitochondria", ")", "in", "cells", "described", "in", "(", "G", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "30", "cells", "from", "3", "coverslips", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "control", "or", "ATAD3B", "-", "Flag", "were", "treated", "with", "or", "without", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ".", "Cell", "lysates", "were", "then", "immunoprecipitated", "with", "Dynabeads", "Protein", "G", "pre", "-", "coupled", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ",", "followed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "Flag", "or", "anti", "-", "LC3B", "antibodies", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "LC3B", "and", "ATAD3B", "-", "Flag", "were", "further", "evaluated", "by"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4293T cells were treated with H2O2 for 2 h, and cell lysates were then immunoprecipitated with Dynabeads Protein G pre-coupled with rabbit IgG (control) or anti-ATAD3 antibody, followed by Western blotting with anti-LC3B or anti-ATAD3 antibodies.ATAD3 DKO HeLa cells expressing GFP-LC3B were transiently transfected with control, ATAD3A-Flag or ATAD3B-Flag. 48 h after transfection, cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-Flag M2 affinity gel, and analyzed by Western blotting using anti-Flag or anti-GFP antibodies.HeLa cells were treated with 200 µM H2O2 for 2 h, and cell lysates were incubated with the indicated GST-ATAD3A or GST-ATAD3B protein fragments (expressed in E.coli) coupled to glutathione agarose beads (Pierce) for GST pull-down assay. Eluted protein samples were analyzed by Western blotting using antibodies against GST or LC3B.The indicated GST-ATAD3A or GST-ATAD3B protein fragments and His-LC3B were expressed in E.coli and purified. GST pull-down assay was performed using glutathione agarose beads. Eluted protein samples were analyzed by Western blotting using anti-GST or anti-His antibodies.The indicated GST-ATAD3B(WT) or GST-ATAD3B (LIR mutations) and His-LC3 were expressed in E.coli and purified. GST pull-down assay was performed using the glutathione agarose beads. Eluted protein samples were analyzed by Western blotting using antibodies against GST or LC3B.HeLa expressing GFP-LC3 monoclonal cell line was infected with lentivirus particles containing control or shATAD3B. Five days later, cells were treated with DMSO, or 200 µM H2O2 for 2 h. Cells were fixed and immunostained with anti-Tom20 and imaged by confocal microscopy. The white arrows indicate the LC3 puncta colocalizing or contacting with Tom20 (mitochondria). Scale bar, 10 µm.Quantification of the GFP-LC3 puncta colocalized or contacted with Tom20 (mitochondria) in cells described in (G). Data are presented as mean ± SD (n =30 cells from 3 coverslips), statistical significance was assessed by a two-way ANOVA, N.S., not significant, ***p < 0.001.293T cells transiently transfected with control or ATAD3B-Flag were treated with or without 200 µM H2O2 for 2 h. Cell lysates were then immunoprecipitated with Dynabeads Protein G pre-coupled with anti-Flag antibody, followed by Western blotting with anti-Flag or anti-LC3B antibodies. Relative protein levels of LC3B and ATAD3B-Flag were further evaluated by densitometry"}
{"words": ["Figure", "5Mic10", "KO", "COS7", "cells", "stably", "expressing", "ATAD3A", "-", "Flag", "or", "ATAD3B", "-", "Flag", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ",", "and", "then", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "Tom20", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", ",", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "293T", "cells", "treated", "with", "DMSO", "(", "B", ")", "or", "H2O2", "(", "200", "µM", ",", "2", "h", ")", "(", "D", ")", ",", "were", "harvested", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "gradient", "concentration", "of", "proteinase", "K", "for", "20", "min", "on", "ice", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", ",", "anti", "-", "Tom20", "(", "OMM", ")", ",", "anti", "-", "Tim23", "(", "IMS", ")", ",", "and", "anti", "-", "HSP60", "(", "matrix", ")", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "proteins", "in", "(", "B", ")", "or", "(", "D", ")", "were", "further", "evaluated", "by", "densitometry", "analysis", "using", "ImageJ", "software", ".", "Relative", "trends", "of", "proteolysis", "of", "indicated", "mitochondrial", "proteins", "from", "DMSO", "-", "or", "H2O2", "-", "treated", "cells", "were", "shown", "(", "C", "and", "E", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Control", ",", "ATAD3A", "KO", ",", "ATAD3B", "KO", ",", "or", "ATAD3", "DKO", "HeLa", "cells", "were", "harvested", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "EDC", "(", "20", "mM", ")", "for", "30", "min", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "293T", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "10", "mM", "NAC", ",", "or", "200", "µM", "H2O2", "plus", "10", "mM", "NAC", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "and", "used", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "EDC", "(", "20", "mM", ")", "for", "30", "min", "at", "37", "℃", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "protein", "level", "of", "ATAD3", "oligomers", "to", "HSP60", "described", "in", "(", "F", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "143B", ",", "143B", "ρ0", "cells", "were", "harvested", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "EDC", "(", "20", "mM", ")", "for", "30", "min", "at", "37", "℃", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "293T", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "ddC", "(", "50", "µM", ")", "plus", "EB", "(", "0", ".", "5", "µg", "/", "ml", ")", "for", "10", "days", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "and", "used", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "EDC", "(", "20", "mM", ")", "for", "30", "min", "at", "37", "℃", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "ATAD3A", "KO", "HeLa", "cells", "were", "harvested", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "gradient", "concentration", "of", "proteinase", "K", "for", "20", "min", "on", "ice", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", ",", "anti", "-", "Tom20", "(", "OMM", ")", ",", "anti", "-", "Tim23", "(", "IMS", ")", ",", "and", "anti", "-", "HSP60", "(", "matrix", ")", "(", "K", ")", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "proteins", "in", "(", "K", ")", "were", "further", "evaluated", "by", "densitometry", "analysis", "using", "ImageJ", "software", ".", "Relative", "trends", "of", "proteolysis", "of", "indicated", "mitochondrial", "proteins", "from", "ATAD3A", "KO", "HeLa", "cells", "were", "shown", "(", "L", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Mic10 KO COS7 cells stably expressing ATAD3A-Flag or ATAD3B-Flag were treated with DMSO or 200 µM H2O2 for 2 h, and then fixed and immunostained with anti-Tom20 and anti-Flag antibodies, and analyzed by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm.293T cells treated with DMSO (B) or H2O2 (200 µM, 2 h) (D), were harvested for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with the indicated gradient concentration of proteinase K for 20 min on ice, and then were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3, anti-Tom20 (OMM), anti-Tim23 (IMS), and anti-HSP60 (matrix). Relative protein levels of proteins in (B) or (D) were further evaluated by densitometry analysis using ImageJ software. Relative trends of proteolysis of indicated mitochondrial proteins from DMSO- or H2O2-treated cells were shown (C and E). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments).Control, ATAD3A KO, ATAD3B KO, or ATAD3 DKO HeLa cells were harvested for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with DMSO or EDC (20 mM) for 30 min, and then were analyzed by Western blotting with the indicated antibodies.293T cells were treated with DMSO, 200 µM H2O2, 10 mM NAC, or 200 µM H2O2 plus 10 mM NAC for 2 h. Cells were then harvested and used for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with DMSO or EDC (20 mM) for 30 min at 37 ℃, and then were analyzed by Western blotting with the indicated antibodies. Quantification of the relative protein level of ATAD3 oligomers to HSP60 described in (F). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA, N.S., not significant, *p < 0.05.143B, 143B ρ0 cells were harvested for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with DMSO or EDC (20 mM) for 30 min at 37 ℃, and then were analyzed by Western blotting with the indicated antibodies.293T cells were treated with DMSO or ddC (50 µM) plus EB (0.5 µg/ml) for 10 days. Cells were then harvested and used for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with DMSO or EDC (20 mM) for 30 min at 37℃, and then were analyzed by Western blotting with the indicated antibodies.ATAD3A KO HeLa cells were harvested for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with the indicated gradient concentration of proteinase K for 20 min on ice, and then were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3, anti-Tom20 (OMM), anti-Tim23 (IMS), and anti-HSP60 (matrix) (K). Relative protein levels of proteins in (K) were further evaluated by densitometry analysis using ImageJ software. Relative trends of proteolysis of indicated mitochondrial proteins from ATAD3A KO HeLa cells were shown (L). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "6ρ0206", "_", "A", "and", "ρ0206", "_", "B", "cells", "were", "stained", "with", "mitoSOX", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "DIC", ",", "Differential", "Interference", "Contrast", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "MitoSOX", "fluorescence", "intensity", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Mitochondria", "carrying", "the", "3243A", ">", "G", "mutation", "in", "the", "tRNA", "Leu", "(", "UUR", ")", "gene", "from", "the", "same", "MELAS", "myoblasts", "were", "transferred", "into", "ρ0", "206", "cell", "line", "to", "generate", "ρ0206", "_", "A", "(", "100", "%", "wild", "-", "type", "mtDNA", ")", "and", "ρ0206", "_", "B", "(", "~", "90", "%", "m", ".", "3243A", ">", "G", "mtDNA", ")", "cell", "lines", ".", "ρ0206", "_", "A", "and", "ρ0206", "_", "B", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", "or", "anti", "-", "Tubulin", "antibodies", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "proteins", "were", "further", "evaluated", "by", "densitometry", "analysis", "using", "ImageJ", "software", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "protein", "level", "of", "ATAD3B", "to", "Tubulin", "was", "shown", "at", "right", "panels", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Normal", "or", "MELAS", "patient", "fibroblasts", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", "or", "anti", "-", "Tubulin", "antibodies", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "proteins", "were", "further", "evaluated", "by", "densitometry", "analysis", "using", "ImageJ", "software", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "protein", "level", "of", "ATAD3B", "to", "Tubulin", "was", "shown", "at", "right", "panels", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "ρ0206", "_", "A", ",", "ρ0206", "_", "B", ",", "and", "ρ0206", "-", "B", "cells", "pretreated", "with", "ddC", "(", "50µM", ")", "plus", "EB", "(", "0", ".", "5µg", "/", "ml", ")", "for", "10", "days", ",", "and", "then", "harvested", "and", "lysed", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", "or", "anti", "-", "GAPDH", "antibodies", ".", "ρ0206", "_", "B", "cells", "were", "infected", "with", "control", ",", "ATAD3B", "-", "Flag", "or", "ATAD3B", "(", "mLIR", ")", "-", "Flag", ".", "After", "two", "weeks", ",", "total", "DNA", "from", "cells", "was", "isolated", "and", "used", "to", "calculate", "the", "mutation", "rate", "of", "3243A", ">", "G", "by", "quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "using", "the", "TaqMan", "Probe", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "ρ0206", "_", "B", "cells", "were", "infected", "with", "control", ",", "ATAD3A", "-", "Flag", ",", "ATAD3B", "-", "Flag", ",", "or", "ATAD3B", "(", "mLIR", ")", "-", "Flag", ".", "After", "two", "weeks", ",", "the", "cellular", "ATP", "levels", "were", "measured", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "MELAS", "patient", "fibroblasts", "were", "infected", "with", "control", ",", "ATAD3A", "-", "Flag", ",", "ATAD3B", "-", "Flag", "or", "ATAD3B", "(", "mLIR", ")", "-", "Flag", ".", "After", "two", "weeks", ",", "total", "DNA", "was", "isolated", "from", "fibroblasts", "and", "used", "to", "calculate", "the", "mutation", "rate", "of", "3243A", ">", "G", "by", "quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "using", "the", "TaqMan", "Probe", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6ρ0206_A and ρ0206_B cells were stained with mitoSOX and analyzed by confocal microscopy. DIC, Differential Interference Contrast. Scale bar, 25 µm. Quantification of the MitoSOX fluorescence intensity described in (A). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by student's t-test, **p < 0.01.Mitochondria carrying the 3243A>G mutation in the tRNA Leu(UUR) gene from the same MELAS myoblasts were transferred into ρ0 206 cell line to generate ρ0206_A (100% wild-type mtDNA) and ρ0206_B (~90% m.3243A>G mtDNA) cell lines. ρ0206_A and ρ0206_B cell lysates were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3 or anti-Tubulin antibodies. Relative protein levels of proteins were further evaluated by densitometry analysis using ImageJ software. Quantification of the relative protein level of ATAD3B to Tubulin was shown at right panels. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by student's t-test, ***p < 0.001.Normal or MELAS patient fibroblasts cell lysates were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3 or anti-Tubulin antibodies. Relative protein levels of proteins were further evaluated by densitometry analysis using ImageJ software. Quantification of the relative protein level of ATAD3B to Tubulin was shown at right panels. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by student's t-test, ***p < 0.001.ρ0206_A, ρ0206_B, and ρ0206-B cells pretreated with ddC (50µM) plus EB (0.5µg/ml) for 10 days, and then harvested and lysed. Cell lysates were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3 or anti-GAPDH antibodies.ρ0206_B cells were infected with control, ATAD3B-Flag or ATAD3B (mLIR)-Flag. After two weeks, total DNA from cells was isolated and used to calculate the mutation rate of 3243A>G by quantitative real-time PCR using the TaqMan Probe. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA, N.S., not significant, *p < 0.05.ρ0206_B cells were infected with control, ATAD3A-Flag, ATAD3B-Flag, or ATAD3B (mLIR)-Flag. After two weeks, the cellular ATP levels were measured. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA, N.S., not significant, *p < 0.05.MELAS patient fibroblasts were infected with control, ATAD3A-Flag, ATAD3B-Flag or ATAD3B(mLIR)-Flag. After two weeks, total DNA was isolated from fibroblasts and used to calculate the mutation rate of 3243A>G by quantitative real-time PCR using the TaqMan Probe. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA, N.S., not significant, **p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "1Comparison", "of", "bacterial", "colony", "forming", "unit", "(", "CFU", ")", "in", "feces", "from", "vehicle", "-", "and", "ABX", "-", "treated", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ")", ".", "n", ".", "d", ".", ",", "non", "-", "detectable", ".", "Representative", "image", "and", "measurements", "of", "lengths", "for", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteal", ",", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "-", "capillary", "plexus", "and", "DAPI", "+", "villus", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "villi", "lengths", "and", "absolute", "and", "relative", "lacteal", "lengths", "in", "duodenum", "(", "DD", ")", ",", "jejunum", "(", "JJ", ")", "and", "ileum", "(", "IL", ")", "of", "vehicle", "-", "or", "ABX", "-", "treated", "mice", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "the", "number", "of", "Prox1", "+", "LECs", "within", "initial", "100", "μm", "portion", "(", "F", ")", "presented", "as", "relative", "fluorescence", "intensity", "(", "FI", ")", ")", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "of", "jejunum", "from", "vehicle", "-", "or", "ABX", "-", "treated", "mice", ".", "Dotted", "lines", "outline", "villi", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "AU", ",", "arbitrary", "unit", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "the", "VEGFR3", "expression", "(", "G", ")", ",", "presented", "as", "relative", "fluorescence", "intensity", "(", "FI", ")", ")", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "of", "jejunum", "from", "vehicle", "-", "or", "ABX", "-", "treated", "mice", ".", "Dotted", "lines", "outline", "villi", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "AU", ",", "arbitrary", "unit", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Comparison of bacterial colony forming unit (CFU) in feces from vehicle- and ABX-treated mice (n = 5 mice/group). n.d., non-detectable.Representative image and measurements of lengths for CD31+/LYVE-1+ lacteal, CD31+/LYVE-1- capillary plexus and DAPI+ villus.Images and comparisons of villi lengths and absolute and relative lacteal lengths in duodenum (DD), jejunum (JJ) and ileum (IL) of vehicle- or ABX-treated mice. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group).Images and comparisons of the number of Prox1+ LECs within initial 100 μm portion (F) presented as relative fluorescence intensity (FI)) in CD31+/LYVE-1+ lacteals of jejunum from vehicle- or ABX-treated mice. Dotted lines outline villi. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). AU, arbitrary unit.Images and comparisons of the VEGFR3 expression (G), presented as relative fluorescence intensity (FI)) in CD31+/LYVE-1+ lacteals of jejunum from vehicle- or ABX-treated mice. Dotted lines outline villi. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). AU, arbitrary unit."}
{"words": ["Figure", "2Images", "and", "comparison", "of", "VE", "-", "cadherin", "LEC", "junctions", "in", "lacteals", "of", "jejunum", "between", "vehicle", "-", "and", "ABX", "-", "treated", "mice", ".", "Each", "boxed", "portion", "is", "highly", "magnified", "for", "visualization", "of", "detailed", "distributions", "of", "VE", "-", "cadherin", "to", "distinguish", "button", "-", "like", "(", "red", "arrowheads", ")", ",", "zipper", "-", "like", "(", "open", "arrowheads", ")", "and", "mixed", "LEC", "junctions", "in", "lacteals", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ",", "5", "-", "10", "villi", "/", "mouse", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "Representative", "intravital", "imaging", "and", "quantification", "of", "lipid", "clearance", "from", "lamina", "propria", "via", "lacteals", ".", "Asterisks", "indicate", "the", "site", "in", "lamina", "propria", "where", "fluorescence", "intensity", "(", "FI", ")", "was", "measured", ".", "Relative", "FI", "divided", "by", "mean", "FI", "of", "controls", "at", "16", "min", "(", "left", ")", "and", "normalized", "FI", "divided", "by", "FI", "at", "16", "min", "in", "each", "villus", "(", "right", ")", "after", "initial", "loading", "of", "BODIPY", "-", "FA", "were", "quantified", ".", "For", "normalization", "of", "FI", ",", "villi", "that", "showed", "peak", "intensity", "earlier", "or", "later", "than", "16", "min", "were", "excluded", "(", "n", "=", "5", "-", "7", "mice", "/", "group", ",", "5", "-", "10", "villi", "/", "mouse", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Representative", "images", "from", "transmission", "electron", "microscopic", "examination", "of", "lacteals", "and", "quantification", "of", "frequency", "of", "open", "junctions", "(", "n", "=", "4", "mice", "/", "group", ",", "4", "-", "6", "images", "/", "mouse", ")", ".", "Jejunum", "of", "vehicle", "-", "and", "ABX", "-", "treated", "mice", "were", "harvested", "2", "hours", "after", "oral", "lipid", "loading", ".", "Note", "that", "the", "junction", "between", "LECs", "(", "red", "colored", "bidirectional", "arrows", ")", "is", "open", "in", "vehicle", "-", "treated", "mice", ",", "but", "not", "in", "ABX", "-", "treated", "mice", ".", "CM", ",", "chylomicron", ";", "IS", ",", "interstitium", "of", "lamina", "propria", ";", "LC", ",", "large", "caveola", ";", "Lu", ",", "lacteal", "lumen", ";", "Ve", ",", "vesicle", "containing", "lipoproteins", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "μm", ".", "quantification", "of", "frequency", "of", "open", "junctions", "(", "n", "=", "4", "mice", "/", "group", ",", "4", "-", "6", "images", "/", "mouse", ")", ".", "Note", "that", "the", "junction", "between", "LECs", "(", "red", "colored", "bidirectional", "arrows", ")", "is", "open", "in", "vehicle", "-", "treated", "mice", ",", "but", "not", "in", "ABX", "-", "treated", "mice", ".", "Comparisons", "of", "serum", "triglyceride", "(", "TG", ")", "and", "free", "fatty", "acids", "(", "FFA", ")", "at", "indicated", "time", "points", "in", "vehicle", "-", "and", "ABX", "-", "treated", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "7", "mice", "/", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Images and comparison of VE-cadherin LEC junctions in lacteals of jejunum between vehicle- and ABX-treated mice. Each boxed portion is highly magnified for visualization of detailed distributions of VE-cadherin to distinguish button-like (red arrowheads), zipper-like (open arrowheads) and mixed LEC junctions in lacteals (n = 6 mice/group, 5-10 villi/mouse). Scale bars, 50 μm.Representative intravital imaging and quantification of lipid clearance from lamina propria via lacteals. Asterisks indicate the site in lamina propria where fluorescence intensity (FI) was measured. Relative FI divided by mean FI of controls at 16 min (left) and normalized FI divided by FI at 16 min in each villus (right) after initial loading of BODIPY-FA were quantified. For normalization of FI, villi that showed peak intensity earlier or later than 16 min were excluded (n = 5-7 mice/group, 5-10 villi/mouse). Scale bars, 100 μm.Representative images from transmission electron microscopic examination of lacteals and quantification of frequency of open junctions (n = 4 mice/group, 4-6 images/mouse). Jejunum of vehicle- and ABX-treated mice were harvested 2 hours after oral lipid loading. Note that the junction between LECs (red colored bidirectional arrows) is open in vehicle-treated mice, but not in ABX-treated mice. CM, chylomicron; IS, interstitium of lamina propria; LC, large caveola; Lu, lacteal lumen; Ve, vesicle containing lipoproteins. Scale bars, 1 μm.quantification of frequency of open junctions (n = 4 mice/group, 4-6 images/mouse). Note that the junction between LECs (red colored bidirectional arrows) is open in vehicle-treated mice, but not in ABX-treated mice.Comparisons of serum triglyceride (TG) and free fatty acids (FFA) at indicated time points in vehicle- and ABX- treated mice (n = 5-7 mice/group)."}
{"words": ["Figure", "3Images", "and", "comparisons", "of", "absolute", "and", "relative", "lacteal", "lengths", "in", "jejunum", "between", "vehicle", "-", "or", "ABX", "-", "treated", "mice", "at", "P7", ",", "P14", ",", "and", "P28", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "number", "of", "Prox1", "+", "LECs", "within", "initial", "100", "μm", "portion", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "of", "jejunum", "from", "vehicle", "-", "or", "ABX", "-", "treated", "mice", ".", "Dotted", "lines", "outline", "villi", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "proportions", "of", "each", "VE", "-", "cadherin", "LEC", "junctions", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "in", "jejunum", "between", "vehicle", "-", "or", "ABX", "-", "treated", "mice", "at", "P7", ",", "P14", ",", "and", "P28", ".", "Button", "-", "like", "(", "red", "arrowheads", ")", "and", "zipper", "-", "like", "(", "open", "arrowheads", ")", "junctions", "are", "indicated", "in", "each", "magnified", "box", "in", "right", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ",", "5", "-", "10", "villi", "/", "mouse", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Images and comparisons of absolute and relative lacteal lengths in jejunum between vehicle- or ABX-treated mice at P7, P14, and P28. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). Scale bars, 100 μm.Images and comparisons of number of Prox1+ LECs within initial 100 μm portion in CD31+/LYVE-1+ lacteals of jejunum from vehicle- or ABX-treated mice. Dotted lines outline villi. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). Scale bars, 100 μm.Images and comparisons of proportions of each VE-cadherin LEC junctions in CD31+/LYVE-1+ lacteals in jejunum between vehicle- or ABX-treated mice at P7, P14, and P28. Button-like (red arrowheads) and zipper-like (open arrowheads) junctions are indicated in each magnified box in right (n = 6 mice/group, 5-10 villi/mouse). Scale bars, 25 μm."}
{"words": ["Figure", "4Images", "and", "comparisons", "of", "absolute", "and", "relative", "lacteal", "lengths", "in", "duodenum", "(", "DD", ")", ",", "jejunum", "(", "JJ", ")", "and", "ileum", "(", "IL", ")", "of", "8", "-", "week", "old", "SPF", ",", "GF", "or", "CONV", "mice", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "the", "number", "of", "Prox1", "+", "LECs", "within", "initial", "100", "μm", "portion", "(", "C", ")", "and", "VEGFR3", "expression", "(", "D", ",", "presented", "as", "relative", "fluorescent", "intensity", "(", "FI", ")", ")", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "of", "jejunum", "from", "SPF", ",", "GF", "and", "CONV", "mice", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "AU", ",", "arbitrary", "unit", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparison", "of", "proportions", "of", "each", "VE", "-", "cadherin", "LEC", "junctions", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "in", "jejunum", "among", "SPF", ",", "GF", "and", "CONV", "mice", ".", "Button", "-", "like", "(", "red", "arrowheads", ")", "and", "zipper", "-", "like", "(", "open", "arrowheads", ")", "junctions", "are", "indicated", "in", "each", "magnified", "box", "in", "below", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ",", "5", "-", "10", "villi", "/", "mouse", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Images and comparisons of absolute and relative lacteal lengths in duodenum (DD), jejunum (JJ) and ileum (IL) of 8-week old SPF, GF or CONV mice. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). Scale bars, 100 μm.Images and comparisons of the number of Prox1+ LECs within initial 100 μm portion (C) and VEGFR3 expression (D, presented as relative fluorescent intensity (FI)) in CD31+/LYVE-1+ lacteals of jejunum from SPF, GF and CONV mice. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). AU, arbitrary unit. Scale bars, 100 μm.Images and comparison of proportions of each VE-cadherin LEC junctions in CD31+/LYVE-1+ lacteals in jejunum among SPF, GF and CONV mice. Button-like (red arrowheads) and zipper-like (open arrowheads) junctions are indicated in each magnified box in below (n = 6 mice/group, 5-10 villi/mouse). Scale bars, 25 μm."}
{"words": ["Figure", "5Images", "and", "comparison", "of", "VEGFR3", "expression", "(", "presented", "as", "relative", "fluorescent", "intensity", "(", "FI", ")", ")", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "of", "jejunum", "between", "WT", "and", "VR3iΔLEC", "mice", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "AU", ",", "arbitrary", "unit", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "absolute", "and", "relative", "lacteal", "lengths", "in", "duodenum", "(", "DD", ")", ",", "jejunum", "(", "JJ", ")", "and", "ileum", "(", "IL", ")", "of", "WT", "and", "VR3iΔLEC", "mice", ".", "Note", "that", ",", "in", "addition", "to", "the", "alterations", "in", "the", "lacteal", "lengths", "in", "VR3iΔLEC", "mice", ",", "diameters", "of", "the", "lacteal", "also", "shrank", "by", "VEGFR3", "ablation", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "number", "of", "Prox1", "+", "LECs", "within", "initial", "100", "μm", "portion", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "of", "jejunum", "from", "WT", "and", "VR3iΔLEC", "mice", ".", "Dotted", "lines", "outline", "villi", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparison", "of", "proportions", "of", "each", "VE", "-", "cadherin", "LEC", "junctions", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "in", "jejunum", "from", "WT", "and", "VR3iΔLEC", "mice", ".", "Button", "-", "like", "(", "red", "arrowheads", ")", "and", "zipper", "-", "like", "(", "open", "arrowheads", ")", "junctions", "are", "indicated", "in", "each", "magnified", "box", "in", "below", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ",", "5", "-", "10", "villi", "/", "mouse", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", ".", "Comparisons", "of", "serum", "triglyceride", "(", "TG", ")", "at", "indicated", "time", "points", "in", "WT", "and", "VR3iΔLEC", "mice", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Comparison", "of", "protein", "levels", "of", "VEGF", "-", "C", "in", "the", "whole", "tissue", "of", "jejunum", "and", "ileum", "from", "SPF", ",", "GF", ",", "and", "CONV", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "5", "mice", "/", "group", ")", ".", "Comparison", "of", "mRNA", "levels", "of", "VEGF", "-", "C", "in", "the", "whole", "tissue", "of", "jejunum", "and", "ileum", "from", "SPF", ",", "GF", ",", "and", "CONV", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "5", "mice", "/", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Images and comparison of VEGFR3 expression (presented as relative fluorescent intensity (FI)) in CD31+/LYVE-1+ lacteals of jejunum between WT and VR3iΔLEC mice. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). AU, arbitrary unit. Scale bars, 100 μm.Images and comparisons of absolute and relative lacteal lengths in duodenum (DD), jejunum (JJ) and ileum (IL) of WT and VR3iΔLEC mice. Note that, in addition to the alterations in the lacteal lengths in VR3iΔLEC mice, diameters of the lacteal also shrank by VEGFR3 ablation. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). Scale bars, 100 μm.Images and comparisons of number of Prox1+ LECs within initial 100 μm portion in CD31+/LYVE-1+ lacteals of jejunum from WT and VR3iΔLEC mice. Dotted lines outline villi. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). Scale bars, 100 μm.Images and comparison of proportions of each VE-cadherin LEC junctions in CD31+/LYVE-1+ lacteals in jejunum from WT and VR3iΔLEC mice. Button-like (red arrowheads) and zipper-like (open arrowheads) junctions are indicated in each magnified box in below (n = 6 mice/group, 5-10 villi/mouse). Scale bars, 25 μm.Comparisons of serum triglyceride (TG) at indicated time points in WT and VR3iΔLEC mice (n = 6 mice/group).Comparison of protein levels of VEGF-C in the whole tissue of jejunum and ileum from SPF, GF, and CONV mice (n = 3-5 mice/group).Comparison of mRNA levels of VEGF-C in the whole tissue of jejunum and ileum from SPF, GF, and CONV mice (n = 3-5 mice/group)."}
{"words": ["Figure", "6Comparison", "of", "mRNA", "levels", "of", "VEGF", "-", "C", "in", "sorted", "CD45", "-", "stromal", "cells", "and", "CD45", "+", "MHCII", "+", "F4", "/", "80", "+", "macrophages", "from", "jejunum", "and", "ileum", "of", "vehicle", "-", "treated", "mice", ".", "The", "mean", "of", "transcription", "levels", "of", "VEGF", "-", "C", "in", "CD45", "-", "stromal", "cells", "was", "normalized", "to", "1", ",", "and", "the", "relative", "levels", "in", "macrophages", "were", "presented", "as", "fold", "change", "(", "n", "=", "4", "mice", "/", "group", ")", ".", "Comparisons", "of", "VEGF", "-", "C", "transcription", "level", "in", "CD45", "-", "stromal", "cells", "(", "left", ")", "and", "CD45", "+", "MHCII", "+", "F4", "/", "80", "+", "macrophages", "(", "right", ")", "in", "jejunum", "and", "ileum", "of", "vehicle", "-", "and", "ABX", "-", "treated", "mice", ".", "The", "mean", "of", "transcription", "levels", "of", "VEGF", "-", "C", "in", "vehicle", "-", "treated", "mice", "was", "normalized", "to", "1", ",", "and", "the", "relative", "levels", "in", "ABX", "-", "treated", "mice", "were", "presented", "as", "fold", "change", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Images", "and", "comparison", "of", "F4", "/", "80", "+", "macrophages", "in", "the", "villi", "of", "duodenum", "(", "DD", ")", ",", "jejunum", "(", "JJ", ")", ",", "and", "ileum", "(", "IL", ")", "from", "vehicle", "-", "or", "ABX", "-", "treated", "mice", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "sites", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "AU", ",", "arbitrary", "unit", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "and", "comparison", "of", "MHCII", "+", "F4", "/", "80", "+", "macrophage", "gated", "on", "DAPI", "-", "CD45", "+", "cells", "(", "E", ")", "macrophage", "gated", "on", "DAPI", "-", "CD45", "+", "cells", "from", "jejunum", "and", "ileum", "of", "vehicle", "-", "and", "ABX", "-", "treated", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ")", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "and", "comparison", "of", "CX3CR1", "+", "F4", "/", "80", "+", "macrophage", "gated", "on", "DAPI", "-", "CD45", "+", "MHCII", "+", "cells", "(", "F", ")", "macrophage", "gated", "on", "DAPI", "-", "CD45", "+", "cells", "from", "jejunum", "and", "ileum", "of", "vehicle", "-", "and", "ABX", "-", "treated", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Comparison of mRNA levels of VEGF-C in sorted CD45- stromal cells and CD45+ MHCII+ F4/80+ macrophages from jejunum and ileum of vehicle-treated mice. The mean of transcription levels of VEGF-C in CD45- stromal cells was normalized to 1, and the relative levels in macrophages were presented as fold change (n = 4 mice/group).Comparisons of VEGF-C transcription level in CD45- stromal cells (left) and CD45+ MHCII+ F4/80+ macrophages (right) in jejunum and ileum of vehicle- and ABX-treated mice. The mean of transcription levels of VEGF-C in vehicle-treated mice was normalized to 1, and the relative levels in ABX-treated mice were presented as fold change (n = 5 -6 mice/group).Images and comparison of F4/80+ macrophages in the villi of duodenum (DD), jejunum (JJ), and ileum (IL) from vehicle- or ABX-treated mice. Each dot indicates mean value of 5 sites in a mouse (n = 6 mice/group). AU, arbitrary unit. Scale bars, 100 μm.Representative flow cytometric analysis and comparison of MHCII+ F4/80+ macrophage gated on DAPI- CD45+ cells (E) macrophage gated on DAPI- CD45+ cells from jejunum and ileum of vehicle- and ABX-treated mice (n = 5 mice/group).Representative flow cytometric analysis and comparison of CX3CR1+ F4/80+ macrophage gated on DAPI- CD45+ MHCII+ cells (F) macrophage gated on DAPI- CD45+ cells from jejunum and ileum of vehicle- and ABX-treated mice (n = 5 mice/group)."}
{"words": ["Figure", "7Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "and", "comparison", "of", "MHCII", "+", "F4", "/", "80", "+", "macrophage", "gated", "on", "DAPI", "-", "CD45", "+", "cells", "from", "jejunum", "and", "ileum", "of", "WT", "and", "DTR", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ")", ".", "Comparison", "of", "mRNA", "levels", "of", "VEGF", "-", "C", "in", "the", "whole", "tissue", "of", "jejunum", "and", "ileum", "from", "WT", "and", "DTR", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ")", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "absolute", "and", "relative", "lacteal", "lengths", "in", "duodenum", "(", "DD", ")", ",", "jejunum", "(", "JJ", ")", "and", "ileum", "(", "IL", ")", "of", "WT", "and", "DTR", "mice", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "number", "of", "Prox1", "+", "LECs", "within", "initial", "100", "μm", "portion", "(", "upper", ")", "and", "VEGFR3", "expression", "(", "lower", ",", "presented", "as", "relative", "fluorescent", "intensity", "(", "FI", ")", ")", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "of", "jejunum", "from", "WT", "and", "DTR", "mice", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "AU", ",", "arbitrary", "unit", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparison", "of", "proportions", "of", "each", "VE", "-", "cadherin", "LEC", "junctions", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "in", "jejunum", "between", "WT", "and", "DTR", "mice", ".", "Button", "-", "like", "(", "red", "arrowheads", ")", "and", "zipper", "-", "like", "(", "open", "arrowheads", ")", "junctions", "are", "indicated", "in", "each", "magnified", "box", "in", "below", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ",", "5", "-", "10", "villi", "/", "mouse", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative flow cytometric analysis and comparison of MHCII+ F4/80+ macrophage gated on DAPI- CD45+ cells from jejunum and ileum of WT and DTR mice (n = 5 mice/group).Comparison of mRNA levels of VEGF-C in the whole tissue of jejunum and ileum from WT and DTR mice (n = 5 mice/group).Images and comparisons of absolute and relative lacteal lengths in duodenum (DD), jejunum (JJ) and ileum (IL) of WT and DTR mice. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). Scale bars, 100 μm.Images and comparisons of number of Prox1+ LECs within initial 100 μm portion (upper) and VEGFR3 expression (lower, presented as relative fluorescent intensity (FI)) in CD31+/LYVE-1+ lacteals of jejunum from WT and DTR mice. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). AU, arbitrary unit. Scale bars, 100 μm.Images and comparison of proportions of each VE-cadherin LEC junctions in CD31+/LYVE-1+ lacteals in jejunum between WT and DTR mice. Button-like (red arrowheads) and zipper-like (open arrowheads) junctions are indicated in each magnified box in below (n = 6 mice/group, 5-10 villi/mouse). Scale bars, 25 μm."}
{"words": ["Figure", "8Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "and", "comparison", "of", "MHCII", "+", "F4", "/", "80", "+", "macrophage", "gated", "on", "DAPI", "-", "CD45", "+", "cells", "from", "jejunum", "and", "ileum", "of", "WT", "and", "MyD88ΔMP", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ")", ".", "Comparisons", "of", "mRNA", "levels", "of", "VEGF", "-", "C", "in", "sorted", "MHCII", "+", "F4", "/", "80", "+", "macrophages", "from", "jejunum", "and", "ileum", "of", "WT", "and", "MyD88ΔMP", "mice", ".", "The", "mean", "of", "transcription", "levels", "of", "VEGF", "-", "C", "in", "WT", "mice", "was", "normalized", "to", "1", ",", "and", "the", "relative", "level", "in", "MyD88ΔMP", "mice", "were", "presented", "as", "fold", "change", "(", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ")", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "absolute", "and", "relative", "lacteal", "lengths", "in", "duodenum", "(", "DD", ")", ",", "jejunum", "(", "JJ", ")", "and", "ileum", "(", "IL", ")", "of", "WT", "and", "MyD88ΔMP", "mice", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparisons", "of", "number", "of", "Prox1", "+", "LECs", "within", "initial", "100", "μm", "portion", "(", "upper", ")", "and", "VEGFR3", "expression", "(", "lower", ",", "presented", "as", "relative", "fluorescent", "intensity", "(", "FI", ")", ")", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "of", "jejunum", "from", "WT", "and", "MyD88ΔMP", "mice", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", ".", "Each", "dot", "indicates", "mean", "value", "of", "5", "-", "10", "villi", "in", "a", "mouse", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "AU", ",", "arbitrary", "unit", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Images", "and", "comparison", "of", "proportions", "of", "each", "VE", "-", "cadherin", "LEC", "junctions", "in", "CD31", "+", "/", "LYVE", "-", "1", "+", "lacteals", "in", "jejunum", "between", "WT", "and", "MyD88ΔMP", "mice", ".", "Button", "-", "like", "(", "red", "arrowheads", ")", "and", "zipper", "-", "like", "(", "open", "arrowheads", ")", "junctions", "are", "indicated", "in", "each", "magnified", "box", "in", "below", "(", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ",", "5", "-", "10", "villi", "/", "mouse", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Representative flow cytometric analysis and comparison of MHCII+ F4/80+ macrophage gated on DAPI- CD45+ cells from jejunum and ileum of WT and MyD88ΔMP mice (n = 5 mice/group).Comparisons of mRNA levels of VEGF-C in sorted MHCII+ F4/80+ macrophages from jejunum and ileum of WT and MyD88ΔMP mice. The mean of transcription levels of VEGF-C in WT mice was normalized to 1, and the relative level in MyD88ΔMP mice were presented as fold change (n = 5 mice/group).Images and comparisons of absolute and relative lacteal lengths in duodenum (DD), jejunum (JJ) and ileum (IL) of WT and MyD88ΔMP mice. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). Scale bars, 100 μm.Images and comparisons of number of Prox1+ LECs within initial 100 μm portion (upper) and VEGFR3 expression (lower, presented as relative fluorescent intensity (FI)) in CD31+/LYVE-1+ lacteals of jejunum from WT and MyD88ΔMP mice. Each dot indicates mean value of 5-10 villi. Each dot indicates mean value of 5-10 villi in a mouse (n = 6 mice/group). AU, arbitrary unit. Scale bars, 100 μm.Images and comparison of proportions of each VE-cadherin LEC junctions in CD31+/LYVE-1+ lacteals in jejunum between WT and MyD88ΔMP mice. Button-like (red arrowheads) and zipper-like (open arrowheads) junctions are indicated in each magnified box in below (n = 6 mice/group, 5-10 villi/mouse). Scale bars, 25 μm."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "Southern", "blots", "showing", "DSB", "repair", "products", "in", "WT", ",", "rad59", "∆", ",", "rad52", "-", "R70A", "and", "rad59", "∆", "rad52", "-", "R70A", "cells", ".", "DNA", "was", "digested", "with", "Bsp1286I", "and", "probed", "with", "a", "MAT", "-", "distal", "sequence", "(", "yellow", "box", "in", "panel", "B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative Southern blots showing DSB repair products in WT, rad59∆, rad52-R70A and rad59∆ rad52-R70A cells. DNA was digested with Bsp1286I and probed with a MAT-distal sequence (yellow box in panel B)."}
{"words": ["Figure", "2Viability", "of", "indicated", "strains", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Welch", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "was", "used", "to", "determine", "the", "p", "-", "valueRepresentative", "Southern", "blots", "showing", "DSB", "repair", "products", "in", "WT", ",", "rad59", "∆", ",", "and", "rad52", "-", "R70A", ".", "DNA", "was", "digested", "with", "XhoI", "and", "EcoRI", "and", "probed", "with", "a", "Z", "sequence", "(", "yellow", "box", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Viability of indicated strains (mean ± SD; n = 3). Data information: Welch's unpaired t-test was used to determine the p-valueRepresentative Southern blots showing DSB repair products in WT, rad59∆, and rad52-R70A. DNA was digested with XhoI and EcoRI and probed with a Z sequence (yellow box)."}
{"words": ["Figure", "3Percentage", "of", "chromosome", "loss", "of", "indicated", "mutants", ".", "Data", "information", ":", "χ2", "test", "is", "used", "to", "determine", "the", "p", "-", "value", "and", "number", "of", "colonies", "tested", "per", "mutant", "is", "indicated", "in", "Appendix", "Table", "S1", ".", "Schematic", "of", "mutation", "analysis", "during", "allelic", "recombination", "(", "left", ")", ".", "Mutation", "reporter", "cassette", "is", "inserted", "within", "the", "repair", "template", "16", "kb", "away", "from", "strand", "invasion", "site", ".", "Mutation", "rate", "(", "right", ")", "of", "WT", ",", "rad59", "∆", ",", "rad52", "-", "R70A", "was", "calculated", "as", "previously", "described", "(", "Saini", "et", ".", "al", ".", ",", "2013", ")", ".", "Data", "information", ":", "χ", "Mutation", "rates", "are", "reported", "as", "the", "median", "value", ",", "and", "statistical", "comparisons", "between", "median", "mutation", "rates", "were", "performed", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Percentage of chromosome loss of indicated mutants. Data information: χ2 test is used to determine the p-value and number of colonies tested per mutant is indicated in Appendix Table S1.Schematic of mutation analysis during allelic recombination (left). Mutation reporter cassette is inserted within the repair template 16 kb away from strand invasion site. Mutation rate (right) of WT, rad59∆, rad52-R70A was calculated as previously described (Saini et. al., 2013). Data information: χ Mutation rates are reported as the median value, and statistical comparisons between median mutation rates were performed using the Mann-Whitney U-test."}
{"words": ["Figure", "4Representative", "Southern", "blots", "showing", "DSB", "repair", "products", "of", "indicated", "mutants", "in", "regular", "mating", "type", "switching", "(", "H", "-", "1400", "assay", ")", ".", "Viability", "of", "indicated", "mutants", "are", "shown", ".", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Welch", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "was", "used", "to", "determine", "the", "p", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative Southern blots showing DSB repair products of indicated mutants in regular mating type switching (H-1400 assay).Viability of indicated mutants are shown. (mean ± SD; n = 3). Data information: Welch's unpaired t-test was used to determine the p-value"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "Representative", "Southern", "blots", "showing", "DSB", "repair", "products", "(", "top", ")", ",", "percentage", "of", "BIR", "among", "repair", "products", "(", "bottom", "left", ")", "and", "viability", "(", "bottom", "right", ")", "of", "WT", "and", "sir2", "∆", "in", "the", "H", "-", "150", "assay", "(", "A", ")", ",", "H", "-", "-", "150", "no", "-", "gap", "assay", "(", "B", ")", "or", "native", "mating", "type", "switching", "H", "-", "1400", "assay", "(", "C", ")", ".", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "Welch", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "was", "used", "to", "determine", "the", "p", "-", "value", "in", "panels", "A", "-", "C", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) Representative Southern blots showing DSB repair products (top), percentage of BIR among repair products (bottom left) and viability (bottom right) of WT and sir2∆ in the H-150 assay (A), H--150 no-gap assay (B) or native mating type switching H-1400 assay (C). (mean ± SD; n = 3). Welch's unpaired t-test was used to determine the p-value in panels A-C."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "Southern", "blots", "showing", "DSB", "repair", "products", "(", "top", ")", ",", "percentage", "of", "BIR", "among", "repair", "products", "(", "bottom", "left", ")", "and", "viability", "(", "bottom", "right", ")", "of", "indicated", "mutants", "in", "the", "H", "-", "150", "no", "-", "gap", "assay", "(", "A", ")", "or", "H", "-", "150", "assay", "(", "B", ")", ".", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "≥", "3", ")", ".", "Welch", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "was", "used", "to", "determine", "the", "p", "-", "value", "in", "panels", "A", "and", "B", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-B) Representative Southern blots showing DSB repair products (top), percentage of BIR among repair products (bottom left) and viability (bottom right) of indicated mutants in the H-150 no-gap assay (A) or H-150 assay (B). (mean ± SD; n ≥3). Welch's unpaired t-test was used to determine the p-value in panels A and B."}
{"words": ["Figure", "1HCT116", "and", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "20", "µM", "LXR623", "for", "24h", ".", "Transcriptome", "and", "gene", "set", "enrichment", "analysis", "was", "performed", ".", "Shown", "are", "enrichment", "plots", ".", "NES", ":", "normalized", "enrichment", "score", ".", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "20", "µM", "LXR623", "for", "24h", ".", "Transcriptome", "and", "gene", "set", "enrichment", "analysis", "was", "performed", ".", "Shown", "are", "enrichment", "plots", ".", "NES", ":", "normalized", "enrichment", "score", ".", "U87", "GBM", "cells", "were", "treated", "with", "20", "µM", "LXR623", "or", "50", "µM", "Simvastatin", "(", "Sim", ")", "for", "48h", ".", "Thereafter", ",", "lysates", "were", "collected", "and", "analyzed", "for", "total", "cholesterol", "levels", ".", "Shown", "are", "means", "and", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Shown", "is", "a", "volcano", "plot", "of", "patients", "from", "the", "TCGA", "(", "database", ")", "with", "high", "vs", ".", "low", "levels", "of", "ABCA1", ".", "A", "close", "-", "up", "of", "the", "most", "significantly", "down", "-", "regulated", "genes", "is", "presented", "(", "mRNAs", "related", "to", "the", "electron", "transport", "chain", "and", "mitochondrial", "metabolism", ")", ".", "The", "x", "-", "axis", "highlights", "the", "fold", "changes", "(", "log2", "scale", ")", "(", "down", "-", "regulated", "genes", ",", "negative", "values", ")", ",", "whereas", "the", "y", "-", "axis", "indicates", "the", "level", "of", "statistical", "significance", "(", "shown", "in", "-", "log10", "format", ")", ".", "GBM12", "GBM", "cells", "(", "short", "term", "patient", "-", "derived", "xenograft", ")", ",", "U87", "GBM", "cells", ",", "HCT116", "colonic", "carcinoma", "cells", "and", "A375", "melanoma", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "ABT263", ",", "LXR623", "or", "the", "combination", "for", "72h", ".", "Thereafter", ",", "cellular", "viability", "was", "analyzed", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1HCT116 and U87 cells were treated with 20 µM LXR623 for 24h. Transcriptome and gene set enrichment analysis was performed. Shown are enrichment plots. NES: normalized enrichment score.HCT116 cells were treated with 20 µM LXR623 for 24h. Transcriptome and gene set enrichment analysis was performed. Shown are enrichment plots. NES: normalized enrichment score.U87 GBM cells were treated with 20 µM LXR623 or 50 µM Simvastatin (Sim) for 48h. Thereafter, lysates were collected and analyzed for total cholesterol levels. Shown are means and SD (n = 3).Shown is a volcano plot of patients from the TCGA (database) with high vs. low levels of ABCA1. A close-up of the most significantly down-regulated genes is presented (mRNAs related to the electron transport chain and mitochondrial metabolism). The x-axis highlights the fold changes (log2 scale) (down-regulated genes, negative values), whereas the y-axis indicates the level of statistical significance (shown in -log10 format).GBM12 GBM cells (short term patient-derived xenograft), U87 GBM cells, HCT116 colonic carcinoma cells and A375 melanoma cells were treated with the indicated concentrations of ABT263, LXR623 or the combination for 72h. Thereafter, cellular viability was analyzed and statistical analysis was performed."}
{"words": ["Figure", "2U87", ",", "T98G", "and", "LN229", "cells", "were", "treated", "with", "1", "µM", "ABT263", ",", "20", "µM", "LXR623", "or", "the", "combination", "of", "both", "for", "72h", ".", "Mewo", "melanoma", "and", "HCT116", "colon", "carcinoma", "cells", "were", "treated", "with", "1", "µM", "ABT263", ",", "10", "µM", "LXR623", "or", "the", "combination", "of", "both", "for", "72h", "(", "MeWo", ")", "or", "for", "48h", "(", "HCT116", ")", ".", "Thereafter", ",", "cells", "were", "stained", "with", "annexin", "V", "/", "propidium", "iodide", "and", "analyzed", "by", "multi", "-", "parametric", "flow", "cytometry", ".", ",", "Stem", "-", "like", "GBM", "cells", ",", "NCH644", ",", "NCH421k", "and", "NCH690", "were", "treated", "with", "1", "µM", "ABT263", ",", "20", "µM", "LXR623", "or", "the", "combination", "of", "both", "for", "48h", ".", "Thereafter", ",", "cells", "were", "stained", "with", "annexin", "V", "/", "propidium", "iodide", "and", "analyzed", "by", "multi", "-", "parametric", "flow", "cytometry", ".", "U87", "(", "72h", "treatment", ")", "and", "HCT116", "(", "48h", "treatment", ")", "were", "treated", "with", "1", "µM", "ABT263", ",", "20", "µM", "(", "U87", ")", "or", "10", "µM", "(", "HCT116", ")", "LXR623", "or", "the", "combination", "of", "both", ",", "stained", "with", "TMRE", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometric", "analysis", "for", "dissipation", "of", "mitochondrial", "membrane", "potential", ".", "HCT116", "colonic", "carcinoma", "cells", "were", "treated", "with", "ABT263", ",", "LXR623", "or", "the", "combination", "of", "both", ".", "Whole", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "subjected", "to", "capillary", "electrophoresis", "for", "the", "expression", "/", "cleavage", "of", "PARP", ",", "total", "caspase", "-", "9", "(", "CP9", ")", "and", "Vinculin", ".", "CF", ":", "cleaved", "fragment", ",", "FL", ":", "full", "length", ".", "HCT116", "colonic", "carcinoma", "or", "NCH644", "glioblastoma", "stem", "cells", "were", "treated", "with", "selective", "BH3", "-", "mimetics", ",", "WEHI", "-", "539", "(", "Bcl", "-", "xL", "inhibitor", ")", ",", "ABT199", "(", "Bcl", "-", "2", "inhibitor", ")", "or", "A1210477", "(", "Mcl", "-", "1", "inhibitor", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "LXR623", "for", "48h", ".", "Thereafter", ",", "cells", "were", "labeled", "with", "annexin", "V", "/", "propidium", "iodide", "and", "analyzed", "by", "multi", "-", "parametric", "flow", "cytometry", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2U87, T98G and LN229 cells were treated with 1 µM ABT263, 20 µM LXR623 or the combination of both for 72h. Mewo melanoma and HCT116 colon carcinoma cells were treated with 1 µM ABT263, 10 µM LXR623 or the combination of both for 72h (MeWo) or for 48h (HCT116). Thereafter, cells were stained with annexin V/propidium iodide and analyzed by multi-parametric flow cytometry., Stem-like GBM cells, NCH644, NCH421k and NCH690 were treated with 1 µM ABT263, 20 µM LXR623 or the combination of both for 48h. Thereafter, cells were stained with annexin V/propidium iodide and analyzed by multi-parametric flow cytometry.U87 (72h treatment) and HCT116 (48h treatment) were treated with 1 µM ABT263, 20 µM (U87) or 10 µM (HCT116) LXR623 or the combination of both, stained with TMRE and analyzed by flow cytometric analysis for dissipation of mitochondrial membrane potential.HCT116 colonic carcinoma cells were treated with ABT263, LXR623 or the combination of both. Whole protein lysates were collected and subjected to capillary electrophoresis for the expression/cleavage of PARP, total caspase-9 (CP9) and Vinculin. CF: cleaved fragment, FL: full length.HCT116 colonic carcinoma or NCH644 glioblastoma stem cells were treated with selective BH3-mimetics, WEHI-539 (Bcl-xL inhibitor), ABT199 (Bcl-2 inhibitor) or A1210477 (Mcl-1 inhibitor) in the presence or absence of LXR623 for 48h. Thereafter, cells were labeled with annexin V/propidium iodide and analyzed by multi-parametric flow cytometry."}
{"words": ["Figure", "3", ",", "LN229", ",", "T98G", ",", "U87", ",", "U87", "-", "EGFRvIII", "and", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "LXR623", "for", "72h", ".", "Thereafter", ",", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "subjected", "to", "standard", "western", "blot", "(", "LN229", ",", "T98G", "and", "U87", ")", "or", "capillary", "electrophoresis", "(", "U87", "-", "EGFR", "-", "vIII", "and", "HCT116", ")", "for", "the", "expression", "of", "Usp9X", ",", "Mcl", "-", "1", ",", "Bcl", "-", "2", ",", "Bcl", "-", "xL", ",", "Noxa", ",", "BIM", "and", "/", "or", "Actin", "and", "Vinculin", ".", "In", "U87", "-", "EGFRvIII", "and", "HCT116", ",", "Vinculin", "was", "used", "in", "lieu", "of", "Actin", ".", "LN229", ",", "T98G", ",", "U87", ",", "U87", "-", "EGFRvIII", "and", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "LXR623", "as", "described", "in", "A", ".", "Thereafter", ",", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "subjected", "to", "capillary", "electrophoresis", "for", "the", "expression", "of", "ABCA1", "and", "Vinculin", ".", "LN229", "were", "transfected", "with", "siNT", ",", "siNoxa", "1", ",", "siNoxa", "2", "or", "BAK", "-", "siRNA", "for", "72h", ".", "Thereafter", ",", "cells", "were", "treated", "with", "the", "combination", "treatment", "of", "1", "µM", "ABT263", "and", "20", "µM", "LXR623", "for", "another", "24h", ".", "After", "conclusion", "of", "the", "treatment", ",", "cells", "were", "harvested", ",", "fixed", ",", "stained", "with", "propidium", "iodide", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "for", "DNA", "-", "fragmentation", ".", "LN229", "were", "transfected", "as", "described", "in", "B", ".", "Thereafter", ",", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "analyzed", "by", "capillary", "electrophoresis", "for", "the", "expression", "of", "Noxa", ",", "BAK", "and", "Vinculin", ".", "LN229", "GBM", "cells", "were", "treated", "with", "10", "µM", "LXR623", "(", "LXR", ")", ",", "1", "µM", "ABT263", "or", "the", "combination", "for", "48h", ".", "Thereafter", ",", "protein", "lysates", "were", "prepared", "and", "immunoprecipitated", "with", "an", "antibody", "against", "BAK", ".", "Standard", "western", "blotting", "was", "performed", "(", "immunoprecipitation", "and", "the", "corresponding", "inputs", ")", "with", "antibody", "against", "BAK", "and", "Mcl", "-", "1", ".", "The", "arrows", "highlight", "the", "specific", "protein", "bands", ",", "while", "stars", "indicate", "the", "immunoglobulin", "light", "-", "chains", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3, LN229, T98G, U87, U87-EGFRvIII and HCT116 cells were treated with increasing concentrations of LXR623 for 72h. Thereafter, protein lysates were collected and subjected to standard western blot (LN229, T98G and U87) or capillary electrophoresis (U87-EGFR-vIII and HCT116) for the expression of Usp9X, Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xL, Noxa, BIM and/or Actin and Vinculin. In U87-EGFRvIII and HCT116, Vinculin was used in lieu of Actin.LN229, T98G, U87, U87-EGFRvIII and HCT116 cells were treated with LXR623 as described in A. Thereafter, protein lysates were collected and subjected to capillary electrophoresis for the expression of ABCA1 and Vinculin.LN229 were transfected with siNT, siNoxa 1, siNoxa 2 or BAK-siRNA for 72h. Thereafter, cells were treated with the combination treatment of 1 µM ABT263 and 20 µM LXR623 for another 24h. After conclusion of the treatment, cells were harvested, fixed, stained with propidium iodide and analyzed by flow cytometry for DNA - fragmentation.LN229 were transfected as described in B. Thereafter, whole cell protein lysates were collected and analyzed by capillary electrophoresis for the expression of Noxa, BAK and Vinculin.LN229 GBM cells were treated with 10 µM LXR623 (LXR), 1 µM ABT263 or the combination for 48h. Thereafter, protein lysates were prepared and immunoprecipitated with an antibody against BAK. Standard western blotting was performed (immunoprecipitation and the corresponding inputs) with antibody against BAK and Mcl-1. The arrows highlight the specific protein bands, while stars indicate the immunoglobulin light-chains."}
{"words": ["Figure", "4U87", "cells", "were", "treated", "with", "20", "µM", "LXR623", "for", "7h", "and", "24h", ".", "Thereafter", ",", "cells", "were", "stained", "with", "annexin", "V", "/", "propidium", "iodide", "and", "analyzed", "by", "multi", "-", "parametric", "flow", "cytometry", ".", "The", "lower", "left", "quadrant", "indicates", "the", "percentage", "of", "viable", "cells", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "LXR623", "as", "indicated", "for", "7h", "and", "analyzed", "for", "total", "ATP", "levels", "by", "a", "luminescence", "assay", ".", "To", "account", "for", "dead", "cells", ",", "assays", "were", "normalized", "to", "DNA", "-", "content", "(", "cell", "number", ")", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "LXR623", "as", "indicated", "for", "24h", ".", "Cell", "lysates", "were", "prepared", "and", "subjected", "to", "LC", "/", "MS", "for", "the", "determination", "of", "ATP", "levels", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "LXR623", "for", "7h", "and", "24h", ".", "Thereafter", ",", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "analyzed", "by", "capillary", "electrophoresis", "for", "the", "expression", "of", "phosphorylated", "AMPK", "(", "threonine", "172", ")", "and", "total", "AMPK", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "LXR623", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "exogenous", "ATP", "for", "7h", ".", "Thereafter", ",", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "analyzed", "by", "capillary", "electrophoresis", "for", "the", "expression", "of", "ATF4", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "LXR623", "for", "24h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "cholesterol", ".", "Thereafter", ",", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "analyzed", "by", "capillary", "electrophoresis", "for", "the", "expression", "of", "phosphorylated", "AMPK", "(", "threonine", "172", ")", "and", "total", "AMPK", ".", "Cells", "were", "treated", "as", "in", "F", "and", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "analyzed", "by", "capillary", "electrophoresis", "for", "the", "expression", "of", "ATF4", "and", "Vinculin", "(", "G", ")", "and", "by", "the", "standard", "western", "blot", "for", "the", "expression", "of", "Noxa", "and", "Actin", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "LXR623", ".", "Thereafter", ",", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "prepared", "and", "analyzed", "for", "classical", "ER", "-", "stress", "markers", ",", "GRP78", ",", "ATF4", "and", "Noxa", "by", "capillary", "electrophoresis", ".", "U87", "cells", "were", "transfected", "with", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "n", ".", "t", ".", "-", "siRNA", ")", ",", "ATF3", "-", "siRNA", ",", "ATF4", "siRNA", "or", "the", "combination", "of", "both", "ATF4", "and", "ATF3", "siRNAs", ".", "After", "48h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "LXR623", ",", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "harvested", "and", "analyzed", "by", "capillary", "electrophoresis", "for", "the", "expression", "of", "ATF3", ",", "ATF4", ",", "Noxa", "and", "Vinculin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4U87 cells were treated with 20 µM LXR623 for 7h and 24h. Thereafter, cells were stained with annexin V/propidium iodide and analyzed by multi-parametric flow cytometry. The lower left quadrant indicates the percentage of viable cells.U87 cells were treated with LXR623 as indicated for 7h and analyzed for total ATP levels by a luminescence assay. To account for dead cells, assays were normalized to DNA-content (cell number).U87 cells were treated with LXR623 as indicated for 24h. Cell lysates were prepared and subjected to LC/MS for the determination of ATP levels.U87 cells were treated with increasing concentrations of LXR623 for 7h and 24h. Thereafter, whole cell protein lysates were collected and analyzed by capillary electrophoresis for the expression of phosphorylated AMPK (threonine 172) and total AMPK.U87 cells were treated with increasing concentrations of LXR623 in the presence or absence of exogenous ATP for 7h. Thereafter, whole cell protein lysates were collected and analyzed by capillary electrophoresis for the expression of ATF4.U87 cells were treated with increasing concentrations of LXR623 for 24h in the presence or absence of cholesterol. Thereafter, whole cell protein lysates were collected and analyzed by capillary electrophoresis for the expression of phosphorylated AMPK (threonine 172) and total AMPK.Cells were treated as in F and whole cell protein lysates were collected and analyzed by capillary electrophoresis for the expression of ATF4 and Vinculin (G) and by the standard western blot for the expression of Noxa and Actin.U87 cells were treated with increasing concentrations of LXR623. Thereafter, whole cell protein lysates were prepared and analyzed for classical ER-stress markers, GRP78, ATF4 and Noxa by capillary electrophoresis.U87 cells were transfected with non-targeting siRNA (n.t.-siRNA), ATF3-siRNA, ATF4 siRNA or the combination of both ATF4 and ATF3 siRNAs. After 48h, cells were treated with LXR623, whole cell protein lysates were harvested and analyzed by capillary electrophoresis for the expression of ATF3, ATF4, Noxa and Vinculin."}
{"words": ["Figure", "5U87", "cells", "were", "treated", "as", "in", "A", ".", "Shown", "are", "the", "levels", "of", "TCA", "-", "cycle", "metabolites", ".", "U87", "cells", "were", "incubated", "in", "DMEM", "(", "devoid", "of", "phenol", "red", ",", "glucose", ",", "pyruvate", "and", "glutamine", ")", "supplemented", "with", "25", "mM", "U", "-", "13C", "-", "glucose", ",", "4", "mM", "glutamine", "and", "1", ".", "5", "%", "dialyzed", "FBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "20", "µM", "LXR623", "for", "24", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "for", "LC", "/", "MS", "analysis", ".", "The", "fractions", "of", "each", "different", "isotopologue", "of", "each", "metabolite", "were", "calculated", "(", "percentage", "of", "the", "entire", "pool", ")", ".", "Shown", "are", "the", "isotopologues", "of", "the", "TCA", "cycle", "intermediates", "labeled", "by", "glucose", "carbons", "and", "non", "-", "labeled", "isotopologues", "(", "m", "+", "0", ")", ".", "U87", "cells", "were", "incubated", "in", "DMEM", "(", "devoid", "of", "phenol", "red", ",", "glucose", ",", "pyruvate", "and", "glutamine", ")", "supplemented", "with", "25", "mM", "U", "-", "13C", "-", "glucose", ",", "4", "mM", "glutamine", "and", "1", ".", "5", "%", "dialyzed", "FBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "20", "µM", "LXR623", "for", "24", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "for", "LC", "/", "MS", "analysis", ".", "The", "fractions", "of", "each", "different", "isotopologue", "of", "each", "metabolite", "were", "calculated", "(", "percentage", "of", "the", "entire", "pool", ")", ".", "Shown", "are", "the", "isotopologues", "of", "the", "TCA", "cycle", "intermediates", "labeled", "by", "glucose", "carbons", "and", "non", "-", "labeled", "isotopologues", "(", "m", "+", "0", ")", ".", "U87", "cells", "were", "incubated", "in", "DMEM", "(", "devoid", "of", "phenol", "red", ",", "glucose", ",", "pyruvate", "and", "glutamine", ")", "supplemented", "with", "25", "mM", "U", "-", "13C", "-", "glucose", ",", "4", "mM", "glutamine", "and", "1", ".", "5", "%", "dialyzed", "FBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "20", "µM", "LXR623", "for", "24", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "for", "LC", "/", "MS", "analysis", ".", "The", "fractions", "of", "each", "different", "isotopologue", "of", "each", "metabolite", "were", "calculated", "(", "percentage", "of", "the", "entire", "pool", ")", ".", "Shown", "are", "the", "isotopologues", "of", "non", "-", "essential", "aminoacids", "(", "glutamatic", "acid", "and", "aspartic", "acid", ")", ".", "U87", "cells", "were", "incubated", "in", "DMEM", "(", "devoid", "of", "phenol", "red", ",", "glucose", ",", "pyruvate", "and", "glutamine", ")", "supplemented", "with", "25", "mM", "U", "-", "13C", "-", "glucose", ",", "4", "mM", "glutamine", "and", "1", ".", "5", "%", "dialyzed", "FBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "20", "µM", "LXR623", "for", "24", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "for", "LC", "/", "MS", "analysis", ".", "The", "fractions", "of", "each", "different", "isotopologue", "of", "each", "metabolite", "were", "calculated", "(", "percentage", "of", "the", "entire", "pool", ")", ".", "Shown", "are", "the", "isotopologues", "of", "non", "-", "essential", "aminoacids", "(", "glutamatic", "acidU87", "cells", "were", "incubated", "in", "DMEM", "(", "devoid", "of", "phenol", "red", ",", "glucose", ",", "pyruvate", "and", "glutamine", ")", "supplemented", "with", "25", "mM", "U", "-", "13C", "-", "glucose", ",", "4", "mM", "glutamine", "and", "1", ".", "5", "%", "dialyzed", "FBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "20", "µM", "LXR623", "for", "24", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "for", "LC", "/", "MS", "analysis", ".", "The", "fractions", "of", "each", "different", "isotopologue", "of", "each", "metabolite", "were", "calculated", "(", "percentage", "of", "the", "entire", "pool", ")", ".", "Shown", "are", "the", "isotopologues", "of", "glutathione", "and", "nucleotides", ".", "U87", "cells", "were", "incubated", "in", "DMEM", "(", "devoid", "of", "phenol", "red", ",", "glucose", ",", "pyruvate", "and", "glutamine", ")", "supplemented", "with", "25", "mM", "U", "-", "13C", "-", "glucose", ",", "4", "mM", "glutamine", "and", "1", ".", "5", "%", "dialyzed", "FBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "20", "µM", "LXR623", "for", "24", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "for", "LC", "/", "MS", "analysis", ".", "The", "fractions", "of", "each", "different", "isotopologue", "of", "each", "metabolite", "were", "calculated", "(", "percentage", "of", "the", "entire", "pool", ")", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "LXR623", "20", "µM", "for", "24h", ".", "Thereafter", ",", "cells", "were", "processed", "for", "polar", "metabolite", "analysis", "by", "LC", "/", "MS", ".", "Shown", "are", "the", "levels", "of", "NAD", "and", "NADH2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5U87 cells were treated as in A. Shown are the levels of TCA-cycle metabolites.U87 cells were incubated in DMEM (devoid of phenol red, glucose, pyruvate and glutamine) supplemented with 25 mM U-13C-glucose, 4 mM glutamine and 1.5% dialyzed FBS in the presence or absence of 20 µM LXR623 for 24 hours. Cells were then harvested for LC/MS analysis. The fractions of each different isotopologue of each metabolite were calculated (percentage of the entire pool). Shown are the isotopologues of the TCA cycle intermediates labeled by glucose carbons and non-labeled isotopologues (m+0).U87 cells were incubated in DMEM (devoid of phenol red, glucose, pyruvate and glutamine) supplemented with 25 mM U-13C-glucose, 4 mM glutamine and 1.5% dialyzed FBS in the presence or absence of 20 µM LXR623 for 24 hours. Cells were then harvested for LC/MS analysis. The fractions of each different isotopologue of each metabolite were calculated (percentage of the entire pool). Shown are the isotopologues of the TCA cycle intermediates labeled by glucose carbons and non-labeled isotopologues (m+0).U87 cells were incubated in DMEM (devoid of phenol red, glucose, pyruvate and glutamine) supplemented with 25 mM U-13C-glucose, 4 mM glutamine and 1.5% dialyzed FBS in the presence or absence of 20 µM LXR623 for 24 hours. Cells were then harvested for LC/MS analysis. The fractions of each different isotopologue of each metabolite were calculated (percentage of the entire pool). Shown are the isotopologues of non-essential aminoacids (glutamatic acid and aspartic acid).U87 cells were incubated in DMEM (devoid of phenol red, glucose, pyruvate and glutamine) supplemented with 25 mM U-13C-glucose, 4 mM glutamine and 1.5% dialyzed FBS in the presence or absence of 20 µM LXR623 for 24 hours. Cells were then harvested for LC/MS analysis. The fractions of each different isotopologue of each metabolite were calculated (percentage of the entire pool). Shown are the isotopologues of non-essential aminoacids (glutamatic acidU87 cells were incubated in DMEM (devoid of phenol red, glucose, pyruvate and glutamine) supplemented with 25 mM U-13C-glucose, 4 mM glutamine and 1.5% dialyzed FBS in the presence or absence of 20 µM LXR623 for 24 hours. Cells were then harvested for LC/MS analysis. The fractions of each different isotopologue of each metabolite were calculated (percentage of the entire pool). Shown are the isotopologues of glutathione and nucleotides.U87 cells were incubated in DMEM (devoid of phenol red, glucose, pyruvate and glutamine) supplemented with 25 mM U-13C-glucose, 4 mM glutamine and 1.5% dialyzed FBS in the presence or absence of 20 µM LXR623 for 24 hours. Cells were then harvested for LC/MS analysis. The fractions of each different isotopologue of each metabolite were calculated (percentage of the entire pool).U87 cells were treated with DMSO or LXR623 20 µM for 24h. Thereafter, cells were processed for polar metabolite analysis by LC/MS. Shown are the levels of NAD and NADH2."}
{"words": ["Figure", "6U87", "cells", "were", "treated", "with", "LXR623", "for", "1h", ",", "3h", "or", "5h", "and", "subjected", "to", "extracellular", "flux", "analysis", "on", "the", "Seahorse", "XFp", "instrument", "in", "the", "context", "of", "a", "mitochondrial", "stress", "assay", "(", "A", "-", "C", ")", ".", "From", "this", "assay", ",", "coupled", "respiration", "was", "calculated", "(", "D", "-", "F", ")", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "LXR623", ",", "cholesterol", "or", "the", "combination", "of", "both", "for", "24h", "and", "subjected", "to", "extracellular", "flux", "analysis", "on", "the", "Seahorse", "XFp", "instrument", "in", "the", "context", "of", "a", "mitochondrial", "stress", "assay", "(", "G", ")", ".", "From", "this", "assay", ",", "mitochondrial", "OCR", "and", "coupled", "respiration", "was", "calculated", "(", "H", "-", "I", ")", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "LXR623", "20", "µM", "with", "the", "indicated", "time", "point", ".", "Thereafter", ",", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "subjected", "to", "standard", "western", "blot", "for", "the", "expression", "of", "the", "respiratory", "complexes", "(", "OXPHOS", ")", ",", "Noxa", ",", "and", "ATF4", ".", "A", "star", "indicates", "an", "unspecific", "band", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "LXR623", "20", "µM", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "cycloheximide", "for", "7h", ".", "Thereafter", ",", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "the", "protein", "levels", "of", "the", "components", "of", "complex", "V", "were", "analyzed", "by", "standard", "western", "blot", ".", "U87", "cells", "were", "treated", "with", "increasing", "concentration", "of", "LXR623", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "cholesterol", ".", "Thereafter", ",", "whole", "cell", "protein", "lysates", "were", "collected", "and", "analyzed", "the", "protein", "levels", "of", "the", "respiratory", "complexes", "(", "OXPHOS", ")", "by", "standard", "western", "blot", ".", "U87", "cells", "transduced", "with", "non", "-", "targeting", "or", "LXRβ", "shRNA", "were", "treated", "with", "vehicle", "or", "20", "µM", "LXR623", "for", "24h", ".", "Thereafter", ",", "extracellular", "flux", "analysis", "was", "performed", "in", "the", "context", "of", "a", "mitochondrial", "stress", "assay", ".", "From", "this", "assay", ",", "basal", "respiration", "and", "coupled", "respiration", "was", "calculated", "(", "M", "-", "N", ")", ".", "U87", "cells", "transduced", "with", "non", "-", "targeting", "or", "LXRβ", "shRNA", "were", "treated", "with", "vehicle", "or", "20", "µM", "LXR623", "for", "24h", ".", "RNA", "and", "protein", "were", "collected", "and", "analyzed", "for", "the", "expression", "of", "LXRβ", "mRNA", "(", "O", ")", "or", "LXRβ", "protein", "by", "capillary", "electrophoresis", "(", "P", ")", ".", "Shown", "are", "means", "and", "SD", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", ".", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6U87 cells were treated with LXR623 for 1h, 3h or 5h and subjected to extracellular flux analysis on the Seahorse XFp instrument in the context of a mitochondrial stress assay (A-C). From this assay, coupled respiration was calculated (D-F).U87 cells were treated with LXR623, cholesterol or the combination of both for 24h and subjected to extracellular flux analysis on the Seahorse XFp instrument in the context of a mitochondrial stress assay (G). From this assay, mitochondrial OCR and coupled respiration was calculated (H-I).U87 cells were treated with DMSO or LXR623 20 µM with the indicated time point. Thereafter, whole cell protein lysates were collected and subjected to standard western blot for the expression of the respiratory complexes (OXPHOS), Noxa, and ATF4. A star indicates an unspecific band.U87 cells were treated with DMSO or LXR623 20 µM in the presence or absence of cycloheximide for 7h. Thereafter, whole cell protein lysates were collected and the protein levels of the components of complex V were analyzed by standard western blot.U87 cells were treated with increasing concentration of LXR623 in the presence or absence of cholesterol. Thereafter, whole cell protein lysates were collected and analyzed the protein levels of the respiratory complexes (OXPHOS) by standard western blot.U87 cells transduced with non-targeting or LXRβ shRNA were treated with vehicle or 20 µM LXR623 for 24h. Thereafter, extracellular flux analysis was performed in the context of a mitochondrial stress assay. From this assay, basal respiration and coupled respiration was calculated (M-N).U87 cells transduced with non-targeting or LXRβ shRNA were treated with vehicle or 20 µM LXR623 for 24h. RNA and protein were collected and analyzed for the expression of LXRβ mRNA (O) or LXRβ protein by capillary electrophoresis (P). Shown are means and SD (n = 5). Statistical significance was determined by two-sided student's t.test."}
{"words": ["Figure", "71x106", "HCT116", "colon", "carcinoma", "cells", "were", "implanted", "subcutaneously", ".", "Animals", "were", "treated", "intraperitoneally", "with", "vehicle", ",", "LXR623", "(", "100", "-", "200", "mg", "/", "kg", ")", ",", "ABT263", "(", "100", "mg", "/", "kg", ")", "or", "both", "agents", "(", "3", "days", "per", "week", "for", "1", ".", "5", "weeks", ".", "Tumor", "growth", "curves", "show", "the", "development", "of", "tumor", "size", "for", "each", "treatment", "group", ".", "Scatter", "plots", "display", "the", "quantitative", "representation", "of", "the", "tumor", "size", "among", "the", "different", "treatments", "toward", "the", "end", "of", "the", "experiment", ".", "Shown", "are", "means", "and", "SD", "(", "n", "≥", "5", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "022", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0063", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "B", ",", "E", ",", "GBM43", "PDXs", "were", "implanted", "subcutaneously", ".", "Animals", "were", "treated", "intraperitoneally", "with", "vehicle", ",", "LXR623", "(", "100", "mg", "/", "kg", ")", ",", "ABT263", "(", "75", "mg", "/", "kg", ")", "or", "both", "agents", "(", "3", "days", "per", "week", "for", "1", ".", "5", "weeks", ")", ".", "Tumor", "growth", "curves", "show", "the", "development", "of", "tumor", "size", "for", "each", "treatment", "group", ".", "Scatter", "plots", "display", "the", "quantitative", "representation", "of", "the", "tumor", "size", "among", "the", "different", "treatments", "toward", "the", "end", "of", "the", "experiment", ".", "Shown", "are", "means", "and", "SD", "(", "n", "≥", "5", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "022", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0031", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "C", ",", "F", ",", "A375", "BRAF", "V600E", "mutated", "melanomas", "were", "implanted", "subcutaneously", ".", "Animals", "were", "treated", "intraperitoneally", "with", "vehicle", ",", "LXR623", "(", "100", "mg", "/", "kg", ")", ",", "ABT263", "(", "75", "mg", "/", "kg", ")", "or", "both", "agents", "(", "3", "days", "per", "week", "for", "1", ".", "5", "weeks", ")", ".", "Tumor", "growth", "curves", "show", "the", "development", "of", "tumor", "size", "for", "each", "treatment", "group", ".", "Scatter", "plots", "display", "the", "quantitative", "representation", "of", "the", "tumor", "size", "among", "the", "different", "treatments", "toward", "the", "end", "of", "the", "experiment", ".", "Shown", "are", "means", "and", "SD", "(", "n", "≥", "5", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0109", "(", "GW3965", "vs", "Combination", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0166", "(", "ABT263", "vs", "Combination", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0047", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "Related", "to", "the", "HCT116", "colonic", "xenograft", "model", ",", "representative", "histopathological", "images", "(", "hematoxylin", "and", "eosin", "stain", ")", "are", "shown", "from", "each", "treatment", "group", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "Sections", "from", "the", "same", "treatment", "groups", "as", "in", "G", "were", "stained", "with", "TUNEL", "and", "SDHB", ",", "repectively", ".", "Displayed", "are", "representative", "images", "of", "the", "staining", ".", "Scale", "bar", "50", "µM", ".", "Sections", "from", "the", "experiment", "in", "7A", "were", "quantified", "for", "apoptotic", "bodies", ",", "Sections", "from", "the", "experiment", "in", "7A", "were", "quantified", "for", ",", "number", "of", "TUNEL", "positive", "cellsSections", "from", "the", "experiment", "in", "7A", "were", "quantified", "for", "number", "of", "mitosis", "per", "multiple", "high", "-", "power", "fields", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 71x106 HCT116 colon carcinoma cells were implanted subcutaneously. Animals were treated intraperitoneally with vehicle, LXR623 (100-200 mg/kg), ABT263 (100 mg/kg) or both agents (3 days per week for 1.5 weeks. Tumor growth curves show the development of tumor size for each treatment group. Scatter plots display the quantitative representation of the tumor size among the different treatments toward the end of the experiment. Shown are means and SD (n ≥ 5). *p=0.022, **p=0.0063, ****p<0.0001. Statistical significance was determined by one-way ANOVA. B, E, GBM43 PDXs were implanted subcutaneously. Animals were treated intraperitoneally with vehicle, LXR623 (100 mg/kg), ABT263 (75 mg/kg) or both agents (3 days per week for 1.5 weeks). Tumor growth curves show the development of tumor size for each treatment group. Scatter plots display the quantitative representation of the tumor size among the different treatments toward the end of the experiment. Shown are means and SD (n ≥ 5). *p=0.022, **p=0.0031. Statistical significance was determined by one-way ANOVA. C, F, A375 BRAF V600E mutated melanomas were implanted subcutaneously. Animals were treated intraperitoneally with vehicle, LXR623 (100 mg/kg), ABT263 (75 mg/kg) or both agents (3 days per week for 1.5 weeks). Tumor growth curves show the development of tumor size for each treatment group. Scatter plots display the quantitative representation of the tumor size among the different treatments toward the end of the experiment. Shown are means and SD (n ≥ 5). *p=0.0109 (GW3965 vs Combination), *p=0.0166 (ABT263 vs Combination), **p=0.0047. Statistical significance was determined by one-way ANOVA. Related to the HCT116 colonic xenograft model, representative histopathological images (hematoxylin and eosin stain) are shown from each treatment group. Scale bar: 50 µm. Sections from the same treatment groups as in G were stained with TUNEL and SDHB, repectively. Displayed are representative images of the staining. Scale bar 50 µM.Sections from the experiment in 7A were quantified for apoptotic bodies, Sections from the experiment in 7A were quantified for , number of TUNEL positive cellsSections from the experiment in 7A were quantified for number of mitosis per multiple high-power fields."}
{"words": ["Figure", "1C", ")", "MiNA", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "stained", "with", "the", "membrane", "potential", "-", "independent", "dye", "MitoTracker", "™", "Green", "(", "MTG", ",", "100", "nM", ")", "to", "visualize", "and", "determine", "the", "mitochondrial", "area", "(", "=", "mitochondrial", "footprint", ")", ".", "Left", ":", "HeLa", "WT", "cells", "grown", "in", "10", "mM", "galactose", "stained", "with", "7", "nM", "TMRE", "(", "red", ")", "plus", "100", "nM", "MTG", "(", "green", ")", ".", "Co", "-", "localization", "shown", "in", "yellow", ".", "Right", ":", "mitochondrial", "footprint", "(", "white", ")", "and", "mitochondrial", "skeleton", "(", "red", ")", "generated", "from", "MiNA", "analysis", "of", "the", "MTG", "channel", "(", "green", ")", ".", "D", ")", "Left", ":", "HeLa", "IF1", "-", "KO", "cells", "grown", "in", "10", "mM", "galactose", "stained", "with", "7", "nM", "TMRE", "(", "red", ")", "plus", "100", "nM", "MTG", "(", "green", ")", ".", "Right", ":", "mitochondrial", "footprint", "(", "white", ")", "and", "mitochondrial", "skeleton", "(", "red", ")", "generated", "from", "MiNA", "analysis", "of", "the", "MTG", "channel", "(", "green", ")", ".", "E", ")", "Left", ":", "HeLa", "IF1", "-", "H49K", "cells", "grown", "in", "10", "mM", "galactose", "stained", "with", "7", "nM", "TMRE", "(", "red", ")", "plus", "100", "nM", "MTG", "(", "green", ")", ".", "Right", ":", "mitochondrial", "footprint", "(", "white", ")", "and", "mitochondrial", "skeleton", "(", "red", ")", "generated", "from", "MiNA", "analysis", "of", "the", "MTG", "channel", "(", "green", ")", ".", "Co", "-", "localization", "shown", "in", "yellow", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "F", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C) MiNA analysis of HeLa cells stained with the membrane potential-independent dye MitoTracker™Green (MTG, 100 nM) to visualize and determine the mitochondrial area (= mitochondrial footprint). Left: HeLa WT cells grown in 10 mM galactose stained with 7 nM TMRE (red) plus 100 nM MTG (green). Co-localization shown in yellow. Right: mitochondrial footprint (white) and mitochondrial skeleton (red) generated from MiNA analysis of the MTG channel (green). D) Left: HeLa IF1-KO cells grown in 10 mM galactose stained with 7 nM TMRE (red) plus 100 nM MTG (green). Right: mitochondrial footprint (white) and mitochondrial skeleton (red) generated from MiNA analysis of the MTG channel (green). E) Left: HeLa IF1-H49K cells grown in 10 mM galactose stained with 7 nM TMRE (red) plus 100 nM MTG (green). Right: mitochondrial footprint (white) and mitochondrial skeleton (red) generated from MiNA analysis of the MTG channel (green). Co-localization shown in yellow. Scale bars = 10 µm. F)"}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "BN", "-", "PAGE", "and", "subsequent", "immuno", "-", "blotting", "of", "mitochondrial", "extracts", "from", "indicated", "HeLa", "cell", "lines", "showing", "the", "assembly", "of", "F1FO", "ATP", "synthase", "and", "binding", "of", "IF1", ".", "Monomers", "(", "M", ")", ",", "dimers", "(", "D", ")", "and", "oligomers", "(", "O", ")", "were", "detected", ".", "Left", "panel", ":", "Coomassie", "-", "stained", "gel", ".", "Right", "panels", ":", "Immunoblotting", "and", "detection", "of", "ATP", "synthase", "and", "IF1", ".", "WT", ":", "wild", "type", "HeLa", "cells", ";", "IF", "*", ":", "cells", "expressing", "IF1", "-", "H49K", ".", "Stars", "indicate", "oligomeric", "IF1", "forms", ".", "I", ":", "complex", "I", ";", "III", ":", "complex", "III", ".", "D", ")", "Assembly", "of", "sEcGFP", "-", "tagged", "subunits", "CoxVIIIa", "-", "sEcGFP", "(", "CIV", "#", ")", "into", "complex", "IV", ",", "and", "assembly", "of", "subunits", "γ", "-", "sEcGFP", "(", "SUγ", "#", ")", "and", "SU", "e", "-", "sEcGFP", "(", "Sue", "#", ")", "into", "ATP", "synthase", ".", "Proteins", "were", "separated", "by", "BN", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", ".", "Lanes", "#", "1", "-", "#", "10", "were", "cut", "into", "three", "pieces", "for", "further", "evaluation", ".", "Lanes", "1", "-", "2", ":", "complex", "IV", "assembly", "in", "WT", "and", "CoxVIIIa", "-", "sEcGFP", "-", "expressing", "cells", ",", "detection", "of", "CIV", "with", "anti", "-", "Cox1", ".", "Lanes", "3", "-", "4", ":", "complex", "V", "assembly", "in", "WT", "and", "SUγ", "-", "sEcGFP", "-", "expressing", "cells", ",", "detection", "with", "anti", "-", "SU", "γ", ".", "Lanes", "8", "-", "10", ":", "assembly", "of", "CIV", "#", "into", "CIV", ",", "SU", "γ", "-", "sEcGFP", "(", "SUγ", "#", ")", "into", "CV", ",", "and", "SU", "e", "-", "sEcGFP", "(", "SUe", "#", ")", "into", "CV", ".", "At", "lane", "#", "6", "in", "the", "Coomassie", "-", "stained", "gel", ",", "the", "positions", "of", "molecular", "weight", "markers", "(", "M", ")", "are", "shown", ".", "SC", ":", "respiratory", "supercomplexes", ";", "CIV2", ":", "complex", "IV", "dimers", ";", "CIV", ":", "complex", "IV", "monomer", ";", "s1", ":", "F1", "-", "c8", "subcomplexes", ";", "s2", ":", "subcomplexes", "of", "CV", "containing", "subunits", "b", ",", "e", "and", "g", "He", "et", "al", ".", ",", "2018", "(", ")", ".", "Blue", "*", "*", ":", "dimeric", "F1F0", "ATP", "synthase", ";", "blue", "*", ":", "monomeric", "F1F0", "ATP", "synthase", ".", "Red", "asterisks", ":", "respiratory"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) BN-PAGE and subsequent immuno-blotting of mitochondrial extracts from indicated HeLa cell lines showing the assembly of F1FO ATP synthase and binding of IF1. Monomers (M), dimers (D) and oligomers (O) were detected. Left panel: Coomassie-stained gel. Right panels: Immunoblotting and detection of ATP synthase and IF1. WT: wild type HeLa cells; IF*: cells expressing IF1-H49K. Stars indicate oligomeric IF1 forms. I: complex I; III: complex III.D) Assembly of sEcGFP-tagged subunits CoxVIIIa-sEcGFP (CIV#) into complex IV, and assembly of subunits γ-sEcGFP (SUγ#) and SU e-sEcGFP (Sue#) into ATP synthase. Proteins were separated by BN-PAGE and immunoblotted. Lanes #1-#10 were cut into three pieces for further evaluation. Lanes 1-2: complex IV assembly in WT and CoxVIIIa-sEcGFP-expressing cells, detection of CIV with anti-Cox1. Lanes 3-4: complex V assembly in WT and SUγ-sEcGFP-expressing cells, detection with anti-SU γ. Lanes 8-10: assembly of CIV# into CIV, SU γ-sEcGFP (SUγ#) into CV, and SU e-sEcGFP (SUe#) into CV. At lane #6 in the Coomassie-stained gel, the positions of molecular weight markers (M) are shown. SC: respiratory supercomplexes; CIV2: complex IV dimers; CIV: complex IV monomer; s1: F1-c8 subcomplexes; s2: subcomplexes of CV containing subunits b, e and g He et al., 2018(). Blue **: dimeric F1F0 ATP synthase; blue*: monomeric F1F0 ATP synthase. Red asterisks: respiratory supercomplexes"}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "A", "'", "Trajectory", "maps", "of", "ATP", "synthase", "labeled", "at", "SU", "γ", "(", "A", ")", "and", "SU", "g", "(", "A", "'", ")", "in", "single", "mitochondria", ".", "Insets", ":", "Detailed", "views", "of", "the", "diffusion", "of", "CV", "-", "SU", "γ", "(", "A", ")", "and", "CV", "-", "SU", "g", "(", "A", "'", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "1", "μm", "overview", "and", "0", ".", "5", "μm", "insets", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A,A' Trajectory maps of ATP synthase labeled at SU γ (A) and SU g (A') in single mitochondria. Insets: Detailed views of the diffusion of CV-SU γ (A) and CV-SU g (A'). Scale bars: 1 μm overview and 0.5 μm insets."}
{"words": ["Figure", "4B", ")", "Diffusion", "coefficients", "for", "ATP", "synthase", "under", "control", "conditions", "(", "5", ".", "6", "mM", "glucose", ")", ",", "and", "under", "OXPHOS", "conditions", ".", "The", "probability", "density", "function", "(", "PDF", ")", "and", "cumulative", "density", "function", "(", "CDF", ")", "of", "-", "log", "D", "is", "plotted", ".", "Number", "of", "trajectories", "analyzed", ":", "8622", "(", "Glc", ")", "and", "10333", "(", "Gal", ")", "from", "mitochondria", "in", "at", "least", "5", "different", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B) Diffusion coefficients for ATP synthase under control conditions (5.6 mM glucose), and under OXPHOS conditions. The probability density function (PDF) and cumulative density function (CDF) of -log D is plotted. Number of trajectories analyzed: 8622 (Glc) and 10333 (Gal) from mitochondria in at least 5 different cells."}
{"words": ["Figure", "5C", ")", "Images", "showing", "matrix", "pH", "equilibration", "with", "extracellular", "pH", ".", "Shown", "are", "ratiometric", "fluorescence", "images", "of", "MPP", "-", "sEcGFP", "before", "and", "after", "addition", "of", "the", "uncouplers", "and", "inhibitors", "FCCP", ",", "nigericin", "and", "oligomycin", "(", "plus", "0", ".", "002", "%", "w", "/", "v", "Triton", "X", "-", "100", "where", "indicated", ")", ".", "False", "color", "images", "(", "λ511", "/", "λ464", ")", "indicate", "ratio", "values", ".", "D", ")", "Ratiometric", "imaging", "of", "mitochondrial", "pH", "after", "equilibration", "with", "extracellular", "pH", "values", "pH", "=", "8", ",", "pH", "=", "7", ".", "4", "and", "pH", "=", "6", ".", "5", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C) Images showing matrix pH equilibration with extracellular pH. Shown are ratiometric fluorescence images of MPP-sEcGFP before and after addition of the uncouplers and inhibitors FCCP, nigericin and oligomycin (plus 0.002 % w/v Triton X-100 where indicated). False color images (λ511/λ464) indicate ratio values. D) Ratiometric imaging of mitochondrial pH after equilibration with extracellular pH values pH=8, pH=7.4 and pH=6.5. Scale bars = 10 µm. E"}
{"words": ["Figure", "6B", ")", "Mitochondrial", "pH", "values", "at", "SU", "e", ",", "SU", "γ", "and", "in", "the", "matrix", "bulk", "in", "hyper", "-", "glycolytic", "cells", "(", "high", "glucose", ":", "HGlc", ",", "25", "mM", ")", ".", "C", ")", "pH", "at", "SU", "e", ",", "SU", "γ", "and", "in", "the", "matrix", "in", "respiring", "cells", "(", "Gal", ",", "10", "mM", ")", ".", "D", ")", "pH", "at", "CoxVIIIa", "at", "complex", "IV", "in", "the", "ICS", "before", "and", "after", "stimulation", "of", "the", "respiratory", "chain", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B) Mitochondrial pH values at SU e, SU γ and in the matrix bulk in hyper-glycolytic cells (high glucose: HGlc, 25 mM). C) pH at SU e , SU γ and in the matrix in respiring cells (Gal, 10 mM). D) pH at CoxVIIIa at complex IV in the ICS before and after stimulation of the respiratory chain. Da"}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "Mitochondrial", "pH", "at", "CV", "SU", "e", "measured", "in", "HeLa", "WT", "in", "glycolytic", "(", "HGlc", ")", "and", "respiring", "(", "Gal", ")", "conditions", ".", "Where", "indicated", ",", "5", "µg", "/", "mL", "oligomycin", "was", "added", "to", "inhibit", "CV", "activity", ".", "B", ")", "Mitochondrial", "pH", "at", "CV", "SU", "e", "in", "IF1", "-", "KO", "cells", ".", "Conditions", ":", "glycolytic", "(", "HGlc", ")", "and", "respiring", "(", "Gal", ")", "with", "and", "without", "oligomycin", ".", "C", ")", "Mitochondrial", "pH", "at", "CV", "SU", "e", "in", "IF1", "-", "OE", "cells", ".", "Conditions", ":", "glycolytic", "(", "HGlc", ")", "and", "respiring", "(", "Gal", ")", "with", "and", "without", "oligomycin", ".", "D", ")", "F", ")", "Effect", "of", "inhibiting", "the", "respiratory", "chain", "at", "complex", "III", "(", "CIII", ")", "with", "antimycin", "A", "(", "AA", ")", "on", "the", "local", "pH", "at", "SU", "e", "in", "WT", "cells", "(", "glycolytic", "conditions", ")", ".", "G", ")", "Local", "pH", "at", "SU", "e", "in", "IF1", "-", "KO", "cells", "after", "inhibiting", "CIII", ".", "H", ")", "Local", "pH", "at", "SU", "e", "in", "IF1", "-", "OE", "cells", "after", "inhibiting", "CIII", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) Mitochondrial pH at CV SU e measured in HeLa WT in glycolytic (HGlc) and respiring (Gal) conditions. Where indicated, 5 µg/mL oligomycin was added to inhibit CV activity. B) Mitochondrial pH at CV SU e in IF1-KO cells. Conditions: glycolytic (HGlc) and respiring (Gal) with and without oligomycin. C) Mitochondrial pH at CV SU e in IF1-OE cells. Conditions: glycolytic (HGlc) and respiring (Gal) with and without oligomycin. D)F) Effect of inhibiting the respiratory chain at complex III (CIII) with antimycin A (AA) on the local pH at SU e in WT cells (glycolytic conditions). G) Local pH at SU e in IF1-KO cells after inhibiting CIII. H) Local pH at SU e in IF1-OE cells after inhibiting CIII. Da"}
{"words": ["Figure", "8A", ")", "Mitochondrial", "pH", "at", "CV", "SU", "e", "is", "compared", "for", "HeLa", "WT", ",", "IF1", "-", "KO", "and", "IF1", "-", "H49K", "cells", "under", "glycolytic", "and", "respiring", "conditions", ".", "D", ")", "pH", "at", "respiratory", "complex", "IV", "at", "SU", "CoxVIIIa", "in", "the", "ICS", "measured", "in", "HeLa", "WT", ",", "IF1", "-", "KO", "and", "IF1", "-", "H49K", "cells", "under", "glycolytic", "and", "respiring", "conditions", ".", "J", ")", "pH", "measurements", "in", "mitochondria", "in", "live", "cells", "expressing", "sEcGFP", "as", "the", "pH", "sensor", "at", "SU", "γ", ".", "The", "pH", "was", "color", "coded", "according", "to", "respective", "emission", "ratio", ".", "The", "pH", "at", "SU", "γ", "in", "IF1", "-", "H49K", "-", "expressing", "cells", "is", "compared", "with", "WT", "cells", ".", "(", "Scale", "bar", ":", "1", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A) Mitochondrial pH at CV SU e is compared for HeLa WT, IF1-KO and IF1-H49K cells under glycolytic and respiring conditions.D) pH at respiratory complex IV at SU CoxVIIIa in the ICS measured in HeLa WT, IF1-KO and IF1-H49K cells under glycolytic and respiring conditions.J) pH measurements in mitochondria in live cells expressing sEcGFP as the pH sensor at SU γ. The pH was color coded according to respective emission ratio. The pH at SU γ in IF1-H49K-expressing cells is compared with WT cells. (Scale bar: 1 µm)."}
{"words": ["Figure", "9A", ")", "Mitochondrial", "ATP", "production", "rates", "in", "HeLa", "cells", "the", "presence", "and", "absence", "of", "IF1", ".", "Oxygen", "consumption", "rates", "(", "OCR", ")", "and", "extracellular", "acidification", "rates", "(", "ECAR", ")", "were", "determined", "with", "an", "automatic", "flux", "analyzer", "(", "Seahorse", "/", "Agilent", ")", ".", "After", "monitoring", "basal", "respiration", ",", "oligomycin", "(", "1", "µM", ")", ",", "and", "rotenone", "plus", "antimycin", "A", "(", "Rot", ";", "0", ".", "5", "µM", ";", "AA", ",", "0", ".", "5", "µM", ")", "were", "added", "sequentially", "to", "determine", "glycolytic", "and", "mitochondrial", "ATP", "production", "rates", ".", "~", "12", "technical", "replicates", "per", "measurement", ",", "N", "=", "4", "independent", "assays", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A) Mitochondrial ATP production rates in HeLa cells the presence and absence of IF1. Oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) were determined with an automatic flux analyzer (Seahorse/Agilent). After monitoring basal respiration, oligomycin (1 µM), and rotenone plus antimycin A (Rot; 0.5 µM; AA, 0.5 µM) were added sequentially to determine glycolytic and mitochondrial ATP production rates. ~12 technical replicates per measurement, N=4 independent assays."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "MYB", "knockdown", "(", "MiaPaCa", "-", "shMYB", "and", "Panc1", "-", "shMYB", ")", "and", "forced", "MYB", "-", "overexpressing", "(", "BxPC3", "-", "MYB", ")", "PC", "cells", "along", "with", "their", "respective", "control", "cell", "lines", "(", "MiaPaCa", "-", "Scr", ",", "Panc1", "-", "Scr", ",", "and", "BxPC3", "-", "Neo", ")", "were", "subjected", "to", "hypoxia", "(", "1", "%", "O2", ")", "treatment", "for", "different", "time", "intervals", "(", "0", "-", "96", "h", ")", ".", "Their", "growth", "was", "measured", "by", "viable", "cell", "counting", "using", "a", "trypan", "blue", "exclusion", "assay", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "ECAR", "(", "E", ")", "and", "OCR", "(", "F", ")", "in", "control", "and", "MYB", "silenced", "MiaPaCa", "cells", "cultured", "under", "normoxia", "or", "treated", "with", "hypoxia", "mimetic", "CoCl2", "(", "100", "μM", "for", "4", "h", ")", ".", "Thereafter", ",", "ECAR", "was", "measured", "in", "PC", "cells", "with", "sequential", "injection", "of", "glucose", ",", "oligomycin", ",", "and", "2", "-", "DG", ",", "while", "OCR", "was", "measured", "with", "the", "serial", "addition", "of", "oligomycin", ",", "FCCP", ",", "and", "antimycin", "A", "/", "rotenone", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) MYB knockdown (MiaPaCa-shMYB and Panc1-shMYB) and forced MYB-overexpressing (BxPC3-MYB) PC cells along with their respective control cell lines (MiaPaCa-Scr, Panc1-Scr, and BxPC3-Neo) were subjected to hypoxia (1% O2) treatment for different time intervals (0-96 h). Their growth was measured by viable cell counting using a trypan blue exclusion assay.(E, F) ECAR (E) and OCR (F) in control and MYB silenced MiaPaCa cells cultured under normoxia or treated with hypoxia mimetic CoCl2 (100 μM for 4 h). Thereafter, ECAR was measured in PC cells with sequential injection of glucose, oligomycin, and 2-DG, while OCR was measured with the serial addition of oligomycin, FCCP, and antimycin A/rotenone."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "MYB", "expression", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", "in", "pancreatic", "cancer", "cells", "cultured", "under", "hypoxia", "for", "different", "time", "intervals", ".", "HIF1α", "accumulation", "was", "examined", "as", "a", "positive", "control", ".", "MYB", "protein", "(", "C", ")", "levels", "were", "measured", "in", "the", "prostate", "(", "LNCaP", ")", ",", "lung", "(", "A549", ")", ",", "breast", "(", "MB231", ")", ",", "and", "colon", "(", "HCT116", ")", "cancer", "cells", "cultured", "under", "normoxia", "and", "hypoxia", "(", "6", "h", ")", "by", "immunoblotting", "respectively", ".", "β", "-", "actin", "served", "as", "an", "internal", "control", ".", "N", "-", "normoxia", "and", "H", "-", "hypoxia", ".", "(", "E", ")", "Pancreatic", "cancer", "cells", "were", "transiently", "transfected", "either", "with", "non", "-", "targeted", "control", "siRNA", "(", "siCtrl", ")", "or", "HIF1α", "-", "targeting", "siRNA", "(", "siHIF1α", ")", "for", "24", "h", "and", "then", "incubated", "under", "hypoxia", "for", "6", "h", ".", "MYB", "expression", "was", "analyzed", "at", "protein", "and", "mRNA", "levels", ".", "(", "F", ")", "Cells", "were", "treated", "with", "either", "vehicle", "or", "CoCl2", "(", "100µM", ")", "for", "6", "h", ",", "and", "total", "protein", "and", "RNA", "were", "isolated", ".", "The", "expression", "of", "HIF1α", "and", "MYB", "was", "examined", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) MYB expression was analyzed by immunoblotting in pancreatic cancer cells cultured under hypoxia for different time intervals. HIF1α accumulation was examined as a positive control.MYB protein (C) levels were measured in the prostate (LNCaP), lung (A549), breast (MB231), and colon (HCT116) cancer cells cultured under normoxia and hypoxia (6 h) by immunoblotting respectively. β-actin served as an internal control. N- normoxia and H- hypoxia.(E) Pancreatic cancer cells were transiently transfected either with non-targeted control siRNA (siCtrl) or HIF1α -targeting siRNA (siHIF1α) for 24 h and then incubated under hypoxia for 6 h. MYB expression was analyzed at protein and mRNA levels.(F) Cells were treated with either vehicle or CoCl2 (100µM) for 6 h, and total protein and RNA were isolated. The expression of HIF1α and MYB was examined. β-actin was used as an internal control."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "HuR", "localization", "was", "examined", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "in", "cells", "exposed", "to", "hypoxia", "for", "1", "h", ".", "HuR", "(", "green", ")", ",", "and", "nucleus", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "μm", "(", "lower", "left", "corner", ")", ".", "Lower", "panels", "are", "digitally", "magnified", "views", "of", "the", "marked", "rectangles", ".", "(", "C", ")", "Cytosolic", "and", "nuclear", "protein", "fractions", "were", "prepared", "from", "cells", "cultured", "under", "hypoxia", "for", "1h", "and", "HuR", "expression", "was", "examined", "by", "immunoblotting", ".", "α", "-", "Tubulin", "(", "nuclear", ")", "and", "Lamin", "A", "(", "cytoplasm", ")", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "(", "G", ")", "Cells", "transfected", "with", "HuR", "or", "control", "siRNA", "for", "48", "h", "were", "exposed", "to", "hypoxia", "for", "6", "h", ",", "and", "MYB", "and", "HuR", "expression", "was", "determined", "by", "immunoblotting", "or", "qRT", "-", "PCR", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) HuR localization was examined by immunofluorescence microscopy in cells exposed to hypoxia for 1 h. HuR (green), and nucleus (blue). Scale bar, 25 μm (lower left corner). Lower panels are digitally magnified views of the marked rectangles.(C) Cytosolic and nuclear protein fractions were prepared from cells cultured under hypoxia for 1h and HuR expression was examined by immunoblotting. α-Tubulin (nuclear) and Lamin A (cytoplasm) were used as loading controls.(G) Cells transfected with HuR or control siRNA for 48 h were exposed to hypoxia for 6 h, and MYB and HuR expression was determined by immunoblotting or qRT-PCR."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "MYB", "-", "silenced", "(", "MiaPaCa", "-", "shMYB", "and", "Panc1", "-", "shMYB", ")", "and", "MYB", "-", "overexpressing", "(", "BxPC3", "-", "MYB", ")", "PC", "cells", ",", "along", "with", "their", "control", "cell", "lines", "(", "MiaPaCa", "-", "Scr", ",", "Panc1", "-", "Scr", ",", "and", "BxPC3", "-", "Neo", ")", "were", "exposed", "to", "hypoxia", "for", "6", "h", ".", "Protein", "lysates", "were", "made", ",", "and", "the", "expression", "of", "MYB", "and", "HIF1α", "was", "examined", "by", "immunoblotting", ".", "β", "-", "actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "The", "transcriptional", "activity", "of", "the", "HIF1α", "promoter", "was", "determined", "by", "performing", "the", "promoter", "-", "reporter", "assay", ".", "MYB", "-", "modulated", "PC", "cell", "lines", "were", "transfected", "with", "the", "reporter", "plasmid", ",", "and", "after", "24", "h", "of", "transfection", ",", "cells", "were", "cultured", "under", "hypoxia", "or", "normoxia", "for", "24", "h", ",", "and", "the", "supernatant", "was", "collected", ".", "HIF1α", "promoter", "-", "driven", "Gaussia", "luciferase", "activity", "was", "normalized", "with", "SEAP", "activity", ",", "and", "the", "data", "was", "presented", "as", "a", "bar", "diagram", ".", "(", "E", ")", "MYB", "-", "silenced", "or", "-", "overexpressing", "PC", "cell", "lines", "were", "exposed", "to", "normoxia", "or", "hypoxia", "for", "6", "h", "and", "subjected", "to", "chromatin", "immunoprecipitation", "using", "anti", "-", "MYB", "antibodies", "or", "IgG", "control", "followed", "by", "qPCR", "analysis", "using", "site", "-", "specific", "primers", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) MYB-silenced (MiaPaCa-shMYB and Panc1-shMYB) and MYB-overexpressing (BxPC3-MYB) PC cells, along with their control cell lines (MiaPaCa-Scr, Panc1-Scr, and BxPC3-Neo) were exposed to hypoxia for 6 h. Protein lysates were made, and the expression of MYB and HIF1α was examined by immunoblotting. β-actin served as a loading control.(C) The transcriptional activity of the HIF1α promoter was determined by performing the promoter-reporter assay. MYB-modulated PC cell lines were transfected with the reporter plasmid, and after 24 h of transfection, cells were cultured under hypoxia or normoxia for 24 h, and the supernatant was collected. HIF1α promoter-driven Gaussia luciferase activity was normalized with SEAP activity, and the data was presented as a bar diagram.(E) MYB-silenced or -overexpressing PC cell lines were exposed to normoxia or hypoxia for 6 h and subjected to chromatin immunoprecipitation using anti-MYB antibodies or IgG control followed by qPCR analysis using site-specific primers."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "was", "performed", "to", "analyze", "HIF1α", "and", "MYB", "expression", "in", "MYB", "-", "silenced", "(", "shMYB", ")", "and", "those", "having", "a", "forced", "overexpression", "of", "HIF1α", "(", "shMYB", "-", "HIF1αOE", ")", "along", "with", "their", "respective", "controls", "(", "Scr", "and", "shMYB", "-", "Neo", ")", "cultured", "under", "hypoxia", ".", "β", "-", "actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "Live", "/", "Dead", "staining", "was", "performed", "in", "MYB", "-", "silenced", "MiaPaCa", "and", "Panc", "-", "1", "or", "MYB", "silenced", "-", "HIF1α", "overexpressed", "cells", "cultured", "under", "hypoxia", "for", "48", "h", ".", "Cells", "were", "visualized", "under", "a", "fluorescence", "microscope", ".", "Representative", "fluorescence", "micrographs", "are", "presented", ".", "The", "number", "of", "live", "and", "dead", "cells", "was", "counted", "from", "the", "captured", "random", "images", ".", "Scale", "bar", ",", "150", "μm", "(", "lower", "right", "corner", ")", ".", "(", "F", ")", "MYB", "-", "silenced", "and", "HIF1α", "overexpressing", "MYB", "knockdown", "PC", "cells", "and", "control", "cells", "were", "cultured", "under", "hypoxia", "for", "48", "h", ".", "Conditioned", "media", "was", "collected", "and", "analyzed", "to", "assess", "glucose", "consumption", "and", "lactate", "secretion", "by", "measuring", "their", "levels", ".", "The", "data", "was", "normalized", "with", "the", "number", "of", "cells", "and", "presented", "as", "relative", "fold", "changes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunoblot analysis was performed to analyze HIF1α and MYB expression in MYB-silenced (shMYB) and those having a forced overexpression of HIF1α (shMYB-HIF1αOE) along with their respective controls (Scr and shMYB-Neo) cultured under hypoxia. β-actin served as a loading control.(C) Live/Dead staining was performed in MYB-silenced MiaPaCa and Panc-1 or MYB silenced- HIF1α overexpressed cells cultured under hypoxia for 48 h. Cells were visualized under a fluorescence microscope. Representative fluorescence micrographs are presented. The number of live and dead cells was counted from the captured random images. Scale bar, 150 μm (lower right corner).(F) MYB-silenced and HIF1α overexpressing MYB knockdown PC cells and control cells were cultured under hypoxia for 48 h. Conditioned media was collected and analyzed to assess glucose consumption and lactate secretion by measuring their levels. The data was normalized with the number of cells and presented as relative fold changes."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "Quantitative", "ChIP", "-", "qPCR", "was", "performed", "to", "analyze", "the", "occupancy", "of", "MYB", "under", "normoxia", "and", "hypoxia", "at", "promoter", "regions", "of", "selected", "glycolytic", "genes", "(", "GLUT3", ",", "HK2", ",", "PFKL", ",", "ENO2", ",", "and", "MCT4", ")", "using", "anti", "-", "MYB", "or", "IgG", "control", "antibodies", ".", "The", "enrichment", "of", "promoter", "regions", "was", "compared", "between", "cells", "cultured", "under", "normoxia", "or", "hypoxia", ".", "p300", "(", "E", ")", ",", "and", "H3K9ac", "(", "F", ")", "on", "the", "promoter", "regions", "were", "also", "confirmed", "by", "ChIP", "-", "qPCR", "using", "specific", "antibodies", "and", "fold", "enrichment", "calculated", "and", "presented", "as", "a", "bar", "graph", "after", "normalization", "with", "control", "IgG", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) Quantitative ChIP-qPCR was performed to analyze the occupancy of MYB under normoxia and hypoxia at promoter regions of selected glycolytic genes (GLUT3, HK2, PFKL, ENO2, and MCT4) using anti-MYB or IgG control antibodies. The enrichment of promoter regions was compared between cells cultured under normoxia or hypoxia.p300 (E), and H3K9ac (F) on the promoter regions were also confirmed by ChIP- qPCR using specific antibodies and fold enrichment calculated and presented as a bar graph after normalization with control IgG."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ",", "B", ")", "Interaction", "of", "MYB", "with", "HIF1α", "(", "A", ")", "and", "p300", "(", "B", ")", "was", "examined", "by", "co", "-", "immunoprecipitation", "assays", "in", "the", "lysates", "of", "pancreatic", "cancer", "cells", "cultured", "under", "hypoxia", "for", "6", "h", ".", "Immunoprecipitation", "with", "IgG", "isotype", "antibody", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "10", "%", "of", "total", "cell", "lysate", "was", "used", "as", "input", "for", "western", "blot", "analysis", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Co", "-", "localization", "of", "MYB", "with", "HIF1α", "(", "C", ")", "and", "p300", "(", "D", ")", "was", "examined", "in", "pancreatic", "cancer", "cells", "grown", "under", "hypoxia", "for", "6", "h", "by", "immunofluorescence", "assays", "followed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "30", "μm", "(", "lower", "left", "corner", ")", ".", "Lower", "panels", "are", "digitally", "magnified", "views", "of", "the", "marked", "rectangles", ".", "For", "ease", "of", "visualization", ",", "a", "pseudo", "color", "(", "purple", ")", "was", "adopted", "for", "p300", "staining", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A, B) Interaction of MYB with HIF1α (A) and p300 (B) was examined by co-immunoprecipitation assays in the lysates of pancreatic cancer cells cultured under hypoxia for 6 h. Immunoprecipitation with IgG isotype antibody was used as a control. 10% of total cell lysate was used as input for western blot analysis.(C, D) Co-localization of MYB with HIF1α (C) and p300 (D) was examined in pancreatic cancer cells grown under hypoxia for 6 h by immunofluorescence assays followed by confocal microscopy. Scale bar, 30 μm (lower left corner). Lower panels are digitally magnified views of the marked rectangles. For ease of visualization, a pseudo color (purple) was adopted for p300 staining."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "B", ",", "C", ")", "Tumor", "growth", "was", "monitored", "by", "non", "-", "invasive", "bioluminescence", "imaging", ".", "Tumors", "were", "resected", "at", "the", "experimental", "endpoint", ",", "and", "their", "weights", "(", "B", ")", "and", "volumes", "(", "C", ")", "were", "recorded", ".", "(", "G", ")", "Tumor", "xenograft", "serial", "sections", "were", "immunostained", "for", "pimonidazole", "(", "PDZ", ")", "adduct", ",", "MYB", ",", "HK2", ",", "GLUT3", ",", "and", "MCT4", "using", "specific", "antibodies", ".", "Images", "were", "taken", "at", "40X", "magnification", ".", "Scale", "bar", ",", "60", "μm", "(", "lower", "left", "corner", ")", ".", "The", "dashed", "lines", "demarcate", "the", "hypoxic", "region", "based", "on", "the", "PDZ", "staining", "pattern", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(B, C) Tumor growth was monitored by non-invasive bioluminescence imaging. Tumors were resected at the experimental endpoint, and their weights (B) and volumes (C) were recorded.(G) Tumor xenograft serial sections were immunostained for pimonidazole (PDZ) adduct, MYB, HK2, GLUT3, and MCT4 using specific antibodies. Images were taken at 40X magnification. Scale bar, 60 μm (lower left corner). The dashed lines demarcate the hypoxic region based on the PDZ staining pattern."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "U2OS", "cells", "were", "either", "mock", "or", "treated", "with", "10", "μM", "XL413", "for", "30", "minutes", ",", "at", "which", "point", "4", "mM", "HU", "was", "added", "and", "cells", "further", "incubated", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "then", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Reduction", "of", "phosphorylation", "of", "Ser40", "/", "41", "on", "MCM2", "is", "indicative", "of", "CDC7", "inhibition", "by", "XL413", ".", "Representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "B", ".", "U2OS", "cells", "were", "either", "mock", "treated", "or", "treated", "with", "10", "μM", "XL413", ",", "4", "mM", "HU", "or", "both", "for", "24", "hours", "before", "performing", "neutral", "comet", "assays", ".", "Representative", "images", "of", "comets", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μM", ".", "In", "the", "dot", "plots", "~", "800", "comets", "per", "each", "condition", "were", "analysed", ",", "means", "are", "indicated", "with", "a", "red", "line", "and", "their", "value", "shown", "above", "the", "plot", ".", "Data", "are", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "U2OS", "cells", "were", "either", "untreated", "or", "treated", "with", "10", "μM", "XL413", "or", "with", "5", "µM", "AZD6738", "alone", "or", "in", "combination", "and", ",", "where", "indicated", ",", "after", "30", "minutes", "4", "mM", "HU", "was", "added", "for", "a", "further", "2", "hours", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Total", "protein", "stain", "(", "TPS", ")", "as", "a", "loading", "control", ".", "Representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "U2OS", "cells", "were", "either", "untreated", "or", "treated", "with", "4", "mM", "HU", "for", "5", "hours", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "μM", "XL413", "which", "had", "either", "been", "added", "to", "cells", "30", "minutes", "prior", "(", "pre", "-", "treatment", ")", "or", "at", "the", "same", "time", "(", "co", "-", "treatment", ")", "to", "the", "addition", "of", "HU", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "and", "total", "protein", "stain", "(", "TPS", ")", "is", "displayed", "as", "a", "loading", "control", ".", "Representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. U2OS cells were either mock or treated with 10 μM XL413 for 30 minutes, at which point 4 mM HU was added and cells further incubated for the indicated times. Whole cell extracts were then analysed by western blotting with the indicated antibodies. Reduction of phosphorylation of Ser40/41 on MCM2 is indicative of CDC7 inhibition by XL413. Representative of two independent experiments.B. U2OS cells were either mock treated or treated with 10 μM XL413, 4 mM HU or both for 24 hours before performing neutral comet assays. Representative images of comets are shown. Scale bar = 100 μM. In the dot plots ~800 comets per each condition were analysed, means are indicated with a red line and their value shown above the plot. Data are from two independent experiments.C. U2OS cells were either untreated or treated with 10 μM XL413 or with 5 µM AZD6738 alone or in combination and, where indicated, after 30 minutes 4 mM HU was added for a further 2 hours. Whole cell extracts were analysed by western blotting with the indicated antibodies. Total protein stain (TPS) as a loading control. Representative of two independent experiments.D. U2OS cells were either untreated or treated with 4 mM HU for 5 hours in the presence or absence of 10 μM XL413 which had either been added to cells 30 minutes prior (pre-treatment) or at the same time (co-treatment) to the addition of HU. Whole cell extracts were analysed by western blotting with the indicated antibodies and total protein stain (TPS) is displayed as a loading control. Representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "CSK", "soluble", "and", "chromatin", "-", "enriched", "protein", "fractions", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "C", "-", "D", ".", "Flow", "cytometry", "analysis", "to", "assess", "levels", "of", "pS139", "Histone", "H2AX", "(", "c", ")", ".", "Histograms", "show", "the", "mono", "-", "parametric", "analysis", "of", "cell", "count", "against", "pS139", "Histone", "H2AX", "intensity", ".", "Histograms", "are", "overlaid", "to", "appreciate", "changes", "in", "pS139", "Histone", "H2AX", "intensity", "upon", "treatment", "(", "Red", "lines", ")", "relative", "to", "appropriate", "experimental", "baseline", "controls", "(", "Grey", "lines", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. CSK soluble and chromatin-enriched protein fractions were analysed by western blotting with the indicated antibodies. Representative of two independent experiments.C-D. Flow cytometry analysis to assess levels of pS139 Histone H2AX (c). Histograms show the mono-parametric analysis of cell count against pS139 Histone H2AX intensity. Histograms are overlaid to appreciate changes in pS139 Histone H2AX intensity upon treatment (Red lines) relative to appropriate experimental baseline controls (Grey lines). Data are representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "U2OS", "cells", "were", "labelled", "with", "EdU", "for", "30", "minutes", ",", "then", "EdU", "was", "washed", "and", "cells", "were", "further", "incubated", "for", "either", "1", "or", "2", "hours", "in", "presence", "of", "thymidine", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", "cells", "were", "fixed", "and", "proteins", "binding", "to", "EdU", "-", "labelled", "DNA", "captured", "by", "DNA", "mediated", "chromatin", "Pull", "down", "technique", "(", "DmChP", ")", ".", "Graphical", "experimental", "outline", "is", "shown", "above", "the", "analysis", "by", "western", "blot", "of", "relevant", "proteins", "in", "both", "input", "and", "captured", "material", ".", "B", ".", "U2OS", "cells", "were", "labelled", "with", "EdU", "for", "30", "minutes", "and", "then", "treated", "with", "4", "mM", "HU", "for", "2", "hours", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "μM", "XL413", ".", "Proteins", "binding", "to", "EdU", "-", "labelled", "DNA", "captured", "by", "DmChP", "were", "then", "analysed", "by", "western", "blot", "as", "above", ".", "C", ".", "As", "in", "panel", "B", "but", "incubation", "with", "HU", "was", "extended", "to", "24", "hours", ".", "Black", "arrow", "indicates", "MRE11", "electrophoretic", "-", "mobility", "shift", ".", "D", ".", "U2OS", "cells", "were", "either", "mock", "or", "treated", "with", "10", "μM", "XL413", "for", "30", "minutes", ",", "at", "which", "point", "4", "mM", "HU", "was", "added", "and", "cells", "incubated", "for", "further", "24", "hours", ".", "Extracts", "prepared", "from", "HU", "treated", "cells", "were", "then", "incubated", "in", "presence", "or", "absence", "of", "λ", "-", "phosphatase", ".", "Proteins", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "anti", "-", "MRE11", "antibodies", ".", "Total", "protein", "stain", "(", "TPS", ")", "is", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Black", "arrow", "indicates", "MRE11", "electrophoretic", "-", "mobility", "shift", ".", "E", ".", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "4", "mM", "HU", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "μM", "XL413", "for", "24", "hours", ".", "PCNA", "(", "green", ")", "and", "MRE11", "(", "red", ")", "were", "detected", "by", "immunofluorescence", ".", "Inset", "I", "-", "II", "represent", "enlargements", "of", "selected", "region", "of", "the", "merged", "images", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "PCNA", "and", "MRE11", "colocalization", "was", "assessed", "with", "ImageJ", "in", "~", "70", "randomly", "selected", "cells", "for", "each", "condition", "from", "four", "biological", "replicates", "and", "expressed", "as", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "student", "t", "test", "(", "*", "p", "˂", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. U2OS cells were labelled with EdU for 30 minutes, then EdU was washed and cells were further incubated for either 1 or 2 hours in presence of thymidine. At the indicated time points cells were fixed and proteins binding to EdU-labelled DNA captured by DNA mediated chromatin Pull down technique (DmChP). Graphical experimental outline is shown above the analysis by western blot of relevant proteins in both input and captured material.B. U2OS cells were labelled with EdU for 30 minutes and then treated with 4 mM HU for 2 hours in the presence or absence of 10 μM XL413. Proteins binding to EdU-labelled DNA captured by DmChP were then analysed by western blot as above.C. As in panel B but incubation with HU was extended to 24 hours. Black arrow indicates MRE11 electrophoretic-mobility shift.D. U2OS cells were either mock or treated with 10 μM XL413 for 30 minutes, at which point 4 mM HU was added and cells incubated for further 24 hours. Extracts prepared from HU treated cells were then incubated in presence or absence of λ-phosphatase. Proteins were analysed by western blotting with anti-MRE11 antibodies. Total protein stain (TPS) is used as a loading control. Black arrow indicates MRE11 electrophoretic-mobility shift.E. U2OS cells were treated with 4 mM HU in the presence or absence of 10 μM XL413 for 24 hours. PCNA (green) and MRE11 (red) were detected by immunofluorescence. Inset I-II represent enlargements of selected region of the merged images.F. Quantification of PCNA and MRE11 colocalization was assessed with ImageJ in ~70 randomly selected cells for each condition from four biological replicates and expressed as Pearson's correlation coefficient. Error bars represent SEM. Statistical significance was assessed by student t test (*p˂0.05"}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "MCF10A", "cells", "were", "either", "mock", "or", "treated", "with", "10", "μM", "XL413", "and", "labelled", "with", "IdU", "(", "red", ")", "for", "30", "minutes", "at", "which", "point", "4", "mM", "HU", "was", "added", "for", "2", "hours", ".", "HU", "was", "then", "washed", "off", "and", "cells", "labelled", "with", "CldU", "(", "green", ")", "in", "the", "continued", "presence", "or", "absence", "of", "XL413", ".", "A", "set", "of", "representative", "DNA", "fibres", "from", "each", "condition", "is", "shown", "and", "the", "percentage", "of", "IdU", "(", "red", ")", "only", "tracts", "is", "plotted", ".", "At", "least", "200", "replication", "forks", "were", "analysed", "for", "each", "condition", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "SEM", "from", "three", "biological", "repeats", "and", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "the", "student", "t", "test", "(", "*", "*", "p", "˂", "0", ".", "01B", ".", "U2OS", "cells", "were", "either", "mock", "or", "treated", "with", "10", "μM", "XL413", ",", "50", "μM", "Mirin", "or", "both", ",", "and", "labelled", "with", "IdU", "(", "red", ")", "for", "30", "minutes", "at", "which", "point", "4", "mM", "HU", "was", "added", "for", "2", "hours", ".", "HU", "was", "then", "washed", "off", "and", "cells", "labelled", "with", "CldU", "(", "green", ")", "in", "the", "continued", "presence", "or", "absence", "of", "XL413", "and", "/", "or", "Mirin", ".", "A", "set", "of", "representative", "DNA", "fibres", "from", "each", "condition", "is", "shown", "and", "the", "percentage", "of", "IdU", "(", "red", ")", "only", "tracts", "is", "plotted", ".", "At", "least", "200", "replication", "forks", "were", "analysed", "for", "each", "condition", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "SEM", "from", "four", "biological", "repeats", "and", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "the", "student", "t", "test", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "˂", "0", ".", "01C", ".", "U2OS", "cells", "were", "either", "mock", "or", "pretreated", "for", "the", "indicated", "times", "with", "10", "μM", "XL413", ",", "50", "μM", "Mirin", "or", "both", ",", "and", "labelled", "with", "CldU", "(", "red", ")", ".", "Then", "50", "nM", "CPT", "was", "added", "and", "cells", "labelled", "with", "of", "IdU", "(", "green", ")", "for", "further", "30", "minutes", ".", "A", "set", "of", "representative", "DNA", "fibres", "from", "each", "condition", "is", "shown", "and", "the", "IdU", "/", "CIdU", "tract", "length", "ratio", "is", "plotted", ".", "The", "box", "extends", "from", "the", "25th", "to", "the", "75th", "percentile", "with", "the", "line", "in", "the", "box", "representing", "the", "median", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "10", "-", "90", "percentiles", "with", "data", "outside", "this", "range", "for", "individual", "outliers", "being", "plotted", "as", "dots", ".", "At", "least", "100", "replication", "forks", "were", "analyzed", "for", "each", "condition", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "one", "way", "ANOVA", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "and", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "post", "test", "(", "ns", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "are", "related", "to", "the", "experiment", "shown", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "a", "second", "independent", "experiment", ".", "D", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "(", "siLuc", ")", "or", "MRE11", "targeting", "siRNA", "(", "siMRE11", ")", ".", "After", "48", "hours", "cells", "were", "either", "mock", "or", "pretreated", "with", "10", "μM", "XL413", "and", "labelled", "with", "CldU", "(", "red", ")", "for", "30", "minutes", ".", "Where", "indicated", "50", "nM", "CPT", "was", "added", "and", "then", "cells", "were", "labelled", "with", "IdU", "(", "green", ")", ".", "A", "set", "of", "representative", "DNA", "fibres", "from", "each", "condition", "is", "shown", "and", "the", "IdU", "/", "CIdU", "tract", "length", "ratio", "is", "plotted", ".", "The", "box", "extends", "from", "the", "25th", "to", "the", "75th", "percentile", "with", "the", "line", "in", "the", "box", "representing", "the", "median", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "10", "-", "90", "percentileswith", "data", "outside", "this", "range", "for", "individual", "outliers", "being", "plotted", "as", "dots", ".", "At", "least", "100", "replication", "forks", "were", "analyzed", "for", "each", "condition", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "one", "way", "ANOVA", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "and", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "post", "test", "(", "ns", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "are", "related", "to", "the", "experiment", "shown", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "a", "second", "independent", "experiment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. MCF10A cells were either mock or treated with 10 μM XL413 and labelled with IdU (red) for 30 minutes at which point 4 mM HU was added for 2 hours. HU was then washed off and cells labelled with CldU (green) in the continued presence or absence of XL413. A set of representative DNA fibres from each condition is shown and the percentage of IdU (red) only tracts is plotted. At least 200 replication forks were analysed for each condition. Error bars represent the SEM from three biological repeats and statistical significance was assessed by the student t test (** p˂0.01B. U2OS cells were either mock or treated with 10 μM XL413, 50 μM Mirin or both, and labelled with IdU (red) for 30 minutes at which point 4 mM HU was added for 2 hours. HU was then washed off and cells labelled with CldU (green) in the continued presence or absence of XL413 and/or Mirin. A set of representative DNA fibres from each condition is shown and the percentage of IdU (red) only tracts is plotted. At least 200 replication forks were analysed for each condition. Error bars represent the SEM from four biological repeats and statistical significance was assessed by the student t test (*p<0.05, ** p˂0.01C. U2OS cells were either mock or pretreated for the indicated times with 10 μM XL413, 50 μM Mirin or both, and labelled with CldU (red). Then 50 nM CPT was added and cells labelled with of IdU (green) for further 30 minutes. A set of representative DNA fibres from each condition is shown and the IdU/CIdU tract length ratio is plotted. The box extends from the 25th to the 75th percentile with the line in the box representing the median. Whiskers indicate the 10-90 percentiles with data outside this range for individual outliers being plotted as dots. At least 100 replication forks were analyzed for each condition. P values were calculated using one way ANOVA Kruskal-Wallis test and Dunn's multiple comparison post test (ns, not significant, **** p<0.0001) and are related to the experiment shown. Similar results were obtained in a second independent experiment.D. U2OS cells were transfected with control (siLuc) or MRE11 targeting siRNA (siMRE11). After 48 hours cells were either mock or pretreated with 10 μM XL413 and labelled with CldU (red) for 30 minutes. Where indicated 50 nM CPT was added and then cells were labelled with IdU (green). A set of representative DNA fibres from each condition is shown and the IdU/CIdU tract length ratio is plotted. The box extends from the 25th to the 75th percentile with the line in the box representing the median. Whiskers indicate the 10-90 percentileswith data outside this range for individual outliers being plotted as dots. At least 100 replication forks were analyzed for each condition. P values were calculated using one way ANOVA Kruskal-Wallis test and Dunn's multiple comparison post test (ns, not significant, **** p<0.0001) and are related to the experiment shown. Similar results were obtained in a second independent experiment."}
{"words": ["Figure", "5B", ".", "Representative", "western", "blot", "of", "indicated", "proteins", "obtained", "from", "whole", "cell", "extracts", ".", "pS40", "/", "41", "on", "MCM2", "indicates", "effective", "CDC7", "inhibition", "by", "XL413", ".", "C", ".", "Ratios", "of", "IdU", "/", "CldU", "tracts", "length", "is", "plotted", ".", "The", "box", "extends", "from", "the", "25th", "to", "the", "75th", "percentile", "with", "the", "line", "in", "the", "box", "representing", "the", "median", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "10", "-", "90", "percentiles", "with", "data", "outside", "this", "range", "for", "individual", "outliers", "being", "plotted", "as", "dots", ".", "Mean", "values", "of", "IdU", "/", "CldU", "ratios", "are", "indicated", "above", "the", "plot", ".", "At", "least", "100", "replication", "forks", "were", "analyzed", "for", "each", "condition", ".", "D", ".", "The", "mean", "values", "of", "IdU", "/", "CldU", "tract", "length", "ratios", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "plotted", ",", "with", "the", "standard", "deviation", "(", "blue", "lines", ")", "and", "mean", "(", "red", "line", ")", ".", "Statistical", "analysis", ":", "student", "t", "-", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001E", ".", "Electron", "micrographs", "of", "representative", "replication", "forks", "from", "U2OS", "cells", "A", "regressed", "arm", "is", "labelled", ":", "P", "=", "parental", "strand", ";", "D", "=", "daughter", "strand", ";", "and", "R", "=", "reversed", "fork", ";", "the", "four", "-", "way", "junction", "at", "the", "reversed", "fork", "is", "magnified", "in", "the", "inset", ".", "The", "red", "arrows", "indicates", "single", "stranded", "DNA", "at", "the", "fork", ".", "Scale", "bar", "is", "200", " ", "nm", "(", " ", "=", " ", "460", " ", "bp", ")", ",", "100", " ", "nm", "(", " ", "=", " ", "230", " ", "bp", ")", "in", "the", "inset", ".", "F", ".", "Frequency", "of", "reversed", "replication", "forks", "isolated", "from", "mock", "-", "depleted", "(", "siLuc", ")", "and", "BRCA2", "-", "depleted", "(", "siBRCA2", ")", "U2OS", "cells", "upon", "5", "hour", "treatment", "with", "4", "mM", "HU", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "10", "μM", "XL413", ".", "The", "number", "of", "replication", "intermediates", "analyzed", "is", "indicated", "in", "parentheses", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "two", "independent", "experiments", "(", "Appendix", "TableG", ".", "Amount", "of", "ssDNA", "length", "at", "the", "junction", "(", "Red", "arrows", "in", "Figure", "4D", ")", "in", "siLuc", "and", "siBRCA2", "U2OS", "cells", "treated", "with", "4", "mM", "of", "HU", "for", "5", "hours", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "XL413", ".", "N", "indicates", "the", "number", "of", "forks", "observed", ",", "and", "only", "molecules", "with", "detectable", "ssDNA", "stretches", "are", "included", "in", "the", "analysis", ".", "The", "lines", "show", "the", "mean", "length", "of", "ssDNA", "regions", "at", "the", "fork", "and", "the", "value", "is", "displayed", "above", "the"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B. Representative western blot of indicated proteins obtained from whole cell extracts. pS40/41 on MCM2 indicates effective CDC7 inhibition by XL413.C. Ratios of IdU/CldU tracts length is plotted. The box extends from the 25th to the 75th percentile with the line in the box representing the median. Whiskers indicate the 10-90 percentiles with data outside this range for individual outliers being plotted as dots. Mean values of IdU/CldU ratios are indicated above the plot. At least 100 replication forks were analyzed for each condition.D. The mean values of IdU/CldU tract length ratios from three independent experiments are plotted, with the standard deviation (blue lines) and mean (red line). Statistical analysis: student t-test; ns, not significant; **P<0.01, ***P < 0.001E. Electron micrographs of representative replication forks from U2OS cells A regressed arm is labelled: P=parental strand; D=daughter strand; and R=reversed fork; the four-way junction at the reversed fork is magnified in the inset. The red arrows indicates single stranded DNA at the fork. Scale bar is 200 nm ( = 460 bp), 100 nm ( = 230 bp) in the inset.F. Frequency of reversed replication forks isolated from mock-depleted (siLuc) and BRCA2-depleted (siBRCA2) U2OS cells upon 5 hour treatment with 4 mM HU in the presence and absence of 10 μM XL413. The number of replication intermediates analyzed is indicated in parentheses. Similar results were obtained in two independent experiments (Appendix TableG. Amount of ssDNA length at the junction (Red arrows in Figure 4D) in siLuc and siBRCA2 U2OS cells treated with 4 mM of HU for 5 hours in the presence or absence of XL413. N indicates the number of forks observed, and only molecules with detectable ssDNA stretches are included in the analysis. The lines show the mean length of ssDNA regions at the fork and the value is displayed above the plot"}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Representative", "metaphase", "spread", "from", "BRCA2", "depleted", "U2OS", "cell", "treated", "with", "HU", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μM", ".", "Arrows", "indicate", "the", "chromosomes", "enlarged", "in", "the", "insets", ",", "two", "of", "which", "show", "chromatid", "breaks", "(", "*", "B", "-", "C", ".", "The", "graphs", "show", "the", "average", "number", "of", "chromatid", "breaks", "per", "spread", ".", "In", "each", "experiment", "30", "chromosome", "spreads", "for", "each", "condition", "were", "analysed", "and", "three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "assessed", "by", "student", "t", "test", "(", "*", "*", "p", "˂", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001D", "-", "E", ".", "U2OS", "and", "AS", "-", "CDC7", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "(", "siCon", ")", "or", "BRCA2", "(", "siBRCA2", ")", "targeting", "siRNAs", ".", "48", "hours", "post", "transfection", "cells", "were", "either", "mock", "-", "treated", "or", "treated", "with", "10", "μM", "XL413", "or", "10", "μM", "3MB", "-", "PP1", "respectively", "for", "24", "hours", "with", "Nocodazole", "added", "for", "the", "last", "16", "hours", "of", "the", "experiment", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "number", "of", "chromatid", "breaks", "per", "spread", ".", "In", "each", "experiment", "30", "chromosome", "spreads", "for", "each", "condition", "were", "analysed", "and", "three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "assessed", "by", "student", "t", "test", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Representative metaphase spread from BRCA2 depleted U2OS cell treated with HU. Scale bar = 5 μM. Arrows indicate the chromosomes enlarged in the insets, two of which show chromatid breaks (*B-C. The graphs show the average number of chromatid breaks per spread. In each experiment 30 chromosome spreads for each condition were analysed and three independent experiments were performed. Error bars represent SEM. Statistical significance assessed by student t test (** p˂0.01, *** p<0.001D-E. U2OS and AS-CDC7 cells were transfected with control (siCon) or BRCA2 (siBRCA2) targeting siRNAs. 48 hours post transfection cells were either mock-treated or treated with 10 μM XL413 or 10 μM 3MB-PP1 respectively for 24 hours with Nocodazole added for the last 16 hours of the experiment. The graph shows the average number of chromatid breaks per spread. In each experiment 30 chromosome spreads for each condition were analysed and three independent experiments were performed. Error bars represent SEM. Statistical significance assessed by student t test (*p<0.05, *** p<0.001"}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "-", "stained", "cross", "section", "of", "a", "human", "liver", "slice", ".", "Scale", "bar", "is", "representative", "of", "A", "-", "F", ".", "Image", "is", "also", "used", "in", "Fig", ".", "S3A", ".", "B", ".", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "in", "an", "immediate", "adjacent", "tissue", "slice", "from", "A", ".", "The", "image", "displays", "a", "heatmap", "gradient", "of", "intensity", "from", "white", "(", "least", "abundant", ")", "to", "red", "(", "most", "abundant", ")", "which", "is", "representative", "of", "B", ",", "D", ",", "and", "F", ".", "C", ".", "H", "&", "E", "-", "stained", "cross", "section", "of", "a", "human", "lung", "slice", ".", "Image", "is", "also", "used", "in", "Fig", ".", "S3D", ".", "D", ".", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "in", "an", "immediate", "adjacent", "tissue", "slice", "from", "C", ".", "E", ".", "H", "&", "E", "-", "stained", "cross", "section", "of", "frontal", "cortical", "region", "of", "a", "human", "brain", "tissue", ".", "Image", "is", "also", "used", "in", "Fig", ".", "S3G", ".", "F", ".", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "in", "an", "immediate", "adjacent", "tissue", "slice", "from", "E", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "relative", "abundance", "of", "total", "glycogen", "calculated", "from", "the", "sum", "of", "CL3", "-", "CL18", "in", "human", "liver", ",", "lung", ",", "and", "brain", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "region", ")", ".", "*", "0", ".", "01", " ", "<", " ", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "for", "total", "glycogen", ".", "H", ".", "Glycogen", "structure", "represented", "by", "normalized", "chain", "length", "distribution", "(", "ratio", "to", "CL3", ")", "of", "each", "human", "liver", ",", "lung", "and", "brain", "from", "G", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "region", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Hematoxylin and eosin (H&E)-stained cross section of a human liver slice. Scale bar is representative of A-F. Image is also used in Fig. S3A. B. Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) in an immediate adjacent tissue slice from A. The image displays a heatmap gradient of intensity from white (least abundant) to red (most abundant) which is representative of B, D, and F. C. H&E-stained cross section of a human lung slice. Image is also used in Fig. S3D. D. Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) in an immediate adjacent tissue slice from C. E.H&E-stained cross section of frontal cortical region of a human brain tissue. Image is also used in Fig. S3G. F. Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) in an immediate adjacent tissue slice from E. G. Quantification of relative abundance of total glycogen calculated from the sum of CL3-CL18 in human liver, lung, and brain. Values are presented as mean +/- standard error (n=3 technical replicates per region). *0.01 < P < 0.05; ***P < 0.001; ****P<0.0001, analyzed by one-way ANOVA with Tukey's multiple comparison for total glycogen. H. Glycogen structure represented by normalized chain length distribution (ratio to CL3) of each human liver, lung and brain from G. Values are presented as mean +/- standard error (n=3 technical replicates per region)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "-", "stained", "cross", "section", "of", "adenocarcinoma", "of", "the", "prostate", ",", "lung", "squamous", "cell", "carcinoma", "(", "LUSC", ")", ",", "lung", "adenocarcinoma", "(", "LUAD", ")", ",", "and", "Ewing", "sarcoma", "(", "ES", ")", "of", "the", "abdomen", "tumor", ".", "Annotated", "regions", "are", "T", "-", "tumor", ",", "S", "-", "stroma", ",", "D", "/", "G", "-", "duct", "/", "glandular", ",", "and", "A", "-", "adipose", "tissue", ".", "Scale", "bar", "is", "representative", "of", "A", "and", "B", ".", "Images", "are", "also", "used", "in", "Fig", ".", "S4A", ",", "5D", "and", "S6G", ".", "B", ".", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "from", "an", "immediate", "adjacent", "resected", "tissue", "section", "shown", "in", "A", ".", "The", "image", "displays", "a", "heatmap", "gradient", "of", "intensity", "with", "white", "(", "least", "abundant", ")", "to", "red", "(", "most", "abundant", ")", ".", "Images", "are", "also", "used", "in", "Fig", ".", "S4E", ",", "5D", ",", "and", "S6G", ".", "C", ".", "Glycogen", "structure", "defined", "by", "distribution", "of", "released", "glucose", "polymers", "as", "representation", "of", "glycogen", "chain", "length", "(", "CL", ")", "distribution", "from", "tumor", "regions", "shown", "in", "A", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "region", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Hematoxylin and eosin (H&E)-stained cross section of adenocarcinoma of the prostate, lung squamous cell carcinoma (LUSC), lung adenocarcinoma (LUAD), and Ewing sarcoma (ES) of the abdomen tumor. Annotated regions are T-tumor, S-stroma, D/G-duct/glandular, and A-adipose tissue. Scale bar is representative of A and B. Images are also used in Fig. S4A, 5D and S6G. B. Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) from an immediate adjacent resected tissue section shown in A. The image displays a heatmap gradient of intensity with white (least abundant) to red (most abundant). Images are also used in Fig. S4E, 5D, and S6G. C. Glycogen structure defined by distribution of released glucose polymers as representation of glycogen chain length (CL) distribution from tumor regions shown in A. Values are presented as mean +/- standard error (n=3 technical replicates per region)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "(", "Left", ")", "Hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "-", "stained", "cross", "section", "of", "an", "Ewing", "sarcoma", "(", "ES", ")", "of", "the", "shoulder", "tumor", ".", "Annotated", "regions", "are", "annotated", "as", "T", "-", "tumor", "and", "M", "-", "muscle", ".", "(", "Right", ")", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "from", "an", "immediate", "adjacent", "resected", "tissue", "section", ".", "The", "image", "displays", "a", "heatmap", "gradient", "of", "intensity", "from", "white", "(", "least", "abundant", ")", "to", "red", "(", "most", "abundant", ")", ".", "Scale", "bar", "and", "intensity", "gradient", "below", "are", "representative", "of", "all", "images", "in", "A", "-", "E", ".", "B", ".", "(", "Left", ")", "H", "&", "E", "stained", "cross", "section", "of", "an", "ES", "of", "the", "chest", "wall", "tumor", ".", "Annotated", "regions", "are", "annotated", "as", "T", "-", "tumor", "and", "N", "-", "necrosis", ".", "(", "Right", ")", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "from", "an", "immediate", "adjacent", "resected", "tissue", "section", ".", "C", ".", "(", "Left", ")", "H", "&", "E", "stained", "cross", "section", "of", "an", "ES", "of", "the", "rib", "tumor", ".", "Annotated", "regions", "are", "annotated", "as", "T", "-", "tumor", "and", "N", "-", "necrosis", ".", "(", "Right", ")", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "from", "an", "immediate", "adjacent", "resected", "tissue", "section", ".", "D", ".", "(", "Left", ")", "H", "&", "E", "stained", "cross", "section", "of", "an", "ES", "of", "the", "abdomen", "tumor", ".", "Annotated", "regions", "are", "T", "-", "tumor", ",", "S", "-", "stroma", ",", "and", "A", "-", "adipose", "tissue", ".", "(", "Right", ")", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "from", "an", "immediate", "adjacent", "resected", "tissue", "section", ".", "E", ".", "(", "Left", ")", "H", "&", "E", "stained", "cross", "section", "of", "an", "ES", "of", "the", "bladder", "tumor", ".", "Annotated", "regions", "are", "T", "-", "tumor", "and", "S", "-", "stroma", ".", "(", "Right", ")", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "from", "an", "immediate", "adjacent", "resected", "tissue", "section", ".", "F", ".", "Magnified", "H", "&", "E", "cross", "section", "of", "(", "top", ",", "left", ")", "tumor", ",", "and", "(", "top", ",", "right", ")", "muscle", "tissue", "from", "ES", "rib", "with", "magnified", "image", "of", "CL7", "(", "m", "/", "z", "=", "1175", ")", "of", "(", "bottom", ",", "left", ")", "tumor", ",", "and", "(", "bottom", ",", "right", ")", "muscle", "tissues", ".", "G", ".", "Magnified", "H", "&", "E", "cross", "section", "of", "(", "top", ",", "left", ")", "tumor", ",", "(", "top", ",", "middle", ")", "stroma", ",", "and", "(", "top", ",", "right", ")", "adipose", "tissues", "from", "ES", "abdomen", "with", "magnified", "image", "of", "CL7", "(", "m", "/", "z", "=", "1175", ")", "of", "(", "bottom", ",", "left", ")", "tumor", ",", "(", "bottom", ",", "middle", ")", "stroma", "and", "(", "bottom", ",", "right", ")", "adipose", "tissues", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. (Left) Hematoxylin and eosin (H&E)-stained cross section of an Ewing sarcoma (ES) of the shoulder tumor. Annotated regions are annotated as T-tumor and M-muscle. (Right) Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) from an immediate adjacent resected tissue section. The image displays a heatmap gradient of intensity from white (least abundant) to red (most abundant). Scale bar and intensity gradient below are representative of all images in A-E. B. (Left) H&E stained cross section of an ES of the chest wall tumor. Annotated regions are annotated as T-tumor and N-necrosis. (Right) Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) from an immediate adjacent resected tissue section. C. (Left) H&E stained cross section of an ES of the rib tumor. Annotated regions are annotated as T-tumor and N-necrosis. (Right) Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) from an immediate adjacent resected tissue section. D. (Left) H&E stained cross section of an ES of the abdomen tumor. Annotated regions are T-tumor, S-stroma, and A-adipose tissue. (Right) Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) from an immediate adjacent resected tissue section. E. (Left) H&E stained cross section of an ES of the bladder tumor. Annotated regions are T-tumor and S-stroma. (Right) Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) from an immediate adjacent resected tissue section. F. Magnified H&E cross section of (top, left) tumor, and (top, right) muscle tissue from ES rib with magnified image of CL7 (m/z=1175) of (bottom, left) tumor, and (bottom, right) muscle tissues. G. Magnified H&E cross section of (top, left) tumor, (top, middle) stroma, and (top, right) adipose tissues from ES abdomen with magnified image of CL7 (m/z=1175) of (bottom, left) tumor, (bottom, middle) stroma and (bottom, right) adipose tissues."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "(", "Left", ")", "Hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "stained", "cross", "section", "of", "a", "normal", "human", "tibia", "(", "Top", ")", "resected", "at", "the", "same", "time", "as", "the", "Ewing", "sarcoma", "(", "ES", ")", "of", "the", "tibia", "tumor", "(", "Bottom", ")", ".", "Annotated", "regions", "are", "CT", "-", "connective", "tissue", ",", "B", "-", "decalcified", "bone", ",", "BM", "-", "bone", "marrow", ",", "T", "-", "tumor", ",", "and", "S", "-", "stroma", ".", "(", "Right", ")", "Spatial", "distribution", "and", "relative", "abundance", "of", "glycogen", "(", "represented", "by", "CL7", ")", "from", "an", "immediate", "adjacent", "resected", "tissue", "section", "shown", "in", "A", ".", "The", "image", "displays", "a", "heatmap", "gradient", "of", "intensity", "with", "white", "(", "least", "abundant", ")", "to", "red", "(", "most", "abundant", ")", ".", "Scale", "bar", "and", "intensity", "gradient", "below", "are", "representative", "of", "all", "images", "in", "A", ".", "B", ".", "Glycogen", "structure", "defined", "by", "distribution", "of", "released", "glucose", "polymers", "as", "representation", "of", "glycogen", "chain", "length", "(", "CL", ")", "distribution", "from", "normal", "tibia", "in", "A", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "region", ")", ".", "#", "0", ".", "01", " ", "<", " ", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "analyzed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "for", "each", "glycogen", "chain", "length", ".", "C", ".", "Glycogen", "structure", "defined", "by", "distribution", "of", "released", "glucose", "polymers", "as", "representation", "of", "glycogen", "chain", "length", "(", "CL", ")", "distribution", "from", "the", "ES", "of", "the", "tibia", "tumor", "in", "A", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "region", ")", ".", "*", "*", "0", ".", "001", " ", "<", " ", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "analyzed", "by", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "for", "each", "glycogen", "chain", "length", ".", "F", ".", "In", "vivo", "tumor", "growth", "of", "A673", "EV", "or", "GYS1", "-", "KO", "injected", "in", "the", "flanks", "of", "athymic", "nude", "mice", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "(", "n", "=", "8", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "analyzed", "by", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "G", ".", "Half", "maximal", "effective", "concentration", "(", "EC50", ")", "of", "the", "small", "molecular", "inhibitor", "guaiacol", "in", "A673", "cells", "in", "vitro", ".", "J", ".", "Spatial", "distribution", "of", "phosphorylated", "CL5", "of", "human", "tibia", "(", "top", ")", "and", "tibial", "ES", "tumor", "(", "bottom", ")", ".", "The", "image", "displays", "a", "heatmap", "gradient", "of", "intensity", "with", "black", "(", "least", "abundant", ")", "to", "yellow", "(", "most", "abundant", ")", ".", "K", ".", "Phosphorylated", "chain", "length", "distribution", "in", "normal", "human", "tibia", "and", "tibial", "ES", "tumor", "in", "J", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "region", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "analyzed", "by", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "for", "each", "glycogen", "chain", "length", ".", "N", ".", "Representatives", "image", "of", "immunohistochemical", "staining", "of", "laforin", "in", "ES", "patient", "samples", "with", "annotation", "between", "tumor", "(", "T", ")", "and", "stroma", "(", "S", ")", "tissues", ".", "Tissues", "were", "scanned", "digitally", "using", "the", "Axio", "Scan", ".", "Z1", "side", "scanner", ".", "Scale", "bar", "is", "shown", "below", "the", "image", ".", "O", ".", "Quantification", "of", "immunohistochemical", "laforin", "staining", "between", "normal", "tissue", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "region", ")", ",", "tibial", "ES", "tumor", "(", "n", "=", "7", "technical", "replicates", "per", "region", ")", ",", "and", "stroma", "of", "five", "ES", "tissues", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", ".", "*", "*", "0", ".", "001", " ", "<", " ", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0", ";", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", ".", "P", ".", "(", "Top", ")", "Western", "blot", "showing", "confirmation", "of", "laforin", "overexpression", "in", "A673", "xenograft", "tumors", ".", "(", "Bottom", ")", "Tumor", "growth", "of", "xenografts", "of", "A673", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "and", "laforin", "overexpression", "(", "LAOE", ")", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "(", "n", "=", "8", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "analyzed", "by", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. (Left) Hematoxylin and eosin (H&E) stained cross section of a normal human tibia (Top) resected at the same time as the Ewing sarcoma (ES) of the tibia tumor (Bottom). Annotated regions are CT-connective tissue, B-decalcified bone, BM-bone marrow, T-tumor, and S-stroma. (Right) Spatial distribution and relative abundance of glycogen (represented by CL7) from an immediate adjacent resected tissue section shown in A. The image displays a heatmap gradient of intensity with white (least abundant) to red (most abundant). Scale bar and intensity gradient below are representative of all images in A. B. Glycogen structure defined by distribution of released glucose polymers as representation of glycogen chain length (CL) distribution from normal tibia in A. Values are presented as mean +/- standard error (n=3 technical replicates per region). #0.01 < P < 0.05; ****P<0.0001, analyzed by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparison for each glycogen chain length.C. Glycogen structure defined by distribution of released glucose polymers as representation of glycogen chain length (CL) distribution from the ES of the tibia tumor in A. Values are presented as mean +/- standard error (n=3 technical replicates per region). **0.001 < P < 0.01; ****P<0.0001, analyzed by two-tailed t-test for each glycogen chain length.F. In vivo tumor growth of A673 EV or GYS1-KO injected in the flanks of athymic nude mice. Values are presented as mean +/- standard error (n=8 biological replicates per group). ****P<0.0001, analyzed by two-tailed t-test.G. Half maximal effective concentration (EC50) of the small molecular inhibitor guaiacol in A673 cells in vitro.J. Spatial distribution of phosphorylated CL5 of human tibia (top) and tibial ES tumor (bottom). The image displays a heatmap gradient of intensity with black (least abundant) to yellow (most abundant). K. Phosphorylated chain length distribution in normal human tibia and tibial ES tumor in J. Values are presented as mean +/- standard error (n=3 technical replicates per region). ****P<0.0001, analyzed by two-tailed t-test for each glycogen chain length.N. Representatives image of immunohistochemical staining of laforin in ES patient samples with annotation between tumor (T) and stroma (S) tissues. Tissues were scanned digitally using the Axio Scan.Z1 side scanner. Scale bar is shown below the image. O. Quantification of immunohistochemical laforin staining between normal tissue (n=3 technical replicates per region), tibial ES tumor (n=7 technical replicates per region), and stroma of five ES tissues (n=7). Values are presented as mean +/- standard error. **0.001 < P < 0.0; ***P < 0.001; ****P<0.0001, analyzed by one-way ANOVA with Tukey's multiple comparison.P. (Top) Western blot showing confirmation of laforin overexpression in A673 xenograft tumors. (Bottom) Tumor growth of xenografts of A673 empty vector (EV) and laforin overexpression (LAOE). Values are presented as mean +/- standard error (n=8 biological replicates per group). ****P<0.0001, analyzed by two-tailed t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "FLAG", "and", "FLAG", "-", "tagged", "TEX264", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ".", "Inputs", "(", "20", "%", "of", "the", "lysates", ")", "and", "immunoprecipitates", "(", "from", "80", "%", "of", "the", "lysates", ")", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "WT", "or", "mutated", "TEX264", "-", "FLAG", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "and", "detected", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "TEX264", "-", "GFP", "or", "its", "mutant", "were", "cultured", "in", "starvation", "media", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Bars", ":", "10", "µm", "and", "1", "µm", "(", "insets", ")", "(", "D", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "TEX264", "puncta", "per", "cell", ".", "Solid", "bars", "indicate", "the", "medians", ",", "boxes", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ",", "and", "whiskers", "the", "0th", "to", "100th", "percentile", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Data", "were", "collected", "from", "48", "cells", "for", "each", "cell", "type", "(", "E", ")", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "WT", "and", "TEX264", "-", "KO", "HeLa", "cells", "(", "with", "or", "without", "the", "indicated", "TEX264", "mutants", "with", "a", "C", "-", "terminal", "FLAG", "tag", ")", "stably", "expressing", "the", "ER", "-", "phagy", "reporter", "(", "ss", "-", "RFP", "-", "GFP", "-", "KDEL", ")", "were", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "doxycycline", "for", "24", "h", "to", "induce", "the", "reporter", ".", "After", "doxycycline", "was", "removed", ",", "cells", "were", "cultured", "in", "starvation", "medium", "lacking", "amino", "acids", "and", "serum", "for", "9", "h", "(", "F", ")", ".", "The", "band", "intensities", "of", "RFP", "and", "RFP", "-", "GFP", "were", "quantified", "and", "the", "ratio", "of", "RFP", ":", "RFP", "-", "GFP", "(", "normalized", "to", "WT", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) HEK293T cells transiently expressing FLAG and FLAG-tagged TEX264 were subjected to immunoprecipitation (IP). Inputs (20% of the lysates) and immunoprecipitates (from 80% of the lysates) were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies.(C) HEK293T cells transiently expressing WT or mutated TEX264-FLAG were subjected to immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody and detected with the indicated antibodies.(D and E) MEFs stably expressing TEX264-GFP or its mutant were cultured in starvation media and immunostained with an anti-LC3 antibody. Bars: 10 µm and 1 µm (insets) (D). Quantification of the number of TEX264 puncta per cell. Solid bars indicate the medians, boxes the interquartile range (25th to 75th percentile), and whiskers the 0th to 100th percentile. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test. Data were collected from 48 cells for each cell type (E).(F and G) WT and TEX264-KO HeLa cells (with or without the indicated TEX264 mutants with a C-terminal FLAG tag) stably expressing the ER-phagy reporter (ss-RFP-GFP-KDEL) were cultured in the presence of doxycycline for 24 h to induce the reporter. After doxycycline was removed, cells were cultured in starvation medium lacking amino acids and serum for 9 h (F). The band intensities of RFP and RFP-GFP were quantified and the ratio of RFP:RFP-GFP (normalized to WT) is shown. Data represent the mean ± standard error of the mean (SEM) of three independent experiments. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test (G)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "and", "B", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "TEX264", "-", "GFP", "were", "cultured", "in", "starvation", "media", "with", "or", "without", "bafilomycin", "A1", "(", "Baf", "A1", ")", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "pTEX264", "and", "anti", "-", "LC3", "antibodies", ".", "Bars", ":", "10", "µm", "and", "1", "µm", "(", "insets", ")", "(", "A", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "pTEX264", "puncta", "per", "cell", ".", "Solid", "bars", "indicate", "the", "medians", ",", "boxes", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ",", "and", "whiskers", "the", "0th", "to", "100th", "percentile", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Data", "were", "collected", "from", "35", "cells", "for", "each", "cell", "type", "(", "B", ")", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "250", "nM", "Torin", "1", "and", "Baf", "A1", "for", "16", "h", ",", "and", "cell", "homogenates", "were", "subjected", "to", "an", "OptiPrep", "membrane", "flotation", "analysis", ".", "(", "D", ",", "E", "and", "F", ")", "WT", ",", "ATG3", "-", "KO", ",", "and", "FIP200", "-", "KO", "HeLa", "cells", "were", "cultured", "in", "starvation", "media", "lacking", "amino", "acids", "and", "serum", "with", "or", "without", "Baf", "A1", "for", "1", "or", "5", "h", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", "(", "D", ")", ".", "Relative", "changes", "of", "the", "ratio", "of", "band", "intensities", "of", "phosphorylated", "TEX264", "to", "HSP90", "and", "total", "TEX264", "during", "starvation", "are", "shown", "(", "E", "and", "F", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A and B) MEFs stably expressing TEX264-GFP were cultured in starvation media with or without bafilomycin A1 (Baf A1) and immunostained with anti-pTEX264 and anti-LC3 antibodies. Bars: 10 µm and 1 µm (insets) (A). Quantification of the number of pTEX264 puncta per cell. Solid bars indicate the medians, boxes the interquartile range (25th to 75th percentile), and whiskers the 0th to 100th percentile. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test. Data were collected from 35 cells for each cell type (B).(C) HeLa cells were treated with 250 nM Torin 1 and Baf A1 for 16 h, and cell homogenates were subjected to an OptiPrep membrane flotation analysis.(D, E and F) WT, ATG3-KO, and FIP200-KO HeLa cells were cultured in starvation media lacking amino acids and serum with or without Baf A1 for 1 or 5 h. Cell lysates were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies (D). Relative changes of the ratio of band intensities of phosphorylated TEX264 to HSP90 and total TEX264 during starvation are shown (E and F). Data represent the mean ± SEM of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "cultured", "with", "20", "nM", "CK1", "inhibitor", "(", "D4476", ")", "or", "CK2", "inhibitor", "(", "CX4945", ")", "for", "3", "h", ",", "followed", "by", "starvation", "(", "with", "the", "inhibitors", ")", "for", "3", "h", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "Recombinant", "TEX264", "-", "FLAG", "was", "incubated", "with", "or", "without", "CK2", "and", "the", "CK2", "inhibitor", "(", "CX4945", ")", "in", "the", "presence", "of", "200", "µM", "ATP", "for", "1", "h", ".", "(", "C", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "TEX264", "-", "FLAG", "and", "one", "of", "the", "three", "Halo", "-", "CK2A", "isoforms", "or", "Halo", "-", "CK2B", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "and", "detected", "with", "anti", "-", "Halo", "and", "anti", "-", "FLAG", "antibodies", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "WT", "or", "TEX264", "-", "FLAG", "mutants", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ".", "Inputs", "(", "20", "%", "of", "the", "lysates", ")", "and", "immunoprecipitates", "(", "from", "80", "%", "of", "the", "lysates", ")", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", "(", "D", ")", ".", "The", "band", "intensities", "in", "the", "IP", "fractions", "were", "quantified", ",", "and", "the", "phospho", "-", "serine", ":", "FLAG", "ratio", "was", "calculated", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "E", ")", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "TEX264", "-", "GFP", "were", "cultured", "with", "the", "CK2", "inhibitor", "for", "3", "h", "followed", "by", "starvation", "(", "with", "the", "CK2", "inhibitor", ")", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", "and", "1", "μm", "(", "insets", ")", "(", "F", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "TEX264", "puncta", "per", "cell", ".", "Solid", "bars", "indicate", "the", "medians", ",", "boxes", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ",", "and", "whiskers", "the", "0th", "to", "100th", "percentile", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Data", "were", "collected", "from", "85", "cells", "for", "each", "cell", "type", "(", "G", ")", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "WT", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "the", "ER", "-", "phagy", "reporter", "were", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "doxycycline", "for", "24", "h", "to", "induce", "the", "reporter", ".", "After", "doxycycline", "was", "removed", ",", "cells", "were", "cultured", "with", "20", "nM", "CK2", "inhibitor", "for", "3", "h", "followed", "by", "starvation", "(", "with", "the", "CK2", "inhibitor", ")", "for", "6", "h", "(", "H", ")", ".", "The", "band", "intensities", "of", "RFP", "and", "RFP", "-", "GFP", "were", "quantified", "and", "the", "ratio", "of", "RFP", ":", "RFP", "-", "GFP", "(", "normalized", "to", "WT", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "six", "independent", "experiments", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "I", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) HeLa cells were cultured with 20 nM CK1 inhibitor (D4476) or CK2 inhibitor (CX4945) for 3 h, followed by starvation (with the inhibitors) for 3 h. Cell lysates were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies.(B) Recombinant TEX264-FLAG was incubated with or without CK2 and the CK2 inhibitor (CX4945) in the presence of 200 µM ATP for 1 h.(C) HEK293T cells transiently expressing TEX264-FLAG and one of the three Halo-CK2A isoforms or Halo-CK2B were subjected to immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody and detected with anti-Halo and anti-FLAG antibodies.(D and E) HEK293T cells transiently expressing WT or TEX264-FLAG mutants were subjected to immunoprecipitation (IP). Inputs (20% of the lysates) and immunoprecipitates (from 80% of the lysates) were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies (D). The band intensities in the IP fractions were quantified, and the phospho-serine:FLAG ratio was calculated. Data represent the mean ± SEM of five independent experiments. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test (E).(F and G) MEFs stably expressing TEX264-GFP were cultured with the CK2 inhibitor for 3 h followed by starvation (with the CK2 inhibitor) and immunostained with an anti-LC3 antibody. Scale bars represent 10 μm and 1 μm (insets) (F). Quantification of the number of TEX264 puncta per cell. Solid bars indicate the medians, boxes the interquartile range (25th to 75th percentile), and whiskers the 0th to 100th percentile. Differences were statistically analyzed by an unpaired two-tailed Student's t-test. Data were collected from 85 cells for each cell type (G).(H and I) WT HeLa cells stably expressing the ER-phagy reporter were cultured in the presence of doxycycline for 24 h to induce the reporter. After doxycycline was removed, cells were cultured with 20 nM CK2 inhibitor for 3 h followed by starvation (with the CK2 inhibitor) for 6 h (H). The band intensities of RFP and RFP-GFP were quantified and the ratio of RFP:RFP-GFP (normalized to WT) is shown. Data represent the mean ± SEM of six independent experiments. Differences were statistically analyzed by an unpaired two-tailed Student's t-test (I)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "WT", "or", "mutated", "TEX264", "-", "FLAG", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "and", "detected", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "TEX264", "-", "GFP", "or", "its", "mutants", "were", "cultured", "in", "starvation", "media", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Bars", ":", "10", "µm", "and", "5", "µm", "(", "insets", ")", "(", "C", ")", ".", "The", "intensity", "of", "the", "GFP", "signal", "under", "starvation", "conditions", "was", "quantified", "at", "TEX264", "-", "GFP", "puncta", "and", "the", "ER", ".", "The", "puncta", ":", "ER", "signal", "ratio", "was", "calculated", ".", "Solid", "bars", "indicate", "the", "medians", ",", "boxes", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ",", "and", "whiskers", "the", "0th", "to", "100th", "percentile", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Data", "were", "collected", "from", "70", "puncta", "for", "each", "cell", "type", "(", "D", ")", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "WT", "and", "TEX264", "-", "KO", "(", "expressing", "WT", "or", "TEX264", "-", "FLAG", "mutants", ")", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "the", "ER", "-", "phagy", "reporter", "were", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "doxycycline", "for", "24", "h", "to", "induce", "the", "reporter", ".", "After", "doxycycline", "was", "removed", ",", "the", "cells", "were", "cultured", "in", "starvation", "medium", "lacking", "amino", "acids", "and", "serum", "for", "9", "h", "(", "E", ")", ".", "The", "band", "intensities", "of", "RFP", "and", "RFP", "-", "GFP", "were", "quantified", "and", "the", "ratio", "of", "RFP", ":", "RFP", "-", "GFP", "(", "normalized", "to", "WT", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "four", "independent", "experiments", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) HEK293T cells transiently expressing WT or mutated TEX264-FLAG were subjected to immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody and detected with the indicated antibodies.(C and D) MEFs stably expressing TEX264-GFP or its mutants were cultured in starvation media and immunostained with an anti-LC3 antibody. Bars: 10 µm and 5 µm (insets) (C). The intensity of the GFP signal under starvation conditions was quantified at TEX264-GFP puncta and the ER. The puncta:ER signal ratio was calculated. Solid bars indicate the medians, boxes the interquartile range (25th to 75th percentile), and whiskers the 0th to 100th percentile. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test. Data were collected from 70 puncta for each cell type (D).(E and F) WT and TEX264-KO (expressing WT or TEX264-FLAG mutants) HeLa cells stably expressing the ER-phagy reporter were cultured in the presence of doxycycline for 24 h to induce the reporter. After doxycycline was removed, the cells were cultured in starvation medium lacking amino acids and serum for 9 h (E). The band intensities of RFP and RFP-GFP were quantified and the ratio of RFP:RFP-GFP (normalized to WT) is shown. Data represent the mean ± SEM of four independent experiments. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test (F)."}
{"words": ["Figure", "1A", "Transfected", "GFP", "−", "Atg8", "homologs", "were", "immunoprecipitated", "with", "μMACS", "™", "from", "total", "U2OS", "cell", "extracts", "followed", "by", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "−", "GFP", "and", "anti", "−", "ALFY", "antibodies", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "C", "The", "indicated", "35S", "−", "labelled", "in", "vitro", "−", "translated", "GFP", "−", "tagged", "constructs", "were", "incubated", "with", "GST", ",", "GST", "−", "LC3B", "or", "GST", "−", "GABARAP", "conjugated", "to", "glutathione", "Sepharose", ",", "and", "their", "binding", "was", "evaluated", "by", "autoradiography", "(", "ARG", ")", ".", "5", "%", "of", "the", "in", "vitro", "−", "translated", "protein", "(", "arrow", "head", ")", "used", "was", "loaded", ".", "Equal", "amounts", "of", "GST", "proteins", "were", "used", "as", "shown", "by", "Coomassie", "Brilliant", "Blue", "(", "CBB", ")", "staining", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "D", "Recombinant", "ALFY", "(", "aa", "2981", "-", "3526", ")", "was", "incubated", "with", "GST", "‐", "Atg8", "proteins", "conjugated", "to", "glutathione", "Sepharose", ".", "The", "pulled", "‐", "down", "complexes", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "anti", "‐", "ALFY", "and", "anti", "‐", "GST", "immunoblotting", ".", "5", "%", "of", "the", "recombinant", "ALFY", "protein", "used", "was", "loaded", "as", "input", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Transfected GFP−Atg8 homologs were immunoprecipitated with μMACS™ from total U2OS cell extracts followed by immunoblot analysis with anti−GFP and anti−ALFY antibodies. Data are representative of two independent experiments.C The indicated 35S−labelled in vitro−translated GFP−tagged constructs were incubated with GST, GST−LC3B or GST−GABARAP conjugated to glutathione Sepharose, and their binding was evaluated by autoradiography (ARG). 5% of the in vitro−translated protein (arrow head) used was loaded. Equal amounts of GST proteins were used as shown by Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining. Data are representative of three independent experiments.D Recombinant ALFY (aa 2981-3526) was incubated with GST‐Atg8 proteins conjugated to glutathione Sepharose. The pulled‐down complexes were subjected to SDS-PAGE and anti‐ALFY and anti‐GST immunoblotting. 5% of the recombinant ALFY protein used was loaded as input. Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2B", "35S", "−", "labelled", "in", "vitro", "−", "translated", "GFP", "−", "ALFY", "(", "aa", "2981", "-", "3526", ")", "wild", "−", "type", "and", "different", "LIR", "mutants", "were", "incubated", "with", "GST", "−", "GABARAP", "or", "−", "LC3C", "and", "binding", "evaluated", "by", "ARG", ".", "10", "and", "2", "%", "of", "the", "in", "vitro", "−", "translated", "proteins", "used", "were", "loaded", "to", "illustrate", "binding", "affinity", ".", "CBB", "staining", "shows", "equal", "amounts", "of", "GST", "proteins", "used", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "MBP", ",", "MBP", "−", "ALFY", "(", "aa", "3255", "-", "3526", ")", "or", "the", "ALFY", "−", "LIR", "mutant", "(", "F3346A", ")", "conjugated", "to", "amylose", "resins", "was", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "purified", "GABARAP", ".", "The", "pulled", "−", "down", "complexes", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "visualized", "by", "CBB", "staining", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "D", "Thermodynamic", "parameters", "of", "ALFY", "−", "LIR", "peptide", "(", "aa", "3341", "-", "3354", ")", "to", "Atg8", "homologs", ".", "All", "titrations", "were", "performed", "at", "25", "°", "C", "as", "described", "in", "Supplementary", "Methods", ".", "ITC", "data", "were", "fitted", "to", "a", "one", "−", "site", "binding", "model", ".", "ND", ",", "not", "detected", ".", "E", "35S", "−", "labelled", "in", "vitro", "−", "translated", "GFP", "or", "GFP", "−", "Bchs", "(", "aa", "3326", "-", "3341", ")", "were", "incubated", "with", "GST", "or", "GST", "−", "dAtg8a", "and", "binding", "evaluated", "by", "ARG", ".", "5", "%", "of", "the", "in", "vitro", "−", "translated", "protein", "used", "was", "loaded", ".", "Ponceau", "staining", "shows", "equal", "amounts", "of", "GST", "proteins", "used", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B 35S−labelled in vitro−translated GFP−ALFY (aa 2981-3526) wild−type and different LIR mutants were incubated with GST−GABARAP or −LC3C and binding evaluated by ARG. 10 and 2% of the in vitro−translated proteins used were loaded to illustrate binding affinity. CBB staining shows equal amounts of GST proteins used. Data are representative of three independent experiments.C MBP, MBP−ALFY (aa 3255-3526) or the ALFY−LIR mutant (F3346A) conjugated to amylose resins was incubated in the absence or presence of purified GABARAP. The pulled−down complexes were subjected to SDS-PAGE and visualized by CBB staining. Data are representative of three independent experiments.D Thermodynamic parameters of ALFY−LIR peptide (aa 3341-3354) to Atg8 homologs. All titrations were performed at 25°C as described in Supplementary Methods. ITC data were fitted to a one−site binding model. ND, not detected.E 35S−labelled in vitro−translated GFP or GFP−Bchs (aa 3326-3341) were incubated with GST or GST−dAtg8a and binding evaluated by ARG. 5% of the in vitro−translated protein used was loaded. Ponceau staining shows equal amounts of GST proteins used. Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3D", "GFP", "−", "LC3B", "and", "GFP", "−", "LC3B", "(", "Q26K", "/", "H27Y", "/", "H57D", ")", "were", "immunoprecipitated", "with", "GFP", "−", "TRAP", "®", "from", "total", "cell", "lysate", "of", "stably", "transfected", "HeLa", "FlpIn", "cells", ",", "followed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", "MBP", "‐", "ALFY3255", "-", "3526", "conjugated", "to", "amylose", "resin", "was", "incubated", "with", "GST", "or", "the", "indicated", "GABARAP", "mutants", ".", "The", "pulled", "‐", "down", "complexes", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "visualized", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "‐", "MBP", "and", "anti", "‐", "GABARAP", "antibodies", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "F", "MBP", "−", "tagged", "ALFY3255", "-", "3526", "and", "p62168", "-", "391", "or", "their", "corresponding", "LIR", "mutants", "(", "F3346A", "and", "W340A", ",", "respectively", ")", "were", "conjugated", "to", "amylose", "resin", "and", "incubated", "with", "purified", "GST", ",", "GABARAP", ",", "GABARAP", "mutant", "(", "K24Q", "/", "Y25H", "/", "D54H", ")", ",", "LC3B", "or", "LC3B", "mutant", "(", "Q26K", "/", "H27Y", "/", "H57D", ")", ".", "The", "bound", "proteins", "were", "visualized", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "−", "GABARAP", ",", "anti", "−", "LC3", "and", "anti", "−", "MBP", "antibodies", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "G", "35S", "‐", "labelled", "in", "vitro", "‐", "translated", "GFP", "‐", "ALFY", "(", "aa", "2981", "-", "3526", ")", "wild", "‐", "type", "and", "K3343A", "/", "D3344A", "/", "Y3351A", "mutant", "were", "incubated", "with", "GST", "‐", "LC3B", "and", "GABARAP", "and", "binding", "evaluated", "by", "ARG", ".", "10", "%", "of", "the", "in", "vitro", "‐", "translated", "proteins", "used", "was", "loaded", ".", "CBB", "staining", "shows", "equal", "amounts", "of", "GST", "proteins", "used", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D GFP−LC3B and GFP−LC3B (Q26K/H27Y/H57D) were immunoprecipitated with GFP−TRAP® from total cell lysate of stably transfected HeLa FlpIn cells, followed by SDS-PAGE and immunoblotting with the indicated antibodies. Data are representative of three independent experiments.E MBP‐ALFY3255-3526 conjugated to amylose resin was incubated with GST or the indicated GABARAP mutants. The pulled‐down complexes were subjected to SDS-PAGE and visualized by immunoblotting with anti‐MBP and anti‐GABARAP antibodies. Data are representative of three independent experiments.F MBP−tagged ALFY3255-3526 and p62168-391 or their corresponding LIR mutants (F3346A and W340A, respectively) were conjugated to amylose resin and incubated with purified GST, GABARAP, GABARAP mutant (K24Q/Y25H/D54H), LC3B or LC3B mutant (Q26K/H27Y/H57D). The bound proteins were visualized by immunoblotting with anti−GABARAP, anti−LC3 and anti−MBP antibodies. Data are representative of three independent experiments.G 35S‐labelled in vitro‐translated GFP‐ALFY (aa 2981-3526) wild‐type and K3343A/D3344A/Y3351A mutant were incubated with GST‐LC3B and GABARAP and binding evaluated by ARG. 10% of the in vitro‐translated proteins used was loaded. CBB staining shows equal amounts of GST proteins used. Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4A", "HeLa", "FlpIn", "GFP", "−", "GABARAP", "cells", "were", "treated", "with", "proteasomal", "inhibitor", "(", "MG132", ",", "2", "h", ")", "or", "subjected", "to", "amino", "acid", "starvation", "(", "EBSS", ",", "2", "h", ")", ",", "before", "staining", "with", "anti", "−", "ALFY", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "B", "GFP", "−", "tagged", "full", "−", "length", "ALFY", "wild", "−", "type", "or", "LC3", "−", "interacting", "region", "(", "LIR", ")", "−", "mutant", "was", "expressed", "into", "Alfy", "−", "deficient", "MEFs", "using", "an", "adenovirus", "system", ".", "At", "48", "h", "after", "infection", ",", "the", "MEFs", "were", "cultured", "in", "normal", "media", "or", "EBSS", "for", "1", ".", "5", "h", "before", "staining", "with", "anti", "−", "LC3B", "or", "anti", "−", "GABARAP", "antibodies", ".", "Scale", "bars", "10", "μm", ".", "C", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "or", "siRNA", "targeting", "GABARAP", ",", "GABARAPL1", "and", "GABARAPL2", ".", "72", "h", "after", "transfection", "cells", "were", "immunostained", "with", "anti", "−", "LC3B", ",", "anti", "−", "ALFY", "and", "anti", "−", "p62", "antibodies", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "D", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "or", "siRNA", "targeting", "ALFY", ".", "72", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "puromycin", "with", "or", "without", "bafilomycin", "A1", "for", "2", "h", "and", "total", "cell", "lysates", "were", "fractionated", "into", "TX", "−", "100", "−", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", ".", "The", "TX", "−", "100", "−", "soluble", "/", "insoluble", "fractions", "were", "then", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", "ALFY", "WT", "and", "KO", "MEFs", "were", "treated", "with", "puromycin", "or", "EBSS", "with", "or", "without", "bafilomycin", "A1", "for", "2", "h", "and", "the", "total", "cell", "lysates", "were", "then", "fractionated", "into", "Triton", "X", "−", "100", "(", "TX", "−", "100", ")", "−", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", ".", "The", "TX", "−", "100", "−", "soluble", "/", "insoluble", "fractions", "were", "then", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A HeLa FlpIn GFP−GABARAP cells were treated with proteasomal inhibitor (MG132, 2 h) or subjected to amino acid starvation (EBSS, 2 h), before staining with anti−ALFY antibodies. Scale bar, 10 μm.B GFP−tagged full−length ALFY wild−type or LC3−interacting region (LIR)−mutant was expressed into Alfy−deficient MEFs using an adenovirus system. At 48 h after infection, the MEFs were cultured in normal media or EBSS for 1.5 h before staining with anti−LC3B or anti−GABARAP antibodies. Scale bars 10 μm.C HeLa cells were treated with control or siRNA targeting GABARAP, GABARAPL1 and GABARAPL2. 72 h after transfection cells were immunostained with anti−LC3B, anti−ALFY and anti−p62 antibodies. Scale bars, 10 μm.D HeLa cells were treated with control or siRNA targeting ALFY. 72 h after transfection, cells were treated with puromycin with or without bafilomycin A1 for 2 h and total cell lysates were fractionated into TX−100−soluble and insoluble fractions. The TX−100−soluble/insoluble fractions were then immunoblotted with the indicated antibodies. Data are representative of three independent experiments.E ALFY WT and KO MEFs were treated with puromycin or EBSS with or without bafilomycin A1 for 2 h and the total cell lysates were then fractionated into Triton X−100 (TX−100)−soluble and insoluble fractions. The TX−100−soluble/insoluble fractions were then immunoblotted with the indicated antibodies. Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "ERK71", "mutants", "have", "elevated", "triacylglycerol", "(", "TAG", ")", "levels", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "≥", "10", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "C", ".", "Fat", "body", "specific", "depletion", "of", "ERK7", "by", "RNAi", "(", "BDSC", "56939", ")", "leads", "to", "increased", "TAG", "levels", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "10", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "D", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "of", "lipid", "droplet", "(", "LipidTOX", ")", "and", "nuclear", "(", "DAPI", ")", "staining", "in", "control", "and", "ERK71", "mutant", "fat", "bodies", "of", "third", "instar", "larvae", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "E", ".", "ERK71", "mutant", "fat", "body", "cells", "contain", "more", "lipid", "droplets", "than", "control", "cells", "(", "N", "=", "30", "cells", "for", "each", "genotype", ")", ".", "F", ".", "After", "fed", "[", "13C", "]", "glucose", ",", "the", "ERK71", "mutant", "fat", "bodies", "display", "elevated", "[", "13C", "]", "TAG", "/", "PE", "and", "unlabeled", "TAG", "/", "PE", "molar", "ratios", "(", "measured", "by", "mass", "spectrometry", "-", "based", "lipidomics", ",", "N", "=", "3", "replicates", "of", "15", "fat", "bodies", "/", "replicate", ",", "TAG", "=", "triacylglycerol", ",", "PE", "=", "phosphatidylethanolamine", ")", "G", ".", "ERK7", "overexpression", "in", "the", "fat", "body", "results", "in", "reduced", "TAG", "levels", ",", "while", "kinase", "-", "dead", "(", "K54R", ")", "and", "activation", "loop", "phosphorylation", "-", "deficient", "(", "T190A", "/", "Y192F", ")", "mutants", "of", "ERK7", "do", "not", "influence", "the", "TAG", "storage", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "≥", "10", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "H", "-", "ERK7", "expressing", ",", "GFP", "-", "marked", ",", "fat", "body", "clone", "(", "H", ",", "marked", "by", "yellow", "dotted", "line", ";", "scale", "bar", ":", "50", "µm", ")", "visualized", "by", "LipidTOX", "staining", "(", "N", "=", "11", "for", "control", "and", "4", "for", "ERK7", "overexpression", ")", ".", "ERK7", "expressing", ",", "fat", "body", "clone", "contains", "less", "(", "I", ")", "and", "smaller", "(", "J", ")", "lipid", "droplets", "than", "control", "cells", "(", "N", "=", "11", "for", "control", "and", "4", "for", "ERK7", "overexpression", ")", ".", "K", ".", "qRT", "-", "PCR", "based", "expression", "analysis", "of", "ERK7", "from", "fat", "bodies", "of", "w1118", "larvae", "upon", "6", "h", "starvation", ".", "Expression", "of", "RP49", "was", "used", "for", "normalization", "(", "N", "=", "3", "replicates", "of", "10", "fat", "bodies", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. ERK71 mutants have elevated triacylglycerol (TAG) levels (N=4 replicates of ≥10 larvae/ replicate for each genotype). C. Fat body specific depletion of ERK7 by RNAi (BDSC 56939) leads to increased TAG levels (N=4 replicates of 10 larvae/replicate for each genotype). D. Representative immunofluorescent images of lipid droplet (LipidTOX) and nuclear (DAPI) staining in control and ERK71 mutant fat bodies of third instar larvae. Scale bar: 50 µm. E. ERK71 mutant fat body cells contain more lipid droplets than control cells (N=30 cells for each genotype). F. After fed [13C]glucose, the ERK71 mutant fat bodies display elevated [13C]TAG/PE and unlabeled TAG/PE molar ratios (measured by mass spectrometry-based lipidomics, N=3 replicates of 15 fat bodies/replicate, TAG=triacylglycerol, PE=phosphatidylethanolamine)G. ERK7 overexpression in the fat body results in reduced TAG levels, while kinase-dead (K54R) and activation loop phosphorylation-deficient (T190A/Y192F) mutants of ERK7 do not influence the TAG storage (N=4 replicates of ≥10 larvae/replicate for each genotype).H- ERK7 expressing, GFP-marked, fat body clone (H, marked by yellow dotted line; scale bar: 50 µm) visualized by LipidTOX staining (N=11 for control and 4 for ERK7 overexpression).ERK7 expressing, fat body clone contains less (I) and smaller (J) lipid droplets than control cells (N=11 for control and 4 for ERK7 overexpression).K. qRT-PCR based expression analysis of ERK7 from fat bodies of w1118 larvae upon 6 h starvation. Expression of RP49 was used for normalization (N=3 replicates of 10 fat bodies/replicate for each genotype)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Fatty", "acid", "composition", "of", "total", "lipids", "in", "CG", ">", "control", "and", "CG", ">", "ERK7", "larvae", ",", "measured", "by", "gas", "chromatography", "(", "N", "=", "3", "replicates", "of", "15", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "C", ".", "Amount", "of", "glucose", "-", "derived", "[", "13C", "]", "-", "labeled", "carbons", "incorporated", "into", "the", "TAG", "pool", "of", "control", "and", "CG", ">", "ERK7", "fat", "bodies", "(", "N", "=", "3", "replicates", "of", "15", "fat", "bodies", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", "and", "diet", ")", ".", "D", ".", "Ectopic", "ERK7", "expression", "in", "the", "fat", "body", "results", "in", "elevated", "hemolymph", "glucose", "levels", "(", "N", "=", "3", "replicates", "of", "15", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "E", ".", "Circulating", "glucose", "levels", "are", "decreased", "in", "ERK71", "mutants", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "15", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Fatty acid composition of total lipids in CG>control and CG>ERK7 larvae, measured by gas chromatography (N=3 replicates of 15 larvae/replicate for each genotype).C. Amount of glucose-derived [13C]-labeled carbons incorporated into the TAG pool of control and CG>ERK7 fat bodies (N=3 replicates of 15 fat bodies/replicate for each genotype and diet).D. Ectopic ERK7 expression in the fat body results in elevated hemolymph glucose levels (N=3 replicates of 15 larvae/replicate for each genotype). E. Circulating glucose levels are decreased in ERK71 mutants (N=4 replicates of 15 larvae/replicate for each genotype). "}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Four", "-", "way", "plot", "(", "t", "-", "statistics", ")", "presenting", "the", "ERK7", "-", "dependent", "fasting", "-", "responsive", "genes", "(", "adj", ".", "p", ".", "val", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Dark", "blue", "indicates", "significant", "in", "both", "comparisons", ";", "dark", "turquoise", ",", "significant", "in", "one", "comparison", ";", "light", "turquoise", ",", "not", "significant", ".", "D", ".", "Heatmaps", "displaying", "expression", "patterns", "of", "selected", "genes", "involved", "in", "lipid", "anabolism", "and", "lipid", "catabolism", ".", "Color", "key", "displays", "scaled", "log2", "gene", "expression", ".", "E", ",", "F", ".", "Expression", "analysis", "of", "Seipin", ",", "Agpat3", ",", "ATPCL", ",", "fabp", ",", "Lip4", "and", "CG34448", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "RP49", "was", "used", "for", "normalization", "(", "N", "=", "3", "replicates", "of", "≥", "10", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Four-way plot (t-statistics) presenting the ERK7-dependent fasting-responsive genes (adj.p.val < 0.05). Dark blue indicates significant in both comparisons; dark turquoise, significant in one comparison; light turquoise, not significant.D. Heatmaps displaying expression patterns of selected genes involved in lipid anabolism and lipid catabolism. Color key displays scaled log2 gene expression.E, F. Expression analysis of Seipin, Agpat3, ATPCL, fabp, Lip4 and CG34448 by qRT-PCR. RP49 was used for normalization (N=3 replicates of ≥10 larvae/replicate for each genotype)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Weight", "of", "control", "and", "ERK71", "mutant", "larvae", "at", "72h", "after", "egg", "deposition", "(", "AED", ")", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "12", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "B", ".", "Pupariation", "kinetics", "of", "control", "and", "ERK71", "mutants", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "30", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "analyzed", "by", "Log", "-", "rank", "test", ".", "C", ".", "ERK71", "mutants", "fail", "to", "suppress", "growth", "upon", "24", "h", "of", "starvation", "(", "N", "≥", "4", "replicates", "of", "15", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "D", ".", "ERK71", "mutant", "larvae", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "24", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "analyzed", "by", "Log", "-", "rank", "test", ")", "are", "sensitive", "to", "nutrient", "deprivation", ".", "Fat", "body", "specific", "knockdown", "of", "ERK7", "by", "RNAi", "(", "BDSC", "56939", ")", "leads", "to", "a", "moderately", "accelerated", "pupariation", "rate", "(", "E", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "analyzed", "by", "Log", "-", "rank", "test", ",", "N", "=", "8", "replicates", "of", "30", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", "F", ".", "Fat", "body", "specific", "knockdown", "of", "ERK7", "by", "RNAi", "(", "BDSC", "56939", ")", "leads", "to", "an", "increase", "in", "larval", "weight", "at", "72h", "AED", "(", "F", ",", "N", "=", "5", "replicates", "of", "15", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "G", ".", "A", "representative", "image", "showing", "that", "fat", "body", "-", "specific", "overexpression", "of", "ERK7", "by", "the", "CG", "-", "GAL4", "driver", "(", "CG", ">", "ERK7", ")", "impairs", "larval", "growth", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "5", "mm", ".", "H", ".", "Ectopic", "expression", "of", "ERK7", "leads", "to", "delayed", "pupariation", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "analyzed", "by", "Log", "-", "rank", "test", ")", ",", "while", "kinase", "-", "dead", "(", "K54R", ")", "and", "activation", "loop", "phosphorylation", "-", "deficient", "(", "T190A", "/", "Y192F", ")", "mutants", "of", "ERK7", "do", "not", "influence", "pupariation", "rate", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "30", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "I", ".", "In", "contrast", "to", "ERK7", "wt", ",", "kinase", "-", "dead", "(", "K54R", ")", "and", "activation", "loop", "phosphorylation", "-", "deficient", "(", "T190A", "/", "Y192F", ")", "mutants", "of", "ERK7", "do", "not", "influence", "the", "pupal", "volume", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "10", "pupae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Weight of control and ERK71 mutant larvae at 72h after egg deposition (AED) (N=4 replicates of 12 larvae/replicate for each genotype).B. Pupariation kinetics of control and ERK71 mutants (N=4 replicates of 30 larvae/replicate for each genotype). p<0.0001, analyzed by Log-rank test.C. ERK71 mutants fail to suppress growth upon 24 h of starvation (N≥4 replicates of 15 larvae/replicate for each genotype).D. ERK71 mutant larvae (N=4 replicates of 24 larvae/replicate for each genotype, p<0.01 analyzed by Log-rank test) are sensitive to nutrient deprivation.Fat body specific knockdown of ERK7 by RNAi (BDSC 56939) leads to a moderately accelerated pupariation rate (E, p<0.001 analyzed by Log-rank test, N=8 replicates of 30 larvae/replicate for each genotype)F. Fat body specific knockdown of ERK7 by RNAi (BDSC 56939) leads to an increase in larval weight at 72h AED (F, N=5 replicates of 15 larvae/replicate for each genotype).G. A representative image showing that fat body-specific overexpression of ERK7 by the CG-GAL4 driver (CG>ERK7) impairs larval growth. Scale bar: 0.5 mm.H. Ectopic expression of ERK7 leads to delayed pupariation (p<0.0001, analyzed by Log-rank test), while kinase-dead (K54R) and activation loop phosphorylation-deficient (T190A/Y192F) mutants of ERK7 do not influence pupariation rate (N=4 replicates of 30 larvae/replicate for each genotype).I. In contrast to ERK7 wt, kinase-dead (K54R) and activation loop phosphorylation-deficient (T190A/Y192F) mutants of ERK7 do not influence the pupal volume (N=4 replicates of 10 pupae/replicate for each genotype)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "of", "control", "and", "ERK71", "mutant", "fat", "bodies", "with", "DAPI", "staining", "to", "visualize", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ":", "30", "µm", ".", "B", ",", "C", ".", "ERK71", "mutant", "fat", "bodies", "display", "increased", "nuclear", "area", "(", "B", ",", "N", ">", "160", "cells", ",", "obtained", "from", "5", "independent", "fat", "bodies", ")", "and", "increased", "nucleolar", "/", "nuclear", "area", "ratio", "(", "C", ",", "N", ">", "80", "cells", "for", "nucleolus", "/", "nucleus", "ratio", ",", "obtained", "from", "5", "independent", "fat", "bodies", ")", ",", "when", "compared", "to", "control", "fat", "bodies", ".", "D", "-", "F", ".", "ERK7", "expressing", "fat", "body", "clones", "(", "D", ",", "marked", "by", "GFP", ",", "scale", "bar", ":", "20", "µm", ")", "display", "reduced", "nuclear", "area", "(", "E", ")", "and", "reduced", "nucleolar", "/", "nuclear", "area", "ratio", "(", "F", ")", ",", "when", "compared", "to", "control", "cells", ".", "Nuclei", "were", "visualized", "by", "DAPI", "staining", ",", "nucleoli", "were", "visualized", "by", "anti", "-", "Fibrillarin", "antibodies", "(", "N", "=", "10", ")", ".", "G", ",", "H", ".", "Expression", "analysis", "of", "Pol", "I", "(", "G", ")", "and", "Pol", "III", "(", "H", ")", "target", "RNAs", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Expression", "of", "CDK7", "was", "used", "for", "normalization", "(", "N", "=", "3", "replicates", "of", "10", "fat", "bodies", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Representative immunofluorescent images of control and ERK71 mutant fat bodies with DAPI staining to visualize nucleus. Scale bar: 30 µm. B, C. ERK71 mutant fat bodies display increased nuclear area (B, N>160 cells, obtained from 5 independent fat bodies) and increased nucleolar/nuclear area ratio (C, N>80 cells for nucleolus/nucleus ratio, obtained from 5 independent fat bodies), when compared to control fat bodies.D-F. ERK7 expressing fat body clones (D, marked by GFP, scale bar: 20 µm) display reduced nuclear area (E) and reduced nucleolar/nuclear area ratio (F), when compared to control cells. Nuclei were visualized by DAPI staining, nucleoli were visualized by anti-Fibrillarin antibodies (N=10).G, H. Expression analysis of Pol I (G) and Pol III (H) target RNAs by qRT-PCR. Expression of CDK7 was used for normalization (N=3 replicates of 10 fat bodies/replicate for each genotype)."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "ERK7", "overexpression", "leads", "to", "phosphorylation", "of", "PWP1", ",", "as", "shown", "by", "appearance", "of", "an", "extra", "band", "on", "Phos", "-", "tag", "Western", "blot", "(", "marked", "with", "red", "arrow", ")", ".", "Insulin", "-", "inducible", "bands", "(", "dark", "blue", ")", "remain", "unresponsive", "to", "ERK7", ".", "B", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "of", "PWP1", "localization", "in", "fat", "bodies", "of", "ERK71", "mutant", "and", "control", "third", "instar", "larvae", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "µm", ".", "C", ".", "PWP1", "localization", "displays", "increased", "nucleolar", "/", "nuclear", "ratio", "in", "ERK71", "mutant", "fat", "bodies", "compared", "to", "control", "(", "N", "=", "20", "cells", "from", "5", "independent", "fat", "bodies", "per", "genotype", ")", ".", "D", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "of", "PWP1", "localization", "in", "fat", "bodies", "of", "third", "instar", "larvae", ".", "ERK7", "overexpression", "(", "GFP", "marked", "clones", ")", "alters", "the", "subcellular", "localization", "of", "PWP1", ".", "Scale", "bar", ":", "30", "µm", ".", "E", ".", "PWP1", "localization", "displays", "reduced", "nuclear", "/", "cytoplasmic", "ratio", "in", "ERK7", "overexpressing", "clones", ",", "compared", "to", "control", "cells", "(", "N", "=", "10", "cells", "from", "at", "least", "8", "different", "fat", "bodies", "per", "genotype", ")", ".", "F", ".", "Fat", "body", "specific", "depletion", "of", "PWP1", "by", "RNAi", "leads", "to", "decreased", "TAG", "levels", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "≥", "10", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "G", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "of", "fat", "bodies", "in", "a", "genetic", "epistasis", "experiment", "using", "ERK7", "and", "PWP1", "fat", "body", "(", "CG", "-", "GAL4", ")", "knockdown", "with", "LipidTOX", "staining", "and", "DAPI", "to", "visualize", "lipid", "droplets", "and", "nucleus", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "H", ",", "I", ".", "Fat", "body", "specific", "knockdown", "of", "PWP1", "suppresses", "increased", "lipid", "droplet", "number", "(", "H", ";", "N", ">", "30", "cells", "per", "genotype", ")", "and", "increased", "nuclear", "area", "(", "I", ";", "N", ">", "45", "cells", "per", "genotype", ")", "caused", "by", "ERK7", "knockdown", "(", "BDSC", "56939", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. ERK7 overexpression leads to phosphorylation of PWP1, as shown by appearance of an extra band on Phos-tag Western blot (marked with red arrow). Insulin-inducible bands (dark blue) remain unresponsive to ERK7.B. Representative immunofluorescent images of PWP1 localization in fat bodies of ERK71 mutant and control third instar larvae. Scale bar: 20 µm. C. PWP1 localization displays increased nucleolar/nuclear ratio in ERK71 mutant fat bodies compared to control (N=20 cells from 5 independent fat bodies per genotype). D. Representative immunofluorescent images of PWP1 localization in fat bodies of third instar larvae. ERK7 overexpression (GFP marked clones) alters the subcellular localization of PWP1. Scale bar: 30 µm. E. PWP1 localization displays reduced nuclear/cytoplasmic ratio in ERK7 overexpressing clones, compared to control cells (N=10 cells from at least 8 different fat bodies per genotype). F. Fat body specific depletion of PWP1 by RNAi leads to decreased TAG levels (N=4 replicates of ≥10 larvae/replicate for each genotype).G. Representative immunofluorescent images of fat bodies in a genetic epistasis experiment using ERK7 and PWP1 fat body (CG-GAL4) knockdown with LipidTOX staining and DAPI to visualize lipid droplets and nucleus, respectively. Scale bar: 50 µm. H, I. Fat body specific knockdown of PWP1 suppresses increased lipid droplet number (H; N>30 cells per genotype) and increased nuclear area (I; N>45 cells per genotype) caused by ERK7 knockdown (BDSC 56939). "}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", ".", "Expression", "of", "sugarbabe", "is", "downregulated", "in", "fat", "bodies", "upon", "knockdown", "of", "PWP1", "(", "A", ")", "and", "ectopic", "expression", "of", "ERK7", "(", "B", ")", "(", "N", "=", "3", "replicates", "of", "10", "fat", "bodies", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "C", ".", "ERK71", "mutants", "fail", "to", "maximally", "downregulate", "sugarbabe", "expression", "upon", "fasting", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "10", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "D", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "of", "fat", "bodies", "in", "a", "genetic", "epistasis", "experiment", "using", "ERK71", "and", "sug", "mutants", "(", "sug17Δ", "/", "Df", "(", "2R", ")", "Exel7123", ")", "with", "LipidTOX", "and", "DAPI", "staining", "to", "visualize", "lipid", "droplets", "and", "nucleus", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "E", ".", "sug", "mutant", "(", "sug17Δ", "/", "Df", "(", "2R", ")", "Exel7123", ")", "suppresses", "increased", "lipid", "droplet", "number", "observed", "in", "ERK71", "mutants", "(", "N", ">", "20", ")", ".", "F", ".", "Ectopic", "sugarbabe", "expression", "in", "the", "fat", "body", "partially", "rescues", "TAG", "levels", "in", "the", "CG", ">", "ERK7", "larvae", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "≥", "10", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "G", ".", "sug", "mutant", "(", "sug17Δ", "/", "Df", "(", "2R", ")", "Exel7123", ")", "suppresses", "increased", "nuclear", "size", "phenotype", "of", "ERK71", "mutant", "fat", "body", "cells", "(", "N", "≥", "25", "cells", "per", "genotype", ")", ".", "Ectopic", "Sugarbabe", "expression", "in", "the", "fat", "body", "partially", "restores", "the", "pupariation", "rate", "(", "H", ")", "(", "p", "<", "0", ".", "001", "for", "the", "rescue", ",", "analyzed", "by", "Log", "-", "rank", "test", ",", "N", "=", "4", "replicates", "of", "30", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", "of", "CG", ">", "ERK7", "larvaeI", ".", "Ectopic", "Sugarbabe", "expression", "in", "the", "fat", "body", "partially", "restores", "the", "pupal", "volume", "of", "CG", ">", "ERK7", "larvae", "(", "I", ")", "(", "N", "=", "4", "replicates", "of", "10", "pupae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", ")", ".", "J", ".", "Addition", "of", "20", "%", "sucrose", "improves", "the", "growth", "rate", "and", "survival", "of", "CG", ">", "ERK7", "larvae", ".", "Pupariation", "kinetics", "of", "CG", ">", "ERK7", "larvae", "on", "20", "%", "yeast", "or", "20", "%", "yeast", "+", "20", "%", "sucrose", "diet", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "the", "rescue", ",", "analyzed", "by", "Log", "-", "rank", "test", ",", "N", "=", "4", "replicates", "of", "30", "larvae", "/", "replicate", "for", "each", "genotype", "and", "diet", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, B. Expression of sugarbabe is downregulated in fat bodies upon knockdown of PWP1 (A) and ectopic expression of ERK7 (B) (N=3 replicates of 10 fat bodies/replicate for each genotype).C. ERK71 mutants fail to maximally downregulate sugarbabe expression upon fasting (N=4 replicates of 10 larvae/replicate for each genotype).D. Representative immunofluorescent images of fat bodies in a genetic epistasis experiment using ERK71 and sug mutants (sug17Δ/Df(2R)Exel7123) with LipidTOX and DAPI staining to visualize lipid droplets and nucleus, respectively. Scale bar: 50 µm. E. sug mutant (sug17Δ/Df(2R)Exel7123) suppresses increased lipid droplet number observed in ERK71 mutants (N>20). F. Ectopic sugarbabe expression in the fat body partially rescues TAG levels in the CG>ERK7 larvae (N=4 replicates of ≥10 larvae/replicate for each genotype).G. sug mutant (sug17Δ/Df(2R)Exel7123) suppresses increased nuclear size phenotype of ERK71 mutant fat body cells (N ≥25 cells per genotype).Ectopic Sugarbabe expression in the fat body partially restores the pupariation rate (H) (p<0.001 for the rescue, analyzed by Log-rank test, N=4 replicates of 30 larvae/replicate for each genotype) of CG>ERK7 larvaeI. Ectopic Sugarbabe expression in the fat body partially restores the pupal volume of CG>ERK7 larvae (I) (N=4 replicates of 10 pupae/replicate for each genotype).J. Addition of 20% sucrose improves the growth rate and survival of CG>ERK7 larvae. Pupariation kinetics of CG>ERK7 larvae on 20% yeast or 20% yeast + 20% sucrose diet (p<0.0001 for the rescue, analyzed by Log-rank test, N=4 replicates of 30 larvae/replicate for each genotype and diet)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "GFP", "-", "positive", "HEK293", "cells", "at", "day", "7", "post", "-", "transduction", "using", "1x106", "TU", "/", "cell", "of", "RGD4C", ".", "TPA", ".", "GFP", "or", "RGD4C", ".", "AAVP", ".", "GFP", "particles", ".", "Non", "-", "targeted", "(", "NT", ")", "particles", "were", "included", "as", "control", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "five", "independent", "experiments", ",", "performed", "each", "in", "triplicates", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(F) Representative images of GFP-positive HEK293 cells at day 7 post-transduction using 1x106 TU/cell of RGD4C.TPA.GFP or RGD4C.AAVP.GFP particles. Non-targeted (NT) particles were included as control. Data shown are representative of five independent experiments, performed each in triplicates. Scale bar, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Quantification", "of", "gene", "expression", "in", "HEK293", "cells", "after", "transduction", "with", "0", ".", "5x106", ",", "1x106", ",", "and", "2x106", "TU", "/", "cell", "of", "RGD4C", ".", "TPA", ",", "RGD4C", ".", "AAVP", "or", "non", "-", "targeted", "(", "NT", ")", "particles", "carrying", "Lucia", ".", "Luciferase", "activity", "was", "measured", "at", "days", "1", "to", "6", "post", "-", "transduction", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "and", "are", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "FITC", "-", "labelled", "TPA", "and", "AAVP", "particle", "diffusion", "in", "Matrigel", "at", "5", "and", "30", "minutes", "post", "-", "inoculation", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "C", ")", "Particle", "diffusion", "using", "a", "vertical", "trans", "-", "well", "system", "partitioned", "by", "Matrigel", ".", "Samples", "were", "collected", "from", "the", "wells", "below", "the", "Matrigel", "at", "days", "1", "to", "7", ",", "n", "=", "3", ",", "technical", "replicates", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", ",", "independent", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "D", ")", "Comparison", "of", "AAVP", "and", "TPA", "internalisation", "efficiency", "in", "HEK293", "cells", "as", "evaluated", "by", "staining", "of", "the", "phage", "capsid", "proteins", ",", "then", "quantified", "by", "FACS", "at", "2", "and", "4", "hours", "post", "-", "transduction", ",", "0", ".", "1X106TU", "/", "cell", ",", "and", "normalised", "to", "particle", "length", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "independent", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "ITRs", "in", "the", "cytosol", "and", "nucleus", "of", "HEK293", "cells", "24", "hours", "post", "-", "transduction", "with", "0", ".", "5x106", "TU", "/", "cell", "of", "RGD4C", ".", "TPA", "and", "RGD4C", ".", "AAVP", ",", "using", "qPCR", "with", "primers", "specific", "to", "AAV", "-", "2", "ITRs", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "and", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", ",", "independent", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "Lucia", "reporter", "gene", "expression", "following", "transduction", "of", "human", "primary", "SEBTA003", "glioblastoma", "and", "G26", "glioblastoma", "-", "derived", "neural", "stem", "cells", "with", "1x106", "TU", "/", "cell", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "G", ")", "3D", "primary", "GBM001", "tumor", "spheres", "subjected", "to", "transduction", "by", "increasing", "doses", "of", "TPA", "and", "AAVP", "encoding", "Lucia", ".", "Experiments", "were", "repeated", "three", "times", "and", "performed", "in", "triplicates", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "+", "SEM", "and", "are", "representative", "of", "one", "experiment", ".", "Independent", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Quantification of gene expression in HEK293 cells after transduction with 0.5x106, 1x106, and 2x106 TU/cell of RGD4C.TPA, RGD4C.AAVP or non-targeted (NT) particles carrying Lucia. Luciferase activity was measured at days 1 to 6 post-transduction. Data shown are representative of three independent experiments (n = 3), and are expressed as mean + SEM. One-way ANOVA with Tukey's HSD test was used for data analysis.(B) Representative images of FITC-labelled TPA and AAVP particle diffusion in Matrigel at 5 and 30 minutes post-inoculation (n = 3). Scale bar, 100 μm. (C) Particle diffusion using a vertical trans-well system partitioned by Matrigel. Samples were collected from the wells below the Matrigel at days 1 to 7, n = 3, technical replicates. Data are expressed as mean + SEM, independent t-test was used for data analysis.(D) Comparison of AAVP and TPA internalisation efficiency in HEK293 cells as evaluated by staining of the phage capsid proteins, then quantified by FACS at 2 and 4 hours post-transduction, 0.1X106TU/cell, and normalised to particle length. Data are expressed as mean + SEM of n = 3 independent experiments, independent t-test was used for data analysis.(E) Quantification of ITRs in the cytosol and nucleus of HEK293 cells 24 hours post-transduction with 0.5x106 TU/cell of RGD4C.TPA and RGD4C.AAVP, using qPCR with primers specific to AAV-2 ITRs. Data are representative of n = 3 independent experiments and expressed as mean + SEM, independent t-test was used for data analysis.(F) Quantification of Lucia reporter gene expression following transduction of human primary SEBTA003 glioblastoma and G26 glioblastoma-derived neural stem cells with 1x106 TU/cell. Data are expressed as mean + SEM of n = 3 independent experiments. One-way ANOVA with Tukey's HSD test was used for data analysis.(G) 3D primary GBM001 tumor spheres subjected to transduction by increasing doses of TPA and AAVP encoding Lucia. Experiments were repeated three times and performed in triplicates. Data are shown as mean + SEM and are representative of one experiment. Independent t-test was used for data analysis."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "ELISA", "quantification", "of", "TNFα", "production", "in", "media", "collected", "on", "days", "3", "to", "5", "post", "-", "transduction", "of", "human", "primary", "GBM001", "tumor", "spheres", "at", "1x106", "TU", "/", "cell", "of", "targeted", "(", "RGD4C", ")", "or", "non", "-", "targeted", "(", "NT", ")", "TPA", "particles", "carrying", "native", "TNFα", "or", "recombinant", "TNFαIL2", "sequences", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "experiment", "and", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", ".", "Experiments", "were", "repeated", "twice", "in", "triplicates", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "C", ")", "Biodistribution", "of", "gene", "delivery", "upon", "intravenous", "administration", "of", "5x1010", "TU", "of", "NT", "or", "RGD4C", ".", "TPA", ".", "TNFαIL2", "to", "NOD", "/", "SCID", "mice", "bearing", "subcutaneous", "human", "GBM001", ".", "Tumors", "and", "healthy", "organs", "were", "harvested", "at", "day", "18", "post", "-", "transduction", "and", "analysed", "using", "RT", "-", "qPCR", "to", "quantify", "the", "TNFαIL2", "transcripts", ".", "Data", "shown", "are", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", ",", "from", "n", "=", "3", "mice", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "D", ")", "BLI", "of", "Luc", "showing", "representative", "mice", "with", "subcutaneous", "GBM001", "labelled", "with", "Luc", "gene", ",", "at", "day", "18", "post", "targeted", "TNFαIL2", "cytokine", "treatment", ".", "(", "E", ")", "Analysis", "of", "tumor", "growth", "in", "representative", "mice", ",", "from", "D", ",", "using", "the", "tumor", "bioluminescence", "data", "(", "total", "flux", ")", "and", "expressed", "as", "fold", "changes", "of", "tumor", "luminescence", "flux", "at", "different", "time", "points", "compared", "to", "day", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) ELISA quantification of TNFα production in media collected on days 3 to 5 post-transduction of human primary GBM001 tumor spheres at 1x106 TU/cell of targeted (RGD4C) or non-targeted (NT) TPA particles carrying native TNFα or recombinant TNFαIL2 sequences. Data are representative of one experiment and expressed as mean + SEM. Experiments were repeated twice in triplicates, one-way ANOVA with Tukey's HSD test was used for data analysis.(C) Biodistribution of gene delivery upon intravenous administration of 5x1010 TU of NT or RGD4C.TPA.TNFαIL2 to NOD/SCID mice bearing subcutaneous human GBM001. Tumors and healthy organs were harvested at day 18 post-transduction and analysed using RT-qPCR to quantify the TNFαIL2 transcripts. Data shown are expressed as mean + SEM, from n = 3 mice. Two-way ANOVA was used for data analysis.(D) BLI of Luc showing representative mice with subcutaneous GBM001 labelled with Luc gene, at day 18 post targeted TNFαIL2 cytokine treatment. (E) Analysis of tumor growth in representative mice, from D, using the tumor bioluminescence data (total flux) and expressed as fold changes of tumor luminescence flux at different time points compared to day 0."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Investigation", "of", "the", "TPA", ".", "IL15IgK", "in", "comparison", "to", "the", "native", "TPA", ".", "IL15", "in", "B16", ".", "F1", "and", "CT26", ".", "CL25", "tumor", "cells", ".", "The", "TPA", "DNA", "constructs", "were", "transfected", "into", "tumor", "cells", ",", "then", "the", "bioactivity", "of", "secreted", "IL15", "was", "assessed", "by", "evaluating", "the", "effects", "of", "media", "from", "transfected", "cells", "on", "the", "proliferation", "of", "mouse", "CTLL", "-", "2", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "experiment", "and", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", ".", "Experiments", "were", "repeated", "twice", "and", "performed", "in", "triplicates", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", "(", "C", ")", "Targeted", "(", "RGD4C", ")", "and", "non", "-", "targeted", "(", "NT", ")", "TPA", "particles", "carrying", "IL15IgK", "were", "produced", "and", "used", "to", "transduce", "B16", ".", "F1", "or", "CT26", ".", "CL25", "cells", "at", "0", ".", "5x106", "or", "1x106", "TU", "/", "cell", ".", "Then", "secreted", "IL15", "was", "quantified", "by", "ELISA", "in", "tumor", "cell", "media", "collected", "on", "day", "5", "post", "-", "transduction", ".", "RGD4C", ".", "TPA", "without", "IL15IgK", "(", "mock", ")", "was", "also", "included", "as", "control", ".", "Experiments", "were", "repeated", "twice", "and", "shown", "are", "the", "results", "from", "a", "representative", "experiment", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "D", ")", "Evaluation", "of", "CTLL", "-", "2", "proliferation", "in", "the", "presence", "of", "media", "collected", "from", "B16", ".", "F1", "or", "CT26", ".", "CL25", "tumor", "cells", "after", "transduction", "with", "TPA", "particles", "carrying", "IL15IgK", ".", "Cells", "treated", "with", "a", "recombinant", "IL2", "cytokine", "were", "included", "as", "a", "positive", "control", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "experiment", ",", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", "and", "shown", "as", "change", "in", "CTLL", "-", "2", "number", "relative", "to", "treatment", "initiation", "day", ".", "Experiments", "were", "repeated", "twice", "and", "in", "triplicates", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", "was", "used", "to", "analyse", "the", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Investigation of the TPA.IL15IgK in comparison to the native TPA.IL15 in B16.F1 and CT26.CL25 tumor cells. The TPA DNA constructs were transfected into tumor cells, then the bioactivity of secreted IL15 was assessed by evaluating the effects of media from transfected cells on the proliferation of mouse CTLL-2. Data are representative of one experiment and expressed as mean + SEM. Experiments were repeated twice and performed in triplicates, one-way ANOVA with Tukey's HSD test was used for data analysis(C) Targeted (RGD4C) and non-targeted (NT) TPA particles carrying IL15IgK were produced and used to transduce B16.F1 or CT26.CL25 cells at 0.5x106 or 1x106 TU/cell. Then secreted IL15 was quantified by ELISA in tumor cell media collected on day 5 post-transduction. RGD4C.TPA without IL15IgK (mock) was also included as control. Experiments were repeated twice and shown are the results from a representative experiment. Data are expressed as mean + SEM, one-way ANOVA with Tukey's HSD test was used for data analysis.(D) Evaluation of CTLL-2 proliferation in the presence of media collected from B16.F1 or CT26.CL25 tumor cells after transduction with TPA particles carrying IL15IgK. Cells treated with a recombinant IL2 cytokine were included as a positive control. Data are representative of one experiment, expressed as mean + SEM and shown as change in CTLL-2 number relative to treatment initiation day. Experiments were repeated twice and in triplicates, one-way ANOVA with Tukey's HSD test was used to analyse the data."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Tumor", "-", "bearing", "BALB", "/", "c", "mice", "with", "established", "subcutaneous", "CT26", ".", "CL25", "tumors", "were", "intravenously", "injected", "with", "a", "single", "dose", ",", "5x1010", "TU", "/", "mouse", ",", "of", "targeted", "(", "RGD4C", ")", "or", "non", "-", "targeted", "(", "NT", ")", "TPA", ".", "IL15IgK", ".", "Gene", "delivery", "was", "evaluated", "by", "quantifying", "the", "IL15IgK", "mRNA", "expression", "in", "tumors", "and", "healthy", "tissues", "at", "day", "5", "post", "TPA", "administration", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "experiment", ",", "n", "=", "3", ",", "and", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "B", ")", "Safety", "of", "dose", "escalation", "regimens", "assessed", "at", "day", "5", "following", "TPA", "delivery", ",", "by", "evaluating", "the", "serum", "levels", "of", "LDH", "from", "n", "=", "2", "mice", "/", "TPA", "dose", "of", "targeted", "(", "RGD4C", ")", "or", "non", "-", "targeted", "(", "NT", ")", "TPA", ".", "IL15IgK", ".", "Serums", "from", "untreated", "mice", "were", "also", "analysed", ".", "(", "C", ")", "Representative", "tumor", "-", "bearing", "mice", "showing", "bioluminescence", "imaging", "of", "luciferase", "on", "days", "0", "and", "5", "post", "administration", "with", "5x1010", "TU", "of", "RGD4C", ".", "TPA", ".", "IL15IgK", "(", "RGD4C", ")", "or", "non", "-", "targeted", "(", "NT", ")", "particles", ".", "The", "CT26", ".", "CL25", "tumor", "cells", "stably", "express", "a", "luciferase", "Luc", "reporter", "gene", ".", "Untreated", "mice", "were", "also", "included", "as", "controls", "(", "CTRL", ")", ".", "(", "D", ")", "Changes", "in", "tumor", "viability", "in", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "from", "day", "0", "to", "day", "5", "post", "TPA", "administration", ".", "Tumor", "viability", "was", "measured", "by", "bioluminescence", "activity", ".", "The", "central", "band", "represents", "the", "median", "of", "the", "data", ".", "The", "boxes", "upper", "and", "lower", "lines", "represent", "quartile", "3", "and", "quartile", "1", "of", "the", "data", ",", "respectively", ".", "The", "whiskers", "represent", "the", "maximum", "and", "minimum", "outliers", "of", "the", "data", ".", "Non", "-", "parametric", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "E", ")", "Kaplan", "Meier", "curves", "showing", "survival", "benefit", "for", "tumor", "-", "bearing", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "from", "all", "experimental", "groups", ".", "(", "F", ")", "Animal", "weights", "(", "n", "=", "4", ")", "were", "monitored", "during", "therapy", "experiments", "ad", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Tumor-bearing BALB/c mice with established subcutaneous CT26.CL25 tumors were intravenously injected with a single dose, 5x1010 TU/mouse, of targeted (RGD4C) or non-targeted (NT) TPA.IL15IgK. Gene delivery was evaluated by quantifying the IL15IgK mRNA expression in tumors and healthy tissues at day 5 post TPA administration. Data are representative of one experiment, n = 3, and expressed as mean + SEM. Two-way ANOVA test was used for data analysis.(B) Safety of dose escalation regimens assessed at day 5 following TPA delivery, by evaluating the serum levels of LDH from n = 2 mice/TPA dose of targeted (RGD4C) or non-targeted (NT) TPA.IL15IgK. Serums from untreated mice were also analysed.(C) Representative tumor-bearing mice showing bioluminescence imaging of luciferase on days 0 and 5 post administration with 5x1010 TU of RGD4C.TPA.IL15IgK (RGD4C) or non-targeted (NT) particles. The CT26.CL25 tumor cells stably express a luciferase Luc reporter gene. Untreated mice were also included as controls (CTRL).(D) Changes in tumor viability in mice (n = 4) from day 0 to day 5 post TPA administration. Tumor viability was measured by bioluminescence activity. The central band represents the median of the data. The boxes upper and lower lines represent quartile 3 and quartile 1 of the data, respectively. The whiskers represent the maximum and minimum outliers of the data. Non-parametric Kruskal-Wallis test was used for data analysis.(E) Kaplan Meier curves showing survival benefit for tumor-bearing mice (n = 4) from all experimental groups.(F) Animal weights (n = 4) were monitored during therapy experiments ad expressed as mean + SEM."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "The", "immune", "profile", "of", "CT26", ".", "CL25", "tumors", "was", "investigated", "using", "RT", "-", "qPCR", "at", "day", "5", "after", "TPA", ".", "IL15IgK", "administration", ".", "A", "panel", "of", "immunological", "mRNA", "transcripts", "were", "selected", "for", "analysis", "and", "included", "CD8a", "and", "CD8b", "as", "markers", "for", "CD8", "+", "T", "cell", "population", ";", "NKp46", "for", "NK", "cell", "population", ".", "Markers", "for", "cytotoxic", "cell", "-", "killing", "by", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "GZMa", ",", "GZMb", ")", "and", "by", "NK", "cells", "(", "Prf1", ")", "were", "also", "analysed", ".", "Expression", "of", "TBX21", "was", "evaluated", "as", "a", "marker", "for", "the", "Th1", "response", "mediated", "by", "interferon", "gamma", "(", "IFN", "-", "γ", ")", ",", "and", "FoxP3", "for", "Treg", "cells", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "n", "=", "5", "mice", "and", "expressed", "as", "mean", "+", "SEM", ".", "Non", "-", "parametric", "Mann", "-", "Whitney", "test", "was", "used", "for", "GZMb", "and", "TBX2", "data", "analysis", ",", "and", "independent", "t", "-", "test", "to", "analyse", "data", "of", "the", "other", "markers", ".", "(", "B", ")", "TPA", "particles", "encoding", "IL12", "were", "used", "to", "treat", "immunocompetent", "BALB", "/", "c", "mice", "bearing", "subcutaneous", "CT26", ".", "CL25", "tumors", "labelled", "with", "a", "Luc", "reporter", "gene", ".", "Representative", "tumor", "-", "bearing", "mice", "at", "day", "5", "post", "-", "treatment", "with", "targeted", "RGD4C", ".", "TPA", ".", "IL12", "(", "RGD4C", ")", "or", "non", "-", "targeted", "TPA", ".", "IL12", "(", "NT", ")", ".", "(", "C", ")", "Analysis", "of", "total", "flux", "change", "in", "tumors", ",", "n", "=", "4", "mice", ",", "after", "IL12", "immunotherapy", ".", "The", "central", "band", "represents", "the", "median", "of", "the", "data", ".", "The", "boxes", "upper", "and", "lower", "lines", "represent", "quartile", "3", "and", "quartile", "1", "of", "the", "data", ",", "respectively", ".", "The", "whiskers", "represent", "the", "maximum", "and", "minimum", "outliers", "of", "the", "data", ".", "Non", "-", "parametric", "Mann", "-", "Whitney", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "D", ")", "Kaplan", "Meier", "curves", "showing", "survival", "benefit", "for", "tumor", "-", "bearing", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "from", "two", "experimental", "groups", ".", "(", "E", ")", "Serial", "quantification", "of", "IL12", "in", "media", "of", "B16", ".", "F10", "cells", "treated", "with", "RGD4C", ".", "TPA", ".", "IL12", "or", "controls", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "experiment", ",", "n", "=", "3", "biological", "repeats", ",", "and", "shown", "as", "mean", "+", "SD", "Experiments", "were", "repeated", "three", "times", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "(", "F", ")", "RGD4C", ".", "TPA", ".", "IL12", "immunotherapy", "of", "subcutaneous", "B16", ".", "F10", "tumors", "in", "C57BL", "/", "6", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "+", "SEM", "independent", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "data", "analysis", ".", "Tumor", "volume", "changes", "are", "shown", "over", "time", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) The immune profile of CT26.CL25 tumors was investigated using RT-qPCR at day 5 after TPA.IL15IgK administration. A panel of immunological mRNA transcripts were selected for analysis and included CD8a and CD8b as markers for CD8+ T cell population; NKp46 for NK cell population. Markers for cytotoxic cell-killing by CD8+ T cells (GZMa, GZMb) and by NK cells (Prf1) were also analysed. Expression of TBX21 was evaluated as a marker for the Th1 response mediated by interferon gamma (IFN-γ), and FoxP3 for Treg cells. Data shown are representative of n = 5 mice and expressed as mean + SEM. Non-parametric Mann-Whitney test was used for GZMb and TBX2 data analysis, and independent t-test to analyse data of the other markers.(B) TPA particles encoding IL12 were used to treat immunocompetent BALB/c mice bearing subcutaneous CT26.CL25 tumors labelled with a Luc reporter gene. Representative tumor-bearing mice at day 5 post-treatment with targeted RGD4C.TPA.IL12 (RGD4C) or non-targeted TPA.IL12 (NT).(C) Analysis of total flux change in tumors, n = 4 mice, after IL12 immunotherapy. The central band represents the median of the data. The boxes upper and lower lines represent quartile 3 and quartile 1 of the data, respectively. The whiskers represent the maximum and minimum outliers of the data. Non-parametric Mann-Whitney test was used for data analysis.(D) Kaplan Meier curves showing survival benefit for tumor-bearing mice (n = 4) from two experimental groups.(E) Serial quantification of IL12 in media of B16.F10 cells treated with RGD4C.TPA.IL12 or controls. Data are representative of one experiment, n = 3 biological repeats, and shown as mean + SD Experiments were repeated three times. One-way ANOVA with Tukey's HSD test was used for data analysis.(F) RGD4C.TPA.IL12 immunotherapy of subcutaneous B16.F10 tumors in C57BL/6 mice (n = 4). Data are shown as mean + SEM independent t-test was used for data analysis. Tumor volume changes are shown over time."}
{"words": ["Figure", "1Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "stratified", "by", "the", "patient", "MICA", "-", "129", "genotype", "for", "all", "patients", "(", "n", "=", "446", ")", ".", "The", "survival", "curve", "is", "displayed", "for", "the", "first", "66", "months", ";", "7", ".", "6", "%", "of", "the", "patients", "were", "followed", "longer", ".", "Effects", "on", "overall", "survival", "were", "determined", "by", "Cox", "regression", "with", "covariate", "adjustment", "as", "indicated", "in", "Table2", ".", "The", "HR", "indicates", "the", "risk", "per", "MICA", "-", "129Met", "allele", "carried", "by", "the", "patients", "(", "additive", "risk", "model", ")", ".", "The", "numbers", "of", "patients", "carrying", "the", "three", "genotypes", "and", "the", "number", "of", "events", "(", "in", "brackets", ")", "are", "indicated", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "for", "patients", "receiving", "a", "graft", "matched", "for", "the", "MICA", "-", "129", "genotype", "(", "n", "=", "404", ")", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "for", "patients", "who", "experienced", "aGVDH", "(", "any", "grade", ",", "n", "=", "244", ")", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "for", "patients", "not", "experiencing", "aGVHD", "(", "n", "=", "189", ")", ".", "The", "HR", "indicates", "the", "risk", "of", "patients", "carrying", "two", "MICA", "-", "129Met", "alleles", "(", "recessive", "risk", "model", ")", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "for", "patients", "who", "did", "not", "receive", "a", "T", "-", "cell", "-", "depleting", "treatment", "with", "ATG", "(", "n", "=", "193", ")", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "for", "patients", "treated", "with", "ATG", "(", "n", "=", "250", ")", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "for", "patients", "with", "the", "MICA", "-", "129Val", "/", "Val", "genotype", "(", "n", "=", "229", ")", "stratified", "by", "treatment", "with", "ATG", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "for", "patients", "carrying", "one", "or", "two", "MICA", "-", "129Met", "alleles", "(", "n", "=", "214", ")", "stratified", "by", "treatment", "with", "ATG", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Kaplan-Meier survival curves stratified by the patient MICA-129 genotype for all patients (n = 446). The survival curve is displayed for the first 66 months; 7.6% of the patients were followed longer. Effects on overall survival were determined by Cox regression with covariate adjustment as indicated in Table2. The HR indicates the risk per MICA-129Met allele carried by the patients (additive risk model). The numbers of patients carrying the three genotypes and the number of events (in brackets) are indicated.Kaplan-Meier survival curves for patients receiving a graft matched for the MICA-129 genotype (n = 404).Kaplan-Meier survival curves for patients who experienced aGVDH (any grade, n = 244).Kaplan-Meier survival curves for patients not experiencing aGVHD (n = 189). The HR indicates the risk of patients carrying two MICA-129Met alleles (recessive risk model).Kaplan-Meier survival curves for patients who did not receive a T-cell-depleting treatment with ATG (n = 193).Kaplan-Meier survival curves for patients treated with ATG (n = 250).Kaplan-Meier survival curves for patients with the MICA-129Val/Val genotype (n = 229) stratified by treatment with ATG.Kaplan-Meier survival curves for patients carrying one or two MICA-129Met alleles (n = 214) stratified by treatment with ATG."}
{"words": ["Figure", "2The", "linear", "regression", "of", "MICA", "expression", "intensity", "and", "binding", "of", "a", "recombinant", "NKG2D", "-", "Fc", "fusion", "protein", "both", "determined", "as", "MFI", "by", "flow", "cytometry", "is", "displayed", "for", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "(", "n", "=", "79", ",", "left", "panel", ")", "and", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clones", "(", "n", "=", "81", ",", "right", "panel", ")", ".", "The", "coefficients", "of", "determination", "(", "R2", ")", ",", "the", "regression", "coefficients", "(", "reg", ".", "coeff", ".", ")", ",", "and", "the", "P", "-", "values", "for", "Pearson", "correlation", "are", "indicated", ".", "Purified", "IL", "-", "2", "-", "stimulated", "(", "100", "U", "/", "ml", "for", "4", "days", ")", "NK", "cells", "(", "106", ")", "were", "stimulated", "with", "immobilized", "MICA", "-", "129Met", "-", "mIgG2a", "-", "Fc", "or", "MICA", "-", "129Val", "-", "mIgG2a", "-", "Fc", "or", "OVA", "-", "mIgG2a", "-", "Fc", "fusion", "proteins", "(", "10", "μg", "/", "ml", ")", "for", "3", ",", "10", ",", "or", "30", "min", ".", "The", "protein", "lysates", "of", "these", "cells", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "and", "the", "blot", "was", "probed", "subsequently", "with", "an", "anti", "-", "phospho", "-", "Tyr", "mAb", ",", "an", "anti", "-", "phospho", "-", "SRC", "family", "(", "Tyr419", ")", "kinases", "Ab", ",", "and", "an", "anti", "-", "β", "-", "actin", "mAb", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "arrow", "points", "toward", "phosphorylated", "SRC", "family", "kinases", ".", "Blots", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", "were", "analyzed", "by", "densitometry", ",", "and", "the", "means", "plus", "SD", "of", "the", "ratio", "between", "phospho", "-", "SRC", "family", "kinase", "and", "β", "-", "actin", "signals", "is", "displayed", ".", "The", "difference", "between", "NK", "cells", "stimulated", "for", "10", "min", "by", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", "or", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", "proteins", "was", "assessed", "by", "t", "-", "test", ".", "Purified", "IL", "-", "2", "-", "stimulated", "NK", "cells", "(", "100", "U", "/", "ml", "for", "4", "days", ",", "106", ")", "were", "incubated", "with", "the", "SRC", "kinase", "inhibitor", "PP2", "(", "25", "μM", ")", ",", "the", "vehicle", "DMSO", ",", "or", "medium", "only", "(", "Ø", ")", "for", "30", "min", "before", "being", "added", "to", "immobilized", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", ",", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", ",", "or", "OVA", "-", "Fc", "fusion", "proteins", "(", "10", "μg", "/", "ml", ")", "for", "10", "min", ".", "The", "protein", "lysates", "of", "these", "cells", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "and", "the", "blot", "was", "probed", "subsequently", "with", "an", "anti", "-", "phospho", "-", "Tyr", "mAb", "and", "an", "anti", "-", "β", "-", "actin", "mAb", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "blot", "is", "representative", "for", "two", "independent", "experiments", ".", "In", "parallel", ",", "degranulation", "of", "the", "NK", "cells", "was", "measured", "by", "anti", "-", "CD107a", "staining", "in", "flow", "cytometry", ".", "The", "difference", "between", "DMSO", "-", "and", "PP2", "-", "treated", "cells", "with", "respect", "to", "CD107a", "+", "cells", "and", "the", "MFI", "of", "CD107a", "is", "indicated", "in", "the", "histograms", ".", "The", "results", "are", "representative", "for", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The linear regression of MICA expression intensity and binding of a recombinant NKG2D-Fc fusion protein both determined as MFI by flow cytometry is displayed for L-MICA-129Met (n = 79, left panel) and L-MICA-129Val clones (n = 81, right panel). The coefficients of determination (R2), the regression coefficients (reg. coeff.), and the P-values for Pearson correlation are indicated.Purified IL-2-stimulated (100 U/ml for 4 days) NK cells (106) were stimulated with immobilized MICA-129Met-mIgG2a-Fc or MICA-129Val-mIgG2a-Fc or OVA-mIgG2a-Fc fusion proteins (10 μg/ml) for 3, 10, or 30 min. The protein lysates of these cells were separated by SDS-PAGE, and the blot was probed subsequently with an anti-phospho-Tyr mAb, an anti-phospho-SRC family (Tyr419) kinases Ab, and an anti-β-actin mAb as a loading control. The arrow points toward phosphorylated SRC family kinases.Blots obtained from three independent experiments were analyzed by densitometry, and the means plus SD of the ratio between phospho-SRC family kinase and β-actin signals is displayed. The difference between NK cells stimulated for 10 min by MICA-129Met-Fc or MICA-129Val-Fc proteins was assessed by t-test.Purified IL-2-stimulated NK cells (100 U/ml for 4 days, 106) were incubated with the SRC kinase inhibitor PP2 (25 μM), the vehicle DMSO, or medium only (Ø) for 30 min before being added to immobilized MICA-129Met-Fc, MICA-129Val-Fc, or OVA-Fc fusion proteins (10 μg/ml) for 10 min. The protein lysates of these cells were separated by SDS-PAGE, and the blot was probed subsequently with an anti-phospho-Tyr mAb and an anti-β-actin mAb as a loading control. The blot is representative for two independent experiments.In parallel, degranulation of the NK cells was measured by anti-CD107a staining in flow cytometry. The difference between DMSO- and PP2-treated cells with respect to CD107a+ cells and the MFI of CD107a is indicated in the histograms. The results are representative for two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3The", "degranulation", "(", "CD107a", "expression", ")", "of", "purified", "IL", "-", "2", "-", "stimulated", "(", "100", "U", "/", "ml", "for", "4", "days", ")", "NK", "cells", "in", "response", "to", "immobilized", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", "and", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", ",", "and", "as", "negative", "control", ",", "OVA", "-", "Fc", "fusion", "proteins", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", "after", "1", "h", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Displayed", "are", "means", "and", "SD", "of", "the", "MFI", "(", "left", "panel", ")", "and", "the", "percentage", "of", "CD107a", "+", "cells", "(", "right", "panel", ")", ".", "Differences", "between", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", "-", "and", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", "-", "induced", "NK", "-", "cell", "degranulation", "were", "analyzed", "by", "two", "-", "way", "ANCOVA", "adjusted", "for", "MICA", "protein", "concentration", ",", "and", "the", "respective", "P", "-", "values", "are", "indicated", ".", "The", "degranulation", "of", "IL", "-", "2", "-", "stimulated", "LAK", "cells", "(", "100", "U", "/", "ml", "for", "4", "days", ")", "exposed", "to", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "(", "n", "=", "27", ")", "or", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clones", "(", "n", "=", "27", ")", "for", "1", "h", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "CD107a", "cell", "surface", "expression", "was", "analyzed", "after", "gating", "on", "CD56", "+", "NK", "cells", ".", "In", "parallel", ",", "the", "MICA", "expression", "on", "target", "cells", "was", "determined", ".", "Displayed", "are", "the", "linear", "regressions", "of", "the", "MFI", "of", "CD107a", "on", "NK", "cells", "(", "upper", "panels", ")", "or", "the", "proportion", "of", "CD107a", "+", "NK", "cells", "(", "lower", "panels", ")", "and", "the", "MICA", "expression", "intensity", "on", "target", "cells", "(", "MFI", ")", "for", "the", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "(", "left", "panels", ")", "and", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clones", "(", "right", "panels", ")", ".", "The", "coefficients", "of", "determination", "(", "R2", ")", ",", "the", "regression", "coefficients", "(", "reg", ".", "coeff", ".", ")", ",", "and", "the", "P", "-", "values", "for", "Pearson", "correlation", "are", "indicated", ".", "A", "representative", "of", "21", "experiments", "is", "shown", "demonstrating", "the", "specific", "cytotoxic", "activity", "of", "LAK", "cells", "against", "an", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "and", "an", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clone", ".", "L", "-", "con", "cells", "served", "as", "a", "negative", "and", "K562", "cells", "as", "a", "positive", "control", ".", "The", "means", "of", "specific", "lysis", "of", "triplicates", "plus", "SD", "at", "different", "E", ":", "T", "ratios", "(", "200", ":", "1", "to", "3", ":", "1", ")", "were", "measured", "in", "an", "51chromium", "-", "release", "assay", ".", "The", "MICA", "expression", "intensity", "and", "the", "binding", "of", "a", "recombinant", "NKG2D", "-", "Fc", "fusion", "protein", "to", "the", "target", "cells", "were", "determined", "in", "parallel", "by", "flow", "cytometry", ",", "and", "the", "MFIs", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3The degranulation (CD107a expression) of purified IL-2-stimulated (100 U/ml for 4 days) NK cells in response to immobilized MICA-129Met-Fc and MICA-129Val-Fc, and as negative control, OVA-Fc fusion proteins was determined by flow cytometry after 1 h (n = 3). Displayed are means and SD of the MFI (left panel) and the percentage of CD107a+ cells (right panel). Differences between MICA-129Met-Fc- and MICA-129Val-Fc-induced NK-cell degranulation were analyzed by two-way ANCOVA adjusted for MICA protein concentration, and the respective P-values are indicated.The degranulation of IL-2-stimulated LAK cells (100 U/ml for 4 days) exposed to L-MICA-129Met (n = 27) or L-MICA-129Val clones (n = 27) for 1 h was determined by flow cytometry. CD107a cell surface expression was analyzed after gating on CD56+ NK cells. In parallel, the MICA expression on target cells was determined. Displayed are the linear regressions of the MFI of CD107a on NK cells (upper panels) or the proportion of CD107a+ NK cells (lower panels) and the MICA expression intensity on target cells (MFI) for the L-MICA-129Met (left panels) and L-MICA-129Val clones (right panels). The coefficients of determination (R2), the regression coefficients (reg. coeff.), and the P-values for Pearson correlation are indicated.A representative of 21 experiments is shown demonstrating the specific cytotoxic activity of LAK cells against an L-MICA-129Met and an L-MICA-129Val clone. L-con cells served as a negative and K562 cells as a positive control. The means of specific lysis of triplicates plus SD at different E:T ratios (200:1 to 3:1) were measured in an 51chromium-release assay. The MICA expression intensity and the binding of a recombinant NKG2D-Fc fusion protein to the target cells were determined in parallel by flow cytometry, and the MFIs are indicated."}
{"words": ["Figure", "4The", "IFNγ", "expression", "of", "purified", "IL", "-", "2", "-", "stimulated", "(", "100", "U", "/", "ml", "for", "4", "days", ")", "NK", "cells", "exposed", "for", "4", "h", "to", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "(", "n", "=", "23", ")", "or", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clones", "(", "n", "=", "23", ")", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "IFNγ", "expression", "was", "analyzed", "after", "gating", "on", "CD56brightCD16", "−", "NK", "cells", ".", "In", "parallel", ",", "the", "MICA", "expression", "on", "target", "cells", "was", "determined", ".", "Displayed", "are", "the", "linear", "regressions", "of", "the", "MFI", "of", "IFNγ", "in", "CD56brightCD16", "−", "NK", "cells", "(", "upper", "panels", ")", "or", "the", "proportion", "of", "IFNγ", "+", "CD56brightCD16", "−", "NK", "cells", "(", "lower", "panels", ")", "and", "the", "MICA", "expression", "intensity", "on", "target", "cells", "(", "MFI", ")", "for", "the", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "(", "left", "panels", ")", "and", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clones", "(", "right", "panels", ")", ".", "The", "coefficients", "of", "determination", "(", "R2", ")", ",", "the", "regression", "coefficients", "(", "reg", ".", "coeff", ".", ")", ",", "and", "the", "P", "-", "values", "for", "Pearson", "correlation", "are", "indicated", ".", "The", "IFNγ", "release", "of", "purified", "IL", "-", "2", "-", "stimulated", "NK", "cells", "(", "100", "U", "/", "ml", "for", "4", "days", ")", "co", "-", "cultured", "with", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "(", "n", "=", "34", ")", "or", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clones", "(", "n", "=", "32", ")", "for", "24", "h", "was", "measured", "in", "the", "supernatant", "by", "ELISA", ".", "In", "parallel", ",", "the", "MICA", "expression", "intensity", "on", "target", "cells", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "linear", "regressions", "of", "IFNγ", "release", "(", "pg", "/", "ml", ")", "by", "NK", "cells", "and", "MICA", "expression", "on", "targets", "(", "MFI", ")", "are", "displayed", "for", "the", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "clones", "(", "left", "panel", ")", "and", "the", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clones", "(", "right", "panel", ")", ".", "The", "coefficients", "of", "determination", "(", "R2", ")", ",", "the", "regression", "coefficients", "(", "reg", ".", "coeff", ".", ")", ",", "and", "the", "P", "-", "values", "for", "Pearson", "correlation", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4The IFNγ expression of purified IL-2-stimulated (100 U/ml for 4 days) NK cells exposed for 4 h to L-MICA-129Met (n = 23) or L-MICA-129Val clones (n = 23) was determined by flow cytometry. The IFNγ expression was analyzed after gating on CD56brightCD16−NK cells. In parallel, the MICA expression on target cells was determined. Displayed are the linear regressions of the MFI of IFNγ in CD56brightCD16−NK cells (upper panels) or the proportion of IFNγ+CD56brightCD16−NK cells (lower panels) and the MICA expression intensity on target cells (MFI) for the L-MICA-129Met (left panels) and L-MICA-129Val clones (right panels). The coefficients of determination (R2), the regression coefficients (reg. coeff.), and the P-values for Pearson correlation are indicated.The IFNγ release of purified IL-2-stimulated NK cells (100 U/ml for 4 days) co-cultured with L-MICA-129Met (n = 34) or L-MICA-129Val clones (n = 32) for 24 h was measured in the supernatant by ELISA. In parallel, the MICA expression intensity on target cells was determined by flow cytometry. The linear regressions of IFNγ release (pg/ml) by NK cells and MICA expression on targets (MFI) are displayed for the L-MICA-129Met clones (left panel) and the L-MICA-129Val clones (right panel). The coefficients of determination (R2), the regression coefficients (reg. coeff.), and the P-values for Pearson correlation are indicated."}
{"words": ["Figure", "5NKG2D", "expression", "on", "purified", "IL", "-", "2", "-", "stimulated", "NK", "cells", "(", "100", "U", "/", "ml", "for", "4", "days", ")", "exposed", "to", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "(", "n", "=", "25", ")", "or", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clones", "(", "n", "=", "25", ")", "for", "0", ",", "4", ",", "and", "24", "h", "was", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "NK", "cells", "(", "2", ".", "5", "×", "105", ")", "were", "co", "-", "cultured", "with", "5", "×", "104", "target", "cells", "and", "analyzed", "for", "NKG2D", "expression", "after", "gating", "of", "CD3", "−", "CD56", "+", "cells", ".", "The", "means", "and", "SD", "of", "the", "percentage", "of", "NKG2D", "+", "NK", "cells", "(", "left", "panel", ")", "and", "of", "the", "MFI", "of", "NKG2D", "(", "right", "panel", ")", "are", "shown", ".", "Differences", "between", "the", "groups", "were", "analyzed", "by", "repeated", "measures", "ANOVA", ",", "and", "P", "-", "values", "for", "pairwise", "comparisons", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5NKG2D expression on purified IL-2-stimulated NK cells (100 U/ml for 4 days) exposed to L-MICA-129Met (n = 25) or L-MICA-129Val clones (n = 25) for 0, 4, and 24 h was analyzed by flow cytometry. NK cells (2.5 × 105) were co-cultured with 5 × 104 target cells and analyzed for NKG2D expression after gating of CD3−CD56+ cells. The means and SD of the percentage of NKG2D+ NK cells (left panel) and of the MFI of NKG2D (right panel) are shown. Differences between the groups were analyzed by repeated measures ANOVA, and P-values for pairwise comparisons are indicated."}
{"words": ["Figure", "6MACS", "-", "separated", "CD8", "+", "T", "cells", "were", "cultured", "in", "triplicate", "on", "an", "immobilized", "anti", "-", "CD3", "mAb", "(", "0", ".", "005", "μg", "/", "ml", "[", "upper", "panel", "]", "or", "0", ".", "01", "μg", "/", "ml", "[", "lower", "panel", "]", ")", "in", "combination", "with", "recombinant", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", ",", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", ",", "and", "OVA", "-", "Fc", "proteins", "at", "various", "concentrations", "(", "1", ".", "0", ",", "0", ".", "5", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "0", "μg", "/", "ml", ")", ".", "After", "72", "h", ",", "25", "%", "of", "the", "supernatant", "was", "harvested", "and", "IL", "-", "2", "concentrations", "were", "measured", "by", "ELISA", ".", "The", "harvested", "medium", "was", "replaced", "by", "the", "same", "volume", "containing", "1", "μCi", "3H", "-", "labeled", "thymidine", ".", "After", "12", "h", ",", "the", "plates", "were", "completely", "harvested", "and", "the", "DNA", "-", "bound", "radioactivity", "was", "determined", ".", "The", "means", "and", "SD", "of", "the", "stimulation", "index", "(", "SI", ")", "are", "displayed", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Significant", "differences", "between", "MICA", "-", "129Met", "/", "Val", "-", "Fc", "and", "OVA", "-", "Fc", "proteins", "were", "found", "when", "the", "antigen", "-", "specific", "signal", "(", "anti", "-", "CD3", ")", "was", "limited", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ";", "upper", "left", "panel", ":", "1", ".", "0", "μg", "/", "ml", ":", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0372", "and", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0366", ";", "upper", "right", "panel", ":", "1", ".", "0", "μg", "/", "ml", ":", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0499", "and", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0192", ";", "0", ".", "5", "μg", "/", "ml", ":", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0164", "and", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0357", ";", "lower", "left", "panel", ":", "0", ".", "5", "μg", "/", "ml", ":", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0287", "and", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0232", ";", "lower", "right", "panel", ":", "1", ".", "0", "μg", "/", "ml", ":", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0171", "and", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", "versus", "OVA", "-", "Fc", "P", "=", "0", ".", "0484", ")", ".", "Purified", "CFSE", "-", "stained", "CD8", "+", "T", "cells", "were", "stimulated", "by", "immobilized", "anti", "-", "CD3", "(", "0", ".", "005", "μg", "/", "ml", ")", "in", "combination", "with", "recombinant", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", ",", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", ",", "OVA", "-", "Fc", "proteins", ",", "or", "co", "-", "stimulatory", "mAb", "(", "anti", "-", "CD28", ",", "anti", "-", "NKG2D", ")", "or", "an", "isotype", "control", "(", "mIgG1", ")", ".", "The", "proliferation", "of", "CD3", "+", "CD8", "+", "T", "cells", "was", "assessed", "at", "60", "h", "by", "flow", "cytometry", ".", "Results", "of", "a", "representative", "out", "of", "6", "experiments", "are", "displayed", ".", "Untreated", "CFSE", "-", "stained", "CD8", "+", "T", "cells", "are", "included", "for", "comparison", ".", "The", "percentage", "of", "proliferating", "cells", "and", "MFI", "for", "CFSE", "are", "indicated", ".", "The", "MFI", "of", "CFSE", "in", "unstimulated", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "control", ")", "was", "set", "to", "100", "%", "in", "individual", "experiments", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "and", "the", "relative", "decrease", "due", "to", "proliferation", "was", "calculated", ".", "Means", "+", "SD", "are", "shown", ".", "Significant", "differences", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0277", ",", "Wilcoxon", "test", ")", "between", "MICA", "-", "129Met", "-", "Fc", "versus", "MICA", "-", "129Val", "-", "Fc", "and", "OVA", "-", "Fc", "proteins", "were", "found", "at", "slightly", "higher", "anti", "-", "CD3", "concentrations", "(", "0", ".", "1", "and", "0", ".", "05", "μg", "/", "ml", ")", "than", "at", "later", "time", "points", "(", "see", "A", ")", ".", "Anti", "-", "CD28", "and", "anti", "-", "NKG2D", "mAb", "were", "used", "in", "parallel", "as", "a", "positive", "control", ",", "mean", "+", "SD", "are", "shown", ",", "and", "significant", "differences", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0277", ",", "Wilcoxon", "test", ")", "to", "the", "isotype", "control", "(", "mIgG1", ")", "are", "indicated", "(", "n", "=", "6", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6MACS-separated CD8+ T cells were cultured in triplicate on an immobilized anti-CD3 mAb (0.005 μg/ml [upper panel] or 0.01 μg/ml [lower panel]) in combination with recombinant MICA-129Met-Fc, MICA-129Val-Fc, and OVA-Fc proteins at various concentrations (1.0, 0.5, 0.1, 0.0 μg/ml). After 72 h, 25% of the supernatant was harvested and IL-2 concentrations were measured by ELISA. The harvested medium was replaced by the same volume containing 1 μCi 3H-labeled thymidine. After 12 h, the plates were completely harvested and the DNA-bound radioactivity was determined. The means and SD of the stimulation index (SI) are displayed (n = 4). Significant differences between MICA-129Met/Val-Fc and OVA-Fc proteins were found when the antigen-specific signal (anti-CD3) was limited (*P < 0.05, t-test; upper left panel: 1.0 μg/ml: MICA-129Met-Fc versus OVA-Fc P = 0.0372 and MICA-129Val-Fc versus OVA-Fc P = 0.0366; upper right panel: 1.0 μg/ml: MICA-129Met-Fc versus OVA-Fc P = 0.0499 and MICA-129Val-Fc versus OVA-Fc P = 0.0192; 0.5 μg/ml: MICA-129Met-Fc versus OVA-Fc P = 0.0164 and MICA-129Val-Fc versus OVA-Fc P = 0.0357; lower left panel: 0.5 μg/ml: MICA-129Met-Fc versus OVA-Fc P = 0.0287 and MICA-129Val-Fc versus OVA-Fc P = 0.0232; lower right panel: 1.0 μg/ml: MICA-129Met-Fc versus OVA-Fc P = 0.0171 and MICA-129Val-Fc versus OVA-Fc P = 0.0484).Purified CFSE-stained CD8+T cells were stimulated by immobilized anti-CD3 (0.005 μg/ml) in combination with recombinant MICA-129Met-Fc, MICA-129Val-Fc, OVA-Fc proteins, or co-stimulatory mAb (anti-CD28, anti-NKG2D) or an isotype control (mIgG1). The proliferation of CD3+CD8+T cells was assessed at 60 h by flow cytometry. Results of a representative out of 6 experiments are displayed. Untreated CFSE-stained CD8+T cells are included for comparison. The percentage of proliferating cells and MFI for CFSE are indicated.The MFI of CFSE in unstimulated CD8+T cells (control) was set to 100% in individual experiments (n = 6), and the relative decrease due to proliferation was calculated. Means + SD are shown. Significant differences (*P = 0.0277, Wilcoxon test) between MICA-129Met-Fc versus MICA-129Val-Fc and OVA-Fc proteins were found at slightly higher anti-CD3 concentrations (0.1 and 0.05 μg/ml) than at later time points (see A).Anti-CD28 and anti-NKG2D mAb were used in parallel as a positive control, mean + SD are shown, and significant differences (*P = 0.0277, Wilcoxon test) to the isotype control (mIgG1) are indicated (n = 6)."}
{"words": ["Figure", "7NKG2D", "expression", "on", "purified", "CD8", "+", "T", "cells", "exposed", "to", "L", "-", "MICA", "-", "129Met", "(", "n", "=", "19", ")", "or", "L", "-", "MICA", "-", "129Val", "clones", "(", "n", "=", "19", ")", "for", "0", ",", "4", ",", "and", "24", "h", "was", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "2", ".", "5", "×", "105", ")", "were", "co", "-", "cultured", "with", "5", "×", "104", "target", "cells", "and", "analyzed", "for", "NKG2D", "expression", "after", "gating", "on", "CD3", "+", "CD8", "+", "T", "cells", ".", "The", "means", "and", "SD", "of", "the", "MFI", "of", "NKG2D", "(", "left", "panel", ")", "and", "of", "the", "percentage", "of", "NKG2D", "+", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "right", "panel", ")", "are", "displayed", ".", "Differences", "between", "the", "groups", "were", "analyzed", "by", "repeated", "measures", "ANOVA", ",", "and", "the", "P", "-", "values", "are", "indicated", ".", "Purified", "CD8", "+", "T", "cells", "were", "cultured", "on", "plate", "-", "bound", "anti", "-", "NKG2D", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "or", "isotype", "control", "(", "mIgG1", ")", "for", "24", "h", "before", "the", "NKG2D", "expression", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "Means", "and", "SD", "of", "MFI", "(", "upper", "panel", ")", "and", "percentage", "of", "NKG2D", "+", "cells", "(", "lower", "panel", ")", "are", "shown", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Differences", "between", "the", "groups", "were", "analyzed", "by", "t", "-", "tests", ",", "and", "the", "P", "-", "values", "are", "indicated", ".", "These", "CD8", "+", "T", "cells", "were", "subsequently", "CFSE", "-", "stained", "and", "cultured", "on", "plates", "coated", "with", "anti", "-", "CD3", "(", "0", ".", "005", "μg", "/", "ml", ")", "in", "combination", "with", "anti", "-", "CD28", "(", "0", ".", "5", "μg", "/", "ml", ")", "as", "a", "positive", "control", "or", "anti", "-", "NKG2D", "(", "0", ".", "5", "μg", "/", "ml", ")", ".", "Proliferation", "was", "measured", "after", "60", "h", "by", "flow", "cytometry", ".", "Untreated", "CFSE", "-", "stained", "CD8", "+", "T", "cells", "are", "included", "for", "comparison", ".", "The", "percentage", "of", "proliferating", "cells", "and", "the", "MFI", "for", "CFSE", "are", "indicated", ".", "The", "MFI", "of", "CFSE", "in", "unstimulated", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "control", ")", "was", "set", "to", "100", "%", "in", "individual", "experiments", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "and", "the", "relative", "decrease", "due", "to", "proliferation", "was", "calculated", ".", "Means", "+", "SD", "are", "shown", ".", "Significant", "differences", "(", "Wilcoxon", "test", ")", "between", "CD8", "+", "T", "cells", "pre", "-", "exposed", "to", "anti", "-", "NKG2D", "and", "isotype", "control", "(", "mIgG1", ")", "were", "found", "in", "these", "experiments", "at", "anti", "-", "CD3", "concentrations", "of", "0", ".", "01", "and", "0", ".", "005", "μg", "/", "ml", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7NKG2D expression on purified CD8+T cells exposed to L-MICA-129Met (n = 19) or L-MICA-129Val clones (n = 19) for 0, 4, and 24 h was analyzed by flow cytometry. CD8+T cells (2.5 × 105) were co-cultured with 5 × 104 target cells and analyzed for NKG2D expression after gating on CD3+CD8+T cells. The means and SD of the MFI of NKG2D (left panel) and of the percentage of NKG2D+CD8+T cells (right panel) are displayed. Differences between the groups were analyzed by repeated measures ANOVA, and the P-values are indicated.Purified CD8+ T cells were cultured on plate-bound anti-NKG2D (1 μg/ml) or isotype control (mIgG1) for 24 h before the NKG2D expression was measured by flow cytometry. Means and SD of MFI (upper panel) and percentage of NKG2D+ cells (lower panel) are shown (n = 6). Differences between the groups were analyzed by t-tests, and the P-values are indicated.These CD8+T cells were subsequently CFSE-stained and cultured on plates coated with anti-CD3 (0.005 μg/ml) in combination with anti-CD28 (0.5 μg/ml) as a positive control or anti-NKG2D (0.5 μg/ml). Proliferation was measured after 60 h by flow cytometry. Untreated CFSE-stained CD8+T cells are included for comparison. The percentage of proliferating cells and the MFI for CFSE are indicated.The MFI of CFSE in unstimulated CD8+T cells (control) was set to 100% in individual experiments (n = 6), and the relative decrease due to proliferation was calculated. Means + SD are shown. Significant differences (Wilcoxon test) between CD8+T cells pre-exposed to anti-NKG2D and isotype control (mIgG1) were found in these experiments at anti-CD3 concentrations of 0.01 and 0.005 μg/ml."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "D", "Appearance", "of", "autophagic", "structures", "(", "marked", "with", "GFP", "-", "Atg8a", ")", "during", "wound", "closure", "in", "the", "epidermis", "of", "control", "third", "instar", "larvae", "and", "after", "epidermal", "knockdown", "of", "the", "autophagy", "pathway", "components", "Atg1", ",", "Atg5", ",", "Atg6", ",", "Atg7", "or", "Atg12", ".", "All", "constructs", "are", "expressed", "in", "the", "epidermis", "under", "the", "control", "of", "the", "A58", "-", "Gal4", "driver", ".", "(", "A", ")", "Time", "points", "from", "movies", "of", "wounded", "epidermis", ".", "The", "wounds", "have", "closed", "by", "2", "h", "in", "all", "cases", ".", "(", "B", ")", "Higher", "magnification", "of", "the", "areas", "marked", "by", "magenta", "boxes", "at", "t", "=", "120", "min", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "appearance", "of", "GFP", "-", "Atg8a", "puncta", "in", "the", "imaged", "area", "(", "10000", "µm2", ")", "3", "control", "larvae", ",", "shown", "for", "each", "individual", "larva", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "number", "of", "GFP", "-", "Atg8a", "puncta", "in", "different", "genetic", "conditions", "measured", "in", "an", "area", "of", "10000", "µm2", "at", "the", "time", "of", "wound", "closure", ";", "n", "=", "4", "-", "10", "larvae", "each", "genotype", ",", "for", "the", "detail", "see", "Data", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-D Appearance of autophagic structures (marked with GFP-Atg8a) during wound closure in the epidermis of control third instar larvae and after epidermal knockdown of the autophagy pathway components Atg1, Atg5, Atg6, Atg7 or Atg12. All constructs are expressed in the epidermis under the control of the A58-Gal4 driver. (A) Time points from movies of wounded epidermis. The wounds have closed by 2 h in all cases. (B) Higher magnification of the areas marked by magenta boxes at t=120 min. (C) Quantification of the appearance of GFP-Atg8a puncta in the imaged area (10000 µm2) 3 control larvae, shown for each individual larva. (D) Quantification of number of GFP-Atg8a puncta in different genetic conditions measured in an area of 10000 µm2 at the time of wound closure; n=4-10 larvae each genotype, for the detail see Data analysis."}
{"words": ["Figure", "3Control", "of", "epidermal", "autophagy", "by", "TOR", "signalling", ".", "(", "A", ")", "Epidermis", "of", "third", "instar", "larvae", "expressing", "the", "autophagosome", "marker", "GFP", "-", "Atg8a", "together", "with", "constructs", "for", "up", "-", "or", "down", "-", "regulating", "the", "autophagy", "pathway", "in", "the", "epidermis", ".", "Healthy", "epidermis", "contains", "few", "autophagosomes", ",", "but", "artificially", "activating", "autophagy", "through", "overexpression", "of", "Atg1", "or", "blocking", "TOR", "signalling", "leads", "to", "accumulation", "of", "autophagosomes", ".", "(", "B", ")", "Higher", "magnification", "of", "the", "areas", "marked", "by", "magenta", "boxes", "in", "(", "A", ")", ".", "Control", "of", "epidermal", "autophagy", "by", "TOR", "signalling", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "Atg8a", "puncta", "in", "an", "area", "of", "10000", "µm2", ",", "n", "=", "6", "-", "8", "larvae", "each", "genotype", ".", "We", "assumed", "unequal", "sample", "size", "and", "unequal", "variances", "and", "calculations", "were", "performed", ".", "Values", "are", "presented", "as", "box", "plots", ".", "Box", "plot", "elements", "are", ":", "center", "line", ",", "median", ";", "box", "limits", ",", "upper", "and", "lower", "quartiles", ";", "whiskers", ",", "1", ".", "5x", "interquartile", "range", ";", "points", ",", "outliers", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Control of epidermal autophagy by TOR signalling. (A) Epidermis of third instar larvae expressing the autophagosome marker GFP-Atg8a together with constructs for up- or down-regulating the autophagy pathway in the epidermis. Healthy epidermis contains few autophagosomes, but artificially activating autophagy through overexpression of Atg1 or blocking TOR signalling leads to accumulation of autophagosomes. (B) Higher magnification of the areas marked by magenta boxes in (A).Control of epidermal autophagy by TOR signalling. (C) Quantification of Atg8a puncta in an area of 10000 µm2, n=6-8 larvae each genotype. We assumed unequal sample size and unequal variances and calculations were performed. Values are presented as box plots. Box plot elements are: center line, median; box limits, upper and lower quartiles; whiskers, 1.5x interquartile range; points, outliers."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "D", "Fluorescence", "loss", "in", "photobleaching", "(", "FLIP", ")", "to", "test", "free", "cytoplasmic", "GFP", "motility", "within", "the", "epidermis", ".", "A", "small", "area", "(", "magenta", "circle", ";", "179", "or", "1098", "µm2", ")", "was", "laser", "-", "illuminated", "for", "the", "indicated", "times", "(", "3", "or", "20", "min", ")", "in", "control", "or", "Atg1", "-", "expressing", "epidermis", "also", "expressing", "free", "GFP", ".", "(", "A", ")", "Snapshots", "before", "bleaching", "and", "at", "3", "points", "of", "recovery", ".", "(", "B", ")", "Kymographs", "along", "the", "broken", "line", "in", "(", "A", ")", "during", "recovery", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Quantification", "of", "fluorescence", "recovery", "after", "bleaching", ",", "shown", "separately", "for", "3", "and", "20", "min", "bleaching", "protocols", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-D Fluorescence loss in photobleaching (FLIP) to test free cytoplasmic GFP motility within the epidermis. A small area (magenta circle; 179 or 1098 µm2) was laser-illuminated for the indicated times (3 or 20 min) in control or Atg1-expressing epidermis also expressing free GFP. (A) Snapshots before bleaching and at 3 points of recovery. (B) Kymographs along the broken line in (A) during recovery. (C, D) Quantification of fluorescence recovery after bleaching, shown separately for 3 and 20 min bleaching protocols."}
{"words": ["Figure", "8B", "-", "D", "Atg1", "-", "induced", "syncytium", "formation", "is", "abolished", "when", "Atg5", "function", "is", "downregulated", "(", "compare", "to", "rows", "2", "and", "3", "in", "Fig", ".", "5A", ",", "B", ")", ";", "same", "representation", "as", "shown", "in", "Fig", ".", "5A", "-", "D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8B-D Atg1-induced syncytium formation is abolished when Atg5 function is downregulated (compare to rows 2 and 3 in Fig. 5A, B); same representation as shown in Fig. 5A-D."}
{"words": ["Figure", "9C", ",", "D", "Accumulation", "of", "neutral", "lipid", "in", "the", "cytoplasm", "under", "conditions", "of", "uncontrolled", "autophagy", ".", "(", "C", ")", "Fixed", "epidermis", "from", "larvae", "expressing", "the", "indicated", "constructs", "was", "stained", "with", "BodiPy", "493", "/", "503", "to", "mark", "lipid", "accumulations", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "lipid", "puncta", "in", "an", "epidermal", "area", "of", "10000", "µm2", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "A", "-", "D", ",", "n", "=", "7", "-", "20", "larvae", "each", "genotype", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9C, D Accumulation of neutral lipid in the cytoplasm under conditions of uncontrolled autophagy. (C) Fixed epidermis from larvae expressing the indicated constructs was stained with BodiPy 493/503 to mark lipid accumulations. (D) Quantification of the number of lipid puncta in an epidermal area of 10000 µm2 in the indicated conditions. A-D, n=7-20 larvae each genotype."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ",", "b", ")", "Bacteria", "in", "the", "spleens", "of", "Slamf1", "−", "/", "−", "Rag1", "−", "/", "−", "and", "Rag1", "−", "/", "−", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "a", ")", "or", "Slamf1", "−", "/", "−", "and", "Slamf1", "+", "/", "+", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "b", ")", "48", "h", "after", "intraperitoneal", "injection", "of", "virulent", "S", ".", "typhimurium", "14028s", "or", "attenuated", "S", ".", "typhimurium", "SseB", "−", ".", "CFU", ",", "colony", "-", "forming", "units", ";", "ND", ",", "not", "detectable", ".", "Data", "are", "representative", "of", "four", "independent", "experiments", "(", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "(", "c", "-", "e", ")", "Killing", "of", "bacteria", "by", "peritoneal", "macrophages", "from", "Slamf1", "+", "/", "+", "and", "Slamf1", "−", "/", "−", "BALB", "/", "c", "mice", "exposed", "to", "S", ".", "typhimurium", "SseB", "−", "(", "c", ")", ",", "E", ".", "coli", "F18", "(", "d", ")", "or", "S", ".", "aureus", "(", "e", ")", ",", "assessed", "by", "gentamycin", "assay", ".", "Data", "are", "representative", "of", "five", "independent", "experiments", "(", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "(", "f", ")", "Uptake", "of", "bacteria", "by", "Slamf1", "+", "/", "+", "(", "red", "solid", "lines", ")", "or", "Slamf1", "−", "/", "−", "(", "black", "solid", "lines", ")", "BALB", "/", "c", "peritoneal", "macrophages", "incubated", "at", "37", "°", "C", "with", "E", ".", "coli", "-", "eGFP", "or", "S", ".", "typhimurium", "-", "eGFP", "or", "by", "Slamf1", "+", "/", "+", "macrophages", "incubated", "for", "60", "min", "at", "4", "°", "C", "with", "the", "bacteria", "(", "dotted", "lines", ")", ".", "Right", ",", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a,b) Bacteria in the spleens of Slamf1−/−Rag1−/− and Rag1−/− BALB/c mice (a) or Slamf1−/− and Slamf1+/+ BALB/c mice (b) 48 h after intraperitoneal injection of virulent S. typhimurium 14028s or attenuated S. typhimurium SseB−. CFU, colony-forming units; ND, not detectable. Data are representative of four independent experiments (mean and s.d.).(c-e) Killing of bacteria by peritoneal macrophages from Slamf1+/+ and Slamf1−/− BALB/c mice exposed to S. typhimurium SseB− (c), E. coli F18 (d) or S. aureus (e), assessed by gentamycin assay. Data are representative of five independent experiments (mean and s.d.).(f) Uptake of bacteria by Slamf1+/+ (red solid lines) or Slamf1−/− (black solid lines) BALB/c peritoneal macrophages incubated at 37 °C with E. coli-eGFP or S. typhimurium-eGFP or by Slamf1+/+ macrophages incubated for 60 min at 4 °C with the bacteria (dotted lines). Right, mean fluorescence intensity (MFI). Data are representative of three independent experiments (mean and s.d.)."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "NOX2", "activity", "in", "Slamf1", "+", "/", "+", "and", "Slamf1", "-", "/", "-", "BALB", "/", "c", "peritoneal", "macrophages", "stimulated", "for", "0", "-", "100", "min", "with", "E", ".", "coli", "F18", ",", "S", ".", "aureus", "or", "PMA", ",", "assessed", "with", "lucigenin", ".", "Data", "are", "representative", "of", "five", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "(", "b", ")", "Phagosomal", "pH", "of", "Slamf1", "+", "/", "+", ",", "Slamf1", "-", "/", "-", "and", "gp91phox", "-", "/", "-", "B6", "primary", "macrophages", "loaded", "for", "0", "-", "200", "min", "with", "pHrodo", "-", "coated", "E", ".", "coli", "or", "S", ".", "aureus", ",", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "(", "c", ")", "NOX2", "activity", "in", "primary", "macrophages", "in", "response", "to", "LPS", ",", "purified", "OmpC", ",", "peptidoglycan", "(", "PGN", ")", "or", "PMA", ",", "assessed", "with", "lucigenin", ".", "TLR4", "-", "KO", ",", "TLR4", "-", "deficient", "(", "strain", "del", "/", "Jtht", ";", "C3H", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "five", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) NOX2 activity in Slamf1+/+ and Slamf1-/- BALB/c peritoneal macrophages stimulated for 0-100 min with E. coli F18, S. aureus or PMA, assessed with lucigenin. Data are representative of five independent experiments (mean ± s.d.).(b) Phagosomal pH of Slamf1+/+, Slamf1-/- and gp91phox-/- B6 primary macrophages loaded for 0-200 min with pHrodo-coated E. coli or S. aureus, analyzed by flow cytometry. Data are representative of three independent experiments (mean ± s.d.).(c) NOX2 activity in primary macrophages in response to LPS, purified OmpC, peptidoglycan (PGN) or PMA, assessed with lucigenin. TLR4-KO, TLR4-deficient (strain del/Jtht; C3H). Data are representative of five independent experiments (mean ± s.d.)."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Fluorescence", "microscopy", "of", "E", ".", "coli", "-", "containing", "phagosomes", "in", "primary", "macrophages", "transfected", "with", "RFP", "-", "conjugated", "LAMP", "-", "1", ",", "showing", "colocalization", "with", "E", ".", "coli", "-", "eGFP", "or", "S", ".", "aureus", "-", "eGFP", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "phagosomes", "in", "the", "microscopy", "at", "left", ".", "(", "b", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "LAMP", "-", "1", "in", "phagosomes", "isolated", "by", "sucrose", "-", "gradient", "flotation", "from", "RAW264", ".", "7", "macrophages", "after", "phagocytosis", "by", "Slamf1", "-", "or", "mock", "-", "transfected", "RAW264", ".", "7", "macrophages", "of", "beads", "coated", "with", "E", ".", "coli", "outer", "membrane", "extract", ".", "WCL", ",", "whole", "-", "cell", "lysate", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "LAMP", "-", "1", "in", "the", "immunoblot", "at", "left", ".", "(", "c", ")", "Localization", "of", "MHC", "class", "II", "-", "eGFP", "(", "MHCII", "GFP", ")", "in", "phagosomes", "of", "primary", "macrophages", "from", "Slamf1", "+", "/", "+", "or", "Slamf1", "−", "/", "−", "MHC", "class", "II", "-", "eGFP", "(", "B6", ")", "mice", "and", "3", "-", "μm", "beads", "coated", "with", "E", ".", "coli", "outer", "membrane", "extract", ".", "(", "d", ")", "Entry", "of", "3", "-", "μm", "beads", "coated", "with", "E", ".", "coli", "outer", "membrane", "extract", "into", "lysosomes", "loaded", "with", "Texas", "red", "-", "dextran", ".", "Right", "(", "c", ",", "d", ")", ",", "quantification", "of", "fluorescence", "in", "the", "microscopy", "at", "left", ".", "Numbers", "in", "bottom", "right", "corners", "(", "a", ",", "c", ",", "d", ")", "indicate", "time", "(", "in", "min", ")", ".", "Original", "magnification", "(", "a", "-", "c", ")", ",", "×", "60", ".", "DIC", ",", "differential", "interference", "contrast", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "combined", "experiments", "(", "a", ")", "or", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "b", "-", "d", ")", "with", "at", "least", "100", "beads", "or", "80", "bacteria", "in", "each", "(", "error", "bars", ",", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Fluorescence microscopy of E. coli-containing phagosomes in primary macrophages transfected with RFP-conjugated LAMP-1, showing colocalization with E. coli-eGFP or S. aureus-eGFP. Right, quantification of LAMP-1+ phagosomes in the microscopy at left.(b) Immunoblot analysis of LAMP-1 in phagosomes isolated by sucrose-gradient flotation from RAW264.7 macrophages after phagocytosis by Slamf1- or mock-transfected RAW264.7 macrophages of beads coated with E. coli outer membrane extract. WCL, whole-cell lysate. Right, quantification of LAMP-1 in the immunoblot at left.(c) Localization of MHC class II-eGFP (MHCII GFP) in phagosomes of primary macrophages from Slamf1+/+ or Slamf1−/− MHC class II-eGFP (B6) mice and 3-μm beads coated with E. coli outer membrane extract. (d) Entry of 3-μm beads coated with E. coli outer membrane extract into lysosomes loaded with Texas red-dextran. Right (c,d), quantification of fluorescence in the microscopy at left. Numbers in bottom right corners (a,c,d) indicate time (in min). Original magnification (a-c), ×60. DIC, differential interference contrast. Data are representative of three combined experiments (a) or at least three independent experiments (b-d) with at least 100 beads or 80 bacteria in each (error bars, s.d.)."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ",", "b", ")", "Association", "of", "EEA", "-", "1", "(", "a", ")", "or", "Rab5", "(", "b", ")", "with", "phagosomes", "generated", "in", "primary", "macrophages", "by", "3", "-", "μm", "beads", "coated", "with", "E", ".", "coli", "outer", "membrane", "extract", ";", "numbers", "in", "bottom", "corners", "indicate", "time", "(", "in", "min", ")", ".", "α", "-", ",", "anti", "-", ".", "Original", "magnification", ",", "×", "60", ".", "Right", "(", "a", ",", "b", ")", ",", "quantification", "of", "fluorescence", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "error", "bars", ",", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a,b) Association of EEA-1 (a) or Rab5 (b) with phagosomes generated in primary macrophages by 3-μm beads coated with E. coli outer membrane extract; numbers in bottom corners indicate time (in min). α-, anti-. Original magnification, ×60. Right (a,b), quantification of fluorescence. Data are representative of at least three independent experiments (error bars, s.d.)."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Colocalization", "of", "SLAM", "and", "bacteria", "in", "RAW264", ".", "7", "macrophages", "transfected", "with", "SLAM", "-", "mCherry", "and", "allowed", "to", "phagocytose", "E", ".", "coli", "-", "eGFP", "or", "S", ".", "aureus", "-", "eGFP", "for", "0", "-", "120", "min", "(", "time", "(", "in", "min", ")", ",", "bottom", "right", "corners", "at", "left", ")", ".", "Original", "magnification", ",", "×", "60", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "fluorescence", "at", "left", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "with", "a", "minimum", "of", "40", "bacteria", "per", "time", "point", "(", "error", "bars", ",", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "(", "b", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "phagosome", "isolates", "from", "RAW264", ".", "7", "macrophages", "transiently", "transfected", "with", "cDNA", "encoding", "Myc", "-", "tagged", "SLAM", "(", "Slamf1", "-", "Myc", ")", "or", "mock", "transfected", "and", "allowed", "to", "phagocytose", "beads", "coated", "with", "E", ".", "coli", "outer", "membrane", "extract", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "kDa", ",", "kilodaltons", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Colocalization of SLAM and bacteria in RAW264.7 macrophages transfected with SLAM-mCherry and allowed to phagocytose E. coli-eGFP or S. aureus-eGFP for 0-120 min (time (in min), bottom right corners at left). Original magnification, ×60. Right, quantification of fluorescence at left. Data are representative of two independent experiments with a minimum of 40 bacteria per time point (error bars, s.d.).(b) Immunoblot analysis of phagosome isolates from RAW264.7 macrophages transiently transfected with cDNA encoding Myc-tagged SLAM (Slamf1-Myc) or mock transfected and allowed to phagocytose beads coated with E. coli outer membrane extract for 60 or 120 min. kDa, kilodaltons. Data are representative of at least three independent experiments."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Luciferase", "activity", "in", "Jurkat", "cells", "transfected", "with", "a", "fusion", "of", "SLAM", "and", "CD3ζ", "and", "a", "luciferase", "reporter", "(", "as", "described", "in", "Results", ")", ",", "plus", "a", "renilla", "luciferase", "reporter", ",", "then", "exposed", "to", "heat", "-", "killed", "bacteria", "(", "top", ")", ".", "(", "b", ")", "Luciferase", "activity", "in", "Jurkat", "cells", "transfected", "with", "the", "fusion", "in", "a", "(", "Slamf1", "-", "CD3ζ", ")", "or", "a", "fusion", "of", "SLAM", "ectodomain", "construct", "lacking", "the", "immunoglobulin", "V", "domain", "and", "CD3ζ", "(", "ΔIgV", "-", "Slamf1", "-", "CD3ζ", ")", ",", "and", "luciferase", "reporters", "as", "in", "a", ",", "then", "exposed", "to", "heat", "-", "killed", "E", ".", "coli", "F18", ".", "(", "c", ")", "Luciferase", "activity", "in", "Jurkat", "cells", "transfected", "as", "in", "a", ",", "then", "left", "uninoculated", "(", "−", ")", "or", "inoculated", "with", "10", "×", "108", "E", ".", "coli", "F18", "(", "+", ")", ",", "followed", "by", "the", "addition", "of", "monoclonal", "antibody", "(", "mAb", ";", "amount", ",", "under", "graph", ")", "9D1", "to", "SLAM", "(", "α", "-", "SLAM", ")", "or", "rat", "immunoglobulin", "G2b", "isotype", "-", "matched", "control", "antibody", "(", "Rat", "IgG2b", ")", ".", "(", "d", ")", "Luciferase", "activity", "in", "Jurkat", "cells", "transfected", "as", "in", "a", ",", "then", "exposed", "to", "medium", "alone", "(", "Med", ")", ",", "wild", "-", "type", "E", ".", "coli", "(", "JM101", ")", ",", "or", "JM101", "E", ".", "coli", "mutants", "lacking", "both", "Omp", "C", "and", "Omp", "F", "(", "HN705", ")", "or", "lacking", "either", "OmpC", "(", "ΔOmpC", ")", "or", "OmpF", "(", "ΔOmpF", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "error", "bars", "(", "a", ")", ",", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Luciferase activity in Jurkat cells transfected with a fusion of SLAM and CD3ζ and a luciferase reporter (as described in Results), plus a renilla luciferase reporter, then exposed to heat-killed bacteria (top).(b) Luciferase activity in Jurkat cells transfected with the fusion in a (Slamf1-CD3ζ) or a fusion of SLAM ectodomain construct lacking the immunoglobulin V domain and CD3ζ (ΔIgV-Slamf1-CD3ζ), and luciferase reporters as in a, then exposed to heat-killed E. coli F18.(c) Luciferase activity in Jurkat cells transfected as in a, then left uninoculated (−) or inoculated with 10 × 108 E. coli F18 (+), followed by the addition of monoclonal antibody (mAb; amount, under graph) 9D1 to SLAM (α-SLAM) or rat immunoglobulin G2b isotype-matched control antibody (Rat IgG2b).(d) Luciferase activity in Jurkat cells transfected as in a, then exposed to medium alone (Med), wild-type E. coli (JM101), or JM101 E. coli mutants lacking both Omp C and Omp F (HN705) or lacking either OmpC (ΔOmpC) or OmpF (ΔOmpF). Data are representative of at least three independent experiments (error bars (a), s.d.)."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ",", "b", ")", "Production", "of", "phagosomal", "PtdIns", "(", "3", ")", "P", "in", "E", ".", "coli", "-", "containing", "phagosomes", "of", "primary", "peritoneal", "macrophages", "transfected", "with", "reporter", "cDNA", "encoding", "an", "eGFP", "-", "tagged", "PX", "domain", "of", "p40phox", "(", "p40", "PX", "-", "eGFP", ")", "and", "treated", "with", "DsRed", "-", "expressing", "E", ".", "coli", "(", "E", ".", "coli", "-", "DsRed", ";", "a", ")", "or", "beads", "coated", "with", "E", ".", "coli", "outer", "membrane", "extract", "(", "b", ")", ".", "Numbers", "in", "bottom", "right", "corners", "indicate", "time", "(", "in", "min", ")", ".", "Original", "magnification", ",", "×", "60", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "fluorescence", "in", "microscopy", "at", "left", ".", "(", "c", ")", "HPLC", "analysis", "of", "the", "production", "of", "PtdIns", "(", "3", ")", "P", "in", "primary", "macrophages", "labeled", "with", "3H", "-", "tagged", "myoinositol", "and", "treated", "with", "beads", "coated", "with", "E", ".", "coli", "outer", "membrane", "extract", ".", "(", "d", ")", "PtdIns", "(", "3", ")", "P", "production", "in", "RAW264", ".", "7", "cells", "stably", "expressing", "SLAM", "or", "a", "mock", "construct", ",", "transfected", "with", "eGFP", "-", "tagged", "p40", "PX", "and", "treated", "with", "beads", "coated", "with", "E", ".", "coli", "outer", "membrane", "extract", ".", "Data", "are", "from", "three", "combined", "experiments", "(", "a", ")", "or", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "b", ",", "d", ")", "or", "two", "independent", "experiments", "(", "c", ")", "with", "at", "least", "100", "beads", "or", "bacteria", "per", "experiment", "(", "error", "bars", ",", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a,b) Production of phagosomal PtdIns(3)P in E. coli-containing phagosomes of primary peritoneal macrophages transfected with reporter cDNA encoding an eGFP-tagged PX domain of p40phox (p40 PX-eGFP) and treated with DsRed-expressing E. coli (E. coli-DsRed; a) or beads coated with E. coli outer membrane extract (b). Numbers in bottom right corners indicate time (in min). Original magnification, ×60. Right, quantification of fluorescence in microscopy at left.(c) HPLC analysis of the production of PtdIns(3)P in primary macrophages labeled with 3H-tagged myoinositol and treated with beads coated with E. coli outer membrane extract.(d) PtdIns(3)P production in RAW264.7 cells stably expressing SLAM or a mock construct, transfected with eGFP-tagged p40 PX and treated with beads coated with E. coli outer membrane extract. Data are from three combined experiments (a) or are representative of at least three independent experiments (b,d) or two independent experiments (c) with at least 100 beads or bacteria per experiment (error bars, s.d.)."}
{"words": ["figf8", "(", "a", ",", "b", ")", "Immunoassay", "of", "293", "cells", "transfected", "with", "various", "combinations", "of", "full", "-", "length", "SLAM", "(", "a", ")", "or", "hemagglutinin", "-", "tagged", "(", "-", "HA", ")", "tail", "-", "less", "SLAM", "(", "b", ")", ",", "EAT", "-", "2A", ",", "V5", "-", "tagged", "(", "-", "V5", ")", "Vps34", "-", "Vps15", ",", "and", "beclin", "-", "1", ";", "proteins", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "lysates", "with", "monoclonal", "antibody", "to", "SLAM", ",", "as", "well", "as", "whole", "-", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", ",", "were", "analyzed", "by", "immunoblot", "(", "IB", ")", "with", "anti", "-", "beclin", "-", "1", ",", "anti", "-", "Vps34", ",", "anti", "-", "V5", ",", "anti", "-", "hemagglutinin", ",", "anti", "-", "SLAM", "or", "anti", "-", "EAT2", ".", "(", "c", ")", "Microscopy", "of", "RAW264", ".", "7", "cells", "transiently", "transfected", "with", "cDNA", "encoding", "GFP", "-", "tagged", "beclin", "-", "1", "and", "SLAM", "-", "mCherry", ",", "then", "treated", "with", "beads", "coated", "with", "E", ".", "coli", "outer", "membrane", "extract", "(", "at", "a", "ratio", "of", "10", ":", "1", ",", "beads", "/", "cells", ")", "and", "fixed", "after", "60", "min", ".", "Data", "are", "representative", "of", "six", "(", "a", ")", "or", "two", "(", "b", ",", "c", ")", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf8(a,b) Immunoassay of 293 cells transfected with various combinations of full-length SLAM (a) or hemagglutinin-tagged (-HA) tail-less SLAM (b), EAT-2A, V5-tagged (-V5) Vps34-Vps15, and beclin-1; proteins immunoprecipitated (IP) from lysates with monoclonal antibody to SLAM, as well as whole-cell lysates (WCL), were analyzed by immunoblot (IB) with anti-beclin-1, anti-Vps34, anti-V5, anti-hemagglutinin, anti-SLAM or anti-EAT2.(c) Microscopy of RAW264.7 cells transiently transfected with cDNA encoding GFP-tagged beclin-1 and SLAM-mCherry, then treated with beads coated with E. coli outer membrane extract (at a ratio of 10:1, beads/cells) and fixed after 60 min. Data are representative of six (a) or two (b,c) independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Two", "-", "hybrid", "interaction", "between", "GBD", "-", "AC40", "and", "WT", "or", "mutant", "GAD", "-", "IN1578", "-", "635", ".", "Alanine", "substitutions", "in", "IN1578", "-", "635", "are", "indicated", ".", "Cells", "were", "plated", "in", "two", "-", "fold", "serial", "dilutions", "on", "DO", "-", "Leu", "-", "Trp", "-", "His", "plates", ".", "No", "growth", "or", "protein", "expression", "defects", "were", "detected", "(", "Figs", "EV1A", "-", "B", ")", ".", "+", ",", "interaction", ";", "-", ",", "no", "interaction", ".", "C", ".", "Two", "-", "hybrid", "interaction", "between", "GBD", "-", "AC40", "and", "different", "IN1", "regions", "fused", "to", "GAD", ",", "as", "indicated", ".", "Cells", "were", "plated", "in", "ten", "-", "fold", "serial", "dilutions", "on", "DO", "-", "Leu", "-", "Trp", "-", "His", "plates", ".", "No", "growth", "or", "protein", "expression", "defects", "were", "detected", "(", "Figs", "EV1C", "-", "D", ")", ".", "+", ",", "interaction", ";", "-", ",", "no", "interaction", ".", "D", ".", "In", "vitro", "interaction", "between", "AC40", "and", "IN1", "proteins", "co", "-", "expressed", "in", "E", ".", "coli", ".", "Co", "-", "precipitation", "of", "WT", "or", "mutated", "(", "K617A", ",", "S621A", ",", "or", "L622A", ")", "IN1", "-", "C", "-", "tag", "using", "AC40", "-", "Twin", "-", "Strep", "-", "tag", "as", "bait", "from", "bacterial", "protein", "extracts", "co", "-", "expressing", "(", "+", ")", "or", "not", "(", "-", ")", "these", "proteins", ".", "Expected", "sizes", "are", "41", "kDa", "for", "AC40", "-", "Twin", "-", "Strep", "-", "tag", "and", "100", "kDa", "for", "IN1", "-", "C", "-", "tag", "(", "WT", "and", "mutants", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Two-hybrid interaction between GBD-AC40 and WT or mutant GAD-IN1578-635. Alanine substitutions in IN1578-635 are indicated. Cells were plated in two-fold serial dilutions on DO-Leu-Trp-His plates. No growth or protein expression defects were detected (Figs EV1A-B). +, interaction; -, no interaction.C. Two-hybrid interaction between GBD-AC40 and different IN1 regions fused to GAD, as indicated. Cells were plated in ten-fold serial dilutions on DO-Leu-Trp-His plates. No growth or protein expression defects were detected (Figs EV1C-D). +, interaction; -, no interaction.D. In vitro interaction between AC40 and IN1 proteins co-expressed in E. coli. Co-precipitation of WT or mutated (K617A, S621A, or L622A) IN1-C-tag using AC40-Twin-Strep-tag as bait from bacterial protein extracts co-expressing (+) or not (-) these proteins. Expected sizes are 41 kDa for AC40-Twin-Strep-tag and 100 kDa for IN1-C-tag (WT and mutants)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Localization", "of", "GFP2", "-", "IN1", "bNLS", "variants", "in", "yeast", "cells", "by", "direct", "fluorescence", "microscopy", ".", "Nup49", "-", "mCherry", "signal", "was", "used", "to", "visualize", "the", "location", "of", "the", "nuclear", "envelope", ".", "Corresponding", "DIC", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "B", ".", "Retrotransposition", "frequency", "(", "log", "scale", ")", "of", "pGAL1", "-", "Ty1his3AI", "bearing", "the", "indicated", "substitutions", "of", "conserved", "residues", "in", "a", "spt3", "-", "101", "rad52", "∆", "strain", ".", "IN1", "catalytic", "core", "domain", "mutant", "D154A", "is", "defective", "for", "integration", "and", "NLS", "mutant", "(", "KKR628", "-", "630GGT", ")", "for", "nuclear", "import", ".", "Values", "are", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", "experiments", ",", "each", "performed", "with", "four", "independent", "colonies", ".", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "otherwise", "not", "significant", "(", "Student", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Localization of GFP2-IN1 bNLS variants in yeast cells by direct fluorescence microscopy. Nup49-mCherry signal was used to visualize the location of the nuclear envelope. Corresponding DIC images are shown. Scale bar is 5 μm.B. Retrotransposition frequency (log scale) of pGAL1-Ty1his3AI bearing the indicated substitutions of conserved residues in a spt3-101 rad52∆ strain. IN1 catalytic core domain mutant D154A is defective for integration and NLS mutant (KKR628-630GGT) for nuclear import. Values are mean±SD, n=4 experiments, each performed with four independent colonies. ***p ≤ 0.001, otherwise not significant (Student t-test)."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "ectopic", "IN1", "using", "C160", "-", "HA", "as", "bait", ",", "from", "yeast", "protein", "extracts", "expressing", "WT", "or", "mutated", "IN1", "-", "Strep", "(", "K617A", ",", "S621A", ",", "or", "L622A", ")", "from", "the", "GAL1", "promoter", "in", "the", "presence", "of", "galactose", ".", "Expected", "sizes", "are", "160", "kDa", "for", "C160", "-", "HA", "and", "100", "kDa", "for", "IN1", "-", "Strep", "(", "WT", "and", "mutants", ")", ".", "B", ".", "Quantitative", "ChIP", "analysis", "of", "HA", "-", "IN1", "enrichment", "at", "Pol", "III", "-", "transcribed", "genes", ".", "Immunoprecipitated", "DNA", "from", "yeast", "cells", "producing", "ectopic", "IN1", "is", "expressed", "as", "a", "value", "relative", "to", "that", "of", "the", "input", ".", "Pol", "III", "transcribed", "-", "genes", ":", "tDNA", "-", "Ile", "and", "tDNA", "-", "Leu", "families", "(", "16", "and", "22", "genes", ",", "respectively", ")", "and", "the", "unique", "SCR1", "gene", ".", "GAL1", "ORF", "serves", "as", "a", "control", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "C", ".", "Fold", "enrichment", "of", "WT", "HA", "-", "IN1", "over", "input", "at", "all", "the", "genes", "where", "HA", "-", "IN1", "has", "been", "detected", "by", "ChIP", "-", "seq", "analysis", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "gene", ".", "Grey", ",", "tDNAs", ";", "Red", ",", "other", "Pol", "III", "-", "transcribed", "genes", ";", "Blue", ",", "Pol", "II", "-", "transcribed", "genes", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "separation", "between", "Pol", "II", "and", "Pol", "III", "-", "transcribed", "genes", ".", "D", ".", "WT", "and", "mutant", "IN1", "association", "with", "all", "Pol", "III", "-", "transcribed", "genes", ".", "Values", "obtained", "from", "ChIP", "seq", "analysis", "have", "been", "normalized", "in", "log2", "RPKM", "(", "reads", "per", "kilobase", "per", "million", "mapped", "reads", ")", ".", "Control", "is", "anti", "-", "HA", "immunoprecipitation", "of", "chromatin", "extracts", "in", "cells", "expressing", "IN1", "-", "Strep", ".", "Immunopurified", "DNA", "from", "3", "-", "4", "independent", "experiments", "was", "combined", "in", "one", "replicate", ".", "Data", "are", "presented", "as", "boxplots", "showing", "the", "median", ",", "the", "first", "quartile", ",", "and", "the", "third", "quartile", ".", "Error", "bars", "show", "minimum", "and", "maximum", "values", ".", "E", ".", "Genome", "-", "wide", "occupancy", "profiles", "(", "top", ")", "and", "heatmaps", "(", "bottom", ")", "of", "WT", "and", "HA", "-", "IN1", "mutants", "over", "a", "1kb", "window", "upstream", "and", "downstream", "of", "all", "tDNAs", ".", "Pearson", "correlation", "to", "WT", "values", "corresponding", "to", "Fig", "EV2B", "are", "indicated", ".", "F", ".", "WT", "and", "mutant", "IN1", "association", "to", "all", "Pol", "-", "II", "transcribed", "genes", "respectively", ".", "Control", ",", "replicates", "and", "data", "presentation", ",", "as", "described", "for", "panel", "D", ".", "Regions", "used", "for", "calculation", "are", "gene", "bodies", ".", "G", ".", "Recruitment", "of", "IN1", "along", "the", "SCR1", "gene", "locus", ".", "Top", ".", "ChIP", "‐", "qPCR", "analysis", "as", "described", "for", "panel", "Fig", "3B", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Bottom", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "SCR1", "locus", "with", "DNA", "amplicon", "positions", ".", "TATA", ",", "A", "and", "B", "boxes", "and", "terminator", "of", "transcription", "(", "T", ")", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Co-immunoprecipitation of ectopic IN1 using C160-HA as bait, from yeast protein extracts expressing WT or mutated IN1-Strep (K617A, S621A, or L622A) from the GAL1 promoter in the presence of galactose. Expected sizes are 160 kDa for C160-HA and 100 kDa for IN1-Strep (WT and mutants).B. Quantitative ChIP analysis of HA-IN1 enrichment at Pol III-transcribed genes. Immunoprecipitated DNA from yeast cells producing ectopic IN1 is expressed as a value relative to that of the input. Pol III transcribed-genes: tDNA-Ile and tDNA-Leu families (16 and 22 genes, respectively) and the unique SCR1 gene. GAL1 ORF serves as a control. Data represent means ± SD (n ≥ 3).C. Fold enrichment of WT HA-IN1 over input at all the genes where HA-IN1 has been detected by ChIP-seq analysis. Each dot represents a gene. Grey, tDNAs ; Red, other Pol III-transcribed genes ; Blue, Pol II-transcribed genes. The dashed line indicates the separation between Pol II and Pol III-transcribed genes.D. WT and mutant IN1 association with all Pol III-transcribed genes. Values obtained from ChIP seq analysis have been normalized in log2 RPKM (reads per kilobase per million mapped reads). Control is anti-HA immunoprecipitation of chromatin extracts in cells expressing IN1-Strep. Immunopurified DNA from 3-4 independent experiments was combined in one replicate. Data are presented as boxplots showing the median, the first quartile, and the third quartile. Error bars show minimum and maximum values.E. Genome-wide occupancy profiles (top) and heatmaps (bottom) of WT and HA-IN1 mutants over a 1kb window upstream and downstream of all tDNAs. Pearson correlation to WT values corresponding to Fig EV2B are indicated.F. WT and mutant IN1 association to all Pol-II transcribed genes respectively. Control, replicates and data presentation, as described for panel D. Regions used for calculation are gene bodies.G. Recruitment of IN1 along the SCR1 gene locus. Top. ChIP‐qPCR analysis as described for panel Fig 3B. Data represent means ± SD (n = 3). Bottom. Schematic representation of the SCR1 locus with DNA amplicon positions. TATA, A and B boxes and terminator of transcription (T) are indicated."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "ectopic", "IN1", "using", "TAP", "-", "tagged", "-", "A190", "as", "bait", "from", "yeast", "protein", "extracts", "expressing", "WT", "or", "the", "indicated", "IN1", "-", "HBH", "mutants", "from", "a", "pTet", "-", "Off", "promoter", "in", "the", "absence", "of", "doxycycline", ".", "Expected", "sizes", "are", "204", "kDa", "for", "A190", "-", "HA", "and", "82", "kDa", "for", "IN1", "-", "Strep", "(", "WT", "and", "mutants", ")", ".", "B", ".", "Genome", "browser", "visualization", "of", "HA", "-", "IN1", "occupancy", "at", "the", "RDN1", "locus", ".", "Occupancy", "of", "WT", "HA", "-", "IN1", "and", "K617A", ",", "S621A", "and", "L622A", "HA", "-", "IN1", "mutants", "is", "represented", "in", "each", "panel", ".", "Control", ",", "as", "described", "for", "panel", "3D", ".", "C", ".", "Top", ".", "IN1", "is", "recruited", "at", "Pol", "I", "-", "transcribed", "genes", ".", "ChIP", "‐", "qPCR", "analysis", "as", "described", "for", "panel", "3B", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Bottom", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "RDN1", "locus", "with", "DNA", "amplicon", "positions", ".", "D", ".", "Recruitment", "of", "WT", "and", "mutant", "HA", "-", "IN1", "(", "K617A", ",", "S621A", ",", "or", "L622A", ")", "at", "the", "18S", "rDNA", "locus", "transcribed", "by", "Pol", "I", ".", "ChIP", "‐", "qPCR", "analysis", "as", "described", "for", "panel", "3B", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Co-immunoprecipitation of ectopic IN1 using TAP-tagged-A190 as bait from yeast protein extracts expressing WT or the indicated IN1-HBH mutants from a pTet-Off promoter in the absence of doxycycline. Expected sizes are 204 kDa for A190-HA and 82 kDa for IN1-Strep (WT and mutants).B. Genome browser visualization of HA-IN1 occupancy at the RDN1 locus. Occupancy of WT HA-IN1 and K617A, S621A and L622A HA-IN1 mutants is represented in each panel. Control, as described for panel 3D.C. Top. IN1 is recruited at Pol I-transcribed genes. ChIP‐qPCR analysis as described for panel 3B. Data represent means ± SD (n = 3). Bottom. Schematic representation of the RDN1 locus with DNA amplicon positions.D. Recruitment of WT and mutant HA-IN1 (K617A, S621A, or L622A) at the 18S rDNA locus transcribed by Pol I. ChIP‐qPCR analysis as described for panel 3B. Data represent means ± SD (n = 3)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Detection", "of", "de", "novo", "Ty1", "insertions", "upstream", "of", "the", "SUF16", "and", "SEO1", "genes", "by", "PCR", "using", "a", "primer", "in", "HIS3", "(", "red", "triangle", ")", "and", "a", "primer", "in", "the", "locus", "of", "interest", "(", "blue", "triangle", ")", ".", "Ty1", "retrotransposition", "was", "induced", "in", "cells", "transformed", "with", "plasmids", "expressing", "WT", "or", "mutant", "(", "IN1", "K617A", ",", "S621A", "and", "L622A", ")", "Ty1his3AI", "from", "the", "GAL1", "promoter", ".", "Total", "genomic", "DNA", "was", "extracted", "from", "His", "+", "cells", "obtained", "from", "independent", "cultures", ".", "B", ".", "Genome", "-", "Wide", "Ty1", "insertion", "frequencies", "at", "each", "genomic", "feature", "are", "clustered", "in", "a", "heatmap", ".", "Score", "is", "computed", "in", "column", "Z", "-", "score", ".", "ORFs", ",", "all", "Pol", "II", "-", "transcribed", "genes", "except", "gene", "at", "subtelomeres", ";", "Pol", "I", ",", "one", "RDN37", "copy", ";", "up", "1kb", "Pol", "III", ",", "1kb", "upstream", "of", "all", "Pol", "III", "transcribed", "genes", ";", "Subtelomeres", ",", "genomic", "coordinates", "corresponding", "to", "chromatin", "covered", "by", "Sir2", "and", "Sir3", ",", "when", "they", "are", "co", "-", "overexpressed", "(", "Hocher", "et", "al", ",", "2018", ")", ";", "Random", ",", "100", "000", "random", "Ty1", "computed", "insertions", "in", "the", "genome", ".", "C", ".", "Detection", "of", "de", "novo", "Ty1", "insertions", "upstream", "of", "RDN5", "and", "in", "RDN37", "genes", "by", "PCR", "as", "described", "for", "panel", "5A", ".", "Four", "total", "genomic", "DNA", "preparation", "from", "panel", "A", "were", "randomly", "tested", "by", "PCR", ".", "D", ".", "Ty1", "insertion", "profile", "upstream", "of", "tDNAs", ".", "Total", "genomic", "DNA", "extracted", "in", "(", "B", ")", "was", "prepared", "for", "Ty1", "de", "novo", "integration", "event", "sequencing", ".", "Ty1", "insertions", "are", "computed", "in", "a", "1kb", "window", "upstream", "of", "all", "the", "275", "nuclear", "tDNAs", "(", "position", "0", "in", "the", "graph", ")", ".", "Each", "position", "is", "divided", "by", "the", "number", "of", "insertions", "at", "this", "position", "(", "weight", ")", ".", "The", "Smoothing", "curves", "indicate", "the", "general", "trend", ".", "Nucleosome", "center", "positions", "for", "the", "three", "first", "nucleosomes", "upstream", "of", "all", "tDNAs", "are", "from", "(", "Brogaard", "et", "al", ",", "2012", ")", ".", "E", ".", "Ty1", "insertion", "frequencies", "for", "each", "left", "and", "right", "subtelomere", "of", "chromosomes", "are", "clustered", "in", "a", "heatmap", ".", "Score", "is", "computed", "in", "row", "Z", "-", "score", ".", "Random", ",", "as", "described", "for", "panel", "B", ".", "High", "level", "of", "WT", "Ty1", "-", "HIS3", "integration", "in", "II", "-", "L", "is", "due", "to", "the", "presence", "of", "the", "tRNA", "gene", "tF", "(", "GAA", ")", "B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Detection of de novo Ty1 insertions upstream of the SUF16 and SEO1 genes by PCR using a primer in HIS3 (red triangle) and a primer in the locus of interest (blue triangle). Ty1 retrotransposition was induced in cells transformed with plasmids expressing WT or mutant (IN1 K617A, S621A and L622A) Ty1his3AI from the GAL1 promoter. Total genomic DNA was extracted from His+ cells obtained from independent cultures.B. Genome-Wide Ty1 insertion frequencies at each genomic feature are clustered in a heatmap. Score is computed in column Z-score. ORFs, all Pol II-transcribed genes except gene at subtelomeres; Pol I, one RDN37 copy; up 1kb Pol III, 1kb upstream of all Pol III transcribed genes; Subtelomeres, genomic coordinates corresponding to chromatin covered by Sir2 and Sir3, when they are co-overexpressed (Hocher et al, 2018); Random, 100 000 random Ty1 computed insertions in the genome.C. Detection of de novo Ty1 insertions upstream of RDN5 and in RDN37 genes by PCR as described for panel 5A. Four total genomic DNA preparation from panel A were randomly tested by PCR.D. Ty1 insertion profile upstream of tDNAs. Total genomic DNA extracted in (B) was prepared for Ty1 de novo integration event sequencing. Ty1 insertions are computed in a 1kb window upstream of all the 275 nuclear tDNAs (position 0 in the graph). Each position is divided by the number of insertions at this position (weight). The Smoothing curves indicate the general trend. Nucleosome center positions for the three first nucleosomes upstream of all tDNAs are from (Brogaard et al, 2012).E. Ty1 insertion frequencies for each left and right subtelomere of chromosomes are clustered in a heatmap. Score is computed in row Z-score. Random, as described for panel B. High level of WT Ty1-HIS3 integration in II-L is due to the presence of the tRNA gene tF(GAA)B."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Two", "-", "hybrid", "interaction", "between", "GBD", "-", "AC40", "(", "left", ")", "or", "GBD", "-", "Sir4", "(", "right", ")", "and", "different", "GAD", "-", "IN5", "or", "GAD", "-", "IN1", "constructions", ".", "Cells", "were", "plated", "in", "five", "-", "fold", "serial", "dilutions", "on", "DO", "-", "Leu", "-", "Trp", "-", "His", "plates", ".", "No", "growth", "or", "protein", "expression", "defects", "were", "detectedB", ".", "Genome", "-", "wide", "occupancy", "profiles", "(", "top", ")", "and", "heatmaps", "(", "bottom", ")", "of", "IN5", ",", "WT", ",", "and", "indicated", "mutants", ",", "+", "/", "-", "1kb", "upstream", "and", "downstream", "of", "all", "tDNAs", ".", "C", ".", "Genome", "browser", "visualization", "of", "different", "HA", "-", "IN", "occupancy", "for", "chromosome", "V", "(", "chrV", ":", "431129", ".", ".", "443275", ")", ".", "Occupancy", "of", "the", "indicated", "integrase", "is", "represented", "in", "each", "panel", ".", "Control", ",", "as", "panel", "3D", ".", "The", "region", "contains", "tH", "(", "GUG", ")", "E2", ",", "tK", "(", "CUU", ")", "E2", ",", "tV", "(", "ACC", ")", "E1", ",", "tI", "(", "AAU", ")", "E1", ",", "SNR52", "and", "SCR1", ",", "all", "transcribed", "by", "Pol", "III", ".", "D", ".", "Detection", "of", "Ty5", ",", "Ty5ΔTD5", "+", "bNLS", "or", "Ty1", "de", "novo", "integration", "events", "at", "HMR", "and", "HML", "loci", ",", "SCR1", "and", "upstream", "of", "all", "glycine", "tDNAs", ",", "by", "PCR", "using", "a", "primer", "in", "HIS3", "and", "a", "primer", "in", "the", "locus", "of", "interest", ".", "Retrotransposition", "was", "induced", "in", "cells", "transformed", "with", "WT", "or", "mutated", "pGAL1", "-", "Ty5his3AI", "(", "Ty5", "or", "Ty5ΔTD5", "+", "bNLS", ")", "and", "pGAL1", "-", "Ty1his3AI", "(", "Ty1", ")", ".", "Total", "genomic", "DNA", "was", "extracted", "from", "His", "+", "cells", "obtained", "from", "independent", "cultures", ".", "Nucleosome", "position", "(", "green", "circles", ")", "is", "indicated", "on", "the", "right", "of", "the", "panels", "(", "Brogaard", "et", "al", ",", "2012", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Two-hybrid interaction between GBD-AC40 (left) or GBD-Sir4 (right) and different GAD-IN5 or GAD-IN1 constructions. Cells were plated in five-fold serial dilutions on DO-Leu-Trp-His plates. No growth or protein expression defects were detectedB. Genome-wide occupancy profiles (top) and heatmaps (bottom) of IN5, WT, and indicated mutants, +/- 1kb upstream and downstream of all tDNAs.C. Genome browser visualization of different HA-IN occupancy for chromosome V (chrV:431129..443275). Occupancy of the indicated integrase is represented in each panel. Control, as panel 3D. The region contains tH(GUG)E2, tK(CUU)E2, tV(ACC)E1, tI(AAU)E1, SNR52 and SCR1, all transcribed by Pol III.D. Detection of Ty5, Ty5ΔTD5+bNLS or Ty1 de novo integration events at HMR and HML loci, SCR1 and upstream of all glycine tDNAs, by PCR using a primer in HIS3 and a primer in the locus of interest. Retrotransposition was induced in cells transformed with WT or mutated pGAL1-Ty5his3AI (Ty5 or Ty5ΔTD5+bNLS) and pGAL1-Ty1his3AI (Ty1). Total genomic DNA was extracted from His+ cells obtained from independent cultures. Nucleosome position (green circles) is indicated on the right of the panels (Brogaard et al, 2012)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Violin", "plots", "displaying", "RNA", "-", "seq", "readings", "by", "FPKM", "(", "normalized", "Fragments", "Per", "Kilobase", "Million", ")", "of", "chaperones", "HSPA1A", "and", "HSPA1B", "of", "human", "hippocampus", "samples", "of", "demented", "patients", "and", "controls", "(", "n", "=", "49", ",", "42", ";", "unpaired", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "test", ";", "continuous", "lines", ":", "median", ";", "dashed", "lines", ":", "quartiles", ")", ".", "(", "D", ")", "Mean", "and", "SEM", "of", "mRNA", "levels", "of", "Xbp1s", ",", "Bip", "/", "Hspa5", "and", "Chop", "/", "Ddit3", "were", "determined", "in", "dissected", "hippocampus", "of", "i", ".", "p", ".", "treated", "mice", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "animals", "/", "group", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", "compared", "tunicamycin", "treated", "groups", ")", ".", "(", "E", ")", "Animals", "received", "bilateral", "intra", "-", "hippocampal", "injections", "of", "2", "μl", "tunicamcyin", "(", "5", "mg", "/", "mL", ")", "or", "vehicle", "for", "24", "h", ".", "Graphs", "indicate", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "Xbp1s", "mRNA", "levels", "in", "the", "hippocampus", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "animals", "/", "group", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", "compared", "tunicamycin", "treated", "groups", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "Mean", "and", "SEM", "of", "relative", "levels", "of", "S", "-", "nitrosylated", "IRE1", "(", "f", ")", "and", "total", "IRE1", "(", "g", ")", "in", "brains", "from", "young", "and", "aged", "mice", ".", "Histograms", "show", "relative", "levels", "of", "SNO", "-", "IRE1", "/", "input", "IRE1α", "measured", "by", "biotin", "-", "switch", "assay", "and", "total", "IRE1", "/", "GAPDH", "quantified", "by", "densitometry", "on", "standard", "immunoblots", "for", "young", "(", "3", "-", "month", "-", "old", ")", "versus", "aged", "(", "24", "month", "-", "old", ")", "mouse", "brains", "(", "n", "=", "3", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Violin plots displaying RNA-seq readings by FPKM (normalized Fragments Per Kilobase Million) of chaperones HSPA1A and HSPA1B of human hippocampus samples of demented patients and controls (n = 49,42; unpaired Kolmogorov-Smirnov test; continuous lines: median; dashed lines: quartiles).(D) Mean and SEM of mRNA levels of Xbp1s, Bip/Hspa5 and Chop/Ddit3 were determined in dissected hippocampus of i.p. treated mice by quantitative RT-PCR. (n = 3-4 animals/group. One-way ANOVA followed by Tukey's post-test compared tunicamycin treated groups).(E) Animals received bilateral intra-hippocampal injections of 2 μl tunicamcyin (5 mg/mL) or vehicle for 24 h. Graphs indicate mean and s.e.m. of Xbp1s mRNA levels in the hippocampus (n = 3-4 animals/group. One-way ANOVA followed by Tukey's post-test compared tunicamycin treated groups.(F-G) Mean and SEM of relative levels of S-nitrosylated IRE1 (f) and total IRE1 (g) in brains from young and aged mice. Histograms show relative levels of SNO-IRE1/input IRE1α measured by biotin-switch assay and total IRE1/GAPDH quantified by densitometry on standard immunoblots for young (3-month-old) versus aged (24 month-old) mouse brains (n = 3, unpaired Student's t test). Data information:"}
{"words": ["Figure", "2Young", "(", "3", "-", "6", "months", ")", ",", "middle", "aged", "(", "12", "-", "14", "months", ")", "and", "aged", "(", "18", "-", "20", "months", ")", "conditional", "knockout", "for", "IRE1", "(", "IRE1cKO", ")", "and", "their", "littermates", "flox", "/", "flox", "control", "animals", "(", "IRE1WT", ")", "were", "evaluated", "(", "C", ")", "Representative", "photomicrographs", "of", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "hippocampal", "slices", "derived", "from", "young", "(", "3", "months", ")", ",", "middle", "-", "aged", "(", "12", "months", ")", "and", "aged", "(", "22", "-", "24", "months", ")", "of", "IRE1WT", "or", "IRE1cKO", "animals", ".", "Magnification", ":", "20x", ";", "scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "Arrows", "indicate", "β", "-", "galactosidase", "staining", ".", "Young", "(", "3", "-", "6", "months", ")", ",", "middle", "aged", "(", "12", "-", "14", "months", ")", "and", "aged", "(", "18", "-", "20", "months", ")", "conditional", "knockout", "for", "IRE1", "(", "IRE1cKO", ")", "and", "their", "littermates", "flox", "/", "flox", "control", "animals", "(", "IRE1WT", ")", "were", "evaluated", "(", "D", ")", "Mean", "and", "SEM", "of", "percentage", "of", "β", "-", "galactosidase", "staining", "in", "CA3", "region", "(", "n", "=", "3", "-", "5", "animals", "/", "group", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "dendritic", "spines", "(", "arrows", ")", "in", "the", "CA1", "region", "of", "middle", "-", "aged", "IRE1WT", "animals", "injected", "with", "AAV", "-", "Mock", "or", "AAV", "-", "Cre", ".", "60x", "magnification", ",", "(", "G", ")", "Mean", "and", "SEM", "of", "spine", "density", "per", "μm", "(", "n", "=", "3", ",", "3", ";", "4", ",", "4", "animals", ")", ".", "P", "computed", "by", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "within", "each", "age", "-", "matched", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Young (3-6 months), middle aged (12-14 months) and aged (18-20 months) conditional knockout for IRE1 (IRE1cKO) and their littermates flox/flox control animals (IRE1WT) were evaluated (C) Representative photomicrographs of β-galactosidase staining of hippocampal slices derived from young (3 months), middle-aged (12 months) and aged (22-24 months) of IRE1WT or IRE1cKO animals. Magnification: 20x; scale bar: 200 μm. Arrows indicate β-galactosidase staining.Young (3-6 months), middle aged (12-14 months) and aged (18-20 months) conditional knockout for IRE1 (IRE1cKO) and their littermates flox/flox control animals (IRE1WT) were evaluated (D) Mean and SEM of percentage of β-galactosidase staining in CA3 region (n = 3-5 animals/group).(F) Representative confocal images of dendritic spines (arrows) in the CA1 region of middle-aged IRE1WT animals injected with AAV-Mock or AAV-Cre. 60x magnification, (G) Mean and SEM of spine density per μm (n = 3, 3; 4, 4 animals). P computed by unpaired Student's t test within each age-matched group."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "hippocampal", "slices", "derived", "from", "aged", "(", "22", "-", "24", "months", ")", "TgXBP1s", "and", "WT", "animals", ".", "(", "F", ")", "Mean", "and", "SEM", "of", "percentage", "of", "area", "stained", "by", "β", "-", "galactosidase", "in", "the", "hippocampus", "of", "aged", "(", "20", "-", "24", "months", ")", "TgXBP1s", "compared", "to", "littermate", "controls", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(E) Representative images of β-galactosidase staining of hippocampal slices derived from aged (22-24 months) TgXBP1s and WT animals. (F) Mean and SEM of percentage of area stained by β-galactosidase in the hippocampus of aged (20-24 months) TgXBP1s compared to littermate controls."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "D", ")", "Left", "panel", ":", "Representative", "images", "showing", "dendritic", "spines", "of", "aged", "(", "22", "-", "24", "months", ")", "animals", "injected", "with", "AAV2", "-", "eGFP", "(", "mock", ")", "or", "with", "AAV2", "-", "XBP1s", "(", "arrows", "indicate", "dendritic", "spines", ")", ".", "Young", "animal", "dendrite", "is", "shown", "for", "reference", ".", "60x", "magnification", ".", "Scale", "bar", ":", "5μm", ".", "Right", "panel", ":", "Mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "spine", "density", "per", "μm", "for", "indicated", "experimental", "groups", "(", "n", "=", "24", ",", "53", "and", "35", "dendrites", "from", "3", ",", "5", "and", "6", "animals", ",", "respectively", "(", "E", ")", "Left", "panel", ":", "Representative", "images", "of", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "hippocampal", "slices", "derived", "from", "aged", "mice", "injected", "with", "AAV2", "-", "Mock", "or", "AAV2", "-", "XBP1s", "(", "arrow", "indicate", "β", "-", "galactosidase", "staining", ")", ".", "Magnification", "20x", ";", "scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "Right", "panel", ":", "Histograms", "show", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "percentage", "of", "β", "-", "galactosidase", "-", "stained", "area", ".", "n", "=", "6", ",", "6", ";", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "F", ")", "Left", "panel", ":", "Immunofluorescence", "of", "γH2aX", "(", "red", ")", "counterstained", "with", "nuclei", "(", "blue", ")", "comparing", "aged", "mice", "injected", "with", "AAV", "-", "Mock", "or", "AAV", "-", "XBP1s", ".", "Magnification", ":", "40x", ";", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "Right", "panel", ":", "Histograms", "show", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "percentage", "of", "γH2A", "-", "positive", "cells", ";", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "comparing", "the", "aged", "groups", "(", "n", "=", "6", ",", "6", "animals", "/", "group", ";", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(D) Left panel: Representative images showing dendritic spines of aged (22-24 months) animals injected with AAV2-eGFP (mock) or with AAV2-XBP1s (arrows indicate dendritic spines). Young animal dendrite is shown for reference. 60x magnification. Scale bar: 5μm. Right panel: Mean and s.e.m. of spine density per μm for indicated experimental groups (n = 24, 53 and 35 dendrites from 3, 5 and 6 animals, respectively(E) Left panel: Representative images of β-galactosidase staining of hippocampal slices derived from aged mice injected with AAV2-Mock or AAV2-XBP1s (arrow indicate β-galactosidase staining). Magnification 20x; scale bar, 200 μm. Right panel: Histograms show mean and s.e.m. of percentage of β-galactosidase-stained area. n = 6, 6; unpaired Student's t test.(F) Left panel: Immunofluorescence of γH2aX (red) counterstained with nuclei (blue) comparing aged mice injected with AAV-Mock or AAV-XBP1s. Magnification: 40x; Scale bar: 50μm. Right panel: Histograms show mean and s.e.m. of percentage of γH2A- positive cells; unpaired Student's t test comparing the aged groups ( n = 6, 6 animals/group; unpaired Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Whole", "chromosomes", "imaged", "by", "conventional", "TEM", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "1µmB", ".", "Slice", "from", "a", "large", "tomographic", "volume", ";", "part", "of", "the", "carbon", "film", "surrounding", "a", "hole", "with", "vitrified", "ice", "containing", "the", "plates", "is", "indicated", "with", "an", "asterisk", ";", "the", "inset", "illustrates", "that", "the", "slice", "of", "a", "plate", "corresponds", "to", "a", "line", "in", "the", "x", "-", "y", "plane", "(", "perpendicular", "to", "the", "direction", "of", "the", "electron", "beam", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "200", "nmC", "-", "G", "Slices", "from", "different", "tomograms", "and", "the", "corresponding", "3D", "segmentations", "showing", "plates", "with", "different", "sizes", "and", "shapes", ".", "In", "addition", "to", "a", "typical", "slice", "through", "the", "x", "-", "y", "plane", "(", "yellow", ")", ",", "two", "slices", "through", "the", "x", "-", "z", "(", "red", ")", "and", "y", "-", "z", "(", "green", ")", "planes", "(", "orthogonal", "to", "the", "x", "-", "y", "plane", ")", "are", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", "D", ")", ",", "100", "nm", "(", "E", "-", "G", ")", ",", "50", "nm", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Whole chromosomes imaged by conventional TEM. Data information: Scale bars: 1µmB. Slice from a large tomographic volume; part of the carbon film surrounding a hole with vitrified ice containing the plates is indicated with an asterisk; the inset illustrates that the slice of a plate corresponds to a line in the x-y plane (perpendicular to the direction of the electron beam). Data information: Scale bars: 200 nmC-G Slices from different tomograms and the corresponding 3D segmentations showing plates with different sizes and shapes. In addition to a typical slice through the x-y plane (yellow), two slices through the x-z (red) and y-z (green) planes (orthogonal to the x-y plane) are shown in (C). Data information: Scale bars: 200 nm D), 100 nm (E-G), 50 nm (C)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Nucleosomes", "(", "N", ")", "decorating", "a", "relaxed", "plate", "(", "P1", ")", ";", "insets", "in", "the", "upper", "right", "show", "additional", "examples", ".", "Nucleosomes", "are", "not", "visible", "as", "individual", "units", "in", "typical", "compact", "plates", "(", "P2", ")", ".", "Short", "compact", "interdigitated", "solenoids", "are", "shown", "in", "the", "main", "image", "(", "S", ")", "and", "in", "the", "bottom", "-", "left", "insets", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "50", "nmB", "-", "E", "Slice", "(", "B", ")", "and", "segmentations", "in", "three", "different", "orientations", "(", "C", ")", "of", "a", "large", "relaxed", "plate", "decorated", "with", "many", "nucleosomes", "on", "its", "right", "side", ".", "Slice", "(", "D", ")", "and", "segmentation", "(", "E", ")", "of", "a", "relaxed", "plate", "forming", "a", "tube", "decorated", "with", "nucleosomes", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "50", "nm", "insets", ",", "B", "-", "E", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Nucleosomes (N) decorating a relaxed plate (P1); insets in the upper right show additional examples. Nucleosomes are not visible as individual units in typical compact plates (P2). Short compact interdigitated solenoids are shown in the main image (S) and in the bottom-left insets. Data information: Scale bars: 50 nmB-E Slice (B) and segmentations in three different orientations (C) of a large relaxed plate decorated with many nucleosomes on its right side. Slice (D) and segmentation (E) of a relaxed plate forming a tube decorated with nucleosomes. Data information: Scale bars: 50 nm insets, B-E)"}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", "Plates", "with", "several", "layers", "that", "are", "not", "closely", "appressed", ".", "C", "-", "E", "Large", "multilayer", "plates", "having", "the", "size", "of", "human", "metaphase", "chromatids", "[", "~", "0", ".", "6", "µm", "diameter", "]", "(", "C", ")", ";", "the", "inset", "schematically", "shows", "the", "perpendicular", "orientation", "of", "chromatin", "layers", "with", "respect", "to", "the", "chromatid", "axes", "proposed", "in", "the", "thin", "-", "plate", "model", "In", "other", "slices", "(", "D", ",", "E", ")", ",", "the", "multilayer", "structures", "shown", "in", "(", "C", ")", "are", "more", "compact", "and", "the", "individual", "layers", "are", "not", "visible", "as", "separate", "elements", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "50", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A,B Plates with several layers that are not closely appressed. C-E Large multilayer plates having the size of human metaphase chromatids [~0.6 µm diameter ] (C); the inset schematically shows the perpendicular orientation of chromatin layers with respect to the chromatid axes proposed in the thin-plate model In other slices (D,E), the multilayer structures shown in (C) are more compact and the individual layers are not visible as separate elements. Data information: Scale bars: 50 nm. "}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "C", "Slices", "showing", "lateral", "association", "between", "two", "plates", "and", "the", "corresponding", "3D", "segmentations", ".", "D", ".", "Edge", "-", "to", "-", "edge", "interactions", "form", "cylindrical", "structures", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "50", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-C Slices showing lateral association between two plates and the corresponding 3D segmentations. D. Edge-to-edge interactions form cylindrical structures. Data information: Scale bars: 50 nm. "}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", "The", "cation", "concentrations", "used", "are", "indicated", "for", "each", "experiment", ";", "AU", ",", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C The cation concentrations used are indicated for each experiment; AU, arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "1Dox", "-", "induced", "prolongation", "of", "Nanog", "expression", "in", "Nanogtg", "embryos", "up", "to", "E9", ".", "5", "results", "in", "lack", "of", "blood", "(", "left", ")", "and", "downregulation", "of", "erythropoietic", "gene", "expression", ".", "The", "center", "and", "right", "panels", "show", "whole", "-", "mount", "in", "situ", "hybridization", "for", "Hbb", "-", "bh1", "(", "in", "embryos", "with", "intact", "yolk", "sacs", ")", "and", "for", "the", "long", "non", "-", "coding", "RNA", "Redrum", ".", "Asterisks", "mark", "the", "aorta", "-", "gonad", "-", "mesonephros", "region", "(", "AGM", ")", "and", "arrows", "the", "tailbud", ".", "Embryos", "of", "the", "same", "genotype", "but", "not", "treated", "with", "dox", "were", "used", "as", "controls", "(", "-", "dox", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "µm", ".", "Endomucin", "staining", "of", "vessels", "in", "control", "(", "-", "dox", ")", "or", "treated", "(", "+", "dox", ")", "E9", ".", "5", "Nanogtg", "embryos", ".", "On", "the", "right", ",", "higher", "magnifications", "of", "the", "boxed", "areas", ".", "Scale", "bar", ",", "500", "µm", ".", "Representative", "FACS", "plot", "of", "the", "distribution", "of", "the", "CD71", "and", "Ter119", "populations", "in", "dissected", "yolk", "sacs", "from", "untreated", "and", "dox", "-", "treated", "E9", ".", "5", "Nanogtg", "embryos", ".", "Quantification", "of", "the", "CD71", "+", "Ter119", "+", "population", "in", "controls", "(", "-", "dox", ",", "black", "dots", ";", "n", "=", "8", ")", "and", "Nanog", "expressing", "(", "+", "dox", ",", "red", "dots", ";", "n", "=", "7", ")", "E9", ".", "5", "yolk", "sacs", ".", "Each", "replicate", "contained", "a", "pool", "of", "5", "(", "-", "dox", ")", "or", "8", "(", "+", "dox", ")", "E9", ".", "5", "Nanogtg", "embryos", ".", "*", "*", "*", "P", ".", "<", "0", ".", "0005", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "Representative", "FACS", "plots", "showing", "the", "distribution", "of", "cKit", "and", "CD41", "populations", "in", "yolk", "sacs", "from", "untreated", "controls", "(", "-", "dox", ")", "and", "Nanog", "expressing", "(", "+", "dox", ")", "E9", ".", "5", "Nanogtg", "embryos", ".", "Quantification", "of", "different", "progenitor", "populations", "in", "yolk", "sacs", "from", "control", "(", "-", "dox", ",", "black", "dots", ";", "n", "=", "8", ")", "and", "Nanog", "expressing", "(", "+", "dox", ",", "red", "dots", ";", "n", "=", "7", ")", "E9", ".", "5", "embryos", ".", "Each", "replicate", "contained", "a", "pool", "of", "5", "(", "-", "dox", ")", "or", "8", "(", "+", "dox", ")", "E9", ".", "5", "Nanogtg", "embryos", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "SD", ".", "Differences", "in", "the", "expression", "levels", "of", "Nanog", "and", "selected", "hematopoietic", "genes", "in", "the", "CD71", "+", "Ter119", "+", "population", "of", "control", "(", "-", "dox", ";", "n", "=", "7", ")", "and", "Nanog", "-", "expressing", "(", "+", "dox", ";", "n", "=", "4", ")", "E9", ".", "5", "embryos", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Dox-induced prolongation of Nanog expression in Nanogtg embryos up to E9.5 results in lack of blood (left) and downregulation of erythropoietic gene expression. The center and right panels show whole-mount in situ hybridization for Hbb-bh1 (in embryos with intact yolk sacs) and for the long non-coding RNA Redrum. Asterisks mark the aorta-gonad-mesonephros region (AGM) and arrows the tailbud. Embryos of the same genotype but not treated with dox were used as controls (-dox). Scale bars, 500 µm.Endomucin staining of vessels in control (-dox) or treated (+dox) E9.5 Nanogtg embryos. On the right, higher magnifications of the boxed areas. Scale bar, 500 µm.Representative FACS plot of the distribution of the CD71 and Ter119 populations in dissected yolk sacs from untreated and dox-treated E9.5 Nanogtg embryos. Quantification of the CD71+ Ter119+ population in controls (-dox, black dots; n=8) and Nanog expressing (+dox, red dots; n=7) E9.5 yolk sacs. Each replicate contained a pool of 5 (-dox) or 8 (+dox) E9.5 Nanogtg embryos. ***P. < 0.0005; Student's t-test. Horizontal line represents mean values and error bars standard deviation (SD).Representative FACS plots showing the distribution of cKit and CD41 populations in yolk sacs from untreated controls (-dox) and Nanog expressing (+dox) E9.5 Nanogtg embryos. Quantification of different progenitor populations in yolk sacs from control (-dox, black dots; n=8) and Nanog expressing (+dox, red dots; n=7) E9.5 embryos. Each replicate contained a pool of 5 (-dox) or 8 (+dox) E9.5 Nanogtg embryos. Horizontal line represents mean values and error bars SD.Differences in the expression levels of Nanog and selected hematopoietic genes in the CD71+ Ter119+ population of control (-dox; n=7) and Nanog-expressing (+dox; n=4) E9.5 embryos. **P < 0.005, ***P < 0.0005; Student's t-test. Horizontal line represents mean values and error bars SD."}
{"words": ["Figure", "2Freshly", "dissected", "dox", "-", "treated", "Nanogtg", "E10", ".", "5", "embryos", "without", "(", "control", ")", "and", "with", "(", "chimera", ")", "contribution", "of", "wt", "-", "ESGFP", "cells", "(", "left", ",", "brightfield", ";", "right", ",", "GFP", ")", ".", "Arrows", "mark", "the", "presence", "of", "blood", "in", "chimeric", "embryos", "that", "is", "absent", "from", "controls", ".", "Scale", "bar", ",", "500", "µm", ".", "Representative", "FACS", "plots", "showing", "of", "red", "blood", "cell", "maturation", "as", "determined", "by", "CD71", "/", "Ter119", "staining", "in", "single", "dox", "-", "treated", "E10", ".", "5", "control", "(", "left", ")", "and", "chimeric", "(", "right", ")", "embryos", ".", "Quantification", "of", "the", "CD71", "+", "Ter119", "+", "population", "in", "single", "dox", "-", "treated", "E10", ".", "5", "embryos", "(", "D", ";", "control", ",", "n", "=", "18", ";", "chimera", ",", "n", "=", "10", ")", ",", "untreated", "embryos", "(", "E", ";", "control", ",", "n", "=", "7", ";", "chimera", ",", "n", "=", "12", ")", ",", "and", "in", "GFP", "-", "cells", "(", "not", "derived", "from", "wild", "type", "ES", "cells", ")", "from", "dox", "-", "treated", "embryos", "(", "F", ";", "control", ",", "n", "=", "18", ";", "chimera", ",", "n", "=", "10", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Freshly dissected dox-treated Nanogtg E10.5 embryos without (control) and with (chimera) contribution of wt-ESGFP cells (left, brightfield; right, GFP). Arrows mark the presence of blood in chimeric embryos that is absent from controls. Scale bar, 500 µm.Representative FACS plots showing of red blood cell maturation as determined by CD71/Ter119 staining in single dox-treated E10.5 control (left) and chimeric (right) embryos.Quantification of the CD71+ Ter119+ population in single dox-treated E10.5 embryos (D; control, n=18; chimera, n=10), untreated embryos (E; control, n=7; chimera, n=12), and in GFP- cells (not derived from wild type ES cells) from dox-treated embryos (F; control, n=18; chimera, n=10). ***P < 0.0005; Student's t-test. Horizontal line represents mean values and error bars SD."}
{"words": ["Figure", "3Quantification", "of", "colony", "-", "forming", "units", "generated", "by", "wild", "type", "(", "wt", ")", "and", "knockout", "(", "Nanog", "-", "/", "-", ")", "ES", "cells", "after", "culture", "of", "EBs", "for", "5", "(", "D5", ")", ",", "6", "(", "D6", ")", ",", "or", "7", "(", "D7", ")", "days", "and", "plating", "disaggregated", "cells", "in", "different", "hemogenic", "-", "promoting", "conditions", ")", ".", "Panels", "on", "the", "left", "show", "representative", "images", "of", "mouse", "hematopoietic", "colonies", "obtained", "after", "12", "days", "of", "culture", "in", "specific", "media", ".", "CFU", "-", "GEMM", ",", "progenitors", "giving", "rise", "to", "granulocytes", ",", "erythrocytes", ",", "monocytes", ",", "and", "megakaryocytes", ";", "BFU", "-", "E", ",", "burst", "forming", "units", "-", "erythroid", ";", "Ery", "-", "P", ",", "colony", "forming", "primitive", "erythroid", ";", "CFU", "-", "GM", ",", "granulocyte", "-", "monocyte", "precursors", ";", "CFU", "-", "M", ",", "monocyte", "precursors", ";", "CFU", "-", "G", ",", "granulocyte", "precursors", ".", "No", "CFU", "-", "GEMM", "are", "detected", "at", "D5", "and", "no", "BFU", "-", "E", "at", "D7", ".", "For", "both", "wt", "and", "knockout", "cells", ",", "n", "=", "3", "each", "with", "3", "technical", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "00005", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "SD", ".", "RT", "-", "qPCR", "determination", "of", "the", "relative", "expression", "of", "Brachyury", "and", "selected", "hematopoietic", "genes", "in", "control", "(", "wt", ",", "right", ")", "and", "knockout", "(", "Nanog", "-", "/", "-", ",", "left", ")", "ES", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", "during", "10", "days", "of", "EB", "differentiation", "in", "hematopoietic", "-", "cytokine", "-", "enriched", "medium", ".", "Black", "arrowheads", "indicate", "the", "peak", "of", "Brachyury", "expression", "and", "white", "arrowheads", "the", "time", "of", "maximum", "hematopoietic", "-", "gene", "expression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Quantification of colony-forming units generated by wild type (wt) and knockout (Nanog-/-) ES cells after culture of EBs for 5 (D5), 6 (D6), or 7 (D7) days and plating disaggregated cells in different hemogenic-promoting conditions). Panels on the left show representative images of mouse hematopoietic colonies obtained after 12 days of culture in specific media. CFU-GEMM, progenitors giving rise to granulocytes, erythrocytes, monocytes, and megakaryocytes; BFU-E, burst forming units-erythroid; Ery-P, colony forming primitive erythroid; CFU-GM, granulocyte-monocyte precursors; CFU-M, monocyte precursors; CFU-G, granulocyte precursors. No CFU-GEMM are detected at D5 and no BFU-E at D7. For both wt and knockout cells, n=3 each with 3 technical replicates. *P < 0.05, **P < 0.005, ***P < 0.00005; Student's t-test. Horizontal line represents mean values and error bars SD.RT-qPCR determination of the relative expression of Brachyury and selected hematopoietic genes in control (wt, right) and knockout (Nanog-/-, left) ES cells (n=3) during 10 days of EB differentiation in hematopoietic-cytokine-enriched medium. Black arrowheads indicate the peak of Brachyury expression and white arrowheads the time of maximum hematopoietic-gene expression."}
{"words": ["Figure", "4Representative", "FACS", "plots", "showing", "the", "distribution", "of", "different", "populations", "distinguished", "by", "CD71", "/", "Ter119", "staining", "in", "whole", "bone", "marrow", "from", "untreated", "(", "-", "dox", ")", "or", "treated", "(", "+", "dox", ")", "adult", "mice", ".", "S0", "(", "double", "negative", "cell", ")", ",", "S1", "(", "proerythroblast", ")", ",", "S2", "(", "basophylic", "erythroblast", ")", ",", "S3", "(", "polychromatic", "erythroblast", ")", ",", "and", "S4", "(", "orthochromatic", "erythroblast", ")", "are", "different", "stages", "of", "blood", "maturation", ".", "Quantification", "of", "the", "S1", "-", "S4", "erythroid", "populations", "(", "-", "dox", ",", "n", "=", "4", ";", "+", "dox", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "SD", ".", "Representative", "FACS", "plots", "showing", "the", "distribution", "of", "CD16", "/", "32", "and", "CD34", "hematopoietic", "precursors", "sorted", "from", "the", "cKit", "+", "Sca1", "-", "LIN", "-", "bone", "marrow", "of", "untreated", "(", "-", "dox", ")", "or", "treated", "(", "+", "dox", ")", "adult", "Nanogtg", "mice", ".", "Quantification", "of", "precursor", "populations", "based", "on", "CD16", "/", "32", "and", "CD34", "sorting", ",", "as", "total", "number", "of", "cells", "per", "individual", "femur", "(", "-", "dox", ",", "n", "=", "5", ";", "+", "dox", ",", "n", "=", "6", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "SD", ".", "RT", "-", "qPCR", "quantification", "of", "the", "relative", "expression", "of", "hematopoietic", "genes", "in", "megakaryocyte", "-", "erythroid", "progenitors", "(", "MEP", ")", "(", "-", "dox", ",", "n", "=", "8", ";", "+", "dox", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "00005", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "SD", ".", "Contribution", "of", "Nanogtg", "transplanted", "bone", "marrow", "cells", "to", "peripheral", "blood", "before", "(", "left", ")", "and", "after", "(", "right", ")", "dox", "treatment", ".", "Percentage", "of", "host", "derived", "cells", "(", "CD45", ".", "1", "+", ")", "are", "shown", "in", "black", ",", "and", "of", "donor", "derived", "cells", "(", "CD45", ".", "1", "/", "CD45", ".", "2", "double", "+", ")", "in", "red", ".", "Individual", "mice", "are", "indicated", "on", "the", "x", "-", "axis", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Contribution", "of", "Nanogtg", "transplanted", "cells", "to", "LSK", ",", "CMP", ",", "GMP", "and", "MEP", "populations", "purified", "from", "bone", "marrow", ".", "Percentage", "of", "host", "derived", "cells", "(", "CD45", ".", "1", "+", ")", "are", "show", "in", "black", ",", "and", "of", "donor", "derived", "cells", "(", "CD45", ".", "1", "/", "CD45", ".", "2", "double", "+", ")", "in", "blue", ".", "Individual", "mice", "are", "indicated", "on", "the", "x", "-", "axis", "(", "n", "=", "7", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative FACS plots showing the distribution of different populations distinguished by CD71/Ter119 staining in whole bone marrow from untreated (-dox) or treated (+dox) adult mice. S0 (double negative cell), S1 (proerythroblast), S2 (basophylic erythroblast), S3 (polychromatic erythroblast), and S4 (orthochromatic erythroblast) are different stages of blood maturation. Quantification of the S1-S4 erythroid populations (-dox, n=4; +dox, n=5). *P < 0.05, **P < 0.005, ***P < 0.0005; Student's t-test. Horizontal line represents mean values and error bars SD.Representative FACS plots showing the distribution of CD16/32 and CD34 hematopoietic precursors sorted from the cKit+Sca1-LIN- bone marrow of untreated (-dox) or treated (+dox) adult Nanogtg mice.Quantification of precursor populations based on CD16/32 and CD34 sorting, as total number of cells per individual femur (-dox, n=5; +dox, n=6). *P < 0.05, **P < 0.005; Student's t-test. Horizontal line represents mean values and error bars SD.RT-qPCR quantification of the relative expression of hematopoietic genes in megakaryocyte-erythroid progenitors (MEP) (-dox, n=8; +dox, n=5). *P < 0.05, ****P < 0.00005; Student's t-test. Horizontal line represents mean values and error bars SD.Contribution of Nanogtg transplanted bone marrow cells to peripheral blood before (left) and after (right) dox treatment. Percentage of host derived cells (CD45.1+) are shown in black, and of donor derived cells (CD45.1/CD45.2 double +) in red. Individual mice are indicated on the x-axis (n=7).Contribution of Nanogtg transplanted cells to LSK, CMP, GMP and MEP populations purified from bone marrow. Percentage of host derived cells (CD45.1+) are show in black, and of donor derived cells (CD45.1/CD45.2 double +) in blue. Individual mice are indicated on the x-axis (n=7)."}
{"words": ["Figure", "5Expected", "and", "observed", "number", "of", "mesodermal", "(", "Flk1", "+", ")", "cells", "of", "the", "E7", ".", "0", "mouse", "embryo", "expressing", "Nanog", "and", "selected", "mesodermal", "or", "hematopoietic", "gene", "expression", ",", "based", "on", "single", "cell", "RNA", "-", "seq", "data", "(", "Scialdone", "et", "al", ".", ",", "2016", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "a", "hypergeometric", "test", ".", "PCA", "showing", "the", "distribution", "of", "Flk1", "+", "E7", ".", "0", "mesoderm", "cells", "expressing", "Nanog", "(", "green", ")", "or", "Tal1", "(", "red", ")", ".", "The", "single", "cell", "expressing", "both", "genes", "is", "shown", "in", "yellow", "and", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "E6", ".", "5", "Nanogtg", "embryos", "after", "8", "hours", "ex", "-", "utero", "culture", "in", "the", "presence", "(", "+", "dox", ")", "or", "absence", "(", "-", "dox", ")", "of", "doxycycline", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "RT", "-", "qPCR", "quantification", "of", "the", "relative", "expression", "of", "Nanog", ",", "Tal1", ",", "and", "Klf1", "in", "individual", "untreated", "embryos", "(", "-", "dox", ")", "or", "treated", "embryos", "(", "+", "dox", ")", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "SD", ".", "Whole", "mount", "in", "situ", "hybridization", "of", "Tal1", "in", "E7", ".", "5", "untreated", "(", "-", "dox", ")", "or", "in", "utero", "treated", "(", "+", "dox", ")", "Nanogtg", "embryos", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "RT", "-", "qPCR", "determination", "of", "relative", "expression", "in", "wild", "type", "and", "CRISPR", "-", "deleted", "embryos", "(", "n", "=", "5", ")", "of", "Tal1", "(", "wt", ",", "n", "=", "19", ";", "deleted", ",", "n", "=", "13", ")", ",", "Klf1", "(", "wt", ",", "n", "=", "3", ";", "deleted", ",", "n", "=", "6", ")", ",", "Gfi1b", "(", "wt", ",", "n", "=", "10", ";", "deleted", ",", "n", "=", "8", ")", ",", "Runx1", "(", "wt", ",", "n", "=", "13", ";", "deleted", ",", "n", "=", "5", ")", "and", "Stil", "(", "wt", ",", "n", "=", "19", ";", "deleted", ",", "n", "=", "13", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "SD", ".", "Experimental", "design", "for", "ES", "to", "EpiL", "cell", "differentiation", "of", "Nanogtg", "cells", "and", "two", "independent", "clones", "(", "Nanogtg", ";", "dTal1del", "#", "1", "and", "Nanogtg", ";", "dTal1del", "#", "2", ")", "where", "the", "binding", "site", "for", "NANOG", "distal", "to", "Tal1", "has", "been", "deleted", "(", "left", ")", ".", "On", "the", "right", ",", "relative", "expression", "of", "Tal1", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", "for", "each", "ES", "cell", "line", "(", "ESC", ";", "n", "=", "9", "for", "all", "three", "lines", ")", "and", "EpiL", "cells", "without", "(", "EpiLC", ";", "Nanogtg", "and", "Nanogtg", ";", "dTal1del", "#", "1", ",", "n", "=", "8", ";", "Nanogtg", ";", "dTal1del", "#", "2", ",", "n", "=", "6", ")", "or", "with", "dox", "treatment", "(", "EpiLC", "+", "dox", ";", "n", "=", "9", "for", "all", "three", "lines", ")", ".", "The", "genotype", "of", "the", "cell", "lines", "is", "indicated", "below", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "Nanogtg", "ESC", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "=", "not", "significant", ";", "ANOVA", "with", "Fisher", "post", "-", "test", ".", "Horizontal", "line", "represents", "mean", "values", "and", "error", "bars", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Expected and observed number of mesodermal (Flk1+) cells of the E7.0 mouse embryo expressing Nanog and selected mesodermal or hematopoietic gene expression, based on single cell RNA-seq data (Scialdone et al., 2016). Statistical significance was calculated with a hypergeometric test.PCA showing the distribution of Flk1+ E7.0 mesoderm cells expressing Nanog (green) or Tal1 (red). The single cell expressing both genes is shown in yellow and indicated by an arrow.E6.5 Nanogtg embryos after 8 hours ex-utero culture in the presence (+dox) or absence (-dox) of doxycycline. Scale bar, 100 µm.RT-qPCR quantification of the relative expression of Nanog, Tal1, and Klf1 in individual untreated embryos (-dox) or treated embryos (+dox) (n=5). **P < 0.005, ***P < 0.0005; Student's t-test. Horizontal line represents mean values and error bars SD.Whole mount in situ hybridization of Tal1 in E7.5 untreated (-dox) or in utero treated (+dox) Nanogtg embryos. Scale bar, 100 µm.RT-qPCR determination of relative expression in wild type and CRISPR-deleted embryos (n=5) of Tal1 (wt, n=19; deleted, n=13), Klf1 (wt, n=3; deleted, n=6), Gfi1b (wt, n=10; deleted, n=8), Runx1 (wt, n=13; deleted, n=5) and Stil (wt, n=19; deleted, n=13). **P < 0.005, Student's t-test. Horizontal line represents mean values and error bars SD.Experimental design for ES to EpiL cell differentiation of Nanogtg cells and two independent clones (Nanogtg;dTal1del#1 and Nanogtg;dTal1del#2) where the binding site for NANOG distal to Tal1 has been deleted (left). On the right, relative expression of Tal1 determined by RT-qPCR for each ES cell line (ESC; n=9 for all three lines) and EpiL cells without (EpiLC; Nanogtg and Nanogtg;dTal1del#1, n=8; Nanogtg;dTal1del#2, n=6) or with dox treatment (EpiLC +dox; n=9 for all three lines). The genotype of the cell lines is indicated below. Values were normalized to Nanogtg ESC. *P < 0.05, **P < 0.01, ns = not significant; ANOVA with Fisher post-test. Horizontal line represents mean values and error bars standard error of the mean (SEM).  "}
{"words": ["Figure", "1B", "Competitive", "inhibition", "of", "mitochondrial", "protein", "import", "by", "clogger", "proteins", "inhibits", "cell", "growths", ".", "Yeast", "cells", "expressing", "clogger", "proteins", "(", "cytochrome", "b2", "-", "DHFR", "and", "cytochrome", "b2", "∆", "19", "-", "DHFR", ")", "or", "cytosolic", "DHFR", "for", "comparison", "under", "control", "of", "the", "galactose", "-", "inducible", "promoter", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "on", "lactate", "medium", ".", "Ten", "-", "fold", "serial", "dilutions", "were", "dropped", "on", "lactate", "(", "no", "induction", ")", "or", "lactate", "with", "0", ".", "5", "%", "galactose", "medium", "(", "induction", ")", ".", "MTS", ",", "matrix", "-", "targeting", "signal", ".", "E", "Levels", "of", "the", "proteasome", "protein", "Pre6", "were", "detected", "upon", "expression", "of", "cytosolic", "DHFR", "or", "clogger", "by", "Western", "blotting", "and", "quantified", "from", "three", "replicates", ".", "Cells", "were", "grown", "in", "lactate", "medium", "and", "clogger", "expression", "was", "induced", "for", "4", ".", "5", "h", "with", "0", ".", "5", "%", "galactose", "before", "samples", "were", "harvested", "and", "lysed", ".", "Data", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "standard", "deviations", "from", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Competitive inhibition of mitochondrial protein import by clogger proteins inhibits cell growths. Yeast cells expressing clogger proteins (cytochrome b2-DHFR and cytochrome b2∆19-DHFR) or cytosolic DHFR for comparison under control of the galactose-inducible promoter were grown to mid-log phase on lactate medium. Ten-fold serial dilutions were dropped on lactate (no induction) or lactate with 0.5% galactose medium (induction). MTS, matrix-targeting signal.E Levels of the proteasome protein Pre6 were detected upon expression of cytosolic DHFR or clogger by Western blotting and quantified from three replicates. Cells were grown in lactate medium and clogger expression was induced for 4.5 h with 0.5% galactose before samples were harvested and lysed. Data are displayed as mean ± standard deviations from n = 3 independent biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2A", "The", "clogger", "was", "expressed", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "and", "∆", "rpn4", "(", "∆", ")", "cells", "for", "4", ".", "5", "h", "with", "medium", "containing", "0", ".", "5", "%", "galactose", ".", "Medium", "was", "exchanged", "for", "a", "non", "-", "inducing", "lactate", "medium", ".", "Precursor", "(", "pre", ")", "and", "mature", "(", "m", ")", "forms", "of", "the", "b2", "∆", "-", "DHFR", "clogger", "were", "visualized", "by", "Western", "blotting", "using", "a", "DHFR", "-", "specific", "antibody", ".", "G", "Signals", "of", "Hsp104", "and", "Hsp42", "before", "and", "after", "clogger", "induction", "in", "wild", "type", "and", "∆", "rpn4", "cells", ".", "The", "cytosolic", "soluble", "DHFR", "protein", "was", "expressed", "for", "control", ".", "The", "strains", "were", "grown", "in", "lactate", "medium", "and", "clogger", "expression", "was", "induced", "with", "0", ".", "5", "%", "galactose", "for", "6", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A The clogger was expressed in wild type (WT) and ∆rpn4 (∆) cells for 4.5 h with medium containing 0.5% galactose. Medium was exchanged for a non-inducing lactate medium. Precursor (pre) and mature (m) forms of the b2∆-DHFR clogger were visualized by Western blotting using a DHFR-specific antibody.G Signals of Hsp104 and Hsp42 before and after clogger induction in wild type and ∆rpn4 cells. The cytosolic soluble DHFR protein was expressed for control. The strains were grown in lactate medium and clogger expression was induced with 0.5% galactose for 6 h."}
{"words": ["Figure", "3A", "Cytosolic", "DHFR", "(", "control", ")", "or", "the", "clogger", "protein", "b2", "-", "DHFR", "were", "expressed", "in", "wild", "type", "and", "∆", "rpn4", "cells", "for", "4", ".", "5", "h", ".", "The", "distribution", "of", "constitutively", "expressed", "Hsp104", "-", "GFP", "was", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Diameter", "of", "Hsp104", "-", "GFP", "-", "bound", "aggregates", "were", "quantified", ".", ".", "Data", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "standard", "deviations", "from", "n", "=", "36", "independent", "biological", "replicates", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "two", "-", "sided", ",", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "P", "values", "are", "indicated", "as", "asterisks", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "See", "also", "Fig", ".", "EV4A", "for", "quantification", "of", "the", "number", "of", "aggregates", "per", "cell", ".", "B", "Hsp104", "-", "GFP", "was", "purified", "on", "nanotrap", "sepharose", "in", "wild", "type", "cells", "that", "were", "grown", "at", "the", "indicated", "temperatures", ".", "SN", ",", "supernatant", "representing", "the", "non", "-", "bound", "fraction", ".", "The", "signals", "for", "Ssa1", "and", "Sod1", "are", "shown", "for", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Cytosolic DHFR (control) or the clogger protein b2-DHFR were expressed in wild type and ∆rpn4 cells for 4.5 h. The distribution of constitutively expressed Hsp104-GFP was visualized by fluorescence microscopy. Diameter of Hsp104-GFP-bound aggregates were quantified. . Data are displayed as mean ± standard deviations from n = 36 independent biological replicates. Significance was assessed using two-sided, paired Student's t-test. P values are indicated as asterisks ** p ≤ 0.01, **** p ≤ 0.0001. See also Fig. EV4A for quantification of the number of aggregates per cell.B Hsp104-GFP was purified on nanotrap sepharose in wild type cells that were grown at the indicated temperatures. SN, supernatant representing the non-bound fraction. The signals for Ssa1 and Sod1 are shown for control."}
{"words": ["Figure", "5A", "The", "mitochondrial", "proteins", "Pdb1", ",", "Mam33", "and", "Aim17", "were", "co", "-", "expressed", "for", "4", ".", "5", "h", "with", "clogger", "as", "fusions", "with", "the", "red", "fluorescent", "protein", "RFP", "(", "mCherry", ")", ".", "Fluorescence", "microscopic", "images", "of", "the", "indicated", "mitochondrial", "proteins", "visualized", "4", ".", "5", "h", "after", "induction", "of", "the", "clogger", "or", "cytosolic", "DHFR", "for", "control", ".", "For", "quantification", "of", "colocalization", "B", "Mutants", "lacking", "Hsp104", "and", "Hsp42", "were", "transformed", "with", "Aim17", "-", "expressing", "plasmids", "and", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "lactate", "medium", ".", "Clogger", "expression", "was", "induced", "for", "4", ".", "5", "h", "with", "0", ".", "5", "%", "galactose", "before", "microscopy", "was", "perfomed", ".", "Please", "note", "that", "in", "the", "absence", "of", "Hsp42", "and", "Hsp104", ",", "no", "Aim17", "-", "RFP", "-", "containing", "granules", "are", "formed", ".", "C", "Wild", "type", "cells", "were", "transformed", "with", "plasmids", "for", "the", "simultaneous", "expression", "of", "the", "clogger", "and", "an", "N", "-", "terminally", "truncated", "version", "of", "Mam33", "-", "RFP", "(", "both", "under", "control", "of", "GAL", "promoter", ")", "together", "with", "constitutively", "expressed", "Hsp104", "-", "GFP", "(", "TPI", "promoter", ")", ".", "The", "cells", "were", "grown", "on", "lactate", "plus", "0", ".", "5", "%", "galactose", "-", "containing", "medium", "for", "4", ".", "5", "h", ".", "The", "distribution", "of", "the", "fluorescent", "proteins", "was", "visualized", "by", "microscopy", ".", "D", "Wild", "type", "cells", "expressing", "Hsp104", "-", "GFP", "were", "grown", "on", "glucose", "or", "lactate", "medium", "to", "log", "phase", ".", "Cells", "were", "diluted", "and", "visualized", "by", "life", "cell", "imaging", ".", "Please", "note", ",", "that", "in", "glucose", "media", ",", "Hsp104", "-", "GFP", "is", "initially", "dispersed", "in", "cells", "and", "only", "aggregates", "when", "cells", "become", "stationary", ".", "In", "contrast", ",", "Hsp104", "-", "GFP", "-", "containing", "granules", "are", "frequent", "on", "lactate", "medium", "even", "at", "log", "phase", ".", "See", "movie", "EV1", "for", "life", "cell", "imaging", "of", "glucose", "-", "grown", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A The mitochondrial proteins Pdb1, Mam33 and Aim17 were co-expressed for 4.5 h with clogger as fusions with the red fluorescent protein RFP (mCherry). Fluorescence microscopic images of the indicated mitochondrial proteins visualized 4.5 h after induction of the clogger or cytosolic DHFR for control. For quantification of colocalization B Mutants lacking Hsp104 and Hsp42 were transformed with Aim17-expressing plasmids and grown to mid-log phase in lactate medium. Clogger expression was induced for 4.5 h with 0.5 % galactose before microscopy was perfomed. Please note that in the absence of Hsp42 and Hsp104, no Aim17-RFP-containing granules are formed. C Wild type cells were transformed with plasmids for the simultaneous expression of the clogger and an N-terminally truncated version of Mam33-RFP (both under control of GAL promoter) together with constitutively expressed Hsp104-GFP (TPI promoter) . The cells were grown on lactate plus 0.5% galactose-containing medium for 4.5 h. The distribution of the fluorescent proteins was visualized by microscopy.D Wild type cells expressing Hsp104-GFP were grown on glucose or lactate medium to log phase. Cells were diluted and visualized by life cell imaging. Please note, that in glucose media, Hsp104-GFP is initially dispersed in cells and only aggregates when cells become stationary. In contrast, Hsp104-GFP-containing granules are frequent on lactate medium even at log phase. See movie EV1 for life cell imaging of glucose-grown cells."}
{"words": ["Figure", "6E", "Clogger", "and", "Mam33", "-", "HA", "were", "co", "-", "expressed", "for", "4", ".", "5", "h", "in", "wild", "type", "and", "∆", "hsp42", "cells", ".", "Mitochondria", "were", "isolated", "and", "subjected", "to", "Western", "blotting", "to", "detect", "mature", "(", "m", ")", "and", "precursor", "(", "pre", ")", "forms", "of", "Mam33", "-", "HA", ".", "The", "matrix", "protein", "Tim16", "served", "as", "loading", "control", ".", "F", "The", "mitochondria", "used", "for", "E", "were", "treated", "with", "proteinase", "K", "(", "PK", ")", "to", "remove", "surface", "-", "exposed", "proteins", ".", "Mitochondrial", "membranes", "were", "lysed", "with", "NP", "-", "40", "and", "soluble", "(", "S", ")", "and", "aggregated", "(", "P", ")", "proteins", "were", "separated", "by", "centrifugation", ".", "T", ",", "total", ".", "G", "To", "measure", "the", "toxicity", "of", "clogger", "expression", ",", "clogger", "proteins", "were", "induced", "for", "24", "h", "with", "lactate", "medium", "containing", "0", ".", "5", "%", "galactose", "in", "the", "mutants", "indicated", ".", "Aliquots", "were", "removed", "and", "the", "number", "of", "living", "cells", "were", "assessed", "by", "a", "plating", "assay", "on", "glucose", "-", "containing", "plates", ".", "The", "resistance", "of", "∆", "rpn4", "to", "clogger", "expression", "depends", "on", "Hsp104", "and", "Hsp42", ".", "Data", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "standard", "deviations", "from", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6E Clogger and Mam33-HA were co-expressed for 4.5 h in wild type and ∆hsp42 cells. Mitochondria were isolated and subjected to Western blotting to detect mature (m) and precursor (pre) forms of Mam33-HA. The matrix protein Tim16 served as loading control.F The mitochondria used for E were treated with proteinase K (PK) to remove surface-exposed proteins. Mitochondrial membranes were lysed with NP-40 and soluble (S) and aggregated (P) proteins were separated by centrifugation. T, total.G To measure the toxicity of clogger expression, clogger proteins were induced for 24 h with lactate medium containing 0.5 % galactose in the mutants indicated. Aliquots were removed and the number of living cells were assessed by a plating assay on glucose-containing plates. The resistance of ∆rpn4 to clogger expression depends on Hsp104 and Hsp42. Data are displayed as mean ± standard deviations from n = 3 independent biological replicates."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Expression", "of", "CH25H", "in", "heathy", "donors", "and", "COVID", "-", "19", "patients", ".", "The", "box", "plot", "shows", "the", "expression", "of", "CH25H", "in", "macrophages", "of", "bronchoalveolar", "lavage", "fluids", "from", "three", "healthy", "donors", ",", "three", "moderate", "COVID", "-", "19", "patients", "and", "six", "severe", "COVID", "-", "19", "patients", "by", "scRNA", "-", "seq", "analysis", "(", "Liao", "et", "al", ".", ",", "2020", ")", ".", "Characterization", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "pseudovirus", ".", "(", "C", ")", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ",", "SARS", "-", "CoV", "and", "VSV", "pseudovirus", "(", "VSVG", ")", "were", "concentrated", "by", "ultracentrifuge", ".", "Incorporation", "of", "spike", "protein", "on", "viral", "membrane", "was", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "an", "antibody", "recognizing", "S2", "subunit", "of", "SARS", "-", "CoV", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ".", "VSV", "Matrix", "protein", "served", "as", "a", "loading", "control", "for", "viral", "particles", ".", "Black", "arrows", "indicate", "full", "length", "S", "and", "cleaved", "spike", "(", "S2", "subunit", ")", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Expression of CH25H in heathy donors and COVID-19 patients. The box plot shows the expression of CH25H in macrophages of bronchoalveolar lavage fluids from three healthy donors, three moderate COVID-19 patients and six severe COVID-19 patients by scRNA-seq analysis (Liao et al., 2020).Characterization of SARS-CoV-2 pseudovirus. (C) SARS-CoV-2, SARS-CoV and VSV pseudovirus (VSVG) were concentrated by ultracentrifuge. Incorporation of spike protein on viral membrane was analyzed by western blot using an antibody recognizing S2 subunit of SARS-CoV and SARS-CoV-2. VSV Matrix protein served as a loading control for viral particles. Black arrows indicate full length S and cleaved spike (S2 subunit), respectively."}
{"words": ["Figure", "225HC", "inhibits", "membrane", "fusion", "mediated", "by", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "(", "F", ")", "293FT", "or", "Vero", "cells", "were", "treated", "with", "EtOH", "or", "25HC", "(", "5", "µM", ")", "for", "16h", "prior", "to", "transfection", "with", "pLVX", "plasmids", "encoding", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "(", "F", ")", "in", "the", "absence", "of", "EtOH", "or", "25HC", ".", "At", "24h", "post", "-", "transfection", ",", "syncytium", "formation", "was", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "White", "arrows", "indicate", "syncytia", ".", "Quantification", "of", "membrane", "fusion", "was", "performed", "by", "calculating", "the", "percentages", "of", "nuclei", "involved", "in", "syncytia", "formation", "from", "all", "nuclei", "in", "GFP", "positive", "cells", ".", "25HC", "inhibits", "membrane", "fusion", "mediated", "by", ",", "SARS", "-", "CoV", "S", "(", "G", ",", "left", ")", ",", "and", "MERS", "-", "CoV", "S", "(", "G", ",", "right", ")", ".", "293FT", "or", "Vero", "cells", "were", "treated", "with", "EtOH", "or", "25HC", "(", "5", "µM", ")", "for", "16h", "prior", "to", "transfection", "with", "pLVX", "plasmids", "encoding", ",", "SARS", "-", "CoV", "S", "(", "G", ",", "left", ")", ",", "and", "MERS", "-", "CoV", "S", "(", "G", ",", "right", ")", "in", "the", "absence", "of", "EtOH", "or", "25HC", ".", "At", "24h", "post", "-", "transfection", ",", "syncytium", "formation", "was", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "White", "arrows", "indicate", "syncytia", ".", "Quantification", "of", "membrane", "fusion", "was", "performed", "by", "calculating", "the", "percentages", "of", "nuclei", "involved", "in", "syncytia", "formation", "from", "all", "nuclei", "in", "GFP", "positive", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 225HC inhibits membrane fusion mediated by SARS-CoV-2 S (F) 293FT or Vero cells were treated with EtOH or 25HC (5 µM) for 16h prior to transfection with pLVX plasmids encoding SARS-CoV-2 S (F) in the absence of EtOH or 25HC. At 24h post-transfection, syncytium formation was visualized by fluorescence microscopy. White arrows indicate syncytia. Quantification of membrane fusion was performed by calculating the percentages of nuclei involved in syncytia formation from all nuclei in GFP positive cells.25HC inhibits membrane fusion mediated by , SARS-CoV S (G, left), and MERS-CoV S (G, right). 293FT or Vero cells were treated with EtOH or 25HC (5 µM) for 16h prior to transfection with pLVX plasmids encoding , SARS-CoV S (G, left), and MERS-CoV S (G, right) in the absence of EtOH or 25HC. At 24h post-transfection, syncytium formation was visualized by fluorescence microscopy. Scale bar, 50 μm. White arrows indicate syncytia. Quantification of membrane fusion was performed by calculating the percentages of nuclei involved in syncytia formation from all nuclei in GFP positive cells."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", "-", "C", ")", "25HC", "depletes", "accessible", "cholesterol", "on", "the", "plasma", "membrane", ".", "(", "B", ")", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "treated", "with", "indicated", "concentrations", "of", "25HC", "for", "1h", ",", "and", "subsequently", "incubated", "with", "ALOD4", "for", "30", "min", ".", "Cell", "were", "washed", "twice", "with", "PBS", ",", "lysed", ",", "and", "the", "amounts", "of", "bound", "ALOD4", "were", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "(", "C", ")", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "treated", "with", "5", "µM", "25HC", "for", "1h", ",", "and", "subsequently", "incubated", "with", "AF488", "labeled", "ALOD4", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "washed", "twice", "and", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "(", "D", ")", "Cholesterol", "rescues", "the", "level", "of", "accessible", "cholesterol", "on", "the", "plasma", "membrane", "of", "25HC", "-", "treated", "cells", ".", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "pretreated", "with", "ethanol", "or", "5", "µM", "25HC", "for", "16h", ".", "Cells", "were", "washed", "and", "incubated", "with", "PBS", "or", "20", "µM", "cholesterol", "for", "1", "h", ".", "After", "further", "incubation", "with", "ALOD4", ",", "cells", "were", "washed", "with", "PBS", "twice", "and", "lysed", ".", "The", "amount", "of", "bound", "ALOD4", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "Addition", "of", "cholesterol", "rescues", "entry", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "pseudovirus", ",", "SARS", "-", "CoV", "pseudovirus", "into", "25HC", "-", "treated", "Calu", "-", "3", "cells", ".", "Cells", "were", "pretreated", "with", "ethanol", "or", "5", "µM", "25HC", "for", "16h", ",", "washed", "and", "incubated", "with", "PBS", "or", "80", "µM", "cholesterol", "for", "1h", "prior", "to", "infection", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "pseudovirus", ".", "Entry", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "pseudovirus", "(", "E", "and", "F", ")", "was", "assessed", "by", "luciferase", "assay", "or", "by", "fluorescence", "microscopy", "at", "24h", "post", "-", "infection", ".", "Addition", "of", "cholesterol", "rescues", "entry", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "pseudovirus", ",", "SARS", "-", "CoV", "pseudovirus", ",", "and", "MERS", "-", "CoV", "pseudovirus", "into", "25HC", "-", "treated", "Calu", "-", "3", "cells", ".", "Cells", "were", "pretreated", "with", "ethanol", "or", "5", "µM", "25HC", "for", "16h", ",", "washed", "and", "incubated", "with", "PBS", "or", "80", "µM", "cholesterol", "for", "1h", "prior", "to", "infection", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "pseudovirus", ".", ",", "SARS", "-", "CoV", "pseudovirus", "(", "G", ")", ",", "and", "MERS", "-", "CoV", "pseudovirus", "(", "H", ")", "was", "assessed", "by", "luciferase", "assay", "or", "by", "fluorescence", "microscopy", "at", "24h", "post", "-", "infection", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B-C) 25HC depletes accessible cholesterol on the plasma membrane. (B) Calu-3 cells were treated with indicated concentrations of 25HC for 1h, and subsequently incubated with ALOD4 for 30 min. Cell were washed twice with PBS, lysed, and the amounts of bound ALOD4 were examined by western blotting. (C) Calu-3 cells were treated with 5 µM 25HC for 1h, and subsequently incubated with AF488 labeled ALOD4 for 30 min. Cells were washed twice and examined by fluorescence microscopy.(D) Cholesterol rescues the level of accessible cholesterol on the plasma membrane of 25HC-treated cells. Calu-3 cells were pretreated with ethanol or 5 µM 25HC for 16h. Cells were washed and incubated with PBS or 20 µM cholesterol for 1 h. After further incubation with ALOD4, cells were washed with PBS twice and lysed. The amount of bound ALOD4 was examined by western blotting.Addition of cholesterol rescues entry of SARS-CoV-2 pseudovirus, SARS-CoV pseudovirus into 25HC-treated Calu-3 cells. Cells were pretreated with ethanol or 5 µM 25HC for 16h, washed and incubated with PBS or 80 µM cholesterol for 1h prior to infection with SARS-CoV-2 pseudovirus. Entry of SARS-CoV-2 pseudovirus (E and F) was assessed by luciferase assay or by fluorescence microscopy at 24h post-infection.Addition of cholesterol rescues entry of SARS-CoV-2 pseudovirus, SARS-CoV pseudovirus, and MERS-CoV pseudovirus into 25HC-treated Calu-3 cells. Cells were pretreated with ethanol or 5 µM 25HC for 16h, washed and incubated with PBS or 80 µM cholesterol for 1h prior to infection with SARS-CoV-2 pseudovirus. , SARS-CoV pseudovirus (G), and MERS-CoV pseudovirus (H) was assessed by luciferase assay or by fluorescence microscopy at 24h post-infection."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "SZ58", "-", "035", "rescues", "surface", "accessible", "cholesterol", "in", "25HC", "-", "treated", "cells", ".", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "or", "40", "µM", "SZ58", "-", "035", "for", "16", "h", ",", "prior", "to", "treatment", "with", "ethanol", "or", "2", ".", "5", "µM", "25HC", "for", "1h", ".", "Cells", "were", "then", "incubated", "with", "ALOD4", "for", "30", "min", ".", "The", "amount", "of", "bound", "ALOD4", "was", "examined", "by", "western", "blotting", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) SZ58-035 rescues surface accessible cholesterol in 25HC-treated cells. Calu-3 cells were treated with vehicle or 40 µM SZ58-035 for 16 h, prior to treatment with ethanol or 2.5 µM 25HC for 1h. Cells were then incubated with ALOD4 for 30 min. The amount of bound ALOD4 was examined by western blotting."}
{"words": ["Figure", "1E", "Reproducibility", "of", "2", "independent", "experiments", "-", "correlation", "of", "observed", "changes", "in", "expression", ".", "Blue", "line", "indicates", "the", "linear", "fit", "with", "shaded", "areas", "as", "confidence", "intervals", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1E Reproducibility of 2 independent experiments - correlation of observed changes in expression. Blue line indicates the linear fit with shaded areas as confidence intervals."}
{"words": ["Figure", "2A", "Number", "of", "target", "genes", "identified", "using", "differential", "expression", "for", "each", "assayed", "TF", ".", "*", "genes", "identified", "as", "essential", "for", "self", "-", "renewal", "of", "Hoxb8", "-", "FL", "cells", "either", "in", "(", "Basilico", "et", "al", ",", "2020", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Number of target genes identified using differential expression for each assayed TF. *genes identified as essential for self-renewal of Hoxb8-FL cells either in (Basilico et al, 2020)."}
{"words": ["Figure", "3A", "A", "representation", "of", "the", "pairwise", "degree", "of", "overlap", "in", "targets", "(", "size", "of", "the", "circle", ")", "and", "correlation", "in", "gene", "expression", "changes", "(", "colour", ")", "among", "overlapping", "targets", "for", "indicated", "TF", "perturbations", ".", "Red", "indicates", "positive", "correlations", "and", "blue", "negative", "correlations", ".", "D", "Identification", "of", "target", "gene", "modules", "-", "groups", "of", "genes", "with", "common", "regulatory", "patterns", "by", "TFs", ".", "Colour", "indicates", "the", "fold", "change", "(", "adjusted", "for", "significance", ")", "of", "gene", "expression", "following", "each", "TF", "perturbation", ".", "Rows", "(", "perturbed", "TFs", ")", "and", "columns", "(", "target", "genes", ")", "are", "hierarchically", "clustered", ".", "44", "modules", "for", "target", "genes", "are", "shown", ".", "Below", "examples", ".", "Selected", "modules", "with", "highlighted", "overall", "regulation", "pattern", "and", "example", "genes", "listed", "below", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A A representation of the pairwise degree of overlap in targets (size of the circle) and correlation in gene expression changes (colour) among overlapping targets for indicated TF perturbations. Red indicates positive correlations and blue negative correlations.D Identification of target gene modules - groups of genes with common regulatory patterns by TFs. Colour indicates the fold change (adjusted for significance) of gene expression following each TF perturbation. Rows (perturbed TFs) and columns (target genes) are hierarchically clustered. 44 modules for target genes are shown. Below examples. Selected modules with highlighted overall regulation pattern and example genes listed below."}
{"words": ["Figure", "4D", "Changes", "in", "expression", "for", "genes", "co", "-", "regulated", "by", "separate", "Cebpa", "/", "Meis1", "/", "Spi1", "and", "Hoxb8", "perturbations", "(", "FDR", "<", "0", ".", "1", "and", "|", "log2", "(", "FoldChange", ")", "|", ">", "0", ".", "2", ")", ".", "The", "interaction", "row", "indicates", "changes", "beyond", "simple", "additive", "effect", "(", "white", "=", "additive", "effect", ")", ".", "Each", "gene", "was", "annotated", "with", "an", "interaction", "class", "(", "int", ".", "class", ")", "as", "explained", "in", "(", "C", ")", ",", "using", "the", "|", "log2", "(", "FoldChange", ")", "|", ">", "0", ".", "2", ")", "threshold", "to", "assign", "change", "direction", ".", "E", "Fractions", "of", "genes", "in", "each", "interaction", "class", "showed", "in", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D Changes in expression for genes co-regulated by separate Cebpa/Meis1/Spi1 and Hoxb8 perturbations (FDR <0.1 and |log2(FoldChange)| > 0.2). The interaction row indicates changes beyond simple additive effect (white = additive effect). Each gene was annotated with an interaction class (int. class) as explained in (C), using the |log2(FoldChange)| > 0.2) threshold to assign change direction. E Fractions of genes in each interaction class showed in (D). "}
{"words": ["Figure", "5A", "Dice", "scores", "summarising", "overlaps", "among", "peaks", "identified", "for", "14", "ChIP", "experiments", "in", "Hoxb8", "-", "FL", "cells", ".", "B", "Comparison", "of", "genes", "identified", "as", "differentially", "expressed", "following", "TF", "loss", "with", "mapped", "ChIP", "peaks", "in", "a", "corresponding", "experiment", ".", "Enrichment", "over", "a", "random", "value", "and", "the", "p", "-", "value", "(", "based", "on", "the", "hypergeometric", "test", ")", "are", "shown", "(", "bars", "corresponding", "to", "non", "-", "significant", "enrichment", "values", "are", "semi", "-", "transparent", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "separately", "for", "genes", "up", "-", "and", "down", "-", "regulated", ".", "C", ",", "D", "Genomic", "views", "of", "relevant", "TF", "binding", "to", "Cebpa", "and", "Gata3", "loci", "(", "supporting", "direct", "regulatory", "interactions", "identified", "in", "Figs", "3A", ",", "B", ",", "C", ")", ".", "The", "red", "arrow", "indicates", "a", "putative", "enhancer", "element", ",", "which", "is", "bound", "by", "Ebf1", "and", "flanked", "by", "AcK27", "-", "rich", "regions", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Dice scores summarising overlaps among peaks identified for 14 ChIP experiments in Hoxb8-FL cells.B Comparison of genes identified as differentially expressed following TF loss with mapped ChIP peaks in a corresponding experiment. Enrichment over a random value and the p-value (based on the hypergeometric test) are shown (bars corresponding to non-significant enrichment values are semi-transparent). Analysis was performed separately for genes up- and down-regulated.C, D Genomic views of relevant TF binding to Cebpa and Gata3 loci (supporting direct regulatory interactions identified in Figs 3A,B,C). The red arrow indicates a putative enhancer element, which is bound by Ebf1 and flanked by AcK27-rich regions."}
{"words": ["Figure", "6C", "Correlation", "in", "gene", "expression", "changes", "following", "Ebf1", "and", "Gata3", "loss", "in", "Hoxb8", "-", "FL", "cells", ".", "Each", "quadrant", "corresponds", "to", "a", "set", "of", "target", "genes", "with", "a", "common", "regulation", "by", "Gata3", "/", "Ebf1", "-", "I", "-", "inhibition", "/", "inhibition", ",", "II", "-", "activation", "/", "inhibition", ",", "III", "-", "activation", "/", "activation", ",", "IV", "-", "inhibition", "/", "activation", ".", "For", "each", "group", "the", "sums", "of", "scaled", "expression", "values", "in", "mouse", "LK", "/", "LSK", "or", "human", "BMMC", "landscapes", "is", "plotted", "to", "highlight", "cell", "types", "with", "the", "highest", "overall", "expression", ".", "For", "landscape", "annotation", "see", "Fig", "7B", "andE", ".", ".", "Changes", "in", "expression", "for", "example", "genes", "are", "provided", "in", "Appendix", "Fig", "2G", "-", "J", ".", "Blue", "line", "indicates", "the", "linear", "fit", "with", "shaded", "areas", "as", "confidence", "intervals", ".", "E", "Correlation", "in", "expression", "changes", "after", "24h", "following", "Ebf1", "loss", "in", "Hoxb8", "-", "FL", "cells", "and", "re", "-", "expression", "of", "Ebf1", "in", "Ebf1", "-", "/", "-", "pre", "-", "pro", "B", "cells", "(", "Li", "et", "al", ",", "2018", ")", ".", "Blue", "line", "indicates", "the", "linear", "fit", "with", "shaded", "areas", "as", "confidence", "intervals", ".", "F", ",", "G", "Expression", "of", "the", "key", "marker", "genes", "(", "F", ")", "and", "Ebf1", ",", "Pax5", ",", "Gata3", ",", "Cebpa", "factors", "(", "G", ")", "along", "pseudotime", "corresponding", "to", "the", "B", "-", "cell", "differentiation", "trajectory", "in", "human", "foetal", "liver", "cells", ",", "data", "from", "(", "Popescu", "et", "al", ",", "2019", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C Correlation in gene expression changes following Ebf1 and Gata3 loss in Hoxb8-FL cells. Each quadrant corresponds to a set of target genes with a common regulation by Gata3/Ebf1 - I - inhibition/inhibition, II - activation/inhibition, III - activation/activation, IV - inhibition/activation. For each group the sums of scaled expression values in mouse LK/LSK or human BMMC landscapes is plotted to highlight cell types with the highest overall expression. For landscape annotation see Fig 7B andE.. Changes in expression for example genes are provided in Appendix Fig 2G-J. Blue line indicates the linear fit with shaded areas as confidence intervals.E Correlation in expression changes after 24h following Ebf1 loss in Hoxb8-FL cells and re-expression of Ebf1 in Ebf1-/- pre-pro B cells (Li et al, 2018). Blue line indicates the linear fit with shaded areas as confidence intervals.F, G Expression of the key marker genes (F) and Ebf1, Pax5, Gata3, Cebpa factors (G) along pseudotime corresponding to the B-cell differentiation trajectory in human foetal liver cells, data from (Popescu et al, 2019)."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Still", "images", "of", "GFP", "(", "syncytia", ")", "and", "Propidium", "Iodide", "(", "PI", ")", "(", "cell", "death", ")", "at", "different", "time", "-", "points", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "U2OS", "-", "ACE2", "fusion", "and", "death", "by", "time", "-", "lapse", "microscopy", ".", "Results", "are", "mean", "±", "sd", "from", "3", "fields", "per", "condition", ".", "D", ".", "S", "staining", "of", "infected", "U2OS", "-", "ACE2", "cells", "analyzed", "by", "immunofluorescence", ".", "The", "Hoechst", "dye", "stains", "the", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "µm", ".", "E", ".", "Surface", "S", "staining", "of", "infected", "U2OS", "-", "ACE2", "cells", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Results", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Still images of GFP (syncytia) and Propidium Iodide (PI) (cell death) at different time-points. Scale bar: 100 µm.C. Quantification of U2OS-ACE2 fusion and death by time-lapse microscopy. Results are mean±sd from 3 fields per condition.D. S staining of infected U2OS-ACE2 cells analyzed by immunofluorescence. The Hoechst dye stains the nuclei. Scale bar: 40 µm.E. Surface S staining of infected U2OS-ACE2 cells analyzed by flow cytometry. Results are representative of at least three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2Cells", "were", "infected", "at", "the", "indicated", "multiplicity", "of", "infection", "(", "MOI", ")", "and", "analyzed", "after", "20h", ".", "A", ".", "TMPRSS2", "increases", "fusion", "and", "cell", "mortality", ".", "Right", "panel", ":", "Areas", "of", "GFP", "+", "cells", "and", "PI", "+", "cellsCells", "were", "infected", "at", "the", "indicated", "multiplicity", "of", "infection", "(", "MOI", ")", "and", "analyzed", "after", "20h", ".", "B", ".", "IFITM1", ",", "but", "not", "IFITM2", "and", "3", ",", "inhibits", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "induced", "syncytia", "formation", ".", "Right", "panels", ":", "Area", "of", "GFP", "+", "cellsCells", "were", "infected", "at", "the", "indicated", "multiplicity", "of", "infection", "(", "MOI", ")", "and", "analyzed", "after", "20h", ".", "C", ".", "The", "fusion", "of", "IFITM1", "+", "cells", "with", "U2OS", "-", "ACE2", "syncytia", "is", "drastically", "reduced", ".", "Right", "panel", ":", "Area", "of", "IFITM", "+", "GFP", "+", "cellsCells", "were", "infected", "at", "the", "indicated", "multiplicity", "of", "infection", "(", "MOI", ")", "and", "analyzed", "after", "20h", ".", "D", ".", "IFITM1", "decreases", "the", "number", "of", "infected", "cells", ".", "Right", "panel", ":", "Fraction", "of", "cells", "positive", "for", "S", ",", "normalized", "to", "control", "cells", "(", "transduced", "with", "pQCXIP", "-", "empty", "vector", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Cells were infected at the indicated multiplicity of infection (MOI) and analyzed after 20h. A. TMPRSS2 increases fusion and cell mortality. Right panel: Areas of GFP+ cells and PI+ cellsCells were infected at the indicated multiplicity of infection (MOI) and analyzed after 20h. B. IFITM1, but not IFITM2 and 3, inhibits SARS-CoV-2-induced syncytia formation. Right panels: Area of GFP+ cellsCells were infected at the indicated multiplicity of infection (MOI) and analyzed after 20h. C. The fusion of IFITM1+ cells with U2OS-ACE2 syncytia is drastically reduced. Right panel: Area of IFITM+ GFP+ cellsCells were infected at the indicated multiplicity of infection (MOI) and analyzed after 20h. D. IFITM1 decreases the number of infected cells. Right panel: Fraction of cells positive for S, normalized to control cells (transduced with pQCXIP-empty vector )."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "Representative", "images", "of", "cell", "-", "cell", "fusion", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "GFP", "+", "areas", ".", "Results", "are", "mean", "±", "sd", "from", "5", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "TMPRSS2", "accelerates", "fusion", ".", "Cells", "were", "monitored", "by", "video", "microscopy", "and", "the", "GFP", "area", "was", "quantified", "over", "time", ".", "Left", "panel", ":", "one", "representative", "experiment", ".", "Results", "are", "mean", "±", "sd", "from", "3", "fields", "per", "condition", ".", "Right", "panel", ":", "Mean", "±", "sd", "from", "7", "independent", "experiments", "(", "at", "12h", "post", "transfection", ")", ".", "E", ".", "Impact", "of", "TMPRSS2", "and", "IFITMs", "on", "the", "kinetics", "of", "fusion", "by", "S", "-", "expressing", "293T", "cells", ".", "One", "representative", "out", "of", "three", "independent", "experiment", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. Representative images of cell-cell fusion. Scale bar: 100 µm.C. Quantification of GFP+ areas. Results are mean±sd from 5 independent experiments.D. TMPRSS2 accelerates fusion. Cells were monitored by video microscopy and the GFP area was quantified over time. Left panel: one representative experiment. Results are mean±sd from 3 fields per condition. Right panel: Mean±sd from 7 independent experiments (at 12h post transfection).E. Impact of TMPRSS2 and IFITMs on the kinetics of fusion by S-expressing 293T cells. One representative out of three independent experiment is shown."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "S", "-", "expressing", "cells", "(", "Donor", "cells", ")", ",", "ACE2", "-", "expressing", "cells", "(", "Acceptor", "cells", ")", "were", "co", "-", "transfected", "with", "TMPRSS2", ",", "IFITM", "or", "control", "plasmids", ".", "Cell", "fusion", "was", "quantified", "by", "measuring", "the", "GFP", "+", "area", "after", "18h", ".", "The", "indicated", "combinations", "were", "tested", ".", "The", "impact", "of", "IFITMs", "was", "measured", "in", "absence", "of", "TMPRSS2", "(", "left", "panel", ")", ",", "in", "presence", "of", "TMPRSS2", "in", "donor", "(", "middle", "panel", ")", "or", "acceptor", "cells", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "sd", "of", "4", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", ":", "One", "-", "Way", "ANOVA", ",", "ns", ":", "non", "-", "significant", ",", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "∗", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Impact", "of", "TMPRSS2", "on", "IFITMs", "levels", ".", "B", ".", "TMPRSS2", "does", "not", "decrease", "IFITM", "amounts", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "IFITM", "plasmids", ",", "with", "or", "without", "TMPRSS2", ",", "and", "analyzed", "18h", "later", ".", "C", ".", "Impact", "of", "TMPRSS2", "on", "S", "and", "ACE2", ",", "measured", "by", "Western", "Blot", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "or", "without", "IFITM1", ",", "TMPRSS2", ",", "S", "or", "ACE2", "plasmids", ",", "and", "analyzed", "18h", "later", ".", "Impact", "of", "TMPRSS2", "on", "S", "levels", ".", "D", ".", "TMPRSS2", "decreases", "S", "surface", "levels", ",", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "S", "plasmid", ",", "with", "or", "without", "TMPRSS2", ",", "and", "analyzed", "18h", "later", ".", "Murine", "polyclonal", "anti", "-", "S", "antibodies", ",", "one", "serum", "from", "a", "convalescent", "COVID", "-", "19", "patient", "(", "sera", "n", "°", "111", ")", ",", "and", "two", "monoclonal", "antibodies", "(", "anti", "-", "S1", "and", "anti", "-", "S2", ")", "were", "tested", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. S-expressing cells (Donor cells), ACE2-expressing cells (Acceptor cells) were co-transfected with TMPRSS2, IFITM or control plasmids. Cell fusion was quantified by measuring the GFP+ area after 18h. The indicated combinations were tested. The impact of IFITMs was measured in absence of TMPRSS2 (left panel), in presence of TMPRSS2 in donor (middle panel) or acceptor cells (right panel). Data are mean±sd of 4 independent experiments. Statistical analysis: One-Way ANOVA, ns: non-significant, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗∗p < 0.0001.Impact of TMPRSS2 on IFITMs levels. B. TMPRSS2 does not decrease IFITM amounts measured by flow cytometry. 293T cells were transfected with the indicated IFITM plasmids, with or without TMPRSS2, and analyzed 18h later.C. Impact of TMPRSS2 on S and ACE2, measured by Western Blot. 293T cells were transfected with or without IFITM1, TMPRSS2, S or ACE2 plasmids, and analyzed 18h later.Impact of TMPRSS2 on S levels. D. TMPRSS2 decreases S surface levels, measured by flow cytometry. 293T cells were transfected with S plasmid, with or without TMPRSS2, and analyzed 18h later. Murine polyclonal anti-S antibodies, one serum from a convalescent COVID-19 patient (sera n°111), and two monoclonal antibodies (anti-S1 and anti-S2) were tested. Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Identification", "of", "FASTKD2", "interacting", "proteins", "by", "AP", "-", "MS", "and", "BioID", ".", "26", "high", "confidence", "interactors", "detected", "by", "both", "techniques", "are", "listed", "on", "the", "right", ".", "B", ".", "Prey", "specificity", "graph", "for", "BioID", "interactome", "of", "TRUB2", "protein", ".", "Prey", "specificity", "was", "calculated", "as", "the", "relative", "enrichment", "of", "interaction", "of", "individual", "preys", "and", "TRUB2", ",", "compared", "to", "their", "interaction", "with", "138", "other", "baits", "(", "42", "mitochondrial", "baits", ",", "96", "baits", "from", "other", "cellular", "compartments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Identification of FASTKD2 interacting proteins by AP-MS and BioID. 26 high confidence interactors detected by both techniques are listed on the right.B. Prey specificity graph for BioID interactome of TRUB2 protein. Prey specificity was calculated as the relative enrichment of interaction of individual preys and TRUB2, compared to their interaction with 138 other baits (42 mitochondrial baits, 96 baits from other cellular compartments)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "indicated", "proteins", "in", "control", "and", "siRNA", "treated", "cells", ".", "B", ".", "BN", "-", "PAGE", "analysis", "of", "siRNA", "-", "mediated", "depletion", "shows", "an", "OXPHOS", "defect", "as", "revealed", "by", "subunit", "-", "specific", "antibodies", "against", "individual", "OXPHOS", "complexes", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "the", "levels", "of", "individual", "OXPHOS", "complexes", "normalized", "to", "Complex", "II", "levels", ".", "The", "graph", "represents", "the", "relative", "abundance", "of", "individual", "complexes", "in", "cells", "treated", "with", "the", "specified", "siRNA", "versus", "controls", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "3", "-", "7", "independent", "experiments", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "paired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "D", ",", "E", ".", "Pulse", "-", "labeling", "mitochondrial", "translation", "experiment", "of", "the", "13", "mitochondria", "-", "encoded", "polypeptides", "(", "seven", "subunits", "of", "complex", "I", "[", "ND", "]", ",", "three", "subunits", "of", "complex", "IV", "[", "COX", "]", ",", "two", "subunits", "of", "complex", "V", "[", "ATP", "]", "and", "one", "subunit", "of", "complex", "III", "[", "cyt", "b", "]", ")", "in", "control", "and", "siRNA", "treated", "cells", ".", "(", "E", ")", "Detail", "of", "a", "mitochondrial", "pulse", "-", "labeling", "experiment", "showing", "a", "severe", "decrease", "in", "the", "translation", "of", "ATP6", "and", "ATP8", "in", "TRUB2", "depleted", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblot analysis of indicated proteins in control and siRNA treated cells.B. BN-PAGE analysis of siRNA-mediated depletion shows an OXPHOS defect as revealed by subunit-specific antibodies against individual OXPHOS complexes.C. Quantification of the levels of individual OXPHOS complexes normalized to Complex II levels. The graph represents the relative abundance of individual complexes in cells treated with the specified siRNA versus controls. The bars represent the mean ± SEM of 3-7 independent experiments. P-values were calculated using paired two-tailed t-test (* P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001).D, E. Pulse-labeling mitochondrial translation experiment of the 13 mitochondria-encoded polypeptides (seven subunits of complex I [ND], three subunits of complex IV [COX], two subunits of complex V [ATP] and one subunit of complex III [cyt b]) in control and siRNA treated cells. (E) Detail of a mitochondrial pulse-labeling experiment showing a severe decrease in the translation of ATP6 and ATP8 in TRUB2 depleted cells."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ".", "Identification", "of", "mitochondrial", "ribosomal", "proteins", "and", "pseudouridine", "synthase", "interacting", "proteins", "by", "sucrose", "gradient", "centrifugation", "in", "control", "cells", "(", "A", ")", "Individual", "fractions", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "migration", "of", "the", "mt", "-", "SSU", "(", "28S", ")", ",", "the", "mt", "-", "LSU", "(", "39S", ")", "and", "the", "mitochondrial", "monosome", "(", "55S", ")", "are", "shown", ".", "A", ",", "B", ".", "Identification", "of", "mitochondrial", "ribosomal", "proteins", "and", "pseudouridine", "synthase", "interacting", "proteins", "by", "sucrose", "gradient", "centrifugation", "in", "cells", "treated", "with", "siRNA", "(", "B", ")", ".", "Individual", "fractions", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "migration", "of", "the", "mt", "-", "SSU", "(", "28S", ")", ",", "the", "mt", "-", "LSU", "(", "39S", ")", "and", "the", "mitochondrial", "monosome", "(", "55S", ")", "are", "shown", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "the", "levels", "of", "the", "mt", "-", "SSU", "(", "28S", ")", ",", "the", "mt", "-", "LSU", "(", "39S", ")", "and", "the", "mitochondrial", "monosome", "(", "55S", ")", "normalized", "to", "the", "SDHA", "levels", ".", "The", "graph", "represents", "the", "relative", "abundance", "of", "individual", "subunits", "in", "cells", "treated", "with", "specified", "siRNA", "versus", "controls", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "D", ".", "2D", "-", "immunoblot", "analysis", "(", "BN", "-", "PAGE", "/", "SDS", "-", "PAGE", ")", "of", "pseudouridine", "synthase", "interacting", "proteins", ".", "The", "migration", "(", "sizes", "in", "kDa", ")", "of", "known", "protein", "complexes", "in", "the", "first", "dimension", "is", "indicated", "on", "the", "top", "of", "the", "blot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B. Identification of mitochondrial ribosomal proteins and pseudouridine synthase interacting proteins by sucrose gradient centrifugation in control cells (A) Individual fractions were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. The migration of the mt-SSU (28S), the mt-LSU (39S) and the mitochondrial monosome (55S) are shown.A, B. Identification of mitochondrial ribosomal proteins and pseudouridine synthase interacting proteins by sucrose gradient centrifugation in cells treated with siRNA (B). Individual fractions were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. The migration of the mt-SSU (28S), the mt-LSU (39S) and the mitochondrial monosome (55S) are shown.C. Quantification of the levels of the mt-SSU (28S), the mt-LSU (39S) and the mitochondrial monosome (55S) normalized to the SDHA levels. The graph represents the relative abundance of individual subunits in cells treated with specified siRNA versus controls. The bars represent the mean ± SEM.D. 2D-immunoblot analysis (BN-PAGE/SDS-PAGE) of pseudouridine synthase interacting proteins. The migration (sizes in kDa) of known protein complexes in the first dimension is indicated on the top of the blot."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Quantification", "of", "Δ", "(", "the", "difference", "between", "the", "rate", "of", "deletions", "in", "CMC", "treated", "vs", "un", "-", "treated", "cells", ")", "for", "individual", "ψ", "sites", "in", "control", "and", "siRNA", "treated", "cells", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "one", "-", "tailed", "t", "-", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Quantification of Δ (the difference between the rate of deletions in CMC treated vs un-treated cells) for individual ψ sites in control and siRNA treated cells. The bars represent the mean ± SEM of two independent experiments. P-values were calculated using a one-tailed t-test (* P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "(", "MOI", "=", "10", ")", "for", "4", "h", "(", "as", "described", "in", "the", "Materials", "and", "Methods", ")", ",", "and", "then", "incubated", "for", "24", "h", "(", "left", ")", "or", "the", "indicated", "periods", "of", "time", "(", "right", ")", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "stained", "with", "DAPI", "to", "visualize", "nuclei", "(", "blue", ")", ",", "and", "immunolabeled", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Primary", "antibody", "was", "detected", "using", "an", "Alexa", "Fluor", "488", "-", "conjugated", "goat", "anti", "-", "rabbit", "IgG", "(", "green", ")", ".", "Left", ":", "representative", "immunofluorescence", "images", "of", "LC3", "punctae", ";", "right", ":", "quantification", "of", "data", "(", "LC3", "-", "punctated", "cells", "were", "counted", "manually", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "vs", ".", "Mtb", "-", "WT", "-", "infected", "condition", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "µm", ".", "(", "(", "B", ")", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "3", "-", "methyladenine", "(", "3", "-", "MA", ";", "10", "mM", ")", "and", "subjected", "to", "confocal", "analysis", "as", "described", "in", "Figure", "1A", ".", "LC3", "-", "punctated", "cells", "were", "counted", "manually", ".", "Each", "condition", "was", "assayed", "in", "triplicate", ",", "and", "at", "least", "250", "cells", "were", "counted", "in", "each", "well", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "vs", ".", "SC", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analyses", "performed", "using", "Abs", "raised", "to", "LC3", "or", "β", "-", "actin", ".", "Experimental", "conditions", "were", "identical", "to", "those", "outlined", "in", "panel", "A", ".", "Gel", "images", "representative", "of", "three", "experiments", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "Electron", "micrographs", "of", "Mtb", "-", "Δeis", "-", "infected", "BMDMs", "under", "low", "(", "left", ")", "and", "high", "(", "right", ")", "magnification", "show", "the", "accumulation", "of", "autophagic", "vesicles", "(", "black", "arrow", ",", "initial", "autophagic", "vacuoles", ";", "white", "arrow", ",", "degradative", "autophagic", "vacuoles", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "µm", "(", "left", ")", ",", "0", ".", "5", "µm", "(", "right", ")", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "analyses", "performed", "using", "Abs", "raised", "to", "LC3", "or", "β", "-", "actin", ".", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "(", "10", "mM", ")", "or", "bafilomycin", "A1", "(", "Baf", "-", "A1", ";", "100", "nM", ")", ".", "Gel", "images", "representative", "of", "three", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "ratio", "of", "the", "intensities", "of", "the", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "and", "β", "-", "actin", "bands", "is", "indicated", "below", "each", "lane", "(", "C", "and", "E", ")", ".", "UI", ",", "uninfected", ";", "SC", ",", "solvent", "control", "(", "0", ".", "1", "%", "distilled", "water", "(", "B", ")", ",", "0", ".", "1", "%", "DMSO", "(", "E", ")", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) BMDMs were infected with Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis (MOI = 10) for 4 h (as described in the Materials and Methods), and then incubated for 24 h (left) or the indicated periods of time (right). Cells were fixed, stained with DAPI to visualize nuclei (blue), and immunolabeled with an anti-LC3 antibody. Primary antibody was detected using an Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (green). Left: representative immunofluorescence images of LC3 punctae; right: quantification of data (LC3-punctated cells were counted manually). ***p<0.001, vs. Mtb-WT-infected condition. Scale bars, 5 µm. ((B) BMDMs were infected with Mtb-Δeis in the absence or presence of 3-methyladenine (3-MA; 10 mM) and subjected to confocal analysis as described in Figure 1A. LC3-punctated cells were counted manually. Each condition was assayed in triplicate, and at least 250 cells were counted in each well. ***p<0.001, vs. SC.(C) Immunoblot analyses performed using Abs raised to LC3 or β-actin. Experimental conditions were identical to those outlined in panel A. Gel images representative of three experiments are shown.(D) Electron micrographs of Mtb-Δeis-infected BMDMs under low (left) and high (right) magnification show the accumulation of autophagic vesicles (black arrow, initial autophagic vacuoles; white arrow, degradative autophagic vacuoles). Scale bars: 2 µm (left), 0.5 µm (right).(E) Immunoblot analyses performed using Abs raised to LC3 or β-actin. BMDMs were infected with Mtb-Δeis in the presence or absence of 3-MA (10 mM) or bafilomycin A1 (Baf-A1; 100 nM). Gel images representative of three experiments are shown. The ratio of the intensities of the LC3-II/LC3-I and β-actin bands is indicated below each lane (C and E). UI, uninfected; SC, solvent control (0.1% distilled water (B), 0.1% DMSO (E))."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "and", "B", ")", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "at", "different", "MOIs", "(", "0", ".", "1", ",", "1", "and", "10", ")", "for", "18", "h", "(", "A", ")", "or", "for", "the", "indicated", "periods", "of", "time", "(", "B", ";", "MOI", " ", "=", " ", "10", ")", ".", "Supernatants", "were", "assessed", "by", "ELISA", "for", "levels", "of", "TNF", "-", "α", "and", "IL", "-", "6", ".", "Data", "(", "A", "and", "B", ")", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "experiments", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "BMDMs", "were", "stimulated", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "then", "incubated", "with", "10", "µM", "DHE", "or", "5", "µM", "DCFH", "-", "DA", "for", "15", "min", ",", "washed", "thoroughly", ",", "and", "immediately", "analyzed", "for", "superoxide", "or", "H2O2", "production", "by", "flow", "cytometry", "(", "C", ",", "Left", ")", ".", "Cells", "were", "labeled", "with", "MitoSOX", "for", "30", "min", "and", "analyzed", "for", "mitochondrial", "ROS", "levels", "by", "flow", "cytometry", "(", "D", ",", "top", ")", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "ROS", "generation", "(", "C", ",", "right", ";", "D", ",", "bottom", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "vs", ".", "Mtb", "-", "WT", "-", "infected", "condition", ".", "UI", ",", "uninfected", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A and B) BMDMs were infected with Mtb-WT, Mtb-Δeis or Mtb-c-eis at different MOIs (0.1, 1 and 10) for 18 h (A) or for the indicated periods of time (B; MOI = 10). Supernatants were assessed by ELISA for levels of TNF-α and IL-6. Data (A and B) are presented as the mean±SD of five experiments.(C and D) BMDMs were stimulated with Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis for 30 min. Cells were then incubated with 10 µM DHE or 5 µM DCFH-DA for 15 min, washed thoroughly, and immediately analyzed for superoxide or H2O2 production by flow cytometry (C, Left). Cells were labeled with MitoSOX for 30 min and analyzed for mitochondrial ROS levels by flow cytometry (D, top). Quantitative analysis of ROS generation (C, right; D, bottom). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, vs. Mtb-WT-infected condition. UI, uninfected."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "C", ")", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "(", "MOI", " ", "=", " ", "10", ")", "for", "18", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "DPI", "(", "10", "µM", ")", ",", "NAC", "(", "20", "mM", ")", ",", "catalase", "(", "Cat", ",", "1", "mU", "/", "mL", ")", ",", "or", "tiron", "(", "5", "mM", ")", ".", "(", "A", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "(", "top", ")", ";", "percentage", "of", "endogenous", "LC3", "-", "punctated", "cells", "(", "bottom", ")", "(", "B", ")", "Immunoblot", "analyses", "of", "BMDMs", "with", "antibodies", "raised", "to", "LC3", "or", "β", "-", "actin", ".", "Gel", "images", "are", "representative", "of", "three", "experiments", ".", "The", "ratio", "of", "the", "intensities", "of", "the", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "and", "β", "-", "actin", "bands", "is", "indicated", "below", "each", "lane", ".", "(", "C", ")", "Experimental", "conditions", "were", "identical", "to", "those", "outlined", "in", "Figure", "3A", ".", "Supernatants", "collected", "18", "h", "after", "infection", "were", "assessed", "for", "cytokine", "levels", "by", "ELISA", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "experiments", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "BMDMs", "from", "WT", "and", "NOX2", "KO", "mice", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "for", "18", "h", ".", "(", "D", ")", "Numbers", "of", "LC3", "-", "punctated", "cells", "(", "counted", "manually", ")", "are", "shown", "(", "at", "least", "250", "cells", "were", "counted", "in", "each", "well", ")", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "analyses", "performed", "using", "Abs", "raised", "to", "LC3", "or", "β", "-", "actin", ".", "BMDMs", "from", "WT", "and", "NOX2", "KO", "mice", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "for", "18", "h", ".", "Gel", "images", "representative", "of", "three", "experiments", "are", "shown", ".", "(", "F", ")", "Supernatants", "collected", "18", "h", "after", "infection", "were", "assessed", "for", "cytokine", "levels", "by", "ELISA", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "at", "least", "three", "separate", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "vs", ".", "SC", "(", "A", "and", "C", ")", ";", "WT", "mice", "(", "D", "and", "F", ")", ".", "UI", ",", "uninfected", ";", "SC", ",", "solvent", "control", "(", "0", ".", "1", "%", "DMSO", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-C) BMDMs were infected with Mtb-Δeis (MOI = 10) for 18 h in the presence or absence of DPI (10 µM), NAC (20 mM), catalase (Cat, 1 mU/mL), or tiron (5 mM). (A) Representative immunofluorescence images (top); percentage of endogenous LC3-punctated cells (bottom)(B) Immunoblot analyses of BMDMs with antibodies raised to LC3 or β-actin. Gel images are representative of three experiments. The ratio of the intensities of the LC3-II/LC3-I and β-actin bands is indicated below each lane.(C) Experimental conditions were identical to those outlined in Figure 3A. Supernatants collected 18 h after infection were assessed for cytokine levels by ELISA. Data represent the mean±SD of five experiments.(D-F) BMDMs from WT and NOX2 KO mice were infected with Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis for 18 h. (D) Numbers of LC3-punctated cells (counted manually) are shown (at least 250 cells were counted in each well).(E) Immunoblot analyses performed using Abs raised to LC3 or β-actin. BMDMs from WT and NOX2 KO mice were infected with Mtb-Δeis for 18 h. Gel images representative of three experiments are shown.(F) Supernatants collected 18 h after infection were assessed for cytokine levels by ELISA. Data are presented as the mean±SD of at least three separate experiments, each performed in triplicate. ***p<0.001, vs. SC (A and C); WT mice (D and F). UI, uninfected; SC, solvent control (0.1% DMSO)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "(", "MOI", " ", "=", " ", "10", ")", "for", "the", "indicated", "periods", "of", "time", ",", "washed", "to", "remove", "unbound", "mycobacteria", ",", "and", "then", "incubated", "in", "complete", "DMEM", "at", "37", "°", "C", "in", "5", "%", "CO2", ".", "Cell", "viability", "was", "assessed", "by", "PI", "staining", "and", "then", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Experimental", "conditions", "were", "identical", "to", "those", "outlined", "in", "panel", "A", ".", "BMDMs", "were", "infected", "with", "the", "three", "strains", "of", "mycobacteria", "for", "36", "h", ".", "B", ")", "Apoptosis", "was", "assessed", "using", "a", "TUNEL", "/", "apoptosis", "detection", "kit", ",", "according", "to", "the", "manufacturer", "'", "s", "protocol", ".", "Cells", "were", "then", "examined", "under", "a", "laser", "-", "scanning", "confocal", "microscope", "(", "LSM", "510", ";", "Zeiss", ")", ".", "Percentages", "of", "TUNEL", "-", "positive", ",", "PI", "-", "positive", ",", "and", "TUNEL", "-", "/", "PI", "-", "double", "-", "positive", "cells", "were", "calculated", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "separate", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Morphological", "changes", "in", "BMDMs", "infected", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "at", "MOIs", "of", "1", "and", "10", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", "(", "low", "magnification", ")", ",", "20", "µm", "(", "high", "magnification", ")", ".", "(", "D", ")", "Macrophages", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "zVAD", "-", "fmk", "(", "20", "µM", ")", "or", "3", "-", "MA", "(", "10", "mM", ")", ".", "Staurosporine", "(", "STS", ";", "500", "nM", ")", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "After", "36", "h", ",", "cells", "were", "stained", "with", "PI", "and", "then", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "at", "least", "three", "separate", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "duplicate", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "vs", ".", "Mtb", "-", "WT", "-", "infected", "condition", "(", "A", "and", "B", ")", ";", "Mtb", "-", "Δeis", "-", "infected", "condition", "without", "inhibitors", "(", "D", ")", ".", "UI", ",", "uninfected", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) BMDMs were infected with Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis (MOI = 10) for the indicated periods of time, washed to remove unbound mycobacteria, and then incubated in complete DMEM at 37°C in 5% CO2. Cell viability was assessed by PI staining and then examined by fluorescence microscopy. (B and C) Experimental conditions were identical to those outlined in panel A. BMDMs were infected with the three strains of mycobacteria for 36 h.B) Apoptosis was assessed using a TUNEL/apoptosis detection kit, according to the manufacturer's protocol. Cells were then examined under a laser-scanning confocal microscope (LSM 510; Zeiss). Percentages of TUNEL-positive, PI-positive, and TUNEL-/PI-double-positive cells were calculated. Data are representative of three separate experiments.(C) Morphological changes in BMDMs infected with Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis at MOIs of 1 and 10. Representative images are shown. Scale bars: 50 µm (low magnification), 20 µm (high magnification).(D) Macrophages were infected with Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis in the presence or absence of zVAD-fmk (20 µM) or 3-MA (10 mM). Staurosporine (STS; 500 nM) was used as a positive control. After 36 h, cells were stained with PI and then examined by fluorescence microscopy. Data are presented as the mean±SD of at least three separate experiments, each performed in duplicate. *p<0.05, ***p<0.001, vs. Mtb-WT-infected condition (A and B); Mtb-Δeis-infected condition without inhibitors (D). UI, uninfected."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "and", "B", ")", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "(", "MOI", " ", "=", " ", "1", ")", "for", "the", "indicated", "periods", "of", "time", ",", "and", "then", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "using", "Abs", "raised", "to", "p", "-", "ERK1", "/", "2", ",", "p", "-", "p38", ",", "p", "-", "JNK", ",", "and", "β", "-", "actin", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "that", "all", "yielded", "similar", "results", "(", "A", ")", ".", "Expression", "of", "phospho", "-", "MAPK", "/", "β", "-", "actin", "protein", "in", "cytoplasmic", "extracts", "of", "BMDMs", "was", "quantified", "densitometrically", "(", "B", ")", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "BMDMs", "were", "pretreated", "with", "U0126", "(", "5", ",", "10", ",", "20", "µM", ")", ",", "SB203580", "(", "SB", ";", "1", ",", "5", ",", "10", "µM", ")", ",", "or", "SP600125", "(", "SP", ";", "5", ",", "10", ",", "20", "µM", ")", "for", "45", "min", ",", "and", "then", "infected", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "for", "30", "min", "(", "C", ")", "or", "36", "h", "(", "D", ")", ".", "(", "C", ")", "Cells", "were", "then", "incubated", "with", "DHE", "for", "15", "min", ",", "washed", "rapidly", "and", "thoroughly", ",", "and", "analyzed", "immediately", "for", "superoxide", "levels", "by", "flow", "cytometry", ".", "Quantitative", "DHE", "fluorescence", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "four", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Cell", "death", "after", "36", "h", "was", "assessed", "by", "PI", "staining", "and", "then", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "(", "(", "E", ")", "Raw264", ".", "7", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", "specific", "for", "JNK1", "(", "siJNK", ")", "or", "a", "non", "-", "specific", "control", "siRNA", "(", "siNS", ")", ".", "At", "24", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "for", "36", "h", ".", "Cell", "death", "was", "then", "assessed", "by", "PI", "staining", ",", "and", "then", "examined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Transfection", "efficiency", "was", "assessed", "by", "RT", "-", "PCR", "(", "inset", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "random", "fields", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "D", "and", "E", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "vs", ".", "Mtb", "-", "WT", "-", "infected", "condition", "(", "B", ")", ";", "SC", "(", "C", "and", "D", ")", ";", "siNS", "(", "E", ")", ".", "UI", ",", "uninfected", ";", "SC", ",", "solvent", "control", "(", "0", ".", "1", "%", "DMSO", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A and B) BMDMs were infected with Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis (MOI = 1) for the indicated periods of time, and then subjected to Western blot analysis using Abs raised to p-ERK1/2, p-p38, p-JNK, and β-actin. Data shown are representative of three independent experiments that all yielded similar results (A). Expression of phospho-MAPK/β-actin protein in cytoplasmic extracts of BMDMs was quantified densitometrically (B).(C and D) BMDMs were pretreated with U0126 (5, 10, 20 µM), SB203580 (SB; 1, 5, 10 µM), or SP600125 (SP; 5, 10, 20 µM) for 45 min, and then infected with Mtb-Δeis for 30 min (C) or 36 h (D). (C) Cells were then incubated with DHE for 15 min, washed rapidly and thoroughly, and analyzed immediately for superoxide levels by flow cytometry. Quantitative DHE fluorescence data represent the mean±SD of four experiments. (D) Cell death after 36 h was assessed by PI staining and then examined by fluorescence microscopy. ((E) Raw264.7 cells were transfected with siRNA specific for JNK1 (siJNK) or a non-specific control siRNA (siNS). At 24 h after transfection, cells were infected with Mtb-Δeis for 36 h. Cell death was then assessed by PI staining, and then examined by flow cytometry. Transfection efficiency was assessed by RT-PCR (inset). Data represent the mean±SD of five random fields and are representative of three independent experiments (D and E). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, vs. Mtb-WT-infected condition (B); SC (C and D); siNS (E). UI, uninfected; SC, solvent control (0.1% DMSO)."}
{"words": ["Figure", "6C57BL", "/", "6", "mice", "were", "challenged", ",", "by", "aerosol", ",", "with", "10", "-", "30", "CFU", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "and", "sacrificed", "4", "weeks", "post", "-", "infection", ".", "(", "A", ")", "High", "-", "and", "low", "-", "magnification", "electron", "micrographs", "of", "lung", "tissue", "sections", "from", "mice", "infected", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "show", "accumulation", "of", "autophagic", "vesicles", "(", "black", "arrow", ",", "bacteria", "in", "autophagic", "vacuoles", ";", "white", "arrow", ",", "degradative", "autophagic", "vacuoles", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "µm", "(", "left", "upper", ")", ",", "0", ".", "5", "µm", "(", "right", ")", ".", "Numbers", "of", "autophagic", "vacuoles", "per", "cell", "in", "each", "TEM", "section", "(", "left", "lower", ")", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", " ", "=", " ", "50", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "lung", "tissue", "from", "Mtb", "-", "WT", "-", ",", "Mtb", "-", "Δeis", "-", ",", "and", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "-", "infected", "mice", ".", "Total", "RNA", "was", "extracted", "from", "paraffin", "-", "embedded", "lung", "tissue", "sections", ",", "as", "described", "in", "the", "Materials", "and", "Methods", ".", "(", "C", ")", "To", "assess", "in", "vivo", "cell", "death", ",", "bronchoalveolar", "lavage", "fluid", "cells", "from", "Mtb", "-", "WT", "-", ",", "Mtb", "-", "Δeis", "-", ",", "and", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "-", "infected", "mice", "were", "subjected", "to", "PI", "staining", ",", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", " ", "=", " ", "4", ")", ".", "(", "D", ")", "Numbers", "of", "CFUs", "in", "lung", "and", "spleen", "4", "weeks", "after", "infection", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", ".", "Data", "are", "presented", "as", "log10", "CFU", "±", "SEM", "(", "n", " ", "=", " ", "4", ")", ".", "(", "E", ")", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "WT", ",", "Mtb", "-", "Δeis", ",", "or", "Mtb", "-", "c", "-", "eis", "and", "then", "analyzed", "by", "CFU", "assay", ".", "CFU", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "four", "individual", "experiments", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "vs", ".", "Mtb", "-", "WT", "-", "infected", "condition", ".", "UI", ",", "uninfected", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C57BL/6 mice were challenged, by aerosol, with 10-30 CFU Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis and sacrificed 4 weeks post-infection. (A) High- and low-magnification electron micrographs of lung tissue sections from mice infected with Mtb-Δeis show accumulation of autophagic vesicles (black arrow, bacteria in autophagic vacuoles; white arrow, degradative autophagic vacuoles). Scale bars: 2 µm (left upper), 0.5 µm (right). Numbers of autophagic vacuoles per cell in each TEM section (left lower) (mean±SD; n = 50).(B) Quantitative RT-PCR analysis of lung tissue from Mtb-WT-, Mtb-Δeis-, and Mtb-c-eis-infected mice. Total RNA was extracted from paraffin-embedded lung tissue sections, as described in the Materials and Methods.(C) To assess in vivo cell death, bronchoalveolar lavage fluid cells from Mtb-WT-, Mtb-Δeis-, and Mtb-c-eis-infected mice were subjected to PI staining, and analyzed by flow cytometry. Data are presented as the mean±SEM (n = 4).(D) Numbers of CFUs in lung and spleen 4 weeks after infection with Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis. Data are presented as log10 CFU±SEM (n = 4).(E) BMDMs were infected with Mtb-WT, Mtb-Δeis, or Mtb-c-eis and then analyzed by CFU assay. CFU data represent the mean±SD of four individual experiments. **p<0.01, ***p<0.001, vs. Mtb-WT-infected condition. UI, uninfected."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Intracellular", "superoxide", "production", "was", "analyzed", "by", "flow", "cytometric", "analysis", ".", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "(", "MOI", " ", "=", " ", "10", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "recombinant", "Eis", "protein", "(", "rEis", ";", "5", ",", "10", ",", "20", "µg", "/", "mL", ")", "or", "30", "kDa", "Mtb", "antigen", "(", "30", "k", ";", "5", ",", "10", ",", "20", "µg", "/", "mL", ")", ".", "Upper", ",", "representative", "flow", "cytometric", "analysis", ";", "lower", ",", "quantitation", "of", "superoxide", "generation", ".", "(", "B", ")", "THP", "-", "1", "cells", "were", "transfected", "with", "mock", ",", "Eis", "-", "WT", ",", "or", "Eis", "-", "ΔAT", "constructs", ",", "and", "infected", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "DHE", "(", "for", "superoxide", ")", "or", "DCFH", "-", "DA", "(", "for", "H2O2", ")", "and", "subjected", "to", "flow", "cytometric", "analysis", ".", "Inset", ",", "transfection", "efficiency", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Experimental", "conditions", "were", "identical", "to", "those", "outlined", "in", "panels", "A", "and", "B", ",", "respectively", ".", "Supernatants", "were", "collected", "18", "h", "after", "infection", "and", "assessed", "by", "ELISA", "for", "levels", "of", "TNF", "-", "α", "and", "IL", "-", "6", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "experiments", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "THP", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "mock", ",", "Eis", "-", "WT", ",", "or", "Eis", "-", "ΔAT", "constructs", "were", "pretreated", "with", "SP600125", "(", "SP", ";", "20", "µM", ")", "or", "SB203580", "(", "SB", ";", "5", "µM", ")", "for", "45", "min", "before", "infection", "with", "Mtb", "-", "Δeis", "for", "30", "min", "(", "E", ")", "or", "18", "h", "(", "F", ")", ".", "E", ",", "Intracellular", "superoxide", "production", "was", "analyzed", "by", "flow", "cytometric", "analysis", ".", "F", ",", "ELISA", "analysis", "for", "TNF", "-", "α", "and", "IL", "-", "6", "levels", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "experiments", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "vs", ".", "SC", "(", "A", ",", "C", ",", "E", ",", "and", "F", ")", ";", "mock", "control", "(", "B", "and", "D", ")", ".", "UI", ",", "uninfected", ";", "SC", ",", "solvent", "control", "(", "0", ".", "1", "%", "DMSO", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Intracellular superoxide production was analyzed by flow cytometric analysis. BMDMs were infected with Mtb-Δeis (MOI = 10) in the presence or absence of recombinant Eis protein (rEis; 5, 10, 20 µg/mL) or 30 kDa Mtb antigen (30 k; 5, 10, 20 µg/mL). Upper, representative flow cytometric analysis; lower, quantitation of superoxide generation.(B) THP-1 cells were transfected with mock, Eis-WT, or Eis-ΔAT constructs, and infected with Mtb-Δeis for 30 min. Cells were stained with DHE (for superoxide) or DCFH-DA (for H2O2) and subjected to flow cytometric analysis. Inset, transfection efficiency.(C and D) Experimental conditions were identical to those outlined in panels A and B, respectively. Supernatants were collected 18 h after infection and assessed by ELISA for levels of TNF-α and IL-6. Data are presented as the mean±SD of five experiments.(E and F) THP-1 cells transfected with mock, Eis-WT, or Eis-ΔAT constructs were pretreated with SP600125 (SP; 20 µM) or SB203580 (SB; 5 µM) for 45 min before infection with Mtb-Δeis for 30 min (E) or 18 h (F). E, Intracellular superoxide production was analyzed by flow cytometric analysis. F, ELISA analysis for TNF-α and IL-6 levels. Data are presented as the mean±SD of three experiments. **p<0.01, ***p<0.001, vs. SC (A, C, E, and F); mock control (B and D). UI, uninfected; SC, solvent control (0.1% DMSO)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Crystal", "structure", "of", "a", "dynamin", "monomer", "(", "PDB", "ID", ":", "3SNH", ")", "and", "corresponding", "color", "-", "coded", "linear", "domain", "architecture", "of", "dynamin", ".", "The", "PHD", "is", "shown", "in", "both", "the", "closed", "(", "3SNH", ",", "solution", "structure", ")", "and", "open", "(", "3ZYS", ",", "cryo", "-", "EM", "reconstruction", "of", "membrane", "-", "bound", "dynamin", ")", "states", ".", "The", "approximate", "locations", "of", "terminal", "residues", "flanking", "different", "functional", "domains", "are", "identified", "with", "black", "arrowheads", ".", "The", "positions", "of", "the", "L1SP", "and", "L2SP", "loops", "are", "identified", "by", "red", "arrowheads", ".", "Changes", "in", "HDX", "behavior", "for", "dynamin", "analyzed", "(", "B", ")", "in", "solution", "the", "presence", "GMPPCP", ",", "(", "C", ")", "in", "solution", "in", "the", "presence", "of", "GDP", "•", "AlF4", "-", ",", "(", "D", ")", "membrane", "-", "bound", ",", "or", "(", "E", ")", "membrane", "-", "bound", "in", "the", "presence", "of", "GMPPCP", "and", "mapped", "onto", "the", "structures", "of", "dynamin", "monomers", ".", "Color", "coding", "(", "see", "scale", "below", ")", "shows", "the", "extent", "of", "solvent", "exchange", "relative", "to", "apo", "dynamin", "in", "solution", ".", "All", "HDX", "MS", "data", "shown", "represents", "an", "average", "of", "3", "replicates", "and", "are", "color", "coded", "from", "red", "to", "blue", "with", "warm", "colors", "representing", "increased", "conformational", "dynamics", "(", "red", "being", "the", "highest", "D2O", "uptake", ")", "and", "cool", "colors", "representing", "decreased", "conformational", "dynamics", "(", "blue", "being", "the", "lowest", "D2O", "uptake", ")", ".", "Grey", "indicates", "no", "statistically", "significant", "change", "between", "the", "two", "states", ".", "Quantitative", "data", "on", "the", "individual", "peptides", "used", "to", "generate", "this", "map", "are", "provided", "in", "Appendix", "(", "Figure", "S1", "-", "S4", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Crystal structure of a dynamin monomer (PDB ID: 3SNH) and corresponding color-coded linear domain architecture of dynamin. The PHD is shown in both the closed (3SNH, solution structure) and open (3ZYS, cryo-EM reconstruction of membrane-bound dynamin) states. The approximate locations of terminal residues flanking different functional domains are identified with black arrowheads. The positions of the L1SP and L2SP loops are identified by red arrowheads.Changes in HDX behavior for dynamin analyzed (B) in solution the presence GMPPCP, (C) in solution in the presence of GDP•AlF4-, (D) membrane-bound, or (E) membrane-bound in the presence of GMPPCP and mapped onto the structures of dynamin monomers. Color coding (see scale below) shows the extent of solvent exchange relative to apo dynamin in solution. All HDX MS data shown represents an average of 3 replicates and are color coded from red to blue with warm colors representing increased conformational dynamics (red being the highest D2O uptake) and cool colors representing decreased conformational dynamics (blue being the lowest D2O uptake). Grey indicates no statistically significant change between the two states. Quantitative data on the individual peptides used to generate this map are provided in Appendix (Figure S1-S4)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Changes", "in", "solvent", "exchange", "superimposed", "onto", "the", "structure", "(", "PDB", "ID", ":", "2SNH", ")", "of", "the", "G", "domain", "or", "(", "B", ")", "the", "stalk", "/", "PHD", "of", "dynamin", "in", "the", "GMPPCP", "or", "lipid", "bound", "states", ",", "respectively", ".", "Key", "structural", "elements", "are", "identified", "and", "the", "color", "-", "coding", "shows", "the", "magnitude", "of", "solvent", "exchange", "relative", "to", "the", "apo", "state", "(", "see", "scale", "below", ")", ".", "(", "C", ")", "Differential", "kinetics", "of", "solvent", "exchange", "of", "selected", "peptides", "that", "were", "identified", "as", "altered", "in", "both", "GMPPCP", "and", "GDP", "•", "AlF4", "-", "-", "bound", "states", ".", "The", "peptides", "are", "mapped", "to", "secondary", "structure", "elements", "on", "the", "polypeptide", "sequence", ".", "Differences", "in", "kinetics", "of", "solvent", "exchange", "of", "select", "peptides", "measured", "(", "D", ")", "for", "dynamin", "bound", "to", "GMPPCP", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "lipid", "nanotubes", "(", "E", ")", "for", "dynamin", "bound", "to", "lipid", "nanotubes", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "GMPPCP", ".", "HDX", "data", "are", "presented", "as", "an", "average", "of", "three", "independent", "triplicates", "and", "color", "coded", "as", "in", "Figure", "1", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Changes in solvent exchange superimposed onto the structure (PDB ID: 2SNH) of the G domain or (B) the stalk/PHD of dynamin in the GMPPCP or lipid bound states, respectively. Key structural elements are identified and the color-coding shows the magnitude of solvent exchange relative to the apo state (see scale below).(C) Differential kinetics of solvent exchange of selected peptides that were identified as altered in both GMPPCP and GDP•AlF4--bound states. The peptides are mapped to secondary structure elements on the polypeptide sequence. Differences in kinetics of solvent exchange of select peptides measured (D) for dynamin bound to GMPPCP in the presence or absence of lipid nanotubes (E) for dynamin bound to lipid nanotubes in the presence or absence of GMPPCP. HDX data are presented as an average of three independent triplicates and color coded as in Figure 1."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Design", "of", "a", "functional", "dynamin", "mutant", "to", "probe", "PHD", "stalk", "interactions", ".", "Minimal", "structure", "of", "the", "PHD", "and", "the", "PHD", "-", "Stalk", "interface", "showing", "the", "location", "of", "important", "residues", "discussed", "in", "this", "study", ".", "The", "unresolved", "loop", "L1NS", "in", "the", "stalk", "hosts", "the", "IAEDANS", "label", "and", "is", "sensitive", "to", "the", "two", "tryptophans", "(", "W525", "and", "W542", ")", "in", "the", "PHD", ".", "The", "distance", "between", "two", "introduced", "cysteines", "(", "S357C", "and", "native", "C602", ")", "used", "to", "construct", "a", "double", "cysteine", "Dyn1", "is", "also", "shown", ".", "(", "B", ")", "Comparison", "of", "emission", "spectra", "of", "various", "IAEDANS", "-", "labeled", "Dyn1", "RCL", "variants", "(", "D352C", ",", "Y354C", ",", "S357C", ",", "I365C", ",", "H367C", ")", ",", "upon", "Trp", "excitation", "at", "295", "nm", ".", "(", "C", ")", "FRET", "transfer", "upon", "excitation", "is", "contributed", "by", "two", "neighboring", "Trps", "(", "W525", "and", "W542", ")", ";", "Substitution", "by", "Phe", "resulted", "in", "significant", "loss", "of", "FRET", ".", "(", "D", ")", "IAEDANS", "emission", "kinetics", "upon", "addition", "of", "lipid", "nanotubes", "with", "or", "without", "PI4", ",", "5P2", "(", "ex", "=", "295", ")", ".", "The", "arrow", "indicates", "addition", "of", "lipids", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Design of a functional dynamin mutant to probe PHD stalk interactions. Minimal structure of the PHD and the PHD-Stalk interface showing the location of important residues discussed in this study. The unresolved loop L1NS in the stalk hosts the IAEDANS label and is sensitive to the two tryptophans (W525 and W542) in the PHD. The distance between two introduced cysteines (S357C and native C602) used to construct a double cysteine Dyn1 is also shown.(B) Comparison of emission spectra of various IAEDANS-labeled Dyn1 RCL variants (D352C, Y354C, S357C, I365C, H367C), upon Trp excitation at 295 nm.(C) FRET transfer upon excitation is contributed by two neighboring Trps (W525 and W542); Substitution by Phe resulted in significant loss of FRET.(D) IAEDANS emission kinetics upon addition of lipid nanotubes with or without PI4,5P2 (ex=295). The arrow indicates addition of lipids."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Histogram", "shows", "basal", "and", "assembly", "-", "stimulated", "GTPase", "activities", "of", "non", "-", "crosslinked", "Dyn1CC", "vs", "crosslinked", "Dyn1Closed", "and", "Dyn1WT", ".", "Inset", "shows", "crosslinking", "of", "the", "PHD", "and", "stalk", "domains", "in", "Dyn1Y354C", "/", "S607C", "(", "Dyn1CC", ")", "with", "the", "bifunctional", "crosslinker", ",", "MTS", "-", "2", "-", "MTS", ",", "to", "yield", "Dyn1Closed", ",", "which", "migrates", "more", "slowly", "on", "SDS", "-", "PAGE", ",", "as", "well", "as", "liposome", "binding", "of", "Dyn1CC", "compared", "to", "Dyn1Closed", "(", "Bound", ",", "B", ";", "Unbound", ",", "UB", ")", ".", "(", "C", ")", "Ability", "of", "Dyn1WT", ",", "Dyn1CC", "and", "Dyn1Closed", "to", "catalyze", "membrane", "fission", "and", "vesicle", "release", "from", "SUPER", "templates", ".", "(", "D", ")", "Size", "exclusion", "chromatographic", "profiles", "of", "Dyn1CC", ",", "Dyn1Closed", "at", "room", "temperature", "or", "after", "incubation", "for", "10", "min", "at", "37", "°", "C", ".", "(", "E", ")", "Oligomeric", "state", "of", "Dyn1ΔΔ", "at", "room", "temperature", ".", "(", "F", ")", "Negative", "-", "stain", "electron", "micrographs", "of", "Dyn1WT", ",", "Dyn1ΔΔ", "and", "Dyn1Closed", "assembled", "onto", "lipid", "nanotubes", ".", "Scale", "bar", "=", "200", "nm", "(", "G", ")", "Curvature", "dependent", "liposome", "-", "stimulated", "GTPase", "activity", "of", "Dyn1WT", "and", "Dyn1ΔΔ", ".", "(", "H", ")", "Ability", "of", "Dyn1WT", "and", "Dyn1ΔΔ", "to", "catalyze", "membrane", "fission", "and", "vesicle", "release", "from", "SUPER", "templates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Histogram shows basal and assembly-stimulated GTPase activities of non-crosslinked Dyn1CC vs crosslinked Dyn1Closed and Dyn1WT. Inset shows crosslinking of the PHD and stalk domains in Dyn1Y354C/S607C (Dyn1CC) with the bifunctional crosslinker, MTS-2-MTS, to yield Dyn1Closed, which migrates more slowly on SDS-PAGE, as well as liposome binding of Dyn1CC compared to Dyn1Closed (Bound, B; Unbound, UB).(C) Ability of Dyn1WT, Dyn1CC and Dyn1Closed to catalyze membrane fission and vesicle release from SUPER templates.(D) Size exclusion chromatographic profiles of Dyn1CC, Dyn1Closed at room temperature or after incubation for 10 min at 37°C.(E) Oligomeric state of Dyn1ΔΔ at room temperature.(F) Negative-stain electron micrographs of Dyn1WT, Dyn1ΔΔ and Dyn1Closed assembled onto lipid nanotubes. Scale bar = 200 nm(G) Curvature dependent liposome-stimulated GTPase activity of Dyn1WT and Dyn1ΔΔ.(H) Ability of Dyn1WT and Dyn1ΔΔ to catalyze membrane fission and vesicle release from SUPER templates."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Temperature", "dependence", "of", "basal", "and", "lipid", "stimulated", "GTPase", "activity", "of", "Dyn1WT", "and", "Dyn2S619L", ".", "(", "B", ")", "Temperature", "sensitive", "membrane", "fission", "activity", "of", "Dyn1WT", ",", "Dyn2WT", "and", "Dyn2S619L", "measured", "using", "SUPER", "templates", ".", "(", "C", ")", "Detection", "of", "Dyn2", "PHD", "-", "stalk", "interactions", "by", "FRET", "using", "IAEDANS", "-", "labeled", "Dyn2L354C", ".", "(", "D", ")", "Curvature", "dependent", "membrane", "binding", "and", "consequent", "opening", "of", "PHD", "in", "Dyn1Y354C", "-", "IAEDANS", "and", "Dyn2L354C", "-", "IAEDANS", ".", "(", "E", ")", "Differential", "temperature", "dependence", "of", "PHD", "-", "stalk", "FRET", "for", "WT", "and", "S619L", "mutant", "Dyn2IAEDANS", ".", "Data", "are", "presented", "as", "relative", "FRET", "distances", "assuming", "a", "single", "donor", "/", "acceptor", "pair", ".", "(", "F", ")", "Differential", "solvent", "exchange", "kinetics", "of", "Dyn1S619L", "at", "ambient", "temperature", "compared", "to", "Dyn1WT", "under", "identical", "conditions", ".", "Yellow", "coloring", "indicates", "a", "significant", "increase", "in", "HDX", ".", "Quantitative", "data", "on", "the", "individual", "peptides", "used", "to", "generate", "this", "map", "are", "provided", "in", "(", "Appendix", "Fig", ".", "S5", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Temperature dependence of basal and lipid stimulated GTPase activity of Dyn1WT and Dyn2S619L.(B) Temperature sensitive membrane fission activity of Dyn1WT, Dyn2WT and Dyn2S619L measured using SUPER templates.(C) Detection of Dyn2 PHD-stalk interactions by FRET using IAEDANS-labeled Dyn2L354C.(D) Curvature dependent membrane binding and consequent opening of PHD in Dyn1Y354C-IAEDANS and Dyn2L354C-IAEDANS.(E) Differential temperature dependence of PHD-stalk FRET for WT and S619L mutant Dyn2IAEDANS. Data are presented as relative FRET distances assuming a single donor/acceptor pair.(F) Differential solvent exchange kinetics of Dyn1S619L at ambient temperature compared to Dyn1WT under identical conditions. Yellow coloring indicates a significant increase in HDX. Quantitative data on the individual peptides used to generate this map are provided in (Appendix Fig. S5)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "Transferrin", "receptor", "(", "TfnR", ")", "uptake", ",", "a", "measure", "of", "CME", ",", "shown", "as", "%", "uptake", "of", "total", "steady", "-", "state", "surface", "TfnR", "for", "control", "H1299", "cells", ",", "and", "H1299", "cells", "stabily", "expressing", "low", "amounts", "of", "siRNA", "-", "resistant", "Dyn2WT", "-", "EGFP", "(", "A", ")", "or", "Dyn2S619L", "-", "EGFP", "(", "B", ")", "with", "or", "without", "treatment", "of", "siRNA", "-", "directed", "towards", "endogenous", "Dyn2", ".", "(", "C", ")", "Fixed", "cell", "TIRF", "-", "M", "images", "of", "Dyn2WT", "-", "EGFP", "or", "Dyn2S619L", "-", "EGFP", "expressing", "H1299", "cells", "with", "or", "without", "Dyn2", "-", "siRNA", "treatment", "showing", "co", "-", "localization", "with", "clathrin", "light", "chain", "immunostained", "rabbit", "anti", "-", "CLC", "and", "Alexa", "547", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "(", "D", ")", "Percentage", "of", "Dyn2", "-", "EGFP", "positive", "clathrin", "coated", "pits", "detected", "by", "live", "cell", "TIRF", "-", "M", "and", "automated", "master", "/", "slave", "image", "analysis", "(", "Aguet", "et", "al", ",", "2013", ")", ".", "(", "E", ")", "Lifetime", "analysis", "of", "CCPs", "which", "are", "positive", "for", "EGFP", "-", "Dyn2WT", "or", "EGFP", "-", "Dyn2S619L", "with", "or", "without", "siRNA", "-", "mediated", "specific", "knockdown", "of", "endogenous", "Dyn2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A,B) Transferrin receptor (TfnR) uptake, a measure of CME, shown as % uptake of total steady-state surface TfnR for control H1299 cells, and H1299 cells stabily expressing low amounts of siRNA-resistant Dyn2WT-EGFP (A) or Dyn2S619L-EGFP (B) with or without treatment of siRNA-directed towards endogenous Dyn2.(C) Fixed cell TIRF-M images of Dyn2WT-EGFP or Dyn2S619L-EGFP expressing H1299 cells with or without Dyn2-siRNA treatment showing co-localization with clathrin light chain immunostained rabbit anti-CLC and Alexa 547-conjugated secondary antibodies.(D) Percentage of Dyn2-EGFP positive clathrin coated pits detected by live cell TIRF-M and automated master/slave image analysis (Aguet et al, 2013).(E) Lifetime analysis of CCPs which are positive for EGFP-Dyn2WT or EGFP-Dyn2S619L with or without siRNA-mediated specific knockdown of endogenous Dyn2."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Colocalization", "of", "LacCer", "and", "LysoTracker", "(", "LyTr", ")", "in", "different", "CTR", "and", "LSD", "patient", "fibroblasts", ".", "Mander", "´", "s", "coefficients", "were", "calculated", "using", "the", "Fiji", "JACoP", "plugin", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "(", "A", ",", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Confocal", "images", "(", "B", ")", "and", "statistical", "analysis", "(", "C", ")", "showing", "colocalization", "of", "LacCer", "and", "LyTr", "in", "human", "CTR", "and", "MLIV", "fibroblasts", ",", "treated", "with", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "16h", ")", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Confocal", "images", "(", "D", ")", "and", "statistical", "analysis", "(", "E", ")", "showing", "colocalization", "of", "LacCer", "and", "LyTr", "in", "human", "CTR", "and", "NPC1", "fibroblasts", ",", "treated", "with", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "C", ",", "E", ",", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "Confocal", "images", "and", "statistical", "analysis", "showing", "LacCer", "/", "LyTr", "colocalization", "in", "MLIV", "patient", "fibroblasts", "which", "were", "mock", "-", "electroporated", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "electroporated", "with", "a", "gain", "-", "of", "-", "function", "hTPC2", "(", "M484L", "/", "G734E", ")", ":", "mCherry", "TOPO", "3", ".", "1", "vector", "and", "treated", "with", "either", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "16h", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "G", ",", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "H", "-", "I", ")", "Ca2", "+", "chelation", "(", "BAPTA", "-", "AM", ")", "dose", "-", "dependently", "impairs", "LacCer", "trafficking", "in", "CTR", "fibroblasts", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "I", ")", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "J", "-", "K", ")", "Confocal", "images", "(", "J", ")", "and", "statistical", "analysis", "(", "K", ")", "of", "NPC1", "patient", "fibroblasts", "treated", "with", "50", "nM", "mock", "siRNA", "(", "siSCR", ")", "or", "siRNA", "targeting", "TPCN2", "(", "siTPC2", ")", "for", "72", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "(", "K", ")", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Colocalization of LacCer and LysoTracker (LyTr) in different CTR and LSD patient fibroblasts. Mander´s coefficients were calculated using the Fiji JACoP plugin. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's (A, multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(B-C) Confocal images (B) and statistical analysis (C) showing colocalization of LacCer and LyTr in human CTR and MLIV fibroblasts, treated with TPC2-A1-P (30 µM, 16h). (D-E) Confocal images (D) and statistical analysis (E) showing colocalization of LacCer and LyTr in human CTR and NPC1 fibroblasts, treated with TPC2-A1-P (30 µM, 48h). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's C, E, multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(F-G) Confocal images and statistical analysis showing LacCer/LyTr colocalization in MLIV patient fibroblasts which were mock-electroporated and treated with DMSO or electroporated with a gain-of-function hTPC2(M484L/G734E):mCherry TOPO 3.1 vector and treated with either DMSO or TPC2-A1-P (30 µM, 16h). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's G, multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(H-I) Ca2+ chelation (BAPTA-AM) dose-dependently impairs LacCer trafficking in CTR fibroblasts. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's I) multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(J-K) Confocal images (J) and statistical analysis (K) of NPC1 patient fibroblasts treated with 50 nM mock siRNA (siSCR) or siRNA targeting TPCN2 (siTPC2) for 72 hours. Cells were then treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, Tukey's (K) multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "B", ")", "Confocal", "images", "(", "A", ")", "and", "statistical", "analysis", "(", "B", ")", "of", "cholesterol", "accumulation", "in", "human", "CTR", ",", "MLIV", ",", "JNCL", ",", "and", "NPC1", "fibroblasts", ".", "Cholesterol", "accumulation", "was", "evident", "for", "NPC1", "and", "MLIV", "fibroblasts", ",", "but", "not", "for", "JNCL", "fibroblasts", ".", "The", "images", "show", "filipin", "staining", "to", "visualize", "cholesterol", "accumulation", "and", "TO", "-", "PRO3", "as", "nuclear", "staining", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "B", ",", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", "rescued", "NPC1", "and", "MLIV", "cholesterol", "accumulation", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "D", ",", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Confocal", "images", "(", "E", "-", "F", ")", "of", "MLIV", "patient", "fibroblasts", "mock", "-", "electroporated", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "electroporated", "with", "a", "gain", "-", "of", "-", "function", "hTPC2", "(", "M484L", "/", "G734E", ")", ":", "mCherry", "TOPO", "3", ".", "1", "vector", "(", "white", "arrow", "heads", ")", "and", "treated", "with", "either", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", ".", "statistical", "analysis", "(", "G", ")", "of", "MLIV", "patient", "fibroblasts", "mock", "-", "electroporated", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "electroporated", "with", "a", "gain", "-", "of", "-", "function", "hTPC2", "(", "M484L", "/", "G734E", ")", ":", "mCherry", "TOPO", "3", ".", "1", "vector", "(", "white", "arrow", "heads", ")", "and", "treated", "with", "either", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Confocal", "images", "and", "statistical", "analysis", "of", "human", "CTR", "patient", "fibroblasts", "treated", "with", "50", "nM", "mock", "siRNA", "(", "siSCR", ")", "or", "siRNA", "targeting", "TPCN2", "(", "siTPC2", ")", "for", "72", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "DMSO", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Confocal", "images", "and", "statistical", "analysis", "of", "human", "NPC1", "patient", "fibroblasts", "treated", "with", "50", "nM", "mock", "siRNA", "(", "siSCR", ")", "or", "siRNA", "targeting", "TPCN2", "(", "siTPC2", ")", "for", "72", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "K", ")", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Statistics", "(", "L", ")", "of", "human", "CTR", ",", "MLIV", ",", "JNCL", ",", "and", "NPC1", "fibroblasts", ".", "Effect", "of", "the", "treatment", "with", "TPC2", "agonist", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", "was", "examined", "in", "NPC1", "and", "MLIV", "cells", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "L", ")", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "electron", "microscopy", "images", "(", "M", ")", "of", "human", "CTR", ",", "MLIV", ",", "JNCL", ",", "and", "NPC1", "fibroblasts", ".", "Effect", "of", "the", "treatment", "with", "TPC2", "agonist", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", "was", "examined", "in", "NPC1", "and", "MLIV", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-B) Confocal images (A) and statistical analysis (B) of cholesterol accumulation in human CTR, MLIV, JNCL, and NPC1 fibroblasts. Cholesterol accumulation was evident for NPC1 and MLIV fibroblasts, but not for JNCL fibroblasts. The images show filipin staining to visualize cholesterol accumulation and TO-PRO3 as nuclear staining. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test (B, *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(C-D) TPC2-A1-P (30 µM, 48h) rescued NPC1 and MLIV cholesterol accumulation. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test D, *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Confocal images (E-F) of MLIV patient fibroblasts mock-electroporated and treated with DMSO or electroporated with a gain-of-function hTPC2(M484L/G734E):mCherry TOPO 3.1 vector (white arrow heads) and treated with either DMSO or TPC2-A1-P (30 µM, 48h).statistical analysis (G) of MLIV patient fibroblasts mock-electroporated and treated with DMSO or electroporated with a gain-of-function hTPC2(M484L/G734E):mCherry TOPO 3.1 vector (white arrow heads) and treated with either DMSO or TPC2-A1-P (30 µM, 48h). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Confocal images and statistical analysis of human CTR patient fibroblasts treated with 50 nM mock siRNA (siSCR) or siRNA targeting TPCN2 (siTPC2) for 72 hours. Cells were then treated with DMSO Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells) two-tailed Student's t-test *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Confocal images and statistical analysis of human NPC1 patient fibroblasts treated with 50 nM mock siRNA (siSCR) or siRNA targeting TPCN2 (siTPC2) for 72 hours. Cells were then treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); two-tailed Student's t-test K). *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Statistics (L) of human CTR, MLIV, JNCL, and NPC1 fibroblasts. Effect of the treatment with TPC2 agonist (30 µM, 48h) was examined in NPC1 and MLIV cells. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test , L) *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.electron microscopy images (M) of human CTR, MLIV, JNCL, and NPC1 fibroblasts. Effect of the treatment with TPC2 agonist (30 µM, 48h) was examined in NPC1 and MLIV cells."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "of", "CTR", "and", "JNCL", "fibroblasts", ".", "Images", "show", "LAMP1", "staining", "and", "autofluorescence", "at", "405", "and", "488", "nm", "excitation", "wavelength", ",", "respectively", ",", "corresponding", "to", "the", "lipofuscin", "autofluorescence", "spectrum", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "following", "cell", "cycle", "arrest", "(", "2h", "mitomycin", "C", "treatment", ")", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "images", "showing", "no", "autofluorescence", "signal", "at", "594", "nm", "excitation", "wavelength", "(", "used", "for", "LAMP1", "staining", ")", ".", "(", "C", ")", "Mean", "autofluorescence", "intensity", "in", "LAMP1", "+", "area", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Mean", "intensity", "of", "shigatoxin", "(", "STX", ")", "in", "CTR", "and", "JNCL", "fibroblasts", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "after", "cell", "cycle", "arrest", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Confocal", "images", "of", "Gb3", "accumulation", "stained", "with", "shigatoxin", "(", "STX", ")", "in", "CTR", "and", "JNCL", "fibroblasts", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "after", "cell", "cycle", "arrest", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Confocal images of CTR and JNCL fibroblasts. Images show LAMP1 staining and autofluorescence at 405 and 488 nm excitation wavelength, respectively, corresponding to the lipofuscin autofluorescence spectrum. Cells were treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM) following cell cycle arrest (2h mitomycin C treatment). (B) Confocal images showing no autofluorescence signal at 594 nm excitation wavelength (used for LAMP1 staining).(C) Mean autofluorescence intensity in LAMP1+ area. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells; one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test. **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Mean intensity of shigatoxin (STX) in CTR and JNCL fibroblasts. Cells were treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM) after cell cycle arrest. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells; one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test. **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Confocal images of Gb3 accumulation stained with shigatoxin (STX) in CTR and JNCL fibroblasts. Cells were treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM) after cell cycle arrest."}
{"words": ["Figure", "5Cortical", "neurons", "were", "differentiated", "from", "iPSCs", ",", "generating", "lysosomal", "storage", "disease", "neurons", "and", "isogenic", "controls", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "cathepsin", "B", "(", "CtsB", ")", "in", "CTR", "and", "MCOLN1IVS3", "-", "2A", ">", "G", "neurons", "treated", "with", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "or", "DMSO", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ",", "obtained", "from", "at", "least", "three", "distinct", "neuronal", "differentiations", ")", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "C", ")", ".", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Cortical", "neurons", "were", "differentiated", "from", "iPSCs", ",", "generating", "lysosomal", "storage", "disease", "neurons", "and", "isogenic", "controls", ".", "Cortical", "neurons", "were", "treated", "with", "compounds", "and", "acidic", "compartments", "stained", "with", "LysoTracker", "(", "LyTr", ")", ".", "Endolysosomal", "expansion", "was", "observed", "in", "MCOLN1IVS3", "-", "2A", ">", "G", ",", "CLN3D416G", "and", "CLN3ΔEx4", "-", "7", "neurons", ",", "which", "was", "ameliorated", "by", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "treatment", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ",", "obtained", "from", "at", "least", "three", "distinct", "neuronal", "differentiations", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Cortical", "neurons", "were", "differentiated", "from", "iPSCs", ",", "generating", "lysosomal", "storage", "disease", "neurons", "and", "isogenic", "controls", ".", "(", "H", "-", "I", ")", "Electron", "microscopy", "analysis", "of", "neuronal", "rosettes", "(", "neuronal", "progenitor", "cells", ",", "NPC", ")", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", ".", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "treatment", "significantly", "decreased", "the", "number", "of", "inclusion", "bodies", "(", "black", "arrow", "heads", ")", "in", "MCOLN1IVS3", "-", "2A", ">", "G", ".", "CLN3D416G", "and", "CLN3ΔEx4", "-", "7", "lacked", "an", "appropriate", "assay", "window", "and", "showed", "no", "significant", "accumulation", "of", "inclusion", "bodies", ".", "However", ",", "CLN3ΔEx4", "-", "7", "NPC", "showed", "significantly", "more", "mitochondria", "with", "aberrant", "cristae", "numbers", "(", "white", "arrow", "heads", ")", ",", "a", "phenotype", "which", "was", "rescued", "by", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "treatment", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ",", "obtained", "from", "at", "least", "three", "distinct", "neuronal", "differentiations", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Cortical neurons were differentiated from iPSCs, generating lysosomal storage disease neurons and isogenic controls. (C-D) Western blot analysis of cathepsin B (CtsB) in CTR and MCOLN1IVS3-2A>G neurons treated with TPC2-A1-P (30 µM) or DMSO. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells, obtained from at least three distinct neuronal differentiations); two-tailed Student's t-test (C). **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Cortical neurons were differentiated from iPSCs, generating lysosomal storage disease neurons and isogenic controls. Cortical neurons were treated with compounds and acidic compartments stained with LysoTracker (LyTr). Endolysosomal expansion was observed in MCOLN1IVS3-2A>G, CLN3D416G and CLN3ΔEx4-7 neurons, which was ameliorated by TPC2-A1-P (30 µM) treatment. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells, obtained from at least three distinct neuronal differentiations); one-way ANOVA, post hoc Tukey's multiple comparisons test **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Cortical neurons were differentiated from iPSCs, generating lysosomal storage disease neurons and isogenic controls. (H-I) Electron microscopy analysis of neuronal rosettes (neuronal progenitor cells, NPC) treated with DMSO or TPC2-A1-P. TPC2-A1-P treatment significantly decreased the number of inclusion bodies (black arrow heads) in MCOLN1IVS3-2A>G. CLN3D416G and CLN3ΔEx4-7 lacked an appropriate assay window and showed no significant accumulation of inclusion bodies. However, CLN3ΔEx4-7 NPC showed significantly more mitochondria with aberrant cristae numbers (white arrow heads), a phenotype which was rescued by TPC2-A1-P (30 µM) treatment. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells, obtained from at least three distinct neuronal differentiations); one-way ANOVA, post hoc Tukey's multiple comparisons test **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "of", "plasma", "membrane", "(", "PM", ")", "LAMP1", "immunofluorescence", "in", "CTR", "fibroblasts", ".", "LAMP1", "on", "the", "PM", "is", "expressed", "as", "fold", "-", "change", "relative", "to", "DMSO", "-", "treated", "cells", ".", "(", "B", ")", "Statistical", "analysis", "of", "lysosomal", "exocytosis", "data", "as", "shown", "in", "A", ".", "(", "C", ")", "Lysosomal", "exocytosis", "in", "CTR", ",", "MLIV", ",", "NPC1", "and", "JNCL", "human", "fibroblasts", ".", "PM", "-", "localized", "LAMP1", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", ",", "expressed", "as", "%", "of", "CTR", "DMSO", "-", "treated", "cells", ".", "Ionomycin", "in", "A", "-", "C", "(", "4", "µM", ";", "10", "min", "treatment", ")", "was", "used", "as", "positive", "control", ".", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "and", "ML", "-", "SA1", "(", "30", "µM", ",", "each", ";", "90", "min", "treatment", "in", "A", "-", "C", ")", ".", "Statistics", "(", "B", "-", "C", ")", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "for", "each", "tested", "condition", "(", "in", "B", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ",", "in", "C", "each", "dot", "is", "the", "mean", "FITC", "intensity", "value", "expressed", "as", "percentage", "obtained", "from", "at", "least", "1", "*", "104", "events", ")", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "(", "B", ")", "or", "Tukey", "'", "s", "(", "C", ")", "multiple", "comparisons", "test", ",", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "LC3", "(", "LC3I", "-", "II", ")", "following", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "or", "ML", "-", "SA1", "(", "30", "µM", ",", "each", ")", "treatment", ",", "alone", "or", "with", "BafA1", ",", "under", "fed", "(", "complete", "media", ")", "or", "starvation", "(", "HBSS", ")", "conditions", "in", "CTR", ",", "MLIV", "and", "NPC1", "patientfibroblasts", ".", "analysis", "of", "endogenous", "LC3", "following", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "or", "ML", "-", "SA1", "(", "30", "µM", ",", "each", ")", "treatment", ",", "alone", "or", "with", "BafA1", ",", "under", "fed", "(", "complete", "media", ")", "or", "starvation", "(", "HBSS", ")", "conditions", "in", "CTR", ",", "MLIV", "and", "NPC1", "patientfibroblasts", ".", "Graphs", "show", "densitometry", "of", "LC3II", "bands", "normalized", "to", "actin", ".", "Statistics", "(", "G", ",", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SD", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "lysates", "per", "condition", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "(", "H", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "LC3", "(", "LC3I", "-", "II", ")", "following", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "or", "DMSO", "treatment", ",", "under", "fed", "(", "complete", "Neurobasal", "/", "B27", ")", "or", "starvation", "(", "DMEM", "/", "F12", "free", ")", "conditions", "in", "CTR", "and", "MLIV", "iPSC", "derived", "cortical", "neurons", ".", "Graphs", "show", "densitometry", "of", "LC3II", "bands", "normalized", "to", "actin", ".", "Statistics", "H", ",", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SD", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "lysates", "per", "condition", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "SQSTM1", "(", "P62", ")", "upon", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "or", "ML", "-", "SA1", "(", "30", "µM", ",", "each", ")", "treatment", ",", "under", "fed", "(", "complete", "media", ")", "or", "starvation", "(", "HBSS", ")", "conditions", "in", "CTR", ",", "MLIV", "and", "NPC1", "patient", "fibroblasts", ".", "Statistics", "J", ")", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SD", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "lysates", "per", "condition", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Confocal images of plasma membrane (PM) LAMP1 immunofluorescence in CTR fibroblasts. LAMP1 on the PM is expressed as fold-change relative to DMSO-treated cells. (B) Statistical analysis of lysosomal exocytosis data as shown in A. (C) Lysosomal exocytosis in CTR, MLIV, NPC1 and JNCL human fibroblasts. PM-localized LAMP1 was measured by flow cytometry, expressed as % of CTR DMSO-treated cells. Ionomycin in A-C (4 µM; 10 min treatment) was used as positive control. TPC2-A1-P and ML-SA1 (30 µM, each; 90 min treatment in A-C). Statistics (B-C): Shown are mean values ± SEM. n > 3 for each tested condition (in B each dot represents an imaged frame containing several cells, in C each dot is the mean FITC intensity value expressed as percentage obtained from at least 1*104 events); two-way ANOVA, post hoc Dunnett's (B) or Tukey's (C) multiple comparisons test, *p-value < 0.05; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Immunoblot analysis of endogenous LC3 (LC3I-II) following TPC2-A1-P or ML-SA1 (30 µM, each) treatment, alone or with BafA1, under fed (complete media) or starvation (HBSS) conditions in CTR, MLIV and NPC1 patientfibroblasts.analysis of endogenous LC3 following TPC2-A1-P or ML-SA1 (30 µM, each) treatment, alone or with BafA1, under fed (complete media) or starvation (HBSS) conditions in CTR, MLIV and NPC1 patientfibroblasts. Graphs show densitometry of LC3II bands normalized to actin. Statistics (G, Shown are mean values ± SD. n = 3 lysates per condition pooled from 3 independent experiments; two-tailed Student's t-test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001.(H) Immunoblot analysis of endogenous LC3 (LC3I-II) following TPC2-A1-P (30 µM) or DMSO treatment, under fed (complete Neurobasal/B27) or starvation (DMEM/F12 free) conditions in CTR and MLIV iPSC derived cortical neurons. Graphs show densitometry of LC3II bands normalized to actin. Statistics H, Shown are mean values ± SD. n = 3 lysates per condition pooled from 3 independent experiments; two-tailed Student's t-test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001.Immunoblot analysis of endogenous SQSTM1 (P62) upon TPC2-A1-P or ML-SA1 (30 µM, each) treatment, under fed (complete media) or starvation (HBSS) conditions in CTR, MLIV and NPC1 patient fibroblasts. Statistics J): Shown are mean values ± SD. n = 3 lysates per condition pooled from 3 independent experiments; two-tailed Student's t-test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "D", ")", "A", "cDNA", "array", "was", "used", "to", "map", "TPC2", "transcripts", "in", "the", "human", "brain", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(D) A cDNA array was used to map TPC2 transcripts in the human brain."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "was", "injected", "intravenously", ",", "and", "mice", "sacrificed", "at", "the", "indicated", "time", ".", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "was", "measured", "in", "plasma", "and", "brain", "by", "LC", "-", "MS", "/", "MS", ".", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "was", "rapidly", "eliminated", ",", "being", "undetectable", "by", "240", "min", ".", "(", "B", ")", "Elimination", "rate", "constants", "were", "determined", "using", "a", "semi", "-", "log", "plot", ".", "A", "two", "-", "phase", "decay", "model", "could", "fit", "the", "obtained", "data", "points", "in", "plasma", ",", "while", "a", "one", "-", "phase", "decay", "model", "fit", "the", "data", "in", "brain", ".", "(", "C", ")", "Brain", "[", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "]", "was", "simulated", "for", "various", "injected", "doses", ".", "20", "mg", "/", "kg", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "was", "chosen", "to", "avoid", "off", "-", "target", "activity", "while", "providing", "a", "therapeutic", "dose", "for", ">", "20", "min", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) TPC2-A1-P was injected intravenously, and mice sacrificed at the indicated time. TPC2-A1-P was measured in plasma and brain by LC-MS/MS. TPC2-A1-P was rapidly eliminated, being undetectable by 240 min.(B) Elimination rate constants were determined using a semi-log plot. A two-phase decay model could fit the obtained data points in plasma, while a one-phase decay model fit the data in brain.(C) Brain [TPC2-A1-P] was simulated for various injected doses. 20 mg/kg TPC2-A1-P was chosen to avoid off-target activity while providing a therapeutic dose for >20 min."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Left", "column", ",", "an", "active", "summer", "squirrel", ";", "right", "column", ",", "a", "torpid", "squirrel", ".", "B", ".", "The", "morphology", "of", "quadriceps", "is", "unchanged", "by", "hibernation", "as", "seen", "in", "haematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ")", "stained", "sections", "(", "scale", "bar", "90", " ", "µm", ")", ".", "C", ".", "Dystrophin", "staining", "was", "performed", "to", "outline", "the", "sarcolemma", "to", "determine", "percentage", "distribution", "of", "minimum", "Feret", "'", "s", "diameter", ".", "D", ".", "Average", " ", "±", " ", "SD", "of", "minimum", "Feret", "'", "s", "diameter", "in", "quadriceps", "(", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "26", ")", "and", "tibialis", "anterior", "(", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "33", ")", "muscles", "is", "not", "significantly", "different", "between", "summer", "and", "hibernation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Left column, an active summer squirrel; right column, a torpid squirrel.B. The morphology of quadriceps is unchanged by hibernation as seen in haematoxylin and eosin (H&amp;amp;E) stained sections (scale bar 90 µm).C. Dystrophin staining was performed to outline the sarcolemma to determine percentage distribution of minimum Feret's diameter.D. Average ± SD of minimum Feret's diameter in quadriceps (p = 0.26) and tibialis anterior (p = 0.33) muscles is not significantly different between summer and hibernation."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Western", "blot", "of", "quadriceps", "muscle", "from", "summer", "active", "(", "S", ")", "and", "hibernating", "(", "H", ")", "squirrels", "using", "antibodies", "against", "the", "proteins", "indicated", ".", "An", "increased", "abundance", "of", "P", "−", "Foxo3a", "(", "serine", "−", "253", ")", "is", "accompanied", "by", "a", "decrease", "in", "P", "−", "Akt", "(", "serine", "−", "478", ")", ".", "Corresponding", "densitometry", "of", "P", "−", "Akt", "and", "P", "−", "Foxo3a", "as", "a", "function", "of", "total", "Akt", "and", "Foxo3a", ".", "B", ".", "Relative", "mRNA", "levels", "for", "four", "Foxo3a", "downstream", "targets", "show", "no", "significant", "changes", "during", "hibernation", ".", "C", ".", "Western", "blots", "analysis", "of", "mTOR", "downstream", "targets", "shows", "significant", "upregulation", "of", "P", "−", "P70", "and", "P", "−", "4E", "−", "BP1", "during", "hibernation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Western blot of quadriceps muscle from summer active (S) and hibernating (H) squirrels using antibodies against the proteins indicated. An increased abundance of P−Foxo3a (serine−253) is accompanied by a decrease in P−Akt (serine−478). Corresponding densitometry of P−Akt and P−Foxo3a as a function of total Akt and Foxo3a.B. Relative mRNA levels for four Foxo3a downstream targets show no significant changes during hibernation.C. Western blots analysis of mTOR downstream targets shows significant upregulation of P−P70 and P−4E−BP1 during hibernation."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Western", "blot", "analyses", "and", "densitometry", "of", "quadriceps", "muscles", "from", "non", "−", "hibernating", "and", "hibernating", "squirrels", "demonstrates", "significant", "increases", "in", "total", "SGK1", "and", "phosphorylated", "SGK1", ".", "Immunostaining", "of", "quadriceps", "muscle", "for", "total", "SGK1", "shows", "upregulation", "during", "hibernation", ".", "B", ".", "Levels", "of", "phosphorylated", "Foxo3a", "in", "S315", "and", "T32", "are", "significantly", "increased", "during", "hibernation", ".", "Densitometric", "analysis", "of", "P", "‐", "Foxo3a", "as", "a", "function", "of", "Foxo3a", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Western blot analyses and densitometry of quadriceps muscles from non−hibernating and hibernating squirrels demonstrates significant increases in total SGK1 and phosphorylated SGK1. Immunostaining of quadriceps muscle for total SGK1 shows upregulation during hibernation.B. Levels of phosphorylated Foxo3a in S315 and T32 are significantly increased during hibernation. Densitometric analysis of P‐Foxo3a as a function of Foxo3a."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "The", "morphology", "of", "tibialis", "anterior", "muscle", "as", "revealed", "by", "haematoxylin", "-", "eosin", "staining", "shows", "increased", "variation", "in", "muscle", "fiber", "size", "with", "numerous", "atrophic", "muscle", "fibers", "(", "scale", "bar", "90", " ", "µm", ")", ".", "B", ".", "Percentage", "distribution", "and", "mean", "minimum", "Feret", "'", "s", "diameter", "in", "tibialis", "anterior", "muscle", "(", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "02", ")", ".", "C", ".", "Increased", "levels", "of", "phosphorylated", "Akt", "(", "S478", ")", "in", "skeletal", "muscles", "of", "sgk1", "−", "/", "−", "mice", ".", "D", ".", "sgk1", "−", "/", "−", "mice", "exhibit", "decreased", "running", "distance", "after", "36", "days", "of", "exposure", "to", "a", "running", "wheel", ",", "(", "p", "=", "0", ".", "01", ";", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ")", ".", "E", ".", "Isometric", "force", "from", "soleus", "muscles", "of", "WT", "and", "sgk1", "-", "/", "-", "mice", "during", "repetitive", "electrical", "stimulations", "for", "500", "ms", ".", "Amplitudes", "of", "isometric", "force", "from", "soleus", "muscles", "at", "two", "stimulation", "frequencies", ".", "Specific", "force", "is", "plotted", "in", "all", "cases", ".", "Mean", "values", "±", "SD", "from", "n", "=", "9", "(", "sgk1", "−", "/", "−", ")", "and", "n", "=", "10", "(", "WT", ")", "independent", "animals", "(", "p", "=", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A.The morphology of tibialis anterior muscle as revealed by haematoxylin-eosin staining shows increased variation in muscle fiber size with numerous atrophic muscle fibers (scale bar 90 µm).B. Percentage distribution and mean minimum Feret's diameter in tibialis anterior muscle (p = 0.02).C. Increased levels of phosphorylated Akt (S478) in skeletal muscles of sgk1−/− mice.D. sgk1−/− mice exhibit decreased running distance after 36 days of exposure to a running wheel, (p = 0.01; n = 6 animals per group).E. Isometric force from soleus muscles of WT and sgk1-/- mice during repetitive electrical stimulations for 500 ms. Amplitudes of isometric force from soleus muscles at two stimulation frequencies. Specific force is plotted in all cases. Mean values ± SD from n = 9 (sgk1−/−) and n = 10 (WT) independent animals (p = 0.01)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "staining", "of", "tibialis", "anterior", "sections", "from", "2", "‐", "month", "old", "control", "and", "transgenic", "mice", "shows", "no", "differences", "(", "scale", "bar", "90", " ", "µm", ")", ".", "B", ".", "Morphometric", "analyses", "of", "minimum", "Feret", "'", "s", "diameter", "of", "TA", "muscle", "reveal", "no", "changes", "in", "fiber", "size", "distribution", "or", "mean", "fiber", "size", ".", "C", ".", "Western", "blots", "and", "densitometric", "analysis", "of", "muscle", "from", "transgenic", "and", "control", "mice", ".", "Downstream", "targets", "of", "the", "mTOR", "signalling", "cascade", "(", "p70S6K", "and", "4EBP1", ")", "demonstrate", "significant", "upregulation", "of", "their", "phosphorylated", "forms", "in", "sgk1tg", "mice", ".", "D", ".", "Western", "blot", "analyses", "and", "densitometry", "of", "phosphorylated", "FOXO3a", "and", "total", "FOXO3a", "of", "tibialis", "anterior", "muscles", "from", "control", "and", "transgenic", "mice", "(", "n", " ", "=", " ", "4", ")", "show", "an", "increase", "of", "phosphorylation", "at", "S315", "and", "T32", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. H&amp;amp;E staining of tibialis anterior sections from 2‐month old control and transgenic mice shows no differences (scale bar 90 µm).B. Morphometric analyses of minimum Feret's diameter of TA muscle reveal no changes in fiber size distribution or mean fiber size.C. Western blots and densitometric analysis of muscle from transgenic and control mice. Downstream targets of the mTOR signalling cascade (p70S6K and 4EBP1) demonstrate significant upregulation of their phosphorylated forms in sgk1tg mice.D. Western blot analyses and densitometry of phosphorylated FOXO3a and total FOXO3a of tibialis anterior muscles from control and transgenic mice (n = 4) show an increase of phosphorylation at S315 and T32."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "staining", "of", "tibialis", "anterior", "sections", "reveals", "no", "changes", "in", "muscle", "architecture", "(", "scale", "bar", "90", " ", "µm", ")", ".", "B", ".", "Morphometric", "analysis", "demonstrates", "a", "decrease", "in", "muscle", "fiber", "size", "of", "the", "wild", "−", "type", "control", "mice", "compared", "with", "sgk1tg", "transgenic", "littermates", "(", "p", "=", "0", ".", "0015", ")", ".", "C", ".", "Western", "blot", "and", "densitometry", "analysis", "shows", "that", "levels", "of", "phosphorylated", "Foxo3a", "at", "S315", "and", "T32", "are", "increased", "in", "sgk1tg", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. H&amp;amp;E staining of tibialis anterior sections reveals no changes in muscle architecture (scale bar 90 µm).B. Morphometric analysis demonstrates a decrease in muscle fiber size of the wild−type control mice compared with sgk1tg transgenic littermates (p = 0.0015).C. Western blot and densitometry analysis shows that levels of phosphorylated Foxo3a at S315 and T32 are increased in sgk1tg."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Transfection", "of", "constitutively", "active", "Sgk1", "(", "CA", ")", "into", "immobilized", "tibialis", "anterior", "muscle", "(", "green", ")", "reveals", "increased", "fiber", "size", "diameter", "when", "compared", "to", "control", ",", "EGFP", "only", "transfected", "muscle", "fibers", "of", "immobilized", "tibialis", "anterior", "muscles", "(", "100", "µm", ")", ".", "Laminin", "γ", "−", "1", "staining", "(", "red", ")", "outlines", "the", "basement", "membrane", "and", "blue", "staining", "marks", "nuclei", "(", "DAPI", ")", ".", "B", ".", "Representation", "of", "the", "minimum", "Feret", "'", "s", "diameter", "average", "±", "SD", "(", "control", "and", "immobilized", ";", "n", "=", "9", "-", "10", "per", "group", ";", "800", "-", "950", "fibers", "were", "measured", ")", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "029", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "034", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "047", ",", "p", "=", "0", ".", "43", ",", "respectively", ")", ".", "C", ".", "Percentage", "distribution", "of", "the", "minimum", "Feret", "'", "s", "diameter", "of", "tibialis", "anterior", "muscle", "immobilized", "and", "transfected", "with", "eGFP", "(", "GFP", ")", ",", "wild", "−", "type", "Sgk1", "(", "WT", ")", ",", "kinase", "dead", "Sgk1", "(", "KD", ")", "and", "constitutively", "active", "Sgk1", "(", "CA", ")", "compared", "to", "non", "−", "immobilized", "control", "TA", "muscle", "(", "black", "dotted", "line", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Transfection of constitutively active Sgk1 (CA) into immobilized tibialis anterior muscle (green) reveals increased fiber size diameter when compared to control, EGFP only transfected muscle fibers of immobilized tibialis anterior muscles (100 µm). Laminin γ−1 staining (red) outlines the basement membrane and blue staining marks nuclei (DAPI).B. Representation of the minimum Feret's diameter average ± SD (control and immobilized; n = 9-10 per group; 800-950 fibers were measured) (*p = 0.029, *p = 0.034, *p = 0.047, p = 0.43, respectively).C. Percentage distribution of the minimum Feret's diameter of tibialis anterior muscle immobilized and transfected with eGFP (GFP), wild−type Sgk1 (WT), kinase dead Sgk1 (KD) and constitutively active Sgk1 (CA) compared to non−immobilized control TA muscle (black dotted line)."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "F", "Immunostaining", "of", "primary", "HL", "with", "H2A", ".", "B", "(", "brown", ",", "indicated", "by", "black", "arrows", ")", "with", "a", "nuclear", "counterstain", "(", "blue", ")", ".", "Human", "testis", "(", "positive", "control", ")", "(", "A", ")", ",", "Human", "tonsils", "(", "negative", "control", ")", "(", "B", ")", ",", "Nodular", "sclerosis", "classical", "cHL", ",", "double", "staining", "with", "CD15", "(", "pink", ")", "to", "identify", "HRS", "cells", "and", "H2A", ".", "B", "(", "brown", ")", "(", "C", ")", ",", "Mixed", "cellularity", "cHL", "(", "D", ")", ",", "Lymphocyte", "rich", "cHL", "(", "E", ")", ",", "Nodular", "sclerosis", "HL", "(", "F", ")", ".", "Scale", "bar", "for", "panels", "A", ",", "B", ",", "D", "-", "F", "is", "50", "µm", ";", "scale", "bar", "for", "panel", "C", "is", "15", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-F Immunostaining of primary HL with H2A.B (brown, indicated by black arrows) with a nuclear counterstain (blue). Human testis (positive control) (A), Human tonsils (negative control) (B), Nodular sclerosis classical cHL, double staining with CD15 (pink) to identify HRS cells and H2A.B (brown) (C), Mixed cellularity cHL (D), Lymphocyte rich cHL (E), Nodular sclerosis HL (F). Scale bar for panels A, B, D-F is 50 µm; scale bar for panel C is 15 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", "Relative", "mRNA", "expression", "levels", "of", "H2A", ".", "B", "in", "L1236", ",", "L428", ",", "HDLM2", "HL", "cell", "lines", "and", "Germinal", "centre", "B", "lymphocytes", "(", "GC", ")", "compared", "to", "the", "Ramos", "B", "lymphocyte", "cell", "line", ".", "The", "results", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Relative mRNA expression levels of H2A.B in L1236, L428, HDLM2 HL cell lines and Germinal centre B lymphocytes (GC) compared to the Ramos B lymphocyte cell line. The results are presented as the mean ± SD of three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "3D", "H2A", ".", "B", "interacts", "with", "Pol", "I", ".", "Western", "blot", "showing", "co", "-", "immunoprecipitation", "of", "RPA194", "with", "H2A", ".", "B", ".", "The", "Pol", "I", "subunit", "RPA194", "was", "immunoprecipitated", "from", "L1236", "(", "left", "panel", ")", "and", "L428", "(", "right", "panel", ")", "nuclear", "extracts", ".", "The", "pull", "-", "down", "by", "RPA194", "antibody", "(", "IP", ")", ",", "pull", "-", "down", "by", "empty", "beads", "or", "IgG", "isotype", "control", ",", "and", "1", "%", "input", "protein", "were", "loaded", "for", "Western", "blot", "detection", "using", "anti", "-", "H2A", ".", "B", "and", "anti", "-", "RPA194", "antibodies", ".", "E", "H2A", ".", "B", "interacts", "with", "RPA194", "in", "live", "cells", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "performed", "to", "detect", "RPA194", "in", "the", "BioID", "samples", "from", "L1236", "cells", "(", "left", "panel", ")", ",", "and", "L428", "cells", "(", "right", "panel", ")", ".", "The", "samples", "were", "prepared", "using", "pull", "-", "down", "with", "streptavidin", "beads", "from", "the", "cell", "lysate", "of", "the", "empty", "vector", ",", "BirA", "*", "-", "H2A", ".", "B", "and", "H2A", ".", "B", "-", "BirA", "*", "transduced", "cells", ",", "which", "were", "preincubated", "with", "50", "µM", "biotin", "for", "24", "h", ".", "The", "positive", "control", "was", "loaded", "as", "1", "%", "input", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D H2A.B interacts with Pol I. Western blot showing co-immunoprecipitation of RPA194 with H2A.B. The Pol I subunit RPA194 was immunoprecipitated from L1236 (left panel) and L428 (right panel) nuclear extracts. The pull-down by RPA194 antibody (IP), pull-down by empty beads or IgG isotype control, and 1% input protein were loaded for Western blot detection using anti-H2A.B and anti-RPA194 antibodies.E H2A.B interacts with RPA194 in live cells. Western blot analysis was performed to detect RPA194 in the BioID samples from L1236 cells (left panel), and L428 cells (right panel). The samples were prepared using pull-down with streptavidin beads from the cell lysate of the empty vector, BirA*-H2A.B and H2A.B-BirA* transduced cells, which were preincubated with 50 µM biotin for 24 h. The positive control was loaded as 1% input."}
{"words": ["Figure", "4B", "Cell", "proliferation", "assay", "in", "the", "presence", "(", "shNTC", ")", "or", "during", "depletion", "of", "H2A", ".", "B", "(", "shH2A", ".", "B", ")", ".", "The", "results", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "for", "five", "biological", "replicates", ".", "The", "significance", "of", "the", "difference", "was", "determined", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "and", "denoted", "as", "ns", "(", "not", "significant", ")", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Cell proliferation assay in the presence (shNTC) or during depletion of H2A.B (shH2A.B). The results are presented as mean ± SD for five biological replicates. The significance of the difference was determined by Student's t test and denoted as ns (not significant); **, p < 0.01; ***, p<0.001."}
{"words": ["Figure", "6E", "Genome", "browser", "screen", "shots", "of", "gene", "examples", "(", "RPs", "RPLP1", "and", "RPL23A", ",", "and", "HDAC5", "and", "TAF10", ")", "that", "contain", "H2A", ".", "B", "at", "their", "promoters", "identified", "by", "the", "CUT", "&", "RUN", "peak", "calling", "and", "whose", "expression", "decreased", "significantly", "following", "H2A", ".", "B", "knockdown", "in", "the", "RNA", "-", "seq", "analysis", ".", "Green", "and", "purple", "indicates", "L1236", "and", "L428cells", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6E Genome browser screen shots of gene examples (RPs RPLP1 and RPL23A, and HDAC5 and TAF10) that contain H2A.B at their promoters identified by the CUT&RUN peak calling and whose expression decreased significantly following H2A.B knockdown in the RNA-seq analysis. Green and purple indicates L1236 and L428cells, respectively."}
{"words": ["Figure", "7B", "Differential", "exon", "usage", "of", "the", "CD44", "gene", ".", "C", ".", "Differential", "exon", "usage", "of", "the", "RPL17", "gene", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B Differential exon usage of the CD44 gene. C. Differential exon usage of the RPL17 gene. "}
{"words": ["Figure", "8D", ",", "E", "Two", "examples", "show", "increased", "accessibility", "at", "the", "promoter", "peak", "(", "NXF1", ")", "(", "D", ")", "and", "decreased", "accessibility", "at", "the", "peak", "across", "the", "intron", "-", "exon", "boundary", "(", "KDM4A", ")", "(", "E", ")", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8D, E Two examples show increased accessibility at the promoter peak (NXF1) (D) and decreased accessibility at the peak across the intron-exon boundary (KDM4A) (E), respectively."}
{"words": ["Figure", "1Module", "-", "trait", "relationships", "were", "established", "by", "WGCNA", "using", "eight", "independent", "microarray", "analyses", "comprising", "375", "human", "prostate", "samples", ".", "Gene", "modules", "(", "y", "axis", ")", "are", "denoted", "by", "an", "arbitrary", "color", "name", ".", "Bins", "show", "the", "Pearson", "correlation", "value", "between", "gene", "expression", "levels", "of", "each", "module", "within", "the", "noted", "phenotype", "/", "disease", "stage", "(", "x", "axis", ")", "and", "p", "values", ".", "A", "value", "of", "1", "(", "red", ")", "quantifies", "the", "strongest", "positive", "correlation", "(", "genes", "are", "upregulated", ")", ",", "-", "1", "(", "blue", ")", "the", "strongest", "negative", "correlation", "(", "genes", "are", "downregulated", ")", ",", "and", "0", "(", "white", ")", "no", "correlation", ".", "Microarray", "analysis", "was", "performed", "following", "doxycycline", "-", "regulated", "specific", "AR", "-", "V7", "depletion", "(", "using", "a", "tet", "-", "plKO", "backbone", ")", "in", "22Rv1", "PC", "cells", "compared", "to", "doxycycline", "-", "treated", "shGFP", "controls", ".", "The", "genes", "that", "were", "significantly", "regulated", "by", "shAR", "-", "V7", "(", "in", "either", "direction", ",", "p", "value", "<", "0", ".", "05", ")", "were", "distributed", "among", "the", "gene", "modules", "defined", "by", "WGCNA", "in", "panel", "A", ".", "Upregulated", "genes", "(", "red", ")", "are", "those", "in", "which", "expression", "decreased", "following", "AR", "-", "V7", "depletion", "and", "conversely", "downregulated", "genes", "(", "blue", ")", "are", "those", "that", "increased", "following", "AR", "-", "V7", "depletion", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Module-trait relationships were established by WGCNA using eight independent microarray analyses comprising 375 human prostate samples. Gene modules (y axis) are denoted by an arbitrary color name. Bins show the Pearson correlation value between gene expression levels of each module within the noted phenotype/disease stage (x axis) and p values. A value of 1 (red) quantifies the strongest positive correlation (genes are upregulated), -1 (blue) the strongest negative correlation (genes are downregulated), and 0 (white) no correlation.Microarray analysis was performed following doxycycline-regulated specific AR-V7 depletion (using a tet-plKO backbone) in 22Rv1 PC cells compared to doxycycline-treated shGFP controls. The genes that were significantly regulated by shAR-V7 (in either direction, p value < 0.05) were distributed among the gene modules defined by WGCNA in panel A. Upregulated genes (red) are those in which expression decreased following AR-V7 depletion and conversely downregulated genes (blue) are those that increased following AR-V7 depletion."}
{"words": ["Figure", "2Hornberg", "et", "al", ".", ",", "2011", "gene", "expression", "profiling", "array", "data", "was", "analyzed", "to", "determine", "the", "expression", "levels", "of", "the", "seven", "genes", "in", "human", "CRPC", "bone", "metastases", ",", "grouped", "by", "their", "relative", "levels", "of", "AR", "-", "VS", ",", "mainly", "AR", "-", "V7", ".", "(", "High", "-", "levels", "of", "AR", "-", "V7", "(", "top", "quartile", ")", "or", "lower", "levels", "of", "AR", "-", "V7", "(", "quartiles", "1", "-", "3", ")", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ".", "Non", "-", "parametric", "Mann", "-", "Whitney", "test", "was", "performed", "(", "two", "-", "tailed", ")", ".", "Note", "that", "BUB1B", "expression", "was", "not", "measured", "in", "these", "microarrays", ".", "*", "*", "Significant", "at", "a", "p", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "N", "(", "AR", "-", "V7", "low", ")", "=", "20", ";", "N", "(", "AR", "-", "V7", "high", ")", "=", "10", ".", "The", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "for", "Disease", "-", "Free", "Survival", "(", "DFS", ")", "and", "overall", "survival", "were", "built", "using", "the", "Prostate", "Adenocarcinoma", "TCGA", "dataset", "(", "465", "samples", ")", "(", "upper", "graphs", ")", ".", "The", "black", "curves", "denote", "cases", "with", "normal", "expression", "of", "the", "gene", "set", ",", "and", "red", "represents", "cases", "where", "the", "mRNA", "levels", "of", "the", "seven", "genes", "were", "upregulated", "(", "z", "-", "score", "threshold", "≤", "1", ".", "96", ")", ".", "For", "DFS", ":", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "0009", ";", "for", "death", ":", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "026", ".", "An", "independent", "dataset", "was", "analyzed", "(", "Prostate", "Adenocarcinoma", "MSKCC", ",", "Cancer", "Cell", "2010", ",", "123", "samples", ")", "(", "lower", "graphs", ")", ".", "The", "black", "curves", "denote", "cases", "with", "normal", "expression", "of", "the", "gene", "set", ",", "and", "red", "represents", "cases", "where", "the", "mRNA", "levels", "of", "at", "least", "five", "genes", "of", "the", "gene", "set", "were", "upregulated", "(", "z", "-", "score", "threshold", "≤", "1", ".", "96", ")", ".", "For", "DFS", ":", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "0007", ";", "for", "death", ":", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "00546", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Hornberg et al., 2011 gene expression profiling array data was analyzed to determine the expression levels of the seven genes in human CRPC bone metastases, grouped by their relative levels of AR-VS, mainly AR-V7. (High-levels of AR-V7 (top quartile) or lower levels of AR-V7 (quartiles 1-3). Data are plotted as the mean ± s.e.m.. Non-parametric Mann-Whitney test was performed (two-tailed). Note that BUB1B expression was not measured in these microarrays. ** Significant at a p value < 0.05. N (AR-V7 low) = 20; N (AR-V7 high) = 10.The Kaplan-Meier curves for Disease-Free Survival (DFS) and overall survival were built using the Prostate Adenocarcinoma TCGA dataset (465 samples) (upper graphs). The black curves denote cases with normal expression of the gene set, and red represents cases where the mRNA levels of the seven genes were upregulated (z-score threshold ≤ 1.96). For DFS: p-value = 0.0009; for death: p-value = 0.026. An independent dataset was analyzed (Prostate Adenocarcinoma MSKCC, Cancer Cell 2010, 123 samples) (lower graphs). The black curves denote cases with normal expression of the gene set, and red represents cases where the mRNA levels of at least five genes of the gene set were upregulated (z-score threshold ≤ 1.96). For DFS: p-value = 0.0007; for death: p-value = 0.00546."}
{"words": ["Figure", "3Cell", "proliferation", "was", "examined", "in", "the", "CRPC", "cell", "line", "22Rv1", "following", "individual", "depletion", "of", "mRNAs", "for", "the", "seven", "genes", "or", "shGFP", "controls", ",", "using", "shRNA", "against", "the", "coding", "region", "for", "each", "gene", "(", "shRNA", "#", "2", ")", ".", "Cell", "number", "was", "measured", "using", "a", "non", "-", "perturbing", "nuclear", "restricted", "dye", "and", "quantified", "after", "72", "hours", "using", "Incucyte", "Zoom", "System", ".", "Data", "shown", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "8", "to", "12", "replicates", "normalized", "to", "their", "shGFP", "control", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "(", "p", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", ")", "and", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "were", "performed", ".", "Representative", "images", "of", "22Rv1", "stably", "depleted", "of", "BUB1B", ",", "or", "control", "(", "shGFP", ")", "are", "shown", ".", "22Rv1", "stably", "depleted", "of", "each", "of", "the", "seven", "genes", "were", "transfected", "with", "a", "dual", "plasmid", "luciferase", "reporter", "system", "which", "quantifies", "AR", "activity", "and", "basal", "transcription", ".", "The", "assay", "was", "conducted", "in", "2", "%", "CSS", "to", "measure", "AR", "ligand", "-", "independent", "transcriptional", "activity", ".", "Data", "represent", "two", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ",", "showing", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "normalized", "to", "their", "shGFP", "controls", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "(", "p", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", ")", "and", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "were", "performed", ".", "*", "Significant", "at", "a", "p", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "The", "expression", "of", "FKBP5", "and", "UBE2C", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "mRNA", "levels", "was", "examined", "in", "22Rv1", "cells", "stably", "expressing", "shRNA", "for", "each", "of", "the", "seven", "genes", ".", "Cells", "were", "cultured", "in", "2", "%", "CSS", ".", "Data", "represent", "two", "independent", "experiments", "performed", "in", "duplicate", "or", "triplicate", ",", "showing", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "normalized", "to", "their", "shGFP", "controls", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "(", "p", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", ")", "and", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "were", "performed", ".", "*", "Significant", "at", "a", "p", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "value", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Cell proliferation was examined in the CRPC cell line 22Rv1 following individual depletion of mRNAs for the seven genes or shGFP controls, using shRNA against the coding region for each gene (shRNA #2). Cell number was measured using a non-perturbing nuclear restricted dye and quantified after 72 hours using Incucyte Zoom System. Data shown are mean ± s.e.m. of 8 to 12 replicates normalized to their shGFP control. Kruskal-Wallis test (p value < 0.0001, two-tailed) and Dunn's multiple comparisons test were performed.Representative images of 22Rv1 stably depleted of BUB1B, or control (shGFP) are shown.22Rv1 stably depleted of each of the seven genes were transfected with a dual plasmid luciferase reporter system which quantifies AR activity and basal transcription. The assay was conducted in 2% CSS to measure AR ligand-independent transcriptional activity. Data represent two independent experiments performed in triplicate, showing the mean ± s.e.m., and normalized to their shGFP controls. Kruskal-Wallis test (p value < 0.0001, two-tailed) and Dunn's multiple comparisons test were performed. * Significant at a p value < 0.05, ** p value < 0.001.The expression of FKBP5 and UBE2C determined by RT-qPCR analysis and normalized to GAPDH mRNA levels was examined in 22Rv1 cells stably expressing shRNA for each of the seven genes. Cells were cultured in 2% CSS. Data represent two independent experiments performed in duplicate or triplicate, showing the mean ± s.e.m., and normalized to their shGFP controls. Kruskal-Wallis test (p value < 0.0001, two-tailed) and Dunn's multiple comparisons test were performed. * Significant at a p value < 0.05, ** p value < 0.001."}
{"words": ["Figure", "4The", "CRPC", "cell", "line", "22Rv1", "was", "cultured", "in", "2", "%", "CSS", "media", "and", "was", "treated", "for", "72", "hours", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOX", ")", ",", "N9", "-", "isopropylolomoucine", "(", "N", "-", "9", ")", ",", "or", "the", "combination", "of", "DOX", "and", "N", "-", "9", "at", "different", "concentrations", ".", "Cell", "confluence", "was", "monitored", "using", "Incucyte", "Zoom", "System", "and", "the", "experiments", "were", "done", "with", "eight", "replicates", "each", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "using", "Compusyn", "software", ",", "and", "a", "normalized", "isobologram", "was", "built", ".", "The", "table", "shows", "the", "Combination", "Index", "(", "CI", ")", "for", "the", "different", "drug", "combinations", ".", "CI", "=", "1", "represents", "additivity", ",", "CI", "<", "1", "synergism", ",", "and", "CI", ">", "1", "antagonistic", "effects", ".", "The", "non", "-", "tumorigenic", "prostate", "epithelial", "cell", "line", "RWPE1", ",", "the", "AR", "-", "null", "PC", "cell", "line", "PC3", ",", "the", "androgen", "dependent", "cell", "line", "LNCaP", ",", "and", "the", "CRPC", "cell", "lines", "C4", "-", "2B", "and", "22Rv1", "were", "treated", "for", "72", "hours", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ",", "DOX", "(", "100", "ng", "/", "mL", "[", "184", "nM", "]", ")", ",", "N", "-", "9", "(", "200", "ng", "/", "mL", "[", "613", "nM", "]", ")", ",", "or", "the", "combination", "of", "DOX", "(", "100", "ng", "/", "mL", "[", "184", "nM", "]", ")", "and", "N", "-", "9", "(", "200", "ng", "/", "mL", "[", "613", "nM", "]", ")", ".", "C4", "-", "2B", "and", "22Rv1", "cells", "were", "kept", "in", "10", "%", "CSS", "media", ",", "and", "the", "other", "cell", "lines", "in", "10", "%", "FBS", ".", "Cell", "confluence", "was", "monitored", "using", "the", "Incucyte", "Zoom", "System", ".", "Data", "represent", "two", "independent", "experiments", ",", "with", "four", "to", "six", "replicates", "each", ",", "showing", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "normalized", "to", "vehicle", "controls", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "P", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", ")", ".", "*", "Significant", "at", "a", "p", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "value", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "The", "non", "-", "tumorigenic", "prostate", "cell", "line", "RWPE", "-", "1", "and", "the", "CRPC", "cell", "line", "22Rv1", "were", "treated", "for", "72", "hours", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "or", "the", "combination", "of", "DOX", "and", "N", "-", "9", "at", "100", "ng", "/", "mL", "and", "N", "-", "9", "200", "ng", "/", "mL", ",", "respectively", ".", "Cell", "confluence", "was", "monitored", "using", "the", "Incucyte", "Zoom", "System", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4The CRPC cell line 22Rv1 was cultured in 2% CSS media and was treated for 72 hours with vehicle (DMSO), doxorubicin (DOX), N9-isopropylolomoucine (N-9), or the combination of DOX and N-9 at different concentrations. Cell confluence was monitored using Incucyte Zoom System and the experiments were done with eight replicates each. The data were analyzed using Compusyn software, and a normalized isobologram was built. The table shows the Combination Index (CI) for the different drug combinations. CI=1 represents additivity, CI<1 synergism, and CI>1 antagonistic effects.The non-tumorigenic prostate epithelial cell line RWPE1, the AR-null PC cell line PC3, the androgen dependent cell line LNCaP, and the CRPC cell lines C4-2B and 22Rv1 were treated for 72 hours with vehicle (DMSO), DOX (100 ng/mL [184 nM]), N-9 (200 ng/mL [613 nM]), or the combination of DOX (100 ng/mL [184 nM]) and N-9 (200 ng/mL [613 nM]). C4-2B and 22Rv1 cells were kept in 10% CSS media, and the other cell lines in 10% FBS. Cell confluence was monitored using the Incucyte Zoom System. Data represent two independent experiments, with four to six replicates each, showing the mean ± s.e.m., and normalized to vehicle controls (Kruskal-Wallis test, P value <0.0001, two-tailed). *Significant at a p value < 0.05, ** p value < 0.01, *** p value < 0.001.The non-tumorigenic prostate cell line RWPE-1 and the CRPC cell line 22Rv1 were treated for 72 hours with vehicle (DMSO) or the combination of DOX and N-9 at 100 ng/mL and N-9 200 ng/mL, respectively. Cell confluence was monitored using the Incucyte Zoom System."}
{"words": ["Figure", "2Sashimi", "plots", "of", "representative", "SRSF3", "-", "dependent", "exons", ".", "C2C12", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", "(", "siCont", ")", ",", "Srsf3", "siRNA", "(", "siSrsf3", ")", ",", "Hnrnpk", "siRNA", "(", "siHnrnpk", ")", ",", "or", "both", "Srsf3", "and", "Hnrnpk", "siRNAs", "(", "siSrsf3", "+", "siHnrnpk", ")", ",", "and", "RNA", "-", "seq", "was", "performed", ".", "Lines", "indicate", "junction", "-", "spanning", "reads", ".", "Gene", "structures", "are", "shown", "below", "the", "Sashimi", "plots", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Sashimi plots of representative SRSF3-dependent exons. C2C12 cells were treated with control siRNA (siCont), Srsf3 siRNA (siSrsf3), Hnrnpk siRNA (siHnrnpk), or both Srsf3 and Hnrnpk siRNAs (siSrsf3+siHnrnpk), and RNA-seq was performed. Lines indicate junction-spanning reads. Gene structures are shown below the Sashimi plots."}
{"words": ["Figure", "3Volcano", "plot", "showing", "fold", "changes", "versus", "P", "-", "values", "of", "the", "normalized", "MASCOT", "scores", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", ")", "of", "identified", "proteins", "between", "3XFLAG", "-", "SRSF3", "-", "IP", "and", "Cont", "-", "IP", ".", "Each", "experiment", "was", "triplicated", ".", "The", "members", "of", "the", "representative", "families", "of", "splicing", "factors", "are", "highlighted", "by", "colors", "(", "right", "upper", "box", ")", ".", "Volcano", "plot", "showing", "fold", "changes", "versus", "P", "-", "values", "of", "the", "normalized", "MASCOT", "scores", "of", "identified", "proteins", "between", "3XFLAG", "-", "HNRNPK", "-", "IP", "and", "Cont", "-", "IP", ".", "Each", "experiment", "was", "triplicated", ".", "The", "members", "of", "the", "representative", "families", "of", "splicing", "factors", "are", "highlighted", "by", "colors", "(", "right", "upper", "box", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Volcano plot showing fold changes versus P-values of the normalized MASCOT scores (see Materials and Methods) of identified proteins between 3XFLAG-SRSF3-IP and Cont-IP. Each experiment was triplicated. The members of the representative families of splicing factors are highlighted by colors (right upper box).   Volcano plot showing fold changes versus P-values of the normalized MASCOT scores of identified proteins between 3XFLAG-HNRNPK-IP and Cont-IP. Each experiment was triplicated. The members of the representative families of splicing factors are highlighted by colors (right upper box).   "}
{"words": ["Figure", "4mRNA", "expression", "levels", "of", "seven", "CPSF", "factors", "in", "C2C12", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNA", "normalized", "for", "those", "treated", "with", "the", "control", "siRNA", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "CuffDiff", "(", "Trapnell", "et", "all", ".", ",", "2010", ")", ".", "Western", "blots", "showing", "protein", "expression", "levels", "of", "CPSF6", "and", "β", "-", "actin", "(", "ACTB", ")", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "harvested", "42", "h", "after", "siRNA", "transfection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4mRNA expression levels of seven CPSF factors in C2C12 cells treated with the indicated siRNA normalized for those treated with the control siRNA. **p < 0.01 by CuffDiff (Trapnell et all., 2010).Western blots showing protein expression levels of CPSF6 and β-actin (ACTB). Whole cell lysates were harvested 42 h after siRNA transfection."}
{"words": ["Figure", "6SRSF3", "-", "responsive", "alternative", "3", "′", "ends", "of", "the", "Med1", "gene", ".", "(", "Top", "panel", ")", "Disorder", "analysis", "for", "MED1", "using", "PONDR", "VL", "-", "XT", "(", "deep", "blue", ")", "and", "IUPred2", "(", "light", "blue", ")", ".", "The", "scores", "in", "the", "ordinate", "indicate", "disordered", "tendencies", "between", "0", "and", "1", "(", "a", "score", "of", "more", "than", "0", ".", "5", "indicates", "disordered", ")", ".", "(", "Middle", "panel", ")", "Protein", "and", "gene", "structures", "of", "MED1", ".", "The", "protein", "structure", "was", "segmented", "into", "individual", "exonic", "regions", ".", "The", "SRSF3", "-", "responsive", "last", "exon", "is", "indicated", "in", "pink", ".", "(", "Bottom", "panel", ")", "Sashimi", "plots", "of", "RNA", "-", "seqs", "from", "Srsf3", "-", "and", "/", "or", "Hnrnpk", "-", "silenced", "cells", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "MED1", "in", "C2C12", "cells", "treated", "with", "siCont", "(", "C", ")", ",", "siSrsf3", "(", "S", ")", ",", "siHnrnpk", "(", "K", ")", ",", "or", "siSrsf3", "+", "siHnrnpk", "(", "S", "+", "K", ")", ".", "A", "white", "dotted", "contour", "outlines", "the", "nucleus", ".", "Box", "plots", "(", "right", ")", "show", "quantification", "of", "nuclear", "(", "NUC", ")", "and", "cytoplasmic", "(", "CYT", ")", "localization", "of", "MED1", ".", "The", "average", "intensity", "of", "one", "nucleus", "or", "a", "cytoplasmic", "segment", "is", "individually", "plotted", ".", "The", "intrinsically", "disordered", "region", "(", "IDR", ")", "in", "MED4", ".", "Disorder", "analysis", ",", "protein", "and", "gene", "structures", ",", "and", "Sashimi", "plots", "are", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "Splicing", "of", "these", "genes", "was", "not", "affected", "by", "the", "siRNA", "treatment", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "MED4", "in", "C2C12", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "Box", "plots", "show", "quantification", "of", "nuclear", "localization", "of", "MED4", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "nucleus", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "MED1", "and", "MED4", "in", "C2C12", "cells", "The", "arrows", "denote", "representative", "puncta", ",", "including", "both", "MED1", "and", "MED4", ".", "The", "number", "of", "MED1", "puncta", "(", "left", ")", "and", "MED4", "puncta", "(", "right", ")", "per", "nucleus", "in", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNA", ".", "MED1", "signals", "on", "MED4", "puncta", "normalized", "to", "nuclear", "MED1", "signals", ".", "MED1", "signal", "intensity", "on", "each", "MED4", "punctum", "was", "individually", "plotted", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6SRSF3-responsive alternative 3′ ends of the Med1 gene. (Top panel) Disorder analysis for MED1 using PONDR VL-XT (deep blue) and IUPred2 (light blue). The scores in the ordinate indicate disordered tendencies between 0 and 1 (a score of more than 0.5 indicates disordered). (Middle panel) Protein and gene structures of MED1. The protein structure was segmented into individual exonic regions. The SRSF3-responsive last exon is indicated in pink. (Bottom panel) Sashimi plots of RNA-seqs from Srsf3- and/or Hnrnpk-silenced cells.Immunofluorescence images of MED1 in C2C12 cells treated with siCont (C), siSrsf3 (S), siHnrnpk (K), or siSrsf3+siHnrnpk (S+K). A white dotted contour outlines the nucleus. Box plots (right) show quantification of nuclear (NUC) and cytoplasmic (CYT) localization of MED1. The average intensity of one nucleus or a cytoplasmic segment is individually plotted.The intrinsically disordered region (IDR) in MED4. Disorder analysis, protein and gene structures, and Sashimi plots are shown in (B). Splicing of these genes was not affected by the siRNA treatment.Immunofluorescence images of MED4 in C2C12 cells treated with the indicated siRNAs. Box plots show quantification of nuclear localization of MED4. Each dot represents one nucleus.Immunofluorescence images of MED1 and MED4 in C2C12 cells The arrows denote representative puncta, including both MED1 and MED4.The number of MED1 puncta (left) and MED4 puncta (right) per nucleus in cells treated with the indicated siRNA.MED1 signals on MED4 puncta normalized to nuclear MED1 signals. MED1 signal intensity on each MED4 punctum was individually plotted."}
{"words": ["Figure", "1B", "Forest", "plots", "display", "the", "hazard", "ratios", "of", "genes", "at", "the", "17q12", "amplicon", "according", "to", "the", "DFS", "(", "top", "right", ")", "and", "OS", "(", "bottom", "right", ")", "of", "breast", "cancer", "patients", "in", "the", "METABRIC", "dataset", ".", "Genes", "located", "at", "the", "HER2", "amplicon", "were", "nominated", "according", "to", "hazard", "-", "ratio", "levels", "(", "all", "P", "-", "values", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "The", "HER2", "co", "-", "amplification", "percentage", "of", "the", "indicated", "genes", "is", "represented", "as", "bar", "graphs", "(", "left", ")", ".", "C", "The", "frequency", "of", "CDK12", "amplification", "in", "HER2", "-", "amplified", "-", "and", "HER2", "-", "nonamplified", "breast", "cancer", ".", "The", "bar", "graphs", "indicate", "the", "frequency", "of", "HER2", "and", "CDK12", "co", "-", "amplified", "cases", "among", "the", "patients", "with", "HER2", "gene", "amplification", "(", "left", ")", ".", "Tables", "show", "the", "percentage", "of", "CDK12", "amplification", "in", "the", "indicated", "cohorts", "(", "right", ")", ".", "Amp", ",", "amplification", ";", "non", "-", "amp", ",", "non", "-", "amplification", ".", "D", "Scatter", "plot", "showing", "the", "correlation", "between", "CDK12", "expression", "and", "its", "copy", "number", "alteration", "(", "CNA", ")", "in", "METABRIC", "(", "left", ")", ".", "The", "r", "value", "was", "calculated", "as", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", ".", "Box", "plots", "showing", "the", "mRNA", "levels", "of", "CDK12", "in", "the", "indicated", "subtypes", "from", "METABRIC", "(", "right", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", ".", "E", "Survival", "analysis", "of", "breast", "cancer", "patients", "according", "to", "the", "expression", "of", "CDK12", "in", "METABRIC", "(", "top", ")", "and", "KM", "plotter", "(", "bottom", ")", "using", "the", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "with", "the", "log", "-", "rank", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Forest plots display the hazard ratios of genes at the 17q12 amplicon according to the DFS (top right) and OS (bottom right) of breast cancer patients in the METABRIC dataset. Genes located at the HER2 amplicon were nominated according to hazard-ratio levels (all P-values < 0.01). The HER2 co-amplification percentage of the indicated genes is represented as bar graphs (left).C The frequency of CDK12 amplification in HER2-amplified- and HER2-nonamplified breast cancer. The bar graphs indicate the frequency of HER2 and CDK12 co-amplified cases among the patients with HER2 gene amplification (left). Tables show the percentage of CDK12 amplification in the indicated cohorts (right). Amp, amplification; non-amp, non-amplification.D Scatter plot showing the correlation between CDK12 expression and its copy number alteration (CNA) in METABRIC (left). The r value was calculated as the Pearson's correlation coefficient. Box plots showing the mRNA levels of CDK12 in the indicated subtypes from METABRIC (right). P-values were calculated using one-way ANOVA, followed by post-hoc LSD test.E Survival analysis of breast cancer patients according to the expression of CDK12 in METABRIC (top) and KM plotter (bottom) using the Kaplan-Meier method with the log-rank test."}
{"words": ["Figure", "2A", "FACS", "analysis", "of", "the", "percentages", "of", "CD44", "+", "/", "CD24", "−", "/", "ESA", "+", "breast", "CSC", "-", "like", "populations", "in", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "and", "HCC", "-", "1419", "cells", "and", "CDK12", "-", "siRNA", "-", "transfected", "BT474", "and", "HCC", "-", "1954", "cells", ".", "Top", ",", "representative", "dot", "plot", "of", "CD44", "-", "APC", "versus", "CD24", "-", "PE", "expression", "for", "viable", "cells", "(", "red", ")", "and", "ESA", "-", "positive", "cells", "(", "blue", ")", "from", "the", "viable", "cells", ".", "Bottom", ",", "the", "percentage", "of", "CD44", "+", "/", "CD24", "-", "/", "ESA", "+", "cell", "population", "(", "blue", "dots", "at", "lower", "right", "quadrant", "in", "the", "plots", ")", "was", "quantified", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "samples", ".", "P", "-", "values", "were", "based", "on", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "ZR", "-", "75", "-", "30", "and", "HCC", "-", "1419", "cells", ")", "and", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", "(", "BT474", "and", "HCC", "-", "1954", "cells", ")", ".", "Amp", ",", "amplification", ";", "non", "-", "amp", ",", "non", "-", "amplification", ";", "Trz", ",", "trastuzumab", ".", "B", "ALDEFLUOR", "assay", "for", "analysing", "cell", "population", "with", "a", "high", "ALDH", "activity", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Cells", "either", "treated", "with", "ALDH", "inhibitor", "DEAB", "(", "with", "DEAB", ";", "negative", "control", ")", "or", "untreated", "(", "without", "DEAB", ")", "were", "incubated", "with", "ALDEFLURO", "substrate", "(", "BAAA", ")", ".", "In", "the", "FACS", "analysis", ",", "the", "percentage", "of", "ALDEFLUOR", "-", "positive", "population", "was", "determined", "based", "on", "the", "shift", "of", "fluorescent", "cells", "seen", "in", "the", "dot", "plots", "in", "the", "absence", "of", "DEAB", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "based", "on", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "cell", "line", "information", "was", "indicated", "as", "follows", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "C", "The", "self", "-", "renewal", "of", "CSCs", "in", "the", "indicated", "stable", "cell", "lines", "was", "analysed", "using", "a", "tumorsphere", "-", "formation", "assay", ".", "The", "number", "of", "tumorsphere", "cells", "(", ">", "100", "μm", "in", "diameter", ")", "was", "counted", "after", "3", ",", "5", ",", "and", "7", "days", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "value", "was", "calculated", "based", "on", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "ZR", "-", "75", "-", "30", "and", "HCC", "-", "1419", "cells", ")", "or", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", "(", "BT474", "and", "HCC", "-", "1954", "cells", ")", ".", "cell", "line", "information", "was", "indicated", "as", "follows", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "PR", ",", "trastuzumab", "-", "partial", "responsive", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "D", "Cell", "growth", "of", "the", "indicated", "stable", "cell", "lines", "treated", "with", "trastuzumab", "(", "Trz", ")", "or", "vehicle", "(", "veh", ")", "as", "measured", "by", "SRB", "assay", ".", "Trastuzumab", "-", "sensitive", "HER2", "+", "breast", "cancer", "cell", "lines", "(", "S", ")", "and", "trastuzumab", "-", "insensitive", "HER2", "+", "breast", "cancer", "cell", "lines", "(", "partial", "responsive", ",", "PR", ";", "resistant", ",", "R", ")", "were", "treated", "with", "1", "µg", "/", "mL", "or", "100", "µg", "/", "mL", "trastuzumab", ",", "respectively", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "RM", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", ".", "cell", "line", "information", "was", "indicated", "as", "follows", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "PR", ",", "trastuzumab", "-", "partial", "responsive", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "E", "Analysis", "of", "the", "effect", "of", "CDK12", "deficiency", "on", "the", "in", "vivo", "trastuzumab", "response", "of", "HER2", "+", "breast", "cancer", ".", "Mice", "were", "orthotopically", "xenografted", "with", "the", "indicated", "HER2", "+", "breast", "cancer", "cells", "and", "treated", "with", "20", "mg", "/", "kg", "trastuzumab", ".", "The", "growth", "curve", "of", "each", "group", "was", "analysed", "twice", "weekly", "for", "5", "to", "6", "weeks", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ";", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", "for", "the", "last", "day", "of", "tumor", "measurement", ".", "cell", "line", "information", "was", "indicated", "as", "follows", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A FACS analysis of the percentages of CD44+/CD24−/ESA+ breast CSC-like populations in CDK12-overexpressing ZR-75-30 and HCC-1419 cells and CDK12-siRNA-transfected BT474 and HCC-1954 cells. Top, representative dot plot of CD44-APC versus CD24-PE expression for viable cells (red) and ESA-positive cells (blue) from the viable cells. Bottom, the percentage of CD44+/CD24-/ESA+ cell population (blue dots at lower right quadrant in the plots) was quantified in the indicated cell lines. Mean ± s.d. of three independent samples. P-values were based on two-tailed Student's t-test (ZR-75-30 and HCC-1419 cells) and one-way ANOVA with a post-hoc LSD test (BT474 and HCC-1954 cells). Amp, amplification; non-amp, non-amplification; Trz, trastuzumab.B ALDEFLUOR assay for analysing cell population with a high ALDH activity in the indicated cell lines. Cells either treated with ALDH inhibitor DEAB (with DEAB; negative control) or untreated (without DEAB) were incubated with ALDEFLURO substrate (BAAA). In the FACS analysis, the percentage of ALDEFLUOR-positive population was determined based on the shift of fluorescent cells seen in the dot plots in the absence of DEAB. Mean ± s.d. . P-values were calculated based on a two-tailed Student's t-test cell line information was indicated as follows: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.C The self-renewal of CSCs in the indicated stable cell lines was analysed using a tumorsphere-formation assay. The number of tumorsphere cells (> 100 μm in diameter) was counted after 3, 5, and 7 days. Data represent the mean ± s.d. (n = 3). P-value was calculated based on a two-tailed Student's t-test (ZR-75-30 and HCC-1419 cells) or ANOVA with a post-hoc LSD test (BT474 and HCC-1954 cells). cell line information was indicated as follows: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; R, trastuzumab-resistant; PR, trastuzumab-partial responsive; S, trastuzumab-sensitive.D Cell growth of the indicated stable cell lines treated with trastuzumab (Trz) or vehicle (veh) as measured by SRB assay. Trastuzumab-sensitive HER2+ breast cancer cell lines (S) and trastuzumab-insensitive HER2+ breast cancer cell lines (partial responsive, PR; resistant, R) were treated with 1 µg/mL or 100 µg/mL trastuzumab, respectively. Data represent the mean ± s.d. P-values were calculated using RM ANOVA with a post-hoc LSD test. cell line information was indicated as follows: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; R, trastuzumab-resistant; PR, trastuzumab-partial responsive; S, trastuzumab-sensitive.E Analysis of the effect of CDK12 deficiency on the in vivo trastuzumab response of HER2+ breast cancer. Mice were orthotopically xenografted with the indicated HER2+ breast cancer cells and treated with 20 mg/kg trastuzumab. The growth curve of each group was analysed twice weekly for 5 to 6 weeks (n = 8/group; mean ± s.e.m.). P-values were calculated using one-way ANOVA with a post-hoc LSD test for the last day of tumor measurement. cell line information was indicated as follows: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells R, trastuzumab-resistant S, trastuzumab-sensitive."}
{"words": ["Figure", "3A", "Heatmap", "presents", "the", "alteration", "of", "gene", "expression", "(", "≥", "1", ".", "5", "-", "fold", ")", "between", "control", "(", "CON", ")", "and", "CDK12", "-", "overexpressing", "(", "CDK12", ")", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", "obtained", "from", "RNA", "-", "seq", "analysis", ".", "B", "GSEA", "displaying", "correlations", "of", "the", "gene", "-", "expression", "profiles", "between", "control", "and", "CDK12", "-", "overexpressing", "cells", "based", "on", "RNA", "-", "seq", "results", ".", "D", "The", "CDK12", "-", "target", "genes", "identified", "by", "RNA", "-", "seq", "were", "validated", "in", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", "using", "qRT", "-", "PCR", "analysis", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "displaying", "the", "fold", "-", "enrichment", "of", "the", "indicated", "proteins", "and", "histone", "H3", "acetylation", "at", "the", "TSS", "of", "CDK12", "-", "target", "genes", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "F", "Effect", "of", "CDK12", "kinase", "inhibition", "on", "the", "expression", "of", "WNT1", ",", "WNT3", ",", "and", "IRS1", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "different", "doses", "of", "dinaciclib", "for", "12", "h", ",", "and", "the", "expression", "of", "candidate", "targets", "of", "CDK12", "were", "analysed", "by", "immunoblot", "and", "qRT", "-", "PCR", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "by", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "G", "Cell", "viability", "was", "measured", "by", "SRB", "assay", "in", "trastuzumab", "-", "sensitive", "BT474", "cells", "and", "trastuzumab", "-", "resistant", "HCC", "-", "1954", "cells", "treated", "with", "1", "µg", "/", "mL", "or", "100", "µg", "/", "mL", "trastuzumab", "(", "Trz", ")", "and", "/", "or", "5", "nM", "or", "10", "nM", "dinaciclib", "(", "Dina", ")", ",", "respectively", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", ",", "RM", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "H", "Tumor", "growth", "curves", "for", "mice", "xenografted", "with", "the", "indicated", "HER2", "+", "breast", "cancer", "cells", "treated", "with", "20", "mg", "/", "kg", "trastuzumab", "and", "/", "or", "20", "mg", "/", "kg", "dinaciclib", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ";", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "P", "-", "values", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "(", "BT474", ")", "or", "Dunnett", "T3", "(", "HCC", "-", "1954", ")", "test", "for", "the", "last", "day", "of", "tumor", "measurement", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Heatmap presents the alteration of gene expression (≥1.5-fold) between control (CON) and CDK12-overexpressing (CDK12) ZR-75-30 cells obtained from RNA-seq analysis.B GSEA displaying correlations of the gene-expression profiles between control and CDK12-overexpressing cells based on RNA-seq results.D The CDK12-target genes identified by RNA-seq were validated in CDK12-overexpressing ZR-75-30 cells using qRT-PCR analysis. Mean ± s.d. (n = 3). P-values by two-tailed Student's t-test.E ChIP-qPCR analysis displaying the fold-enrichment of the indicated proteins and histone H3 acetylation at the TSS of CDK12-target genes in the indicated cell lines. Mean ± s.d. (n = 3). P-values by two-tailed Student's t-test. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.F Effect of CDK12 kinase inhibition on the expression of WNT1, WNT3, and IRS1. Cells were treated with different doses of dinaciclib for 12 h, and the expression of candidate targets of CDK12 were analysed by immunoblot and qRT-PCR Mean ± s.d. (n = 3). P-values by ANOVA with a post-hoc LSD test. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells ; R, trastuzumab-resistant; S, trastuzumab-sensitive.G Cell viability was measured by SRB assay in trastuzumab-sensitive BT474 cells and trastuzumab-resistant HCC-1954 cells treated with 1 µg/mL or 100 µg/mL trastuzumab (Trz) and/or 5 nM or 10 nM dinaciclib (Dina), respectively. Mean ± s.d. (n = 3). P-values, RM ANOVA with a post-hoc LSD test. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells R, trastuzumab-resistant; S, trastuzumab-sensitive.H Tumor growth curves for mice xenografted with the indicated HER2+ breast cancer cells treated with 20 mg/kg trastuzumab and/or 20 mg/kg dinaciclib (n = 8/group; mean ± s.e.m.). P-values, one-way ANOVA with a post-hoc LSD (BT474) or Dunnett T3 (HCC-1954) test for the last day of tumor measurement. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells R, trastuzumab-resistant; S, trastuzumab-sensitive."}
{"words": ["Figure", "4A", "Western", "blot", "and", "qRT", "-", "PCR", "results", "showing", "phosphorylation", "levels", "of", "GSK", "-", "3β", "and", "WNT1", "and", "WNT3", "expression", ",", "respectively", ",", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitiveSubcellular", "localization", "of", "β", "-", "catenin", "in", "the", "indicated", "stable", "cell", "lines", "were", "analysed", "by", "cellular", "fractionation", "(", "B", ")", "Subcellular", "localization", "of", "β", "-", "catenin", "in", "the", "indicated", "stable", "cell", "lines", "were", "analysed", "by", "immunofluorescence", "staining", "(", "C", ")", ".", "Nuclear", "translocation", "of", "β", "-", "catenin", "in", "control", ",", "CDK12", "-", "overexpressing", ",", "and", "CDK12", "-", "knockdown", "stable", "cell", "lines", "was", "quantified", "by", "counting", "the", "cells", "harboring", "exclusively", "nuclear", "β", "-", "catenin", "(", "N", ")", "from", "the", "immunofluorescence", "image", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "value", "was", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "M", "+", "C", ",", "cells", "containing", "membrane", "and", "/", "or", "cytoplasmic", "β", "-", "catenin", ";", "N", ",", "cells", "dominantly", "expressing", "nuclear", "β", "-", "catenin", ".", "Green", ",", "β", "-", "catenin", "staining", ";", "Blue", ",", "DAPI", "staining", "for", "visualization", "of", "nucleus", ";", "Scale", "bar", "=", "10", "μ", ".", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "D", "Luciferase", "-", "reporter", "assay", "measuring", "the", "TCF", "/", "lymphoid", "enhancer", "-", "binding", "factor", "-", "promoter", "activity", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "TOP", ",", "pTOP", "-", "flash", "(", "wild", "-", "type", "TCF", "-", "binding", "sites", ")", ",", "FOP", ",", "pFOP", "-", "flash", "(", "mutant", "TCF", "-", "binding", "sites", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", "The", "mRNA", "levels", "of", "the", "WNT", "/", "β", "-", "catenin", "/", "TCF", "-", "target", "genes", "in", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", "and", "CDK12", "-", "knockdown", "BT474", "cells", "were", "analysed", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "F", "Effect", "of", "WNT", "/", "β", "-", "catenin", "/", "TCF", "pathway", "on", "the", "CDK12", "regulation", "of", "breast", "CSCs", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ")", "or", "10", "nM", "FH535", ",", "a", "β", "-", "catenin", "/", "TCF", "inhibitor", ",", "for", "24", "h", ",", "and", "changes", "in", "the", "CD44", "+", "/", "CD24", "-", "/", "ESA", "+", "cell", "population", "were", "measured", "using", "FACS", "analysis", ".", "Cells", "seen", "at", "lower", "right", "quadrant", "in", "the", "dot", "plots", "indicate", "CD44", "+", "/", "CD24", "-", "population", "(", "red", ")", "and", "CD44", "+", "/", "CD24", "-", "/", "ESA", "+", "population", "(", "blue", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "ofP", "-", "value", "was", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Western blot and qRT-PCR results showing phosphorylation levels of GSK-3β and WNT1 and WNT3 expression, respectively, in the indicated cell lines. Mean ± s.d. (n = 3). P-values by two-tailed Student's t-test. a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; S, trastuzumab-sensitiveSubcellular localization of β-catenin in the indicated stable cell lines were analysed by cellular fractionation (B)Subcellular localization of β-catenin in the indicated stable cell lines were analysed by immunofluorescence staining (C). Nuclear translocation of β-catenin in control, CDK12-overexpressing, and CDK12-knockdown stable cell lines was quantified by counting the cells harboring exclusively nuclear β-catenin (N) from the immunofluorescence image. Mean ± s.d. (n = 3). P-value was calculated using a two-tailed Student's t-test. M+C, cells containing membrane and/or cytoplasmic β-catenin; N, cells dominantly expressing nuclear β-catenin. Green, β-catenin staining; Blue, DAPI staining for visualization of nucleus; Scale bar = 10 μ. a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; S, trastuzumab-sensitive.D Luciferase-reporter assay measuring the TCF/ lymphoid enhancer-binding factor-promoter activity in the indicated cell lines. TOP, pTOP-flash (wild-type TCF-binding sites), FOP, pFOP-flash (mutant TCF-binding sites). Data represent the mean ± s.d. P-values were calculated using a two-tailed Student's t-test.E The mRNA levels of the WNT/β-catenin/TCF-target genes in CDK12-overexpressing ZR-75-30 cells and CDK12-knockdown BT474 cells were analysed by qRT-PCR. Mean ± s.d. (n = 3). P-values were calculated using a two-tailed Student's t-test.F Effect of WNT/ β-catenin/TCF pathway on the CDK12 regulation of breast CSCs. Cells were treated with DMSO (vehicle) or 10 nM FH535, a β-catenin/TCF inhibitor, for 24 h, and changes in the CD44+/CD24-/ESA+ cell population were measured using FACS analysis. Cells seen at lower right quadrant in the dot plots indicate CD44+/CD24- population (red) and CD44+/CD24-/ESA+ population (blue). Data represent the mean ± s.d. ofP-value was calculated using one-way ANOVA with a post-hoc LSD test."}
{"words": ["Figure", "5A", "Human", "phospho", "-", "RTK", "array", "displaying", "the", "activation", "of", "phosphokinase", "-", "related", "proteins", "in", "CDK12", "-", "knockdown", "BT474", "cells", ".", "The", "bar", "graph", "shows", "the", "fold", "change", "of", "spot", "intensity", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "B", "Immunoblots", "showing", "the", "levels", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "different", "types", "of", "HER2", "+", "breast", "cancer", "stably", "expressing", "CDK12", "or", "with", "CDK12", "knocked", "down", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "PR", ",", "trastuzumab", "-", "partial", "responsive", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "showing", "the", "amounts", "of", "bindings", "between", "ErbB", "receptors", ".", "Cell", "lysates", "from", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HER2", "antibody", "and", "immunoblotted", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "IgG", ",", "negative", "control", ".", "Cell", "line", "information", ":", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "D", "Western", "blot", "and", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "phosphorylation", "levels", "and", "expression", "of", "IRS1", ",", "respectively", ",", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "E", "Co", "-", "IP", "analysis", "indicating", "the", "amounts", "of", "IRS1", "protein", "interaction", "with", "ErbB", "receptors", "and", "p85", "in", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", ".", "Cell", "line", "information", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "F", "IRS1", "effect", "on", "CDK12", "-", "induced", "phosphorylation", "of", "ErbB", "receptors", ".", "Lysates", "from", "cells", "treated", "with", "either", "control", "siRNA", "or", "IRS1", "siRNA", "(", "siIRS1", ")", "for", "24", "h", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Cell", "line", "information", ":", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Human phospho-RTK array displaying the activation of phosphokinase-related proteins in CDK12-knockdown BT474 cells. The bar graph shows the fold change of spot intensity. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.B Immunoblots showing the levels of the indicated proteins in different types of HER2+ breast cancer stably expressing CDK12 or with CDK12 knocked down. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; R, trastuzumab-resistant; PR, trastuzumab-partial responsive; S, trastuzumab-sensitive.Co-IP analysis showing the amounts of bindings between ErbB receptors. Cell lysates from CDK12-overexpressing ZR-75-30 cells were immunoprecipitated with anti-HER2 antibody and immunoblotted using the indicated antibodies. IgG, negative control. Cell line information: ; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.D Western blot and qRT-PCR analysis of the phosphorylation levels and expression of IRS1, respectively, in the indicated cell lines. Mean ± s.d. (n = 3). P-values were calculated using a two-tailed Student's t-test. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; R, trastuzumab-resistant S, trastuzumab-sensitive.E Co-IP analysis indicating the amounts of IRS1 protein interaction with ErbB receptors and p85 in CDK12-overexpressing ZR-75-30 cells. Cell line information n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.F IRS1 effect on CDK12-induced phosphorylation of ErbB receptors. Lysates from cells treated with either control siRNA or IRS1 siRNA (siIRS1) for 24 h were subjected to immunoblotting with the indicated antibodies. Cell line information: n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive."}
{"words": ["f1a", ",", "COS7", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "GFP", "-", "ATG14", "and", "DsRed", "-", "ER", "or", "RFP", "-", "SEC61b", ";", "(", "an", "ER", "marker", ")", "were", "immunostained", "for", "the", "mitochondria", "marker", "TOMM20", ".", "Scale", "bars", ",", "2", " ", "µm", ".", "b", ",", "An", "immunogold", "electron", "micrograph", "of", "starved", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "ATG14", "probed", "with", "anti", "-", "GFP", "antibodies", "(", "red", "arrows", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "nm", ".", "c", ",", "Immunoblots", "of", "subcellular", "fractions", "isolated", "from", "HEK293", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "DFCP1", ".", "Cyto", ",", "cytosol", ";", "micro", ",", "microsome", ";", "mito", ",", "mitochondria", ";", "PNS", ",", "post", "-", "nuclear", "supernatant", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1a, COS7 cells co-transfected with GFP-ATG14 and DsRed-ER or RFP-SEC61b; (an ER marker) were immunostained for the mitochondria marker TOMM20. Scale bars, 2 µm.b, An immunogold electron micrograph of starved HeLa cells expressing GFP-ATG14 probed with anti-GFP antibodies (red arrows). Scale bar, 200 nm.c, Immunoblots of subcellular fractions isolated from HEK293 cells stably expressing GFP-DFCP1. Cyto, cytosol; micro, microsome; mito, mitochondria; PNS, post-nuclear supernatant."}
{"words": ["f2a", ",", "COS7", "cells", "stably", "expressing", "yellow", "fluorescent", "protein", "(", "YFP", ")", "-", "ATG5", "were", "transfected", "with", "RFP", "-", "SEC61b", ";", "and", "teal", "fluorescent", "protein", "(", "TFP", ")", "-", "mito", ",", "and", "immunostained", "for", "TOMM20", ".", "b", ",", "Time", "-", "lapse", "images", "of", "COS7", "cells", "transfected", "with", "YFP", "-", "ATG5", ",", "RFP", "-", "SEC61b", ";", "and", "TFP", "-", "mito", "under", "starved", "conditions", ".", "c", ",", "d", ",", "Distribution", "of", "distances", "of", "YFP", "-", "ATG5", "dots", "fromthe", "centre", "to", "the", "surface", "of", "the", "ER", "(", "c", ")", "and", "to", "the", "surface", "of", "mitochondria", "(", "d", ")", ".", "e", ",", "f", ",", "Distances", "of", "YFP", "-", "ATG5", "dots", "over", "their", "lifetime", "for", "data", "from", "c", "(", "e", ")", "and", "d", "(", "f", ")", ",", "respectively", ".", "All", "scale", "bars", ",", "2", " ", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2a, COS7 cells stably expressing yellow fluorescent protein (YFP)-ATG5 were transfected with RFP-SEC61b; and teal fluorescent protein (TFP)-mito, and immunostained for TOMM20.b, Time-lapse images of COS7 cells transfected with YFP-ATG5, RFP-SEC61b; and TFP-mito under starved conditions.c, d, Distribution of distances of YFP-ATG5 dots fromthe centre to the surface of the ER (c) and to the surface of mitochondria (d). e, f, Distances of YFP-ATG5 dots over their lifetime for data from c (e) and d (f), respectively. All scale bars, 2 µm."}
{"words": ["f3a", ",", "COS7", "cells", "expressing", "GFP", "-", "SEC61b", ";", "and", "STX17", "were", "immunostained", "for", "TOMM20", ".", "b", ",", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "ATG14", "were", "immunostained", "for", "STX17", ".", "c", ",", "Immunoblot", "of", "subcellular", "fractions", "of", "HEK293", "cells", ".", "d", ",", "STX17", "knockdown", "COS7", "cells", "expressing", "GFP", "-", "ATG14", "and", "RFP", "-", "SEC61b", ";", "were", "immunostained", "for", "TOMM20", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "d", ".", "e", ",", "Immuoblot", "of", "subcellular", "fractions", "of", "STX17", "knockdown", "(", "using", "two", "STX17", "siRNAs", ",", "STX17", "-", "1", "and", "STX17", "-", "2", ")", "HEK293", "cells", "expressing", "GFP", "-", "DFCP1", ".", "f", ",", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "STX17", "and", "ATG14", "using", "HeLa", "cells", "expressing", "Flag", "-", "ATG14", "and", "Myc", "-", "STX17", ".", "g", ",", "Pull", "-", "down", "of", "ATG14", "complex", "from", "HeLa", "cells", "expressing", "Myc", "-", "STX17", "or", "Myc", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "µm", "(", "a", ",", "b", ")", "and", "2", "µm", "(", "d", ")", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3a, COS7 cells expressing GFP-SEC61b; and STX17 were immunostained for TOMM20.b, HeLa cells expressing GFP-ATG14 were immunostained for STX17.c, Immunoblot of subcellular fractions of HEK293 cells.d, STX17 knockdown COS7 cells expressing GFP-ATG14 and RFP-SEC61b; were immunostained for TOMM20. Error bars denote s.d.e, Immuoblot of subcellular fractions of STX17 knockdown (using two STX17 siRNAs, STX17-1 and STX17-2) HEK293 cells expressing GFP-DFCP1.f, Co-immunoprecipitation of STX17 and ATG14 using HeLa cells expressing Flag-ATG14 and Myc-STX17.g, Pull-down of ATG14 complex from HeLa cells expressing Myc-STX17 or Myc. Scale bars, 5 µm (a, b) and 2 µm (d)."}
{"words": ["f4a", ",", "Correlative", "light", "and", "electron", "microscopy", "analysis", "of", "STX17", "knockdown", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "(", "white", "arrows", ")", "infected", "with", "GAS", "(", "red", "arrows", ")", ".", "DAPI", ",", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ".", "b", ",", "Electron", "micrographs", "of", "STX17", "knockdown", "cells", ".", "White", "arrows", "denote", "autolysosomes", ",", "black", "arrows", "denote", "autophagosome", ",", "white", "arrowheads", "mark", "isolation", "membranes", ".", "c", ",", "Immunogold", "electron", "micrographs", "of", "STX17", "knockdown", "HeLa", "cells", "stained", "for", "GFP", "-", "LC3", ".", "d", ",", "GFP", "-", "ATG5", "dots", "(", "arrows", ")", "in", "STX17", "knockdown", "HeLa", "cells", ".", "e", ",", "Quantification", "of", "staining", "in", "d", ".", "f", ",", "Immunoblot", "of", "p62", "in", "STX17", "knockdown", "cells", ".", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "g", ",", "Degradation", "of", "long", "-", "lived", "proteins", "in", "STX17", "knockdown", "cells", ".", "St", ",", "starved", ";", "wor", ",", "wortmannin", ".", "All", "error", "bars", "denote", "s", ".", "d", ".", "Scale", "bars", ",", "1", " ", "µm", "(", "a", ",", "b", ")", ",", "200", " ", "nm", "(", "c", ")", "and", "5", " ", "µm", "(", "d", ")", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4a, Correlative light and electron microscopy analysis of STX17 knockdown HeLa cells expressing GFP-LC3 (white arrows) infected with GAS (red arrows). DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole.b, Electron micrographs of STX17 knockdown cells. White arrows denote autolysosomes, black arrows denote autophagosome, white arrowheads mark isolation membranes.c, Immunogold electron micrographs of STX17 knockdown HeLa cells stained for GFP-LC3.d, GFP-ATG5 dots (arrows) in STX17 knockdown HeLa cells. e, Quantification of staining in d.f, Immunoblot of p62 in STX17 knockdown cells. Tubulin was used as a loading control.g, Degradation of long-lived proteins in STX17 knockdown cells. St, starved; wor, wortmannin. All error bars denote s.d. Scale bars, 1 µm (a, b), 200 nm (c) and 5 µm (d)."}
{"words": ["Figure", "2PS", "decarboxylase", "activity", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ",", "W303", ")", "and", "the", "indicated", "mutant", "strains", "expressed", "as", "(", "B", ")", "the", "molecular", "species", "composition", "of", "13C315N", "-", "labeled", "PS", "(", "*", "PS", ")", "and", "13C215N", "-", "labeled", "PE", "(", "*", "PE", ")", ",", "after", "20", "min", "incubation", "with", "13C315N", "-", "serine", ".", "(", "C", ")", "The", "corresponding", "molecular", "signatures", "of", "PSD", "activity", "represented", "by", "the", "label", "distribution", "per", "molecular", "species", "between", "*", "PS", "and", "*", "PE", "as", "percentages", "of", "the", "total", "amount", "of", "label", "incorporated", "in", "the", "molecular", "species", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2PS decarboxylase activity in wild-type (WT, W303) and the indicated mutant strains expressed as (B) the molecular species composition of 13C315N-labeled PS (*PS) and 13C215N-labeled PE (*PE), after 20 min incubation with 13C315N-serine.(C) The corresponding molecular signatures of PSD activity represented by the label distribution per molecular species between *PS and *PE as percentages of the total amount of label incorporated in the molecular species indicated."}
{"words": ["Figure", "3PS", "decarboxylase", "activity", "in", "a", "psd1Δpsd2Δdpl1Δ", "mutant", "expressing", "Psd1", ",", "Psd1", "(", "ER", ")", "or", "Psd1", "(", "Mt", ")", "expressed", "as", "(", "B", ")", "the", "molecular", "species", "composition", "of", "*", "PS", "and", "*", "PE", "after", "20", "min", "incubation", "with", "13C315N", "-", "serinePS", "decarboxylase", "activity", "in", "a", "psd1Δpsd2Δdpl1Δ", "mutant", "expressing", "Psd1", ",", "Psd1", "(", "ER", ")", "or", "Psd1", "(", "Mt", ")", "expressed", "as", ";", "(", "C", ")", "the", "corresponding", "molecular", "signatures", "of", "PSD", "activity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3PS decarboxylase activity in a psd1Δpsd2Δdpl1Δ mutant expressing Psd1, Psd1(ER) or Psd1(Mt) expressed as (B) the molecular species composition of *PS and *PE after 20 min incubation with 13C315N-serinePS decarboxylase activity in a psd1Δpsd2Δdpl1Δ mutant expressing Psd1, Psd1(ER) or Psd1(Mt) expressed as ; (C) the corresponding molecular signatures of PSD activity."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Acyl", "chain", "composition", "of", "WT", "and", "psd1", "∆", "cells", "overexpressing", "SCT1", "(", "pSCT1", ")", "vs", ".", "empty", "vector", "control", "(", "pEmpty", ")", ".", "Data", "is", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "10", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "multiple", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "Ratio", "of", "the", "proportions", "of", "saturated", "over", "unsaturated", "acyl", "chains", "(", "SFA", "/", "UFA", ")", "of", "WT", ",", "psd1", "∆", ",", "crd1", "∆", "and", "psd2", "∆", "overexpressing", "SCT1", "vs", ".", "empty", "vector", "control", ".", "Data", "is", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "OLE1", "transcript", "levels", "in", "WT", "and", "psd1", "∆", "transformed", "with", "pSCT1", "vs", ".", "pEmpty", "as", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Data", "were", "normalized", "to", "endogenous", "ACT1", "mRNA", ",", "and", "to", "the", "average", "of", "WT", "pEmpty", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Acyl chain composition of WT and psd1∆ cells overexpressing SCT1 (pSCT1) vs. empty vector control (pEmpty). Data is presented as mean ± SD (n>10). **** p < 0.0001, multiple t-test.(C) Ratio of the proportions of saturated over unsaturated acyl chains (SFA/UFA) of WT, psd1∆, crd1∆ and psd2∆ overexpressing SCT1 vs. empty vector control. Data is presented as mean ± SD (n≥3). ** p<0.01, **** p < 0.0001, unpaired two-tailed t-test.(D) OLE1 transcript levels in WT and psd1∆ transformed with pSCT1 vs. pEmpty as determined by RT-qPCR. Data were normalized to endogenous ACT1 mRNA, and to the average of WT pEmpty (n=3)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "SFA", "/", "UFA", "ratios", "of", "WT", "and", "indicated", "mutant", "strains", "overexpressing", "SCT1", "(", "pSCT1", ")", "vs", ".", "control", "(", "pEmpty", ")", ".", "Data", "is", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "of", "the", "indicated", "bar", "compared", "to", "WT", "pSCT1", ".", "(", "B", ")", "Growth", "of", "WT", "and", "indicated", "mutant", "strains", "overexpressing", "SCT1", "(", "pSCT1", ")", "vs", ".", "pEmpty", ".", "Serial", "dilutions", "(", "10", "-", "1", "-", "10", "-", "4", ")", "were", "spotted", "on", "SGal", "+", "0", ".", "05", "%", "glucose", "and", "incubated", "for", "3", "days", "at", "30", "°", "C", ".", "PS", "decarboxylase", "activity", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ",", "BY4741", ")", "and", "the", "indicated", "mutant", "strains", "transformed", "with", "pEmpty", ",", "expressed", ",", "and", "(", "D", ")", "molecular", "species", "composition", "of", "13C315N", "-", "labeled", "PS", "(", "*", "PS", ")", "and", "13C215N", "-", "labeled", "PE", "(", "*", "PE", ")", "after", "20", "min", "incubation", "with", "13C315N", "-", "serine", ".", "The", "differences", "in", "molecular", "species", "profiles", "of", "*", "PS", "and", "*", "PE", "between", "the", "BY4741", "WT", "shown", "here", "and", "those", "obtained", "by", "2H3", "-", "serine", "labeling", "(", "Figure", "4A", ")", "are", "attributed", "to", "the", "different", "culture", "media", ",", "lipid", "extraction", "procedures", "and", "mass", "spectrometry", "techniques", "used", ".", "(", "E", ")", "The", "corresponding", "molecular", "signatures", "of", "PSD", "activity", "represented", "by", "the", "label", "distribution", "per", "molecular", "species", "between", "*", "PS", "and", "*", "PE", "as", "percentages", "of", "the", "total", "amount", "of", "label", "incorporated", "in", "the", "molecular", "species", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) SFA/UFA ratios of WT and indicated mutant strains overexpressing SCT1 (pSCT1) vs. control (pEmpty). Data is presented as mean ± SD (n≥3). * p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001, n.s. not significant, unpaired two-tailed t-test of the indicated bar compared to WT pSCT1.(B) Growth of WT and indicated mutant strains overexpressing SCT1 (pSCT1) vs. pEmpty. Serial dilutions (10-1 - 10-4) were spotted on SGal + 0.05% glucose and incubated for 3 days at 30°C.PS decarboxylase activity in wild-type (WT, BY4741) and the indicated mutant strains transformed with pEmpty, expressed , and (D) molecular species composition of 13C315N-labeled PS (*PS) and 13C215N-labeled PE (*PE) after 20 min incubation with 13C315N-serine. The differences in molecular species profiles of *PS and *PE between the BY4741 WT shown here and those obtained by 2H3-serine labeling (Figure 4A) are attributed to the different culture media, lipid extraction procedures and mass spectrometry techniques used.(E) The corresponding molecular signatures of PSD activity represented by the label distribution per molecular species between *PS and *PE as percentages of the total amount of label incorporated in the molecular species indicated."}
{"words": ["Figure", "6SFA", "/", "UFA", "-", "ratio", "of", "WT", "and", "indicated", "mutant", "strains", "overexpressing", "SCT1", "cultured", "without", "(", "data", "taken", "from", "Fig", "5A", ")", "and", "with", "1", "mM", "ethanolamine", "(", "etn", ")", "or", "1", "mM", "choline", "(", "cho", ")", "as", "indicated", ".", "Data", "is", "presented", "as", "average", "±", "SD", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "unpaired", "t", "-", "test", "of", "the", "indicated", "bar", "compared", "to", "the", "corresponding", "condition", "of", "WT", ".", "Underlying", "data", "for", "this", "figure", "can", "be", "found", "in", "Appendix", "Table", "S1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6SFA/UFA-ratio of WT and indicated mutant strains overexpressing SCT1 cultured without (data taken from Fig 5A) and with 1 mM ethanolamine (etn) or 1 mM choline (cho) as indicated. Data is presented as average ± SD (n≥3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, unpaired t-test of the indicated bar compared to the corresponding condition of WT. Underlying data for this figure can be found in Appendix Table S1."}
{"words": ["Figure", "1A", "Electron", "microscopy", "analyses", "to", "see", "autophagic", "bodies", "in", "the", "vacuoles", "under", "both", "growth", "and", "nitrogen", "starvation", "conditions", ".", "Autophagic", "bodies", "typically", "contain", "cytosolic", "ribosomes", ".", "pep4", "∆", "prb1", "∆", "and", "pep4", "∆", "prb1", "∆", "atg2", "∆", "cells", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "(", "OD600", "=", "1", ")", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", "for", "5", "h", ".", "The", "cells", "were", "examined", "by", "transmission", "electron", "microscopy", "as", "described", "in", ".", "Scale", "bar", ",", "500", "nm", ".", "B", "-", "D", "Time", "‐", "dependent", "changes", "in", "nucleoside", "contents", "under", "nitrogen", "starvation", "(", "B", ")", ",", "rapamycin", "treatment", "(", "C", ")", ",", "and", "carbon", "starvation", "(", "D", ")", "conditions", ".", "Wild", "‐", "type", "and", "atg2Δ", "cells", "were", "grown", "in", "SD", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", ",", "SD", "medium", "with", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", ",", "or", "SD", "(", "‐", "C", ")", "at", "time", "0", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "nucleosides", "were", "analyzed", "by", "LC", "/", "MS", "as", "described", "in", ".", "Results", "are", "presented", "as", "normalized", "intensities", "on", "the", "basis", "of", "peak", "height", "of", "each", "metabolite", "in", "wild", "‐", "type", "cells", ".", "All", "data", "are", "means", "of", "triplicate", "samples", ".", "The", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Electron microscopy analyses to see autophagic bodies in the vacuoles under both growth and nitrogen starvation conditions. Autophagic bodies typically contain cytosolic ribosomes. pep4∆prb1∆ and pep4∆prb1∆atg2∆ cells were grown in SD to mid‐log phase (OD600 = 1) and transferred to SD(‐N) for 5 h. The cells were examined by transmission electron microscopy as described in . Scale bar, 500 nm.B-D Time‐dependent changes in nucleoside contents under nitrogen starvation (B), rapamycin treatment (C), and carbon starvation (D) conditions. Wild‐type and atg2Δ cells were grown in SD and transferred to SD(‐N), SD medium with 0.2 μM rapamycin, or SD(‐C) at time 0. At the indicated time points, nucleosides were analyzed by LC/MS as described in . Results are presented as normalized intensities on the basis of peak height of each metabolite in wild‐type cells. All data are means of triplicate samples. The error bars represent the standard deviation."}
{"words": ["Figure", "2A", "Time", "‐", "dependent", "changes", "in", "nucleoside", "contents", "under", "nitrogen", "starvation", ".", "Nucleosides", "in", "wild", "‐", "type", ",", "atg2Δ", ",", "atg7Δ", ",", "atg11Δ", ",", "atg17Δ", ",", "atg19Δ", ",", "atg32Δ", ",", "nvj1Δ", ",", "and", "pep4prb1Δ", "cells", "under", "nitrogen", "starvation", ".", "All", "data", "are", "means", "of", "triplicates", ".", "The", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "B", "Alkaline", "phosphatase", "(", "ALP", ")", "assay", "(", "Pho8", "∆", "60", ")", ".", "Wild", "‐", "type", ",", "atg2", "∆", ",", "atg11Δ", ",", "atg17Δ", ",", "and", "atg19Δ", "cells", "expressing", "Pho8", "∆", "60", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", "at", "time", "0", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "lysates", "were", "prepared", "and", "subjected", "to", "the", "ALP", "assay", ".", "The", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "0005", "(", "paired", "t", "‐", "test", ",", "two", "‐", "tailed", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Time‐dependent changes in nucleoside contents under nitrogen starvation. Nucleosides in wild‐type, atg2Δ, atg7Δ, atg11Δ, atg17Δ, atg19Δ, atg32Δ, nvj1Δ, and pep4prb1Δ cells under nitrogen starvation. All data are means of triplicates. The error bars represent the standard deviation.B Alkaline phosphatase (ALP) assay (Pho8∆60). Wild‐type, atg2∆, atg11Δ, atg17Δ, and atg19Δ cells expressing Pho8∆60 were grown in SD to mid‐log phase and transferred to SD(‐N) at time 0. At the indicated time points, lysates were prepared and subjected to the ALP assay. The bars represent the standard deviation of three independent experiments. *P 0.05; **P 0.005; ***P 0.0005 (paired t‐test, two‐tailed)"}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "C", "Wild", "‐", "type", ",", "atg2Δ", ",", "pho8Δ", ",", "and", "rny1Δ", "cells", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", "at", "time", "0", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "nucleosides", "(", "A", ")", "were", "analyzed", "by", "LC", "/", "MS", "as", "described", "in", ".", "The", "results", "are", "presented", "as", "normalized", "intensities", "on", "the", "basis", "of", "the", "peak", "height", "of", "each", "metabolite", "in", "wild", "‐", "type", "cells", ".", "Note", "that", "3", "′", "‐", "NMPs", "in", "pho8Δ", "are", "presented", "in", "a", "different", "scale", ".", "All", "data", "are", "means", "of", "triplicates", ".", "The", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "A", "-", "C", "Wild", "‐", "type", ",", "atg2Δ", ",", "pho8Δ", ",", "and", "rny1Δ", "cells", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", "at", "time", "0", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "5", "′", "‐", "NMPs", "(", "B", ")", "were", "analyzed", "by", "LC", "/", "MS", "as", "described", "in", ".", "The", "results", "are", "presented", "as", "normalized", "intensities", "on", "the", "basis", "of", "the", "peak", "height", "of", "each", "metabolite", "in", "wild", "‐", "type", "cells", ".", "Note", "that", "3", "′", "‐", "NMPs", "in", "pho8Δ", "are", "presented", "in", "a", "different", "scale", ".", "All", "data", "are", "means", "of", "triplicates", ".", "The", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "A", "-", "C", "Wild", "‐", "type", ",", "atg2Δ", ",", "pho8Δ", ",", "and", "rny1Δ", "cells", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", "at", "time", "0", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "3", "′", "‐", "NMPs", "(", "C", ")", "were", "analyzed", "by", "LC", "/", "MS", "as", "described", "in", ".", "The", "results", "are", "presented", "as", "normalized", "intensities", "on", "the", "basis", "of", "the", "peak", "height", "of", "each", "metabolite", "in", "wild", "‐", "type", "cells", ".", "Note", "that", "3", "′", "‐", "NMPs", "in", "pho8Δ", "are", "presented", "in", "a", "different", "scale", ".", "All", "data", "are", "means", "of", "triplicates", ".", "The", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-C Wild‐type, atg2Δ, pho8Δ, and rny1Δ cells were grown in SD to mid‐log phase and transferred to SD(‐N) at time 0. At the indicated time points, nucleosides (A) were analyzed by LC/MS as described in . The results are presented as normalized intensities on the basis of the peak height of each metabolite in wild‐type cells. Note that 3′‐NMPs in pho8Δ are presented in a different scale. All data are means of triplicates. The error bars represent the standard deviation.A-C Wild‐type, atg2Δ, pho8Δ, and rny1Δ cells were grown in SD to mid‐log phase and transferred to SD(‐N) at time 0. At the indicated time points, 5′‐NMPs (B) were analyzed by LC/MS as described in . The results are presented as normalized intensities on the basis of the peak height of each metabolite in wild‐type cells. Note that 3′‐NMPs in pho8Δ are presented in a different scale. All data are means of triplicates. The error bars represent the standard deviation.A-C Wild‐type, atg2Δ, pho8Δ, and rny1Δ cells were grown in SD to mid‐log phase and transferred to SD(‐N) at time 0. At the indicated time points, 3′‐NMPs (C) were analyzed by LC/MS as described in . The results are presented as normalized intensities on the basis of the peak height of each metabolite in wild‐type cells. Note that 3′‐NMPs in pho8Δ are presented in a different scale. All data are means of triplicates. The error bars represent the standard deviation."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "Expression", "and", "localization", "of", "Rny1", "and", "Pho8", ".", "Wild", "‐", "type", "cells", "and", "atg2Δ", "cells", "expressing", "Rny1", "‐", "GFP", "or", "Pho8", "‐", "GFP", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", ".", "After", "2", "h", "of", "starvation", ",", "GFP", "‐", "tagged", "proteins", "were", "observed", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "A", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "A", ",", "B", "Expression", "and", "localization", "of", "Rny1", "and", "Pho8", ".", "Wild", "‐", "type", "cells", "and", "atg2", "∆", "cells", "expressing", "Rny1", "‐", "GFP", "or", "Pho8", "‐", "GFP", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", ".", "After", "2", "h", "of", "starvation", ",", "GFP", "‐", "tagged", "proteins", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "with", "anti", "‐", "GFP", "antibody", "(", "B", ")", ".", "C", "Detection", "of", "free", "RNA", ".", "Wild", "‐", "type", ",", "atg2", "∆", ",", "rny1", "∆", ",", "and", "rny1", "∆", "atg2", "∆", "cells", "grown", "in", "SD", "(", "left", ")", "or", "SD", "(", "‐", "N", ")", "for", "2", "h", "(", "right", ")", "were", "stained", "with", "FM4", "‐", "64", "and", "GR", "Green", "and", "observed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B Expression and localization of Rny1 and Pho8. Wild‐type cells and atg2Δ cells expressing Rny1‐GFP or Pho8‐GFP were grown in SD to mid‐log phase and transferred to SD(‐N). After 2 h of starvation, GFP‐tagged proteins were observed by fluorescence microscopy (A). Scale bar, 5 μm.A, B Expression and localization of Rny1 and Pho8. Wild‐type cells and atg2∆ cells expressing Rny1‐GFP or Pho8‐GFP were grown in SD to mid‐log phase and transferred to SD(‐N). After 2 h of starvation, GFP‐tagged proteins were analyzed by Western blot with anti‐GFP antibody (B).C Detection of free RNA. Wild‐type, atg2∆, rny1∆, and rny1∆atg2∆ cells grown in SD (left) or SD(‐N) for 2 h (right) were stained with FM4‐64 and GR Green and observed by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "5A", "Time", "‐", "dependent", "change", "in", "nucleoside", "levels", "after", "nitrogen", "starvation", ".", "Wild", "‐", "type", ",", "atg2", "∆", ",", "ubp3", "∆", ",", "and", "bre5", "∆", "cells", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", "at", "time", "0", ".", "Metabolites", "were", "analyzed", "by", "LC", "/", "MS", "as", "described", "in", ".", "The", "results", "are", "presented", "as", "normalized", "intensities", "on", "the", "basis", "of", "the", "peak", "height", "of", "each", "metabolite", "in", "wild", "‐", "type", "cells", ".", "All", "data", "are", "means", "of", "triplicates", ".", "The", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "B", "Detection", "of", "free", "RNA", "within", "cells", ".", "rny1", "∆", ",", "rny1", "∆", "atg2", "∆", ",", "rny1", "∆", "ubp3", "∆", ",", "and", "rny1", "∆", "bre5", "∆", "cells", "grown", "in", "SD", "(", "‐", "N", ")", "for", "2", "h", "were", "stained", "with", "FM4", "‐", "64", "and", "GR", "Green", "and", "observed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Time‐dependent change in nucleoside levels after nitrogen starvation. Wild‐type, atg2∆, ubp3∆, and bre5∆ cells were grown in SD to mid‐log phase and transferred to SD(‐N) at time 0. Metabolites were analyzed by LC/MS as described in . The results are presented as normalized intensities on the basis of the peak height of each metabolite in wild‐type cells. All data are means of triplicates. The error bars represent the standard deviation.B Detection of free RNA within cells. rny1∆, rny1∆atg2∆, rny1∆ubp3∆, and rny1∆bre5∆ cells grown in SD(‐N) for 2 h were stained with FM4‐64 and GR Green and observed by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "6B", ",", "C", "Nucleosides", "(", "B", ")", "and", "nucleobases", "(", "C", ")", "within", "the", "cells", ".", "Wild", "‐", "type", "and", "atg2", "∆", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", "at", "time", "0", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "the", "cells", "were", "collected", ";", "their", "metabolites", "were", "extracted", ",", "and", "the", "nucleosides", "and", "nucleobases", "were", "analyzed", "by", "LC", "/", "MS", ".", "The", "level", "of", "each", "nucleoside", "and", "base", "is", "presented", "as", "its", "absolute", "concentration", ",", "as", "described", "in", "and", "Supplementary", "Methods", ".", "All", "data", "are", "means", "of", "duplicates", "except", "the", "wild", "‐", "type", "strain", "at", "1", "h", ".", "D", ",", "E", "Nucleosides", "(", "D", ")", "and", "nucleobases", "(", "E", ")", "in", "the", "medium", ".", "The", "culture", "medium", "of", "the", "above", "cultures", "was", "filtered", ",", "and", "nucleosides", "and", "nucleobases", "were", "directly", "analyzed", "by", "LC", "/", "MS", "as", "described", "in", "and", "Supplementary", "Methods", ".", "All", "data", "are", "means", "of", "duplicates", ".", "F", ",", "G", "Destinations", "of", "nucleosides", "and", "bases", ".", "Based", "on", "the", "data", "from", "(", "B", "-", "E", ")", ",", "the", "level", "of", "each", "nucleoside", "and", "base", "in", "cells", "(", "open", "circle", ")", "and", "in", "cells", "and", "medium", "(", "closed", "circle", ")", "of", "wild", "‐", "type", "strain", "were", "estimated", ".", "See", "Supplementary", "Methods", "in", "detail", "(", "flow", "chart", "of", "the", "calculation", "procedure", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B, C Nucleosides (B) and nucleobases (C) within the cells. Wild‐type and atg2∆ were grown in SD to mid‐log phase and transferred to SD(‐N) at time 0. At the indicated time points, the cells were collected; their metabolites were extracted, and the nucleosides and nucleobases were analyzed by LC/MS. The level of each nucleoside and base is presented as its absolute concentration, as described in and Supplementary Methods. All data are means of duplicates except the wild‐type strain at 1 h.D, E Nucleosides (D) and nucleobases (E) in the medium. The culture medium of the above cultures was filtered, and nucleosides and nucleobases were directly analyzed by LC/MS as described in and Supplementary Methods. All data are means of duplicates.F, G Destinations of nucleosides and bases. Based on the data from (B-E), the level of each nucleoside and base in cells (open circle) and in cells and medium (closed circle) of wild‐type strain were estimated. See Supplementary Methods in detail (flow chart of the calculation procedure)."}
{"words": ["Figure", "7Wild", "‐", "type", "and", "atg1Δ", "of", "S", ".", "pombe", "were", "grown", "in", "SD", "to", "mid", "‐", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "‐", "N", ")", "at", "time", "0", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "the", "cells", "were", "collected", ";", "the", "metabolites", "in", "these", "cells", "were", "extracted", "and", "analyzed", "by", "LC", "/", "MS", "as", "described", "in", ".", "The", "results", "are", "presented", "as", "normalized", "intensities", "on", "the", "basis", "of", "peak", "height", "of", "each", "metabolite", "in", "wild", "‐", "type", "cells", ".", "All", "data", "are", "means", "of", "triplicates", ".", "The", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Wild‐type and atg1Δ of S. pombe were grown in SD to mid‐log phase and transferred to SD(‐N) at time 0. At the indicated time points, the cells were collected; the metabolites in these cells were extracted and analyzed by LC/MS as described in . The results are presented as normalized intensities on the basis of peak height of each metabolite in wild‐type cells. All data are means of triplicates. The error bars represent the standard deviation."}
{"words": ["Figure", "1Immunoprecipitation", "was", "performed", "with", "GFP", "-", "binding", "protein", "immobilized", "on", "magnetic", "beads", "using", "extracts", "of", "Arabidopsis", "seedlings", ",", "expressing", "either", "YFP", "-", "MKKK7", "or", "Lti6B", ".", "Seedlings", "were", "treated", "with", "1", "μM", "flg22", "for", "the", "indicated", "time", ".", "YFP", "-", "MKKK7", "and", "Lti6B", "-", "GFP", "were", "detected", "with", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", "while", "FLS2", "was", "detected", "with", "an", "FLS", "-", "specific", "antibody", ".", "Upper", "panel", "shows", "(", "co", ")", "-", "immunoprecipated", "proteins", ",", "lower", "panel", "shows", "input", "levels", "of", "protein", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "position", "of", "proteins", "of", "interest", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunoprecipitation was performed with GFP-binding protein immobilized on magnetic beads using extracts of Arabidopsis seedlings, expressing either YFP-MKKK7 or Lti6B. Seedlings were treated with 1 μM flg22 for the indicated time. YFP-MKKK7 and Lti6B-GFP were detected with an anti-GFP antibody while FLS2 was detected with an FLS-specific antibody. Upper panel shows (co)-immunoprecipated proteins, lower panel shows input levels of protein. Arrowheads indicate the position of proteins of interest."}
{"words": ["Figure", "2Application", "of", "selected", "reaction", "monitoring", "(", "SRM", ")", "mass", "spectrometry", "to", "quantify", "phosphorylated", "peptides", "in", "cell", "extracts", "treated", "with", "1", "μM", "flg22", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "ratio", "of", "endogenous", "phosphopeptide", "versus", "spiked", "-", "in", "synthetic", "phosphopeptide", "normalized", "to", "t", "=", "0", "with", "error", "bars", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ".", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "significant", "difference", "level", "compared", "to", "t", "=", "0", "(", "student", "t", "-", "test", ",", "*", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ">", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ">", "0", ".", "001", ")", ".", "The", "color", "of", "each", "bar", "corresponds", "to", "the", "different", "time", "points", "(", "0", "minutes", "=", "dark", "blue", ",", "5", "minutes", "=", "red", ",", "10", "minutes", "=", "green", ",", "20", "minutes", "=", "purple", ",", "30", "minutes", "=", "light", "blue", ")", ".", "Above", "each", "graph", "is", "the", "protein", "name", "and", "the", "phosphorylated", "residue", "(", "in", "brackets", ")", "is", "indicated", "and", "below", "the", "corresponding", "phosphopeptide", "is", "shown", "with", "the", "Serine", "(", "S", ")", ",", "Threonine", "(", "T", ")", "or", "Tyrosine", "(", "Y", ")", "phosphorylation", "site", "indicated", "by", "\"", "[", "+", "80", "]", "\"", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Application of selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry to quantify phosphorylated peptides in cell extracts treated with 1 μM flg22. Bars represent the mean ratio of endogenous phosphopeptide versus spiked-in synthetic phosphopeptide normalized to t = 0 with error bars ± SEM (n=3.). Asterisks indicate significant difference level compared to t = 0 (student t-test, *>0.05, **>0.01 and ***>0.001). The color of each bar corresponds to the different time points (0 minutes = dark blue, 5 minutes = red, 10 minutes = green, 20 minutes = purple, 30 minutes = light blue). Above each graph is the protein name and the phosphorylated residue (in brackets) is indicated and below the corresponding phosphopeptide is shown with the Serine (S), Threonine (T) or Tyrosine (Y) phosphorylation site indicated by \"[+80]\"."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Immunoblot", "analyses", "showing", "MAPK", "phosphorylation", "after", "flg22", "induction", "in", "Col", "-", "0", "and", "in", "mkkk7", ".", "Protein", "extracts", "were", "made", "from", "seedlings", "treated", "with", "1", "μM", "flg22", "and", "samples", "were", "taken", "at", "t", "=", "0", ",", "10", "and", "30", "min", "post", "induction", ".", "The", "p44", "/", "42", "antibody", "was", "used", "to", "detect", "phosphorylated", "MAPKs", ".", "Position", "of", "the", "individual", "phosphorylated", "MAPKs", "is", "indicated", "at", "the", "right", ".", "Equal", "loading", "of", "proteins", "is", "shown", "with", "an", "α", "-", "Actin", "antibody", "as", "a", "loading", "control", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "done", "with", "identical", "resultsB", ")", "MPK6", "phosphorylation", "is", "specifically", "enhanced", "in", "mkkk7", ".", "Comparison", "of", "phosphopeptide", "abundances", "from", "selected", "MAP", "kinases", "in", "Col", "-", "0", "(", "blue", ")", "and", "mkkk7", "(", "red", ")", "seedlings", "at", "t", "=", "0", "min", "and", "t", "=", "10", "min", "after", "1", "μM", "flagellin", "treatment", "by", "selected", "reaction", "monitoring", "(", "SRM", ")", "mass", "spectrometry", ".", "Phosphopeptide", "corresponding", "to", "MKKK7", "are", "only", "detectable", "in", "Col", "-", "0", "seedlings", "and", "are", "non", "-", "detectable", "(", "ND", ")", "in", "mkkk7", ".", "Bars", "represent", "means", "of", "measured", "peptide", "areas", "(", "sum", "of", "all", "transition", "areas", ")", "for", "three", "biological", "replicates", ",", "with", "error", "bars", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "significant", "difference", "between", "Col", "-", "0", "and", "mkkk7", "at", "individual", "time", "points", "(", "student", "t", "-", "test", ",", "*", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ">", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ">", "0", ".", "001", ")", ".", "ND", "indicates", "integration", "of", "an", "area", "without", "transitions", "significantly", "above", "background", ".", "Above", "each", "graph", "the", "protein", "name", "and", "the", "phosphorylated", "residue", "(", "in", "brackets", ")", "is", "indicated", "as", "well", "as", "the", "corresponding", "phosphopeptide", "sequence", ".", "Serine", "(", "S", ")", ",", "Threonine", "(", "T", ")", "or", "Tyrosine", "(", "Y", ")", "phosphorylation", "is", "indicated", "by", "\"", "[", "+", "80", "]", "\"", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Immunoblot analyses showing MAPK phosphorylation after flg22 induction in Col-0 and in mkkk7. Protein extracts were made from seedlings treated with 1 μM flg22 and samples were taken at t=0, 10 and 30 min post induction. The p44/42 antibody was used to detect phosphorylated MAPKs. Position of the individual phosphorylated MAPKs is indicated at the right. Equal loading of proteins is shown with an α-Actin antibody as a loading control (bottom panel). Three biological replicates were done with identical resultsB) MPK6 phosphorylation is specifically enhanced in mkkk7. Comparison of phosphopeptide abundances from selected MAP kinases in Col-0 (blue) and mkkk7 (red) seedlings at t = 0 min and t = 10 min after 1 μM flagellin treatment by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Phosphopeptide corresponding to MKKK7 are only detectable in Col-0 seedlings and are non-detectable (ND) in mkkk7. Bars represent means of measured peptide areas (sum of all transition areas) for three biological replicates, with error bars ± SEM (n=3). Asterisks indicate significant difference between Col-0 and mkkk7 at individual time points (student t-test, *>0.05, **>0.01 and ***>0.001). ND indicates integration of an area without transitions significantly above background. Above each graph the protein name and the phosphorylated residue (in brackets) is indicated as well as the corresponding phosphopeptide sequence. Serine (S), Threonine (T) or Tyrosine (Y) phosphorylation is indicated by \"[+80]\"."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Transient", "expression", "analysis", "in", "Arabidopsis", "mesophyll", "protoplasts", "shows", "enhanced", "defense", "gene", "expression", "in", "mkkk7", "protoplasts", "after", "flg22", "treatment", ".", "Protoplasts", "were", "isolated", "from", "4", "week", "old", "plants", "and", "transfected", "with", "pWRKY29", ":", "fLUC", "(", "WRKY29", ")", "or", "pFRK1", ":", "fLUC", "(", "FRK1", ")", "constructs", "together", "with", "35S", ":", "rLUC", ",", "as", "indicated", "in", "the", "graph", ".", "Protoplasts", "were", "treated", "for", "4", "hrs", "with", "10", "µM", "flg22", "or", "mock", "treated", "as", "indicated", ".", "The", "horizontal", "axis", "indicates", "the", "treatment", "while", "the", "vertical", "axis", "represents", "expression", "levels", "relative", "to", "the", "mock", "treated", "control", "sample", ",", "as", "fold", "induction", ".", "All", "measurements", "were", "normalized", "to", "the", "rLUC", "activity", ".", "Bars", "represent", "means", "±", "STDEV", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Experiment", "was", "repeated", "6", "times", "with", "similar", "results", ".", "B", ")", "WRKY29", "transcripts", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "flg22", "treated", "leaf", "material", ".", "Leaf", "strips", "of", "Col", "-", "0", "and", "mkkk7", "were", "treated", "with", "1", "µM", "flg22", "for", "t", "=", "0", ",", "1", ",", "2", ",", "and", "4h", ".", "WRKY29", "transcripts", "were", "normalized", "against", "Ubiquitin", "transcript", "as", "described", "before", "[", "62", "]", ".", "Bars", "represent", "mean", "value", "and", "error", "bars", "show", "SE", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "student", "t", "-", "test", ")", ".", "C", ")", "FRK1", "transcripts", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "flg22", "treated", "leaf", "material", ".", "Leaf", "strips", "of", "Col", "-", "0", "and", "mkkk7", "were", "treated", "with", "1", "µM", "flg22", "fort", "=", "0", ",", "1", ",", "2", ",", "and", "4h", ".", "FRK1", "transcripts", "were", "normalized", "against", "Ubiquitin", "transcript", "as", "described", "before", "[", "62", "]", ".", "Bars", "represent", "mean", "value", "and", "error", "bars", "show", "SE", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "student", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Transient expression analysis in Arabidopsis mesophyll protoplasts shows enhanced defense gene expression in mkkk7 protoplasts after flg22 treatment. Protoplasts were isolated from 4 week old plants and transfected with pWRKY29:fLUC (WRKY29) or pFRK1:fLUC(FRK1) constructs together with 35S:rLUC, as indicated in the graph. Protoplasts were treated for 4 hrs with 10 µM flg22 or mock treated as indicated. The horizontal axis indicates the treatment while the vertical axis represents expression levels relative to the mock treated control sample, as fold induction. All measurements were normalized to the rLUC activity. Bars represent means ± STDEV (n=2). Experiment was repeated 6 times with similar results.B) WRKY29 transcripts measured by qRT-PCR in flg22 treated leaf material. Leaf strips of Col-0 and mkkk7 were treated with 1 µM flg22 for t=0, 1, 2, and 4h. WRKY29 transcripts were normalized against Ubiquitin transcript as described before [62]. Bars represent mean value and error bars show SE (n=3). (* p<0.05, ** p<0.01, student t-test).C) FRK1 transcripts measured by qRT-PCR in flg22 treated leaf material. Leaf strips of Col-0 and mkkk7 were treated with 1 µM flg22 fort=0, 1, 2, and 4h. FRK1 transcripts were normalized against Ubiquitin transcript as described before [62]. Bars represent mean value and error bars show SE (n=3). (* p<0.05, ** p<0.01, student t-test)."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Transient", "co", "-", "expression", "of", "MKKK7", "in", "Arabidopsis", "mesophyll", "protoplasts", "shows", "suppression", "of", "flg22", "-", "induced", "WRKY29", "gene", "expression", ".", "Protoplasts", "were", "transfected", "with", "pWRKY29", ":", "fLUC", ",", "35S", ":", "rLUC", "and", "indicated", "overexpression", "constructs", "of", "MKKK7", "(", "OE", "-", "MKKK7", ",", "OE", "-", "MKKK7AA", "or", "OE", "-", "MKKK7DD", ")", "as", "indicated", "on", "the", "horizontal", "axis", ".", "Protoplasts", "were", "treated", "with", "10", "μM", "flg22", "or", "mock", "treated", "for", "4", "hrs", ".", "All", "measurements", "were", "normalized", "to", "the", "rLUC", "activity", "and", "expression", "is", "relative", "to", "the", "mock", "treated", "control", "sample", ",", "shown", "as", "fold", "induction", "on", "the", "vertical", "axis", ".", "Results", "shown", "are", "means", "±", "STDEV", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "At", "least", "two", "biological", "replicates", "were", "done", "with", "similar"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Transient co-expression of MKKK7 in Arabidopsis mesophyll protoplasts shows suppression of flg22-induced WRKY29 gene expression. Protoplasts were transfected with pWRKY29:fLUC, 35S:rLUC and indicated overexpression constructs of MKKK7 (OE-MKKK7, OE-MKKK7AA or OE-MKKK7DD) as indicated on the horizontal axis. Protoplasts were treated with 10 μM flg22 or mock treated for 4 hrs. All measurements were normalized to the rLUC activity and expression is relative to the mock treated control sample, shown as fold induction on the vertical axis. Results shown are means ± STDEV (n=2). At least two biological replicates were done with similar results"}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Four", "-", "week", "-", "old", "seedlings", "were", "dipped", "into", "a", "suspension", "containing", "virulent", "Pst", "DC3000", "and", "72", "h", "later", "the", "disease", "symptoms", "were", "scored", ".", "Data", "represents", "mean", "values", "±", "SEM", "(", "n", "=", "20", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "paired", "t", "-", "test", ")", ".", "Three", "biological", "experiments", "were", "done", "showing", "similar", "results", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "bacterial", "growth", "in", "Arabidopsis", "lines", "Col", "-", "0", ",", "mkkk7", "and", "p35S", ":", "MKKK7", "-", "GFP", "in", "the", "mkkk7", "background", ".", "Four", "to", "five", "-", "week", "-", "old", "plants", "were", "pressure", "-", "infiltrated", "with", "virulent", "Pst", "DC3000", "and", "at", "indicated", "time", "points", "6", "samples", "were", "harvested", "and", "bacteria", "re", "-", "isolated", "on", "selective", "media", ".", "The", "number", "of", "colony", "forming", "units", "(", "cfu", "/", "cm2", ")", "was", "determined", "at", "t", "=", "0", ",", "2", "and", "3days", "post", "inoculation", "(", "dpi", ")", ".", "Data", "represents", "mean", "values", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "paired", "t", "-", "test", ")", ".", "Experiments", "were", "done", "at", "least", "twice", "with", "similar", "results", ".", "C", ")", "Disease", "symptom", "development", "in", "Pst", "-", "infected", "lines", "with", "estradiol", "inducible", "constructs", "of", "ind", "-", "MKKK7AA", "L8", ",", "ind", "-", "MKKK7AA", "L10", ",", "ind", "-", "MKKK7DD", "L1", "and", "ind", "-", "MKKK7DD", "L3", ".", "Two", "independent", "transgenic", "lines", "for", "each", "construct", "were", "grown", "under", "short", "-", "day", "conditions", "and", "disease", "symptoms", "were", "scored", "3", "dpi", ".", "Data", "represents", "mean", "values", "±", "SEM", "(", "n", "=", "20", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "paired", "t", "-", "test", ")", ".", "The", "vertical", "axis", "represents", "the", "percentage", "disease", "symptoms", ".", "Experiments", "were", "done", "at", "least", "twice", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Four-week-old seedlings were dipped into a suspension containing virulent Pst DC3000 and 72 h later the disease symptoms were scored. Data represents mean values ± SEM (n=20;***, p<0.001; paired t-test). Three biological experiments were done showing similar results.B) Quantification of bacterial growth in Arabidopsis lines Col-0, mkkk7 and p35S:MKKK7-GFP in the mkkk7 background. Four to five-week-old plants were pressure-infiltrated with virulent Pst DC3000 and at indicated time points 6 samples were harvested and bacteria re-isolated on selective media. The number of colony forming units (cfu/cm2) was determined at t=0, 2 and 3days post inoculation (dpi). Data represents mean values ± SEM (n=6; **, p<0.01; paired t-test). Experiments were done at least twice with similar results.C) Disease symptom development in Pst-infected lines with estradiol inducible constructs of ind-MKKK7AA L8, ind-MKKK7AA L10, ind-MKKK7DD L1 and ind-MKKK7DD L3. Two independent transgenic lines for each construct were grown under short-day conditions and disease symptoms were scored 3 dpi. Data represents mean values ± SEM (n=20; *, p<0.05; **, p<0.01; paired t-test). The vertical axis represents the percentage disease symptoms. Experiments were done at least twice with similar results."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "Effect", "of", "100", "nM", "flg22", "treatment", "on", "ROS", "burst", "measured", "in", "5", "week", "old", "plants", "of", "Col", "-", "0", "and", "mkkk7", ".", "B", ")", "Effect", "of", "100", "nM", "flg22", "treatment", "on", "the", "ROS", "burst", "measured", "in", "5", "week", "old", "plants", "of", "Col", "-", "0", "and", "two", "independent", "inducible", "MKKK7AA", "transgenic", "lines", ".", "C", ")", "Effect", "of", "100", "nM", "flg22", "treatment", "on", "the", "ROS", "burst", "measured", "in", "5", "weeks", "old", "plants", "of", "Col", "-", "0", "and", "two", "independent", "inducible", "MKKK7DD", "transgenic", "lines", ".", "Graphs", "represent", "means", "with", "error", "bars", "±", "SEM", "(", "n", "=", "24", ")", ".", "The", "vertical", "axis", "represents", "the", "relative", "increase", "in", "ROS", "production", "(", "photon", "counts", ")", "after", "PAMP", "treatment", ".", "At", "least", "three", "biological", "replicate", "experiments", "were", "done", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) Effect of 100 nM flg22 treatment on ROS burst measured in 5 week old plants of Col-0 and mkkk7.B) Effect of 100 nM flg22 treatment on the ROS burst measured in 5 week old plants of Col-0 and two independent inducible MKKK7AA transgenic lines.C) Effect of 100 nM flg22 treatment on the ROS burst measured in 5 weeks old plants of Col-0 and two independent inducible MKKK7DD transgenic lines. Graphs represent means with error bars ± SEM (n=24). The vertical axis represents the relative increase in ROS production (photon counts) after PAMP treatment. At least three biological replicate experiments were done with similar results."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "NDUFS3", "protein", "levels", "in", "homogenates", "from", "quadriceps", "muscle", "of", "15", "-", "days", "old", "(", "upper", "panel", ")", "and", "1", "-", "month", "old", "animals", "(", "lower", "panel", ")", ".", "(", "B", ")", "Body", "weight", "comparison", "over", "time", "of", "Ndufs3", "smKO", "male", "mice", "(", "filled", "blue", "squares", ";", "n", "=", "14", ")", "and", "age", "matched", "wild", "-", "type", "(", "WTFlx", ";", "n", "=", "15", ")", "males", "(", "empty", "blue", "squares", ")", ".", "Ndufs3", "smKO", "females", "(", "filled", "red", "circles", ")", "showed", "similar", "results", "(", "n", "=", "10", "for", "smKO", ",", "and", "n", "=", "12", "for", "WTFlx", "group", ")", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ";", "(", "C", ")", "Representative", "image", "of", "a", "smKO", "male", "Ndfu3s3", "-", "smKO", "mouse", "and", "a", "WTFlx", "littermate", "of", "6", "-", "month", "old", "showing", "decreased", "body", "weight", ".", "(", "D", ")", "Survival", "curve", "of", "Ndufs3", "smKO", "female", "mice", "(", "red", "line", ")", "and", "males", "(", "blue", "line", ")", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "Test", ";", "p", "=", "0", ".", "0010", "for", "males", "(", "n", "=", "19", ")", ",", "and", "p", "=", "0", ".", "0004", "for", "females", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "(", "E", ")", "Nocturnal", "ambulatory", "activity", "of", "Ndufs3", "smKO", "and", "aged", "matched", "wild", "-", "type", "littermates", "from", "1", "and", "2", "months", "old", "male", "mice", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "to", "determine", "the", "level", "of", "statistical", "difference", ".", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "F", ")", "The", "number", "of", "falls", "in", "the", "treadmill", "of", "WTFlx", "and", "Ndufs3", "smKO", "male", "mice", ",", "starting", "at", "2", "months", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Bars", "represent", "means", "±", "standard", "error", "(", "SE", ")", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "to", "determine", "the", "level", "of", "statistical", "difference", ".", "n", ".", "s", ".", "-", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "G", ")", "Rotarod", "performed", "by", "Ndufs3", "smKO", "and", "wild", "-", "type", "male", "mice", ".", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Bars", "represent", "means", "±", "standard", "error", "(", "SE", ")", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "to", "determine", "the", "level", "of", "statistical", "difference", ".", "n", ".", "s", ".", "-", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Western blot analysis of NDUFS3 protein levels in homogenates from quadriceps muscle of 15-days old (upper panel) and 1-month old animals (lower panel).(B) Body weight comparison over time of Ndufs3 smKO male mice (filled blue squares; n=14) and age matched wild-type (WTFlx; n=15) males (empty blue squares). Ndufs3 smKO females (filled red circles) showed similar results (n=10 for smKO, and n=12 for WTFlx group). P values were calculated by Student's t test;(C) Representative image of a smKO male Ndfu3s3-smKO mouse and a WTFlx littermate of 6-month old showing decreased body weight.(D) Survival curve of Ndufs3 smKO female mice (red line) and males (blue line). P values were calculated using Log-rank (Mantel-Cox) Test; p=0.0010 for males (n=19), and p=0.0004 for females (n=10).(E) Nocturnal ambulatory activity of Ndufs3 smKO and aged matched wild-type littermates from 1 and 2 months old male mice. P values were calculated by Student's t test. P values were calculated by Student's t test to determine the level of statistical difference. ; *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.0001.(F) The number of falls in the treadmill of WTFlx and Ndufs3 smKO male mice, starting at 2 months (n=8). Bars represent means ± standard error (SE). P values were calculated by Student's t test to determine the level of statistical difference. n.s.-not significant; *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.0001.(G) Rotarod performed by Ndufs3 smKO and wild-type male mice. (n=8). Bars represent means ± standard error (SE). P values were calculated by Student's t test to determine the level of statistical difference. n.s.-not significant; *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.0001."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "image", "of", "quadriceps", "from", "WTFlx", "and", "Ndufs3", "smKO", "animals", "of", "8", "months", "of", "age", ".", "Muscle", "weight", "from", "Ndufs3", "smKO", "males", "(", "black", "bar", ")", "and", "wild", "-", "type", "mice", "(", "white", "bar", ")", "from", "6", ",", "and", "8", "months", "of", "age", "(", "n", "=", "5", "each", "group", ")", ".", "Bars", "represent", "means", "±", "standard", "error", "(", "SEM", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "H", "&", "E", ",", "COX", ",", "and", "SDH", "staining", "of", "quadriceps", "from", "WTFlx", "and", "Ndufs3", "-", "Mlc1f", "smKO", "at", "8", "months", "old", ".", "(", "C", ")", "Cross", "-", "sectional", "area", "(", "CSA", ")", "of", "quadriceps", "muscle", "fibers", ".", "A", "minimum", "of", "100", "fibers", "/", "sample", "were", "analyzed", "(", "n", "=", "3", "/", "genotype", ")", ".", "The", "percentage", "of", "central", "nuclei", "in", "skeletal", "muscle", "fibers", "of", "quadriceps", "muscle", "of", "WTFlx", "and", "Ndufs3", "smKO", "at", "8", "months", "(", "n", "=", "3", "mice", "for", "WTFlx", "and", "n", "=", "4", "mice", "for", "Ndufs3", "smKO", ")", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "D", ")", "Serum", "lactate", "levels", "of", "WTFlx", "and", "Ndufs3", "-", "smKO", "animals", "at", "different", "ages", ".", "Ndufs3", "smKO", "male", "mice", "(", "filled", "black", "squares", ")", "showed", "increased", "levels", "compared", "to", "matched", "WTFlx", "males", "(", "empty", "black", "squares", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "(", "E", ")", "BN", "-", "PAGE", "In", "-", "Gel", "Activities", "of", "Complex", "I", "and", "IV", "measured", "in", "homogenates", "from", "quadriceps", "of", "wild", "-", "type", "and", "Ndufs3", "-", "Mlc1f", "smKO", "animals", "at", "2", "and", "4", "months", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "Western", "blots", "of", "muscle", "homogenates", "(", "quadriceps", ")", "of", "WTFlx", "and", "Ndufs3", "-", "Mlc1f", "smKO", "animals", "at", "different", "ages", "(", "2", "and", "4", "months", ",", "respectively", ")", "using", "antibodies", "against", "PGC", "-", "1α", ",", "COX1", "(", "complex", "IV", "subunit", ")", ",", "NDUFS3", ",", "VDAC1", ",", "SDHA", "(", "complex", "II", "subunit", ")", ",", "and", "β", "-", "actin", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "western", "blots", "in", "panels", "F", "and", "G", ".", "Bars", "represent", "means", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "for", "each", "group", ".", "P", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative image of quadriceps from WTFlx and Ndufs3 smKO animals of 8 months of age. Muscle weight from Ndufs3 smKO males (black bar) and wild-type mice (white bar) from 6, and 8 months of age (n=5 each group). Bars represent means ± standard error (SEM).(B) Representative H&E, COX, and SDH staining of quadriceps from WTFlx and Ndufs3-Mlc1f smKO at 8 months old.(C) Cross-sectional area (CSA) of quadriceps muscle fibers. A minimum of 100 fibers/sample were analyzed (n =3/genotype). The percentage of central nuclei in skeletal muscle fibers of quadriceps muscle of WTFlx and Ndufs3 smKO at 8 months (n =3 mice for WTFlx and n=4 mice for Ndufs3 smKO). P values were calculated by Student's t test.(D) Serum lactate levels of WTFlx and Ndufs3-smKO animals at different ages. Ndufs3 smKO male mice (filled black squares) showed increased levels compared to matched WTFlx males (empty black squares). Error bars represent SEM.(E) BN-PAGE In-Gel Activities of Complex I and IV measured in homogenates from quadriceps of wild-type and Ndufs3-Mlc1f smKO animals at 2 and 4 months.(F-G) Western blots of muscle homogenates (quadriceps) of WTFlx and Ndufs3-Mlc1f smKO animals at different ages (2 and 4 months, respectively) using antibodies against PGC-1α, COX1 (complex IV subunit), NDUFS3, VDAC1, SDHA (complex II subunit), and β-actin. (H) Quantification of the western blots in panels F and G. Bars represent means ±SEM of n=4 for each group. P values were determined by Student's t test."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "The", "KO", "-", "GFP", "mouse", "was", "visibly", "smaller", "and", "weaker", "than", "a", "KO", "-", "NDUFS3", "mouse", ",", "at", "7", "months", ".", "(", "D", ")", "Females", "body", "weight", "injected", "with", "rAAV9", "-", "Ndufs3", "(", "heretofore", "referred", "to", "as", "KO", "-", "NDUFS3", ")", "mice", "were", "similar", "to", "WTFlx", "mice", "body", "weight", "and", "significantly", "higher", "than", "the", "rAAV9", "-", "eGFP", "injected", "mice", "(", "KO", "-", "GFP", ")", "starting", "at", "5", "months", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "post", "-", "test", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "Test", ";", "p", "=", "0", ".", "0016", "(", "KO", "-", "NDUFS3", "vs", "KO", "-", "GFP", ")", ";", "p", "=", "0", ".", "0014", "(", "KO", "-", "GFP", "vs", "WTFlx", ")", ";", "n", "-", "indicates", "the", "number", "of", "animals", "used", "per", "group", ".", "(", "E", ")", "Males", "body", "weight", "of", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "were", "similar", "to", "WTFlx", "mice", ",", "and", "significantly", "different", "from", "KO", "-", "GFP", "from", "4", "months", "onwards", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "post", "-", "test", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "Test", ";", "p", "=", "0", ".", "0016", "(", "KO", "-", "NDUFS3", "vs", "KO", "-", "GFP", ")", ";", "p", "=", "0", ".", "0014", "(", "KO", "-", "GFP", "vs", "WTFlx", ")", ";", "n", "-", "indicates", "the", "number", "of", "animals", "used", "per", "group", ".", "(", "F", ")", "Treadmill", "performance", "was", "significantly", "improved", "in", "the", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "when", "compared", "to", "the", "KO", "-", "GFP", ",", "from", "2", "months", "onwards", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "Test", ";", "p", "=", "0", ".", "0016", "(", "KO", "-", "NDUFS3", "vs", "KO", "-", "GFP", ")", ";", "p", "=", "0", ".", "0014", "(", "KO", "-", "GFP", "vs", "WTFlx", ")", ";", "n", "-", "indicates", "the", "number", "of", "animals", "used", "per", "group", ".", "(", "G", ")", "Four", "limb", "strength", "was", "evaluated", "by", "the", "grid", "hang", "test", ".", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "performed", "significantly", "better", "starting", "at", "3", "months", ",", "when", "compared", "to", "the", "KO", "-", "GFP", "mice", ".", "F", ")", "and", "G", ")", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "-", "test", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "Test", ";", "p", "=", "0", ".", "0016", "(", "KO", "-", "NDUFS3", "vs", "KO", "-", "GFP", ")", ";", "p", "=", "0", ".", "0014", "(", "KO", "-", "GFP", "vs", "WTFlx", ")", ";", "n", "-", "indicates", "the", "number", "of", "animals", "used", "per", "group", ".", "(", "H", ")", "Quadriceps", "and", "gastrocnemius", "wet", "weight", "of", "6", "months", "old", "mice", "was", "similar", "between", "WTFlx", "and", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", ".", "Quadriceps", "weight", "was", "significantly", "increased", "in", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "when", "compared", "to", "KO", "-", "GFP", "injected", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "-", "test", ".", "ns", "-", "not", "significant", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "Test", ";", "p", "=", "0", ".", "0016", "(", "KO", "-", "NDUFS3", "vs", "KO", "-", "GFP", ")", ";", "p", "=", "0", ".", "0014", "(", "KO", "-", "GFP", "vs", "WTFlx", ")", ";", "n", "-", "indicates", "the", "number", "of", "animals", "used", "per", "group", ".", "(", "I", ")", "Survival", "curve", "of", "Ndufs3", "smKO", "mice", "injected", "with", "rAVV9", "-", "Ndufs3", "(", "blue", "line", ")", "and", "with", "rAVV9", "-", "eGFP", "(", "green", "line", ")", ".", "WTFlx", "mice", "are", "depicted", "in", "black", ".", "rAAV9", "-", "Ndufs3", "injections", "extended", "the", "survival", "of", "the", "smKO", "mice", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) The KO-GFP mouse was visibly smaller and weaker than a KO-NDUFS3 mouse, at 7 months.(D) Females body weight injected with rAAV9-Ndufs3 (heretofore referred to as KO-NDUFS3) mice were similar to WTFlx mice body weight and significantly higher than the rAAV9-eGFP injected mice (KO-GFP) starting at 5 months. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Tukey post-test. P values were calculated using Log-rank (Mantel-Cox) Test; p=0.0016 (KO-NDUFS3 vs KO-GFP); p=0.0014 (KO-GFP vs WTFlx); n-indicates the number of animals used per group.(E) Males body weight of KO-NDUFS3 mice were similar to WTFlx mice, and significantly different from KO-GFP from 4 months onwards. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by a Tukey post-test. P values were calculated using Log-rank (Mantel-Cox) Test; p=0.0016 (KO-NDUFS3 vs KO-GFP); p=0.0014 (KO-GFP vs WTFlx); n-indicates the number of animals used per group.(F) Treadmill performance was significantly improved in the KO-NDUFS3 mice when compared to the KO-GFP, from 2 months onwards. P values were calculated using Log-rank (Mantel-Cox) Test; p=0.0016 (KO-NDUFS3 vs KO-GFP); p=0.0014 (KO-GFP vs WTFlx); n-indicates the number of animals used per group.(G) Four limb strength was evaluated by the grid hang test. KO-NDUFS3 mice performed significantly better starting at 3 months, when compared to the KO-GFP mice. F) and G) Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test. P values were calculated using Log-rank (Mantel-Cox) Test; p=0.0016 (KO-NDUFS3 vs KO-GFP); p=0.0014 (KO-GFP vs WTFlx); n-indicates the number of animals used per group.(H) Quadriceps and gastrocnemius wet weight of 6 months old mice was similar between WTFlx and KO-NDUFS3 mice. Quadriceps weight was significantly increased in KO-NDUFS3 mice when compared to KO-GFP injected. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test. ns- not significant. P values were calculated using Log-rank (Mantel-Cox) Test; p=0.0016 (KO-NDUFS3 vs KO-GFP); p=0.0014 (KO-GFP vs WTFlx); n-indicates the number of animals used per group.(I) Survival curve of Ndufs3 smKO mice injected with rAVV9-Ndufs3 (blue line) and with rAVV9-eGFP (green line). WTFlx mice are depicted in black. rAAV9-Ndufs3 injections extended the survival of the smKO mice."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Western", "blots", "of", "6", "months", "old", "quadriceps", "of", "WTFlx", ",", "KO", "and", "KO", "-", "NDUFS3", "injected", "mice", "at", "15", "-", "18", "days", "old", ".", "GFP", "expression", "was", "observed", "only", "in", "the", "KO", "-", "GFP", "mice", ".", "Protein", "loading", "was", "obtained", "with", "stain", "-", "free", "gel", "technology", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "NDUFS3", ",", "COXI", "and", "SDHA", "expression", "levels", "in", "female", "mice", "showed", "in", "A", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "of", "BN", "-", "PAGE", "of", "quadriceps", "of", "6", "-", "month", "-", "old", "mice", ".", "We", "analyzed", ":", "CI", "(", "NDUFA9", ",", "NDUFB8", ")", ",", "CIV", "(", "COX1", ")", ",", "CII", "(", "SDHA", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "BN", "-", "PAGE", "western", "blots", "from", "female", "mice", "shown", "in", "panel", "C", ".", "(", "E", ")", "BN", "-", "PAGE", "in", "-", "gel", "activity", "of", "CI", "and", "CIV", "in", "quadriceps", "of", "6", "-", "month", "-", "old", "mice", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "BN", "-", "PAGE", "in", "-", "gel", "activities", "in", "females", ".", "(", "G", ")", "Total", "mtDNA", "levels", "in", "quadriceps", "from", "males", "and", "females", "were", "determined", "by", "qPCR", "using", "the", "ratio", "ND1", "/", "18S", ".", "Inset", "shows", "the", "appearance", "of", "the", "quadriceps", ",", "reflecting", "normalization", "of", "mitochondrial", "levels", "after", "replacement", "of", "NDUFS3", ".", "(", "H", ")", "Spectrophotometric", "CI", "/", "citrate", "synthase", "activity", "ratio", "was", "measured", "in", "quadriceps", "homogenates", "of", "6", "-", "month", "-", "old", "males", "and", "females", ".", "(", "I", ")", "Plasma", "lactate", "levels", "were", "determined", "as", "described", "in", "methods", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "post", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Western blots of 6 months old quadriceps of WTFlx, KO and KO-NDUFS3 injected mice at 15-18 days old. GFP expression was observed only in the KO-GFP mice. Protein loading was obtained with stain-free gel technology. (B) Quantification of NDUFS3, COXI and SDHA expression levels in female mice showed in A.(C) Western blot of BN-PAGE of quadriceps of 6-month-old mice. We analyzed: CI (NDUFA9, NDUFB8), CIV (COX1), CII (SDHA). (D) Quantification of the BN-PAGE western blots from female mice shown in panel C.(E) BN-PAGE in-gel activity of CI and CIV in quadriceps of 6-month-old mice. (F) Quantification of BN-PAGE in-gel activities in females.(G) Total mtDNA levels in quadriceps from males and females were determined by qPCR using the ratio ND1/18S. Inset shows the appearance of the quadriceps, reflecting normalization of mitochondrial levels after replacement of NDUFS3.(H) Spectrophotometric CI/citrate synthase activity ratio was measured in quadriceps homogenates of 6-month-old males and females.(I) Plasma lactate levels were determined as described in methods. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Tukey post-test."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "The", "smKO", "mice", "group", "that", "received", "retro", "-", "orbital", "injections", "at", "2", "months", "was", "tested", "prior", "to", "the", "rAAV9", "-", "Ndufs3", "injection", "showing", "a", "significant", "exercise", "intolerance", "attested", "by", "the", "number", "of", "falls", "in", "the", "treadmill", ".", "The", "KO", "-", "NDUFS3", "gradually", "recovered", "over", "time", ".", "Individual", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "are", "color", "coded", ".", "Green", "triangles", "represent", "the", "animals", "injected", "with", "GFP", "whereas", "white", "triangles", "represent", "non", "-", "injected", "mice", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "The", "hang", "test", "was", "performed", "in", "symptomatic", "mice", "which", "had", "a", "significant", "decrease", "in", "four", "-", "limb", "muscle", "strength", "and", "coordination", ",", "at", "2", "months", ".", "The", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "showed", "a", "significant", "recovery", "3", ".", "5", "months", "after", "injection", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "KO", "-", "NDUFS3", "muscle", "weight", "was", "similar", "to", "WTFlx", "mice", ",", "and", "it", "was", "significantly", "increased", "in", "gastrocnemius", "when", "compared", "to", "KO", "-", "GFP", "mice", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "-", "test", ".", "(", "E", ")", "Immunohistochemical", "analysis", "with", "NDUFB8", "and", "COX1", "antibodies", "in", "quadriceps", "muscle", "sections", "of", "6", "-", "month", "-", "old", "animals", ".", "The", "expression", "of", "NDUFB8", "(", "representative", "of", "assembled", "CI", ")", "was", "recovered", "in", "the", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "and", "COX1", "expression", "was", "similar", "to", "WTFlx", "animals", ".", "(", "F", ")", "COX", "and", "COX", "/", "SDH", "activity", "staining", "showed", "that", "KO", "-", "NDUFS3", "quadriceps", "were", "reverted", "to", "levels", "found", "in", "wild", "-", "type", ",", "at", "6", "months", ".", "n", "-", "indicates", "the", "number", "of", "animals", "used", "per", "group", ",", "scale", ":", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) The smKO mice group that received retro-orbital injections at 2 months was tested prior to the rAAV9-Ndufs3 injection showing a significant exercise intolerance attested by the number of falls in the treadmill. The KO-NDUFS3 gradually recovered over time. Individual KO-NDUFS3 mice are color coded. Green triangles represent the animals injected with GFP whereas white triangles represent non-injected mice. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test.(C) The hang test was performed in symptomatic mice which had a significant decrease in four-limb muscle strength and coordination, at 2 months. The KO-NDUFS3 mice showed a significant recovery 3.5 months after injection. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test.(D) KO-NDUFS3 muscle weight was similar to WTFlx mice, and it was significantly increased in gastrocnemius when compared to KO-GFP mice. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test.(E) Immunohistochemical analysis with NDUFB8 and COX1 antibodies in quadriceps muscle sections of 6-month-old animals. The expression of NDUFB8 (representative of assembled CI) was recovered in the KO-NDUFS3 mice and COX1 expression was similar to WTFlx animals.(F) COX and COX/SDH activity staining showed that KO-NDUFS3 quadriceps were reverted to levels found in wild-type, at 6 months. n-indicates the number of animals used per group, scale: 100 µm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Western", "blots", "showed", "NDUFS3", "expression", "in", "KO", "-", "NDUFS3", "and", "GFP", "expression", "in", "the", "KO", "-", "GFP", "quadriceps", "samples", ".", "PGC", "-", "1α", "expression", "was", "normalized", "in", "the", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "which", "was", "abnormally", "elevated", "in", "the", "KO", "-", "GFP", ".", "The", "same", "was", "observed", "for", "CIV", "(", "COX1", ")", ",", "CIII", "(", "Core", "2", ")", "and", "CII", "(", "SDHA", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "western", "blots", "showed", "in", "A", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "post", "-", "test", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "(", "C", ")", "BN", "-", "PAGE", "western", "blots", "showed", "recovery", "of", "Complex", "I", "assembly", "into", "complex", "and", "supercomplexes", "in", "KO", "-", "NDUFS3", "injected", "mice", ".", "CIV", "and", "CII", "were", "similar", "to", "wild", "-", "type", "in", "the", "KO", "-", "NDUFS3", "samples", ",", "at", "6", "months", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "BN", "-", "PAGE", "western", "blots", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "post", "-", "test", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "(", "E", ")", "BN", "-", "PAGE", "In", "-", "gel", "CI", "and", "IV", "activities", "of", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "were", "also", "reverted", "to", "levels", "similar", "to", "the", "WTFlx", "samples", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "in", "-", "gel", "activities", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "post", "-", "test", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "(", "G", ")", "Complex", "I", "/", "Citrate", "synthase", "activity", "of", "KO", "-", "NDUFS3", "samples", "measured", "spectrophotometrically", "were", "similar", "to", "WTFlx", "samples", "and", "increased", "in", "comparison", "to", "KO", "-", "GFP", "mice", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "post", "-", "test", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "(", "H", ")", "Total", "mtDNA", "levels", "were", "determined", "by", "qPCR", ".", "MtDNA", "levels", "in", "KO", "-", "NDUFS3", "mice", "were", "decreased", "when", "compared", "to", "KO", "-", "GFP", "mice", "and", "not", "different", "from", "the", "levels", "in", "WTFlx", "mice", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "-", "test", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "post", "-", "test", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ".", "(", "I", ")", "The", "serum", "lactate", "levels", "were", "similar", "to", "WTFlx", "in", "KO", "-", "NDUFS3", "samples", "and", "significantly", "decreased", "when", "compared", "to", "KO", "-", "GFP", "levels", ".", "The", "individual", "KO", "-", "NDUFS3", "animals", "are", "color", "coded", ".", "Green", "triangles", "represent", "the", "animals", "injected", "with", "rAAV9", "-", "eGFP", "whereas", "black", "triangles", "represent", "animals", "which", "did", "not", "receive", "an", "rAAV9", "-", "eGFP", "injection", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "post", "-", "test", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Western blots showed NDUFS3 expression in KO-NDUFS3 and GFP expression in the KO-GFP quadriceps samples. PGC-1α expression was normalized in the KO-NDUFS3 mice which was abnormally elevated in the KO-GFP. The same was observed for CIV (COX1), CIII (Core 2) and CII (SDHA). (B) Quantification of western blots showed in A. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Tukey post-test. Data represent means ±SEM.(C) BN-PAGE western blots showed recovery of Complex I assembly into complex and supercomplexes in KO-NDUFS3 injected mice. CIV and CII were similar to wild-type in the KO-NDUFS3 samples, at 6 months.(D) Quantification of BN-PAGE western blots Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Tukey post-test. Data represent means ±SEM.(E) BN-PAGE In-gel CI and IV activities of KO-NDUFS3 mice were also reverted to levels similar to the WTFlx samples (F) Quantification of in-gel activities. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Tukey post-test. Data represent means ±SEM.(G) Complex I/Citrate synthase activity of KO-NDUFS3 samples measured spectrophotometrically were similar to WTFlx samples and increased in comparison to KO-GFP mice. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Tukey post-test. Data represent means ±SEM.(H) Total mtDNA levels were determined by qPCR. MtDNA levels in KO-NDUFS3 mice were decreased when compared to KO-GFP mice and not different from the levels in WTFlx mice. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Tukey post-test. Data represent means ±SEM.(I) The serum lactate levels were similar to WTFlx in KO-NDUFS3 samples and significantly decreased when compared to KO-GFP levels. The individual KO-NDUFS3 animals are color coded. Green triangles represent the animals injected with rAAV9-eGFP whereas black triangles represent animals which did not receive an rAAV9-eGFP injection. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Tukey post-test. Data represent means ±SEM."}
{"words": ["Figure", "1Population", "doublings", "(", "PDs", ")", "determined", "in", "BJ", "cells", "cultured", "with", "and", "without", "folate", "for", "28", "days", ".", "Example", "of", "a", "single", "combed", "DNA", "molecule", "labeled", "with", "IdU", "(", "green", ")", "and", "CldU", "(", "red", ")", ",", "showing", "replication", "from", "three", "adjacent", "origins", ".", "Horizontal", "white", "arrows", "indicate", "fork", "orientation", ".", "Representative", "examples", "of", "single", "combed", "DNA", "molecules", "from", "control", "cells", "and", "cells", "grown", "for", "7", "days", "in", "a", "folate", "-", "free", "medium", ".", "Fork", "rate", "(", "Kb", "/", "min", ")", "distribution", ".", "Light", "blue", "bars", ":", "BJ", "cells", "(", "n", "=", "126", ")", ";", "black", "bars", ":", "BJ", "cells", "that", "were", "cultured", "for", "7", "days", "in", "a", "folate", "-", "free", "medium", "(", "n", "=", "131", ")", ";", "blue", "bars", ":", "BJ", "cells", "cultured", "for", "7", "days", "in", "a", "folate", "-", "free", "medium", "and", "supplemented", "with", "A", ",", "G", ",", "C", ",", "and", "T", "nucleosides", "for", "the", "last", "48", "h", "of", "the", "experiment", "(", "n", "=", "138", ")", ".", "Box", "plot", "summarizing", "the", "fork", "rate", "distribution", "(", "Kb", "/", "min", ")", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Control", "(", "n", "=", "360", ")", ";", "−", "folate", "(", "n", "=", "372", ")", ";", "−", "folate", "+", "AGCT", "(", "n", "=", "361", ")", ".", "Fork", "distance", "(", "Kb", ")", "distribution", ".", "The", "color", "code", "is", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Control", "(", "n", "=", "72", ")", ";", "−", "folate", "(", "n", "=", "71", ")", ";", "−", "folate", "+", "AGCT", "(", "n", "=", "75", ")", ".", "Box", "plot", "summarizing", "the", "fork", "distance", "distribution", "(", "Kb", ")", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Control", "(", "n", "=", "212", ")", ";", "−", "folate", "(", "n", "=", "215", ")", ";", "−", "folate", "+", "AGCT", "(", "n", "=", "209", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Population doublings (PDs) determined in BJ cells cultured with and without folate for 28 days.Example of a single combed DNA molecule labeled with IdU (green) and CldU (red), showing replication from three adjacent origins. Horizontal white arrows indicate fork orientation.Representative examples of single combed DNA molecules from control cells and cells grown for 7 days in a folate-free medium.Fork rate (Kb/min) distribution. Light blue bars: BJ cells (n = 126); black bars: BJ cells that were cultured for 7 days in a folate-free medium (n = 131); blue bars: BJ cells cultured for 7 days in a folate-free medium and supplemented with A, G, C, and T nucleosides for the last 48 h of the experiment (n = 138).Box plot summarizing the fork rate distribution (Kb/min) of three independent experiments. Control (n = 360); −folate (n = 372); −folate + AGCT (n = 361).Fork distance (Kb) distribution. The color code is as in (D). Control (n = 72); −folate (n = 71); −folate + AGCT (n = 75).Box plot summarizing the fork distance distribution (Kb) of three independent experiments. Control (n = 212); −folate (n = 215); −folate + AGCT (n = 209)."}
{"words": ["Figure", "2A", "Population", "doublings", "(", "PDs", ")", "determined", "in", "BJ", "cells", "cultured", "at", "the", "indicated", "folate", "concentrations", "for", "48", "days", ".", "B", ",", "C", "The", "average", "replication", "rate", "±", "SEM", "(", "B", ")", "and", "the", "average", "fork", "distance", "±", "SEM", "(", "C", ")", "in", "the", "indicated", "folate", "concentrations", "at", "14", "and", "21", "days", ".", "At", "least", "115", "DNA", "fibers", "were", "analyzed", "at", "each", "concentration", "and", "at", "each", "time", "point", "to", "determine", "the", "average", "replication", "rate", ".", "At", "least", "71", "replication", "forks", "were", "analyzed", "at", "each", "concentration", "and", "at", "each", "time", "point", "to", "determine", "the", "average", "fork", "distance", ".", "D", "-", "G", "BJ", "cells", "were", "grown", "for", "14", "days", "in", "100", "nM", "folate", "with", "and", "without", "nucleoside", "supplementation", ".", "(", "D", ")", "Fork", "rate", "(", "Kb", "/", "min", ")", "distribution", ".", "Light", "blue", "bars", ":", "BJ", "cells", "(", "n", "=", "115", ")", ";", "gray", "bars", ":", "BJ", "cells", "that", "were", "cultured", "for", "14", "days", "in", "100", "nM", "folate", "(", "n", "=", "117", ")", ";", "blue", "bars", ":", "BJ", "cells", "cultured", "for", "14", "days", "in", "100", "nM", "folate", "and", "supplemented", "with", "A", ",", "G", ",", "C", ",", "and", "T", "nucleosides", "for", "the", "last", "48", "h", "of", "the", "experiment", "(", "n", "=", "117", ")", ".", "(", "E", ")", "Box", "plot", "summarizing", "the", "fork", "rate", "distribution", "(", "Kb", "/", "min", ")", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Control", "(", "n", "=", "352", ")", ";", "100", "nM", "folate", "(", "n", "=", "364", ")", ";", "100", "nM", "folate", "+", "AGCT", "(", "n", "=", "355", ")", ".", "Main", "box", "represents", "the", "values", "from", "the", "lower", "to", "upper", "quartile", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ".", "The", "middle", "line", "represents", "the", "median", ".", "(", "F", ")", "Fork", "distance", "(", "Kb", ")", "distribution", ".", "The", "color", "code", "is", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Control", "(", "n", "=", "69", ")", ";", "100", "nM", "folate", "(", "n", "=", "74", ")", ";", "100", "nM", "folate", "+", "AGCT", "(", "n", "=", "72", ")", ".", "(", "G", ")", "Box", "plot", "summarizing", "the", "fork", "distance", "distribution", "(", "Kb", ")", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Control", "(", "n", "=", "201", ")", ";", "100", "nM", "folate", "(", "n", "=", "220", ")", ";", "100", "nM", "folate", "+", "AGCT", "(", "n", "=", "228", ")", ".", "Main", "box", "represents", "the", "values", "from", "the", "lower", "to", "upper", "quartile", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ".", "The", "middle", "line", "represents", "the", "median", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Population doublings (PDs) determined in BJ cells cultured at the indicated folate concentrations for 48 days.B, C The average replication rate ± SEM (B) and the average fork distance ± SEM (C) in the indicated folate concentrations at 14 and 21 days. At least 115 DNA fibers were analyzed at each concentration and at each time point to determine the average replication rate. At least 71 replication forks were analyzed at each concentration and at each time point to determine the average fork distance.D-G BJ cells were grown for 14 days in 100 nM folate with and without nucleoside supplementation. (D) Fork rate (Kb/min) distribution. Light blue bars: BJ cells (n = 115); gray bars: BJ cells that were cultured for 14 days in 100 nM folate (n = 117); blue bars: BJ cells cultured for 14 days in 100 nM folate and supplemented with A, G, C, and T nucleosides for the last 48 h of the experiment (n = 117). (E) Box plot summarizing the fork rate distribution (Kb/min) of three independent experiments. Control (n = 352); 100 nM folate (n = 364); 100 nM folate + AGCT (n = 355). Main box represents the values from the lower to upper quartile (25th to 75th percentile). The middle line represents the median. (F) Fork distance (Kb) distribution. The color code is as in (D). Control (n = 69); 100 nM folate (n = 74); 100 nM folate + AGCT (n = 72). (G) Box plot summarizing the fork distance distribution (Kb) of three independent experiments. Control (n = 201); 100 nM folate (n = 220); 100 nM folate + AGCT (n = 228). Main box represents the values from the lower to upper quartile (25th to 75th percentile). The middle line represents the median. **P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "3Cyclin", "E", "-", "expressing", "BJ", "cells", "were", "grown", "for", "7", "days", "with", "and", "without", "folate", ".", "Fork", "rate", "(", "Kb", "/", "min", ")", "distribution", ".", "White", "bars", ":", "BJ", "cells", "expressing", "an", "empty", "vector", "(", "n", "=", "145", ")", ";", "dark", "gray", "bars", ":", "BJ", "cells", "expressing", "the", "cyclin", "E", "oncogene", "(", "n", "=", "147", ")", ";", "light", "gray", "bars", ":", "BJ", "cells", "cultured", "for", "7", "days", "in", "a", "folate", "-", "free", "medium", "(", "n", "=", "135", ")", ";", "black", "bars", ":", "BJ", "cells", "expressing", "the", "cyclin", "E", "oncogene", "cultured", "for", "7", "days", "in", "a", "folate", "-", "free", "medium", "(", "n", "=", "138", ")", ".", "Cyclin", "E", "-", "expressing", "BJ", "cells", "were", "grown", "for", "7", "days", "with", "and", "without", "folate", ".", "Fork", "distance", "distribution", "(", "Kb", ")", ".", "The", "color", "code", "is", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Empty", "vector", "(", "n", "=", "78", ")", ";", "CycE", "(", "n", "=", "79", ")", ";", "empty", "vector", "−", "folate", "(", "n", "=", "71", ")", ";", "CycE", "−", "folate", "(", "n", "=", "80", ")", ".", "Cyclin", "E", "-", "expressing", "BJ", "cells", "were", "grown", "for", "7", "days", "with", "and", "without", "folate", ".", "Percent", "of", "origins", "with", "the", "indicated", "progression", "ratio", "between", "sister", "forks", ".", "Empty", "vector", "(", "n", "=", "158", ")", ";", "CycE", "(", "n", "=", "155", ")", ";", "empty", "vector", "−", "folate", "(", "n", "=", "160", ")", ";", "CycE", "−", "folate", "(", "n", "=", "154", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Cyclin", "E", "-", "expressing", "BJ", "cells", "were", "grown", "for", "7", "days", "with", "and", "without", "folate", ".", "Examples", "of", "nuclei", "with", "γH2AX", "and", "53BP1", "foci", "following", "cyclin", "E", "expression", "(", "CycE", ")", "(", "n", "=", "65", ")", ",", "empty", "vector", "(", "n", "=", "65", ")", ",", "folate", "-", "free", "medium", "for", "7", "days", "(", "empty", "vector", "−", "folate", ")", "(", "n", "=", "67", ")", "or", "oncogene", "expression", "under", "folate", "-", "free", "conditions", "(", "CycE", "−", "folate", ")", "(", "n", "=", "70", ")", ".", "Red", ":", "γH2AX", ";", "green", ":", "53BP1", ";", "blue", ":", "DAPI", "staining", ".", "Percent", "of", "nuclei", "with", "the", "indicated", "number", "of", "γH2AX", "-", "53BP1", "co", "-", "localized", "foci", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Cyclin E-expressing BJ cells were grown for 7 days with and without folate.Fork rate (Kb/min) distribution. White bars: BJ cells expressing an empty vector (n = 145); dark gray bars: BJ cells expressing the cyclin E oncogene (n = 147); light gray bars: BJ cells cultured for 7 days in a folate-free medium (n = 135); black bars: BJ cells expressing the cyclin E oncogene cultured for 7 days in a folate-free medium (n = 138).Cyclin E-expressing BJ cells were grown for 7 days with and without folate. Fork distance distribution (Kb). The color code is as in (A). Empty vector (n = 78); CycE (n = 79); empty vector −folate (n = 71); CycE −folate (n = 80).Cyclin E-expressing BJ cells were grown for 7 days with and without folate. Percent of origins with the indicated progression ratio between sister forks. Empty vector (n = 158); CycE (n = 155); empty vector −folate (n = 160); CycE −folate (n = 154). *P < 0.05.Cyclin E-expressing BJ cells were grown for 7 days with and without folate.Examples of nuclei with γH2AX and 53BP1 foci following cyclin E expression (CycE) (n = 65), empty vector (n = 65), folate-free medium for 7 days (empty vector −folate) (n = 67) or oncogene expression under folate-free conditions (CycE −folate) (n = 70). Red: γH2AX; green: 53BP1; blue: DAPI staining.Percent of nuclei with the indicated number of γH2AX-53BP1 co-localized foci. **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "4Cyclin", "E", "-", "expressing", "BJ", "cells", "grown", "for", "7", "days", "with", "and", "without", "folate", ".", "Immunoblotting", "with", "anti", "-", "phosphorylated", "ATM", "and", "anti", "-", "phosphorylated", "CHK1", "antibodies", ".", "Anti", "-", "β", "-", "catenin", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "Protein", "level", "quantification", ".", "Cyclin", "E", "-", "expressing", "BJ", "cells", "grown", "for", "7", "days", "with", "and", "without", "folate", ".", "Examples", "of", "nuclei", "with", "RAD51", "foci", "following", "cyclin", "E", "expression", "(", "CycE", ")", "(", "n", "=", "67", ")", ",", "empty", "vector", "(", "n", "=", "65", ")", ",", "folate", "-", "free", "medium", "for", "7", "days", "(", "−", "folate", ")", "(", "n", "=", "71", ")", "or", "oncogene", "expression", "under", "folate", "-", "free", "conditions", "(", "CycE", "−", "folate", ")", "(", "n", "=", "75", ")", ".", "Green", ":", "RAD51", ",", "blue", ":", "DAPI", "staining", ".", "Percent", "of", "nuclei", "with", "the", "indicated", "number", "of", "RAD51", "foci", "(", "n", "=", "66", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Cyclin E-expressing BJ cells grown for 7 days with and without folate.Immunoblotting with anti-phosphorylated ATM and anti-phosphorylated CHK1 antibodies. Anti-β-catenin and anti-actin antibodies were used as loading controls.Protein level quantification.Cyclin E-expressing BJ cells grown for 7 days with and without folate.Examples of nuclei with RAD51 foci following cyclin E expression (CycE) (n = 67), empty vector (n = 65), folate-free medium for 7 days (−folate) (n = 71) or oncogene expression under folate-free conditions (CycE −folate) (n = 75). Green: RAD51, blue: DAPI staining.Percent of nuclei with the indicated number of RAD51 foci (n = 66). **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "Cyclin", "E", "-", "and", "Ras", "(", "H", "-", "RasV12", ")", "-", "expressing", "3T3", "cells", "grown", "in", "100", "nM", "folate", "for", "4", "weeks", "and", "then", "two", "additional", "weeks", "in", "a", "normal", "medium", ".", "Control", "cells", "were", "grown", "in", "a", "normal", "medium", "for", "the", "whole", "period", ".", "(", "A", ")", "Examples", "of", "anchorage", "-", "independent", "growth", "in", "soft", "agar", "of", "3T3", "cells", ".", "(", "B", ")", "Average", "number", "of", "colonies", "per", "soft", "agar", "plate", "of", "3T3", "cells", ".", "The", "number", "of", "colonies", "per", "plate", "is", "expressed", "as", "the", "average", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "-", "E", "Ras", "(", "H", "-", "RasV12", ")", "-", "expressing", "MCF10A", "cells", "grown", "in", "100", "nM", "folate", "for", "4", "weeks", "and", "then", "two", "additional", "weeks", "in", "a", "normal", "medium", ".", "Control", "cells", "were", "grown", "in", "a", "normal", "medium", "for", "the", "whole", "period", ".", "(", "C", ")", "Examples", "of", "anchorage", "-", "independent", "growth", "in", "soft", "agar", "of", "MCF10A", "cells", ".", "(", "D", ")", "Average", "number", "of", "colonies", "per", "soft", "agar", "plate", "of", "MCF10A", "cells", ".", "The", "number", "of", "colonies", "per", "plate", "is", "expressed", "as", "the", "average", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Percentage", "of", "tumor", "-", "free", "flanks", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "cell", "injection", ".", "Ten", "mice", "were", "injected", "in", "both", "sides", "in", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B Cyclin E- and Ras (H-RasV12)-expressing 3T3 cells grown in 100 nM folate for 4 weeks and then two additional weeks in a normal medium. Control cells were grown in a normal medium for the whole period. (A) Examples of anchorage-independent growth in soft agar of 3T3 cells. (B) Average number of colonies per soft agar plate of 3T3 cells. The number of colonies per plate is expressed as the average ± SEM from three independent experiments.C-E Ras (H-RasV12)-expressing MCF10A cells grown in 100 nM folate for 4 weeks and then two additional weeks in a normal medium. Control cells were grown in a normal medium for the whole period. (C) Examples of anchorage-independent growth in soft agar of MCF10A cells. (D) Average number of colonies per soft agar plate of MCF10A cells. The number of colonies per plate is expressed as the average ± SEM from three independent experiments. (E) Percentage of tumor-free flanks at the indicated time points after cell injection. Ten mice were injected in both sides in each group."}
{"words": ["Figure", "1C", ")", "Time", "course", "analysis", "of", "triubiquitin", "(", "2", "µM", ")", "hydrolysis", "using", "250", "nM", "SARS2", "PLpro", ",", "resolved", "on", "a", "Coomassie", "stained", "SDS", "-", "PAGE", "gel", ".", "Linkage", "specific", "cleavage", "of", "Lys48", "-", "linked", "triubiquitin", "to", "di", "-", "and", "monoubiquitin", "resembles", "SARS", "PLpro", "activity", "(", "Békés", "et", "al", ",", "2015", ";", "2016", ")", ".", "See", "Source", "Data", "for", "uncropped", "gels", ",", "and", "Appendix", "Fig", "S1B", "-", "D", "for", "gel", "-", "based", "cleavage", "quantification", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C) Time course analysis of triubiquitin (2 µM) hydrolysis using 250 nM SARS2 PLpro, resolved on a Coomassie stained SDS-PAGE gel. Linkage specific cleavage of Lys48-linked triubiquitin to di- and monoubiquitin resembles SARS PLpro activity (Békés et al, 2015; 2016). See Source Data for uncropped gels, and Appendix Fig S1B-D for gel-based cleavage quantification."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Fluorescence", "polarisation", "assays", "against", "ubiquitin", "-", "TAMRA", "and", "ISG15", "-", "TAMRA", "using", "indicated", "SARS2", "PLpro", "variants", "performed", "in", "technical", "triplicate", "and", "n", "=", "2", "for", "each", "mutant", ",", "and", "compared", "to", "wild", "-", "type", "PLpro", "as", "shown", "in", "Appendix", "Fig", "S1A", ".", "Catalytic", "efficiencies", "were", "calculated", "as", "described", "in", "Methods", ".", "C", ")", "Gel", "based", "analysis", "of", "PLpro", "variant", "activity", "against", "Lys48", "-", "triubiquitin", "and", "proISG15", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "duplicate", ",", "see", "Fig", "EV3", "and", "Source", "Data", "for", "uncropped", "gels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Fluorescence polarisation assays against ubiquitin-TAMRA and ISG15-TAMRA using indicated SARS2 PLpro variants performed in technical triplicate and n=2 for each mutant, and compared to wild-type PLpro as shown in Appendix Fig S1A. Catalytic efficiencies were calculated as described in Methods.C) Gel based analysis of PLpro variant activity against Lys48-triubiquitin and proISG15. Experiments were performed in duplicate, see Fig EV3 and Source Data for uncropped gels."}
{"words": ["Figure", "3C", ")", "Calculated", "enzymatic", "efficiencies", "for", "K48", "-", "diUb", "-", "TAMRA", "cleavage", ",", "followed", "by", "fluorescence", "polarisation", "with", "PLpro", "wild", "-", "type", "(", "reproduced", "from", "Appendix", "Fig", "S1A", ")", ",", "and", "PLpro", "F69S", ".", "(", "Left", ")", "Using", "the", "same", "concentration", "range", "of", "SARS2", "PLpro", ",", "the", "F69S", "mutant", "activity", "could", "not", "be", "fitted", ";", "(", "middle", ")", "a", "higher", "concentration", "recovered", "an", "activity", "slightly", "lower", "as", "compared", "to", "PLpro", "cleaving", "ubiquitin", "-", "TAMRA", "(", "45", "vs", ".", "86", "M", "-", "1s", "-", "1", ",", "compare", "Fig", "1D", ",", "Appendix", "Fig", "S1A", ")", ".", "(", "Right", ")", "A", "~", "3", "-", "fold", "lower", "efficiency", "for", "PLpro", "F69S", "cleaving", "ISG15", "-", "TAMRA", "yields", "values", "similar", "to", "cleavage", "of", "ISG15CTD", "-", "TAMRA", "(", "Appendix", "Fig", "S1A", ")", ",", "suggesting", "that", "the", "S2", "site", "contributes", "the", "difference", "in", "binding", "for", "the", "N", "-", "terminal", "Ubl", "-", "fold", ".", "Experiments", "for", "F69S", "were", "performed", "in", "technical", "triplicate", "and", "biological", "duplicate", ";", "wild", "-", "type", "data", "is", "reproduced", "from", "experiments", "shown", "in", "Fig", "1D", ",", "Appendix", "Fig", "S1A", ".", "D", "-", "F", ")", "Gel", "based", "analysis", "showing", "hydrolysis", "time", "course", "of", "triubiquitin", "(", "D", ")", ",", "proISG15CTD", "(", "E", ")", "and", "proISG15", "(", "F", ")", "using", "wild", "-", "type", "PLpro", "(", "left", ",", "wild", "-", "type", "gels", "reproduced", "from", "Appendix", "Fig", "S1B", "-", "D", "to", "enable", "direct", "comparison", ")", "or", "PLpro", "F69S", "(", "right", ")", ".", "PLpro", "F69S", "has", "a", "strong", "effect", "on", "triubiquitin", "hydrolysis", "(", "D", ")", ",", "no", "marked", "effect", "on", "hydrolysis", "of", "proISG15CTD", "(", "E", ")", "and", "reduces", "proISG15", "cleavage", "to", "the", "same", "levels", "as", "proISG15CTD", "(", "compare", "E", ",", "F", ")", ",", "Experiments", "were", "performed", "in", "duplicate", ",", "see", "Source", "Data", "for", "uncropped", "gels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C) Calculated enzymatic efficiencies for K48-diUb-TAMRA cleavage, followed by fluorescence polarisation with PLpro wild-type (reproduced from Appendix Fig S1A), and PLpro F69S. (Left) Using the same concentration range of SARS2 PLpro, the F69S mutant activity could not be fitted; (middle) a higher concentration recovered an activity slightly lower as compared to PLpro cleaving ubiquitin-TAMRA (45 vs. 86 M-1s-1, compare Fig 1D, Appendix Fig S1A). (Right) A ~3-fold lower efficiency for PLpro F69S cleaving ISG15-TAMRA yields values similar to cleavage of ISG15CTD-TAMRA (Appendix Fig S1A), suggesting that the S2 site contributes the difference in binding for the N-terminal Ubl-fold. Experiments for F69S were performed in technical triplicate and biological duplicate; wild-type data is reproduced from experiments shown in Fig 1D, Appendix Fig S1A.D-F) Gel based analysis showing hydrolysis time course of triubiquitin (D), proISG15CTD (E) and proISG15 (F) using wild-type PLpro (left, wild-type gels reproduced from Appendix Fig S1B-D to enable direct comparison) or PLpro F69S (right). PLpro F69S has a strong effect on triubiquitin hydrolysis (D), no marked effect on hydrolysis of proISG15CTD (E) and reduces proISG15 cleavage to the same levels as proISG15CTD (compare E, F), Experiments were performed in duplicate, see Source Data for uncropped gels."}
{"words": ["Figure", "4B", ")", "Hit", "compounds", "and", "compound", "rac5c", "(", "see", "Fig", "5", ")", ",", "were", "further", "assessed", "in", "10", "-", "point", "IC50", "titrations", "using", "the", "Ub", "-", "Rhodamine", "assay", ",", "using", "a", "starting", "concentration", "of", "100", "µM", "serially", "diluted", "in", "1", ":", "3", "steps", ".", "Degree", "of", "inhibition", "is", "shown", "as", "a", "titration", "heat", "-", "map", "from", "dark", "(", "full", "inhibition", ")", "to", "light", "blue", "(", "low", "/", "no", "inhibition", ")", ".", "The", "catalytic", "domain", "of", "human", "USP21", "(", "Ye", "et", "al", ",", "2011", ")", "was", "used", "as", "a", "counterscreen", ".", "Each", "PLpro", "hit", "compound", "showed", "either", "no", "activity", "in", "the", "titration", "analysis", ",", "or", "an", "identical", "inhibition", "profile", "against", "PLpro", "and", "USP21", ",", "suggesting", "assay", "interference", ".", "Rac5c", "was", "specific", "for", "SARS2", "PLpro", "and", "did", "not", "inhibit", "USP21", "even", "at", "the", "highest", "concentration", "of", "100", "µM", ".", "IC50", "assays", "were", "performed", "in", "technical", "triplicate", "in", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B) Hit compounds and compound rac5c (see Fig 5), were further assessed in 10-point IC50 titrations using the Ub-Rhodamine assay, using a starting concentration of 100 µM serially diluted in 1:3 steps. Degree of inhibition is shown as a titration heat-map from dark (full inhibition) to light blue (low/no inhibition). The catalytic domain of human USP21 (Ye et al, 2011) was used as a counterscreen. Each PLpro hit compound showed either no activity in the titration analysis, or an identical inhibition profile against PLpro and USP21, suggesting assay interference. Rac5c was specific for SARS2 PLpro and did not inhibit USP21 even at the highest concentration of 100 µM. IC50 assays were performed in technical triplicate in two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5C", ")", "In", "vitro", "inhibition", "(", "IC50", ")", "for", "rac5c", "inhibiting", "SARS2", "PLpro", ".", "Experiments", "were", "performed", "using", "the", "HTS", "assay", "(", "Fig", "4", ")", ",", "in", "technical", "triplicate", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "A", "geometric", "mean", "was", "used", "to", "determine", "IC50", ".", "D", ")", "Full", "-", "length", "nsp3", "was", "expressed", "from", "a", "C", "-", "terminally", "GFP", "-", "tagged", "vector", "in", "HEK293T", "cells", "and", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "rac5c", "for", "24", "h", ".", "GFP", "is", "released", "from", "the", "C", "-", "terminus", ",", "presumably", "by", "nsp3", "protease", "activity", ".", "Nsp3", "can", "be", "detected", "by", "a", "SARS", "/", "SARS2", "PLpro", "antibody", "(", "see", "Fig", "EV5E", "for", "antibody", "validation", ")", ".", "Lysates", "were", "blotted", "for", "Lys48", "-", "linked", "polyubiquitin", "with", "a", "linkage", "specific", "antibody", "(", "K48", ")", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "duplicate", "with", "similar", "results", ".", "Also", "see", "Fig", "EV5F", ",", "G", "and", "Source", "Data", "for", "uncropped", "blots", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C) In vitro inhibition (IC50) for rac5c inhibiting SARS2 PLpro. Experiments were performed using the HTS assay (Fig 4), in technical triplicate in three independent experiments. A geometric mean was used to determine IC50.D) Full-length nsp3 was expressed from a C-terminally GFP-tagged vector in HEK293T cells and treated with increasing concentrations of rac5c for 24 h. GFP is released from the C-terminus, presumably by nsp3 protease activity. Nsp3 can be detected by a SARS/SARS2 PLpro antibody (see Fig EV5E for antibody validation). Lysates were blotted for Lys48-linked polyubiquitin with a linkage specific antibody (K48). Experiments were performed in duplicate with similar results. Also see Fig EV5F, G and Source Data for uncropped blots."}
{"words": ["Figure", "6B", ")", "Reduction", "in", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "induced", "cytopathic", "effect", "with", "rac5c", ",", "Remdesivir", "(", "RDV", ")", "and", "hydroxychloroquine", "(", "HCQ", ")", "treatment", ".", "DMSO", "0", ".", "3", "%", "(", "v", "/", "v", ")", "was", "required", "to", "keep", "33", "µM", "rac5c", "in", "solution", "(", "see", "Fig", "EV6A", ",", "B", ")", ".", "Mean", "(", "black", "line", ")", "is", "provided", "for", "18", "samples", "in", "each", "group", ",", "representing", "3", "independent", "experiments", "with", "6", "biological", "replicates", "per", "experiment", "across", "the", "different", "concentrations", "of", "rac5c", ".", "HCQ", "data", "is", "pooled", "from", "2", "independent", "experiments", "and", "RDV", "from", "1", "experiment", "using", "6", "biological", "repeats", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "with", "regular", "Dunnet", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", "between", "treatment", "arms", "and", "infected", "/", "vehicle", "treated", "control", "using", "a", "single", "pooled", "variance", ".", "C", ")", "TCID50", "data", ",", "mean", "and", "SD", ",", "for", "one", "representative", "experiment", "from", "B", "with", "6", "technical", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B) Reduction in SARS-CoV-2 induced cytopathic effect with rac5c, Remdesivir (RDV) and hydroxychloroquine (HCQ) treatment. DMSO 0.3% (v/v) was required to keep 33 µM rac5c in solution (see Fig EV6A, B). Mean (black line) is provided for 18 samples in each group, representing 3 independent experiments with 6 biological replicates per experiment across the different concentrations of rac5c. HCQ data is pooled from 2 independent experiments and RDV from 1 experiment using 6 biological repeats. P values were calculated using a one-way ANOVA, with regular Dunnet's post-hoc test for multiple comparisons between treatment arms and infected/vehicle treated control using a single pooled variance.C) TCID50 data, mean and SD, for one representative experiment from B with 6 technical replicates."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "-", "F", ")", "TNF", "-", "α", ",", "Cxcl1", "and", "Cxcl2", "(", "A", ",", "C", ",", "and", "E", "respectively", ")", "were", "measured", "at", "24", "h", "after", "stimulation", "of", "bone", "-", "marrow", "-", "derived", "neutrophils", "(", "5", "x", "105", "cells", ")", "with", "increasing", "concentrations", "of", "bacterial", "nucleic", "acids", "(", "1", ",", "5", ",", "10", "and", "20", "µg", "of", "DNA", "+", "RNA", "in", "equal", "proportions", ")", ",", "HK", "-", "bacteria", "(", "1", ",", "5", ",", "10", "or", "20", "μg", "/", "ml", ")", "or", "live", "bacteria", "(", "MOIs", "of", "2", ",", "5", ",", "10", "and", "20", ")", ".", "LPS", "(", "1", ",", "10", ",", "100", "and", "1000", "ng", "/", "ml", ")", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "stimulus", ".", "(", "B", ",", "D", "and", "F", ")", ",", "Effect", "of", "FPR", "antagonist", "Boc", "-", "2", "on", "GBS", "-", "induced", "TNF", "-", "α", ",", "Cxcl1", "and", "Cxcl2", "production", ",", "respectively", ".", "Bone", "-", "marrow", "-", "derived", "neutrophils", "were", "exposed", "to", "Boc", "-", "2", "(", "50", "µM", ")", "for", "1", "hour", "and", "then", "stimulated", "with", "HK", "-", "GBS", "(", "10", "µg", "/", "ml", ")", "or", "live", "GBS", "(", "MOI", "of", "5", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "+", "standard", "deviations", "of", "measurements", "from", "three", "independent", "experiments", "conducted", "in", "duplicate", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A-F) TNF-α, Cxcl1 and Cxcl2 (A, C, and E respectively) were measured at 24 h after stimulation of bone-marrow-derived neutrophils (5 x 105 cells) with increasing concentrations of bacterial nucleic acids (1, 5, 10 and 20 µg of DNA + RNA in equal proportions), HK-bacteria (1, 5, 10 or 20 μg/ml) or live bacteria (MOIs of 2, 5, 10 and 20). LPS (1, 10, 100 and 1000 ng/ml) was used as a positive control stimulus. (B, D and F), Effect of FPR antagonist Boc-2 on GBS-induced TNF-α, Cxcl1 and Cxcl2 production, respectively. Bone-marrow-derived neutrophils were exposed to Boc-2 (50 µM) for 1 hour and then stimulated with HK-GBS (10 µg/ml) or live GBS (MOI of 5). Data are expressed as means + standard deviations of measurements from three independent experiments conducted in duplicate. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, as determined by unpaired t-test; ns, not significant."}
{"words": ["Figure", "2Bone", "-", "marrow", "-", "derived", "neutrophils", "were", "exposed", "to", "Boc", "-", "2", "(", "10", "µM", ")", "or", "WRW4", "(", "1", ",", "5", "and", "10", "µM", ")", "for", "1", "hour", "and", "then", "stimulated", "with", "HK", "-", "GBS", "(", "10", "µg", "/", "ml", ")", "or", "live", "GBS", "(", "MOI", "of", "5", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "+", "standard", "deviations", "of", "measurements", "from", "three", "independent", "experiments", "conducted", "in", "duplicate", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Bone-marrow-derived neutrophils were exposed to Boc-2 (10 µM) or WRW4 (1, 5 and 10 µM) for 1 hour and then stimulated with HK-GBS (10 µg/ml) or live GBS (MOI of 5). Data are expressed as means + standard deviations of measurements from three independent experiments conducted in duplicate. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, as determined by unpaired t-test; ns, not significant."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "F", ")", "Cxcl1", "and", "Cxcl2", "concentrations", "in", "24", "-", "h", "culture", "supernatants", "of", "neutrophils", "(", "A", "and", "B", ")", ",", "CSF", "-", "polarized", "(", "C", "and", "D", ")", "or", "GM", "-", "CSF", "-", "polarized", "(", "E", "and", "F", ")", "BMDMs", "(", "ΜΦ", ")", "from", "WT", "or", "Fpr", "-", "deficient", "mice", "stimulated", "with", "live", "GBS", "(", "MOI", "of", "2", ",", "5", ",", "and", "10", ")", "or", "HK", "-", "GBS", "(", "10", "µg", "/", "ml", ")", ".", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "stimulus", ".", "Means", "+", "SD", "of", "data", "from", "three", "independent", "experiments", "conducted", "in", "duplicate", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "WT", "mice", ",", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-F) Cxcl1 and Cxcl2 concentrations in 24-h culture supernatants of neutrophils (A and B), CSF-polarized (C and D) or GM-CSF-polarized (E and F) BMDMs (ΜΦ) from WT or Fpr-deficient mice stimulated with live GBS (MOI of 2, 5, and 10) or HK-GBS (10 µg/ml). LPS (100 ng/ml) was used as a positive control stimulus. Means + SD of data from three independent experiments conducted in duplicate. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs WT mice, determined by unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "survival", "rates", "in", "WT", ",", "Fpr1", "and", "Fpr2", "KO", "mice", "after", "i", ".", "p", ".", "challenge", "with", "2x105", "bacteria", ".", "Data", "are", "the", "cumulative", "results", "from", "two", "experiments", ",", "each", "involving", "8", "animals", "per", "group", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "vs", "WT", "mice", ",", "as", "determined", "by", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "means", "+", "SDs", "of", "three", "duplicate", "determinations", ",", "each", "conducted", "in", "a", "different", "animal", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "Neutrophil", "influx", "(", "F", ")", "and", "bacterial", "burden", "(", "G", ")", "in", "peritoneal", "lavage", "fluid", "samples", "collected", "from", "Fpr2", "-", "/", "-", "mice", "at", "3", "h", "after", "i", ".", "p", ".", "challenge", "with", "live", "GBS", "(", "2x107", "CFU", ")", ".", "At", "1h", "post", "-", "challenge", "mice", "were", "inoculated", "i", ".", "p", ".", "with", "1", "μg", "of", "recombinant", "Cxcl1", "or", "Cxcl2", "or", "with", "vehicle", ".", "Data", "information", ":", ",", "individual", "data", "points", "and", "means", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "versus", "vehicle", "treated", "mice", "determined", "by", "unpaired", "t", "test", "or", "Mann", "-", "Whitney", "U"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E), Kaplan-Meier analysis of survival rates in WT, Fpr1 and Fpr2 KO mice after i.p. challenge with 2x105 bacteria. Data are the cumulative results from two experiments, each involving 8 animals per group. **P < 0.01, ****P < 0.0001 vs WT mice, as determined by Kaplan-Meier analysis. Data information: means + SDs of three duplicate determinations, each conducted in a different animal.(F-G) Neutrophil influx (F) and bacterial burden (G) in peritoneal lavage fluid samples collected from Fpr2-/- mice at 3 h after i.p. challenge with live GBS (2x107 CFU). At 1h post-challenge mice were inoculated i.p. with 1 μg of recombinant Cxcl1 or Cxcl2 or with vehicle. Data information: , individual data points and means. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus vehicle treated mice determined by unpaired t test or Mann-Whitney U test"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", "and", "D", ")", ",", "Cxcl2", "release", "in", "neutrophil", "cultures", "stimulated", "with", "combinations", "of", "HK", "-", "bacteria", ",", "GBS", "fMet", "peptides", "or", "TLR", "agonists", ".", "Neutrophils", "were", "exposed", "to", "a", "50", "µM", "concentration", "of", "Fpr", "agonists", "(", "fMIFL", ",", "WKYMVM", "or", "fPep8", "and", "fPep10", ")", "for", "1", "h", "before", "the", "addition", "of", "the", "indicated", "TLR", "agonists", ",", "which", "included", "HK", "-", "GBS", "(", "10", "μg", "/", "ml", ")", ",", "LPS", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", "and", "RNA", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", ".", "In", "some", "cases", ",", "neutrophils", "were", "exposed", "to", "graded", "doses", "(", "10", ",", "20", "and", "50", "µM", ")", "of", "the", "indicated", "Fpr", "agonists", "alone", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "+", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "each", "conducted", "in", "duplicate", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C and D), Cxcl2 release in neutrophil cultures stimulated with combinations of HK-bacteria, GBS fMet peptides or TLR agonists. Neutrophils were exposed to a 50 µM concentration of Fpr agonists (fMIFL, WKYMVM or fPep8 and fPep10) for 1 h before the addition of the indicated TLR agonists, which included HK-GBS (10 μg/ml), LPS (1 µg/ml) and RNA (1 µg /ml). In some cases, neutrophils were exposed to graded doses (10, 20 and 50 µM) of the indicated Fpr agonists alone. Data information: Data are expressed as means + SD from three independent experiments, each conducted in duplicate. **P < 0.01, ***P < 0.001, as determined by unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", ",", "Effect", "of", "actinonin", "on", "Cxcl2", "production", "by", "neutrophils", ".", "Neutrophils", "were", "stimulated", "with", "live", "GBS", "(", "MOI", "5", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "formyl", "peptidase", "inhibitor", "actinonin", "(", "32µg", "/", "ml", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "means", "+", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "conducted", "in", "duplicate", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", ",", "Effect", "of", "treatment", "with", "ROS", "scavengers", "/", "inhibitors", "on", "Cxcl2", "production", ".", "Neutrophils", "were", "treated", "with", "the", "singlet", "oxygen", "scavenger", "MnTBAP", "(", "100", "μM", ")", ",", "the", "hydrogen", "peroxide", "scavenger", "DMTU", "(", "10", "mM", ")", ",", "the", "NADPH", "oxidase", "inhibitor", "DPI", "(", "20", "μM", ")", "or", "the", "ASK1", "inhibitor", "GS", "-", "444217", "(", "1", "μM", ")", "for", "1", "h", "before", "the", "addition", "of", "live", "GBS", "(", "MOI", "of", "5", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "means", "+", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "conducted", "in", "duplicate", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A), Effect of actinonin on Cxcl2 production by neutrophils. Neutrophils were stimulated with live GBS (MOI 5) in the presence or absence of the formyl peptidase inhibitor actinonin (32µg/ml). Data information: Data are means + SD from three independent experiments conducted in duplicate. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, as determined by unpaired t-test.(D), Effect of treatment with ROS scavengers/inhibitors on Cxcl2 production. Neutrophils were treated with the singlet oxygen scavenger MnTBAP (100 μM), the hydrogen peroxide scavenger DMTU (10 mM), the NADPH oxidase inhibitor DPI (20 μM) or the ASK1 inhibitor GS-444217 (1 μM) for 1 h before the addition of live GBS (MOI of 5). Data information: Data are means + SD from three independent experiments conducted in duplicate. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, as determined by unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "B", ")", "Bone", "-", "marrow", "-", "derived", "neutrophils", "were", "exposed", "to", "different", "concentrations", "of", "signaling", "molecule", "(", "A", ")", "or", "transcription", "factors", "inhibitors", "(", "B", ")", "for", "1", "hour", "and", "then", "stimulated", "with", "live", "GBS", "(", "MOI", "5", ")", ".", "Target", "molecules", "are", "indicated", "in", "parentheses", ".", "Data", "are", "means", "+", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "conducted", "in", "duplicate", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-B) Bone-marrow-derived neutrophils were exposed to different concentrations of signaling molecule (A) or transcription factors inhibitors (B) for 1 hour and then stimulated with live GBS (MOI 5). Target molecules are indicated in parentheses. Data are means + SD from three independent experiments conducted in duplicate. **P < 0.01, ***P < 0.001, as determined by unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "C", ")", ",", "Effect", "of", "p38MAPK", "inhibition", "on", "the", "activation", "of", "AP", "-", "1", "family", "members", "in", "neutrophils", "stimulated", "with", "live", "GBS", ".", "Neutrophils", "were", "pretreated", "with", "SB202190", "(", "5μM", ")", ",", "stimulated", "for", "90min", "with", "live", "GBS", "(", "MOI", "5", ")", ",", "lysed", "and", "assayed", "for", "AP", "-", "1", "activation", ".", "Data", "are", "means", "+", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "conducted", "in", "duplicate", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", ",", "Effect", "of", "the", "absence", "of", "Fpr1", ",", "Fpr2", "or", "the", "TLR", "adaptor", "MyD88", "on", "the", "activation", "of", "AP", "-", "1", "family", "members", "in", "neutrophils", ".", "Neutrophils", "from", "WT", ",", "Fpr", "-", "or", "MyD88", "-", "deficient", "mice", "were", "stimulated", "for", "90", "min", "with", "live", "GBS", "(", "MOI", "5", ")", ",", "lysed", "and", "assayed", "for", "AP", "-", "1", "activation", ".", "Data", "are", "means", "+", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "conducted", "in", "duplicate", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "WT", "mice", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "E", ")", ",", "Effect", "of", "TAK1", "inhibition", "on", "p38", "MAPK", "activation", "in", "neutrophils", "stimulated", "with", "live", "GBS", "(", "MOI", "5", ")", ".", "(", "F", ")", ",", "Effect", "of", "the", "absence", "of", "Fpr1", ",", "Fpr2", "or", "the", "TLR", "adaptor", "MyD88", "on", "p38MAPK", "activation", "in", "neutrophils", "stimulated", "with", "live", "GBS", "(", "MOI", "5", ")", ".", "Shown", "is", "a", "blot", "representative", "of", "three", "separate", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(C), Effect of p38MAPK inhibition on the activation of AP-1 family members in neutrophils stimulated with live GBS. Neutrophils were pretreated with SB202190 (5μM), stimulated for 90min with live GBS (MOI 5), lysed and assayed for AP-1 activation. Data are means + SD from three independent experiments conducted in duplicate. *P < 0.05, ***P < 0.001, as determined by unpaired t-test.(D), Effect of the absence of Fpr1, Fpr2 or the TLR adaptor MyD88 on the activation of AP-1 family members in neutrophils. Neutrophils from WT, Fpr- or MyD88-deficient mice were stimulated for 90 min with live GBS (MOI 5), lysed and assayed for AP-1 activation. Data are means + SD from three independent experiments conducted in duplicate. *P < 0.05, ***P < 0.001 vs WT mice, as determined by unpaired t-test.(E), Effect of TAK1 inhibition on p38 MAPK activation in neutrophils stimulated with live GBS (MOI 5).(F), Effect of the absence of Fpr1, Fpr2 or the TLR adaptor MyD88 on p38MAPK activation in neutrophils stimulated with live GBS (MOI 5). Shown is a blot representative of three separate experiments."}
{"words": ["Figure", "1b", ")", "Histograms", "of", "GFP", "expression", "(", "x", "-", "axis", ")", "are", "presented", "from", "A549", "cells", "transduced", "with", "the", "different", "viral", "vectors", ".", "c", ")", "Percentage", "of", "GFP", "positive", "cells", "from", "the", "experiment", "described", "in", "(", "b", ")", ".", ".", "d", ")", "A", "PCR", "assay", "along", "with", "primers", ",", "as", "illustrated", "in", "Appendix", "Figure", "S2a", ",", "was", "used", "to", "detect", "formation", "of", "LTR", "junction", "and", "thereby", "circularization", "of", "the", "vector", ".", "The", "expected", "size", "of", "PCR", "product", "is", "552", "bp", "from", "a", "1", "-", "LTR", "circle", "and", "1029", "bp", "from", "a", "2", "-", "LTR", "circle", ".", ".", "e", ")", "Southern", "Blot", "analysis", "to", "detect", "integration", "events", "in", "LV", "-", "and", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "-", "transduced", "single", "cell", "clones", "with", "DNA", "probed", "against", "the", "viral", "genome", ".", "A", "6", ".", "8", "kb", "positive", "control", "from", "a", "linearized", "plasmid", "(", "lane", "3", ")", "was", "included", "for", "indication", "of", "the", "size", "of", "DNA", "circles", "formed", "by", "non", "-", "integrated", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "vector", ".", "f", "-", "h", ")", "A", "padlock", "probe", "assay", ",", "as", "illustrated", "in", "Appendix", "Figure", "S4", ",", "was", "used", "to", "demonstrate", "persistence", "of", "proviral", "DNA", "either", "in", "a", "circular", "or", "integrated", "form", ".", "Representative", "images", "show", "DNA", "persistence", "in", "(", "f", ")", "LV", "-", ",", "(", "g", ")", "NILV", "-", "or", "(", "h", ")", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "-", "transduced", "cells", ".", "Each", "red", "dot", "(", "Cy3", ")", "represents", "a", "single", "DNA", "molecule", "and", "cell", "nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "33342", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1b) Histograms of GFP expression (x-axis) are presented from A549 cells transduced with the different viral vectors.c) Percentage of GFP positive cells from the experiment described in (b).. d) A PCR assay along with primers, as illustrated in Appendix Figure S2a, was used to detect formation of LTR junction and thereby circularization of the vector. The expected size of PCR product is 552 bp from a 1-LTR circle and 1029 bp from a 2-LTR circle.. e) Southern Blot analysis to detect integration events in LV- and NILV-S/MAR-transduced single cell clones with DNA probed against the viral genome. A 6.8 kb positive control from a linearized plasmid (lane 3) was included for indication of the size of DNA circles formed by non-integrated NILV-S/MAR vector.f-h) A padlock probe assay, as illustrated in Appendix Figure S4, was used to demonstrate persistence of proviral DNA either in a circular or integrated form. Representative images show DNA persistence in (f) LV-, (g) NILV- or (h) NILV-S/MAR-transduced cells. Each red dot (Cy3) represents a single DNA molecule and cell nuclei were stained with Hoechst 33342."}
{"words": ["Figure", "2c", ")", "Flow", "cytometry", "histograms", "of", "RFP", "expression", "(", "x", "-", "axis", ")", "of", "A549", "/", "RFP", "+", "Luc", "+", "cells", "at", "day", "20", "and", "27", "after", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "(", "GFP", ",", "shNT", ")", "or", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "(", "GFP", ",", "shRFP", ")", "transduction", ".", "d", ")", "Luciferase", "activity", "of", "the", "A549", "/", "RFP", "+", "Luc", "+", "cells", "at", "day", "20", "and", "day", "44", "after", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "(", "GFP", ",", "shNT", ")", "-", "or", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "(", "GFP", ",", "shRFP", ")", "-", "transduction", ".", "e", "-", "h", ")", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "show", "the", "expression", "of", "RFP", "from", "either", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "-", "transduced", "or", "un", "-", "transduced", "A549", "/", "RFP", "+", "Luc", "+", "cells", "with", "cell", "nuclei", "stained", "with", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ")", ".", "RFP", "signal", "(", "orange", ")", "were", "collected", "with", "a", "fixed", "exposure", "time", "(", "300", "ms", ")", "for", "equal", "comparison", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2c) Flow cytometry histograms of RFP expression (x-axis) of A549/RFP+Luc+ cells at day 20 and 27 after NILV-S/MAR(GFP, shNT) or NILV-S/MAR(GFP, shRFP) transduction.d) Luciferase activity of the A549/RFP+Luc+ cells at day 20 and day 44 after NILV-S/MAR(GFP, shNT)- or NILV-S/MAR(GFP, shRFP)-transduction.e-h) Representative fluorescence microscopy images show the expression of RFP from either NILV-S/MAR-transduced or un-transduced A549/RFP+Luc+ cells with cell nuclei stained with Hoechst 33342 (blue). RFP signal (orange) were collected with a fixed exposure time (300 ms) for equal comparison."}
{"words": ["Figure", "3c", ")", "Percentage", "of", "CD19CAR", "expression", "on", "CD3", "+", "T", "cells", "from", "each", "independent", "donor", ".", "d", ")", "Histograms", "of", "CD19", "CAR", "expression", "on", "T", "cells", "form", "one", "representative", "donor", "before", "and", "after", "expansion", ".", "e", ")", "CD107a", "expression", "on", "transduced", "T", "cells", "(", "CD3", "+", ")", "after", "exposure", "to", "CD19", "+", "target", "cells", "(", "Daudi", ")", "for", "24", "h", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "f", ")", "IFN", "-", "γ", "production", "in", "the", "supernatant", "was", "analyzed", "by", "ELISA", "after", "24", "h", "of", "exposure", "of", "transduced", "T", "cells", "to", "target", "cells", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "g", ")", "Relative", "viability", "of", "target", "cells", "(", "CD19", "+", "Daudi", ")", ",", "as", "an", "indication", "of", "T", "cell", "killing", "efficacy", ",", "were", "measured", "at", "different", "effector", "T", "cell", "to", "target", "cell", "ratio", "(", "E", ":", "T", "ratio", ")", "and", "normalized", "to", "the", "signal", "from", "target", "cells", "alone", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "h", ")", "Transduced", "T", "cells", "were", "labeled", "with", "a", "fluorescent", "cell", "membrane", "dye", "and", "co", "-", "cultured", "with", "CD19", "+", "Daudi", "cells", "for", "4", "days", ".", "Dye", "dilution", "upon", "T", "cell", "division", "was", "monitored", "by", "flow", "cytometry", "and", "representative", "histograms", "are", "shown", ".", "i", "-", "m", ")", "Mice", "were", "treated", "by", "intravenous", "injection", "of", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "(", "Mock", ")", ",", "LV", "(", "CD19CAR", ")", "and", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "(", "CD19CAR", ")", "-", "transduced", "T", "cells", "(", "8x106", "cells", "/", "injection", ")", "at", "days", "18", ",", "21", ",", "24", "after", "tumor", "implantation", ".", "Tumor", "growth", "was", "monitored", "by", "caliper", "measurements", ".", "i", "-", "k", ")", "Tumor", "volume", "of", "individual", "mice", "in", "each", "treatment", "groups", "are", "presented", ".", "l", ")", "The", "average", "tumor", "volume", "of", "each", "treatment", "group", "is", "presented", "and", "the", "values", "on", "day", "37", "were", "statistically", "compared", "(", "n", "=", "12", "in", "LV", "group", ",", "n", "=", "9", "in", "NILV", "-", "S", "/", "MAR", "group", "and", "n", "=", "11", "in", "Mock", "control", "group", ")", ".", "m", ")", "The", "survival", "of", "mice", "is", "shown", "as", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", ".", "n", "-", "p", ")", "Representative", "images", "showing", "infiltration", "of", "adoptively", "transferred", "human", "T", "cells", "into", "tumors", ".", "T", "cells", "were", "visualized", "by", "staining", "for", "human", "CD3", "(", "red", ")", "and", "nucleus", "(", "blue", ")", ".", "q", ")", "Quantification", "of", "CD3", "+", "T", "cells", "from", "each", "treatment", "group", "is", "presented", "(", "n", "=", "5", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3c) Percentage of CD19CAR expression on CD3+ T cells from each independent donor. d) Histograms of CD19 CAR expression on T cells form one representative donor before and after expansion. e) CD107a expression on transduced T cells (CD3+) after exposure to CD19+ target cells (Daudi) for 24 h (n=6). f) IFN-γ production in the supernatant was analyzed by ELISA after 24 h of exposure of transduced T cells to target cells (n=6). g) Relative viability of target cells (CD19+ Daudi), as an indication of T cell killing efficacy, were measured at different effector T cell to target cell ratio (E:T ratio) and normalized to the signal from target cells alone (n=6). h) Transduced T cells were labeled with a fluorescent cell membrane dye and co-cultured with CD19+ Daudi cells for 4 days. Dye dilution upon T cell division was monitored by flow cytometry and representative histograms are shown.i-m) Mice were treated by intravenous injection of NILV-S/MAR(Mock), LV(CD19CAR) and NILV-S/MAR(CD19CAR)-transduced T cells (8x106 cells/injection) at days 18, 21, 24 after tumor implantation. Tumor growth was monitored by caliper measurements. i-k) Tumor volume of individual mice in each treatment groups are presented. l) The average tumor volume of each treatment group is presented and the values on day 37 were statistically compared (n=12 in LV group, n=9 in NILV-S/MAR group and n=11 in Mock control group). m) The survival of mice is shown as Kaplan-Meier curves.n-p) Representative images showing infiltration of adoptively transferred human T cells into tumors. T cells were visualized by staining for human CD3 (red) and nucleus (blue). q) Quantification of CD3+ T cells from each treatment group is presented (n=5)."}
{"words": ["Figure", "1B", "Antiproliferative", "activities", "of", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "and", "crizotinib", "against", "EML4", "-", "ALK", "Ba", "/", "F3", "and", "parental", "Ba", "/", "F3", "cells", ",", "respectively", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "increasing", "concentration", "of", "each", "drug", "for", "48", "hours", "and", "then", "analyzed", "by", "MTS", "assay", ".", "Each", "concentration", "was", "performed", "in", "triplicate", ".", "Data", "were", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "C", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "downregulates", "ALK", "signaling", "pathways", "in", "EML4", "-", "ALK", "Ba", "/", "F3", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "or", "crizotinib", "for", "4", "h", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunobloting", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Antiproliferative activities of XMU-MP-5 and crizotinib against EML4-ALK Ba/F3 and parental Ba/F3 cells, respectively. Cells were treated with increasing concentration of each drug for 48 hours and then analyzed by MTS assay. Each concentration was performed in triplicate. Data were presented as Mean ± SEM from three independent experiments (n = 3) .C XMU-MP-5 downregulates ALK signaling pathways in EML4-ALK Ba/F3 cells. Cells were treated with XMU-MP-5 or crizotinib for 4 h, and then analyzed by immunobloting."}
{"words": ["Figure", "2C", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "suppressed", "ALK", "signaling", "pathway", "in", "H3122", "cells", ".", "E", "Comparison", "of", "tumor", "volume", "of", "different", "treatment", "groups", "in", "11", "days", ".", "BALB", "/", "c", "nude", "mice", "bearing", "H3122", "xenograft", "tumors", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "and", "crizotinib", "by", "tail", "vein", "injection", "once", "daily", ".", "Data", "were", "shown", "as", "Mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Statistical", "comparasions", "were", "performed", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "P", "=", "0", ".", "1063", ";", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0097", ".", "G", "Representative", "images", "of", "tumors", "analyzed", "by", "H", "&", "E", "and", "IHC", "staining", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C XMU-MP-5 suppressed ALK signaling pathway in H3122 cells.E Comparison of tumor volume of different treatment groups in 11 days. BALB/c nude mice bearing H3122 xenograft tumors were treated with vehicle, XMU-MP-5 and crizotinib by tail vein injection once daily. Data were shown as Mean ± SEM (n = 6). Statistical comparasions were performed using a two-tailed, unpaired Student's t test. N.S., P = 0.1063; **P = 0.0097.G Representative images of tumors analyzed by H&E and IHC staining. Scale bars, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "4A", "Cell", "viability", "was", "measured", "by", "MTS", "assay", ".", "Each", "concentration", "was", "performed", "in", "triplicate", ".", "The", "exact", "IC50", "value", "was", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S6", ".", "IC50", "fold", "changes", "of", "wild", "type", "and", "mutant", "EML4", "-", "ALK", "Ba", "/", "F3", "cell", "lines", "to", "parental", "Ba", "/", "F3", "cell", "line", "of", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "and", "crizotinib", "were", "determined", ".", "B", "Heatmap", "of", "the", "anti", "-", "proliferative", "activity", "of", "ALK", "inhibitors", "across", "Ba", "/", "F3", "cell", "lines", "with", "different", "ALK", "mutations", ".", "C", ",", "D", "In", "vivo", "activity", "of", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "against", "L1196M", "xenograft", "mouse", "model", ".", "BALB", "/", "c", "nude", "mice", "bearing", "L1196M", "Ba", "/", "F3", "xenograft", "tumors", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "30", "mg", "/", "kg", "or", "60", "mg", "/", "kg", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "by", "tail", "vein", "injection", "once", "daily", ".", "Tumor", "volume", "(", "C", ")", "and", "tumor", "weight", "(", "D", ")", "were", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Statistical", "comparasions", "were", "performed", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "for", "(", "C", ")", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "P", "=", "0", ".", "1482", ";", "*", "P", "=", "0", ".", "037", ".", "Statistical", "comparasions", "were", "performed", "using", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "test", "for", "(", "D", ")", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "P", "=", "0", ".", "2162", ";", "*", "P", "=", "0", ".", "0122", ".", "E", ",", "F", "Efficacy", "of", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "in", "G1202R", "Ba", "/", "F3", "xenograft", "mouse", "model", ".", "BALB", "/", "c", "nude", "mice", "bearing", "G1202R", "Ba", "/", "F3", "cells", "xenograft", "tumors", "were", "administrated", "with", "vehicle", "or", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "by", "tail", "vein", "injection", "twice", "daily", ".", "Lorlatinib", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "by", "oral", "administration", ".", "Tumor", "volume", "(", "E", ")", "and", "tumor", "weight", "(", "F", ")", "were", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Statistical", "comparasions", "were", "performed", "using", "a", "two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "for", "(", "E", ")", ",", "Vehicle", "vs", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "30", "mg", "/", "kg", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0433", ";", "Vehicle", "vs", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "30", "mg", "/", "kg", "BID", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0093", ";", "Vehicle", "vs", "Lorlatinib", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0029", ".", "Statistical", "comparasions", "were", "performed", "using", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "test", "for", "(", "F", ")", ".", "Vehicle", "vs", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "30", "mg", "/", "kg", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0008", ";", "Vehicle", "vs", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "30", "mg", "/", "kg", "BID", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", ";", "Vehicle", "vs", "Lorlatinib", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Cell viability was measured by MTS assay. Each concentration was performed in triplicate. The exact IC50 value was presented as Mean ± SEM from three independent experiments (n = 3) and shown in Appendix Table S6. IC50 fold changes of wild type and mutant EML4-ALK Ba/F3 cell lines to parental Ba/F3 cell line of XMU-MP-5 and crizotinib were determined.B Heatmap of the anti-proliferative activity of ALK inhibitors across Ba/F3 cell lines with different ALK mutations.C, D In vivo activity of XMU-MP-5 against L1196M xenograft mouse model. BALB/c nude mice bearing L1196M Ba/F3 xenograft tumors were treated with vehicle, 30 mg/kg or 60 mg/kg XMU-MP-5 by tail vein injection once daily. Tumor volume (C) and tumor weight (D) were shown as mean ± SEM (n = 6). Statistical comparasions were performed using a two-tailed, unpaired Student's t test for (C), N.S., P = 0.1482; *P = 0.037. Statistical comparasions were performed using a one-way ANOVA with Dunnett test for (D), N.S., P = 0.2162; *P = 0.0122.E, F Efficacy of XMU-MP-5 in G1202R Ba/F3 xenograft mouse model. BALB/c nude mice bearing G1202R Ba/F3 cells xenograft tumors were administrated with vehicle or XMU-MP-5 by tail vein injection twice daily. Lorlatinib was used as a positive control by oral administration. Tumor volume (E) and tumor weight (F) were shown as mean ± SEM (n = 6). Statistical comparasions were performed using a two-tailed, unpaired Student's t test for (E), Vehicle vs XMU-MP-5 30 mg/kg, *P = 0.0433; Vehicle vs XMU-MP-5 30 mg/kg BID, **P = 0.0093; Vehicle vs Lorlatinib, **P = 0.0029. Statistical comparasions were performed using a one-way ANOVA with Dunnett test for (F). Vehicle vs XMU-MP-5 30 mg/kg, ***P = 0.0008; Vehicle vs XMU-MP-5 30 mg/kg BID, ***P = 0.0003; Vehicle vs Lorlatinib, ***P = 0.0002."}
{"words": ["Figure", "5A", "Representative", "CT", "images", "(", "upper", "panel", ")", "and", "H", "&", "E", "staining", "(", "lower", "panel", ")", "of", "lungs", "from", "EML4", "-", "ALK", "tumor", "-", "bearing", "mice", "are", "shown", ".", "The", "complete", "set", "of", "CT", "images", "refers", "to", "Appendix", "Figure", "S10A", ".", "Mice", "were", "treated", "with", "30", "mg", "/", "kg", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "twice", "daily", "for", "3", "weeks", ".", "H", ":", "heart", ";", "arrow", "indicated", "tumor", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", ".", "B", "IHC", "analyses", "of", "lungs", "from", "EML4", "-", "ALK", "transgenic", "mice", ".", "pALK", "and", "Cl", "-", "caspase", "3", "were", "probed", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "C", "Representative", "CT", "images", "(", "upper", "panel", ")", "and", "H", "&", "E", "staining", "(", "lower", "panel", ")", "of", "lungs", "from", "EML4", "-", "ALK", "(", "L1196M", ")", "tumor", "-", "bearing", "mice", "are", "shown", ".", "The", "complete", "set", "of", "CT", "images", "refers", "to", "Appendix", "Figure", "S10B", ".", "Mice", "were", "treated", "with", "40", "mg", "/", "kg", "XMU", "-", "MP", "-", "5", "twice", "daily", "for", "1", "week", ".", "H", ":", "heart", ";", "arrow", "indicated", "tumor", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", ".", "D", "IHC", "analyses", "of", "lungs", "from", "EML4", "-", "ALK", "(", "L1196M", ")", "transgenic", "mice", ".", "pALK", "and", "Cl", "-", "caspase", "3", "were", "probed", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Representative CT images (upper panel) and H&E staining (lower panel) of lungs from EML4-ALK tumor-bearing mice are shown. The complete set of CT images refers to Appendix Figure S10A. Mice were treated with 30 mg/kg XMU-MP-5 twice daily for 3 weeks. H: heart; arrow indicated tumor. Scale bars, 200 μm. B IHC analyses of lungs from EML4-ALK transgenic mice. pALK and Cl-caspase 3 were probed. Scale bars, 100 μm.C Representative CT images (upper panel) and H&E staining (lower panel) of lungs from EML4-ALK(L1196M) tumor-bearing mice are shown. The complete set of CT images refers to Appendix Figure S10B. Mice were treated with 40 mg/kg XMU-MP-5 twice daily for 1 week. H: heart; arrow indicated tumor. Scale bars, 200 μm. D IHC analyses of lungs from EML4-ALK(L1196M) transgenic mice. pALK and Cl-caspase 3 were probed. Scale bars, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "ARPI", "(", "CSS", ",", "ENZA", ",", "ODM", "-", "201", ",", "14449", ")", "decreased", ",", "while", "R1881", "increased", ",", "SDHA", "and", "SDHB", "subunit", "protein", "levels", "in", "both", "LNCaP", "and", "LAPC4", "cells", ".", "PSA", "is", "used", "as", "a", "positive", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. ARPI (CSS, ENZA, ODM-201, 14449) decreased, while R1881 increased, SDHA and SDHB subunit protein levels in both LNCaP and LAPC4 cells. PSA is used as a positive control."}
{"words": ["Figure", "2D", ".", "SDH", "repression", "during", "acute", "phase", "of", "ENZA", "stress", "increased", "transcription", "of", "different", "AR", "-", "regulated", "genes", "without", "altering", "AR", "mRNAs", "levels", "in", "LNCaP", "cells", ".", "Data", "information", ":", "ENZA", ":", "enzalutamide", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "compared", "between", "groups", ".", "E", "-", "F", ".", "Overexpression", "of", "SDHA", "and", "SDHB", "subunits", "decreased", "AR", "protein", "levels", "(", "E", ")", "and", "AR", "transactivation", "(", "F", ")", "in", "LNCaP", "cells", ".", "Data", "information", ":", "ENZA", ":", "enzalutamide", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "compared", "between", "groups", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D. SDH repression during acute phase of ENZA stress increased transcription of different AR-regulated genes without altering AR mRNAs levels in LNCaP cells. Data information: ENZA: enzalutamide.Data shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using two tailed unpaired Student's t-test *, p<0.05 and **, p<0.01 compared between groups.E-F. Overexpression of SDHA and SDHB subunits decreased AR protein levels (E) and AR transactivation (F) in LNCaP cells. Data information: ENZA: enzalutamide.Data shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey's test *, p<0.05 and **, p<0.01 compared between groups."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "SDH", "-", "repressed", "LNCaP", "cells", "were", "able", "to", "maintain", "higher", "proliferation", "rate", "particularly", "during", "ENZA", "stress", "with", "or", "without", "Hsp27", "silencing", "in", "real", "time", "cell", "proliferation", "assay", ".", "Data", "information", ":", "ENZA", ":", "enzalutamide", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "following", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "panels", "C", "(", "end", "points", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "between", "groupsE", ".", "Treatment", "with", "p", "-", "p38", "inhibitors", ":", "SB203580", "(", "10", "µM", ")", "or", "Genistein", "(", "20", "µM", ")", "for", "24", "h", "reduced", "AR", "upregulation", "induced", "by", "SDH", "repression", "in", "LNCaP", "cells", "(", "left", "panel", ")", ".", "Bar", "graph", "in", "the", "right", "panel", "shows", "band", "intensity", "normalized", "to", "loading", "control", ".", "Data", "information", ":", "ENZA", ":", "enzalutamide", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "following", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "panels", "E", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "between"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. SDH-repressed LNCaP cells were able to maintain higher proliferation rate particularly during ENZA stress with or without Hsp27 silencing in real time cell proliferation assay. Data information: ENZA: enzalutamide. Data shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA following Tukey's test for panels C (end points) . *, p<0.05, **, p<0.01 and ***, p<0.001 compared between groupsE. Treatment with p-p38 inhibitors: SB203580 (10 µM) or Genistein (20 µM) for 24 h reduced AR upregulation induced by SDH repression in LNCaP cells (left panel). Bar graph in the right panel shows band intensity normalized to loading control. Data information: ENZA: enzalutamide. Data shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA following Tukey's test for panels E . *, p<0.05, **, p<0.01 and ***, p<0.001 compared between groups"}
{"words": ["Figure", "4F", ".", ".", "Treatment", "with", "5", "µM", "STO", "-", "609", "for", "24", "h", "in", "LNCaP", "cells", "inhibited", "AR", "upregulation", "induced", "by", "SDHA", "/", "SDHB", "subunit", "silencing", ".", "G", ".", "Thapsigargin", ",", "DMM", ",", "DMS", "and", "ENZA", "treatment", "for", "the", "indicated", "time", "points", "increased", "intracellular", "calcium", "flux", "in", "LNCaP", "cells", "as", "visualized", "with", "calcium", "sensitive", "Fluo4", "-", "AM", "probe", "under", "confocal", "microscope", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4F.. Treatment with 5 µM STO-609 for 24 h in LNCaP cells inhibited AR upregulation induced by SDHA/SDHB subunit silencing.G. Thapsigargin, DMM, DMS and ENZA treatment for the indicated time points increased intracellular calcium flux in LNCaP cells as visualized with calcium sensitive Fluo4-AM probe under confocal microscope."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", ".", "Human", "patient", "samples", "demonstrate", "relative", "differences", "in", "the", "immunoexpression", "of", "AR", ",", "SDHA", ",", "p", "-", "CaMKK2", "/", "p", "-", "AMPK", ",", "p", "-", "p38", ",", "and", "p", "-", "Hsp27", "in", "untreated", "(", "n", "=", "70", ")", ",", "neoadjuvant", "-", "treated", "(", "NHT", ")", "(", "n", "=", "130", ")", "and", "CRPC", "(", "n", "=", "24", ")", "samples", ".", "Representative", "images", "(", "A", ")", ",", "dot", "plots", "(", "B", ")", ",", "compiled", "bar", "graph", "(", "C", ")", "support", "the", "AR", "-", "SDH", "loop", "where", "inhibition", "of", "AR", "axis", "in", "NHT", "samples", "reduced", "SDHA", "levels", "along", "with", "upregulation", "of", "p", "-", "CaMKK2", "/", "p", "-", "AMPK", "/", "p", "-", "p38", "/", "p", "-", "Hsp27", "axis", ".", "AR", "-", "positive", "CRPC", "samples", "restored", "SDHA", "as", "well", "as", "the", "whole", "axis", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ":", "100µm", ".", "All", "the", "TMAs", "were", "constructed", "from", "minimum", "2", "cores", "per", "patient", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C. Human patient samples demonstrate relative differences in the immunoexpression of AR, SDHA, p-CaMKK2/p-AMPK, p-p38, and p-Hsp27 in untreated (n=70), neoadjuvant-treated (NHT) (n=130) and CRPC (n=24) samples. Representative images (A), dot plots (B), compiled bar graph (C) support the AR-SDH loop where inhibition of AR axis in NHT samples reduced SDHA levels along with upregulation of p-CaMKK2/p-AMPK/p-p38/p-Hsp27 axis. AR-positive CRPC samples restored SDHA as well as the whole axis. Data information: Data shown as mean ± SEM. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey's test. **, p<0.01; ***, p<0.001 and ****, p<0.0001. Scale bar: 100µm. All the TMAs were constructed from minimum 2 cores per patient. "}
{"words": ["Figure", "6D", ".", "IVM", "reversed", "the", "cell", "proliferation", "benefit", "mediated", "by", "SDH", "repression", "in", "LNCaP", "cells", ".", "Data", "shown", "as", "means", "±", "SEM", "In", "vitro", "data", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "for", "the", "last", "data", "point", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "between", "groups", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "E", ".", "LNCaP", "xenografts", "treated", "with", "IVM", "(", "n", "=", "10", ")", "(", "10mg", "/", "kg", ")", "demonstrated", "lower", "serum", "PSA", "values", "(", "upper", "panel", ")", "and", "growth", "of", "tumours", "after", "castration", "(", "lower", "panel", ")", "compared", "to", "vehicle", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "PSA", "was", "measured", "every", "week", ".", "Data", "shown", "as", "means", "±", "SEMF", ".", "IVM", "treatment", "reduced", "p", "-", "Hsp27", "levels", "and", "therefore", "AR", "protein", "level", ",", "with", "subsequent", "p", "-", "CAMKK2", "axis", "activation", "in", "castrated", "LNCaP", "xenografts", ".", "Bar", "graph", "in", "the", "right", "panel", "shows", "quantification", "of", "data", "from", "western", "blot", "normalized", "to", "loading", "control", ".", "Data", "shown", "as", "means", "±"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D. IVM reversed the cell proliferation benefit mediated by SDH repression in LNCaP cells. Data shown as means ± SEM In vitro data represent three independent experiments. Statistical analysis was performed for the last data point *, p<0.05, **, p<0.01 and ***, p<0.001 compared between groups, one-way ANOVA followed by Tukey's test.E. LNCaP xenografts treated with IVM (n=10) (10mg/kg) demonstrated lower serum PSA values (upper panel) and growth of tumours after castration (lower panel) compared to vehicle (n=10). PSA was measured every week. Data shown as means ± SEMF. IVM treatment reduced p-Hsp27 levels and therefore AR protein level, with subsequent p-CAMKK2 axis activation in castrated LNCaP xenografts. Bar graph in the right panel shows quantification of data from western blot normalized to loading control. Data shown as means ± SD"}
{"words": ["Figure", "1B", ")", "Total", "T", "cells", "were", "enriched", "from", "spleens", "of", "Ptpn6fl", "/", "fl", "/", "Ptpn11fl", "/", "flWbm", ",", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "/", "Ptpn11fl", "/", "flWbm", ",", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "mice", ".", "Expression", "of", "Ptpn6", "and", "Ptpn11", "was", "tested", "by", "immunoblot", "in", "cell", "lysates", ",", "Gapdh", "used", "as", "loading", "control", ".", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "and", "control", "mice", "were", "subcutaneously", "injected", "with", "MC38", "cells", ".", "Tumour", "growth", "in", "individual", "mice", "is", "shown", "for", "the", "indicated", "genotypes", "and", "treatments", ";", "number", "of", "mice", "eradicating", "the", "tumour", "is", "shown", "within", "the", "graphs", "(", "C", ")", ".", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "and", "control", "mice", "were", "subcutaneously", "injected", "with", "MC38", "cells", ".", "Survival", "curves", "are", "shown", "(", "D", ")", ".", "Tumour", "growth", "in", "individual", "mice", "challenged", "with", "MC38", "and", "subsequently", "treated", "with", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", "or", "isotype", "control", "is", "shown", "for", "each", "indicated", "genotype", ";", "number", "of", "mice", "eradicating", "the", "tumour", "is", "shown", "within", "the", "graphs", "(", "G", ")", ".", "individual", "mice", "challenged", "with", "MC38", "and", "subsequently", "treated", "with", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", "or", "isotype", "control", "is", "shown", "for", "each", "indicated", "genotype", "Survival", "curves", "of", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "/", "Ptpn11fl", "/", "flWbm", "and", "control", "mice", "is", "shown", "(", "H", ")", ".", "I", ",", "J", ")", "10", "-", "12", "days", "following", "MC38", "tumour", "inoculation", "and", "treatment", "with", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", "or", "isotype", "control", ",", "CD4cre", "Ptpn6", "/", "11wt", "/", "wt", "and", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "/", "Ptpn11fl", "/", "flWbm", "mice", "were", "sacrificed", ",", "and", "TILs", "analysed", ".", "Graphs", "depict", "frequencies", "of", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "gated", "as", "CD45", "+", "TCRβ", "+", "CD8", "+", ")", "expressing", "IFN", "-", "γ", "and", "TNFα", "upon", "re", "-", "stimulation", "(", "G", ")", "and", "percentages", "of", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B) Total T cells were enriched from spleens of Ptpn6fl/fl/Ptpn11fl/flWbm, CD4cre Ptpn6fl/fl/Ptpn11fl/flWbm, CD4cre Ptpn6fl/fl mice. Expression of Ptpn6 and Ptpn11 was tested by immunoblot in cell lysates, Gapdh used as loading control.CD4cre Ptpn6fl/fl and control mice were subcutaneously injected with MC38 cells. Tumour growth in individual mice is shown for the indicated genotypes and treatments; number of mice eradicating the tumour is shown within the graphs (C).CD4cre Ptpn6fl/fl and control mice were subcutaneously injected with MC38 cells. Survival curves are shown (D).Tumour growth in individual mice challenged with MC38 and subsequently treated with anti-PD-1 antibody or isotype control is shown for each indicated genotype; number of mice eradicating the tumour is shown within the graphs (G).individual mice challenged with MC38 and subsequently treated with anti-PD-1 antibody or isotype control is shown for each indicated genotype Survival curves of CD4cre Ptpn6fl/fl/Ptpn11fl/flWbm and control mice is shown (H).I, J) 10-12 days following MC38 tumour inoculation and treatment with anti-PD-1 antibody or isotype control, CD4cre Ptpn6/11wt/wt and CD4cre Ptpn6fl/fl/Ptpn11fl/flWbm mice were sacrificed, and TILs analysed. Graphs depict frequencies of CD8+ T cells (gated as CD45+ TCRβ+ CD8+) expressing IFN-γ and TNFα upon re-stimulation (G) and percentages of CD8+ T cells (H)."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Ptpn6", "and", "Ptpn11", "copy", "number", ",", "as", "estimated", "through", "high", "resolution", "mass", "spectrometry", "in", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "control", "CTLs", ".", "C", "and", "D", ")", "GzmBcre", "R26R", "-", "YFP", "reporter", "mice", "were", "injected", "subcutaneously", "with", "MC38", "cells", "and", "analysed", "after", "11", "days", ".", "Graphs", "show", "the", "percentage", "of", "YFP", "+", "cells", "among", "CD45", "+", "CD8", "+", "TILs", "(", "C", ")", "and", "the", "percentage", "of", "PD", "-", "1", "+", "cells", "among", "CD45", "+", "CD8", "+", "YFP", "+", "TILs", "(", "D", ")", ".", "Results", "depict", "n", "=", "4", "mice", "(", "C", "and", "D", ")", ".", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "control", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "mice", "were", "subcutaneously", "injected", "with", "MC38", "cells", ".", "Survival", "curves", "and", "statistical", "comparisons", "between", "different", "groups", "are", "shown", "(", "E", ")", ".", "The", "tumour", "start", "depicts", "the", "time", "(", "days", ")", "following", "tumour", "engraftment", "after", "which", "the", "tumour", "is", "palpable", ",", "while", "tumour", "endpoint", "depicts", "the", "time", "(", "days", ")", "from", "tumour", "start", "until", "the", "reaching", "the", "maximal", "allowed", "tumour", "size", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Ptpn6 and Ptpn11 copy number, as estimated through high resolution mass spectrometry in GzmBcre Ptpn6/11fl/fl and control CTLs.C and D) GzmBcre R26R-YFP reporter mice were injected subcutaneously with MC38 cells and analysed after 11 days. Graphs show the percentage of YFP+ cells among CD45+ CD8+ TILs (C) and the percentage of PD-1+ cells among CD45+ CD8+ YFP+ TILs (D). Results depict n = 4 mice (C and D).GzmBcre Ptpn6/11fl/fl and control Ptpn6/11fl/fl mice were subcutaneously injected with MC38 cells. Survival curves and statistical comparisons between different groups are shown (E).The tumour start depicts the time (days) following tumour engraftment after which the tumour is palpable, while tumour endpoint depicts the time (days) from tumour start until the reaching the maximal allowed tumour size (F)."}
{"words": ["Figure", "3C", ")", "Numbers", "of", "CTLs", "(", "gated", "on", "CD8", "+", "T", "cells", ")", "from", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "or", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "mice", "were", "counted", "daily", "by", "flow", "cytometry", "with", "the", "addition", "of", "DAPI", "to", "monitor", "dead", "cells", ".", "D", ")", "Quantitative", "high", "-", "resolution", "mass", "spectrometry", "was", "used", "to", "resolve", "the", "proteome", "of", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "CTLs", "(", "day", "7", ")", ".", "The", "plot", "depicts", "protein", "copy", "number", "in", "control", "and", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "cells", ".", "Significantly", "altered", "proteins", "are", "indicated", "in", "red", ";", "selected", "examples", "are", "annotated", ".", "Results", "are", "based", "on", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "and", "two", "-", "tailed", ",", "unequal", "-", "variance", "t", "-", "test", "on", "log10", "transformed", "copy", "number", "per", "cell", "values", "was", "used", "to", "compare", "differences", "between", "experimental", "groups", ".", "G", ")", "Graph", "illustrates", "the", "percentage", "of", "DAPI", "+", "dead", "cells", "of", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "CTLs", "(", "gated", "on", "CD8", "+", "T", "cells", ")", "at", "the", "indicated", "days", "as", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "H", ")", "Protein", "copy", "number", "of", "Tnfrsf1b", "and", "Mcl", "-", "1", "in", "GzmB", "cre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "control", "CTLs", ",", "as", "estimated", "through", "high", "resolution", "mass", "spectrometry", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C) Numbers of CTLs (gated on CD8+ T cells) from Ptpn6/11fl/fl or GzmBcre Ptpn6/11fl/fl mice were counted daily by flow cytometry with the addition of DAPI to monitor dead cells.D) Quantitative high-resolution mass spectrometry was used to resolve the proteome of Ptpn6/11fl/fl and GzmBcre Ptpn6/11fl/fl CTLs (day 7). The plot depicts protein copy number in control and GzmBcre Ptpn6/11fl/fl cells. Significantly altered proteins are indicated in red; selected examples are annotated. Results are based on n = 3 biological replicates and two-tailed, unequal-variance t-test on log10 transformed copy number per cell values was used to compare differences between experimental groups.G) Graph illustrates the percentage of DAPI+ dead cells of Ptpn6/11fl/fl and GzmBcre Ptpn6/11fl/fl CTLs (gated on CD8+ T cells) at the indicated days as measured by flow cytometry.H) Protein copy number of Tnfrsf1b and Mcl-1 in GzmB cre Ptpn6/11fl/fl and control CTLs, as estimated through high resolution mass spectrometry."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "sections", "of", "WT", "and", "MPSIIIA", "brains", "at", "9", "months", "of", "age", "stained", "for", "astrocytes", "(", "GFAP", ")", "or", "microglia", "(", "isolectin", "B4", ",", "ILB4", ")", ".", "Images", "correspond", "to", "high", "power", "views", "covering", "cortical", "layers", "II", "-", "V", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Quantitative", "PCR", "for", "various", "inflammatory", "cytokines", "in", "whole", "brains", "from", "9", "month", "old", "WT", "and", "MPSIIIA", "mice", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WT", ".", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", ",", "data", "for", "each", "cytokine", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WT", ".", "Quantification", "of", "IL", "-", "1β", "and", "IL", "-", "1Ra", "levels", "in", "plasma", "from", "human", "healthy", "control", "and", "MPSIII", "patients", "(", "n", "=", "6", "control", "participants", "and", "n", "=", "21", "MPSIII", "patients", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "C", ".", "IL", "-", "1β", ",", "control", "vs", ".", "MPSIII", "P", "=", "0", ".", "0407", ";", "D", ".", "IL", "-", "1Ra", ",", "control", "vs", ".", "MPSIII", "P", "=", "0", ".", "0001", ".", "Quantification", "of", "IL", "-", "1β", "and", "IL", "-", "1Ra", "levels", "in", "cerebrospinal", "fluid", "(", "CSF", ")", "from", "control", "and", "MPSIII", "patients", "(", "n", "=", "3", "control", "participants", "and", "n", "=", "21", "MPSIII", "patients", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "F", ".", "IL", "-", "1Ra", ",", "control", "vs", ".", "MPSIII", "P", "=", "0", ".", "0167", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative sections of WT and MPSIIIA brains at 9 months of age stained for astrocytes (GFAP) or microglia (isolectin B4, ILB4). Images correspond to high power views covering cortical layers II-V. Scale bar, 100 μm. (n=4 mice per group).Quantitative PCR for various inflammatory cytokines in whole brains from 9 month old WT and MPSIIIA mice. Symbols above bars are versus WT. (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV, data for each cytokine were tested by unpaired t-test; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus WT.Quantification of IL-1β and IL-1Ra levels in plasma from human healthy control and MPSIII patients (n=6 control participants and n=21 MPSIII patients). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by unpaired t-test. C. IL-1β, control vs. MPSIII P=0.0407; D. IL-1Ra, control vs. MPSIII P=0.0001. Quantification of IL-1β and IL-1Ra levels in cerebrospinal fluid (CSF) from control and MPSIII patients (n=3 control participants and n=21 MPSIII patients). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by unpaired t-test; *P<0.05. F. IL-1Ra, control vs. MPSIII P=0.0167."}
{"words": ["Figure", "2The", "expression", "of", "Il1b", "was", "measured", "in", "whole", "brain", "using", "quantitative", "PCR", "1", "hour", ",", "2", "hours", "and", "6", "hours", "after", "I", ".", "P", ".", "challenge", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "PBS", "at", "the", "relevant", "time", "-", "point", ".", "Quantification", "of", "intracellular", "production", "of", "IL", "-", "1β", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "PBS", ".", "Quantification", "of", "IL", "-", "1β", "secreted", "into", "the", "media", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "A", "horizontal", "dotted", "line", "represents", "the", "limit", "of", "detection", "of", "the", "ELISA", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "PBS", ".", "WT", "mixed", "glial", "cultures", "were", "co", "-", "treated", "with", "MPSIIIA", "GAG", "(", "4", "μg", "/", "ml", ")", "and", "/", "or", "the", "TLR4", "inhibitor", "CLI", "-", "095", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "for", "24", "hours", ".", "The", "intracellular", "production", "of", "IL", "-", "1β", "was", "measured", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "MPSIIIA", "GAG", "+", "vehicle", ".", "Multi", "-", "heparinase", "(", "HepM", ")", "and", "/", "or", "chondroitinase", "ABC", "(", "cABC", ")", "digests", "were", "performed", "on", "MPSIIIA", "GAG", ",", "and", "the", "resulting", "oligosaccharides", "applied", "to", "a", "WT", "mixed", "glial", "culture", "for", "24", "hours", "alongside", "heparin", ",", "bovine", "HS", "(", "bHS", ")", ",", "porcine", "DS", "(", "pDS", ")", "and", "WT", "GAG", ".", "The", "intracellular", "production", "of", "IL", "-", "1β", "was", "measured", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "MPSIIIA", "GAG", "alone", ".", "MPSIIIA", "GAG", "was", "2", "-", "O", "-", "desulphated", "(", "hashed", "bars", ")", "utilising", "120", "mM", "NaOH", ",", "and", "compositional", "HS", "disaccharide", "analysis", "performed", "via", "RP", "-", "HPLC", "against", "untreated", "MPSIIIA", "GAG", "(", "black", "bars", ")", "to", "validate", "complete", "2", "-", "O", "-", "desulphation", ".", "Percentage", "contribution", "of", "each", "modification", "were", "determined", "(", "n", "=", "3", "GAG", "samples", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "2S", "MPSIIIA", "GAG", "vs", ".", "2S", "2", "-", "ODS", "MPSIIIA", "GAG", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "NS", ",", "N", "-", "sulphated", "glucosamine", ";", "2S", ",", "2", "-", "O", "-", "sulphate", "group", ";", "6S", ",", "6", "-", "O", "sulphate", "group", ".", "MPSIIIA", "GAG", "was", "2", "-", "O", "-", "desulphated", "and", "the", "resulting", "oligosaccharides", "applied", "to", "a", "WT", "mixed", "glial", "culture", "for", "24", "hours", ".", "The", "intracellular", "production", "of", "IL", "-", "1β", "was", "measured", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "MPSIIIA", "GAG", "vs", ".", "2ODS", "MPSIIIA", "GAG", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "2ODS", ",", "2", "-", "O", "-", "desulphated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The expression of Il1b was measured in whole brain using quantitative PCR 1 hour, 2 hours and 6 hours after I.P. challenge (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by two-way ANOVA with Bonferroni's post-test; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus PBS at the relevant time-point.Quantification of intracellular production of IL-1β (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; ***P<0.001. Symbols above bars are versus PBS. Quantification of IL-1β secreted into the media (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). A horizontal dotted line represents the limit of detection of the ELISA. Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus PBS.WT mixed glial cultures were co-treated with MPSIIIA GAG (4 μg/ml) and/or the TLR4 inhibitor CLI-095 (1 μg/ml) for 24 hours. The intracellular production of IL-1β was measured (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; ***P<0.001. Symbols above bars are versus MPSIIIA GAG + vehicle.Multi-heparinase (HepM) and/or chondroitinase ABC (cABC) digests were performed on MPSIIIA GAG, and the resulting oligosaccharides applied to a WT mixed glial culture for 24 hours alongside heparin, bovine HS (bHS), porcine DS (pDS) and WT GAG. The intracellular production of IL-1β was measured (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; *P<0.05, ***P<0.001. Symbols above bars are versus MPSIIIA GAG alone.MPSIIIA GAG was 2-O-desulphated (hashed bars) utilising 120 mM NaOH, and compositional HS disaccharide analysis performed via RP-HPLC against untreated MPSIIIA GAG (black bars) to validate complete 2-O-desulphation. Percentage contribution of each modification were determined (n=3 GAG samples). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by two-way ANOVA with Bonferroni's post-test; 2S MPSIIIA GAG vs. 2S 2-ODS MPSIIIA GAG P<0.0001. NS, N-sulphated glucosamine; 2S, 2-O-sulphate group; 6S, 6-O sulphate group.MPSIIIA GAG was 2-O-desulphated and the resulting oligosaccharides applied to a WT mixed glial culture for 24 hours. The intracellular production of IL-1β was measured (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; MPSIIIA GAG vs. 2ODS MPSIIIA GAG P<0.0001. 2ODS, 2-O-desulphated."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "sections", "from", "9", "month", "old", "WT", "and", "MPSIIIA", "brains", "showing", "secondary", "storage", "of", "GM2", "ganglioside", ",", "cholesterol", ",", "protein", "aggregates", "and", "amyloid", "beta", "peptide", "1", "-", "40", "and", "1", "-", "42", "within", "cortical", "layers", "II", "to", "V", "/", "VI", ",", "x20", ",", "scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Inserts", ",", "100x", ",", "scale", "bar", ":", "10μm", ".", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", "ATP", "levels", "in", "whole", "brain", "homogenate", "from", "9", "month", "old", "WT", "and", "MPSIIIA", "mice", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "WT", "vs", ".", "MPSIIIA", "P", "<", "0", ".", "02Brain", "transcription", "of", "mRNA", "species", "for", "various", "inflammasome", "components", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", ",", "data", "for", "each", "cytokine", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WTCaspase", "1", "activity", "levels", "in", "whole", "brain", "homogenate", "from", "WT", "and", "MPSIIIA", "mice", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "WT", "vs", ".", "MPSIIIA", "P", "<", "0", ".", "0001WT", "(", "E", "-", "G", ")", "and", "Nlrp3", "-", "/", "-", "(", "H", "-", "J", ")", "mixed", "glia", "were", "primed", "with", "MPSIIIA", "GAG", "or", "LPS", ".", "ATP", "(", "5", "mM", ")", ",", "cholesterol", "crystals", "(", "1", "mg", "/", "ml", ")", "or", "amyloid", "-", "β", "fibrils", "(", "Aβ1", "-", "40", "4", ".", "3", "μM", "and", "Aβ1", "-", "42", "5", "μM", ")", "were", "added", "4", "hours", "post", "-", "priming", "stimulus", ",", "and", "the", "secretion", "of", "IL", "-", "1β", "into", "the", "media", "measured", "via", "ELISA", "after", "a", "further", "20", "hours", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative sections from 9 month old WT and MPSIIIA brains showing secondary storage of GM2 ganglioside, cholesterol, protein aggregates and amyloid beta peptide 1-40 and 1-42 within cortical layers II to V/VI, x20, scale bar: 50 μm. Inserts, 100x, scale bar: 10μm. (n=4 mice per group)ATP levels in whole brain homogenate from 9 month old WT and MPSIIIA mice (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by unpaired t-test. WT vs. MPSIIIA P<0.02Brain transcription of mRNA species for various inflammasome components (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV, data for each cytokine were tested by unpaired t-test; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus WTCaspase 1 activity levels in whole brain homogenate from WT and MPSIIIA mice (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by unpaired t-test. WT vs. MPSIIIA P<0.0001WT (E-G) and Nlrp3-/- (H-J) mixed glia were primed with MPSIIIA GAG or LPS. ATP (5 mM), cholesterol crystals (1 mg/ml) or amyloid-β fibrils (Aβ1-40 4.3 μM and Aβ1-42 5 μM) were added 4 hours post-priming stimulus, and the secretion of IL-1β into the media measured via ELISA after a further 20 hours (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; *P<0.05, ***P<0.001"}
{"words": ["Figure", "4The", "biological", "activity", "of", "LV", "-", "mediated", "IL", "-", "1Ra", "was", "assessed", "in", "vitro", ".", "RAW264", ".", "7", "macrophages", "were", "transduced", "with", "LV", ".", "IL1RN", "or", "LV", ".", "GFP", "vectors", "at", "a", "MOI", "of", "10", ".", "After", "72", "hours", "cells", "were", "stimulated", "with", "recombinant", "hIL", "-", "1β", "and", "the", "expression", "of", "TNF", "-", "α", "assessed", "after", "a", "further", "48", "hours", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "NTC", "within", "a", "treatment", "group", ".", "A", "portion", "of", "transduced", "HSCs", "were", "plated", "into", "CFU", "assays", ",", "incubated", "for", "12", "days", "and", "CFU", "colonies", "analysed", ".", "Vector", "copy", "number", "were", "quantified", "(", "n", "=", "6", "CFU", "assays", ")", ".", "A", "portion", "of", "transduced", "HSCs", "were", "plated", "into", "CFU", "assays", ",", "incubated", "for", "12", "days", "and", "CFU", "colonies", "analysed", ".", "protein", "production", "of", "secreted", "human", "IL", "-", "1Ra", "were", "quantified", "(", "n", "=", "6", "CFU", "assays", ")", ".", "A", "portion", "of", "transduced", "HSCs", "were", "plated", "into", "CFU", "assays", ",", "incubated", "for", "12", "days", "and", "CFU", "colonies", "analysed", ".", "intracellular", "human", "IL", "-", "1Ra", "were", "quantified", "(", "n", "=", "6", "CFU", "assays", ")", ".", "Donor", "chimerism", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", "at", "4", "months", "of", "age", "(", "2", "months", "post", "-", "transplant", ")", "(", "n", "=", "10", "mice", ")", ".", "based", "on", "peripheral", "blood", "composition", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", "at", "4", "months", "of", "age", "(", "2", "months", "post", "-", "transplant", ")", "(", "n", "=", "10", "mice", ")", ".", "Human", "IL", "-", "1Ra", "expression", "was", "quantified", "in", "the", "plasma", "of", "mice", "at", "6", "months", "of", "age", "(", "4", "months", "post", "-", "transplant", ")", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "WT", "vs", ".", "LV", ".", "IL1RN", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "MPSIIIA", "vs", ".", "LV", ".", "IL1RN", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WT", ".", "Vector", "copy", "number", "was", "evaluated", "in", "brain", ",", "spleen", ",", "liver", ",", "white", "blood", "cells", "(", "WBC", ")", "and", "bone", "marrow", "(", "BM", ")", "of", "mice", "at", "6", "months", "of", "age", "(", "4", "months", "post", "-", "transplant", ")", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Quantification", "of", "human", "IL", "-", "1Ra", "levels", "in", "the", "brain", "of", "transplanted", "MPSIIIA", "mice", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "WT", "vs", ".", "LV", ".", "IL1RN", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "MPSIIIA", "vs", ".", "LV", ".", "IL1RN", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WT", ".", "Representative", "sections", "from", "6", "-", "month", "old", "MPSIIIA", "and", "LV", ".", "IL1RN", "transplanted", "MPSIIIA", "mice", ".", "Sections", "show", "the", "CA3", "region", "of", "the", "hippocampus", ".", "Cells", "expressing", "high", "levels", "of", "human", "IL", "-", "1Ra", "are", "indicated", "with", "black", "arrows", ".", "40x", ",", "scale", "bar", ",", "50", "μm", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4The biological activity of LV-mediated IL-1Ra was assessed in vitro. RAW264.7 macrophages were transduced with LV.IL1RN or LV.GFP vectors at a MOI of 10. After 72 hours cells were stimulated with recombinant hIL-1β and the expression of TNF-α assessed after a further 48 hours. (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by two-way ANOVA with Bonferroni's post-test; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus NTC within a treatment group.A portion of transduced HSCs were plated into CFU assays, incubated for 12 days and CFU colonies analysed. Vector copy number were quantified (n=6 CFU assays).A portion of transduced HSCs were plated into CFU assays, incubated for 12 days and CFU colonies analysed. protein production of secreted human IL-1Ra were quantified (n=6 CFU assays).A portion of transduced HSCs were plated into CFU assays, incubated for 12 days and CFU colonies analysed. intracellular human IL-1Ra were quantified (n=6 CFU assays).Donor chimerism was determined by flow cytometry at 4 months of age (2 months post-transplant) (n=10 mice).based on peripheral blood composition was determined by flow cytometry at 4 months of age (2 months post-transplant) (n=10 mice).Human IL-1Ra expression was quantified in the plasma of mice at 6 months of age (4 months post-transplant) (n=10 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; WT vs. LV.IL1RN P<0.0001; MPSIIIA vs. LV.IL1RN P<0.0001. Symbols above bars are versus WT.Vector copy number was evaluated in brain, spleen, liver, white blood cells (WBC) and bone marrow (BM) of mice at 6 months of age (4 months post-transplant) (n=10 mice per group).Quantification of human IL-1Ra levels in the brain of transplanted MPSIIIA mice (n=10 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; WT vs. LV.IL1RN P<0.0001; MPSIIIA vs. LV.IL1RN P<0.0001. Symbols above bars are versus WT.Representative sections from 6-month old MPSIIIA and LV.IL1RN transplanted MPSIIIA mice. Sections show the CA3 region of the hippocampus. Cells expressing high levels of human IL-1Ra are indicated with black arrows. 40x, scale bar, 50 μm (n=4 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "5Mice", "were", "placed", "in", "the", "centre", "of", "the", "Y", "-", "maze", "and", "allowed", "to", "explore", "freely", "for", "10", "minutes", ".", "The", "percentage", "of", "spontaneous", "alternations", "in", "the", "Y", "-", "maze", "were", "measured", "to", "assess", "working", "memory", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01A", "one", "-", "hour", "open", "field", "test", "was", "performed", "and", "path", "length", "measured", "as", "an", "indicator", "of", "hyperactivity", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Mice were placed in the centre of the Y-maze and allowed to explore freely for 10 minutes. The percentage of spontaneous alternations in the Y-maze were measured to assess working memory (n=10 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; *P<0.05, **P<0.01A one-hour open field test was performed and path length measured as an indicator of hyperactivity (n=10 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; ***P<0.001. Symbols above bars are versus WT"}
{"words": ["Figure", "6Representative", "images", "of", "the", "hippocampus", "and", "cortex", "(", "layers", "II", "-", "V", ")", "from", "control", "and", "treated", "mice", "stained", "with", "anti", "-", "mouse", "glial", "fibrillary", "acidic", "protein", "(", "GFAP", ";", "red", ")", "/", "DAPI", "(", "nuclear", ",", "blue", ")", "to", "identify", "activated", "astrocytes", ",", "20x", ",", "scale", "bar", ":", "50μm", "Representative", "images", "of", "the", "hippocampus", "and", "cortex", "(", "layers", "II", "-", "V", ")", "from", "control", "and", "treated", "mice", "stained", "with", "isolectin", "B4", "(", "ILB4", ")", "to", "identify", "activated", "microglia", ",", "20x", ",", "scale", "bar", ":", "50μThe", "average", "number", "of", "GFAP", "positive", "astrocyte", "cells", "over", "three", "fields", "of", "view", "per", "mouse", "of", "the", "hippocampus", "(", "C", ")", "and", "the", "cortex", "(", "D", ")", "were", "counted", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ",", "average", "of", "3", "fields", "of", "view", "per", "mouse", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WTThe", "average", "number", "of", "ILB4", "+", "positive", "microglial", "cells", "over", "three", "fields", "of", "view", "per", "mouse", "of", "the", "hippocampus", "(", "C", ")", "and", "the", "cortex", "(", "D", ")", "were", "counted", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ",", "average", "of", "3", "fields", "of", "view", "per", "mouse", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative images of the hippocampus and cortex (layers II-V) from control and treated mice stained with anti-mouse glial fibrillary acidic protein (GFAP; red)/DAPI (nuclear, blue) to identify activated astrocytes, 20x, scale bar: 50μm Representative images of the hippocampus and cortex (layers II-V) from control and treated mice stained with isolectin B4 (ILB4) to identify activated microglia, 20x, scale bar: 50μThe average number of GFAP positive astrocyte cells over three fields of view per mouse of the hippocampus (C) and the cortex (D) were counted (n=4 mice per group, average of 3 fields of view per mouse). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus WTThe average number of ILB4+ positive microglial cells over three fields of view per mouse of the hippocampus (C) and the cortex (D) were counted (n=4 mice per group, average of 3 fields of view per mouse). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; ***P<0.001. Symbols above bars are versus WT"}
{"words": ["Figure", "1Purified", "Drosophila", "Delta", "and", "Serrate", "NE3", "proteins", "bind", "to", "liposomes", "(", "D", ")", "Binding", "is", "reduced", "in", "Delta", "∆", "β1", "-", "2", ",", "but", "not", "to", "the", "Serrate", "equivalent", "using", "liposomes", "composed", "of", "PC", ":", "PS", ":", "PE", "-", "fluoroscein", "(", "80", ":", "15", ":", "5", ")", ".", "Notch", "binding", "to", "Drosophila", "Delta", "NE3", "(", "E", ")", "WT", "and", "∆", "β1", "-", "2", "(", "Delta", "∆", "β1", "-", "2", ")", "variants", "both", "bind", "to", "Notch", ",", "unlike", "variant", "with", "F204A", "substitution", "in", "DSL", "domain", ".", "Comparisons", "were", "performed", "with", "a", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Values", "are", "shown", "as", "scattered", "data", "points", "with", "the", "dark", "lines", "representing", "the", "means", ".", "ns", ",", "no", "significant", "difference", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Purified Drosophila Delta and Serrate NE3 proteins bind to liposomes (D) Binding is reduced in Delta∆β1-2, but not to the Serrate equivalent using liposomes composed of PC:PS:PE-fluoroscein (80:15:5). Notch binding to Drosophila Delta NE3 (E) WT and ∆β1-2 (Delta∆β1-2) variants both bind to Notch, unlike variant with F204A substitution in DSL domain. Comparisons were performed with a two-tailed unpaired t-test. Values are shown as scattered data points with the dark lines representing the means. ns, no significant difference, **P < 0.01; ***P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "2Adult", "wings", "from", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "flies", ".", "No", "defects", "are", "detected", "in", "wings", "from", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "/", "+", "(", "B", ")", ",", "Homozygous", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "/", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "have", "extra", "vein", "tissue", "near", "L5", "and", "uneven", "L2", "veins", "(", "arrowheads", ";", "C", ")", ".", "Microchaetae", "are", "arranged", "in", "rows", "on", "the", "thorax", "of", "control", "(", "yw", ")", "flies", ";", "these", "become", "disordered", "and", "more", "dense", "in", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "/", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", ".", "White", "rectangle", "indicates", "area", "scored", "for", "E", "Number", "of", "microchaetes", "per", "central", "area", "(", "white", "rectangle", "in", "D", ")", "in", "the", "indicated", "genotypes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Adult wings from Dl∆β1-2 flies. No defects are detected in wings from Dl∆β1-2/+ (B), Homozygous Dl∆β1-2/ Dl∆β1-2 have extra vein tissue near L5 and uneven L2 veins (arrowheads; C).Microchaetae are arranged in rows on the thorax of control (yw) flies; these become disordered and more dense in Dl∆β1-2/Dl∆β1-2. White rectangle indicates area scored for E Number of microchaetes per central area (white rectangle in D) in the indicated genotypes."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "images", "of", "adult", "females", "wings", "in", "combinations", "of", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "with", "loss", "of", "function", "Delta", "alleles", ".", "In", "combinations", "with", "Dlrev10", "(", "A", ")", ",", "Dl", "∆", "Exon2", "(", "B", ")", ",", "or", "Df", "(", "3R", ")", "DlFx3", "(", "C", ")", ",", "vein", "thickening", "is", "strongly", "enhanced", "(", "right", "panels", ")", "compared", "to", "heterozygous", "mutants", "alone", "(", "left", "panels", ")", ".", "Vertical", "square", "brackets", "indicate", "the", "regions", "used", "for", "vein", "thickness", "quantification", ".", "Quantification", "of", "wing", "-", "vein", "thickness", "in", "females", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Representative", "images", "of", "adult", "female", "wings", "demonstrate", "that", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "rescues", "the", "wing", "notching", "phenotype", ",", "caused", "by", "a", "Notch", "loss", "of", "function", "allele", "(", "N55e11", ")", ".", "Horizontal", "square", "bracket", "indicates", "the", "L5", "vein", "\"", "delta", "\"", "at", "the", "intersection", "with", "the", "wing", "margin", "analyzed", "in", "EV2E", ".", "Quantification", "of", "wing", "notching", "in", "females", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "rescues", "notching", "in", "a", "similar", "manner", "to", "Dlrev10", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative images of adult females wings in combinations of Dl∆β1-2 with loss of function Delta alleles. In combinations with Dlrev10 (A), Dl∆Exon2 (B), or Df(3R)DlFx3 (C), vein thickening is strongly enhanced (right panels) compared to heterozygous mutants alone (left panels). Vertical square brackets indicate the regions used for vein thickness quantification. Quantification of wing-vein thickness in females of the indicated genotypes. Representative images of adult female wings demonstrate that Dl∆β1-2 rescues the wing notching phenotype, caused by a Notch loss of function allele (N55e11). Horizontal square bracket indicates the L5 vein \"delta\" at the intersection with the wing margin analyzed in EV2E. Quantification of wing notching in females of the indicated genotypes, Dl∆β1-2 rescues notching in a similar manner to Dlrev10."}
{"words": ["Figure", "4Equatorial", "region", "of", "eye", "imaginal", "discs", "where", "E", "(", "spl", ")", "mδ0", ".", "5", "expression", "(", "green", ")", "becomes", "restricted", "to", "a", "single", "photoreceptor", "in", "each", "cluster", "(", "magenta", ")", ",", "as", "detected", "in", "control", "and", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "/", "+", "discs", "(", "top", "panels", ")", ".", "In", "Df", "(", "3R", ")", "DlFx3", "/", "+", "and", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "/", "Df", "(", "3R", ")", "DlFx3", "discs", "(", "bottom", "panels", ")", "E", "(", "spl", ")", "mδ0", ".", "5", "expression", "is", "reduced", "(", "Df", "(", "3R", ")", "DlFx3", "/", "+", ")", "or", "absent", "from", "several", "clusters", "(", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "/", "Df", "(", "3R", ")", "DlFx3", ")", "indicative", "of", "reduced", "Notch", "signalling", ".", "Scale", "bars", "correspond", "to", "10", "μm", ".", "Proportion", "of", "photoreceptors", "clusters", "that", "fail", "to", "express", "the", "E", "(", "spl", ")", "mδ0", ".", "5", "reporter", "in", "the", "indicated", "genotypes", ".", "ns", ",", "no", "significant", "difference", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "On", "the", "violin", "plot", ",", "dashed", "line", "represents", "the", "median", "and", "the", "dotted", "lines", "show", "the", "quartiles", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Equatorial region of eye imaginal discs where E(spl)mδ0.5 expression (green) becomes restricted to a single photoreceptor in each cluster (magenta), as detected in control and Dl∆β1-2/+ discs (top panels). In Df(3R)DlFx3 /+ and Dl∆β1-2/Df(3R)DlFx3 discs (bottom panels) E(spl)mδ0.5 expression is reduced (Df(3R)DlFx3 /+) or absent from several clusters (Dl∆β1-2/Df(3R)DlFx3) indicative of reduced Notch signalling. Scale bars correspond to 10 μm.Proportion of photoreceptors clusters that fail to express the E(spl)mδ0.5 reporter in the indicated genotypes. ns, no significant difference, *** P<0.0001 (one-way ANOVA). On the violin plot, dashed line represents the median and the dotted lines show the quartiles."}
{"words": ["Figure", "5Apical", "view", "of", "wing", "imaginal", "disc", "with", "homozygous", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "clones", "(", "GFP", "negative", ")", "stained", "for", "Dl", "(", "red", ")", "and", "Cadherin", "(", "blue", ")", ".", "(", "A", "'", ")", "Z", "-", "projection", "of", "apical", "layers", "spanning", "a", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "clone", "(", "GFP", "negative", ")", "located", "at", "the", "DV", "boundary", ".", "No", "change", "in", "apical", "localisation", "of", "Dl", "(", "red", ")", "and", "Cadherin", "(", "blue", ")", "is", "detected", ".", "Panels", "on", "the", "right", "show", "the", "Dl", "(", "grayscale", ")", "apical", "localisation", "on", "the", "wing", "imaginal", "disc", ".", "Uptake", "assay", "at", "t", "=", "0", ".", "After", "exposure", "to", "extracellular", "anti", "-", "Dl", "antibody", ",", "Dl", "protein", "(", "red", ")", "is", "detected", "at", "similar", "levels", "apical", "to", "Cadherin", "(", "blue", ")", "in", "wild", "-", "type", "(", "GFP", ")", "and", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "mutant", "tissue", "(", "GFP", "negative", ")", ".", "(", "B", "'", ")", "Cross", "-", "sectional", "view", "of", "B", ",", "Dl", "protein", "(", "red", ")", "is", "present", "apically", "relative", "to", "Cadherin", "(", "Blue", ")", "which", "marks", "adherens", "junctions", ".", "Middle", "and", "lower", "panels", "show", "the", "crosssection", "in", "grayscale", "of", "the", "apical", "marker", "Cadherin", "(", "Cad", ")", "and", "Delta", "(", "Dl", ")", ",", "respectively", ".", "Uptake", "assay", "after", "30", "minutes", ",", "internalised", "anti", "-", "Dl", "(", "red", ")", "enters", "the", "endocytic", "route", "and", "in", "the", "cross", "sectional", "view", "(", "C", "'", ")", "can", "similarly", "be", "detected", "as", "puncta", "along", "the", "cell", "axis", "in", "wild", "-", "type", "(", "GFP", ")", "and", "homozygous", "Dl", "∆", "β1", "-", "2", "(", "GFP", "negative", ")", "tissue", ".", "Middle", "and", "lower", "panels", "show", "the", "crosssection", "in", "grayscale", "of", "the", "apical", "marker", "Cadherin", "(", "Cad", ")", "and", "Delta", "(", "Dl", ")", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Apical view of wing imaginal disc with homozygous Dl∆β1-2 clones (GFP negative) stained for Dl (red) and Cadherin (blue). (A') Z-projection of apical layers spanning a Dl∆β1-2 clone (GFP negative) located at the DV boundary. No change in apical localisation of Dl (red) and Cadherin (blue) is detected. Panels on the right show the Dl (grayscale) apical localisation on the wing imaginal disc.Uptake assay at t=0. After exposure to extracellular anti-Dl antibody, Dl protein (red) is detected at similar levels apical to Cadherin (blue) in wild-type (GFP) and Dl∆β1-2 mutant tissue (GFP negative). (B') Cross-sectional view of B, Dl protein (red) is present apically relative to Cadherin (Blue) which marks adherens junctions. Middle and lower panels show the crosssection in grayscale of the apical marker Cadherin (Cad) and Delta (Dl), respectively. Uptake assay after 30 minutes, internalised anti-Dl (red) enters the endocytic route and in the cross sectional view (C') can similarly be detected as puncta along the cell axis in wild-type (GFP) and homozygous Dl∆β1-2 (GFP negative) tissue. Middle and lower panels show the crosssection in grayscale of the apical marker Cadherin (Cad) and Delta (Dl), respectively."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Western", "blotting", "was", "performed", "to", "determine", "FoxO1", "expression", ",", "p62", "degradation", "and", "LC3", "-", "II", "accumulation", "in", "H1299", ",", "HCT116", "and", "HeLa", "cells", "in", "response", "to", "serum", "starvation", "(", "SS", ")", "for", "24", "h", "or", "0", ".", "5", "mM", "H2O2", "for", "6", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "E64", "and", "pepstatin", "A", "(", "PEPS", "A", ")", ".", "(", "b", ",", "c", ")", "Stable", "FoxO1", "knockdown", "HCT116", "cells", ",", "or", "cells", "with", "an", "empty", "RNAi", "plasmid", ",", "were", "incubated", "in", "a", "serum", "-", "free", "medium", "for", "up", "to", "36", "h", "(", "b", ")", "or", "treated", "with", "0", ".", "5", "mM", "H2O2", "for", "up", "to", "12", "h", "(", "c", ")", ";", "western", "blotting", "was", "performed", "to", "detect", "changes", "in", "FoxO1", ",", "p62", ",", "LC3", "-", "II", "or", "β", "-", "actin", ".", "(", "d", ")", "HCT116", "cells", "were", "labelled", "with", "[", "3H", "]", "leucine", "for", "48", "h", ",", "washed", "and", "incubated", "for", "24", "h", ",", "before", "being", "subjected", "to", "serum", "starvation", "for", "24", "h", "or", "0", ".", "5", "mM", "H2O2", "for", "12", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", ".", "At", "12", "or", "24", "h", "after", "treatment", ",", "the", "relative", "degradation", "of", "long", "-", "lived", "proteins", "was", "measured", "by", "counting", "radioactivity", ".", "Data", "in", "d", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Two", "asterisks", ",", "P", "0", ".", "01", ";", "asterisk", ",", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "e", ")", "Autophagic", "vesicles", "or", "autophagosomes", "in", "HCT116", "cells", "or", "stable", "FoxO1", "-", "RNAi", "HCT116", "cells", ",", "were", "observed", "by", "electron", "microscopy", "after", "24", "h", "of", "serum", "starvation", ".", "The", "bottom", "picture", "enlargement", "showing", "clearer", "autophagic", "vesicles", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "The", "graph", "shows", "a", "statistical", "analysis", "of", "autophagic", "vesicles", "in", "HCT116", "cells", "with", "or", "without", "knockdown", "of", "FoxO1", "in", "response", "to", "serum", "starvation", ".", "Data", "in", "e", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "f", ")", "LC3", "-", "immunopositive", "punctate", "signals", "were", "observed", "in", "HCT116", "or", "in", "stable", "FoxO1", "-", "RNAi", "HCT116", "cells", "in", "response", "to", "serum", "starvation", "for", "24", "h", "or", "0", ".", "5", "mM", "H2O2", "treatment", ".", "(", "g", ")", "Quantification", "of", "LC3", "-", "positive", "punctate", "cells", "in", "f", ".", "Data", "in", "g", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "h", ")", "A", "rescue", "experiment", "using", "a", "specific", "mutated", "FoxO1", "plasmid", "to", "validate", "the", "activity", "of", "FoxO1", "in", "the", "induction", "of", "autophagy", "in", "HCT116", "cells", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", ",", "with", "or", "without", "E64", "and", "pepstatin", "A", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Western blotting was performed to determine FoxO1 expression, p62 degradation and LC3-II accumulation in H1299, HCT116 and HeLa cells in response to serum starvation (SS) for 24 h or 0.5 mM H2O2 for 6 h in the presence or absence of E64 and pepstatin A (PEPS A).(b, c) Stable FoxO1 knockdown HCT116 cells, or cells with an empty RNAi plasmid, were incubated in a serum-free medium for up to 36 h (b) or treated with 0.5 mM H2O2 for up to 12 h (c); western blotting was performed to detect changes in FoxO1, p62, LC3-II or β-actin.(d) HCT116 cells were labelled with [3H]leucine for 48 h, washed and incubated for 24 h, before being subjected to serum starvation for 24 h or 0.5 mM H2O2 for 12 h in the presence or absence of 3-MA. At 12 or 24 h after treatment, the relative degradation of long-lived proteins was measured by counting radioactivity. Data in d are means ± s.d. (n = 3). Two asterisks, P 0.01; asterisk, P 0.05; NS, not significant, P > 0.05; Student's t-test.(e) Autophagic vesicles or autophagosomes in HCT116 cells or stable FoxO1-RNAi HCT116 cells, were observed by electron microscopy after 24 h of serum starvation. The bottom picture enlargement showing clearer autophagic vesicles indicated by an arrow. The graph shows a statistical analysis of autophagic vesicles in HCT116 cells with or without knockdown of FoxO1 in response to serum starvation. Data in e are means ± s.d. (n = 3).(f) LC3-immunopositive punctate signals were observed in HCT116 or in stable FoxO1-RNAi HCT116 cells in response to serum starvation for 24 h or 0.5 mM H2O2 treatment. (g) Quantification of LC3-positive punctate cells in f. Data in g are means ± s. d. (n = 3).(h) A rescue experiment using a specific mutated FoxO1 plasmid to validate the activity of FoxO1 in the induction of autophagy in HCT116 cells in the presence or absence of serum, with or without E64 and pepstatin A."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "A", "Flag", "-", "tagged", "FoxO1", "(", "WT", ")", ",", "FoxO1", "(", "ΔDB", ")", ",", "FoxO1", "(", "ΔDB3A", ")", "or", "an", "empty", "plasmid", "was", "individually", "transfected", "into", "GFP", "-", "LC3", "pre", "-", "transfected", "H1299", "cells", ",", "and", "the", "cellular", "localization", "of", "FoxO1", "(", "upper", "panels", ")", "or", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "signals", "(", "lower", "panels", ")", "was", "observed", "with", "a", "confocal", "microscope", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "b", ")", "The", "numbers", "of", "punctate", "GFP", "-", "LC3", "cells", "are", "represented", "by", "the", "ratio", "of", "GFP", "-", "LC3", "-", "labelled", "punctate", "cells", "to", "overall", "survived", "H1299", "cells", "(", "at", "least", "200", "cells", "were", "counted", ")", ".", "Data", "in", "b", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "c", ")", "p62", "degradation", "and", "LC3", "-", "II", "accumulation", "were", "evaluated", "by", "western", "blotting", "in", "H1299", "cells", "transfected", "with", "exogenous", "FoxO1", "-", "expressing", "plasmids", "mentioned", "above", ".", "(", "d", ")", "H1299", "cells", "were", "labelled", "with", "[", "3H", "]", "leucine", "for", "48", "h", ",", "then", "transfected", "with", "a", "control", "plasmid", "or", "various", "Flag", "-", "FoxO1", "plasmids", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "or", "E64", "and", "pepstatin", "A", ".", "Degradation", "of", "long", "-", "lived", "proteins", "was", "measured", "at", "the", "indicated", "time", ",", "24", "h", "after", "transfection", ".", "Data", "in", "d", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "e", ")", "A", "GFP", "-", "tagged", "FoxO1", "(", "3A", ")", "or", "an", "empty", "plasmid", "was", "co", "-", "transfected", "with", "a", "FoxO1", "-", "promoter", "luciferase", "plasmid", "into", "H1299", "cells", ".", "After", "24", "h", ",", "luciferase", "reporter", "activity", "of", "FoxO1", "was", "measured", ".", "RLU", ",", "relative", "luciferase", "units", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "f", ")", "A", "set", "of", "RNAi", "-", "resistant", "rescue", "forms", "of", "FoxO1", "plasmids", "were", "transfected", "into", "stable", "FoxO1", "-", "RNAi", "HCT116", "cells", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "E64", "and", "pepstatin", "A", ".", "Western", "blotting", "was", "performed", "to", "detect", "p62", "degradation", "and", "LC3", "-", "II", "accumulation", ".", "(", "g", ")", "Flag", "-", "tagged", "FoxO1", "(", "WT", ")", "r", ",", "FoxO1", "(", "3A", ")", "r", ",", "FoxO1", "(", "3A", "-", "NLSm", ")", "r", ",", "FoxO1", "(", "NESm", ")", "r", "or", "an", "empty", "plasmid", "were", "individually", "transfected", "into", "GFP", "-", "LC3", "pre", "-", "transfected", "HCT116", "cells", "(", "FoxO1", "-", "RNAi", "treated", ")", ",", "and", "the", "cellular", "localization", "of", "FoxO1", "(", "upper", "panels", ")", "or", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "signals", "(", "lower", "panels", ")", "were", "observed", "with", "a", "confocal", "microscope", ".", "(", "h", ")", "The", "numbers", "of", "punctate", "GFP", "-", "LC3", "cells", "are", "represented", "by", "the", "ratio", "of", "GFP", "-", "LC3", "-", "labelled", "punctate", "cells", "to", "overall", "survived", "HCT116", "cells", ".", "Data", "in", "h", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) A Flag-tagged FoxO1(WT), FoxO1(ΔDB), FoxO1(ΔDB3A) or an empty plasmid was individually transfected into GFP-LC3 pre-transfected H1299 cells, and the cellular localization of FoxO1 (upper panels) or GFP-LC3 punctate signals (lower panels) was observed with a confocal microscope. Scale bars, 10 μm. (b) The numbers of punctate GFP-LC3 cells are represented by the ratio of GFP-LC3-labelled punctate cells to overall survived H1299 cells (at least 200 cells were counted). Data in b are means ± s.d. (n = 3).(c) p62 degradation and LC3-II accumulation were evaluated by western blotting in H1299 cells transfected with exogenous FoxO1-expressing plasmids mentioned above.(d) H1299 cells were labelled with [3H]leucine for 48 h, then transfected with a control plasmid or various Flag-FoxO1 plasmids, in the presence or absence of 3-MA or E64 and pepstatin A. Degradation of long-lived proteins was measured at the indicated time, 24 h after transfection. Data in d are means ± s.d. (n = 3).(e) A GFP-tagged FoxO1(3A) or an empty plasmid was co-transfected with a FoxO1-promoter luciferase plasmid into H1299 cells. After 24 h, luciferase reporter activity of FoxO1 was measured. RLU, relative luciferase units. Data are means ± s.d. (n = 3).(f) A set of RNAi-resistant rescue forms of FoxO1 plasmids were transfected into stable FoxO1-RNAi HCT116 cells in the presence or absence of E64 and pepstatin A. Western blotting was performed to detect p62 degradation and LC3-II accumulation.(g) Flag-tagged FoxO1(WT)r, FoxO1(3A)r, FoxO1(3A-NLSm)r, FoxO1(NESm)r or an empty plasmid were individually transfected into GFP-LC3 pre-transfected HCT116 cells (FoxO1-RNAi treated), and the cellular localization of FoxO1 (upper panels) or GFP-LC3 punctate signals (lower panels) were observed with a confocal microscope. (h) The numbers of punctate GFP-LC3 cells are represented by the ratio of GFP-LC3-labelled punctate cells to overall survived HCT116 cells. Data in h are means ± s.d. (n = 3)."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Different", "FoxO1", "-", "expressing", "plasmids", ",", "namely", "FoxO1", "(", "WT", ")", ",", "FoxO1", "(", "3A", ")", ",", "FoxO1", "(", "ΔDB", ")", ",", "FoxO1", "(", "ΔDB3A", ")", ",", "FoxO1", "(", "NESm", ")", "and", "FoxO1", "(", "3A", "-", "NLSm", ")", ",", "were", "transfected", "into", "H1299", "cells", "and", "cell", "fractionation", "was", "performed", "to", "analyse", "cellular", "localization", "(", "N", ",", "nucleus", ";", "C", ",", "cytoplasm", ")", "of", "these", "FoxO1", "mutants", ".", "PCAF", "is", "a", "loading", "control", "for", "nuclear", "protein", ",", "and", "actin", "is", "the", "loading", "control", "for", "cytoplasmic", "protein", ".", "(", "b", ")", "Quantitative", "PCR", "was", "performed", "to", "measure", "the", "transactivity", "of", "autophagy", "-", "related", "genes", "in", "transfected", "H1299", "cells", "with", "different", "FoxO1", "-", "expressing", "plasmids", "(", "upper", "panel", ")", "or", "in", "stable", "FoxO1", "-", "RNAi", "or", "non", "-", "RNAi", "-", "treated", "HCT116", "cells", "in", "response", "to", "serum", "starvation", "for", "24", "h", "or", "0", ".", "5", "mM", "H2O2", "for", "12", "h", "(", "lower", "panel", ")", ".", "All", "data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "c", ")", "Different", "FoxO1", "-", "mutant", "-", "expressing", "plasmids", "were", "transfected", "into", "H1299", "cells", "and", "a", "ChIP", "assay", "was", "performed", "to", "measure", "the", "binding", "activity", "of", "these", "mutated", "FoxO1", "to", "the", "p27", "promoter", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Different FoxO1-expressing plasmids, namely FoxO1(WT), FoxO1(3A), FoxO1(ΔDB), FoxO1(ΔDB3A), FoxO1(NESm) and FoxO1(3A-NLSm), were transfected into H1299 cells and cell fractionation was performed to analyse cellular localization (N, nucleus; C, cytoplasm) of these FoxO1 mutants. PCAF is a loading control for nuclear protein, and actin is the loading control for cytoplasmic protein.(b) Quantitative PCR was performed to measure the transactivity of autophagy-related genes in transfected H1299 cells with different FoxO1-expressing plasmids (upper panel) or in stable FoxO1-RNAi or non-RNAi-treated HCT116 cells in response to serum starvation for 24 h or 0.5 mM H2O2 for 12 h (lower panel). All data are means ± s.d. (n = 3).(c) Different FoxO1-mutant-expressing plasmids were transfected into H1299 cells and a ChIP assay was performed to measure the binding activity of these mutated FoxO1 to the p27 promoter."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "serum", "starvation", "for", "24", "h", "(", "upper", "panels", ")", "or", "0", ".", "5", "mM", "H2O2", "for", "12", "h", "(", "lower", "panels", ")", ";", "cytosolic", "proteins", "were", "extracted", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FoxO1", "and", "probed", "with", "anti", "-", "acetylated", "lysine", "(", "Ace", "-", "lyn", ")", ".", "Both", "bottom", "panels", "display", "cytosolic", "FoxO1", ".", "IP", ",", "immunoprecipitation", ".", "(", "b", ")", "HCT116", "cells", "were", "serum", "-", "starved", "for", "24", "h", "and", "the", "cytosolic", "proteins", "were", "extracted", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FoxO1", "or", "anti", "-", "SIRT2", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-", "SIRT2", "or", "anti", "-", "FoxO1", ",", "respectively", "(", "top", "and", "middle", "panels", ")", ".", "FoxO1", "(", "WT", ")", "was", "also", "transfected", "into", "H1299", "cells", "and", "the", "cytosolic", "protein", "was", "extracted", ",", "followed", "by", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FoxO1", "and", "probing", "with", "anti", "-", "SIRT2", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "(", "c", ")", "HCT116", "cells", "were", "transfected", "with", "SIRT2", "RNAi", "plasmid", "or", "an", "empty", "control", "plasmid", ".", "At", "48", "h", "after", "transfection", ",", "the", "cytosolic", "lysate", "was", "extracted", "for", "probing", "with", "SIRT2", "or", "FoxO1", "(", "upper", "panels", ")", ",", "or", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FoxO1", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-", "acetylated", "lysine", "(", "lower", "panels", ")", ".", "IB", ",", "immunoblot", ".", "(", "d", ")", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "AGK2", "for", "24", "h", "at", "different", "doses", ",", "as", "indicated", ".", "The", "cytosolic", "lysate", "was", "extracted", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FoxO1", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-", "acetylated", "lysine", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) HCT116 cells were treated with serum starvation for 24 h (upper panels) or 0.5 mM H2O2 for 12 h (lower panels); cytosolic proteins were extracted for co-immunoprecipitation with anti-FoxO1 and probed with anti-acetylated lysine (Ace-lyn). Both bottom panels display cytosolic FoxO1. IP, immunoprecipitation.(b) HCT116 cells were serum-starved for 24 h and the cytosolic proteins were extracted for co-immunoprecipitation with anti-FoxO1 or anti-SIRT2, followed by probing with anti-SIRT2 or anti-FoxO1, respectively (top and middle panels). FoxO1(WT) was also transfected into H1299 cells and the cytosolic protein was extracted, followed by co-immunoprecipitation with anti-FoxO1 and probing with anti-SIRT2 (bottom panels).(c) HCT116 cells were transfected with SIRT2 RNAi plasmid or an empty control plasmid. At 48 h after transfection, the cytosolic lysate was extracted for probing with SIRT2 or FoxO1 (upper panels), or for co-immunoprecipitation with anti-FoxO1, followed by probing with anti-acetylated lysine (lower panels). IB, immunoblot.(d) HCT116 cells were treated with AGK2 for 24 h at different doses, as indicated. The cytosolic lysate was extracted for co-immunoprecipitation with anti-FoxO1, followed by probing with anti-acetylated lysine."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ",", "b", ")", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "an", "empty", "control", "plasmid", "or", "with", "the", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "WT", ")", "plasmid", ".", "At", "24", "h", "after", "transfection", ",", "the", "cytosolic", "lysate", "was", "extracted", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FoxO1", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-", "mTOR", ",", "Beclin", "1", ",", "Vps34", "or", "Atg1", "(", "a", ")", "and", "with", "Atg3", ",", "Atg4", ",", "Atg10", ",", "Atg7", "or", "LC3", "(", "b", ")", ".", "(", "c", ")", "H1299", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Myc", "-", "Atg7", ",", "with", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "WT", ")", "or", "with", "an", "empty", "control", "plasmid", ".", "At", "24", "h", "after", "transfection", ",", "the", "cytosolic", "lysate", "was", "extracted", "for", "Flag", "with", "anti", "-", "Flag", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-", "Myc", ".", "HCT116", "cells", "were", "serum", "-", "starved", "for", "24", "h", "(", "d", ")", "and", "the", "cytosolic", "lysate", "was", "extracted", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FoxO1", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-", "Atg7", "(", "e", ")", "Different", "Myc", "-", "tagged", "FoxO1", "fragments", "and", "Flag", "-", "tagged", "Atg7", "were", "co", "-", "transfected", "into", "H1299", "cells", ",", "and", "the", "cytosolic", "lysate", "was", "extracted", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Myc", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-", "Flag", ".", "(", "f", ")", "HCT116", "cells", "were", "transfected", "with", "an", "empty", "control", "plasmid", ",", "an", "SIRT2", "(", "WT", ")", "-", "expressing", "plasmid", "or", "an", "SIRT2", "(", "168A", ")", "-", "expressing", "plasmid", ".", "At", "24", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "serum", "-", "starved", "for", "24", "h", ",", "and", "the", "cytosolic", "lysate", "was", "extracted", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FoxO1", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-", "Atg7", ".", "HCT116", "cells", "weretreated", "with", "AGK2", "for", "24", "h", "(", "g", ")", ",", "and", "the", "cytosolic", "lysate", "was", "extracted", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FoxO1", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a, b) H1299 cells were transfected with an empty control plasmid or with the Flag-FoxO1(WT) plasmid. At 24 h after transfection, the cytosolic lysate was extracted for co-immunoprecipitation with anti-FoxO1, followed by probing with anti-mTOR, Beclin 1, Vps34 or Atg1 (a) and with Atg3, Atg4, Atg10, Atg7 or LC3 (b).(c) H1299 cells were co-transfected with Myc-Atg7, with Flag-FoxO1(WT) or with an empty control plasmid. At 24 h after transfection, the cytosolic lysate was extracted for Flag with anti-Flag, followed by probing with anti-Myc.HCT116 cells were serum-starved for 24 h (d)and the cytosolic lysate was extracted for co-immunoprecipitation with anti-FoxO1, followed by probing with anti-Atg7(e) Different Myc-tagged FoxO1 fragments and Flag-tagged Atg7 were co-transfected into H1299 cells, and the cytosolic lysate was extracted for co-immunoprecipitation with anti-Myc, followed by probing with anti-Flag.(f) HCT116 cells were transfected with an empty control plasmid, an SIRT2(WT)-expressing plasmid or an SIRT2(168A)-expressing plasmid. At 24 h after transfection, cells were serum-starved for 24 h, and the cytosolic lysate was extracted for co-immunoprecipitation with anti-FoxO1, followed by probing with anti-Atg7.HCT116 cells weretreated with AGK2 for 24 h (g), and the cytosolic lysate was extracted for co-immunoprecipitation with anti-FoxO1, followed by probing with anti-Atg7"}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "HCT116", "cells", "or", "stable", "FoxO1", "-", "RNAi", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "a", "non", "-", "specific", "RNAi", "control", "or", "SIRT2", "-", "RNAi", ",", "and", "LC3", "-", "II", "accumulation", "or", "p62", "degradation", "was", "detected", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "E64", "and", "pepstatin", "A", ".", "(", "b", ")", "HCT116", "cells", "or", "stable", "FoxO1", "-", "RNAi", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μM", "AGK2", "for", "24", "h", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "E64", "and", "pepstatin", "A", ".", "Changes", "in", "FoxO1", ",", "p62", "and", "LC3", "-", "II", "were", "determined", "by", "western", "blotting", "(", "upper", "panels", ")", ",", "or", "the", "formation", "of", "LC3", "punctate", "signals", "was", "observed", "(", "lower", "panels", ")", ".", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μM", "AGK2", "for", "24", "h", "and", "the", "formation", "of", "LC3", "punctate", "signals", "was", "observed", ".", "Quantification", "of", "the", "ratio", "of", "LC3", "punctate", "cells", "to", "overall", "HCT116", "cells", "is", "shown", "in", "the", "lower", "right", "panel", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "c", ")", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "WT", ")", ",", "SIRT2", "(", "WT", ")", "or", "SIRT2", "(", "168A", ")", ".", "At", "24", "h", "after", "transfection", ",", "the", "cell", "lysate", "was", "extracted", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "SIRT2", ",", "anti", "-", "LC3", ",", "anti", "-", "p62", "or", "anti", "-", "β", "-", "actin", ".", ".", "(", "d", ")", "HCT116", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "control", "plasmid", ",", "a", "SIRT2", "(", "WT", ")", "-", "expressing", "plasmid", "or", "a", "SIRT2", "(", "168A", ")", "-", "expressing", "plasmid", ".", "At", "24", "h", "after", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "subjected", "to", "serum", "starvation", "for", "24", "h", ".", "The", "cell", "lysate", "was", "extracted", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "SIRT2", ",", "anti", "-", "LC3", ",", "anti", "-", "p62", "or", "anti", "-", "β", "-", "actin", ".", "(", "e", ")", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "Myc", "-", "Atg7", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "WT", ")", "or", "mutated", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "KR", ")", ".", "At", "24", "h", "after", "transfection", ",", "the", "cytosolic", "lysate", "was", "extracted", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Myc", ",", "followed", "by", "probing", "with", "anti", "-", "Flag", ".", "(", "f", ")", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "control", "plasmid", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "WT", ")", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "K262R", ")", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "K265R", ")", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "K274R", ")", "or", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "KR", ")", ".", "At", "24h", "after", "transfection", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "E64", "and", "pepstatin", "A", "and", "immunoblotted", ",", "the", "cell", "lysate", "was", "extracted", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "LC3", ",", "anti", "-", "p62", "or", "anti", "-", "β", "-", "actin", ".", "(", "g", ")", "Left", ":", "H1299", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "WT", ")", "or", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "KR", ")", ".", "The", "formation", "of", "GFP", "-", "LC3", "-", "labelled", "punctate", "signals", "was", "observed", "24", "h", "after", "transfection", ".", "Right", ":", "quantification", "of", "the", "ratio", "of", "GFP", "-", "LC3", "-", "labelled", "punctate", "cells", "to", "overall", "survived", "H1299", "cells", ".", "Data", "in", "g", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", "(", "b", ")", ",", "10", "μm", "(", "g", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) HCT116 cells or stable FoxO1-RNAi HCT116 cells were treated with a non-specific RNAi control or SIRT2-RNAi, and LC3-II accumulation or p62 degradation was detected in the presence or absence of E64 and pepstatin A.(b) HCT116 cells or stable FoxO1-RNAi HCT116 cells were treated with 10 μM AGK2 for 24 h, in the presence or absence of E64 and pepstatin A. Changes in FoxO1, p62 and LC3-II were determined by western blotting (upper panels), or the formation of LC3 punctate signals was observed (lower panels). HCT116 cells were treated with 10 μM AGK2 for 24 h and the formation of LC3 punctate signals was observed. Quantification of the ratio of LC3 punctate cells to overall HCT116 cells is shown in the lower right panel. Data are means ± s.d. (n = 3).(c) H1299 cells were transfected with Flag-FoxO1(WT), SIRT2(WT) or SIRT2(168A). At 24 h after transfection, the cell lysate was extracted and immunoblotted with anti-Flag, anti-SIRT2, anti-LC3, anti-p62 or anti-β-actin..(d) HCT116 cells were transfected with a control plasmid, a SIRT2(WT)-expressing plasmid or a SIRT2(168A)-expressing plasmid. At 24 h after transfection, the cells were subjected to serum starvation for 24 h. The cell lysate was extracted and immunoblotted with anti-SIRT2, anti-LC3, anti-p62 or anti-β-actin.(e) H1299 cells were transfected with Myc-Atg7, Flag-FoxO1(WT) or mutated Flag-FoxO1(KR). At 24 h after transfection, the cytosolic lysate was extracted for co-immunoprecipitation with anti-Myc, followed by probing with anti-Flag.(f) H1299 cells were transfected with a control plasmid, Flag-FoxO1(WT), Flag-FoxO1(K262R), Flag-FoxO1(K265R), Flag-FoxO1(K274R) or Flag-FoxO1(KR). At 24h after transfection in the presence or absence of E64 and pepstatin A and immunoblotted, the cell lysate was extracted and immunoblotted with anti-Flag, anti-LC3, anti-p62 or anti-β-actin.(g) Left: H1299 cells were co-transfected with GFP-LC3, Flag-FoxO1(WT) or Flag-FoxO1(KR). The formation of GFP-LC3-labelled punctate signals was observed 24 h after transfection. Right: quantification of the ratio of GFP-LC3-labelled punctate cells to overall survived H1299 cells. Data in g are means ± s.d. (n = 3). Scale bars, 25 μm (b), 10 μm (g)."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "control", "plasmid", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "WT", ")", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "3A", ")", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "ΔDB", ")", "or", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "ΔDB3A", ")", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "mM", "3", "-", "MA", "(", "upper", "panel", ")", "or", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "50", "μM", "Z", "-", "VAD", "-", "fmk", "(", "lower", "panel", ")", ";", "cells", "were", "stained", "with", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "48", "h", "after", "transfection", ".", "PI", "-", "stained", "(", "dead", ")", "cells", "were", "counted", "by", "flow", "cytometry", "and", "the", "percentage", "cell", "loss", "was", "calculated", ".", "(", "b", ")", "FoxO1", "(", "WT", ")", "or", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "ΔDB", ")", "was", "transfected", "into", "H1299", "cells", ";", "48", "h", "later", "the", "autophagic", "vesicles", "were", "observed", "under", "an", "electron", "microscope", ".", "Enlarged", "images", "(", "right", ")", "show", "clearer", "autophagic", "vesicles", "indicated", "by", "arrows", ".", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "(", "c", ")", "48", "h", "cells", "with", "or", "without", "Atg5", "RNAi", "were", "transfected", "with", "FoxO1", "(", "WT", ")", ",", "and", "cell", "death", "was", "determined", "by", "staining", "with", "PI", "at", "48", "h", "after", "transfection", ".", "Data", "in", "c", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "d", ")", "The", "stable", "Atg5", "knockdown", "H1299", "cells", "was", "further", "transfected", "with", "a", "control", "plasmid", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "WT", ")", ",", "or", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "ΔDB", ")", ",", "and", "the", "percentage", "cell", "loss", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "at", "48", "h", "after", "transfection", ".", "Data", "in", "d", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) H1299 cells were transfected with a control plasmid, Flag-FoxO1(WT), Flag-FoxO1(3A), Flag-FoxO1(ΔDB) or Flag-FoxO1(ΔDB3A), in the presence or absence of 10 mM 3-MA (upper panel) or in the presence or absence of 50 μM Z-VAD-fmk (lower panel); cells were stained with propidium iodide (PI) 48 h after transfection. PI-stained (dead) cells were counted by flow cytometry and the percentage cell loss was calculated.(b) FoxO1(WT) or Flag-FoxO1(ΔDB) was transfected into H1299 cells; 48 h later the autophagic vesicles were observed under an electron microscope. Enlarged images (right) show clearer autophagic vesicles indicated by arrows. Scale bars, 2 μm.(c) 48 h cells with or without Atg5 RNAi were transfected with FoxO1(WT), and cell death was determined by staining with PI at 48 h after transfection. Data in c are means ± s.d. (n = 3).(d) The stable Atg5 knockdown H1299 cells was further transfected with a control plasmid, Flag-FoxO1(WT), or Flag-FoxO1(ΔDB), and the percentage cell loss was quantified by flow cytometry at 48 h after transfection. Data in d are means ± s.d. (n = 3)."}
{"words": ["figf8", "(", "a", ")", "Stable", "H1299", "cells", "with", "or", "without", "Atg7", "knockdown", "were", "transfected", "with", "a", "control", "plasmid", "(", "group", "1", ")", ",", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "ΔDB", ")", "(", "group", "2", ")", "or", "Flag", "-", "FoxO1", "(", "ΔDB", "-", "3A", ")", "(", "group", "3", ")", ";", "107", "cells", "were", "then", "injected", "into", "18", "nude", "mice", ",", "with", "6", "mice", "per", "group", ".", "Seven", "weeks", "later", "the", "mice", "were", "killed", "and", "the", "tumours", "were", "weighed", "and", "analysed", "(", "bottom", "graph", ")", ".", "Group", "1", ":", "tumour", "weights", "were", "1", ".", "22", "±", "0", ".", "78", "g", "(", "without", "Atg7", "RNAi", ")", "and", "1", ".", "31", "±", "0", ".", "43", "g", "(", "with", "Atg7", "RNAi", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "426", ".", "Group", "2", ":", "tumour", "weights", "were", "0", ".", "49", "±", "0", ".", "18", "g", "(", "without", "Atg7", "RNAi", ")", "and", "0", ".", "80", "±", "0", ".", "20", "g", "(", "with", "Atg7", "RNAi", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "017", ".", "Group", "3", ":", "tumour", "weights", "were", "1", ".", "00", "±", "0", ".", "40", "g", "(", "without", "Atg7", "RNAi", ")", "and", "1", ".", "10", "±", "0", ".", "36", "g", "(", "with", "Atg7", "RNAi", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "500", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "b", ")", "Expression", "levels", "of", "FoxO1", "and", "Atg7", "conjugate", "in", "mice", "tumours", "were", "determined", "by", "western", "blotting", ".", "(", "c", ")", "HCT116", "cells", "(", "107", ")", "or", "stable", "FoxO1", "-", "knockdown", "HCT116", "cells", "(", "107", ")", "were", "injected", "into", "the", "left", "or", "right", "hind", "legs", "of", "three", "nude", "mice", ".", "Six", "weeks", "later", "the", "mice", "were", "killed", "and", "the", "tumours", "were", "weighed", "and", "analysed", "(", "bottom", "graph", ")", ".", "Tumour", "weights", "were", "0", ".", "08", "±", "0", ".", "10", "g", "(", "without", "FoxO1", "RNAi", ")", "and", "0", ".", "48", "±", "0", ".", "06", "g", "(", "with", "FoxO1", "RNAi", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "020", ".", "Data", "are", "means", "±", "sd", ".", "n", "=", "3", ".", "(", "d", ")", "Protein", "was", "extracted", "from", "one", "paired", "colon", "tumour", "(", "T", ")", "or", "adjacent", "normal", "tissue", "(", "N", ")", "from", "one", "patient", ",", "and", "western", "blotting", "was", "performed", "to", "detect", "changes", "in", "FoxO1", "or", "p62", ".", "(", "e", ")", "Proteins", "were", "extracted", "from", "16", "paired", "samples", "from", "patients", "for", "western", "blotting", "with", "anti", "-", "FoxO1", "or", "with", "anti", "-", "p62", "antibody", ".", "Protein", "bands", "were", "scanned", "with", "a", "phosphorimager", "and", "relative", "band", "intensity", "was", "normalized", "to", "the", "β", "-", "actin", "band", ".", "FoxO1", "of", "normal", "tissue", ",", "0", ".", "37", ";", "FoxO1", "of", "tumour", "tissue", ",", "0", ".", "10", ";", "P", "=", "0", ".", "001", ",", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", ".", "p62", "of", "normal", "tissue", ",", "0", ".", "32", ";", "p62", "of", "tumour", "tissue", ",", "1", ".", "00", ";", "P", "=", "0", ".", "009", ",", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", ".", "Data", "in", "e", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "16", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf8(a) Stable H1299 cells with or without Atg7 knockdown were transfected with a control plasmid (group 1), Flag-FoxO1(ΔDB) (group 2) or Flag-FoxO1(ΔDB-3A) (group 3); 107 cells were then injected into 18 nude mice, with 6 mice per group. Seven weeks later the mice were killed and the tumours were weighed and analysed (bottom graph). Group 1: tumour weights were 1.22 ± 0.78 g (without Atg7 RNAi) and 1.31 ± 0.43 g (with Atg7 RNAi), P = 0.426. Group 2: tumour weights were 0.49 ± 0.18 g (without Atg7 RNAi) and 0.80 ± 0.20 g (with Atg7 RNAi), P = 0.017. Group 3: tumour weights were 1.00 ± 0.40 g (without Atg7 RNAi) and 1.10 ± 0.36 g (with Atg7 RNAi), P = 0.500. Data are means ± s.d. (n = 6).(b) Expression levels of FoxO1 and Atg7 conjugate in mice tumours were determined by western blotting.(c) HCT116 cells (107) or stable FoxO1-knockdown HCT116 cells (107) were injected into the left or right hind legs of three nude mice. Six weeks later the mice were killed and the tumours were weighed and analysed (bottom graph). Tumour weights were 0.08 ± 0.10 g (without FoxO1 RNAi) and 0.48 ± 0.06 g (with FoxO1 RNAi), P = 0.020. Data are means ± sd. n = 3.(d) Protein was extracted from one paired colon tumour (T) or adjacent normal tissue (N) from one patient, and western blotting was performed to detect changes in FoxO1 or p62.(e) Proteins were extracted from 16 paired samples from patients for western blotting with anti-FoxO1 or with anti-p62 antibody. Protein bands were scanned with a phosphorimager and relative band intensity was normalized to the β-actin band. FoxO1 of normal tissue, 0.37; FoxO1 of tumour tissue, 0.10; P = 0.001, two-sided t-test. p62 of normal tissue, 0.32; p62 of tumour tissue, 1.00; P = 0.009, two-sided t-test. Data in e are means ± s.d. (n = 16)."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "dual", "-", "channel", "kymographs", "showing", "that", "Rheb", "is", "recruited", "to", "mitochondria", "in", "axons", "and", "co", "-", "migrates", "with", "mitochondria", "in", "a", "predominant", "retrograde", "direction", "upon", "mitochondrial", "membrane", "potential", "(", "∆", "ψm", ")", "dissipation", ".", "The", "motility", "of", "mitochondria", "(", "Mito", ")", "and", "Rheb", "-", "associated", "mitochondria", "(", "Rheb", "-", "Mito", ")", "in", "axons", "were", "quantified", ",", "respectively", ".", "Vertical", "lines", "represent", "stationary", "organelles", ".", "Slanted", "lines", "or", "curves", "to", "the", "right", "(", "negative", "slope", ")", "represent", "anterograde", "movement", ";", "those", "to", "the", "left", "(", "positive", "slope", ")", "indicate", "retrograde", "movement", ".", "An", "organelle", "was", "considered", "stationary", "if", "it", "remained", "immotile", "(", "displacement", "≤", "5", "μm", ")", ".", "Time", "-", "lapse", "images", "(", "B", ")", "showing", "colocalization", "and", "comigration", "(", "white", "arrows", ")", "of", "Rheb", "with", "mitochondria", "in", "a", "retrograde", "direction", "along", "axons", "during", "a", "148", "-", "s", "recording", "period", ".", "Cortical", "neurons", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "Rheb", "and", "DsRed", "-", "Mito", "at", "5", "-", "7", "DIV", "and", "incubated", "with", "DMSO", "or", "10", "μM", "CCCP", "for", "24", "hr", "prior", "to", "imaging", "at", "10", "-", "12", "DIV", ".", "quantitative", "analysis", "showing", "that", "Rheb", "is", "recruited", "to", "mitochondria", "in", "axons", "and", "co", "-", "migrates", "with", "mitochondria", "in", "a", "predominant", "retrograde", "direction", "upon", "mitochondrial", "membrane", "potential", "(", "∆", "ψm", ")", "dissipation", ".", "The", "motility", "of", "mitochondria", "(", "Mito", ")", "and", "Rheb", "-", "associated", "mitochondria", "(", "Rheb", "-", "Mito", ")", "in", "axons", "were", "quantified", ",", "respectively", ".", "Vertical", "lines", "represent", "stationary", "organelles", ".", "Slanted", "lines", "or", "curves", "to", "the", "right", "(", "negative", "slope", ")", "represent", "anterograde", "movement", ";", "those", "to", "the", "left", "(", "positive", "slope", ")", "indicate", "retrograde", "movement", ".", "An", "organelle", "was", "considered", "stationary", "if", "it", "remained", "immotile", "(", "displacement", "≤", "5", "μm", ")", ".", "Quantitative", "analysis", "showing", "robust", "association", "of", "Rheb", "with", "depolarized", "mitochondria", "within", "axons", "treated", "with", "CCCP", ".", "The", "percentages", "of", "mitochondria", "targeted", "by", "Rheb", "or", "Rheb", "-", "SSVM", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "CCCP", "were", "quantified", ",", "respectivelyrepresentative", "images", "showing", "robust", "association", "of", "Rheb", "with", "depolarized", "mitochondria", "within", "axons", "treated", "with", "CCCP", ".", "Rheb", "-", "SSVM", ",", "a", "farnesylation", "deficient", "mutant", "of", "Rheb", ",", "fails", "to", "be", "recruited", "to", "mitochondria", "upon", "dissipating", "∆", "ψm", ".", "Mitochondria", "associated", "with", "Rheb", "were", "marked", "by", "white", "arrows", ".", "F", "-", "H", "Representative", "dual", "-", "channel", "kymographs", "(", "F", ")", "and", "quantitative", "analysis", "(", "G", ",", "H", ")", "showing", "that", "Rheb", "-", "mediated", "mitophagy", "activation", "depends", "on", "Rheb", "recruitment", "to", "mitochondria", "through", "Rheb", "farnesylation", ".", "Note", "that", "Rheb", ",", "but", "not", "Rheb", "-", "SSVM", ",", "is", "associated", "with", "autophagic", "vacuoles", "(", "AVs", ")", "within", "axons", "upon", "∆", "ψm", "dissipation", ".", "Rheb", "-", "associated", "AVs", "move", "in", "a", "predominant", "retrograde", "direction", "along", "axons", ".", "The", "number", "of", "Rheb", "-", "associated", "AVs", "(", "Rheb", "-", "AVs", ")", "with", "or", "without", "CCCP", "treatment", "and", "the", "relative", "motilities", "of", "AVs", "and", "Rheb", "-", "AVs", "in", "CCCP", "-", "treated", "axons", "were", "quantified", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative dual-channel kymographs showing that Rheb is recruited to mitochondria in axons and co-migrates with mitochondria in a predominant retrograde direction upon mitochondrial membrane potential (∆ψm) dissipation. The motility of mitochondria (Mito) and Rheb-associated mitochondria (Rheb-Mito) in axons were quantified, respectively. Vertical lines represent stationary organelles. Slanted lines or curves to the right (negative slope) represent anterograde movement; those to the left (positive slope) indicate retrograde movement. An organelle was considered stationary if it remained immotile (displacement ≤ 5 μm).Time-lapse images (B) showing colocalization and comigration (white arrows) of Rheb with mitochondria in a retrograde direction along axons during a 148-s recording period. Cortical neurons were transfected with GFP-Rheb and DsRed-Mito at 5-7 DIV and incubated with DMSO or 10 μM CCCP for 24 hr prior to imaging at 10-12 DIV.quantitative analysis showing that Rheb is recruited to mitochondria in axons and co-migrates with mitochondria in a predominant retrograde direction upon mitochondrial membrane potential (∆ψm) dissipation. The motility of mitochondria (Mito) and Rheb-associated mitochondria (Rheb-Mito) in axons were quantified, respectively. Vertical lines represent stationary organelles. Slanted lines or curves to the right (negative slope) represent anterograde movement; those to the left (positive slope) indicate retrograde movement. An organelle was considered stationary if it remained immotile (displacement ≤ 5 μm).Quantitative analysis showing robust association of Rheb with depolarized mitochondria within axons treated with CCCP. The percentages of mitochondria targeted by Rheb or Rheb-SSVM in the presence or absence of CCCP were quantified, respectivelyrepresentative images showing robust association of Rheb with depolarized mitochondria within axons treated with CCCP. Rheb-SSVM, a farnesylation deficient mutant of Rheb, fails to be recruited to mitochondria upon dissipating ∆ψm. Mitochondria associated with Rheb were marked by white arrows.F-H Representative dual-channel kymographs (F) and quantitative analysis (G, H) showing that Rheb-mediated mitophagy activation depends on Rheb recruitment to mitochondria through Rheb farnesylation. Note that Rheb, but not Rheb-SSVM, is associated with autophagic vacuoles (AVs) within axons upon ∆ψm dissipation. Rheb-associated AVs move in a predominant retrograde direction along axons. The number of Rheb-associated AVs (Rheb-AVs) with or without CCCP treatment and the relative motilities of AVs and Rheb-AVs in CCCP-treated axons were quantified, respectively"}
{"words": ["Figure", "2Representative", "dual", "-", "channel", "kymographs", "showing", "that", "Rheb", "enhances", "mitophagy", "in", "CCCP", "-", "treated", "axons", ".", "quantitative", "analysis", "showing", "that", "Rheb", "enhances", "mitophagy", "in", "CCCP", "-", "treated", "axons", ".", "The", "numbers", "of", "mitochondria", "(", "Mito", ")", ",", "AVs", ",", "and", "Mito", "-", "AVs", "/", "mitophagosomes", ",", "the", "percentage", "of", "Mito", "within", "AVs", ",", "were", "quantifiedquantitative", "analysis", "the", "percentage", "of", "Mito", "within", "AVs", ",", "and", "the", "motilities", "of", "AVs", "and", "Mito", "-", "AVs", "along", "axons", "with", "and", "without", "elevated", "Rheb", "expression", "were", "quantifiedD", ",", "E", "Representative", "images", "(", "D", ")", "and", "quantitative", "analysis", "(", "E", ")", "showing", "that", "mitophagy", "in", "axons", "requires", "Rheb", "and", "Nix", ",", "but", "not", "Parkin", ".", "The", "number", "of", "mitophagosomes", "indicated", "by", "white", "arrows", "and", "the", "percentage", "of", "Mito", "within", "AVs", "in", "CCCP", "-", "treated", "axons", "expressing", "scrambled", "shRNA", ",", "Rheb", "shRNA", ",", "Nix", "shRNA", ",", "or", "Parkin", "shRNA", "were", "quantified", ",", "respectively", "(", "E", ")", ".", "F", ",", "G", "Quantitative", "analysis", "(", "F", ")", "and", "representative", "blots", "(", "G", ")", "showing", "increased", "mitochondrial", "association", "with", "Rheb", "and", "LC3", "-", "II", "in", "mature", "cortical", "neurons", "upon", "∆", "ψm", "depolarization", ".", "Cortical", "neurons", "at", "14", "DIV", "were", "incubated", "with", "DMSO", "or", "10", "μM", "CCCP", "for", "24", "hr", "and", "then", "subjected", "to", "fractionation", "into", "post", "-", "nuclear", "supernatant", "(", "P", ")", ",", "mitochondria", "-", "enriched", "membrane", "fraction", "(", "M", ")", ",", "and", "cytosolic", "supernatant", "(", "S", ")", ".", "Equal", "amounts", "of", "protein", "(", "20", "μg", ")", "were", "sequentially", "immunoblotted", "with", "antibodies", "against", "mitophagic", "/", "autophagic", "proteins", "Rheb", ",", "LC3", ",", "and", "Rab7", ",", "mitochondrial", "protein", "VDAC", ",", "and", "cytosolic", "protein", "GAPDH", "on", "the", "same", "membranes", "after", "stripping", "between", "each", "antibody", "application", ".", "The", "purity", "of", "mitochondrial", "fractions", "was", "confirmed", "by", "enrichment", "of", "VDAC", "and", "less", "abundance", "of", "GAPDH", ",", "compared", "to", "post", "-", "nuclear", "supernatant", ".", "Protein", "levels", "in", "mitochondrial", "fractions", "of", "CCCP", "-", "treated", "neurons", "were", "normalized", "to", "those", "in", "neurons", "incubated", "with", "DMSO", ".", "Data", "were", "quantified", "from", "four", "independent", "repeats", ".", "Quantitative", "analysis", "showing", "that", "Rheb", "RNAi", "augments", "axonal", "retention", "of", "oxidized", "mitochondria", "upon", "∆", "ψm", "depolarization", ".", "The", "fluorescence", "of", "MitoROGFP", "was", "emitted", "at", "510", "nm", "and", "excited", "at", "405", "nm", "or", "488", "nm", ",", "respectively", ".", "Mean", "fluorescence", "intensity", "ratios", "evoked", "by", "the", "two", "excitation", "wavelengths", "at", "individual", "mitochondria", "in", "the", "CCCP", "-", "treated", "axons", "expressing", "scrambled", "shRNA", "or", "Rheb", "shRNA", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "those", "of", "control", "neurons", "transfected", "with", "scrambled", "shRNA", "(", "H", ")", ".", "representative", "images", "showing", "that", "Rheb", "RNAi", "augments", "axonal", "retention", "of", "oxidized", "mitochondria", "upon", "∆", "ψm", "depolarization", ".", "The", "fluorescence", "of", "MitoROGFP", "was", "emitted", "at", "510", "nm", "and", "excited", "at", "405", "nm", "or", "488", "nm", ",", "respectively", ".", "Ratiometric", "images", "were", "generated", "from", "fluorescence", "excited", "by", "405", "nm", "light", "relative", "to", "that", "excited", "by", "488", "nm", "light", ".", "The", "ratio", "has", "been", "false", "colored", "with", "the", "indicated", "heat", "map", ",", "with", "high", "intensity", "indicative", "of", "ROGFP", "fluorescence", "in", "a", "more", "oxidative"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative dual-channel kymographs showing that Rheb enhances mitophagy in CCCP-treated axons.quantitative analysis showing that Rheb enhances mitophagy in CCCP-treated axons. The numbers of mitochondria (Mito), AVs, and Mito-AVs/mitophagosomes, the percentage of Mito within AVs, were quantifiedquantitative analysis the percentage of Mito within AVs, and the motilities of AVs and Mito-AVs along axons with and without elevated Rheb expression were quantifiedD,E Representative images (D) and quantitative analysis (E) showing that mitophagy in axons requires Rheb and Nix, but not Parkin. The number of mitophagosomes indicated by white arrows and the percentage of Mito within AVs in CCCP-treated axons expressing scrambled shRNA, Rheb shRNA, Nix shRNA, or Parkin shRNA were quantified, respectively (E).F,G Quantitative analysis (F) and representative blots (G) showing increased mitochondrial association with Rheb and LC3-II in mature cortical neurons upon ∆ψm depolarization. Cortical neurons at 14 DIV were incubated with DMSO or 10 μM CCCP for 24 hr and then subjected to fractionation into post-nuclear supernatant (P), mitochondria-enriched membrane fraction (M), and cytosolic supernatant (S). Equal amounts of protein (20 μg) were sequentially immunoblotted with antibodies against mitophagic/autophagic proteins Rheb, LC3, and Rab7, mitochondrial protein VDAC, and cytosolic protein GAPDH on the same membranes after stripping between each antibody application. The purity of mitochondrial fractions was confirmed by enrichment of VDAC and less abundance of GAPDH, compared to post-nuclear supernatant. Protein levels in mitochondrial fractions of CCCP-treated neurons were normalized to those in neurons incubated with DMSO. Data were quantified from four independent repeats.Quantitative analysis showing that Rheb RNAi augments axonal retention of oxidized mitochondria upon ∆ψm depolarization. The fluorescence of MitoROGFP was emitted at 510 nm and excited at 405 nm or 488 nm, respectively. Mean fluorescence intensity ratios evoked by the two excitation wavelengths at individual mitochondria in the CCCP-treated axons expressing scrambled shRNA or Rheb shRNA were quantified and normalized to those of control neurons transfected with scrambled shRNA (H).representative images showing that Rheb RNAi augments axonal retention of oxidized mitochondria upon ∆ψm depolarization. The fluorescence of MitoROGFP was emitted at 510 nm and excited at 405 nm or 488 nm, respectively. Ratiometric images were generated from fluorescence excited by 405 nm light relative to that excited by 488 nm light. The ratio has been false colored with the indicated heat map, with high intensity indicative of ROGFP fluorescence in a more oxidative level"}
{"words": ["Figure", "3Aberrant", "accumulation", "of", "mitophagosomes", "co", "-", "labeled", "by", "antibodies", "against", "LC3", "and", "cytochrome", "c", "(", "Cyto", "c", ")", "in", "the", "hippocampal", "mossy", "fibers", "of", "mutant", "hAPP", "Tg", "mouse", "brains", ".", "Note", "that", "mitophagosomes", "indicated", "by", "white", "arrows", "are", "not", "readily", "observed", "in", "WT", "mouse", "brainsThe", "average", "number", "of", "mitophagosomes", "per", "section", "(", "320", "μm", "×", "320", "μm", ")", "was", "quantified", "from", "the", "total", "number", "of", "brain", "slice", "sections", "(", "n", ")", "indicated", "on", "the", "top", "of", "the", "barsC", "Clustering", "of", "mitophagosomes", "(", "white", "arrows", ")", "co", "-", "labeled", "by", "antibodies", "against", "LC3", "and", "Cyto", "c", "or", "p62", "and", "HSP60", "within", "swollen", "/", "dystrophic", "presynaptic", "terminals", "indicated", "by", "synaptophysin", "(", "SYP", ")", "surrounding", "amyloid", "plaques", "in", "AD", "mouse", "brains", ".", "Quantitative", "analysis", "showing", "presynaptic", "retention", "of", "mitophagosome", "-", "like", "structures", "in", "the", "hippocampal", "regions", "of", "mutant", "hAPP", "mouse", "brains", ".", "Data", "were", "quantified", "from", "the", "total", "number", "of", "the", "imaging", "fields", "(", "n", ")", "indicated", "in", "parenthesesrepresentative", "TEM", "images", "showing", "presynaptic", "retention", "of", "mitophagosome", "-", "like", "structures", "in", "the", "hippocampal", "regions", "of", "mutant", "hAPP", "mouse", "brains", ".", "White", "arrow", "-", "labeled", "mitophagosomes", "are", "not", "readily", "detected", "in", "WT", "mouse", "brains", ".", "Black", "arrows", "marked", "amphisomes", "or", "degradative", "autophagic", "vacuoles", "(", "AVd", ")", ".", "F", ",", "G", "Mitophagic", "accumulation", "at", "Aβ", "-", "enriched", "synapses", "in", "AD", "mouse", "brains", ".", "Note", "that", "the", "levels", "of", "mitophagic", "/", "autophagic", "proteins", "(", "red", "box", ")", "along", "with", "Aβ", "(", "green", "box", ")", "are", "increased", "in", "synaptic", "fractions", "isolated", "from", "AD", "mouse", "brains", ".", "Equal", "amounts", "(", "10", "μg", ")", "of", "synaptosomal", "preparations", "(", "Syn", ")", "and", "post", "-", "nuclear", "supernatants", "(", "PNS", ")", "from", "WT", "and", "mutant", "hAPP", "mouse", "brains", "were", "sequentially", "immunoblotted", "with", "antibodies", "against", "hAPP", "/", "Aβ", ",", "Rheb", ",", "LC3", ",", "p62", ",", "and", "Rab7", ",", "as", "well", "as", "mitochondrial", "proteins", "TOM20", "and", "SOD2", "on", "the", "same", "membrane", "after", "stripping", "between", "each", "antibody", "application", ".", "The", "purity", "of", "synaptosomal", "fractions", "was", "confirmed", "by", "relative", "enrichment", "of", "SYP", "and", "less", "abundance", "of", "p115", "and", "GAPDH", "(", "F", ")", ".", "Relative", "protein", "levels", "in", "the", "synaptosomal", "preparations", "from", "mutant", "hAPP", "mice", "were", "compared", "to", "those", "in", "WT", "littermate", "controls", ".", "Data", "were", "quantified", "from", "five", "repeats", "(", "G", ")", ".", "H", ",", "I", "Representative", "blots", "(", "H", ")", "and", "quantitative", "analysis", "(", "I", ")", "showing", "increased", "levels", "of", "Rheb", "along", "with", "LC3", "-", "II", ",", "p62", ",", "and", "Rab7", "(", "red", "box", ")", "in", "Mito", "fractions", "purified", "from", "AD", "mouse", "brains", ".", "The", "purity", "of", "Mito", "fractions", "was", "confirmed", "by", "enrichment", "of", "mitochondrial", "proteins", "VDAC", "and", "TOM20", "and", "by", "the", "absence", "of", "GAPDH", "and", "p115", ",", "relative", "to", "PNS", "fractions", ".", "Data", "were", "quantified", "from", "four", "repeats", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Aberrant accumulation of mitophagosomes co-labeled by antibodies against LC3 and cytochrome c (Cyto c) in the hippocampal mossy fibers of mutant hAPP Tg mouse brains. Note that mitophagosomes indicated by white arrows are not readily observed in WT mouse brainsThe average number of mitophagosomes per section (320 μm × 320 μm) was quantified from the total number of brain slice sections (n) indicated on the top of the barsC Clustering of mitophagosomes (white arrows) co-labeled by antibodies against LC3 and Cyto c or p62 and HSP60 within swollen/dystrophic presynaptic terminals indicated by synaptophysin (SYP) surrounding amyloid plaques in AD mouse brains.Quantitative analysis showing presynaptic retention of mitophagosome-like structures in the hippocampal regions of mutant hAPP mouse brains. Data were quantified from the total number of the imaging fields (n) indicated in parenthesesrepresentative TEM images showing presynaptic retention of mitophagosome-like structures in the hippocampal regions of mutant hAPP mouse brains. White arrow-labeled mitophagosomes are not readily detected in WT mouse brains. Black arrows marked amphisomes or degradative autophagic vacuoles (AVd).F,G Mitophagic accumulation at Aβ-enriched synapses in AD mouse brains. Note that the levels of mitophagic/autophagic proteins (red box) along with Aβ (green box) are increased in synaptic fractions isolated from AD mouse brains. Equal amounts (10 μg) of synaptosomal preparations (Syn) and post-nuclear supernatants (PNS) from WT and mutant hAPP mouse brains were sequentially immunoblotted with antibodies against hAPP/Aβ, Rheb, LC3, p62, and Rab7, as well as mitochondrial proteins TOM20 and SOD2 on the same membrane after stripping between each antibody application. The purity of synaptosomal fractions was confirmed by relative enrichment of SYP and less abundance of p115 and GAPDH (F). Relative protein levels in the synaptosomal preparations from mutant hAPP mice were compared to those in WT littermate controls. Data were quantified from five repeats (G).H,I Representative blots (H) and quantitative analysis (I) showing increased levels of Rheb along with LC3-II, p62, and Rab7 (red box) in Mito fractions purified from AD mouse brains. The purity of Mito fractions was confirmed by enrichment of mitochondrial proteins VDAC and TOM20 and by the absence of GAPDH and p115, relative to PNS fractions. Data were quantified from four repeats."}
{"words": ["Figure", "4Representative", "images", "showing", "increased", "mitochondrial", "association", "with", "Rheb", "in", "AD", "axons", ",", "relative", "to", "that", "of", "WT", "littermate", "controls", ".", "Note", "that", "CCCP", "treatment", "enhances", "Rheb", "localization", "to", "mitochondria", ".", "The", "percentages", "of", "white", "arrow", "-", "marked", "mitochondria", "that", "were", "targeted", "by", "Rheb", "in", "WT", "and", "mutant", "hAPP", "axons", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "CCCPquantitative", "analysis", "The", "percentages", "of", "white", "arrow", "-", "marked", "mitochondria", "that", "were", "targeted", "by", "Rheb", "in", "WT", "and", "mutant", "hAPP", "axons", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "CCCP", "were", "quantified", ",", "respectivelyC", "-", "Representative", "dual", "-", "channel", "kymographs", "showing", "defective", "retrograde", "transport", "and", "mitophagic", "accumulation", "within", "AD", "axons", ".", "mitochondria", "within", "AVs", "in", "WT", "or", "mutant", "hAPP", "axons", "with", "and", "without", "CCCP", "were", "quantifiedquantitative", "analysis", ",", "the", "numbers", "of", "Mito", ",", "AVs", ",", "and", "Mito", "-", "AVs", ",", "and", "the", "percentage", "of", "mitochondria", "within", "AVs", "in", "WT", "or", "mutant", "hAPP", "axons", "with", "and", "without", "CCCP", "were", "quantified", ",", "respectivelyquantitative", "analysis", "Relative", "motility", "of", "AVs", "and", "Mito", "-", "AVs", "/", "mitophagosomes", "in", "WT", "or", "mutant", "hAPP", "axons", "with", "and", "without", "CCCP", "were", "quantifiedF", ",", "G", "Quantitative", "analysis", "(", "F", ")", "and", "representative", "blots", "(", "G", ")", "showing", "that", "∆", "ψm", "depolarization", "augments", "mitophagy", "activation", "in", "cortical", "neurons", "cultured", "from", "AD", "mouse", "brains", ".", "Note", "increased", "localization", "of", "Rheb", "along", "with", "LC3", "-", "II", "and", "Rab7", "to", "mitochondria", "in", "mutant", "hAPP", "Tg", "neurons", "after", "CCCP", "treatment", "(", "red", "box", ")", ".", "Data", "were", "quantified", "from", "three", "independent", "repeats", ".", "P", ":", "post", "-", "nuclear", "supernatants", ";", "M", ":", "mitochondria", "-", "enriched", "membrane", "fractions", ";", "S", ":", "cytosolic", "supernatants", ".", "Quantitative", "analysis", "Mean", "fluorescence", "intensity", "ratios", "evoked", "by", "the", "two", "excitation", "wavelengths", "(", "405", "nm", "and", "488", "nm", ")", "at", "individual", "mitochondria", "in", "mutant", "hAPP", "axons", "with", "and", "without", "CCCP", "treatment", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "those", "of", "WT", "controlsrepresentative", "images", "showing", "abnormal", "accumulation", "of", "oxidatively", "damaged", "mitochondria", "in", "AD", "axons", ",", "which", "is", "exacerbated", "after", "dissipating", "∆", "ψm", ".", "Mean", "fluorescence", "intensity", "ratios", "evoked", "by", "the", "two", "excitation", "wavelengths", "(", "405", "nm", "and", "488", "nm", ")", "at", "individual", "mitochondria", "in", "mutant", "hAPP", "axons", "with", "and", "without", "CCCP", "treatment", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "those", "of", "WT"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative images showing increased mitochondrial association with Rheb in AD axons, relative to that of WT littermate controls. Note that CCCP treatment enhances Rheb localization to mitochondria. The percentages of white arrow-marked mitochondria that were targeted by Rheb in WT and mutant hAPP axons in the absence and presence of CCCPquantitative analysis The percentages of white arrow-marked mitochondria that were targeted by Rheb in WT and mutant hAPP axons in the absence and presence of CCCP were quantified, respectivelyC- Representative dual-channel kymographs showing defective retrograde transport and mitophagic accumulation within AD axons. mitochondria within AVs in WT or mutant hAPP axons with and without CCCP were quantifiedquantitative analysis , the numbers of Mito, AVs, and Mito-AVs, and the percentage of mitochondria within AVs in WT or mutant hAPP axons with and without CCCP were quantified, respectivelyquantitative analysis Relative motility of AVs and Mito-AVs/mitophagosomes in WT or mutant hAPP axons with and without CCCP were quantifiedF,G Quantitative analysis (F) and representative blots (G) showing that ∆ψm depolarization augments mitophagy activation in cortical neurons cultured from AD mouse brains. Note increased localization of Rheb along with LC3-II and Rab7 to mitochondria in mutant hAPP Tg neurons after CCCP treatment (red box). Data were quantified from three independent repeats. P: post-nuclear supernatants; M: mitochondria-enriched membrane fractions; S: cytosolic supernatants.Quantitative analysis Mean fluorescence intensity ratios evoked by the two excitation wavelengths (405 nm and 488 nm) at individual mitochondria in mutant hAPP axons with and without CCCP treatment were quantified and normalized to those of WT controlsrepresentative images showing abnormal accumulation of oxidatively damaged mitochondria in AD axons, which is exacerbated after dissipating ∆ψm. Mean fluorescence intensity ratios evoked by the two excitation wavelengths (405 nm and 488 nm) at individual mitochondria in mutant hAPP axons with and without CCCP treatment were quantified and normalized to those of WT controls"}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "Representative", "images", "(", "A", ")", "and", "quantitative", "analysis", "(", "B", ")", "showing", "aberrant", "accumulation", "of", "mitophagosomes", "labeled", "by", "LC3", "and", "Cyto", "c", "antibodies", "in", "the", "hippocampal", "mossy", "fibers", "of", "snapin", "-", "cKO", "mouse", "brains", ".", "Note", "that", "white", "arrow", "-", "labeled", "mitophagosomes", "are", "not", "readily", "observed", "in", "WT", "mouse", "brains", ".", "The", "average", "number", "of", "mitophagosomes", "per", "section", "(", "320", "μm", "×", "320", "μm", ")", "was", "quantified", ".", "Representative", "blots", "showing", "aberrant", "mitophagic", "retention", "at", "synaptic", "terminals", "in", "snapin", "-", "mutant", "mouse", "brains", ".", "The", "levels", "of", "Rheb", "along", "with", "LC3", "-", "II", ",", "p62", ",", "and", "Rab7", "are", "significantly", "elevated", "in", "the", "synaptosomal", "fractions", "(", "Syn", ")", "purified", "from", "snapin", "-", "deficient", "mouse", "brains", ",", "relative", "to", "those", "of", "WT", "littermate", "controls", "(", "red", "box", ")", ".", "Equal", "amounts", "(", "10", "μg", ")", "of", "Syn", "and", "post", "-", "nuclear", "supernatants", "(", "PNSquantitative", "analysis", "The", "levels", "of", "Rheb", "along", "with", "LC3", "-", "II", ",", "p62", ",", "and", "Rab7", "are", "significantly", "elevated", "in", "the", "synaptosomal", "fractions", "(", "Syn", ")", "purified", "from", "snapin", "-", "deficient", "mouse", "brains", ",", "relative", "to", "those", "of", "WT", "littermate", "controls", "WT", "and", "snapin", "-", "mutant", "mouse", "brains", "were", "sequentially", "immunoblotted", "with", "antibodies", "against", "TOM20", "on", "the", "same", "membrane", "after", "stripping", "between", "each", "antibody", "application", ".", "The", "purity", "of", "synaptosomal", "fractions", "was", "confirmed", "by", "relative", "enrichment", "of", "SYP", "and", "PSD95", "and", "less", "abundance", "of", "GAPDH", ".", "Data", "were", "quantified", "from", "five", "independent", "repeats", ".", "E", ",", "F", "Representative", "blots", "(", "E", ")", "and", "quantitative", "analysis", "(", "F", ")", "showing", "mitophagic", "accumulation", "in", "the", "brains", "of", "snapin", "conditional", "KO", "(", "cKO", ")", "mice", "by", "crossing", "with", "Thy1", "-", "cre", "Tg", "mice", ".", "Note", "increased", "levels", "of", "Rheb", "along", "with", "LC3", "-", "II", ",", "p62", ",", "and", "Rab7", "in", "mitochondrial", "(", "Mito", ")", "fractions", "isolated", "from", "snapin", "-", "deficient", "mouse", "brains", ",", "relative", "to", "those", "of", "WT", "littermate", "controls", "(", "red", "box", ")", ".", "Data", "were", "quantified", "from", "five", "independent", "repeats", ".", "PNS", ":", "post", "-", "nuclear", "supernatants", ".", "G", ",", "H", "Representative", "TEM", "images", "(", "G", ")", "and", "quantitative", "analysis", "(", "H", ")", "showing", "abnormal", "presynaptic", "retention", "of", "mitophagosome", "-", "like", "structures", "in", "the", "hippocampal", "regions", "of", "snapin", "-", "deficient", "mouse", "brains", ".", "Mitophagosomes", ",", "indicated", "by", "black", "arrows", ",", "are", "not", "readily", "detected", "in", "WT", "mouse", "brains", ".", "Data", "were", "quantified", "from", "the", "total", "number", "of", "the", "imaging", "fields", "(", "n", ")", "indicated", "in", "parentheses", "(", "H", ")", ".", "I", ",", "J", "Representative", "images", "(", "I", ")", "and", "quantitative", "analysis", "(", "J", ")", "showing", "that", "deletion", "of", "snapin", "in", "mouse", "brains", "induces", "synaptic", "damage", ".", "Note", "that", "the", "density", "of", "presynaptic", "terminals", "in", "the", "hippocampal", "mossy", "fibers", "revealed", "by", "SYP", "immunostaining", "is", "significantly", "reduced", "in", "snapin", "-", "mutant", "mice", "crossed", "with", "CamKII", "-", "cre", "Tg", "mice", "at", "the", "age", "of", "8", "months", ",", "relative", "to", "that", "of", "WT", "littermate", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A,B Representative images (A) and quantitative analysis (B) showing aberrant accumulation of mitophagosomes labeled by LC3 and Cyto c antibodies in the hippocampal mossy fibers of snapin-cKO mouse brains. Note that white arrow-labeled mitophagosomes are not readily observed in WT mouse brains. The average number of mitophagosomes per section (320 μm × 320 μm) was quantified.Representative blots showing aberrant mitophagic retention at synaptic terminals in snapin-mutant mouse brains. The levels of Rheb along with LC3-II, p62, and Rab7 are significantly elevated in the synaptosomal fractions (Syn) purified from snapin-deficient mouse brains, relative to those of WT littermate controls (red box). Equal amounts (10 μg) of Syn and post-nuclear supernatants (PNSquantitative analysis The levels of Rheb along with LC3-II, p62, and Rab7 are significantly elevated in the synaptosomal fractions (Syn) purified from snapin-deficient mouse brains, relative to those of WT littermate controls WT and snapin-mutant mouse brains were sequentially immunoblotted with antibodies against TOM20 on the same membrane after stripping between each antibody application. The purity of synaptosomal fractions was confirmed by relative enrichment of SYP and PSD95 and less abundance of GAPDH. Data were quantified from five independent repeats.E,F Representative blots (E) and quantitative analysis (F) showing mitophagic accumulation in the brains of snapin conditional KO (cKO) mice by crossing with Thy1-cre Tg mice. Note increased levels of Rheb along with LC3-II, p62, and Rab7 in mitochondrial (Mito) fractions isolated from snapin-deficient mouse brains, relative to those of WT littermate controls (red box). Data were quantified from five independent repeats. PNS: post-nuclear supernatants.G,H Representative TEM images (G) and quantitative analysis (H) showing abnormal presynaptic retention of mitophagosome-like structures in the hippocampal regions of snapin-deficient mouse brains. Mitophagosomes, indicated by black arrows, are not readily detected in WT mouse brains. Data were quantified from the total number of the imaging fields (n) indicated in parentheses (H).I,J Representative images (I) and quantitative analysis (J) showing that deletion of snapin in mouse brains induces synaptic damage. Note that the density of presynaptic terminals in the hippocampal mossy fibers revealed by SYP immunostaining is significantly reduced in snapin-mutant mice crossed with CamKII-cre Tg mice at the age of 8 months, relative to that of WT littermate controls."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "dual", "-", "channel", "kymographs", "(", "A", ")", "and", "quantitative", "analysis", "(", "B", "showing", "that", "overexpression", "of", "Snapin", ",", "but", "not", "Snapin", "-", "L99K", ",", "a", "Snapin", "mutant", "deficient", "in", "dynein", "motor", "binding", ",", "reduces", "mitophagic", "accumulation", "within", "AD", "axons", "incubated", "with", "CCCP", ".", "Representative", "quantitative", "analysis", "showing", "that", "overexpression", "of", "Snapin", ",", "but", "not", "Snapin", "-", "L99K", ",", "a", "SnapinD", "Mean", "fluorescence", "intensity", "ratios", "evoked", "by", "405", "nm", "and", "488", "nm", "excitation", "wavelengths", "at", "individual", "mitochondria", "in", "mutant", "hAPP", "axons", "expressing", "Snapin", "or", "Snapin", "-", "L99K", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "those", "of", "mutant", "hAPP", "controls", ".", "Note", "that", "oxidatively", "stressed", "mitochondria", "are", "reduced", "within", "AD", "axons", "expressing", "Snapin", "after", "CCCP", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative dual-channel kymographs (A) and quantitative analysis (B showing that overexpression of Snapin, but not Snapin-L99K, a Snapin mutant deficient in dynein motor binding, reduces mitophagic accumulation within AD axons incubated with CCCP.Representative quantitative analysis showing that overexpression of Snapin, but not Snapin-L99K, a SnapinD Mean fluorescence intensity ratios evoked by 405 nm and 488 nm excitation wavelengths at individual mitochondria in mutant hAPP axons expressing Snapin or Snapin-L99K were quantified and normalized to those of mutant hAPP controls. Note that oxidatively stressed mitochondria are reduced within AD axons expressing Snapin after CCCP treatment."}
{"words": ["Figure", "7A", "Representative", "images", "showing", "gene", "delivery", "into", "the", "hippocampus", "of", "AD", "mice", "injected", "with", "AAV", "-", "mCherry", "or", "AAV", "-", "mCherry", "-", "Snapin", ".", "mCherry", "fluorescence", "indicated", "by", "white", "arrows", "is", "present", "in", "the", "soma", "and", "processes", "of", "transduced", "neurons", "in", "the", "hippocampal", "CA3", "and", "dentate", "gyrus", "(", "DG", ")", "of", "mutant", "hAPP", "mouse", "brains", ".", "NeuN", ",", "a", "neuronal", "nuclear", "marker", ",", "indicates", "neurons", ".", "Attenuation", "of", "mitophagic", "accumulation", "in", "the", "hippocampal", "mossy", "fibers", "of", "AD", "mice", "transduced", "with", "AAV", "-", "mCherry", "-", "Snapin", ".", "Note", "a", "marked", "reduction", "of", "mitophagosomes", "(", "white", "arrows", ")", "in", "mutant", "hAPP", "Tg", "mouse", "brains", "with", "elevated", "Snapin", "expression", "Cyto", "c", "*", ":", "color", "is", "converted", "from", "blue", "to", "red", "for", "better", "contrastAttenuation", "of", "mitophagic", "accumulation", "in", "the", "hippocampal", "mossy", "fibers", "of", "AD", "mice", "transduced", "with", "AAV", "-", "mCherry", "-", "Snapin", ".", "Note", "a", "marked", "reduction", "of", "mitophagosomes", "(", "white", "arrows", ")", "in", "mutant", "hAPP", "Tg", "mouse", "brains", "with", "elevated", "Snapin", "expressionD", ",", "E", "Quantitative", "analysis", "(", "D", ")", "and", "representative", "images", "(", "E", ")", "showing", "increased", "density", "of", "presynaptic", "terminals", "in", "the", "hippocampal", "mossy", "fibers", "of", "AD", "mice", "infected", "with", "AAV", "-", "mCherry", "-", "Snapin", ".", "Blue", "indicates", "the", "signal", "of", "DAPI", "staining", ".", "The", "percentage", "area", "of", "SYP", "-", "labeled", "presynaptic", "terminals", "was", "quantified", "and", "normalized", "to", "that", "of", "control", "AD", "mice", "injected", "with", "AAV", "-", "mCherry", "(", "D", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "quantified", "from", "a", "total", "number", "of", "40", "-", "44", "imaging", "slice", "sections", "of", "three", "pairs", "of", "mutant", "hAPP", "Tg", "mice", "with", "AAV", "injection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Representative images showing gene delivery into the hippocampus of AD mice injected with AAV-mCherry or AAV-mCherry-Snapin. mCherry fluorescence indicated by white arrows is present in the soma and processes of transduced neurons in the hippocampal CA3 and dentate gyrus (DG) of mutant hAPP mouse brains. NeuN, a neuronal nuclear marker, indicates neurons.Attenuation of mitophagic accumulation in the hippocampal mossy fibers of AD mice transduced with AAV-mCherry-Snapin. Note a marked reduction of mitophagosomes (white arrows) in mutant hAPP Tg mouse brains with elevated Snapin expression Cyto c*: color is converted from blue to red for better contrastAttenuation of mitophagic accumulation in the hippocampal mossy fibers of AD mice transduced with AAV-mCherry-Snapin. Note a marked reduction of mitophagosomes (white arrows) in mutant hAPP Tg mouse brains with elevated Snapin expressionD,E Quantitative analysis (D) and representative images (E) showing increased density of presynaptic terminals in the hippocampal mossy fibers of AD mice infected with AAV-mCherry-Snapin. Blue indicates the signal of DAPI staining. The percentage area of SYP-labeled presynaptic terminals was quantified and normalized to that of control AD mice injected with AAV-mCherry (D). Data information: Data were quantified from a total number of 40-44 imaging slice sections of three pairs of mutant hAPP Tg mice with AAV injection."}
{"words": ["Figure", "1B", "Plasmids", "encoding", "truncated", "mutants", "of", "the", "Smad6", "MH2", "domain", "were", "co", "-", "transfected", "into", "HEK293", "cells", "with", "HA", "-", "tagged", "Pellino", "-", "1N", "plasmid", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "IB", ",", "immunoblot", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "C", ",", "D", "The", "SBE", "-", "Luc", "reporter", "plasmid", "was", "co", "-", "transfected", "with", "an", "empty", "vector", ",", "Myc", "-", "Smad6", "(", "400", "-", "441", ")", ",", "or", "full", "-", "length", "Smad6", "-", "expressing", "plasmids", "into", "CMT", "-", "93", "cells", ",", "respectively", ".", "After", "24", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "TGF", "-", "β1", "for", "2", "h", "and", "luciferase", "activities", "were", "measured", "and", "normalized", ".", "Data", "were", "statistically", "analyzed", "by", "a", "t", "-", "test", "and", "show", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "C", ",", "D", "The", "5xNF", "-", "κB", "-", "Luc", "reporter", "plasmid", "was", "co", "-", "transfected", "with", "an", "empty", "vector", ",", "Myc", "-", "Smad6", "(", "400", "-", "441", ")", ",", "or", "full", "-", "length", "Smad6", "-", "expressing", "plasmids", "into", "CMT", "-", "93", "cells", ",", "respectively", ".", "After", "24", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "LPS", "for", "2", "h", "and", "luciferase", "activities", "were", "measured", "and", "normalized", ".", "Data", "were", "statistically", "analyzed", "by", "a", "t", "-", "test", "and", "show", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "E", "CMT", "-", "93", "cell", "lines", "stably", "expressing", "Smad6", "amino", "acids", "400", "-", "441", "were", "treated", "with", "LPS", "for", "the", "indicated", "time", "and", "expression", "of", "IκBα", ",", "IKKα", ",", "and", "phospho", "-", "IKKα", "/", "β", "was", "monitored", "by", "immunoblotting", ".", "As", "a", "positive", "control", ",", "CMT", "-", "93", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "TGF", "-", "β1", "for", "2", "h", ".", "CMT", "-", "93", "cells", "stably", "expressing", "the", "empty", "vector", "pMSCV", "-", "puro", "were", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Plasmids encoding truncated mutants of the Smad6 MH2 domain were co-transfected into HEK293 cells with HA-tagged Pellino-1N plasmid. Cell lysates were immunoprecipitated with anti-HA antibody and immunoblotted with anti-Myc antibody. Data are representative of at least three independent experiments. IP, immunoprecipitation; IB, immunoblot; TCL, total cell lysates.C, D The SBE-Luc reporter plasmid was co-transfected with an empty vector, Myc-Smad6 (400-441), or full-length Smad6-expressing plasmids into CMT-93 cells, respectively. After 24 h, cells were treated with TGF-β1 for 2 h and luciferase activities were measured and normalized. Data were statistically analyzed by a t-test and show the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0.05, ***P < 0.001.C, D The 5xNF-κB-Luc reporter plasmid was co-transfected with an empty vector, Myc-Smad6 (400-441), or full-length Smad6-expressing plasmids into CMT-93 cells, respectively. After 24 h, cells were treated with LPS for 2 h and luciferase activities were measured and normalized. Data were statistically analyzed by a t-test and show the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0.05, ***P < 0.001.E CMT-93 cell lines stably expressing Smad6 amino acids 400-441 were treated with LPS for the indicated time and expression of IκBα, IKKα, and phospho-IKKα/β was monitored by immunoblotting. As a positive control, CMT-93 cells were pre-treated with TGF-β1 for 2 h. CMT-93 cells stably expressing the empty vector pMSCV-puro were used as a negative control. β-actin was used as a loading control. All data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2B", "A", "plasmid", "encoding", "the", "truncated", "mutant", "composed", "of", "Smad6", "amino", "acids", "422", "-", "441", "(", "Myc", "-", "Smad6", "(", "422", "-", "441", ")", ")", "or", "wild", "-", "type", "Smad6", "MH2", "domain", "(", "Myc", "-", "Smad6", "-", "MH2", ")", "was", "co", "-", "transfected", "with", "the", "HA", "-", "tagged", "full", "-", "length", "Pellino", "-", "1", "plasmid", "into", "HEK293", "cells", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "with", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "HA", "antibody", ",", "and", "immunoblotted", "(", "IB", ")", "with", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Myc", "antibody", ",", "respectively", ".", "The", "vector", ",", "CS3MTBXA", "-", "6xMyc", ",", "was", "transfected", "as", "a", "negative", "control", ".", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "IB", ",", "immunoblot", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "The", "Myc", "-", "Smad6", "(", "422", "-", "441", ")", "plasmid", "was", "co", "-", "transfected", "with", "full", "-", "length", "Flag", "-", "IRAK1", ",", "Flag", "-", "TRAF6", ",", "Flag", "-", "MyD88", ",", "or", "HA", "-", "Pellino", "-", "1", "plasmid", "into", "HEK293", "cells", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "the", "indicated", "antibodies", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", ".", "IgG", "was", "added", "as", "a", "negative", "control", "for", "IP", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ",", "E", "The", "SBE", "-", "Luc", "or", "5xNF", "-", "κB", "-", "Luc", "reporter", "plasmids", "were", "co", "-", "transfected", "with", "an", "empty", "vector", "or", "the", "Myc", "-", "Smad6", "(", "422", "-", "441", ")", "plasmid", "into", "CMT", "-", "93", "cells", ",", "respectively", ".", "After", "24", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "TGF", "-", "β1", "for", "6", "h", "or", "LPS", "for", "2", "h", ",", "and", "luciferase", "activities", "were", "measured", "and", "normalized", ".", "F", "The", "BRE", "-", "Luc", "reporter", "plasmid", "was", "co", "-", "transfected", "with", "an", "empty", "vector", "or", "the", "Myc", "-", "Smad6", "(", "422", "-", "441", ")", "plasmid", "or", "full", "-", "length", "Smad6", "into", "RAW264", ".", "7", "cells", ",", "respectively", ".", "After", "24", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "BMP4", "for", "6", "h", "and", "luciferase", "activity", "was", "measured", "and", "normalized", ".", "G", "A", "plasmid", "encoding", "the", "truncated", "mutant", "composed", "of", "Smad6", "amino", "acids", "422", "-", "441", "(", "Myc", "-", "Smad6", "(", "422", "-", "441", ")", ")", "or", "wild", "-", "type", "Smad6", "MH2", "domain", "(", "Myc", "-", "Smad6", "-", "MH2", ")", "or", "full", "-", "length", "Smad6", "(", "Myc", "-", "Smad6", ")", "was", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "full", "-", "length", "Smad4", "or", "HA", "-", "tagged", "full", "-", "length", "Pellino", "-", "1", "plasmid", "into", "HEK293", "cells", ",", "respectively", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "with", "anti", "-", "Myc", "and", "immunoblotted", "(", "IB", ")", "with", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Myc", "antibody", ",", "respectively", ".", "The", "vector", ",", "pCS3MTBXA", "-", "6xMyc", ",", "was", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "Smad4", "or", "HA", "-", "Pellino", "-", "1", "as", "a", "negative", "control", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B A plasmid encoding the truncated mutant composed of Smad6 amino acids 422-441 (Myc-Smad6(422-441)) or wild-type Smad6 MH2 domain (Myc-Smad6-MH2) was co-transfected with the HA-tagged full-length Pellino-1 plasmid into HEK293 cells. Cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-Myc or anti-HA antibody, and immunoblotted (IB) with anti-HA or anti-Myc antibody, respectively. The vector, CS3MTBXA-6xMyc, was transfected as a negative control. IP, immunoprecipitation; IB, immunoblot; TCL, total cell lysates. Data are representative of at least three independent experiments.C The Myc-Smad6(422-441) plasmid was co-transfected with full-length Flag-IRAK1, Flag-TRAF6, Flag-MyD88, or HA-Pellino-1 plasmid into HEK293 cells. Cell lysates were immunoprecipitated with the indicated antibodies and immunoblotted with anti-Myc antibody. IgG was added as a negative control for IP. Data are representative of at least three independent experiments.D, E The SBE-Luc or 5xNF-κB-Luc reporter plasmids were co-transfected with an empty vector or the Myc-Smad6(422-441) plasmid into CMT-93 cells, respectively. After 24 h, cells were treated with TGF-β1 for 6 h or LPS for 2 h, and luciferase activities were measured and normalized.F The BRE-Luc reporter plasmid was co-transfected with an empty vector or the Myc-Smad6(422-441) plasmid or full-length Smad6 into RAW264.7 cells, respectively. After 24 h, cells were treated with BMP4 for 6 h and luciferase activity was measured and normalized.G A plasmid encoding the truncated mutant composed of Smad6 amino acids 422-441 (Myc-Smad6(422-441)) or wild-type Smad6 MH2 domain (Myc-Smad6-MH2) or full-length Smad6 (Myc-Smad6) was co-transfected with HA-tagged full-length Smad4 or HA-tagged full-length Pellino-1 plasmid into HEK293 cells, respectively. Cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-Myc and immunoblotted (IB) with anti-HA or anti-Myc antibody, respectively. The vector, pCS3MTBXA-6xMyc, was co-transfected with HA-Smad4 or HA-Pellino-1 as a negative control. Data are representative of at least three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3A", "Pre", "-", "treatment", "of", "Smaducin", "-", "6", "reduces", "LPS", "-", "induced", "interleukin", "-", "6", "(", "Il6", ")", "gene", "expression", "in", "a", "dose", "-", "dependent", "manner", "in", "RAW264", ".", "7", "cells", ".", "Il6", "gene", "expression", "was", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "B", ",", "C", "Pre", "-", "treatment", "of", "100", "nM", "Smaducin", "-", "6", "or", "scrambled", "peptide", "(", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", ")", "for", "30", "min", "inhibits", "(", "B", ")", "NF", "-", "κB", "-", "mediated", "luciferase", "gene", "expression", "when", "RAW264", ".", "7", "cells", "are", "treated", "with", "LPS", "for", "2", "h", ".", "Luciferase", "activity", "in", "(", "B", ")", "was", "normalized", "to", "β", "-", "galactosidase", "activity", ".", "B", ",", "C", "Pre", "-", "treatment", "of", "100", "nM", "Smaducin", "-", "6", "or", "scrambled", "peptide", "(", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", ")", "for", "30", "min", "inhibits", "(", "C", ")", "IκBα", "degradation", "and", "IKKα", "/", "β", "phosphorylation", "when", "RAW264", ".", "7", "cells", "are", "treated", "with", "LPS", "for", "2", "h", ".", "D", "Peli1", "knockdown", "or", "wild", "-", "type", "humanTHP1", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "100", "nM", "Pal", "-", "Scram", "peptide", "and", "Smaducin", "-", "6", "for", "30", "min", "and", "subsequently", "treated", "with", "LPS", "for", "2", "h", ".", "Il6", "and", "Peli1", "gene", "expression", "were", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "show", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", "RAW264", ".", "7", "cells", "were", "treated", "with", "100", "nM", "FITC", "-", "conjugated", "Smaducin", "-", "6", "and", "TAT", "-", "S6", "(", "422", "-", "441", ")", ",", "and", "localization", "was", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "(", "magnification", ",", "200", "×", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "F", "After", "pre", "-", "treating", "RAW264", ".", "7", "cells", "with", "biotin", "-", "conjugated", "Smaducin", "-", "6", "(", "100", "nM", ")", "for", "30", "min", ",", "cells", "were", "treated", "with", "LPS", "for", "2", "h", ".", "Subsequent", "precipitation", "by", "streptavidin", "-", "agarose", "showed", "that", "endogenous", "Pellino", "-", "1", "binds", "to", "the", "Smaducin", "-", "6", "peptide", ".", "A", "biotin", "-", "conjugated", "scrambled", "peptide", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "G", "-", "I", "Immunoprecipitation", "assays", "in", "primary", "peritoneal", "macrophages", "show", "that", "Smaducin", "-", "6", "inhibits", "the", "formation", "of", "endogenous", "(", "G", ")", "IRAK1", "-", ",", "(", "H", ")", "RIP1", "-", ",", "or", "(", "I", ")", "IKKε", "-", "mediated", "signaling", "complexes", "induced", "by", "2", "h", "LPS", "treatment", ",", "compared", "to", "a", "scrambled", "peptide", ".", "IB", ",", "immunoblot", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Pre-treatment of Smaducin-6 reduces LPS-induced interleukin-6 (Il6) gene expression in a dose-dependent manner in RAW264.7 cells. Il6 gene expression was analyzed by qRT-PCR.B, C Pre-treatment of 100 nM Smaducin-6 or scrambled peptide (Pal-Scram #1) for 30 min inhibits (B) NF-κB-mediated luciferase gene expression when RAW264.7 cells are treated with LPS for 2 h. Luciferase activity in (B) was normalized to β-galactosidase activity.B, C Pre-treatment of 100 nM Smaducin-6 or scrambled peptide (Pal-Scram #1) for 30 min inhibits (C) IκBα degradation and IKKα/β phosphorylation when RAW264.7 cells are treated with LPS for 2 h.D Peli1 knockdown or wild-type humanTHP1 cells were pre-treated with 100 nM Pal-Scram peptide and Smaducin-6 for 30 min and subsequently treated with LPS for 2 h. Il6 and Peli1 gene expression were analyzed by qRT-PCR. Data show the mean ± SD of three independent experiments.E RAW264.7 cells were treated with 100 nM FITC-conjugated Smaducin-6 and TAT-S6(422-441), and localization was observed by confocal microscopy. Scale bar, 10 μm (magnification, 200×). Nuclei were stained with DAPI.F After pre-treating RAW264.7 cells with biotin-conjugated Smaducin-6 (100 nM) for 30 min, cells were treated with LPS for 2 h. Subsequent precipitation by streptavidin-agarose showed that endogenous Pellino-1 binds to the Smaducin-6 peptide. A biotin-conjugated scrambled peptide was used as a negative control.G-I Immunoprecipitation assays in primary peritoneal macrophages show that Smaducin-6 inhibits the formation of endogenous (G) IRAK1-, (H) RIP1-, or (I) IKKε-mediated signaling complexes induced by 2 h LPS treatment, compared to a scrambled peptide. IB, immunoblot; TCL, total cell lysates. Data shown are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4Subcutaneous", "injection", "of", "Smaducin", "-", "6", "increases", "the", "survival", "rate", "of", "severe", "CLP", "-", "induced", "sepsis", "mice", "(", "BALB", "/", "c", "mice", ")", ".", "Different", "amounts", "of", "Smaducin", "-", "6", "were", "subcutaneously", "injected", "at", "2", "h", "post", "-", "CLP", "followed", "by", "three", "injections", "at", "12", "-", "h", "intervals", ".", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", "per", "experiment", ".", "Smaducin", "-", "6", "treatment", "reduces", "abnormal", "nuclei", "and", "cell", "morphology", "observed", "in", "tissues", "of", "CLP", "-", "induced", "BALB", "/", "c", "mice", ",", "as", "observed", "by", "hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "/", "E", ")", "staining", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "40", "μm", "(", "magnification", ",", "400", "×", ")", ".", "The", "survival", "rates", "of", "severe", "CLP", "-", "induced", "sepsis", "mice", "by", "subcutaneously", "injected", "Smaducin", "-", "6", "were", "compared", "with", "those", "by", "intraperitoneally", "injected", "antibiotics", "(", "8", "mg", "/", "kg", "gentamycin", "plus", "8", "mg", "/", "kg", "cephalosporin", ")", ".", "Antibiotics", "were", "intraperitoneally", "injected", "into", "CLP", "mice", "at", "2", "h", "post", "-", "CLP", "followed", "by", "an", "additional", "injection", "after", "12", "h", ".", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", "per", "experiment", ".", "Therapeutic", "effects", "of", "Smaducin", "-", "6", "alone", ",", "or", "antibiotics", "(", "8", "mg", "/", "kg", "gentamycin", "plus", "8", "mg", "/", "kg", "cephalosporin", ")", ",", "or", "different", "amounts", "of", "Smaducin", "-", "6", "plus", "antibiotics", "were", "observed", "in", "CLP", "mice", ".", "Antibiotics", "were", "intraperitoneally", "injected", "into", "CLP", "mice", "at", "2", "h", "post", "-", "CLP", "followed", "by", "an", "additional", "injection", "after", "12", "h", ".", "Smaducin", "-", "6", "was", "subcutaneously", "injected", "at", "2", "h", "post", "-", "CLP", "followed", "by", "three", "injections", "at", "12", "-", "h", "intervals", ".", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ".", "Comparison", "of", "mortality", "of", "severe", "CLP", "-", "induced", "sepsis", "mice", "upon", "subcutaneous", "injections", "of", "a", "total", "of", "16", "mg", "/", "kg", "Smaducin", "-", "6", "or", "TAT", "-", "S6", "(", "422", "-", "441", ")", "peptide", ".", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Subcutaneous injection of Smaducin-6 increases the survival rate of severe CLP-induced sepsis mice (BALB/c mice). Different amounts of Smaducin-6 were subcutaneously injected at 2 h post-CLP followed by three injections at 12-h intervals. n = 10 mice per group per experiment.Smaducin-6 treatment reduces abnormal nuclei and cell morphology observed in tissues of CLP-induced BALB/c mice, as observed by hematoxylin and eosin (H/E) staining. Data shown are representative of five independent experiments. Scale bar, 40 μm (magnification, 400×).The survival rates of severe CLP-induced sepsis mice by subcutaneously injected Smaducin-6 were compared with those by intraperitoneally injected antibiotics (8 mg/kg gentamycin plus 8 mg/kg cephalosporin). Antibiotics were intraperitoneally injected into CLP mice at 2 h post-CLP followed by an additional injection after 12 h. n = 10 mice per group per experiment.Therapeutic effects of Smaducin-6 alone, or antibiotics (8 mg/kg gentamycin plus 8 mg/kg cephalosporin), or different amounts of Smaducin-6 plus antibiotics were observed in CLP mice. Antibiotics were intraperitoneally injected into CLP mice at 2 h post-CLP followed by an additional injection after 12 h. Smaducin-6 was subcutaneously injected at 2 h post-CLP followed by three injections at 12-h intervals. n = 10 mice per group.Comparison of mortality of severe CLP-induced sepsis mice upon subcutaneous injections of a total of 16 mg/kg Smaducin-6 or TAT-S6(422-441) peptide. n = 10 mice per group."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "I", "Smaducin", "-", "6", "treatment", "decreased", "the", "concentration", "of", "IL", "-", "6", ",", "TNF", "-", "α", ",", "IFN", "-", "γ", ",", "and", "IL", "-", "1β", "in", "the", "blood", "of", "CLP", "mice", "(", "A", "-", "D", ")", ",", "but", "not", "IL", "-", "4", ",", "IL", "-", "10", ",", "TGF", "-", "β1", ",", "IL", "-", "12", ",", "or", "IL", "-", "17A", "(", "E", "-", "I", ")", ".", "Cytokine", "concentrations", "were", "analyzed", "by", "ELISA", ".", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", "per", "experiment", ".", "Data", "were", "statistically", "analyzed", "by", "the", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "sham", "or", "vehicle", "control", "(", "CLP", " ", "+", " ", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", ")", ".", "J", "Expression", "of", "the", "IL", "-", "6", "protein", "is", "reduced", "in", "the", "spleen", "and", "liver", "of", "Smaducin", "-", "6", "-", "treated", "CLP", "mice", ".", "Each", "lane", "represents", "independent", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-I Smaducin-6 treatment decreased the concentration of IL-6, TNF-α, IFN-γ, and IL-1β in the blood of CLP mice (A-D), but not IL-4, IL-10, TGF-β1, IL-12, or IL-17A (E-I). Cytokine concentrations were analyzed by ELISA. n = 10 mice per group per experiment. Data were statistically analyzed by the Dunnett's multiple comparison test (one-way ANOVA). ***P < 0.001, **P < 0.005, *P < 0.05 compared to sham or vehicle control (CLP + Pal-Scram #1).J Expression of the IL-6 protein is reduced in the spleen and liver of Smaducin-6-treated CLP mice. Each lane represents independent mice."}
{"words": ["Figure", "6Subcutaneous", "injection", "of", "Smaducin", "-", "6", "into", "CLP", "mice", "reduced", "bacterial", "loads", "in", "peritoneal", "fluid", ".", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", "per", "experiment", ".", "Data", "were", "statistically", "analyzed", "by", "the", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "compared", "to", "sham", "or", "vehicle", "control", "(", "CLP", " ", "+", " ", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", ")", ".", "Smaducin", "-", "6", "increases", "neutrophil", "numbers", "in", "peritoneal", "lavage", "fluids", "from", "LPS", "-", "induced", "endotoxemia", "BALB", "/", "c", "mice", ".", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", "per", "experiment", ".", "Data", "were", "statistically", "analyzed", "by", "a", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "compared", "to", "sham", "or", "vehicle", "control", "(", "CLP", "+", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", ")", ".", "CXCR2", "expression", "in", "human", "neutrophils", ",", "measured", "by", "FACS", ",", "was", "decreased", "by", "LPS", "treatment", "and", "restored", "by", "Smaducin", "-", "6", "treatment", ".", "Treatment", "with", "Smaducin", "-", "6", "downregulates", "LPS", "-", "induced", "GRK2", "expression", "in", "RAW264", ".", "7", "cells", "and", "human", "neutrophils", ".", "CXCR2", "-", "expressing", "neutrophils", "isolated", "from", "CLP", "mice", "in", "the", "presence", "of", "Smaducin", "-", "6", "or", "Pal", "-", "Scram", "peptide", "were", "analyzed", "by", "FACS", ".", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", "were", "used", ".", "Data", "were", "statistically", "analyzed", "by", "a", "t", "-", "test", "and", "show", "the", "mean", "±", "SD", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "compared", "to", "sham", "or", "vehicle", "controls", "(", "CLP", " ", "+", " ", "PBS", "and", "CLP", " ", "+", " ", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", ")", ".", "GRK2", "expression", "was", "directly", "analyzed", "by", "immunoblotting", "in", "neutrophils", "isolated", "from", "CLP", "mice", "in", "the", "presence", "of", "Smaducin", "-", "6", "or", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", "peptide", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Subcutaneous injection of Smaducin-6 into CLP mice reduced bacterial loads in peritoneal fluid. n = 10 mice per group per experiment. Data were statistically analyzed by the Mann-Whitney U-test. **P < 0.005 compared to sham or vehicle control (CLP + Pal-Scram #1).Smaducin-6 increases neutrophil numbers in peritoneal lavage fluids from LPS-induced endotoxemia BALB/c mice. n = 5 mice per group per experiment. Data were statistically analyzed by a t-test. **P < 0.005 compared to sham or vehicle control (CLP + Pal-Scram #1).CXCR2 expression in human neutrophils, measured by FACS, was decreased by LPS treatment and restored by Smaducin-6 treatment.Treatment with Smaducin-6 downregulates LPS-induced GRK2 expression in RAW264.7 cells and human neutrophils.CXCR2-expressing neutrophils isolated from CLP mice in the presence of Smaducin-6 or Pal-Scram peptide were analyzed by FACS. n = 5 mice per group were used. Data were statistically analyzed by a t-test and show the mean ± SD of at least three independent experiments. **P < 0.005 compared to sham or vehicle controls (CLP + PBS and CLP + Pal-Scram #1).GRK2 expression was directly analyzed by immunoblotting in neutrophils isolated from CLP mice in the presence of Smaducin-6 or Pal-Scram #1 peptide."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", "Quantitative", "analysis", "of", "(", "A", ")", "TUNEL", "-", "positive", "cells", "and", "(", "B", ")", "caspase", "-", "3", "-", "positive", "cells", "in", "IHC", "in", "the", "spleens", "of", "CLP", " ", "+", " ", "PBS", ",", "CLP", " ", "+", " ", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", ",", "and", "CLP", " ", "+", " ", "Smaducin", "-", "6", "mice", ".", "Three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", "per", "experiments", ")", "were", "performed", ".", "At", "least", "five", "hot", "spots", "in", "a", "section", "of", "TUNEL", "and", "IHC", "per", "experiment", "were", "selected", ",", "and", "average", "count", "was", "determined", ".", "The", "data", "were", "expressed", "as", "a", "mean", "percentage", "of", "total", "cell", "numbers", "and", "statistically", "analyzed", "by", "a", "t", "-", "test", "and", "show", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "sham", "or", "vehicle", "control", "(", "CLP", " ", "+", " ", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", ")", ".", "C", "ELISA", "showing", "that", "Smaducin", "-", "6", "treatment", "reduced", "IFN", "-", "β1", "levels", "in", "peritoneal", "lavage", "fluids", "compared", "to", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", "-", "treated", "CLP", "mice", ".", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", "per", "experiment", ".", "Data", "were", "statistically", "analyzed", "by", "the", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "sham", "or", "vehicle", "control", "(", "CLP", " ", "+", " ", "Pal", "-", "Scram", "#", "1", ")", ".", "D", ",", "E", "IFN", "-", "β1", "(", "D", ")", "and", "TRAIL", "(", "E", ")", "expression", "detected", "by", "FACS", "in", "splenocytes", "is", "decreased", "in", "Smaducin", "-", "6", "-", "treated", "CLP", "mice", "compared", "to", "scrambled", "peptide", "-", "treated", "CLP", "mice", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "F", "Decreased", "expression", "of", "TRAIL", "was", "detected", "by", "IHC", "in", "the", "spleen", "of", "CLP", "-", "induced", "mice", "treated", "with", "Smaducin", "-", "6", "compared", "to", "mice", "treated", "with", "Pal", "-", "Scram", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", "(", "magnification", ",", "200", "×", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, B Quantitative analysis of (A) TUNEL-positive cells and (B) caspase-3-positive cells in IHC in the spleens of CLP + PBS, CLP + Pal-Scram #1, and CLP + Smaducin-6 mice. Three independent experiments (n = 3 mice per group per experiments) were performed. At least five hot spots in a section of TUNEL and IHC per experiment were selected, and average count was determined. The data were expressed as a mean percentage of total cell numbers and statistically analyzed by a t-test and show the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0.005, ***P < 0.001 compared to sham or vehicle control (CLP + Pal-Scram #1).C ELISA showing that Smaducin-6 treatment reduced IFN-β1 levels in peritoneal lavage fluids compared to Pal-Scram #1-treated CLP mice. n = 10 mice per group per experiment. Data were statistically analyzed by the Dunnett's multiple comparison test (one-way ANOVA). ***P < 0.001 compared to sham or vehicle control (CLP + Pal-Scram #1).D, E IFN-β1 (D) and TRAIL (E) expression detected by FACS in splenocytes is decreased in Smaducin-6-treated CLP mice compared to scrambled peptide-treated CLP mice. Data are representative of three independent experiments.F Decreased expression of TRAIL was detected by IHC in the spleen of CLP-induced mice treated with Smaducin-6 compared to mice treated with Pal-Scram. Scale bar, 100 μm (magnification, 200×). Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3B", "Size", "exclusion", "chromatography", "confirms", "that", "the", "oligomerisation", "tendency", "of", "FICDR371S", "is", "unperturbed", "relative", "to", "wild", "-", "type", "FICD", ".", "Across", "a", "range", "of", "assessable", "enzyme", "concentrations", "both", "FICDs", "elute", "as", "predominantly", "dimeric", "species", ".", "The", "elution", "profile", "of", "a", "monomeric", "FICDL258D", "-", "H363A", "mutant", "is", "also", "shown", "for", "reference", ",", "alongside", "the", "elution", "times", "of", "molecular", "weight", "standards", ".", "C", "Representative", "immunoblot", "comparing", "the", "ability", "of", "wild", "-", "type", "and", "Arg371Ser", "FICD", "(", "at", "a", "wide", "range", "of", "enzyme", "concentrations", ")", "to", "catalyse", "the", "accumulation", "of", "BiP", "-", "AMP", "in", "the", "presence", "of", "physiological", "ATP", "concentrations", "(", "5", "mM", ")", ".", "At", "low", "enzyme", "concentrations", "(", "and", "early", "time", "points", ")", "the", "AMPylation", "defect", "imposed", "by", "Arg371Ser", "is", "manifest", ".", "At", "higher", "enzyme", "concentrations", "where", "the", "deAMPylation", "activity", "of", "the", "wild", "-", "type", "enzyme", "begins", "to", "dominate", ",", "the", "residual", "AMPylation", "activity", "of", "FICDR371S", "results", "in", "a", "greater", "accumulation", "of", "BiP", "-", "AMP", "(", "relative", "to", "the", "same", "concentration", "of", "wild", "-", "type", "enzyme", ")", ".", "D", "Quantification", "of", "the", "AMPylated", "BiP", "signals", "relative", "to", "total", "BiP", "of", "experiments", "as", "in", "C", "(", "mean", "values", "±", "SEM", ",", "n", "=", "4", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "F", "Representative", "immunoblot", "comparing", "the", "accumulation", "of", "BiP", "-", "AMP", "in", "reactions", "constituted", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "wild", "-", "type", "and", "Arg371Ser", "FICD", ",", "performed", "as", "in", "A", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "lower", "panel", "is", "a", "Coomassie", "-", "stained", "gel", "of", "the", "reaction", "constituents", ".", "An", "N", "-", "terminally", "extended", "version", "of", "the", "wild", "-", "type", "enzyme", "(", "residues", "45", "-", "458was", "used", "in", "lanes", "2", "and", "5", "-", "7", ",", "to", "distinguish", "its", "migration", "on", "the", "gel", "from", "the", "mutant", "(", "residues", "104", "-", "445", ")", ".", "The", "bar", "diagram", "provides", "quantification", "of", "the", "AMPylated", "BiP", "signals", "relative", "to", "total", "BiP", "of", "experiments", "as", "in", "F", "(", "from", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Size exclusion chromatography confirms that the oligomerisation tendency of FICDR371S is unperturbed relative to wild-type FICD. Across a range of assessable enzyme concentrations both FICDs elute as predominantly dimeric species. The elution profile of a monomeric FICDL258D-H363A mutant is also shown for reference, alongside the elution times of molecular weight standards.C Representative immunoblot comparing the ability of wild-type and Arg371Ser FICD (at a wide range of enzyme concentrations) to catalyse the accumulation of BiP-AMP in the presence of physiological ATP concentrations (5 mM). At low enzyme concentrations (and early time points) the AMPylation defect imposed by Arg371Ser is manifest. At higher enzyme concentrations where the deAMPylation activity of the wild-type enzyme begins to dominate, the residual AMPylation activity of FICDR371S results in a greater accumulation of BiP-AMP (relative to the same concentration of wild-type enzyme). D Quantification of the AMPylated BiP signals relative to total BiP of experiments as in C (mean values ± SEM, n = 4, biological replicates).F Representative immunoblot comparing the accumulation of BiP-AMP in reactions constituted with the indicated concentrations of wild-type and Arg371Ser FICD, performed as in A (upper panel). The lower panel is a Coomassie-stained gel of the reaction constituents. An N-terminally extended version of the wild-type enzyme (residues 45-458was used in lanes 2 and 5-7, to distinguish its migration on the gel from the mutant (residues 104-445). The bar diagram provides quantification of the AMPylated BiP signals relative to total BiP of experiments as in F (from n = 3, biological replicates, mean values ± SEM)."}
{"words": ["Figure", "4A", "Immunoblots", "of", "AMPylated", "proteins", "detected", "with", "a", "pan", "-", "AMP", "antibody", ",", "BiP", ",", "FICD", "and", "eIF2α", "(", "a", "loading", "control", ")", "in", "lysates", "of", "FICD", "∆", "CHO", "cells", "transiently", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "the", "indicated", "derivatives", "of", "FICD", ".", "Signals", "corresponding", "to", "AMPylated", "BiP", ",", "auto", "-", "AMPylated", "FICDE234G", ",", "total", "BiP", ",", "FICD", "and", "eIF2α", "are", "indicated", ".", "The", "novel", "species", "reactive", "with", "the", "anti", "-", "FICD", "antiserum", "in", "lysates", "of", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "FICDR371S", "(", "*", ")", "likely", "reflects", "a", "glycosylated", "isoform", "arising", "from", "the", "creation", "of", "a", "new", "glycosylation", "site", "at", "Asn369", ".", "C", "Quantification", "of", "the", "data", "from", "repeats", "of", "the", "experiment", "as", "shown", "in", "B", ".", "The", "upper", "two", "graphs", "show", "the", "percent", "of", "cells", "with", "high", "CHOP", ":", ":", "GFP", "or", "high", "XBP", ":", ":", "Turq", "for", "each", "transfection", ".", "The", "lower", "panel", "provides", "quantitation", "of", "the", "median", "fluorescence", "intensity", "for", "each", "reporter", ".", "Mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", ",", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Immunoblots of AMPylated proteins detected with a pan-AMP antibody, BiP, FICD and eIF2α (a loading control) in lysates of FICD∆ CHO cells transiently transfected with plasmids encoding the indicated derivatives of FICD. Signals corresponding to AMPylated BiP, auto-AMPylated FICDE234G, total BiP, FICD and eIF2α are indicated. The novel species reactive with the anti-FICD antiserum in lysates of cells transfected with plasmids expressing FICDR371S (*) likely reflects a glycosylated isoform arising from the creation of a new glycosylation site at Asn369.C Quantification of the data from repeats of the experiment as shown in B. The upper two graphs show the percent of cells with high CHOP::GFP or high XBP::Turq for each transfection. The lower panel provides quantitation of the median fluorescence intensity for each reporter. Mean ± SD, n=4, biological replicates."}
{"words": ["Figure", "5B", "On", "the", "left", "are", "immunoblots", "of", "AMPylated", "proteins", "detected", "with", "pan", "-", "AMP", ",", "BiP", "and", "eIF2α", "(", "a", "loading", "control", ")", "reactive", "antibodies", "in", "lysates", "of", "cells", "of", "the", "indicated", "genotype", ".", "The", "cells", "were", "untreated", "or", "exposed", "to", "the", "protein", "synthesis", "inhibitor", ",", "cycloheximide", "(", "Cx", ",", "100", "µg", "/", "mL", ")", "for", "the", "indicated", "time", ".", "In", "the", "panel", "on", "the", "right", "are", "immunoblots", "of", "samples", "immunoprecipitated", "with", "a", "BiP", "-", "specific", "antiserum", "from", "the", "lysates", "of", "the", "samples", "shown", "on", "the", "left", ".", "C", "Immunoblots", "as", "in", "B", "in", "lysates", "of", "cells", "of", "the", "indicated", "genotype", ".", "The", "cells", "were", "untreated", "or", "exposed", "to", "the", "protein", "synthesis", "inhibitor", ",", "cycloheximide", "(", "Cx", ",", "100", "µg", "/", "mL", ")", "and", "/", "or", "thapsigargin", "(", "Tg", ")", "for", "the", "indicated", "periods", "prior", "to", "harvest", ".", "D", "Quantification", "of", "ratio", "of", "the", "BiP", "-", "AMP", "to", "total", "BiP", "signal", "(", "expressed", "in", "arbitrary", "units", ")", "of", "repeats", "of", "the", "experiment", "shown", "in", "C", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "the", "BiP", "-", "AMP", "signal", "normalized", "to", "total", "BiP", "signal", "from", "the", "same", "samples", "are", "depicted", ",", "(", "P", "values", "by", "two", "tailed", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "6", ",", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B On the left are immunoblots of AMPylated proteins detected with pan-AMP, BiP and eIF2α (a loading control) reactive antibodies in lysates of cells of the indicated genotype. The cells were untreated or exposed to the protein synthesis inhibitor, cycloheximide (Cx, 100 µg/mL) for the indicated time. In the panel on the right are immunoblots of samples immunoprecipitated with a BiP-specific antiserum from the lysates of the samples shown on the left.C Immunoblots as in B in lysates of cells of the indicated genotype. The cells were untreated or exposed to the protein synthesis inhibitor, cycloheximide (Cx, 100 µg/mL) and/or thapsigargin (Tg) for the indicated periods prior to harvest. D Quantification of ratio of the BiP-AMP to total BiP signal (expressed in arbitrary units) of repeats of the experiment shown in C. Mean ± SD of the BiP-AMP signal normalized to total BiP signal from the same samples are depicted, (P values by two tailed t-test, n = 6, biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Representative", "immunoblot", "of", "AMPylated", "proteins", "in", "FICD", "∆", "CHO", "cells", "transiently", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "encoding", "the", "indicated", "FICD", "enzymes", "(", "replicated", "three", "times", ")", ".", "Note", "that", "the", "hyperactive", "E234G", "mutant", "bearing", "the", "K124E", "-", "H131A", "mutations", "that", "compromise", "its", "ability", "to", "interact", "with", "BiP", ",", "is", "nonetheless", "consistently", "auto", "-", "AMPylated", ".", "C", "Bar", "diagram", "of", "the", "amount", "of", "alkaline", "phosphatase", "[", "normalised", "to", "cytoplasmic", "luciferase", "(", "a", "transfection", "marker", ")", "]", "secreted", "from", "FICD", "∆", "CHO", "cells", "co", "-", "expressing", "the", "indicated", "FICD", "enzymes", ".", "The", "K124E", "-", "H131A", "mutations", "that", "interfere", "with", "engagement", "of", "BiP", "as", "a", "substrate", "reverse", "the", "secretion", "defect", "imposed", "by", "the", "hyperactive", "FICD", "enzymes", "[", "Mean", "±", "SD", ",", "P", "values", "by", "ANOVA", "with", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "n", "=", "8", "-", "16", "(", "biological", "replicates", ")", "]", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Representative immunoblot of AMPylated proteins in FICD∆ CHO cells transiently transfected with expression plasmids encoding the indicated FICD enzymes (replicated three times). Note that the hyperactive E234G mutant bearing the K124E-H131A mutations that compromise its ability to interact with BiP, is nonetheless consistently auto-AMPylated.C Bar diagram of the amount of alkaline phosphatase [normalised to cytoplasmic luciferase (a transfection marker)] secreted from FICD∆ CHO cells co-expressing the indicated FICD enzymes. The K124E-H131A mutations that interfere with engagement of BiP as a substrate reverse the secretion defect imposed by the hyperactive FICD enzymes [Mean ± SD, P values by ANOVA with Šídák's multiple comparisons test, n = 8-16 (biological replicates)]."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Oxygen", "consumption", "ratio", ",", ",", "in", "the", "indicated", "VSMC", "types", ".", "(", "B", ")", "mitochondrial", "ATP", "synthesis", "in", "the", "indicated", "VSMC", "types", ".", "(", "C", ")", "mitochondrial", "membrane", "potential", "(", "MP", ")", ",", "in", "the", "indicated", "VSMC", "types", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Oxygen consumption ratio, , in the indicated VSMC types.(B) mitochondrial ATP synthesis in the indicated VSMC types.(C) mitochondrial membrane potential (MP), in the indicated VSMC types."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Cytosolic", "ATP", "synthesis", "in", "the", "indicated", "VSMC", "types", ",", "measured", "by", "incorporation", "of", "phosphate", "-", "32", "(", "32Pi", ")", "into", "ADP", ".", "[", "32Pi", "]", "-", "ATP", "was", "separated", "from", "32Pi", "using", "the", "molybdate", "method", ",", "as", "explained", "in", "the", "Methods", "section", ".", "(", "B", ")", "Intracellular", "lactate", "concentration", "(", "C", ")", "external", "acidification", "in", "the", "indicated", "VSMC", "types", ".", "(", "D", ")", "Calcium", "accumulation", "in", "mitochondria", "after", "24", "h", "of", "incubation", "in", "MEM", "media", "containing", "10", "µCi", "/", "mL", "calcium", "-", "45", "(", "45Ca2", "+", ")", "as", "a", "radiotracer", ".", "(", "E", ")", "Magnesium", "concentration", "in", "isolated", "mitochondria", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Cytosolic ATP synthesis in the indicated VSMC types, measured by incorporation of phosphate-32 (32Pi) into ADP. [32Pi]-ATP was separated from 32Pi using the molybdate method, as explained in the Methods section.(B) Intracellular lactate concentration(C) external acidification in the indicated VSMC types.(D) Calcium accumulation in mitochondria after 24 h of incubation in MEM media containing 10 µCi/mL calcium-45 (45Ca2+) as a radiotracer.(E) Magnesium concentration in isolated mitochondria."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Representative", "time", "-", "course", "of", "2", "mmol", "/", "L", "phosphate", "on", "calcification", "of", "LmnaG609G", "/", "+", "VSMCs", "(", "up", ")", ".", "Calcification", "was", "visualized", "with", "Alizarin", "red", ".", "Representative", "microscopic", "images", "(", "10x", ";", "scale", "bar", ":", "100", "µm", ")", "showing", "calcification", "of", "treated", "and", "untreated", "LmnaG609G", "/", "+", "VSMCs", "(", "down", ")", ".", "(", "C", "-", "F", ")", "Measures", "of", "calcium", "in", "treated", "living", "LmnaG609G", "/", "+", "VSMCs", "(", "C", ")", ",", "treated", "fixed", "LmnaG609G", "/", "+", "VSMCs", "(", "D", ")", ",", "untreated", "living", "LmnaG609G", "/", "+", "VSMCs", "(", "E", ")", ",", "and", "untreated", "fixed", "LmnaG609G", "/", "+", "VSMCs", "(", "F", ")", ".", "(", "G", ")", "The", "calcification", "inhibitory", "capacity", "was", "calculated", "as", "the", "difference", "in", "calcium", "deposition", "between", "living", "and", "fixed", "cells", "(", "ΔCa2", "+", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Representative time-course of 2 mmol/L phosphate on calcification of LmnaG609G/+ VSMCs (up). Calcification was visualized with Alizarin red. Representative microscopic images (10x; scale bar: 100 µm) showing calcification of treated and untreated LmnaG609G/+ VSMCs (down).(C-F) Measures of calcium in treated living LmnaG609G/+ VSMCs (C), treated fixed LmnaG609G/+ VSMCs (D), untreated living LmnaG609G/+ VSMCs (E), and untreated fixed LmnaG609G/+ VSMCs (F).(G) The calcification inhibitory capacity was calculated as the difference in calcium deposition between living and fixed cells (ΔCa2+)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Magnesium", "intake", "in", "34", "-", "week", "-", "old", "untreated", "and", "treated", "LmnaG609G", "/", "+", "mice", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "(", "B", ")", "Plasma", "magnesium", "concentration", "in", "34", "-", "week", "-", "old", "untreated", "and", "treated", "LmnaG609G", "/", "+", "mice", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "(", "C", ")", "Calcium", "content", "of", "aortas", "obtained", "from", "34", "-", "week", "-", "old", "wild", "-", "type", "mice", "and", "untreated", "and", "treated", "LmnaG609G", "/", "+", "mice", "(", "n", "=", "20", ")", ".", "(", "D", ")", "Body", "masses", "of", "34", "-", "week", "-", "old", "untreated", "and", "treated", "LmnaG609G", "/", "+", "mice", ".", "(", "E", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "graph", "for", "untreated", "and", "treated", "LmnaG609G", "/", "+", "mice", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "photographs", "of", "40", "-", "wk", "-", "old", "wild", "-", "type", ",", "untreated", "and", "treated", "LmnaG609G", "/", "+", "mice", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Magnesium intake in 34-week-old untreated and treated LmnaG609G/+ mice (n=16).(B) Plasma magnesium concentration in 34-week-old untreated and treated LmnaG609G/+ mice (n=16).(C) Calcium content of aortas obtained from 34-week-old wild-type mice and untreated and treated LmnaG609G/+ mice (n=20).(D) Body masses of 34-week-old untreated and treated LmnaG609G/+ mice.(E) Kaplan-Meier graph for untreated and treated LmnaG609G/+ mice (n=16).(F) Representative photographs of 40-wk-old wild-type, untreated and treated LmnaG609G/+ mice."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "ATP", "concentration", "in", "liver", "homogenates", "obtained", "from", "34", "-", "week", "-", "old", "wild", "-", "type", ",", "untreated", "or", "treated", "LmnaG609G", "/", "+", "mice", ".", "(", "B", ")", "Mitochondrial", "calcium", "measured", "in", "liver", "mitochondria", "isolated", "from", "the", "indicated", "experimental", "mouse", "groups", ".", "(", "C", ")", "Magnesium", "concentration", "in", "isolated", "mitochondria", ".", "(", "D", ")", "Activities", "of", "the", "indicated", "mitochondrial", "complexes", "(", "I", ",", "II", ",", "III", ",", "IV", ",", "and", "V", ")", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "rotenone", "(", "2", "µmol", "/", "L", ")", ",", "2", "-", "thenoyltrifluoroacetone", "(", "TTFA", ";", "1", "mmol", "/", "L", ")", ",", "antimycin", "A", "(", "10", "µmol", "/", "L", ")", ",", "potassium", "cyanide", "(", "KCN", ";", "1", "mmol", "/", "L", ")", ",", "or", "oligomycin", "(", "10", "µmol", "/", "L", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) ATP concentration in liver homogenates obtained from 34-week-old wild-type, untreated or treated LmnaG609G/+ mice.(B) Mitochondrial calcium measured in liver mitochondria isolated from the indicated experimental mouse groups.(C) Magnesium concentration in isolated mitochondria.(D) Activities of the indicated mitochondrial complexes (I, II, III, IV, and V) in the absence or presence of rotenone (2 µmol/L), 2-thenoyltrifluoroacetone (TTFA; 1 mmol/L), antimycin A (10 µmol/L), potassium cyanide (KCN; 1 mmol/L), or oligomycin (10 µmol/L)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Light", "microscopy", "images", "of", "LGCs", ",", "FBGCs", "and", "osteoclasts", "stained", "with", "Giemsa", "staining", "(", "upper", "panel", ")", ".", "Representative", "Hoechst", "dye", "images", "acquired", "by", "ImageStream", "(", "lower", "panel", ")", "of", "sorted", "cells", "showing", "mononuclear", "(", "mono", ")", "and", "multinucleated", "(", "multi", ")", "populations", "for", "each", "cell", "type", ".", "(", "C", ")", "RNA", "-", "seq", "volcano", "plots", "highlighting", "the", "top", "15", "differentially", "expressed", "genes", "between", "mononuclear", "and", "multinucleated", "populations", "for", "each", "cell", "type", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Light microscopy images of LGCs, FBGCs and osteoclasts stained with Giemsa staining (upper panel). Representative Hoechst dye images acquired by ImageStream (lower panel) of sorted cells showing mononuclear (mono) and multinucleated (multi) populations for each cell type.(C) RNA-seq volcano plots highlighting the top 15 differentially expressed genes between mononuclear and multinucleated populations for each cell type."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "MRC1", "surface", "marker", "expression", "(", "red", ")", "acquired", "by", "ImageStream", "in", "mononuclear", "(", "mono", ")", "and", "multinucleated", "(", "multi", ")", "LGCs", ",", "FBGCs", "and", "osteoclasts", "stained", "for", "Hoechst", ".", "Bar", "graphs", "(", "lower", "panel", ")", "represent", "normalized", "MRC1", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", ",", "measured", "by", "ImageStream", ";", "n", "=", "4", "donors", ".", "(", "E", ")", "CSF1R", ",", "MRC1", ",", "TLR2", "and", "FOS", "relative", "expression", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "for", "LGCs", "(", "upper", ")", ",", "FBGCs", "(", "middle", ")", "and", "osteoclasts", "(", "lower", ")", ",", "following", "the", "cell", "membrane", "fusion", "regulator", "DC", "-", "STAMP", "knockdown", ".", "si", "-", "Ctrl", ",", "scrambled", "siRNA", ";", "si", "-", "DC", "-", "STAMP", ",", "DC", "-", "STAMP", "siRNA", ";", "n", "=", "7", "donors", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) MRC1 surface marker expression (red) acquired by ImageStream in mononuclear (mono) and multinucleated (multi) LGCs, FBGCs and osteoclasts stained for Hoechst. Bar graphs (lower panel) represent normalized MRC1 mean fluorescence intensity (MFI), measured by ImageStream; n=4 donors.(E) CSF1R, MRC1, TLR2 and FOS relative expression measured by qRT-PCR for LGCs (upper), FBGCs (middle) and osteoclasts (lower), following the cell membrane fusion regulator DC-STAMP knockdown. si-Ctrl, scrambled siRNA; si-DC-STAMP, DC-STAMP siRNA; n=7 donors."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "E", ")", "The", "effect", "of", "lysosomotropic", "agents", "(", "hydroxychloroquine", ",", "hydroxy", ";", "ammonium", "chloride", ",", "NH4Cl", ")", "and", "v", "-", "ATPase", "inhibitors", "(", "Bafilomycin", "A1", ",", "Baf", "A1", ";", "Concanamycin", "A", ",", "Con", "A", ")", "on", "fusion", "and", "multinucleation", "in", "LGCs", "(", "upper", "panel", ")", ",", "FBGCs", "(", "middle", "panel", ")", "and", "osteoclasts", "(", "lower", "panel", ")", ".", "To", "test", "the", "effect", "of", "lysosome", "dysfunction", "on", "cellular", "iron", ",", "FeCl3", "was", "supplemented", ".", "Error", "bars", "are", "median", "with", "interquartile", "range", ";", "significance", "tested", "by", "one", "-", "way", "Anova", "followed", "by", "Sídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "on", "log", "transformed", "data", ";", "n", "=", "4", "donors", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(E) The effect of lysosomotropic agents (hydroxychloroquine, hydroxy; ammonium chloride, NH4Cl) and v-ATPase inhibitors (Bafilomycin A1, Baf A1; Concanamycin A, Con A) on fusion and multinucleation in LGCs (upper panel), FBGCs (middle panel) and osteoclasts (lower panel). To test the effect of lysosome dysfunction on cellular iron, FeCl3 was supplemented. Error bars are median with interquartile range; significance tested by one-way Anova followed by Sídák's multiple comparisons on log transformed data; n=4 donors; *, P < 0.05; **, P < 0.01; *** P < 0.001; ****, P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", "B7", "-", "H3", "surface", "marker", "expression", "(", "red", ")", "acquired", "by", "ImageStream", "in", "mononuclear", "and", "multinucleated", "LGCs", ",", "FBGCs", "and", "osteoclasts", "stained", "for", "Hoechst", ".", "Bar", "graphs", "(", "lower", "panel", ")", "show", "normalized", "B7", "-", "H3", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", ",", "measured", "by", "ImageStream", ";", "n", "=", "4", "donors", ".", "Error", "bars", "are", "mean", "±", "SD", ";", "significance", "tested", "by", "paired", "t", "-", "test", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "ns", ",", "non", "-", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E) B7-H3 surface marker expression (red) acquired by ImageStream in mononuclear and multinucleated LGCs, FBGCs and osteoclasts stained for Hoechst. Bar graphs (lower panel) show normalized B7-H3 mean fluorescence intensity (MFI), measured by ImageStream; n=4 donors. Error bars are mean ± SD; significance tested by paired t-test; **, P < 0.01; ns, non-significant."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "Phagocytosis", "quantified", "by", "ImageStream", "analysis", "in", "LGCs", ",", "FBGCs", "and", "osteoclasts", ".", "Representative", "images", "showing", "the", "uptake", "of", "S", ".", "Aureus", "bioparticles", "(", "yellow", ")", "in", "mononuclear", "(", "mono", ")", "and", "multinucleated", "(", "multi", ")", "cells", ".", "Bar", "graphs", "(", "lower", "panel", ")", "show", "normalized", "S", ".", "Aureus", "bioparticles", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "measured", "by", "ImageStream", ";", "n", "=", "5", "donors", ".", "Error", "bars", "are", "mean", "±", "SD", ";", "significance", "tested", "by", "paired", "t", "-", "test", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "ns", ",", "non", "-", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) Phagocytosis quantified by ImageStream analysis in LGCs, FBGCs and osteoclasts. Representative images showing the uptake of S. Aureus bioparticles (yellow) in mononuclear (mono) and multinucleated (multi) cells. Bar graphs (lower panel) show normalized S. Aureus bioparticles mean fluorescence intensity (MFI) measured by ImageStream; n=5 donors. Error bars are mean ± SD; significance tested by paired t-test; **, P < 0.01; ns, non-significant."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "TRAP", "immunohistochemistry", "(", "upper", "panel", ")", "and", "hydroxyapatite", "resorption", "(", "lower", "panel", ")", "in", "LGCs", ",", "FBGCs", "and", "osteoclasts", ".", "Note", "the", "presence", "of", "TRAP", "+", "MGCs", "in", "all", "cell", "types", "and", "hydroxyapatite", "resorption", "only", "in", "osteoclasts", ".", "(", "D", ")", "Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ",", "upper", "panel", ")", ",", "its", "related", "readout", "(", "middle", "panel", ")", "and", "extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ",", "lower", "panel", ")", "measured", "by", "extracellular", "flux", "analysis", "in", "sorted", "mononuclear", "and", "multinucleated", "osteoclasts", ";", "n", "=", "4", "donors", ".", "(", "E", ")", "Extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ",", "left", ")", "and", "glycolysis", "(", "right", ")", "in", "mononuclear", "and", "multinucleated", "osteoclasts", ";", "n", "=", "4", "donors", ".", "(", "F", ")", "Mitochondria", "copy", "number", "measured", "by", "qPCR", "in", "mononuclear", "and", "multinucleated", "osteoclasts", ";", "n", "=", "3", "donors", ".", "(", "G", ")", "Relative", "expression", "of", "mitochondrial", "transcripts", "in", "sorted", "mononuclear", "and", "multinucleated", "osteoclasts", "after", "normalisation", "by", "mitochondrial", "copy", "number", ";", "n", "=", "6", "donors", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) TRAP immunohistochemistry (upper panel) and hydroxyapatite resorption (lower panel) in LGCs, FBGCs and osteoclasts. Note the presence of TRAP+ MGCs in all cell types and hydroxyapatite resorption only in osteoclasts.(D) Oxygen consumption rate (OCR, upper panel), its related readout (middle panel) and extracellular acidification rate (ECAR, lower panel) measured by extracellular flux analysis in sorted mononuclear and multinucleated osteoclasts; n=4 donors. (E) Extracellular acidification rate (ECAR, left) and glycolysis (right) in mononuclear and multinucleated osteoclasts; n=4 donors.(F) Mitochondria copy number measured by qPCR in mononuclear and multinucleated osteoclasts; n=3 donors.(G) Relative expression of mitochondrial transcripts in sorted mononuclear and multinucleated osteoclasts after normalisation by mitochondrial copy number; n=6 donors."}
{"words": ["Figure", "1B", "Latency", "to", "enter", "dark", "compartment", "for", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "white", "bars", ",", "n", "=", "11", ")", "and", "Gadd45a", "-", "KO", "(", "blue", "bars", ",", "n", "=", "11", ")", ".", "A", "significant", "reduction", "was", "found", "in", "the", "Gadd45a", "-", "KO", "at", "24", "hours", "and", "7", "days", "after", "the", "training", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "C", "In", "situ", "hybridization", "to", "detect", "Gadd45a", "mRNA", "in", "adult", "wild", "-", "type", "hippocampus", "(", "n", "=", "8", "animals", ";", "antisense", ",", "left", "panel", ";", "sense", ",", "middle", "panel", ")", "and", "in", "Gadd45a", "-", "KO", "sections", "(", "n", "=", "6", "animals", ";", "right", "panel", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "µm", "(", "black", "bar", ")", ".", "D", "Experience", "-", "dependent", "changes", "in", "mRNA", "levels", "were", "evaluated", "under", "control", "conditions", "(", "home", "cage", ")", "and", "exposed", "to", "the", "PA", "(", "context", ",", "and", "context", "+", "shock", "groups", ";", "n", "=", "6", "for", "all", "groups", ")", ",", "respectively", ".", "Hippocampal", "Gadd45a", "mRNA", "levels", "remained", "unchanged", ",", "while", "Gadd45b", "was", "induced", "(", "context", ";", "t10", "=", "2", ".", "427", ",", "context", "+", "shock", "t10", "=", "2", ".", "319", ")", ".", "Concomitantly", ",", "mRNA", "levels", "of", "activity", "-", "regulated", "cytoskeleton", "protein", "(", "Arc", ")", ",", "as", "a", "proxy", "of", "neuronal", "activation", ",", "were", "increased", "in", "mice", "exposed", "to", "the", "PA", "context", "(", "t10", "=", "3", ".", "406", ")", "and", "context", "+", "shock", "(", "t10", "=", "3", ".", "141", ")", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "1", "-", "Way", "ANOVA", "and", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Latency to enter dark compartment for Gadd45a-WT (white bars, n=11) and Gadd45a-KO (blue bars, n=11). A significant reduction was found in the Gadd45a-KO at 24 hours and 7 days after the training. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni post-hoc test: * = p<0.05.C In situ hybridization to detect Gadd45a mRNA in adult wild-type hippocampus (n=8 animals; antisense, left panel; sense, middle panel) and in Gadd45a-KO sections (n=6 animals; right panel). Scale bars: 500 µm (black bar).D Experience-dependent changes in mRNA levels were evaluated under control conditions (home cage) and exposed to the PA (context, and context + shock groups; n=6 for all groups), respectively. Hippocampal Gadd45a mRNA levels remained unchanged, while Gadd45b was induced (context; t10=2.427, context + shock t10=2.319). Concomitantly, mRNA levels of activity-regulated cytoskeleton protein (Arc), as a proxy of neuronal activation, were increased in mice exposed to the PA context (t10=3.406) and context + shock (t10=3.141). Values shown are mean ± SEM; 1-Way ANOVA and unpaired t-test: * = p<0.05, *** = p<0.001."}
{"words": ["Figure", "2Gadd45a", "mRNA", "level", "in", "the", "hippocampus", "of", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "7", ")", "was", "significantly", "increased", "(", "t10", "=", "4", ".", "189", ")", "as", "compared", "to", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "C", "Immunohistochemistry", "for", "hemagglutinin", "(", "HA", ",", "fused", "to", "Gadd45α", ")", "in", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "Nex", "-", "Cre", "(", "-", "/", "-", ")", ",", "n", "=", "5", ")", "and", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "hippocampi", "(", "Nex", "-", "Cre", "(", "+", "/", "-", ")", ",", "n", "=", "5", ")", "8", "weeks", "after", "AAV", "injection", ".", "Note", "that", "the", "Gadd45α", "-", "HA", "signal", "in", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "is", "predominantly", "found", "in", "the", "stratum", "pyramidale", "(", "sp", ")", "but", "also", "in", "the", "stratum", "oriens", "and", "stratum", "radiatum", "(", "so", "and", "sr", ",", "respectively", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "250", "µm", ".", "D", "Cellular", "distribution", "of", "Gadd45α", "was", "analyzed", "by", "HA", "-", "western", "blot", "on", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "protein", "fractions", "of", "Gadd45a", "-", "WT", "and", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "(", "n", "=", "2", "for", "both", "groups", ")", ".", "HA", "was", "found", "predominantly", "in", "the", "nuclear", "fraction", "of", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "hippocampi", ",", "with", "a", "smaller", "but", "recognizable", "expression", "also", "in", "the", "cytoplasm", ".", "E", "Latency", "to", "enter", "the", "dark", "compartment", "for", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "white", "bars", ",", "n", "=", "10", ")", "and", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "(", "red", "bars", ",", "n", "=", "12", ")", "in", "the", "PA", "test", ".", "A", "significant", "increase", "was", "found", "24", "hours", "and", "7", "days", "after", "the", "PA", "training", "in", "the", "Gadd45a", "-", "overexpresion", "group", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "Post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Gadd45a mRNA level in the hippocampus of Gadd45a-overexpressing mice (red, n=7) was significantly increased (t10=4.189) as compared to Gadd45a-WT (n=5). Values shown are mean ± SEM; unpaired t-test: ** = p<0.01.C Immunohistochemistry for hemagglutinin (HA, fused to Gadd45α) in Gadd45a-WT (Nex-Cre(-/-), n=5) and Gadd45a-overexpressing hippocampi (Nex-Cre(+/-), n=5) 8 weeks after AAV injection. Note that the Gadd45α-HA signal in Gadd45a-overexpressing mice is predominantly found in the stratum pyramidale (sp) but also in the stratum oriens and stratum radiatum (so and sr, respectively). Scale bar: 250 µm.D Cellular distribution of Gadd45α was analyzed by HA-western blot on nuclear and cytoplasmic protein fractions of Gadd45a-WT and Gadd45a-overexpressing mice (n=2 for both groups). HA was found predominantly in the nuclear fraction of Gadd45a-overexpressing hippocampi, with a smaller but recognizable expression also in the cytoplasm.E Latency to enter the dark compartment for Gadd45a-WT (white bars, n=10) and Gadd45a-overexpressing mice (red bars, n=12) in the PA test. A significant increase was found 24 hours and 7 days after the PA training in the Gadd45a-overexpresion group. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni Post-hoc test: * = p<0.05."}
{"words": ["Figure", "3B", "LTP", "protocol", "was", "applied", "to", "16", "slices", "of", "Gadd45a", "-", "WT", "mice", "(", "white", "dots", ",", "n", "=", "5", "animals", ")", "and", "11", "slices", "of", "Gadd45a", "-", "KO", "mice", "(", "blue", "dots", ",", "n", "=", "5", "animals", ")", ",", "resulting", "in", "a", "significantly", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "t", "-", "test", ")", "lowered", "induction", "of", "LTP", "in", "Gadd45a", "-", "KO", "mice", "as", "compared", "with", "Gadd45a", "-", "WT", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ".", "C", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "(", "red", "dots", ",", "n", "=", "10", "slices", "from", "6", "animals", ")", "presented", "a", "slightly", "increased", "LTP", "as", "compared", "with", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "white", "dots", ",", "n", "=", "8", "slices", "from", "6", "animals", ")", ",", "which", "became", "more", "pronounced", "during", "the", "late", "phase", "of", "the", "experiment", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B LTP protocol was applied to 16 slices of Gadd45a-WT mice (white dots, n=5 animals) and 11 slices of Gadd45a-KO mice (blue dots, n=5 animals), resulting in a significantly (p<0.05, Student t-test) lowered induction of LTP in Gadd45a-KO mice as compared with Gadd45a-WT. Values shown are mean ± SEM. C Gadd45a-overexpressing mice (red dots, n=10 slices from 6 animals) presented a slightly increased LTP as compared with Gadd45a-WT (white dots, n=8 slices from 6 animals), which became more pronounced during the late phase of the experiment. Values shown are mean ± SEM. "}
{"words": ["Figure", "4A", "MA", "plot", "of", "DESeq", "differential", "expression", "analysis", "with", "the", "1", "%", "false", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "hits", "in", "red", "(", "5", "/", "402", ";", "and", "with", ">", "2", "-", "fold", "change", "1", "/", "65", ",", "up", "-", "/", "down", "-", "regulated", "respectively", ")", ".", "D", "UCSC", "browser", "view", "of", "reads", "-", "per", "-", "million", "-", "normalised", "RNA", "-", "seq", "coverage", "for", "Grin2a", "in", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "black", ")", "and", "Gadd45a", "-", "KO", "(", "blue", ")", "representative", "samples", ".", "Gene", "structure", "of", "Grin2a", "(", "colored", "in", "purple", ")", ",", "and", "the", "direction", "of", "transcription", "(", "red", "arrow", ")", ".", "Upper", "pannel", "covers", "the", "entire", "transcript", "while", "lower", "panel", "is", "an", "enlargement", "of", "exons", "4", "-", "8", ".", "E", "Detailed", "view", "of", "the", "extended", "3", "´", "UTR", "of", "Grin2a", "showing", "a", "significant", "5", "´", "<", "3", "´", "gradient", "in", "RNA", "-", "seq", "coverage", ".", "Note", "that", "the", "normalised", "read", "coverage", "is", "similar", "between", "genotypes", "at", "the", "actual", "3", "´", "UTR", "end", "but", "differs", "significantly", "upstream", "including", "the", "annotated", "exons", ".", "For", "subsequent", "experiments", ",", "position", "of", "the", "designed", "primers", "covering", "proximal", "and", "distal", "parts", "of", "the", "3", "´", "UTR", "are", "indicated", "below", ".", "F", ",", "G", "Validation", "of", "Gadd45α", "-", "regulated", "levels", "of", "Grin2a", "mRNA", "by", "qPCR", "with", "primers", "covering", "exons", "3", "-", "4", ".", "Grin2a", "mRNA", "levels", "were", "analyzed", "in", "the", "hippocampus", "of", "mice", "under", "control", "conditions", "(", "white", "bars", ";", "Gadd45a", "-", "WT", "=", "7", "and", "Gadd45a", "-", "KO", "=", "7", ")", "and", "1", "hour", "after", "PA", "(", "Gadd45a", "-", "WT", "=", "5", ",", "black", "bars", ";", "Gadd45a", "-", "KO", "=", "6", ",", "blue", "bars", ")", ".", "Random", "primed", "cDNA", "levels", "(", "F", ")", ",", "were", "very", "similar", "in", "all", "the", "experimental", "groups", ".", "Oligo", "(", "dT", ")", "-", "primed", "cDNA", "(", "G", ")", "revealed", "a", "significant", "increase", "of", "Grin2a", "1h", "after", "PA", ",", "which", "was", "only", "observed", "in", "Gadd45a", "-", "WT", "mice", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "H", ",", "I", "mRNA", "levels", "of", "proximal", "vs", ".", "distal", "parts", "of", "the", "3", "´", "UTR", "analyzed", "in", "the", "same", "set", "of", "oligo", "(", "dT", ")", "-", "primed", "cDNA", ".", "(", "H", ")", "Significant", "increase", "in", "Grin2a", "mRNA", "levels", "was", "found", "for", "the", "proximal", "part", "only", "in", "Gadd45a", "-", "WT", ".", "(", "I", ")", "Distal", "parts", "of", "the", "3", "´", "UTR", "remained", "unchanged", "(", "n", "=", "6", "for", "all", "groups", ")", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A MA plot of DESeq differential expression analysis with the 1% false discovery rate (FDR) hits in red (5/402; and with >2-fold change 1/65, up-/down-regulated respectively).D UCSC browser view of reads-per-million-normalised RNA-seq coverage for Grin2a in Gadd45a-WT (black) and Gadd45a-KO (blue) representative samples. Gene structure of Grin2a (colored in purple), and the direction of transcription (red arrow). Upper pannel covers the entire transcript while lower panel is an enlargement of exons 4-8.E Detailed view of the extended 3´UTR of Grin2a showing a significant 5´<3´ gradient in RNA-seq coverage. Note that the normalised read coverage is similar between genotypes at the actual 3´UTR end but differs significantly upstream including the annotated exons. For subsequent experiments, position of the designed primers covering proximal and distal parts of the 3´UTR are indicated below.F, G Validation of Gadd45α-regulated levels of Grin2a mRNA by qPCR with primers covering exons 3-4. Grin2a mRNA levels were analyzed in the hippocampus of mice under control conditions (white bars; Gadd45a-WT=7 and Gadd45a-KO=7) and 1 hour after PA (Gadd45a-WT=5, black bars; Gadd45a-KO=6, blue bars). Random primed cDNA levels (F), were very similar in all the experimental groups. Oligo(dT)-primed cDNA (G) revealed a significant increase of Grin2a 1h after PA, which was only observed in Gadd45a-WT mice. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni post-hoc test: ** = p<0.01, *** = p<0.001. H, I mRNA levels of proximal vs. distal parts of the 3´UTR analyzed in the same set of oligo(dT)-primed cDNA. (H) Significant increase in Grin2a mRNA levels was found for the proximal part only in Gadd45a-WT. (I) Distal parts of the 3´UTR remained unchanged (n=6 for all groups). Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni post-hoc test: * = p<0.05. "}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "NR2A", "protein", "levels", "were", "analyzed", "in", "the", "hippocampus", "of", "mice", "under", "control", "conditions", "(", "white", "bars", ";", "Gadd45a", "-", "WT", ",", "n", "=", "13", "and", "Gadd45a", "-", "KO", ",", "n", "=", "14", ")", "and", "1", "hour", "after", "PA", "(", "black", "bars", ";", "Gadd45a", "-", "WT", "=", "14", ",", "Gadd45a", "-", "KO", "=", "14", ")", ".", "NR2A", "signal", "(", "160", "kDa", ")", "was", "normalized", "to", "the", "loading", "control", "(", "tubulin", "(", "55", "kDa", ")", "for", "the", "total", "fraction", ",", "and", "synaptotagmin", "(", "68", "kDa", ")", "for", "the", "synaptosomal", "fraction", ")", "and", "calculated", "as", "percentage", "of", "control", ".", "In", "Gadd45a", "-", "WT", "samples", "(", "A", ")", ",", "NR2A", "protein", "levels", "were", "unchanged", "in", "the", "total", "fraction", "during", "memory", "formation", ",", "while", "in", "the", "synaptosomal", "fraction", ",", "a", "significant", "increase", "was", "detected", "(", "t20", "=", "3", ".", "199", ")", ".", "In", "Gadd45a", "-", "KO", "hippocampi", "(", "B", ")", ",", "levels", "of", "NR2A", "protein", "in", "both", "fractions", "remained", "unaltered", "during", "memory", "consolidation", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "C", "Gadd45α", "pulldown", "experiments", "were", "carried", "out", "in", "wild", "-", "type", "hippocampal", "lysates", "(", "n", "=", "12", "for", "all", "groups", ")", ".", "Percentage", "of", "input", "recovery", "was", "unchanged", "between", "GFP", "-", "FLAG", "(", "green", "bars", ")", "and", "Gadd45α", "-", "FLAG", "(", "black", "bars", ")", "for", "genes", "that", "are", "not", "regulated", "by", "Gadd45α", ",", "such", "as", "succinate", "dehydrogenase", "complex", "flavoprotein", "subunit", "A", "(", "Sdha", ",", "no", "3", "´", "UTR", "extension", ")", ",", "and", "mitogen", "-", "activated", "protein", "kinase", "6", "(", "Map2K6", ",", "containing", "3", "´", "UTR", "extension", "of", "10", "kb", ")", ".", "On", "the", "contrary", ",", "Gadd45α", "-", "FLAG", "bound", "fraction", "revealed", "a", "significant", "increase", "in", "Grin2a", "(", "t22", "=", "4", ".", "992", ")", "and", "Grm5", "mRNA", "(", "t22", "=", "4", ".", "939", ")", "as", "compared", "to", "GFP", "-", "FLAG", "fraction", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "Post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B NR2A protein levels were analyzed in the hippocampus of mice under control conditions (white bars; Gadd45a-WT, n=13 and Gadd45a-KO, n=14) and 1 hour after PA (black bars; Gadd45a-WT=14, Gadd45a-KO=14). NR2A signal (160 kDa) was normalized to the loading control (tubulin (55 kDa) for the total fraction, and synaptotagmin (68 kDa) for the synaptosomal fraction) and calculated as percentage of control. In Gadd45a-WT samples (A), NR2A protein levels were unchanged in the total fraction during memory formation, while in the synaptosomal fraction, a significant increase was detected (t20=3.199). In Gadd45a-KO hippocampi (B), levels of NR2A protein in both fractions remained unaltered during memory consolidation. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni post-hoc test: ** = p<0.01.C Gadd45α pulldown experiments were carried out in wild-type hippocampal lysates (n=12 for all groups). Percentage of input recovery was unchanged between GFP-FLAG (green bars) and Gadd45α-FLAG (black bars) for genes that are not regulated by Gadd45α, such as succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A (Sdha, no 3´UTR extension), and mitogen-activated protein kinase 6 (Map2K6, containing 3´UTR extension of 10 kb). On the contrary, Gadd45α-FLAG bound fraction revealed a significant increase in Grin2a (t22=4.992) and Grm5 mRNA (t22=4.939) as compared to GFP-FLAG fraction. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni Post-hoc test: *** = p<0.001."}
{"words": ["Figure", "6B", "Hippocampal", "Gadd45a", "mRNA", "levels", "were", "significantly", "upregulated", "in", "both", "Gadd45a", "-", "overexpression", "(", "q24", "=", "4", ".", "094", ")", "and", "Gadd45aK45E", "-", "overexpression", "groups", "(", "q24", "=", "4", ".", "726", ")", "(", "n", "=", "9", "for", "all", "groups", ")", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "Tukey", "´", "s", "multiple", "comparison", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "C", "Immunohistochemistry", "for", "hemagglutinin", "(", "HA", ",", "fused", "to", "Gadd45α", ")", "in", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "left", ")", ",", "Gadd45a", "-", "overexpression", "(", "middle", ")", "and", "Gadd45aK45E", "-", "overexpression", "(", "right", ")", "samples", "8", "weeks", "after", "AAV", "injection", "(", "n", "=", "3", "for", "all", "groups", ")", ".", "Upper", "row", "depicts", "the", "entire", "hippocampus", ",", "while", "center", "and", "lower", "rows", "show", "magnifications", "of", "the", "CA3", "area", "in", "which", "the", "HA", "signal", "(", "red", ")", "is", "not", "restricted", "to", "the", "nuclei", "(", "blue", "and", "white", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "250", "µm", ".", "D", "Gadd45α", "-", "overexpression", "was", "confirmed", "at", "the", "protein", "level", "by", "HA", "-", "western", "blot", "on", "hippocampal", "samples", "from", "Gadd45a", "-", "WT", ",", "Gadd45a", "-", "overexpression", "and", "Gadd45aK45E", "-", "overexpression", "mice", "(", "n", "=", "3", "for", "all", "groups", ")", ".", "Hippocampus", "scale", "bars", ":", "250", "µm", ";", "CA3", "scale", "bars", ":", "50µm", ".", "E", "Latency", "to", "enter", "the", "dark", "compartment", "for", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "white", "bars", ",", "n", "=", "12", ")", ",", "Gadd45a", "-", "overexpression", "(", "red", "bars", ",", "n", "=", "11", ")", "and", "Gadd45aK45E", "-", "overexpression", "mice", "(", "grey", "bars", ",", "n", "=", "11", ")", "in", "the", "PA", "test", ".", "Note", "that", ",", "unlike", "Gadd45a", "-", "overexpression", "mice", ",", "those", "expressing", "the", "mutated", "form", "of", "Gadd45α", "(", "no", "RNA", "-", "binding", "capacity", ")", "did", "not", "show", "an", "increase", "in", "memory", "retention", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "Post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B Hippocampal Gadd45a mRNA levels were significantly upregulated in both Gadd45a-overexpression (q24 = 4.094) and Gadd45aK45E-overexpression groups (q24 = 4.726) (n=9 for all groups). Values shown are mean ± SEM; Tukey´s multiple comparison test: * = p<0.05, ** = p<0.01.C Immunohistochemistry for hemagglutinin (HA, fused to Gadd45α) in Gadd45a-WT (left), Gadd45a-overexpression (middle) and Gadd45aK45E-overexpression (right) samples 8 weeks after AAV injection (n=3 for all groups). Upper row depicts the entire hippocampus, while center and lower rows show magnifications of the CA3 area in which the HA signal (red) is not restricted to the nuclei (blue and white). Scale bar: 250 µm.D Gadd45α-overexpression was confirmed at the protein level by HA-western blot on hippocampal samples from Gadd45a-WT, Gadd45a-overexpression and Gadd45aK45E-overexpression mice (n=3 for all groups). Hippocampus scale bars: 250 µm; CA3 scale bars: 50µm.E Latency to enter the dark compartment for Gadd45a-WT (white bars, n=12), Gadd45a-overexpression (red bars, n=11) and Gadd45aK45E-overexpression mice (grey bars, n=11) in the PA test. Note that, unlike Gadd45a-overexpression mice, those expressing the mutated form of Gadd45α (no RNA-binding capacity) did not show an increase in memory retention. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni Post-hoc test: * = p<0.05, *** = p<0.001."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Electron", "micrographs", "of", "MEFs", ".", "Scale", "bar", ";", "1", "μm", ".", "High", "-", "magnification", "images", "depicting", "representative", "electron", "-", "dense", "materials", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ";", "0", ".", "2", "μm", ".", "(", "B", ")", "Citrate", "synthase", "activity", "(", "absorbance", "/", "min", ")", "was", "measured", "in", "MEFs", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "eight", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", ",", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Oxygen", "consumption", "rates", "(", "OCRs", ")", "of", "MEFs", "were", "measured", "on", "an", "XF24", "Analyzer", ".", "(", "C", ")", "Oxygen", "consumption", "profiles", "for", "MEFs", "exposed", "sequentially", "to", "oligomycin", "(", "2", "μg", "/", "mL", ")", "(", "Oligo", ")", ",", "FCCP", "(", "2", "μM", ")", ",", "and", "rotenone", "(", "1", "μM", ")", "plus", "actinomycin", "(", "2", "μM", ")", "(", "R", "&", "A", ")", ".", "(", "D", ")", "OCR", "(", "pmol", "O2", "/", "min", ")", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "eight", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "E", ")", "ATP", "production", "(", "pmol", "/", "min", ")", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "eight", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunoblot", "of", "LC3", "and", "p62", "in", "MEFs", "of", "indicated", "genotype", ".", "MEFs", "were", "treated", "with", "tunicamycin", "(", "5", "μg", "/", "ml", ")", "or", "vehicle", "control", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "bafilomycin", "A1", "(", "400", "nM", ")", ",", "and", "endogenous", "LC3", "and", "p62", "levels", "were", "measured", "by", "immunoblotting", ".", "Data", "represent", "the", "ratios", "of", "LC3", "-", "II", "to", "LC3", "-", "I", "and", "p62", "to", "actin", "in", "the", "absence", "of", "bafilomycin", ",", "which", "were", "normalized", "LRRK", "+", "/", "+", "MEFs", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "G", ")", "Survival", "rate", "of", "MEFs", "treated", "with", "tunicamycin", "(", "5", "μg", "/", "ml", ")", ",", "thapsigargin", "(", "1", "μM", ")", ",", "or", "hydrogen", "peroxide", "(", "100", "μM", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Electron micrographs of MEFs . Scale bar; 1 μm. High-magnification images depicting representative electron-dense materials are shown. Scale bar; 0.2 μm.(B) Citrate synthase activity (absorbance/min) was measured in MEFs . Error bars represent ±SD from eight independent experiments. Data information: For graph , the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01.(C, D) Oxygen consumption rates (OCRs) of MEFs were measured on an XF24 Analyzer. (C) Oxygen consumption profiles for MEFs exposed sequentially to oligomycin (2 μg/mL) (Oligo), FCCP (2 μM), and rotenone (1 μM) plus actinomycin (2 μM) (R & A). (D) OCR (pmol O2/min) (n=8). Error bars represent ±SD from eight independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01.(E) ATP production (pmol/min) (n=8). Error bars represent ±SD from eight independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01.(F) Representative immunoblot of LC3 and p62 in MEFs of indicated genotype. MEFs were treated with tunicamycin (5 μg/ml) or vehicle control in the presence or absence of bafilomycin A1 (400 nM), and endogenous LC3 and p62 levels were measured by immunoblotting. Data represent the ratios of LC3-II to LC3-I and p62 to actin in the absence of bafilomycin, which were normalized LRRK+/+ MEFs. Error bars represent ±SD from four independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01.(G) Survival rate of MEFs treated with tunicamycin (5 μg/ml), thapsigargin (1 μM), or hydrogen peroxide (100 μM). Error bars represent ±SD from four independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "2MEFs", "were", "transfected", "with", "mitochondrially", "targeted", "Cameleon", ".", "Free", "Ca2", "+", "dynamics", "in", "the", "mitochondrial", "matrix", "were", "visualized", "using", "FRET", ".", "Mitochondrial", "[", "Ca2", "+", "]", "(", "[", "Ca2", "+", "]", "m", ")", "was", "continuously", "monitored", "by", "FRET", "imaging", "data", "are", "represented", "as", "absolute", "[", "Ca2", "+", "]", "in", "μmol", ".", "(", "A", ")", "Absolute", "[", "Ca2", "+", "]", "m", "changes", "in", "MEFs", "of", "indicated", "genotype", "in", "response", "to", "bradykinin", "(", "2", ".", "5", "μM", ")", ".", "(", "B", ")", "Basal", "and", "peak", "values", "of", "Ca2", "+", "transients", "(", "μM", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01MEFs", "were", "transfected", "with", "mitochondrially", "targeted", "Cameleon", ".", "Free", "Ca2", "+", "dynamics", "in", "the", "mitochondrial", "matrix", "were", "visualized", "using", "FRET", ".", "Mitochondrial", "[", "Ca2", "+", "]", "(", "[", "Ca2", "+", "]", "m", ")", "was", "continuously", "monitored", "by", "FRET", "imaging", "data", "are", "represented", "as", "absolute", "[", "Ca2", "+", "]", "in", "μmol", ".", "(", "C", ")", "Peak", "values", "of", "Ca2", "+", "transients", "in", "MEFs", "transfected", "with", "IP3R", "or", "shRNA", "against", "IP3R", ",", "or", "treated", "with", "2", "-", "AP", "(", "20", "mM", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01MEFs", "were", "transfected", "with", "mitochondrially", "targeted", "Cameleon", ".", "Free", "Ca2", "+", "dynamics", "in", "the", "mitochondrial", "matrix", "were", "visualized", "using", "FRET", ".", "Mitochondrial", "[", "Ca2", "+", "]", "(", "[", "Ca2", "+", "]", "m", ")", "was", "continuously", "monitored", "by", "FRET", "imaging", "data", "are", "represented", "as", "absolute", "[", "Ca2", "+", "]", "in", "μmol", ".", "(", "D", ")", "Peak", "values", "of", "Ca2", "+", "transients", "in", "MEFs", "transfected", "with", "VDAC1", "or", "shRNA", "against", "VDAC1", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "E", ")", "Representative", "electron", "of", "MEFs", ".", "Full", "arrowheads", "designate", "the", "limits", "of", "the", "zone", "of", "intimate", "contact", "between", "ER", "and", "mitochondria", "20", "nm", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "nm", ".", "Data", "represent", "percentage", "of", "ERmitochondrial", "contacts", "per", "mitochondria", "perimeter", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "40", "images", "MEFs", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "F", ")", "In", "situ", "PLA", "images", "using", "anti", "-", "IP3R", "and", "anti", "-", "VDAC1", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "Data", "represent", "fluorescent", "in", "MEFs", "normalized", "LRRK2", "+", "/", "+", "MEFs", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "G", ")", "Peak", "values", "of", "Ca2", "+", "transients", "in", "MEFs", "transfected", "with", "synthetic", "tethering", "protein", "(", "TOM", "-", "mRFP", "-", "ER", ")", "to", "induce", "artificial", "tethering", "of", "the", "ER", "and", "mitochondria", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2MEFs were transfected with mitochondrially targeted Cameleon. Free Ca2+ dynamics in the mitochondrial matrix were visualized using FRET. Mitochondrial [Ca2+] ([Ca2+]m) was continuously monitored by FRET imaging data are represented as absolute [Ca2+] in μmol. (A) Absolute [Ca2+]m changes in MEFs of indicated genotype in response to bradykinin (2.5 μM). (B) Basal and peak values of Ca2+ transients (μM). Error bars represent ±SD from six independent experiments. Data information: For graph P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01MEFs were transfected with mitochondrially targeted Cameleon. Free Ca2+ dynamics in the mitochondrial matrix were visualized using FRET. Mitochondrial [Ca2+] ([Ca2+]m) was continuously monitored by FRET imaging data are represented as absolute [Ca2+] in μmol. (C) Peak values of Ca2+ transients in MEFs transfected with IP3R or shRNA against IP3R, or treated with 2-AP (20 mM). Error bars represent ±SD from six independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01MEFs were transfected with mitochondrially targeted Cameleon. Free Ca2+ dynamics in the mitochondrial matrix were visualized using FRET. Mitochondrial [Ca2+] ([Ca2+]m) was continuously monitored by FRET imaging data are represented as absolute [Ca2+] in μmol. (D) Peak values of Ca2+ transients in MEFs transfected with VDAC1 or shRNA against VDAC1. Error bars represent ±SD from six independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01(E) Representative electron of MEFs . Full arrowheads designate the limits of the zone of intimate contact between ER and mitochondria 20 nm). Scale bar: 100 nm. Data represent percentage of ERmitochondrial contacts per mitochondria perimeter. Error bars represent ±SD from 40 images MEFs Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01(F) In situ PLA images using anti-IP3R and anti-VDAC1 antibodies. Scale bar: 20 μm. Data represent fluorescent in MEFs normalized LRRK2+/+ MEFs. Error bars represent ±SD from six independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01(G) Peak values of Ca2+ transients in MEFs transfected with synthetic tethering protein (TOM-mRFP-ER) to induce artificial tethering of the ER and mitochondria. Error bars represent ±SD from six independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "MAM", "components", "in", "MEFs", "of", "indicated", "genotype", ".", "MAM", "fraction", "was", "extracted", "from", "MEFs", "by", "the", "Percoll", "gradient", "method", "and", "immunoblotted", "with", "antibodies", "indicated", "at", "the", "right", ".", "(", "C", ")", "Peak", "values", "of", "Ca2", "+", "transients", "in", "MEFs", "transfected", "with", "deletion", "constructs", "of", "LRRK2", "(", "G2019S", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", ",", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "D", ")", "Binding", "assays", "to", "detect", "interactions", "between", "deletion", "constructs", "of", "LRRK2", "(", "G2019S", ")", "and", "E3", "ubiquitin", "ligases", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "deletion", "constructs", "of", "LRRK2", "(", "G2019S", ")", "and", "E3", "ubiquitin", "ligases", ",", "and", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibody", "against", "the", "V5", "or", "HA", "epitope", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "subjected", "to", "SDS", "/", "PAGE", ",", "and", "blots", "were", "stained", "with", "antibody", "against", "the", "V5", "or", "HA", "epitope", ",", "as", "indicated", "the", "right", "of", "each", "panel", ".", "Peak", "values", "of", "Ca2", "+", "transients", "in", "MEFs", "transfected", "with", "ligase", "-", "active", "MARCH5", "(", "WT", ")", ",", "MULAN", "(", "WT", ")", ",", "and", "Parkin", "(", "W403A", ")", "[", "Parkin", "(", "WA", ")", "]", "or", "dominant", "-", "negative", "forms", "of", "MARCH5", "(", "H43W", ")", "[", "MARCH", "(", "HW", ")", "]", ",", "MULAN", "(", "C339A", ")", "[", "MULAN", "(", "CA", ")", "]", ",", "Parkin", "(", "C431A", ")", "[", "Parkin", "(", "CA", ")", "]", "(", "E", ")", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05Peak", "values", "of", "Ca2", "+", "transients", "in", "MEFs", "transfected", "with", "active", "USP30", "or", "inactive", "USP30", "(", "C77S", ")", "[", "USP", "(", "CS", ")", "]", "(", "F", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative immunoblots of MAM components in MEFs of indicated genotype. MAM fraction was extracted from MEFs by the Percoll gradient method and immunoblotted with antibodies indicated at the right.(C) Peak values of Ca2+ transients in MEFs transfected with deletion constructs of LRRK2(G2019S). Error bars represent ±SD from six independent experiments. Data information: For graph , the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05(D) Binding assays to detect interactions between deletion constructs of LRRK2(G2019S) and E3 ubiquitin ligases. HEK293 cells were transfected with deletion constructs of LRRK2(G2019S) and E3 ubiquitin ligases, and cell lysates were immunoprecipitated with antibody against the V5 or HA epitope. Precipitated proteins were subjected to SDS/PAGE, and blots were stained with antibody against the V5 or HA epitope, as indicated the right of each panel.Peak values of Ca2+ transients in MEFs transfected with ligase-active MARCH5(WT), MULAN(WT), and Parkin(W403A) [Parkin(WA)] or dominant-negative forms of MARCH5(H43W) [MARCH(HW)], MULAN(C339A) [MULAN(CA)], Parkin(C431A) [Parkin(CA)] (E) Error bars represent ±SD from six independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05Peak values of Ca2+ transients in MEFs transfected with active USP30 or inactive USP30(C77S) [USP(CS)] (F). Error bars represent ±SD from six independent experiments. Data information: For graph the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Immunoprecipitation", "/", "Immunoblot", "of", "phosphorylated", "E3", "ubiquitin", "ligases", "in", "LRRK2", "+", "/", "+", "and", "LRRK2", "(", "G2019S", ")", "-", "expressing", "MEFs", "treated", "with", "vehicle", "(", "Control", ")", "or", "tunicamycin", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", ".", "Endogenous", "PERK", ",", "MARCH5", ",", "MULAN", "and", "Parkin", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibody", ",", "and", "precipitates", "were", "immunoblotted", "with", "antibody", "indicated", "at", "the", "right", ".", "Data", "represent", "the", "ratio", "of", "phosphorylated", "to", "total", "protein", "levels", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "A", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "B", ")", "Immunoprecipitation", "/", "immunoblot", "of", "phosphorylated", "E3", "ubiquitin", "ligases", "and", "mitofusin", "2", "in", "MEFs", "in", "the", "of", "tunicamycin", "(", "5", "μg", "/", "ml", ")", ".", "LRRK2", "(", "G2019S", ")", "MEFs", "were", "also", "pretreated", "with", "LRRK2", "-", "IN", "-", "1", "(", "1", "μM", ")", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "each", "E3", "ubiquitin", "ligase", "and", "biquitin", "and", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibody", "against", "the", "Myc", "or", "HA", "epitope", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "subjected", "to", "SDS", "/", "PAGE", ",", "and", "blots", "were", "stained", "with", "antibody", "against", "the", "Myc", "epitope", ",", "phosphoserine", "or", "mitofin2", "as", "indicated", "to", "the", "right", "of", "each", "panel", ".", "Mfn2", ":", "mitofusin", "2", ",", "Ub", ":", "ubiquitin", ".", "Data", "represent", "ratios", "of", "phosphorylated", "to", "total", "E3", "ubiquitin", "ligase", "and", "mitofusin2", "to", "actin", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "B", ",", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Immunoprecipitation/Immunoblot of phosphorylated E3 ubiquitin ligases in LRRK2+/+ and LRRK2(G2019S)-expressing MEFs treated with vehicle (Control) or tunicamycin (1 μg/ml). Endogenous PERK, MARCH5, MULAN and Parkin were immunoprecipitated with antibody, and precipitates were immunoblotted with antibody indicated at the right. Data represent the ratio of phosphorylated to total protein levels. Error bars represent ±SD from independent experiments. Data information: For graph A the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01(B) Immunoprecipitation/immunoblot of phosphorylated E3 ubiquitin ligases and mitofusin 2 in MEFs in the of tunicamycin (5 μg/ml). LRRK2(G2019S) MEFs were also pretreated with LRRK2-IN-1 (1 μM). MEFs were transfected with each E3 ubiquitin ligase and biquitin and lysates were immunoprecipitated with antibody against the Myc or HA epitope. Precipitated proteins were subjected to SDS/PAGE, and blots were stained with antibody against the Myc epitope, phosphoserine or mitofin2 as indicated to the right of each panel. Mfn2: mitofusin 2, Ub: ubiquitin. Data represent ratios of phosphorylated to total E3 ubiquitin ligase and mitofusin2 to actin. Error bars represent ±SD from four independent experiments. Data information: For graph B, the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Peak", "values", "of", "Ca2", "+", "transients", "in", "MEFs", "treated", "with", "LRRK2", "-", "IN", "-", "1", "(", "1", "μM", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "A", ",", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "B", ")", "(", "Upper", "panel", ")", "Diagram", "showing", "full", "-", "length", "PERK", "Myc", "at", "the", "N", "-", "terminus", "and", "FLAG", "at", "the", "C", "-", "terminus", "(", "M", "-", "PERK", "-", "F", ")", ".", "S1P", "recognition", "sequence", "R33SLL", "is", "mutated", "to", "A33SLL", "(", "M", "-", "PERK", "(", "R33A", ")", "-", "F", ")", ".", "(", "Lower", "panel", ")", "Immunoblot", "of", "PERK", "and", "PERK", "(", "R33A", ")", "from", "transfected", "MEFs", "under", "tunicamycin", ".", "MAM", "fraction", "and", "cytosol", "were", "extracted", "from", "transfected", "MEFs", "by", "the", "Percoll", "gradient", "method", ".", "Lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibody", "against", "FLAG", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "subjected", "to", "SDS", "/", "PAGE", ",", "and", "blots", "were", "stained", "with", "antibody", "as", "indicated", "to", "the", "right", ".", "(", "C", ")", "In", "vitro", "kinase", "assay", "using", "isolated", "PERK", ",", "isolated", "E3", "ubiquitin", "ligase", "and", "[", "γ", "-", "32P", "]", "ATP", ".", "Reaction", "mixture", "was", "subjected", "to", "SDS", "/", "PAGE", ".", "Blots", "were", "with", "antibody", "against", "Myc", ",", "FLAG", "or", "phosphoserine", ".", "[", "γ", "-", "32P", "]", "ATP", "-", "incorporated", "E3", "ubiquitin", "ligases", "were", "visualized", "by", "autoradiography", "(", "blot", "was", "exposed", "for", "24", ",", "and", "right", "blot", "for", "36", ")", ".", "(", "D", ")", "In", "vitro", "ubiquitination", "assay", "using", "phosphorylated", "E3", "ubiquitin", "ligases", ",", "HA", "-", "tagged", "Ubl", ",", "and", "His", "-", "tagged", "mitofusin2", "in", "the", "presence", "of", "E1", "enzyme", ",", "UbcH7", "and", "ATP", ".", "E3", "ubiquitin", "ligases", "were", "initially", "phosphorylated", "PERK", "or", "PERK", "(", "K618R", ")", "in", "vitro", ".", "Phosphorylated", "E3", "ubiquitin", "ligases", "were", "in", "vitro", "ubiquitination", ".", "itofusin", "2", "with", "Ni", "-", "NTA", "subjected", "to", "SDS", "/", "PAGE", ".", "Blots", "were", "with", "antibody", "against", "HA", "or", "mitofusin2", ".", "Mfn2", ":", "mitofusin", "2", ",", "Ub", ":", "ubiquitin", ".", "(", "E", ")", "Immunoprecipitation", "/", "Immunoblot", "of", "phosphorylated", "E3", "ubiquitin", "ligases", "and", "mitofusin", "2", "in", "LRRK2", "(", "G2019S", ")", "-", "expressing", "MEFs", "transfected", "with", "the", "increasing", "amounts", "of", "LRRK2", "-", "d1", "-", "V5", "(", "1", ",", "5", ",", "25", "μg", "/", "106", "cells", ")", "treated", "with", "tunicamycin", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", ".", "Endogenous", "MARCH5", ",", "MULAN", "and", "Parkin", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibody", ",", "and", "precipitates", "were", "immunoblotted", "with", "antibody", "indicated", "at", "the", "right", ".", "Endogenous", "mitofusin", "2", "was", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "mitofusin", "2", "antibody", ".", "Data", "represent", "the", "ratio", "of", "phosphorylated", "to", "total", "protein", "levels", "of", "MARCH5", ",", "MULAN", "and", "Parkin", ",", "and", "the", "ratio", "of", "mitofusin", "2", "to", "actin", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "E", ",", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Peak values of Ca2+ transients in MEFs treated with LRRK2-IN-1 (1 μM). Error bars represent ±SD from six independent experiments. Data information: For graph A , the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01(B)(Upper panel) Diagram showing full-length PERK Myc at the N-terminus and FLAG at the C-terminus (M-PERK-F). S1P recognition sequence R33SLL is mutated to A33SLL (M-PERK(R33A)-F). (Lower panel) Immunoblot of PERK and PERK(R33A) from transfected MEFs under tunicamycin. MAM fraction and cytosol were extracted from transfected MEFs by the Percoll gradient method. Lysates were immunoprecipitated with antibody against FLAG. Precipitated proteins were subjected to SDS/PAGE, and blots were stained with antibody as indicated to the right.(C) In vitro kinase assay using isolated PERK, isolated E3 ubiquitin ligase and [γ-32P]ATP. Reaction mixture was subjected to SDS/PAGE. Blots were with antibody against Myc, FLAG or phosphoserine. [γ-32P]ATP-incorporated E3 ubiquitin ligases were visualized by autoradiography ( blot was exposed for 24 , and right blot for 36 ).(D) In vitro ubiquitination assay using phosphorylated E3 ubiquitin ligases, HA-tagged Ubl, and His-tagged mitofusin2 in the presence of E1 enzyme, UbcH7 and ATP. E3 ubiquitin ligases were initially phosphorylated PERK or PERK(K618R) in vitro. Phosphorylated E3 ubiquitin ligases were in vitro ubiquitination. itofusin 2 with Ni-NTA subjected to SDS/PAGE. Blots were with antibody against HA or mitofusin2. Mfn2: mitofusin 2, Ub: ubiquitin.(E) Immunoprecipitation/Immunoblot of phosphorylated E3 ubiquitin ligases and mitofusin 2 in LRRK2(G2019S)-expressing MEFs transfected with the increasing amounts of LRRK2-d1-V5 (1, 5, 25 μg/106 cells) treated with tunicamycin (1 μg/ml). Endogenous MARCH5, MULAN and Parkin were immunoprecipitated with antibody, and precipitates were immunoblotted with antibody indicated at the right. Endogenous mitofusin 2 was immunoblotted with anti-mitofusin 2 antibody. Data represent the ratio of phosphorylated to total protein levels of MARCH5, MULAN and Parkin, and the ratio of mitofusin 2 to actin. Error bars represent ±SD from independent experiments. Data information: For graph E, the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01"}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Immunoprecipitation", "/", "mmunoblot", "of", "E3", "ubiquitin", "ligases", "by", "PERK", "and", "the", "binding", "to", "mutant", "LRRK2", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "PERK", "and", "either", "MARCH5", ",", "MULAN", "or", "Parkin", ",", "LRRK2", ",", "LRRK2", "(", "D1994A", ")", "or", "LRRK2", "(", "S1292D", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibody", "against", "Myc", "or", "V5", ",", "and", "precipitates", "were", "immunoblotted", "with", "antibody", "indicated", "the", "right", ".", "(", "B", ")", "In", "vitro", "kinase", "assay", "for", "auto", "-", "phosphorylated", "LRRK2", "using", "isolated", "LRRK2", "mutants", "and", "[", "γ", "-", "32P", "]", "ATP", "with", "or", "without", "LRRK2", "-", "IN", "-", "1", "(", "1", "μM", ")", ".", "Mutant", "LRRK2", "precipitated", "with", "antibody", "against", "V5", "was", "subjected", "to", "SDS", "/", "PAGE", ".", "Blots", "were", "with", "antibody", "against", "V5", "or", "phosphoserine", ".", "[", "γ", "-", "32P", "]", "ATP", "-", "incorporated", "LRRK2", "visualized", "by", "autoradiography", ".", "(", "C", ")", "Binding", "assays", "to", "detect", "interactions", "between", "phosphomimetic", "LRRK2", "(", "S1292D", ")", "or", "phosphorylation", "-", "defective", "LRRK2", "(", "S1292A", ")", "and", "E3", "ubiquitin", "ligases", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "LRRK2", "mutants", "and", "E3", "ubiquitin", "ligases", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibody", "against", "Myc", "or", "V5", "epitope", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "subjected", "to", "SDS", "/", "PAGE", ",", "for", "immunoblotwith", "antibody", "against", "V5", "or", "Myc", ".", "(", "D", ")", "Immunoprecipitation", "/", "mmunoblot", "of", "E3", "ubiquitin", "ligases", "by", "PERK", "-", "ΔN", "in", "the", "presence", "of", "LRRK2", "(", "S1292A", ")", "or", "LRRK2", "(", "S1292D", ")", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "MARCH5", ",", "MULAN", ",", "Parkin", ",", "and", "PERK", "-", "ΔN", "LRRK2", "(", "S1292A", ")", "or", "LRRK2", "(", "S1292D", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibody", "against", "Myc", ",", "and", "precipitates", "were", "immunoblotted", "with", "antibody", "indicated", "the", "right", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Immunoprecipitation/mmunoblot of E3 ubiquitin ligases by PERK and the binding to mutant LRRK2. HEK293 cells were transfected with PERK and either MARCH5, MULAN or Parkin, LRRK2, LRRK2(D1994A) or LRRK2(S1292D). Cell lysates were immunoprecipitated with antibody against Myc or V5, and precipitates were immunoblotted with antibody indicated the right.(B) In vitro kinase assay for auto-phosphorylated LRRK2 using isolated LRRK2 mutants and [γ-32P]ATP with or without LRRK2-IN-1 (1 μM). Mutant LRRK2 precipitated with antibody against V5 was subjected to SDS/PAGE. Blots were with antibody against V5 or phosphoserine. [γ-32P]ATP-incorporated LRRK2 visualized by autoradiography.(C) Binding assays to detect interactions between phosphomimetic LRRK2(S1292D) or phosphorylation-defective LRRK2(S1292A) and E3 ubiquitin ligases. HEK293 cells were transfected with LRRK2 mutants and E3 ubiquitin ligases lysates were immunoprecipitated with antibody against Myc or V5 epitope. Precipitated proteins were subjected to SDS/PAGE, for immunoblotwith antibody against V5 or Myc.(D) Immunoprecipitation/mmunoblot of E3 ubiquitin ligases by PERK-ΔN in the presence of LRRK2(S1292A) or LRRK2(S1292D). HEK293 cells were transfected with MARCH5, MULAN, Parkin, and PERK-ΔN LRRK2(S1292A) or LRRK2(S1292D). Cell lysates were immunoprecipitated with antibody against Myc, and precipitates were immunoblotted with antibody indicated the right."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Immunoblot", "of", "LC3", "and", "p62", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "PERK", "-", "ΔN", "or", "PERK", "shRNA", ".", "Endogenous", "LC3", "and", "p62", "levels", "were", "measured", "by", "immunoblotting", ".", "Data", "represent", "the", "ratios", "of", "LC3", "-", "II", "to", "LC3", "-", "I", "and", "p62", "to", "actin", "normalized", "LRRK", "+", "/", "+", "MEFs", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "For", "graph", "A", ",", "the", "P", "values", "was", "determined", "by", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "B", ")", "Peak", "values", "of", "Ca2", "+", "transients", "in", "MEFs", "transfected", "with", "PERK", "-", "ΔN", "or", "PERK", "shRNA", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SD", "from", "six", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Immunoblot of LC3 and p62. MEFs were transfected with PERK-ΔN or PERK shRNA. Endogenous LC3 and p62 levels were measured by immunoblotting. Data represent the ratios of LC3-II to LC3-I and p62 to actin normalized LRRK+/+ MEFs. Error bars represent ±SD from four independent experiments. Data information: For graph A, the P values was determined by a Mann-Whitney U test. ns = not significant, *P < 0.05.(B) Peak values of Ca2+ transients in MEFs transfected with PERK-ΔN or PERK shRNA. Error bars represent ±SD from six independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1D", ")", "In", "the", "6", "months", "old", "p32cKO", "heart", ",", "p62", "and", "multi", "-", "ubiquitin", "staining", "patterns", "were", "co", "-", "localized", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "E", ")", "In", "the", "6", "months", "old", "p32cKO", "heart", ",", "the", "staining", "patterns", "of", "p62", "and", "the", "mitochondrial", "marker", "protein", ",", "pyruvate", "dehydrogenase", "(", "PDH", ")", ",", "were", "co", "-", "localized", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "ubiquitinated", "proteins", "using", "an", "anti", "-", "multi", "-", "ubiquitin", "antibody", "in", "the", "6", "months", "old", "WT", "and", "p32cKO", "heart", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "vs", "p32cKO", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D) In the 6 months old p32cKO heart, p62 and multi-ubiquitin staining patterns were co-localized. Scale bar, 5 µm. E) In the 6 months old p32cKO heart, the staining patterns of p62 and the mitochondrial marker protein, pyruvate dehydrogenase (PDH), were co-localized. Scale bar, 5 µm.(F) Western blot analysis of ubiquitinated proteins using an anti-multi-ubiquitin antibody in the 6 months old WT and p32cKO heart (n = 4 mice per group). Error bars are presented as mean ± SD. Student's t-test was performed on WT vs p32cKO, ***p < 0.005."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Autofluorescence", "showing", "lipofuscin", "localization", "around", "the", "nucleus", "in", "the", "6", "months", "old", "p32cKO", "heart", ".", "Tissues", "were", "excited", "at", "a", "wavelength", "of", "540", "(", "upper", "panel", ")", "or", "470", "(", "lower", "panel", ")", "and", "emission", "spectra", "were", "collected", "with", "a", "confocal", "microscope", "at", "wavelengths", "(", "band", "path", ")", "of", "580", "-", "630", "nm", "(", "upper", "panel", ")", "or", "510", "-", "560", "nm", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Enlarged", "view", "of", "the", "white", "squares", "is", "shown", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "µm", ".", "The", "quantification", "of", "the", "ratio", "of", "autofluorescence", "of", "DAPI", "staining", "is", "presented", "in", "the", "plot", "in", "the", "right", "panel", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "three", "months", "old", "mice", ",", "n", "=", "11", ";", "6", "months", "old", "mice", ",", "n", "=", "9", "-", "14", ",", "9", "months", "old", "mice", ",", "n", "=", "9", "-", "15", ",", "12", "months", "old", "mice", ",", "n", "=", "11", "-", "21", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ".", "(", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "Lamp2", "in", "the", "6", "months", "old", "WT", "and", "p32cKO", "hearts", ".", "Quantification", "is", "shown", "in", "the", "lower", "panel", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "vs", "p32cKO", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Autofluorescence showing lipofuscin localization around the nucleus in the 6 months old p32cKO heart. Tissues were excited at a wavelength of 540 (upper panel) or 470 (lower panel) and emission spectra were collected with a confocal microscope at wavelengths (band path) of 580-630 nm (upper panel) or 510-560 nm (lower panel). Enlarged view of the white squares is shown right. Scale bars, 20 µm. The quantification of the ratio of autofluorescence of DAPI staining is presented in the plot in the right panel as mean ± SEM (three months old mice, n = 11; 6 months old mice, n = 9-14, 9 months old mice, n = 9-15, 12 months old mice, n = 11-21). Statistical significance was assessed by Student's t-test, ***p < 0.005.(D) Western blot analysis of Lamp2 in the 6 months old WT and p32cKO hearts. Quantification is shown in the lower panel (n = 4 mice per group). GAPDH was used as an internal control. Error bars are presented as mean ± SD. Student's t-test was performed on WT vs p32cKO, ***p < 0.005."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "metabolomic", "analysis", "of", "NAD", "+", ",", "NADH", ",", "NADP", "+", ",", "nicotinamide", "and", "NAAD", "in", "the", "6", "months", "old", "WT", "and", "p32cKO", "hearts", ".", "NAD", "+", "and", "NADP", "+", "showed", "significantly", "different", "levels", "between", "WT", "and", "p32cKO", "hearts", "(", "n", "=", "12", ")", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "vs", "p32cKO", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0002", ".", "(", "B", ")", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "RNA", "expression", "of", "NAD", "-", "synthesizing", "enzymes", "in", "the", "6", "months", "old", "WT", "and", "p32cKO", "hearts", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "mice", "vs", "p32cKO", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "The", "right", "panel", "shows", "the", "NAD", "synthesis", "pathway", "and", "mRNA", "expression", "levels", "are", "indicated", "by", "red", "arrows", ".", "NAM", ":", "nicotinamide", ",", "NA", ":", "nicotinic", "acid", ",", "QA", ":", "quinolic", "acid", ",", "NMN", ":", "nicotinamide", "mononucleotide", ".", "(", "G", ")", "Nmnat3", "mRNA", "expression", "in", "3T3", "-", "L1", "cells", "after", "1", "mM", "CAP", "treatment", "for", "72", "h", ".", "The", "HIF1α", "inhibitor", "(", "20", "or", "50", "µM", ")", "was", "added", "2", "h", "before", "the", "CAP", "treatment", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "cells", "vs", "WT", "cells", "treated", "CAP", "and", "(", "or", ")", "HIF1α", "inhibitor", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "I", ")", "Nmnat3", "mRNA", "expression", "in", "3T3", "-", "L1", "cells", "after", "150", "µM", "CoCl2", "treatment", "for", "72", "h", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) LC-MS/MS metabolomic analysis of NAD+, NADH, NADP+, nicotinamide and NAAD in the 6 months old WT and p32cKO hearts. NAD+ and NADP+ showed significantly different levels between WT and p32cKO hearts (n = 12). Error bars are presented as mean ± SD. Student's t-test was performed on WT vs p32cKO, **p < 0.001, ***p < 0.0002.(B) Real-time PCR analysis of RNA expression of NAD-synthesizing enzymes in the 6 months old WT and p32cKO hearts. Error bars are presented as mean ± SD. Student's t-test was performed on WT mice vs p32cKO mice (n = 6), ***p < 0.005, *p < 0.05. The right panel shows the NAD synthesis pathway and mRNA expression levels are indicated by red arrows. NAM: nicotinamide, NA: nicotinic acid, QA: quinolic acid, NMN: nicotinamide mononucleotide.(G) Nmnat3 mRNA expression in 3T3-L1 cells after 1 mM CAP treatment for 72 h. The HIF1α inhibitor (20 or 50 µM) was added 2 h before the CAP treatment. Error bars are presented as mean ± SD of three independent experiments. Student's t-test was performed on WT cells vs WT cells treated CAP and (or) HIF1α inhibitor,**p < 0.01, *p < 0.05.(I) Nmnat3 mRNA expression in 3T3-L1 cells after 150 µM CoCl2 treatment for 72 h (n = 3). Error bars are presented as mean ± SD of three independent experiments. Statistical significance was assessed by Student's t-test, **p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Lysosomal", "acidification", "is", "impaired", "in", "p32KO", "MEFs", ".", "Representative", "images", "of", "WT", "and", "p32KO", "MEFs", ",", "stained", "with", "dextran", "-", "Oregon", "Green", "(", "488", ")", "and", "dextran", "-", "TMRM", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Addition", "of", "1", "mM", "NMN", "for", "48", "h", "to", "p32KO", "MEFs", "rescued", "lysosomal", "acidification", ",", "and", "1", "mM", "CAP", "treatment", "of", "WT", "MEFs", "for", "48", "h", "decreased", "lysosomal", "acidification", ".", "Dextran", "-", "Oregon", "Green", "is", "quenched", "under", "acidic", "pH", ",", "and", "thus", "an", "increased", "green", ":", "red", "ratio", "denotes", "impaired", "lysosomal", "acidification", ".", "The", "average", "±", "SEM", "of", "the", "green", ":", "red", "ratio", "in", "at", "least", "30", "cells", "in", "two", "independent", "experiments", "is", "presented", "in", "the", "plot", "(", "normalized", "to", "WT", "green", "/", "red", "=", "1", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Nmnat3", "(", "v1", ")", "overexpression", "in", "p32KO", "MEFs", "rescued", "lysosomal", "function", ".", "LysoTracker", "Red", "-", "stained", "p32KO", "MEFs", "were", "quantified", "by", "flow", "cytometry", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "4", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Lysosomal acidification is impaired in p32KO MEFs. Representative images of WT and p32KO MEFs, stained with dextran-Oregon Green (488) and dextran-TMRM. Scale bar, 5 µm. Addition of 1 mM NMN for 48 h to p32KO MEFs rescued lysosomal acidification, and 1 mM CAP treatment of WT MEFs for 48 h decreased lysosomal acidification. Dextran-Oregon Green is quenched under acidic pH, and thus an increased green:red ratio denotes impaired lysosomal acidification. The average ± SEM of the green:red ratio in at least 30 cells in two independent experiments is presented in the plot (normalized to WT green/red = 1). Statistical significance was assessed by Student's t-test, *p < 0.05, ***p < 0.001.(E) Nmnat3(v1) overexpression in p32KO MEFs rescued lysosomal function. LysoTracker Red-stained p32KO MEFs were quantified by flow cytometry. Error bars are presented as mean ± SEM of 4 independent experiments. Statistical significance was assessed by Student's t-test, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "WT", "MEFs", "were", "stained", "with", "dextran", "-", "Oregon", "Green", "and", "dextran", "-", "TMRM", "to", "examine", "lysosomal", "acidification", "after", "10", "nM", "FK866", "treatment", ".", "FK866", "decreased", "lysosomal", "acidification", ",", "which", "was", "rescued", "by", "1", "mM", "NMN", "pretreatment", ".", "The", "stained", "MEFs", "were", "quantified", "using", "a", "microscope", "(", "BZ", "-", "X800", ",", "KEYENCE", ")", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "F", ")", "To", "examine", "autophagosome", "and", "autolysosome", "formation", ",", "we", "used", "DAPRed", ",", "which", "indicates", "autophagosomes", ",", "and", "DALGreen", ",", "which", "indicates", "autolysosomes", ".", "After", "starvation", ",", "co", "-", "localization", "of", "both", "staining", "agents", "was", "observed", "upon", "FK866", "or", "bafilomycin", "A", "treatment", "in", "WT", "MEF", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) WT MEFs were stained with dextran-Oregon Green and dextran-TMRM to examine lysosomal acidification after 10 nM FK866 treatment. FK866 decreased lysosomal acidification, which was rescued by 1 mM NMN pretreatment. The stained MEFs were quantified using a microscope (BZ-X800, KEYENCE). Error bars are presented as mean ± SEM of three independent experiments. Statistical significance was assessed by one-way ANOVA, ***p < 0.001.(F) To examine autophagosome and autolysosome formation, we used DAPRed, which indicates autophagosomes, and DALGreen, which indicates autolysosomes. After starvation, co-localization of both staining agents was observed upon FK866 or bafilomycin A treatment in WT MEF cells. Scale bars, 10 µm. Quantification is shown on the right. Error bars are presented as mean ± SEM of three independent experiments. Statistical significance was assessed by one-way ANOVA, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "D", ")", "After", "adding", "various", "concentrations", "of", "NaCl", "to", "the", "lysosomal", "fraction", "of", "WT", "MEFs", ",", "the", "membrane", "pellet", "(", "bound", ")", "and", "supernatant", "(", "free", ")", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "GAPDH", "and", "PGK1", "antibodies", ".", "(", "I", ")", "After", "addition", "of", "GAP", ",", "NAD", "and", "Pi", ",", "ATP", "production", "in", "the", "lysosomal", "fraction", "isolated", "by", "MAG10", "was", "measured", "using", "a", "luciferin", "/", "luciferase", "kit", ".", "Iodoacetate", "(", "IA", ";", "4", "µM", ")", "was", "used", "to", "inhibit", "GAPDH", "activity", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "002", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(D) After adding various concentrations of NaCl to the lysosomal fraction of WT MEFs, the membrane pellet (bound) and supernatant (free) were subjected to immunoblotting with GAPDH and PGK1 antibodies.(I) After addition of GAP, NAD and Pi, ATP production in the lysosomal fraction isolated by MAG10 was measured using a luciferin/luciferase kit. Iodoacetate (IA; 4 µM) was used to inhibit GAPDH activity. Three independent experiments were performed. Error bars are presented as mean ± SEM of three independent experiments. Statistical significance was assessed by one-way ANOVA, **p < 0.002."}
{"words": ["Figure", "1B", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "shows", "the", "early", "steps", "in", "neuronal", "differentiation", ".", "Two", "transient", "basal", "protrusions", "are", "extended", "along", "the", "basal", "surface", "of", "the", "neural", "tube", "(", "6h", "26", "to", "14h", "01", ")", "and", "then", "retracted", "(", "15h", "31", "to", "17h", "31", ")", ".", "The", "apical", "attachment", "is", "also", "retracted", "(", "17h", "31", "to", "19h", "53", ";", "e", ".", "g", ".", "-", "1h", "30", ",", ")", "before", "the", "axon", "is", "extended", "(", "20h", "38", "to", "21h", "50", ")", ".", "Main", "images", "are", "maximum", "projections", "and", "insets", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "C", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "shows", "a", "neuron", "before", ",", "during", "and", "after", "axon", "initiation", ".", "Prior", "to", "axon", "initiation", ",", "the", "neuron", "extends", "multiple", "small", ",", "transient", "pre", "-", "axonal", "protrusions", "(", "-", "2h", "to", "-", "20m", ")", ".", "The", "nascent", "axon", "is", "extended", "(", "0h", ")", "and", "maintained", "for", "a", "short", "period", "(", "0h", "to", "30m", ")", "before", "axon", "growth", "begins", "(", "45m", "to", "2h", "20", ")", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "D", "Plots", "showing", "axon", "position", "on", "the", "soma", "(", "e", ".", "g", ".", "asterisk", "in", "Figure", "1C", "0h", ")", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "86", "cells", "from", "8", "experiments", ")", ".", "Axon", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "95", ".", "3o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "148", ".", "9o", ")", ".", "Data", "analysed", "using", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "the", "Rayleigh", "'", "s", "test", ".", "F", "Lateral", "and", "transverse", "reconstructions", "of", "DoLA", "neuron", "at", "the", "time", "of", "axon", "initiation", "(", "0h", ")", "and", "during", "axon", "growth", "(", "4h", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "G", "-", "M", "Plots", "showing", "axon", "position", "on", "the", "soma", "relative", "to", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "in", "dorsal", "and", "transverse", "view", "for", "DoLA", "(", "G", ";", "n", "=", "7", "cells", ")", ",", "CiA", "(", "H", ";", "n", "=", "10", "cells", ")", ",", "CiD", "(", "I", ";", "n", "=", "3", "cells", ")", ",", "VeLD", "(", "J", ";", "n", "=", "5", "cells", ")", ",", "CoSA", "(", "K", ";", "n", "=", "11", "cells", ")", ",", "CoB", "(", "L", ";", "n", "=", "6", "cells", ")", "and", "UCoD", "(", "M", ";", "15", "cells", ")", "neuronal", "subtypes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Image sequence from confocal time lapse shows the early steps in neuronal differentiation. Two transient basal protrusions are extended along the basal surface of the neural tube (6h 26 to 14h 01) and then retracted (15h 31 to 17h 31). The apical attachment is also retracted (17h 31 to 19h 53; e.g. -1h 30,) before the axon is extended (20h 38 to 21h 50). Main images are maximum projections and insets are transverse reconstructions from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.C Image sequence from confocal time lapse shows a neuron before, during and after axon initiation. Prior to axon initiation, the neuron extends multiple small, transient pre-axonal protrusions (-2h to -20m). The nascent axon is extended (0h) and maintained for a short period (0h to 30m) before axon growth begins (45m to 2h 20). Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.D Plots showing axon position on the soma (e.g. asterisk in Figure 1C 0h) relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 86 cells from 8 experiments). Axon position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = 95.3o; transverse view P < 0.001, mean = 148.9o). Data analysed using Moore's modification of the Rayleigh's test.F Lateral and transverse reconstructions of DoLA neuron at the time of axon initiation (0h) and during axon growth (4h). Data information: All scale bars = 10 µm.G-M Plots showing axon position on the soma relative to cell centroid at 0,0 in dorsal and transverse view for DoLA (G; n = 7 cells), CiA (H; n = 10 cells), CiD (I; n = 3 cells), VeLD (J; n = 5 cells), CoSA (K; n = 11 cells), CoB (L; n = 6 cells) and UCoD (M; 15 cells) neuronal subtypes."}
{"words": ["Figure", "2A", "Image", "sequence", "showing", "centrosome", "position", "of", "a", "neuron", "labelled", "with", "membrane", "and", "centrosome", "labels", "during", "apical", "process", "retraction", ".", "The", "centrosome", "is", "retracted", "close", "to", "the", "tip", "of", "the", "apical", "process", ".", "Images", "are", "maximum", "projections", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "B", "(", "i", ")", "Image", "sequence", "showing", "a", "neuron", "labelled", "with", "a", "membrane", "marker", "during", "apical", "retraction", "without", "any", "observable", "abscission", "event", "(", "n", "=", "64", "/", "72", "cells", "from", "6", "experiments", ")", ".", "(", "ii", ")", "High", "resolution", "images", "of", "boxed", "section", "in", "(", "i", ")", ".", "Images", "are", "maximum", "projections", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "C", "(", "i", ")", "Low", "magnification", "overview", "of", "the", "spinal", "cord", "of", "a", "cilium", "reporter", "line", ",", "Tg", "(", "actb2", ":", "arl13b", "-", "GFP", ")", "from", "a", "single", "confocal", "slice", ".", "(", "ii", ")", "High", "resolution", "image", "sequence", "of", "boxed", "section", "in", "(", "i", ")", ".", "One", "GFP", "-", "labelled", "cilium", "moves", "from", "apical", "surface", "towards", "the", "basal", "surface", "of", "the", "spinal", "cord", "(", "n", "=", "13", "cilia", "from", "two", "experiments", ")", ".", "Images", "are", "maximum", "projections", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "D", "(", "i", ")", "Low", "magnification", "overview", "of", "the", "spinal", "cord", "of", "a", "Tg", "(", "actb2", ":", "arl13b", "-", "GFP", ")", "embryo", "labelled", "with", "centrin", "-", "RFP", "from", "a", "single", "confocal", "slice", ".", "(", "ii", ")", "Image", "sequence", "of", "boxed", "section", "in", "(", "i", ")", ".", "A", "cilium", "and", "centrosome", "move", "together", "from", "apical", "surface", "towards", "the", "basal", "surface", "of", "the", "spinal", "cord", "(", "n", "=", "2", "cells", "from", "one", "experiment", ")", ".", "Insets", "show", "high", "magnification", "of", "cilium", "-", "centrosome", "pair", ".", "Images", "are", "maximum", "projections", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "E", "Graph", "showing", "length", "of", "cilium", "as", "it", "moves", "from", "apical", "surface", "(", "0", "%", ")", "to", "close", "to", "basal", "surface", "(", "100", "%", ".", "Cilium", "length", "did", "not", "change", "(", "P", ">", "0", ".", "05", "for", "n", "=", "6", "/", "7", "cilia", "from", "two", "experiments", ";", "non", "-", "linear", "regression", ")", ".", "F", "Distance", "between", "centrosome", "and", "cilium", "in", "Tg", "(", "actb2", ":", "arl13b", "-", "GFP", ")", "embryos", "fixed", "and", "processed", "for", "immunohistochemistry", "against", "GFP", "to", "label", "the", "cilium", "and", "γ", "-", "tubulin", "to", "label", "the", "centrosome", ".", "No", "difference", "was", "found", "in", "the", "distance", "between", "the", "two", "organelles", "when", "close", "to", "the", "apical", "surface", "or", "away", "from", "the", "midline", "(", "n", "=", "50", "cells", "per", "position", "from", "two", "experiments", ";", "P", "=", "0", ".", "8279", ";", "midline", "mean", "=", "0", ".", "4956", ",", "s", ".", "d", "=", "0", ".", "1125", ";", "away", "from", "midline", "mean", "=", "0", ".", "5004", ",", "s", ".", "d", "=", "0", ".", "1077", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Bars", "show", "mean", "and", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Image sequence showing centrosome position of a neuron labelled with membrane and centrosome labels during apical process retraction. The centrosome is retracted close to the tip of the apical process. Images are maximum projections from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.B (i) Image sequence showing a neuron labelled with a membrane marker during apical retraction without any observable abscission event (n = 64/72 cells from 6 experiments). (ii) High resolution images of boxed section in (i). Images are maximum projections from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.C (i) Low magnification overview of the spinal cord of a cilium reporter line, Tg(actb2:arl13b-GFP) from a single confocal slice. (ii) High resolution image sequence of boxed section in (i). One GFP-labelled cilium moves from apical surface towards the basal surface of the spinal cord (n = 13 cilia from two experiments). Images are maximum projections from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.D (i) Low magnification overview of the spinal cord of a Tg(actb2:arl13b-GFP) embryo labelled with centrin-RFP from a single confocal slice. (ii) Image sequence of boxed section in (i). A cilium and centrosome move together from apical surface towards the basal surface of the spinal cord (n = 2 cells from one experiment). Insets show high magnification of cilium-centrosome pair. Images are maximum projections from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.E Graph showing length of cilium as it moves from apical surface (0%) to close to basal surface (100%. Cilium length did not change (P > 0.05 for n = 6/7 cilia from two experiments; non-linear regression).F Distance between centrosome and cilium in Tg(actb2:arl13b-GFP) embryos fixed and processed for immunohistochemistry against GFP to label the cilium and γ-tubulin to label the centrosome. No difference was found in the distance between the two organelles when close to the apical surface or away from the midline (n = 50 cells per position from two experiments; P = 0.8279; midline mean = 0.4956, s.d = 0.1125; away from midline mean = 0.5004, s.d = 0.1077; Student's unpaired t-test). Bars show mean and standard deviation."}
{"words": ["Figure", "3A", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "shows", "a", "neuron", "labelled", "with", "membrane", "and", "centrosome", "markers", "before", "(", "-", "16m", ")", ",", "during", "(", "0m", ")", "and", "after", "axon", "initiation", "(", "15m", ",", "31m", ")", ".", "The", "centrosome", "is", "located", "on", "the", "opposite", "side", "of", "the", "cell", "to", "the", "nascent", "axon", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "B", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "shows", "a", "neuron", "labelled", "with", "membrane", "and", "Golgi", "complex", "markers", "before", "(", "-", "17m", ")", ",", "during", "(", "0m", ")", "and", "after", "axon", "initiation", "(", "17m", ",", "37m", ")", ".", "The", "Golgi", "complex", "is", "located", "on", "the", "opposite", "side", "of", "the", "cell", "to", "the", "nascent", "axon", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "C", "Graph", "showing", "distance", "between", "centrosome", "or", "Golgi", "complex", "and", "base", "of", "axon", "at", "time", "of", "axon", "initiation", "and", "6", "-", "8", "hours", "after", "axon", "initiation", ".", "Bars", "show", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "At", "time", "of", "axon", "initiation", ":", "centrosome", "-", "axon", "mean", "=", "10", ".", "1", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "3", ".", "3", ",", "n", "=", "26", "cells", "from", "three", "experiments", ";", "Golgi", "complex", "-", "axon", "mean", "=", "9", ".", "3", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "3", ".", "8", ",", "n", "=", "16", "cells", "from", "two", "experiments", ".", "At", "6", "-", "8", "hours", "after", "axon", "initiation", ":", "centrosome", "-", "axon", "mean", "=", "4", ".", "2", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "2", ".", "1", ",", "n", "=", "26", "cells", ";", "Golgi", "complex", "-", "axon", "mean", "=", "4", ".", "3", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "2", ".", "1", ",", "n", "=", "27", "cells", ".", "D", "Transverse", "reconstruction", "from", "confocal", "time", "lapse", "of", "a", "neuron", "labelled", "with", "membrane", "and", "centrosome", "markers", "during", "axon", "growth", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "E", "Transverse", "reconstruction", "from", "confocal", "time", "lapse", "of", "a", "neuron", "labelled", "with", "membrane", "and", "Golgi", "complex", "markers", "during", "axon", "growth", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "F", "Plots", "showing", "the", "positions", "of", "the", "centrosome", "and", "base", "of", "the", "axon", "at", "the", "time", "of", "axon", "initiation", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "26", "cells", "from", "three", "experiments", ")", ".", "Left", "-", "hand", "plots", ":", "centrosome", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "-", "100", ".", "8o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "-", "33", ".", "7o", ")", "and", "axon", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "101", ".", "0o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "154", ".", "8o", ";", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "Rayleigh", "'", "s", "test", ")", ".", "Centrosome", "and", "axon", "positions", "are", "significantly", "different", "(", "dorsal", "view", "0", ".", "001", ">", "P", ";", "transverse", "view", "0", ".", "001", ">", "P", ";", "Moore", "'", "s", "test", "for", "paired", "data", ")", ".", "Right", "-", "hand", "plots", ":", "vectors", "linking", "centrosome", "and", "nascent", "axon", "of", "the", "same", "cell", "are", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "91", ".", "0o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "151", ".", "7o", ";", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "Rayleigh", "'", "s", "test", ")", ".", "G", "Plots", "showing", "the", "positions", "of", "the", "Golgi", "complex", "(", "magenta", ")", "and", "base", "of", "the", "axon", "(", "grey", ")", "at", "the", "time", "of", "axon", "initiation", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "16", "cells", "from", "two", "experiments", ")", ".", "Left", "-", "hand", "plots", ":", "Golgi", "complex", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "0", ".", "01", "<", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "mean", "=", "-", "83", ".", "0o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "-", "53", ".", "4o", ")", "and", "axon", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "89", ".", "1o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "147", ".", "4o", ";", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "Rayleigh", "'", "s", "test", ")", ".", "Golgi", "complex", "and", "axon", "positions", "are", "significantly", "different", "(", "dorsal", "view", "0", ".", "001", ">", "P", ";", "transverse", "view", "0", ".", "001", ">", "P", ";", "Moore", "'", "s", "test", "for", "paired", "data", ")", ".", "Right", "-", "hand", "plots", ":", "vectors", "linking", "Golgi", "complex", "and", "nascent", "axon", "of", "the", "same", "cell", "are", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "98", ".", "5o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "156", ".", "8o", ";", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "Rayleigh", "'", "s", "test", ")", ".", "H", "Plots", "showing", "the", "positions", "of", "the", "centrosome", "and", "base", "of", "the", "axon", "6", "-", "12", "hours", "after", "axon", "initiation", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "26", "cells", ")", ".", "Centrosome", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "67", ".", "7o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "151", ".", "6o", ")", ".", "Axon", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "74", ".", "0o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "153", ".", "7o", ";", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "Rayleigh", "'", "s", "test", ")", ".", "Centrosome", "and", "axon", "positions", "are", "not", "significantly", "different", "(", "dorsal", "view", "0", ".", "5", "<", "P", ";", "transverse", "view", "0", ".", "1", "<", "P", "<", "0", ".", "5", ";", "Moore", "'", "s", "test", "for", "paired", "data", ")", ".", "I", "Plots", "showing", "the", "positions", "of", "the", "Golgi", "complex", "and", "base", "of", "the", "axon", "6", "-", "12", "hours", "after", "axon", "initiation", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "27", "cells", ")", ".", "Golgi", "complex", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "79", ".", "9o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "149", ".", "9o", ")", ".", "Axon", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "76", ".", "0o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "153", ".", "9o", ";", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "Rayleigh", "'", "s", "test", ")", ".", "Golgi", "complex", "and", "axon", "positions", "are", "different", "only", "in", "transverse", "view", "(", "dorsal", "view", "0", ".", "5", "<", "P", ";", "transverse", "view", "0", ".", "005", "<", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "Moore", "'", "s", "test", "for", "paired", "data", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Image sequence from confocal time lapse shows a neuron labelled with membrane and centrosome markers before (-16m), during (0m) and after axon initiation (15m, 31m). The centrosome is located on the opposite side of the cell to the nascent axon. Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.B Image sequence from confocal time lapse shows a neuron labelled with membrane and Golgi complex markers before (-17m), during (0m) and after axon initiation (17m, 37m). The Golgi complex is located on the opposite side of the cell to the nascent axon. Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.C Graph showing distance between centrosome or Golgi complex and base of axon at time of axon initiation and 6-8 hours after axon initiation. Bars show mean and standard deviation. At time of axon initiation: centrosome-axon mean = 10.1 µm, s.d. = 3.3, n = 26 cells from three experiments; Golgi complex-axon mean = 9.3 µm, s.d. = 3.8, n = 16 cells from two experiments. At 6-8 hours after axon initiation: centrosome-axon mean = 4.2 µm, s.d. = 2.1, n = 26 cells; Golgi complex-axon mean = 4.3 µm, s.d. = 2.1, n = 27 cells.D Transverse reconstruction from confocal time lapse of a neuron labelled with membrane and centrosome markers during axon growth. Data information: All scale bars = 10 µm.E Transverse reconstruction from confocal time lapse of a neuron labelled with membrane and Golgi complex markers during axon growth. Data information: All scale bars = 10 µm.F Plots showing the positions of the centrosome and base of the axon at the time of axon initiation relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 26 cells from three experiments). Left-hand plots: centrosome position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = -100.8o; transverse view P < 0.001, mean = -33.7o) and axon position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = 101.0o; transverse view P < 0.001, mean = 154.8o; Moore's modification of Rayleigh's test). Centrosome and axon positions are significantly different (dorsal view 0.001 > P; transverse view 0.001 > P; Moore's test for paired data). Right-hand plots: vectors linking centrosome and nascent axon of the same cell are not random (dorsal view P < 0.001, mean = 91.0o; transverse view P < 0.001, mean = 151.7o; Moore's modification of Rayleigh's test). G Plots showing the positions of the Golgi complex (magenta) and base of the axon (grey) at the time of axon initiation relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 16 cells from two experiments). Left-hand plots: Golgi complex position is not random (dorsal view 0.01 < P < 0.05, mean = -83.0o; transverse view P < 0.001, mean = -53.4o) and axon position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = 89.1o; transverse view P < 0.001, mean = 147.4o; Moore's modification of Rayleigh's test). Golgi complex and axon positions are significantly different (dorsal view 0.001 > P; transverse view 0.001 > P; Moore's test for paired data). Right-hand plots: vectors linking Golgi complex and nascent axon of the same cell are not random (dorsal view P < 0.001, mean = 98.5o; transverse view P < 0.001, mean = 156.8o; Moore's modification of Rayleigh's test). H Plots showing the positions of the centrosome and base of the axon 6-12 hours after axon initiation relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 26 cells). Centrosome position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = 67.7o; transverse view P < 0.001, mean = 151.6o). Axon position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = 74.0o; transverse view P < 0.001, mean = 153.7o; Moore's modification of Rayleigh's test). Centrosome and axon positions are not significantly different (dorsal view 0.5 < P; transverse view 0.1 < P < 0.5; Moore's test for paired data). I Plots showing the positions of the Golgi complex and base of the axon 6-12 hours after axon initiation relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 27 cells). Golgi complex position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = 79.9o; transverse view P < 0.001, mean = 149.9o). Axon position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = 76.0o; transverse view P < 0.001, mean = 153.9o; Moore's modification of Rayleigh's test). Golgi complex and axon positions are different only in transverse view (dorsal view 0.5 < P; transverse view 0.005 < P < 0.01; Moore's test for paired data)."}
{"words": ["Figure", "4A", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "of", "a", "neuron", "labelled", "with", "a", "membrane", "marker", "and", "lifeact", "-", "Ruby", "before", ",", "during", "(", "0m", ")", "and", "after", "axon", "initiation", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "B", "Graph", "showing", "time", "(", "minutes", ")", "between", "actin", "accumulation", "and", "nascent", "axon", "initiation", "(", "n", "=", "15", "cells", "from", "7", "experiments", ")", ".", "Bars", "show", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "C", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "of", "a", "neuron", "labelled", "with", "lifeact", "-", "Ruby", "and", "EB3", "-", "GFP", "before", ",", "during", "(", "0m", ")", "and", "after", "axon", "initiation", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "D", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "of", "a", "neuron", "labelled", "with", "a", "membrane", "marker", "and", "Kif5c560", "-", "YFP", "before", ",", "during", "(", "0m", ")", "and", "after", "axon", "initiation", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "E", "Three", "time", "points", "from", "confocal", "time", "lapse", "of", "a", "triple", "labelled", "neuron", "before", ",", "during", "(", "0m", ")", "and", "after", "nascent", "axon", "initiation", ".", "Images", "to", "left", "show", "distribution", "sequence", "of", "lifeact", "-", "Ruby", ",", "kif5c560", "-", "YFP", "and", "EB3", "-", "GFP", "individually", ".", "Dual", "channel", "merges", "to", "the", "right", "show", "relative", "locations", "of", "pairs", "of", "fusion", "proteins", ".", "Images", "to", "right", "are", "maximum", "projections", "of", "transverse", "reslices", "of", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Image sequence from confocal time lapse of a neuron labelled with a membrane marker and lifeact-Ruby before, during (0m) and after axon initiation. Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.B Graph showing time (minutes) between actin accumulation and nascent axon initiation (n = 15 cells from 7 experiments). Bars show mean and standard deviation.C Image sequence from confocal time lapse of a neuron labelled with lifeact-Ruby and EB3-GFP before, during (0m) and after axon initiation. Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.D Image sequence from confocal time lapse of a neuron labelled with a membrane marker and Kif5c560-YFP before, during (0m) and after axon initiation. Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.E Three time points from confocal time lapse of a triple labelled neuron before, during (0m) and after nascent axon initiation. Images to left show distribution sequence of lifeact-Ruby, kif5c560-YFP and EB3-GFP individually. Dual channel merges to the right show relative locations of pairs of fusion proteins. Images to right are maximum projections of transverse reslices of confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm."}
{"words": ["Figure", "5A", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "of", "a", "neuron", "that", "does", "not", "extend", "a", "nascent", "axon", "during", "nocodazole", "treatment", "labelled", "with", "a", "membrane", "marker", "and", "lifeact", "-", "Ruby", "before", "(", "-", "10m", ")", "and", "during", "(", "0m", "to", "170m", ")", "nocodazole", "treatment", ".", "Protrusions", "present", "before", "nocodazole", "addition", "are", "retracted", "upon", "nocodazole", "treatment", "(", "20m", ")", ".", "Short", ",", "transient", "non", "-", "axonal", "protrusions", "are", "extended", "during", "nocodazole", "treatment", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "B", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "of", "a", "neuron", "that", "extends", "a", "nascent", "axon", "during", "nocodazole", "treatment", "labelled", "with", "a", "membrane", "marker", "and", "lifeact", "-", "Ruby", "before", "(", "-", "10m", ")", "and", "during", "(", "0h", "to", "170m", ")", "nocodazole", "treatment", ".", "Small", "protrusions", "present", "before", "nocodazole", "addition", "(", "-", "10m", ")", "are", "retracted", "upon", "nocodazole", "treatment", "(", "0m", ")", ".", "A", "nascent", "axon", "-", "like", "protrusion", "(", "long", ",", "broad", ",", "long", "-", "lived", ")", "is", "extended", "during", "nocodazole", "treatment", "(", "110m", "to", "170m", ")", ".", "Transient", "non", "-", "axonal", "protrusions", "are", "also", "present", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "C", "Graph", "showing", "duration", "(", "minutes", ")", "of", "nascent", "axon", "-", "like", "protrusions", "in", "nocodazole", "treated", "cells", "and", "non", "-", "axonal", "protrusions", "in", "control", "and", "nocodazole", "treated", "cells", ".", "Control", "nascent", "axons", "were", "not", "analysed", "as", "they", "do", "not", "retract", ".", "Bars", "show", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "Nocodazole", "nascent", "axons", ":", "n", "=", "14", "protrusions", "from", "14", "cells", "from", "three", "experiments", ";", "mean", "=", "65", ".", "17", "minutes", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "20", ".", "33", ".", "Control", "non", "-", "axons", ":", "n", "=", "40", "protrusions", "from", "10", "cells", "from", "three", "experiments", ";", "mean", "=", "17", ".", "15", "minutes", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "8", ".", "804", ".", "Nocodazole", "non", "-", "axons", ":", "n", "=", "41", "protrusions", "from", "16", "cells", "from", "three", "experiments", ";", "mean", "=", "16", ".", "182", "minutes", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "7", ".", "147", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparisons", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "nocodazole", "nascent", "axon", "vs", "nocodazole", "non", "-", "axon", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "control", "non", "-", "axon", "vs", "nocodazole", "non", "-", "axon", "P", "=", "0", ".", "9132", ".", "D", "Graph", "showing", "length", "(", "µm", ")", "of", "nascent", "axon", "-", "like", "protrusions", "and", "non", "-", "axonal", "protrusions", "in", "control", "and", "nocodazole", "treated", "cells", ".", "Bars", "show", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "Control", "nascent", "axons", "were", "analysed", "after", "60", "minutes", ":", "n", "=", "18", "protrusions", "from", "18", "cells", ";", "mean", "=", "14", ".", "092", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "5", ".", "149", ".", "Nocodazole", "nascent", "axons", ":", "n", "=", "14", "protrusions", "from", "14", "cells", ";", "mean", "=", "9", ".", "596", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "2", ".", "371", ".", "Control", "non", "-", "axons", ":", "n", "=", "40", "protrusions", "from", "10", "cells", ";", "mean", "=", "5", ".", "802", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "2", ".", "553", ".", "Nocodazole", "non", "-", "axons", ":", "n", "=", "41", "protrusion", "from", "16", "cells", ";", "mean", "=", "4", ".", "407", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "2", ".", "024", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparisons", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "control", "nascent", "axon", "vs", "nocodazole", "nascent", "axon", "P", "=", "0", ".", "0002", ";", "control", "nascent", "axon", "vs", "control", "non", "-", "axon", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "nocodazole", "nascent", "axon", "vs", "nocodazole", "non", "-", "axon", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "control", "non", "-", "axon", "vs", "nocodazole", "non", "-", "axon", "P", "=", "0", ".", "1485", ".", "E", "Graph", "showing", "width", "(", "µm", ")", "at", "the", "base", "of", "nascent", "axon", "-", "like", "protrusions", "and", "non", "-", "axonal", "protrusions", "in", "control", "and", "nocodazole", "treated", "cells", ".", "Bars", "show", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "Control", "nascent", "axons", ":", "n", "=", "19", "protrusions", "from", "19", "cells", "from", "six", "experiments", ";", "mean", "=", "7", ".", "806", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "3", ".", "163", ".", "Nocodazole", "nascent", "axons", ":", "n", "=", "14", "protrusions", "from", "14", "cells", "from", "three", "experiments", ";", "mean", "=", "4", ".", "188", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "1", ".", "637", ".", "Control", "non", "-", "axons", "from", "three", "experiments", ":", "n", "=", "40", "protrusions", "from", "10", "cells", ";", "mean", "=", "1", ".", "061", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "0", ".", "652", ".", "Nocodazole", "non", "-", "axons", "from", "three", "experiments", ":", "n", "=", "41", "protrusions", "from", "16", "cells", ";", "mean", "=", "0", ".", "984", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "0", ".", "757", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparisons", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "control", "nascent", "axon", "vs", "nocodazole", "nascent", "axon", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "control", "nascent", "axon", "vs", "control", "non", "-", "axon", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "nocodazole", "nascent", "axon", "vs", "nocodazole", "non", "-", "axon", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "control", "non", "-", "axon", "vs", "nocodazole", "non", "-", "axon", "P", "=", "0", ".", "9958", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "F", "Plots", "showing", "nascent", "axon", "position", "on", "the", "soma", "of", "control", "cells", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "19", "cells", "from", "six", "experiments", ")", ".", "Numbers", "show", "total", "count", "of", "axons", "in", "each", "quadrant", ".", "G", "Plots", "showing", "nascent", "axon", "position", "on", "the", "soma", "of", "nocodazole", "treated", "cells", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "14", "cells", "from", "three", "experiments", ")", ".", "Numbers", "show", "total", "count", "of", "axons", "in", "each", "quadrant", ".", "H", "Plots", "showing", "the", "position", "of", "non", "-", "axonal", "protrusions", "on", "the", "soma", "of", "control", "cells", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "40", "protrusions", "from", "10", "cells", "from", "three", "experiments", ")", ".", "Numbers", "show", "total", "count", "of", "protrusions", "in", "each", "quadrant", ".", "I", "Plots", "showing", "the", "position", "of", "non", "-", "axonal", "protrusions", "on", "the", "soma", "of", "nocodazole", "treated", "cells", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "41", "protrusions", "from", "16", "cells", "from", "three", "experiments", ")", ".", "Numbers", "show", "total", "count", "of", "protrusions", "originating", "in", "each", "quadrant", ".", "J", "Graph", "showing", "the", "ratio", "of", "kif5c560", "-", "YFP", "fluorescence", "intensity", "in", "the", "soma", "compared", "to", "the", "axon", "with", "or", "without", "nocodazole", ".", "Bars", "show", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "Control", ":", "n", "=", "6", "cells", "from", "four", "experiments", ";", "mean", "=", "1", ".", "81", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "1", ".", "59", ".", "Nocodazole", ":", "n", "=", "7", "cells", "from", "four", "experiments", ";", "mean", "=", "0", ".", "75", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "0", ".", "19", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "K", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "of", "a", "neuron", "that", "extends", "a", "nascent", "axon", "during", "nocodazole", "treatment", "labelled", "with", "a", "membrane", "marker", "and", "kif5c560", "-", "YFP", "before", "(", "-", "10m", ")", "and", "during", "(", "0h", "to", "144m", ")", "nocodazole", "treatment", ".", "A", "nascent", "axon", "-", "like", "protrusion", "is", "extended", "during", "nocodazole", "treatment", "(", "92m", "to", "144m", ")", "but", "kif5c560", "-", "YFP", "does", "not", "accumulate", "there", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Image sequence from confocal time lapse of a neuron that does not extend a nascent axon during nocodazole treatment labelled with a membrane marker and lifeact-Ruby before (-10m) and during (0m to 170m) nocodazole treatment. Protrusions present before nocodazole addition are retracted upon nocodazole treatment (20m). Short, transient non-axonal protrusions are extended during nocodazole treatment. Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks. B Image sequence from confocal time lapse of a neuron that extends a nascent axon during nocodazole treatment labelled with a membrane marker and lifeact-Ruby before (-10m) and during (0h to 170m) nocodazole treatment. Small protrusions present before nocodazole addition (-10m) are retracted upon nocodazole treatment (0m). A nascent axon-like protrusion (long, broad, long-lived) is extended during nocodazole treatment (110m to 170m). Transient non-axonal protrusions are also present. Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm.C Graph showing duration (minutes) of nascent axon-like protrusions in nocodazole treated cells and non-axonal protrusions in control and nocodazole treated cells. Control nascent axons were not analysed as they do not retract. Bars show mean and standard deviation. Nocodazole nascent axons: n = 14 protrusions from 14 cells from three experiments; mean = 65.17 minutes, s.d. = 20.33. Control non-axons: n = 40 protrusions from 10 cells from three experiments; mean = 17.15 minutes, s.d. = 8.804. Nocodazole non-axons: n = 41 protrusions from 16 cells from three experiments; mean = 16.182 minutes, s.d. = 7.147. One-way ANOVA with multiple comparisons: P < 0.0001; nocodazole nascent axon vs nocodazole non-axon P < 0.0001; control non-axon vs nocodazole non-axon P = 0.9132. D Graph showing length (µm) of nascent axon-like protrusions and non-axonal protrusions in control and nocodazole treated cells. Bars show mean and standard deviation. Control nascent axons were analysed after 60 minutes: n = 18 protrusions from 18 cells; mean = 14.092 µm, s.d. = 5.149. Nocodazole nascent axons: n = 14 protrusions from 14 cells; mean = 9.596 µm, s.d. = 2.371. Control non-axons: n = 40 protrusions from 10 cells; mean = 5.802 µm, s.d. = 2.553. Nocodazole non-axons: n = 41 protrusion from 16 cells; mean = 4.407 µm, s.d. = 2.024. One-way ANOVA with multiple comparisons: P < 0.0001; control nascent axon vs nocodazole nascent axon P = 0.0002; control nascent axon vs control non-axon P < 0.0001; nocodazole nascent axon vs nocodazole non-axon P < 0.0001; control non-axon vs nocodazole non-axon P = 0.1485. E Graph showing width (µm) at the base of nascent axon-like protrusions and non-axonal protrusions in control and nocodazole treated cells. Bars show mean and standard deviation. Control nascent axons: n = 19 protrusions from 19 cells from six experiments; mean = 7.806 µm, s.d. = 3.163. Nocodazole nascent axons: n = 14 protrusions from 14 cells from three experiments; mean = 4.188 µm, s.d. = 1.637. Control non-axons from three experiments: n = 40 protrusions from 10 cells; mean = 1.061 µm, s.d. = 0.652. Nocodazole non-axons from three experiments: n = 41 protrusions from 16 cells; mean = 0.984 µm, s.d. = 0.757. One-way ANOVA with multiple comparisons: P < 0.0001; control nascent axon vs nocodazole nascent axon P < 0.0001; control nascent axon vs control non-axon P < 0.0001; nocodazole nascent axon vs nocodazole non-axon P < 0.0001; control non-axon vs nocodazole non-axon P = 0.9958. Data information: *** P < 0.001. **** P < 0.0001.F Plots showing nascent axon position on the soma of control cells relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 19 cells from six experiments). Numbers show total count of axons in each quadrant. G Plots showing nascent axon position on the soma of nocodazole treated cells relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 14 cells from three experiments). Numbers show total count of axons in each quadrant. H Plots showing the position of non-axonal protrusions on the soma of control cells relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 40 protrusions from 10 cells from three experiments). Numbers show total count of protrusions in each quadrant. I Plots showing the position of non-axonal protrusions on the soma of nocodazole treated cells relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 41 protrusions from 16 cells from three experiments). Numbers show total count of protrusions originating in each quadrant.J Graph showing the ratio of kif5c560-YFP fluorescence intensity in the soma compared to the axon with or without nocodazole. Bars show mean and standard deviation. Control: n = 6 cells from four experiments; mean = 1.81, s.d. = 1.59. Nocodazole: n = 7 cells from four experiments; mean = 0.75, s.d. = 0.19. Data information: *** P < 0.001. **** P < 0.0001.K Image sequence from confocal time lapse of a neuron that extends a nascent axon during nocodazole treatment labelled with a membrane marker and kif5c560-YFP before (-10m) and during (0h to 144m) nocodazole treatment. A nascent axon-like protrusion is extended during nocodazole treatment (92m to 144m) but kif5c560-YFP does not accumulate there. Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks. Data information: All scale bars = 10 µm."}
{"words": ["Figure", "6A", "Transverse", "section", "from", "a", "confocal", "z", "-", "stack", "showing", "the", "whole", "neural", "tube", "of", "a", "utr", "-", "mCherry", "embryo", ",", "showing", "localisation", "to", "the", "basal", "surface", ".", "B", "Transverse", "sections", "from", "a", "confocal", "z", "-", "stack", "of", "a", "non", "-", "apical", "progenitor", "labelled", "with", "a", "membrane", "marker", "in", "a", "utr", "-", "mCherry", "embryo", "to", "identify", "the", "basal", "surface", "of", "the", "spinal", "cord", ".", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "-", "lapse", "shows", "the", "non", "-", "apical", "progenitor", "(", "-", "44m", ")", "undergoing", "mitosis", "to", "produce", "two", "neurons", "(", "-", "22m", ")", ",", "of", "which", "one", "is", "not", "in", "contact", "with", "the", "basal", "surface", ".", "Both", "neurons", "extend", "nascent", "axons", "(", "0m", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "5", "µm", ".", "C", "Transverse", "sections", "from", "a", "confocal", "z", "-", "stack", "of", "a", "neuron", "at", "the", "time", "of", "nascent", "axon", "initiation", "labelled", "with", "a", "membrane", "marker", "in", "a", "utr", "-", "mCherry", "embryo", "to", "identify", "the", "basal", "surface", "of", "the", "spinal", "cord", ".", "Three", "different", "sections", "show", "the", "middle", "of", "the", "soma", ",", "the", "axon", "initiation", "site", ",", "and", "the", "axon", "tip", ".", "Green", "and", "magenta", "peaks", "in", "graphs", "show", "relative", "positions", "of", "cell", "membrane", "and", "basal", "surface", ",", "respectively", ".", "D", "Transverse", "sections", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", "of", "a", "neuron", "at", "the", "time", "of", "nascent", "axon", "initiation", "labelled", "with", "a", "membrane", "marker", "in", "a", "utr", "-", "mCherry", "embryo", "injected", "with", "lamMO", ".", "Three", "different", "sections", "show", "the", "middle", "of", "the", "soma", ",", "the", "axon", "initiation", "site", ",", "and", "the", "axon", "tip", ".", "Green", "and", "magenta", "peaks", "in", "graphs", "show", "relative", "positions", "of", "cell", "membrane", "and", "basal", "surface", ",", "respectively", ".", "E", "Graphs", "showing", "distance", "(", "µm", ")", "between", "the", "basal", "edge", "of", "the", "soma", ",", "the", "axon", "initiation", "site", "or", "the", "axon", "tip", "and", "the", "basal", "surface", "of", "the", "spinal", "cord", ".", "Measurements", "were", "performed", "by", "measuring", "between", "basal", "-", "most", "green", "and", "magenta", "peaks", "in", "graphs", "of", "relative", "grey", "values", "(", "C", ",", "D", ")", ".", "Bars", "show", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "WT", ":", "n", "=", "5", "cells", "from", "one", "experiment", ";", "lamMO", ":", "n", "=", "11", "cells", "from", "two", "experiments", ".", "Soma", ":", "WT", "mean", "=", "2", ".", "007", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "1", ".", "055", ";", "lamMO", "mean", "=", "1", ".", "871", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "1", ".", "830", ".", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "880", ".", "Axon", "initiation", "site", ":", "WT", "mean", "=", "1", ".", "366", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "3", ".", "13", ";", "lamMO", "mean", "=", "2", ".", "353", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "2", ".", "125", ".", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "468", ".", "Axon", "tip", ":", "WT", "mean", "=", "0", ".", "637", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "1", ".", "078", ";", "lamMO", "mean", "=", "2", ".", "903", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "2", ".", "0433", ".", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "037", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "=", "5", "µm", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "F", "Image", "sequence", "from", "confocal", "time", "lapse", "shows", "a", "neuron", "in", "a", "Sly", "-", "/", "-", "embryo", "labelled", "with", "membrane", "and", "centrosome", "markers", "before", "(", "-", "40m", ")", ",", "during", "(", "0", ")", "and", "after", "axon", "initiation", "(", "20m", ")", ".", "Images", "are", "transverse", "reconstructions", "from", "confocal", "z", "-", "stacks", ".", "G", "Plots", "showing", "axon", "position", "on", "the", "soma", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "in", "Sly", "-", "/", "-", "embryos", "(", "n", "=", "18", "cells", "from", "three", "experiments", ")", ".", "Axon", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "98", ".", "8o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "161", ".", "1o", ";", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "Rayleigh", "'", "s", "test", ")", ".", "H", "Plots", "showing", "merge", "of", "WT", "and", "Sly", "-", "/", "-", "axon", "positions", "on", "the", "cell", "body", "relative", "to", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "views", ".", "Axon", "positions", "in", "WT", "and", "Sly", "-", "/", "-", "are", "not", "significantly", "different", "in", "dorsal", "view", "(", "0", ".", "2", "<", "P", "<", "0", ".", "5", ")", "but", "are", "in", "transverse", "view", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "Batschelet", "'", "s", "alternative", "to", "Hotelling", "test", ")", ".", "WT", ":", "n", "=", "86", "cells", "from", "eight", "experiments", ";", "Sly", "-", "/", "-", ":", "n", "=", "18", "cells", "from", "three", "experiments", ".", "I", "Graph", "showing", "distance", "between", "centrosome", "and", "base", "of", "axon", "at", "time", "of", "axon", "initiation", "in", "WT", "and", "Sly", "-", "/", "-", "embryos", ".", "Bars", "show", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "WT", ":", "n", "=", "26", "cells", "from", "three", "experiments", ",", "mean", "=", "10", ".", "13", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "3", ".", "35", ".", "Sly", "-", "/", "-", ":", "n", "=", "15", "cells", "from", "two", "experiments", ",", "mean", "=", "12", ".", "41", "µm", ",", "s", ".", "d", ".", "=", "3", ".", "281", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "=", "0", ".", "123", ".", "J", "Plots", "showing", "centrosome", "position", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "in", "Sly", "-", "/", "-", "embryos", "(", "n", "=", "15", "cells", "from", "two", "experiments", ")", ".", "Centrosome", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "-", "129", ".", "0o", ";", "transverse", "view", "0", ".", "001", "<", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "mean", "=", "-", "57", ".", "0o", ";", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "Rayleigh", "'", "s", "test", ")", ".", "K", "Plots", "showing", "merge", "of", "WT", "and", "Sly", "-", "/", "-", "centrosome", "positions", "on", "the", "cell", "body", "relative", "to", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "views", ".", "Centrosome", "positions", "are", "not", "significantly", "different", "between", "WT", "and", "Sly", "-", "/", "-", "(", "dorsal", "view", "0", ".", "2", "<", "P", "<", "0", ".", "2", ",", "transverse", "view", "0", ".", "1", "<", "P", "<", "0", ".", "2", ";", "Batschelet", "'", "s", "alternative", "to", "Hotelling", "test", ")", ".", "WT", ":", "n", "=", "26", "cells", "from", "three", "experiments", ";", "Sly", "-", "/", "-", ":", "n", "=", "15", "cells", "from", "two", "experiments", ".", "L", "Plots", "showing", "the", "positions", "of", "the", "centrosome", "and", "base", "of", "the", "axon", "in", "Sly", "-", "/", "-", "embryos", "at", "the", "time", "of", "axon", "initiation", "relative", "to", "the", "cell", "centroid", "at", "0", ",", "0", "for", "dorsal", "and", "transverse", "view", "(", "n", "=", "15", "cells", "from", "two", "experiments", ")", ".", "Left", "-", "hand", "plots", ":", "centrosome", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "-", "129", ".", "0o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "-", "57", ".", "0", ")", "and", "axon", "position", "is", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "95", ".", "1o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "168", ".", "8o", ",", "Moore", "'", "s", "modification", "of", "Rayleigh", "'", "s", "test", ")", ".", "Centrosome", "and", "axon", "positions", "are", "significantly", "different", "(", "dorsal", "view", "0", ".", "001", ">", "P", ";", "transverse", "view", "0", ".", "001", ">", "P", ";", "Moore", "'", "s", "test", "for", "paired", "data", ")", ".", "Right", "-", "hand", "plots", ":", "vectors", "connecting", "centrosome", "and", "nascent", "axon", "from", "the", "same", "cell", "are", "not", "random", "(", "dorsal", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "66", ".", "1o", ";", "transverse", "view", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "mean", "=", "150", ".", "9o", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Transverse section from a confocal z-stack showing the whole neural tube of a utr-mCherry embryo, showing localisation to the basal surface. B Transverse sections from a confocal z-stack of a non-apical progenitor labelled with a membrane marker in a utr-mCherry embryo to identify the basal surface of the spinal cord. Image sequence from confocal time-lapse shows the non-apical progenitor (-44m) undergoing mitosis to produce two neurons (-22m), of which one is not in contact with the basal surface. Both neurons extend nascent axons (0m). Data information: All scale bars = 5 µm.C Transverse sections from a confocal z-stack of a neuron at the time of nascent axon initiation labelled with a membrane marker in a utr-mCherry embryo to identify the basal surface of the spinal cord. Three different sections show the middle of the soma, the axon initiation site, and the axon tip. Green and magenta peaks in graphs show relative positions of cell membrane and basal surface, respectively. D Transverse sections from confocal z-stacks of a neuron at the time of nascent axon initiation labelled with a membrane marker in a utr-mCherry embryo injected with lamMO. Three different sections show the middle of the soma, the axon initiation site, and the axon tip. Green and magenta peaks in graphs show relative positions of cell membrane and basal surface, respectively. E Graphs showing distance (µm) between the basal edge of the soma, the axon initiation site or the axon tip and the basal surface of the spinal cord. Measurements were performed by measuring between basal-most green and magenta peaks in graphs of relative grey values (C, D). Bars show mean and standard deviation. WT: n = 5 cells from one experiment; lamMO: n = 11 cells from two experiments. Soma: WT mean = 2.007 µm, s.d. = 1.055; lamMO mean = 1.871 µm, s.d. = 1.830. Student's two-tailed test, P = 0.880. Axon initiation site: WT mean = 1.366 µm, s.d. = 3.13; lamMO mean = 2.353 µm, s.d. = 2.125. Student's two-tailed test, P = 0.468. Axon tip: WT mean = 0.637 µm, s.d. = 1.078; lamMO mean = 2.903 µm, s.d. = 2.0433. Student's two-tailed test, P = 0.037. Data information: All scale bars = 5 µm. * P < 0.05.F Image sequence from confocal time lapse shows a neuron in a Sly-/- embryo labelled with membrane and centrosome markers before (-40m), during (0) and after axon initiation (20m). Images are transverse reconstructions from confocal z-stacks.G Plots showing axon position on the soma relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view in Sly-/- embryos (n = 18 cells from three experiments). Axon position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = 98.8o; transverse view P < 0.001, mean = 161.1o; Moore's modification of Rayleigh's test). H Plots showing merge of WT and Sly-/- axon positions on the cell body relative to cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse views. Axon positions in WT and Sly-/- are not significantly different in dorsal view (0.2 < P < 0.5) but are in transverse view (P < 0.001; Batschelet's alternative to Hotelling test). WT: n = 86 cells from eight experiments; Sly-/-: n = 18 cells from three experiments.I Graph showing distance between centrosome and base of axon at time of axon initiation in WT and Sly-/- embryos. Bars show mean and standard deviation. WT: n = 26 cells from three experiments, mean = 10.13 µm, s.d. = 3.35. Sly-/-: n = 15 cells from two experiments, mean = 12.41 µm, s.d. = 3.281. One-way ANOVA, P = 0.123.J Plots showing centrosome position relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view in Sly-/- embryos (n = 15 cells from two experiments). Centrosome position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = -129.0o; transverse view 0.001 < P < 0.005, mean = -57.0o; Moore's modification of Rayleigh's test). K Plots showing merge of WT and Sly-/- centrosome positions on the cell body relative to cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse views. Centrosome positions are not significantly different between WT and Sly-/- (dorsal view 0.2 < P < 0.2, transverse view 0.1 < P < 0.2; Batschelet's alternative to Hotelling test). WT: n = 26 cells from three experiments; Sly-/-: n = 15 cells from two experiments.L Plots showing the positions of the centrosome and base of the axon in Sly-/- embryos at the time of axon initiation relative to the cell centroid at 0,0 for dorsal and transverse view (n = 15 cells from two experiments). Left-hand plots: centrosome position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = -129.0o; transverse view P < 0.001, mean = -57.0) and axon position is not random (dorsal view P < 0.001, mean = 95.1o; transverse view P < 0.001, mean = 168.8o, Moore's modification of Rayleigh's test). Centrosome and axon positions are significantly different (dorsal view 0.001 > P; transverse view 0.001 > P; Moore's test for paired data). Right-hand plots: vectors connecting centrosome and nascent axon from the same cell are not random (dorsal view P < 0.001, mean = 66.1o; transverse view P < 0.001, mean = 150.9o)."}
{"words": ["Figure", "1D", ".", "Global", "measurement", "of", "the", "severing", "of", "filaments", "exposed", "to", "20", "nM", "mCherry", "-", "cofilin", "-", "1", "from", "time", "t", "=", "0", "onwards", ".", "N", "=", "20", "(", "from", "1", "representative", "experiment", ")", "and", "50", "(", "1", "experiment", ")", "for", "non", "-", "oxidized", "and", "oxidized", "actin", "filaments", ",", "respectively", ".", "P", "-", "value", "=", "8", ".", "10", "-", "8", "(", "log", "-", "rank", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Thick", "solid", "and", "dashed", "lines", "are", "survival", "fractions", "calculated", "from", "the", "experimental", "data", ".", "Thin", "grey", "lines", "are", "single", "exponential", "fits", ".", "95", "%", "confidence", "intervals", "are", "shown", "as", "shaded", "surfaces", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D. Global measurement of the severing of filaments exposed to 20 nM mCherry-cofilin-1 from time t=0 onwards. N = 20 (from 1 representative experiment) and 50 (1 experiment) for non-oxidized and oxidized actin filaments, respectively. P-value = 8.10-8 (log-rank test). Data information: Thick solid and dashed lines are survival fractions calculated from the experimental data. Thin grey lines are single exponential fits. 95% confidence intervals are shown as shaded surfaces.  "}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "Global", "quantification", "of", "the", "severing", "events", "on", "oxidized", "and", "non", "-", "oxidized", "filaments", "exposed", "to", "unlabelled", "S3D", "-", "cofilin1", "from", "time", "t", "=", "0", "onwards", ".", "From", "top", "to", "bottom", ",", "N", "=", "50", "(", "from", "1", "experiment", ")", ",", "50", "(", "1", "experiment", ")", ",", "100", "(", "2", "experiments", ")", "filaments", ".", "Data", "information", "All", "lines", "are", "survival", "fractions", "calculated", "from", "the", "experimental", "data", "95", "%", "confidence", "intervals", "are", "shown", "as", "shaded", "surfaces", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. Global quantification of the severing events on oxidized and non-oxidized filaments exposed to unlabelled S3D-cofilin1 from time t=0 onwards. From top to bottom, N = 50 (from 1 experiment), 50 (1 experiment), 100 (2 experiments) filaments. Data information All lines are survival fractions calculated from the experimental data 95% confidence intervals are shown as shaded surfaces."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Time", "-", "lapse", "images", "of", "Tpm", "-", "saturated", "actin", "filament", "depolymerizing", "from", "their", "barbed", "end", "(", "BE", ")", ",", "with", "or", "without", "MICAL1", ".", "Depolymerization", "is", "initiated", "at", "time", "t", "=", "0", "from", "a", "non", "-", "oxidized", "actin", "filament", ".", "The", "increase", "in", "the", "depolymerization", "rate", "reflects", "the", "oxidation", "of", "actin", "with", "time", ".", "Tpm", "is", "labeled", "with", "neonGreen", "(", "nGr", ")", ",", "and", "actin", "is", "unlabeled", ".", "C", ".", "Time", "-", "lapse", "images", "showing", "the", "disassembly", "of", "Tpm", "domains", ".", "Filaments", "were", "saturated", "with", "100", "nM", "nGr", "-", "Tpm1", ".", "8", "before", "the", "experiment", "and", "Tpm", "was", "removed", "from", "solution", "at", "time", "t", "=", "0", "(", "the", "solution", "contains", "0", ".", "6", "µM", "unlabeled", "G", "-", "actin", "to", "prevent", "filament", "depolymerization", ")", ".", "PE", "and", "BE", "indicate", "F", "-", "actin", "pointed", "and", "barbed", "end", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Time-lapse images of Tpm-saturated actin filament depolymerizing from their barbed end (BE), with or without MICAL1. Depolymerization is initiated at time t=0 from a non-oxidized actin filament. The increase in the depolymerization rate reflects the oxidation of actin with time. Tpm is labeled with neonGreen (nGr), and actin is unlabeled.C. Time-lapse images showing the disassembly of Tpm domains. Filaments were saturated with 100 nM nGr-Tpm1.8 before the experiment and Tpm was removed from solution at time t=0 (the solution contains 0.6 µM unlabeled G-actin to prevent filament depolymerization). PE and BE indicate F-actin pointed and barbed end, respectively."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Time", "-", "lapse", "images", "of", "filaments", ",", "oxidized", "or", "not", ",", "bare", "or", "Tpm", "-", "saturated", ",", "exposed", "to", "1", "µM", "mCherry", "-", "cofilin", "-", "1", ",", "from", "time", "t", "=", "0", "onwards", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Time-lapse images of filaments, oxidized or not, bare or Tpm-saturated, exposed to 1 µM mCherry-cofilin-1, from time t=0 onwards."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Time", "-", "lapse", "of", "actin", "filaments", "constantly", "exposed", "to", "nGr", "-", "Tpm1", ".", "8", "(", "yellow", ")", ",", "WT", "mCh", "-", "cofilin", "-", "1", "(", "blue", ")", "and", "S3D", "-", "cofilin", "-", "1", ",", "and", "to", "MICAL1", "from", "time", "t", "=", "100s", "onwards", ".", "Here", "we", "mixed", "WT", "with", "an", "excess", "of", "S3D", "-", "cofilin", "-", "1", "to", "mimic", "cellular", "conditions", "in", "which", "most", "of", "cofilin", "-", "1", "is", "inhibited", "by", "phosphorylation", ".", "While", "Tpm", "prevents", "cofilin", "from", "binding", "to", "non", "-", "oxidized", "filaments", ",", "MICAL1", "rapidly", "oxidizes", "actin", ",", "allowing", "cofilin", "to", "bind", "and", "sever", "filaments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Time-lapse of actin filaments constantly exposed to nGr-Tpm1.8 (yellow), WT mCh-cofilin-1 (blue) and S3D-cofilin-1, and to MICAL1 from time t=100s onwards. Here we mixed WT with an excess of S3D-cofilin-1 to mimic cellular conditions in which most of cofilin-1 is inhibited by phosphorylation. While Tpm prevents cofilin from binding to non-oxidized filaments, MICAL1 rapidly oxidizes actin, allowing cofilin to bind and sever filaments."}
{"words": ["Figure", "1E", "and", "F", ".", "TLC", "analysis", "of", "cGAMP", ",", "which", "is", "indicative", "of", "cGAS", "activation", ",", "upon", "incubation", "with", "E", ")", "tRNA", "or", "F", ")", "total", "RNA", "(", "n", "=", "2", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "The", "FL", "-", "hcGAS", "concentration", "was", "0", ".", "265", "mg", "/", "mL", ".", "The", "tRNA", "concentrations", "from", "low", "to", "high", "were", "0", ".", "025", ",", "0", ".", "05", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "25", ",", "and", "0", ".", "85", "mg", "/", "mL", ".", "The", "extracted", "total", "RNA", "concentrations", "from", "low", "to", "high", "were", "0", ".", "025", ",", "0", ".", "05", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "25", ",", "and", "0", ".", "5", "mg", "/", "mL", ".", "NC", "indicates", "the", "negative", "control", "that", "has", "only", "the", "FL", "-", "hcGAS", ".", "dsDNA", "ISD", "at", "a", "concentration", "of", "0", ".", "05", "mg", "/", "mL", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "All", "the", "samples", "were", "prepared", "in", "20", "mM", "HEPES", "at", "pH", "7", ".", "5", "and", "150", "mM", "NaCl", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1E and F. TLC analysis of cGAMP, which is indicative of cGAS activation, upon incubation with E) tRNA or F) total RNA (n=2, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). The FL-hcGAS concentration was 0.265 mg/mL. The tRNA concentrations from low to high were 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, and 0.85 mg/mL. The extracted total RNA concentrations from low to high were 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, and 0.5 mg/mL. NC indicates the negative control that has only the FL-hcGAS. dsDNA ISD at a concentration of 0.05 mg/mL was used as a positive control. All the samples were prepared in 20 mM HEPES at pH 7.5 and 150 mM NaCl."}
{"words": ["Figure", "2F", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "OptiPrep", "gradient", "fractions", "with", "or", "without", "DNase", "and", "RNase", "treatments", ".", "G", ".", "The", "three", "images", "on", "the", "left", "showing", "fluorescence", "signals", "of", "endogenous", "cGAS", "and", "RNA", "in", "HeLa", "cells", "(", "n", "=", "13", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "10", "µm", ".", "The", "scatterplot", "on", "the", "right", "plots", "the", "signal", "intensities", "of", "cGAS", "versus", "RNA", "at", "each", "pixel", "in", "the", "indicated", "cytoplasmic", "area", "(", "yellow", "circle", ")", ".", "H", ".", "The", "three", "images", "on", "the", "left", "showing", "the", "fluorescence", "signals", "of", "mCherry", "and", "RNA", "in", "HEK293T", "cells", "(", "n", "=", "9", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "10", "µm", ".", "The", "scatterplot", "on", "the", "right", "plots", "signal", "intensities", "of", "mCherry", "versus", "RNA", "at", "each", "pixel", "in", "the", "indicated", "cytoplasmic", "area", "(", "yellow", "circle", ")", ".", "I", ".", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "(", "CC", ")", "analysis", "of", "the", "fluorescence", "signals", "of", "cGAS", "vs", ".", "RNA", "(", "n", "=", "13", ",", "biological", "replicates", ")", ",", "and", "mCherry", "vs", ".", "RNA", "(", "n", "=", "9", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "The", "median", "values", "were", "calculated", "and", "used", "for", "evaluation", "of", "significance", ".", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2F. Western blot analysis of the OptiPrep gradient fractions with or without DNase and RNase treatments.G. The three images on the left showing fluorescence signals of endogenous cGAS and RNA in HeLa cells (n=13, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). The scale bar represents 10 µm. The scatterplot on the right plots the signal intensities of cGAS versus RNA at each pixel in the indicated cytoplasmic area (yellow circle). H. The three images on the left showing the fluorescence signals of mCherry and RNA in HEK293T cells (n=9, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). The scale bar represents 10 µm. The scatterplot on the right plots signal intensities of mCherry versus RNA at each pixel in the indicated cytoplasmic area (yellow circle). I. Pearson's correlation coefficient (CC) analysis of the fluorescence signals of cGAS vs. RNA (n=13, biological replicates), and mCherry vs. RNA (n=9, biological replicates). The median values were calculated and used for evaluation of significance. ***P < 0.001 (two-tailed Mann-Whitney test)."}
{"words": ["Figure", "4D", ".", "Fluorescence", "microscopy", "images", "showing", "the", "replacement", "of", "FTSC", "-", "tRNA", "by", "Cy5", "-", "ISD", "at", "indicated", "concentrations", "in", "preformed", "granules", "of", "hcGAS", "and", "FTSC", "-", "tRNA", "(", "n", "=", "2", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "In", "each", "square", ",", "a", "representative", "area", "that", "is", "1", "/", "16", "of", "the", "raw", "image", "is", "displayed", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "20", "µm", ".", "E", ".", "Fluorescence", "microscopy", "images", "showing", "the", "replacement", "of", "FTSC", "-", "tRNA", "by", "TAMRA", "-", "380", "bp", "-", "dsDNA", "at", "indicated", "concentrations", "in", "preformed", "granules", "of", "hcGAS", "and", "FTSC", "-", "tRNA", "(", "n", "=", "2", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "In", "each", "square", ",", "a", "representative", "area", "that", "is", "1", "/", "16", "of", "the", "raw", "image", "is", "displayed", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "20", "µm", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "the", "replacement", "in", "\"", "D", "\"", ".", "For", "each", "square", ",", "the", "raw", "image", "used", "was", "evenly", "divided", "into", "four", "parts", ".", "Fluorescence", "signal", "ratios", "of", "Cy5", "-", "ISD", "over", "FTSC", "-", "tRNA", "in", "the", "four", "parts", "were", "calculated", ",", "averaged", "and", "plotted", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "the", "replacement", "in", "\"", "E", "\"", ".", "For", "each", "square", ",", "the", "raw", "image", "used", "was", "evenly", "divided", "into", "four", "parts", ".", "Fluorescence", "signal", "ratios", "of", "TAMRA", "-", "380", "bp", "-", "dsDNA", "over", "FTSC", "-", "tRNA", "in", "the", "four", "parts", "were", "calculated", ",", "averaged", "and", "plotted", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D. Fluorescence microscopy images showing the replacement of FTSC-tRNA by Cy5-ISD at indicated concentrations in preformed granules of hcGAS and FTSC-tRNA (n=2, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). In each square, a representative area that is 1/16 of the raw image is displayed. The scale bars represent 20 µm. E. Fluorescence microscopy images showing the replacement of FTSC-tRNA by TAMRA-380 bp-dsDNA at indicated concentrations in preformed granules of hcGAS and FTSC-tRNA (n=2, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). In each square, a representative area that is 1/16 of the raw image is displayed. The scale bars represent 20 µm. F. Quantification of the replacement in \"D\". For each square, the raw image used was evenly divided into four parts. Fluorescence signal ratios of Cy5-ISD over FTSC-tRNA in the four parts were calculated, averaged and plotted. G. Quantification of the replacement in \"E\". For each square, the raw image used was evenly divided into four parts. Fluorescence signal ratios of TAMRA-380 bp-dsDNA over FTSC-tRNA in the four parts were calculated, averaged and plotted."}